ES2741936T3 - Anticuerpos anti-SEZ6 y procedimientos de uso - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal que se une a una proteína SEZ6 humana y comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, donde el anticuerpo comprende: (a) los residuos 24-34 de SEQ ID NO: 172 para CDR-L1, los residuos 50-56 de SEQ ID NO: 172 para CDR-L2, los residuos 89-97 de SEQ ID NO: 172 para CDR-L3, los residuos 31-35 de SEQ ID NO: 173 para CDR-H1, los residuos 50-65 de SEQ ID NO: 173 para CDR-H2 y los residuos 95-102 de SEQ ID NO: 173 para CDR-H3, donde los residuos se numeran según Kabat; (b) los residuos 23-34 de SEQ ID NO: 172 para CDR-L1, los residuos 50-56 de SEQ ID NO: 172 para CDR-L2, los residuos 89-97 de SEQ ID NO: 172 para CDR-L3, los residuos 26-32 de SEQ ID NO: 173 para CDR-H1, los residuos 50-58 de SEQ ID NO: 173 para CDR-H2 y los residuos 95-102 de SEQ ID NO: 173 para CDR-H3, donde los residuos se numeran según Chothia; o (c) los residuos 30-36 de SEQ ID NO: 172 para CDR-L1, los residuos 46-55 de SEQ ID NO: 172 para CDR-L2, los residuos 89-96 de SEQ ID NO: 172 para CDR-L3, los residuos 30-35 de SEQ ID NO: 173 para CDR-H1, los residuos 47-58 de SEQ ID NO: 173 para CDR-H2 y los residuos 93-101 de SEQ ID NO: 173 para CDR-H3, donde los residuos se numeran según MacCallum.
Description
DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-SEZ6 y procedimientos de uso
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] Esta solicitud se refiere en general a compuestos, composiciones y procedimientos novedosos para su uso en el diagnóstico, la prevención, el tratamiento o la mejora de trastornos proliferativos y cualquier expansión, recidiva, recaída o metástasis de los mismos. En un amplio aspecto, la presente descripción se refiere al uso de moduladores del homólogo 6 relacionado con las convulsiones (SEZ6), incluidos los anticuerpos anti-SEZ6 y construcciones de fusión, para el tratamiento, diagnóstico o profilaxis de trastornos neoplásicos. Los casos seleccionados de la presente descripción proporcionan el uso de dichos moduladores de SEZ6, incluidos los conjugados anticuerpo-fármaco, para el tratamiento inmunoterapéutico de neoplasias que comprende preferentemente una reducción en la frecuencia de las células iniciadoras de tumores.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] La diferenciación de las células madre y progenitoras y la proliferación celular son procesos continuos normales que actúan de forma concertada para estimular el crecimiento tisular durante la organogénesis y el reemplazo celular, y para reparar la mayoría de los tejidos durante la vida de todos los organismos vivos. En el transcurso normal de los acontecimientos, la diferenciación y la proliferación celular están controladas por numerosos factores y señales que generalmente se equilibran para mantener decisiones sobre el destino celular y la arquitectura tisular. Por lo tanto, en gran medida, este microentorno controlado es el que regula en gran medida la división celular y la maduración tisular donde se generan señales de forma adecuada en función de las necesidades del organismo. A este respecto, la proliferación y la diferenciación celular normalmente se producen solamente según sea necesario para el reemplazo de células dañadas o moribundas, o para el crecimiento. Desafortunadamente, la alteración de la proliferación y/o la diferenciación celular puede ser consecuencia de multitud de factores que incluyen, por ejemplo, la carencia o abundancia excesiva de diversos compuestos químicos de señalización, la presencia de microentornos alterados, mutaciones genéticas o alguna combinación de los mismos. Cuando se interrumpe o altera de algún modo la proliferación y/o la diferenciación celular normal, esto puede originar varias enfermedades o trastornos, incluidos trastornos proliferativos tales como el cáncer.
[0003] Gunnersen y col. (PLOS ONE, vol. 4, n.° 8, 2009, e6546) se refiere al gen 6 relacionado con las convulsiones (Sez-6) en las células amacrinas de la retina de roedores y la consecuencia de la eliminación del gen. Osaki y col. (Brain Research, vol. 1386, 2011, páginas 58-69) se refiere a la distribución de la proteína del gen 6 (Sez-6) relacionado con las convulsiones durante el desarrollo posnatal del cerebro anterior de ratón. Shimizu-Nishikawa y col. (Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 216, n.° 1, 1995, páginas 382-389) se refiere a la clonación y caracterización del gen relacionado con las convulsiones, SEZ-6.
[0004] Los tratamientos convencionales para el cáncer incluyen quimioterapia, radioterapia, cirugía, inmunoterapia (por ejemplo, modificadores de la respuesta biológica, vacunas o agentes terapéuticos dirigidos) o combinaciones de los mismos. Desafortunadamente, ciertos tipos de cáncer presentan una respuesta mínima o nula a dichos tratamientos. Por ejemplo, en algunos pacientes los tumores exhiben mutaciones genéticas que hacen que presenten una respuesta nula a pesar de la eficacia general de las terapias seleccionadas. Además, dependiendo del tipo de cáncer y de la forma que adquiera, puede suceder que algunos tratamientos disponibles, tal como la cirugía, no sean alternativas viables. Las limitaciones inherentes de los agentes terapéuticos actuales utilizados como estándar de atención médica se manifiestan particularmente cuando se intenta tratar a pacientes que han sido sometidos a tratamientos anteriores y que posteriormente han sufrido una recaída. En tales casos, los regímenes terapéuticos fallidos y el resultante deterioro de los pacientes pueden contribuir a la aparición de tumores refractarios que se manifiestan a menudo como una enfermedad relativamente agresiva que, en última instancia, resulta ser incurable. Aunque se han producido grandes mejoras en el diagnóstico y el tratamiento del cáncer a lo largo de los años, las tasas de supervivencia globales para muchos tumores sólidos han permanecido en gran parte invariables debido al fracaso de las terapias existentes para prevenir la recaída, la recidiva y las metástasis tumorales. Por lo tanto, el desarrollo de terapias más potentes y dirigidas sigue siendo un desafío para los trastornos proliferativos.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0005] Estos y otros objetivos se proporcionan en la presente descripción, la cual, en un sentido amplio, se refiere a procedimientos, compuestos, composiciones y artículos de fabricación que se pueden utilizar en el tratamiento de trastornos asociados con SEZ6 (por ejemplo, trastornos proliferativos o trastornos neoplásicos). Con base en la descripción en el presente documento, se proporciona la invención definida en las reivindicaciones adjuntas. Por lo tanto, la presente invención proporciona moduladores del homólogo 6 relacionado con las convulsiones (o SEZ6) que se dirigen de forma eficaz a células tumorales y/o células madre cancerosas, y se pueden utilizar para tratar a pacientes que padecen una gran diversidad de neoplasias. Como se describirá más detalladamente en el presente documento, existen al menos dos isoformas o variantes de SEZ6 de origen natural
y los moduladores descritos pueden comprender o asociarse selectivamente con una ¡soforma o la otra o con ambas. Además, en ciertos casos, los moduladores de SEZ6 descritos pueden reaccionar adicionalmente con uno o más miembros de la familia SEZ (por ejemplo, SEZ6L o SEZ6L2) o, en otros casos, se pueden generar y seleccionar de modo que se asocien o reaccionen exclusivamente con una o más isoformas de SEZ6. En cualquier caso, los moduladores pueden comprender cualquier compuesto que reconozca, compita, agonice, antagonice, interaccione, se una o se asocie con un gen o polipéptido s EZ6 (o uno de sus fragmentos) y module, ajuste, altere, cambie o modifique el impacto de la proteína s Ez6 sobre una o más vías fisiológicas. Por lo tanto, en un sentido amplio, la presente descripción se refiere en general a moduladores de SEZ6 aislados y usos de los mismo. En casos preferidos, la descripción se refiere más particularmente a moduladores de SEZ6 aislados que comprenden anticuerpos (es decir, anticuerpos que se unen, reaccionan o se asocian inmunopreferencialmente con al menos una isoforma de SEZ6) que, en casos particularmente preferidos, se asocian o conjugan con uno o más agentes citotóxicos. Además, como se analiza extensamente a continuación, dichos moduladores se pueden utilizar para proporcionar composiciones farmacéuticas útiles para la profilaxis, el diagnóstico o el tratamiento de trastornos proliferativos.
[0006] En casos seleccionados de la descripción, los moduladores de SEZ6 pueden comprender un polipéptido SEZ6 o fragmentos del mismo, ya sea en una forma aislada o fusionados o asociados con otros restos (por ejemplo, Fc-SEZ6, PEG-SEZ6 o SEZ6 asociado con un resto de direccionamiento). En otros casos seleccionados, los moduladores de SEZ6 pueden comprender antagonistas de SEZ6 que, a los efectos de la presente invención, se debe entender que se refieren a cualquier construcción o compuesto que reconozca, compita, interaccione, se una o se asocie con SEZ6 y neutralice, elimine, reduzca, sensibilice, reprograme, inhiba o controle el crecimiento de células neoplásicas, incluidas las células iniciadoras de tumores. En casos preferidos, los moduladores de SEZ6 de la presente descripción comprenden anticuerpos anti-SEZ6, o fragmentos o derivados de los mismos, que se ha descubierto inesperadamente que silencian, neutralizan, reducen, disminuyen, agotan, moderan, merman, reprograman, eliminan o inhiben de otro modo la capacidad de las células iniciadoras de tumores para propagar, mantener, expandir, proliferar o facilitar de otro modo la supervivencia, recidiva, regeneración y/o metástasis de las células neoplásicas. En realizaciones particularmente preferidas, los anticuerpos o fragmentos inmunorreactivos se pueden asociar o conjugar con uno o más agentes anticancerosos (por ejemplo, un agente citotóxico).
[0007] En lo que respecta a dichos moduladores, se podrá apreciar que los anticuerpos compatibles pueden presentar una cualquiera de entre una serie de formas que incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales y monoclonales, quiméricos, con injertos de CDR, humanizados y humanos, y variantes y/o fragmentos inmunorreactivos de cada uno de los anteriores. Las realizaciones preferidas comprenderán anticuerpos que sean relativamente no inmunogénicos tales como construcciones humanizadas o completamente humanas. Obviamente, teniendo en cuenta la presente descripción, los expertos en la técnica podrían identificar fácilmente una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) asociadas con regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los moduladores de anticuerpo de SEZ6, y emplear estas CDR para modificar o fabricar anticuerpos quiméricos, humanizados o con injertos de CDR sin necesidad de realizar demasiados experimentos. Por consiguiente, en ciertos casos preferidos, el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo que incorpora una o más CDR como las que se definen en las FIGS. 10A y 10B, y derivadas de las regiones variables murinas de las cadenas ligera (FIG. 10A) o pesada (FIG. 10B) contiguas (SEQ ID NO: 20-169) expuestas en las mismas. Dichas regiones variables con injertos de CDR que contienen un marco humano y variantes de las mismas también se muestran en la FIG. 10 que comprende las SEQ ID NO: 170-199. En casos preferidos, dichos anticuerpos comprenderán anticuerpos monoclonales y, en casos incluso más preferidos, comprenderán anticuerpos quiméricos, con injertos de CDR o humanizados.
[0008] Las secuencias de ácido nucleico ejemplares que codifican cada una las secuencias de aminoácidos expuestas en las FIGS. 10A y 10B se adjuntan a la presente en la lista de secuencias y comprenden las SEQ ID NO: 220 a 399. A este respecto, se apreciará que la descripción comprende además moléculas de ácido nucleico (y construcciones, vectores y células huésped asociados) que codifican las secuencias de aminoácidos de la región variable del anticuerpo descrito que incluyen las expuestas en la lista de secuencias que se adjunta.
[0009] Más particularmente, en casos seleccionados, los moduladores de SEZ6 compatibles pueden comprender un anticuerpo que tiene una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, donde dicha región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ
ID NO: 166 y SEQ ID NO: 168, y donde dicha región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ
ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ I NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID : 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ I NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ I NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ I NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO:
SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SE NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO:
SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SE NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO:
SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167 y SEQ ID NO: 169. En otros casos preferidos, los moduladores seleccionados comprenderán regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden un 65, 70, 75 o un 80 % de identidad con las secuencias murinas mencionadas anteriormente. En aún otros casos, los moduladores comprenderán regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden un 85, 90 o incluso un 95 % de identidad con las secuencias murinas descritas.
[0010] Obviamente, teniendo en cuenta la presente descripción, los expertos en la técnica podrían identificar fácilmente CDR asociadas con cada una de las regiones variables de cadena pesada y ligera, y emplear estas CDR para modificar o fabricar anticuerpos quiméricos, humanizados o con injertos de CDR sin necesidad de realizar demasiados experimentos. En este sentido, en casos seleccionados, la presente descripción se refiere a anticuerpos anti-SEZ6 que comprenden una o más CDR de una secuencia de región variable que se expone en la FIG. 10A o la FIG. 10B. En casos preferidos, dichos anticuerpos comprenderán anticuerpos monoclonales y, en casos incluso más preferidos, comprenderán anticuerpos quiméricos, con injertos de CDR o humanizados. Como se analiza más detalladamente a continuación, otros casos adicionales comprenderán dichos anticuerpos conjugados o asociados con uno o más agentes citotóxicos.
[0011] Otro aspecto de la descripción comprende moduladores obtenidos o derivados de SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10, SC17.11, SC17.14, SC17.15, SC17.16, SC17.17, SC17.18, SC17.19, SC17.22, SC17.24, SC17.27, SC17.28, SC17.29, SC17.30, SC17.32, SC17.34, SC17.35, SC17.36, SC17.38, SC17.39, SC17.40, SC17.41, SC17.42, SC17.45, SC17.46, SC17.47, SC17.49, SC17.50, SC17.53, SC17.54, SC17.56, SC17.57, SC17.59, SC17.61, SC17.63, SC17.71, SC17.72, SC17.74, SC17.76, SC17.77, SC17.79, SC17.81, SC17.82, SC17.84, SC17.85, SC17.87, SC17.89, SC17.90, SC17.91, SC17.93, SC17.95, SC17.97, SC17.99, SC17.102, SC17.114, SC17.115, SC17.120, SC17121, SC17.122, SC17.140, SC17.151, SC17.156, SC17.161, SC17.166, SC17.187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 y SC17.200.
[0012] En aún otros casos compatibles, la presente descripción comprenderá los moduladores de SEZ6 con injerto de CDR o humanizados hSC17.16, hSC17.17, hSC17.24, hSC17.28, SC17.34, hSC17.46, SC17.151, SC17.155, SC17.156, SC17.161 y SC17.200. Aún otros casos se refieren a un modulador de SEZ6 que comprende un anticuerpo humanizado donde dicho anticuerpo humanizado comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, donde dicha región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID nO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID
NO: 188 y SEQ ID NO: 190, y donde dicha región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID nO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179 y SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID
NO: 189 y SEQ ID NO: 191. Adicionalmente, se proporcionan ciertas variantes humanizadas de regiones variables de cadena ligera (SEQ ID NO: 192) y pesada (SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198 y SEQ ID NO: 199) según las enseñanzas del presente documento. Además, como se ha descrito justo antes, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera humanizadas ejemplares se exponen en la lista de secuencias adjunta a la misma como SEQ ID NO: 370 -399.
[0013] Aparte de los aspectos mencionados anteriormente, otras realizaciones preferidas de la presente invención comprenderán moduladores de SEZ6 asociados o conjugados con uno o más fármacos para proporcionar conjugados moduladores que puede que sean particularmente eficaces en el tratamiento de trastornos proliferativos (solos o combinados con otros agentes farmacéuticamente activos). Más generalmente, una vez que se hayan fabricado y seleccionado los moduladores de la invención, se pueden unir, fusionar, conjugar (por ejemplo, de forma covalente o no covalente) o asociar de otro modo con restos para el diagnóstico o farmacéuticamente activos, o modificadores biocompatibles. Como se usan en el presente documento, los términos «conjugado», «conjugado modulador» o «conjugado de anticuerpo», se utilizarán en un sentido amplio y se establecerá que se refieren a
cualquier molécula biológicamente activa o detectable, o fármaco asociado con los moduladores descritos independientemente del procedimiento de asociación. A este respecto, se entenderá que tales conjugados pueden comprender, además de los moduladores descritos, péptidos, polipéptidos, proteínas, profármacos que son metabolizados para obtener un agente activo in vivo, polímeros, moléculas de ácido nucleico, moléculas de bajo peso molecular, agentes de unión, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas y radioisótopos. Además, como se ha indicado anteriormente, el conjugado seleccionado puede estar asociado de forma covalente o no covalente con el modulador o ligado a este y presentar diversas proporciones molares estequiométricas dependiendo, al menos en parte, del procedimiento empleado para conseguir la conjugación.
[0014] Los aspectos particularmente preferidos de la presente descripción comprenderán conjugados anticuerpo-modulador o conjugados anticuerpo-fármaco que se pueden utilizar para el diagnóstico y/o el tratamiento de trastornos proliferativos. Dichos conjugados se pueden representar con la fórmula M-[L-D]n, donde M representa un modulador descrito o un resto de unión a la diana, L es un conector opcional o unidad conectora, D es un fármaco o profármaco compatible, y n es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 20. Se apreciará que, a menos que el contexto dicte lo contrario, se entenderá que las expresiones «conjugado anticuerpo-fármaco» o «ADC» o la fórmula M-[L-D]n abarcan los conjugados que comprenden restos tanto restos terapéuticos como de diagnóstico. En tales casos, los compuestos conjugados anticuerpo-fármaco comprenderán normalmente anti-SEZ6 como la unidad moduladora (M), un resto terapéutico o de diagnóstico (D), y opcionalmente un conector (L) que une el fármaco al agente de unión al antígeno. En un caso preferido, el anticuerpo es un mAb de SEZ6 que comprende al menos una CDR de las regiones variables de cadena pesada y ligera como se describe anteriormente.
[0015] Como se ha indicado previamente, un aspecto de la invención puede comprender la asociación inesperada de los polipéptidos SEZ6 con células madre cancerosas. Por lo tanto, en ciertas realizaciones diferentes, la invención comprenderá un modulador de SEZ6 que reduce la frecuencia de las células iniciadoras de tumores al administrarlo a un sujeto. Preferentemente, la reducción de la frecuencia se determinará utilizando un análisis de dilución limitante in vitro o in vivo. En casos particularmente preferidos, dicho análisis se puede realizar utilizando un análisis de dilución limitante in vivo que comprenda el trasplante de células tumorales humanas vivas en ratones inmunodeprimidos. Como alternativa, el análisis de dilución limitante se puede realizar utilizando un análisis de dilución limitante in vitro que comprenda la deposición por dilución limitante de células tumorales humanas vivas en condiciones que estimulen las colonias in vitro. En cualquier caso, el análisis, el cálculo o la cuantificación de la reducción de la frecuencia comprenderá preferentemente el uso del modelo estadístico de la distribución de Poisson para proporcionar un recuento preciso. Se apreciará que, a pesar de que se prefieran estos procedimientos de cuantificación, también se puede utilizar otra metodología menos laboriosa, tal como citometría de flujo o la inmunohistoquímica, para proporcionar los valores deseados y, por consiguiente, se contempla expresamente como incluida dentro del alcance de la presente descripción. En estos casos, la reducción de la frecuencia se puede determinar utilizando un análisis por citometría de flujo o una detección inmunohistoquímica de los marcadores superficiales de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores.
[0016] En este sentido, en otro caso preferido de la presente descripción comprende un procedimiento para tratar un trastorno asociado con SEZ6 que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de SEZ6 a un sujeto que lo necesita, mediante el cual se reduce la frecuencia de las células iniciadoras de tumores. Preferentemente, el trastorno asociado con SEZ6 comprende un trastorno neoplásico. De nuevo, la reducción de la frecuencia de las células iniciadoras de tumores se determinará preferentemente utilizando un análisis de dilución limitante in vitro o in vivo.
[0017] A este respecto, se apreciará que la presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que los inmunógenos de SEZ6 se asocian con las células perpetuantes de tumores (es decir, células madre cancerosas) que intervienen en la etiología de diversas neoplasias. Más específicamente, la presente solicitud demuestra inesperadamente que la administración de diversos moduladores de SEZ6 ilustrativos puede mediar, reducir, agotar, inhibir o eliminar la señalización tumorigénica por parte de células iniciadoras de tumores (es decir, reducir la frecuencia de las células iniciadoras de tumores). Esta señalización reducida, ya sea por agotamiento, neutralización, reducción, eliminación, reprogramación o silenciamiento de las células iniciadoras de tumores o por modificación de la morfología de las células tumorales (por ejemplo, diferenciación inducida, alteración del nicho), a su vez permite el tratamiento más efectivo de trastornos asociados con SEZ6 mediante la inhibición de la tumorigénesis, el mantenimiento, la expansión y/o la metástasis y la recidiva tumoral.
[0018] Además de la asociación mencionada anteriormente con células madre cancerosas, existen pruebas de que las isoformas de SEZ6 pueden intervenir en el crecimiento, la recidiva o el potencial metastásico de tumores que comprenden características neuroendocrinas. A los efectos de la presente invención, este tipo de tumores comprenderán tumores neuroendocrinos y tumores pseudoendocrinos. La intervención en la proliferación de tales células tumorigénicas utilizando los moduladores de SEZ6 novedosos descritos en el presente documento puede mejorar o tratar de este modo un trastorno mediante más de un mecanismo (es decir, la reducción de las células iniciadoras de tumores y la alteración de la señalización de la vía oncogénica) para proporcionar efectos aditivos o sinérgicos. Otras realizaciones preferidas adicionales pueden aprovechar la internalización celular de SEZ6 de la superficie celular para proporcionar un agente anticanceroso mediado por un modulador. A este respecto, se apreciará
que la presente descripción no se limita a ningún mecanismo de acción particular sino que abarca el uso general de los moduladores descritos para tratar trastornos asociados con SEZ6 (incluidas diversas neoplasias).
[0019] Por lo tanto, en otros casos, la presente descripción comprenderá el uso de los moduladores descritos para tratar tumores que comprenden características neuroendocrinas en un sujeto que lo necesite. Por supuesto, se pueden utilizar los mismos moduladores para la profilaxis, el pronóstico, el diagnóstico, el teragnóstico, la inhibición o la terapia de mantenimiento de estos mismos tumores.
[0020] Otras facetas de la presente descripción aprovechan la capacidad de los moduladores descritos para alterar potencialmente las vías oncogénicas a la vez que silencian simultáneamente las células iniciadoras de tumores. Tales moduladores de SEZ6 multiactivos (por ejemplo, antagonistas de SEZ6) pueden resultar particularmente eficaces cuando se usan en combinación con agentes anticancerosos o agentes citorreductores que se emplean como estándar de atención médica. Por consiguiente, los casos preferidos de la presente descripción comprenden el uso de los moduladores descritos como agentes antimetastásicos para la terapia de mantenimiento después de tratamientos iniciales. Además, se pueden utilizar dos o más antagonistas de SEZ6 (por ejemplo, anticuerpos que se unen específicamente a dos epítopos discretos en SEZ6) combinados según las presentes enseñanzas. Además, como se analiza en cierto detalle más adelante, los moduladores de SEZ6 de la presente invención se pueden utilizar en un estado conjugado o no conjugado y, opcionalmente, como un agente sensibilizante, en combinación con una diversidad de agentes anticancerosos químicos o biológicos.
[0021] Por consiguiente, otro caso preferido de la presente descripción comprende un procedimiento de sensibilización de un tumor en un sujeto para su tratamiento con un agente anticanceroso que comprende la etapa de administrar un modulador de SEZ6 a dicho sujeto. Otros casos comprenden un procedimiento para reducir la metástasis o recidiva tumoral después de un tratamiento que comprende administrar un modulador de SEZ6 a un sujeto que lo necesite. En un aspecto particularmente preferido de la descripción, el modulador de SEZ6 dará como resultado específicamente una reducción de la frecuencia de las células iniciadoras de tumores como se determina utilizando un análisis de dilución limitante in vitro o in vivo.
[0022] Los casos más generalmente preferidos de la descripción comprenden un procedimiento para tratar un trastorno asociado con SEZ6 en un sujeto que lo necesite que comprende la etapa de administrar un modulador de SEZ6 al sujeto. En casos particularmente preferidos, el modulador de SEZ6 se asociará (por ejemplo, conjugará) con un agente anticanceroso. En otros casos adicionales, el modulador de SEZ6 se internalizará después de asociarse o unirse a SEZ6 en o cerca de la superficie de la célula. Además, los aspectos beneficiosos de la presente descripción, que incluyen cualquier alteración de las vías de señalización y beneficios colaterales, se pueden conseguir tanto si el tejido tumoral del sujeto presenta niveles elevados de SEZ6, como unos niveles reducidos o bajos de SEZ6 en comparación con el tejido adyacente normal. Los casos particularmente preferidos comprenderán el tratamiento de trastornos que presentan niveles elevados de SEZ6 en células tumorigénicas en comparación con el tejido normal o células no tumorigénicas.
[0023] En otro aspecto más, la presente descripción comprenderá un procedimiento para tratar a un sujeto que padece un trastorno neoplásico que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un modulador de SEZ6 internalizante. Los casos preferidos comprenderán la administración de moduladores de tipo anticuerpo internalizantes donde, en otros casos seleccionados, los moduladores de tipo anticuerpo internalizantes se conjugan o asocian con un agente citotóxico.
[0024] Otros casos se refieren a un procedimiento para tratar a un sujeto que padece un trastorno asociado con SEZ6 que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un modulador de SEZ6 supresor.
[0025] En otro caso adicional, la presente descripción proporciona procedimientos de terapia de mantenimiento, donde los efectores o moduladores descritos se administran durante un periodo después de un procedimiento inicial (por ejemplo, quimioterapia, radiación o cirugía) diseñado para eliminar al menos una porción de la masa tumoral. Dichos regímenes terapéuticos se pueden administrar durante un periodo de semanas, un periodo de meses o incluso un periodo de años, durante el cual los moduladores de SEZ6 pueden actuar profilácticamente para inhibir la metástasis y/o recidiva tumoral. En otros casos adicionales, los moduladores descritos se pueden administrar de forma concertada con regímenes citorreductores conocidos para prevenir o retardar la metástasis, el mantenimiento o la recidiva tumoral.
[0026] Además, se apreciará que los moduladores de SEZ6 de la presente descripción se pueden generar y/o seleccionar para que reaccionen con una o más isoformas de SEZ6 o con una única isoforma de la proteína o, por el contrario, pueden comprender un modulador de pan-SEZ6 que reaccione o se asocie con al menos un miembro de la familia s EZ6 adicional (por ejemplo, SEZ6L o SEZ6L2 e isoformas de los mismos) además de SEZ6. Más específicamente, como se describe en el presente documento, los moduladores preferidos, tales como anticuerpos, se pueden generar y seleccionar de modo que reaccionen con dominios (o epítopos en los mismos) que se presentan por SEZ6 únicamente o con dominios que están conservados al menos en cierto modo entre dos o más de los
miembros de la familia SEZ6.
[0027] En otros casos preferidos adicionales, los moduladores se asociarán o unirán a un epítopo, una porción, un motivo o un dominio específico de SEZ6. Como se analizará en cierto detalle a continuación, ambas isoformas de SEZ6 incorporan una región extracelular idéntica (véase la FIG. 1E) que comprende al menos un dominio N-terminal, dos dominios Sushi y CUB alternos, y tres repeticiones de dominio Sushi en tándem adicionales. Además, la proteína SEZ6 comprende un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático. Por consiguiente, en ciertos casos, los moduladores se unirán o asociarán con el dominio N-terminal de SEZ6 (es decir, los aminoácidos 1-335 de la proteína madura) o con un epítopo en el mismo. Otros aspectos de la presente descripción comprenden moduladores que se asocian o se unen a un epítopo específico situado en un dominio Sushi particular de SEZ6. A este respecto, el modulador particular se puede asociar o unir a un epítopo situado en el Dominio Sushi 1 (aminoácidos 336-395), Dominio Sushi 2 (aminoácidos 511-572), Dominio Sushi 3 (aminoácidos 690-748), Dominio Sushi 4 (aminoácidos 750 813) o Dominio Sushi 5 (aminoácidos 817-878). Otros aspectos de la presente descripción comprenden moduladores que se asocian o se unen a un epítopo específico situado en un dominio de tipo CUB particular de SEZ6. A este respecto, el modulador particular se puede asociar o unir a un epítopo situado en el Dominio CUB 1 (aminoácidos 397 508) o el Dominio CUB 2 (aminoácidos 574-685). Por supuesto, se apreciará que cada uno de los dominios mencionados anteriormente puede comprender más de un epítopo y se puede asociar con más de una sección.
[0028] En lo que respecta a las «secciones» de modulador o anticuerpo, se apreciará que el antígeno SEZ6 se puede analizar o mapear mediante la unión competitiva al anticuerpo utilizando técnicas reconocidas en la técnica para definir secciones específicas situadas a lo largo de la proteína. Como se analiza más detalladamente en el presente documento y se muestra en los Ejemplos 9 y 10 a continuación, se puede considerar que dos anticuerpos (uno de los cuales se puede denominar «anticuerpo de referencia», «anticuerpo delineante de secciones» o «anticuerpo delineante») están en la misma sección si compiten sustancialmente entre sí por la unión al antígeno diana. En dichos casos, los epítopos del anticuerpo en cuestión pueden ser idénticos, sustancialmente idénticos o lo suficientemente cercanos (ya sea en un sentido lineal donde están separados por unos pocos aminoácidos o conformacionalmente) de manera que la unión de ambos anticuerpos al antígeno esté inhibida o impedida estérica o electrostáticamente. Dichas secciones definidas se pueden asociar generalmente con ciertos dominios de SEZ6 (por ejemplo, el anticuerpo de referencia se unirá a un epítopo contenido en un dominio específico) aunque la correlación no es siempre precisa (por ejemplo, puede haber más de una sección en un dominio o la sección puede estar definida conformacionalmente y comprender más de un dominio). Se apreciará que los expertos en la técnica podrán determinar fácilmente la relación entre los dominios de SEZ6 y las secciones determinadas empíricamente.
[0029] En lo que respecta a la presente descripción, el análisis de la unión competitiva utilizando técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, ELISA, resonancia de plasmón superficial o interferometría de biocapa) definió al menos siete secciones diferentes, cada una de las cuales se comprobó que contenía múltiples moduladores de tipo anticuerpo. A los efectos de la presente descripción, las siete secciones se denominaron secciones A-F y sección U. Las secciones A-F son secciones únicas y los anticuerpos contenidos en cada una de estas secciones compiten entre sí por la unión a la proteína SEZ6. La sección U contiene anticuerpos que no compiten con los anticuerpos de las secciones A-F, pero que pueden competir entre sí por la unión. Por lo tanto, en casos seleccionados, la presente descripción comprenderá un modulador que reside en una sección seleccionada del grupo que consiste en la sección A, la sección B, la sección C, la sección D, la sección E, la sección F y la sección U. En otros casos, la presente descripción comprende un modulador que reside en una sección definida por un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo que consiste en SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10, SC17.11, SC17.14, SC17.15, SC17.16, SC17.17, SC17.18, SC17.19, SC17.22, SC17.24, SC17.27, SC17.28, SC17.29, SC17.30, SC17.32, SC17.34, SC17.35, SC17.36, SC17.38, SC17.39, SC17.40, SC17.41, SC17.42, SC17.45 SC17.46, SC17.47, SC17.49, SC17.50, SC17.53, SC17.54, SC17.56, SC17.57, SC17.59, SC17.61, SC17.63 SC17.71, SC17.72, SC17.74, SC17.76, SC17.77, SC17.79, SC17.81, SC17.82, SC17.84, SC17.85, SC17.87 SC17.89, SC17.90, SC17.91, SC17.93, SC17.95, SC17.97, SC17.99, SC17.102, SC17.114, SC17.115, SC17.120, SC17121, SC17.122, SC17.140, SC17.151, SC17.156, SC17.161, SC17.166, SC17.187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 y SC17.200. En otros casos adicionales, la descripción comprenderá moduladores de la sección A, moduladores de la sección B, moduladores de la sección C, moduladores de la sección D, moduladores de la sección E, moduladores de la sección F o moduladores de la sección U. Aún otros casos preferidos comprenderán un modulador de anticuerpo de referencia y cualquier anticuerpo que compita con el anticuerpo de referencia.
[0030] La expresión «competir» o «anticuerpo de competencia», cuando se utiliza en el contexto de los moduladores descritos, se refiere a la competición de unión entre anticuerpos según se determina con un ensayo donde un anticuerpo de referencia o un fragmento inmunológicamente funcional impide o inhibe sustancialmente (por ejemplo, más de un 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o un 90 %) la unión específica de un anticuerpo de ensayo a un antígeno común. Los procedimientos compatibles para determinar dicha competición comprenden técnicas conocidas en la técnica tales como, por ejemplo, interferometría de biocapa, resonancia de plasmón superficial, citometría de flujo, ELISA competitivo, etc.
[0031] En un caso seleccionado, la descripción comprende un modulador de pan-SEZ6 que se asocia con SEZ6 y al menos un miembro de la familia s EZ6 diferente (por ejemplo, SEZ6L o SEZ6L2). En otros casos
seleccionados, la descripción comprende un modulador de SEZ6 que se asocia inmunoespecíficamente con una o más isoformas de SEZ6 pero no se asociada inmunoespecíficamente con ningún otro miembro de la familia SEZ6. En otros casos adicionales, la presente descripción comprende un procedimiento para tratar a un sujeto que lo necesite que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de pan-SEZ6. Otros casos adicionales comprenden un procedimiento para tratar a un sujeto que lo necesite que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de SEZ6 que se asocia inmunoespecíficamente con una o más isoformas de SEZ6 pero que no se asocia inmunoespecíficamente con ningún otro miembro de la familia SEZ6.
[0032] Además de los usos terapéuticos analizados anteriormente, también se apreciará que los moduladores de la presente invención se pueden utilizar para detectar, diagnosticar o clasificar los trastornos relacionados con SEZ6 y, en particular, trastornos proliferativos. En algunos casos, el modulador se puede administrar al sujeto y detectar o monitorizar in vivo. Los expertos en la técnica apreciarán que dichos moduladores se pueden marcar o asociar con marcadores o indicadores como los que se describen más adelante, y se pueden detectar utilizando cualquiera de numerosas técnicas estándar (por ejemplo, MRI, escaneo CAT, escaneo PET, etc.).
[0033] Por lo tanto, en algunos casos, la descripción comprenderá un procedimiento para diagnosticar, detectar o monitorizar un trastorno asociado con SEZ6 in vivo en un sujeto que lo necesite que comprende la etapa de administrar un modulador de SEZ6.
[0034] En otros casos, los moduladores se pueden utilizar en un contexto de diagnóstico in vitro utilizando procedimientos reconocidos en la técnica. En este sentido, un caso preferido comprende un procedimiento para diagnosticar un trastorno proliferativo en un sujeto que lo necesite que comprende las etapas de:
a. obtener una muestra de tejido de dicho sujeto;
b. poner en contacto la muestra de tejido con al menos un modulador de SEZ6; y
c. detectar o cuantificar el modulador de SEZ6 asociado con la muestra.
[0035] Dichos procedimientos se pueden apreciar fácilmente junto con la presente solicitud y se pueden realizar fácilmente utilizando la tecnología comercial generalmente disponible tal como lectores de placas automáticos, sistemas indicadores específicos, etc. En casos seleccionados, el modulador de SEZ6 se asociará con las células perpetuantes de tumores presentes en la muestra. En otros casos preferidos, la etapa de detección o cuantificación comprenderá una reducción de la frecuencia de las células iniciadoras de tumores y la detección de la misma. Además, se puede realizar un análisis de dilución limitante según se ha mencionado previamente, el cual empleará preferentemente el uso del modelo estadístico de la distribución de Poisson con el fin de proporcionar un recuento preciso para la reducción de la frecuencia.
[0036] Del mismo modo, la presente descripción también proporciona kits o dispositivos y procedimientos asociados que son útiles en el diagnóstico y la monitorización de trastornos asociados con SEZ6 tales como el cáncer. Con este fin, la presente descripción proporciona preferentemente un artículo de fabricación útil para diagnosticar o tratar trastornos asociados con SEZ6 que comprende un receptáculo que comprende un modulador de SEZ6 y materiales instructivos para utilizar el modulador de SEZ6 para tratar o diagnosticar el trastorno asociado con SEZ6. En casos seleccionados, los dispositivos y los procedimientos asociados comprenderán la etapa de establecer contacto con al menos una célula tumoral circulante.
[0037] Otros casos preferidos de la descripción también aprovechan las propiedades de los moduladores descritos como un instrumento útil para identificar, caracterizar, aislar, seccionar o enriquecer poblaciones o subpoblaciones de células iniciadoras de tumores a través de procedimientos tales como el análisis por citometría de flujo, incluida la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o el seccionamiento mediado por láser.
[0038] En este sentido, otro caso preferido de la presente descripción se refiere a un procedimiento para identificar, aislar, seccionar o enriquecer una población de células iniciadoras de tumores que comprende el paso de poner en contacto las células iniciadoras de tumores con un modulador de SEZ6.
[0039] Lo anterior es un resumen y, por lo tanto, contiene necesariamente simplificaciones, generalizaciones y omisiones de detalles; por consiguiente, los expertos en la técnica apreciarán que el resumen es únicamente ilustrativo y no se pretende que sea limitante de ningún modo. Otros aspectos, características y ventajas de los procedimientos, las composiciones y/o los dispositivos y/u otra materia objeto que se describen en el presente documento serán evidentes en vista de las enseñanzas que se exponen en el presente documento. El resumen se proporciona para introducir una selección de conceptos de una forma simplificada, que se describen más detalladamente a continuación en la Descripción detallada. No se pretende que este resumen identifique características clave ni características esenciales de la materia objeto reivindicada, ni tampoco se pretende que se utilice como herramienta para determinar el alcance de la materia objeto reivindicada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
[0040]
Las FIGS. 1A-1E son diversas representaciones de SEZ6 que incluyen secuencias de ácido nucleico o aminoácidos que pertenecen a los moduladores de SEZ6 descritos en el presente documento. Las FIGS. 1A y 1B (SEQ ID NO: 1 y 2) representan la secuencia de ARNm de longitud completa que contiene los marcos de lectura abiertos (ORF) (subrayados) que codifican las variantes de SEZ6 1 y 2, respectivamente. Las FIGS. 1C y 1D (SEQ ID NO: 3 y 4) proporcionan las secuencias de aminoácidos correspondientes de los ORF indicados en las FIGS. 1A y 1B, respectivamente, donde los residuos aminoacídicos subrayados con una línea indican el dominio de expansión transmembrana predicho para cada isoforma de proteína y los residuos aminoacídicos doblemente subrayados indican el péptido señal; la FIG. 1E representa el alineamiento de las dos isoformas de proteína (SEQ ID NO: 3 y 4) para ilustrar las diferencias de secuencia en los extremos citoplasmáticos de cada isoforma, donde los residuos subrayados indican las diferencias entre las dos secuencias; y la FIG. 1F proporciona una representación esquemática de la región extracelular de la proteína SEZ6 que ilustra las posiciones de los diferentes dominios.
Las FIGS. 2A-2C proporcionan una representación en forma de tabla del porcentaje de identidad a nivel proteico entre la isoforma de SEZ6 más similar a la humana y las proteínas SEZ6 de mono rhesus, cinomolgo, ratón o rata (FIG. 2A); una enumeración en forma de tabla de diversos códigos de acceso de secuencias de ADNc o proteicas para cada una de las isoformas informadas de la familia de genes SEZ6 (FIG. 2B); y el porcentaje de identidad a nivel proteico entre las isoformas más largas de las proteínas SEZ6, SEZ6L y SEZ6L2 humanas (FIG. 2C).
Las FIGS. 3A-3C proporcionan diversas representaciones de secuencias de ácido nucleico o aminoácidos relacionadas con la producción de inmunógenos o las líneas celulares que se utilizan para generar o caracterizar los moduladores de SEZ6 descritos en el presente documento. Para SEZ6 humana, se construyó un clon de ADNc específico (FIG. 3A; SEQ ID NO: 5) que codificaba la proteína SEZ6 humana madura completa (FIG. 3B; SEQ ID NO: 6) a partir de un clon de ADNc comercial (BC146292; SEQ ID NO: 7) con diferencias conocidas (FIG. 3C) procedente de una secuencia de referencia de una base de datos, NP_849191 (SEQ ID NO: 3), para la proteína SEZ6.
Las FIGS. 4A y 4B proporcionan un ADNc (FIG. 4A; SEQ ID NO: 8) utilizado para expresar una construcción de Fc-SEZ6 en células CHO-S y obtener un inmunógeno proteico (FIG. 4B; SEQ ID NO: 9), que comprende el ECD de SEZ6 humana fusionado con un dominio Fc de IgG2 humana, donde las secuencias subrayadas corresponden al dominio Fc de IgG2 humana, las secuencias subrayadas con dos líneas corresponden al péptido señal de IgK, y los aminoácidos en negrita corresponden a los residuos proporcionados por los sitios de restricción utilizados para clonar el fragmento hSCRx17.
Las FIGS. 5A - 5J proporcionan diversas representaciones de las secuencias de ácido nucleico o aminoácidos relacionadas con la producción de los inmunógenos o las líneas celulares que se utilizan para generar o caracterizar los moduladores de SEZ6 descritos en el presente documento, donde las secuencias subrayadas indican el ECD de la proteína para el miembro de la familia SEZ6 o SEZ6 específico que se esté ilustrando, y las figuras comprenden las secuencias de ADNc para las construcciones que codifican la proteína SEZ6 murina madura (FIG. 5A, SEQ ID NO: 10), SEZ6 de rata madura (FIG. 5C, SEQ ID NO: 12), SEZ6 de cinomolgo maduro (FIG. 5E, SEQ ID NO: 14), ECD maduro de la proteína SEz6l humana (FIG. 5G, SeQ ID NO: 16), o el ECD maduro de la proteína SEZ6L2 humana (FIG. 5I, SEQ ID NO: 18), o las proteínas correspondientes codificadas por estas construcciones de ADNc, concretamente, SEZ6 murina madura (FIG. 5B, SEQ ID NO: 11), SEZ6 de rata madura (FIG. 5D, SEQ ID NO: 13), SEZ6 de cinomolgo madura (FIG. 5F, SEQ ID NO: 15), ECD maduro de la proteína SEZ6L humana (FIG. 5H, SEQ iD NO: 17), o el ECD maduro de la proteína SEZ6L2 humana (FIG. 5J, SEQ ID NO: 19).
Las FIGS. 6A y 6B son representaciones de los niveles de expresión del ARNm de varios genes según se evaluaron utilizando la secuenciación del transcriptoma completo (SOLiD) de ARNm derivado de subpoblaciones de células tumorales o tejidos normales. La FIG. 6A es una representación en forma de tabla de genes asociados con tumores que tienen características neuroendocrinas; y la FlG. 6B es una representación gráfica de la expresión de ARNm de SEZ6 en tejidos normales y en varios tumores de xenoinjerto no tradicionales (NTX) derivados de cánceres de pulmón. Las FIGS. 7A-7F representan los niveles de expresión de ARNm analizados utilizando una micromatriz. La FlG. 7A es una representación gráfica de una agrupación no supervisada de perfiles de micromatrices para 46 líneas tumorales y dos tejidos normales; las FIGS. 7B y 7C son representaciones en forma de tabla de los valores de intensidad normalizados correspondientes a los niveles de expresión relativa de genes seleccionados relacionados con fenotipos neuroendocrinos (FlG. 7B) o la vía de señalización Notch (FlG. 7C), donde las celdas sin sombreado y los números relativamente bajos indican una expresión escasa o nula, y las celdas más oscuras y los números relativamente mayores indican niveles de expresión más elevados; la FlG. 7d es una representación gráfica que muestra los niveles de expresión relativa del ARNm de HES6 en diversos tumores y tejidos de control según se midieron utilizando qRT-PCR; la FlG. 7E es una representación en forma de tabla de los valores de intensidad normalizados correspondientes a los niveles de expresión relativa de genes seleccionados que indican neurogénesis, compromiso neural o diferenciación hacia los destinos neurales, donde las celdas sin sombreado indican una expresión escasa o nula y las celdas más oscuras indican unos niveles de expresión más elevados; y la FlG. 7F es una representación gráfica de los valores de intensidad normalizados correspondientes a la expresión relativa de SEZ6 en varias líneas tumorales de NTX.
Las FIGS. 8A y 8B son representaciones gráficas que muestran los niveles de expresión relativa de los transcritos de ARNm de SEZ6 según se midieron por RT-PCR en una serie de muestras de ARN aisladas de tejidos normales o tumores NTX de constitución neuroendocrina (FlG. 8A) y una diversidad de tumores NTX diferentes (FlG. 8B). Las FIGS. 9A y 9B son representaciones gráficas que muestran los niveles de expresión de ARNm absolutos (FlG.
9A) o normalizados (FlG. 9B) de SEZ6 humana según se midieron por RT-PCR en muestras de tumores enteros
(punto gris) o tejido adyacente normal de características similares (NAT; punto blanco) de pacientes con uno de entre dieciocho tipos diferentes de tumores sólidos.
Las FIGS. 10A y 10B proporcionan, en un formato de tabla, las secuencias de aminoácidos contiguas de las regiones variables de cadena ligera y pesada de una serie de moduladores de SEZ6 ejemplares humanizados y murinos aislados, clonados y modificados como se describe en los Ejemplos en el presente documento.
La FIG. 11 expone diversas características de moduladores ejemplares de la descripción. La FIG. 11A muestra las propiedades bioquímicas e inmunológicas de moduladores de SEZ6 ejemplares, representadas en un formato de tabla; y la FIG. 11B proporciona una correlación entre el dominio al que se une el anticuerpo y la eficacia del anticuerpo en un ensayo de destrucción in vitro.
Las FIGS. 12A y 12B muestran la detección de la expresión de SEZ6. La FIG. 12A muestra la expresión de SEZ6 en células HEK-293T modificadas para que sobreexpresen la proteína SEZ6 humana (h293T-HuSEZ6) utilizando el anticuerpo anti-SEZ6 SC17.33; la FIG. 12B muestra la expresión proteica relativa de SEZ6 humana en diversos lisados de tumor NTX y de tejidos normales según se midieron utilizando un ensayo electroquimioluminiscente.
Las FIGS. 13A y 13B muestran la detección por citometría de flujo de la expresión de la proteína SEZ6 en células de tumores NTX utilizando diversos anticuerpos anti-SEZ6 (FIG. 13a ); mientras que la FIG. 13B muestra la expresión mejorada de la proteína SEZ6 en CSC en comparación con subpoblaciones de NTG utilizando diversos anticuerpos anti-SEZ6 (FIG. 13B).
Las FIGS. 14A y 14B muestran que las CSC que expresan SEZ6 presentan una tumorigenicidad mejorada en comparación con las CSC que no expresan SEZ6. La FIG. 14A es una gráfica de contorno que muestra la clasificación celular según FACS de las células en un tumor pulmonar (LU37) en función de la expresión de CD324 (un marcador de CSC) y SEZ6; la FIG. 14B es una representación gráfica del crecimiento de células tumorales que son o bien CD324+SEZ6+ (círculos negros) o CD324+SEZ6-(círculos blancos) tras implantarlas en ratones inmunodeprimidos. Las células tumorales que expresan tanto CD324 como SEZ6 exhiben una tumorigenicidad mejorada.
Las FIGS. 15A y 15B proporcionan, respectivamente, una representación en forma de tabla y gráfica que ilustra que los moduladores descritos se pueden utilizar de manera eficaz como restos de direccionamiento para dirigir cargas útiles citotóxicas hacia células que han sido modificadas para que expresen SEZ6 (FIG. 15A) y hacia tumores pulmonares NTX (LU80, LU37 y LU100) desarrollados in vitro (FIG. 15B), donde la reducción de las unidades de luminiscencia relativas normalizadas (RLU) indica la destrucción de las células a través de la internalización de la toxina saporina.
La FIG. 16 es una representación tabular de los resultados inmunohistoquímicos que muestra la expresión de SEZ6 en diversos tumores NTX.
Las FIGS. 17A y 17B representan la capacidad de los anticuerpos anti-SEZ6 de ratón conjugados para retardar el crecimiento in vitro e in vivo de células de tumores NTX. La FIG. 17A muestra los resultados de un ensayo de destrucción in vitro utilizando ADC anti-SEZ6 en células HEK293 que sobreexpresan SEZ6; mientras que la FIG. 17B muestra el efecto de ADC anti-SEZ6 sobre el crecimiento in vivo de tumores SCLC (LU86) y LCNEC (Lu50).
Las FIGS. 18A y 18B representan la capacidad de anticuerpos anti-SEZ6 humanizados conjugados para retardar el crecimiento in vivo de cuatro tumores SCLC (LU80, LU64, LU111 y LU117) y conseguir una remisión duradera en ratones inmunodeprimidos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
I. Introducción
[0041] A pesar de que la presente invención se pueda realizar de muchas formas diferentes, en el presente documento se describen realizaciones ilustrativas específicas de la misma que ilustran los principios de la invención. Cabe destacar que la presente invención no se limita a los casos específicos ilustrados. Además, todos los títulos de las secciones utilizados en el presente documento tienen carácter únicamente organizativo y no se deben interpretar como limitantes de la materia objeto descrita. Por último, a los efectos de la presente descripción, todos los números de acceso identificativos de secuencia se pueden encontrar en la base de datos de secuencias de referencia (RefSeq) del NCBI y/o la base de datos de archivo de secuencias GenBank® del NCBI, a menos que se indique lo contrario.
[0042] Como se ha mencionado previamente, se ha descubierto sorprendentemente que la expresión de SEZ6 está asociada con trastornos de crecimiento neoplásico y proliferativos, particularmente en el caso de tumores con características neuroendocrinas, y que SEZ6 y sus variantes o isoformas del mismo proporcionan marcadores tumorales útiles que pueden aprovecharse en el tratamiento de enfermedades relacionadas. Además, como se muestra en la presente solicitud, se ha descubierto inesperadamente que los marcadores o determinantes de SEZ6, tales como la proteína SEZ6 de la superficie celular, están asociados con las células madre cancerosas (también conocidas como células perpetuantes de tumores) y pueden aprovecharse de forma eficaz para conseguir la eliminación o el silenciamiento de las mismas. La capacidad para reducir o eliminar de forma selectiva las células madre cancerosas (por ejemplo, mediante el uso de moduladores de SEZ6 conjugados) es particularmente sorprendente ya que existe constancia de que estas células son generalmente resistentes a muchos tratamientos convencionales. Es decir, la eficacia de los procedimientos de tratamiento dirigidos tradicionales, así como también de los más recientes, se ve limitada a menudo por la existencia y/o la emergencia de células madre cancerosas resistentes que son capaces de perpetuar el cáncer incluso ante estos diferentes procedimientos de tratamiento. Además, los determinantes asociados con las células madre cancerosas suelen ser malas dianas terapéuticas debido
a que su expresión es baja o inestable, a que no se mantienen asociados con la célula tumorigénica o a que no están presentes en la superficie celular. En contraste drástico con las enseñanzas de la técnica anterior, los compuestos y procedimientos descritos en el presente documento superan de forma eficaz esta resistencia inherente para eliminar, agotar, silenciar o propiciar específicamente la diferenciación de estas células madre cancerosas, y de este modo anulan su capacidad para soportar o reinducir el crecimiento tumoral subyacente.
[0043] Más específicamente, se ha descubierto que los moduladores de SEZ6, tales como los que se describen en el presente documento, se pueden utilizar de forma conveniente en el pronóstico, el diagnóstico, el teragnóstico, el tratamiento o la prevención de trastornos proliferativos (por ejemplo, trastornos neoplásicos) en sujetos que lo necesiten. Por consiguiente, aunque a continuación se expondrán detalladamente los casos preferidos de la descripción, particularmente en términos de dominios, regiones o epítopos particulares, o en el contexto de células madre cancerosas o tumores que comprenden características neuroendocrinas y sus interacciones con los moduladores descritos, los expertos en la técnica apreciarán que el alcance de la presente descripción no se limita a dichos casos ejemplares. En cambio, los casos más extensos de la presente descripción y las reivindicaciones adjuntas se refieren de forma expresa y amplia a moduladores de SEZ6 (incluidos los moduladores conjugados) y su uso en el pronóstico, el diagnóstico, el teragnóstico, el tratamiento o la prevención de diversos trastornos mediados por SEZ6 o asociados con este, que incluyen trastornos proliferativos o neoplásicos, independientemente de cualquier mecanismo particular de acción o del componente molecular o celular, o tumor al que se dirijan específicamente.
[0044] Con tal fin y tal como se demuestra en la presente solicitud, se ha descubierto inesperadamente que los moduladores de SEZ6 descritos se pueden utilizar de forma eficaz para atacar y eliminar o incapacitar de algún otro modo células proliferativas o tumorigénicas y para tratar trastornos asociados con SEZ6 (por ejemplo, neoplasias). Como se usa en el presente documento, un «trastorno asociado con SEZ6» se refiere a cualquier trastorno o enfermedad (incluidos los trastornos proliferativos) que se marque, diagnostique, detecte o identifique por una aberración fenotípica o genotípica de los componentes genéticos de SEZ6 o su expresión durante el transcurso o la etiología de la enfermedad o trastorno. A este respecto, un determinante o una aberración fenotípica de SEZ6 puede comprender, por ejemplo, niveles elevados o reducidos de expresión de la proteína SEZ6, una expresión anómala de la proteína SEZ6 en ciertas poblaciones de células definibles o una expresión anómala de la proteína SEZ6 en una fase o etapa inadecuada de un ciclo vital celular. Obviamente, se apreciará que también se pueden utilizar patrones de expresión similares de determinantes genotípicos (por ejemplo, niveles de transcripción de ARNm) de SEZ6 para clasificar o detectar trastornos asociados con s EZ6.
[0045] Como se usan en el presente documento, los términos «determinante» o «determinante de SEZ6» se referirán a cualquier rasgo, propiedad, marcador o factor detectable que esté asociado de forma identificable con una célula, una población de células o un tejido particular, o que se encuentre específicamente en o sobre estos, incluidos aquellos identificados en o sobre un tejido, una célula o una población de células afectados por una enfermedad o un trastorno asociado con SEZ6. En casos preferidos seleccionados, los moduladores de SEZ6 se pueden asociar, unir o hacer reaccionar directamente con el determinante de SEZ6 (por ejemplo, la proteína SEZ6 de la superficie celular o el ARNm de SEZ6) y de este modo mejoran el trastorno. Más generalmente, los determinantes pueden ser de naturaleza morfológica, funcional o bioquímica y pueden ser genotípicos o fenotípicos. En otros casos preferidos, el determinante es un componente genético o un antígeno de la superficie celular que se expresa (o no) diferencial o preferencialmente por unos tipos de células específicas (por ejemplo, células madre cancerosas) o por células en ciertas condiciones (por ejemplo, durante puntos específicos del ciclo celular o células en un nicho particular). En otros casos preferidos adicionales, el determinante puede comprender un gen o entidad genética que se regule (por aumento o disminución) de forma diferente en una célula o población de células discreta específica, un gen que se modifique diferencialmente respecto a su estructura física y composición química, o una proteína o colección de proteínas asociadas físicamente con un gen que presenten modificaciones químicas diferenciales. Los determinantes contemplados en el presente documento se consideran específicamente positivos o negativos, y pueden referirse a una célula, una subpoblación de células o un tejido (por ejemplo, tumores), por su presencia (positivos) o ausencia (negativos).
[0046] De manera similar, los «moduladores de SEZ6» de la descripción comprenden en un sentido amplio cualquier compuesto que reconozca, reaccione, compita, antagonice, interaccione, se una, agonice o se asocie con una variante o isoforma de SEZ6 (o dominios, regiones o epítopos específicos de estas) o su componente genético. Mediante estas interacciones, los moduladores de SEZ6 pueden eliminar, reducir o moderar de forma favorable la frecuencia, actividad, recidiva, metástasis o movilidad de células tumorigénicas (por ejemplo, células perpetuantes de tumores o células madre cancerosas). Los moduladores ejemplares descritos en el presente documento comprenden nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, péptidos o polipéptidos. En ciertos casos preferidos, los moduladores seleccionados comprenderán anticuerpos para una isoforma de la proteína SEZ6, o fragmentos inmunorreactivos o derivados de los mismos. Dichos anticuerpos pueden ser de naturaleza antagonista o agonista, y pueden estar opcionalmente conjugados o asociados con un agente terapéutico o de diagnóstico. Además, dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden comprender anticuerpos supresores, neutralizantes o internalizantes. En otros casos, los moduladores de la presente descripción constituirán una construcción de SEZ6 que comprenderá una isoforma de SEZ6 o un fragmento reactivo de la misma. Se apreciará que dichas construcciones pueden comprender proteínas de fusión y pueden incluir dominios reactivos de otros polipéptidos tales como inmunoglobulinas o
modificadores de la respuesta biológica. En otros aspectos adicionales, el modulador de SEZ6 comprenderá un resto de ácido nucleico (por ejemplo, miARN, ARNip, ARNhc, construcciones antisentido, etc.) que ejerce los efectos deseados a nivel genómico. Más adelante se analizarán detalladamente otros moduladores adicionales compatibles con las presentes enseñanzas.
