BR112014020816B1 - Anticorpos monoclonais anti-sez6, conjugado anticorpo-fármaco e composições farmacêuticas - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS ANTI-SEZ6, SEU USO, SUAS COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, CONJUGADO ANTICORPO- FÁRMACO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA E ÁCIDO NUCLEICO. São fornecidos novos moduladores de SEZ6, incluindo anticorpos dos mesmos e derivados, ácidos nucleicos codificando os mesmos, células hospedeiras compreendendo os referidos ácidos nucleicos, conjugado anticorpo-fármaco, bem como uso dos referidos moduladores na fabricação de medicamentos para tratar distúrbios proliferativos e os referidos medicamentos.

Description

Pedidos Cruzados

[001] Esse pedido reivindica a prioridade do Pedido de Patente Provisória dos E.U.A. No. 61/603, 203 depositado em 24 de fevereiro, 2012, incorporado aqui por referência na sua totalidade.

Listagem de Sequências

[002] O presente pedido contém uma listagem de sequências que foi submetida em formato ASCII através de EFS-Web e é aqui incorporada por referência na sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 19 de fevereiro, 2013, é denominada 11200.0014-00304 e tem 450.013 bytes de tamanho.

Área da Invenção

[003] Este pedido se relaciona geralmente com novos compostos, composições e métodos de seu uso no diagnóstico, prevenção, tratamento ou melhorias de distúrbios proliferativos e qualquer sua expansão, recorrência, recaída ou metástase. Em um aspeto amplo, a presente invenção se relaciona com o uso de moduladores do homólogo 6 relacionados com convulsões (SEZ6), incluindo anticorpos anti-SEZ6 e constructos de fusão, para o tratamento, diagnóstico ou profilaxia de distúrbios neoplásicos. Modalidades selecionadas da presente invenção proporcionam o uso de tais moduladores de SEZ6, incluindo conjugados anticorpo-fármaco, para o tratamento imunoterapêutico de malignidades compreendendo preferencialmente uma redução da frequência de células iniciadoras de tumor.

Antecedentes da Invenção

[004] A diferenciação de células-tronco e genitoras e proliferação celularsão processos em curso normais que atuam em conjunto para apoiar o crescimento de tecidos durante a organogênese e substituição celular e reparação da maioria dos tecidos durante o tempo de vida de todos os organismos vivos. No decurso normal de eventos, a diferenciação e proliferação celulares são controladas por numerosos fatores e sinais que são geralmente equilibrados para manter decisões sobre o destino das células e arquitetura dos tecidos. Assim, em grande medida, este é o microambiente controlado que regula a divisão celular e a maturação dos tecidos onde sinais são apropriadamente gerados com base nas necessidades do organismo. A este respeito, a proliferação e diferenciação celulares ocorrem normalmente somente como necessário para a substituição de células danificadas ou a morrer ou para crescimento. Infelizmente, a disrupção da proliferação e/ou diferenciação celulares pode resultar de uma miríade de fatores incluindo, por exemplo, a sub ou sobreabundância de vários químicos sinalizadores, a presença de microambientes alterados, mutações genéticas ou alguma sua combinação. Quando as proliferação e/ou diferenciação celulares são perturbadas ou de algum modo interrompidas, podem levar a várias doenças ou distúrbios incluindo distúrbios proliferativos tais como câncer.

[005] Tratamentos convencionais para câncer incluem quimioterapia, radioterapia, cirurgia, imunoterapia (p.ex., modificadores da resposta biológica, vacinas ou terapêuticos dirigidos) ou suas combinações. Infelizmente, certos cânceres não respondem ou respondem minimamente a tais tratamentos. Por exemplo, em alguns pacientes, os tumores exibem mutações de genes que os tornam não responsivos apesar da eficácia geral de terapias selecionadas. Além do mais, dependendo do tipo de câncer e que forma ele toma, alguns tratamentos disponíveis, tais como cirurgia, podem não ser alternativas viáveis. Limitações inerentes no padrão corrente de terapêuticos de cuidado são particularmente evidentes quando se tenta tratar pacientes que foram submetidos a tratamentos prévios e subsequentemente recaíram. Em tais casos, os regimes terapêuticos falhados e deterioração do paciente resultantes podem contribuir para tumores refratários que se manifestam frequentemente como uma doença relativamente agressiva que em última análise prova ser incurável. Embora tenham havido grandes melhorias no diagnóstico e tratamento do câncer ao longo dos anos, as taxas de sobrevivência globais para muitos tumores sólidos têm permanecido grandemente inalteradas devido à falha de terapias existentes em prevenirem recaída, recorrência e metástases do tumor. Assim, permanece um desafio desenvolver terapias mais dirigidas e potentes para distúrbios proliferativos.

Sumário da Invenção

[006] A presente invenção refere-se a métodos, compostos, composições e artigos de fabricação que podem ser usados no tratamento de distúrbios associados a SEZ6 (p.ex., distúrbios proliferativos ou distúrbios neoplásicos). Para esse fim, a presente invenção proporciona novos moduladores do homólogo 6 relacionado com convulsões (ou SEZ6) que se dirigem eficazmente a células do tumor e/ou células-tronco do câncer e podem ser usados para tratar pacientes sofrendo de uma ampla variedade de malignidades. Como será discutido em mais detalhe aqui, existem pelo menos duas isoformas ou variantes de SEZ6 que ocorrem naturalmente e os moduladores divulgados podem compreender ou se associar seletivamente com uma isoforma ou a outra ou com ambas. Além do mais, em certas modalidades, os moduladores de SEZ6 divulgados podem adicionalmente reagir com um ou mais membros da família de SEZ (p.ex., SEZ6L ou SEZ6L2) ou, em outras modalidades, podem ser gerados e selecionados de modo a se associarem ou reagirem com isoforma(s) de SEZ6. Em qualquer caso, os moduladores podem compreender qualquer composto que reconheça, compita, agonize, antagonize, interatue, se ligue ou se associe com um gene ou polipeptídeo de SEZ6 (ou seu fragmento) e module, ajuste, altere, mude ou modifique o impacto da proteína SEZ6 em uma ou mais vias fisiológicas. Assim, em um sentido mais amplo, a presente invenção está geralmente dirigida a moduladores de SEZ6 isolados e seus usos. Em modalidades preferenciais, a invenção é mais particularmente dirigida a moduladores SEZ6 isolados compreendendo anticorpos (i.e., anticorpos que se ligam imunopreferencialmente, reagem com ou se associam com pelo menos uma isoforma de SEZ6) que, em modalidades particularmente preferenciais, estão associados a ou conjugados com um ou mais agentes citotóxicos. Além do mais, como discutido extensivamente em baixo, tais moduladores podem ser usados para proporcionar composições farmacêuticas úteis para a profilaxia, diagnóstico ou tratamento de distúrbios proliferativos.

[007] Em modalidades selecionadas da invenção, os moduladores de SEZ6 podem compreender um polipeptídeo de SEZ6 ou seus fragmentos, em uma forma isolada ou fundido ou associado com outras frações (p.ex., Fc-SEZ6, PEG-SEZ6 ou SEZ6 associado a uma porção dirigida). Em outras modalidades selecionadas, os moduladores de SEZ6 podem compreender antagonistas de SEZ6 que, para os propósitos do presente pedido, devem ser considerados como significando qualquer constructo ou composto que reconhece, compete, interatua, se liga ou se associada com SEZ6 e neutraliza, elimina, reduz, sensibiliza, reprograma, inibe ou controla o crescimento de células neoplásicas incluindo células iniciadoras de tumor. Em modalidades preferencial, os moduladores de SEZ6 da presente invenção compreendem anticorpos anti-SEZ6, ou seus fragmentos ou derivados, que se descobriu inesperadamente que silenciam, neutralizam, reduzem, diminuem, esgotam, moderam, diminuem, reprogramam, eliminam, ou de outro modo inibem a capacidade das células iniciadoras de tumor de propagarem, manterem, expandirem, proliferarem ou de outro modo facilitarem a sobrevivência, recorrência, regeneração e/ou metastização de células neoplásicas. Em modalidades particularmente preferenciais, os anticorpos ou fragmentos imunorreativos podem ser associados a, ou conjugados com, um ou mais agentes anticâncer (p.ex., um agente citotóxico).

[008] No que diz respeito a tais moduladores, será apreciado que os anticorpos compatíveis podem tomar qualquer uma de um número de formas incluindo, por exemplo, anticorpos policlonais e monoclonais, anticorpos quiméricos, enxertados com CDR, humanizados e humanos e fragmentos e/ou variantes imunorreativos de cada um dos acima. Modalidades preferenciais compreenderão anticorpos que são relativamente não imunogênicos tais como constructos humanizados ou completamente humanos. Obviamente, tendo em vista a presente divulgação, aqueles peritos na técnica poderiam prontamente identificar uma ou mais regiões determinadoras da complementaridade (CDRs) associadas a regiões variáveis da cadeia pesada e leve de moduladores de anticorpo de SEZ6 e usar essas CDRs para construir ou fabricar anticorpos quiméricos, humanizados ou enxertados com CDR sem experimentação indevida. Conformemente, em certas modalidades preferenciais, o modulador de SEZ6 compreende um anticorpo que incorpora uma ou mais CDRs como definido nas FIGS. 10A e 10B e derivadas das regiões variáveis de murino de cadeia contígua leve (FIG. 10A) ou pesada (FIG. 10B) (SEQ ID NOS: 20-169) apresentadas aqui. Tais regiões variáveis enxertadas com CDR com um enquadramento humano e suas variantes são também mostradas na FIG. 10 compreendendo SEQ ID NOS: 170-199. Em modalidades preferenciais, tais anticorpos compreenderão anticorpo monoclonais e, em modalidades mais preferenciais, compreenderão anticorpos quiméricos, enxertados com CDR ou humanizados.

[009] Sequências de ácido nucleico exemplares codificando cada uma das sequências de aminoácidos apresentadas nas FIGS. 10A e 10B são anexadas na listagem de sequências e compreendem SEQ ID NOS: 220 a 399. A este respeito, será apreciado que a invenção compreende adicionalmente moléculas de ácido nucleico (e constructos, vetores e células hospedeiras associados) codificando sequências de aminoácidos de regiões variáveis de anticorpos divulgadas incluindo aquelas apresentadas na listagem de sequências anexada.

[0010] Mais particularmente, em modalidades selecionadas, os moduladores de SEZ6 compatíveis podem compreender um anticorpo tendo uma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada em que a referida região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos como apresentadas em SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166 e SEQ ID NO: 168 e em que a referida região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos como apresentadas em SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167 e SEQ ID NO: 169. Em outras modalidades preferenciais, os moduladores selecionados compreenderão regiões variáveis da cadeia pesada e leve que compreendem 65, 70, 75 ou 80 % de identidade com as sequências de murino acima mencionadas. Ainda em outras modalidades preferenciais, os moduladores compreenderão regiões variáveis da cadeia pesada e leve que compreendem 85, 90 ou mesmo 95 % de identidade com as sequências de murino divulgadas.

[0011] Obviamente, tendo em vista a presente divulgação, aqueles peritos na técnica poderiam prontamente identificar CDRs associadas com cada uma das anteriormente mencionadas regiões variáveis da cadeia pesada e leve e usar essas CDRs para construir ou fabricar anticorpos quiméricos, humanizados ou enxertados com CDR sem experimentação indevida. Como tal, em modalidades selecionadas, a presente invenção dirige-se a anticorpos anti-SEZ6 compreendendo uma ou mais CDRs de uma sequência de região variável apresentadas na FIG. 10A ou FIG. 10B. Em modalidades preferenciais, tais anticorpos compreenderão anticorpos monoclonais e, em modalidades mais preferenciais, compreenderão anticorpos quiméricos, enxertados com CDR ou humanizados. Como discutido em maior detalhe embaixo, outras modalidades compreendendo ainda tais anticorpos conjugados ou associados com um ou mais agentes citotóxicos.

[0012] Outro aspeto da invenção compreende moduladores obtidos ou derivados de SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10, SC17.11, SC17.14, SC17.15, SC17.16, SC17.17, SC17.18, SC17.19, SC17.22, SC17.24, SC17.27, SC17.28, SC17.29, SC17.30, SC17.32, SC17.34, SC17.35, SC17.36, SC17.38, SC17.39, SC17.40, SC17.41, SC17.42, SC17.45, SC17.46, SC17.47, SC17.49, SC17.50, SC17.53, SC17.54, SC17.56, SC17.57, SC17.59, SC17.61, SC17.63, SC17.71, SC17.72, SC17.74, SC17.76, SC17.77, SC17.79, SC17.81, SC17.82, SC17.84, SC17.85, SC17.87, SC17.89, SC17.90, SC17.91, SC17.93, SC17.95, SC17.97, SC17.99, SC17.102, SC17.114, SC17.115, SC17.120, SC17121, SC17.122, SC17.140, SC17.151, SC17.156, SC17.161, SC17.166, SC17.187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 e SC17.200.

[0013] Ainda em outras modalidades compatíveis, a presente invenção compreenderá os moduladores SEZ6 enxertados com CDR ou humanizados hSC17.16, hSC17.17, hSC17.24, hSC17.28, SC17.34, hSC17.46, SC17.151, SC17.155, SC17.156, SC17.161 e SC17.200. Outras modalidades ainda são dirigidas a um modulador de SEZ6 compreendendo um anticorpo humanizado em que o referido anticorpo humanizado compreende uma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada em que a referida região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos como apresentadas em SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188 e SEQ ID NO: 190 e em que a referida região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60 % de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos como apresentadas em SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179 e SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189 e SEQ ID NO: 191. Além disso, certas variantes humanas de regiões variáveis da cadeia leve (SEQ ID NO: 192) e pesada (SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198 e SEQ ID NO: 199) são providenciadas de acordo com os ensinamentos aqui. Além do mais, como descrito imediatamente acima, as sequências de ácido nucleico codificando as regiões variáveis da cadeia pesada e leve humanizadas exemplificadas são apresentadas na listagem de sequências aqui anexada como SEQ ID NOS: 370 - 399.

[0014] Para além dos aspetos acima mencionados, outras modalidades preferenciais da presente invenção compreenderão moduladores de SEZ6 associados a ou conjugados com um ou mais fármacos para proporcionar conjugados de moduladores que podem ser particularmente eficazes no tratamento de distúrbios proliferativos (sozinhos ou em combinação com outros agentes farmaceuticamente ativos). Mais geralmente, logo que os moduladores da invenção forem fabricados e selecionados, eles podem ser ligados com, fundidos com, conjugados com (p.ex., covalentemente ou não covalentemente) ou de outro modo associados a frações farmaceuticamente ativas ou de diagnóstico ou modificadores biocompatíveis. Como usado aqui, o termo "conjugado" ou "conjugado de modulador" ou "conjugado de anticorpo" será usado amplamente e considerado como significando qualquer molécula ou fármaco biologicamente ativo ou detectável associado aos moduladores divulgados independentemente do método de associação. A este respeito, será entendido que tais conjugados podem, adicionalmente aos moduladores divulgados, compreender peptídeos, polipeptídeos, proteínas, pró-fármacos que são metabolizados em um agente ativo in vivo, polímeros, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequenas, agentes de ligação, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgânicas, moléculas orgânicas e radioisótopos. Além do mais, como indicado acima, o conjugado selecionado pode estar covalentemente ou não covalentemente associado ao, ou ligado ao, modulador e exibir várias razões molares estequiométricas dependendo, pelo menos em parte, do método usado para efetuar a conjugação.

[0015] Aspetos particularmente preferenciais da presente invenção compreenderão conjugados anticorpo-modulador ou conjugados anticorpo-fármaco que podem ser usados para o diagnóstico e/ou tratamento de distúrbios proliferativos. Tais conjugados podem ser representados pela fórmula M-[L-D]n onde M significa um modulador ou porção de ligação alvo divulgado, L é um ligante ou unidade ligante opcional, D é um fármaco ou pró-fármaco compatível e n é um inteiro de cerca de 1 a cerca de 20. Será apreciado que, a não ser que ditado de outro modo pelo contexto, os termos "conjugado anticorpo-fármaco" ou "ADC" ou a fórmula M-[L-D]n devem ser considerados como englobando conjugados compreendendo frações terapêuticas e de diagnóstico. Em tais modalidades, os compostos conjugados anticorpo-fármaco compreenderão tipicamente anti-SEZ6 como a unidade moduladora (M), uma porção terapêutica ou de diagnóstico (D), e opcionalmente um ligante (L) que une o fármaco e o agente de ligação do antigênio. Em uma modalidade preferencial, o anticorpo é um mAb de SEZ6 compreendendo pelo menos uma CDR das regiões variáveis da cadeia leve e pesada como descrito acima.

[0016] Como previamente indicado, um aspeto da invenção pode compreender a associação inesperada de polipeptídeos SEZ6 com células-tronco do câncer. Assim, em certas modalidades, a invenção compreenderá um modulador de SEZ6 que reduz a frequência de células iniciadores de tumor após administração a um sujeito. Preferencialmente, a redução na frequência será determinada usando análise de diluição limitante in vitro ou in vivo. Em modalidades particularmente preferenciais, tal análise pode ser conduzida usando análise de diluição limitante in vivo compreendendo transplante de células de tumor humano vivas em camundongos imunocomprometidos. Alternativamente, a análise de diluição limitante pode ser conduzida usando análise de diluição limitante in vitro compreendendo deposição de diluição limitante de células de tumor humano vivas em condições apoiando colônias in vitro. Em qualquer um dos casos, a análise, cálculo ou quantificação da redução na frequência compreenderá preferencialmente o uso de estatística de distribuição de Poisson para proporcionar uma contabilização precisa. Será apreciado que, embora tais métodos de quantificação sejam preferenciais, outra metodologia com menos trabalho intensivo como citometria de fluxo ou imunohistoquímica pode ser também usada para proporcionar os valores desejados e, conformemente, são expressamente contempladas como estando dentro do escopo da presente invenção. Em tais casos, a redução na frequência pode ser determinada usando análise de citometria de fluxo ou detecção imunohistoquímica de marcadores da superfície de células do tumor que se sabe que enriquecem quanto a células iniciadoras de tumor.

[0017] Como tal, outra modalidade preferencial da presente invenção compreende um método de tratamento de um distúrbio associado a SEZ6 compreendendo administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um modulador de SEZ6 a um sujeito com sua necessidade pela qual a frequência de células iniciadoras de tumor é reduzida. Preferencialmente, o distúrbio associado a SEZ6 compreende um distúrbio neoplásico. Novamente, a redução na frequência de células iniciadoras de tumor será preferencialmente determinada usando análise de diluição limitante in vitro ou in vivo.

[0018] A este respeito, será apreciado que a presente invenção é baseada, pelo menos em parte, na descoberta de que os imunogênios de SEZ6 estão associados a células perpetuadoras de tumor (i.e., células-tronco do câncer) que estão envolvidas na etiologia de várias neoplasias. Mais especificamente, o presente pedido demonstra inesperadamente que a administração de vários moduladores de SEZ6 exemplares pode mediar, reduzir, esgotar, inibir ou eliminar sinalização tumorigênica por células iniciadoras de tumor (i.e., reduz a frequência de células iniciadoras de tumor). Esta sinalização reduzida, quer por esgotamento, neutralização, redução, eliminação, reprogramação ou silenciamento das células iniciadoras de tumor ou por modificação da morfologia das células de tumor (p.ex., diferenciação induzida, disrupção de nicho) permite por seu turno um tratamento mais eficaz de distúrbios associados a SEZ6 por inibição da tumorigênese, manutenção do tumor, expansão e/ou metastização e recorrência.

[0019] Para além da associação acima mencionada a células- tronco do câncer, existe evidência de que as isoformas de SEZ6 podem estar implicadas no crescimento, recorrência ou potencial metastático de tumores compreendendo características neuroendócrinas. Para os propósitos da presente invenção, tais tumores compreenderão tumores neuroendócrinos e pseudotumores neuroendócrinos. A intervenção na proliferação de tais células tumorigênicas usando os novos moduladores de SEZ6 descritos aqui pode de este modo melhorar ou tratar um distúrbio por mais do que um mecanismo (i.e., redução das células iniciadoras de tumor e disrupção da sinalização da via oncogênica) para proporcionar efeitos aditivos ou sinérgicos. Ainda outras modalidades preferenciais podem tirar vantagem da internalização celular de SEZ6 da superfície celular para distribuir um agente anticâncer mediado por modulador. A este respeito, será apreciado que a presente invenção não está limitada por qualquer mecanismo particular de ação, mas ao invés engloba o amplo uso dos moduladores divulgados para tratar distúrbios associados a SEZ6 (incluindo várias neoplasias).

[0020] Assim, em outras modalidades, a presente invenção compreenderá o uso dos moduladores divulgados para tratar tumores compreendendo características neuroendócrinas em um sujeito com sua necessidade. Obviamente, os mesmos moduladores podem ser usados para a profilaxia, prognóstico, diagnóstico, teragnóstico, inibição ou terapia de manutenção destes mesmos tumores.

[0021] Outras facetas da presente invenção exploram a capacidade dos moduladores divulgados de potencialmente perturbarem as vias oncogênicas enquanto silenciam simultaneamente células iniciadoras do tumor. Tais moduladores de SEZ6 multiativos (p.ex., antagonistas de SEZ6) podem provar serem particularmente eficazes quando usados em combinação com agentes anticâncer ou agentes pré-compactação de padrão de assistência. Conformemente, modalidades preferenciais da presente invenção compreendem uso dos moduladores divulgados como agentes antimetastáticos para terapia de manutenção após tratamentos iniciais. Adicionalmente, dois ou mais antagonistas de SEZ6 (p.ex., anticorpos que se ligam especificamente a dois epítopos discretos de SEZ6) podem ser usados em combinação de acordo com os presentes ensinamentos. Além do mais, como discutido em mais detalhe em baixo, os moduladores de SEZ6 da presente invenção podem ser usados em um estado conjugado ou não conjugado e, opcionalmente, como um agente sensibilizante em combinação com uma variedade de agentes anticâncer químicos ou biológicos.

[0022] Conformemente, outra modalidade preferencial da presente invenção compreende um método de sensibilização de um tumor em um sujeito para tratamento com um agente anticâncer compreendendo o passo de administração de um modulador de SEZ6 ao referido sujeito. Outras modalidades compreendem um método de redução das metástases ou recorrência do tumor após tratamento compreendendo administração de um modulador de SEZ6 a um sujeito com sua necessidade. Em um aspeto particularmente preferencial da invenção, o modulador de SEZ6 irá especificamente resultar em uma redução da frequência de células iniciadoras de tumor como determinado usando análise de diluição limitante in vitro ou in vivo.

[0023] Modalidades mais geralmente preferenciais da invenção compreendem um método de tratamento de um distúrbio associado a SEZ6 em um sujeito com sua necessidade compreendendo o passo de administração de um modulador de SEZ6 ao sujeito. Em modalidades particularmente preferenciais, o modulador de SEZ6 estará associado a (p.ex., conjugado com) um agente anticâncer. Ainda em outras modalidades, o modulador de SEZ6 internalizará após associação ou ligação a SEZ6 na ou próximo da superfície da célula. Além do mais, os aspetos benéficos da presente invenção, incluindo qualquer disrupção de vias de sinalização e benefícios colaterais, podem ser alcançados se o tecido de tumor alvo exibir níveis elevados de SEZ6 ou níveis reduzidos ou deprimidos de SEZ6 em comparação com tecido adjacente normal. Modalidades particularmente preferenciais compreenderão o tratamento de distúrbios exibindo níveis elevados de SEZ6 em células tumorigênicas em comparação com tecido normal ou células não tumorigênicas.

[0024] Ainda em outro aspeto, a presente invenção compreenderá um método de tratamento de um sujeito sofrendo de um distúrbio neoplásico compreendendo o passo de administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um modulador de SEZ6 internalizante. Modalidades preferenciais compreenderão a administração de moduladores de anticorpo internalizantes em que, em outras modalidades selecionadas, os moduladores de anticorpos internalizantes estão conjugados com ou associados a um agente citotóxico.

[0025] Outras modalidades estão dirigidas a um método de tratamento de um sujeito sofrendo de um distúrbio associado a SEZ6 compreendendo o passo de administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um modulador de SEZ6 esgotante.