[0047] Más generalmente, los moduladores de SEZ6 de la presente descripción comprenden en un sentido amplio cualquier compuesto que reconozca, reaccione, compita, antagonice, interaccione, se una, agonice o se asocie con un determinante (genotípico o fenotípico) de SEZ6, incluida la proteína SEZ6 de la superficie celular. Independientemente de la forma del modulador que se seleccione en última instancia, este se encontrará preferentemente en un estado aislado y purificado antes de introducirlo en un sujeto. A este respecto, los términos «modulador de SEZ6 aislado» o «anticuerpo de SEZ6 aislado» deben interpretarse en un sentido amplio y según la práctica farmacéutica estándar, se refiere a cualquier preparación o composición que comprenda el modulador en un estado sustancialmente exento de contaminantes (biológicos o de otro tipo) no deseados. Además, estos preparados se pueden purificar y formular, según se desee, utilizando diversas técnicas reconocidas en la técnica. Obviamente, se apreciará que tales preparaciones «aisladas» se pueden formular o combinar intencionalmente con principios activos o inertes, según se desee, para mejorar los aspectos comerciales, terapéuticos o de fabricación del producto acabado y proporcionar composiciones farmacéuticas. En un sentido más amplio, las mismas consideraciones generales se pueden aplicar a una isoforma o variante «aislada» de SEZ6, o a un ácido nucleico «aislado» que codifique la misma.
[0048] Además, se ha descubierto sorprendentemente que los moduladores que interaccionan, se asocian o se unen a dominios, motivos o epítopos de SEZ6 particulares son especialmente eficaces para eliminar células tumorigénicas y/o silenciar o atenuar los efectos de las células madre cancerosas sobre el crecimiento o la propagación del tumor. Es decir, a pesar de que los moduladores que reaccionan o se asocian con dominios que están próximos a la superficie celular (por ejemplo, uno de los dominios similares a CUB o Sushi) son eficaces para agotar o neutralizar las células tumorigénicas, se ha descubierto inesperadamente que los moduladores que se asocian o se unen a dominios, motivos o regiones que están relativamente más distantes de la superficie celular también son eficaces para eliminar, neutralizar, agotar o silenciar células tumorigénicas. Esto es especialmente cierto en el caso de los moduladores conjugados tales como, por ejemplo, conjugados de anticuerpo anti-SEZ6-fármaco que comprenden un agente citotóxico.
[0049] Aunque la presente descripción contempla expresamente el uso de cualquier modulador de SEZ6 en el tratamiento de cualquier trastorno asociado con SEZ6, que incluye cualquier tipo de neoplasia, en casos particularmente preferidos, los moduladores descritos se pueden utilizar para prevenir, tratar o diagnosticar tumores que comprenden características (genotípicas o fenotípicas) neuroendocrinas, incluidos los tumores neuroendocrinos. Los «tumores neuroendocrinos canónicos» (NET) o verdaderos se originan en el sistema endocrino difuso y típicamente son muy agresivos. Los tumores neuroendocrinos aparecen en el riñón, aparato genitourinario (vejiga, próstata, ovario, cuello del útero y endometrio), tracto gastrointestinal (estómago, colon), tiroides (cáncer medular de tiroides) y pulmón (carcinoma de pulmón microcítico y carcinoma neuroendocrino de células grandes). Además, los moduladores descritos se pueden utilizar convenientemente para tratar, prevenir o diagnosticar tumores pseudoneuroendocrinos (pNET) que genotípica o fenotípicamente imitan, comprenden, se asemejan o presentan rasgos comunes respecto a los tumores neuroendocrinos canónicos. Los «tumores pseudoneuroendocrinos» son tumores que se originan a partir de células del sistema neuroendocrino difuso o a partir de células donde se ha reactivado de forma aberrante una cascada de diferenciación neuroendocrina durante el proceso oncogénico. Tales pNET normalmente comparten ciertas características genotípicas, fenotípicas o bioquímicas con tumores neuroendocrinos definidos tradicionalmente, que incluyen la capacidad para producir subconjuntos de aminas, neurotransmisores y hormonas peptídicas biológicamente activos. Por consiguiente, a los efectos de la presente invención, se entenderá que las frases «tumores que comprenden características neuroendocrinas» o «tumores que presentan características neuroendocrinas» comprenden tanto tumores neuroendocrinos como tumores pseudoneuroendocrinos a menos que el contexto dicte lo contrario.
[0050] Aparte de la asociación con tumores analizada de forma general anteriormente, también existen indicios de la asociación fenotípica o genotípica entre células iniciadoras de tumores (TIC) y determinantes de SEZ6. A este respecto, ciertas TIC seleccionadas (por ejemplo, células madre cancerosas) pueden expresar niveles elevados de proteínas SEZ6 cuando se comparan con tejido normal y células no tumorigénicas (NTG), que juntas constituyen normalmente la mayor parte de un tumor sólido. Por lo tanto, los determinantes de SEZ6 pueden comprender un marcador (o antígeno o inmunógeno) asociado con un tumor, y los moduladores descritos pueden proporcionar agentes eficaces para detectar y suprimir TIC y neoplasias asociadas debido a unos niveles alterados de las proteínas en las superficies celulares o en el microentorno del tumor. Por consiguiente, los moduladores de SEZ6, incluidos los antagonistas y anticuerpos inmunorreactivos que se asocian, unen o reaccionan con las proteínas, pueden reducir de forma eficaz la frecuencia de las células iniciadoras de tumores, y podrían ser útiles para eliminar, agotar, incapacitar, reducir, promover la diferenciación de estas células iniciadoras de tumores o para impedir o limitar de otro modo su capacidad para permanecer en estado latente y/o continuar fomentando el crecimiento, la metástasis o la recidiva del tumor en un paciente. A este respecto, los expertos en la técnica apreciarán que la presente descripción proporciona además moduladores de SEZ6 y su uso para reducir la frecuencia de las células iniciadoras de tumores.
II. Fisiología de SEZ6
[0051] SEZ6 (que también se conoce como homólogo 6 relacionado con las convulsiones) es una proteína transmembrana de tipo I que se clonó originariamente a partir de células derivadas de la corteza cerebral de ratón tratadas con el agente convulsivo pentilentetrazol (Shimizu-Nishikawa, 1995; PMID: 7723619). Los ortólogos proteicos de SEZ6 representativos incluyen, pero sin limitación, los de ser humano (NP_849191; NP_001092105), chimpancé (XP_511368, NP_001139913), ratón (NP_067261), y rata (NP_001099224). En los seres humanos, el gen SEZ6 consiste en 17 exones con una extensión de 51,1 kBp situados en el cromosoma 17q11.2. Los sitios aceptores de corte y empalme alterno separados por tan solo 16 pares de bases dentro del último exón originan dos transcritos procesados, uno de aproximadamente 4210 bases (NM_178860; FIG. 1A) y otro de aproximadamente 4194 bases (NM_001098635, FIG. 1B). El primer transcrito codifica una proteína de 994 aminoácidos (NP_849191; FIG. 1C), mientras que el último codifica una proteína de 993 aminoácidos (NP_001092105; FIG. 1D). Estas dos isoformas proteicas de SEZ6 comparten una identidad de un 100 % a lo largo de sus dominios extracelulares y sus dominios transmembrana, diferenciándose únicamente en los diez últimos residuos aminoacídicos (FIG. 1E). Se ha descrito que una tercera variante de corte y empalme genera una forma secretada de SEZ6 (Shimizu-Nishikawa, 1995; PMID: 7723619), sin embargo, esta no se ha incluido en las RefSeqs asociadas que se encuentran en la entrada de la página de genes en la base de datos del NCBI. Los moduladores de la descripción se pueden unir a cualquiera de las variantes de corte y empalme.
[0052] Se desconoce la relevancia biológica de las isoformas, a pesar de que un estudio ha sugerido acciones opuestas para la membrana frente a las proteínas solubles cuando se restablece su expresión en las neuronas de ratones con SEZ6 de murino desactivado (Gunnersen y col. 2007, PMID: 18031681). La identidad de la secuencia proteica entre especies para proteínas SEZ6 se enumera en la FIG. 2A. En el genoma humano, existen dos genes estrechamente relacionados: el de tipo homólogo 6 relacionado con las convulsiones (SEZ6L) y el de tipo homólogo 6 relacionado con las convulsiones 2 (SEZ6L2), cada uno de los cuales presenta múltiples variantes de corte y empalme que codifican numerosas isoformas (FIG. 2B). Los porcentajes de identidad para la proteína más larga de cada uno de los miembros de esta familia de proteínas de tipo SEZ6 en seres humanos se muestran en la FIG. 2C. En conjunto, SEZ6, SEZ6L y SEZ6L2, incluidas sus diversas isoformas, se denominarán la familia SEZ6 a los efectos de la presente solicitud. Los moduladores de SEZ6 de la descripción comprenden moduladores que son específicos para cada uno de SEZ6, SEZ6L o SEZ6L2. Como alternativa, los moduladores de la descripción pueden reaccionar de forma cruzada con SEZ6 y uno o ambos de entre SEZ6L y/o SEZ6L2.
[0053] La proteína SEZ6 madura está compuesta por una serie de dominios estructurales: un dominio citoplasmático, un dominio transmembrana y un dominio extracelular que comprende un único dominio N-terminal, seguido de dos dominios de tipo Sushi y CUB alternos, y tres repeticiones de dominio Sushi en tándem adicionales. Existen dos isoformas del antígeno SEZ6 y difieren únicamente en el extremo carboxiterminal, dominio citoplasmático.
[0054] La FIG. 1F proporciona un diagrama esquemático de la región extracelular de la proteína SEZ6, que ilustra la yuxtaposición general de los dominios Sushi y CUB, y el dominio N-terminal. Generalmente, los dominios se reconocen como los que aparecen en aproximadamente los residuos de aminoácidos 336-395 (Dominio Sushi 1), 397 508 (Dominio CUB 1 ), 511-572 (Dominio Sushi 2), 574-685 (Dominio CUB 2), 690-748 (Dominio Sushi 3), 750-813 (Dominio Sushi 4), 817-878 (Dominio Sushi 5), con el dominio N-terminal en aproximadamente los residuos aminoacídicos 1-335 y una preferencia composicional de residuos ricos en prolina en aproximadamente los residuos aminoacídicos 71-169.
[0055] Las repeticiones Sushi son similares a las repeticiones consenso cortas que se encuentran en otras proteínas reguladoras del complemento humano (es decir, los sitios de unión C3b/C4b del complemento). Los dominios de tipo CUB son dominios que se asemejan a CUB y que se encuentran en otras proteínas de unión al complemento de mamíferos, los cuales se asocian con una amplia gama de proteínas que participan en numerosos procesos biológicos diferentes de la activación del complemento, que incluyen, sin carácter limitante, el moldeo, la guía de axones, la inflamación y la supresión de tumores (Bork y Beckman, 1993, PMID: 8510165). Tanto los dominios Sushi como CUB implican una función para SEZ6 que implica la unión de otras proteínas extracelularmente. Las proteínas que contienen dominios CUB también se han relacionado con las vías de señalización celular y, de forma coherente con esta función, los dominios citoplasmáticos C-terminales de SEZ6 contienen el motivo Asn-Pro-Thr-Tyr (SEQ ID NO: 403), que representa una potencial diana para la fosforilación por parte de los miembros de la familia de tirosina-cinasas Src. De ser verdad, vincularía SEZ6 con una vía de transducción de señales celulares que conduciría a la activación de Ras, lo cual sugeriría que SEZ6 puede ser un receptor neurotrófico.
[0056] Cabe destacar que los términos «proteína madura» o «polipéptido maduro», como se usan en el presente documento, se refieren a la forma o las formas de la proteína SEZ6 producidas sin el péptido señal de 19 aminoácidos que puede escindirse antes de la expresión en la superficie celular. A menos que se indique de otro modo, la numeración de los aminoácidos de SEZ6 (para los dominios, las regiones, los epítopos, etc.) se realizará en el contexto de una proteína madura sin el líder.
[0057] SEZ6 se puede detectar por RT-PCR en niveles bajos en el riñón, el hígado, el corazón, el pulmón y el timo de roedores, aunque se ha observado una fuerte expresión de la proteína únicamente en el cerebro, con un nivel significativo expresado en los testículos (Herbst y Nicklin, 1997, PMID: 9073173). Utilizando suero policlonal para SEZ6, la expresión de la proteína se detectó el día 13 del desarrollo del prosencéfalo de ratón. Se detectó una tinción fuerte en las neuronas posmitóticas en estado de maduración de la placa y subplaca cortical en estado de desarrollo. Esta tinción es menor en el cerebro adulto, donde la expresión de SEZ6 se puede detectar en otras regiones del cerebro asociadas con la plasticidad morfológica en curso, tales como el hipocampo, el cerebelo y el bulbo olfatorio, así como en neuronas de la retina y la médula espinal (Gunnersen y col., 2007, PMID: 18031681). Las señales más densas se encuentran en las regiones con una mayor concentración de cuerpos de células neuronales. A pesar de la expresión generalizada de SEZ6 en la retina, la función retinal no se vio afectada en ausencia de SEZ6 (Gunnersen y col., 2009, PMID: 19662096). El patrón de tinción de SEZ6 está estrechamente ligado a la emergencia del hipocampo y las capas neocorticales, e implica una función específica del prosencéfalo para este gen durante el desarrollo. Se ha descubierto que, en seres humanos y ratones, SEZ6 se expresa de forma diferencial en regiones altamente específicas del neocórtex (Gunnersen y col., 2007, anteriormente).
[0058] Las mutaciones en el gen SEZ6 humano se han relacionado con convulsiones febriles (FS), una convulsión asociada con un aumento de la temperatura corporal y que representa el tipo más habitual de convulsión en la infancia (Yu y col., 2007, PMID:17086543). Las FS se pueden clasificar como simples o complejas, dependiendo de su duración, recidiva y de la extensión del cuerpo afectada por la convulsión. En un cohorte chino, no se encontraron mutaciones de SEZ6 en 15 controles sanos, pero se encontraron mutaciones en 21 de 60 pacientes con FS, siendo el tipo más habitual de mutación una inserción heterocigota de citosina (mutación de desplazamiento del marco) en la posición 1435 del ADNc. La incidencia de la mutación fue significativamente más elevada en pacientes con FS complejas y en pacientes con un historial familiar positivo. Debido a que existe una probabilidad de un 80 % de que los niños con FS complejas padezcan convulsiones en el futuro, los autores sugieren que el hecho de realizar un cribado para detectar mutaciones en SEZ6 podría resultar valioso para predecir la recidiva de FS o el desarrollo de epilepsia (Yu y col., 2007, anteriormente). Estudios posteriores han cuestionado la incidencia, la relevancia y la capacidad de este estudio de tener un poder adecuado que implique la causalidad, pero sí que respaldan el hecho de que SEZ6 podría ser un gen entre muchos que desempeñe una función en trastornos relacionados con convulsiones (Mulley y col., 2011, PMID: 21785725).
[0059] Se siguen desconociendo las funciones moleculares específicas de SEZ6. Según se ha analizado anteriormente, el análisis de los módulos estructurales de la proteína identificados por homología y análisis de secuencias sugiere una posible función en la señalización, la comunicación entre células, y el desarrollo neural. La ramificación dendrítica neuronal y la conectividad que forman las redes de señalización que constituyen el circuito del cerebro se originan y especifican por la acción de programas moleculares intrínsecos en la célula neural, así como también por señales extrínsecas. El proceso de crecimiento dendrítico en neuronas piramidales, la neurona principal en el prosencéfalo de mamíferos, proporciona neuronas con morfologías distintivas, un cuerpo de célula piramidal y dos árboles dendríticos complejos distintos: uno que emerge a partir del ápice y el otro a partir de la base del cuerpo de la célula. Gunnersen y col. (2007, anteriormente) han demostrado que ratones que carecen de SEZ6 presentan un exceso de dendritas cortas en los árboles dendríticos de estas neuronas, aunque no presentan ningún aumento en el campo dendrítico global, que representa el intervalo de neuronas con el cual se conecta una neurona determinada. La restauración de la expresión de las isoformas de SEZ6 unidas a la membrana en las neuronas desactivadas provoca un efecto antirramificante. En ensayos de comportamiento, los ratones que carecen de SEZ6 presentan deficiencias cognitivas, motoras y exploratorias específicas. Estos datos sugieren que SEZ6 es importante para conseguir el equilibrio necesario entre la elongación y la ramificación de las dendritas durante la elaboración de un árbol dendrítico complejo durante el desarrollo.
[0060] Conjuntamente, los estudios anteriores sugieren encarecidamente que la proteína SEZ6 es importante en el contexto del desarrollo neural y es probable que desempeñe una función en la señalización y la comunicación entre células. En los tumores se observa habitualmente una reactivación inadecuada de las vías de señalización del desarrollo o un desequilibrio de las vías de señalización normales (Harris y col., 2012). Una colección de tumores que comparten características que indican una reactivación parcial de los programas de desarrollo son los tumores con fenotipos neuroendocrinos (Yao 2008; PMID: 18565894), donde se expresan y/o secretan diversos marcadores endocrinos y hormonas, y se expresan varios marcadores neurales que indican neurogénesis, compromiso neural o diferenciación hacia los destinos neurales. Los tumores con características neuroendocrinas se originan con poca frecuencia en una amplia gama de sitios primarios y, aunque su clasificación exhaustiva sigue siendo problemática (Yao; PMID: 18565894; Klimstra 2010; PMID: 20664470; Kloppel, 2011; PMID: 22005112), se pueden clasificar en cuatro tipos principales: carcinoides benignos de bajo grado, tumores neuroendocrinos bien diferenciados de bajo grado con comportamiento maligno, tumores con características neuroendocrinas y epiteliales mixtas, y carcinomas neuroendocrinos poco diferenciados de alto grado. Entre estas clasificaciones, los carcinomas neuroendocrinos poco diferenciados, que incluyen el carcinoma de pulmón microcítico (SCLC) y subconjuntos de cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC), son tipos de cáncer con un pronóstico desalentador. Se ha postulado que el SCLC es de origen broncogénico y se origina en parte a partir de células neuroendocrinas pulmonares (Galluzzo y Bocchetta, 2011; PMID: 21504320). Independientemente de la fuente celular de origen para estos tumores, es evidente que presentan un fenotipo endocrino poco diferenciado, a menudo son muy proliferativos y agresivos y frecuentemente sobreexpresan
proteínas neurales. El aumento resultante de marcadores de expresión neural en estos tumores, que se pueden restringir de otro modo principalmente al sistema nervioso o que pueden presentar una expresión limitada durante el desarrollo, entre los cuales SEZ6 puede ser un ejemplo, puede ofrecer, por lo tanto, una diana terapéutica única para tumores con el fenotipo neuroendocrino.
III. Células madre cancerosas
[0061] Como se ha indicado anteriormente, se ha descubierto sorprendentemente que la expresión de SEZ6 aberrante (genotípica y/o fenotípica) está asociada con diversas subpoblaciones de células tumorigénicas. A este respecto, la presente descripción proporciona moduladores de SEZ6 que pueden ser particularmente útiles para dirigirse a dichas células, y especialmente células perpetuantes de tumores, facilitando de este modo el tratamiento, la gestión o la prevención de trastornos neoplásicos. Por lo tanto, en casos preferidos, los moduladores de determinantes (fenotípicos o genotípicos) de SEZ6 se pueden utilizar ventajosamente para reducir la frecuencia de las células iniciadoras de tumores según las presentes enseñanzas y de este modo se facilita el tratamiento o la gestión de trastornos proliferativos.
[0062] A los efectos de la presente solicitud, los términos «célula iniciadora de tumores» (TIC) abarca tanto las «células perpetuantes de tumores» (TPC; es decir, células madre cancerosas o CSC) como las «células progenitoras tumorales» muy proliferativas (denominadas TProg), que juntas constituyen generalmente una subpoblación única (es decir, un 0,1-40 %) de una masa o volumen tumoral. A los efectos de la presente descripción, los términos «células perpetuantes de tumores» y «células madre cancerosas» o «células madre neoplásicas» son equivalentes y se pueden utilizar indistintamente en el presente documento. Las TPC se diferencian de las TProg en que las TPC pueden recapitular por completo la composición de células tumorales existentes en un tumor y tienen una capacidad de autorrenovación ilimitada tal como demuestra el trasplante en serie (dos o más pases a través de ratones) de números reducidos de células aisladas, mientras que las TProg no presentarán una capacidad de autorrenovación ilimitada.
[0063] Los expertos en la técnica apreciarán que la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) utilizando marcadores de la superficie celular adecuados es un procedimiento fiable para aislar subpoblaciones de células madre cancerosas muy enriquecidas (por ejemplo, >99,5 % de pureza) debido, al menos en parte, a su capacidad para diferenciar entre células individuales y grupos de células (es decir, dobletes, etc.). Utilizando dichas técnicas se ha demostrado que, cuando se trasplantan números reducidos de células TProg muy purificadas en ratones inmunodeprimidos, estas pueden estimular el crecimiento tumoral en el trasplante primario. Sin embargo, a diferencia de las subpoblaciones de TPC purificadas, los tumores generados por TProg no reflejan por completo el tumor parental donde respecta a su heterogeneidad celular fenotípica y se puede demostrar que no son eficaces para reiniciar la tumorigénesis en serie en trasplantes posteriores. En cambio, las subpoblaciones de TPC reconstituyen por completo la heterogeneidad celular de los tumores parentales y pueden iniciar tumores de forma eficaz cuando se aíslan y se trasplantan en serie. Por lo tanto, los expertos en la técnica reconocerán que una diferencia definitiva entre TPC y TProg, aunque ambos tipos de células puedan generar tumores en trasplantes primarios, es la capacidad única de TPC para estimular de forma perpetua un crecimiento tumoral heterogéneo tras un trasplante en serie con números reducidos de células. Otras estrategias habituales para caracterizar TPC incluyen la morfología y el examen de marcadores de la superficie celular, el perfil transcripcional y la respuesta a fármacos, a pesar de que la expresión de los marcadores puede variar dependiendo de las condiciones de cultivo y el pase de la línea celular in vitro.
[0064] Por consiguiente, a los efectos de la presente invención, las células perpetuantes de tumores, al igual que las células madre normales que respaldan las jerarquías celulares en los tejidos normales, están definidas preferentemente por su capacidad para autorrenovarse indefinidamente a la vez que mantienen la capacidad para la diferenciación de múltiples linajes. Por lo tanto, las células perpetuantes de tumores son capaces de generar tanto una progenie tumorigénica (es decir, células iniciadoras de tumores: TPC y TProg) como una progenie no tumorigénica (NTG). Como se usa en el presente documento, una «célula no tumorigénica» (NTG) se refiere a una célula tumoral que se origina a partir de células iniciadoras de tumores, pero que no es capaz de autorrenovarse o generar los linajes heterogéneos de células tumorales que constituyen un tumor. Experimentalmente, las células NTG son incapaces de formar tumores en ratones de forma reproducible, incluso cuando se trasplantan números excesivos de células.
[0065] Como se indica, TProg también se clasifican como células iniciadoras de tumores (o TIC) debido a su capacidad limitada para generar tumores en ratones. Las TProg son la progenie de TPC y típicamente son capaces de llevar a cabo un número finito de divisiones celulares que no son autorrenovadoras. Además, las células TProg se pueden dividir a su vez en células progenitoras tumorales tempranas (ETP) y células progenitoras tumorales tardías (LTP), cada una de las cuales se puede distinguir por el fenotipo (por ejemplo, marcadores de la superficie celular) y capacidades diferentes para recapitular la arquitectura celular tumoral. A pesar de que estas diferencias técnicas, tanto ETP como LTP se diferencian funcionalmente de TPC en que por lo general tienen una menor capacidad para reconstituir en serie tumores cuando se trasplantan números reducidos de células y normalmente no reflejan la heterogeneidad del tumor parental. Pese a las diferencias anteriores, también se ha observado que diversas poblaciones de TProg pueden, en raras ocasiones, adquirir la capacidad de autorrenovación atribuida normalmente a las células madre y convertirse ellas mismas en TPC (o CSC). En cualquier caso, es probable que ambos tipos de células iniciadoras de tumores estén representados en la masa tumoral típica de un único paciente y son susceptibles
de tratarse con los moduladores como se ha descrito en el presente documento. Es decir, las composiciones descritas generalmente son eficaces para reducir la frecuencia o alterar la quimiosensibilidad de tales células iniciadoras de tumores positivas para SEZ6 independientemente del caso particular o mezcla representada en un tumor.
[0066] En el contexto de la presente invención, las TPC son más tumorigénicas, relativamente más quiescentes y a menudo más quimiorresistentes que las células TProg (tanto ETP como LPT), NTG y las células no derivadas de TPC que se infiltran en los tumores (por ejemplo, fibroblastos/estroma, células endoteliales y hematopoyéticas) que constituyen el volumen de un tumor. Dado que las terapias y los regímenes convencionales han sido diseñados, en gran parte, para reducir el volumen tumoral y atacar rápidamente a las células proliferantes, es probable que las TPC sean más resistentes a las terapias y los regímenes convencionales que las TProg que proliferan más rápido y otras poblaciones de células constitutivas del tumor. Además, las TPC suelen expresar otras características que las hacen relativamente quimiorresistentes a las terapias convencionales, tales como una mayor expresión de transportadores resistentes a múltiples fármacos, unos mecanismos de reparación de ADN mejorados y proteínas antiapoptóticas. Estas propiedades, cada una de las cuales contribuye a la tolerancia a fármacos de TPC, constituyen una razón clave por la que los regímenes de tratamiento oncológico estándar fracasan a la hora de garantizar el beneficio a largo plazo para la mayoría de los pacientes con una neoplasia en estado avanzado; es decir, no consiguen atacar y erradicar de forma adecuada las células que estimulan el crecimiento tumoral continuado y la recidiva (es decir, TPC o CSC).
[0067] A diferencia de muchos tratamientos de la técnica anterior, las composiciones novedosas de la presente descripción reducen preferentemente la frecuencia de las células iniciadoras de tumores al administrarlas a un sujeto, independientemente de la forma o diana específica (por ejemplo, material genético, anticuerpo de SEZ6 o construcción de fusión del ligando) del modulador seleccionado. Como se ha indicado anteriormente, la reducción de la frecuencia de células iniciadoras de tumores puede ser el resultado de a) la eliminación, el agotamiento, la sensibilización, el silenciamiento o la inhibición de células iniciadoras de tumores; b) el control del crecimiento, la expansión o la recidiva de células iniciadoras de tumores; c) la interrupción de la iniciación, la propagación, el mantenimiento o la proliferación de células iniciadoras de tumores; o d) la alteración de cualquier otro modo de la supervivencia, la regeneración y/o la metástasis de las células tumorigénicas. En algunos casos, la reducción en la frecuencia de las células iniciadoras de tumores se produce como resultado de un cambio en una o más vías fisiológicas. El cambio en la vía, ya sea por reducción o eliminación de las células iniciadoras de tumores o por modificación de su potencial (por ejemplo, diferenciación inducida, alteración del nicho) o por otro tipo de interferencia en su capacidad para afectar al entorno tumoral u otras células, a su vez permite un tratamiento más efectivo de trastornos asociados con SEZ6 al inhibir la tumorigénesis, el mantenimiento y/o la metástasis y la recidiva del tumor.
[0068] Entre los procedimientos reconocidos en la técnica que se pueden utilizar para evaluar esta reducción de la frecuencia de las células iniciadoras de tumores se encuentra el análisis de dilución limitante, ya sea in vitro o in vivo, preferentemente seguido de la enumeración utilizando el modelo estadístico de la distribución de Poisson o evaluando la frecuencia de eventos definitivos predefinidos tales como la capacidad para generar tumores in vivo. Aunque el análisis de dilución limitante comprende procedimientos preferidos para calcular la reducción de la frecuencia de las células iniciadoras de tumores, también se pueden utilizar otros procedimientos, menos complicados, para determinar de forma eficaz los valores deseados, aunque con una exactitud ligeramente menor, y son totalmente compatibles con las enseñanzas en el presente documento. Por lo tanto, como podrán apreciar los expertos en la técnica, también es posible determinar la reducción de los valores de frecuencia utilizando procedimientos inmunohistoquímicos o de citometría de flujo conocidos. En lo que respecta a todos los procedimientos mencionados anteriormente, véase, por ejemplo, Dylla y col. 2008, PMID: 18560594 y Hoey y col. 2009, PMID: 19664991.
[0069] En lo que respecta al análisis de dilución limitante, la enumeración in vitro de la frecuencia de las células iniciadoras de tumores se puede conseguir depositando células tumorales humanas fraccionadas o no fraccionadas (por ejemplo, de tumores tratados y no tratados, respectivamente) en condiciones de cultivo in vitro que favorezcan la formación de colonias. De este modo, las células formadoras de colonias se pueden enumerar mediante un simple recuento y caracterización de las colonias, o mediante un análisis que consiste en, por ejemplo, depositar células tumorales humanas en placas en diluciones en serie y otorgar a cada pocillo una puntuación positiva o negativa para la formación de colonias al menos 10 días después de la colocación en las placas. Los experimentos o análisis de dilución limitante in vivo, que generalmente son más exactos donde respecta a su capacidad para determinar la frecuencia de las células iniciadoras de tumores, incluyen trasplantar células tumorales humanas, ya sean de poblaciones de control sin tratar o tratadas, por ejemplo, en ratones inmunodeprimidos en diluciones en serie y posteriormente otorgar a cada ratón una puntuación positiva o negativa para la formación de tumores al menos 60 días después del trasplante. La derivación de los valores de la frecuencia celular mediante el análisis de dilución limitante in vitro o in vivo se realiza preferentemente aplicando el modelo estadístico de la distribución de Poisson a la frecuencia conocida de eventos positivos y negativos, para proporcionar de este modo una frecuencia para los eventos que se ajustan a la definición de un evento positivo; en este caso, la formación de colonias o tumores, respectivamente.
[0070] En lo que respecta a otros procedimientos compatibles con la presente invención que se pueden utilizar para calcular la frecuencia de las células iniciadoras de tumores, los más comunes comprenden técnicas de citometría de flujo y procedimientos de tinción inmunohistoquímica cuantificables. Aunque no son tan precisos como las técnicas de análisis de dilución limitante descritas justo antes, estos procedimientos son mucho menos laboriosos y
proporcionan valores razonables en un plazo relativamente corto. Por lo tanto, se apreciará que un experto podrá utilizar una determinación del perfil de marcadores de la superficie celular por citometría de flujo empleando uno o más anticuerpos o reactivos que se unen a proteínas de la superficie celular reconocidas en la técnica en las cuales se sabe que las células iniciadoras de tumores están enriquecidas (por ejemplo, marcadores potencialmente compatibles como los que se exponen en la solicitud de PCT WO2012/031280) y de este modo se miden los niveles de TIC de diversas muestras. En otro procedimiento compatible adicional, un experto en la técnica podrá enumerar la frecuencia de TIC in situ (por ejemplo, en una sección de tejido) por inmunohistoquímica utilizando uno o más anticuerpos o reactivos que son capaces de unirse a proteínas de la superficie celular que se cree que demarcan estas células.
[0071] Los expertos en la técnica reconocerán que se han asociado numerosos marcadores (o su ausencia) con diversas poblaciones de células madre cancerosas y se han utilizado para aislar o caracterizar subpoblaciones de células tumorales. A este respecto, los marcadores de células madre cancerosas ejemplares comprenden OCT4, Nanog, STAT3, EPCAM, CD24, CD34, NB84, TrkA, GD2, CD133, CD20, CD56, CD29, B7H3, CD46, receptor de transferrina, JAM3, carboxipeptidasa M, ADAM9, oncostatina M, Lgr5, Lgr6, CD324, CD325, nesatina, Soxl, Bmi-1, eed, easyhl, easyh2, mf2, yy1, smarcA3, smarckA5, smarcD3, smarcE1, mllt3, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT5A, WNT10B, WNT16, AXIN1, BCL9, MYC, (TCF4) SLC7A8, IL1RAP, TEM8, TMPRSS4, MUC16, GPRC5B, SLC6A14, SLC4A11, PPAP2C, CAV1, CAV2, PTPN3, EPHA1, EPHA2, SLC1A1, CX3CL1, ADORA2A, MPZL1, FLJ10052, C4.4A, EDG3, RARRES1, TMEPAI, PTS, CEACAM6, NID2, STEAP, ABCA3, CRIM1, IL1R1, OPN3, DAF, MUC1, MCP, CPD, NMA, ADAM9, GJA1, SLC19A2, ABCA1, PCDH7, ADCY9, SLC39A1, NPC1, ENPP1, N33, GPNMB, LY6E, CELSR1, LRP3, C20orf52, TMEPAI, FLVCR, PCDHA10, GPR54, TGFBR3, SEMA4B, PCDHB2, ABCG2, CD166, AFP, BMP-4, p-catenina, CD2, CD3, CD9, CD14, CD31, CD38, CD44, CD45, CD74, CD90, CXCR4, decorina, EGFR, CD105, CD64, CD16, CD16a, CD16b, GLI1, GLI2, CD49b, y CD49f. Véanse, por ejemplo, Schulenburg y col., 2010, PMID: 20185329, la Patente de Estados Unidos N.° 7.632.678 y las Patentes de Estados Unidos N.° 2007/0292414, 2008/0175870, 2010/0275280, 2010/0162416 y 2011/0020221.
[0072] Se apreciará además que cada uno de los marcadores mencionados anteriormente también se puede utilizar como antígeno diana secundario en el contexto de los anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos de la presente descripción.
[0073] De manera similar, los ejemplos no limitantes de fenotipos de la superficie celular asociados con células madre cancerosas de ciertos tipos de tumores incluyen CD44hicD24low, ALDH+, CD133+, CD123+, CD34+CD38-, CD44+CD24-, CD46hiCD324+CD66c-, CD133+CD34+CD10-CD19-, CD138'CD34'CD19+, CD133+RC2+, CD44+a2 p1hiCD133+, CD44+CD24+ESA+, CD271+, ABCB5+, así como también otros fenotipos de la superficie de células madre cancerosas conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Schulenburg y col., 2010, anteriormente, Visvader y col., 2008, PMID: 18784658 y la Patente de Estados Unidos N.° 2008/0138313.
Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden utilizar fenotipos marcadores, como los que se han mencionado como ejemplos justo antes, junto con un análisis por citometría de flujo y técnicas de clasificación de células estándar para caracterizar, aislar, purificar o enriquecer células TIC y/o TPC o poblaciones de células para su análisis posterior. Tiene interés para la presente invención el hecho de que c D46, CD324 y opcionalmente CD66c se expresen en niveles altos o de forma heterogénea en la superficie de muchas células tumorales humanas de cáncer colorrectal («CR»), de mama («BR»), de pulmón no microcítico (NSCLC), de pulmón microcítico (SCLC), de páncreas («PA»), melanoma («Mel»), de ovario («OV»), y de cabeza y cuello («HN»), independientemente de que las muestras tumorales que se analicen sean muestras del tumor primario del paciente o de tumores NTX derivados del paciente.
[0074] Utilizando cualquiera de los procedimientos a los que se ha hecho referencia anteriormente y marcadores seleccionados como los que se conocen en la técnica, es posible cuantificar la reducción de la frecuencia de TIC (o las TPC en la misma) proporcionada por los moduladores de SEZ6 descritos (incluidos aquellos conjugados con agentes citotóxicos) según las enseñanzas en el presente documento. En algunos casos, los compuestos de la presente descripción pueden reducir la frecuencia de TIC o TPC (mediante diversos mecanismos indicados anteriormente, que incluyen la eliminación, la diferenciación inducida, la alteración del nicho, el silenciamiento, etc.) en un 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 % o incluso en un 35 %. En otros casos, la reducción de la frecuencia de TIC o TPC puede ser del orden de un 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 % o un 65 %. En ciertos casos, los compuestos descritos pueden reducir la frecuencia de TIC o TPC en un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o incluso un 95 %. Obviamente, se apreciará que cualquier reducción de la frecuencia de TIC o TPC probablemente provocará una reducción correspondiente en la tumorigenicidad, persistencia, recidiva y agresividad de la neoplasia.
IV. Moduladores de SEZ6
[0075] En cualquier caso, la presente descripción se refiere al uso de moduladores de SEZ6, incluidos los antagonistas de SEZ6, para el diagnóstico, el teragnóstico, el tratamiento y/o la profilaxis de diversos trastornos que incluyen cualquiera de las diferentes neoplasias asociadas con SEZ6. Los moduladores descritos se pueden utilizar en solitario o junto con una amplia diversidad de compuestos anticancerosos tales como agentes quimioterapéuticos o inmunoterapéuticos (por ejemplo, anticuerpos terapéuticos) o modificadores de la respuesta biológica. En otros casos seleccionados, se pueden utilizar dos o más moduladores de SEZ6 discretos combinados para proporcionar
efectos antineoplásicos mejorados o se pueden utilizar para fabricar construcciones multiespecíficas.
[0076] En ciertos casos, los moduladores de SEZ6 de la presente descripción comprenderán nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, péptidos o polipéptidos. Más particularmente, los moduladores ejemplares de la descripción pueden comprender anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno o derivados de los mismos, proteínas, péptidos, glucoproteínas, glucopéptidos, glucolípidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, construcciones antisentido, ARNip, miARN, moléculas bioorgánicas, peptidomiméticos, agentes farmacológicos y sus metabolitos, secuencias de control de la transcripción y la traducción, y similares. En ciertos casos, los moduladores comprenderán SEZ6 soluble (sSEZ6) o una forma, variante, derivado o fragmento del mismo, incluidos, por ejemplo, las construcciones de fusión de SEZ6 (por ejemplo, SEZ6-Fc, resto dirigido a SEZ6, etc.) o conjugados de SEZ6 (por ejemplo, SEZ6-PEG, agente citotóxico de s EZ6, SEZ6-brm, etc.). También se apreciará que, en otros casos, los moduladores de SEZ6 comprenden anticuerpos o fragmentos inmunorreactivos o derivados de los mismos. En realizaciones particularmente preferidas, los moduladores de la presente invención comprenderán anticuerpos neutralizantes, o derivados o fragmentos de los mismos. En otros casos, los moduladores de SEZ6 pueden comprender anticuerpos internalizantes o fragmentos de los mismos. En otras realizaciones adicionales, los moduladores de SEZ6 pueden comprender anticuerpos supresores o fragmentos de los mismos. Además, al igual que sucede con las construcciones de fusión mencionadas anteriormente, estos moduladores de tipo anticuerpo pueden estar conjugados, unidos o asociados de otro modo con agentes citotóxicos, polímeros o modificadores de la respuesta biológica (BRM) seleccionados o similares para proporcionar inmunoterapias dirigidas con diversos (y opcionalmente múltiples) mecanismos de acción. Tal como se ha indicado anteriormente, dichos anticuerpos pueden ser anticuerpos de pan-SEZ6 y asociarse con dos o más miembros de la familia SEZ6 (por ejemplo, SEZ6 y SEZ6L como se muestra en la FIG. 11A) o pueden ser anticuerpos inmunoespecíficos que reaccionen selectivamente con una o ambas isoformas de SEZ6. En otros casos adicionales, los moduladores pueden operar a nivel genético y pueden comprender compuestos como construcciones antisentido, ARNip, miARN y similares que interaccionen o se asocien con el componente genotípico de un determinante de SEZ6.
[0077] Se apreciará además que los moduladores de SEZ6 descritos pueden agotar, silenciar, neutralizar, eliminar o inhibir el crecimiento, la propagación o la supervivencia de células tumorales, incluidas las TPC, y/o neoplasias asociadas a través de varios mecanismos, que incluyen la agonización o antagonización de vías seleccionadas o la eliminación de células específicas dependiendo, por ejemplo, de la forma del modulador de SEZ6, cualquier carga útil o dosis asociada y el procedimiento de administración. Por lo tanto, aunque los casos preferidos descritos en el presente documento se refieren al agotamiento, la inhibición o el silenciamiento de subpoblaciones de células tumorales específicas, tales como células perpetuantes de tumores, o a moduladores que interaccionan con un epítopo o dominio específico, se debe hacer hincapié en que dichos casos son meramente ilustrativos y no son limitantes en ningún sentido. En cambio, tal como se expone en las reivindicaciones adjuntas, la presente invención se refiere en un sentido amplio a moduladores de SEZ6 y a su uso en el tratamiento, la gestión o la profilaxis de diversos trastornos asociados con SEZ6, independientemente de cuál sea el mecanismo, la región de unión o la población de células tumorales diana en particular.
[0078] Independientemente de la forma del modulador seleccionado, se apreciará que el compuesto elegido puede ser de naturaleza antagonista. Como se usa en el presente documento, un «antagonista» se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir con las actividades de una diana particular o especificada (por ejemplo, SEZ6), incluida la unión de receptores a ligandos o las interacciones de enzimas con sustratos. A este respecto, se apreciará que los antagonistas de SEZ6 de la presente descripción pueden comprender cualquier ligando, polipéptido, péptido, proteína de fusión, anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo o derivado de este que reconozca, reaccione, se una, se combine, compita, se asocie o interaccione de cualquier otro modo con la proteína SEZ6 o un fragmento de esta, y elimine, silencie, reduzca, inhiba, impida, restrinja o controle el crecimiento de células iniciadoras de tumores u otras células neoplásicas incluidas las células constitutivas del tumor o NTG. Los antagonistas compatibles pueden incluir además inhibidores de bajo peso molecular, aptámeros, construcciones antisentido, ARNip, miARN y similares, moléculas de ligando o receptor y sus derivados que reconozcan o se asocien con un determinante genotípico o fenotípico de SEZ6 para alterar de este modo sus patrones de expresión o privarle de su unión o interacción con un sustrato, receptor o ligando.
[0079] Como se usa en el presente documento, un antagonista se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir con las actividades de una proteína particular o especificada, incluida la unión de receptores a ligandos o las interacciones de enzimas con sustratos. Más generalmente, los antagonistas de la descripción pueden comprender anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno o derivados de los mismos, proteínas, péptidos, glucoproteínas, glucopéptidos, glucolípidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, construcciones antisentido, ARNip, miARN, moléculas bioorgánicas, peptidomiméticos, agentes farmacológicos y sus metabolitos, secuencias de control de la transcripción y la traducción, y similares. Los antagonistas también pueden incluir inhibidores de molécula pequeña, proteínas de fusión, moléculas receptoras y derivados que se unan específicamente a la proteína de modo que la priven de su unión a su sustrato diana, variantes antagonistas de la proteína, moléculas antisentido dirigidas a la proteína, aptámeros de ARN y ribozimas contra la proteína.
[0080] Como se usa en el presente documento y se aplica a dos o más moléculas o compuestos, los términos
«reconoce» o «se asocia» se refieren a la reacción, unión, unión específica, combinación, interacción, conexión, ligadura, unificación, coalescencia, fusión o unión, de forma covalente o no covalente, de las moléculas, de modo que una molécula ejerce un efecto sobre la otra molécula.
[0081] Además, como se demuestra en los ejemplos en el presente documento (por ejemplo, véase la FIG.
11), algunos moduladores de SEZ6 humano pueden, en ciertos casos, presentar reactividad cruzada con SEZ6 de una especie que no sea humana (por ejemplo, de rata o mono cinomolgo). En otros casos, los moduladores ejemplares pueden ser específicos para una o más isoformas de SEZ6 humano y no presentarán reactividad cruzada con ortólogos de s EZ6 de otras especies. Obviamente, junto con las enseñanzas en el presente documento, dichos casos pueden comprender anticuerpos de pan-SEZ6 que se asocien con dos o más miembros de la familia SEZ6 de una única especie o anticuerpos que se asocien exclusivamente con SEZ6.
[0082] En cualquier caso, y como se analizará con más detalle posteriormente, los expertos en la técnica apreciarán que los moduladores descritos se pueden utilizar en una forma conjugada o no conjugada. Es decir, el modulador puede estar asociado o conjugado (por ejemplo, de forma covalente o no covalente) con compuestos farmacéuticamente activos, modificadores de la respuesta biológica, agentes anticancerosos, agentes citotóxicos o citostáticos, restos de diagnóstico o modificadores biocompatibles. A este respecto, se entenderá que dichos conjugados pueden comprender péptidos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusión, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequeñas, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas y radioisótopos. Además, como se ha indicado en el presente documento, el conjugado seleccionado puede estar unido de forma covalente o no covalente con el modulador de SEZ6 en diversas proporciones molares dependiendo, al menos en parte, del procedimiento empleado para conseguir la conjugación.
V. Fabricación y suministro de moduladores
A. Moduladores de anticuerpo
1. Introducción
[0083] Como se ha indicado anteriormente, los casos particularmente preferidos de la presente descripción comprenden moduladores de SEZ6 en forma de anticuerpos que se asocian preferentemente con una o más isoformas de SEZ6 (y, opcionalmente, pueden reaccionar de forma cruzada con otros miembros de la familia SEZ6). Los expertos en la técnica apreciarán la base de conocimientos debidamente desarrollada sobre anticuerpos tal como la expuesta, por ejemplo, en Abbas y col., Cellular and Molecular Immunology, 6a ed., W.B. Saunders Company (2010) o Murphey y col., Janeway's Immunobiology, 8a ed., Garland Science (2011).
[0084] Se pretende que el término «anticuerpo» abarque anticuerpos policlonales, anticuerpos multiclonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y primatizados, anticuerpos humanos, anticuerpos producidos recombinantemente, intracuerpos, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos monovalentes, anticuerpos multivalentes, anticuerpos antiidiotípicos, anticuerpos sintéticos, incluidas las muteínas y variantes de los mismos; fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), FvFc monocatenarios, Fv monocatenarios; y derivados de los mismos, incluidas las fusiones de Fc y otras modificaciones, y cualquier otra molécula inmunológicamente activa, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (es decir, asociación o unión al antígeno). Asimismo, el término comprende además todas las clases de anticuerpos (es decir, IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM) y todos los isótopos (es decir, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), así como también sus variaciones a menos que el contexto dicte lo contrario. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se indican con la letra griega minúscula a, 5, £, y, y M, respectivamente. Las cadenas ligeras de los anticuerpos de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a uno de dos tipos claramente diferentes, denominados kappa (k) y lambda (A), basándose en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
[0085] Aunque todos estos anticuerpos estén contemplados por el alcance de la presente invención, en el presente documento se analizaran en cierto detalle realizaciones preferidas que comprenden la clase de inmunoglobulina IgG únicamente a efectos ilustrativos.
[0086] Como se conoce bien, los dominios de variable tanto de las porciones de cadena ligera (Vl) como pesada (Vh) determinan el reconocimiento y la especificidad antigénicos, y los dominios constantes de la cadena ligera (Cl) y la cadena pesada (Ch1, Ch2 o Ch3) confieren y regulan propiedades biológicas importantes tales como la secreción, la movilidad transplacentaria, la semivida en circulación, la unión al complemento, y similares.
[0087] La región «variable» incluye sitios hipervariables que se manifiestan en tres segmentos denominados habitualmente regiones determinantes de la complementariedad (CDR), tanto en los dominios variables de la cadena ligera como de la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables que flanquean las CDR se denominan regiones de marco (FR). Por ejemplo, en los anticuerpos de tipo inmunoglobulina G (IgG) monoméricos de origen natural, las seis CDR presentes en cada brazo de «Y» son secuencias cortas de aminoácidos
no contiguas que están situadas específicamente para formar el sitio de unión al antígeno cuando el anticuerpo adopta su configuración tridimensional en un entorno acuoso. Por lo tanto, cada anticuerpo IgG de origen natural comprende dos sitios de unión idénticos próximos al extremo amino de cada brazo de Y.
[0088] Se apreciará que un experto en la técnica podrá identificar fácilmente la posición de las CDR utilizando técnicas estándar. Los expertos en la técnica también estarán familiarizados con el sistema de numeración que se describe en Kabat y col. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.). A este respecto, Kabat y col. definieron un sistema de numeración para secuencias de dominios variables que se puede aplicar a cualquier anticuerpo. Un experto en la técnica puede asignar inequívocamente este sistema de «numeración de Kabat» a cualquier secuencia de dominio variable, sin recurrir a ningún dato experimental aparte de la propia secuencia. A menos que se especifique de otro modo, las referencias a la numeración de posiciones de residuos aminoacídicos específicas en un anticuerpo se ajustan al sistema de numeración de Kabat.
[0089] Por lo tanto, según Kabat, en Vh, los residuos 31-35 comprenden CDR1, los residuos 50-65 constituyen CDR2, y 95-102 comprenden CDR3, mientras que en Vl, los residuos 24-34 son CDR1, 50-56 comprenden CDr2, y 89-97 constituyen CDR3. Para el contexto, en una Vh, FR1 corresponde al dominio de la región variable que incorpora los aminoácidos 1-30; FR2 corresponde al dominio de la región variable que incorpora los aminoácidos 36-49; FR3 corresponde al dominio de la región variable que incorpora los aminoácidos 66-94, y FR4 corresponde al dominio de la región variable de los aminoácidos 103 al final de la región variable. Las FR para la cadena ligera están separadas de forma similar por cada una de las CDR de la región variable de cadena ligera.
[0090] Cabe destacar que las CDR varían considerablemente de un anticuerpo a otro (y por definición no exhibirán homología con las secuencias consenso de Kabat). Además, la identidad de ciertos residuos individuales en cualquier número de sitio de Kabat puede variar de una cadena de anticuerpo a otra debido a la divergencia alélica o entre especies. Se expone una numeración alternativa en Chothia y col., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) y MacCallum y col., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), aunque, al igual que en Kabat, los límites de las FR están separados por los extremos CDR respectivos como se ha descrito anteriormente. Véase también Chothia y col., Nature 342, págs. 877 883 (1989) y S. Dubel, ed., Handbook of Therapeutic Antibodies, 3a ed., WILEY-VCH Verlag GmbH and Co. (2007), donde las definiciones incluyen la superposición o subconjuntos de residuos aminoacídicos cuando se comparan entre sí.
[0091] Los residuos aminoacídicos que comprenden las regiones de unión o CDR según se definen en cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen a efectos comparativos a continuación.
Definiciones de CDR
[0092] En el contexto de la presente descripción, se apreciará que cualquiera de las CDR de las cadenas pesada y ligera descritas derivadas de las secuencias de aminoácidos de la región variable murina expuestas en la FIG. 10A o la FIG. 10B se puede combinar o reorganizar para proporcionar anticuerpos anti-SEZ6 (por ejemplo, antihSEZ6 humanizados, con injertos de CDR o quiméricos) optimizados según las presentes enseñanzas. Es decir, una o más de las CDR derivadas de las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena ligera expuestas en la FIG. 10A (SEQ ID NO: 20 - 168, números pares) o las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada expuestas en la FIG. 10B (SEQ ID NO: 21 - 169, números impares) se pueden incorporar en un modulador de SEZ6 y, en casos particularmente preferidos, en un anticuerpo con injertos de CDR o humanizado que se asocia inmunoespecíticamente con una o más isoformas de SEZ6. También se exponen ejemplos de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 170-192, números pares) y pesada (SEQ ID NO: 171-193, números impares y 194-199) de dichos moduladores humanizados en las FIGs .10A y 10B.
[0093] Cabe destacar que hSC17.200vL1 (SEQ ID NO: 192) es una variante de la construcción de cadena ligera humanizada hSC17.200 (SEQ ID NO: 190), hSC17.155vH1 - vH6 (SEQ ID NO: 193-198) son variantes de la construcción de cadena pesada hSC.155 (SEQ ID NO: 184) que se deriva de SC17.90 (SEQ ID NO: 127) y que hSC161vH1 (SEQ ID NO: 199) es una variante de la construcción de cadena pesada hSC17.161 (SEQ ID nO: 189). Como se analizará con más detalle posteriormente, estas variantes se construyeron y se evaluaron para optimizar una o más propiedades bioquímicas del anticuerpo parental.
[0094] Estas secuencias de aminoácidos novedosas consideradas conjuntamente representan setenta y cinco moduladores murinos y once humanizados ilustrativos (junto con las variantes descritas) según la presente descripción. Además, las secuencias de ácido nucleico correspondientes de cada uno de los setenta y cinco moduladores murinos y los once moduladores humanizados ilustrativos y variantes de los mismos que se exponen en las FIGS. 10A y 10B se incluyen en la lista de secuencias de la presente solicitud (SEQ ID NO: 220 - 399).
[0095] En las FIGS. 10A y 10B, las CDR anotadas se definen utilizando la numeración de Chothia. Sin embargo, como se analiza y se demuestra más adelante en el Ejemplo 8, un experto en la técnica podría definir, identificar, derivar y/o enumerar fácilmente las CDR como se define en Kabat y col., Chothia y col. o MacCallum y col. para cada secuencia respectiva de cadenas ligera y pesada expuesta en la FIG. 10A o la FIG. 10B. Por consiguiente, cada una de las CDR en cuestión y los anticuerpos que comprenden las CDR definidas mediante todas estas nomenclaturas se incluyen expresamente dentro del alcance de la presente descripción. En un sentido más amplio, los términos «residuo de aminoácidos de CDR de la región variable» o más simplemente «CDR» incluye los aminoácidos en una CDR identificados utilizando cualquier procedimiento de base estructural o secuencial como se ha expuesto anteriormente.
2. Generación de moduladores de anticuerpo
a. Anticuerpos policlonales
[0096] La producción de anticuerpos policlonales en diversos animales huésped, incluidos conejos, ratones, ratas, etc., es muy conocida en la técnica. En algunos casos, se obtiene suero que contiene anticuerpos anti-SEZ6 policlonales desangrando o sacrificando al animal. El suero se puede utilizar con fines de investigación en la forma obtenida del animal o, como alternativa, los anticuerpos anti-SEZ6 se pueden purificar parcial o completamente para proporcionar fracciones de inmunoglobulina o preparados de anticuerpo homogéneos.
[0097] Resumiendo, el animal seleccionado se inmuniza con un inmunógeno de SEZ6 (por ejemplo, SEZ6 soluble o sSEZ6) que puede comprender, por ejemplo, isoformas, dominios y/o péptidos seleccionados, o células vivas o preparados celulares que expresan SEZ6 o fragmentos inmunorreactivos del mismo. Los adyuvantes conocidos en la técnica que se pueden utilizar para aumentar la respuesta inmunitaria, dependiendo de la especie inoculada, incluyen, pero sin limitación, Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo
de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Dichos adyuvantes pueden proteger al antígeno contra la dispersión rápida al secuestrarlo en una reserva local, o pueden contener sustancias que estimulan al huésped para que secrete factores que son quimiotácticos para los macrófagos y otros componentes del sistema inmunitario. Preferentemente, el programa de inmunización incluirá dos o más administraciones del inmunógeno seleccionado repartidas a lo largo de un periodo predeterminado.
[0098] La secuencia de aminoácidos de una proteína SEZ6 como la que se muestra en las FIGS. 1C o 1D se puede analizar con el fin de seleccionar regiones específicas de la proteína SEZ6 para generar anticuerpos. Por ejemplo, se utilizan análisis de la hidrofobicidad e hidrofilicidad de una secuencia de aminoácidos de SEZ6 para identificar regiones hidrófilas en la estructura de SEZ6. Se pueden identificar fácilmente regiones de una proteína SEZ6 que presenten una estructura inmunogénica, así como también otras regiones y dominios, utilizando otros procedimientos diferentes conocidos en la técnica, tales como el análisis de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz o Jameson-Wolf. Se pueden generar perfiles de flexibilidad media utilizando el procedimiento de Bhaskaran R., Ponnuswamy P. K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255. Se pueden generar perfiles de giro beta utilizando el procedimiento de Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294. Por lo tanto, cada región, dominio o motivo de SEZ6 identificado mediante cualquiera de estos programas o procedimientos queda contemplado por el alcance de la presente descripción y se puede aislar o modificar para proporcionar inmunógenos que originen moduladores que comprendan las propiedades deseadas. Los procedimientos preferidos para generar anticuerpos de SEZ6 se ilustran adicionalmente mediante los Ejemplos que se proporcionan en el presente documento. Los procedimientos para preparar una proteína o polipéptido para su uso como un inmunógeno son muy conocidos en la técnica. También se conocen en la técnica procedimientos para preparar conjugados inmunogénicos de una proteína con un vehículo, tal como BSA, KLH u otra proteína portadora. En algunas circunstancias, se utiliza una conjugación directa donde se emplean, por ejemplo, reactivos de carbodiimida; en otros casos, los reactivos de unión son eficaces. La administración de un inmunógeno de SEZ6 se lleva a cabo normalmente por inyección durante un periodo adecuado y utilizando un adyuvante adecuado, como consta en la técnica. Durante el programa de inmunización, se pueden obtener titulaciones de anticuerpos, como se describe más adelante en los Ejemplos, para determinar la idoneidad de la formación de anticuerpos.
b. Anticuerpos monoclonales
[0099] Además, la descripción contempla el uso de anticuerpos monoclonales. Como se conoce en la técnica, el término «anticuerpo monoclonal» (o mAb) se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos salvo por posibles mutaciones (por ejemplo, mutaciones naturales) que puedan estar presentes en cantidades minoritarias. En ciertos casos, tal anticuerpo monoclonal incluye un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une o asocia con un antígeno, donde la secuencia polipeptídica de unión al antígeno se ha obtenido mediante un proceso que incluye la selección de una única secuencia polipeptídica de unión a la diana entre una pluralidad de secuencias polipeptídicas.
[0100] Más generalmente, y como se ilustra en el Ejemplo 6 en el presente documento, se pueden preparar anticuerpos monoclonales utilizando una gran diversidad de técnicas conocidas en la materia, incluyendo hibridoma, técnicas recombinantes, tecnologías de presentación en fago, animales transgénicos (por ejemplo, un XenoMouse®) o alguna combinación de las mismas. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos monoclonales utilizando hibridoma, y técnicas bioquímicas y de ingeniería genética reconocidas en la técnica, tal como se describe más detalladamente en An, Zhigiang (ed.) Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley and Sons, 1a ed. 2009; Shire et. al. (eds.) Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Springer Science Business Media LLC, 1a ed. 2010; Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988; Hammerling, y col., in: Monoclonal Antibodies and T-Cel1Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981).
[0101] Debe entenderse que una secuencia de unión seleccionada se puede alterar adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de unión a la diana, para mejorar su producción en cultivos celulares, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprenda la secuencia de unión a la diana alterada también es un anticuerpo de esta invención.
c. Anticuerpos quiméricos
[0102] En otra realización, el anticuerpo de la invención puede comprender anticuerpos quiméricos derivados de segmentos proteicos unidos covalentemente procedentes de al menos dos especies o tipos de anticuerpos diferentes. Como se conoce en la técnica, el término anticuerpos «quiméricos» se refiere a construcciones donde una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas son idénticas u homologas a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como también fragmentos de tales
anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (Patente de Estados Unidos N.° 4.816.567; Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).
[0103] En una realización, un anticuerpo quimérico según las enseñanzas en el presente documento puede comprender secuencias de aminoácidos de Vh y Vl murinas, y regiones constantes derivadas de fuentes humanas. En otras realizaciones compatibles, un anticuerpo quimérico de la presente invención puede comprender un anticuerpo humanizado como se describe a continuación. En otra realización, el anticuerpo denominado «anticuerpo con injertos de CDR» comprende una o más CDR de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la cadena o cadenas del anticuerpo son idénticas u homólogas a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos. Para el uso en seres humanos, se pueden injertar CDR de roedor seleccionadas en un anticuerpo humano, reemplazando una o más de las regiones variables o CDR naturales del anticuerpo humano. Estas construcciones generalmente presentan las ventajas de que proporcionan funciones moduladoras máximas (por ejemplo, CDC (citotoxicidad dependiente del complemento), ADCc (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos), etc.) a la vez que reducen respuestas inmunitarias al anticuerpo no deseadas en el sujeto.
d. Anticuerpos humanizados
[0104] Un anticuerpo «humanizado» es similar al anticuerpo con injertos de CDR. Como se usa en el presente documento, las formas «humanizadas» de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de una o más inmunoglobulinas no humanas. En un caso, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor o aceptor) donde se reemplazan residuos de una CDR del receptor por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como un ratón, rata, conejo o primate no humano, con la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas. En ciertos casos preferidos, se reemplazan residuos en una o más FR en el dominio variable de la inmunoglobulina humana por residuos no humanos correspondientes del anticuerpo donante para ayudar a mantener la configuración tridimensional adecuada de la o las CDR injertadas y de este modo mejorar la afinidad. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante para, por ejemplo, refinar aún más el comportamiento del anticuerpo.
[0105] El injerto de CDR y los anticuerpos humanizados se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N.° 6.180.370 y 5.693.762. El anticuerpo humanizado opcionalmente también puede comprender al menos una porción de un Fc de inmunoglobulina, normalmente el de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase, por ejemplo, Jones y col., Nature 321:522-525 (1986); y las Patentes de Estados Unidos N.° 6.982.321 y 7.087.409. Otro procedimiento adicional se denomina «humaneering» que se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 2005/0008625. Adicionalmente, un anticuerpo no humano también se puede modificar por deleción específica de epítopos de linfocitos T humanos o «desinmunización» mediante los procedimientos descritos en WO 98/52976 y WO 00/34317.
[0106] Los anticuerpos humanizados también se pueden biomodificar utilizando técnicas comunes de biología molecular, tales como el aislamiento, la manipulación y la expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican todas o parte de las regiones variables de inmunoglobulina de al menos una de entre una cadena pesada o ligera. Además de las fuentes de dicho ácido nucleico indicadas anteriormente, se dispone de secuencias de la línea germinal humana como las descritas, por ejemplo, en Tomlinson, I. A. y col. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. y col. (1995) Immunol. Today 16: 237-242; Chothia, D. y col. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; y Tomlinson y col. (1995) EMBO J 14:4628-4638. El directorio V-BASE (VBASE2 - Retter y col., Nucleic Acid Res. 33; 671-674, 2005) proporciona un catálogo exhaustivo de secuencias de la región variable de inmunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, I. A. y col. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, RU). También se pueden utilizar FR humanas consenso, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 6.300.064.
[0107] En realizaciones seleccionadas y como se detalla más adelante en el Ejemplo 8, al menos un 60 %, 65 %, 70 %, 75 % u 80 % de los residuos de aminoácidos de la región variable de cadena pesada o ligera de los anticuerpos humanizados corresponderá a los residuos de las secuencias de CDR y FR del receptor. En otros casos, al menos un 85 % o un 90 % de los residuos de la región variable de los anticuerpos humanizados corresponderá a los residuos de las secuencias de CDR y FR del receptor. En un caso más preferido, más de un 95 % de los residuos de la región variable de los anticuerpos humanizados corresponderá a los residuos de las secuencias de CDR y FR del receptor.
e. Anticuerpos humanos
[0108] En otra realización, los anticuerpos pueden comprender anticuerpos completamente humanos. El término «anticuerpo humano» se refiere a un anticuerpo que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha preparado utilizando cualquiera de las técnicas de producción de anticuerpos humanos.
[0109] Los anticuerpos humanos se pueden producir utilizando diversas técnicas conocidas en la técnica. Una técnica es la presentación en fago, en la cual se sintetiza una biblioteca de anticuerpos (preferentemente humanos) en fagos, se criba la colección con el antígeno de interés o una porción de unión al anticuerpo del mismo, y se aísla el fago que se une al antígeno, a partir del cual se pueden obtener los fragmentos inmunorreactivos. Los procedimientos para preparar y cribar tales bibliotecas se conocen muy bien en la técnica y los kits para generar las colecciones de presentación en fagos se pueden adquirir de proveedores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catálogo n.° 27-9400-01; y el kit de presentación en fago Stratagene SurfZAP™, catálogo n.° 240612). También existen otros procedimientos y reactivos que se pueden utilizar para generar y cribar bibliotecas de presentación de anticuerpos (véanse, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 5.223.409; las Publicaciones PCT N.° WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; y Barbas y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991)).
[0110] En un caso, los anticuerpos humanos recombinantes se pueden aislar cribando una colección de anticuerpos combinatoria recombinante preparada como se ha indicado anteriormente. En un caso, la biblioteca es una biblioteca de scFv de presentación en fagos, generada utilizando ADNc de Vl y Vh humanas preparados a partir de ARNm aislado de linfocitos B.
[0111] Los anticuerpos producidos por bibliotecas sin tratar (ya sean naturales o sintéticas) pueden tener una afinidad moderada (Ka de aproximadamente 106 a 107 M-1), pero la maduración de la afinidad también se puede simular in vitro por construcción y reselección a partir de colecciones secundarias como las descritas en la técnica. Por ejemplo, se puede introducir una mutación al azar in vitro utilizando la polimerasa propensa a errores (descrita en Leung y col., Technique, 1: 11-15 (1989)). Adicionalmente, la maduración de la afinidad se puede llevar a cabo mutando al azar una o más CDR, por ejemplo, utilizando PCR con cebadores portadores de una secuencia aleatoria que abarque la CDR de interés, en clones de Fv individuales seleccionados y cribándolos para obtener los clones con mayor afinidad. El documento WO 9607754 describe un procedimiento para inducir la mutagénesis en una CDR de una cadena ligera de inmunoglobulina para crear una biblioteca de genes de cadena ligera. Otra estrategia eficaz consiste en recombinar los dominios Vh o Vl seleccionados mediante presentación en fagos con repertorios de variantes de dominios V naturales obtenidos a partir de donantes no inmunizados y cribarlos para obtener los de mayor afinidad en varias rondas de retransposición de las cadenas tal como se describe en Marks y col., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con una constante de disociación Kd (kdisociación/kasociación) de aproximadamente 10-9 M o inferior.
[0112] En otros casos, se pueden emplear procedimientos similares utilizando colecciones que comprenden células eucariotas (por ejemplo, levaduras) que expresan pares de unión en su superficie. Véanse, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 7.700.302 y la Patente de Estados Unidos N.° 12/404.059. En un caso, el anticuerpo humano se selecciona a partir de una fagoteca, donde la fagoteca expresa anticuerpos humanos (Vaughan y col. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6157-6162 (1998). En otros casos, se pueden aislar pares de unión humanos a partir de bibliotecas de anticuerpos combinatorias generadas en células eucariotas tales como levaduras. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 7.700.302. Dichas técnicas permiten convenientemente cribar un número elevado de moduladores potenciales y proporcionar una manipulación relativamente sencilla de secuencias potenciales (por ejemplo, por maduración de la afinidad o transposición recombinante).
[0113] También se pueden producir anticuerpos humanos mediante la introducción de locus de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones donde se han desactivado parcial o completamente los genes de inmunoglobulina endógenos y se han introducido genes de inmunoglobulina humana. Al ser estimulados, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se asemeja mucho a la observada en los seres humanos en todos los aspectos, incluidos la reordenación de los genes, el ensamblaje y el repertorio de los anticuerpos. Esta estrategia se describe, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N.° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016, y las Patentes de Estados Unidos N.° 6.075.181 y 6.150.584 con respecto a la tecnología XenoMouse®; y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Como alternativa, el anticuerpo humano se puede preparar mediante la inmortalización de linfocitos B humanos produciendo un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (tales linfocitos B se pueden recuperar a partir de un individuo que padece un trastorno neoplásico o que puede haber sido inmunizado in vitro). Véanse, por ejemplo, Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985); Boerner y col., J. Immunol, 147 (1):86-95 (1991); y la Patente de Estados Unidos N.° 5.750.373.
3. Procesamiento adicional
[0114] Independientemente de cómo se obtengan, las células productoras de moduladores (por ejemplo, hibridomas, colonias de levaduras, etc.) se pueden seleccionar, clonar y después cribar para obtener unas características deseables, que incluyen, por ejemplo, un crecimiento robusto, una alta producción de anticuerpos y, como se indica con más detalle posteriormente, unas características deseables para un anticuerpo. Los hibridomas se pueden expandir in vivo en animales singénicos, en animales que carecen de sistema inmunitario, por ejemplo, ratones atímicos, o en un cultivo celular in vitro. Los expertos en la técnica estarán muy familiarizados con los
procedimientos para seleccionar, clonar y expandir hibridomas y/o colonias, cada uno de los cuales produce una especie de anticuerpo discreta.
B. Producción de moduladores recombinantes
1. Introducción
[0115] Una vez perfeccionada la fuente, se puede aislar y secuenciar fácilmente el ADN que codifica los moduladores de SEZ6 deseados utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos). Las células de hibridoma aisladas y subclonadas (o colonias derivadas de levaduras o fagos) pueden servir como fuente preferida del ADN si el modulador es un anticuerpo. Si se desea, el ácido nucleico se puede manipular adicionalmente tal como se describe en el presente documento para crear agentes que incluyen proteínas de fusión, o anticuerpos quiméricos, humanizados o completamente humanos. Más particularmente, el ADN aislado (que puede estar modificado) se puede utilizar para clonar secuencias de regiones constantes y variables para la fabricación de anticuerpos.
[0116] Por consiguiente, en casos ejemplares, se pueden producir anticuerpos de forma recombinante, utilizando procedimientos convencionales (tales como los que se exponen en Al-Rubeai; An, y Shire y col. todos anteriormente, y Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002)) en los cuales las células de hibridoma aisladas y subclonadas (colonias derivadas de levaduras o fagos) sirven como fuente preferida de moléculas de ácido nucleico.
[0117] El término «molécula de ácido nucleico», como se usa en el presente documento, pretende incluir moléculas de ADN y moléculas de ARN y variantes artificiales de las mismas (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos), ya sean monocatenarios o bicatenarios. Los ácidos nucleicos pueden codificar una o ambas cadenas de un anticuerpo de la invención, o un fragmento o derivado de los mismos. Las moléculas de ácido nucleico de la descripción también incluyen suficientes polinucleótidos para su uso como sondas de hibridación, cebadores de PCR o cebadores de secuenciación con el fin de identificar, analizar, mutar o amplificar un polinucleótido que codifica un polipéptido; ácidos nucleicos antisentido para inhibir la expresión de un polinucleótido, así como también secuencias complementarias. Los ácidos nucleicos pueden tener cualquier longitud. Por ejemplo, pueden tener una longitud de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1.000, 1.500, 3.000, 5.000 o más nucleótidos, y/o pueden comprender una o más secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias reguladoras, y/o formar parte de un ácido nucleico más grande, por ejemplo, un vector. Se apreciará que dichas secuencias de ácido nucleico se pueden manipular adicionalmente para crear moduladores que incluyen anticuerpos quiméricos, humanizados o completamente humanos. Más particularmente, las moléculas de ácido nucleico aislado (que pueden estar modificadas) se puede utilizar para clonar secuencias de regiones constantes y variables para la fabricación de anticuerpos como se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 7.709.611.
[0118] El término «ácido nucleico aislado» significa que el ácido nucleico (i) se amplificó in vitro, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) se produjo de forma recombinante por clonación, (iii) se purificó, por ejemplo, por escisión y fraccionamiento electroforético en gel o (iv) se sintetizó, por ejemplo, mediante una síntesis química. Un ácido nucleico aislado es un ácido nucleico que se puede manipular mediante técnicas de ADN recombinante.
[0119] Independientemente de que la fuente del ácido nucleico que codifica la porción inmunorreactiva deseada del anticuerpo se obtenga o derive de una tecnología de presentación en fagos, colecciones de levaduras, tecnología basada en hibridomas o sintéticamente, se debe entender que la presente invención abarca las moléculas de ácido nucleico y las secuencias que codifican los anticuerpos, o los fragmentos de unión al antígeno o derivados de los mismos. Además, la presente invención se refiere a vectores y células huésped que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico.
2. Hibridación e identidad de secuencia
[0120] Como se ha indicado, la descripción proporciona además ácidos nucleicos que se hibridan con otros ácidos nucleicos en condiciones de hibridación particulares. Más específicamente, la descripción abarca moléculas de ácido nucleico que se hibridan en condiciones de hibridación de rigurosidad moderada o alta (por ejemplo, como se define más adelante) con las moléculas de ácido nucleico de la invención. Los procedimientos para hibridar ácidos nucleicos son muy conocidos en la técnica. Como ya se sabe, unas condiciones de hibridación de rigurosidad moderada comprenden una solución de prelavado que contiene 5x cloruro sódico/citrato sódico (SSC), 0,5 % de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), tampón de hibridación de aproximadamente un 50 % de formamida, 6xSSC, y una temperatura de hibridación de 55 °C (u otras soluciones de hibridación similares, tales como una que contenga aproximadamente un 50 % de formamida, con una temperatura de hibridación de 42 °C) y condiciones de lavado de 60 °C, en 0,5xSSC,
0,1 % de SDS. A efectos comparativos, la hibridación en condiciones de hibridación de rigurosidad alta comprende el lavado con 6xSSC a 45 °C, seguido de uno o más lavados en 0,1xSSC, 0,2 % de SDS a 68 °C. Además, un experto en la técnica puede manipular las condiciones de hibridación y/o lavado para aumentar o reducir la rigurosidad de la hibridación, de modo que los ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que son al menos un 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o un 99 % de identidad entre sí típicamente se siguen hibridando entre sí.
[0121] La descripción también incluye moléculas de ácido nucleico que son «sustancialmente idénticas» a las moléculas de ácido nucleico descritas. En un caso, el término sustancialmente idéntica con respecto a una secuencia de ácido nucleico significa que se puede interpretar como una secuencia de moléculas de ácido nucleico que presentan al menos un 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o un 90 % de identidad de secuencia. En otros casos, las moléculas de ácido nucleico presentan una identidad secuencial de un 95 % o un 98 % respecto a la secuencia de ácido nucleico de referencia.
[0122] Los parámetros básicos que afectan a la elección de las condiciones de hibridación y las pautas para diseñar condiciones adecuadas se exponen, por ejemplo, en Sambrook, Fritsch, y Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 9 y 11; y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel y col., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4), y un experto en la técnica las podrá determinar fácilmente basándose en, por ejemplo, la longitud y/o la composición de bases del ácido nucleico.
[0123] La similitud secuencial entre polipéptidos, que también se denomina identidad secuencial, se mide normalmente utilizando un software para el análisis de secuencias. El software para el análisis de proteínas empareja secuencias similares utilizando mediciones de la similitud asignada a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluidas las sustituciones aminoacídicas conservadoras. Por ejemplo, la herramienta para el análisis de secuencias GCG (Accelrys Software Inc.) contiene programas, tales como «GAP» y «BEST-FIT», que se pueden utilizar con parámetros preestablecidos para determinar la homología secuencial o identidad secuencial entre polipéptidos relacionados estrechamente, tales como polipéptidos homólogos de especies de organismos diferentes o entre una proteína de tipo silvestre y una de sus muteínas. (Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1 o Durbin y Al., Biological Sequence Analysis: Probabilistic models of proteins and nucleic acids., Cambridge Press (1998)).
[0124] También se pueden comparar secuencias polipeptídicas utilizando FASTA con parámetros preestablecidos o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineamientos y el porcentaje de identidad secuencial de las regiones de la mejor superposición entre las secuencias de referencia y de examen (Pearson (2000), anteriormente). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la descripción con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de organismos diferentes es el programa informático BLAST, especialmente blastp o tblastn, utilizando parámetros preestablecidos. Véase, por ejemplo, Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403410 y Altschul y col. (1997) Nucleic Acids Res.25:3389 402.
[0125] A este respecto, la descripción también incluye moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos que son «sustancialmente idénticos» con respecto a una secuencia polipeptídica de la región variable de un anticuerpo (por ejemplo, ya sea la región variable de cadena ligera o pesada del donante, la región variable de cadena ligera o pesada del aceptor o la construcción humanizada resultante). Como se aplica a dichos polipéptidos, el término «identidad sustancial» o «sustancialmente idénticos» significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como por medio de los programas GAP o BEST-FIT utilizando penalizaciones por hueco preestablecidas, comparten al menos un 60 % o 65 % de identidad de secuencia, preferentemente al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 % o un 90 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos un 93 %, 95 %, 98 % o un 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren en sustituciones aminoacídicas conservadoras. Una «sustitución aminoacídica conservadora» es aquella donde un residuo aminoacídico se sustituye por otro residuo aminoacídico que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución aminoacídica conservadora no modificará de forma sustancial las propiedades funcionales de una proteína. En los casos donde dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí en sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad secuencial o el grado de similitud se puede ajustar al alza para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución.
3. Expresión
[0126] Los diferentes procesos de la expresión recombinante, es decir, la producción de ARN o de ARN y proteína/péptido, se conocen bien como se expone, por ejemplo, en Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Sambrook y col., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (2000); y Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel y col., eds., Current Protocols, una colaboración empresarial entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (en suplementos a lo largo de 2006).
[0127] Ciertos términos de interés incluyen «secuencia de control de la expresión» que comprende promotores,
sitios de unión al ribosoma, potenciadores y otros elementos de control que regulan la transcripción de un gen o la traducción de ARNm. Como se sabe con certeza, un «promotor» o una «región promotora» se refiere a una secuencia de ácido nucleico que está situada generalmente aguas arriba (5') con respecto a la secuencia de ácido nucleico que se está expresando y controla la expresión de la secuencia al proporcionar un sitio de reconocimiento y unión para la ARN-polimerasa.
[0128] Los promotores ejemplares que son compatibles según la invención incluyen promotores para la polimerasa SP6, t 3 y T7, el promotor de ARN U6 humano, el promotor de CMV y promotores híbridos artificiales de los mismos (por ejemplo, CMV) donde una o varias partes se fusionan con una o varias partes de promotores de genes de otras proteínas celulares tales como, por ejemplo, GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa) humana, y que incluyen o no uno o más intrones adicionales.
[0129] En ciertas realizaciones, la molécula de ácido nucleico puede estar presente en un vector, cuando proceda con un promotor, que controle la expresión del ácido nucleico. El término «vector» ya conocido comprende cualquier vehículo intermediario para un ácido nucleico que permite, por ejemplo, introducir el ácido nucleico en células procariotas y/o eucariotas y, cuando proceda, integrarlo en un genoma. Los procedimientos de transformación de células de mamífero son muy conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461, y 4.959.455. Los vectores pueden incluir una secuencia de nucleótidos que codifique un anticuerpo de la descripción (por ejemplo, un anticuerpo entero, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, una Vh o Vl de un anticuerpo, o una porción de los mismos, o una CDR de cadena pesada o ligera, un Fv monocatenario, o fragmentos o variantes del mismo), ligada operativamente a un promotor (véanse, por ejemplo, la publicación PCT WO 86/05807; la publicación PCT WO 89/01036; y la patente de Estados Unidos N.° 5.122.464).
[0130] Se comercializan una diversidad de sistemas vectoriales de expresión en el huésped, y muchos son compatibles con las enseñanzas en el presente documento y se pueden utilizar para expresar los moduladores de la invención. Dichos sistemas incluyen, pero sin limitación, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis, streptomyces) transformadas con ADN bacteriófago recombinante, vectores de expresión de ADN plasmídico o ADN cosmídico que contienen secuencias que codifican moduladores; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transfectada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias que codifican moduladores; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias que codifican moduladores; sistemas de células vegetales (por ejemplo, Nicotiana, Arabidopsis, lentejas de agua, maíz, trigo, patata, etc.) infectados con vectores de expresión víricos recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor; virus del mosaico del tabaco) o transfectados con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias que codifican moduladores; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 3T3, etc.) que albergan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K del virus vaccinia).
[0131] Como se usa en el presente documento, el término «célula huésped» incluye cualquier tipo de sistema celular que se puede modificar para que genere los polipéptidos y las moléculas de unión al antígeno de la presente descripción. En una realización, la célula huésped se modifica para permitir la producción de una molécula de unión al antígeno con glucoformas modificadas. En un caso preferido, la molécula de unión al antígeno o la variante de la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo o una proteína de fusión. En ciertas realizaciones, las células huésped han sido manipuladas adicionalmente para que expresen niveles más elevados de uno o más polipéptidos con actividad N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTI11). Las células huésped compatibles incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, tales como células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insecto y células vegetales, por nombrar solo algunas, pero también las células comprendidas en un animal transgénico, planta transgénica, o planta cultivada o tejido animal.
[0132] Para la producción a largo plazo y de alto rendimiento de proteínas recombinantes se prefiere la expresión estable. Por consiguiente, se pueden modificar genéticamente líneas celulares que expresan de forma estable el modulador seleccionado utilizando técnicas estándar reconocidas en la técnica. En vez de utilizar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación víricos, las células huésped se pueden transformar con ADN controlado por elementos para el control de la expresión adecuados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Se puede utilizar cualquiera de los sistemas de selección conocidos en la técnica, incluido el sistema de expresión del gen de la glutamina-sintetasa (el sistema GS) que proporciona una estrategia eficiente para incrementar la expresión en ciertas condiciones. El sistema GS se describe en su totalidad o en parte en relación con las patentes EP 0216846, 0256 055, 0323997 y 0338841 y las Patentes de Estados Unidos N.° 5.591.639 y 5.879.936. Otro sistema de expresión preferido, el kit Freedom™ CHO-S comercializado por Life Technologies (número de catálogo A13696-01), también facilita el desarrollo de líneas celulares estables que se pueden utilizar para producir moduladores.
[0133] Dichos sistemas de expresión en el huésped representan vehículos a través de los cuales se pueden
producir las secuencias codificantes de interés y posteriormente purificarlas, pero también representan células que, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos adecuadas, pueden expresar una molécula de la invención in situ. La célula huésped se puede cotransfectar con dos vectores de expresión de la descripción, por ejemplo, donde el primer vector codifica un polipéptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector codifica un polipéptido derivado de cadena ligera.
[0134] Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la presente invención proporciona células huésped recombinantes que permiten la expresión de anticuerpos o porciones de los mismos. Los anticuerpos producidos mediante la expresión en tales células huésped recombinantes se denominan en el presente documento anticuerpos recombinantes. La presente invención también proporciona células descendientes de dichas células huésped y anticuerpos producidos por las mismas.
C. Síntesis química
[0135] Además, los moduladores se pueden sintetizar químicamente utilizando técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, véanse Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y., y Hunkapiller, M., y col., 1984, Nature 310:105-111). Es más, si se desea, se pueden introducir aminoácidos no clásicos o análogos de aminoácidos químicos (tales como isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-aminoisobutírico, ácido 4-aminobutírico y similares) como una sustitución o una adición en una secuencia polipeptídica
D. Sistemas transgénicos
[0136] En otros casos, los moduladores se pueden producir transgénicamente mediante la generación de un mamífero o una planta que sea transgénico para moléculas recombinantes tales como las secuencias de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, y que produzca los compuestos deseados en una forma recuperable. Esto incluye, por ejemplo, la producción de moduladores proteicos (por ejemplo, anticuerpos) en leche de cabras, vacas u otros mamíferos, y su recuperación a partir de la leche. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172, y 5.741.957. En algunos casos, los animales transgénicos no humanos que comprenden loci de inmunoglobulina humana se inmunizan para producir anticuerpos.
[0137] Otras técnicas transgénicas se exponen en Hogan y col., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2a ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson y col., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); y Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999) y la Patente de Estados Unidos N.° 6.417.429. En algunos casos, los animales no humanos son ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado o caballos, y el producto deseado se produce en su sangre, leche, orina, saliva, lágrimas, mucosidad y otros fluidos corporales a partir de los cuales se puede obtener fácilmente utilizando técnicas de purificación reconocidas en la técnica.
[0138] Otros sistemas de producción compatibles incluyen procedimientos para crear anticuerpos en plantas tales como los que se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N.° 6.046.037 y 5.959.177.
E. Aislamiento/Purificación
[0139] Una vez se ha producido un modulador de la invención por expresión recombinante o cualquier otra de las técnicas descritas, este se puede purificar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica para la purificación de inmunoglobulinas o proteínas. A este respecto, el modulador se puede «aislar» lo que significa que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos terapéuticos o de diagnóstico para el polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. Los moduladores aislados incluyen un modulador in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente.
[0140] Si la molécula deseada se produce intracelularmente, como primera etapa, los desechos particulados, ya sean células huésped o fragmentos lisados, se pueden eliminar, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cuando el modulador se secreta al medio, el sobrenadante de tales sistemas de expresión generalmente se concentra primero utilizando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Pellicon (Millipore Corp.). Una vez que se eliminan los contaminantes insolubles, la preparación del modulador se puede purificar adicionalmente utilizando técnicas estándar tales como, por ejemplo, cromatografía en hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad de interés particular. A este respecto, la proteína A se puede utilizar para purificar anticuerpos que se basan en las cadenas pesadas de IgG1, IgG2 o IgG4 humana (Lindmark, y col., J Immunol Meth 62:1 (1983)), mientras que la proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para la IgG3 humana (Guss y col., EMBO J 5:1567 (1986)). También se dispone de otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, la precipitación en etanol, HPLC en fase inversa, la cromatografía en sílice, la cromatografía en
heparina, la cromatografía de sefarosa en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), el cromatoenfoque, SDS-PAGE y la precipitación en sulfato de amonio, dependiendo del anticuerpo que se desee recuperar. En casos particularmente preferidos, los moduladores de la presente descripción se purificarán, al menos en parte, utilizando cromatografía de afinidad con Proteína A o Proteína G.
VI. Fragmentos y derivados de los moduladores de SEZ6
[0141] Independientemente de la metodología de generación y producción que se seleccione, los moduladores de la presente descripción reaccionarán, se unirán, se combinarán, formarán complejos, se conectarán, se enlazarán, se adherirán, interaccionarán o se asociarán de otro modo con un determinante diana (por ejemplo, antígeno) y de este modo proporcionarán los resultados deseados. Cuando el modulador comprende un anticuerpo o un fragmento, construcción o derivado del mismo, dichas asociaciones pueden ser a través de uno o más «sitios de unión» o «componentes de unión» expresados en el anticuerpo, donde un sitio de unión comprende una región de un polipéptido que es responsable de la unión selectiva a una molécula o antígeno diana de interés. Los dominios de unión comprenden al menos un sitio de unión (por ejemplo, un anticuerpo IgG intacto tendrá dos dominios de unión y dos sitios de unión). Los dominios de unión ejemplares incluyen un dominio variable de un anticuerpo, un dominio de unión al receptor de un ligando, un dominio de unión al ligando de un receptor o un dominio enzimático.
A. Anticuerpos
[0142] Como se ha apreciado anteriormente, el término «anticuerpo» pretende incluir, al menos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos con injertos de CDR, anticuerpos humanizados y primatizados, anticuerpos humanos, anticuerpos producidos recombinantemente, intracuerpos, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos monovalentes, anticuerpos multivalentes, anticuerpos antiidiotípicos, así como también anticuerpos sintéticos.
B. Fragmentos
[0143] Independientemente del modulador (por ejemplo, quimérico, humanizado, etc.) que se seleccione para poner en práctica la invención, se apreciará que los fragmentos inmunorreactivos del mismo se pueden utilizar según las enseñanzas en el presente documento. Un «fragmento de anticuerpo» comprende al menos una porción de un anticuerpo intacto. Como se usa en el presente documento, el término «fragmento» de una molécula de anticuerpo incluye fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos, y el término «fragmento de unión al antígeno» se refiere a un fragmento polipeptídico de una inmunoglobulina o anticuerpo que se une o reacciona inmunoespecíficamente con un antígeno o determinante inmunogénico seleccionado del mismo, o compite con el anticuerpo intacto del cual se derivan los fragmentos por la unión específica al antígeno.
[0144] Los fragmentos ilustrativos incluyen: Vl, Vh , scFv, fragmento F(ab')2, fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv, fragmentos de un anticuerpo con un dominio único, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenarias y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de un anticuerpo. Además, un fragmento activo comprende una porción del anticuerpo que conserva su capacidad para interaccionar con el antígeno/sustratos o receptores y modificarlos de una forma similar a la de un anticuerpo intacto (aunque quizás de una forma menos eficiente).
[0145] En otras realizaciones, un fragmento de anticuerpo es aquel que comprende la región Fc y aquel que conserva al menos una de las funciones biológicas asociadas normalmente con la región Fc cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como la unión a FcRn, la modulación de la semivida del anticuerpo, la función ADCC y la unión al complemento. En una realización, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una semivida in vivo sustancialmente similar a la de un anticuerpo intacto. Por ejemplo, tal fragmento de anticuerpo puede comprender un brazo de unión al antígeno enlazado a una secuencia de Fc capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento.
[0146] Como reconocerán los expertos en la técnica, se pueden obtener fragmentos por tratamiento químico o enzimático (tal como papaína o pepsina) de un anticuerpo intacto o entero o una cadena de anticuerpo, o por medios recombinantes. Véase, por ejemplo, Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999), para consultar una descripción más detallada de los fragmentos de anticuerpo.
C. Derivados
[0147] La descripción incluye además derivados de moduladores inmunorreactivos y moléculas de unión al antígeno que comprenden una o más modificaciones.
1. Anticuerpos multivalentes
[0148] En una realización, los moduladores de la invención pueden ser monovalentes o mutivalentes (por
ejemplo, bivalentes, trivalentes, etc.). Como se usa en el presente documento, el término «valencia» se refiere al número de sitios de unión a diana potenciales asociados con un anticuerpo. Cada sitio de unión a la diana se une específicamente a una molécula diana o posición o locus específico en una molécula diana. Cuando un anticuerpo es monovalente, cada sitio de unión de la molécula se unirá específicamente a una única posición o epítopo antigénico. Cuando un anticuerpo comprende más de un sitio de unión a la diana (multivalente), cada sitio de unión a la diana se puede unir específicamente a moléculas idénticas o diferentes (por ejemplo, se puede unir a ligandos diferentes o antígenos diferentes, o epítopos o posiciones diferentes en el mismo antígeno). Véanse, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 2009/0130105. En cada caso, al menos uno de los sitios de unión comprenderá un epítopo, motivo o dominio asociado con una isoforma de SEZ6.
[0149] En una realización, los moduladores son anticuerpos biespecíficos donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes, como se describe en Millstein y col., 1983, Nature, 305:537-539. Otras realizaciones incluyen anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos triespecíficos. Otras construcciones multiespecíficas compatibles más sofisticadas y procedimientos para su fabricación se exponen en la Patente de Estados Unidos N.° 2009/0155255, así como el documento WO 94/04690; Suresh y col., 1986, Methods in Enzymology, 121:210; y el documento WO96/27011.
[0150] Como se ha indicado anteriormente, los anticuerpos multivalentes se pueden unir inmunoespecíficamente a epítopos diferentes de la molécula diana deseada o se pueden unir inmunoespecíficamente tanto a la molécula diana como también a un epítopo heterólogo, tal como un material de soporte sólido o polipéptido heterólogo. Aunque las realizaciones preferidas de los anticuerpos anti-SEZ6 se unen solamente a dos antígenos (es decir, anticuerpos biespecíficos), la presente invención también abarca anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos triespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos también incluyen anticuerpos reticulados o «heteroconjugados». Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar a avidina, el otro a biotina. Dichos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunitario a células no deseadas (Patente de Estados Unidos N.° 4.676.980), y para el tratamiento de la infección por VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden preparar utilizando cualesquiera procedimientos de reticulación convenientes. Los agentes reticulantes adecuados se conocen bien en la técnica, y se describen en la Patente de Estados Unidos N.° 4.676.980, junto con múltiples técnicas de reticulación.
[0151] En otras realizaciones más, los dominios variables de un anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios que combinan anticuerpo-antígeno) se fusionan con secuencias de un dominio constante de inmunoglobulina, tales como un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2, y/o CH3, utilizando procedimientos con los que estarán familiarizados los expertos en la técnica.
2. Modificaciones de la región Fc
[0152] Además de las diversas modificaciones, sustituciones, adiciones o deleciones de la región variable o de unión de los moduladores descritos (por ejemplo, Fc-SEZ6 o anticuerpos anti-SEZ6) expuestas anteriormente, los expertos en la técnica apreciarán que los casos seccionados de la presente descripción también pueden comprender sustituciones o modificaciones de la región constante (es decir, la región Fc). Más particularmente, se contempla que los moduladores de SEZ6 de la invención pueden contener, entre otros, una o más sustituciones, mutaciones y/o modificaciones de residuos aminoacídicos adicionales que den como resultado un compuesto con características preferidas que incluyen, pero sin limitación: propiedades farmacocinéticas alteradas, una semivida sérica mayor, una afinidad de unión mayor, una inmunogenicidad reducida, una producción mayor, una unión alterada del ligando de Fc a un receptor Fc (FcR), una actividad «ADCC» (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) o «CDC» (citotoxicidad dependiente del complemento) mayor o menor, una glucosilación alterada y/o enlaces disulfuro y una especificidad de unión modificada. A este respecto, se apreciará que estas variantes de Fc se puedan utilizar convenientemente para mejorar las propiedades antineoplásicas efectivas de los moduladores descritas.
[0153] Con este fin, ciertas realizaciones de la invención pueden comprender sustituciones o modificaciones de la región Fc, por ejemplo, la adición de uno o más residuos aminoacídicos, sustituciones, mutaciones y/o modificaciones para producir un compuesto con funciones efectoras de Fc mejoradas o preferidas. Por ejemplo, los cambios en los residuos aminoacídicos que participan en la interacción entre el dominio Fc y un receptor Fc (por ejemplo, FcyRI, FcyRIIA y B, FcyRIII y FcRn) pueden conducir a una citotoxicidad mayor y/o propiedades farmacocinéticas alteradas, tales como una semivida sérica mayor (véase, por ejemplo, Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel y col., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas y col., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)).
[0154] En realizaciones seleccionadas, se pueden generar anticuerpos con semividas in vivo mayores mediante la modificación (por ejemplo, sustitución, deleción o adición) de residuos aminoacídicos identificados como participantes en la interacción entre el dominio Fc y el receptor FcRn (véanse, por ejemplo, Publicaciones Internacionales N.° WO 97/34631; WO 04/029207; Patente de Estados Unidos N.° 6.737.056 y la Patente de Estados Unidos N.° 2003/0190311. En lo que respecta a tales realizaciones, las variantes de Fc pueden proporcionar semividas
en un mamífero, preferentemente un ser humano, superiores a 5 días, superiores a 10 días, superiores a 15 días, preferentemente superiores a 20 días, superiores a 25 días, superiores a 30 días, superiores a 35 días, superiores a 40 días, superiores a 45 días, superiores a 2 meses, superiores a 3 meses, superiores a 4 meses o superiores a 5 meses. El aumento de la semivida da como resultado una titulación sérica mayor que reduce así la frecuencia de la administración de los anticuerpos y/o reduce la concentración de los anticuerpos que se ha de administrar. La unión a FcRn humano in vivo y la semivida sérica de los polipéptidos de unión de alta afinidad a FcRn humano se pueden evaluar, por ejemplo, en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transfectadas que expresan FcRn humano, o en primates a los cuales se les administran los polipéptidos con una variante de la región Fc. El documento WO 2000/42072 describe variantes de anticuerpo con una unión mayor o menor a FcRn. Véase además, por ejemplo, Shields y col. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).
[0155] En otras realizaciones, las alteraciones de Fc pueden conducir a una actividad ADCC o CDC mayor o menor. Como se conoce en la técnica, CDC se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento, y ADCC se refiere a una forma de citotoxicidad donde la Ig secretada unida a FcR presente en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células asesinas naturales, neutrófilos y macrófagos) permite a estas células efectoras citotóxicas unirse específicamente a una célula diana portadora de antígeno y posteriormente destruir la célula diana con citotoxinas. En el contexto de la presente invención, las variantes de anticuerpo se proporcionan con una afinidad por la unión a FcR «alterada», la cual es una unión mayor o menor en comparación con un anticuerpo original o sin modificar o con un anticuerpo que comprende una secuencia de FcR nativa. Dichas variantes que presentan una unión menor pueden poseer una unión baja o inapreciable, por ejemplo, una unión de un 0-20 % al FcR en comparación con una secuencia nativa, por ejemplo, según se determina mediante técnicas muy conocidas en la técnica. En otras realizaciones, la variante exhibirá una mayor unión en comparación con el dominio Fc de inmunoglobulina nativa. Se apreciará que estos tipos de variantes de Fc se puedan utilizar convenientemente para mejorar las propiedades antineoplásicas efectivas de los anticuerpos descritos. En otras realizaciones más, tales alteraciones conducen a una mayor afinidad de unión, una inmunogenicidad menor, una producción mayor, una glucosilación alterada y/o puentes disulfuro (por ejemplo, para sitios de conjugación), una especificidad de unión modificada, una fagocitosis mayor; y/o la regulación descendente de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de linfocitos B; BCR), etc.
3. Glucosilación alterada
[0156] Aún otras realizaciones comprenden una o más glucoformas modificadas, es decir, un modulador de SEZ6 que comprende un patrón de glucosilación alterado o una composición de carbohidratos alterada que está enlazado covalentemente a la proteína (por ejemplo, en el dominio Fc). Véase, por ejemplo, Shields, R. L. y col. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740. Las glucoformas modificadas pueden ser útiles para diversos propósitos que incluyen, pero sin limitación, el aumento o la reducción de la función efectora, el aumento de la afinidad del modulador por una diana o el fomento de la producción del modulador. En ciertas realizaciones donde se desea reducir la función efectora, la molécula se puede modificar para que exprese una forma no glucosilada. Las sustituciones que pueden provocar la eliminación de uno o más sitios de glucosilación del marco de la región variable para suprimir de este modo la glucosilación en el sitio son muy conocidas (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N.° 5.714.350 y 6.350.861). En cambio, se pueden impartir mejores funciones efectoras o una unión mejorada a la molécula que contiene Fc añadiendo por ingeniería genética uno o más sitios de glucosilación adicionales.
[0157] Otras realizaciones incluyen una variante de Fc que tiene una composición de glucosilación alterada, tal como un anticuerpo hipofucosilado que contiene cantidades reducidas de residuos fucosílicos o un anticuerpo que tiene unas estructuras GlcNAc bisectrices mayores. Se ha demostrado que dichos patrones de glucosilación alterados aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Se pueden generar glucoformas modificadas mediante cualquier procedimiento con el que esté familiarizado un experto en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de cepas de expresión variantes o modificadas, mediante la coexpresión con una o más enzimas (por ejemplo, N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTI11)), mediante la expresión de una molécula que comprende una región Fc en diversos organismos o líneas celulares de diversos organismos, o mediante la modificación de uno o más carbohidratos después de que la molécula que comprende la región Fc se haya expresado (véase, por ejemplo, el documento WO 2012/117002).
4. Procesamiento adicional
[0158] Los moduladores se pueden modificar diferencialmente durante o después de la producción, por ejemplo, por glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, ligadura a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Se puede llevar a cabo cualquiera de entre numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas que incluyen, pero sin limitación, la escisión química específica por bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa V8, NaBH4, acetilación, formilación, oxidación, reducción, síntesis metabólica en presencia de tunicamicina, etc.
[0159] Diversas modificaciones postraduccionales que la invención también abarca incluyen, por ejemplo, cadenas carbohidrato unidas a través de N o unidas a través de O, el procesamiento de extremos N-terminales o Cterminales, la unión de restos químicos al esqueleto aminoacídico, modificaciones químicas de cadenas carbohidrato unidas a través de N o unidas a través de O y la adición o deleción de un residuo de metionina N-terminal como resultado de la expresión de células huésped procariotas. Además, los moduladores también se pueden modificar con un marcador detectable, tal como un marcador enzimático, fluorescente, radioisotópico o de afinidad para permitir la detección y el aislamiento del modulador.
VII. Características de los moduladores
[0160] Independientemente del modo de obtención o de las formas mencionadas anteriormente que el modulador adquiera, diversos casos de los moduladores descritos pueden exhibir ciertas características. En casos seleccionados, se pueden seleccionar, clonar y cribar posteriormente células productoras de anticuerpos (por ejemplo, hibridomas o colonias de levaduras) para obtener unas propiedades favorables que incluyen, por ejemplo, un crecimiento robusto, una alta producción de moduladores y, como se analiza con más detalle posteriormente, unas características deseables para un modulador. En otros casos, se pueden conferir o modificar las características del modulador seleccionando un antígeno particular (por ejemplo, una isoforma de SEZ6 específica o un fragmento de esta) o un fragmento inmunorreactivo del antígeno diana para su inoculación en el animal. En otros casos adicionales, los moduladores seleccionados se pueden modificar como se ha descrito anteriormente para mejorar o refinar sus características inmunoquímicas tales como la afinidad o propiedades farmacocinéticas.
A. Moduladores neutralizantes
[0161] En ciertas realizaciones, los moduladores comprenderán anticuerpos «neutralizantes», o derivados o fragmentos de los mismos. Es decir, la presente invención puede comprender moléculas de anticuerpo que se unen a dominios, motivos o epítopos específicos, y que son capaces de bloquear, reducir o inhibir la actividad biológica de SEZ6. Más generalmente, la expresión «anticuerpo neutralizante» se refiere a un anticuerpo que se une o interacciona con una molécula o ligando diana, y evita que la molécula diana se una o asocie con una entidad de unión, tal como un receptor o sustrato, y de este modo se interrumpe una respuesta biológica que de lo contrario provocaría la interacción de las moléculas.
[0162] Se apreciará que se pueden utilizar ensayos de unión competitiva conocidos en la técnica para evaluar la unión y la especificidad de un anticuerpo o fragmento o derivado inmunológicamente funcional del mismo. Con respecto a la presente invención, se entenderá que un anticuerpo o fragmento inhibe o reduce la unión de SEZ6 a una entidad de unión o sustrato (por ejemplo, un ligando neurotrófico) cuando un exceso de anticuerpo reduzca la cantidad de entidad de unión unida a SEz6 al menos aproximadamente un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o más según se mide, por ejemplo, mediante la actividad del ligando neurotrófico afectado o en un ensayo de unión competitiva in vitro. En el caso de los anticuerpos para SEZ6, por ejemplo, un anticuerpo neutralizante o antagonista preferentemente alterará la actividad del ligando al menos aproximadamente un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o más. Se apreciará que esta actividad modificada se puede medir directamente utilizando técnicas reconocidas en la técnica o se puede medir por el impacto que la actividad alterada ejerce posteriormente (por ejemplo, oncogénesis, supervivencia celular o activación de la vía).
B. Moduladores internalizantes
[0163] Aunque existen pruebas que indican que SEZ6 o isoformas seleccionadas del mismo pueden estar presentes en una forma soluble, es probable que al menos parte de SEZ6 permanezca asociada con la superficie celular, lo que permite la internalización de los moduladores descritos. Por consiguiente, los anticuerpos anti-SEZ6 de la presente invención pueden ser internalizados, al menos en cierto grado, por células que expresen SEZ6. Por ejemplo, un anticuerpo anti-SEZ6 que se una a SEZ6 en la superficie de una célula iniciadora de tumores podrá ser internalizado por la célula iniciadora de tumores. En casos particularmente preferidos, dichos anticuerpos anti-SEZ6 se pueden conjugar o asociar con agentes anticancerosos tales como restos citotóxicos que destruyen la célula al internalizarlos. En realizaciones particularmente preferidas, el modulador comprenderá un conjugado anticuerpo internalizante-fármaco.
[0164] Como se usa en el presente documento, un modulador que se «internaliza» es aquel que es captado (junto con cualquier carga útil) por la célula al unirse a un antígeno o receptor asociado. Como se apreciará, el modulador internalizante puede comprender, en casos preferidos, un anticuerpo que incluya fragmentos de anticuerpo y derivados del mismo, así como también conjugados de anticuerpo. La internalización puede tener lugar in vitro o in vivo. Para las aplicaciones terapéuticas, la internalización tendrá lugar preferentemente in vivo en un sujeto que lo necesite. El número de moléculas de anticuerpo internalizadas puede ser suficiente o adecuado para destruir una célula que expresa antígeno, especialmente una célula madre cancerosa que expresa antígeno. Dependiendo de la potencia del anticuerpo o el conjugado de anticuerpo, en algunos casos, la captación de una única molécula de anticuerpo en la célula es suficiente para destruir la célula diana a la cual se une el anticuerpo. Por ejemplo, ciertas toxinas son tan sumamente potentes que la internalización de unas pocas moléculas de la toxina conjugada con el anticuerpo es suficiente para destruir la célula tumoral. El hecho de que un anticuerpo se internalice al unirse a una
célula de mamífero se puede determinar mediante diversos ensayos, incluidos los que se describen más adelante en los Ejemplos (por ejemplo, los Ejemplos 15, 17 y 18). También se describen procedimientos para detectar si un anticuerpo se internaliza en una célula en la Patente de Estados Unidos N.° 7.619.068.
C. Moduladores supresores
[0165] En otras realizaciones, los anticuerpos comprenderán anticuerpos supresores, o derivados o fragmentos de los mismos. El término anticuerpo «supresor» se refiere a un anticuerpo que se une o asocia preferentemente con un antígeno en o cerca de la superficie celular, e induce, fomenta o provoca la muerte o la eliminación de la célula (por ejemplo, por CDC, ADCC o introducción de un agente citotóxico). En algunos casos, los anticuerpos supresores seleccionados estarán asociados o conjugados con un agente citotóxico.
[0166] Preferentemente, un anticuerpo supresor será capaz de suprimir, incapacitar, eliminar o destruir al menos un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o un 99 % de las células tumorigénicas con SEZ6 en una población de células definidas. En algunos casos, la población de células puede comprender células perpetuantes de tumores enriquecidas, seccionadas, purificadas o aisladas. En otros casos, la población de células puede comprender muestras tumorales enteras o extractos tumorales heterogéneos que comprenden células perpetuantes de tumores. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden utilizar técnicas bioquímicas estándar como las que se describen más adelante en los Ejemplos (por ejemplo, los Ejemplos 14 y 15) para monitorizar y cuantificar el agotamiento de células tumorigénicas o células perpetuantes de tumores según las enseñanzas en el presente documento.
D. Clasificación en secciones y unión a epítopos
[0167] Se apreciará además que los moduladores de anticuerpo anti-SEZ6 descritos se asociarán o se unirán a epítopos discretos o determinantes inmunogénicos presentados por la diana seccionada o un fragmento de la misma. En ciertas realizaciones, los epítopos o determinantes inmunogénicos incluyen agrupaciones químicamente tensioactivas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcares, grupos fosforilo o grupos sulfonilo y, en ciertas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Por lo tanto, el término «epítopo», tal como se utiliza en el presente documento, incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse específicamente a un receptor de linfocitos T o inmunoglobulina, o que interacciona de otro modo con una molécula. En ciertas realizaciones, se dice que un anticuerpo se une específicamente (o se une o reacciona inmunoespecíficamente) con un antígeno cuando reconoce preferencialmente su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. En realizaciones preferidas, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación en equilibrio (Kd) es inferior o igual a 10-6 M, o inferior o igual a 10-7 M, más preferentemente cuando la constante de disociación en equilibrio es inferior o igual a 10-8 M e incluso más preferentemente cuando la constante de disociación es inferior o igual a 10-9 M.
[0168] Más directamente, el término «epítopo» se utiliza con su sentido bioquímico común y se refiere a una porción de un antígeno diana que puede ser reconocida por un modulador de tipo anticuerpo particular y a la que este se une específicamente. Cuando el antígeno es un polipéptido, tal como SEZ6, se pueden formar epítopos generalmente a partir de tanto aminoácidos contiguos como aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína («epítopos conformacionales»). En dichos epítopos conformacionales, los puntos de interacción se encuentran entre residuos aminoacídicos en la proteína que están separados linealmente unos de otros. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos (denominados a veces epítopos «lineales» o «contiguos») normalmente se retienen al desnaturalizarse la proteína, mientras que los epítopos formados por el plegamiento terciario normalmente se pierden al desnaturalizarse la proteína. En cualquier caso, un epítopo de un anticuerpo típicamente incluye al menos 3 y más habitualmente al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una única conformación espacial.
[0169] A este respecto, se apreciará que, en ciertos casos, un epítopo se puede asociar con una o más regiones, dominios o motivos de la proteína SEZ6 o residir en estos (por ejemplo, los aminoácidos 1-906 de la isoforma 1). Como se indica más detalladamente en el presente documento, la región extracelular de la proteína SEZ6 comprende una serie de dominios generalmente reconocidos que incluyen cinco dominios Sushi y dos dominios CUB junto con un dominio N-terminal. A los efectos de la presente descripción, el término «dominio» se utilizará según su significado generalmente aceptado y se entenderá que se refiere a una entidad estructural conservada definible o identificable dentro de una proteína que exhibe un contenido estructural secundario característico. En muchos casos, los dominios homólogos con funciones comunes presentarán usualmente similitudes secuenciales y se pueden encontrar en diversas proteínas dispares (por ejemplo, existe constancia de la presencia de dominios Sushi en un gran número de proteínas diferentes). De forma similar, el término «motivo» reconocido en la técnica se utilizará según su significado habitual y se referirá en general a una región conservada corta de una proteína constituida normalmente por de diez a veinte residuos aminoacídicos contiguos. Como se analiza a lo largo del documento, los casos seleccionados comprenden moduladores que se asocian o unen a un epítopo dentro de regiones, dominios o motivos específicos de SEZ6.
[0170] En cualquier caso, una vez que se determina un epítopo deseado en un antígeno, se pueden generar anticuerpos para el epítopo, por ejemplo, por inmunización con un péptido que comprenda el epítopo utilizando técnicas que se describen en la presente invención. Como alternativa, durante el proceso de descubrimiento, la generación y la caracterización de anticuerpos pueden dilucidar información sobre epítopos deseables situados en dominios o motivos específicos. A partir de esta información, se puede entonces cribar anticuerpos competitivamente para la unión al mismo epítopo. Una estrategia para conseguir esto consiste en realizar estudios de competición para encontrar anticuerpos que se unan competitivamente uno respecto al otro, es decir, los anticuerpos compiten por la unión al antígeno. En el documento WO 03/48731 se describe un proceso de alto rendimiento para la clasificación en secciones de los anticuerpos en función de su competición cruzada. A continuación, en los Ejemplos 9 y 10, se exponen otros procedimientos para la clasificación en secciones o el mapeo de los epítopos o el nivel de dominios que comprenden la competición entre moduladores o la expresión de un fragmento antigénico en levaduras.
[0171] Como se usa en el presente documento, el término «clasificación en secciones» se refiere a procedimientos utilizados para agrupar o clasificar anticuerpos en función de sus características de unión al antígeno y competición. Aunque las técnicas son útiles para definir y categorizar los moduladores de la presente invención, las secciones no siempre se correlacionan directamente con epítopos y tales determinaciones iniciales de la unión a epítopos se pueden refinar aún más y confirmar mediante otra metodología reconocida en la técnica como la que se describe en el presente documento. Sin embargo, como se analiza y se muestra más adelante en los Ejemplos, la asignación empírica de moduladores de anticuerpo a secciones individuales proporciona información que puede ser indicativa del potencial terapéutico de los moduladores descritos.
[0172] Más específicamente, se puede determinar si un anticuerpo de referencia seleccionado (o fragmento del mismo) se une al mismo epítopo o presenta competición cruzada por la unión con un segundo anticuerpo de ensayo (es decir, pertenece a la misma sección) utilizando procedimientos conocidos en la técnica y que se exponen en los Ejemplos en el presente documento. En un caso, un modulador de tipo anticuerpo de referencia se asocia con un antígeno SEZ6 en condiciones de saturación y después se determina la capacidad de un modulador de tipo anticuerpo de ensayo o secundario para unirse a s EZ6 utilizando técnicas inmunoquímicas estándar. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse sustancialmente a SEZ6 al mismo tiempo que el anticuerpo anti-SEZ6 de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo o secundario se une a un epítopo diferente al del anticuerpo de referencia o primario. Sin embargo, si el anticuerpo de ensayo no es capaz de unirse sustancialmente a SEZ6 al mismo tiempo, entonces el anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo, un epítopo superpuesto o un epítopo que se encuentra muy próximo (al menos estéricamente) al epítopo al que se une el anticuerpo primario. Es decir, el anticuerpo de ensayo compite por la unión al antígeno y pertenece a la misma sección que el anticuerpo de referencia.
[0173] La expresión «competir» o «anticuerpo que compite», cuando se utiliza en el contexto de los moduladores descritos, se refiere a la competición entre anticuerpos según se determina con un ensayo donde un anticuerpo de ensayo o un fragmento inmunológicamente funcional objeto de estudio previene o inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común. Típicamente, un ensayo de este tipo supone el uso de antígeno purificado (por ejemplo, SEZ6 o un dominio o fragmento de este) unido a una superficie sólida o células portadoras de cualquiera de los mismos, una inmunoglobulina de ensayo sin marcar y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o las células en presencia de la inmunoglobulina de ensayo. Usualmente, la inmunoglobulina de ensayo está presente en exceso y/o se deja que se una primero. Los anticuerpos identificados mediante un ensayo de competición (anticuerpos competitivos) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente lo suficientemente próximo al epítopo al que se une el anticuerpo de referencia para que haya impedimentos estéricos. En los Ejemplos del presente documento se proporcionan detalles adicionales referentes a procedimientos para determinar la unión competitiva. Usualmente, cuando un anticuerpo competitivo esté presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común al menos un 30 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o un 75 %. En algunos casos, la unión se inhibe en al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o el 97 % o más.
[0174] En cambio, cuando se una el anticuerpo de referencia, inhibirá preferentemente la unión de un anticuerpo de ensayo añadido posteriormente (es decir, un modulador de SEZ6) al menos un 30 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o un 75 %. En algunos casos, la unión del anticuerpo de ensayo se inhibe en al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o el 97 % o más.
[0175] En lo que respecta a la presente invención, y como se expone en los Ejemplos 9 y 10 a continuación, se ha determinado (mediante resonancia de plasmón superficial o interferometría de biocapa) que el dominio extracelular de SEZ6 define al menos siete secciones por la unión competitiva denominadas en el presente documento de la «sección A» a la «sección F» y la sección U.
[0176] A este respecto y como consta en la técnica y se detalla más adelante en los Ejemplos, los datos sobre la clasificación en secciones o unión competitiva deseados se pueden obtener utilizando una metodología de radioinmunoensayo (RIA) indirecto o directo en fase sólida, inmunoensayo enzimático (EIA o ELISA) indirecto o directo en fase sólida, ensayo de competición de tipo sándwich, un sistema Biacore™ 2000 (es decir, resonancia de plasmón
superficial - GE Healthcare), un analizador ForteBio® (es decir, interferometría de biocapa - ForteBio, Inc.) o citometría de flujo. La expresión «resonancia de plasmón superficial», como se utiliza en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite analizar interacciones específicas a tiempo real mediante la detección de alteraciones en concentraciones proteicas dentro de una matriz biosensora. La expresión «interferometría de biocapa» se refiere a una técnica analítica óptica que analiza el patrón de interferencia de la luz blanca reflejada a partir de dos superficies: una capa de proteína inmovilizada en un cabezal biosensor y una capa de referencia interna. Cualquier cambio en el número de moléculas unidas al cabezal biosensor provoca un desplazamiento en el patrón de interferencia que se puede medir a tiempo real. En casos particularmente preferidos, el análisis (ya sea resonancia de plasmón superficial, interferometría de biocapa o citometría de flujo) se realizó utilizando un instrumento Biacore o ForteBio o un citómetro de flujo (por ejemplo, FACSAria II) como se demuestra más adelante en los Ejemplos.