[0026] Ainda em outra modalidade, a presente invenção proporciona métodos de terapia de manutenção em que os efetores ou moduladores divulgados são administrados ao longo de um período de tempo após um procedimento inicial (p.ex., quimioterapêutica, radiação ou cirurgia) desenhado para remover pelo menos uma porção da massa de tumor. Tais regimes terapêuticos podem ser administrados ao longo de um período de semanas, um período de meses ou mesmo um período de anos em que os moduladores de SEZ6 podem atuar profilaticamente para inibir as metástases e/ou recorrência do tumor. Ainda em outras modalidades, os moduladores divulgados podem ser administrados em conjunto com regimes de pré- compactação conhecidos para prevenir ou retardar as metástases, manutenção ou recorrência do tumor.

[0027] Será de seguida apreciado que os moduladores de SEZ6 da presente invenção podem ser gerados e selecionados para reagirem com isoforma(s) conhecidas de SEZ6 ou uma isoforma única da proteína ou, reciprocamente, podem compreender um modulador pan-SEZ6 que reage com ou se associa a pelo menos um membro adicional da família de SEZ6 (por exemplo, SEZ6L ou SEZ6L2) adicionalmente ao SEZ6 . Mais especificamente, como aqui revelado, moduladores preferenciais tais como anticorpos podem ser gerados e selecionados de forma a que eles reajam com domínios (ou epítopos neles) que são exibidos por SEZ6 somente ou com domínios que estão pelo menos algo conservado ao longo de dois ou mais dos membros da família de SEZ6.

[0028] Ainda em outras modalidades preferenciais, os moduladores se associarão ou se ligarão a um epítopo, porção, motivo ou domínio específico de SEZ6. Como será discutido em algum detalhe em baixo, ambas as isoformas de SEZ6 incorporam uma região extracelular idêntica (ver FIG. 1E) compreendendo pelo menos um domínio N-terminal, dois domínios alternados Sushi e CUB, e três pares adicionais de repetições de domínio Sushi. Além disso, a proteína SEZ6 compreende um domínio de transmembrana e um domínio citoplásmico. Em conformidade, em certas modalidade os moduladores irão ligar-se ou associar-se ao domínio N-terminal de SEZ6 (i.e., aminoácidos 1-335 na proteína madura) ou a um epítopo nela. Outros aspetos da presente invenção compreendem moduladores que se associam ou ligam a um epítopo específico localizado em um domínio Sushi particular de SEZ6. A este respeito, o modulador particular pode se associar ou ligar a um epítopo localizado em domínio Sushi 1 (aminoácidos 336-395), domínio Sushi 2 (aminoácidos 511-572), domínio Sushi 3 (aminoácidos 690-748), domínio Sushi 4 (aminoácidos 750-813), ou domínio Sushi 5 (aminoácidos 817-878). Outros aspetos da presente invenção compreendem moduladores que se associam ou ligam a um epítopo específico localizado em um domínio tipo CUB particular de SEZ6. A este respeito, o modulador particular pode associar-se ou ligar-se a um epítopo localizado no domínio CUB 1 (aminoácidos 397-508) ou domínio CUB 2 (aminoácidos 574-685). Obviamente, será apreciado que cada um dos domínios acima mencionados pode compreender mais do que um epítopo e pode estar associado a mais de um conjugado.

[0029] No que diz respeito a "conjugados" de modulador ou anticorpo, será apreciado que o antigênio de SEZ6 pode ser analisado ou mapeado através de ligação de anticorpo competitivo usando técnicas reconhecidas pela técnica para definir conjugados específicos localizados ao longo da proteína. Embora discutido em mais detalhe aqui e mostrado nos Exemplos 9 e 10 em baixo, dois anticorpos (um dos quais pode ser denominado um "anticorpo de referência", "anticorpo delineando conjugado" ou "anticorpo delineante") podem ser considerados como estando no mesmo conjugado se eles competirem substancialmente um com o outro quanto à ligação ao antigênio alvo. Em tais casos, os epítopos de anticorpo objetos podem ser idênticos, substancialmente idênticos ou próximos o suficiente (ou um um sentido linear onde eles estão separados por alguns aminoácidos ou conformacionalmente) tal que ambos os anticorpos sejam estericamente ou eletrostaticamente inibidos ou impedidos de ligação ao antigênio. Tais conjugados definidos podem ser geralmente associados a certos domínios de SEZ6 (p.ex., o anticorpo de referência se ligará a um epítopo contido em um domínio específico) embora a correlação não seja sempre precisa (p.ex. podem existir mais do que um conjugado em um domínio ou o conjugado pode ser definido conformacionalmente e compreender mais do que um domínio). Será apreciado que aqueles peritos na técnica podem prontamente determinar a relação entre os domínios de SEZ6 e os conjugados empiricamente determinados.

[0030] No que diz respeito à presente invenção, a análise de ligação competitiva usando técnicas reconhecidas pela técnica (p.ex., ELISA, ressonância de plasmon de superfície ou interferometria de biocamada) definiu pelo menos sete conjugados distintos, cada um dos quais se descobriu que continha um número de moduladores de anticorpo. Para os propósitos da presente divulgação, os nove conjugados foram denominados conjugado A-F e conjugado U. Conjugados A-F são conjugados únicos e os anticorpos contidos em cada um desses conjugados competem uns com os outros para ligação à proteína SEZ6. Conjugado U contém anticorpos que não competem com anticorpos em conjugados A-F, mas que podem competir com ligação uns aos outros. Assim, em modalidades selecionadas, a presente invenção compreenderá um modulador residindo em um conjugado selecionado do grupo consistindo de conjugado A, conjugado B, conjugado C, conjugado D, conjugado E, conjugado F, e conjugado U. Em outras modalidades, a presente invenção compreende um modulador residindo e um conjugado definido por um anticorpo de referência selecionado do grupo consistindo de SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10, SC17.11, SC17.14, SC17.15, SC17.16, SC17.17, SC17.18, SC17.19, SC17.22, SC17.24, SC17.27, SC17.28, SC17.29, SC17.30, SC17.32, SC17.34, SC17.35, SC17.36, SC17.38, SC17.39, SC17.40, SC17.41, SC17.42, SC17.45, SC17.46, SC17.47, SC17.49, SC17.50, SC17.53, SC17.54, SC17.56, SC17.57, SC17.59, SC17.61, SC17.63, SC17.71, SC17.72, SC17.74, SC17.76, SC17.77, SC17.79, SC17.81, SC17.82, SC17.84, SC17.85, SC17.87, SC17.89, SC17.90, SC17.91, SC17.93, SC17.95, SC17.97, SC17.99, SC17.102, SC17.114, SC17.115, SC17.120, SC17121, SC17.122, SC17.140, SC17.151, SC17.156, SC17.161, SC17.166, SC17.187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 e SC17.200. Ainda em outras modalidades, a invenção compreenderá moduladores do conjugado A, moduladores do conjugado B, moduladores do conjugado C, moduladores do conjugado D, moduladores do conjugado E, moduladores do conjugado F ou moduladores do conjugado U. Outras modalidades ainda compreenderão um modulador de anticorpo de referência e qualquer anticorpo que compita com o anticorpo de referência.

[0031] O termo "compete" ou "anticorpo em competição", quando usado no contexto dos moduladores divulgados, significa competição pela ligação entre anticorpos como determinado por um ensaio no qual um anticorpo de referência ou fragmento imunologicamente funcional previne ou inibe substancialmente (p.ex., mais do que 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 % ou 90 %) a ligação específica a um anticorpo de teste a um antigênio comum. Métodos compatíveis para determinação de tal competição compreendem técnicas conhecidas na técnica tais como, por exemplo, interferometria de biocamada, ressonância de plasmon de superfície, citometria de fluxo, ELISA competitivo, etc..

[0032] Em uma modalidade selecionada, a invenção compreende um modulador pan-SEZ6 que se associa a SEZ6 e pelo menos um outro membro da família SEZ6 (por exemplo, SEZ6L ou SEZ6L2). Em outras modalidades selecionadas, a invenção compreende um modulador de SEZ6 que se associa imunoespecificamente a uma ou mais isoformas de SEZ6 mas não se associa imunoespecificamente a qualquer outro membro da família de SEZ6. Ainda em outras modalidades, a presente invenção compreende um método de tratamento de um sujeito com sua necessidade compreendendo administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um modulador de pan-SEZ6. Ainda outras modalidades compreendem um método de tratamento de um sujeito com sua necessidade compreendendo administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um modulador de SEZ6 que se associa imunoespecificamente a uma ou mais isoformas de SEZ6 mas não se associa imunoespecificamente a qualquer outro membro da família de SEZ6.

[0033] Para além dos usos terapêuticos discutidos acima, será também apreciado que os moduladores da presente invenção podem ser usados para detectar, diagnosticar ou classificar distúrbios relacionados com SEZ6 e, em particular, distúrbios proliferativos. Em algumas modalidades, o modulador pode ser administrado ao sujeito e detectado ou monitorizado in vivo. Aqueles com perícia na técnica apreciarão que tais moduladores podem ser marcados com ou associados a marcadores ou repórteres como divulgado em baixo e detectados usando qualquer uma de uma variedade de técnicas padrão (p.ex., MRI, scan CAT, scan PET, etc.).

[0034] Assim, em algumas modalidades, a invenção compreenderá um método de diagnóstico, detecção ou monitorização de um distúrbio associado a SEZ6 in vivo em um sujeito com sua necessidade compreendendo o passo de administração de um modulador de SEZ6.

[0035] Em outros casos, os moduladores podem ser usados em um ambiente de diagnóstico in vitro usando procedimentos reconhecidos pela técnica. Como tal, uma modalidade preferencial compreende um método de diagnóstico de um distúrbio proliferativo em um sujeito com sua necessidade compreendendo os passos de: a. obtenção de uma amostra de tecido do referido sujeito; b. contacto da amostra de tecido com pelo menos um modulador de SEZ6; e c. detecção ou quantificação do modulador de SEZ6 associado à amostra.

[0036] Tais métodos podem ser facilmente discernidos em conjunto com o presente pedido e podem ser prontamente realizados usando tecnologia comercial geralmente disponível tal como leitores de placa automáticos, sistemas repórter dedicados, etc.. Em modalidades selecionadas, o modulador de SEZ6 estará associado a células perpetuadoras de tumor presentes na amostra. Em outras modalidades preferenciais, o passo de detecção ou quantificação compreenderá uma redução da frequência de células iniciadoras de tumor e sua detecção. Além disso, a análise de diluição limitante pode ser conduzida como previamente aludido acima e usará de preferência estatística de distribuição de Poisson para providenciar uma contabilização precisa em relação à redução de frequência.

[0037] De um modo similar, a presente invenção proporciona também conjuntos ou dispositivos e métodos associados que são úteis no diagnóstico e monitorização de distúrbios associados a SEZ6 tais como câncer. Para esta finalidade, a presente invenção proporciona preferencialmente um artigo de fabricação útil para diagnóstico ou tratamento de distúrbios associados a SEZ6 compreendendo um receptáculo compreendendo um modulador de SEZ6 e materiais didáticos para uso do referido modulador de SEZ6 para tratar ou diagnosticar o distúrbio associado a SEZ6 . Em modalidades selecionadas, os dispositivos e métodos associados compreenderão o passo de contacto de pelo menos uma célula de tumor circulante.

[0038] Outras modalidades preferenciais da invenção exploram também as propriedades dos moduladores divulgados como um instrumento útil para identificação, caracterização, isolamento, secionamento ou enriquecimento de populações ou subpopulações de células iniciadoras de tumor através de métodos tais como análise de citometria de fluxo incluindo separação de células ativada por fluorescência (FACS) ou secionamento mediado por laser.

[0039] Como tal, outra modalidade preferencial da presente invenção está dirigida a um método de identificação, isolamento, secionamento ou enriquecimento de uma população de células iniciadoras de tumor compreendendo o passo de contacto das referidas células iniciadoras de tumor com um modulador de SEZ6.

[0040] O acima mencionado é um sumário e contém assim, por necessidade, simplificações, generalizações, e omissões de detalhe; consequentemente, aqueles peritos na técnica apreciarão que o sumário é ilustrativo somente e não se destina a ser de qualquer modo limitante. Outros aspetos, características, e vantagens dos métodos, composições e/ou dispositivos e/ou outro assunto descritos aqui se tornarão aparentes nos ensinamentos apresentados aqui. O sumário é proporcionado para introduzir uma seleção de conceitos em uma forma simplificada que são adicionalmente descritos em baixo na Descrição Detalhada. Este sumário não se destina a identificar características chaves ou características essenciais do assunto reivindicado, nem se destina a ser usado como um auxiliar na determinação do escopo do assunto reivindicado.

Breve Descrição das Figuras

[0041] As FIGS. 1A - 1E são várias representações de SEZ6 incluindo sequências de ácido nucleico ou de aminoácidos pertencendo aos moduladores SEZ6 aqui descritos. As FIGS. 1A e 1B (SEQ ID NOS: 1 e 2) representam a sequência de mRNA de comprimento total contendo as matrizes de leitura aberta (ORFs) (sublinhadas) codificando as variantes SEZ6 1 e 2, respectivamente. As FIGS. 1C e 1D (SEQ ID NOS: 3 e 4) providenciam as correspondentes sequências de aminoácidos das ORF denotadas nas FIGS. 1A e 1B, respectivamente, com os resíduos aminoácidos únicos sublinhados indicando o domínio de abrangência transmembranar previsto para cada isoforma de proteína e os resíduos aminoácidos duplos sublinhados indicando o peptídeo de sinal ; FIG. 1E representa o alinhamento das duas isoformas de proteína (SEQ ID NOS: 3 e 4) para ilustrar as diferenças de sequência nos terminais citoplásmicos de cada isoforma, com os resíduos sublinhados indicando as diferenças entre as duas sequências; e FIG. 1F proporciona uma representação esquemática da região extracelular da proteína SEZ6 ilustrando as posições dos vários domínios.

[0042] As FIGS. 2A - 2C providenciam representações tabulares da percentagem de identidade ao nível da proteína entre a isoforma humana mais próxima de SEZ6 e proteínas SEZ6 de rhesus, cinomolgo, camundongo ou rato (FIG. 2A); uma lista tabular de vários cDNA ou acessos de sequência proteica para cada uma das isoformas reportadas do gene da família SEZ6 (FIG. 2B); e a identidade de percentagem ao nível da proteína entre as isoformas mais longas das proteínas humanas SEZ6, SEZ6L, e SEZ6L2 (FIG. 2C).

[0043] As FIGS. 3A - 3C providenciam várias representações de sequências de ácido nucléico ou de aminoácidos relacionados com a produção dos imunogênios ou linhas celulares usadas para gerar ou caracterizar os moduladores SEZ6 aqui descritos. Para SEZ6 humano, foi construído um clone de cDNA específico (FIG. 3A; SEQ ID NO: 5) codificando a proteína completa SEZ6 humana madura (FIG. 3B; SEQ ID NO: 6) a partir de um clone cDNA comercial (BC146292; SEQ ID NO: 7) com diferenças conhecidas (FIG. 3C) a partir de sequência de referência de base de dados, NP_849191 (SEQ ID NO: 3), para a proteína SEZ6.

[0044] As FIGS. 4A e 4B providenciam um cDNA (FIG. 4A; SEQ ID NO: 8) usado para expressar um constructo Fc-SEZ6 em células CHO- S e originar um imunogênio de proteína (FIG. 4B; SEQ ID NO: 9), compreendendo o ECD de SEZ6 humano fundido com um domínio IgG2 Fc humano, no qual as sequências sublinhadas correspondem ao domínio IgG2 Fc humano, as sequências com duplo sublinhado correspondem ao peptídeo de sinal IgK, e os aminoácidos a negrito correspondem a resíduos contribuídos pelos locais de restrição usados para clonar o fragmento hSCRx17.

[0045] As FIGS. 5A - 5J providenciam várias representações de sequências de ácido nucléico ou aminoácidos relacionadas com a produção dos imunogênios ou linhas celulares usadas para gerar ou caracterizar os moduladores SEZ6 aqui descritos, em que as sequências sublinhadas denotam o ECD da proteína para o SEZ6 específico ou membro da família SEZ6 sendo ilustrado, e as figuras compreendem as sequências de cDNA para os constructos codificando o SEZ6 de murino maduro (FIG. 5A, SEQ ID NO: 10), SEZ6 de rato maduro (FIG. 5C, SEQ ID NO: 12), SEZ6 de cinomolgo maduro (FIG. 5E, SEQ ID NO: 14), ECD maduro da proteína SEZ6L humana (FIG. 5G, SEQ ID NO: 16 ), ou o ECD maduro da proteína SEZ6L2 humana (FIG. 5I, SEQ ID NO: 18), ou as proteínas correspondentes codificadas por esses constructos de cDNA, nomeadamente SEZ6 de murino maduro (FIG. 5B, SEQ ID NO: 11), SEZ6 de rato maduro (FIG. 5D, SEQ ID NO: 13), SEZ6 de cinomolgo maduro (FIG. 5F, SEQ ID NO: 15), o ECD maduro da proteína SEZ6L humana (FIG. 5H, SEQ ID NO: 17 ), ou o ECD maduro da proteína SEZ6L2 humana (FIG. 5J, SEQ ID NO: 19).

[0046] As FIGS. 6A e 6B são representações de níveis de expressão de mRNA de vários genes como medidos usando sequenciação de transcriptoma inteiro (SOLiD) de mRNA derivado de subpopulações de células do tumor ou tecidos normais. A FIG. 6A é uma representação tabular de genes associados com tumores com características neuroendócrinas; e FIG. 6B é uma representação gráfica de expressão de mRNA de SEZ6 em tecidos normais e vários tumores não tradicionais de xenoenxerto (NTX) derivados de câncer de pulmão.

[0047] A FIG. 7A - 7F representam níveis de expressão de mRNA analisados usando microrredes. A FIG. 7A é uma representação gráfica de aglomeramento não supervisionado de perfis de microrredes para 46 linhas de tumor e dois tecidos normais; FIGS. 7B e 7C são representações tabulares de valores de intensidade normalizados correspondendo a níveis de expressão relativos de genes selecionados relacionados com fenótipos neuroendócrinos (FIG. 7B) ou a via de sinalização Notch (FIG. 7C) em que as células não sombreadas e os números relativamente baixos indicam pouca a nula expressão e as células mais escuras e números relativamente mais elevados indicam níveis de expressão mais elevados; a FIG. 7D é uma representação gráfica mostrando os níveis de expressão relativos de mRNA de HES6 em vários tumores e tecidos de controle como medido usando qRT-PCR; a FIG. 7E é uma representação tabular de valores de intensidade normalizados correspondendo a níveis de expressão relativos de genes selecionados indicativos de neurogênese, compromisso neural, ou diferenciação em relação a destinos neurais, com células não sombreadas indicando pouca ou nenhuma expressão e células mais escuras indicando maiores níveis de expressão; e a FIG. 7F é uma representação gráfica de valores de intensidade normalizados correspondendo a expressão relativa de SEZ6 em várias linhas de tumor NTX.

[0048] As FIGS. 8A e 8B são representações gráficas mostrando níveis de expressão relativos de transcritos mRNA de SEZ6 como medidos por RT-PCR em uma variedade de amostras RNA isoladas de tecidos normais ou massa de tumores neuroendócrinos NTX (FIG. 8A) e uma variedade de outros tumores NTX (FIG. 8B).

[0049] As FIGS. 9A e 9B são representações gráficas mostrando níveis de expressão mRNA absolutos (FIG. 9A) ou normalizados (FIG. 9B) de SEZ6 humano como medido por RT-PCR em espécimes de tumor inteiro (ponto cinzento) ou tecido adjacente normal correspondente (NAT; ponto branco) de pacientes com um de dezoito tipos de tumor sólido diferentes.

[0050] As FIGS. 10A e 10B providenciam em uma forma tabular, as sequências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeia pesada e leve de vários moduladores SEZ6 exemplares de murino e de humano isolados, clonados e manipulados como descrito nos exemplos aqui.

[0051] A FIG. 11 apresenta várias características de moduladores exemplares da invenção. A FIG. 11A mostra as propriedades bioquímicas e imunológicas de moduladores exemplares SEZ6 como representados em formato tabular; e a Figura 11B providencia uma correlação entre o domínio ao qual o anticorpo se liga e a eficácia do anticorpo em um ensaio de morte in vitro.

[0052] As FIGS. 12A e 12B mostram detecção de expressão de SEZ6. A FIG. 12A mostra expressão de SEZ6 em células HEK-293T manipuladas para sobre-expressarem proteína humana SEZ6 (h293T- HuSEZ6) usando o anticorpo anti-SEZ6 SC17.33; FIG. 12B mostra a expressão de proteína relativa de SEZ6 humano em vários lisados de tumor NTX e de tecido normal como medido usando um ensaio eletroquimioluminescente.

[0053] As FIGS. 13A e 13B mostram detecção por citometria de fluxo com expressão de proteína SEZ6 em células de tumor NTX usando vários anticorpos anti-SEZ6 (FIG. 13A); enquanto a FIG. 13B mostra expressão acrescida da proteína SEZ6 em CSCs em comparação com subpopulações NTG usando vários anticorpos anti- SEZ6 (FIG. 13B).

[0054] As FIGS. 14A e 14B mostram que CSCs expressando SEZ6 exibem tumorigenicidade aumentada em comparação com CSCs que não expressam SEZ6. A FIG. 14A é um gráfico de contorno mostrando separação de células por FACS das células em um tumor do pulmão (LU37) com base na expressão de CD324 (um marcador de CSCs) e SEZ6; FIG. 14B é uma representação gráfica do crescimento das células de tumor que são CD324+SEZ6+ (círculos negros) ou CD324+SEZ6- (círculos brancos) após implantação em ratos imunocomprometidos. As células de tumor expressando CD324 e SEZ6 exibem tumorigenicidade aumentada.

[0055] As FIGS. 15A e 15B providenciam, respectivamente, uma representação tabular e gráfica ilustrando que os moduladores revelados podem ser efetivamente usados como frações dirigidas para direcionar cargas citotóxicas para células manipuladas para expressar SEZ6 (FIG. 15A) e tumores do pulmão NTX (LU80, LU37 e LU100) cultivados in vitro (FIG. 15B) onde a redução nas unidades de luminescência relativa normalizadas (RLU) é indicativa da morte celular através de internalização da toxina da saporina.

[0056] A FIG. 16 é uma representação tabular de resultados imunohistoquímicos mostrando expressão de SEZ6 em vários tumores NTX.

[0057] As FIGS. 17A e 17B representam a capacidade de anticorpos anti-SEZ6 conjugados de camundongo retardarem o crescimento in vitro e in vivo de células de tumor NTX. A FIG. 17A mostra o resultado de um ensaio de morte in vitro usando ADCs anti- SEZ6 em células HEK293 com sobre-expressão de SEZ6; enquanto a FIG. 17B mostra o efeito de ADCs anti-SEZ6 no crescimento in vivo de tumores SCLC (LU86) e LCNEC (LU50).

[0058] As FIGS. 18A e 18B representam a capacidade de anticorpos anti-SEZ6 humanizados conjugados retardarem o crescimento in vivo de quatro tumores SCLC (LU80, LU64, LU111 e LU117) e alcançarem remissão durável em ratos imunodeficientes.

Descrição Detalhada da Invenção I. Introdução

[0059] Embora a presente invenção possa ser realizada em muitas formas diferentes, são divulgadas aqui suas modalidades ilustrativas específicas que exemplificam os princípios da invenção. Deve ser enfatizado que a presente invenção não está limitada às modalidades ilustradas específicas. Além do mais, quaisquer títulos de seção usados aqui são para propósitos de organização somente e não são para serem interpretados como limitando a matéria descrita. Finalmente, para os propósitos da presente divulgação, todos os números de Acesso identificadores das sequências podem ser encontrados na base de dados de Referência do NCBI (RefSeq) e/ou na base de dados do arquivo de sequências GenBank® do NCBI a não ser que notado de outro modo.