[0177] Para caracterizar adicionalmente los epítopos con los que se asocian o unen los moduladores de anticuerpo de SEZ6 descritos, se realizó un mapeo de los epítopos a nivel de dominios utilizando una modificación del protocolo descrito por Cochran y col. (J Immunol Methods. 287 (1-2): 147-158 (2004)). Resumiendo, se expresaron dominios individuales de SEZ6 que comprendían secuencias de aminoácidos específicas en la superficie de una levadura y se determinó la unión de cada anticuerpo de SEZ6 por citometría de flujo. Los resultados se analizan a continuación en el Ejemplo 10 y se muestran en las FIGS. 14A y 14B.
[0178] Otras técnicas de mapeo de los epítopos compatibles incluyen mutantes por barrido de alanina, inmunotransferencia peptídica (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63),
o análisis de escisión peptídica. Además, se pueden emplear procedimientos tales como la escisión de epítopos, la extracción de epítopos y la modificación química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496).
[0179] En otros casos, la creación de perfiles asistida por modificación (MAP), conocida también como creación de perfiles de anticuerpos basada en la estructura de los antígenos (ASAP), proporciona un procedimiento que categoriza grandes números de anticuerpos monoclonales (mAb) dirigidos contra el mismo antígeno según las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo a superficies antigénicas modificadas química o enzimáticamente (Patente de Estados Unidos N.° 2004/0101920).
[0180] Cada categoría puede reflejar un epítopo único, ya sea claramente diferente o parcialmente superpuesto con el epítopo representado por otra categoría. Esta tecnología permite filtrar rápidamente anticuerpos genéticamente idénticos, de modo que la caracterización se puede centrar en anticuerpos genéticamente diferentes. Se apreciará que se puede utilizar MAP para clasificar los moduladores de anticuerpo de hSEZ6 de la descripción en grupos de anticuerpos que se unen a epítopos diferentes.
Los agentes útiles para alterar la estructura del antígeno inmovilizado incluyen enzimas tales como enzimas proteolíticas (por ejemplo, tripsina, endoproteinasa Glu-C, endoproteinasa Asp-N, quimotripsina, etc.). Los agentes útiles para alterar la estructura del antígeno inmovilizado también pueden ser agentes químicos, tales como esteres de succinimidilo y sus derivados, compuestos que contienen aminas primarias, hidrazinas y carbohidrazinas, aminoácidos libres, etc.
[0181] La proteína antigénica se puede inmovilizar en las superficies de un chip biosensor o microesferas de poliestireno. Estas últimas se pueden procesar con, por ejemplo, un ensayo tal como un ensayo de detección LUMINEX™ múltiplex (Luminex Corp.). Debido a la capacidad de LUMINEX para gestionar análisis múltiplex con hasta 100 tipos diferentes de microesferas, LUMINEX proporciona superficies antigénicas prácticamente ilimitadas con diversas modificaciones, lo que da como resultado una mejor resolución en la creación de perfiles de los epítopos de un anticuerpo en comparación con un ensayo con un biosensor.
E. Características de la unión de los moduladores
[0182] Aparte de la especificidad de epítopo, los anticuerpos descritos se pueden caracterizar utilizando características físicas tales como, por ejemplo, las afinidades de unión. A este respecto, la presente descripción abarca también el uso de anticuerpos que tienen una afinidad de unión alta para una o más isoformas de SEZ6 o, en el caso de pan-anticuerpos, más de un miembro de la familia SEZ6.
[0183] El término «Kd», como se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Se dice que un anticuerpo de la invención se une inmunoespecíficamente a su antígeno diana cuando la constante de disociación Kd (kdisociación/kasociación) es <10'7 M. El anticuerpo se une específicamente a un antígeno con una afinidad alta cuando la Kd es <5x10'9 M, y con una afinidad muy alta cuando la Kd es <5x10'10 M. En una realización de la invención, el anticuerpo tiene una Kd de <10'9 M y una velocidad de disociación de aproximadamente 1x10'4/s. En una realización de la invención, la velocidad de disociación es <1x10'5/s. En otras realizaciones de la invención, los anticuerpos se unirán a SEZ6 con una Kd de entre aproximadamente 10'7 M y 10'10 M, y en otra realización más, se unirá con una Kd < 2x10'10 M. Otras realizaciones seleccionadas adicionales de la presente invención comprenden anticuerpos que tienen una constante de disociación o Kd (kdisociación/kasociación) inferior a 10'2M, inferior a 5x10'2M, inferior a 10'3M, inferior a 5x10'3M, inferior a 10'4M, inferior a 5x10'4M, inferior a 10'5M, inferior a 5x10'5M, inferior a 10'6M, inferior a 5x10'6M, inferior a 10'7M, inferior a 5x10'7M,
inferior a 10'8M, inferior a 5x10'8M, inferior a 10'9M, inferior a 5x10'9M, inferior a inferior a 5x10'1°M, inferior a inferior a 5x10_11M, inferior a 10'12M, inferior a 5x10'12M, inferior a 10'13M, inferior a 5x10'13M, inferior a 10'14M, inferior a 5x10'14M, inferior a 10'15M o inferior a 5x10'15M.
[0184] En realizaciones específicas, un anticuerpo de la invención que se une inmunoespecíficamente a SEZ6 tiene una constante de la velocidad de asociación o velocidad kasociación (o ka) (SEZ6 (Ab) antígeno (Ag)kasociación-^ Ab-Ag) de al menos 105M-1s-1, al menos 2x105M-1s-1, al menos 5x105M-1s-1, al menos 106M-1s-1, al menos 5x106M-1s-1, al menos 107M-1s-1, al menos 5x107M-1s-1, o al menos 108M-1s-1.
[0185] En otra realización, un anticuerpo de la invención que se une inmunoespecíficamente a SEZ6 tiene una constante de la velocidad de disociación o velocidad kdisociación (o kd) (SEZ6 (Ab) antígeno (Ag)kdisociación-^ Ab-Ag) inferior a 10-1s-1, inferior a 5x10-1s-1, inferior a 10-2s-1, inferior a 5x10-2s-1, inferior a 10-3s-1, inferior a 5x10-3s-1, inferior a 10-4s-1, inferior a 5x10-4s-1, inferior a 10-5s-1, inferior a 5x10-5s-1, inferior a 10-6s-1, inferior a 5x10-6s-1 inferior a 10-7s-1, inferior a 5x10-7s-1, inferior a 10-8s-1, inferior a 5x10-8s-1, inferior a 10-9s-1, inferior a 5x10-9s-1 o inferior a 10-10s-1.
[0186] En otras realizaciones seleccionadas de la presente invención, los anticuerpos anti-SEZ6 tendrán una constante de afinidad o Ka (kasociación/kdisociación) de al menos 102M-1, al menos 5x102M-1, al menos 103M-1, al menos 5x103M-1, al menos 104M-1, al menos 5x104M-1, al menos 105M-1, al menos 5x105M-1, al menos 106M-1, al menos 5x106M-1, al menos 107M-1, al menos 5x107M-1, al menos 108M-1, al menos 5x108M-1, al menos 109M-1, al menos 5x109M-1, al menos 1010M-1, al menos 5x1010M-1, al menos 1011M-1, al menos 5x1011M-1, al menos 1012M-1, al menos 5x1012M-1, al menos 1013M-1, al menos 5x1013M-1, al menos 1014M-1, al menos 5x1014M-1, al menos 1015M-1 o al menos 5x1015M-1.
[0187] Aparte de las características de los moduladores mencionadas anteriormente, los anticuerpos de la presente invención se pueden caracterizar además utilizando características físicas adicionales que incluyen, por ejemplo, la estabilidad térmica (es decir, la temperatura de fusión; Tm) y los puntos isoeléctricos. (Véanse, por ejemplo, Bjellqvist y col., 1993, Electrophoresis 14:1023; Vermeer y col., 2000, Biophys. J. 78:394-404; Vermeer y col., 2000, Biophys. J. 79: 2150-2154).
VIII. Moduladores conjugados
A. Introducción
[0188] Una vez que los moduladores de la invención se hayan generado y/o fabricado y seleccionado según las enseñanzas en el presente documento, se pueden unir, fusionar, conjugar (por ejemplo, de forma covalente o no covalente) o asociar de otro modo con restos para el diagnóstico o farmacéuticamente activos, o modificadores biocompatibles. Como se usan en el presente documento, los términos «conjugado», «conjugado modulador» o «conjugado de anticuerpo», se utilizarán en un sentido amplio y se establecerá que se refieren a cualquier molécula biológicamente activa o detectable, o fármaco asociado con los moduladores descritos independientemente del procedimiento de asociación. A este respecto, se entenderá que tales conjugados pueden comprender, además de los moduladores descritos, péptidos, polipéptidos, proteínas, profármacos que son metabolizados para obtener un agente activo in vivo, polímeros, moléculas de ácido nucleico, moléculas de bajo peso molecular, agentes de unión, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas y radioisótopos. Además, como se ha indicado anteriormente, el conjugado seleccionado puede estar asociado de forma covalente o no covalente con el modulador o ligado a este y presentar diversas proporciones molares estequiométricas dependiendo, al menos en parte, del procedimiento empleado para conseguir la conjugación.
[0189] Los aspectos particularmente preferidos de la presente descripción comprenderán conjugados anticuerpo-modulador o conjugados anticuerpo-fármaco que se pueden utilizar para el diagnóstico y/o el tratamiento de trastornos proliferativos. Se apreciará que, a menos que el contexto dicte lo contrario, se entenderá que las expresiones «conjugado anticuerpo-fármaco» o «ADC» o la fórmula M-[L-D]n abarcan los conjugados que comprenden restos tanto restos terapéuticos como de diagnóstico. En tales casos, los compuestos de conjugado anticuerpo-fármaco comprenderán un modulador de SEZ6 (típicamente un anticuerpo anti-SEZ6) como la unidad moduladora o de unión celular (abreviada como CBA, M o Ab en el presente documento), un resto terapéutico (por ejemplo, agente anticanceroso) o de diagnóstico (D), y opcionalmente un conector (L) que une el fármaco al agente de unión al antígeno. A los efectos de la presente descripción, se entenderá que «n» se refiere a un número entero de 1 a 20. En un caso preferido, el modulador es un mAb de SEZ6 que comprende al menos una CDR de las regiones variables de cadena pesada y ligera como se describe anteriormente.
[0190] Los expertos en la técnica apreciarán que se dispone de varias reacciones diferentes para el enlace o la asociación de restos terapéuticos o de diagnóstico y/o conectores con agentes de unión. En casos seleccionados, esto se puede conseguir haciendo reaccionar los residuos aminoacídicos del agente de unión, por ejemplo, la molécula de anticuerpo, que incluyen los grupos amino de la lisina, los grupos de tipo ácido carboxílico libres del ácido glutámico y aspártico, los grupos sulfhidrilo de la cisteína y los diferentes restos de los aminoácidos aromáticos. Uno de los procedimientos no específicos de enlace covalente utilizados más habitualmente es la reacción carbodiimida para unir
un grupo carboxi (o amino) de un compuesto con grupos amino (o carboxi) del anticuerpo. Además, se han utilizado agentes bifuncionales, tales como dialdehídos o imidoésteres, para enlazar los grupos amino de un compuesto con grupos amino de una molécula de anticuerpo. Para el enlace de fármacos con agentes de unión, también se dispone de la reacción que produce una base de Schiff. Este procedimiento implica la oxidación con peryodato de un fármaco que contiene grupos glicol o hidroxi, para formar así un aldehído que posteriormente se hace reaccionar con el agente de unión. La unión tiene lugar mediante la formación de una base de Schiff con grupos amino del agente de unión. También se pueden utilizar isotiocianatos y azolactonas como agentes de acoplamiento para enlazar covalentemente fármacos con agentes de unión.
[0191] En otros casos, los moduladores descritos de la descripción se pueden conjugar o asociar con proteínas, polipéptidos o péptidos que confieren características seleccionadas (por ejemplo, biotoxinas, biomarcadores, marcadores de purificación, etc.). En ciertos casos preferidos, la presente descripción abarca el uso de moduladores o fragmentos de los mismos fusionados de forma recombinante o conjugados químicamente (incluidas tanto las conjugaciones covalentes como no covalentes) con una proteína o el péptido heterólogo, donde la proteína o el péptido comprende al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos. La construcción no requiere necesariamente estar unido directamente, pero puede que esto ocurra a través de secuencias conectoras de aminoácidos. Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos para dirigir polipéptidos heterólogos a tipos de células particulares que expresen SEZ6, ya sea in vitro o in vivo, fusionando o conjugando los moduladores de la presente invención con anticuerpos específicos para receptores de la superficie celular particulares con el fin de proporcionar construcciones biespecíficas. Además, también se pueden utilizar moduladores fusionados o conjugados con polipéptidos heterólogos en inmunoensayos in vitro y pueden ser particularmente compatibles con la metodología de purificación (por ejemplo, marcadores His) como se conoce en la técnica. Véanse, por ejemplo, la publicación Internacional N.° WO 93/21232; la Patente Europea N.° EP 439.095; Naramura y col., 1994, Immunol. Lett. 39:91-99; la Pat. de Estados Unidos N.° 5.474.981; Gillies y col., 1992, PNAS 89:1428-1432; y Fell y col., 1991, J. Immunol. 146:2446-2452.
B. Conectores
[0192] Aparte de los conectores o espaciadores peptídicos mencionados anteriormente, se apreciará que se pueden utilizar otras variedades o tipos de conector diferentes para asociar los moduladores descritos con restos de diagnóstico o farmacéuticamente activos o modificadores biocompatibles. En algunas realizaciones, el conector se puede escindir en condiciones intracelulares, de modo que la escisión del conector libere la unidad de fármaco del anticuerpo en el entorno intracelular. En otras realizaciones adicionales, la unidad conectora no se puede escindir y el fármaco se libera, por ejemplo, por degradación del anticuerpo.
[0193] Los conectores del ADC son preferentemente estables extracelularmente, evitan la agregación de moléculas de ADC y mantienen el ADC soluble libremente en medios acuosos y en un estado monomérico. Antes de su transporte o suministro a la célula, el conjugado anticuerpo-fármaco (ADC) es preferentemente estable y permanece intacto, es decir, el anticuerpo permanece unido al resto de fármaco. Los conectores son estables fuera de la célula diana y se pueden escindir con una cierta tasa eficaz dentro de la célula. Un conector eficaz: (i) mantendrá las propiedades de unión específicas del anticuerpo; (ii) permitirá el suministro intracelular del conjugado o el resto de fármaco; (iii) permanecerá estable e intacto, es decir, sin escindirse, hasta que el conjugado se haya suministrado o transportado a su sitio seleccionado como diana; y (iv) mantendrá un efecto de destrucción de células citotóxico o un efecto citostático del resto de fármaco PBD. La estabilidad del ADC se puede medir mediante técnicas analíticas estándar tales como espectrometría de masas, HPLC y la técnica de separación/análisis por LC/MS. La unión covalente del anticuerpo y el resto de fármaco requiere que el conector tenga dos grupos funcionales reactivos, es decir, bivalencia en un sentido reactivo. Se conocen reactivos conectores bivalentes que son útiles para enlazar dos o más restos funcionales o biológicamente activos, tales como péptidos, ácidos nucleicos, fármacos, toxinas, anticuerpos, haptenos y grupos indicadores, y ciertos procedimientos han descrito sus conjugados resultantes (Hermanson, G.T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: Nueva York, pág. 234-242).
[0194] Con este fin, ciertas realizaciones de la invención comprenden el uso de un conector que puede ser escindido por un agente de escisión que esté presente en el entorno intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveola). El conector puede ser, por ejemplo, un conector peptidilo que sea escindido por una enzima peptidasa o proteasa intracelular, que incluye, sin carácter limitante, una proteasa lisosomal o endosomal. En algunas realizaciones, el conector peptidilo tiene una longitud de al menos dos aminoácidos o al menos tres aminoácidos. Los agentes de escisión pueden incluir las catepsinas B y D, y plasmina, cada una de las cuales se sabe que hidroliza derivados de fármacos dipeptídicos, lo que da como resultado la liberación del fármaco activo dentro de las células diana. Algunos conectores peptidilo ilustrativos que pueden ser escindidos por la proteasa catepsina B dependiente de tiol son péptidos que comprenden Phe-Leu, ya que se ha comprobado que la catepsina B se expresa en grandes cantidades en el tejido canceroso. Otros ejemplos de tales conectores se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 6.214.345 y la Patente de Estados Unidos N.° 2012/0078028.
[0195] En una realización preferida específica, el conector peptidilo que puede ser escindido por una proteasa intracelular es un conector Val-Cit, un conector Ala-Val o un conector Phe-Lys tal como se describe en la Patente de
Estados Unidos N.° 6.214.345. Una ventaja del uso de la liberación proteolítica intracelular del agente terapéutico es que el agente típicamente se atenúa cuando se conjuga y las estabilidades séricas de los conjugados son típicamente altas.
[0196] En otras realizaciones, el conector escindible es sensible al pH, es decir, sensible a la hidrólisis a ciertos valores de pH. Típicamente, el conector sensible al pH se puede hidrolizar en condiciones ácidas. Por ejemplo, se puede utilizar un conector lábil en medio ácido que se pueda hidrolizar en el lisosoma (por ejemplo, una hidrazona, oxima, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal o similar) (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.122.368; 5.824.805; 5.622.929). Dichos conectores son relativamente estables en condiciones de pH neutro, tales como aquellas en la sangre, pero son inestables a un pH inferior a 5,5 o 5,0, el pH aproximado del lisosoma.
[0197] En otras realizaciones más, el conector se puede escindir en condiciones reductoras (por ejemplo, un conector de disulfuro). En la técnica se conocen varios conectores de disulfuro, incluidos, por ejemplo, los que se pueden formar utilizando SATA (N-succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-pi ridilditio) butirato) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-pi ridilditio)tolueno). En otras realizaciones específicas más, el conector es un conector de malonato (Johnson y col., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), un conector de maleimidobenzoílo (Lau y col., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304), o un análogo de 3'-N-amida (Lau y col., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12). En otras realizaciones adicionales, la unidad conectora no se puede escindir y el fármaco se libera por degradación del anticuerpo. (Véase la Publicación de Estados Unidos N.° 2005/0238649).
[0198] Más particularmente, en realizaciones preferidas (expuestas en la Patente de Estados Unidos N.° 2011/0256157)
los conectores compatibles comprenderán:
donde el asterisco indica el punto de unión al agente citotóxico, CBA es un agente de unión celular/modulador, L1 es un conector, A es un grupo conector que conecta L1 con el agente de unión celular, L2 es un enlace covalente, o junto con -OC(=O)- forma un conector autodestructivo, y L1 o L2 es un conector autoescindible.
[0199] L1 es preferentemente el conector escindible, y se puede considerar el detonante de la activación del conector para su escisión.
[0200] La naturaleza de L1 y L2, cuando estén presentes, puede variar en gran medida. Estos grupos se eligen dependiendo de sus características de escisión, que pueden venir dictadas por las condiciones en el sitio donde se suministre el conjugado. Se prefieren aquellos conectores que son escindidos por acción de enzimas, aunque también se pueden utilizar conectores que pueden ser escindidos por cambios en el pH (por ejemplo, lábiles en medio ácido o básico), la temperatura o por irradiación (por ejemplo, fotolábiles). Los conectores que se pueden escindir en condiciones reductoras u oxidantes también pueden ser útiles en la presente invención.
[0201] L1 puede comprender una secuencia contigua de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos puede ser el sustrato diana de la escisión enzimática, lo cual permite liberar así R10 de la posición N10.
[0202] En una realización, L1 puede escindirse por acción de una enzima. En una realización, la enzima es una esterasa o una peptidasa.
[0203] En una realización, L2 está presente y junto con -C(=O)O- forma un conector autodestructivo. En una realización, L2 es un sustrato de la actividad enzimática, lo cual permite liberar así R10 de la posición N10.
[0204] En una realización, cuando L1 puede escindirse por la acción de una enzima y L2 está presente, la enzima escinde el enlace entre L1 y L2.
[0205] L1 y L2, cuando están presentes, pueden conectarse por un enlace seleccionado de:
-C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-,-OC(=O)NH-, y -NHC(=O)NH-.
[0206] Un grupo amino de L1 que conecta con L2 puede ser el extremo N-terminal de un aminoácido o puede derivar de un grupo amino de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido lisina.
[0207] Un grupo carboxilo de L1 que conecta con L2 puede ser el extremo C-terminal de un aminoácido o puede
derivar de un grupo carboxilo de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido ácido glutámico.
[0208] Un grupo hidroxilo de L1 que conecta con L2 puede derivar de un grupo hidroxilo de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido serina.
[0209] El término «cadena lateral aminoacídica» incluye aquellos grupos que se encuentran en: (i) aminoácidos de origen natural tales como alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina; (ii) aminoácidos secundarios tales como ornitina y citrulina; (iii) aminoácidos no naturales, beta-aminoácidos, análogos sintéticos y derivados de aminoácidos de origen natural; y (iv) todos los enantiómeros, diastereómeros, formas protegidas, enriquecidas isoméricamente, marcadas isotópicamente (por ejemplo, 2H, 3H, 14C, 15N), y mezclas racémicas de los mismos.
[0210] En una realización, -C(=O)O- y L2 forman juntos el grupo:
donde el asterisco indica el punto de unión con la posición del fármaco o el agente citotóxico, la línea ondulada indica el punto de unión al conector L1, Y es -N(H)-, -O-, -C(=O)N(H)- o -C(=O)O-, y n es 0 a 3. El anillo de fenileno está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes como los que se describen en el presente documento. En una realización, el grupo fenileno está opcionalmente sustituido con halo, NO2, R u OR.
[0211] En una realización, Y es NH.
[0212] En una realización, n es 0 o 1. Preferentemente, n es 0.
[0213] Cuando Y es NH y n es 0, el conector autodestructivo se puede denominar conector de tipo paminobencilcarbonilo (PABC).
[0214] El conector autodestructivo permitirá liberar el compuesto protegido cuando se active un sitio distante, que procederá a lo largo de las líneas mostradas a continuación (para n = 0):
donde L* es la forma activada de la porción remanente del conector. Estos grupos presentan la ventaja de separar el sitio de activación del compuesto que se está protegiendo. Como se ha descrito anteriormente, el grupo fenileno está opcionalmente sustituido.
En una realización descrita en el presente documento, el grupo L* es un conector L1 como se ha descrito en el presente documento, que puede incluir un grupo dipeptídico.
[0215] En otra realización, -C(=O)O- y L2 forman juntos un grupo seleccionado de:
donde el asterisco, la línea ondulada, Y y n son como se han definido anteriormente. Cada anillo de fenileno está opcionalmente sustituido con uno, dos o tres sustituyentes como los que se describen en el presente documento. En una realización, el anillo de fenileno que tiene el sustituyente Y está opcionalmente sustituido y el anillo de fenileno que no tiene el sustituyente Y no está sustituido. En una realización, el anillo de fenileno que tiene el sustituyente Y no está sustituido y el anillo de fenileno que no tiene el sustituyente Y está opcionalmente sustituido.
[0216] En otra realización, -C(=O)O- y L2 forman juntos un grupo seleccionado de:
donde el asterisco, la línea ondulada, Y, y n son como se definen anteriormente, E es O, S o NR, D es N, CH, o CR, y F es N, CH, o CR.
[0217] En una realización, D es N.
[0218] En una realización, D es CH.
[0219] En una realización, E es O o S.
[0220] En una realización, F es CH.
[0221] En una realización preferida, el conector es un conector lábil a catepsina.
[0222] En una realización, L1 comprende un dipéptido. El dipéptido se puede representar como -NH-X1-X2-CO-, donde -NH- y -CO- representan los extremos N y C-terminales de los grupos aminoacídicos X1 y X2 respectivamente. Los aminoácidos del dipéptido pueden ser cualquier combinación de aminoácidos naturales. Cuando el conector es un conector lábil a catepsina, el dipéptido puede ser el sitio de acción de la escisión mediada por catepsina.
[0223] Adicionalmente, para los grupos aminoacídicos que tienen una funcionalidad en la cadena lateral amino o carboxilo, por ejemplo, Glu y Lys respectivamente, CO y n H pueden representar esa funcionalidad en la cadena lateral.
[0224] En una realización, el grupo -X1-X2- en el dipéptido, -NH-X1-X2-CO-, se selecciona de:
-Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, -Val-Cit-, -Phe-Cit-, -Leu-Cit-, -Ile-Cit-,-Phe-Arg- y -Trp-Cit-, donde Cit es citrulina.
[0225] Preferentemente, el grupo -X1-X2- en el dipéptido, -NH-X1-X2-CO-, se selecciona de:
-Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, y -Val-Cit-.
[0226] Mucho más preferentemente, el grupo -X1-X2- en el dipéptido, -NH-X1-X2-CO-, es -Phe-Lys- o -Val-Ala-
[0227] Se pueden utilizar otras combinaciones dipeptídicas, incluidas las descritas por Dubowchik y col., Bioconjugate Chemistry, 2002, 13.855-869.
[0228] En una realización, la cadena lateral aminoacídica se derivatiza, cuando sea apropiado. Por ejemplo, se puede derivatizar un grupo amino o un grupo carboxi de una cadena lateral aminoacídica.
[0229] En una realización, un grupo amino NH2 de un aminoácido con cadena lateral, tal como la lisina, es una forma derivatizada seleccionada del grupo que consiste en NHR y NRR'.
[0230] En una realización, un grupo carboxi COOH de un aminoácido con cadena lateral, tal como el ácido
aspártico, es una forma derivatizada seleccionada del grupo que consiste en COOR, CONH2, CONHR y CONRR'.
[0231] En una realización, la cadena lateral aminoacídica está protegida químicamente, cuando sea apropiado.
El grupo protector de la cadena lateral puede ser un grupo como los que se analizan a continuación en relación con el grupo RL. Las secuencias aminoacídicas protegidas pueden ser escindidas por enzimas. Por ejemplo, se ha establecido que una secuencia dipeptídica que comprende un residuo de Lys, cuya cadena lateral está protegida con
Boc, puede escindirse por catepsina.
[0232] Los grupos protectores para las cadenas laterales de aminoácidos son muy conocidos en la técnica y se describen en el catálogo de Novabiochem. Se exponen estrategias de grupos protectores adicionales en Protective Groups in Organic Synthesis, Greene y Wuts.
[0233] A continuación se muestran grupos protectores de cadenas laterales posibles para aquellos aminoácidos que tengan una funcionalidad reactiva en la cadena lateral:
Arg: Z, Mtr, Tos;
Asn: Trt, Xan;
Asp: Bzl, t-Bu;
Cys: Acm, Bzl, Bzl-OMe, Bzl-Me, Trt;
Glu: Bzl, t-Bu;
Gln: Trt, Xan;
His: Boc, Dnp, Tos, Trt;
Lys: Boc, Z-Cl, Fmoc, Z, Alloc;
Ser: Bzl, TBDMS, TBDPS;
Thr: Bz;
Trp: Boc;
Tyr: Bzl, Z, Z-Br.
[0234] En una realización, la protección de las cadenas laterales se selecciona de modo que sea ortogonal respecto a un grupo proporcionado como grupo desactivante o que forme parte de este, cuando esté presente. Por tanto, la eliminación del grupo protector de la cadena lateral no elimina el grupo desactivante ni ninguna otra funcionalidad de grupo protector que forme parte del grupo desactivante.
[0235] En otras realizaciones de la invención, los aminoácidos seleccionados son aquellos que no tienen ninguna funcionalidad reactiva en la cadena lateral. Por ejemplo, los aminoácidos se pueden seleccionar de: Ala, Gly,
Ile, Leu, Met, Phe, Pro, y Val.
[0236] En una realización, el dipéptido se utiliza combinado con un conector autodestructivo. El grupo autodestructivo puede estar conectado a -X2-.
[0237] Cuando hay un conector autodestructivo presente, -X2- está conectado directamente al conector autodestructivo. Preferentemente, el grupo -X2-CO- está conectado a Y, donde Y es NH, para formar de este modo el grupo -X2-CO-NH-.
[0238] -NH-X1- está conectado directamente a A. A puede comprender la funcionalidad -CO- para formar de
este modo un enlace amida con -X1-.
[0239] En una realización, L1 y L2 junto con -OC(=O)- comprenden el grupo NH-X1-X2-CO-PABC-. El grupo
PABC está conectado directamente al agente citotóxico. Preferentemente, el conector autodestructivo y el dipéptido forman juntos el grupo -NH-Phe-Lys-CO-NH-PABC-, que se ilustra a continuación:
donde el asterisco indica el punto de unión con el resto citotóxico seleccionado, y la línea ondulada indica el punto de unión con la porción remanente del conector L1 o el punto de unión con A. Preferentemente, la línea ondulada indica
el punto de unión con A. La cadena lateral del aminoácido Lys puede estar protegida, por ejemplo, con Boc, Fmoc o Alloc, como se ha descrito anteriormente.
[0240] Como alternativa, el conector autodestructivo y el dipéptido forman juntos el grupo -NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-, que se ilustra a continuación:
donde el asterisco y la línea ondulada son como se definen anteriormente.
[0241] Como alternativa, el conector autodestructivo y el dipéptido forman juntos el grupo -NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-, que se ilustra a continuación:
donde el asterisco y la línea ondulada son como se definen anteriormente.
[0242] En algunas realizaciones de la presente invención, puede que se prefiera que si el resto de fármaco contiene un enlace imina sin proteger, por ejemplo, si el resto B está presente, entonces el conector no contenga un grupo amino libre (H2N-). Por lo tanto, si el conector tiene la estructura -A-L1-L2-, entonces esta preferentemente no contendría un grupo amino libre. Esta preferencia es particularmente relevante cuando el conector contiene un dipéptido, por ejemplo, como L1; en esta realización, se preferiría que uno de los dos aminoácidos seleccionados no fuera lisina.
[0243] Sin desear quedar vinculado a ninguna teoría, la combinación de un enlace imina sin proteger en el resto de fármaco y un grupo amino libre en el conector puede provocar la dimerización del resto fármaco-conector que puede interferir con la conjugación de tal resto fármaco-conector con un anticuerpo. La reacción cruzada de estos grupos se puede acelerar en el caso donde el grupo amino libre esté presente como un ión de amonio (H3N+-), tal como cuando se utiliza un ácido fuerte (por ejemplo, TFA) para desproteger el grupo amino libre.
[0244] En una realización, A es un enlace covalente. Por lo tanto, L1 y el agente de unión celular están conectados directamente. Por ejemplo, cuando L1 comprende una secuencia de aminoácidos contigua, el extremo N-terminal de la secuencia puede estar directamente conectado al agente de unión celular.
[0245] Por lo tanto, cuando A sea un enlace covalente, la conexión entre el agente de unión celular y L1 se puede seleccionar de:
-C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-,-OC(=O)NH-, -NHC(=O)NH-, -C(=O)NHC(=O)-, -S-, -S-S-, -CH2C(=O)-, y =N-NH-.
[0246] Un grupo amino de L1 que conecta con el modulador de SEZ6 puede ser el extremo N-terminal de un aminoácido o puede derivar de un grupo amino de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido lisina.
[0247] Un grupo carboxilo de L1 que conecta con el modulador puede ser el extremo C-terminal de un aminoácido o puede derivar de un grupo carboxilo de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido ácido glutámico.
[0248] Un grupo hidroxilo de L1 que conecta con el agente de unión celular puede derivar de un grupo hidroxilo de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido serina.
[0249] Un grupo tiol de L1 que conecta con un agente modulador puede derivar de un grupo tiol de una cadena lateral aminoacídica, por ejemplo, una cadena lateral del aminoácido serina.
[0250] Los comentarios anteriores referentes a los grupos amino, carboxilo, hidroxilo y tiol de L1 también se aplican al agente de unión celular.
[0251] En una realización, L2 junto con -OC(=O)- representa:
donde el asterisco indica el punto de unión con la posición N10, la línea ondulada indica el punto de unión a L1, n es 0 a 3, Y es un enlace covalente o un grupo funcional, y E es un grupo que puede activarse, por ejemplo, por acción de una enzima o con luz, para generar de este modo una unidad autodestructiva. El anillo de fenileno está opcionalmente sustituido además con uno, dos o tres sustituyentes como los que se describen en el presente documento. En una realización, el grupo fenileno está opcionalmente sustituido además con halo, NO2, R u OR. Preferentemente, n es 0 o 1, mucho más preferentemente 0.
[0252] E se selecciona de modo que el grupo sea susceptible de activación, por ejemplo, con luz o por acción de una enzima. E puede ser -NO2 o ácido glucurónico. El primero puede ser sensible a la acción de una nitrorreductasa, el último a la acción de una p-glucoronidasa.
[0253] En esta realización, el conector autodestructivo permitirá liberar el compuesto protegido cuando E se active, que procederá a lo largo de las líneas mostradas a continuación (para n = 0):
donde el asterisco indica el punto de unión a la posición N10, E* es la forma activada de E, e Y es como se describe anteriormente. Estos grupos presentan la ventaja de separar el sitio de activación del compuesto que se está protegiendo. Como se ha descrito anteriormente, el grupo fenileno está opcionalmente sustituido adicionalmente.
[0254] El grupo Y puede ser un enlace covalente con L1.
[0255] El grupo Y puede ser un grupo funcional seleccionado de:
-C(=O)-, -NH-, -O-, -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-,-NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, -NHC(=O)NH-, -NHC(=O)NH, -C(=O)NHC(=O)-, y -S-.
[0256] Cuando L1 es un dipéptido, se prefiere que Y sea -NH- o -C(=O)-, para formar de este modo un enlace amida entre L1 e Y. En esta realización, no es necesario que la secuencia dipeptídica sea un sustrato para una actividad enzimática.
[0257] En otra realización, A es un grupo espaciador. Por lo tanto, L1 y el agente de unión celular están conectados indirectamente.
[0258] L1 y A pueden estar conectados por un enlace seleccionado de:
-C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-,-OC(=O)NH-, y -NHC(=O)NH-.
[0259] Preferentemente, el conector contiene un grupo funcional electrófilo para que reaccione con un grupo funcional nucleófilo en el modulador. Los grupos nucleófilos en los anticuerpos incluyen, pero sin limitación: (i) grupos amino N-terminales, (ii) grupos amino de la cadena lateral, por ejemplo, lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ejemplo, cisteína, y (iv) grupos amino o hidroxilo de azúcares donde el anticuerpo está glucosilado. Los grupos amino,
tiol e hidroxilo son nucleófilos y pueden reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrófilos en restos conectores y reactivos conectores que incluyen: (i) grupos maleimida (ii) disulfuros activados, (iii) esteres activos tales como esteres NHS (N-hidroxisuccinimida), esteres HOBt (N-hidroxibenzotriazol), haloformiatos, y haluros de ácido; (iv) haluros de alquilo y bencilos tales como haloacetamidas; y (v) aldehídos, cetonas, carboxilo, y algunos de los cuales se ilustran como se indica a continuación:
[0260] Ciertos anticuerpos contienen disulfuros entre las cadenas que se pueden reducir, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos se pueden convertir en reactivos para conjugarlos con reactivos conectores por tratamiento con un agente reductor tal como DTT (ditiotreitol). Cada puente de cisteína formará así, teóricamente, dos nucleófilos de tiol reactivos. Se pueden introducir grupos nucleófilos adicionales en los anticuerpos mediante la reacción de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut), lo cual provoca la conversión de una amina en un tiol. Se pueden introducir grupos tiol reactivos en el anticuerpo (o un fragmento del mismo) introduciendo uno, dos, tres, cuatro o más residuos de cisteína (por ejemplo, preparando anticuerpos mutados que comprendan uno o más residuos aminoacídicos de cisteína no nativos). El documento US 7521541 describe la modificación de anticuerpos mediante la introducción de aminoácidos de cisteína reactivos.
[0261] En algunas realizaciones, un conector tiene un grupo nucleófilo reactivo que reacciona con un grupo electrófilo presente en un anticuerpo. Los grupos electrófilos útiles en un anticuerpo incluyen, pero sin limitación, grupos carbonilo de aldehído y cetona. El heteroátomo de un grupo nucleófilo de un conector puede reaccionar con un grupo electrófilo en un anticuerpo y formar un enlace covalente con una unidad de anticuerpo. Los grupos nucleófilos útiles en un conector incluyen, pero sin limitación, hidrazida, oxima, amino, hidroxilo, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina y arilhidrazida. El grupo electrófilo en un anticuerpo proporciona un sitio conveniente para la unión de un conector.
[0262] En una realización, el grupo A es:
donde el asterisco indica el punto de unión a L1, la línea ondulada indica el punto de unión con el agente de unión celular, y n es de 0 a 6. En una realización, n es 5.
[0263] En una realización, el grupo A es:
donde el asterisco indica el punto de unión a L1, la línea ondulada indica el punto de unión con el agente de unión celular, y n es de 0 a 6. En una realización, n es 5.
[0264] En una realización, el grupo A es:
donde el asterisco indica el punto de unión a L1, la línea ondulada indica el punto de unión con el agente de unión celular, n es 0 o 1, y m es de 0 a 30. En una realización preferida, n es 1 y m es de 0 a 10, de 1 a 8, preferentemente de 4 a 8, y mucho más preferentemente 4 u 8. En otra realización, m es de 10 a 30, y preferentemente de 20 a 30. Como alternativa, m es de 0 a 50. En esta realización, m es preferentemente 10-40 y n es 1.
[0265] En una realización, el grupo A es:
donde el asterisco indica el punto de unión a L1, la línea ondulada indica el punto de unión con el agente de unión celular, n es 0 o 1, y m es de 0 a 30. En una realización preferida, n es 1 y m es de 0 a 10, de 1 a 8, preferentemente de 4 a 8, y mucho más preferentemente 4 u 8. En otra realización, m es de 10 a 30, y preferentemente de 20 a 30. Como alternativa, m es de 0 a 50. En esta realización, m es preferentemente 10-40 y n es 1.
[0266] En una realización, la conexión entre el agente de unión celular y A es a través de un residuo tiol del agente de unión celular y un grupo maleimida de A.
[0267] En una realización, la conexión entre el agente de unión celular y A es:
donde el asterisco indica el punto de unión a la porción remanente de A y la línea ondulada indica el punto de unión a la porción remanente del agente de unión celular. En esta realización, el átomo de S deriva típicamente del modulador.
[0268] En cada una de las realizaciones anteriores, se puede utilizar una funcionalidad alternativa en vez del grupo derivado de maleimida que se muestra a continuación:
donde la línea ondulada indica el punto de unión con el agente de unión celular como anteriormente, y el asterisco indica el enlace a la porción remanente del grupo A.
[0269] En una realización, el grupo derivado de maleimida se reemplaza con el grupo:
donde la línea ondulada indica el punto de unión con el agente de unión celular, y el asterisco indica el enlace a la porción remanente del grupo A.
[0270] En una realización, el grupo derivado de maleimida se reemplaza con un grupo, que opcionalmente, junto con el agente de unión celular, se selecciona de:
-C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-,-OC(=O)NH-, -NHC(=O)NH-, -NHC(=O)NH, -C(=O)NHC(=O)-, -S-, -S-S-, -CH2C(=O)-, -C(=O)CH2-, =N-NH- y -NH-N=.
[0271] En una realización, el grupo derivado de maleimida se reemplaza con un grupo, que opcionalmente, junto con el agente de unión celular, se selecciona de:
donde la línea ondulada indica el punto de unión con el agente de unión celular o el enlace a la porción remanente del grupo A, y el asterisco indica el otro del punto de unión con el agente de unión celular o el enlace a la porción remanente del grupo A.
[0272] Otros grupos adecuados para conectar L1 con el modulador seleccionado se describen en el documento WO 2005/082023.
[0273] En otro caso preferido, los moduladores de la presente descripción se pueden asociar con polímeros biocompatibles que comprendan unidades de fármaco-conector. A este respecto, un polímero compatible de este tipo comprende polímeros Fleximer® (Mersana Therapeutics). Dichos polímeros son supuestamente biodegradables, se toleran bien y han sido validados clínicamente. Es más, dichos polímeros son compatibles con numerosas tecnologías y técnicas químicas de conectores personalizables, lo cual permite controlar las propiedades farmacocinéticas, el lugar donde se libere el fármaco y obtener una mejor biodistribución.
[0274] Los moduladores seleccionados también pueden ser radioisótopos conjugados directamente o pueden comprender quelatos macrocíclicos útiles para conjugar iones radiometálicos (como se describe en el presente documento). En ciertas realizaciones, el quelato macrocíclico es ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N"-tetraacético (DOTA) que se puede unir al anticuerpo a través de una molécula conectora. Dichas moléculas conectoras se conocen comúnmente en la técnica y se describen en Denardo y col., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483; Peterson y col., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; y Zimmerman y col., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943.
[0275] Más generalmente, las técnicas para conjugar restos terapéuticos o agentes citotóxicos con moduladores son muy conocidas. Como se analiza anteriormente, se pueden conjugar restos con moduladores mediante cualquier procedimiento reconocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, el enlace de aldehído/Schiff, enlace de sulfhidrilo, enlace lábil en medio ácido, enlace de cis-aconitilo, enlace de hidrazona, enlace degradable enzimáticamente (véase, generalmente Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171). Véanse además, por ejemplo, Amon y col., «Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy», en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld y col. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y col., «Antibodies For Drug Delivery», en Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson y col. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, «Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review», en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera y col. (eds.), págs. 475-506 (1985); «Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy», en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin y col. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe y col., 1982, Immunol. Rev. 62:119. En casos preferidos, un modulador de SEZ6 que está conjugado con un resto terapéutico o agente citotóxico puede internalizarse por una célula al unirse a una molécula de SEZ6 asociada con la superficie celular administrando así la carga útil terapéutica.
C. Modificadores biocompatibles
[0276] En casos seleccionados, los moduladores de la descripción se pueden conjugar o asociar de otro modo con modificadores biocompatibles que se pueden utilizar para ajustar, alterar, mejorar o moderar las características de los moduladores según se desee. Por ejemplo, se pueden generar anticuerpos o construcciones de fusión con semividas in vivo mayores mediante la adhesión de moléculas poliméricas de peso molecular relativamente alto tales como polietilenglicol (PEG) disponible comercialmente o polímeros biocompatibles similares. Los expertos en la técnica apreciarán que el PEG se puede obtener con muchos pesos moleculares y configuraciones moleculares diferentes que se pueden seleccionar para conferir propiedades específicas al anticuerpo (por ejemplo, la semivida se puede adaptar). El PEG se puede unir a moduladores, o fragmentos o derivados de anticuerpo con o sin un conector multifuncional, ya sea a través de la conjugación de sitio específico del PEG con el extremo N- o C-terminal de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, o a través de grupos amino épsilon presentes en residuos de lisina. Se puede utilizar una derivatización con polímeros lineales o ramificados que produzca una pérdida de actividad biológica mínima. El grado de conjugación se puede monitorizar estrechamente por SDS-PAGE y espectrometría de masas para garantizar una conjugación óptima de las moléculas de PEG y las moléculas de anticuerpo. El PEG sin reaccionar
se puede separar de los conjugados anticuerpo-PEG mediante, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño o de intercambio iónico. De forma similar, los moduladores descritos se pueden conjugar con albúmina para hacer que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo sea más estable in vivo o para que tenga una semivida más prolongada in vivo. Las técnicas se conocen bien en la técnica, véanse, por ejemplo, las Publicaciones Internacionales Wo 93/15199, WO 93/15200, y WO 01/77137; y la Patente Europea N.° 04l3.622. Otros conjugados biocompatibles serán evidentes para los expertos y se podrán identificar fácilmente según las enseñanzas en el presente documento.
D. Agentes de diagnóstico o detección
[0277] En otros casos preferidos, se conjugan moduladores de la presente descripción, o fragmentos o derivados de los mismos, con un agente de diagnóstico o detectable, un marcador o indicador que puede ser, por ejemplo, una molécula biológica (por ejemplo, un péptido o nucleótido), una molécula pequeña, un fluoróforo o un radioisótopo. Los moduladores marcados pueden ser útiles para monitorizar el desarrollo o el avance de un trastorno hiperproliferativo o como parte de un procedimiento de un estudio clínico para determinar la eficacia de una terapia particular que incluya los moduladores descritos (es decir, teragnóstico) o para determinar un curso de tratamiento futuro. Dichos marcadores o indicadores también pueden ser útiles para purificar el modulador seleccionado, analizar el modulador (por ejemplo, la unión al epítopo o la clasificación en secciones del anticuerpo), separar o aislar TIC, o en procedimientos preclínicos o estudios toxicológicos.
[0278] Dichos análisis de diagnóstico y/o detección se puede conseguir acoplando el modulador a sustancias detectables que incluyen, pero sin limitación, diversas enzimas que comprenden, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos protésicos tales como, pero sin limitación, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes tales como, pero sin limitación, umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamino fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes tales como, pero sin limitación, luminol; materiales bioluminescentes tales como, pero sin limitación, luciferasa, luciferina y aecuorina; materiales radioactivos tales como, pero sin limitación, yodo (131I, 125I, 123|, 121|), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In, 111In,), y tecnecio (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, y 117Tin; metales emisores de positrones utilizando diversas tomografías de emisión de positrones, iones metálicos paramagnéticos no radioactivos y moléculas que están radiomarcadas o conjugadas con radioisótopos específicos. En dichos casos, la metodología de detección adecuada es muy conocida en la técnica y está fácilmente disponible a partir de numerosos proveedores comerciales.
[0279] Como se ha indicado anteriormente, en otros casos, los moduladores o fragmentos de los mismos se pueden fusionar o conjugar con secuencias o compuestos marcadores, tales como un péptido o fluoróforo, para facilitar su purificación o procedimientos de diagnóstico o analíticos tales como la inmunohistoquímica, interferometría de biocapa, resonancia de plasmón superficial, citometría de flujo, ELISA competitivo, FACs, etc. En casos preferidos, el marcador comprende un marcador His tal como el proporcionado por el vector pQE (Qiagen), entre otros, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Otros marcadores peptídicos útiles para la purificación incluyen, pero sin limitación, el marcador de hemaglutinina «HA», que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de influenza (Wilson y col., 1984, Cell 37:767) y el marcador «flag» (Patente de Estados Unidos N.° 4.703.004).
E. Restos terapéuticos
[0280] Como se ha indicado previamente, los moduladores, o fragmentos o derivados de los mismos también se pueden conjugar, enlazar, unir o fusionar o asociar de otro modo con un «resto terapéutico» o «fármaco» tal como un agente antiproliferativo o anticanceroso incluyendo, pero sin limitación, agentes citotóxicos, agentes citostáticos, agentes antiangiogénicos, agentes citorreductores, agentes quimioterapéuticos, radioterapia y agentes radioterapéuticos, agentes anticancerosos dirigidos, BRM, anticuerpos terapéuticos, vacunas contra el cáncer, citocinas, terapias hormonales, terapia de radiación, y agentes antimetastásicos y agentes inmunoterapéuticos.
[0281] Los agentes anticancerosos ejemplares preferidos incluyen citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracina, maitansinoides tales como DM-1 y DM-4 (Immunogen, Inc.), diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, epirrubicina y ciclofosfamida, y análogos u homólogos de los mismos. Las citotoxinas compatibles adicionales comprenden dolastatinas y auristatinas, incluyendo monometilauristatina E (MMAE) y monometilauristatina F (MMAF) (Seattle Genetics, Inc.), amanitinas tales como alfa-amanitina, beta-amanitina, gamma-amanitina o épsilon-amanitina (Heidelberg Pharma AG), agentes de unión al surco menor del ADN tales como derivados de duocarmicina (Syntarga, B.V.) y dímeros de pirrolobenzodiazepina modificados (Spirogen, Ltd.), inhibidores de corte y empalme tales como análogos o derivados de meayamicina (por ejemplo, el documento FR901464 como se expone en la Patente de Estados Unidos N.° 7.825.267), agentes de unión tubulares tales como los análogos de epotilona y paclitaxel, y agentes que dañan el ADN tales como calicheamicinas y esperamicinas. Además, en ciertos casos, los moduladores
de SEZ6 de la presente descripción se pueden asociar con moléculas de unión a anti-CD3 para reclutar linfocitos T citotóxicos y hacer que ataquen a las células iniciadoras de tumores (tecnología BiTE; véase, por ejemplo, Fuhrmann, S. y col. Annual Meeting of AACR Abstract N.° 5625 (2010)).
[0282] Otros agentes anticancerosos compatibles adicionales incluyen, pero sin limitación, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracildecarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BCNU) y lomustina (CCNU), busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina y cisdiclorodiaminoplatino (II) (DDP, cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina y antramicina (AMC)) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina). Se puede encontrar una lista más exhaustiva de restos terapéuticos en la publicación PCT WO 03/075957 y la Patente de Estados Unidos N.° 2009/0155255.
[0283] Como se ha indicado anteriormente, las realizaciones seleccionadas de la presente invención se refieren a moduladores de SEZ6 conjugados tales como conjugados de anticuerpo anti-SEZ6-fármaco que comprenden pirrolobenzodiazepina (PBD) como agente citotóxico. Se apreciará que las PBD son agentes alquilantes que ejercen actividad antitumoral al unirse covalentemente al ADN en el surco menor e inhibir la síntesis de ácido nucleico. A este respecto, se ha demostrado que las PBD poseen propiedades antitumorales potentes a la vez que exhiben una mielodepresión mínima. Las PBD compatibles con la presente invención se pueden unir al modulador de SEZ6 utilizando cualquiera de los diversos tipos de conector (por ejemplo, un conector peptidilo que comprende un resto meleimido con un sulfhidrilo libre) y, en ciertas realizaciones, están en forma dimérica (es decir, dímeros de PBD). Algunas PBD compatibles (y conectores opcionales) que se pueden conjugar con los moduladores descritos se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N.° 6.362.331, 7.049.311,7.189.710, 7.429.658, 7.407.951, 7.741.319, 7.557.099, 8.034.808, 8.163.736, la Patente de Estados Unidos N.° 2011/0256157 y las presentaciones PCT WO2011/130613, WO2011/128650 y WO2011/130616.
Por consiguiente, en realizaciones particularmente preferidas, el modulador comprenderá un anticuerpo anti-SEZ6 conjugado o asociado con uno o más dímeros de PBD (es decir, un ADC de SEZ6-PBD).
[0284] En realizaciones particularmente preferidas, las PBD compatibles que se pueden conjugar con los moduladores descritos se describen en la Patente de Estados Unidos N.° 2011/0256157. En esta descripción, puede que se prefieran los dímeros de PBD, es decir, aquellos que comprenden dos restos de PBD. Por lo tanto, los conjugados preferidos de la presente invención son aquellos de fórmula (AB) o (AC):
donde:
las líneas de puntos indican la presencia opcional de un doble enlace entre C1 y C2 o C2 y C3;
R2 se selecciona independientemente de H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R y COR, y opcionalmente se selecciona adicionalmente de halo o dihalo;
donde RD se selecciona independientemente de R, CO2R, COR, CHO, CO2H, y halo;
R6 y R9 se seleccionan independientemente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn y halo;
R7 se selecciona independientemente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn y halo;
R10 es un conector que está conectado a un modulador, o fragmento o derivado del mismo, como se ha descrito anteriormente;
Q se selecciona independientemente de O, S y NH;
R11 es H, o R o, donde Q es O, SO3M, donde M es un catión metálico;
cada uno de R y R' se selecciona independientemente de grupos alquilo C1-12 opcionalmente sustituido, heteroci clilo
C3-20 y arilo C5-20, y opcionalmente, en relación al grupo NRR', R y R' junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterocíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros opcionalmente sustituido; y
donde R2", R6", R7", R9", X", Q" y R11" y son como se definen según R2, R6, R7, R9, X, Q y R11 resp un grupo de desactivación.
Doble enlace
[0285] En una realización, no hay ningún doble enlace presente entre C1 y C2, y C2 y C3.
[0286] En una realización, las líneas de puntos indican la presencia opcional de un doble enlace entre C2 y C3, como se muestra a continuación:
[0287] En una realización, un doble enlace está presente entre C2 y C3 cuando R2 es arilo C5-20 o alquilo C1-12.
[0288] En una realización, las líneas de puntos indican la presencia opcional de un doble enlace entre C1 y C2;
como se muestra a continuación:
[0289] En una realización, un doble enlace está presente entre C1 y C2 cuando R2 es arilo C5-20 o alquilo C1-12.
R2
[0290] En una realización, R2 se selecciona independientemente de H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R y COR, y opcionalmente se selecciona adicionalmente de halo o dihalo.30
[0291] En una realización, R2 se selecciona independientemente de H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R y COR.
[0292] En una realización, R2 se selecciona independientemente de H, =O, =CH2, R, =CH-RD, y =C(RD)2.
[0293] En una realización, R2 es independientemente H.
[0294] En una realización, R2 es independientemente =O.
[0295] En una realización, R2 es independientemente es independientemente =CH2.
[0296] En una realización, R2 es independientemente =CH-RD. Dentro del compuesto PBD, el grupo =CH-RD puede tener cualquiera de las configuraciones que se muestran a continuación:
[0297] En una realización, la configuración es la configuración (I).
[0298] En una realización, R2 es independientemente =C(RD)2.
[0299] En una realización, R2 es independientemente =CF2.
[0300] En una realización, R2 es independientemente R.
[0301] En una realización, R2 es independientemente arilo C5-20 opcionalmente sustituido.
[0302] En una realización, R2 es independientemente alquilo C1-12 opcionalmente sustituido.
[0303] En una realización, R2 es independientemente arilo C5-20 opcionalmente sustituido.
[0304] En una realización, R2 es independientemente arilo C5-7 opcionalmente sustituido.
[0305] En una realización, R2 es independientemente arilo C8-10 opcionalmente sustituido.
[0306] En una realización, R2 es independientemente fenilo opcionalmente sustituido.
[0307] En una realización, R2 es independientemente naftilo opcionalmente sustituido.
[0308] En una realización, R2 es independientemente piridilo opcionalmente sustituido.
[0309] En una realización, R2 es independientemente quinolinilo o isoquinolinilo opcionalmente sustituido.
[0310] En una realización, R2 tiene de uno a tres grupos sustituyentes, con más preferencia por 1 y 2, y siendo los grupos con una única sustitución los más preferidos. Los sustituyentes pueden estar en cualquier posición.
[0311] Cuando R2 es un grupo arilo C5-7, un único sustituyente está preferentemente en un átomo anular que no es adyacente al enlace con la parte remanente del compuesto, es decir, está preferentemente en p o y respecto al enlace con la parte remanente del compuesto. Por lo tanto, cuando el grupo arilo C5-7 es fenilo, el sustituyente está preferentemente en las posiciones meta o para y más preferentemente está en la posición para.
[0312] En una realización, R2 se selecciona de:
donde el asterisco indica el punto de unión.
[0313] Cuando R2 es un grupo arilo C8-10, por ejemplo, quinolinilo o isoquinolinilo, puede tener cualquier número de sustituyentes en cualquier posición de los anillos de quinolina o isoquinolina. En algunas realizaciones, tiene uno, dos o tres sustituyentes, y estos pueden estar en el anillo próximo o distante o en ambos (si hay más de un sustituyente).
[0314] En una realización, cuando R2 está opcionalmente sustituido, los sustituyentes se seleccionan de los sustituyentes que se mencionan más adelante en la sección de los sustituyentes.
[0315] Cuando R está opcionalmente sustituido, los sustituyentes se seleccionan preferentemente de:
Halo, Hidroxilo, Éter, Formilo, Acilo, Carboxi, Éster, Aciloxi, Amino, Amido, Acilamido, Aminocarboniloxi, Ureido, Nitro, Ciano y Tioéter.
[0316] En una realización, cuando R o R2 están opcionalmente sustituidos, los sustituyentes se seleccionan del grupo que consiste en R, OR, SR, NRR', NO2, halo, CO2R, COR, CONH2, CONHR, y CONRR'.
[0317] Cuando R2 es alquilo C1-12, el sustituyente opcional puede incluir adicionalmente grupos heterociclilo C3-20 y arilo C5-20.
[0318] Cuando R2 es heterociclilo C3-20, el sustituyente opcional puede incluir adicionalmente grupos alquilo C1-12 y arilo C5-20.60
[0319] Cuando R2 es un grupo arilo C5-20, el sustituyente opcional puede incluir adicionalmente grupos heterociclilo C3-20 y alquilo C1-12.
[0320] Se entiende que el término «alquilo» abarca las subclases alquenilo y alquinilo, así como también cicloalquilo. Por lo tanto, cuando R2 es alquilo C1-12 opcionalmente sustituido, se entiende que el grupo alquilo contiene opcionalmente uno o más dobles o triples enlaces carbono-carbono, que pueden formar parte de un sistema conjugado. En una realización, el grupo alquilo C1-12 opcionalmente sustituido contiene al menos un doble o triple enlace carbono-carbono, y este enlace está conjugado con un doble enlace presente entre C1 y C2 o entre C2 y C3. En una realización, el grupo alquilo C1-12 es un grupo seleccionado de alquilo C1-12 saturado, alquenilo C2-12, alquinilo C2-12 y cicloalquilo C3-12.
[0321] Si un sustituyente de R2 es halo, será preferentemente F o Cl, más preferentemente Cl.
[0322] Si un sustituyente de R2 es éter, en algunas realizaciones puede ser un grupo alcoxi, por ejemplo, un grupo alcoxi C1-7 (por ejemplo, metoxi, etoxi) o, en algunas realizaciones, puede ser un grupo ariloxi C5-7 (por ejemplo, fenoxi, piridiloxi, furaniloxi).
[0323] Si un sustituyente de R2 es alquilo C1-7, puede ser preferentemente un grupo alquilo C1-4 (por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo).
[0324] Si un sustituyente de R2 es heterociclilo C3-7, en algunas realizaciones puede ser un grupo heterociclilo C6 que contiene nitrógeno, por ejemplo, morfolino, tiomorfolino, piperidinilo, piperazinilo. Estos grupos pueden estar enlazados a la parte remanente del resto de PBD a través del átomo de nitrógeno. Estos grupos además pueden estar sustituidos, por ejemplo, con grupos alquilo C1-4.
[0325] Si un sustituyente de R2 es bis-oxi-alquileno C1-3, este es preferentemente bis-oxi-metileno o bis-oxi-etileno.
[0326] Los sustituyentes particularmente preferidos para R2 incluyen metoxi, etoxi, flúor, cloro, ciano, bis-oximetileno, metilpiperazinilo, morfolino y metil-tienilo.
[0327] Los grupos particularmente preferidos R2 incluyen, pero sin limitación, 4-metoxifenilo, 3-metoxifenilo, 4 etoxi-fenilo, 3-etoxi-fenilo, 4-fluoro-fenilo, 4-clorofenilo, 3,4-bisoximetilen-fenilo, 4-metiltienilo, 4-cianofenilo, 4-fenoxifenilo, quinolin-3-ilo y quinolin-6-ilo, isoquinolin-3-ilo y isoquinolin-6-ilo, 2-tienilo, 2-furanilo, metoxinafenilo y naftilo.
[0328] En una realización, R2 es halo o dihalo. En una realización, R2 es -F o -F2, cuyos sustituyentes se ilustran a continuación como (III) y (IV) respectivamente:
RD
[0329] En una realización RD se selecciona independientemente de R, CO2R, COR, CHO, CO2H, y halo.
[0330] En una realización RD es independientemente R.
[0331] En una realización RD es independientemente halo.
R6
[0332] En una realización R6 se selecciona independientemente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn- y Halo.
[0333] En una realización R6 se selecciona independientemente de H, OH, OR, SH, NH2, NO2 y Halo.
[0334] En una realización R6 se selecciona independientemente de H y Halo.
[0335] En una realización R6 es independientemente H.
[0336] En una realización R6 y R7 juntos forman un grupo -O-(CH2)p-O-, donde p es 1 o 2.
R7
[0337] R7 se selecciona independientemente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn y halo.
[0338] En una realización, R7 es independientemente OR.
[0339] En una realización, R7 es independientemente OR7A, donde R7A es independientemente alquilo C1-6 opcionalmente sustituido.
[0340] En una realización, R7A es independientemente alquilo C1-6 saturado opcionalmente sustituido.
[0341] En una realización, R7A es independientemente alquenilo C2-4 opcionalmente sustituido.
[0342] En una realización, R7A es independientemente Me.
[0343] En una realización, R7A es independientemente CH2Ph.
[0344] En una realización, R7A es independientemente alilo.
[0345] En una realización, el compuesto es un dímero donde los grupos R7 de cada monómero forman juntos un puente dimérico que tiene la fórmula X-R"-X que conecta los monómeros.
R8
[0346] En una realización, el compuesto es un dímero donde los grupos R8 de cada monómero forman juntos un puente dimérico que tiene la fórmula X-R"-X que conecta los monómeros.
[0347] En una realización, R8 es independientemente OR8A, donde R8A es independientemente alquilo C1-4 opcionalmente sustituido.
[0348] En una realización, R8A es independientemente alquilo C1-6 saturado opcionalmente sustituido o alquenilo C2-4 opcionalmente sustituido.
[0349] En una realización, R8A es independientemente Me.
[0350] En una realización, R8A es independientemente CH2Ph.
[0351] En una realización, R8A es independientemente alilo.
[0352] En una realización, R8 y R7 juntos forman un grupo -O-(CH2)p-O-, donde p es 1 o 2.
[0353] En una realización, R8 y R9 juntos forman un grupo -O-(CH2)p-O-, donde p es 1 o 2.
R9
[0354] En una realización, R9 se selecciona independientemente de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn- y Halo.
[0355] En una realización, R9 es independientemente H.
[0356] En una realización, R9 es independientemente R u OR.
R y R'
[0357] En una realización, R se selecciona independientemente de grupos alquilo C1-12 opcionalmente sustituido, heterociclilo C3-20 y arilo C5-20. Estos grupos se definen cada uno más adelante en la sección de los sustituyentes.
[0358] En una realización, R es independientemente alquilo C1-12 opcionalmente sustituido.
[0359] En una realización, R es independientemente heterociclilo C3-20 opcionalmente sustituido.
[0360] En una realización, R es independientemente arilo C5-20 opcionalmente sustituido.
[0361] En una realización, R es independientemente alquilo C1-12 opcionalmente sustituido.
[0362] Anteriormente en relación con R2 se han descrito diversas realizaciones referentes a grupos alquilo y arilo preferidos, y la identidad y el número de sustituyentes opcionales. Las preferencias indicadas para R2 al aplicarse a R son aplicables, cuando sea apropiado, a todos los demás grupos R, por ejemplo, cuando R6, R7, R8 o R9 es R.
[0363] Las preferencias para R también se aplican a R'.
[0364] En algunas realizaciones de la invención, se proporciona un compuesto que tiene el grupo sustituyente -NRR'. En una realización, R y R' junto con el átomo de nitrógeno al cual están enlazados forman un anillo heterocíclico de 4, 5, 6 o 7 miembros opcionalmente sustituido. El anillo puede contener otro heteroátomo, por ejemplo, N, O o S.
[0365] En una realización, el propio anillo heterocíclico está sustituido con un grupo R. Cuando hay otro heteroátomo de N presente, el sustituyente puede estar en el heteroátomo de N.
R"
[0366] R" es un grupo alquileno C3-12, cuya cadena puede estar interrumpida por uno o más heteroátomos, por ejemplo, O, S, N(H), NMe y/o anillos aromáticos, por ejemplo, benceno o piridina, donde tales anillos están opcionalmente sustituidos.
[0367] En una realización, R" es un grupo alquileno C3-12, cuya cadena puede estar interrumpida por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos, por ejemplo, benceno o piridina.
[0368] En una realización, el grupo alquileno está interrumpido opcionalmente por uno o más heteroátomos seleccionados entre O, S y NMe y/o anillos aromáticos, donde tales anillos están opcionalmente sustituidos.
[0369] En una realización, el anillo aromático es un grupo arileno C5-20, donde el arileno se refiere a un resto divalente obtenido al eliminar dos átomos de hidrógeno de dos átomos anulares aromáticos de un compuesto aromático, donde el resto contiene de 5 a 20 átomos anulares.
[0370] En una realización, R" es un grupo alquileno C3-12, cuya cadena puede estar interrumpida por uno o más heteroátomos, por ejemplo, O, S, N(H), NMe y/o anillos aromáticos, por ejemplo, benceno o piridina, donde tales anillos están opcionalmente sustituidos por NH2.
[0371] En una realización, R" es un grupo alquileno C3-12.
[0372] En una realización, R" se selecciona de un grupo alquileno C3, C5, C7, C9 y C11.
[0373] En una realización, R" se selecciona de un grupo alquileno C3, C5 y C7.
[0374] En una realización, R" se selecciona de un grupo alquileno C3 y C5.
[0375] En una realización, R" es un grupo alquileno C3.
[0376] En una realización, R" es un grupo alquileno C5.
[0377] Los grupos alquileno enumerados anteriormente pueden estar opcionalmente interrumpidos por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos, por ejemplo, benceno o piridina, donde tales anillos están opcionalmente sustituidos.
[0378] Los grupos alquileno enumerados anteriormente pueden estar opcionalmente interrumpidos por uno o más heteroátomos y/o anillos aromáticos, por ejemplo, benceno o piridina.5
[0379] Los grupos alquileno enumerados anteriormente pueden ser grupos alquileno alifáticos lineales no sustituidos.
X
[0380] En una realización, X se selecciona de O, S, o N(H).
[0381] Preferentemente, X es O.
R10
[0382] Preferentemente, los conectores compatibles tales como los que se han descrito anteriormente unen un modulador de SEZ6 (CBA/Ab/M) con un resto D correspondiente a un fármaco PBD a través de uno o más enlaces covalentes en la posición de R10 (es decir, N10). El conector es un resto bifuncional o multifuncional que se puede utilizar para unir uno o más restos correspondientes a un fármaco (D) y un modulador (preferentemente un anticuerpo) para formar conjugados anticuerpo-fármaco (ADC). El conector (L) puede ser estable fuera de una célula, es decir, extracelular, o puede escindirse por acción de una enzima, hidrólisis u otras condiciones metabólicas. Los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) se pueden preparar convenientemente utilizando un conector que tenga una funcionalidad reactiva para unir el resto de fármaco con el anticuerpo. Un tiol de una cisteína o una amina, por ejemplo, el N-terminal o una cadena lateral de un aminoácido tal como la lisina, del anticuerpo (Ab) puede formar un enlace con un grupo funcional de un conector o reactivo espaciador, el resto de fármaco PBD (D) o el fármaco-reactivo conector (D-L).
[0383] Muchos grupos funcionales del conector enlazado en la posición N10 del resto de PBD pueden ser útiles para la reacción con el agente de unión celular. Por ejemplo, se pueden formar enlaces de tipo éster, tioéster, amida, tioamida, carbamato, tiocarbamato, urea, tiourea, éter, tioéter o disulfuro por reacción de los intermedios de conectorfármaco PBD y el agente de unión celular.
[0384] En otra realización, el conector puede estar sustituido con grupos que modulen la agregación, solubilidad o reactividad. Por ejemplo, un sustituyente sulfonato puede incrementar la hidrosolubilidad del reactivo y facilitar la reacción de acoplamiento del reactivo conector con el anticuerpo o el resto de fármaco, o facilitar la reacción de acoplamiento de Ab-L con D o D-L con Ab, dependiendo de la ruta sintética empleada para preparar el ADC.
[0385] En una realización preferida, R10 es un grupo:
donde el asterisco indica el punto de unión a la posición N10, CBA es un agente de unión celular/modulador, L1 es un conector, A es un grupo conector que conecta L1 con el agente de unión celular, L2 es un enlace covalente, o junto con -OC(=O)- forma un conector autodestructivo, y L1 o L2 es un conector autoescindible.
[0386] L1 es preferentemente el conector escindible, y se puede considerar el detonante de la activación del conector para su escisión.
[0387] Como se ha analizado anteriormente en la sección de los conectores, la naturaleza de L1 y L2, cuando estén presentes, puede variar mucho. Estos grupos se eligen dependiendo de sus características de escisión, que pueden venir dictadas por las condiciones en el sitio donde se suministre el conjugado. Se prefieren aquellos conectores que son escindidos por acción de enzimas, aunque también se pueden utilizar conectores que pueden ser escindidos por cambios en el pH (por ejemplo, lábiles en medio ácido o básico), la temperatura o por irradiación (por ejemplo, fotolábiles). Los conectores que se pueden escindir en condiciones reductoras u oxidantes también pueden ser útiles en la presente invención.
[0388] L1 puede comprender una secuencia contigua de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos puede ser el sustrato diana de la escisión enzimática, lo cual permite liberar así R10 de la posición N10.
[0389] En una realización, L1 puede escindirse por acción de una enzima. En una realización, la enzima es una esterasa o una peptidasa.
[0390] En una realización, L2 está presente y junto con -C(=O)O- forma un conector autodestructivo. En una realización, L2 es un sustrato de la actividad enzimática, lo cual permite liberar así R10 de la posición N10.
[0391] En una realización, cuando L1 puede escindirse por la acción de una enzima y L2 está presente, la enzima escinde el enlace entre L1 y L2.
[0392] En lo que respecta al enlace del conector elegido a una PBD seleccionada, el grupo RC se puede eliminar de la posición N10 de ciertos restos de PBD para obtener un enlace imina N10-C11, una carbinolamina, una carbinolamina sustituida, cuando QR11 es OSO3M, un aducto de bisulfito, una tiocarbinolamina, una tiocarbinolamina sustituida o una carbinalamina sustituida.
[0393] En una realización, RC, puede ser un grupo protector que se puede eliminar para obtener un enlace imina N10-C11, una carbinolamina, una cabinolamina sustituida o, cuando QR11 es OSO3M, un aducto de bisulfito. En una realización, RC es un grupo protector que se puede eliminar para obtener un enlace imina N10-C11.
[0394] Se pretende que el grupo RC se pueda eliminar en las mismas condiciones que las requeridas para eliminar el grupo R10, por ejemplo, para obtener un enlace imina N10-C11, una carbinolamina, etc. El grupo desactivante actúa como grupo protector para la funcionalidad deseada en la posición N10. Se pretende que el grupo desactivante no sea reactivo respecto a un agente de unión celular. Por ejemplo, RC no es el mismo que RL.
[0395] Los compuestos que tienen un grupo desactivante se pueden utilizar como intermedios en la síntesis de dímeros que tengan un monómero imina. Como alternativa, los compuestos que tienen un grupo desactivante se pueden utilizar como conjugados, donde el grupo desactivante se elimina en la posición diana para obtener una imina, una carbinolamina, una carbinolamina sustituida, etc. Por lo tanto, en esta realización, el grupo desactivante se puede denominar grupo protector de nitrógeno que se puede eliminar terapéuticamente, tal como se define en el documento WO 00/12507.
[0396] En una realización, el grupo RC se puede eliminar en las condiciones que escinden el conector RL del grupo R10. Por lo tanto, en una realización, el grupo desactivante puede escindirse por acción de una enzima.
[0397] En una realización alternativa, el grupo desactivante se puede escindir antes de conectar el conector RL con el modulador. En esta realización, el grupo desactivante se puede eliminar en condiciones que no escinden el conector RL.
[0398] Cuando un compuesto incluye un grupo funcional G1 para formar una conexión con el agente de unión celular, el grupo desactivante se puede eliminar antes de añadir o desenmascarar G1.
[0399] El grupo desactivante se puede utilizar como parte de una estrategia de protección de grupos para garantizar que solamente una de las unidades monoméricas de un dímero se conecte a un agente de unión celular.
[0400] El grupo desactivante se puede utilizar como enmascarante para un enlace imina N10-C11. El grupo desactivante se puede eliminar en el momento donde se necesite la funcionalidad imina en el compuesto. El grupo desactivante también es un enmascarante para una carbinolamina, una carbinolamina sustituida y un aducto de bisulfito, como se ha descrito anteriormente.
[0401] En una realización, RC es un grupo protector de tipo carbamato.
[0402] En una realización, el grupo protector de tipo carbamato se selecciona de:
Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz y PNZ.
[0403] Opcionalmente, el grupo protector de tipo carbamato se selecciona además entre Moc.
[0404] En una realización, RC es un grupo conector RL que carece del grupo funcional para la conexión con el agente de unión celular.
[0405] Esta solicitud se refiere en particular a los grupos RC que son carbamatos.
[0406] En una realización, RC es un grupo:
donde el asterisco indica el punto de unión a la posición N10, G2 es un grupo terminal, L3 es un enlace covalente o un conector escindible L1, L2 es un enlace covalente, o junto con OC(=O) forma un conector autodestructivo.
Cuando L3 y L2 son ambos enlaces covalentes, G2 y OC(=O) forman juntos un grupo protector de tipo carbamato como el que se ha definido anteriormente.
[0407] L1 es como se define anteriormente en relación con R10.
[0408] L2 es como se define anteriormente en relación con R10.
[0409] A continuación se describen varios grupos terminales, incluidos aquellos basados en grupos protectores conocidos.
[0410] En una realización, L3 es un conector autoescindible L1, y L2, junto con OC(=O), forma un conector autodestructivo. En esta realización, G2 es Ac (acetilo) o Moc, o un grupo protector de tipo carbamato seleccionado de: Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz y PNZ. Opcionalmente, el grupo protector de tipo carbamato se selecciona además entre Moc.
[0411] En otra realización, G2 es un grupo acilo -C(=O)G3, donde G3 se selecciona de alquilo (incluidos cicloalquilo, alquenilo y alquinilo), heteroalquilo, heterociclilo y arilo (incluidos heteroarilo y carboarilo). Estos grupos pueden estar opcionalmente sustituidos. El grupo acilo junto con un grupo amino de L3 o L2, cuando proceda, puede formar un enlace amida. El grupo acilo junto con un grupo hidroxi de L3 o L2, cuando proceda, puede formar un enlace de éster.
[0412] En una realización, G3 es heteroalquilo. El grupo heteroalquilo puede comprender polietilenglicol. El grupo heteroalquilo puede tener un heteroátomo, tal como O o N, adyacente al grupo acilo, para formar así un grupo carbamato o carbonato, cuando proceda, con un heteroátomo presente en el grupo L3 o L2, cuando proceda.
[0413] En una realización, G3 se selecciona de NH2, NHR y NRR'. Preferentemente, G3 es NRR'.
[0414] En una realización, G2 es el grupo:
donde el asterisco indica el punto de unión a L3, n es de 0 a 6 y G4 se selecciona de OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', NH2, NHR, NRR', NO2, y halo. Los grupos Oh , SH, NH2 y NHR están protegidos. En una realización, n es de 1 a 6, y preferentemente n es 5. En una realización, G4 es OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', y NRR'. En una realización, G4 es OR, SR, y NRR'. Preferentemente, G4 se selecciona de OR y NRR', mucho más preferentemente G4 es OR. Mucho más preferentemente, G4 es OMe.
[0415] En una realización, el grupo G2 es:
donde el asterisco indica el punto de unión a L3, y n y G4 son como se definen anteriormente.
[0416] En una realización, el grupo G2 es:
donde el asterisco indica el punto de unión a L3, n es 0 o 1, m es de 0 a 50, y G4 se selecciona de OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', NH2, NHR, NRR', NO2, y halo. En una realización preferida, n es 1 y m es de 0 a 10, de 1 a 2, preferentemente de 4 a 8, y mucho más preferentemente 4 u 8. En otra realización, n es 1 y m es de 10 a 50, preferentemente de 20 a 40. Los grupos OH, SH, NH2 y NHR están protegidos. En una realización, G4 es OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', y NRR'. En una realización, G4 es OR, SR, y NRR'. Preferentemente, G4 se selecciona de OR y NRR', mucho más preferentemente G4 es OR. Preferentemente, G4 es OMe.
[0417] En una realización, el grupo G2 es:
donde el asterisco indica el punto de unión a L3, y n, m y G4 son como se definen anteriormente.
[0418] En una realización, el grupo G2 es:
donde n es 1-20, m es 0-6, y G4 se selecciona de OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', NH2, NHR, NRR', NO2, y halo. En una realización, n es 1-10. En otra realización, n es de 10 a 50, preferentemente de 20 a 40. En una realización, n es 1. En una realización, m es 1. Los grupos OH, SH, NH2 y NHR están protegidos. En una realización, G4 es OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', y NRR'. En una realización, G4 es OR, SR, y NRR'. Preferentemente, G4 se selecciona de OR y NRR', mucho más preferentemente G4 es OR. Preferentemente, G4 es OMe.
[0419] En una realización, el grupo G2 es:
donde el asterisco indica el punto de unión a L3, y n, m y G4 son como se definen anteriormente.
[0420] En cada una de las realizaciones anteriores, G4 puede ser OH, SH, NH2 y NHR. Estos grupos están preferentemente protegidos.
[0421] En una realización, OH está protegido con Bzl, TBDMS, o TBDPS.
[0422] En una realización, SH está protegido con Acm, Bzl, Bzl-OMe, Bzl-Me, o Trt.
[0423] En una realización, NH2 o NHR están protegidos con Boc, Moc, Z-Cl, Fmoc, Z o Alloc.
[0424] En una realización, el grupo G2 está presente combinado con un grupo L3, cuyo grupo es un dipéptido.
[0425] El grupo desactivante no está destinado a la conexión con el modulador. Por lo tanto, el otro monómero presente en el dímero actúa como punto de conexión con el modulador a través de un conector. Por consiguiente, se prefiere que la funcionalidad presente en el grupo desactivante no esté disponible para reaccionar con un modulador. Por lo tanto, preferentemente se evitan grupos funcionales tales como OH, SH, NH2, COOH. Sin embargo, la funcionalidad puede estar presente en el grupo desactivante si está protegida, como se ha descrito anteriormente.
[0426] Por lo tanto, según las enseñanzas en el presente documento, una realización de la invención comprende un conjugado que comprende un compuesto:
donde CBA es un agente de unión celular/modulador, y n es 0 o 1. L1 es como se define previamente, y cada uno de RE y RE" se selecciona independientemente de H o RD.
[0427] En otra realización, el conjugado comprende un compuesto:
donde CBA es un agente de unión celular/modulador, L1 es como se ha definido previamente, Ar1 y Ar2 son cada uno independientemente arilo C5-20 opcionalmente sustituido, y n es 0 o 1.
[0428] Los expertos en la técnica apreciarán que otros dímeros de PBD simétricos y asimétricos y conectores son compatibles con la presente invención, y estos se podrían seleccionar sin necesidad de demasiada experimentación sobre la base de las enseñanzas en el presente documento y la técnica anterior.
[0429] Otro aspecto de la invención incluye ADC que comprenden radioisótopos. Los radioisótopos ilustrativos que pueden ser compatibles con tales realizaciones incluyen, pero sin limitación, yodo (131I, 125I, 123I, 121I,), carbono (14C), cobre (62Cu, 64Cu, 67Cu), azufre (35S), tritio (3H), indio (115In, 113In, 112In, 111In,), bismuto (99Tc), talio (201Ti), galio (68Ga, 61Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 20 *5347 *Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, 117Sn, 225Ac, 76Br, y 211At. También se dispone de otros radionucleidos como agentes terapéuticos y de diagnóstico, especialmente aquellos comprendidos en el intervalo de energía de 60 a 4000 keV. Dependiendo de la afección que se deba tratar y el perfil terapéutico deseado, los expertos en la técnica podrán seleccionar fácilmente el radioisótopo adecuado para su uso con los moduladores descritos.
[0430] Los moduladores de SEZ6 de la presente descripción también se pueden conjugar con un resto terapéutico o fármaco que modifique una respuesta biológica determinada (por ejemplo, modificadores de la respuesta biológica o BRM). Es decir, no se debe interpretar que los agentes o restos terapéuticos compatibles con la presente invención se limiten a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, en casos particularmente preferidos, el resto de fármaco puede ser una proteína o polipéptido o fragmento de los mismos que posea una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, Onconasa (u otra RNasa citotóxica), exotoxina de Pseudomonas, toxina colérica o toxina diftérica; una proteína tal como el factor de la necrosis tumoral, a-interferón, p-interferón, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador tisular del plasminógeno, un agente apoptótico, por ejemplo, TNF- a, TNF-p, AIM I (véase la Publicación Internacional N.° WO 97/33899), AIM II (véase la Publicación Internacional N.° WO 97/34911), ligando Fas (Takahashi y col., 1994, J. Immunol., 6:1567), y VeGi (véase la Publicación Internacional N.° WO 99/23105), un agente trombótico o un agente antiangiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina; o un modificador de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfocina (por ejemplo, interleucina-1 («IL-1»), interleucina-2 («IL-2»), interleucina-6 («IL-6»), factor de estimulación de colonias de granulocitos y macrófagos («GM-CSF») y factor de estimulación de colonias de granulocitos («G-CSF»)), o un factor de crecimiento (por ejemplo, hormona del crecimiento («GH»)). Como se ha expuesto anteriormente, en la técnica se conocen procedimientos para fusionar o conjugar moduladores con restos polipeptídicos. Además de las referencias en cuestión descritas previamente, véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 5.336.603; 5.622.929; 5.359.046; 5.349.053; 5.447.851, y 5.112.946; documentos EP 307.434;
EP 367.166; Publicaciones PCT WO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi y col., 1991, PNAS USA 88:10535; Zheng y col., 1995, J Immunol 154:5590; y Vil y col., 1992, PNAS USA 89:11337. Además, como se ha expuesto anteriormente, no se requiere que la asociación de un modulador con tales restos sea necesariamente directa, sino que puede tener lugar a través de secuencias conectoras. Como se ha indicado previamente, dichas moléculas conectoras normalmente se conocen en la técnica y se describen en Denardo y col., 1998, Clin Cancer Res 4:2483;
Peterson y col., 1999, Bioconjug Chem 10:553; Zimmerman y col., 1999, Nucl Med Biol 26:943; Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171.
IX. Diagnósticos y cribado
A. Diagnósticos
[0431] En otros casos adicionales, la descripción proporciona procedimientos in vitro o in vivo para detectar, diagnosticar o monitorizar trastornos proliferativos y procedimientos para cribar células de un paciente con el fin de
identificar células tumorigénicas, incluidas las CSC. Dichos procedimientos incluyen la identificación de un individuo que padece cáncer para tratar o monitorizar el avance de un cáncer que comprende poner en contacto al paciente o una muestra obtenida a partir del paciente (es decir, ya sea in vivo o in vitro) con un modulador como los descritos en el presente documento y detectar la presencia o ausencia, o el nivel de asociación del modulador con moléculas diana ligadas o libres en la muestra. En casos particularmente preferidos, el modulador comprenderá un marcador detectable 0 molécula indicadora como se describe en el presente documento.
[0432] En algunos casos, la asociación del modulador, tal como un anticuerpo, con células particulares en la muestra denota probablemente que la muestra puede contener CSC, lo cual indica que el individuo que padece cáncer puede tratarse de forma eficaz con un modulador como los que se describen en el presente documento. Los procedimientos pueden comprender además una etapa de comparación del nivel de unión con un control. Por el contrario, cuando el modulador sea una construcción de Fc, las propiedades de unión se pueden aprovechar y monitorizar (directa o indirectamente, in vivo o in vitro) cuando esté en contacto con la muestra para proporcionar la información deseada.
[0433] Los procedimientos de ensayo compatibles ilustrativos incluyen radioinmunoensayos, inmunoensayos enzimáticos, ensayos de unión competitiva, inmunoensayo de fluorescencia, ensayos de inmunotransferencia, análisis por inmunotransferencia de Western, ensayos de citometría de flujo y ensayos ELISA. Los diagnósticos o teragnósticos in vivo compatibles pueden comprender técnicas de tomografia o monitorización reconocidas en la técnica tales como tomografia por resonancia magnética, tomografia computarizada (por ejemplo, escaneo CAT), tomografía de positrones (por ejemplo, escaneo PET), radiografía, ultrasonidos, etc., como sabrán los expertos en la técnica.
[0434] En otro caso, la descripción proporciona un procedimiento para analizar el avance del cáncer y/o la patogénesis in vivo. En otro caso, el análisis del avance del cáncer y/o la patogénesis in vivo comprende determinar el alcance del avance del tumor. En otro caso, el análisis comprende identificar el tumor. En otro caso, el análisis del avance del tumor se realiza en el tumor primario. En otro caso, el análisis se realiza a lo largo del tiempo dependiendo del tipo de cáncer, como sabrá un experto en la técnica. En otro caso, se realiza otro análisis in vivo de los tumores secundarios que se originan a partir de células metastásicas del tumor primario. En otro caso, se analizan el tamaño y la forma de los tumores secundarios. En algunos casos, se realiza otro análisis ex vivo.
[0435] En otro caso, la descripción proporciona un procedimiento para analizar el avance del cáncer y/o la patogénesis in vivo que incluye la determinación de la metástasis celular o la detección y cuantificación del nivel de células tumorales circulantes. En aún otro caso, el análisis de la metástasis celular comprende la determinación del crecimiento progresivo de células en un sitio que es discontinuo respecto al tumor primario. En otro caso, el sitio de análisis de la metástasis celular comprende la ruta de la diseminación neoplásica. En algunos casos, las células se pueden dispersar a través de la vasculatura sanguínea, los ganglios linfáticos, dentro de las cavidades corporales o combinaciones de los mismos. En otro caso, el análisis de la metástasis celular se lleva a cabo en vista de la migración, diseminación, extravasación, proliferación celular o combinaciones de las mismas.
[0436] Por consiguiente, en un caso particularmente preferido, los moduladores de la presente descripción se pueden utilizar para detectar y cuantificar los niveles de SEZ6 en una muestra de un paciente (por ejemplo, plasma o sangre), que, a su vez, se puede utilizar para detectar, diagnosticar o monitorizar trastornos asociados con SEZ6, incluidos los trastornos proliferativos. En casos relacionados, los moduladores de la presente descripción se pueden utilizar para detectar, monitorizar y/o cuantificar células tumorales circulantes in vivo o in vitro (véase, por ejemplo, el documento WO 2012/0128801).
En otros casos preferidos adicionales, las células tumorales circulantes pueden comprender células madre cancerosas.
[0437] En ciertos ejemplos, las células tumorigénicas en un sujeto o una muestra de un sujeto se pueden evaluar o caracterizar utilizando los moduladores descritos antes de la terapia o régimen para establecer un punto de referencia. En otros ejemplos, la muestra deriva de un sujeto que ha sido tratado. En algunos ejemplos, la muestra se extrae del sujeto al menos aproximadamente 1, 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 30, 60, 90 días, 6 meses, 9 meses, 12 meses o >12 meses después de que el sujeto comience o finalice el tratamiento. En ciertos ejemplos, las células tumorigénicas se evalúan o caracterizan después de un número determinado de dosis (por ejemplo, después de 2, 5, 10, 20, 30 o más dosis de una terapia). En otros ejemplos, las células tumorigénicas se caracterizan o evalúan 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 4 años o un periodo más prolongado después de haber recibido una o más terapias.
[0438] En otro aspecto, y como se analiza con más detalle a continuación, la presente descripción proporciona kits para detectar, monitorizar o diagnosticar un trastorno hiperproliferativo, identificar un individuo que padezca un trastorno de este tipo para su posible tratamiento o monitorizar el avance (o la regresión) del trastorno en un paciente, donde el kit comprende un modulador como los descritos en el presente documento y reactivos para detectar el impacto del modulador en una muestra.65
[0439] Otro aspecto más de la presente descripción comprende el uso de SEZ6 marcado para la
inmunohistoquímica (IHC). A este respecto, se puede utilizar IHC de SEZ6 como herramienta de diagnóstico para facilitar el diagnóstico de diversos trastornos proliferativos y monitorizar la respuesta potencial a tratamientos, incluida la terapia con un modulador de SEZ6. Se pueden realizar ensayos para el diagnóstico compatibles en tejidos que han sido fijados químicamente (incluyendo, pero sin limitación: formaldehído, gluteraldehído, tetraóxido de osmio, dicromato de potasio, ácido acético, alcoholes, sales de cinc, cloruro mercúrico, tetraóxido de cromo y ácido pícrico) y embebidos (incluyendo, pero sin limitación: metacrilato de glicol, parafina y resinas) o conservados por congelación. Como se analiza con más detalle a continuación, dichos ensayos se podrían utilizar como guía para decisiones sobre el tratamiento y para determinar los periodos y los regímenes de dosificación.
B. Cribado
[0440] En ciertos casos, los moduladores también se pueden utilizar para cribar o identificar compuestos o agentes (por ejemplo, fármacos) que alteran una función o la actividad de células tumorigénicas o su progenie al interaccionar con un antígeno (por ejemplo, sus componentes genotípicos o fenotípicos). Dichos compuestos y agentes pueden ser fármacos potenciales que se pueden cribar para el tratamiento de un trastorno proliferativo, por ejemplo. En un caso, un sistema o procedimiento incluye células tumorigénicas que comprenden SEZ6 y un compuesto o agente (por ejemplo, fármaco), donde las células y el compuesto o agente están en contacto entre sí. En dichos casos, las células en cuestión pueden haber sido identificadas, monitorizadas y/o enriquecidas utilizando los moduladores descritos.
[0441] En otro caso más, un procedimiento incluye poner en contacto, directa o indirectamente, células tumorigénicas o su progenie con un agente o compuesto de prueba y determinar si el agente o compuesto de prueba modula una actividad o función de las células tumorigénicas asociadas con el antígeno. Un ejemplo de una interacción directa es la interacción física, mientras que una interacción indirecta incluye la acción de una composición sobre una molécula intermedia que, a su vez, actúa sobre la entidad de referencia (por ejemplo, célula o cultivo celular). Las actividades o funciones ilustrativas que se pueden modular incluyen cambios en la morfología o viabilidad de las células, expresión de un marcador, diferenciación o desdiferenciación, respiración celular, actividad mitocondrial, integridad de la membrana, maduración, proliferación, viabilidad, apoptosis o muerte celular.
[0442] Los procedimientos para cribar e identificar agentes y compuestos incluyen aquellos adecuados para un cribado de alto rendimiento, que incluyen matrices de células (por ejemplo, micromatrices) situadas o colocadas, opcionalmente en posiciones o lugares predeterminados. Por ejemplo, las células se pueden colocar o situar (presiembra) en una cubeta, tubo, matraz, botella rotatoria o placa de cultivo (por ejemplo, una única cubeta o placa de múltiples pocillos tal como una cubeta o placa de 8, 16, 32, 64, 96, 384 y 1536 pocillos). Los procedimientos de manipulación manuales o robóticos de alto rendimiento pueden sondear interacciones químicas y determinar los niveles de expresión de muchos genes en un periodo corto. Se han desarrollado técnicas que emplean señales moleculares (por ejemplo, a través de fluoróforos) y análisis automáticos que procesan información a una velocidad muy elevada (véase, por ejemplo, a Pinhasov y col., Comb. Chem. High Throughput Screen. 7:133 (2004)). Por ejemplo, la tecnología de micromatrices se ha utilizado de forma generalizada para sondear las interacciones de miles de genes a la vez, al tiempo que se proporciona información sobre genes específicos (véase, por ejemplo, a Mocellin y Rossi, Adv. Exp. Med. Biol. 593:19 (2007)).
[0443] Las bibliotecas que se pueden cribar incluyen, por ejemplo, bibliotecas de moléculas pequeñas, bibliotecas de expresión en fagos, bibliotecas de expresión en levaduras de anticuerpos completamente humanos (Adimab, LLC), bibliotecas de ARNip y vectores de transfección adenovirales.
X. Preparaciones farmacéuticas y usos terapéuticos
A. Formulaciones y vías de administración
[0444] Dependiendo de la forma del modulador junto con cualquier conjugado opcional, el modo de administración deseado, la enfermedad que se esté tratando o monitorizando y otras muchas variables, las composiciones de la invención se pueden formular según se desee utilizando técnicas reconocidas en la técnica. En algunas realizaciones, las composiciones terapéuticas de la invención se pueden administrar puras o con una cantidad mínima de componentes adicionales mientras que otras se pueden formular opcionalmente para que contengan portadores farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que son muy conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, a Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20a ed. (2003); Ansel y col., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7S ed., Lippencott Williams y Wilkins (2004); Kibbe y col., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a ed., Pharmaceutical Press (2000)). Diversos portadores farmacéuticamente aceptables, que incluyen vehículos, adyuvantes y diluyentes, se pueden adquirir fácilmente de muchas fuentes comerciales. Además, también se dispone de un surtido de sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes reguladores del pH y tamponantes, agentes reguladores de la tonicidad, estabilizantes, agentes humectantes y similares. Ciertos portadores ilustrativos no limitantes incluyen solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos.
[0445] Más particularmente, se apreciará que, en algunas realizaciones, las composiciones terapéuticas de la invención se pueden administrar puras o con una cantidad mínima de componentes adicionales. En cambio, los moduladores de SEZ6 de la presente invención se pueden formular opcionalmente para que contengan portadores farmacéuticamente aceptables adecuados, que comprenden excipientes y auxiliares que son muy conocidos en la técnica, y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración del modulador o que ayudan a procesar los compuestos activos para obtener preparados que están farmacéuticamente optimizados para el suministro al sitio de acción. Por ejemplo, un excipiente puede conferir forma o consistencia, o actuar como diluyente para mejorar las propiedades farmacocinéticas o la estabilidad del modulador. Los excipientes o aditivos adecuados incluyen, pero sin limitación, agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsionantes, sales para variar la osmolaridad, agentes encapsulantes, tampones y potenciadores de la penetración cutánea. En ciertas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas se pueden proporcionar en una forma liofilizada y reconstituir en, por ejemplo, solución salina tamponada, antes de su administración.
[0446] Los moduladores descritos para la administración sistémica se pueden formular para la administración entérica, parenteral o tópica. De hecho, estos tres tipos de formulación se pueden utilizar simultáneamente para conseguir una administración sistémica del principio activo. Se exponen excipientes así como formulaciones para el suministro de fármacos parenteral y no parenteral en Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20a Ed. Mack Publishing (2000). Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma hidrosoluble, por ejemplo, sales hidrosolubles. Además, se pueden administrar suspensiones de los compuestos activos según proceda para suspensiones de inyección oleosas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, poli(láctido) sustituido con hexilo, aceite de sésamo, o esteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión e incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes. También se pueden utilizar liposomas para encapsular el agente para su suministro a la célula.
[0447] Las formulaciones adecuadas para la administración entérica incluyen cápsulas de gelatina dura o blanda, píldoras, comprimidos, incluidos los comprimidos recubiertos, elixires, suspensiones, jarabes o inhalaciones y formas de liberación controlada de los mismos.
[0448] En general, los compuestos y las composiciones de la invención, que comprenden moduladores de SEZ6 se pueden administrar in vivo a un sujeto que lo necesite, a través de diversas vías, que incluyen, pero sin limitación, la vía oral, intravenosa, intraarterial, subcutánea, parenteral, intranasal, intramuscular, intracraneal, intracardíaca, intraventricular, intratraqueal, bucal, rectal, intraperitoneal, intradérmica, tópica, transdérmica e intratecal, o bien por implantación o inhalación. Las composiciones en cuestión se pueden formular como preparados en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas; que incluyen, pero sin limitación, comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, ungüentos, soluciones, supositorios, enemas, inyecciones, inhaladores y aerosoles. La formulación y la vía de administración adecuadas se pueden seleccionar según la aplicación y el régimen terapéutico deseados.
B. Dosificaciones
[0449] De forma similar, el régimen de dosificación particular, es decir, la dosis, la duración y la repetición, dependerán del individuo particular y de los antecedentes médicos del individuo, así como también de consideraciones empíricas tales como las propiedades farmacocinéticas (por ejemplo, semivida, tasa de depuración, etc.). La frecuencia de la administración se puede determinar y ajustar durante el curso de la terapia, y se basa en reducir el número de células tumorigénicas o proliferativas, mantener la reducción de tales células neoplásicas, reducir la proliferación de células neoplásicas o retardar el desarrollo de metástasis. En otras realizaciones, la dosis administrada se puede ajustar o atenuar para controlar efectos secundarios y/o toxicidad potenciales. Como alternativa, pueden ser adecuadas las formulaciones de liberación continua prolongada de una composición terapéutica en cuestión.
[0450] En general, los moduladores de la descripción se pueden administrar en diferentes intervalos. Estos incluyen de aproximadamente 10 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por dosis; de aproximadamente 50 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por dosis; de aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por dosis. Otros intervalos incluyen de aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por dosis y de aproximadamente 0,5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por dosis. En ciertos casos, la dosificación es al menos aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 250 pg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 750 pg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal.
[0451] En casos seleccionados, los moduladores se administrarán a aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 pg/kg de peso corporal por dosis. Otros casos comprenderán la administración de moduladores a 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o 900 pg/kg de peso corporal por dosis. En otros casos preferidos, los moduladores
descritos se administrarán en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 mg/kg. En aún otros casos, los moduladores pueden administrarse a 12, 14, 16, 18 o 20 mg/kg de peso corporal por dosis. En otros casos adicionales, los moduladores pueden administrarse a 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 o 100 mg/kg de peso corporal por dosis. Según las enseñanzas en el presente documento, se apreciará que las dosis mencionadas anteriormente se pueden aplicar tanto a los moduladores sin conjugar como a los moduladores conjugados con un agente citotóxico. Un experto en la técnica podría determinar fácilmente las dosis adecuadas para diversos moduladores conjugados y sin conjugar sobre la base de estudios preclínicos en animales, observaciones clínicas, y técnicas y mediciones médicas y bioquímicas estándar.
[0452] En lo que respecta a los moduladores conjugados, las realizaciones particularmente preferidas comprenderán dosis de entre aproximadamente 50 pg/kg a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por dosis. A este respecto, los moduladores conjugados se pueden administrar a 50, 75 o 100 pg/kg o a 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 o 1 mg/kg de peso corporal por dosis. En otras realizaciones preferidas, los moduladores conjugados de la presente invención se pueden administrar a 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 3,5, 3,75, 4, 4,25, 4,5, 4,75 o 5 mg/kg de peso corporal por dosis. En realizaciones particularmente preferidas, dichas dosis de moduladores conjugados se administrarán por vía intravenosa durante un periodo. Además, dichas dosis se pueden administrar varias veces durante un ciclo definido del tratamiento.
[0453] Se pueden proponer otros regímenes de dosificación basados en cálculos del área de la superficie corporal (BSA) como se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 7.744.877. Como se conoce bien, el BSA se calcula utilizando la altura y el peso del paciente, y proporciona una medición del tamaño de un sujeto representado por el área de la superficie de su cuerpo. En ciertos casos, los moduladores se pueden administrar en dosis de 10 mg/m2 a 800 mg/m2, de 50 mg/m2 a 500 mg/m2 y en dosificaciones de 100 mg/m2, 150 mg/m2, 200 mg/m2, 250 mg/m2, 300 mg/m2, 350 mg/m2, 400 mg/m2 o 450 mg/m2.
[0454] También se apreciará que se pueden utilizar técnicas empíricas y reconocidas en la técnica para determinar la dosis adecuada para los moduladores conjugados (es decir, ADC).
[0455] En cualquier caso, los moduladores de SEZ6 (tanto conjugados como sin conjugar) se administran preferentemente según sea necesario a sujetos que lo necesiten. Los expertos en la técnica, tales como un médico responsable del tratamiento, podrán determinar la frecuencia de administración en función de consideraciones sobre la afección que se esté tratando, la edad del sujeto que se esté tratando, la gravedad de la afección que se esté tratando, el estado de salud general del sujeto que se esté tratando y similares. Generalmente, se administra una dosis eficaz del modulador de SEZ6 a un sujeto una o más veces. Más particularmente, se administra una dosis eficaz del modulador al sujeto una vez al mes, más de una vez al mes o menos de una vez al mes. En ciertos casos, la dosis eficaz del modulador de SEZ6 se puede administrar varias veces, que incluyen durante periodos de al menos un mes, al menos seis meses, al menos un año, al menos dos años o un periodo de varios años. En otros casos adicionales, pueden transcurrir varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7), varias semanas (1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) o varios meses (1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) o incluso un año o varios años entre las administraciones de los moduladores descritos.
[0456] En ciertas realizaciones preferidas, el ciclo de tratamiento donde intervienen los moduladores conjugados comprenderá múltiples dosis del producto de fármaco seleccionado (es decir, un ADC) durante un periodo de semanas o meses. Más específicamente, los moduladores conjugados de la presente invención se pueden administrar una vez al día, cada dos días, cada cuatro días, cada semana, cada diez días, cada dos semanas, cada tres semanas, cada mes, cada seis semanas, cada dos meses, cada diez semanas o cada tres meses. A este respecto, se apreciará que las dosis se pueden alterar o el intervalo se puede ajustar en función de la respuesta del paciente y las prácticas clínicas.
[0457] Las dosis y los regímenes también se pueden determinar empíricamente para las composiciones terapéuticas descritas en individuos que han recibido una o más administraciones. Por ejemplo, se pueden administrar a los individuos dosis crecientes de una composición terapéutica producida como se describe en el presente documento. En realizaciones seleccionadas, la dosis se puede aumentar o reducir o atenuar gradualmente basándose respectivamente en efectos secundarios o toxicidad observados o determinados empíricamente. Para evaluar la eficacia de la composición seleccionada, se puede realizar un seguimiento de un marcador de la enfermedad, trastorno o afección específico tal como se ha descrito previamente. En casos donde el individuo padece cáncer, estos marcadores incluyen mediciones directas del tamaño del tumor por observación visual o palpación, la medición indirecta del tamaño del tumor por rayos X u otras técnicas de imagen; una mejora según se evalúa mediante una biopsia tumoral directa y un examen por microscopía de la muestra tumoral; la medición de un marcador tumoral indirecto (por ejemplo, PSA para el cáncer de próstata) o un antígeno identificado según los procedimientos descritos en el presente documento, una disminución del dolor o la parálisis; una mejora en el habla, la visión, la respiración u otra discapacidad asociada con el tumor; un mayor apetito; o un aumento de la calidad de vida según se mide mediante pruebas aceptadas o la prolongación de la supervivencia. Será evidente para un experto en la técnica que la dosis variará dependiendo del individuo, el tipo de afección neoplásica, el estadio de la afección neoplásica, si la afección neoplásica ha comenzado a metastatizarse en otras partes del cuerpo del individuo, y los tratamientos previos y concurrentes que se estén utilizando.
C. Terapias de combinación
[0458] Las terapias combinadas pueden ser particularmente útiles para reducir o inhibir la proliferación no deseada de células neoplásicas, reducir la aparición del cáncer, reducir o prevenir la recidiva del cáncer, o reducir o prevenir la dispersión o metástasis del cáncer. En tales casos, los moduladores de la presente invención pueden actuar como agentes sensibilizantes o quimiosensibilizantes mediante la eliminación de las CSC, que de lo contrario mantendrían y perpetuarían la masa tumoral, y de este modo se consigue utilizar de forma más eficaz los agentes anticancerosos o citorreductores actuales empleados como estándar de atención médica. Es decir, los moduladores descritos pueden proporcionar, en ciertos casos, un efecto mejorado (por ejemplo, de naturaleza aditiva o sinérgica) que potencie el modo de acción de otro agente terapéutico administrado. En el contexto de la presente invención, la expresión «terapia de combinación» se interpretará en un sentido amplio y se refiere simplemente a la administración de un modulador y uno o más agentes anticancerosos que incluyen, pero sin limitación, agentes citotóxicos, agentes citostáticos, agentes antiangiogénicos, agentes citorreductores, agentes quimioterapéuticos, radioterapia y agentes radioterapéuticos, agentes anticancerosos dirigidos (que incluyen tanto anticuerpos monoclonales como entidades de molécula pequeña), BRM, anticuerpos terapéuticos, vacunas contra el cáncer, citocinas, terapias hormonales, terapia con radiación y agentes antimetastásicos, y agentes inmunoterapéuticos, que incluyen tanto las estrategias específicas como no específicas.
[0459] No es necesario que los resultados combinados sean aditivos respecto a los efectos observados cuando se realiza cada tratamiento (por ejemplo, anticuerpo y agente anticanceroso) por separado. Aunque generalmente sean deseables al menos efectos aditivos, cualquier aumento en el efecto antitumoral que sea superior al de las terapias individuales será beneficioso. Además, la descripción no requiere que el tratamiento combinado exhiba efectos sinérgicos. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que con ciertas combinaciones seleccionadas que comprenden casos preferidos, se puede observar sinergia.
[0460] Al poner en práctica la terapia de combinación, el modulador y el agente anticanceroso se pueden administrar al sujeto simultáneamente, ya sea en una única composición o como dos o más composiciones diferentes, utilizando las mismas vías de administración o vías diferentes. Como alternativa, el modulador puede preceder o seguir al tratamiento con un agente anticanceroso, por ejemplo, en intervalos que varían entre minutos y semanas. El periodo de tiempo entre cada administración es tal que al agente anticanceroso y el modulador son capaces de ejercer un efecto combinado sobre el tumor. En al menos un caso, tanto el agente anticanceroso como el modulador se administran en un intervalo de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente dos semanas el uno respecto al otro. En otros casos adicionales, pueden transcurrir varios días (2, 3, 4, 5, 6 o 7), varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) o varios meses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) entre la administración del modulador y el agente anticanceroso.
[0461] La terapia de combinación se puede administrar una vez, dos veces o al menos durante un periodo hasta que la afección se trate, palie o cure. En algunos casos, la terapia de combinación se administra varias veces, por ejemplo, de tres veces al día a una vez cada seis meses. La administración se puede a justar a un programa tal como tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada seis meses o se puede administrar de forma continua a través de una minibomba. La terapia de combinación se puede administrar por cualquier vía, como las indicadas previamente. La terapia de combinación se puede administrar en un sitio distante del sitio del tumor.
[0462] En un caso, se administra un modulador combinado con uno o más agentes anticancerosos durante un ciclo de tratamiento corto a un sujeto que lo necesite. La descripción también contempla la administración discontinua o dosis diarias divididas en varias administraciones parciales. El modulador y el agente anticanceroso se pueden administrar indistintamente, en días alternos o semanas alternas; o se puede administrar una secuencia de tratamientos con el anticuerpo, seguida de uno o más tratamientos de terapia con el agente anticanceroso. En cualquier caso, como entenderán los expertos en la técnica, las dosis adecuadas de agentes quimioterapéuticos generalmente serán aproximadamente equivalentes a aquellas ya empleadas en terapias clínicas donde se administran los agentes quimioterapéuticos solos o combinados con otros agentes quimioterapéuticos.
[0463] En otro caso preferido, los moduladores de SEZ6 de la presente descripción se pueden utilizar en la terapia de mantenimiento para reducir o eliminar la posibilidad de recidiva tumoral después de la presentación inicial de la enfermedad. Preferentemente, el trastorno habrá sido tratado y la masa tumoral inicial habrá sido eliminada, reducida o mejorada de alguna otra forma de modo que el paciente sea asintomático o esté en remisión. En tal momento, se pueden administrar al sujeto cantidades farmacéuticamente eficaces de los moduladores descritos una o más veces, aunque no haya prácticamente indicios o no haya indicios en absoluto de la enfermedad utilizando procedimientos de diagnóstico estándar. En algunos casos, los moduladores se administrarán conforme a un programa regular durante un periodo tal como semanalmente, cada dos semanas, mensualmente, cada seis semanas, cada dos meses, cada tres meses, cada seis meses o anualmente. Teniendo en cuenta las enseñanzas en el presente documento, un experto en la técnica podría determinar fácilmente las dosis y los regímenes de dosificación favorables para reducir el potencial de recidiva de la enfermedad. Además, dichos tratamientos se podrían prolongar durante un
periodo de semanas, meses, años o incluso indefinidamente dependiendo de la respuesta del paciente y los parámetros clínicos y de diagnóstico.
[0464] En otro caso preferido adicional, los moduladores de la presente descripción se pueden utilizar para prevenir o reducir, profilácticamente o como una terapia adyuvante, la posibilidad de que se produzca metástasis tumoral después de un procedimiento citorreductor. Como se usa en la presente descripción, un «procedimiento citorreductor» se define y se refiere en un sentido amplio a cualquier procedimiento, técnica o procedimiento que elimine, reduzca, trate o mejore un tumor o la proliferación de un tumor. Los procedimientos citorreductores ilustrativos incluyen, pero sin limitación, cirugía, tratamientos con radiación (es decir, haz de radiación), quimioterapia, inmunoterapia o ablación. En los momentos adecuados determinados fácilmente por un experto en la técnica en vista de la presente exposición, los moduladores descritos se pueden administrar según sugieran los procedimientos clínicos, teragnósticos o de diagnóstico para reducir la metástasis tumoral. Los moduladores se pueden administrar una o más veces en dosis farmacéuticamente eficaces según se determine utilizando técnicas estándar. Preferentemente, el régimen de dosificación irá acompañado por técnicas de monitorización o diagnóstico adecuadas que permitan su modificación.
[0465] Otros casos adicionales de la descripción comprenden administrar los moduladores descritos a sujetos que son asintomáticos pero que corren el riesgo de desarrollar un trastorno proliferativo. Es decir, los moduladores de la presente invención se pueden utilizar en un sentido realmente preventivo y se pueden administrar a pacientes que hayan sido examinados o se hayan sometido a pruebas y que presenten uno o más factores de riesgo establecidos (por ejemplo, indicios genómicos, antecedentes familiares, resultados de pruebas in vivo o in vitro, etc.) pero que no hayan desarrollado ninguna neoplasia. En tales casos, los expertos en la técnica serían capaces de determinar un régimen de dosificación eficaz mediante la observación empírica o mediante prácticas clínicas aceptadas.
D. Agentes anticancerosos
[0466] El término «agente anticanceroso» o «agente antiproliferativo» se refiere a cualquier agente que se pueda utilizar para tratar un trastorno proliferativo celular tal como el cáncer e incluye, pero sin limitación, agentes citotóxicos, agentes citostáticos, agentes antiangiogénicos, agentes citorreductores, agentes quimioterapéuticos, radioterapia y agentes radioterapéuticos, agentes anticancerosos dirigidos, BRM, anticuerpos terapéuticos, vacunas contra el cáncer, citocinas, terapias hormonales, terapia de radiación, y agentes antimetastásicos y agentes inmunoterapéuticos. Se apreciará que, en casos seleccionados como los indicados anteriormente, tales agentes anticancerosos pueden comprender conjugados y se pueden asociar con moduladores antes de su administración. En ciertos casos, el agente anticanceroso descrito estará unido a un modulador de SEZ6 para proporcionar un ADC tal como se expone en el presente documento.
[0467] Como se usa en el presente documento, el término «agente citotóxico» se refiere a una sustancia que es tóxica para las células, y reduce o inhibe la función de células y/o provoca la destrucción de células. Típicamente, la sustancia es una molécula natural derivada de un organismo vivo. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero sin limitación, toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de bacterias (por ejemplo, la toxina diftérica, endotoxina y exotoxina de Pseudomonas, y enterotoxina A de Staphylococcus), hongos (por ejemplo, a-sarcina, restrictocina), plantas (por ejemplo, abrina, ricina, modecina, viscumina, proteína antivírica de Phytolacca americana, saporina, gelonina, momoridina, tricosantina, toxina de la cebada, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diatínicas, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitegelina, restrictocina, fenomicina, neomicina y los tricotecenos) o animales, (por ejemplo, RNasas citotóxicas, tales como las RNasas pancreáticas extracelulares; DNasa I, incluidos fragmentos y/o variantes de los mismos).
[0468] A los efectos de la presente invención, un «agente quimioterapéutico» comprende un compuesto químico que reduce o inhibe de forma no específica el crecimiento, la proliferación y/o la supervivencia de células cancerosas (por ejemplo, agentes citotóxicos o citostáticos). Dichos agentes químicos normalmente se dirigen a procesos intracelulares necesarios para el crecimiento o la división celular y, por lo tanto, son particularmente eficaces contra células cancerosas, que generalmente crecen y se dividen rápidamente. Por ejemplo, la vincristina despolimeriza microtúbulos y de este modo inhibe la entrada de las células en la fase de mitosis. En general, los agentes quimioterapéuticos pueden incluir cualquier agente químico que inhiba o que esté diseñado para inhibir una célula cancerosa o una célula que es probable que se vuelva cancerosa o genere una progenie tumorigénica (por ejemplo, TIC). Dichos agentes normalmente se administran y normalmente son más eficaces combinados, por ejemplo, en regímenes tales como CHOP o FOLFIRI. De nuevo, en casos seleccionados, dichos agentes quimioterapéuticos se pueden conjugar con los moduladores descritos.