[0060] Como previamente aludido, foi surpreendentemente descoberto que a expressão de SEZ6 está associada ao crescimento neoplásico e a distúrbios proliferativos, particularmente no caso de tumores com características neuroendócrinas, e que SEZ6 e suas variantes ou isoformas proporcionam marcadores de tumor úteis que podem ser explorados no tratamento de doenças relacionadas. Além do mais, como mostrado no presente pedido, se descobriu inesperadamente que os marcadores ou determinantes de SEZ6 tais como proteína SEZ6 à superfície da célula estão associados a células- tronco do câncer (também conhecidas como células perpetuadoras de tumor) e podem ser eficazmente explorados para eliminarem ou silenciarem as mesmas. A capacidade de reduzir ou eliminar seletivamente células-tronco do câncer (p.ex., através do uso de moduladores de SEZ6 conjugados) é particularmente surpreendente na medida em que se sabe que tais células são geralmente resistentes a muitos tratamentos convencionais. Isto é, a eficácia de métodos de tratamento tradicionais, bem como dirigidos mais recentes, é frequentemente limitada pela existência e/ou emergência de células- tronco do câncer resistentes que são capazes de perpetuar o câncer mesmo em face destes diversos métodos de tratamento. Adicionalmente, os determinantes associados a células-tronco do câncer constituem frequentemente alvos terapêuticos fracos devido a expressão baixa ou inconsistente, falha em permanecerem associados à célula tumorigênica ou falha em se apresentarem à superfície da célula. Em nítido contraste com os ensinamentos da técnica prévia, os compostos e métodos presentemente divulgados ultrapassam eficazmente esta resistência inerente para especificamente eliminarem, esgotarem, silenciarem ou promoverem a diferenciação de tais células-tronco do câncer, negando deste modo a sua capacidade de sustentarem ou reinduzirem o crescimento do tumor subjacente.

[0061] Mais especificamente, foi descoberto que os moduladores de SEZ6 tais como aqueles divulgados aqui podem ser vantajosamente usados no prognóstico, diagnóstico, teragnóstico, tratamento ou prevenção de distúrbios proliferativos (p.ex., distúrbios neoplásicos) em sujeitos com sua necessidade. Em conformidade, apesar de em baixo serem discutidas modalidades preferenciais da invenção, particularmente em termos de domínios, regiões ou epítopos específicos ou no contexto de células-tronco do câncer ou tumores compreendendo características neuroendócrinas e suas interações com os moduladores divulgados, os peritos na técnica apreciarão que o escopo da presente invenção não está limitado por tais modalidades exemplares. Ao invés, as modalidades mais amplas da presente invenção e as reivindicações anexas estão amplamente e expressamente dirigidas a moduladores de SEZ6 (incluindo moduladores conjugados) e seu uso no prognóstico, diagnóstico, teragnóstico, tratamento ou prevenção de uma variedade de distúrbios associados a ou mediados por SEZ6, incluindo distúrbios proliferativos ou neoplásicos, independentemente de qualquer mecanismo particular de ação ou tumor especificamente dirigido, componente celular ou molecular.

[0062] Para essa finalidade, e como demonstrado no presente pedido, foi inesperadamente descoberto que os moduladores de SEZ6 divulgados podem ser eficazmente usados para se dirigirem a ou eliminarem ou de outro modo incapacitarem células proliferativas ou tumorigênicas e tratarem distúrbios associados a SEZ6 (p.ex., neoplasia). Como usado aqui, um "distúrbio associado a SEZ6" deve ser considerado como significando qualquer distúrbio ou doença (incluindo distúrbios proliferativos) que seja marcada, diagnosticada, detectada ou identificada por uma aberração fenotípica ou genotípica de componentes genéticos de SEZ6 ou expressão durante o decurso ou etiologia da doença ou distúrbio. A este respeito, uma aberração fenotípica ou determinante de SEZ6 pode, por exemplo, compreender níveis elevados ou diminuídos da expressão da proteína SEZ6, expressão anormal da proteína SEZ6 em certas populações de células definíveis ou expressão anormal da proteína SEZ6 em uma fase ou etapa inapropriada de um ciclo de vida da célula. Obviamente, será apreciado que podem ser também usados padrões de expressão similares de determinantes genotípicos (p.ex., níveis de transcrição de mRNA) de SEZ6 para classificar ou detectar distúrbios associados a SEZ6.

[0063] Como usado aqui, o termo "determinante" ou "determinante de SEZ6" deve significar qualquer traço, propriedade, marcador ou fator detectável que esteja identificavelmente associado a, ou seja especificamente encontrado em ou sobre uma célula particular, população de células ou tecido incluindo aqueles identificados em ou sobre um tecido, célula ou população de células afetado por uma doença ou distúrbio associado a SEZ6. Em modalidades preferenciais selecionadas, os moduladores de SEZ6 podem se associar ao, se ligar ao ou reagir diretamente com o determinante de SEZ6 (p.ex., proteína de SEZ6 ou mRNA de SEZ6 à superfície da célula) e deste modo aliviar a doença. Mais geralmente, os determinantes podem ter uma natureza morfológica, funcional ou bioquímica e podem ser genotípicos ou fenotípicos. Em outras modalidades preferenciais, o determinante é um antigênio à superfície da célula ou componente genético que é diferencialmente ou preferencialmente expresso (ou não) por tipos de células específicos (p.ex., células-tronco do câncer) ou por células sob certas condições (p.ex., durante pontos específicos do ciclo da célula ou células em um nicho particular). Ainda em outras modalidades preferenciais, o determinante pode compreender um gene ou entidade genética que é diferencialmente regulado (para cima ou para baixo) em uma célula específica ou população de células discreta, um gene que é diferentemente modificado no que diz respeito à sua estrutura física e composição química ou uma proteína ou coleção de proteínas fisicamente associadas a um gene que mostra modificações químicas diferenciais. Os determinantes contemplados aqui são especificamente considerados como sendo positivos ou negativos e podem denotar uma célula, subpopulação de células ou tecido (p.ex., tumores) por sua presença (positivos) ou ausência (negativos).

[0064] De um modo similar, "moduladores de SEZ6" da invenção compreendem amplamente qualquer composto que reconheça, reaja com, compita com, antagonize, interatue com, se ligue a, agonize, ou se associe a uma variante ou isoforma de SEZ6 (ou seus domínios, regiões ou epítopos específicos) ou seu componente genético. Por estas interações, os moduladores de SEZ6 podem vantajosamente eliminar, reduzir ou moderar a frequência, atividade, recorrência, metastização ou mobilidade de células tumorigênicas (p.ex., células perpetuadoras de tumor ou células-tronco do câncer). Moduladores exemplares divulgados aqui compreendem nucleotídeos, oligonucleotídeos, polinucleotídeos, peptídeos ou polipeptídeos. Em certas modalidades preferenciais, os moduladores selecionados compreenderão anticorpos para uma isoforma da proteína SEZ6 ou seus fragmentos ou derivados imunorreativos. Tais anticorpos podem ter uma natureza antagonista ou agonista e podem ser opcionalmente conjugados com ou associados a um agente terapêutico ou de diagnóstico. Além do mais, tais anticorpos ou fragmentos de anticorpos podem compreender anticorpos esgotantes, neutralizantes ou internalizantes. Em outras modalidades, os moduladores da presente invenção constituirão um constructo de SEZ6 compreendendo uma isoforma de SEZ6 ou um seu fragmento reativo. Será apreciado que tais constructos podem compreender proteínas de fusão e podem incluir domínios reativos de outros polipeptídeos tais como imunoglobulinas ou modificadores da resposta biológica. Ainda em outros aspetos, o modulador de SEZ6 compreenderá uma porção de ácido nucleico (p.ex., miRNA, siRNA, shRNA, constructos antissenso, etc.) que exerce os efeitos desejados a um nível genômico. Outros moduladores ainda compatíveis com os presentes ensinamentos serão discutidos em detalhe em baixo.

[0065] Mais geralmente, os moduladores SEZ6 da presente invenção compreendem amplamente qualquer composto que reconhece, reage com, compete com, antagoniza, interage com, se liga a, agoniza, ou se associa a um determinante de SEZ6 (genotípico ou fenotípico) incluindo proteína SEZ6 à superfície da célula. Seja qual for a forma do modulador que é em última medida selecionada, estará preferencialmente em um estado isolado e purificado antes da introdução em um sujeito. A este respeito, o termo "modulador de SEZ6 isolado" ou "anticorpo de SEZ6 isolado" deve ser interpretado em um amplo sentido e de acordo com a prática farmacêutica padrão para significar qualquer preparação ou composição compreendendo o modulador em um estado substancialmente isento de contaminantes indesejados (biológicos ou de outro modo). Além do mais, estas preparações podem ser purificadas e formuladas como desejado usando várias técnicas reconhecidas pela técnica. Obviamente, será apreciado que tais preparações "isoladas" podem ser intencionalmente formuladas ou combinadas com ingredientes inertes ou ativos como desejado para melhorar os aspetos comerciais, de fabricação ou terapêuticos do produto final e proporcionar composições farmacêuticas. Em um sentido mais amplo, as mesmas considerações gerais podem ser aplicadas a uma isoforma ou variante de SEZ6 "isolada" ou um ácido nucleico "isolado" codificando a mesma.

[0066] Adicionalmente, foi surpreendentemente descoberto que os moduladores interatuando com, se associando a ou se ligando a domínios, motivos ou epítopos de SEZ6 particulares são especialmente eficazes na eliminação de células tumorigênicas e/ou silenciamento ou atenuação de efeitos das células-tronco do câncer no crescimento ou propagação do tumor. Isto é, embora os moduladores que reajam com ou se associem a domínios que estão próximos da superfície da célula (p.ex., um dos domínios tipo Sushi ou CUB) sejam eficazes no esgotamento ou neutralização de células tumorigênicas, foi inesperadamente descoberto que os moduladores se associando ou se ligando a domínios, motivos ou regiões que estejam relativamente mais distantes da superfície da célula são também eficazes na eliminação, neutralização, esgotamento ou silenciamento de células tumorigênicas. Isto é especialmente verdadeiro no que toca a moduladores conjugados tais como, por exemplo, conjugados anticorpo-fármaco anti-SEZ6 compreendendo um agente citotóxico.

[0067] Embora a presente invenção contemple expressamente o uso de qualquer modulador de SEZ6 no tratamento de qualquer distúrbio de SEZ6, incluindo qualquer tipo de neoplasia, em modalidades particularmente preferenciais, os moduladores divulgados podem ser usados para prevenir, tratar ou diagnosticar tumores compreendendo características neuroendócrinas (genotípicas ou fenotípicas) incluindo tumores neuroendócrinos. "Tumores neuroendócrinos canônicos" (NETs) ou verdadeiros têm origem no sistema endócrino disperso e são tipicamente altamente agressivos. Os tumores neuroendócrinos ocorrem no rim, trato genitourinário (bexiga, próstata, ovários, colo do útero, e endométrio), trato gastrointestinal (estômago, cólon), tiroide (câncer da tiroide medular), e pulmão (carcinoma das células pequenas do pulmão e carcinoma neuroendócrino das células grandes). Além do mais, os moduladores divulgados podem ser vantajosamente usados para tratar, prevenir ou diagnosticar pseudotumores neuroendócrinos (pNETs) que mimetizam, compreendem, se assemelham a ou exibem genotipicamente ou fenotipicamente traços comuns que tumores neuroendócrinos canônicos. "Pseudotumores neuroendócrinos" são tumores que têm origem em células do sistema neuroendócrino difuso ou em células nas quais uma cascata de diferenciação neuroendócrina foi aberrantemente reativada durante o processo oncogênico. Tais pNETs partilham comummente certas características genotípicas, fenotípicas ou bioquímicas com tumores neuroendócrinos tradicionalmente definidos, incluindo a capacidade de produzirem subconjuntos de aminas biologicamente ativas, neurotransmissores, e hormônios de peptídeo. Conformemente, para os propósitos da presente invenção, as frases "tumores compreendendo características neuroendócrinas" ou "tumores exibindo aspetos neuroendócrinos" devem ser consideradas como compreendendo tumores neuroendócrinos e pseudotumores neuroendócrinos a não ser que indicado de outro modo pelo contexto.

[0068] Para além da associação a tumores geralmente discutida acima, existem também indicações de associação fenotípica ou genotípica entre células iniciadoras de tumor (TIC) selecionadas e determinantes de SEZ6. A este respeito, as TICs selecionadas (p.ex., células-tronco do câncer) podem expressar níveis elevados de proteínas SEZ6 quando comparadas com tecido normal e células não tumorigênicas (NTG), que compreendem tipicamente em conjunto muito de um tumor sólido. Assim, os determinantes de SEZ6 podem compreender um marcador (ou antigênio ou imunogênio) associado ao tumor e os moduladores divulgados podem proporcionar agentes eficazes para a detecção e supressão de TIC e neoplasia associada devido a níveis alterados das proteínas nas superfícies das células ou no microambiente do tumor. Conformemente, os moduladores de SEZ6, incluindo antagonistas imunorreativos e anticorpos que se associam a, se ligam a ou reagem com as proteínas, podem eficazmente reduzir a frequência de células iniciadoras de tumor e poderiam ser úteis na eliminação, esgotamento, incapacitação, redução, promoção da diferenciação, ou de outro modo impedimento ou limitação da capacidade destas células iniciadoras de tumor de permanecerem dormentes e/ou continuarem a alimentar o crescimento, metastização ou recorrência do tumor em um paciente. A este respeito, aqueles peritos na técnica apreciarão que a presente invenção proporciona adicionalmente moduladores de SEZ6 e seu uso na redução da frequência de células iniciadoras de tumor.

II. Fisiologia SEZ6

[0069] SEZ6 (também conhecido como homólogo 6 relacionado com convulsões) é uma proteína de transmembrana tipo I originalmente clonada a partir de células de cérebro de rato derivadas do córtex tratadas com o o convulsante pentilenotetrazol (Shimizu- Nishikawa, 1995; PMID: 7723619). Ortólogos de proteína SEZ6 representativos incluem, mas não se limitam a, humano (NP_849191; NP_001092105), chimpanzé (XP_511368, NP_001139913), camundongo (NP_067261), e rato (NP_001099224). Em humanos, o gene de SEZ6 consiste em 17 éxons abrangendo 51,1 kBp localizado no cromossomo 17q11.2. Locais de aceitador de splice apenas separados por 16 pares base dentro do último éxon originam dois transcritos processados,um de aproximadamente 4210 bases (NM_178860; FIG. 1A) e um de aproximadamente 4194 bases (NM_001098635, FIG. 1B). O primeiro transcrito codifica uma proteína de 994 aminoácidos (NP_849191; FIG. 1C), enquanto o segundo transcrito codifica uma proteína de 993 aminoácidos (NP_001092105; FIG. 1D). Essas duas isoformas de proteína de SEZ6 partilham no total 100% de identidade ao longo dos seus domínios extracelulares e dos seus domínios transmembrana, diferindo apenas nos últimos dez resíduos aminoácidos (FIG. 1E). Uma terceira variante de splice foi reportada para gerar um secretado de SEZ6 (Shimizu-Nishikawa, 1995; PMID: 7723619), contudo não foi incluída nas RefSeqs associadas da entrada de página de Gene da base de dados NCBI. Os moduladores da invenção podem ligar-se a qualquer uma das variantes de splice.

[0070] A relevância biológica das isoformas ainda não é clara, apesar de um estudo ter sugerido ações opostas para a membrana versus proteínas solúveis quando a sua expressão é restaurada em neurônios de camundongos de inativação de SEZ6 de murinos (Gunnersen e outros. 2007, PMID: 18031681). A identidade de sequência de proteína em espécies cruzadas para as proteínas SEZ6 estão listadas na FIG. 2A. No genoma humano, há dois genes tipo homólogo 6 relacionado com convulsões (SEZ6L) e tipo homólogo 6 relacionado com convulsões 2 (SEZ6L2), cada um com múltiplos variantes de splice codificando várias isoformas (FIG. 2B). As percentagens de identidades para a proteína mais longa de cada um dos membros desta família de proteínas tipo SEZ6 em humanos são mostradas na FIG. 2C. Tomados em conjunto, SEZ6, SEZ6L e SEZ6L2, incluindo as suas várias isoformas, serão designados a família SEZ6 para os propósitos do presente pedido. Os moduladores SEZ6 compreendem moduladores que são específicos para cada um de SEZ6, SEZ6L ou SEZ6L2. Em alternativa, os moduladores da invenção podem reagir de modo cruzado com SEZ6 e com um ou ambos de SEZ6L e/ou SEZ6L2.

[0071] A proteína SEZ6 madura é composta de uma série de domínios estruturais: um domínio citoplásmico, um domínio de transmembrana e um domínio extracelular compreendendo um domínio de N-terminal único, seguido de dois domínios alternantes tipo Sushi e CUB, e três pares adicionais de repetições de domínio Sushi. Existem duas isoformas do antigênio SEZ6, e diferem apenas no domínio citoplásmico do terminal carboxi extremo.

[0072] A FIG. 1F proporciona um diagrama esquemático da região extracelular da proteína SEZ6, ilustrando a justaposição geral dos domínios Sushi e CUB, e do domínio N-terminal. Geralmente, os domínios EGF são reconhecidos como ocorrendo cerca dos resíduos de aminoácidos 336-395 (Domínio Sushi 1), 397-508 (Domínio CUB 1), 511-572 (Domínio Sushi 2), 574-685 (Domínio CUB 2), 690-748 (Domínio Sushi 3), 750-813 (Domínio Sushi 4), 817-878 (Domínio Sushi 5), com o domínio de N-terminal cerca dos resíduos de aminoácidos 1-335 e um desvio composicional de resíduos ricos em prolina cerca dos resíduos aminoácidos 71-169.

[0073] As repetições Sushi são semelhantes às repetições de consenso curto encontradas nas outras proteínas regulatórias de complemento humanas (i.e., locais de ligação de complemento C3b/C4b). Os domínios tipo CUB são semelhantes aos domínios tipo CUB encontrados em outros proteínas de ligação de complemento de mamíferos que estão associadas a uma ampla gama de proteínas que participam em numerosos processos biológicos que não ativação de complemento, incluindo mas não se limitando a padronização, orientação de axônios, inflamação e supressão de tumor (Bork and Beckman, 1993, PMID: 8510165). Tanto o domínio Sushi como o domínio CUB implicam uma função para SEZ6 envolvendo a ligação de outras proteínas extracelularmente. Proteínas contendo domínios CUB também têm sido ligadas a vias de sinalização de células, e consistentemente com essa função, os domínios citoplásmicos SEZ6 de C-terminal contêm o motivo Asn-Pro-Thr-Tyr (SEQ ID NO: 403), que é um alvo potencial para fosforilação pelos membros da família Src quinase tirosina. Se for verdade, isto ligaria SEZ6 a uma via de transdução de sinal celular conduzindo à ativação de Ras, sugerindo que SEZ6 pode ser um receptor neurotrófico.

[0074] De notar que os termos "proteína madura" ou "polipeptídeo maduro" como aqui usados se referem à ou às formas da proteína SEZ6 produzida sem o peptídeo de sinal de 19 aminoácidos que podem ser clivados antes da expressão à superfície da célula. Salvo indicação em contrário, a numeração de aminoácidos SEZ6 (para domínios, regiões, epítopos, etc.) será no contexto de uma proteína madura sem a líder.

[0075] SEZ6 é detetável por RT-PCR a níveis baixos nos rins, fígado, coração, pulmões e timo de roedores, apesar de uma forte expressão de proteína apenas ter sido vista no cérebro, com um nível significativo expresso nos testículos (Herbst and Nicklin, 1997, PMID: 9073173). Usando soros policlonais para SEZ6, foi detectada expressão de proteína no 13° dia do prosencéfalo de camundongo em desenvolvimento. Foi detectada forte coloração nos neurônios pós- mitóticos em amadurecimento da placa cortical e subplaca em desenvolvimento. A coloração diminui no cérebro adulto onde a expressão de SEZ6 pode ser detectada em outras regiões do cérebro associadas com plasticidade morfológica em curso, como no hipocampo, cerebelo e bulbo olfativo e em neurônios da retina e cordão espinhal (Gunnersen e outros., 2007, PMID: 18031681). Os sinais mais densos foram encontrados em regiões com maior concentração de corpos celulares neuronais. Apesar de expressão retinal generalizada de SEZ6, a função retinal na ausência de SEZ6 não foi afetada (Gunnersen e outros., 2009, PMID: 19662096). O padrão de coloração de SEZ6 está intimamente relacionado com a emergência das camadas neocorticais e do hipocampo, e implica um papel específico do prosencéfalo para esse gene durante o desenvolvimento. Em SEZ6 humano e de camundongo, foi descoberto que era expresso de forma diferente em regiões altamente específicas do neocórtex (Gunnersen e outros., 2007, supra).

[0076] As mutações no gene SEZ6 humano foram associadas a convulsões febris (FS), uma convulsão associada com um aumento da temperatura do corpo e o tipo de convulsão mais comum na infância (Yu e outros., 2007, PMID:17086543). A FS pode ser classificada como simples ou complexa, dependendo da duração, recorrência e extensão do corpo afetada pela convulsão. Em um coorte chinês, não foram encontradas mutações em SEZ6 em 15 controles saudáveis, mas foram encontradas mutações em 21 de 60 pacientes com FS, com o tipo de mutação mais comum sendo uma inserção de citosina heterozigota (mutação por deslocação do quadro de leitura) na posição 1435 do cDNA. A incidência de mutação foi significativamente maior em pacientes com FS complexa e em pacientes com uma história familiar positiva. Uma vez que há 80% de probabilidades de crianças com FS complexa terem convulsões mais tarde, os autores sugerem que o rastreio de mutações em SEZ6 poderá ser valioso na previsão de recorrência de FS ou desenvolvimento de epilepsia (Yu e outros., 2007, supra). Estudos posteriores questionaram a incidência, relevância e capacidade de esse estudo ter poder adequado para implicar causalidade, mas corroboram que SEZ6 pode ser um gene entre muitos que podem desempenhar um papel em distúrbios convulsivos (Mulley e outros., 2011, PMID: 21785725).

[0077] As funções moleculares específicas de SEZ6 continuam pouco claras. Como discutido acima, a análise de módulos estruturais da proteína identificada por homologia e análise de sequência sugerem um possível papel na sinalização, comunicação célula-célula e desenvolvimento neural. A ramificação e conetividade dendrítica neuronal que formam as redes de sinalização que constituem os circuítos do cérebro surgem e são especificados por programas moleculares intrínsecos na célula neural e por sinais extrínsecos. O processo de crescimento dendrítico em neurônios piramidais, o neurônio principal no prosencéfalo dos mamíferos, produz neurônios com morfologias distintas - um corpo celular piramidal e duas árvores dendríticas complexas distintas: uma emergindo do ápice e a outra da base do corpo celular. Gunnersen e outros. (2007, supra) mostraram que camundongos de SEZ6 nulo exibem um excesso de dendritos curtos nas árvores dendríticas desses neurônios, mas que contudo não apresentam aumento no campo dendrítico global, a gama de neurônios com os quais um determinado neurônio se conecta. Restaurar a expressão das isoformas de SEZ6 ligadas por membrana nos neurônios inativados resulta em um efeito anti-ramificação. Em testes comportamentais, os camundongos de SEZ6 nulo apresentam défices específicos a nível exploratório, motor e cognitivo. Esses dados sugerem que SEZ6 é importante para alcançar o equilíbrio necessário entre alongamento e ramificação dos dendritos durante a elaboração de uma árvore dendrítica durante o desenvolvimento.

[0078] Tomados em conjunto, os estudos acima sugerem fortemente que a proteína de SEZ6 é importante no contexto do desenvolvimento neural e tem provavelmente algum papel na comunicação célula-célula e sinalização. A reativação desadequada de vias de sinalização de desenvolvimento ou desregulação de vias de sinalização normais são comumente observadas em tumores (Harris e outros., 2012). Um grupo de tumores partilhando características indicativas da reativação parcial de programas de desenvolvimento são os tumores com fenótipos neuroendócrinos (Yao 2008; PMID: 18565894), em que vários marcadores hormonais e endócrinos são expressos e/ou secretados, e são expressos vários marcadores neurais indicativos de neurogênese, compromisso neural ou diferenciação em relação a destinos neurais. Tumores com características neuroendócrinas surgem frequentemente em uma ampla gama de locais primários, e apesar da sua classificação exaustiva continuar a ser problemática (Yao; PMID: 18565894; Klimstra 2010; PMID: 20664470; Klõppel, 2011; PMID: 22005112), eles podem ser classificados em quatro grandes tipos: carcinoides benignos de baixo grau, tumores neuroendócrinos bem diferenciados de baixo grau com comportamento maligno, tumores com características neuroendócrinas e epiteliais mistas, e carcinomas neuroendócrinos fracamente diferenciados de elevado grau. Destas classificações, os carcinomas neuroendócrinos fracamente diferenciados, que incluem câncer de pulmão de células pequenas (SCLC) e subconjuntos de câncer do pulmão de células não pequenas (NSCLC), são tipos de câncer com prognósticos sombrios. Foi postulado que SCLC tem origem broncogênica, surgindo em parte de células neuroendócrinas pulmonares (Galluzzo e Bocchetta, 2011; PMID: 21504320). Seja qual for a fonte celular específica de origem para esses tumores, é claro que apresentam um fenótipo endócrino fracamente diferenciado, são muitas vezes proliferativos e agressivos e frequentemente sobre-expressam proteínas neurais. A elevação resultante de marcadores de expressão neural em esses tumores que de outro modo podem se restringir primariamente ao sistema nervoso ou apresentar expressão limitada durante o desenvolvimento, dos quais SEZ6 pode ser um exemplar, pode como tal oferecer um alvo terapêutico único para tumores com fenótipo neuroendócrino.