[0469] Los ejemplos de agentes anticancerosos que se pueden utilizar combinados (o conjugados) con los moduladores de la presente invención incluyen, pero sin limitación, agentes alquilantes, sulfonatos de alquilo, aziridinas, etileniminas y metilamilaminas, acetogeninas, una camptotecina, briostatina, calistatina, CC-1065, criptoficinas, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, una sarcodictina, espongistatina, mostazas nitrogenadas, antibióticos, antibióticos enodiínicos, dinemicina, bisfosfonatos, esperamicina, cromóforos de
antibióticos enodiínicos cromoproteicos, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN®, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, erlotinib, vemurafenib, crizotinib, sorafenib, ibrutinib, enzalutamida, análogos del ácido fólico, análogos de la purina, andrógenos, antiadrenales, regenerador del ácido fólico tal como el ácido frolínico, aceglatona, glucósido de aldofosfamida, ácido aminolevulínico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diazicuona, elfornitina, acetato de eliptinio, una epotilona, etoglúcido, nitrato de galio, hidroxiurea, lentinán, lonidainina, maitansinoides, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2-etilhidrazida, procarbazina, complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR), razoxano; rizoxina; sizofirán; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2, 2', 2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente la toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromán; gacitosina; arabinósido («Ara-C»); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, cloranbucilo; gemcitabina GEMZAr®; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino, vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE®, novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecán (Camptosar, CPT-11), inhibidor de topoisomerasas RFS 2000; difluorometilornitina; retinoides; capecitabina; combretastatina; leucovorina; oxaliplatino; inhibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR y VEGF-A que reducen la proliferación celular, y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de hormonas sobre tumores tales como antiestrógenos y moduladores de los receptores de estrógeno selectivos, inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas suprarrenales, y antiandrógenos; así como también troxacitabina (un análogo de citosina del nucleósido de 1,3-dioxolano); oligonucleótidos antisentido, ribozimas tales como un inhibidor de la expresión de VEGF y un inhibidor de la expresión de HER2; vacunas, rIL-2 PROLEUKIN®, el inhibidor de la topoisomerasa 1 LURt Ot ECAN®; rmRH ABARELIX®; Vinorelbina y Esperamicinas, y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
[0470] En otros casos, los moduladores de la presente descripción se pueden utilizar combinados con cualquiera de los diferentes anticuerpos (o agentes inmunoterapéuticos) que en la actualidad están en fase de ensayos clínicos o se comercializan. Con este fin, los moduladores descritos se pueden utilizar combinados con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en abagovomab, adecatumumab, afutuzumab, alemtuzumab, altumomab, amatuximab, anatumomab, arcitumomab, bavituximab, bectumomab, bevacizumab, bivatuzumab, blinatumomab, brentuximab, cantuzumab, catumaxomab, cetuximab, citatuzumab, cixutumumab, clivatuzumab, conatumumab, daratumumab, drozitumab, duligotumab, dusigitumab, detumomab, dacetuzumab, dalotuzumab, ecromeximab, elotuzumab, ensituximab, ertumaxomab, etaracizumab, farletuzumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanvotumab, futuximab, ganitumab, gemtuzumab, girentuximab, glembatumumab, ibritumomab, igovomab, imgatuzumab, indatuximab, inotuzumab, intetumumab, ipilimumab, iratumumab, labetuzumab, lexatumumab, lintuzumab, lorvotuzumab, lucatumumab, mapatumumab, matuzumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, moxetumomab, narnatumab, naptumomab, necitumumab, nimotuzumab, nofetumomabn, ocaratuzumab, ofatumumab, olaratumab, onartuzumab, oportuzumab, oregovomab, panitumumab, parsatuzumab, patritumab, pemtumomab, pertuzumab, pintumomab, pritumumab, racotumomab, radretumab, rilotumumab, rituximab, robatumumab, satumomab, sibrotuzumab, siltuximab, simtuzumab, solitomab, tacatuzumab, taplitumomab, tenatumomab, teprotumumab, tigatuzumab, tositumomab, trastuzumab, tucotuzumab, ublituximab, veltuzumab, vorsetuzumab, votumumab, zalutumumab, CC49, 3F8 y combinaciones de los mismos.
[0471] Otras realizaciones particularmente preferidas adicionales comprenderán el uso de anticuerpos autorizados para la terapia contra el cáncer que incluyen, pero sin limitación, rituximab, trastuzumab, gemtuzumab ozogamcin, alemtuzumab, ibritumomab tiuxetan, tositumomab, bevacizumab, cetuximab, panitumumab, ofatumumab, ipilimumab y brentuximab vedotina. Los expertos en la técnica serán capaces de identificar fácilmente agentes anticancerosos adicionales que sean compatibles con las enseñanzas en el presente documento.
E. Radioterapia
[0472] La presente descripción también proporciona la combinación de moduladores con radioterapia (es decir, cualquier mecanismo para inducir daño en el ADN localmente en las células tumorales tal como irradiación gamma, rayos X, irradiación Uv , microondas, emisiones electrónicas y similares). También se contempla la terapia de combinación donde se emplea el suministro dirigido de radioisótopos a células tumorales y se puede utilizar en conexión con un agente anticanceroso dirigido u otro medio de direccionamiento. Típicamente, la terapia de radiación se administra en pulsos durante un periodo de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2 semanas. La terapia de radiación se puede administrar a sujetos que padecen cáncer de cabeza y cuello durante aproximadamente 6-7 semanas. Opcionalmente, la terapia de radiación se puede administrar como una única dosis o como múltiples dosis secuenciales.
XI. Indicaciones
[0473] Se apreciará que los moduladores de la presente invención se pueden utilizar para diagnosticar, tratar o inhibir la aparición o la recidiva de cualquier trastorno asociado con SEZ6. Por consiguiente, los moduladores de la invención, ya sean administrados solos o combinados con un agente anticanceroso o radioterapia, son particularmente útiles para tratar en general afecciones neoplásicas en pacientes o sujetos, que pueden incluir tumores benignos o malignos (por ejemplo, carcinomas de las glándulas suprarrenales, hígado, riñón, vejiga, mama, gástricos, de ovario, colorrectales, próstata, páncreas, pulmón, tiroides, hígado, cuello del útero, endometrio, esófago y útero; sarcomas; glioblastomas; y diversos tumores de cabeza y cuello); leucemias y neoplasias linfoides; otros trastornos tales como trastornos neuronales, gliales, astrocitales, hipotalámicos y otros trastornos glandulares, macrofágicos, epiteliales, estromales y blastocélicos; y trastornos inflamatorios, angiogénicos, inmunológicos y trastornos provocados por patógenos. En particular, las dianas principales del tratamiento son afecciones neoplásicas que comprenden tumores sólidos, aunque las neoplasias hematológicas quedan contempladas por el alcance de la invención. Preferentemente, el «sujeto» o «paciente» que se ha de tratar será un ser humano aunque se entenderá que estos términos, tal como se utilizan en el presente documento, comprenden cualquier especie de mamífero.
[0474] Más específicamente, las afecciones neoplásicas sometidas al tratamiento según la presente invención se pueden seleccionar del grupo que incluye, pero sin limitación, tumores de las glándulas suprarrenales, cánceres asociados con el SIDA, sarcoma alveolar de partes blandas, tumores astrocíticos, cáncer de vejiga (carcinoma de células escamosas y carcinoma de células transicionales), cáncer de huesos (adamantinoma, quiste óseo aneurismático, osteocondroma, osteosarcoma), cánceres de cerebro y de la médula espinal, tumores cerebrales metastásicos, cáncer de mama, tumores del cuerpo carotídeo, cáncer del cuello del útero, condrosarcoma, cordoma, carcinoma de células renales cromófobas, carcinoma de células claras, cáncer de colon, cáncer colorrectal, histiocitomas fibrosos benignos cutáneos, tumores desmoplásicos de células pequeñas y redondas, ependimomas, tumores de Ewing, condrosarcoma mixoide extraesquelético, fibrogénesis imperfecta ósea, displasia fibrosa ósea, cánceres de las vías biliares y la vesícula biliar, enfermedad trofoblástica gestacional, tumores de células germinales, cánceres de cabeza y cuello, tumores de células insulares, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (nefroblastoma, carcinoma papilar de células renales), leucemias, lipoma/tumores lipomatosos benignos, liposarcoma/tumores lipomatosos malignos, cáncer de hígado (hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular), linfomas, cánceres de pulmón (carcinoma microcítico, adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células grandes, etc.), meduloblastoma, melanoma, meningiomas, neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, neuroblastoma, tumores neuroendocrinos, cáncer ovárico, cánceres pancreáticos, carcinomas papilares de la tiroides, tumores de paratiroides, cánceres pediátricos, tumores de la vaina de los nervios periféricos, feocromocitoma, tumores de la pituitaria, cáncer de próstata, melanoma uveal posterior, trastornos hematológicos poco frecuentes, cáncer metastásico renal, tumor rabdoide, rabdomisarcoma, sarcomas, cáncer de piel, sarcomas de los tejidos blandos, cáncer de células escamosas, cáncer de estómago, sarcoma sinovial, cáncer testicular, carcinoma tímico, timoma, cáncer metastásico de la tiroides y cánceres uterinos (carcinoma del cuello del útero, carcinoma de endometrio y leiomioma).
[0475] En ciertas realizaciones preferidas, el trastorno proliferativo comprenderá un tumor sólido, que incluye, pero sin limitación, carcinomas de las glándulas suprarrenales, hígado, riñón, vejiga, mama, gástricos, ováricos, del cuello del útero, uterinos, esofágicos, colorrectales, de próstata, pancreáticos, de pulmón (tanto microcíticos como no microcíticos), de tiroides, sarcomas, glioblastomas y diversos tumores de cabeza y cuello. En otros casos preferidos, y como se muestra más adelante en los Ejemplos, los moduladores descritos son especialmente eficaces en el tratamiento del cáncer de pulmón microcítico (SCLC) y el cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) (por ejemplo, el cáncer de pulmón no microcítico de células escamosas o el cáncer de pulmón microcítico de células escamosas). En una realización, el cáncer de pulmón es refractario, recividante o resistente a un agente basado en platino (por ejemplo, carboplatino, cisplatino, oxaliplatino, topotecán) y/o un taxano (por ejemplo, docetaxel, paclitaxel, larotaxel o cabazitaxel). Además, en casos particularmente preferidos, los moduladores descritos se pueden utilizar en una forma conjugada para tratar el cáncer de pulmón microcítico.
[0476] En lo que respecta al cáncer de pulmón microcítico, las realizaciones particularmente preferidas comprenderán la administración de moduladores conjugados (ADC). En realizaciones seleccionadas, los moduladores conjugados se administrarán a pacientes que exhiben una enfermedad en estadio limitado. En otros casos, los moduladores descritos se administrarán a pacientes que exhiben una enfermedad en estadio extensivo. En otros casos preferidos, los moduladores conjugados descritos se administrarán a pacientes refractarios (es decir, aquellos que experimentan una recidiva durante o poco después de finalizar un curso de terapia inicial). Otros casos adicionales comprenden la administración de los moduladores descritos a pacientes sensibles (es decir, aquellos cuya recaída tiene lugar más de 2-3 meses después de la terapia primaria). En cada caso, se apreciará que los moduladores compatibles pueden estar en un estadio conjugado o sin conjugar dependiendo del régimen de dosificación seleccionado y el diagnóstico clínico.
[0477] Como se ha analizado anteriormente, los moduladores descritos se pueden utilizar además para prevenir, tratar o diagnosticar tumores con características o fenotipos neuroendocrinos, que incluyen tumores neuroendocrinos. Los tumores neuroendocrinos (NET) verdaderos o canónicos que se originan en el sistema endocrino difuso son relativamente poco frecuentes, con una incidencia de 2-5 cada 100.000 personas, pero son
sumamente agresivos. Los tumores neuroendocrinos aparecen en el riñón, aparato genitourinario (vejiga, próstata, ovario, cuello del útero y endometrio), tracto gastrointestinal (colon, estómago), tiroides (cáncer medular de tiroides) y pulmón (carcinoma de pulmón microcítico y carcinoma neuroendocrino de células grandes). Estos tumores pueden secretar varias hormonas, incluidas la serotonina y/o cromogranina A, que pueden provocar síntomas debilitantes conocidos como el síndrome carcinoide. Estos tumores se pueden representar mediante marcadores inmunohistoquímicos positivos tales como la enolasa neuroespecífica (NSE, conocida también como enolasa gamma, símbolo génico = ENO2), CD56 (o NCAM1), cromogranina A (CHGA) y sinaptofisina (SYP) o mediante genes que se sabe que exhiben una expresión elevada tales como ASCL1. Desafortunadamente, las quimioterapias tradicionales no han sido particularmente efectivas en el tratamiento de NET y la metástasis hepática es un resultado habitual.
[0478] Aunque los moduladores descritos se pueden utilizar convenientemente para tratar tumores neuroendocrinos, también se pueden utilizar para tratar, prevenir o diagnosticar tumores pseudoneuroendocrinos (pNET) que genotípica o fenotípicamente imitan, se asemejan o exhiben rasgos comunes respecto a los tumores neuroendocrinos canónicos. Los tumores pseudoneuroendocrinos o tumores con características neuroendocrinas son tumores que se originan a partir de células del sistema neuroendocrino difuso o a partir de células donde se ha reactivado de forma aberrante una cascada de diferenciación neuroendocrina durante el proceso oncogénico. Tales pNET normalmente comparten ciertas características fenotípicas o bioquímicas con tumores neuroendocrinos definidos tradicionalmente, que incluyen la capacidad para producir subconjuntos de aminas, neurotransmisores y hormonas peptídicas biológicamente activos. Histológicamente, tales tumores (NET y pNET) comparten una apariencia común que normalmente presenta células pequeñas conectadas densamente con citoplasma mínimo de citopatología blanda y núcleos punteados de redondos a ovales. A los efectos de la presente invención, los marcadores histológicos o marcadores genéticos expresados comúnmente que se pueden utilizar para definir tumores neuroendocrinos y pseudoneuroendocrinos incluyen, pero sin limitación, la cromogranina A, CD56, sinaptofisina, PGP9.5, ASCL1 y enolasa neuroespecífica (NSE).
[0479] Por consiguiente, los moduladores de la presente invención se pueden utilizar beneficiosamente para tratar tanto tumores pseudoneuroendocrinos como tumores neuroendocrinos canónicos. A este respecto, los moduladores se pueden utilizar como se describe en el presente documento para tratar tumores neuroendocrinos (tanto NET como pNET) que se originan en el riñón, aparato genitourinario (vejiga, próstata, ovario, cuello del útero y endometrio), tubo gastrointestinal (colon, estómago), tiroides (cáncer medular de tiroides) y pulmón (carcinoma pulmonar microcítico y carcinoma neuroendocrino de células grandes). Además, los moduladores de la presente invención se pueden utilizar para tratar tumores que expresan uno o más marcadores seleccionados del grupo que consiste en NSE, CD56, sinaptofisina, cromogranina A, ASCL1 y PGP9.5 (UCHL1). Es decir, la presente invención se puede utilizar para tratar a un sujeto que padece un tumor que es NSE+ o CD56+ o PGP9.5+ o ASCL1 o SYP+ o CHGA+ o alguna combinación de los mismos.
[0480] En lo que respecta a neoplasias hematológicas, se apreciará además que los compuestos y procedimientos de la presente descripción pueden ser particularmente eficaces en el tratamiento de diversos linfoma de linfocitos B, que incluyen el linfoma de células foliculares de bajo grado/NHL (FCC), linfoma de células del manto (MCL), linfoma difuso de células grandes (DLCL), NHL linfocítico pequeño (LP), NHL folicular/de grado intermedio, NHL difuso de grado intermedio, NHL inmunoblástico de alto grado, NHL linfoblástico de alto grado, NHL de células no escindidas pequeñas de alto grado, NHL de gran masa tumoral, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma linfoplasmacitoide (LPL), linfoma de células del manto (MCL), linfoma folicular (FL), linfoma difuso de células grandes (DLCL), linfoma de Burkitt (BL), linfomas relacionados con el SIDA, linfoma monocítico de linfocitos B, linfoadenopatía angioinmunoblástica, linfocitíco pequeño, folicular, difuso de células grandes, difuso de células pequeñas escindidas, linfoblastoma inmunoblástico de células grandes, pequeño, no escindido, de Burkitt y de no Burkitt, folicular, predominantemente de células grandes; folicular, predominantemente de células pequeñas escindidas; y linfomas foliculares mixtos, de células grandes y de células pequeñas escindidas. Véase, Gaidono y col., «Lymphomas», IN CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, Vol. 2: 2131-2145 (DeVita y col., eds., 5a ed. 1997). Debería ser obvio para los expertos en la técnica que estos linfomas a menudo tendrán nombres diferentes, debido a que los sistemas de clasificación están sujetos a cambios y a que los pacientes que padecen linfomas clasificados con nombres diferentes también se pueden beneficiar de los regímenes terapéuticos combinados de la presente invención.
[0481] La presente descripción también proporciona un tratamiento preventivo o profiláctico de sujetos que presentan tumores benignos o precancerosos. Aparte de tratarse de un trastorno asociado con SEZ6, no se cree que se deba excluir ningún tipo particular de tumor o trastorno proliferativo del tratamiento utilizando la presente invención. Sin embargo, el tipo de células tumorales puede ser relevante para el uso de la invención combinado con agentes terapéuticos secundarios, en particular agentes quimioterapéuticos y agentes anticancerosos dirigidos.
XII. Artículos fabricados
[0482] También se proporcionan paquetes y kits farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes, que comprenden una o más dosis de un modulador de SEZ6. En ciertos casos, se proporciona una dosis unitaria, donde la dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de una composición que comprende, por ejemplo, un anticuerpo anti-SEZ6 con o sin uno o más agentes adicionales. Para otros casos, la dosis unitaria se suministra en
una jeringa desechable precargada para su inyección. En otros casos adicionales, la composición contenida en la dosis unitaria puede comprender solución salina, sacarosa o similares; un tampón, tal como fosfato o similares; y/o se puede formular dentro de un intervalo de pH estable y eficaz. Como alternativa, en ciertos casos, la composición se puede proporcionar como un polvo liofilizado que se puede reconstituir al añadir un líquido adecuado, por ejemplo, agua estéril. En ciertos casos preferidos, la composición comprende una o más sustancias que inhiben la agregación proteica, incluidas, pero sin limitación, la sacarosa y la arginina. Cualquier etiqueta sobre el uno o más recipientes o que esté asociada con estos indica que la composición contenida se utiliza para el diagnóstico o el tratamiento de la afección patológica seleccionada.
[0483] La presente descripción también proporciona kits para producir unidades de administración mono o multidosis de un modulador de SEZ6 y, opcionalmente, uno o más agentes anticancerosos. El kit comprende un recipiente y una etiqueta o un prospecto sobre o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes se pueden formar a partir de diversos materiales tales como vidrio o plástico y contener una cantidad farmacéuticamente eficaz de los moduladores descritos en una forma conjugada o sin conjugar. En otros casos preferidos, el uno o más recipientes comprenden un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón que puede ser perforado por una aguja de inyección hipodérmica). Dichos kits generalmente contendrán en un recipiente adecuado una formulación farmacéuticamente aceptable del modulador de SEZ6 y, opcionalmente, uno o más agentes anticancerosos en el mismo recipiente o en recipientes diferentes. Los kits también pueden contener otras formulaciones farmacéuticamente aceptables, ya sea para el diagnóstico o la terapia de combinación. Por ejemplo, además del modulador de SEZ6 de la invención, dichos kits pueden contener uno o más cualesquiera de una serie de agentes anticancerosos tales como fármacos quimioterapéuticos o radioterapéuticos; agentes antiangiogénicos; agentes antimetastásicos; agentes anticancerosos dirigidos; agentes citotóxicos; y/u otros agentes anticancerosos. Dichos kits también pueden proporcionar reactivos adecuados para conjugar el modulador de SEZ6 con un agente anticanceroso o agente de diagnóstico (por ejemplo, véase la Patente de Estados Unidos N.° 7.422.739).
[0484] Más preferentemente, los kits pueden contener un único recipiente que contenga el modulador de SEZ6, con o sin componentes adicionales, o pueden contener recipientes diferentes para cada agente deseado. Cuando se proporcionan agentes terapéuticos combinados para su conjugación, se puede premezclar una única solución, ya sea en una combinación de un equivalente molar o con un componente en exceso respecto al otro. Como alternativa, el modulador de SEZ6 y cualquier agente anticanceroso opcional del kit se pueden mantener separados dentro de recipientes diferentes antes de administrarlos a un paciente. Los kits también pueden comprender un segundo/tercer recipiente que contenga un tampón estéril farmacéuticamente aceptable u otro diluyente tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución tamponada con fosfato (PBS), solución de Ringer y solución de dextrosa.
[0485] Cuando se proporcionan los componentes del kit en una o más soluciones líquidas, la solución líquida es preferentemente una solución acuosa, con preferencia en particular por una solución acuosa estéril. Sin embargo, los componentes del kit se pueden proporcionar como polvo(s) seco(s). Cuando se proporcionan reactivos o componentes como un polvo seco, el polvo se puede reconstituir mediante la adición de un disolvente adecuado. Se contempla que el disolvente también se puede proporcionar en otro recipiente.
[0486] Como se ha indicado anteriormente de forma breve, los kits también pueden contener un medio mediante el cual se administre el anticuerpo y cualesquiera componentes opcionales a un animal o paciente, por ejemplo, una o más agujas o jeringas, o incluso un cuentagotas, una pipeta u otro aparato similar, a partir del cual se puede inyectar o introducir la formulación en el animal o aplicarla a una parte del cuerpo afectada por una enfermedad. Los kits de la presente descripción también incluirán normalmente un medio que contenga los viales o recipientes similares, y otro componente aislado para su uso comercial, tal como, por ejemplo, recipientes de plástico moldeados por soplado o inyección donde se colocan y retienen los viales y otros aparatos deseados. Cualquier etiqueta o prospecto indica que la composición del modulador de SEZ6 se utiliza para tratar un cáncer, por ejemplo, el cáncer de pulmón microcítico.
[0487] En otros casos preferidos, los moduladores de la presente descripción se pueden utilizar junto con o pueden comprender dispositivos terapéuticos o de diagnóstico útiles en el diagnóstico o el tratamiento de trastornos proliferativos. Por ejemplo, en un caso preferido, los compuestos y las composiciones de la presente invención se pueden combinar con ciertos dispositivos o instrumentos de diagnóstico que se pueden utilizar para detectar, monitorizar, cuantificar u obtener el perfil de células o compuestos marcadores que participan en la etiología o la manifestación de trastornos proliferativos. Para casos seleccionados, los compuestos marcadores pueden comprender NSE, CD56, sinaptofisina, cromogranina A y PGP9.5.
[0488] En casos particularmente preferidos, los dispositivos se pueden utilizar para detectar, monitorizar y/o cuantificar células tumorales circulantes in vivo o in vitro (véase, por ejemplo, el documento WO 2012/0128801 que se incorpora a la presente por referencia).
[0489] En otros casos preferidos adicionales, y como se ha analizado anteriormente, las células tumorales circulantes pueden comprender células madre cancerosas.
XIII. Reactivos para la investigación
[0490] Otros casos preferidos de la descripción también aprovechan las propiedades de los moduladores descritos como un instrumento útil para identificar, monitorizar, aislar, seccionar o enriquecer poblaciones o subpoblaciones de células iniciadoras de tumores mediante procedimientos tales como la citometría de flujo, la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) o el seccionamiento mediado por láser. Los expertos en la técnica apreciarán que los moduladores se pueden utilizar en diversas técnicas compatibles para caracterizar y manipular TIC, incluidas las células madre cancerosas (por ejemplo, véanse las Patentes de Estados Unidos N.° 12/686.359, 12/669.136 y 12/757.649).
XIV. Disposiciones diversas
[0491] A menos que se defina de otro modo en el presente documento, los términos científicos y técnicos utilizados en conexión con la presente invención tendrán los significados habituales con los que estarán familiarizados los expertos en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos en singular incluirán las pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Más específicamente, como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular «un», «una» y «el/la» incluyen los referentes en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a «una proteína» incluye una pluralidad de proteínas; la referencia a «una célula» incluye mezclas de células y similares. Además, los intervalos proporcionados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas incluyen ambos límites de los intervalos y todos los puntos entre los límites. Por lo tanto, un intervalo de 2,0 a 3,0 incluye 2,0, 3,0, y todos los puntos entre 2,0 y 3,0.
[0492] Generalmente, las técnicas de cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética, y la química e hibridación de proteínas y ácidos nucleicos descritas en el presente documento, así como también la nomenclatura empleada en conexión con estas, son las conocidas y de uso común en la técnica. Los procedimientos y las técnicas de la presente descripción se realizan generalmente según procedimientos convencionales muy conocidos en la técnica, y se describen en varias referencias generales y más específicas que se citan y se analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva a menos que se indique lo contrario. Véanse, por ejemplo, Abbas y col., Cellular and Molecular Immunology, 6a ed., W.B. Saunders Company (2010); Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow y Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); y Coligan y col., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se llevan a cabo según las instrucciones del fabricante, según se realizan habitualmente en la técnica o como se describen en el presente documento. La nomenclatura utilizada en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de química analítica, química orgánica sintética, y química farmacéutica y medicinal descritas en el presente documento son los ya conocidos y comúnmente utilizados en la técnica. Además, todos los títulos de las secciones utilizados en el presente documento tienen carácter únicamente organizativo y no se deben interpretar como limitantes de la materia objeto descrita.
XV. Referencias de SEZ6
[0493] Además, todos los títulos de las secciones utilizados en el presente documento tienen carácter únicamente organizativo y no se deben interpretar como limitantes de la materia objeto descrita.
1. Bork P, Beckmann G. (1993). The CUB domain. A widespread module in developmentally regulated proteins. J Mol Biol. 231:539-45. PMID: 8510165.
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3. Gunnersen JM et al. (2007). Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons. Neuron. 56:621-39. PMID: 18031681.
4. Gunnersen JM et al. (2009). Seizure-related gene 6 (Sez-6) in amacrine cells of the rodent retina and the consequence of gene deletion. PLoS One. 4:e6546. PMID:19662096.
5. Herbst R, Nicklin MJ (1997). SEZ-6: promoter selectivity, genomic structure and localized expression in the brain. Brain Res Mol Brain Res. 44:309-22. PMID: 9073173.
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XVI. Casos seleccionados de la descripción
[0494] Además de la descripción y los Ejemplos en el presente documento, la presente descripción se refiere a casos seleccionados que se exponen específicamente justo a continuación.
Casos seleccionados:
[0495]
1. Un modulador de SEZ6 aislado.
2. El modulador de SEZ6 aislado el punto 1, donde el modulador de SEZ6 comprende un antagonista de SEZ6. 3. El modulador de SEZ6 aislado del punto 1, donde el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo del mismo.
4. El modulador de SEZ6 aislado del punto 3, donde el anticuerpo o el fragmento inmunorreactivo del mismo comprende un anticuerpo monoclonal.
5. El modulador de SEZ6 aislado del punto 4, donde el anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos.
6. El modulador de SEZ6 aislado del punto 4, donde el anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo neutralizante.
7. El modulador de SEZ6 aislado del punto 4, donde dicho anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo supresor.
8. El modulador de SEZ6 aislado del punto 4, donde el anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo internalizante.
9. El modulador de SEZ6 aislado del punto 8, donde el anticuerpo monoclonal comprende además un agente citotóxico.
10. El modulador de SEZ6 aislado del punto 4 donde dicho anticuerpo monoclonal comprende una región variable de cadena ligera que tiene tres regiones determinantes de la complementariedad y una región variable de cadena pesada que tiene tres regiones determinantes de la complementariedad donde las regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada y ligera comprenden al menos una región determinante de la complementariedad expuesta en la FIG. 10A o la FIG. 10B, respectivamente.
11. El modulador de SEZ6 aislado del punto 4, donde dicho anticuerpo monoclonal comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, donde dicha región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166 y SEQ ID NO: 168, y donde dicha región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167 y SEQ ID NO: 169.
12. Un modulador de SEZ6 aislado que comprende una CDR de una cualquiera de las regiones variables de cadena pesada o ligera expuestas en el punto 11.
13. Un modulador de SEZ6 aislado que comprende un anticuerpo de competición, donde dicho anticuerpo de competición inhibe la unión de un modulador de SEZ6 aislado de 10 o 11 con respecto a SEZ6 en al menos
aproximadamente 40 %.
14. Un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de aminoácidos o una región variable de cadena ligera de aminoácidos del punto 11.
15. Un vector que comprende el ácido nucleico del punto 14.
16. El modulador de SEZ6 aislado del punto 1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4 y fragmentos de las mismas.
17. El modulador de SEZ6 aislado del punto 16, donde el modulador de SEZ6 comprende además al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina.
18. El modulador de SEZ6 aislado del punto 1, donde el modulador reduce la frecuencia de células iniciadoras de tumores al administrarlo a un sujeto que lo necesite.
19. El modulador de SEZ6 aislado del punto 18, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando un análisis por citometría de flujo de marcadores de la superficie de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores.
20. El modulador de SEZ6 aislado del punto 18, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando una detección inmunohistoquímica de marcadores de la superficie de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores.
21. El modulador de SEZ6 aislado del punto 18, donde las células iniciadoras de tumores comprenden células perpetuantes de tumores.
22. El modulador de SEZ6 aislado del punto 1 que comprende además un agente citotóxico.
23. Una composición farmacéutica que comprende el modulador de SEZ6 aislado del punto 1.
24. La composición farmacéutica del punto 23, donde dicho modulador de SEZ6 aislado comprende un anticuerpo monoclonal.
25. La composición farmacéutica del punto 24, donde dicho anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo humanizado.
26. La composición farmacéutica del punto 25, donde dicho anticuerpo humanizado comprende un agente citotóxico.
27. El modulador de SEZ6 aislado del punto 26, donde el agente citotóxico comprende una pirrolobenzodiazepina.
28. El modulador de SEZ6 aislado del punto 26, donde el agente citotóxico comprende una auristatina.
29. Un procedimiento para tratar un trastorno asociado con SEZ6 que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de SEZ6 a un sujeto que lo necesite.
30. El procedimiento del punto 29, donde dicho modulador de SEZ6 comprende un antagonista de SEZ6.
31. El procedimiento del punto 29, donde dicho modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo.
32. El procedimiento del punto 31, donde el anticuerpo o el fragmento inmunorreactivo del mismo comprende un anticuerpo monoclonal.
33. El procedimiento del punto 32, donde el anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos.
34. El procedimiento del punto 33, donde dicho anticuerpo monoclonal comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, donde dicha región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166 y SEQ ID NO: 168, y donde dicha región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167 y SEQ ID NO: 169. 35. El procedimiento del punto 34, donde dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo humanizado.
36. El procedimiento del punto 32, donde dicho anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo neutralizante. 37. El procedimiento del punto 32, donde dicho anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo internalizante. 38. El procedimiento del punto 37, donde dicho anticuerpo internalizante comprende un agente citotóxico.
39. El procedimiento del punto 38, donde dicho agente citotóxico comprende una pirrolobenzodiazepina.
40. El procedimiento del punto 38, donde dicho agente citotóxico comprende una auristatina.
41. El procedimiento del punto 39, donde dicho trastorno asociado con SEZ6 comprende un trastorno neoplásico. 42. El procedimiento del punto 41, donde dicho trastorno neoplásico comprende un tumor que exhibe características neuroendocrinas.
43. El procedimiento del punto 42, donde el tumor que exhibe características neuroendocrinas comprende un tumor neuroendocrino.
44. El procedimiento del punto 41, donde el sujeto padece un trastorno neoplásico seleccionado del grupo que consiste en cáncer suprarrenal, cáncer de vejiga, cáncer del cuello del útero, cáncer de endometrio, cáncer gástrico, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer de mama.
45. El procedimiento del punto 44, donde el sujeto padece cáncer de pulmón.
46. El procedimiento del punto 45, donde el sujeto padece cáncer de pulmón microcítico.
47. El procedimiento del punto 41, donde el sujeto que padece el trastorno neoplásico exhibe tumores que comprenden células iniciadoras de tumores.
48. El procedimiento del punto 47, que comprende además el paso de reducir la frecuencia de células iniciadoras de tumores en el sujeto.
49. El procedimiento del punto 48, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando un análisis por citometría de flujo de marcadores de la superficie de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores o una detección inmunohistoquímica de marcadores de la superficie de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores.
50. El procedimiento del punto 48, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando un procedimiento del grupo que consiste en un análisis de dilución limitante in vitro e in vivo.
51. El procedimiento del punto 50, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando un análisis de dilución limitante in vivo que comprende el trasplante de células tumorales humanas vivas en ratones inmunodeprimidos.
52. El procedimiento del punto 51, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando un análisis de dilución limitante in vivo que comprende la cuantificación de la frecuencia de células iniciadoras de tumores utilizando el modelo estadístico de la distribución de Poisson.
53. El procedimiento del punto 50, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando un análisis de dilución limitante in vitro que comprende la deposición por dilución limitante de células tumorales humanas vivas en condiciones que estimulen las colonias in vitro.
54. El procedimiento del punto 53, donde la reducción de la frecuencia determinada utilizando un análisis de dilución limitante in vitro comprende la cuantificación de la frecuencia de células iniciadoras de tumores utilizando el modelo estadístico de la distribución de Poisson.
55. El procedimiento del punto 29, que comprende además la etapa de administrar un agente anticanceroso.
56. El procedimiento del punto 29, donde el modulador de SEZ6 comprende una o más CDR de cualquiera de las SEQ ID NO: 20 a 169.
57. El procedimiento del punto 29, donde el modulador de SEZ6 comprende un modulador de pan-SEZ6.
58. El procedimiento del punto 57, donde dicho modulador de SEZ6 comprende un agente citotóxico.
59. Un procedimiento para reducir la frecuencia de células iniciadoras de tumores en un sujeto que lo necesite que comprende la etapa de administrar un modulador de SEZ6 al sujeto.
60. El procedimiento del punto 59, donde las células iniciadoras de tumores comprenden células perpetuantes de tumores.
61. El procedimiento del punto 60, donde dichas células perpetuantes de tumores se seleccionan entre células que expresan marcadores seleccionadas del grupo que consiste en células CD44+, CD324+ y CD133+.
62. El procedimiento del punto 59, donde dicho modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo.
63. El procedimiento del punto 62, donde dicho anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal.
64. El procedimiento del punto 63, donde dicho anticuerpo monoclonal comprende además un agente citotóxico.
65. El procedimiento del punto 59, donde el sujeto padece un trastorno neoplásico seleccionado del grupo que consiste en cáncer suprarrenal, cáncer de vejiga, cáncer del cuello del útero, cáncer de endometrio, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer de mama.
66. El procedimiento del punto 65, donde el sujeto padece cáncer de pulmón.
67. El procedimiento del punto 66, donde el sujeto padece cáncer de pulmón microcítico.
68. El procedimiento del punto 59, donde la frecuencia de células iniciadoras tumorales se reduce al menos un 10 %.
69. El procedimiento del punto 59, donde la reducción de la frecuencia se determina utilizando un análisis por citometría de flujo de marcadores de la superficie de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores o una detección inmunohistoquímica de marcadores de la superficie de células tumorales que se sabe que se encuentran enriquecidos en las células iniciadoras de tumores.
70. Un procedimiento de sensibilización de un tumor en un sujeto para su tratamiento con un agente anticanceroso que comprende la etapa de administrar un modulador de SEZ6 a dicho sujeto.
71. El procedimiento del punto 70, donde dicho modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo.
72. El procedimiento del punto 70, donde dicho tumor es un tumor sólido.
73. El procedimiento del punto 70, donde dicho agente anticanceroso comprende un agente quimioterapéutico. 74. El procedimiento del punto 70, donde dicho agente anticanceroso comprende un agente inmunoterapéutico. 75. Un procedimiento para diagnosticar un trastorno proliferativo en un sujeto que lo necesite que comprende las etapas de:
i. obtener una muestra de tejido de dicho sujeto;
ii. poner en contacto la muestra de tejido con al menos un modulador de SEZ6; y
iii. detectar o cuantificar el modulador de SEZ6 asociado con la muestra.
76. El procedimiento del punto 75, donde el modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo monoclonal.
77. El procedimiento del punto 76, donde el anticuerpo monoclonal está asociado operativamente con un indicador.
78. Un artículo de fabricación útil para diagnosticar o tratar trastornos asociados con SEZ6 que comprende un receptáculo que comprende un modulador de SEZ6 y materiales instructivos para utilizar el modulador de SEZ6 para tratar o diagnosticar el trastorno asociado con SEZ6.
79. El artículo manufacturado del punto 78, donde dicho modulador de SEZ6 es un anticuerpo monoclonal.
80. El artículo manufacturado del punto 78, donde el receptáculo comprende una placa legible.
81. Un procedimiento para tratar a un sujeto que padece un trastorno neoplásico que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un modulador de SEZ6 internalizante.
82. El procedimiento del punto 81, donde dicho modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo.
83. El procedimiento del punto 82, donde dicho anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal.
84. El procedimiento del punto 83, donde el anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo humanizado.
85. El procedimiento del punto 83, donde el anticuerpo monoclonal comprende además un agente citotóxico.
86. El procedimiento del punto 81, que comprende además la etapa de administrar un agente anticanceroso.
87. El procedimiento del punto 81, donde el trastorno neoplásico comprende un tumor que exhibe características neuroendocrinas.
88. El procedimiento del punto 81, donde el trastorno neoplásico comprende un tumor que exhibe características neurales.
89. El procedimiento del punto 81, donde el trastorno neoplásico comprende un cáncer de pulmón.
90. El procedimiento del punto 81, donde el trastorno neoplásico comprende un cáncer de pulmón microcítico.
91. Un procedimiento para tratar a un sujeto que padece un trastorno neoplásico que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un modulador de SEZ6 neutralizante.
92. El procedimiento del punto 91, donde dicho modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo.
93. El procedimiento del punto 92, donde dicho anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal.
94. El procedimiento del punto 93, donde el anticuerpo monoclonal comprende un anticuerpo humanizado.
95. El procedimiento del punto 94, donde dicho anticuerpo humanizado monoclonal comprende además un agente citotóxico.
96. El procedimiento del punto 91, que comprende además la etapa de administrar un agente anticanceroso.
97. El procedimiento del punto 91, donde el trastorno neoplásico comprende un tumor que exhibe características neurales.
98. El procedimiento del punto 91, donde el trastorno neoplásico comprende un tumor que exhibe características neuroendocrinas.
99. El procedimiento del punto 91, donde el trastorno neoplásico comprende un cáncer de pulmón.
100. El procedimiento del punto 99, donde el trastorno neoplásico comprende un cáncer de pulmón microcítico. 101. Un procedimiento para identificar, aislar, seccionar o enriquecer una población de células iniciadoras de tumores que comprende el paso de poner en contacto las células iniciadoras de tumores con un modulador de SEZ6.
102. El procedimiento del punto 101, donde dicho modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo.
103. Un modulador de SEZ6 que comprende un anticuerpo humanizado donde dicho anticuerpo humanizado comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, donde dicha región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad con la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la s Eq ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190 y SEQ ID NO: 192, y donde dicha región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198 y SEQ ID NO: 199.
104. Un procedimiento para inhibir o prevenir la metástasis en un sujeto que lo necesite que comprende la etapa de administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de un modulador de s EZ6.
105. El procedimiento del punto 104, donde el sujeto se somete a un procedimiento citorreductor antes o después de la administración del modulador de SEZ6.
106. El procedimiento del punto 105, donde dicho procedimiento citorreductor comprende la administración de al menos un agente anticanceroso.
107. Un procedimiento para realizar una terapia de mantenimiento en un sujeto que lo necesite que comprende la
etapa de administrar una cantidad farmacéuticamente eficaz de un modulador de SEZ6.
108. El procedimiento del punto 107, donde dicho sujeto ha sido sometido al tratamiento de un trastorno neoplásico antes de administrar el modulador de SEZ6.
109. Un procedimiento para agotar células iniciadoras de tumores en un sujeto que padece un trastorno proliferativo que comprende la etapa de administrar un modulador de SEZ6.
110. Un procedimiento para diagnosticar, detectar o monitorizar un trastorno asociado con SEZ6 in vivo en un sujeto que lo necesite que comprende la etapa de administrar un modulador de SEZ6.
111. Un procedimiento para diagnosticar, detectar o monitorizar un trastorno asociado con SEZ6 en un sujeto que lo necesite que comprende el paso de poner en contacto células tumorales circulantes con un modulador de SEZ6. 112. El procedimiento del punto 111, donde dicha etapa de puesta en contacto se produce in vivo.
113. El procedimiento del punto 111, donde dicha etapa de puesta en contacto tiene lugar in vitro.
114. Un procedimiento para tratar un tumor que exhibe características neuroendocrinas en un paciente que lo necesite que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de SEZ6.
115. El procedimiento del punto 114, donde el tumor que exhibe características neuroendocrinas es un tumor neuroendocrino.
116. Un modulador SEZ6 derivado de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10, SC17.11, SC17.14, SC17.15, SC17.16, SC17.17, SC17.18, SC17.19, SC17.22, SC17.24, SC17.27, SC17.28, SC17.29, SC17.30, SC17.32, SC17.34, SC17.35, SC17.36, SC17.38, SC17.39, SC17.40, SC17.41, SC17.42, SC17.45, SC17.46, SC17.47, SC17.49, SC17.50, SC17.53, SC17.54, SC17.56, SC17.57, SC17.59, SC17.61, SC17.63, SC17.71, SC17.72, SC17.74, SC17.76, SC17.77, SC17.79, SC17.81, SC17.82, SC17.84, SC17.85, SC17.87, SC17.89, SC17.90, SC17.91, SC17.93, SC17.95, SC17.97, SC17.99, SC17.102, SC17.114, SC17.115, SC17.120, SC17121, SC17.122, SC17.140, SC17.151, SC17.156, SC17.161, SC17.166, SC17.187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 y SC17.200.
117. Un modulador de SEZ6 aislado que se une a un epítopo asociado con el Dominio Sushi 1 de SEZ6.
118. El modulador de SEZ6 de 117, donde dicho modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo.
119. El modulador de SEZ6 del punto 118, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal.
120. El modulador de SEZ6 del punto 119, donde el modulador de SEZ6 comprende un ADC.
121 El modulador de SEZ6 del punto 120, donde dicho ADC comprende una pirrolobenzodiazepina.
122 El modulador de SEZ6 del punto 121, que comprende además un conector.
123 Un modulador de SEZ6 aislado que se une a un epítopo asociado con el Dominio Sushi 2 de SEZ6.
124 El modulador de SEZ6 de 123, donde dicho modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo.
125. El modulador de SEZ6 del punto 124, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal.
126. El modulador de SEZ6 del punto 125, donde el modulador de SEZ6 comprende un ADC.
127 El modulador de SEZ6 del punto 126, donde dicho ADC comprende una pirrolobenzodiazepina.
128 El modulador de SEZ6 del punto 127, que comprende además un conector.
129 Un modulador de SEZ6 aislado que se une a un epítopo asociado con el Dominio Sushi 3 de SEZ6.
130 El modulador de SEZ6 de 129, donde dicho modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo.
131. El modulador de SEZ6 del punto 130, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal.
132. El modulador de SEZ6 del punto 131, donde el modulador de SEZ6 comprende un ADC.
133 El modulador de SEZ6 del punto 132, donde dicho ADC comprende una pirrolobenzodiazepina.
134 El modulador de SEZ6 del punto 133, que comprende además un conector.
135 Un modulador de SEZ6 aislado que se une a un epítopo asociado con el Dominio Sushi 4 de SEZ6.
136 El modulador de SEZ6 de 135, donde dicho modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo.
137. El modulador de SEZ6 del punto 136, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal.
138. El modulador de SEZ6 del punto 137, donde el modulador de SEZ6 comprende un ADC.
139 El modulador de SEZ6 del punto 138, donde dicho ADC comprende una pirrolobenzodiazepina.
140 El modulador de SEZ6 del punto 139, que comprende además un conector.
141 Un modulador de SEZ6 aislado que se une a un epítopo asociado con el Dominio Sushi 5 de SEZ6.
142 El modulador de SEZ6 de 141, donde dicho modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo.
143. El modulador de SEZ6 del punto 142, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal.
144. El modulador de SEZ6 del punto 143, donde el modulador de SEZ6 comprende un ADC.
145 El modulador de SEZ6 del punto 144, donde dicho ADC comprende una pirrolobenzodiazepina.
146 El modulador de SEZ6 del punto 145, que comprende además un conector.
147 Un modulador de SEZ6 aislado que se une a un epítopo asociado con el Dominio CUB 1 de SEZ6.
148 El modulador de SEZ6 de 147, donde dicho modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o fragmento
inmunorreactivo del mismo.
149. El modulador de SEZ6 del punto 148, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal.
150. El modulador de SEZ6 del punto 149, donde el modulador de SEZ6 comprende un ADC.
151. El modulador de SEZ6 del punto 150, donde dicho ADC comprende una pirrolobenzodiazepina.
152. El modulador de SEZ6 del punto 151, que comprende además un conector.
153. Un modulador de SEZ6 aislado que se une a un epítopo asociado con el Dominio CUB 2 de SEZ6.
154. El modulador de SEZ6 de 153, donde dicho modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo.
155. El modulador de SEZ6 del punto 154, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal.
156. El modulador de SEZ6 del punto 155, donde el modulador de SEZ6 comprende un ADC.
157. El modulador de SEZ6 del punto 156, donde dicho ADC comprende una pirrolobenzodiazepina.
158. El modulador de SEZ6 del punto 157, que comprende además un conector.
159. Un modulador de SEZ6 aislado que se une a un epítopo asociado con el dominio N-terminal de SEZ6.
160. El modulador de SEZ6 de 159, donde dicho modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o fragmento inmunorreactivo del mismo.
161. El modulador de SEZ6 del punto 160, donde el anticuerpo o fragmento inmunorreactivo de este comprende un anticuerpo monoclonal.
162. El modulador de SEZ6 del punto 161, donde el modulador de SEZ6 comprende un ADC.
163. El modulador de SEZ6 del punto 162, donde dicho ADC comprende una pirrolobenzodiazepina.
164. El modulador de SEZ6 del punto 163, que comprende además un conector.
165. Un modulador de SEZ6 aislado que reside en una sección seleccionada del grupo que consiste en la sección A, sección B, sección C, sección D, sección E, sección F y sección U.
166. Un modulador de SEZ6 aislado que reside en una sección definida por un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo que consiste en SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10, SC17.11, SC17.14, SC17.15, SC17.16, SC17.17, SC17.18, SC17.19, SC17.22, SC17.24, SC17.27, SC17.28, SC17.29, SC17.30, SC17.32, SC17.34, SC17.35, SC17.36, SC17.38, SC17.39, SC17.40, SC17.41, SC17.42, SC17.45, SC17.46, SC17.47, SC17.49, SC17.50, SC17.53, SC17.54, SC17.56, SC17.57, SC17.59, SC17.61, SC17.63, SC17.71, SC17.72, SC17.74, SC17.76, SC17.77, SC17.79, SC17.81, SC17.82, SC17.84, SC17.85, SC17.87, SC17.89, SC17.90, SC17.91, SC17.93, SC17.95, SC17.97, SC17.99, SC17.102, SC17.114, SC17.115, SC17.120, SC17121, SC17.122, SC17.140, SC17.151, SC17.156, SC17.161, SC17.166, SC17.187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 y SC17.200. 167. Un conjugado de anticuerpo-fármaco de fórmula M-[L-D]n o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde:
a. M comprende un modulador de SEZ6;
b. L comprende un conector;
c. D es un agente antiproliferativo; y
d. n es un número entero comprendido de aproximadamente 1 a aproximadamente 20.
168. El conjugado anticuerpo-fármaco del punto 167, donde dicho modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo del mismo.
169. El conjugado anticuerpo-fármaco del punto 168, donde dicho anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal.
170. El conjugado anticuerpo-fármaco del punto 169, donde dicho anticuerpo se deriva de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10, SC17.11, SC17.14, SC17.15, SC17.16, SC17.17, SC17.18, SC17.19, SC17.22, SC17.24, SC17.27, SC17.28, SC17.29, SC17.30, SC17.32, SC17.34, SC17.35, SC17.36, SC17.38, SC17.39, SC17.40, SC17.41, SC17.42, SC17.45, SC17.46, SC17.47, SC17.49, SC17.50, SC17.53, SC17.54, SC17.56, SC17.57, SC17.59, SC17.61, SC17.63, SC17.71, SC17.72, SC17.74, SC17.76, SC17.77, SC17.79, SC17.81, SC17.82, SC17.84, SC17.85, SC17.87, SC17.89, SC17.90, SC17.91, SC17.93, SC17.95, SC17.97, SC17.99, SC17.102, SC17.114, SC17.115, SC17.120, SC17121, SC17.122, SC17.140, SC17.151, SC17.156, SC17.161, SC17.166, SC17.187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 y SC17.200. 171. El conjugado de anticuerpo-fármaco del punto 169, donde el anticuerpo está humanizado.
172. El conjugado de anticuerpo-fármaco del punto 167, donde el conector comprende un conector escindible.
173. El conjugado de anticuerpo-fármaco del punto 172, donde dicho conector escindible comprende un conector peptidilo.
174. El conjugado de anticuerpo-fármaco del punto 167, donde dicho agente antiproliferativo comprende un agente citotóxico.
175. El conjugado de anticuerpo-fármaco del punto 174, donde dicho agente citotóxico comprende una pirrolobenzodiazepina.
176. El conjugado de anticuerpo-fármaco del punto 175, donde dicho pirrolobenzodiazepina comprende un dímero de pirrolobenzodiazepina.
177. Un modulador de SEZ6 aislado que reside en una sección seleccionada del grupo que consiste en la sección A, sección B, sección C, sección D, sección E, sección F y sección U.
178. Un modulador de SEZ6 aislado que reside en una sección definida por un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo que consiste en SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10, SC17.11, SC17.14, SC17.15,
. , . , . , . , . , . , . , . , . y . . 179. Un conjugado anticuerpo-fármaco de la fórmula:
M-[L-D]n
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde
a) M comprende un modulador de SEZ6;
b) L comprende un conector opcional;
c) D es un agente citotóxico seleccionado del grupo que consiste en auristatinas, maitansinoides, amanitinas y dímeros de pirrolobenzodiazepina.
d) n es un número entero de aproximadamente 1 a aproximadamente 20.
180. El conjugado anticuerpo-fármaco del punto 179, donde dicho modulador de SEZ6 comprende un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo del mismo.
181. El conjugado anticuerpo-fármaco del punto 180, donde dicho anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal.
182. El conjugado anticuerpo-fármaco del punto 181, donde dicho anticuerpo se deriva de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10, SC17.11, SC17.14, SC17.15, SC17.16, SC17.17, SC17.18, SC17.19, SC17.22, SC17.24, SC17.27, SC17.28, SC17.29, SC17.30, SC17.32, SC17.34, SC17.35, SC17.36, SC17.38, SC17.39, SC17.40, SC17.41, SC17.42, SC17.45, SC17.46, SC17.47, SC17.49, SC17.50, SC17.53, SC17.54, SC17.56, SC17.57, SC17.59, SC17.61, SC17.63, SC17.71, SC17.72, SC17.74, SC17.76, SC17.77, SC17.79, SC17.81, SC17.82, SC17.84, SC17.85, SC17.87, SC17.89, SC17.90, SC17.91, SC17.93, SC17.95, SC17.97, SC17.99, SC17.102, SC17.114, SC17.115, SC17.120, SC17121, SC17.122, SC17.140, SC17.151, SC17.156, SC17.161, SC17.166, SC17.187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 y SC17.200. 183. El conjugado de anticuerpo-fármaco del punto 182, donde el anticuerpo está humanizado.
184. El conjugado de anticuerpo-fármaco del punto 183, donde el conector comprende un conector escindible.
185. El conjugado de anticuerpo-fármaco del punto 184, donde dicho conector escindible comprende un conector peptidilo.
186. El conjugado de anticuerpo-fármaco del punto 185, donde dicho agente antiproliferativo comprende un agente citotóxico.
187. El conjugado de anticuerpo-fármaco del punto 186, donde dicho agente citotóxico comprende una pirrolobenzodiazepina.
188. El conjugado de anticuerpo-fármaco del punto 187, donde dicho pirrolobenzodiazepina comprende un dímero de pirrolobenzodiazepina.
189. Un modulador de SEZ6 que comprende una CDR de cualquiera de las SEQ ID NO: 20-203.
190. El modulador de SEZ6 del punto 189, donde dicho modulador comprende una pluralidad de CDR de cualquiera de las SEQ ID NO: 20-203.
191. Un modulador de anticuerpo de SEZ6 que compite por la unión a una proteína SEZ6 con un anticuerpo de referencia seleccionado del grupo que consiste en SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10, SC17.11, SC17.14, SC17.15, SC17.16, SC17.17, SC17.18, SC17.19, SC17.22, SC17.24, SC17.27, SC17.28, SC17.29, SC17.30, SC17.32, SC17.34, SC17.35, SC17.36, SC17.38, SC17.39, SC17.40, SC17.41, SC17.42, SC17.45, SC17.46, SC17.47, SC17.49, SC17.50, SC17.53, SC17.54, SC17.56, SC17.57, SC17.59, SC17.61, SC17.63, SC17.71, SC17.72, SC17.74, SC17.76, SC17.77, SC17.79, SC17.81, SC17.82, SC17.84, SC17.85, SC17.87, SC17.89, SC17.90, SC17.91, SC17.93, SC17.95, SC17.97, SC17.99, SC17.102, SC17.114, SC17.115, SC17.120 SC17121, SC17.122, SC17.140, SC17.151, SC17.156, SC17.161, SC17.166, SC17.187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 y SC17.200, donde la unión del modulador de anticuerpo de SEZ6 a la proteína SEZ6 se inhibe al menos un 30 %.
192. Un modulador de SEZ6 que se une a un epítopo de la proteína SEZ6 que comprende los aminoácidos Q12, P14, I16, E17 y E18 (SEQ ID NO: 401).
193. Un modulador de SEZ6 que se une a un epítopo de la proteína SEZ6 que comprende los aminoácidos L73, P74, F75, Q76, P77, D78 y P79 (SEQ ID NO: 402).
194. Un procedimiento para tratar a un sujeto que padece un trastorno proliferativo que comprende la etapa de administrar un modulador de SEZ6 que se une a un epítopo contenido en un dominio de SEZ6 seleccionado del grupo que consiste en el dominio N-terminal, el dominio Sushi 1, el dominio Cub 1, el dominio Sushi 2, el dominio Cub 2, el dominio Sushi 3, el dominio Sushi 4 y el dominio Sushi 5.
195. Un modulador de anticuerpo de SEZ6 humanizado seleccionado del grupo que consiste en hSC17.16, hSC17.17, hSC17.24, hSC17.28, SC17.34, hSC17.46, SC17.151, SC17.155, SC17.156, SC17.161 y SC17.200.
EJEMPLOS
[0496] La presente invención, tal como se ha descrito anteriormente generalmente, se comprenderá más fácilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo ilustrativo y no se pretende que limiten la presente invención. No se pretende que los ejemplos representen que los siguientes experimentos son todos o los únicos experimentos realizados. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados centígrados y la presión equivale o es próxima a la presión atmosférica.
Ejemplo 1
identificación de tumores con características neuroendocrinas y análisis de la expresión de marcadores utilizando la secuenciación del transcriptoma completo
[0497] Los tumores neuroendocrinos (NET) que se originan en el sistema endocrino difuso son poco frecuentes, con una incidencia de 2-5 cada 100.000 personas, pero son sumamente agresivos. Los tumores neuroendocrinos aparecen en las glándulas suprarrenales, riñón, aparato genitourinario (vejiga, próstata, ovario, cuello del útero y endometrio), páncreas, tracto gastrointestinal (estómago y colon), tiroides (cáncer medular de tiroides) y pulmón (carcinoma pulmonar microcítico, carcinoma neuroendocrino de células grandes y carcinoide). Estos tumores pueden secretar varias hormonas, incluidas la serotonina y/o cromogranina A, que pueden provocar síntomas debilitantes conocidos como el síndrome carcinoide. Estos tumores se pueden detectar mediante marcadores inmunohistoquímicos positivos tales como la enolasa neuroespecífica (NSE, conocida también como enolasa gamma, símbolo génico = ENO2), CD56/NCAM1, y sinaptofisina. Las quimioterapias tradicionales no han tenido éxito en el tratamiento de NET y la mortalidad debida a la diseminación metastásica es un resultado común. Desafortunadamente, en la mayoría de los casos, la cirugía es el único tratamiento curativo potencial, siempre que se lleve a cabo después de una detección temprana y antes de la metástasis tumoral. En este contexto, se han realizado estudios para identificar dianas terapéuticas novedosas asociadas con tumores que comprenden características neuroendocrinas.
[0498] Con el fin de identificar y caracterizar los tumores tal como existen en pacientes que padecen cáncer, se desarrolló y mantuvo un banco de tumores de xenoinjerto no tradicionales (NTX) utilizando técnicas conocidas en la técnica. El banco de tumores NTX, que comprende un número sustancial de líneas celulares de tumores discretas, se propagó en ratones inmunodeprimidos mediante múltiples pases de células tumorales heterogéneas obtenidas originariamente a partir de numerosos pacientes con cáncer que padecían diversas neoplasias de tumores sólidos. (Cabe destacar que en algunos de los Ejemplos y las FIGS. en el presente documento, el número de pases de la muestra evaluada se indica como p0-p#, el cual se adjunta a la designación de la muestra, donde p0 indica una muestra sin pases obtenida directamente a partir de un tumor del paciente y p# indica el número de veces que se ha realizado un pase del tumor por un ratón antes de las pruebas). La disponibilidad continua de un gran número de líneas celulares de tumores NTX de los primeros pases discretas con linajes bien definidos facilita considerablemente la identificación y la caracterización de células purificadas a partir de las líneas celulares. En dicho estudio, el uso de líneas celulares NTX sometidas a un número mínimos de pases simplifica la experimentación in vivo y proporciona resultados fácilmente verificables. Además, los tumores NTX de los primeros pases responden a agentes terapéuticos, tales como irinotecán (es decir, Camptosar®) y regímenes de cisplatino/etopósido, lo cual proporciona perspectivas relevantes desde un punto de vista clínico sobre los mecanismos subyacentes que estimulan el crecimiento tumoral, la resistencia a las terapias actuales y la recidiva tumoral.
[0499] A medida que se fueron estableciendo las líneas celulares de tumores NTX, su fenotipo se caracterizó de diversas formas para examinar la expresión génica global. Para identificar qué líneas de NTX en el banco pueden ser NET, se generaron perfiles de expresión génica mediante la secuenciación del transcriptoma completo y/o el análisis de micromatrices. Específicamente, los datos se examinaron para identificar tumores que expresaban niveles elevados de genes específicos que se sabe que son altos en NET o se utilizan como marcadores histoquímicos de la diferenciación neuroendocrina (por ejemplo, ASCL1, NCAM1, CHGA), así como también tumores con cambios en los genes de la vía NOTCH indicativos de la supresión de la señalización de NOTCH (por ejemplo, niveles reducidos de receptores NOTCH, y cambios en ligandos y moléculas efectoras).
[0500] Más particularmente, una vez que se establecieron diversas líneas celulares de tumores NTX tal como se realiza comúnmente para tumores humanos en ratones muy inmunodeprimidos, los tumores se extirparon cuando alcanzaron 800-2.000 mm3, y las células se disociaron y dispersaron en suspensión utilizando técnicas de digestión enzimática reconocidas en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 2007/0292414). A continuación, se agotaron las células murinas de los preparados de células disociadas a partir de estas líneas NTX, y posteriormente se aislaron además subpoblaciones de células tumorales humanas por clasificación de células activadas por fluorescencia y se lisaron en tampón de lisis de ARN RLTplus (Qiagen). Estos lisados se almacenaron después a -80 °C hasta su uso. Tras descongelarlos, se extrajo el ARN total utilizando un kit de aislamiento RNeasy (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante y se cuantificó en un espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Scientific) y un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) de nuevo siguiendo los protocolos y los ajustes de los instrumentos recomendados por el fabricante. Las preparaciones de ARN total resultantes fueron adecuadas para la secuenciación genética y el análisis de la expresión génica.
[0501] Se realizó una secuenciación del transcriptoma completo utilizando el sistema de secuenciación de nueva generación SOLiD (secuenciación por ligamiento/detección de oligonucleótidos) 4.5 o SOLiD 5500x1 de Applied Biosystems (ABI) (Life Technologies) en muestras de ARN de líneas NTX. Se generó ADNc a partir de muestras de ARN total utilizando un protocolo de transcriptoma completo (WT) modificado de ABI diseñado para ARN total de bajo insumo o el sistema Ovation RNA-Seq V2™ (NuGEN Technologies Inc.). El protocolo WT de bajo insumo modificado utiliza 1,0 ng de ARN total para amplificar ARNm en el extremo 3', lo cual conduce a una fuerte distorsión en 3' de la expresión génica mapeada, mientras que el sistema de NuGen permite una amplificación más uniforme a lo largo de todo el transcrito e incluye la amplificación de tanto el ARNm como el ADNc trascrito no poliadenilado utilizando hexámeros aleatorios. La biblioteca de ADNc se fragmentó y se añadieron adaptadores con códigos de barras para poder combinar colecciones de fragmentos de muestras diferentes.
[0502] Las plataformas de secuenciación de nueva generación SOLiD 4.5 y SOLiD 5500x1 de ABI permiten la secuenciación en paralelo de transcriptomas de múltiples líneas NTX y poblaciones clasificadas. Se construye una biblioteca de ADNc a partir de cada muestra de ARN, que se fragmenta y se le asigna un código de barras. Los códigos de barras de cada biblioteca de fragmentos permiten combinar múltiples muestras en concentraciones iguales y analizarlas conjuntamente garantizando a la vez la especificidad de cada muestra. Las muestras se someten a PCR de emulsión utilizando el sistema robótico de microesferas SOLiD™ EZ Bead™ de ABI, que garantiza la uniformidad de la muestra. La secuenciación de extremos pareados genera una lectura de 50 bases en la dirección de 5' a 3' y una lectura de 25 bases en la dirección de 3' a 5' para cada fragmento amplificado clonalmente en una única microesfera que existe en la combinación. En el caso de la plataforma 5500x1, para cada grupo de 8 muestras combinadas en el procedimiento mencionado anteriormente, se depositan microesferas uniformemente en 6 hileras de un único canal en un único chip. Esto generará, de media, más de 50 millones de lecturas de 50 bases y 50 millones de lecturas de 25 bases para cada una de las 8 muestras y genera una representación muy precisa del nivel de transcrito de ARNm en las células tumorales. Los datos generados por la plataforma SOLiD mapearon 34.609 genes tal como anota la versión 47 de RefSeq utilizando la versión hg19.2 de NCBI del genoma humano publicado y proporcionaron mediciones verificables de los niveles de ARN en la mayoría de las muestras.
[0503] La plataforma SOLiD no solo es capaz de capturar la expresión, sino también los SNP, eventos de corte y empalme alternativos conocidos y no conocidos, ARN no codificantes pequeños y potencialmente descubrimientos de nuevos exones basándose únicamente en el alcance de la lectura (lecturas mapeadas especialmente para posiciones genómicas no anotadas previamente). Por lo tanto, el uso de esta plataforma de secuenciación de nueva generación acompañada del análisis de datos registrados y el software de visualización permitió de este modo descubrir la expresión diferencial de transcritos así como también diferencias y/o preferencias por variantes de corte y empalme específicas de transcritos de ARNm expresados. Los datos de secuenciación de la plataforma SOLiD se representan nominalmente como un valor de la expresión de transcritos utilizando las cifras de RPM (lecturas por millón) y RPKM (lecturas por kilobase por millón), lo cual permite el análisis básico de la expresión diferencial según la práctica estándar.
[0504] La secuenciación del transcriptoma completo de cuatro tumores (LU73, LU64, LU86 y LU95) debidos al cáncer de pulmón microcítico (SCLC), un tumor ovárico (OV26) y un carcinoma neuroendocrino de células grandes (LCNEC; LU37) dio como resultado la determinación de los patrones de expresión génica que se encuentran normalmente en NET (FIG. 6A). Más específicamente, estos tumores presentaron una alta expresión de varios marcadores de NET (ASCL1, NCAM1, CHGA), así como también unos niveles reducidos de receptores Notch y moléculas efectoras (por ejemplo, HES1, HEY1), y una alta expresión de marcadores de la supresión de Notch (por ejemplo, DLL3 y HES6). En cambio, 4 muestras de pulmón normal, 3 tumores de adenocarcinoma de pulmón (LU137, LU146 y LU153) y 3 carcinomas de pulmón de células escamosas (LU49, LU70 y LU76) presentan todos ellos expresión de varios receptores Notch y moléculas efectoras, y no muestran una alta expresión de supresores de Notch tales como HES6 y DLL3.
[0505] Además, como se observa en la FIG. 6B, un análisis de los datos del transcriptoma completo que compara muestras de tejidos normales con varias poblaciones de NTX de pulmón con características neuroendocrinas mostró que SEZ6 se reguló positivamente en el nivel del transcrito de ARNm en cuatro poblaciones de cáncer de pulmón con características neuroendocrinas (LU73, LU64, LU86 y LU95) en comparación con una expresión del transcrito extremadamente baja o nula en los tejidos normales ensayados. Estos resultados sugieren que SEZ6 puede desempeñar una función importante en la tumorigénesis y el mantenimiento de cánceres particulares (incluidos los cánceres de pulmón con características neuroendocrinas). Basándose en estos resultados, se seleccionó SEZ6 para análisis posteriores como una diana inmunoterapéutica potencial.
Ejemplo 2
Análisis de micromatrices y por RT-PCR de la expresión génica en tumores NTX seleccionados con características neuroendocrinas
[0506] Para intentar identificar NET adicionales en el banco de NTX mencionado anteriormente, aparte de para los que se dispone de datos del transcriptoma completo obtenidos por SOLiD, se examinó un grupo mayor de líneas
NTX utilizando un análisis de micromatrices. Específicamente, se analizaron 2-6 pg de muestras de ARN total derivadas de tumores enteros en 46 líneas NTX o de 2 tejidos normales utilizando una plataforma de micromatrices OneArray® (Phalanx Biotech Group), que contiene 29.187 sondas designadas contra 19.380 genes en el genoma humano. Más específicamente, se obtuvieron muestras de ARN (como se ha descrito en el Ejemplo 1) a partir de 46 tumores NTX enteros derivados de pacientes que comprendían cánceres colorrectales (CR), melanoma (SK), de riñón (KD), pulmón (LU), ovario (OV), endometrio (EM), mama (BR), hígado (LIV) o páncreas (PA). Se utilizaron tejidos colorrectales normales (NormCR) y de páncreas normal (NormPA) como controles. Aún más específicamente, los tumores de pulmón se subclasificaron además como cánceres de pulmón microcíticos (SCLC), cánceres de células escamosas (SCC) o carcinomas neuroendocrinos de células grandes (LCNEC). Las muestras de ARN se analizaron por triplicado utilizando los protocolos del fabricante y los datos resultantes se analizaron utilizando prácticas estándar en la industria para normalizar y transformar los valores de intensidad medidos obtenidos para el gen en cuestión en cada muestra. Se utilizó un algoritmo de agrupación jerárquica de Pearson Spearman imparcial en el conjunto de paquetes de R/BioConductor denominado hclust.2 para crear un dendrograma micromatricial estándar para estas 48 muestras. Como se conoce en la técnica, R/BioConductor es un lenguaje de programación estadístico de código abierto de uso extendido entre los círculos académicos, financieros y la industria farmacéutica para el análisis de datos. Generalmente, los tumores se dispusieron y agruparon en función de sus patrones de expresión génica, intensidad de expresión, etc.
[0507] Como se muestra en la FIG. 7A, el dendograma derivado de las 48 muestras y para todos los 19.380 genes, agrupó líneas NTX juntas en función de su tipo de tumor o tejido de origen. Varios tumores normalmente asociados con fenotipos neuroendocrinos se agruparon juntos en la rama señalada como (1); estos incluían cánceres de piel, numerosos cánceres de pulmón y otros NET. Resulta interesante que una subrrama, señalada como (2), mostró que dos cánceres de pulmón de células grandes con características neuroendocrinas (LU50.LCNEC y LU37.LCNEC) y un cáncer de pulmón microcítico (LU102.SCLC) se agruparon con un tumor de ovario (OV26) y un tumor de riñón (KD66) (grupo C), lo que sugiere que estos últimos tumores también poseían fenotipos neuroendocrinos. Además, la FIG. 7A muestra un grupo D, que consiste en 3 tumores SCLC adicionales, y a su derecha se encuentra un grupo pequeño (grupo E) que contiene un tumor SCLD adicional (LU100) y un tumor de endometrio neuroendocrino (EM6). Generalmente, se entiende que todos los tumores de los grupos D y E poseen algunas características neuroendocrinas, basándose en la bibliografía académica y la experiencia patológica en centros sanitarios. El hecho de que el grupo G, que comprende SCC, se pueda encontrar en una rama completamente diferente del dendrograma de la FIG. 7A indica que la agrupación no depende exclusivamente del órgano de origen del tumor.
[0508] Una inspección más exhaustiva de una colección de marcadores génicos asociados con NET (FIG. 7B) muestra que estos se expresan en niveles elevados en tumores que forman parte de los grupos C y D, mientras que se expresan en niveles mínimos en tumores del grupo G (carcinoma de células escamosas del pulmón), lo que sugiere que los grupos C y D representan NET o tumores con un fenotipo neuroendocrino. Más específicamente, los NET del grupo C expresan niveles elevados de ASCL1, CALCA, CHgA, SST y NKX2-1, mientras que los NET del grupo D expresan niveles elevados de CHGA, ENO2 y NCAM1, y es la expresión de estos genes de fenotipo neuroendocrino la responsable en parte de la agrupación de estos tumores. Una característica interesante es la fuerte expresión de KIT en el grupo D, un gen cuya asociación con tumores neuroendocrinos ha sido descrita ocasionalmente, pero que se relaciona claramente con la oncogénesis en otros contextos. Esto contrasta con los tumores SCC del grupo G que carecen de una fuerte expresión de cualquiera de estos genes (FIG. 7B).
[0509] Los tumores del grupo C muestran un fenotipo consonante con una reducción en la señalización Noten: una falta de expresión de cualquier receptor Notch, una falta relativa de expresión de JAG1 y HES1, y niveles elevados de expresión de ASCL1 (FIG. 7C). De forma interesante, el grupo D muestro una alta expresión de HES6, un factor de transcripción que puede soportar la actividad de ASCL1 al antagonizar la actividad de HES1 mediante la formación de heterodímeros.
[0510] En vista de los resultados mencionados anteriormente, se examinó la expresión de ARNm de HES6 procedente de diversas líneas NTX y tejidos normales utilizando un equipo 7900HT de Applied Biosystems (Life Technologies) para realizar una RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) a tiempo real Taqman según los protocolos del fabricante. Se aisló ARN como se ha descrito anteriormente y se chequeó para comprobar que su calidad era adecuada para el análisis de la expresión génica. Se adquirió ARN de tejidos normales (Agilent Technologies y Life Technologies). Se utilizaron 200 ng de ARN para sintetizar ADNc utilizando el kit de archivo de ADNc (Life Technologies). El ADNc se utilizó para el análisis de qRT-PCR en matrices de baja densidad de Taqman (TLDA; Life Technologies) que contenían el ensayo Taqman de HES6 para medir los niveles de ARNm de HES6.
[0511] Se muestran los niveles de ARNm de HES6 para cada muestra de las líneas NTX o tejidos normales (un punto en la gráfica) después de la normalización respecto a controles endógenos. Los valores normalizados se representan gráficamente en relación con la expresión media en los tejidos normales de interés para la toxicidad (NormTox). Esta técnica permitió identificar y caracterizar rápidamente diversos tumores con características neuroendocrinas a partir del banco de tumores NTX mediante la medición de HES6 y otros marcadores relevantes. La FIG. 7D ilustra la sobreexpresión general de HES6 en los tumores de muestra con características neuroendocrinas
(por ejemplo, LU-SCLC, LU-LCNEC) en comparación con tejidos normales, tumores de mama, colon, hígado y otros tumores seleccionados. Es significativo que estos datos micromatriciales y de qPCR muestren que al menos algunos tumores de endometrio, riñón y de ovario pueden presentar características tumorales neuroendocrinas (FIGS. 7A y 7D).
[0512] Los datos micromatriciales generados como se ha descrito anteriormente no solo mostraron que los tumores en los grupos C, D y E exhibían diversos marcadores neuroendocrinos, sino que también mostraron que los tumores en esos grupos expresaban marcadores que indicaban neurogénesis, compromiso neural o diferenciación hacia los destinos neurales (FIG. 7E). Cabe destacar que los tumores en el grupo D presentan frecuentemente un aumento de la expresión más fuerte y más uniforme de muchos de estos marcadores (por ejemplo, receptores BEX1 y BEX4, CD56, NrCAM, SEMA, factores SOX y ZIC) y presentan frecuentemente un aumento de la expresión hormonal menor en comparación con otros grupos, lo cual sugiere un fenotipo más neural.
Ejemplo 3
Expresión de ARNm de SEZ6 en tumores con características neuroendocrinas y neurales
[0513] Se utilizaron varias técnicas para identificar tumores con características neuroendocrinas, que incluyeron la secuenciación del transcriptoma completo (Ejemplo 1), así como también la micromatriz y qRT-PCR (Ejemplo 2). Los datos generados de este modo se analizaron posteriormente con el fin de establecer dianas terapéuticas potenciales que presenten una expresión muy elevada en tumores neuroendocrinos en comparación con tumores no neuroendocrinos y tejidos normales. Como se ha analizado en el Ejemplo 1, se ha comprobado que SEZ6, una proteína transmembrana de un único pase que se expresa principalmente en el cerebro normal, presenta una expresión elevada en muchos tumores neuroendocrinos (FIG. 6B).
[0514] Los datos micromatriciales generados en el Ejemplo 2 indicaron que los tumores localizados en los grupos C, D y E expresaban marcadores neuroendocrinos (FIG. 7B) y marcadores neurales (FIG. 7E). Cabe destacar que los tumores en esos mismos grupos también presentaron niveles elevados del transcrito de SEZ6, lo cual sugiere que SEZ6 está asociado con tumores de características neuroendocrinas y neurales (FIG. 7F). Esto concuerda con la función conocida de SEZ6 en el desarrollo del prosencéfalo posnatal y la expresión continuada en las regiones específicas del hipocampo en el adulto. Se cree que SEZ6 desempeña funciones importantes en la señalización y el reconocimiento entre células. A menudo las vías de desarrollo se expresan de forma inadecuada en los tumores.
[0515] Con el fin de determinar los niveles de expresión del ARNm de SEZ6 en líneas de tumores NTX de varias muestras, se realizó una qRT-PCR utilizando el ensayo de Taqman para SEZ6 esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 2 anteriormente. La FIG. 8A muestra la expresión de SEZ6 en comparación con la expresión media en tejidos normales y está normalizada respecto a la expresión del gen de control endógeno ALAS1. La expresión génica de SEZ6 es 10.000.000 de veces superior en poblaciones de NTX neuroendocrino en comparación con los tejidos normales. Cinco de las líneas de NTX SCLC mostradas en la FIG. 8A son muestras de ARNm extraídas directamente de biopsias primarias (p0). La expresión de SEZ6 en estos tumores sin pases demuestra que la expresión de SEZ6 no es un artefacto que se obtenga como resultado de desarrollar tumores humanos en ratones. En la FIG.
8A también se representan tres subtipos de NSCLC: LU25 es un carcinoma de células fusiformes, LU50 es un carcinoma neuroendocrino de células grandes (LCNEC) y LU85 es un carcinoma de células escamosas (SCC). KDY66 y OV26, que representan un tumor de riñón y ovario, respectivamente, se agruparon en la micromatriz junto con los tumores SCLC y LCNEC (FIG. 7A), lo cual sugiere que también presentan características neuroendocrinas.
[0516] Para extender el análisis de la expresión de SEZ6 a una matriz más amplia de muestras de tumores, se realizó una qRT-PCR utilizando el sistema Fluidigm BioMark™ HD. Resumiendo, 1 ng de ARN, preparado como se ha descrito en el Ejemplo 1, se convirtió en ADNc utilizando el kit de archivo de ADNc (Life Technologies). El ADNc se preamplificó utilizando un ensayo de Taqman específico para SEZ6 y a continuación se utilizó para llevar a cabo la qRT-PCR. La expresión en tejidos normales (NormTox o Norm) se comparó con la expresión en las líneas de NTX siguientes, donde el número entre paréntesis indica el número de líneas de NTX únicas ensayadas: BR (5), CR (6), KDY (9), OV (16), PA (9), adenocarcinoma de pulmón (LU-Adeno) (7), LCNEC (2), SCC (11) y SCLC (15) (FIG. 8B). El NTX de SCLC y LCNEC presentó la expresión más elevada de SEZ6, aunque también se observó cierta expresión de SEZ6 en líneas de NTX de OV, PA, CR y LU-Adeno en comparación con las muestras de tejido normal.
[0517] «NormTox» representa las siguientes muestras de tejido normal: dos muestras de colon, dos de riñón, dos de hígado, dos de pulmón, dos de páncreas, dos de corazón, una de esófago, una de músculo esquelético, una de piel, una de intestino delgado, una de bazo, una de estómago y una de tráquea. Otro conjunto de tejidos normales denominados «Norm» representa las siguientes muestras de tejido normal: cerebro, mama, cuello uterino, ovario, células mononucleares de sangre periférica, placenta, próstata, testículos, timo y tiroides. La mayoría de tejidos normales no presentan expresión de SEZ6, mientras que se observa una expresión baja en el páncreas, colon, hígado y pulmón, y una expresión elevada en el cerebro. Se realizó un ensayo de Taqman específico para SEZ6 diferente, utilizando esencialmente el mismo procedimiento que se ha descrito anteriormente, en varias líneas de tumores NTX. El número de líneas tumorales que se evaluaron para cada tipo de tumor se representa como el denominador, mientras
que el número de tumores que expresaron SEZ6 se representa como el numerador: 1/5 CR, 2/2 GA, 1/1 GB (glioblastoma), 1/1 KDY, 2/6 SK, 2/4 LU-Adeno, 2/2 LCNEC, 3/10 LU-SCC, 10/10 SCLC y 1/2 OV (datos no mostrados).
[0518] Considerados conjuntamente, estos datos sugieren que SEZ6 se regula positivamente en tumores que presentan características neuroendocrinas y neurales, lo cual sugiere que puede servir como una diana terapéutica para el tratamiento de estos tipos de tumores.
Ejemplo 4
Expresión de ARNm de SEZ6 en varias muestras tumorales y de tejido normal utilizando qRT-PCR [0519] Para extender el análisis de la expresión de SEZ6 a una matriz más amplia de muestras de tumores, se llevó a cabo una qRT-PCR Taqman sustancialmente como se ha descrito en los Ejemplos anteriores en una matriz de 384 pocillos para qPCR TissueScan™ (Origene Technologies). Esta matriz permite comparar la expresión génica de 18 tipos de tumores sólidos diferentes, con múltiples muestras derivadas de pacientes para cada tipo de tumor y de tejido adyacente normal.
[0520] A este respecto, las FIGS. 9A y 9B muestran los niveles de expresión génica absoluta y relativa, respectivamente, de SEZ6 en muestras de tumores enteros (puntos grises) o tejido adyacente normal (NAT; puntos blancos) de pacientes con uno de los dieciocho tipos de tumores sólidos diferentes. Más específicamente, la FIG. 9A muestra el nivel de expresión de ARNm absoluto para SEZ6 en varias muestras de tumores enteros o tejido adyacente normal de características similares. La FIG. 9B muestra el nivel de expresión de SEZ6 una vez normalizado respecto a la p-actina y se representa gráficamente de forma relativa a la expresión en tejido adyacente normal para cada tipo de tumor analizado. A las muestras en las cuales no se detectó SEZ6 se les asignó un valor Ct de 50, que representa el último ciclo de amplificación en el protocolo experimental. Cada punto representa una única muestra de tejido, representándose el valor de la media geométrica como una línea negra.
[0521] Utilizando esta matriz de Origene, se observó la sobreexpresión de SEZ6 en un subconjunto de cánceres suprarrenales, de hígado, de pulmón, ováricos y pancreáticos, muchos de los cuales pueden representar tumores neuroendocrinos o tumores con fenotipos neuroendocrinos poco diferenciados. Como indica la expresión génica absoluta en la FIG. 9A, los testículos y el páncreas normales son los únicos tejidos normales con una expresión elevada de SEZ6. Esto sugiere que SEZ6 puede desempeñar una función en la tumorigénesis y/o el avance del tumor en una amplia variedad de tumores, incluidos, sin carácter limitante, aquellos que presentan características neuroendocrinas y neurales.
Ejemplo 5
Clonación y expresión de proteínas SEZ6 recombinantes
SEZ6 humana
[0522] Con el fin de generar y desarrollar todos los materiales moleculares y celulares necesarios en la presente invención con relación a SEZ6 humana, se generó ADNc (FIG. 3A; SEQ ID NO: 5) que codificaba la proteína SEZ6 humana madura completa (FIG. 3B, SEQ ID NO: 6) como se indica a continuación. Se adquirió ADNc humano comercial para SEZ6 de Open Biosystems, donde esta secuencia de ADNc corresponde al número de acceso del NCBI BC146292. Los alineamientos de secuencia indicaron que la proteína codificada por BC146292 difería en varios residuos de la de RefSeq NP_849191 (véanse los residuos 414, 415 y 417, FIG. 3C), que codificaba la proteína SEZ6 humana endógena. Se utilizó PCR para amplificar dos fragmentos de ADNc diferentes del clon BC146292, donde los cebadores utilizados introdujeron los cambios deseados en el ADNc en los residuos 414-417 durante el proceso de superponer PCR para crear un ADNc que codificara una proteína SEZ6 madura con una secuencia idéntica a la codificada por NM_178860, la secuencia de ARNm que codifica la proteína SEZ6 humana endógena. El clon de ADNc reparado, denominado hSCRx17 (FIG. 3A), se utilizó para todas las modificaciones por ingeniería genética posteriores de las construcciones que expresaban la proteína SEZ6 humana madura o fragmentos de la misma.
[0523] Con el fin de generar moduladores inmunorreactivos o inmunoespecíficos para la molécula de SEZ6, se generó un gen de fusión quimérico en el cual la porción ECD de la proteína s EZ6 humana se fusionó con el dominio Fc de IgG2 humana (FIG. 4a , SEQ ID NO: 8). Esto se llevó a cabo como se indica a continuación: el ADNc que codifica el ECD de SEZ6 se amplificó mediante PCR a partir del clon de ADNc hSCRx17 (FIG. 3A) y este producto de PCR se subclonó posteriormente en un vector de expresión dirigido por CMV en marco y aguas abajo respecto a la secuencia del péptido señal de IgK y aguas arriba respecto al ADNc de Fc de IgG2 humana, utilizando técnicas moleculares estándar. La secuencia de ADNc que codifica la proteína de fusión hSEZ6-Fc, denominada hSCRx17-Fc ORF, se muestra en la FIG. 4A; la correspondiente secuencia proteica codificada por hSCRx17-Fc ORF se muestra en la FIG.
4B (SEQ ID NO: 9). Las regiones subrayadas de las secuencias corresponden a Fc de IgG2 humana. Las regiones subrayadas y en negrita corresponden al péptido señal de IgK y las secuencias en negrita corresponden a las porciones de la proteína de fusión codificadas por los sitios de restricción de la clonación que flanquean el ECD de
SEZ6.
[0524] Para generar una proteína de ECD hSEZ6 recombinante, se utilizó una estrategia basada en PCR similar. El fragmento de ADNc que codifica el ECD de SEZ6 se amplificó a partir del clon de ADNc hSCRx17 y se subclonó en un vector de expresión dirigido por CMV en marco y aguas abajo respecto a la secuencia del péptido señal de IgK y en marco y aguas arriba respecto a una secuencia que codifica un marcador de epítopo de 9-histidina (SEQ ID NO: 400).
[0525] El vector de expresión dirigido por CMV permite una expresión transitoria de nivel elevado en células HEK-293T y/o CHO-S. Los cultivos adherentes o en suspensión de células HEK-293T, o células CHO-S en suspensión se transfectaron con construcciones de expresión que codificaban proteínas hSEZ6 ECD-Fc o hSEZ6-ECD-His, utilizando un polímero de polietilenimina como reactivo de transfección. De tres a cinco días después de la transfección, las proteínas hSEZ6 ECD-Fc o hSEZ6-ECD-His se purificaron a partir de sobrenadantes celulares clarificados utilizando un explorador AKTA y o bien Proteína A MabSelect SuRe™ (GE Healthcare Life Sciences) o columnas de níquel-EDTA (Qiagen), respectivamente.
[0526] Se construyó una línea celular estable que sobreexpresaba SEZ6 humana recombinante utilizando vectores lentivíricos para transducir las células HEK-293T como se indica a continuación: Se llevó a cabo una amplificación mediante PCR utilizando el clon hSCRx17 como modelo con el fin de producir un fragmento de ADNc que codificara la proteína SEZ6 humana madura. El fragmento que se generó se subclonó en marco aguas abajo respecto a una secuencia que codificaba un péptido señal de IgK y un marcador de epítopo de DDK modificado por ingeniería genética previamente aguas arriba respecto al sitio de clonación múltiple de pCDH-EF1-MCS-T2A-GFP (System Biosciences) utilizando técnicas de clonación molecular estándar. El vector lentivírico bicistrónico resultante se utilizó para modificar por ingeniería genética líneas celulares que sobreexpresaban un péptido SEZ6-T2A humanopolipéptido GFP. La secuencia de T2A fomenta el salto ribosómico de una condensación de enlace peptídico, lo cual da como resultado dos proteínas independientes, en este caso SEZ6 y GFP.
SEZ6 murina
[0527] Se modificó una línea celular estable que sobreexpresaba SEZ6 murina recombinante esencialmente como se ha descrito anteriormente para SEZ6 humana recombinante. Se transdujeron células HEK-293T con un vector lentiviral que expresaba SEZ6 murina. El vector se modificó esencialmente como se indica a continuación. Se obtuvo un fragmento de ADNc (FIG. 5A; SEQ ID NO: 10) que codificaba la proteína SEZ6 murina madura enumerada como RefSeq NM_021286 en la base de datos del NCBI (FIG. 5B; SEQ ID NO: 11) mediante amplificación por PCR a partir de ADNc murino comercial para SEZ6 (Origene; #MC203634) y se subclonó aguas abajo respecto a una secuencia del péptido señal de IgK y una secuencia de marcador epitópico de DDK previamente modificada aguas arriba respecto al sitio de clonación múltiple de pCDH-EF1-MCS-IRES-RFP (System Biosciences) utilizando técnicas de clonación molecular estándar. Esto proporcionó un vector lentiviral bicistrónico que se utilizó para producir una línea celular HEK-293T que sobreexpresara s EZ6 y RFP de murino.
SEZ6 de rata
[0528] Para generar y desarrollar todos los materiales moleculares y celulares necesarios en la presente invención con relación a las proteínas SEZ6 de rata, el ADNc (FIG. 5C, SEQ ID NO: 12) que codificaba la proteína SEZ6 de rata madura completa (FIG. 5D, SEQ ID NO: 13) se obtuvo como se indica a continuación. Se amplificó un ADNc que codificaba la proteína de rata madura completa (es decir, la proteína completa menos el péptido señal natural) a partir de ADNc Marathon-ready de cerebro de rata (Clontech #639412). Los alineamientos de secuencia indicaron que el ECD de la proteína codificada era homólogo a la proteína SEZ6 de rata endógena enumerada como RefSeq NP_001099224 en la base de datos del NCBI. Este clon de ADNc, denominado rSCRx17 (FIG. 5D), se utilizó para la modificación posterior de construcciones que expresaban fragmentos de la proteína SEZ6 de rata.
SEZ6 de cinomolgo
[0529] Para generar y desarrollar todos los materiales moleculares y celulares necesarios en la presente descripción con relación a las proteínas SEZ6 de cinomolgo, el ADNc (FIG. 5E, SEQ ID NO: 14) que codificaba la proteína SEZ6 de cinomolgo (FIG. 5F, SEQ ID NO: 15) se obtuvo como se indica a continuación: Una secuencia de ORF de SEZ6 de cinomolgo prevista se acopló mediante análisis bioinformático del siguiente modo: el ORF del gen SEZ6 humano se obtuvo a partir del número de acceso del NCBI NM_178860 y se comparó, utilizando el algoritmo BLAST, con los cóntigos de secuenciación aleatoria (shotgun) del genoma completo en la base de datos del NCBI. A continuación, los resultados de BLAST se utilizaron para acoplar posibles ORF de SEZ6 de cinomolgo. La secuencia que codificaba el péptido señal natural previsto de SEZ6 de cinomolgo se eliminó de estas secuencias derivadas de BLAST y se reemplazó con una secuencia que codificaba una secuencia de péptido señal de IgK. Después de la optimización de codones para la producción en células de mamífero, esta secuencia de ORF híbrida completa se clasificó como un gen sintético (GeneWiz). Este clon de ADNc optimizado, denominado cSCRx17 (FIG. 3E), se utilizó para modificar por ingeniería genética posteriormente construcciones que expresaban fragmentos de la proteína SEZ6
de cinomolgo.
SEZ6L y SEZ6L2 humanas
[0530] En el genoma humano, existen dos genes estrechamente relacionados con SEZ6: el gen de tipo homólogo 6 relacionado con las convulsiones (SEZ6L) y el gen de tipo homólogo 6 relacionado con las convulsiones-2 (SEZ6L2). Aunque el porcentaje global de identidad es relativamente bajo entre las tres proteínas (~42 %), existen tramos más pequeños de identidad perfecta entre dos de las proteínas o entre las tres proteínas. Con el fin de investigar cualquier reactividad cruzada posible de los moduladores anti-SEZ6 con las proteínas humanas SEZ6L y SEZ6L2, los marcos de lectura abiertos que codifican los ECD de la proteína SEZ6L humana (NP_0066938) y la proteína SEZ6L2 humana (NP_001230261) se optimizaron, en cuanto a sus codones, y se sintetizaron (GeneWiz). Estas secuencias de ADNc optimizadas que codifican los ECD de las proteínas SEZ6L y SEZ6L2 humanas se muestran en las FIGS. 5G y 5I.
Material para estudios de reactividad cruzada
[0531] Se generó material con el fin de estudiar si los moduladores de SEZ6 de la descripción presentan reactividad cruzada con los homólogos de SEZ6 de cinomolgo y/o rata, o con las proteínas SEZ6L y SEZ6L2 humanas estrechamente relacionadas. Se diseñaron genes de fusión quiméricos en los cuales la porción ECD de la proteína SEZ6 de cinomolgo o rata (subrayada en las FIGS. 5D y 5F, respectivamente) estaba fusionada con un marcador epitópico de 9-histidina (SeQ ID NO: 400). Utilizando Pc R, el fragmento de ADNc que codificaba el ECD de SEZ6 de cinomolgo o rata se amplificó a partir de rSCRx17 o cSCRx17, respectivamente, y se subclonó en un vector de expresión dirigido por c Mv en marco y aguas abajo respecto a una secuencia de péptido señal de IgK y en marco y aguas arriba respecto a una secuencia que codificaba un marcador epitópico de 9-histidina (SEQ ID NO: 400). De forma similar, se diseñaron genes de fusión quiméricos en los cuales el marco de lectura abierto que codificaba la porción ECD de las proteínas SEZ6L o SEZ6L2 humanas se subclonó en un vector de expresión dirigido por CMV en marco y aguas abajo respecto a una secuencia de péptido señal de IgK y en marco y aguas arriba respecto a una secuencia que codificaba un marcador de epítopo de 9-histidina (SEQ ID NO: 400). Las secuencias de proteínas codificadas resultantes para estas proteínas de fusión se muestran en las FIGS. 5H y 5J, respectivamente, donde la secuencia subrayada representa el ECD de la proteína particular que se está considerando.
[0532] Los vectores de SEZ6 ECD-His de rata y cinomolgo generados anteriormente se utilizaron para producir y purificar la proteína rSEZ6-ECD-His y la proteína cSEZ6-ECD-His recombinantes, respectivamente, como se indica a continuación: utilizando técnicas reconocidas en la técnica, los cultivos adherentes o en suspensión de células HEK-293T, o células CHO-S en suspensión se transfectaron con los vectores de expresión que codificaban la proteína rSEZ6-ECD-His o cSEZ6-ECD-His. Se utilizó un polímero de polietilenimina como reactivo de transfección. De tres a cinco días después de la transfección, se purificó la proteína rSEZ6-ECD-His o cSEZ6-ECD-His a partir de sobrenadantes celulares clarificados utilizando un explorador AKTA y columnas de níquel-EDTA (Qiagen). De forma similar, se utilizaron los vectores humanos SEZ6L-ECD-His y SEZ6L2-ECD-His para producir y purificar la proteína humana recombinante SEZ6L-ECD-His y la proteína humana SEZ6L2-ECD-His, como se ha descrito para los homólogos de rata y cinomolgo.
Ejemplo 6
Generación de moduladores murinos anti-SEZ6
[0533] Se produjeron moduladores de SEZ6 en forma de anticuerpos murinos según las enseñanzas en el presente documento mediante la inoculación con SEZ6-Fc humano. A este respecto, se utilizaron tres cepas de ratón para generar moduladores de tipo anticuerpo monoclonal murino de alta afinidad que se puedan utilizar para asociarse con SEZ6 y/o inhibir su acción con el fin de prevenir y/o tratar varios trastornos proliferativos. Específicamente, se inmunizaron las cepas de ratón Balb/c, CD-1 y FVB con SEZ6-Fc recombinante humano y se utilizaron para producir hibridomas.
[0534] El antígeno SEZ6-FC se purificó a partir del sobrenadante de células CHO-S que sobreexpresaban la construcción SEZ6-FC como se ha expuesto en el Ejemplo 5 (FIGS. 4A y 4B). Se utilizaron 10 |jg del inmunógeno SEZ6-FC para la primera inmunización y a continuación se utilizaron 5 jg y 2,5 jg del inmunógeno SEZ6-Fc para las siguientes tres inmunizaciones y cinco inmunizaciones, respectivamente. Todas las inmunizaciones se llevaron a cabo con el inmunógeno emulsionado con un volumen equivalente de TITERMAX® Gold (CytRx Corporation) o adyuvante de alumbre. Los anticuerpos murinos se generaron inmunizando seis ratones hembra (dos de cada uno de los siguientes: Balb/c, CD-1, FVB) a través de la almohadilla plantar para todas las inyecciones.
[0535] Se utilizaron ensayos ELISA en fase sólida para cribar los sueros de ratón con el fin de determinar los anticuerpos IgG de ratón específicos para SEZ6 humana. Una señal positiva por encima del ruido de fondo indicaba la presencia de anticuerpos específicos para SEZ6. Resumiendo, se recubrieron placas de 96 pocillos (VWR International, Cat. N.° 610744) con 0,5 jg/ml de SEZ6-His recombinante en tampón de recubrimiento para ELISA
durante toda la noche. Después del lavado con PBS que contenía un 0,02 % (v/v) de Tween 20, los pocilios se bloquearon con un 3 % (p/v) de BSA en PBS, 200 pl/pocillo, durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). El suero de ratón se tituló (1:100, 1:200, 1:400 y 1:800), se añadió a las placas recubiertas con SEZ6 en una cantidad de 50 pl/pocillo y se incubó a TA durante 1 hora. Las placas se lavaron y después se incubaron con 50 pl/pocillo de anticuerpo anti-IgG de ratón de cabra marcado con HRP, diluido con un factor de 1:10.000 en un 3 % de BSA-PBS o un 2 % de FCS en PBS durante 1 hora a TA. Las placas se lavaron de nuevo y se añadieron 40 pl/pocillo de una solución del sustrato TMB (Thermo Scientific 34028) durante 15 minutos a TA. Después del desarrollo, se añadió un volumen equivalente de H2SO42 N para detener el desarrollo del sustrato y las placas se analizaron con un espectrofotómetro para una DO 450.
[0536] Los ratones inmunizados cuyo suero era positivo se sacrificaron y se les extirparon los ganglios linfáticos drenantes (poplíteos e inguinales, e ilíacos medios si estaban inflamados) y se utilizaron como fuente de células productoras de anticuerpos. Una suspensión de un único tipo de linfocitos B (228,9x106 linfocitos) se fusionó con células de mieloma P3x63Ag8.653 no secretoras (ATCC #CRL-1580) en una relación de 1:1 por electrofusión. La electrofusión se realizó utilizando el sistema BTX Hybrimmune™ (BTX Harvard Apparatus), siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras el procedimiento de fusión, las células se volvieron a suspender en medio de selección de hibridomas complementado con azaserina (Sigma #A9666), medio DMEM de alto contenido de glucosa con piruvato sódico (Cellgro, Cat. N.° 15-017-CM) que contenía un 15 % de suero fetal Clone I (Hyclone), un 10 % de BM Condimed (Roche Applied Sciences), L-glutamina 4 mM, 100 IU de penicilina-estreptomicina y 2-mercaptoetanol 50 pM, y después se colocaron en tres matraces T225 en 90 ml de medio de selección por matraz. A continuación, los matraces se introdujeron en una incubadora humidificada a 37 °C que contenía un 5 % de CO2 y un 95 % de aire durante 6-7 días.
[0537] Una vez transcurridos de seis a siete días de cultivo, la biblioteca constituida por las células cultivadas a granel en los matraces T225 se colocó con una concentración de 1 célula por pocillo en placas Falcon de 96 pocillos con fondo en forma de U utilizando el clasificador de células Aria I. Los hibridomas seleccionados se cultivaron después en 200 pl de medio de cultivo que contenía un 15 % de suero fetal Clone I (Hyclone), un 10 % de BM-Condimed (Roche Applied Sciences), piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 4 mM, 100 IU de penicilina-estreptomicina, 2-mercaptoetanol 50 pM e hipoxantina 100 pM. Las posibles células de la biblioteca de hibridomas no utilizadas remanentes se congelaron para pruebas futuras de la biblioteca. Una vez transcurridos de diez a once días de cultivo, se analizaron los sobrenadantes de cada pocillo de las células que se encontraban en las placas para detectar los anticuerpos que reaccionaban con SEZ6 mediante ensayos ELISA y FACS.
[0538] Para el cribado con ELISA, se recubrieron placas de 96 pocillos con 0,3 pg/ml de SEZ6-Fc en PBS durante toda la noche a 4 °C. Las placas se lavaron y se bloquearon con un 3 % de BSA en PBS/Tween durante una hora a 37 °C y se utilizaron inmediatamente o se mantuvieron a 4 °C. Los sobrenadantes de los hibridomas sin diluir se incubaron en las placas durante una hora a TA. Las placas se lavaron y se sondearon con el anticuerpo anti-IgG de ratón de cabra marcado con HRP, diluido con un factor de 1:10.000 en un 3 % de BSA-PBS durante una hora a TA. Después, las placas se incubaron con una solución de sustrato tal como se ha descrito anteriormente y la lectura se realizó a una DO 450. Los pocillos que contenían inmunoglobulina que se unió preferentemente a SEZ6 humana, según se determinó con una señal por encima del ruido de fondo, se transfirieron y se extendieron.
[0539] Los pocillos con hibridomas positivos del cultivo seleccionados que secretaban inmunoglobulina murina también se cribaron para determinar su especificidad por SEZ6 humana y su reactividad cruzada con SEZ6 de cinomolgo, rata y murino, utilizando un ensayo basado en citometría de flujo con 293 células modificadas para que sobreexpresaran el antígeno seleccionado o construcciones fabricadas en el Ejemplo anterior.
[0540] Para los ensayos de citometría de flujo, 50x104 células h293 transducidas respectivamente con SEZ6 humana, de cinomolgo, rata o murino se incubaron durante 30 minutos con 25-100 pl de sobrenadante de hibridomas. Las células se lavaron con PBS/2 % de FCS dos veces y después se incubaron con 50 pl de un fragmento Fc de anticuerpo anti-IgG de ratón producido en cabra específico secundario conjugado con DyLight 649 diluido con un factor de 1:200 en PBS/2 % de FCS. Después de 15 minutos de incubación, las células se lavaron dos veces con PBS/2 % de FCS, se volvieron a suspender en el mismo tampón con DAPI y se analizaron mediante citometría de flujo utilizando un instrumento FACSCanto II según las instrucciones del fabricante Los pocillos que contenían inmunoglobulina que se unía preferentemente a células SEZ6+ GFP+ se transfirieron y se expandieron. Los hibridomas clónicos específicos para hSEZ6 resultantes se conservaron criogénicamente en medio de congelación CS-10 (Biolife Solutions) y se guardaron en nitrógeno líquido. Los anticuerpos que se unían a células con SEZ6 humanas, de cinomolgo, rata o murino se consideraron anticuerpos con reactividad cruzada (véase la FIG. 11A).
[0541] Los análisis de ELISA y de citometría de flujo confirmaron que el anticuerpo purificado a partir de todos o la mayoría de estos hibridomas se unía a SEZ6 de un modo dependiente de la concentración. Los pocillos que contenían inmunoglobulina que se unía a células con SEZ6 y GFP se transfirieron y se expandieron. Los hibridomas clónicos resultantes se conservaron criogénicamente en medio de congelación CS-10 (Biolife Solutions) y se almacenaron en nitrógeno líquido.
[0542] Se realizó una fusión y se sembró en 48 placas (4608 pocilios con una eficiencia de clonación de aproximadamente un 40 %). El cribado inicial proporcionó sesenta y tres anticuerpos murinos que se asociaron con SEZ6 humana. Posteriormente, se realizó un segundo cribado y proporcionó 134 anticuerpos que se asociaron con SEZ6 humana.
Ejemplo 7
Secuenciación de moduladores murinos de SEZ6
[0543] Basándose en lo anterior, se seleccionaron varios anticuerpos monoclonales diferentes ilustrativos que se unían a células h293-hSEZ6 o SEZ6 humanas inmovilizadas con una afinidad aparentemente alta para su secuenciación y posterior análisis. Como se muestra en forma de tabla en las FIGS. lOA y 10B, el análisis de las secuencias de las regiones variables de cadena ligera (FIG. 10A) y las regiones variables de la cadena pesada (FIG.
10B) de anticuerpos monoclonales seleccionados generados en el Ejemplo 6 confirmó que muchas poseían regiones determinantes de la complementariedad novedosas y habitualmente presentaban disposiciones VDJ novedosas. Cabe destacar que las regiones determinantes de la complementariedad expuestas en las FIGS. 10A y 10B se definen como en Chothia y col., anteriormente.
[0544] Como primera etapa en la secuenciación de moduladores ilustrativos, las células hibridómicas seleccionadas se lisaron en reactivo Trizol® (Trizol Plus RNA Purification System, Life Technologies) para preparar el ARN. A este respecto, se volvieron a suspender entre 104 y 105 células en 1 ml de Trizol, y se agitaron enérgicamente después de añadir 200 pl de cloroformo. A continuación, las muestras se centrifugaron a 4 °C durante 10 minutos y la fase acuosa se transfirió a otro tubo de microcentrifugación, al cual se añadió un volumen equivalente de isopropanol. Los tubos se agitaron enérgicamente de nuevo y se dejaron incubar a TA durante 10 minutos antes de centrifugarlos a 4 °C durante 10 minutos. Los sedimentos de ARN resultantes se lavaron una vez con 1 ml de etanol al 70 % y se secaron brevemente a TA antes de volver a suspenderlos en 40 pl de agua tratada con DEPC. La calidad de los preparados de ARN se determinó fraccionando 3 pl en un gel de agarosa al 1 % antes de almacenarlos a -80 °C hasta su uso.
[0545] Se amplificó la región variable de la cadena pesada de Ig de cada hibridoma utilizando una mezcla de cebadores 5' que comprendía treinta y dos cebadores de la secuencia líder específicos de ratón, diseñados para atacar el repertorio Vh completo de ratón, combinados con un cebador Cy de ratón 3' específico para todos los isotipos de Ig de ratón. Se secuenció un fragmento de PCR de 400 bp de la Vh desde ambos extremos utilizando los mismos cebadores de PCR. De forma similar, se utilizó una mezcla de treinta y dos cebadores de la secuencia líder de VK 5' diseñados para amplificar cada una de las familias Vk de ratón combinados con un único cebador inverso específico para la región constante kappa de ratón para amplificar y secuenciar la cadena ligera kappa. Los transcritos de Vh y Vl se amplificaron a partir de 100 ng de ARN total utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).
[0546] Se realizaron ocho reacciones RT-PCR en total para cada hibridoma: cuatro para la cadena ligera Vk y cuatro para la cadena pesada V gamma (y1). Se utilizó el kit de RT-PCR de una etapa para la amplificación (Qiagen). Este kit proporciona una combinación de transcriptasas inversas Sensiscript y Omniscript, ADN-polimerasa HotStarTaq, mezcla dNTP, tampón y Q-Solution, un aditivo novedoso que permite la amplificación eficiente de plantillas «difíciles» (por ejemplo, ricas en GC). Se prepararon mezclas de reacción que incluían 3 pl de ARN, 0,5 de 100 pM de cebadores de cadena pesada o ligera kappa (sintetizados por encargo en IDT), 5 pl de 5x tampón de RT-PCR, 1 pl de dNTP, 1 pl de mezcla de enzimas que contenía transcriptasa inversa y ADN-polimerasa, y 0,4 pl del inhibidor de ribonucleasa RNasin (1 unidad). La mezcla de reacción contiene todos los reactivos requeridos tanto para la transcripción inversa como para la PCR. Se fijó el programa del ciclador término para una etapa de RT a 50 °C durante 30 minutos, 95 °C durante 15 minutos, seguido de 30 ciclos de PCR (95 °C durante 30 segundos, 48 °C durante 30 segundos, 72 °C durante un minuto). Posteriormente, se realizó una incubación final a 72 °C durante 10 minutos.
[0547] Para preparar los productos de PCR para la secuenciación directa del ADN, se purificaron utilizando el kit de purificación de PCR QIAquick™ (Qiagen) según el protocolo del fabricante. Se eluyó el ADN de la columna de centrifugación utilizando 50 pl de agua estéril y después se secuenció directamente a partir de ambas hebras. Los productos de PCR extraídos se secuenciaron directamente utilizando cebadores de las regiones V específicos. Las secuencias nucleotídicas se analizaron utilizando IMGT para identificar los miembros de los genes V, D y J de la línea germinal con la mayor homología secuencial. Las secuencias derivadas se compararon con secuencias de ADN de las línea germinal conocidas de las regiones V y J de Ig utilizando V-BASE2 (Retter y col., anteriormente) y mediante el alineamiento de los genes de Vh y Vl respecto a la base de datos de la línea germinal de ratón para proporcionar las secuencias indicadas que se exponen en las FIGS. 10A y 10B.
[0548] Más específicamente, la FIG. 10A representa las secuencias de aminoácidos contiguas de setenta y cinco regiones variables de cadena ligera murina novedosas de anticuerpos anti-SEZ6 (SEQ ID NO: 20-168, números pares) y once regiones variables de cadena ligera humanizada (SEQ ID NO: 170-192, números pares) derivadas de
cadenas ligeras murinas representativas. De forma similar, la FIG. 10B representa las secuencias de aminoácidos contiguas de setenta y cinco regiones variables de la cadena pesada murina novedosas (SEQ ID NO: 21-169, números impares) de los mismos anticuerpos anti-SEZ6 y once regiones variables de la cadena pesada humanizada (SEQ ID NO: 171-193, número impares) de los mismos anticuerpos murinos que proporcionan las cadenas ligeras humanizadas. Por lo tanto, consideradas conjuntamente, las FIGS. 10A y 10B proporcionan las secuencias indicadas de setenta y cinco anticuerpos anti-SEZ6 murinos operables (denominados SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10, SC17.11, SC17.14, SC17.15, SC17.16, SC17.17, SC17.18, SC17.19, SC17.22, SC17.24, SC17.27, SC17.28, SC17.29, SC17.30, SC17.32, SC17.34, SC17.35, SC17.36, SC17.38, SC17.39, SC17.40, SC17.41, SC17.42, SC17.45, SC17.46, SC17.47, SC17.49, SC17.50, SC17.53, SC17.54, SC17.56, SC17.57, SC17.59, SC17.61, SC17.63, SC17.71, SC17.72, SC17.74, SC17.76, SC17.77, SC17.79, SC17.81, SC17.82, SC17.84, SC17.85, SC17.87, SC17.89, SC17.90, SC17.91, SC17.93, SC17.95, SC17.97, SC17.99, SC17.102, SC17.114, SC17.115, SC17.120, SC17121, SC17.122, SC17.140, SC17.151, SC17.156, SC17.161, SC17.166, SC17.187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 y SC17.200) y once anticuerpos humanizados (denominados hSC17.16, hSC17.17, hSC17.24, hSC17.28, hSC17.34, hSC17.46, hSC17.151, hSC17.155, hSC17.156, hSC17.161 y hSC17.200). Cabe destacar que estas mismas denominaciones se pueden referir al clon que produce el anticuerpo en cuestión y, en este sentido, el uso de cualquier denominación particular se debe interpretar en el contexto de la descripción relacionada.
[0549] Adicionalmente, hSC17.200vL1 (SEQ ID NO: 192) es una variante de la construcción de cadena ligera humanizada hSC17.200 (SEQ ID NO: 190), hSC17.155vH1 - vH6 (SEQ ID NO: 193-198) son variantes de la construcción de cadena pesada hSC.155 (SEQ ID NO: 184) que se deriva de SC17.90 (SEQ ID NO: 127) y que hSC161vH1 (SEQ ID NO: 199) es una variante de la construcción de cadena pesada hSC17.161 (SEQ ID nO: 189). Como se analizará con más detalle posteriormente, estas variantes se construyeron y se evaluaron para optimizar una o más propiedades bioquímicas del anticuerpo parental.
[0550] Adicionalmente, las secuencias de ácido nucleico correspondientes de cada uno de los setenta y cinco moduladores murinos y los once moduladores humanizados ilustrativos y variantes de los mismos que se exponen en las FIGS. 10A y 10B se incluyen en la lista de secuencias de la presente solicitud (SEQ ID NO: 220 - 399).
[0551] A los efectos de la presente solicitud, las SEQ ID NO de cada anticuerpo particular son secuenciales. Por lo tanto, el mAb SC17.1 comprende las SEQ ID NO: 20 y 21 para las regiones variables de las cadenas ligera y pesada, respectivamente. A este respecto, SC17.2 comprende las SEQ ID NO: 22 y 23, SC17.9 comprende las SEQ Id NO: 24 y 25, etc. Además, las secuencias de ácido nucleico correspondientes para cada secuencia de aminoácidos de las FIGS. 10A y 10B se adjuntan a la presente solicitud en la lista de secuencias que se presenta junto con la presente. En la lista de secuencias en cuestión, las secuencias de ácido nucleico incluidas comprenden SEQ ID NO que son doscientas veces mayores que la secuencia de aminoácidos correspondiente (cadena ligera o pesada). Por lo tanto, las secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera y pesada del mAb SC17.1 (es decir, las SEQ ID NO: 20 y 21) constituyen las SEQ ID NO: 220 y 221 en la lista de secuencias. A este respecto, las secuencias de ácido nucleico que codifican todas las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada descritas, incluidas aquellas que codifican las construcciones humanizadas y variantes de las mismas, se numeran de forma similar y comprenden las SEQ ID NO: 220-399.
Ejemplo 8
Generación de moduladores de SEZ6 quiméricos y humanizados
[0552] Como se ha indicado anteriormente, once de los anticuerpos murinos del Ejemplo 7 se humanizaron utilizando injertos de regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Se seleccionaron marcos humanos para las cadenas pesada y ligera en función de la similitud secuencial y estructural con respecto a genes de la línea germinal humana funcionales. A este respecto, la similitud estructural se evaluó comparando la estructura de CDR canónica de ratón con candidatos humanos con las mismas estructuras canónicas tal como se describe en Chothia y col. (anteriormente).
[0553] Más particularmente, se humanizaron once anticuerpos murinos SC17.16, SC17.17, SC17.24, SC17.28, SC17.34, SC17.46, SC17.151, SC17.155, SC17.156, SC17.161 y SC17.200 utilizando un procedimiento de inserción de injertos de CDR asistido por computadora (Abysis Database, UCL Business Ple.) y técnicas de ingeniería molecular estándar para proporcionar los moduladores hSC17.16, hSC17.17, hSC17.24, hSC17.28, hSC17.34, hSC17.46, hSC17.151, hSC17.155, hSC17.156, hSC17.161 y hSC17.200. Las regiones de marco humano de las regiones variables se seleccionaron en función de su mayor homología secuencial respecto a la secuencia de marco de ratón en cuestión y su estructura canónica. A los efectos de analizar la humanización, la asignación de aminoácidos a cada uno de los dominios CDR se ajusta a la numeración de Kabat y col. (anteriormente).
[0554] Los procedimientos de ingeniería molecular se realizaron utilizando técnicas reconocidas en la materia. Con tal fin, se extrajo ARNm total de los hibridomas y se amplificó como se ha expuesto en el Ejemplo 7 justo antes.
[0555] A partir de la información sobre las secuencias de nucleótidos, se obtuvieron datos referentes a los segmentos de los genes V, D y J de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos murinos en cuestión. Basándose en los datos sobre las secuencias, se designaron conjuntos de cebadores nuevos específicos para la secuencia líder de la cadena ligera Vh y Vk de Ig de los anticuerpos para clonar el anticuerpo monoclonal recombinante. Posteriormente, las secuencias V-(D)-J se alinearon con secuencias de la línea germinal de Ig de ratón. Las disposiciones genéticas resultantes para cada uno de los once construcciones humanizadas se muestran justo a continuación en la tabla 1.
TABLA 1
[0556] Los anticuerpos humanizados enumerados en la tabla 1 corresponden a las secuencias de cadena ligera y pesada indicadas que se exponen en las FIGS. 10A y 10B (SEQ ID NO: 170-191). Las secuencias de ácido nucleico correspondientes de las regiones variables de cadena ligera y pesada se exponen en la lista de secuencias. Además, la TABLA 1 muestra que fueron necesarios muy pocos cambios en el entramado para mantener las propiedades favorables de los moduladores de unión. A este respecto, solamente se realizaron cambios en el marco o retromutaciones en tres de las regiones variables de la cadena pesada y solamente se realizaron dos modificaciones en el marco en las regiones variables de cadena ligera.
[0557] Cabe destacar que, para algunas regiones variables de cadena ligera y pesada (por ejemplo, hSC17.200, hSC17.155 y hSC17.161), se introdujeron mutaciones aminoacídicas conservadoras en las CDR para resolver cuestiones de estabilidad y mantener a la vez la unión al antígeno. En cada caso, se observó que la afinidad de unión de los anticuerpos con CDR modificadas era equivalente a la del correspondiente anticuerpo murino o quimérico. Al final de las FIGS. 10A y 10B (SEQ ID NO: 192-199) se enumeran las secuencias de nueve cadenas variantes humanizadas ilustrativas (ligeras y pesadas), que conservan la denominación de la cadena original humanizada con una anotación para indicar que han sido alteradas (por ejemplo, hSC17.200vL1, hSC17.155vH1-6 y hSC17.161vH1).
[0558] Tras la humanización de todos los anticuerpos seleccionados mediante la inserción de injertos de CDR, se analizaron las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada resultantes para determinar su homología con respecto a las regiones variables de las cadenas ligera y pesada aceptoras humanas y donantes murinas. Los resultados, que se muestran a continuación en la tabla 2, indican que las construcciones humanizadas exhibieron uniformemente una homología mayor con respecto a las secuencias receptoras humanas que con respecto a las secuencias donantes murinas. Más específicamente, las regiones variables de cadena pesada y ligera humanizadas muestran en general un porcentaje de homología mayor respecto al caso más semejante de los genes de la línea germinal humana (84 %-95 %) en comparación con la homología de las secuencias de regiones variables humanizadas y las secuencias proteicas de los hibridomas donantes (74 %-89 %).