III. Células-Tronco do Câncer

[0079] Como aludido acima, foi surpreendentemente descoberto que a expressão aberrante de SEZ6 (genotípica e/ou fenotípica) está associada a várias subpopulações de células tumorigênicas. A este respeito, a presente invenção proporciona moduladores de SEZ6 que podem ser particularmente úteis para direcionamento de tais células, e especialmente células perpetuadoras de tumor, facilitando deste modo o tratamento, gestão ou prevenção de distúrbios neoplásicos. Assim, em modalidades preferenciais, os moduladores de determinantes de SEZ6 (fenotípicos ou genotípicos) podem ser vantajosamente usados para reduzir a frequência de células iniciadoras de tumor de acordo com os presentes ensinamentos e facilitar deste modo o tratamento ou gestão de distúrbios proliferativos.

[0080] Para os propósitos do presente pedido, o termo "células iniciadoras de tumor" (TIC) engloba "células perpetuadoras de tumor" (TPC; i.e., células-tronco do câncer ou CSC) e "células genitoras do tumor" altamente proliferativas (denominadas TProg), que compreendem geralmente em conjunto uma única subpopulação (i.e., 0,1-40 %) de uma massa ou tumor em volume. Para os propósitos da presente divulgação, os termos "células perpetuadoras de tumor" e "células-tronco do câncer" ou "células-tronco neoplásicas" são equivalentes e podem ser usados indistintamente aqui. TPC diferem de TProg na medida em que TPC podem completamente recapitular a composição de células do tumor existindo dentro de um tumor e têm capacidade de autorrenovação ilimitada como demonstrado por transplante em série (duas ou mais passagens através de camundongos) de baixos números de células isoladas, ao passo que TProg não exibirão capacidade de autorrenovação ilimitada.

[0081] Aqueles peritos na técnica apreciarão que a separação de células ativada por fluorescência (FACS) usando marcadores da superfície da célula apropriados é um método confiável para isolar subpopulações de células-tronco do câncer altamente enriquecidas (p.ex., > 99,5 % de pureza) devido, pelo menos em parte, à sua capacidade de discriminar entre células únicas e aglomerados de células (i.e., dupletos, etc.). Usando tais técnicas, foi mostrado que, quando baixos números de células de células TProg altamente purificadas são transplantados para camundongos imunocomprometidos, eles podem alimentar o crescimento do tumor em um transplante primário. No entanto, ao contrário de subpopulações de TPC, os tumores gerados por TProg não refletem completamente o tumor genitor na heterogeneidade fenotípica das células e são comprovadamente ineficazes na reiniciação da tumorigênese em série em transplantes subsequentes. Em contraste, as subpopulações de TPC reconstituem completamente a heterogeneidade celular de tumores genitores e conseguem eficazmente iniciar tumores quando isolados e transplantados em série. Assim, aqueles peritos na técnica reconhecerão que uma diferença definitiva entre TPC e TProg, embora ambas possam gerar tumores em transplantes primários, é a capacidade única de TPC de alimentarem perpetuamente o crescimento de tumores heterogêneos após transplante em série a baixos números de células. Outras abordagens comuns para caracterizar TPC envolvem morfologia e exame de marcadores da superfície das células, perfil transcripcional, e resposta a fármacos embora a expressão de marcadores possa mudar com as condições de cultura e com a passagem de linhas de células in vitro.

[0082] Conformemente, para os propósitos da presente invenção as células perpetuadoras de tumor, como as células-tronco normais que apoiam as hierarquias celulares em tecido normal, são preferencialmente definidas pela sua capacidade de se autorrenovarem indefinidamente enquanto mantêm a capacidade de diferenciação multilinhagens.. As células perpetuadoras de tumor são assim capazes de gerar descendência tumorigênica (i.e., células iniciadoras de tumor: TPC e TProg) e descendência não tumorigênica (NTG). Como usada aqui, uma "célula não tumorigênica" (NTG) se refere a uma célula de tumor que surge de células iniciadoras de tumor, mas não tem ela própria a capacidade de se autorrenovar ou gerar as linhagens heterogêneas de células de tumor que compreendem um tumor. Experimentalmente, as células NTG são incapazes de formar reprodutivelmente tumores em camundongos, mesmo quando transplantadas em números de células em excesso.

[0083] Como indicado, TProg são também categorizadas como células iniciadoras de tumor (ou TIC) devido à sua capacidade limitada de gerar tumores em camundongos. TProg são a descendência de TPC e são tipicamente capazes de um número finito de divisões de células não autorrenovantes. Além do mais, as células TProg podem ser adicionalmente divididas em células genitoras de tumor iniciais (ETP) e células genitoras de tumor tardias (LTP), cada uma das quais pode ser distinguida pelo fenótipo (p.ex., marcadores da superfície da célula) e diferentes capacidades de recapitular a arquitetura das células do tumor. Apesar de tais diferenças técnicas, ETP e LTP diferem funcionalmente de TPC na medida em que elas são geralmente menos capazes de reconstituir em série tumores quando transplantadas a baixos números de células e tipicamente não refletem a heterogeneidade do tumor genitor. Não obstante as distinções acima mencionadas, foi também mostrado que várias populações de TProg podem, em ocasiões raras, ganhar capacidades de autorrenovação normalmente atribuídas a células-tronco e se tornam elas próprias TPC (ou CSC). Em qualquer dos casos, ambos os tipos de células iniciadoras de tumor estão provavelmente representados na massa de tumor típica de um único paciente e são sujeitos a tratamento com os moduladores como divulgado aqui. Isto é, as composições divulgadas são geralmente eficazes na redução da frequência ou alteração da quimiossensibilidade de tais células iniciadoras de tumor positivas quanto a SEZ6 independentemente da modalidade particular ou mistura representada em um tumor.

[0084] No contexto da presente invenção, TPC são mais tumorigênicas, relativamente mais quiescentes e frequentemente mais quimiorresistentes do que as TProg (tanto ETP como LTP), células NTG e células não derivadas de TPC infiltrantes de tumor (p.ex., fibroblastos/estroma, células endoteliais & hematopoiéticas) que compreendem a massa de um tumor. Dado que as terapias e regimes convencionais têm sido, em grande parte, desenhados para debulk o tumor e atacar células rapidamente proliferativas, é provável que TPC sejam mais resistentes a terapias e regimes convencionais do que as TProg mais rapidamente proliferativas e outras populações de células de tumor bulk. Adicionalmente, TPC expressam frequentemente outras características que as tornam relativamente quimiorresistentes a terapias convencionais, tais como expressão aumentada de transportadores de resistência a multifármacos, mecanismos de reparação de DNA intensificados e proteínas antiapoptóticas. Estas propriedades, cada uma das quais contribui para tolerância a fármacos por TPC, constituem uma razão chave para a falha de regimes de tratamento de oncologia padrão para assegurar benefício a longo prazo para a maioria dos pacientes com neoplasia de estágio avançado: i.e., a falha de se dirigir adequadamente àquelas e erradicar aquelas células que alimentam o crescimento e recorrência continuados de tumor (i.e., TPC ou CSC).

[0085] Ao contrário de muitos tratamentos da técnica prévia, as novas composições da presente invenção reduzem preferencialmente a frequência de células iniciadoras de tumor após administração a um sujeito independentemente da forma ou alvo específico (p.ex., material genético, anticorpo de SEZ6 ou constructo de fusão de ligando) do modulador selecionado. Como notado acima, a redução na frequência das células iniciadoras de tumor pode ocorrer como um resultado de a) eliminação, esgotamento, sensibilização, silenciamento ou inibição das células iniciadoras de tumor; b) controle do crescimento, expansão ou recorrência das células iniciadoras de tumor; c) interrupção da iniciação, propagação, manutenção, ou proliferação das células iniciadoras de tumor; ou d) por impedimento de outro modo da sobrevivência, regeneração e/ou metastização das células tumorigênicas. Em algumas modalidades, a redução na frequência de células iniciadoras de tumor ocorre como resultado de uma mudança em uma ou mais vias fisiológicas. A mudança na via, quer por redução ou eliminação das células iniciadoras de tumor ou por modificação do seu potencial (p.ex., diferenciação induzida, disrupção de nicho) ou interferência de outro modo com a sua capacidade de influenciar do ambiente do tumor ou outras células, permite por seu turno o tratamento mais eficaz de distúrbios associados a SEZ6 por inibição da tumorigênese, manutenção do tumor e/ou metastização e recorrência.

[0086] Entre os métodos reconhecidos pela técnica que podem ser usados para avaliar tal redução na frequência de células iniciadoras de tumor está a análise de diluição limitante tanto in vitro como in vivo, preferencialmente seguida por enumeração usando estatística de distribuição de Poisson ou avaliação da frequência de eventos definitivos pré-definidos tais como a capacidade de gerar tumores in vivo ou não. Embora tal análise de diluição limitante compreenda métodos preferenciais de cálculo da redução da frequência de células iniciadoras de tumor, métodos menos exigentes podem ser também usados para determinar eficazmente os valores desejados, embora ligeiramente menos precisamente, e são inteiramente compatíveis com os ensinamentos aqui. Assim, como será apreciado por aqueles peritos na técnica, é também possível determinar a redução dos valores de frequência através de meios citométricos de fluxo e imunohistoquímicos bem conhecidos. No que toca a todos os métodos acima mencionados, ver, por exemplo, Dylla e outros. 2008, PMID: 18560594 & Hoey e outros. 2009, PMID: 19664991; cada um dos quais é incorporado aqui por referência na sua totalidade e, em particular, quanto aos métodos divulgados.

[0087] No que diz respeito à análise de diluição limitante, a enumeração in vitro da frequência de células iniciadoras de tumor pode ser alcançada por deposição de células de tumor humano fracionadas ou não fracionadas (p.ex., de tumores tratados e não tratados, respectivamente) em condições de crescimento in vitro que promovem a formação de colônias. Deste modo, as células formadoras de colônias podem ser enumeradas por simples contagem e caracterização de colônias, ou por análise consistindo, por exemplo, na deposição de células de tumor humano em placas em diluições em série e pontuação de cada poço como positivo ou negativo quanto a formação de colônias pelo menos 10 dias após plaqueamento. As experiências ou análises de diluição limitante in vivo, que são geralmente mais precisas na sua capacidade de determinarem a frequência de células iniciadoras de tumor, englobam o transplante de células de tumor humano, de populações de controle não tratadas ou tratadas, por exemplo, em camundongos imunocomprometidos em diluições em série e subsequentemente pontuação de cada camundongo como positivo ou negativo quanto a formação de tumor pelo menos 60 dias após transplante. A derivação de valores da frequência de células por análise de diluição limitante in vitro ou in vivo é preferencialmente feita por aplicação de estatística de distribuição de Poisson à frequência conhecida de eventos positivos e negativos, proporcionando deste modo uma frequência para eventos satisfazendo a definição de um evento positivo; em este caso, formação de colônia ou tumor, respectivamente.

[0088] Quanto a outros métodos compatíveis com a presente invenção que podem ser usados para calcular a frequência de células iniciadoras de tumor, o mais comum compreende técnicas citométricas de fluxo e procedimentos de coloração imunohistoquímica quantificáveis. Embora não tão precisos como as técnicas de análise de diluição limitante descritas imediatamente acima, estes procedimentos são muito menos trabalhosos e proporcionam valores razoáveis em um período de tempo relativamente curto. Assim, será apreciado que um especialista perito pode usar determinação citométrica de fluxo do perfil de marcadores da superfície das células empregando um ou mais anticorpos ou reagentes que se ligam a proteínas da superfície das células reconhecidas pela técnica que se sabe que enriquecem células iniciadoras de tumor (p.ex., marcadores potencialmente compatíveis como são apresentados no pedido PCT 2012/031280 que é incorporado aqui na sua totalidade) e medir desse modo os níveis de TIC a partir de várias amostras. Ainda em outro método compatível, um perito na técnica pode enumerar a frequência de TIC in situ (p.ex., em uma seção de tecido) por imunohistoquímica usando um ou mais anticorpos ou reagentes que são capazes de se ligar a proteínas da superfície da células que se pensa que demarcam estas células.

[0089] Aqueles peritos na técnica reconhecerão que numerosos marcadores (ou sua ausência) foram associados a várias populações de células-tronco do câncer e usados para isolar ou caracterizar subpopulações de células de tumor. A este respeito, os marcadores de células-tronco do câncer exemplares compreendem OCT4, Nanog, STAT3, EPCAM, CD24, CD34, NB84, TrkA, GD2, CD133, CD20, CD56, CD29, B7H3, CD46, receptor de transferrina, JAM3, carboxipeptidase M, ADAM9, oncostatina M, Lgr5, Lgr6, CD324, CD325, nestina, Sox1, Bmi-1, eed, easyh1, easyh2, mf2, yy1, smarcA3, smarckA5, smarcD3, smarcE1, mllt3, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT5A, WNT10B, WNT16, AXIN1, BCL9, MYC, (TCF4) SLC7A8, IL1RAP, TEM8, TMPRSS4, MUC16, GPRC5B, SLC6A14, SLC4A11, PPAP2C, CAV1, CAV2, PTPN3, EPHA1, EPHA2, SLC1A1, CX3CL1, ADORA2A, MPZL1, FLJ10052, C4.4A, EDG3, RARRES1, TMEPAI, PTS, CEACAM6, NID2, STEAP, ABCA3, CRIM1, IL1R1, OPN3, DAF, MUC1, MCP, CPD, NMA, ADAM9, GJA1, SLC19A2, ABCA1, PCDH7, ADCY9, SLC39A1, NPC1, ENPP1, N33, GPNMB, LY6E, CELSR1, LRP3, C20orf52, TMEPAI, FLVCR, PCDHA10, GPR54, TGFBR3, SEMA4B, PCDHB2, ABCG2, CD166, AFP, BMP-4, β-catenina, CD2, CD3, CD9, CD14, CD31, CD38, CD44, CD45, CD74, CD90, CXCR4, decorina, EGFR, CD105, CD64, CD16, CD16a, CD16b, GLI1, GLI2, CD49b, e CD49f. Ver, por exemplo, Schulenburg e outros., 2010, PMID: 20185329, U.S.P.N. 7,632,678 e U.S.P.Ns. 2007/0292414, 2008/0175870, 2010/0275280, 2010/0162416 e 2011/0020221, cada um dos quais é incorporado aqui por referência. Será adicionalmente apreciado que cada um dos marcadores acima mencionados pode ser também usado como um antigênio alvo secundário no contexto dos anticorpos biespecíficos ou multiespecíficos da presente invenção.

[0090] Similarmente, exemplos não limitantes de fenótipos da superfície das células associados a células-tronco do câncer de certos tipos de tumores incluem CD44elevCD24baix, ALDH+, CD133+, CD123+, CD34+CD38-, CD44+CD24-, CD46elevCD324+CD66c-, CD133+CD34+CD10-CD19-, CD138-CD34-CD19+, CD133+RC2+, CD44+α2 β1elevCD133+, CD44+CD24+ESA+, CD271+, ABCB5+, bem como outros fenótipos da superfície de células-tronco do câncer que são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Schulenburg e outros., 2010, supra, Visvader e outros., 2008, PMID: 18,784,658 e U.S.P.N. 2008/0138313, cada um dos quais é incorporado aqui na sua totalidade por referência. Aqueles peritos na técnica apreciarão que os fenótipos de marcadores tais como aqueles exemplificados imediatamente acima podem ser usados em conjunto com análise citométrica de fluxo e técnicas de separação de células padrão para caracterizar, isolar, purificar ou enriquecer células ou populações de células TIC e/ou TPC para análise adicional. De interesse no que diz respeito à presente invenção, CD46, CD324 e, opcionalmente, CD66c são altamente ou heterogeneamente expressos à superfície de muitas células de tumores colorretal ("CR"), da mama ("BR"), das células não pequenas do pulmão (NSCLC), das células pequenas do pulmão (SCLC), pancreático ("PA"), melanoma ("Mel"), dos ovários ("OV"), e da cabeça e pescoço ("HN") humanos, independentemente de se os espécimes de tumor sendo analisados eram espécimes de tumor de pacientes primários ou tumores NTX derivados de pacientes.

[0091] Usando qualquer um dos métodos acima referenciados e marcadores selecionados como conhecido na técnica, é depois possível quantificar a redução na frequência de TIC (ou as TPC nelas) proporcionadas pelos moduladores de SEZ6 divulgados (incluindo aqueles conjugados com agentes citotóxicos) de acordo com os ensinamentos aqui. Em alguns casos, os compostos da presente invenção podem reduzir a frequência de TIC ou TPC (por uma variedade de mecanismos notados acima, incluindo eliminação, diferenciação induzida, disrupção de nicho, silenciamento, etc.) em 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 % ou mesmo em 35 %. Em outras modalidades, a redução na frequência de TIC ou TPC pode ser na ordem de 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 % ou 65 %. Em certas modalidades, os compostos divulgados podem reduzir a frequência de TIC ou TPC em 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou mesmo 95 %. Obviamente, será apreciado que qualquer redução da frequência das TIC ou TPC resulta tipicamente em uma redução correspondente na tumorigenicidade, persistência, recorrência e agressividade da neoplasia.

IV. Moduladores de SEZ6

[0092] Em qualquer um dos casos, a presente invenção está dirigida ao uso de moduladores de SEZ6, incluindo antagonistas de SEZ6, para o diagnóstico, teragnóstico, tratamento e/ou profilaxia de vários distúrbios incluindo qualquer uma de um número de malignidades associadas a SEZ6. Os moduladores divulgados podem ser usados sozinhos ou em conjunto com uma ampla variedade de compostos anticâncer tais como agentes quimioterapêuticos ou imunoterapêuticos (p.ex., anticorpos terapêuticos) ou modificadores da resposta biológica. Em outras modalidades selecionadas, dois ou mais moduladores de SEZ6 discretos podem ser usados em combinação para proporcionar efeitos antineoplásicos intensificados ou podem ser usados para fabricar constructos multiespecíficos.

[0093] Em certas modalidades, os moduladores de SEZ6 da presente invenção compreenderão nucleotídeos, oligonucleotídeos, polinucleotídeos, peptídeos ou polipeptídeos. Mais particularmente, moduladores exemplares da invenção podem compreender anticorpos e seus fragmentos ou derivados de ligação do antigênio, proteínas, peptídeos, glicoproteínas, glicopeptídeos, glicolípidos, polissacarídeos, oligossacarídeos, ácidos nucleicos, constructos antissenso, siRNA, miRNA, moléculas bioorgânicas, peptidomiméticos, agentes farmacológicos e seus metabolitos, sequências de controle transcricional e da tradução, e similares. Em certas modalidades, os moduladores compreenderão SEZ6 solúvel (sSEZ6) ou uma sua forma, variante, derivado ou fragmento incluindo, por exemplo, constructos de fusão de SEZ6 (p.ex., SEZ6-Fc, SEZ6-porção alvo, etc.) ou conjugados de SEZ6 (p.ex.., SEZ6-PEG, SEZ6-agente citotóxico, SEZ6-brm, etc.). Também será apreciado que, em outras modalidades, os moduladores de SEZ6 compreendem anticorpos ou fragmentos imunorreativos ou seus derivados. Em modalidades particularmente preferenciais, os moduladores da presente invenção compreenderão anticorpos neutralizantes ou seus derivados ou fragmentos. Em outras modalidades, os moduladores de SEZ6 podem compreender anticorpos internalizantes ou seus fragmentos. Ainda em outras modalidades, os moduladores de SEZ6 podem compreender anticorpos esgotantes ou seus fragmentos. Além do mais, como com os constructos de fusão acima mencionados, esses moduladores de anticorpo podem ser conjugados com, ligados a ou de outro modo associados a agentes citotóxicos, polímeros, modificadores da resposta biológica (BRMs) selecionados ou similares para proporcionar imunoterapias direcionadas com vários (e opcionalmente múltiplos) mecanismos de ação. Como acima aludido, tais anticorpos podem ser anticorpos pan-SEZ6 e podem associar-se a dois ou mais membros da família SEZ6 (por exemplo, SEZ6 e SEZ6L, como mostrado na FIG. 11A) ou anticorpos imunoespecíficos que seletivamente reagem com uma ou mais isoformas de SEZ6. Ainda em outras modalidades, os moduladores podem operar ao nível genético e podem compreender compostos como constructos antissenso, siRNA, miRNA e similares que interatuam com o ou se associam ao componente genotípico de um determinante de SEZ6.

[0094] Será adicionalmente apreciado que os moduladores de SEZ6 divulgados podem esgotar, silenciar, neutralizar, eliminar ou inibir o crescimento, propagação ou sobrevivência de células de tumor, incluindo TPC, e/ou neoplasia associada através de uma variedade de mecanismos, incluindo agonismo ou antagonismo de vias selecionadas ou eliminação de células específicas dependendo, por exemplo, da forma de modulador de SEZ6, qualquer carga ou dosagem associada e método de distribuição. Assim, embora modalidades preferenciais divulgadas aqui estejam dirigidas ao esgotamento, inibição ou silenciamento de subpopulações de células de tumor específicas tais como células perpetuadoras de tumor ou a moduladores que interatuam com um epítopo ou domínio específico, tem de ser enfatizado que tais modalidades são meramente ilustrativas e não limitantes de qualquer modo. Ao invés, como apresentado nas reivindicações anexas, a presente invenção está amplamente dirigida a moduladores de SEZ6 e seu uso no tratamento, gestão ou profilaxia de vários distúrbios associados a SEZ6 independentemente de qualquer mecanismo, região de ligação ou população de células de tumor alvo particular.

[0095] Independentemente da forma do modulador selecionado, será apreciado que o composto escolhido pode ter uma natureza antagonista. Como usado aqui, um "antagonista" se refere a uma molécula capaz de neutralizar, bloquear, inibir, revogar, reduzir ou interferir com as atividades de um alvo particular ou especificado (p.ex., SEZ6), incluindo a ligação de receptores a ligandos ou as interações de enzimas com substratos. A este respeito, será apreciado que os antagonistas de SEZ6 da presente invenção podem compreender qualquer ligando, polipeptídeo, peptídeo, proteína de fusão, anticorpo ou seu fragmento ou derivado imunologicamente ativo que reconhece, reage, se liga a, se combine com, compete com, se associa a ou de outro modo interage com a proteína SEZ6 ou seu fragmento e elimina, silencia, reduz, inibe, impede, restringe ou controla o crescimento de células iniciadoras de tumor ou outras células neoplásicas incluindo massa de tumor ou célula NTG. Antagonistas compatíveis podem adicionalmente incluir inibidores de pequena molécula, aptâmeros, constructos antissenso, siRNA, miRNA e similares, moléculas de receptor ou ligando e seus derivados que reconhecem ou se associam a um determinante genotípico ou fenotípico de SEZ6 alterando deste modo os padrões de expressão ou sequestrando a sua ligação a ou interação com um substrato, receptor ou ligando.

[0096] Como usado aqui, um antagonista se refere a uma molécula capaz de neutralizar, bloquear, inibir, revogar, reduzir ou interferir com as atividades de uma proteína particular ou especificada, incluindo a ligação de receptores a ligandos ou as interações de enzimas com substratos. Mais geralmente, os antagonistas da invenção podem compreender anticorpos e seus fragmentos ou derivados de ligação do antigênio, proteínas, peptídeos, glicoproteínas, glicopeptídeos, glicolípidos, polissacarídeos, oligossacarídeos, ácidos nucleicos, constructos antissenso, siRNA, miRNA, moléculas bioorgânicas, peptidomiméticos, agentes farmacológicos e seus metabolitos, sequências de controle transcricional e da tradução, e similares. Os antagonistas podem também incluir inibidores de pequena molécula, proteínas de fusão, moléculas de receptor e derivados que se ligam especificamente à proteína sequestrando assim a sua ligação ao seu alvo de substrato, variantes de substrato, variantes de antagonista da proteína, moléculas antissenso dirigidas para a proteína, aptâmeros de RNA e ribozimas contra a proteína.

[0097] Como usados aqui e aplicados a duas ou mais moléculas ou compostos, os termos "reconhece" ou "se associa a" devem ser considerados como significando a reação, ligação, ligação específica, combinação, interação, conexão, ligação, união, coalescência, fusão ou junção, covalentemente ou não covalentemente, das moléculas pela qual uma molécula exerce um efeito na outra molécula.

[0098] Além do mais, como demonstrado nos exemplos aqui (p.ex., ver FIG. 11), alguns moduladores de SEZ6 humano podem, em certos casos, reagir de modo cruzado com SEZ6 de uma espécie que não a humana (p.ex., rato ou macaco cinomolgo). Em outros casos, moduladores exemplares podem ser específicos quanto a uma ou mais isoformas de SEZ6 humano e não exibirão reatividade cruzada com ortólogos de SEZ6 de outras espécies. Obviamente, em conjunto com os ensinamentos aqui, tais modalidades podem compreender anticorpos de pan-SEZ6 que se associam a dois ou mais membros da família de SEZ6 de uma única espécie ou anticorpos que se associam exclusivamente a SEZ6.

[0099] Em qualquer um dos casos, e como será discutido em mais detalhe em baixo, os peritos na técnica apreciarão que os moduladores divulgados podem ser usados em uma forma conjugada ou não conjugada.. Isto é, o modulador pode estar associado a ou conjugado com (p.ex., covalentemente ou não covalentemente) compostos farmaceuticamente ativos, modificadores da resposta biológica, agentes anticâncer, agentes citotóxicos ou citostáticos, frações de diagnóstico ou modificadores biocompatíveis. A este respeito, será entendido que tais conjugados podem compreender peptídeos, polipeptídeos, proteínas, proteínas de fusão, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequenas, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgânicas, moléculas orgânicas e radioisótopos. Além do mais, como indicado aqui, o conjugado selecionado pode estar covalentemente ou não covalentemente ou ligado ao modulador de SEZ6 em várias razões molares dependendo, pelo menos em parte, do método usado para efetuar a conjugação.

V. Fabricação e Fornecimento do Modulador A. Moduladores de Anticorpo 1. Visão Global

[00100] Como previamente aludido, modalidades particularmente preferenciais da presente invenção compreendem moduladores de SEZ6 na forma de anticorpos que se associam preferencialmente a uma ou mais isoformas de SEZ6 (e, opcionalmente, podem reagir de modo cruzado com outros membros da família SEZ6). Aqueles com perícia vulgar na técnica apreciarão a base de conhecimento bem desenvolvida sobre anticorpos tais como apresentada, por exemplo, em Abbas e outros., Cellular and Molecular Immunology, 6a ed., W.B. Saunders Company (2010) ou Murphey e outros., Janeway’s Immunobiology, 8a ed., Garland Science (2011), cada um dos quais é incorporado aqui por referência na sua totalidade.

[00101] O termo "anticorpo" se destina a abranger anticorpos policlonais, anticorpos multiclonais, anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e primatizados, anticorpos humanos, anticorpos recombinantemente produzidos, intracorpos, anticorpos multiespecíficos, anticorpos biespecíficos, anticorpos monovalentes, anticorpos bivalentes, anticorpos anti-idiotípicos, anticorpos sintéticos, incluindo muteínas e suas variantes, fragmentos de anticorpo tais como fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), FvFcs de cadeia única, Fvs de cadeia única; e seus derivados, incluido fusões Fc e outras modificações e qualquer outra molécula imunologicamente ativa desde que exiba atividade biológica desejada (i.e., associação a ou ligação de antigênio). Além do mais, o termo compreende adicionalmente todas as classes de anticorpos (i.e., IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM) e todos os isotipos (i.e., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2), bem como suas variações a não ser que ditado de outro modo pelo contexto. Os domínios da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de anticorpos são denotados pela correspondente letra minúscula grega α, δ, ε, Y, e μ, respectivamente. Às cadeias leves dos anticorpos de qualquer espécie de vertebrados pode ser atribuído um de dois tipos claramente distintos, chamados kappa (K) e lambda (À), com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes.

[00102] Embora todos tais anticorpos estejam dentro do escopo da presente invenção, modalidades preferenciais compreendendo a classe IgG de imunoglobulinas serão discutidas em algum detalhe aqui somente para os propósitos de ilustração. Será entendido que tal divulgação é, no entanto, meramente demonstrativa de composições exemplares e métodos de prática da presente invenção e não de qualquer modo limitante do escopo da invenção ou das reivindicações anexadas a ela.

[00103] Como é bem conhecido, os domínios variáveis das porções de cadeia leve (VL) e pesada (VH) determinam o reconhecimento e especificidade do antigênio e os domínios constantes da cadeia leve (CL) e da cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) conferem e regulam importantes propriedades biológicas tais como secreção, mobilidade transplacental, meia-vida de circulação, ligação do complemento, e similares.

[00104] A região "variável" inclui locais hipervariáveis que se manifestam em três segmentos comummente denominados regiões determinadoras da complementaridade (CDRs), em ambos os domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis flanqueando as CDRs são denominadas regiões framework (FRs). Por exemplo, em anticorpos de imunoglobulina G (IgG) monomérica que ocorrem naturalmente, as seis CDRs presentes em cada braço do "Y" são sequências pequenas, não contíguas de aminoácidos que estão especificamente posicionadas para formar o local de ligação do antigênio à medida que o anticorpo assume a sua configuração tridimensional em um ambiente aquoso. Assim, cada anticorpo de IgG que ocorre naturalmente compreende dois locais de ligação idênticos próximos do terminal amino de cada braço do Y.

[00105] Será apreciado que a posição das CDRs pode ser prontamente identificada por um com perícia vulgar na técnica usando técnicas padrão. Também familiar àqueles na técnica é o sistema de numeração descrito em Kabat e outros. (1991, Publicação dos NIH 913242, National Technical Information Service, Springfield, Va.). A este respeito, Kabat e outros. definiram um sistema de numeração para sequências do domínio variável que é aplicável a qualquer anticorpo. Um com perícia vulgar na técnica pode inequivocamente atribuir este sistema de "numeração de Kabat" a qualquer sequência do domínio variável, sem apoio em quaisquer dados experimentais para além da própria sequência. A não ser que especificado de outro modo, as referências à numeração de posições de resíduos de aminoácidos específicos em um anticorpo são de acordo com o sistema de numeração de Kabat.

[00106] Assim, de acordo com Kabat, nos VH, os resíduos 31-35 compreendem CDR1, os resíduos 50-65 constituem CDR2, e 95-102 compreendem CDR3, enquanto, na VL, os resíduos 24-34 são CDR1, 50-56 compreendem CDR2, e 89-97 constituem CDR3. Para contexto, em um VH, FR1 corresponde ao domínio da região variável englobando os aminoácidos 1-30; FR2 corresponde ao domínio da região variável englobando os aminoácidos 36-49; FR3 corresponde ao domínio da região variável englobando os aminoácidos 66-94, e FR4 corresponde ao domínio da região variável englobando dos aminoácidos 103 ao final da região variável. As FRs para a cadeia leve estão similarmente separadas por uma CDRs da região variável da cadeia leve.

[00107] Note que as CDRs variam consideravelmente de anticorpo para anticorpo (e por definição não exibirão homologia com as sequências de consenso de Kabat). Adicionalmente, a identidade de certos resíduos individuais em qualquer número de local de Kabat podem variar de cadeia de anticorpo para cadeia de anticorpo devido a divergência interespécie ou alélica. Numeração alternativa é apresentada em Chothia e outros., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) e MacCallum e outros., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), embora, como em Kabat, as fronteiras de FR estejam separadas pelos respectivos terminais CDR como descrito acima. Ver também Chothia e outros., Nature 342, pp. 877-883 (1989) e S. Dubel, ed., Handbook of Therapeutic Antibodies, 3a ed., WILEY-VCH Verlag GmbH and Co. (2007), onde as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparadas umas contra as outras. Cada um das referências acima mencionadas é incorporada aqui por referência na sua totalidade e os resíduos de aminoácidos que compreendem regiões de ligação ou CDRs como definido por qualquer uma das referências acima citadas são apresentados para comparação em baixo. Definições de CDR 1A numeração dos resíduos segue a nomenclatura de Kabat e outros., supra 2A numeração dos resíduos segue a nomenclatura de Chothia e outros., supra 3A numeração dos resíduos segue a nomenclatura de MacCallum e outros., supra

[00108] No contexto da presente invenção, será apreciado que qualquer uma das CDRs de cadeia leve ou pesada divulgadas derivada das sequências de aminoácidos da região variável de murino apresentadas na FIG. 10A ou FIG. 10B pode ser combinada ou rearranjada para proporcionar anticorpos anti-SEZ6 (p.ex., anti-hSEZ6 humanizados, enxertados com CDR ou quiméricos) de acordo com os presentes ensinamentos. Isto é, uma ou mais das CDRs derivadas das sequências de aminoácidos da região variável da cadeia leve apresentadas na FIG. 10A (SEQ ID NOS: 20 - 168, números pares) ou as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada apresentadas na FIG. 10B (SEQ ID NOS: 21 - 169, números ímpares) podem ser incorporadas em um modulador de SEZ6 e, em modalidades particularmente preferenciais, em um anticorpo enxertado com CDR ou humanizado que se associa imunoespecificamente a uma ou mais isoformas de SEZ6. Exemplos de sequências de aminoácidos da região variável da cadeia leve (SEQ ID NOS: 170 - 192, números pares) e pesada (SEQ ID NOS: 171 - 193, números ímpares e 194 - 199) de tais moduladores humanizados são também apresentados nas FIGS. 10A e 10B.

[00109] De notar que hSC17.200vL1 (SEQ ID NO: 192) é uma variante do constructo da cadeia leve humanizada hSC17.200 (SEQ ID NO: 190), hSC17.155vH1 - vH6 (SEQ ID NOS: 193-198) são variantes do constructo da cadeia pesada hSC.155 (SEQ ID NO: 184) que é derivada de SC17.90 (SEQ ID NO: 127) e que hSC161vH1 (SEQ ID NO: 199) é uma variante do constructo da cadeia pesada hSC17.161 (SEQ ID NO: 189). Como será discutido em maior detalhe abaixo, essas variantes serão construídas e testadas para otimizar uma ou mais propriedades bioquímicas do anticorpo principal.

[00110] Tomadas em conjunto, estas novas sequências de aminoácidos ilustram setenta e cinco moduladores exemplares de murino e onze humanizados (juntamente com variantes reportadas) de acordo com a presente invenção. Além do mais, as correspondentes sequências de ácido nucleico de cada um dos setenta e cinco moduladores de murino exemplares e onze moduladores humanizados e variantes apresentadas nas FIGS. 10A e 10B estão incluídas na listagem de sequências do presente pedido (SEQ ID NOS: 220 - 399).

[00111] Nas FIGS. 10A e 10B, as CDRs anotadas são definidas usando numeração de Chothia. No entanto, como discutido aqui e demonstrando no Exemplo 8 em baixo, um perito na técnica poderia prontamente definir, identificar, derivar e/ou enumerar as CDRs como definido por Kabat e outros., Chothia e outros. ou MacCallum e outros. para cada sequência de cadeia pesada e leve respectiva apresentada na FIG. 10A ou FIG. 10B. Conformemente, cada uma das CDRs e anticorpos compreendendo CDRs objeto definidos por toda tal nomenclatura está expressamente incluído dentro do escopo da presente invenção. Mais amplamente, os termos "resíduo de aminoácido da CDR da região variável" ou mais simplesmente "CDR" incluem aminoácidos em uma CDR como identificado usando qualquer método baseado em sequência ou estrutura como apresentado acima.

2. Geração de Modulador de Anticorpo a. Anticorpos policlonais

[00112] A produção de anticorpos policlonais em vários animais hospedeiros, incluindo coelhos, camundongos, ratos, etc. é bem conhecida na técnica. Em algumas modalidades, soro contendo anticorpo anti-SEZ6 policlonal é obtido por sangramento ou sacrifício do animal. O soro pode ser usado para propósitos de pesquisa na forma obtida do animal ou, em alternativa, os anticorpos anti-SEZ6 podem ser parcialmente ou completamente purificados para proporcionar frações de imunoglobulina ou preparações de anticorpo homogêneas.

[00113] Brevemente, o animal selecionado é imunizado com um imunogênio de SEZ6 (p.ex., SEZ6 solúvel ou sSEZ6 ) que pode, por exemplo, compreender isoformas, domínios e/ou peptídeos selecionados, ou células ou preparações de células vivas expressando SEZ6 ou seus fragmentos imunorreativos. Adjuvantes conhecidos na técnica que podem ser usados para aumentar a resposta imunológica, dependendo da espécie inoculada, incluem, mas não estão limitados a, Freund (completo e incompleto), géis minerais tais como hidróxido de alumínio, substâncias tensioativas tais como lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões de óleo, hemocianinas de chave/fechadura, dinitrofenol, e adjuvantes humanos potencialmente úteis tais como BCG (bacilo Calmette-Guerin) e corynebacterium parvum. Tais adjuvantes podem proteger o antigênio de dispersão rápida por seu sequestro em um depósito local, ou podem conter substâncias que estimulam o hospedeiro para secretar fatores que são quimiotáticos para macrófagos e outros componentes do sistema imune. Preferencialmente, o programa de imunização envolverá duas ou mais administrações do imunogênio selecionado espalhadas ao longo de um período de tempo pré-determinado.

[00114] A sequência de aminoácidos de uma proteína SEZ6 como mostrado nas FIGS. 1C ou 1D pode ser analisada para selecionar regiões específicas da proteína SEZ6 para geração de anticorpos. Por exemplo, análises de hidrofobicidade e hidrofilicidade de uma sequência de aminoácidos de SEZ6 são usadas para identificar regiões hidrofílicas na estrutura de SEZ6. As regiões de uma proteína SEZ6 que mostram estrutura imunogênica, bem como outras regiões e domínios, podem ser prontamente identificadas usando vários outros métodos conhecidos na técnica, tais como análises de Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz ou Jameson-Wolf. Perfis de Flexibilidade Média podem ser gerados usando o método de Bhaskaran R., Ponnuswamy P. K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255. Perfis de volta beta podem ser gerados usando o método de Deleage, G., Roux B., 1987, Protein Engineering 1:289-294. Assim, cada região, domínio ou motivo de SEZ6 identificado por qualquer um destes programas ou métodos está dentro do escopo da presente invenção e pode ser isolado ou manipulado para proporcionar imunogênios dando origem a moduladores compreendendo propriedades desejadas. Métodos preferenciais para a geração de anticorpos de SEZ6 são adicionalmente ilustrados por meio dos Exemplos proporcionados aqui. Métodos para preparação de uma proteína ou polipeptídeo para uso como um imunogênio são bem conhecidos na técnica. Também bem conhecidos na técnica são métodos para preparação de conjugados imunogênicos de uma proteína com um transportador, tal como BSA, KLH ou outra proteína transportadora. Em algumas circunstâncias, é usada conjugação direta usando, por exemplo, reagentes de carboiimida; em outros casos, reagentes de ligação são eficazes. A administração de um imunogênio de SEZ6 é frequentemente conduzida por injeção ao longo de um período de tempo adequado e com uso de um adjuvante adequado, como é entendido na técnica. Durante o programa de imunização, os títulos de anticorpos podem ser tomados como descrito nos Exemplos em baixo para determinar a adequação da formação de anticorpos.

b. Anticorpos monoclonais

[00115] Adicionalmente, a invenção contempla o uso de anticorpos monoclonais. Como conhecido na técnica, o termo "anticorpo monoclonal" (ou mAb) se refere a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, i.e., os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto para possíveis mutações (p.ex., mutações ocorrendo naturalmente) que podem estar presentes em quantidades mínimas. Em certas modalidades, um tal anticorpo monoclonal inclui um anticorpo compreendendo uma sequência de polipeptídeo que se liga ou se associa a um antigênio em que a sequência de polipeptídeo de ligação do antigênio foi obtida por um processo que inclui a seleção de uma única sequência de polipeptídeo de ligação alvo de uma pluralidade de sequências de polipeptídeo.

[00116] Mais geralmente, e como exemplificado no Exemplo 6 aqui, os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma ampla variedade de técnicas conhecidas na técnica incluindo hibridoma, técnicas recombinantes, tecnologia de exibição de fagos, animais transgênicos (p.ex., um XenoMouse®) ou alguma sua combinação. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando hibridoma e técnicas de manipulação bioquímica e genética reconhecidas pela técnica tal como descrito em mais detalhe em An, Zhigiang (ed.) Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley and Sons, 1a ed. 2009; Shire e outros. (eds.) Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Springer Science + Business Media LLC, 1a ed. 2010; Harlow e outros., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988; Hammerling, e outros., em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.I., 1981), cada um dos quais é incorporado aqui na sua totalidade por referência. Deve ser entendido que uma sequência de ligação selecionada pode ser adicionalmente alterada, por exemplo, para melhorar a afinidade para o alvo, para humanizar a sequência de ligação alvo, para melhorar a sua produção em cultura de células, para reduzir a sua imunogenicidade in vivo, para criar um anticorpo multiespecífico, etc., e que um anticorpo compreendendo a sequência de ligação alvo alterada é também um anticorpo desta invenção.

c. Anticorpos quiméricos

[00117] Em outra modalidade, o anticorpo da invenção pode compreender anticorpos quiméricos derivados de segmentos de proteína covalentemente unidos de pelo menos duas espécies ou tipos de anticorpos diferentes. Como conhecido na técnica, o termo anticorpos "quiméricos" está dirigido a constructos nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica a ou homóloga com sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpos particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico a ou homólogo com sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (U.S. P.N. 4,816,567; Morrison e outros., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).

[00118] Em uma modalidade, um anticorpo quimérico de acordo com os ensinamentos aqui podem compreender sequências de aminoácido VH e VL de murino e regiões constantes derivadas de fontes humanas. Em outras modalidades compatíveis, um anticorpo quimérico da presente invenção pode compreender um anticorpo humanizado como descrito em baixo. Em outra modalidade, o assim chamado anticorpo "enxertado com CDR", o anticorpo compreende uma ou mais CDRs de uma espécie particular de particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpos particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) de anticorpo é idêntico a ou homólogo com uma sequência correspondente em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpos. Para uso em humanos, CDRs de roedor selecionadas podem ser enxertadas em um anticorpo humano, substituindo uma ou mais das regiões variáveis ocorrendo naturalmente ou CDRs do anticorpo humano. Estes constructos têm geralmente a vantagem de proporcionarem funções moduladoras de força plena (p.ex., CDC (citotoxicidade dependente do complemento), ADCC (citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo), etc.) enquanto reduzem respostas imunes indesejadas ao anticorpo pelo sujeito.

d. Anticorpos humanizados

[00119] Similar ao anticorpo enxertado com CDR é um anticorpo "humanizado". Como usadas aqui, formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (p.ex., de murino) são anticorpos quiméricos que contêm uma sequência mínima derivada de uma ou mais imunoglobulinas não humanas. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado é uma imunoglobulina humana (anticorpo recipiente ou aceitador) na qual resíduos de uma CDR do recipiente estão substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como camundongo, rato, coelho, ou primata não humano tendo a especificidade, afinidade, e/ou capacidade desejadas. Em certas modalidades preferenciais, os resíduos em uma ou mais FRs no domínio variável da imunoglobulina humana estão substituídos por resíduos não humanos correspondentes do anticorpo dador para ajudar a manter a configuração tridimensional apropriada da(s) CDR(s) enxertada(s) e melhorar deste modo a afinidade. Além do mais, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recipiente ou no anticorpo dador para, por exemplo, refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo.

[00120] O enxerto de CDR e anticorpos humanizados são descritos, por exemplo, em U.S.P.Ns. 6,180,370 e 5,693,762. O anticorpo humanizado pode também opcionalmente compreender pelo menos uma porção de Fc de uma imunoglobulina, tipicamente aquele de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, ver, p.ex.., Jones e outros., Nature 321:522-525 (1986); e U.S.P.Ns. 6,982,321 e 7,087,409. Ainda outro método é denominado "humaneering" que é descrito, por exemplo, em U.S.P.N. 2005/0,008,625. Adicionalmente, um anticorpo não humano pode ser também modificado por deleção específica de epítopos de células T humanas ou "desimunização" pelos métodos divulgados em WO 98/52976 e WO 00/34317. Cada uma das referências acima mencionadas é incorporada aqui na sua totalidade.

[00121] Anticorpos humanizados podem ser também biomanipulados usando técnicas de biologia molecular comuns, tais como isolamento, manipulação, e expressão de sequências de ácido nucleico que codificam todas as ou parte das regiões variáveis da imunoglobulina de pelo menos uma de uma cadeia pesada ou leve. Adicionalmente às fontes de tal ácido nucleico notado acima, sequências de linha germinativa humana estão disponíveis, por exemplo, em Tomlinson, I. A. e outros. (1992) J. Mol. Biol. 227:776798; Cook, G. P. e outros. (1995) Immunol. Today 16: 237-242; Chothia, D. e outros. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; e Tomlinson e outros. (1995) EMBO J 14:4628-4638. O diretório V-BASE (VBASE2 - Retter e outros., Nucleic Acid Res. 33; 671-674, 2005) proporciona um diretório completo de sequências da região variável da imunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, I. A. e outros. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, RU). FRs humanas de consenso podem ser também usadas, p.ex., como descrito em U.S.P.N. 6.300.064.

[00122] Em modalidades selecionadas, e como detalhado no Exemplo 8 em baixo, pelo menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, ou 80 % dos resíduos de aminoácidos da região variável da cadeia pesada ou leve do anticorpo humanizado corresponderão àqueles das sequências de FR e CDR recipientes. Em outras modalidades, pelo menos 85 % ou 90 % dos resíduos da região variável do anticorpo humanizado corresponderão àqueles das sequências de FR e CDR recipientes. Em uma modalidade preferencial adicional, mais do que 95 % dos resíduos da região variável do anticorpo humanizado corresponderão àqueles das sequências de FR e CDR recipientes.

e. Anticorpos humanos

[00123] Em outra modalidade, os anticorpos podem compreender anticorpos completamente humanos. O termo "anticorpo humano" se refere a um anticorpo que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um humano e/ou foi feito usando qualquer uma das técnicas para fabricação de anticorpos humanos.

[00124] Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na técnica. Uma técnica é exibição de fagos na qual uma biblioteca de anticorpos (preferencialmente humanos) é sintetizada em fagos, a biblioteca é rastreada com o antigênio de interesse ou uma sua porção de ligação do anticorpo, e o fago que se liga ao antigênio é isolado, do qual se pode obter os fragmentos imunorreativos. Métodos para preparação e rastreio de tais bibliotecas são bem conhecidos na técnica e conjuntos para geração de bibliotecas de exibição de fagos estão comercialmente disponíveis (p.ex., o Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, no. de catálogo 27-9400-01; e o conjunto de exibição de fagos SurfZAPTM da Stratagene, no. de catálogo 240612). Existem também outros métodos e reagentes que podem ser usados na geração e rastreio de bibliotecas de exibição de fagos (ver, p.ex., U.S.P.N. 5,223,409; Publicações PCT Nos. WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; e Barbas e outros., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991)).

[00125] Em uma modalidade, os anticorpos humanos recombinantes podem ser isolados por rastreio de uma biblioteca de anticorpos combinatoriais recombinantes preparada como acima. Em uma biblioteca, a biblioteca é uma biblioteca de exibição de fagos scFv, gerada usando cDNAs de VL e VH humanos preparados a partir de mRNA isolado de células B.