TABLA 2
(continuación)
[0559] Tras las pruebas, y como se analizará en el Ejemplo 9, cada una de las construcciones humanizadas exhibieron características de unión favorables más o menos comparables con las que mostraron los anticuerpos originales murinos (datos no mostrados).
[0560] Independientemente de que sean humanizados o murinos, una vez que se determinan las secuencias de ácido nucleico de las regiones variables, los anticuerpos de la presente invención se pueden expresar y aislar utilizando técnicas reconocidas en la materia. Con este fin, se clonaron fragmentos de ADN sintéticos de la región variable de cadena pesada elegida (humanizada o murina) en un vector de expresión de IgG1 humana. De forma análoga, el fragmento de ADN de la región variable de cadena ligera (nuevamente humanizada o murina) se clonó en un vector de expresión de cadena ligera humana. El anticuerpo seleccionado se expresó entonces por cotransfección de las construcciones de ácido nucleico de cadena pesada y ligera derivados en células CHO.
[0561] Más particularmente, un procedimiento compatible de producción de anticuerpos comprendió la clonación direccional de genes de las regiones variables murinas y humanizadas (amplificados por PCR) en vectores de expresión de inmunoglobulina humana seleccionados. Todos los cebadores utilizados en la PCR específica para genes de Ig incluían sitios de restricción que permitieron la clonación directa en vectores de expresión que contenían regiones constantes de la cadena pesada y la cadena ligera de IgG1 humana. Resumiendo, los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación para PCR Qiaquick (Qiagen), y después se digirieron con AgeI y XhoI (para la cadena pesada) y Xmal y DraIII (para la cadena ligera), respectivamente. Los productos de PCR digeridos se purificaron antes de su ligadura en vectores de expresión. Las reacciones de ligadura se realizaron en un volumen total de 10 pl con 200 U de ADN-ligasa T4 (New England Biolabs), 7,5 pl de producto de PCR con especificidad génica purificado y digerido, y 25 ng de ADN vectorial linealizado. Se transformaron bacterias DH10B de E. coli competentes (Life Technologies) mediante choque térmico a 42 °C con 3 pl de producto de ligadura y se colocaron sobre placas de ampicilina (100 pg/ml). El fragmento Agel-EcoRI de la región Vh se insertó después en los mismos sitios del vector de expresión pEE6.4HuIgG1 mientras que el inserto de VK Xmal-DralII sintético se clonó en los sitios Xmal-DralII del vector de expresión pEE12.4Hu-Kappa respectivo.
[0562] Se generaron células que producían el anticuerpo seleccionado por transfección de células HEK 293 con los plásmidos adecuados utilizando 293fectina. A este respecto, se purificó ADN plasmídico con columnas de centrifugación QIAprep (Qiagen). Se cultivaron células renales embrionarias humanas (HEK) 293T (N.° de ATCC CRL-11268) en placas de 150 mm (Falcon, Becton Dickinson) en condiciones estándar en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con un 10 % de FCS desactivado térmicamente, 100 pg/ml de estreptomicina, 100 U/ml de penicilina G (todos ellos de Life Technologies).
[0563] Para las transfecciones transitorias, se cultivaron células con una confluencia de un 80 %. Se añadieron cantidades equivalentes de IgH y ADN vectorial de una cadena de IgL correspondiente (12,5 pg de cada) a 1,5 ml de Opti-MEM mezclados con 50 pl de reactivo de transfección de HEK 293 en 1,5 ml de opti-MEM. La mezcla se incubó durante 30 min a temperatura ambiente y se distribuyó uniformemente en la placa de cultivo. Se recogieron los sobrenadantes tres días después de la transfección, se reemplazaron con 20 ml de DMEM fresco complementado con un 10 % de FBS y se recogieron de nuevo 6 días después de la transfección. Se eliminaron los residuos celulares de los sobrenadantes del cultivo mediante centrifugación a 800xg durante 10 min y se almacenaron a 4 °C. Se purificaron los anticuerpos humanizados y quiméricos recombinantes con microesferas de proteína G (GE Healthcare) y se almacenaron en condiciones adecuadas.
Ejemplo 9
Características de los moduladores de SEZ6
[0564] Se utilizaron varios procedimientos para analizar las características inmunoquímicas y de unión de moduladores de SEZ6 seleccionados generados como se ha expuesto anteriormente. Específicamente, se caracterizaron una serie de moduladores de anticuerpo según su afinidad, clasificación en secciones y reactividad
cruzada respecto al antígeno SEZ6 humano, cinomolgo, de rata y de ratón junto con las proteínas SEZ6L y SEZ6L2 mediante procedimientos reconocidos en la técnica, que incluyen la citometría de flujo. Las afinidades y las constantes cinéticas kasociación y kdisociación de los moduladores seleccionados se midieron utilizando un análisis de interferometría de biocapa con un instrumento ForteBio RED (ForteBio, Inc.) o una resonancia de plasmón superficial utilizando un instrumento Biacore 2000, en cada caso según las instrucciones del fabricante.
[0565] Los resultados de la caracterización se exponen en forma de tabla en la FIG. 11 A, donde se puede observar que los moduladores seleccionados exhibieron en general unas afinidades relativamente altas en el intervalo nanomolar y, en muchos casos, presentaron reactividad cruzada con uno o más ortólogos de SEZ6. La FIG. 12 indica además la sección determinada empíricamente ocupada por el modulador en cuestión. Considerados conjuntamente, estos datos muestran las propiedades de unión variadas de los moduladores descritos, así como también su idoneidad potencial para el desarrollo farmacéutico basándose en su reactividad en modelos con animales.
[0566] A este respecto, se realizó una citometría de flujo utilizando un instrumento FACSCanto II según las instrucciones del fabricante con el fin de confirmar que los moduladores de tipo anticuerpo SC17 seleccionados se pueden asociar de forma inmunoespecífica con SEZ6 humana y para determinar si los mismos moduladores presentarían reactividad cruzada con SEZ6 de cinomolgo, de rata y/o murina, así como también con SEZ6L y SEZ6L2. Más particularmente, los moduladores se ensayaron para determinar su reactividad cruzada con SEZ6 murina y SEZ6 de rata mediante citometría de flujo frente a líneas celulares Neuro2a (ATCC, N.° de catálogo CCL131) y RIN-m5F (ATCC, N.° de catálogo CRL-11605), las cuales expresan SEZ6 de ratón y SEZ6 de rata, respectivamente. Para examinar la reactividad cruzada con SEZ6 de cinomolgo, se utilizó levadura que presentaba el dominio extracelular de SEZ6 de cinomolgo (Boder y col., 1997) para el análisis por citometría de flujo.
[0567] Resumiendo, se incubaron 1x105 células por pocillo de Neuro2a, RIN-5mF o levadura que presentaba células con SEZ6 de cinomolgo durante 30 minutos con 50 pl de tampón de PBS (2 % de FCS) con 5 pg/ml de anticuerpo. Las células se lavaron dos veces con el mismo tampón y a continuación se incubaron con 50 pl por muestra de un fragmento Fc de anticuerpo anti-IgG de ratón de cabra marcado con DyLight 649 específico secundario diluido con un factor de 1:200 en tampón de PBS. Después de incubar durante 15 minutos, las células se lavaron dos veces con el tampón de PBS y se volvieron a suspender en este con DAPI, para el análisis por citometría de flujo de Neuro2a y Rin-m5F, o tampón sin DAPI para el análisis por citometría de flujo de las células de levadura con cSEZ6. Se consideró que los anticuerpos que se unieron a las líneas celulares Neuro2a o RIN-m5F, o a la levadura que presentaba SEZ6 de cinomolgo mostraron reactividad cruzada con SEZ6 murina, SEZ6 de rata o SEZ6 de cinomolgo, respectivamente. La FIG. 11A muestra los resultados de reactividad cruzada. Seis anticuerpos presentaron reactividad cruzada con SEZ6 humana y de ratón (SC17.6, SC17.7, SC17.19, SC17.24, SC17.26 y SC17.42); seis para SEZ6 humana y de rata (SC17.6, SC17.17, SC17.19, SC17.26, SC17.28, SC17.34 y SC17.42); y seis para SEZ6 humana y de cinomolgo (SC17.17, SC17.24, SC17.26, SC17.34, SC17.36 y SC17.45). Cabe destacar que SC17.6 es un duplicado de SC17.16 y presenta las mismas características de unión.
[0568] Con el fin de verificar los datos de reactividad cruzada anteriores para SEZ6 de rata y determinar la afinidad y las constantes cinéticas kasociación y kdisociación de los efectores seleccionados, se llevó a cabo un análisis de interferometría de biocapa con un instrumento ForteBio RED (ForteBio, Inc.) o una resonancia de plasmón superficial con un instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare). Se determinaron las afinidades tanto para SEZ6-His recombinante humana como para SEZ6-HIS recombinante de rata generadas en el Ejemplo 5. Como se observa en la FIG. 11A, varios de los anticuerpos evaluados presentaron reactividad cruzada con SEZ6 de rata. Los marcadores seleccionados presentaron afinidades relativamente altas para SEZ6 tanto humana como de rata en el intervalo nanomolar.
[0569] Para determinar la reactividad cruzada con proteínas que son miembros de la familia, SEZ6L y SEZ6L2, se utilizó un ensayo basado en ELISA. Se recubrieron placas con las proteínas SEZ6, SEZ6L o SEZ6L2 con una concentración de 0,2 pg/ml en PBS durante una noche. Tras lavar con PBS que contenía un 0,05 % (v/v) de Tween 20 (PBST), los pocillos se bloquearon con un 2 % (p/v) de BSA en PBS (PBSA), 100 pl/pocillo, durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, se añadió el anticuerpo con una concentración de 1 pg/ml en 100 pl de PBSA durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras lavar con PBST, se añadieron 100 pl/pocillo de anticuerpo anti-IgG de ratón producido en cabra marcado con HRP diluido con un factor de 1:2000 en PBSa durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y se añadieron 100 pl/pocillo de una solución del sustrato TMB (Thermo Scientific 34028) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después del desarrollo, se añadió un volumen equivalente de H2SO42 N para detener el desarrollo del sustrato y se analizaron con un espectrofotómetro para una DO 450. La FIG.
11A muestra que un anticuerpo presentó reactividad cruzada con SEZ6L (SC17.7) y cinco presentaron reactividad cruzada con SEZ6L2 (SC17.6, s C17.7, SC17.19, SC17.26 y SC17.28). Como se ha analizado anteriormente, dichos anticuerpos pan-SEZ6 son compatibles con las enseñanzas en el presente documento y se pueden utilizar conjuntamente con los procedimientos descritos.
[0570] Las características de unión de las siguientes construcciones humanizadas del Ejemplo 8, hSC17.16, hsC17.17, hSC17.24, hSC17.28, hSC17.34 y hSC17.46, se analizaron con el fin de determinar si el proceso de inserción de injertos de CDR había alterado de forma apreciable sus características de unión. Las construcciones humanizadas (con injertos de CDR) se compararon con anticuerpos quiméricos «tradicionales» que comprendían los
dominios variables de las cadenas pesada y ligera originales murinos (o donantes) y una región constante humana sustancialmente equivalente a la utilizada en las construcciones humanizadas. Se realizó una resonancia de plasmón superficial con estas construcciones utilizando un instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare) con el fin de identificar cualesquiera cambios sutiles en las constantes de velocidad provocados por el proceso de humanización. En todos los casos, los anticuerpos humanizados presentaron una afinidad de unión equivalente a la de los anticuerpos murinos correspondientes o mejor (datos no mostrados).
[0571] Se determinó la clasificación en secciones de los anticuerpos para diversos moduladores de SEZ6, tal como se muestra en la FIG. 11A. Se utilizó un instrumento ForteBio r Ed siguiendo las instrucciones del fabricante para identificar los anticuerpos competitivos que se unían a la misma sección o a secciones diferentes. Resumiendo, se capturó un anticuerpo de referencia (Ab1) en un chip de captura de anticuerpos anti-ratón, a continuación se utilizó una concentración elevada de anticuerpo no enlazante para bloquear el chip y se registró una línea de referencia. Posteriormente, la proteína SEZ6 humana recombinante monomérica (descrita en el Ejemplo 5) se capturó por el anticuerpo específico (Ab1) y la punta se sumergió en un pocillo con el mismo anticuerpo (Ab1) como control o en un pocillo con un anticuerpo de prueba diferente (Ab2). Cuando se observó una unión adicional con un nuevo anticuerpo, entonces se determinó que Ab1 y Ab2 pertenecían a secciones diferentes. Si no se produjo ninguna unión adicional, lo cual se determinó comparando los niveles de unión con el control Ab1, entonces se determinó que Ab2 pertenecía a la misma sección. Como se sabe en la técnica, este proceso se puede expandir para cribar grandes colecciones de anticuerpos únicos, utilizando una hilera entera de anticuerpos que representan secciones únicas en una placa de 96 pocillos. En el presente caso, este proceso de clasificación en secciones mostró que los anticuerpos cribados se unían a al menos siete secciones diferentes de la proteína SEZ6. Las secciones A-F son secciones únicas y los anticuerpos contenidos en cada una de estas secciones compiten entre sí (pero no compiten con los anticuerpos de otras secciones definidas) por la unión con la proteína SEZ6. La sección U contiene anticuerpos que no compiten con los anticuerpos de las secciones A-F, pero que pueden competir entre sí por la unión.
Ejemplo 10
Mapeo de los epítopos de los moduladores de SEZ6
[0572] Para caracterizar los epítopos con los que se asocian o unen los moduladores de anticuerpo de SEZ6 descritos, se realizó un mapeo de los epítopos a nivel de dominios utilizando una modificación del protocolo descrito por Cochran y col. (J Immunol Methods. 287 (1 -2):147-158 (2004))
). Los dominios individuales de SEZ6 se expresaron en la superficie de una levadura y se determinó la unión de cada anticuerpo de SEZ6 por citometría de flujo.
[0573] Se crearon construcciones plasmídicas de presentación en levaduras para la expresión de las siguientes construcciones: Dominio extracelular de SEZ6 (aminoácidos 1-904); Dominio Sushi 1 (aminoácidos 336-395), Dominio CUB 1 (aminoácidos 297-508), Dominio Sushi 2 (aminoácidos 511-572), Dominio CUB 2 (aminoácidos 574-685), Dominio Sushi 3 (aminoácidos 690-748), Dominio Sushi 4 (aminoácidos 750-813), Dominio Sushi 5 (aminoácidos 817 878), y Dominio Sushi 5 C-terminal (aminoácidos 817-904). Adicionalmente, el dominio N-terminal (aminoácidos 1 335) se dividió en 3 fragmentos, denominados N1 (aminoácidos 1-70), N2 (aminoácidos 71-169) y N3 (aminoácidos 169-335), cada uno de los cuales se clonó en el plásmido de presentación en levaduras. La numeración de los aminoácidos no incluye el péptido líder. Para consultar información sobre los dominios, véase en general la entrada Q53EL9 de la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot. Estos plásmidos se transformaron en levadura, que se cultivó posteriormente y se indujo tal como se describe en Cochran y col. Cabe destacar que toda la numeración de los aminoácidos se basa en la proteína SEZ6 madura sin la secuencia líder de 19 aa.
[0574] Para evaluar la unión a una construcción particular, 200.000 células de levadura inducidas que expresaban la construcción deseada se lavaron dos veces en PBS 1 mg/ml de BSA (PBSA) y se incubaron en 50 pl de PBSA con 0,1 pg/ml de anticuerpo anti-c-myc producido en gallina (Life Technologies) y o bien anticuerpo purificado 50 nM o sobrenadante no purificado diluido con un factor de 1:2 procedente de hibridomas cultivados durante 7 días. Las células se incubaron durante 90 minutos sobre hielo y a continuación se lavaron dos veces en PBSA. Posteriormente, las células se incubaron en 50 pl de PBSA con los anticuerpos secundarios adecuados: para los anticuerpos murinos, se añadieron un anticuerpo anti-gallina conjugado con Alexa 488 y un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con Alexa 647 (ambos de Life Technologies), con una concentración de 1 pg/ml de cada uno, y para los anticuerpos humanizados o quiméricos, se añadieron un anticuerpo anti-gallina conjugado con Alexa 647 (Life Technologies) y un anticuerpo anti-humano de cabra conjugado con R-ficoeritrina (Jackson Immunoresearch), con una concentración de 1 pg/ml de cada uno. Después de veinte minutos de incubación sobre hielo, las células se lavaron dos veces con PBSA y se analizaron en un instrumento FACS Canto II.
[0575] Todos los moduladores se unieron únicamente a un solo dominio expresado en las células de levadura. En algunos casos, los clones de los anticuerpos se unieron específicamente a levadura que expresaba el Dominio Sushi 5+ el extremo C-terminal, pero no se unieron a levadura que expresaba el Dominio Sushi 5. Se concluyó que estos clones de los anticuerpos se unían únicamente a la región C-terminal (aminoácidos 879-904).
[0576] Los epítopos se clasificaron como conformacionales (es decir, discontinuos) o lineales. La levadura que presentaba la construcción SEZ6 ECD se trató con calentamiento durante 30 minutos a 80 °C con el fin de desnaturalizar el antígeno, se lavó dos veces en PBSA enfriado con hielo y a continuación se sometió al mismo protocolo de tinción y análisis por citometría de flujo que se han descrito anteriormente. Los anticuerpos que se unieron tanto a la levadura desnaturalizada como a la nativa se clasificaron como de unión a un epítopo lineal, mientras que los anticuerpos que se unieron a la levadura nativa pero no se unieron a la levadura desnaturalizada se clasificaron como conformacionalmente específicos.
[0577] En la TABLA 3 a continuación se presenta un resumen de los datos del mapeo de los epítopos a nivel de dominios para los anticuerpos evaluados. Los anticuerpos que se unen a un epítopo lineal están subrayados y los anticuerpos que se unen a los miembros de la familia s EZ6 SEZ6L y SEZ6L2 se indican con un asterisco y/o una daga, respectivamente.
TABLA 3
[0578] Se observó una tendencia interesante y sorprendente cuando se llevó a cabo un ensayo de destrucción celular in vitro utilizando los moduladores de tipo anticuerpo de SEZ6 con dominios mapeados descritos en este Ejemplo 10. El ensayo de destrucción in vitro, que se llevó a cabo esencialmente como se describe más adelante en el Ejemplo 14, determinó la capacidad de un anticuerpo particular para internalizar y destruir células HEK-293. La FIG.
11B es una gráfica de la eficacia de los anticuerpos evaluados frente a los dominios a los cuales se unen. Los anticuerpos que se unen a ciertos dominios, incluidos los siguientes: N1, N3, Dominio Sushi 1 y Dominio Sushi 4, presentaron una destrucción in vitro mejorada. Los anticuerpos que se asocian con el Dominio Sushi 4, que son muy eficaces a la hora de internalizar y destruir células, exhiben una fuerte correlación con las regiones de entramado de las líneas germinales murinas IGHV1-34 y IKV4-59.
[0579] Además, se realizó un mapeo de los epítopos refinado para anticuerpos seleccionados con el fin de determinar los aminoácidos específicos a los cuales se unían. Los anticuerpos que se unieron a un epítopo lineal se mapearon utilizando el kit para colecciones peptídicas de presentación en fagos Ph.D.-12 (New England Biolabs E8110S). El anticuerpo seleccionado para el mapeo de los epítopos se utilizó como recubrimiento sobre un tubo Nunc MaxiSorp (Nunc) con una concentración de 50 pg/ml en 3 ml de una solución de bicarbonato de sodio 0,1 M a un pH de 8 y se incubó durante una noche. El tubo se bloqueó con una solución al 3 % de BSA en una solución de bicarbonato. Después, se permitió que se unieran 1011 fagos de insumo en PBS 0,1 % de Tween-20 y después se realizaron 10 lavados consecutivos con Tween-20 al 0,1 % para eliminar los fagos que no se hubieran enlazado. Los fagos remanentes se eluyeron con 1 ml de glicina 0,2 M durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación suave y a continuación se neutralizaron con 150 pl de Tris-HCl 1 M a pH 9. Los fagos eluidos se amplificaron y se mezclaron de nuevo con 1011 fagos de insumo, utilizando Tween-20 al 0,5 % durante las etapas de lavado para aumentar la rigurosidad de la selección. Se aisló el ADN de 24 placas de los fagos eluidos procedentes de la segunda ronda, utilizando el kit de centrifugación Qiaprep M13 (Qiagen), y se secuenció. La unión del fago clónico se confirmó
utilizando un ensayo ELISA, en el cual el anticuerpo mapeado o un anticuerpo de control se utilizó como recubrimiento sobre una placa para ELISA, se bloqueó y se expuso a cada fago clónico. La unión del fago se detectó utilizando un anticuerpo anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare) y la solución 1-Step Turbo TMB ELISA (Pierce). Las secuencias peptídicas de fagos correspondientes a fagos de unión específica se alinearon utilizando el vector NTI (Life Technologies) frente a la secuencia peptídica del ECD del antígeno para determinar el epítopo de unión.
[0580] Los anticuerpos que se unieron a un epítopo discontinuo se mapearon utilizando la técnica descrita por Chao y col. (2007). Se generaron bibliotecas de mutantes del ECD de SEZ6 con PCR propensa a errores utilizando los análogos nucleotídicos 8-oxo-2'desoxiguanosina-5'-trifosfato y 2'-desoxi-p-nucleósido-5'trifosfato (ambos de TriLink Bio) para una tasa de mutagénesis diana de una mutación aminoacídica por clon. Estos se transformaron en un formato de presentación en levaduras. Utilizando la técnica descrita anteriormente para el mapeo a nivel de dominios, la biblioteca se tiñó con el fin de determinar la unión del anticuerpo y c-myc para una concentración de 50 nM. Utilizando un instrumento FACS Aria (BD), se seleccionaron los clones que exhibieron una pérdida de la unión en comparación con el ECD de SEZ6 de tipo silvestre. Estos clones se volvieron a cultivar y se sometieron a otra ronda de selección por FACS para determinar la pérdida de la unión al anticuerpo diana. Los clones de ECD individuales se aislaron y secuenciaron utilizando el kit Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep (Zymo Research). Cuando fue necesario, las mutaciones se reformatearon como clones de ECD de un solo mutante utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Quikchange (Agilent).
[0581] A continuación, los clones de ECD individuales se cribaron para determinar si la pérdida de la unión era debida a una mutación en el epítopo o a una mutación que provocaba un plegamiento inadecuado. Las mutaciones donde intervenían cisteína, prolina y codones de parada se descartaron automáticamente debido a la elevada probabilidad de que se tratara de una mutación que provocaría un plegamiento inadecuado. A continuación, los clones de ECD restantes se cribaron para determinar su unión a un anticuerpo no competitivo conformacionalmente específico. Se concluyó que los clones de ECD que habían perdido capacidad de unión a anticuerpos no competitivos conformacionalmente específicos contenían mutaciones que provocaban un plegamiento inadecuado, mientras que los clones de ECD que conservaban una unión equivalente a la del ECD de SEZ6 natural se plegaban de forma adecuada. Se concluyó que las mutaciones en los clones de ECD del último grupo se encontraban en el epítopo. También se construyeron modelos de homología de dominios aislados utilizando MODELLER para confirmar que los residuos identificados se encontraban en el epítopo: 1) estaban localizados cerca los unos de los otros en el modelo de homología plegado y 2) contenían cadenas laterales que estaban expuestas al disolvente, y no enterradas, ya que existe una probabilidad más elevada de que los residuos enterrados provoquen un plegamiento inadecuado y no es probable que formen parte del epítopo de unión. En la tabla 4 se muestra un resumen de los anticuerpos con sus epítopos.
TABLA 4
[0582] NR indica que no se asignó ninguna SEQ ID NO ya que los epítopos eran discontinuos.
[0583] En el caso de SC17.34, SC17.36 y SC17.46, se construyeron mutaciones puntuales en el dominio aislado, el Dominio Sushi 1, que se determinó que era el dominio de unión mediante el mapeo de los epítopos a nivel de dominios. En el caso de SC17.46, las mutaciones potenciales para el cribado no se identificaron en un cribado basado en colecciones; en cambio, se identificaron basándose en el mapeo de dominios, la carencia de reactividad cruzada con el ECD de SEZ6 de cinomolgo y el ECD de SEZ6 de rata, así como los alineamientos de secuencias de las diferentes especies para identificar diferencias en la secuencia primaria de cada especie. Estas mutaciones potenciales se sometieron al mismo análisis que los demás anticuerpos para confirmar el epítopo de SC17.46.
Ejemplo 11
Detección de la expresión en la superficie de SEZ6 mediante citometría de flujo
[0584] Se utilizó citometría de flujo para evaluar la especificidad de los anticuerpos anti-SEZ6 que se generaron para detectar la presencia de la proteína SEZ6 humana en la superficie de líneas celulares HEK-293T modificadas por ingeniería genética, que se construyeron tal como se ha descrito en el Ejemplo 5. Se emplearon controles de tinción de isotipos y de fluorescencia menos uno (FMO) para confirmar la especificidad de la tinción. Resumiendo, se disociaron células HEK-293T transducidas con SEZ6 y GFP humanas (remítase al Ejemplo 5) o muestras de tumores
NTX recogidas, y se dispersaron en una suspensión utilizando técnicas de digestión enzimática reconocidas en la materia (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 2007/0292414),
se incubaron durante 30 minutos con un anticuerpo anti-SEZ6. Las células se lavaron en PBS (2 % de FCS) dos veces y a continuación se incubaron con 50 pl por muestra de un fragmento Fc de anticuerpo anti-IgG de ratón producido en cabra marcado con DyLight 649 específico secundario diluido con un factor de 1:200 en tampón de PBS. Después de una incubación de 15 minutos, las células se lavaron dos veces con PBS, se volvieron a suspender en PBS con DAPI y se analizaron mediante citometría de flujo como se ha analizado previamente.
[0585] Como queda demostrado con los datos representativos que se muestran en la FIG.12A para SC17.33, el modulador de SEZ6 reconoció fuertemente las células HEK-293T-HuSEZ6. Estos datos demuestran que se produjeron moduladores que reconocían específicamente la proteína SEZ6 humana expresada sobre la superficie celular.
[0586] Se evaluó la expresión de la proteína SEZ6 humana sobre la superficie de tumores NTX seleccionados mediante citometría de flujo utilizando varios anticuerpos SC17 ilustrativos. La expresión de SEZ6 en LU37, LU86 y KDY66 se evaluó utilizando el anticuerpo SC17.6, mientras que la expresión de SEZ6 en LU50, LU100 y LU73 se evaluó utilizando los anticuerpos SC17.10, SC17.42 y SC17.28, respectivamente. Los resultados se exponen en la FIG. 13A. Los tumores NTX se recogieron, disociaron y tiñeron conjuntamente con los anticuerpos comercializados anti-CD45 de ratón, anti-H-2Kd de ratón, anti-EpCAM humana y uno de los anticuerpos anti-SEZ6 humana producidos en ratón descritos anteriormente. Los datos que se muestran en la FIG. 13A se generaron utilizando células que no presentaban una tinción positiva para los anticuerpos anti-ratón mencionados anteriormente pero que presentaban una tinción positiva para el anticuerpo anti-EpCAM humana. De forma similar a los experimentos de tinción de HEK-293T descritos anteriormente, se emplearon controles de tinción de isotipos y de fluorescencia menos uno (FMO) para confirmar la especificidad de la tinción. Como se observa en la FIG. 13A, la tinción anti-SEZ6 fue mayor que la de FMO en todas las células de tumores NTX, tal como indica el desplazamiento del perfil fluorescente hacia la derecha y los cambios en los valores de intensidad de fluorescencia media (MFI), para los tumores NTX de pulmón LU37, LU50 y LU86 y el tumor NTX de pulmón de riñón KDY66. Estos datos sugieren que la proteína SEZ6 se expresa en la superficie de varios tumores NTX y, por consiguiente, puede ser modulada utilizando un anticuerpo anti-SEZ6.
Ejemplo 12
Expresión de la proteína SEZ6 en varios tumores
[0587] Teniendo en cuenta los niveles elevados de transcrito de ARNm de SEZ6 asociados con varios tumores, se realizaron estudios para demostrar el correspondiente aumento en la expresión de la proteína SEZ6 en tumores NTX. La expresión de la proteína SEZ6 se detectó con (i) un ensayo ELISA de tipo sándwich para SEZ6 con electroquimioluminiscencia utilizando la plataforma de descubrimiento MSA (Meso Scale Discovery, lLc ); y (ii) tinción inmunohistoquímica.
[0588] Se extirparon tumores NTX de ratones y se congelaron rápidamente en nieve carbónica/etanol. Se añadió tampón para la extracción de proteínas (Biochain Institute, Inc.) a los trozos del tumor descongelados y los tumores se pulverizaron utilizando un sistema TissueLyser (Qiagen). Los lisados se separaron por centrifugación (20.000 g, 20 minutos, 4 °C) y se cuantificó la concentración de proteína total en cada lisado utilizando ácido bicinconínico (BCA). Los lisados proteicos se conservaron a -80 °C hasta su ensayo. Los lisados de tejido normal se adquirieron de Novus Biologicals.
[0589] Se determinaron las concentraciones de la proteína SEZ6 de las muestras de lisado interpolando los valores en una curva de concentración de proteína patrón que se generó utilizando proteína SEZ6 recombinante purificada (Ejemplo 5). La curva patrón de proteína SEZ6 y el ensayo de cuantificación de la proteína se llevaron a cabo como se indica a continuación:
Se recubrieron placas estándar de MSD durante una noche a 4 °C con 30 pl de anticuerpo SC17.17 con una concentración de 2 pg/ml en PBS. Las placas se lavaron con PBST y se bloquearon con 150 pl de solución de bloqueador A de MSD al 3 % durante una hora. Las placas se lavaron de nuevo con PBST. A continuación, el anticuerpo SC17.36 se conjugó con el sulfomarcador de MSD y se añadieron 25 pl del anticuerpo SC17.36 marcado a las placas lavadas con una concentración de 0,5 pg/ml en bloqueador A de MSD al 1 %. También se añadieron 25 pl de lisado diluido 10x en bloqueador A de MSD al 1 % o patrón de SEZ6 recombinante diluido en bloqueador A de MSD al 1 % que contenía un 10 % de tampón para la extracción de proteínas a los pocillos y se incubaron durante dos horas. Las placas se lavaron con PBSt . Se diluyó tampón de lectura T de MSD con tensioactivo hasta IX en agua y se añadieron 150 pl a cada pocillo. Las placas se leyeron con un lector Sector Imager 2400 de MSD que utilizaba un programa de análisis informático integrado para obtener las concentraciones de SEZ6 en las muestras NTX por interpolación a partir de la curva patrón. Posteriormente, los valores se dividieron por la concentración de proteína total para obtener los nanogramos de SEZ6 por miligramo de proteína total en el lisado. Las concentraciones resultantes se exponen en la FIG. 12B, donde cada punto representa concentraciones de la proteína SEZ6 obtenidas a partir de una única línea tumoral NTX. Aunque cada punto se obtiene a partir de una única línea NTX, en la mayoría de los casos se evaluaron múltiples muestras biológicas de la misma línea NTX y se calculó la media de los valores para
proporcionar el dato puntual.
[0590] La FIG. 12B muestra que, en comparación con lisados de tejidos normales, las muestras de tumores de riñón, ovario y LCNEC seleccionadas exhibieron una expresión moderada de la proteína SEZ6, mientras que la expresión más elevada de la proteína SEZ6 se observó en tumores SCLC. Todos los lisados de tejidos normales fueron negativos respecto a la expresión de la proteína SEZ6, con la excepción del lisado ocular y cerebral humano normal.
[0591] Se realizó un estudio inmunohistoquímico (IHC) en tumores PDX para confirmar que SEZ6 se expresaba en la superficie de ciertos tumores PDX, y para determinar la localización de la proteína SEZ6 en la arquitectura del tumor.
[0592] El estudio IHC se realizó en secciones de tejido embebidas en parafina y fijadas en formalina, utilizando un procedimiento de detección indirecta, que incluía un anticuerpo primario monoclonal murino anti-SEZ6 (clon 17.140), anticuerpos secundarios conjugados con biotina específicos de ratón, complejo de avidina/biotina acoplado con peroxidasa de rábano picante y detección de DAB (Nakene PK 1968; 16:557-60). Cuando se tiñeron tumores PDX de xenoinjerto, se utilizó un agente de bloqueo de IgG de ratón (Vector Laboratories; N.° de catálogo PK-2200). SC17.140 fue validado y se confirmó que era adecuado para el estudio IHC ya que mostró una tinción específica en secciones de los sedimentos de células HEK-293T que sobreexpresaban SEZ6 en comparación con los sedimentos de células HEK-293T sin tratar, que se prepararon como es habitual en la técnica. La especificidad se confirmó además mediante la señal competitiva con un exceso molar de 5 de la proteína SEZ6 recombinante purificada en células HEK-293T que sobreexpresaban SEZ6 humana y tumores de xenoinjerto que se demostró mediante IHC que expresaban SEZ6 (datos no mostrados). La FIG. 16 muestra la expresión de SEZ6, que se midió mediante IHC, en tumores NTX SCLC. Se otorgó una puntuación a la intensidad de la tinción, para tener en cuenta la intensidad de la tinción, desde 0 (negativa) hasta 3 (tinción fuerte). Los resultados muestran que un 64 % de los tumores NTX SCLC evaluados expresaron SEZ6.
[0593] Estos datos, combinados con los datos de la transcripción de ARNm para la expresión de SEZ6 expuestos anteriormente (Ejemplo 4) y la expresión proteica en la superficie celular de SEZ6 (Ejemplo 11), respaldan firmemente la teoría de que los determinantes de SEZ6 proporcionan dianas atractivas para la intervención terapéutica.
Ejemplo 13
Enriquecimiento de poblaciones de células iniciadoras de tumores
[0594] Las células tumorales se pueden dividir en términos generales en dos tipos de subpoblaciones celulares: células no tumorigénicas (NTG) y células iniciadores de tumores (TIC). Las TIC tienen la capacidad de formar tumores cuando se implantan en ratones inmunodeprimidos. Las células madre cancerosas (CSC) son un subconjunto de TIC y son capaces de autorreplicarse de forma indefinida a la vez que mantienen la capacidad para la diferenciación de múltiples linajes. Para determinar si la expresión de SEZ6 se podría correlacionar con una mayor tumorigenicidad, se realizaron ensayos de secuenciación del transcriptoma completo, citometría de flujo y tumorigenicidad, todos los cuales se describen a continuación.
[0595] Se llevó a cabo un análisis del transcriptoma completo para la expresión de SEZ6 en varias muestras tumorales tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las CSC se identificaron en función de la expresión de CD324, que se ha demostrado que es un marcador de células madre en varios tumores (véase la solicitud PCT 2012/031280). Los resultados de la FIG.6A muestran que la expresión del ARNm de SEZ6 era mayor en CSC en comparación con células NTG aisladas de dos líneas de tumores NTX SCLC (LU86 y LU95).
[0596] Se llevó a cabo una citometría de flujo en células procedentes de tumores de pulmón NTX esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo 11. Se tiñeron células LU86, LU117 y LU64 conjuntamente con CD324, un marcador de poblaciones CSC (véase la solicitud PCT 2012/031280), y el anticuerpo anti-SEZ6 SC17.10, SC17.28 o SC17.42, respectivamente, para determinar si SEZ6 se expresaba de forma diferente en esas poblaciones. Como se indica en la FIG. 13B, las células LU86, LU117 y LU64 que presentaron una tinción positiva tanto para CD324 como para SEZ6 (línea negra continua) se desplazaron más hacia la derecha que las células que presentaron una tinción positiva únicamente para SEZ6 (línea negra de puntos), lo que indica que SEZ6 se expresa más en CSC en comparación con la población de células NTG. El control de isotipo constitutivo de la población se muestra como un histograma de relleno gris (MOPC = IgG1).
[0597] Para determinar si la expresión de SEZ6 en la superficie celular se podría correlacionar con una mayor capacidad para generar tumores, se llevó a cabo un estudio de tumorigenicidad. Se disociaron muestras de tumores NTX y se dispersaron en suspensión utilizando técnicas de digestión enzimática reconocidas en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 2007/0292414). Las preparaciones celulares disociadas de estas líneas NTX se tiñeron con anticuerpos conjugados con restos fluorescentes que reconocían específicamente CD45 murina, H2kD, CD324 humana y SEZ6 humana, el clon SC17.42. Se aislaron dos subconjuntos de células humanas, ambos
identificados en función de la ausencia de tinción con H2kD o CD45 murina (para agotar los preparados celulares de células murinas), utilizando un citómetro de flujo FACSAria™ (BD Biosciences). Un subconjunto se aisló basándose en la expresión de CD324 y SEZ6, mientras que el otro subconjunto se aisló basándose en un fenotipo CD324+SEZ6-. Las subpoblaciones enriquecidas en los diferentes marcadores se trasplantaron posteriormente en ratones hembra inmunodeprimidos NOD/SCID mediante una inyección subcutánea en la masa de grasa mamaria con una dosis de aproximadamente 50 células por ratón.
[0598] Las FIGS. 14A y 14B ilustran los resultados de estos experimentos realizados utilizando líneas de células NTX representativas derivadas de tumores NSCLC obtenidos de pacientes. La FIG. 14A es un diagrama de dispersión (formado utilizando CD324 y SEZ6) que muestra la distribución del subconjunto mCD45-H2kD- del tumor original y posibles células tumorigiénicas clasificadas. La FIG. 14B muestra gráficamente el volumen del tumor medido obtenido a partir del implante de subpoblaciones de las células clasificadas en ratones inmunodeprimidos. Los valores entre paréntesis indican el número de tumores generados por ratón implantado.
[0599] Significativamente, los datos de la FIG. 14 muestran que la tumorigenicidad se asoció de forma uniforme con la subpoblación de células que expresaban SEZ6 junto con unos niveles elevados de CD324. En cambio, estos mismos datos demuestran que las células tumorales que no expresaban SEZ6 o que expresaban unos niveles bajos de SEZ6 eran mucho menos tumorigénicas que sus homologas positivas o con una expresión elevada. Basándose en los datos generados, se ha descubierto sorprendentemente que subpoblaciones de células tumorales que expresan el fenotipo CD324+SEZ6+ contienen en general la gran mayoría de capacidad tumorigénica y sugieren que SEZ6 podría proporcionar una diana terapéutica eficaz para la modulación de células tumorigénicas.
Ejemplo 14
Los moduladores de SEZ6 facilitan el suministro de
agentes citotóxicos a células HEK-293T que expresan SEZ6
[0600] Para demostrar que los moduladores de SEZ6 de la presente invención son capaces de mediar el suministro de un agente citotóxico a células vivas, se llevó a cabo un ensayo de destrucción celular in vitro utilizando moduladores de tipo anticuerpo de SEZ6 seleccionados unidos a la toxina saporina. La saporina destruye células mediante la desactivación de los ribosomas en el citoplasma. Por lo tanto, la muerte celular utilizando el siguiente ensayo es una indicación de que los anticuerpos de SEZ6 son capaces de internalizar y suministrar los agentes citotóxicos al citoplasma de una célula diana.
[0601] Un fragmento Fab de un anticuerpo anti-IgG de ratón unido covalentemente a saporina («Fab-Saporina») (Advanced Targeting Systems, #IT-48) se combinó con anticuerpos de SEZ6 no marcados y se incubó con células HEK-293T que expresaban SEZ6 (véase el Ejemplo 5). La capacidad de los complejos de saporina resultantes para internalizar y destruir células se midió 72 horas después midiendo la viabilidad celular.
[0602] Específicamente, se depositaron 500 células por pocillo en DMEM complementado con un 10 % de suero bovino fetal, en placas de 96 pocillos tratadas con cultivo tisular un día antes de la adición de los anticuerpos y la toxina. Las células HEK-293T que expresaban SEZ6 humana se trataron con un control (IgG1, IgG2a o IgG2b) o con moduladores de SEZ6 murinos purificados con una concentración de 100, 50 o 10 pM, junto con Fab-Saporina 2 nM. Las células se cultivaron durante tres días y, una vez transcurrido este tiempo, se enumeraron los números de células viables utilizando un instrumento Cell Titer Glo® (Promega) según las instrucciones del fabricante. Las unidades de luminiscencia sin procesar (RLU) utilizando cultivos que contenían células con el fragmento Fab y saporina se fijaron como valores de referencia del 100 % y todos los demás conteos se calcularon según esto (denominados «RLU normalizadas» o «% de células vivas»). La FIG. 15A muestra que muchos de los moduladores de SEZ6 evaluados mediaron la destrucción de células HEK-293T de un modo dependiente de la concentración. Los controles de isotipos (IgG2a, IgG2b y IgG1) no afectaron a los conteos celulares, tal como muestran los resultados en las primeras tres filas de la FIG. 15A (ND = no determinado).
[0603] Este ensayo demuestra que puede tener lugar la internalización cuando el anticuerpo específico para SEZ6 se une a la superficie celular, sin que sea necesaria la dimerización o reticulación adicional.
Ejemplo 15
Los moduladores de SEZ6 median la citotoxicidad en células de tumores de pulmón in v itro
[0604] Para corroborar los resultados del Ejemplo 14 y determinar si los moduladores de SEZ6 pueden mediar la internalización de toxinas y la destrucción celular de células tumorales humanas (en lugar de células modificadas por ingeniería genética), se depositaron en placas células NTX con linaje de ratón agotado y posteriormente fueron expuestas a anticuerpos anti-SEZ6 y Fab-saporina.
[0605] Se disociaron tumores NTX en una única suspensión celular y se depositaron en placas Primaria™ (BD Biosciences) en medio exento de suero complementado con factor de crecimiento como es habitual en la técnica. Tras cultivar las células durante un día a 37 °C/5 % de CO2/5 % de O2, estas se trataron con un control (IgG1, IgG2a o IgG2b) o un modulador de SEZ6 murina y Fab-saporina tal como se ha descrito en el Ejemplo 14. Después de siete días, se evaluó la citotoxicidad de la saporina mediada por el modulador mediante la cuantificación del número remanente de células vivas utilizando un instrumento Cell Titer Glo.
[0606] Como se observa en la FIG. 15B, es evidente que se produjo una reducción en el número de células tumorales cuando LU37 un tumor NSCLC, y LU80, un tumor SCLC, se expusieron a los moduladores de SEZ6 SC17.6 (duplicado de SC17.16) y SC17.33. De forma similar, cuando LU100, un tumor SCLC, se expuso a cuatro moduladores de SEZ6, SC17.6, SC17.19, SC17.33 y SC17.34, con una concentración de 50 y 500 pM, se produjo una reducción de las células tumorales. Por el contrario, los anticuerpos de control de isotipos no tuvieron ningún efecto sobre el número de células vivas después del tratamiento.
[0607] Estos datos no solo demuestran que los anticuerpos ilustrativos descritos en el presente documento son capaces de unirse al antígeno SEZ6 en la superficie celular y facilitar el suministro de una carga útil citotóxica que provoque la muerte celular, sino que los datos anteriores también demuestran que múltiples anticuerpos anti-SEZ6 pueden mediar la destrucción de varias células de tumores NTX.
Ejemplo 16
Preparación de conjugados de anticuerpo de SEZ6-fármaco
[0608] Basándose en los ensayos de destrucción in vitro con saporina de los Ejemplos 14 y 15 y para demostrar adicionalmente la versatilidad de la presente invención, se prepararon conjugados de anticuerpo anti-SEZ6-fármaco con la estructura M-[L-D] tal como se ha definido anteriormente. Es decir, se prepararon conjugados de anticuerpo anti-SEZ6-fármaco (SEZ6-ADC) utilizando agentes citotóxicos enlazados covalentemente. Más específicamente, se prepararon SEZ6-ADC que comprendían un conector como los descritos en el presente documento o en referencias que se mencionan justo a continuación y dímeros de pirrolobenzodiazepina (PBD) seleccionados que se enlazaron covalentemente a los moduladores descritos (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 2011/0256157 y 2012/0078028 y la Patente de Estados Unidos N.° 6.214.345).
[0609] Se sintetizaron combinaciones de fármaco PBD-conector y se purificaron utilizando técnicas reconocidas en la materia teniendo en cuenta las referencias citadas. Aunque se emplearon varios dímeros de PBD y conectores para fabricar las combinaciones de fármaco-conector seleccionadas, cada unidad conectora comprendía un resto maleimido terminal con un sulfhidrilo libre. Utilizando estos conectores, se prepararon conjugaciones mediante la reducción parcial del mAb con tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), seguida de la reacción de los residuos de Cys reducidos con la carga útil del maleimido del conector.
[0610] Más en particular, el modulador de tipo anticuerpo de SEZ6 seleccionado se redujo con 1,3 mol de TCEP por mol de mAb durante 2 h a 37 °C en Tris HCl 25 mM a pH 7,5 y tampón de EDTA 5 mM. La reacción se dejó enfriar hasta 15 °C y se añadió la carga útil del conector en DMSO con una tasa de 2,7 mol/mol de mAb seguida de una cantidad adicional de DMSO hasta una concentración final del 6 % (v/v). Se dejó que la reacción siguiera su curso durante 1 hora. El fármaco-conector sin reaccionar se desactivó mediante la adición de un exceso de N-acetilcisteína. A continuación, el SEZ6-ADC (o SC17-ADC) se purificó en una columna de intercambio iónico utilizando un sistema FPLC AKTA Explorer (G.E. Healthcare) para eliminar el anticuerpo de alto peso molecular agregado, el codisolvente y moléculas de bajo peso molecular. Posteriormente, el ADC eluido se sometió a un cambio de tampón por filtración de flujo tangencial (TFF) en tampón de formulación, a continuación se ajustó su concentración y se añadió un detergente. El ADC final se analizó para determinar la concentración proteica (por medición UV), la agregación (SEC), la proporción de fármaco respecto a anticuerpo (DAR) por HPLC en fase inversa (RP), la presencia de anticuerpo sin conjugar por HPLC con cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), los materiales no proteínicos por RP HPLC y la citotoxicidad in vitro utilizando una línea celular que expresaba SEZ6.
[0611] Utilizando el procedimiento mencionado anteriormente o una metodología sustancialmente similar, se generó una serie de ADC (es decir, M-[L-D]n) que comprendía diversos moduladores de SEZ6 y dímeros de PBD, y se evaluaron en diversos modelos in vivo e in vitro. A los efectos de estos Ejemplos y la presente exposición, tales ADC se pueden denominar en general SEZ6-ADC o SC17-ADC. Los ADC específicos se nombrarán según la denominación del anticuerpo (por ejemplo, SC17.17) y del conector-agente citotóxico específico ADC1, ADC2, etc. Así pues, los moduladores ilustrativos compatibles con la presente invención pueden comprender SC17.17-ADC1 o SC17.24-ADC2 donde ADC1 y ADC2 representan agentes citotóxicos que son dímeros de PBD individuales (y opcionalmente un conector).
[0612] A modo de referente inicial, se midió la citotoxicidad in vitro de hSC17.17-ADC1 para una CI50 de 11 nM cuando se expuso a células HEK293 que sobreexpresaban SEZ6 (no se muestran los datos).
Ejem plo 17
Los moduladores de SEZ6 conjugados median la citotoxicidad en células de tumores de pulmón in v itro [0613] Se evaluaron los ADC generados en el Ejemplo 16 anterior para determinar si eran capaces de mediar la internalización de toxinas y la destrucción celular de células tumorales humanas primarias in vitro.
[0614] Se expusieron células de tumores NTX con linaje de ratón agotado a ADC anti-SEZ6 o un control de isotipo de ratón (msIgG1) utilizando el mismo procedimiento que el descrito en el Ejemplo 15, excepto que no se añadió Fab-saporina. Cuando LU64, un tumor SCLC, y OV26, un tumor ovárico NET, se trataron con ADC anti-SEZ6 (SC17.24-ADC2, SC17.28-ADC2 y SC17.34-ADC2), se observó una mayor reducción en el porcentaje de células viables en comparación con el control msIgG1 (FIG 17A). A pesar de que msIgG1 puede ser citotóxico para las células en concentraciones elevadas, los tres ADC anti-SEZ6 evaluados fueron más potentes, lo cual indica que existe una respuesta inmunoespecífica frente a SEZ6 en lugar de una respuesta general a la citotoxina PBD.
Ejemplo 18
Los moduladores de SEZ6 conjugados suprimen el crecimiento tumoral in v ivo
[0615] Se evaluaron los ADC generados en el Ejemplo 16 anterior para demostrar su capacidad para reducir y suprimir el crecimiento de tumores NTX humanos en ratones inmunodeprimidos.
[0616] Se hicieron crecer subcutáneamente tumores NTX obtenidos a partir de pacientes en los costados de ratones receptores NOD/SCID hembra utilizando técnicas reconocidas en la materia. Se monitorizaron los volúmenes de los tumores y los pesos de los ratones dos veces por semana. Cuando los volúmenes de los tumores alcanzaron 150-250 mm3, los ratones se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento y se les inyectaron dosis de SC17-ADC1 o MsIgG1 anti-hapteno-ADC1 de control por vía intraperitoneal. Los ratones recibieron tres inyecciones de 1 mg/kg (que se indican con líneas verticales en la FIG. 17B y las FIGS. 18A y 18B) durante un periodo de siete días. Tras el tratamiento, se monitorizaron los volúmenes de los tumores y los pesos de los ratones hasta que los tumores superaron 800 mm3 o los ratones enfermaron.
[0617] La FIG. 17B muestra que los ADC anti-SEZ6 son capaces de inhibir in vivo el crecimiento de un tumor SCLC (LU86) y LCNEC (LU50) en ratones. En el caso de LU86, los cinco ADC evaluados (SC17.3-ADC1, SC17.24-ADC1, SC17.26-ADC1, SC17.28-ADC1 y SC17.34-ADC1) produjeron remisiones duraderas que se prolongaron, en algunos casos, más de 120 días después del tratamiento. En particular, el tratamiento con SC17.34-ADC1 inhibió el crecimiento tumoral durante el transcurso del estudio con esa dosis, mientras que SC17.24-ADC1 proporcionó una inhibición significativa del crecimiento tumoral con un periodo hasta que se produjo un avance de más de 50 días. De forma similar, el tratamiento de LU50 con cinco ADC ilustrativos (SC17.3-ADC1, SC17.17-ADC1, SC17.24-ADC1, SC17.34-ADC1 y SC17.46-ADC1) proporcionó una supresión del crecimiento tumoral que se prolongó hasta incluso 35 días con SC17.46 Además, los ratones tratados con SC17-ADC1 no exhibieron ningún efecto adverso para la salud aparte de los que se observan habitualmente en ratones NOD/SCID portadores de tumores inmunodeprimidos. Estos resultados sugieren que los ADC descritos se pueden utilizar para suprimir eficazmente el crecimiento tumoral y que las características particulares del modulador SC17 que se une pueden ejercer un impacto sobre la eficacia in vivo.
[0618] Más concretamente, la capacidad de varios moduladores conjugados para suprimir o ralentizar de forma drástica el crecimiento tumoral in vivo durante periodos prolongados valida adicionalmente el uso de SEZ6 como diana terapéutica para el tratamiento de trastornos proliferativos.
Ejemplo 19
Los moduladores de SEZ6 conjugados humanizados suprimen el crecimiento tumoral in v ivo
[0619] Teniendo en cuenta los excelentes resultados obtenidos con los moduladores ADC anti-SEZ6, se realizaron experimentos adicionales para demostrar la eficacia de moduladores ADC anti-SEZ6 humanizados ejemplares en el tratamiento de tumores SCLC in vivo. Se administraron moduladores ADC anti-SEZ6 humanizados seleccionados (utilizando los moduladores hSC17.17, hSC17.24, hSC17.34 y hSC17.46), producidos como se ha expuesto en el Ejemplo 16, y el ADC de control de isotipo de IgG1 humana (huIgG1) a ratones inmunodeprimidos portadores de varios tumores NTX. El régimen de dosificación fue el mismo que el expuesto en el Ejemplo 18.
[0620] Los resultados de estos experimentos se presentan en las FIGS. 18A y 18B. Se consiguió la eliminación completa y duradera de la masa tumoral mediante la administración de ADC anti-SEZ6 humanizados en cuatro tumores SCLC. La FIG. 18A muestra la reducción del tumor LU80 por hSC17.17-ADC1 y hSC17.46-ADC1; y la eliminación del tumor LU64 por hSC17.17-ADC1, hSC17.34-ADC1 y hSC17.46-ADC1. La FIG. 18B muestra la reducción del tumor LU117 por hSC17.17-ADC1 y hSC17.46-ADC1; y la reducción del tumor LU111 por hSC17.34-ADC1 y hSC17.46-ADC1. Se observó ausencia de recidiva del tumor durante más de 50 días en 3 de los 4 estudios
Claims (14)
1. Un anticuerpo monoclonal que se une a una proteína SEZ6 humana y comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, donde el anticuerpo comprende:
(a) los residuos 24-34 de SEQ ID NO: 172 para CDR-L1, los residuos 50-56 de SEQ ID NO: 172 para CDR-L2, los residuos 89-97 de SEQ ID NO: 172 para CDR-L3, los residuos 31-35 de SEQ ID NO: 173 para CDR-H1, los residuos 50-65 de SEQ ID NO: 173 para CDR-H2 y los residuos 95-102 de SEQ ID NO: 173 para CDR-H3, donde los residuos se numeran según Kabat;
(b) los residuos 23-34 de SEQ ID NO: 172 para CDR-L1, los residuos 50-56 de SEQ ID NO: 172 para CDR-L2, los residuos 89-97 de SEQ ID NO: 172 para CDR-L3, los residuos 26-32 de SEQ ID NO: 173 para CDR-H1, los residuos 50-58 de SEQ ID NO: 173 para CDR-H2 y los residuos 95-102 de SEQ ID NO: 173 para CDR-H3, donde los residuos se numeran según Chothia; o
(c) los residuos 30-36 de SEQ ID NO: 172 para CDR-L1, los residuos 46-55 de SEQ ID NO: 172 para CDR-L2, los residuos 89-96 de SEQ ID NO: 172 para CDR-L3, los residuos 30-35 de SEQ ID NO: 173 para CDR-H1, los residuos 47-58 de SEQ ID NO: 173 para CDR-H2 y los residuos 93-101 de SEQ ID NO: 173 para CDR-H3, donde los residuos se numeran según MacCallum.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena ligera expuesta como la SEQ ID NO: 172 y una región variable de cadena pesada expuesta como la SEQ ID NO: 173.
3. Un anticuerpo monoclonal que se une a una proteína SEZ6 humana y comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, donde el anticuerpo comprende:
(a) los residuos 24-34 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L1, los residuos 50-56 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L2, los residuos 89-97 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L3, los residuos 31-35 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H1, los residuos 50-65 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H2 y los residuos 95-102 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H3, donde los residuos se numeran según Kabat;
(b) los residuos 23-34 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L1, los residuos 50-56 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L2, los residuos 89-97 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L3, los residuos 26-32 de SEQ ID NO: 191 para Cd R-H1, los residuos 50-58 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H2 y los residuos 95-102 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H3, donde los residuos se numeran según Chothia; o
(c) los residuos 30-36 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L1, los residuos 46-55 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L2, los residuos 89-96 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L3, los residuos 30-35 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H1, los residuos 47-58 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H2 y los residuos 93-101 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H3, donde los residuos se numeran según MacCallum.
4. El anticuerpo según la reivindicación 3, que comprende una región variable de cadena ligera expuesta como la SEQ ID NO: 190 y una región variable de cadena pesada expuesta como la SEQ ID NO: 191.
5. El anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dicho anticuerpo comprende un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo quimérico, anticuerpo con injertos de CDR, anticuerpo humanizado, anticuerpo multiespecífico, anticuerpo biespecífico, anticuerpo monovalente, anticuerpo multivalente, fragmento Fab, fragmento F(ab')2, fragmento Fv y fragmento ScFv.
6. Un ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pesada de aminoácidos y una región variable de cadena ligera de aminoácidos de un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Un vector o una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico de la reivindicación 6.
8. Un conjugado anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo monoclonal conjugado con un agente citotóxico, donde el anticuerpo comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
9. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 8, donde el conjugado anticuerpo-fármaco comprende la fórmula: M-[L-D]n, donde:
a) M comprende el anticuerpo monoclonal;
b) L comprende un conector opcional;
c) D comprende un fármaco, que es el agente citotóxico; y
d) n es un número entero de 1 a 20.
10. El conjugado anticuerpo-fármaco de la reivindicación 8 o 9, donde el agente citotóxico comprende una pirrolobenzodiazepina, una duocarmicina, una amanitina, una auristatina, un maitansinoide, una caliqueamicina, o un radioisótopo.
11. Una composición farmacéutica que comprende el conjugado anticuerpo-fármaco de una cualquiera de las reivindicaciones 8-10.
12. El conjugado anticuerpo-fármaco según una cualquiera de las reivindicaciones 8-10 para su uso en el tratamiento del cáncer.
13. El conjugado anticuerpo-fármaco para su uso según la reivindicación 12, donde el uso es para el tratamiento de cáncer suprarrenal, cáncer de vejiga, cáncer de cuello del útero, cáncer de endometrio, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata o cáncer de mama en un paciente.
14. El conjugado anticuerpo-fármaco para su uso según la reivindicación 12, donde el uso es para el tratamiento de cáncer de pulmón microcítico en un paciente.
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