[00126] Os anticorpos produzidos por bibliotecas ingênuas (naturais ou sintéticos) podem ter afinidade moderada (Ka de cerca de 106 a 107 M-1), mas a maturação da afinidade pode ser também mimetizado in vitro por construção e resseleção de bibliotecas secundárias como descrito na técnica. Por exemplo, a mutação pode ser introduzida aleatoriamente in vivo por uso de polimerase propensa a erros (relatado em Leung e outros., Technique, 1: 11-15 (1989)). Adicionalmente, a maturação da afinidade pode ser realizada por mutação aleatória de uma ou mais CDRs, p.ex. usando PCR com iniciadores transportadores sequências aleatórias abrangendo a CDR de interesse, em clones Fv individuais selecionados e rastreio de clones de afinidade mais elevada. WO 9607754 descreveu um método para indução de mutagênese em uma CDR de uma cadeia leve da imunoglobulina para criar uma biblioteca de genes da cadeia leve. Outra abordagem eficaz é recombinar os domínios VH ou VL selecionados por exibição de fagos com repertórios de variantes do domínio V ocorrendo naturalmente obtidas de dadores não imunizados e rastrear quanto a afinidade mais elevada em várias rondas de re- embaralhamento de cadeia como descrito em Marks e outros., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Esta técnica permite a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos com uma constante de dissociação KD (koff/kon) de cerca de 10-9 M ou menos.

[00127] Em outras modalidades, podem ser empregues procedimentos similares usando bibliotecas compreendendo células eucarióticas (p.ex., levedura) que expressam pares de ligação na sua superfície. Ver, por exemplo, U.S.P.N. 7,700,302 e U.S.S.N. 12/404,059. Em uma modalidade, o anticorpo humano é selecionado de uma biblioteca de fagos, onde essa biblioteca de fagos expressa anticorpos humanos (Vaughan e outros. Nature Biotechnology 14:309314 (1996): Sheets e outros. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6157-6162 (1998). Em outras modalidades, os pares de ligação humanos podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos combinatoriais geradas em células eucarióticas tais como levedura. Ver, p.ex., U.S.P.N. 7.700.302. Tais técnicas permitem vantajosamente o rastreio de grandes números de moduladores candidatos e proporcionam manipulação relativamente fácil de sequências candidatas (p.ex., por maturação da afinidade ou embaralhamento recombinante).

[00128] Os anticorpos humanos podem ser também feitos por introdução de loci de imunoglobulina humana em animais transgênicos, p.ex., camundongos nos quais os genes de imunoglobulina endógenos foram parcialmente ou completamente inativados e genes de imunoglobulina humanos foram introduzidos. Após desafio, é observada produção de anticorpos humanos, que se assemelha intimamente com aquela vista em humanos em todos os aspetos, incluindo, rearranjo dos genes, montagem, e repertório de anticorpos. Esta abordagem é descrita, por exemplo, em U.S.P.Ns. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, e U.S.P.Ns. 6,075,181 e 6,150,584 no que toca à tecnologia XenoMouse ; e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado através da imortalização de linfócitos B humanos produzindo um anticorpo dirigido contra um antigênio alvo (tais linfócitos B podem ser recuperados de um indivíduo sofrendo de um distúrbio neoplásico ou que pode ter sido imunizado in vitro). Ver, p.e.x,, Cole e outros., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner e outros., J. Immunol, 147 (l):86-95 (1991); e U.S.P.N. 5.750.373.

3. Processamento Adicional

[00129] Não importa como obtidas, as células produtoras de moduladoras (p.ex., hibridomas, colônias de levedura, etc.) podem ser selecionadas, clonadas e adicionalmente rastreadas quanto a características desejáveis incluindo, por exemplo, crescimento robusto, elevada produção de anticorpos e, como discutido em mais detalhe em baixo, características de anticorpos desejáveis. Os hibridomas podem ser expandidos in vivo em animais singeneicos, em animais que não têm um sistema imune, p.ex., camundongos nus, ou em cultura de células in vitro. Métodos de seleção, clonagem e expansão de hibridomas e/ou colônias, cada um dos quais produz uma espécie de anticorpo discreta, são bem conhecidos daqueles com perícia vulgar na técnica.

B. Produção de Moduladores Recombinantes 1. Visão Global

[00130] Logo que a fonte seja aperfeiçoada, DNA codificando os moduladores de SEZ6 desejados pode ser prontamente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (p.ex., por uso de sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a genes codificando cadeias pesada e leve de anticorpos). Células de hibridoma isoladas e subclonadas (ou colônias derivadas de fagos ou levedura) podem servir como uma fonte preferencial de tal DNA se o modulador for um anticorpo. Se desejado, o ácido nucleico pode ser adicionalmente manipulado como descrito aqui para criar agentes incluindo proteínas de fusão, ou anticorpos quiméricos, humanizados ou completamente humanos. Mais particularmente, o DNA isolado (que pode ser modificado) pode ser usado para clonar sequências da região constante e variável para a fabricação anticorpos.

[00131] Conformemente, em modalidades exemplares, os anticorpos podem ser produzidos recombinantemente, usando procedimentos convencionais (tais como aqueles apresentados em Al- Rubeai; An, e Shire e outros., todos supra, e Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I. (2000); Ausubel e outros., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002)), nos quais as células de hibridoma isoladas e subclonadas (ou colônias derivadas de fagos ou levedura) servem como uma fonte preferencial de moléculas de ácido nucleico.

[00132] O termo "moléculas de ácido nucleico", como usado aqui, se destina a incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA e suas variantes artificiais (p.ex., ácidos nucleicos de peptídeo), tanto de fita única como de fita dupla. Os ácidos nucleicos podem codificar uma ou ambas as cadeias de um anticorpo da invenção, ou um seu fragmento ou derivado. As moléculas de ácido nucleico da invenção incluem também polinucleotídeos suficientes para uso como sondas de hibridação, iniciadores de PCR ou iniciadores de sequenciação para identificação, análise, mutação ou amplificação de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo; ácidos nucleicos antissenso para inibição da expressão de um polinucleotídeo, e bem como sequências complementares. Os ácidos nucleicos podem ter qualquer comprimento. Eles podem ter, por exemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1.000, 1.500, 3.000, 5.000 ou mais nucleotídeos de comprimento, e/ou podem compreender uma ou mais sequências adicionais, por exemplo, sequências reguladoras, e/ou ser parte de um ácido nucleico maior, por exemplo, um vetor. Será apreciado que tais sequências de ácido nucleico podem ser adicionalmente manipuladas para criar moduladores incluindo anticorpos quiméricos, humanizados ou completamente humanos. Mais particularmente, as moléculas de ácido nucleico isoladas (que podem ser modificadas) podem ser usadas para clonar sequências da região constante e variável para a fabricação anticorpos como descrito em U.S.P.N. 7.709.611.

[00133] O termo "ácido nucleico isolado" significa um que o ácido nucleico foi (i) amplificado in vitro, por exemplo, por reação em cadeia da polimerase (PCR), (ii) recombinantemente produzido por clonagem, (iii) purificado, por exemplo, por clivagem e fracionamento eletroforético em gel, ou (iv) sintetizado, por exemplo, por síntese química. Um ácido nucleico isolado é um ácido nucleico que está disponível para manipulação por técnicas de DNA recombinante.

[00134] Quer a fonte do ácido nucleico codificando a porção imunorreativa do anticorpo seja obtido ou derivado de tecnologia de exibição de fagos, bibliotecas de leveduras, tecnologia baseada em hibridoma ou sinteticamente, é para ser entendido que a presente invenção engloba as moléculas de ácido nucleico e sequências codificando os anticorpos ou seus fragmentos ou derivados de ligação do antigênio. Adicionalmente, a presente invenção está dirigida a vetores e células hospedeiras compreendendo tais moléculas de ácido nucleico.

2. Hibridação e Identidade de Sequência

[00135] Como indicado, a invenção proporciona adicionalmente ácidos nucleicos que hibridam com outros ácidos nucleicos sob condições de hibridação particulares. Mais especificamente, a invenção engloba moléculas de ácidos nucleicos que hibridam sob condições de hibridação de estringência moderadas ou elevadas (p.ex., como definidas em baixo) com as moléculas de ácido nucleico da invenção. Métodos para hibridação de ácidos nucleicos são bem conhecidos na técnica. Como é bem conhecido, condições de hibridação moderadamente estringentes compreendem uma solução de pré-lavagem contendo 5x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC), SDS a 0,5 %, EDTA a 1,0 mM (pH 8,0), tampão de hibridação de formamida a cerca de 50 %, 6x SSC, e uma temperatura de hibridação de 55 °C (ou outras soluções de hibridação similares, tais como uma contendo formamida a 50 %, com uma temperatura de hibridação de 42 °C), e condições de lavagem de 60 °C, em 0,5x SSC, SDS a 0,1 %. A título de comparação, a hibridação sob condições de hibridação altamente estringentes compreendem lavagem com 6x SSC a 45 °C, seguida por uma ou mais lavagens em 0,1x SSC, SDS a 0,2 % a 68 °C. Além do mais, um com perícia na técnica consegue manipular as condições de hibridação e/ou lavagem para aumentar ou diminuir a estringência da hibridação tal que os ácidos nucleicos compreendendo sequências de nucleotídeos que sejam 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % idênticas umas às outras permaneçam tipicamente hibridadas umas com as outras.

[00136] A invenção inclui também moléculas de ácido nucleico que são "substancialmente idênticas" com as moléculas de ácido nucleico descritas. Em uma modalidade, o termo substancialmente idêntica no que diz respeito a uma sequência de ácido nucleico pode ser interpretado como uma sequência de moléculas de ácido nucleico exibindo pelo menos cerca de 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, ou 90 % de identidade de sequência. Em outras modalidades, as moléculas de ácido nucleico exibem 95 % ou 98 % de identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico de referência.

[00137] Os parâmetros básicos afetando a escolha das condições de hibridação e orientação para elaboração de condições adequadas são apresentados por, por exemplo, Sambrook, Fritsch, e Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I., capítulo 9 e 11; e Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel e outros., eds., John Wiley & Sons, Inc., seções 2.10 e 6.3-6.4), e podem ser prontamente determinados por aqueles tendo perícia vulgar na técnica com base, por exemplo, no comprimento e/ou composição de base do ácido nucleico.

[00138] A similaridade de sequência para polipeptídeos, que é também referida como identidade de sequência, é tipicamente medida usando software de análise de sequências. O software de análise de proteínas corresponde sequências similares usando medidas de similaridade atribuída a várias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições de aminoácidos conservativas. Por exemplo, a ferramenta de análise de sequências GCG (Accelrys Software Inc.) contém programas tais como "GAP" e "BEST-FIT" que podem ser usados com parâmetros padrão para determinar a homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos intimamente relacionados, tais como polipeptídeos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteína de tipo selvagem e uma sua muteína. (Ver, p.ex., GCG Versão 6.1 ou Durbin et. al., Biological Sequence Analysis: Probabilistic models of proteins and nucleic acids., Cambridge Press (1998)).

[00139] As sequências de polipeptídeos podem ser também comparadas usando FASTA usando parâmetros padrão ou recomendados, um programa em GCG Versão 6.1. FASTA (p.ex., FASTA2 e FASTA3) proporciona alinhamentos e percentagem de identidade de sequência das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de consulta e de pesquisa (Pearson (2000) supra). Outro algoritmo preferencial quando se compara uma sequência da invenção com uma base de dados contendo um grande número de sequências de diferentes organismos é o programa de computador BLAST, especialmente blastp ou tblastn, usando parâmetros padrão. Ver, p.ex., Altschul e outros. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 e Altschul e outros. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402, cada um dos quais é aqui incorporado por referência.

[00140] A este respeito, a invenção inclui também moléculas de ácido nucleico que codifica polipeptídeos que são "substancialmente idênticos" no que diz respeito a uma sequência de polipeptídeo da região variável do anticorpo (p.ex., a região variável da cadeia leve ou pesada do dador, a região variável da cadeia leve ou pesada do aceitador ou o constructo humanizado resultante). Como aplicado a tais polipeptídeos, o termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntico" significa que duas sequências de peptídeo, quando otimamente alinhadas, tal que, pelos programas GAP ou BEST-FIT usando pesos de intervalo padrão, partilham pelo menos 60 % ou 65 % de identidade de sequência, preferencialmente pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, ou 90 % de identidade de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 93 %, 95 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência. Preferencialmente, as posições de resíduos que não são idênticas diferem por substituições de aminoácidos conservativas. Uma "substituição de aminoácido conservativo" é uma na qual um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas similares (p.ex., carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservativa não mudará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Em casos onde duas ou mais sequências de aminoácidos diferem umas das outras por substituições conservativas, a percentagem de identidade de sequência ou grau de similaridade pode ser ajustado para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição.

3. Expressão

[00141] Os vários processos de expressão recombinante, i.e., a produção de RNA ou de RNA e proteína/peptídeo, são bem conhecidos como apresentado, por exemplo, em Berger e Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Sambrook e outros., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3a Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.I., (2000); e Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel e outros., eds., Current Protocols, uma joint venture entre Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (suplementada até 2006).

[00142] Certos termos de interesse incluem "sequência de controle da expressão" que compreende promotores, locais de ligação de ribossomo, intensificadores e outros elementos de controle que regulam a transcrição de um gene ou tradução de mRNA. Como é bem conhecido, um "promotor" ou "região promotora" se relaciona com uma sequência de ácido nucleico que está geralmente localizada a montante (5') da sequência de ácido nucleico sendo expressa e controla a expressão da sequência pelo proporcionar de um local de reconhecimento e ligação para a RNA polimerase.

[00143] Promotores exemplares que são compatíveis de acordo com a invenção incluem promotores para SP6, T3 e T7 polimerase, promotor de RNA de U6 humano, promotor de CMV, e seus promotores híbridos artificiais (p.ex., CMV) onde uma parte ou partes estão fundidas com uma parte ou partes de promotores de genes de outras proteínas celulares tais como p.ex. GAPDH (gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase) humana, e incluindo ou não incluindo (um) íntron(s) adicional(ais).

[00144] Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico pode estar presente em um vetor, onde apropriado com um promotor, que controla a expressão do ácido nucleico. O termo bem conhecido "vetor" compreende qualquer veículo intermediário para um ácido nucleico que permite que o referido ácido nucleico, por exemplo, seja introduzido em células procarióticas e/ou eucarióticas e, onde apropriado, seja integrado em um genoma. Métodos de transformação de células de mamífero são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, U.S.P.Ns. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, e 4,959,455. Os vetores podem incluir uma sequência de nucleotídeos codificando um anticorpo da invenção (p.ex., um anticorpo inteiro, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, um VH ou VL de um anticorpo, ou uma sua porção, ou uma CDR de cadeia pesada ou leve, um Fv de cadeia única, ou seus fragmentos ou variantes), operacionalmente ligada a um promotor (ver, p.ex., Publicação PCT WO 86/05807; Publicação PCT WO 89/01036; e U.S.P.N. 5.122.464).

[00145] Uma variedade de sistemas de vetor de expressão em hospedeiro está comercialmente disponível, e muitos são compatíveis com os ensinamentos aqui e podem ser usados para expressar os moduladores da invenção. Tais sistemas incluem, mas não estão limitados a, microrganismos tais como bactérias (p.ex., E. coli, B. subtilis, streptomyces) transformadas com vetores de expressão de DNA de bacteriófago recombinante, DNA de plasmídeo ou DNA de cosmídeo contendo sequências codificantes do modulador; leveduras (p.ex., Saccharomyces, Pichia) transfectadas com vetores de expressão de levedura recombinante; sistemas de células de insetos infectados com vetores de expressão de vírus recombinante (p.ex., baculovírus) contendo sequências codificantes do modulador; sistemas de células de planta (p.ex., Nicotiana, Arabidopsis, lentilha- d'água, milho, trigo, batata, etc.) infectados com vetores de expressão viral recombinante (p.ex., vírus do mosaico da couve-flor, vírus do mosaico do tabaco) ou transfectados com vetores de expressão de plasmídeo recombinante (p.ex., plasmídeo Ti) contendo sequências codificantes do modulador; ou sistemas de células de mamífero (p.ex., células COS, CHO, BHK, 293, 3T3, etc.) abrigando constructos de expressão recombinante contendo promotores derivados do genoma de células de mamífero (p.ex., promotor da metalotioneína) ou de vírus de mamífero (p.ex., o promotor tardio do adenovírus; o promotor 7.5K do vírus vaccinia).

[00146] Como usado aqui, o termo "célula hospedeira" abrange qualquer tipo de sistema celular que possa ser manipulado para gerar os polipeptídeos e moléculas de ligação do antigênio da presente invenção. Em uma modalidade, a célula hospedeira é manipulada para permitir a produção de uma molécula de ligação do antigênio com glicoformas modificadas. Em uma modalidade preferencial, a molécula de ligação do antigênio, ou molécula de ligação do antigênio variante, é um anticorpo, fragmento de anticorpo, ou proteína de fusão. Em certas modalidades, as células hospedeiras foram adicionalmente manipuladas para expressar níveis aumentados de um ou mais polipeptídeos tendo atividade de N-acetilglucosaminiltransferase III (GnTI11). Células hospedeiras compatíveis incluem células cultivadas, p.ex., células cultivadas de mamífero, tais como células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células do mieloma YO, células do mieloma do camundongo P3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, células de levedura, células de inseto, e células de planta, para nomear somente algumas, mas também células compreendidas dentro de um animal transgênico, planta transgênica ou tecido de planta ou animal cultivado.

[00147] Para o longo prazo, é preferencial a produção de elevado rendimento de expressão estável de proteínas recombinantes. Conformemente, linhas de células que expressam estavelmente o modulador selecionado podem ser manipuladas usando técnicas reconhecidas pela técnica padrão. Ao invés de usar vetores de expressão que contêm origens de replicação virais, as células hospedeiras podem ser transformadas com DNA controlado por elementos de controle da expressão apropriados (p.ex., promotor, intensificador, sequências, terminadores da transcrição, locais de poliadenilação, etc.), e um marcador selecionável. Qualquer um dos sistemas de seleção bem conhecidos na técnica pode ser usado, incluindo o sistema de expressão de genes da glutamina sintetase (o sistema GS) que proporciona uma abordagem eficaz para intensificação da expressão sob certas condições. O sistema GS é discutido por inteiro ou em parte em conexão com as patentes EP 0 216 846, 0 256 055, 0 323 997 e 0 338 841 e U.S.P.N.s 5,591,639 e 5,879,936, cada uma das quais é incorporada aqui por referência. Outro sistema de expressão preferencial, o Conjunto Freedom™ CHO- S é comercialmente proporcionado pela Life Technologies (Número de Catálogo A13696-01), também permite o desenvolvimento de linhas de células estáveis que podem ser usadas para produção de modulador.

[00148] Tais sistemas de expressão em hospedeiro representam veículos pelos quais as sequências codificantes de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas representam também células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências codificantes de nucleotídeos apropriadas, expressar uma molécula da invenção in situ. A célula hospedeira pode ser cotransfectada com dois vetores de expressão da invenção, por exemplo, codificando o primeiro vetor um polipeptídeo derivado da cadeia pesada e o codificando o segundo vetor um polipeptídeo derivado da cadeia leve.

[00149] Assim, em certas modalidades, a presente invenção proporciona células hospedeiras recombinantes permitindo a expressão de anticorpos ou suas porções. Os anticorpos produzidos por expressão em tais células hospedeiras recombinantes são referidos aqui como anticorpos recombinantes. A presente invenção proporciona também células da descendência de tais células hospedeiras, e anticorpos produzidos pelas mesmas.

C. Síntese Química

[00150] Adicionalmente, os moduladores podem ser quimicamente sintetizados usando técnicas conhecidas na técnica (p.ex., ver Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.I., e Hunkapiller, M., e outros., 1984, Nature 310:105-111). Além do mais, se desejado, aminoácidos não clássicos ou análogos de aminoácidos químicos (tais como D-isômeros dos aminoácidos comuns, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a- aminoisobutírico, ácido 4-aminobutúrico, e similares) podem ser introduzidos como uma substituição ou adição em uma sequência de polipeptídeo.

D. Sistemas Transgênicos

[00151] Em outras modalidades, os moduladores podem ser produzidos transgenicamente através da geração de um mamífero ou planta que seja transgênico quanto a moléculas recombinantes tais como as sequências da cadeia pesada e leve da imunoglobulina e que produza os compostos desejados em uma forma recuperável. Isto inclui, por exemplo, a produção de moduladores de proteína (p.ex., anticorpos) no, e recuperado do, leite de cabras, vacas, ou outros mamíferos. Ver, p.ex., U.S.P.Ns. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172, e 5,741,957. Em algumas modalidades, os animais transgênicos não humanos que compreendem loci de imunoglobulinas humanas são imunizados para produzir anticorpos.

[00152] Outras técnicas transgênicas são apresentadas em Hogan e outros., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2a ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson e outros., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); e Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999) e U.S. P.N. 6.417.429. Em algumas modalidades, os animais não humanos são camundongos, ratos, ovelha, porcos, cabras, gado ou cavalos, e o produto desejado é produzido em sangue, leite, urina, saliva, lágrimas, muco e outros fluidos corporais dos quais ele é prontamente obtenível usando técnicas de purificação reconhecidas pela técnica.

[00153] Outros sistemas de produção compatíveis incluem métodos para fabricação de anticorpos em plantas tal como descrito, por exemplo, em U.S.P.Ns. 6,046,037 e 5,959,177, que são incorporados aqui no que diz respeito a tais técnicas.

E. Isolamento/Purificação

[00154] Logo que um modulador da invenção tenha sido produzido por expressão recombinante ou qualquer outra das técnicas divulgadas, pode ser purificado por qualquer método conhecido na técnica para purificação de imunoglobulinas ou proteínas. A este respeito, o modulador pode estar "isolado" o que significa que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com usos de diagnóstico ou terapêuticos para o polipeptídeo e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Os moduladores isolados incluem um modulador in situ dentro de células recombinantes porque pelo menos um componente do ambiente natural do polipeptídeo não estará presente.

[00155] Se a molécula desejada for produzida intracelularmente, como um primeiro passo, os detritos de particulados, células hospedeiras ou fragmentos lisados, podem ser removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Onde o modulador é secretado no meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente primeiramente concentrados usando um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, unidade de ultrafiltração Amicon ou Pellicon (Millipore Corp.). Logo que os contaminantes insolúveis sejam removidos, a preparação de modulador pode ser adicionalmente purificada usando técnicas padrão tais como, por exemplo, cromatografia em hidroxiapatite, eletroforese em gel, diálise, e cromatografia de afinidade, com cromatografia de afinidade de interesse particular. A este respeito, a proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas de IgG1, IgG2 ou IgG4 humanas (Lindmark, e outros., J Immunol Meth 62:1 (1983)), enquanto a proteína G é recomendada para todos os isotipos de camundongo e para IgG3 humana (Guss, e outros., EMBO J 5:1567 (1986)). Outras técnicas para purificação de proteínas tais como fracionamento em uma coluna de permuta iônica, precipitação de etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina, cromatografia de sepharose em uma resina de permuta aniônica ou catiônica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE e precipitação de sulfato de amônio estão também disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado. Em modalidades particularmente preferenciais, os moduladores da presente invenção serão purificados, pelo menos em parte, usando cromatografia de afinidade com Proteína A ou Proteína G.

VI. Fragmentos e Derivados de Moduladores de SEZ6

[00156] Seja qual for a metodologia de geração e produção selecionada, os moduladores da presente invenção reagirão com, se ligarão a, se combinarão com, formarão complexos com, se conectarão a, se anexarão a, se unirão a, interatuarão com ou de outro modo se associarão com um determinante alvo (p.ex., antigênio) e proporcionarão deste modo os resultados desejados. Onde o modulador compreende um anticorpo ou seu fragmento, constructo ou derivado, tais associações podem ser através de um ou mais "locais de ligação" ou "componentes de ligação" expressos no anticorpo, onde um local de ligação compreende uma região de um polipeptídeo que é responsável para ligação seletiva a uma molécula alvo ou antigênio de interesse. Os domínios de ligação compreendem pelo menos um local de ligação (p.ex., um anticorpo de IgG intacto terá dois domínios de ligação e dois locais de ligação). Domínios de ligação exemplares incluem um domínio variável de anticorpo, um domínio de ligação de receptor de um ligando, um domínio de ligação de ligando de um receptor ou um domínio enzimático.

A. Anticorpos

[00157] Como notado acima, o termo "anticorpo" se destina a abranger, pelo menos, anticorpos policlonais, anticorpos multiclonais, anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados com CDR, anticorpos humanizados e primatizados, anticorpos humanos, anticorpos recombinantemente produzidos, intracorpos, anticorpos multiespecíficos, anticorpos biespecíficos, anticorpos monovalentes, anticorpos multivalentes, anticorpos anti-idiotípicos, bem como anticorpos sintéticos.

B. Fragmentos

[00158] Independentemente de qual forma do modulador (p.ex., quimérica, humanizada, etc.) é selecionada para praticar a invenção, será apreciado que fragmentos imunorreativos do mesmo podem ser usados de acordo com os ensinamentos aqui. Um "fragmento de anticorpo" compreende pelo menos uma porção de um anticorpo intacto. Como usado aqui, o termo "fragmento" de uma molécula de anticorpo inclui fragmentos de ligação do antigênio de anticorpos, e o termo "fragmento de ligação do antigênio" se refere a um fragmento de polipeptídeo de uma imunoglobulina ou anticorpo que se liga a ou reage imunoespecificamente com um antigênio selecionado ou seu determinante imunogênico ou compete com o anticorpo intacto do qual os fragmentos foram derivados para ligação de antigênio específica.

[00159] Fragmentos exemplares incluem: VL, VH, scFv, fragmento F(ab')2, fragmento Fab, fragmento Fd, fragmento Fv, fragmentos de anticorpo de domínio único, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Adicionalmente, um fragmento ativo compreende uma porção do anticorpo que retêm a sua capacidade de interatuar com o antigênio/substratos ou receptores e os modificar de um modo similar àquele de um anticorpo intacto (embora talvez com eficácia algo menor).

[00160] Em outras modalidades, um fragmento de anticorpo é um que compreende a região Fc e que retém pelo menos uma das funções biológicas normalmente associadas à região Fc quando presente em um anticorpo intacto, tal como ligação de FcRn, modulação da meia-vida do anticorpo, função ADCC e ligação do complemento. Em uma modalidade, um fragmento de anticorpo é um anticorpo monovalente que tem uma meia-vida in vivo substancialmente similar a um anticorpo intacto. Por exemplo, tal fragmento de anticorpo pode compreender um braço de ligação do antigênio ligado a uma sequência Fc capaz de conferir estabilidade in vivo ao fragmento.

[00161] Como seria bem reconhecido por aqueles peritos na técnica, os fragmentos podem ser obtidos através de tratamento químico ou enzimático (tal como papaína ou pepsina) de um anticorpo intacto ou completo ou cadeia de anticorpo ou por meio recombinante. Ver, p.ex., Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.I. (1999), para uma descrição mais detalhada de fragmentos de anticorpo.

C. Derivados

[00162] A invenção inclui adicionalmente derivados do modulador imunorreativos e moléculas de ligação do antigênio compreendendo uma ou mais modificações.

1. Anticorpos Multivalentes

[00163] Em uma modalidade, os moduladores da invenção podem ser monovalentes ou multivalentes (p.ex., bivalentes, trivalentes, etc.). Como usado aqui, o termo "valência" se refere ao número de potenciais locais de ligação alvo associados a um anticorpo. Cada local de ligação alvo se liga especificamente a uma molécula alvo ou posição específica ou lócus em uma molécula alvo. Quando o anticorpo é monovalente, cada local de ligação da molécula se ligará especificamente a uma única posição de antigênio ou epítopo. Quando um anticorpo compreende mais do que um local de ligação alvo (multivalente), cada local de ligação alvo pode se ligar especificamente à mesma ou diferentes moléculas (p.ex., pode se ligar a diferentes ligandos ou diferentes antigênios, ou diferentes epítopos ou posições no mesmo antigênio). Ver, por exemplo, U.S.P.N. 2009/0,130,105. Em cada caso, pelo menos um dos locais de ligação compreenderá um epítopo, motivo ou domínio associado a uma isoforma de SEZ6.

[00164] Em uma modalidade, os moduladores são anticorpos biespecíficos nos quais as duas cadeias têm diferentes especificidades, como descrito em Millstein e outros., 1983, Nature, 305:537-539. Outras modalidades incluem anticorpos com especificidades adicionais tais como anticorpos triespecíficos. Outros constructos multiespecíficos compatíveis mais sofisticados e métodos da sua fabricação são apresentados em U.S.P.N. 2009/0155255, bem como WO 94/04690; Suresh e outros., 1986, Methods in Enzymology, 121:210; e WO96/27011.

[00165] Como aludido acima, os anticorpos multivalentes podem ser ligar imunoespecificamente a diferentes epítopos da molécula alvo desejada ou pode se ligar imunoespecificamente à molécula alvo bem como um epítopo heterólogo, tal como um polipeptídeo heterólogo ou material de suporte sólido. Embora modalidades preferenciais dos anticorpos anti-SEZ6 se liguem somente a dois antigênios (i.e., anticorpos biespecíficos), anticorpos que especificidades adicionais tais como anticorpos triespecíficos são também englobados pela presente invenção. Os anticorpos biespecíficos incluem também anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado a avidina, o outro a biotina. Tais anticorpos, por exemplo, foram propostos como dirigindo células do sistema imune a células indesejadas (U.S.P.N. 4,676,980), e para tratamento de infecção com HIV (WO 91/00360, WO 92/200373, e EP 03089). Os anticorpos heteroconjugados podem ser feitos usando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica, e são divulgados em U.S. P.N. 4,676,980, em conjunto com um número de técnicas de reticulação.

[00166] Ainda em outras modalidades, os domínios variáveis do anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação anticorpo-antigênio) estão fundidos a sequências de domínio constante da imunoglobulina, tal como um domínio constante da cadeia pesada da imunoglobulina compreendendo pelo menos parte das regiões de charneira, CH2, e/ou CH3, usando métodos bem conhecidos daqueles com perícia vulgar na técnica.

2. Modificações da Região Fc

[00167] Adicionalmente às várias modificações, substituições, adições ou deleções à região variável ou de ligação dos moduladores divulgados (p.ex., anticorpos Fc-SEZ6 ou anti-SEZ6) apresentadas acima, os peritos na técnica apreciarão que modalidades selecionadas da presente invenção podem também compreender substituições ou modificações da região constante (i.e., a região Fc). Mais particularmente, é contemplado que os moduladores de SEZ6 da invenção podem conter inter alia uma ou mais substituições, mutações e/ou modificações de resíduos de aminoácidos adicionais que resultam em um composto com características preferenciais incluindo, mas não se limitando a: farmacocinética alterada, meia-vida no soro aumentada, afinidade de ligação aumentada, imunogenicidade reduzida, produção aumentada, ligação de ligando de Fc a um receptor de Fc (FcR) aumentada, atividade de "ADCC" (citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo) ou "CDC" (citotoxicidade dependente do complemento) intensificada ou reduzida, glicosilação e/ou ligações dissulfeto alteradas e especificidade de ligação modificada. A este respeito, será apreciado que estas variantes de Fc podem ser vantajosamente usadas para intensificar as propriedades antineoplásicas eficazes dos moduladores divulgados.

[00168] Para esta finalidade, certas modalidades da invenção podem compreender substituições ou modificações da região Fc, por exemplo, a adição de um ou mais resíduos de aminoácidos, substituições, mutações e/ou modificações para produzir um composto com funções efetoras de Fc intensificadas ou preferenciais. Por exemplo, mudanças em resíduos de aminoácidos envolvidos na interação entre o domínio Fc e o receptor Fc (p.ex., FCYRI, FCYRIIA e B, FcyRIII e FcRn) podem levar a citotoxicidade aumentada e/ou farmacocinética alterada, tal como meia-vida no soro aumentada (ver, por exemplo, Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel e outros., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas e outros., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995), cada um dos quais é incorporado aqui por referência).

[00169] Em modalidades selecionadas, podem ser gerados anticorpos com meias-vidas in vivo aumentadas por modificação (p.ex., substituição, deleção ou adição) de resíduos de aminoácidos identificados como envolvidos na interação entre o domínio Fc e o receptor FcRn (ver, p.ex., Publicação Internacional Nos. WO 97/34631; WO 04/029207; U.S.P.N. 6,737,056 e U.S.P.N. 2003/0,190,311. No que diz respeito a tais modalidades, as variantes de Fc podem proporcionar meias-vidas em um mamífero, preferencialmente um humano, de mais do que 5 dias, mais do que 10 dias, mais do que 15 dias, preferencialmente mais do que 20 dias, mais do que 25 dias, mais do que 30 dias, mais do que 35 dias, mais do que 40 dias, mais do que 45 dias, mais do que 2 meses, mais do que 3 meses, mais do que 4 meses, ou mais do que 5 meses. A meia-vida aumentada resulta em um título no soro mais elevado que reduz assim a frequência da administração dos anticorpos e/ou reduz a concentração dos anticorpos a serem administrados. A ligação a FcRn humano in vivo e a meia-vida no soro de polipeptídeos de ligação de elevada afinidade de FcRn humanos podem ser avaliados, p.ex., em camundongos transgênicos ou linhas de células humanas transfectadas expressando FcRn humano, ou em primatas aos quais os polipeptídeos com uma região Fc variante são administrados. WO 2000/42072 descreve variantes de anticorpo com ligação melhorada ou diminuída a FcRns. Ver também, p.ex., Shields e outros. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).

[00170] Em outras modalidades, as alterações de Fc podem levar a atividade de ADCC ou CDC intensificada ou reduzida. Como é conhecido na técnica, CDC se refere à lise de uma célula alvo na presença do complemento, e ADCC se refere a uma forma de citotoxicidade na qual Ig secretada ligada a FcRs presentes em certas células citotóxicas (p.ex., células Matadoras Naturais, neutrófilos, e macrófagos) permite que estas células efetoras citotóxicas se liguem especificamente a uma célula alvo transportando antigênio e matam subsequentemente a célula alvo com citotoxinas. No contexto da presente invenção, as variantes de anticorpo são proporcionadas com afinidade de ligação de FcR "alterada", que é ligação intensificada ou diminuída em comparação com um anticorpo genitor ou não modificado ou com um anticorpo compreendendo um FcR de sequência nativa. Tais variantes que exibem ligação diminuída podem possuir pouca ou nula ligação apreciável, p.ex., 0-20 % de ligação ao FcR em comparação com uma sequência nativa, p.ex. como determinado por técnicas bem conhecidas na técnica. Em outras modalidades, a variante exibirá ligação intensificada em comparação com o domínio de Fc de imunoglobulina nativo. Será apreciado que estes tipos de variantes de Fc podem ser vantajosamente usados para intensificar as propriedades antineoplásicas eficazes dos anticorpos divulgados. Ainda em outras modalidades, tais alterações levam a afinidade de ligação aumentada, imunogenicidade reduzida, produção aumentada, glicosilação alterada e/ou ligações dissulfeto (p.ex., para locais de conjugação), especificidade de ligação modificada, fagocitose aumentada; e/ou regulação por baixo de receptores da superfície da célula (p.ex., receptor de células B; BCR), etc..

3. Glicosilação Alterada

[00171] Ainda outras modalidades compreendem uma ou mais glicoformas manipuladas, i.e., um modulador de SEZ6 compreendendo um padrão de glicosilação alterado ou composição de carboidrato alterada que é covalentemente anexada à proteína (p.ex., no domínio de Fc). Ver, por exemplo, Shields, R. L. e outros. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740. As glicoformas manipuladas podem ser úteis para uma variedade de propósitos, incluindo mas não se limitando a intensificação ou redução da função efetora, aumento da afinidade do modulador para um alvo ou facilitação da produção do modulador. Em certas modalidades onde é desejada função efetora reduzida, a molécula pode ser manipulada para expressar uma forma aglicosilada. Substituições que podem resultar em eliminação de um ou mais locais de glicosilação de framework da região variável para eliminar deste modo a glicosilação em esse local são bem conhecidos (ver p.ex. U.S. P.Ns. 5,714,350 e 6,350,861). Reciprocamente, as funções efetoras intensificadas ou ligação melhorada podem ser atribuídas à molécula contendo Fc por manipulação em um ou mais locais de glicosilação adicionais.

[00172] Outras modalidades incluem uma variante de Fc que tem um composição de glicosilação alterada, tal como uma anticorpo hipofucosilado tendo quantidades reduzidas de resíduos de fucosila ou um anticorpo tendo estruturas GlcNAc bifurcadas aumentadas. Demonstrou-se que tais padrões de glicosilação alterados aumentam a capacidade de ADCC de anticorpos. As glicoformas manipuladas podem ser geradas por qualquer método conhecido de um perito na técnica, por exemplo, por uso de estirpes de expressão manipulada ou variante, por coexpressão com uma ou mais enzimas (por exemplo, N- acetilglucosaminiltransferase III (GnTI11)), por expressão de uma molécula compreendendo uma região de Fc em vários organismos ou linhas de células de vários organismos ou por modificação de carboidrato(s) após a molécula compreendendo a região de Fc ter sido expressa (ver, por exemplo, WO 2012/117002).

4. Processamento Adicional

[00173] Os moduladores podem ser diferencialmente modificados durante ou após a produção, p.ex., por glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivação por grupos protetores/bloqueantes conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a uma molécula de anticorpo ou outro ligando celular, etc.. Qualquer uma de numerosas modificações químicas podem ser levadas a cabo por técnicas conhecidas, incluindo mas não se limitando a, clivagem química específica por brometo de cianogênio, tripsina, quimotripsina, papaína, protease V8, NaBH4, acetilação, formilação, oxidação, redução, síntese metabólica na presença de tunicamicina, etc..

[00174] Várias modificações pós-translacionais englobadas também pela invenção incluem, por exemplo, cadeias de carboidrato ligadas em N ou ligadas em O, processamento das extremidades N-terminal ou C-terminal, anexação de frações químicas à estrutura principal dos aminoácidos, modificações químicas das cadeias de carboidrato ligadas em N ou ligadas em O, e adição ou deleção de um resíduo de metionina N-terminal como resultado de expressão de células hospedeiras procarióticas. Além do mais, os moduladores podem ser também modificados com um marcador detectável, tal como um marcador enzimático, fluorescentes, radioisotópico ou de afinidade para permitir detecção e isolamento do modulador.

VII.Características do Modulador

[00175] Independentemente de como foi obtido ou qual das formas acima mencionadas o modulador toma, várias modalidades dos moduladores divulgados podem exibir certas características. Em modalidades selecionadas, as células produtoras de anticorpos (p.ex., hibridomas ou colônias de levedura) podem ser selecionadas, clonadas e adicionalmente rastreadas quanto a propriedades favoráveis incluindo, por exemplo, crescimento robusto, elevada produção do modulador e, como discutido em mais detalhe em baixo, características do modulador desejáveis. Em outros casos, as características do modulador podem ser atribuídas ou influenciadas por seleção de um antigênio particular (p.ex., uma isoforma de SEZ6 específica ou seu fragmento) ou fragmento imunorreativo do antigênio alvo para inoculação do animal. Ainda em outras modalidades, os moduladores selecionados podem ser manipulados como descrito acima para intensificar ou refinar as características imunoquímicas tais como afinidade ou farmacocinética.

A. Moduladores Neutralizantes

[00176] Em certas modalidades, os moduladores compreenderão anticorpos "neutralizantes" ou seus derivados ou fragmentos. Isto é, a presente invenção pode compreender moléculas de anticorpo que se ligam a domínios, motivos ou epítopos específicos e são capazes de bloquear, reduzir ou inibir a atividade biológica de SEZ6. Mais geralmente, o termo "anticorpo neutralizante" se refere a um anticorpo que se liga a ou interatua com uma molécula ou ligando alvo e previne ligação ou associação da molécula alvo a um parceiro de ligação tal como um receptor ou substrato, interrompendo deste modo uma resposta biológica que resultaria de outro modo da interação das moléculas.

[00177] Será apreciado que ensaios de ligação competitiva conhecidos na técnica podem ser usados para avaliar a ligação e especificidade de um anticorpo ou seu fragmento ou derivado imunologicamente funcional. No que diz respeito à presente invenção, um anticorpo ou fragmento será considerado como inibindo ou reduzindo a ligação de SEZ6 a um parceiro de ligação ou substrato (por exemplo, um ligando neurotrófico) quando um excesso de anticorpos reduz a quantidade de parceiro de ligação ligado a SEZ6 em pelo menos cerca de 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % ou mais como medido, por exemplo, por atividade do ligando neurotrófico prejudicada ou em um ensaio de ligação competitiva in vitro. No caso de anticorpos para SEZ6, por exemplo, um anticorpo neutralizante ou antagonista alterará preferencialmente a atividade do ligando por pelo menos cerca de 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % ou mais. Será apreciado que esta atividade modificada pode ser medida diretamente usando técnicas reconhecidas pela técnica ou pode ser medida pelo impacto que a atividade alterada tem a jusante (p.ex., oncogênese, sobrevivência das células ou ativação de via).

B.Moduladores Internalizantes

[00178] Enquanto a evidência indica que SEZ6 ou suas isoformas selecionadas podem estar presentes em uma forma solúvel, pelo menos algum SEZ6 ficará provavelmente associado com a superfície da célula, permitindo assim a internalização dos moduladores divulgados. Em conformidade, os anticorpos anti-SEZ6 da presente invenção podem ser internalizados, pelo menos em alguma medida, por células que expressam SEZ6. Por exemplo, um anticorpo anti- SEZ6 que se liga a SEZ6 na superfície de uma célula onde se inicia um tumor pode ser internalizado pela célula onde se inicia o tumor. Em modalidades preferenciais, tais anticorpos anti-SEZ6 podem estar associados a, ou conjugados com, agentes anticâncer tais como frações citotóxicas que matam a célula após internalização. Em modalidades particularmente preferenciais, o modulador compreenderão um conjugado anticorpo internalizante-fármaco.

[00179] Como usado aqui, um modulador que "se internaliza" é um que é captado (em conjunto com qualquer carga) pela célula após ligação a um antigênio ou receptor associado. Como será apreciado, o modulador internalizante pode, em modalidades preferenciais, compreender um anticorpo incluindo fragmentos de anticorpo e seus derivados, bem como conjugados de anticorpo. A internalização pode ocorrer in vitro ou in vivo. Para aplicações terapêuticas, a internalização ocorrerá preferencialmente in vivo em um sujeito com sua necessidade. O número de moléculas de anticorpo internalizadas pode ser suficiente ou adequada pra matar uma célula expressando antigênio, especialmente uma célula-tronco do câncer expressando antigênio. Dependendo da potência do anticorpo ou conjugado de anticorpo, em alguns casos, a captação de uma única molécula de anticorpo na célula é suficiente para matar a célula alvo à qual o anticorpo se liga. Por exemplo, certas toxinas são tão altamente potentes que a internalização de algumas moléculas da toxina conjugadas com o anticorpo é suficiente para matar a célula de tumor. Se um anticorpo internaliza após ligação a uma célula de mamífero pode ser determinado por vários ensaios incluindo aqueles descritos nos Exemplos em baixo (p.ex., Exemplo 15, 17 e 18). Métodos de detecção de se um anticorpo internaliza em uma célula são também descritos em U.S.P.N. 7,619,068, que é incorporada aqui por referência na sua totalidade.

C. Moduladores Esgotantes

[00180] Em outras modalidades, os anticorpos compreenderão anticorpos esgotantes ou seus derivados ou fragmentos. O termo anticorpo "esgotante" se refere a um anticorpo que se liga preferencialmente ou se associa a um antigênio na ou próximo da superfície da célula e induz, promove ou causa a morte ou eliminação da célula (p.ex., por CDC, ADCC ou introdução de um agente citotóxico). Em algumas modalidades, os anticorpos esgotantes selecionados estarão associados a ou conjugados com um agente citotóxico.

[00181] Preferencialmente, um anticorpo esgotante será capaz de remover, incapacitar, eliminar ou matar pelo menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, ou 99 % de células tumorigênicas de SEZ6 em uma população de células definida. Em algumas modalidades, a população de células pode compreender células perpetuadoras de tumor enriquecidas, secionadas, purificadas ou isoladas. Em outras modalidades, a população de células pode compreender amostras de tumor inteiras ou extratos de tumor heterogêneos que compreendem células perpetuadoras de tumor. Aqueles peritos na técnica apreciarão que técnicas bioquímicas padrão como descrito nos Exemplos em baixo (p.ex., Exemplos 14 e 15) podem ser usadas para monitorizar e quantificar o esgotamento de células tumorigênicas ou células perpetuadoras de tumor de acordo com os ensinamentos aqui.

D. Conjugação e Ligação do Epítopo

[00182] Será adicionalmente apreciado que os moduladores de anticorpo anti-SEZ6 divulgados se associarão, ou se ligarão, a epítopos discretos ou determinantes imunogênicos apresentados pelo alvo selecionado ou seu fragmento. Em certas modalidades, o epítopo ou determinantes imunogênicos incluem agrupamentos quimicamente tensioativos de moléculas tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcares, grupos fosforila, ou grupos sulfonila, e, em certas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas, e/ou características de carga específicas. Assim, como usado aqui, o termo "epítopo" inclui qualquer determinante de proteína capaz de ligação específica a uma imunoglobulina ou receptor de células T ou de outro modo interação com uma molécula. Em certas modalidades, é dito que um anticorpo se liga especificamente (ou se liga a ou reage imunoespecificamente com) a um antigênio quando reconhece preferencialmente seu antigênio alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas. Em modalidades preferenciais, é dito que um anticorpo que se liga especificamente a um antigênio quando a constante de dissociação de equilíbrio (KD) é menos do que ou igual a 10-6M ou menos do que ou igual a 10-7M, mais preferencialmente quando a constante de dissociação de equilíbrio é menos do que ou igual a 10-8M, e ainda mais preferencialmente quando a constante de dissociação é menos do que ou igual a 10-9M.

[00183] Mais diretamente, o termo "epítopo" é usado na seu sentido bioquímico comum e se refere àquela porção do antigênio alvo capaz de ser reconhecido e ligado especificamente por um modulador de anticorpo particular. Quando o antigênio é um polipeptídeo tal como SEZ6, os epítopos podem ser geralmente formados a partir de aminoácidos contíguos e aminoácidos não contíguos justapostos por dobragem terciária de uma proteína ("epítopos conformacionais"). Em tais epítopos conformacionais, os pontos de interação ocorrem ao longo dos resíduos de aminoácidos na proteína que estão linearmente separados uns dos outros. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos (algumas vezes referidos como epítopos "lineares" ou "contínuos") são tipicamente retidos após desnaturação de proteínas, ao passo que os epítopos formados por dobragem terciária são tipicamente perdidos após desnaturação da proteína. Em qualquer um dos casos, um epítopo de anticorpo inclui tipicamente pelo menos 3 e mais usualmente pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos em uma conformação espacial única.

[00184] A este respeito, será apreciado que, em certas modalidades, um epítopo pode estar associado a, ou residir em, uma ou mais regiões, domínios ou motivos da proteína SEZ6 (p.ex., aminoácidos 1-906 da isoforma 1 madura). Como discutido em mais detalhe aqui, a região extracelular da proteína SEZ6 compreende uma série de domínios geralmente reconhecidos incluindo cinco domínios Sushi e dois domínios CUB juntamente com um domínio N-terminal. Para os propósitos da presente divulgação, o termo "domínio" será usado de acordo com seu significado geralmente aceite e será considerado para se referir a uma entidade estrutural identificável ou definível dentro de uma proteína que exibe um conteúdo de estrutura secundária distintivo. Em muitos casos, domínios homólogos com funções comuns mostrarão usualmente similaridades de sequências e se encontrarão em um número de proteínas diferentes (p.ex., domínios Sushi são supostamente encontrados em um grande número de proteínas diferentes). Similarmente, o termo reconhecido pela técnica "motivo" será usado de acordo com seu significado comum e deve se referir geralmente a uma região pequena, conservada de uma proteína que tem tipicamente dez a vinte resíduos de aminoácidos contíguos. Como discutido ao longo, modalidades selecionadas compreendem moduladores que se associam ou ligam a um epítopo dentro de regiões, domínios ou motivos específicos de SEZ6.

[00185] Em qualquer um dos casos, logo que um epítopo desejado em um antigênio esteja determinado, é possível gerar anticorpos para esse epítopo, p.ex., por imunização com um peptídeo compreendendo o epítopo usando técnicas descritas na presente invenção. Alternativamente, durante o processo de recuperação, a geração e caracterização dos anticorpos podem elucidar informações sobre epítopos desejáveis localizados em domínios ou motivos específicos. A partir desta informação, é depois possível rastrear competitivamente anticorpos para ligação ao mesmo epítopo. Uma abordagem para alcançar isto é conduzir estudos de competição para encontrar anticorpos que se ligam competitivamente uns aos outros, i.e., os anticorpos competem pela ligação ao antigênio. Um processo de elevada produtividade para conjugar anticorpos baseado na sua competição cruzada é descrito em WO 03/48731. Outros métodos de conjugação ou mapeamento de nível de domínio ou epítopo compreendendo competição do modulador ou expressão do fragmento de antigênio em levedura são apresentados nos Exemplos 9 e 10 em baixo.

[00186] Como usado aqui, o termo "conjugação" se refere a métodos usados para agrupar ou classificar anticorpos com base nas suas características de ligação do e competição com o antigênio. Embora as técnicas sejam úteis para definição e categorização de moduladores da presente invenção, os conjugados nem sempre se correlacionam diretamente com epítopos e tais determinações iniciais da ligação de epítopo podem ser adicionalmente refinadas e confirmadas por outra metodologia reconhecida pela técnica como descrito aqui. No entanto, como discutido e mostrado nos Exemplos em baixo, a atribuição empírica de moduladores de anticorpo a conjugados individuais proporciona informação que pode ser indicativa do potencial terapêutico dos moduladores divulgados.

[00187] Mais especificamente, pode se determinar se um anticorpo de referência selecionado (ou seu fragmento) se liga ao mesmo epítopo ou compete de modo cruzado para ligação com um segundo anticorpo de teste (i.e., está no mesmo conjugado) por uso de métodos conhecidos na técnica e apresentados nos Exemplos aqui. Em uma modalidade, um modulador de anticorpo de referência está associado a antigênio de SEZ6 sob condições saturantes e depois a capacidade de um modulador de anticorpo secundário ou de teste de se ligar a SEZ6 é determinada usando técnicas imunoquímicas padrão. Se o anticorpo de teste for capaz de se ligar substancialmente a SEZ6 ao mesmo tempo do anticorpo anti-SEZ6 de referência, então o anticorpo secundário ou de teste se liga a um diferente epítopo do que o anticorpo primário ou de referência. No entanto, se o anticorpo de teste não for capaz de se ligar substancialmente a SEZ6 ao mesmo tempo, então, o anticorpo de teste se liga ao mesmo epítopo, um epítopo sobreposto, ou um epítopo que está em proximidade íntima (pelo menos estericamente) ao epítopo ligado pelo anticorpo primário. Isto é, o anticorpo de teste compete pela ligação do antigênio e está no mesmo conjugado como o anticorpo de referência.

[00188] O termo "compete" ou "anticorpo em competição", quando usado no contexto dos moduladores divulgados, significa competição entre anticorpos como determinado por um ensaio no qual um anticorpo de teste ou fragmento imunologicamente funcional sob teste previne ou inibe substancialmente a ligação específica de um anticorpo de referência a um antigênio comum. Tipicamente, tal ensaio envolve o uso de antigênio purificado (p.ex., SEZ6 ou um seu domínio ou fragmento) ligado a uma superfície sólida ou células transportando qualquer um destes, uma imunoglobulina de teste não marcada e uma imunoglobulina de referência marcada. A inibição competitiva é medida por determinação da quantidade de marcador ligada à superfície sólida ou células na presença da imunoglobulina de teste. Usualmente, a imunoglobulina de teste está presente em excesso e/ou se permite que se ligue primeiramente. Os anticorpos identificados por ensaio de competição (anticorpos de competição) incluem anticorpos se ligando ao mesmo epítopo como o anticorpo de referência e anticorpos se ligando a um epítopo adjacente suficientemente próximo ao epítopo ligado pelo anticorpo de referência para que ocorra impedimento estérico. Detalhes adicionais dizendo respeito a métodos para determinação da ligação competitiva são proporcionados nos Exemplos aqui. Usualmente, quando um anticorpo de competição está presente em excesso, inibirá a ligação específica de um anticorpo de referência a um antigênio comum por pelo menos 30 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % ou 75 %. Em alguns casos, a ligação é inibida por pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 97 % ou mais.

[00189] Reciprocamento, quando o anticorpo de referência está ligado, irá preferencialmente inibir a ligação de um anticorpo de teste subsequentemente adicionado (i.e., um modulador de SEZ6) por pelo menos 30 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % ou 75 %. Em alguns casos, a ligação do anticorpo de teste é inibida em pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 97 % ou mais.

[00190] No que diz respeito à presente invenção, e como apresentado nos Exemplos 9 e 10 em baixo, foi determinado (através de ressonância de plasmon de superfície ou interferometria de biocamada) que o domínio extracelular de SEZ6 define pelo menos sete conjugados por ligação competitiva denominado "conjugado A" a "conjugado F" e conjugado U aqui.

[00191] A este respeito, e como conhecido na técnica e detalhado nos Exemplos em baixo, os dados de conjugação ou ligação desejadas competitivas podem ser obtidos usando radioimunoensaio (RIA) direto ou indireto de fase sólida, imunoensaio de enzima (EIA ou ELISA) direto ou indireto de fase sólida, ensaio de competição em sanduíche, um sistema Biacore™ 2000 (i.e., ressonância de plasmon de ressonância - GE Healthcare), um Analisador ForteBio® (i.e., interferometria de biocamada - ForteBio, Inc.) ou metodologia citométrica de fluxo. O termo "ressonância de plasmon de superfície", como usado aqui, se refere a um fenômeno ótico que permite a análise de interações específicas em tempo real por detecção de alterações em concentrações de proteína dentro uma matriz de biossensor. O termo "interferometria de biocamada" se refere a uma técnica analítica ótica que analisa o padrão de interferência da luz branca refletida de duas superfícies: uma camada de proteína imobilizada em uma ponta do biossensor, e uma camada de referência interna. Qualquer mudança no número de moléculas ligado à ponta do biossensor provoca uma troca no padrão de interferência que pode ser medida em tempo real. Em modalidades particularmente preferenciais, a análise (quer ressonância de plasmon de superfície, interferometria de biocamada ou citometria de fluxo) é realizada usando um instrumento Biacore ou ForteBio ou um citômetro de fluxo (p.ex., FACSAria II) como demonstrado nos Exemplos em baixo.

[00192] De modo a caracterizar adicionalmente os epítopos aos quais os moduladores de SEZ6 divulgados se associam ou se ligam, foi realizado mapeamento de epítopo ao nível do domínio usando uma modificação do protocolo descrito por Cochran e outros. (J Immunol Methods. 287 (1-2):147-158 (2004), que é incorporado aqui por referência). Brevemente, domínios individuais de SEZ6 compreendendo sequências de aminoácidos específicas foram expressos na superfície de levedura e a ligação por cada anticorpo de SEZ6 foi determinada através de citometria de fluxo. Estes resultados são discutidos em baixo no Exemplo 10 e mostrados nas FIGS. 14A e 14B.

[00193] Outras técnicas de mapeamento de epítopo compatíveis incluem mutantes de rastreio da alanina, transferências de peptídeo (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63) (aqui especificamente incorporado por referência na sua totalidade), ou análise de clivagem de peptídeo. Adicionalmente, métodos tais como excisão de epítopo, extração de epítopo e modificação química de antigênios podem ser empregues (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496) (aqui especificamente incorporado por referência na sua totalidade). Em outras modalidades, o Perfil Assistido por Modificação (MAP), também conhecido como Perfil de Anticorpo à base de Estrutura de Antigênio (ASAP), proporciona um método que categoriza grandes números de anticorpos monoclonais (mAbs) dirigidos contra o mesmo antigênio de acordo com as similaridades do perfil de ligação de cada anticorpo a superfícies de antigênio quimicamente ou enzimaticamente modificadas (U.S.P.N. 2004/0101920, aqui especificamente incorporada por referência na sua totalidade). Cada categoria pode refletir um epítopo único ou distintamente diferente do ou parcialmente sobreposto com o epítopo representado por outra categoria. Esta tecnologia permite filtragem rápida de anticorpos geneticamente idênticos, tal que a caracterização possa estar focada em anticorpos geneticamente distintos. Será apreciado que MAP pode ser usado para separar os moduladores de anticorpo hSEZ6 da invenção em grupos de anticorpos se ligando a diferentes epítopos.

[00194] Agentes úteis para alteração da estrutura do antigênio imobilizado incluem enzimas tais como enzimas proteolíticas (p.ex., tripsina, endoproteinase Glu-C, endoproteinase Asp-N, quimotripsina, etc.). Agentes úteis para alteração da estrutura do antigênio imobilizado podem ser também agentes químicos, tais como ésteres de succinimidila e seus derivados, compostos contendo amina primária, hidrazinas e carboidrazinas, aminoácidos livres, etc..

[00195] A proteína de antigênio pode estar imobilizada em superfícies do chip do biossensor ou esférulas de polistireno. Estas últimas podem ser processadas com, por exemplo, um ensaio tal como ensaio de detecção multiplex LUMINEX™ (Luminex Corp.). Devido à capacidade de LUMINEX de manusear análise multiplex com até 100 diferentes tipos de esférulas, LUMINEX proporciona superfícies de antigênio quase ilimitadas com várias modificações, resultando em resolução melhorado em perfil de epítopo de anticorpo sobre um ensaio de biossensor.

E. Características de Ligação do Modulador

[00196] Para além da especificidade do epítopo, os anticorpos divulgados podem ser caracterizados usando características físicas tais como, por exemplo, afinidades de ligação. A este respeito, a presente invenção engloba adicionalmente o uso de anticorpos que têm uma elevada afinidade de ligação para uma ou mais isoformas de SEZ6 ou, no caso de pan-anticorpos, mais do que um membro da família de SEZ6.

[00197] O termo "KD", como usado aqui, se destina a se referir à constante de dissociação de uma interação anticorpo-antigênio particular. Se diz que um anticorpo da invenção se liga imunoespecificamente ao seu antigênio alvo quando a constante de dissociação KD (koff/kon) é < 10-7M. O anticorpo se liga especificamente ao antigênio com elevada afinidade quando a KD é < 5x10-9 M, e com muito elevada afinidade quando a KD é < 5x10-10 M. Em uma modalidade da invenção, o anticorpo tem uma KD de < 10-9 M e uma taxa de dissociação de cerca de 1x10-4/seg. Em uma modalidade da invenção, a taxa de dissociação é < 1x10-5/seg. Em outras modalidades da invenção, os anticorpos se ligarão a SEZ6 com uma KD de entre cerca de 10-7M e 10-10M, e ainda em outra modalidade se ligará com uma KD < 2x10-10 M. Ainda outras modalidades da presente invenção compreendem anticorpos que têm uma constante de dissociação ou KD (koff/kon) inferior a 10-2M, inferior a 5x10-2M, inferior a 10-3M, inferior a 5x10-3M, inferior a 10-4M, inferior a 5x10-4M, inferior a 10-5M, inferior a 5x10-5M, inferior a 10-6M, inferior a 5x10-6M, inferior a 10-7M, inferior a 5x10-7M, inferior a 10-8M, inferior a 5x10-8M, inferior a 10-9M, inferior a 5x10-9M, inferior a 10-10M, inferior a 5x10-10M, inferior a 10-11M, inferior a 5x10-11M, inferior a 10-12M, inferior a 5x10-12M, inferior a 10-13M, inferior a 5x10-13M, inferior a 10-14M, inferior a 5x10-14M, inferior a 10-15M ou inferior a 5x10-15M.

[00198] Em modalidades específicas, um anticorpo da invenção que se liga imunoespecificamente a SEZ6 tem uma constante de taxa de associação ou taxa kon (ou ka) (SEZ6 (Ab) + antigênio (Ag)kon^Ab-Ag) de pelo menos 105M-ls-l, pelo menos 2x105M-ls-l, pelo menos 5x105M-ls- l, pelo menos 106M-ls-l, pelo menos 5x106M-ls-l, pelo menos 107M-ls-l, pelo menos 5x107M-ls-l, ou pelo menos 108M-ls-l.

[00199] Em outra modalidade, um anticorpo da invenção que se liga imunoespecificamente a SEZ6 tem uma constante de taxa de dissociação ou taxa koff (ou kd) (SEZ6 (Ab) + antigênio (Ag)koff ^Ab- Ag) de menos do que l0-ls- l, inferior a 5xl0-ls- l, inferior a l0-2s- l, inferior a 5xl0-2s- l, inferior a l0-3s- l, inferior a 5xl0-3s- l, inferior a l0-4s- l, inferior a 5xl0-4s- l, inferior a l0-5s- l, inferior a 5xl0-5s- l, inferior a l0-6s- l, inferior a 5xl0-6s- l inferior a l0-7s- l, inferior a 5xl0-7s- l, inferior a l0-8s- l, inferior a 5xl0-8s- l, inferior a l0-9s- l, inferior a 5xl0-9s- l ou inferior a l0-10s- l.

[00200] Em outras modalidades da presente invenção, os anticorpos anti-SEZ6 terão uma constante de afinidade ou Ka (kon/koff) de pelo menos 102 M-1, pelo menos 5x102 M-1, pelo menos 103 M-1, pelo menos 5x103 M-1, pelo menos 104 M-1, pelo menos 5x104 M-1, pelo menos 105 M-1, pelo menos 5x105 M-1, pelo menos 106 M-1, pelo menos 5x106 M-1, pelo menos 107 M-1, pelo menos 5x107 M-1, pelo menos 108 M-1, pelo menos 5x108 M-1, pelo menos 109 M-1, pelo menos 5x109 M-1, pelo menos 1010 M-1, pelo menos 5x1010 M-1, pelo menos 1011 M-1, pelo menos 5x1011 M-1, pelo menos 1012 M-1, pelo menos 5x1012 M-1, pelo menos 1013 M-1, pelo menos 5x1013 M-1, pelo menos 1014 M-1, pelo menos 5x1014 M-1, pelo menos 1015 M-1 ou pelo menos 5x1015 M-1.

[00201] Para além das características do modulador acima mencionadas, os anticorpos da presente invenção podem ser adicionalmente caracterizados usando características físicas incluindo, por exemplo, estabilidade térmica (i.e., temperatura de fusão; Tm), e pontos isoelétricos. (Ver, p.ex., Bjellqvist e outros., 1993, Electrophoresis 14:1023; Vermeer e outros., 2000, Biophys. J. 78:394404; Vermeer e outros., 2000, Biophys. J. 79: 2150-2154, cada um dos quais é incorporado por referência).

VIII. Moduladores Conjugados A. Visão global

[00202] Logo que os moduladores da invenção forem gerados e/ou fabricados de acordo com os ensinamentos aqui, eles podem ser ligados com, fundidos com, conjugados com (p.ex., covalentemente ou não covalentemente) ou de outro modo associados a frações farmaceuticamente ativas ou de diagnóstico ou modificadores biocompatíveis. Como usado aqui, o termo "conjugado" ou "conjugado de modulador" ou "conjugado de anticorpo" será usado amplamente e considerado como significando qualquer molécula ou fármaco biologicamente ativo ou detectável associado aos modulares divulgados independentemente do método de associação. A este respeito, será entendido que tais conjugados podem, adicionalmente aos moduladores divulgados, compreender peptídeos, polipeptídeos, proteínas, pró-fármacos que são metabolizados em um agente ativo in vivo, polímeros, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequenas, agentes de ligação, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgânicas, moléculas orgânicas e radioisótopos. Além do mais, como indicado acima, o conjugado selecionado pode estar covalentemente ou não covalentemente associado ao, ou ligado ao, modulador e exibir várias razões molares estequiométricas dependendo, pelo menos em parte, do método usado para efetuar a conjugação.

[00203] Aspetos particularmente preferenciais da presente invenção compreenderão conjugados anticorpo-modulador ou conjugados anticorpo-fármaco que podem ser usados para o diagnóstico e/ou tratamento de distúrbios proliferativos. Será apreciado que, a não ser que ditado de outro modo pelo contexto, o termo "conjugado anticorpo- fármaco" ou "ADC" ou a fórmula M-[L-D]n deve ser considerado como englobando conjugados compreendendo frações terapêuticas e de diagnóstico. Em tais modalidades, os compostos conjugados anticorpo-fármaco compreenderão um modulador de SEZ6 (tipicamente um anticorpo anti-SEZ6) como o modulador ou unidade de ligação celular (abreviada como CBA, M, ou Ab aqui), uma porção terapêutica (p.ex., agente anticâncer) ou de diagnóstico (D), e opcionalmente um ligante (L) que une o fármaco e o agente de ligação do antigênio. Para os propósitos da presente divulgação, "n" deve ser considerado como significando um inteiro de 1 a 20. Em uma modalidade preferencial, o modulador é um mAb de SEZ6 compreendendo pelo menos uma CDR das regiões variáveis da cadeia leve e pesada como descrito acima.

[00204] Aqueles peritos na técnica apreciarão que um número de diferentes reações está disponível para a anexação ou associação de frações terapêuticas ou de diagnóstico e/ou ligantes de agentes de ligação. Em modalidades selecionadas, isto pode ser alcançado por reação dos resíduos de aminoácidos do agente de ligação, p.ex., molécula de anticorpo, incluindo os grupos amina da lisina, os grupos carboxílicos livres do ácido glutâmico e aspártico, os grupos sulfidrila de cisteína e as várias frações dos aminoácidos aromáticos. Um dos métodos não específicos de anexação covalente o mais comummente usado é a reação de carbodiimida para ligar um grupo carboxi (ou amino) de um composto a grupos amino (ou carboxi) do anticorpo. Adicionalmente, agentes bifuncionais tais como dialdeídos ou imidoésteres foram usados para ligar o grupo amino de um composto a grupos amino de uma molécula de anticorpo. Também disponível para anexação de fármacos a agentes de ligação está a reação de base de Schiff. Este método envolve a oxidação de periodato de um fármaco que contém grupos glicol ou hidroxi, formando assim um aldeído que é depois reagido com o agente de ligação. A anexação ocorre através da formação de uma base de Schiff com grupos amino do agente de ligação. Isotiocianatos e azlactonas podem ser também usadas como agentes de acoplamento para anexação covalente de fármacos a agentes de ligação.

[00205] Em outras modalidades, os moduladores divulgados da invenção podem ser conjugados com ou associados a proteínas, polipeptídeos ou peptídeos que conferem características selecionadas (p.ex., biotoxinas, biomarcadores, marcadores de purificação, etc.). Em certas modalidades preferenciais, a presente invenção engloba o uso de moduladores ou seus fragmentos recombinantemente fundidos ou quimicamente conjugados (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) com uma proteína ou peptídeo heterólogo em que a proteína ou peptídeo compreende pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90 ou pelo menos 100 aminoácidos. O constructo não necessita necessariamente de ser diretamente ligado, mas pode ocorrer através de sequências ligantes de aminoácidos. Por exemplo, os anticorpos podem ser usados para dirigir polipeptídeos heterólogos a tipos de células particulares expressando SEZ6, in vitro ou in vivo, por fusão ou conjugação dos moduladores da presente invenção com anticorpos específicos para receptores da superfície de células particulares para proporcionar constructos biespecíficos. Além do mais, podem ser também usados moduladores fundidos ou conjugados com polipeptídeos heterólogos em imunoensaios in vitro e podem ser particularmente (p.ex., marcadores de his) como é conhecido na técnica. Ver, p.ex., Publicação internacional No. WO 93/21232; Patente Europeia No. EP 439,095; Naramura e outros., 1994, Immunol. Lett. 39:91-99; Pat. dos E.U.A. No. 5,474,981; Gillies e outros., 1992, PNAS 89:1428-1432; e Fell e outros., 1991, J. Immunol. 146:2446-2452.

B. Ligantes

[00206] Para além dos ligantes ou espaçadores de peptídeo acima mencionados, será apreciado que várias outras variedades ou tipos de ligante podem ser usadas para associar os moduladores divulgados a frações farmaceuticamente ativas ou de diagnóstico ou modificadores biocompatíveis. Em algumas modalidades, o ligante é clivável sob condições intracelulares, tal que a clivagem do ligante libere a unidade de fármaco do anticorpo no ambiente intracelular. Ainda em outras modalidades, a unidade ligante não é clivável e o fármaco é liberado, por exemplo, por degradação do anticorpo.

[00207] Os ligantes do ADC são preferencialmente extracelularmente estáveis, previnem a agregação de moléculas de ADC e mantêm o ADC livremente solúvel em meio aquoso e em um estado monomérico. Antes do transporte ou distribuição em uma célula, o conjugado anticorpo-fármaco (ADC) é preferencialmente estável e permanece intacto, i.e., o anticorpo permanece ligado à porção de fármaco. Os ligantes são estáveis fora da célula alvo e podem ser clivados a alguma taxa eficaz dentro da célula. Um ligante eficaz irá: (i) manter as propriedades de ligação específicas do anticorpo; (ii) permitir distribuição intracelular do conjugado ou porção do fármaco; (iii) permanecer estável e intacto, i.e., não clivado, até o conjugado ter sido distribuído ou transportado até ao seu local alvo; e (iv) manter um efeito citotóxico, de morte de células ou um efeito citostático da porção do fármaco PBD. A estabilidade do ADC pode ser medida por técnicas analíticas padrão tais como espectroscopia de massa, HPLC, e a técnica de separação/análise LC/MS. A anexação covalente do anticorpo e da porção do fármaco requer que o ligante tenha dois grupos funcionais reativos, i.e., bivalência em um sentido reativo. Reagentes ligantes bivalentes que são úteis para anexar duas ou mais frações funcionais ou biologicamente ativas, tais como peptídeos, ácidos nucleicos, fármacos, toxinas, anticorpos, haptenos, e grupos repórter são conhecidos, e métodos descritos seus conjugados resultantes (Hermanson, G.T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: Nova Iorque, p 234-242).

[00208] Para esta finalidade, certas modalidades da invenção compreendem o uso um ligante que é clivável por um agente clivante que está presente no ambiente intracelular (p.ex., dentro de um lisossoma ou endossoma ou caveólos). O ligante pode ser, por exemplo, um ligante de peptidila que é clivado por uma enzima peptidase ou protease intracelular, incluindo, mas não se limitando a, uma protease lisossomal ou endossomal. Em algumas modalidades, o ligante de peptidila tem pelo menos dois aminoácidos de comprimento ou pelo menos três aminoácidos de comprimento. Os agentes clivantes podem incluir catepsinas B e D e plasmina, cada uma das quais se sabe que hidrolisa derivados de fármaco de dipeptídeo resultando na liberação de fármaco atico dentro de células alvo. Ligantes de peptidila exemplares que são cliváveis pela protease dependente de tiol Catepsina B são peptídeos compreendendo Phe- Leu uma vez que se descobriu que Catepsina B era altamente expressa em tecido cancerígeno. Outros exemplos de tais ligantes são descritos, por exemplo, em U.S.P.N. 6,214,345 e U.S.P.N. 2012/0078028, cada uma das quais incorporada aqui por referência na sua totalidade. Em uma modalidade preferencial específica, o ligante de peptidila clivável por uma protease intracelular é um ligante de Val- Cit, um ligante de Ala-Val ou um ligante de Phe-Lys tal como é descrito em U.S.P.N. 6.214.345. Uma vantagem do uso de liberação proteolítica intracelular do agente terapêutico é que o agente está tipicamente atenuado quando conjugado e as estabilidades no soro dos conjugados são tipicamente elevadas.

[00209] Em outras modalidades, o ligante clivável é sensível ao pH, i.e., sensível a hidrólise a certos valores de pH. Tipicamente, o ligante sensível ao pH hidrolizável sob condições ácidas. Por exemplo, um ligante lábil em ácido que seja hidrolizável no lisossoma (p.ex., uma hidrazona, oxima, semicarbazona, tiossemicarbazona, cis-amida aconítica, ortoéster, acetal, cetal, ou similares) pode ser usado (Ver, p.ex., U.S.P.N. 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929). Tais ligantes são relativamente estáveis sob condições de pH neutro, tais como aquelas no sangue, mas são instáveis a pH abaixo de 5,5 ou 5,0, o pH aproximado do lisossoma.

[00210] Ainda em outras modalidades, o ligante é clivável sob condições redutoras (p.ex., um ligante de dissulfeto). Uma variedade de ligantes de dissulfeto é conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, aqueles que podem ser formados usando SATA (N- succinimidil-S-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2- piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato) e SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)tolueno). Ainda em outras modalidades específicas, o ligante é um ligante de malonato (Johnson e outros., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), um ligante de maleimidobenzoíla (Lau e outros., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304), ou um análogo de 3‘-N-amida (Lau e outros., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12). Ainda em outras modalidades, a unidade ligante não é clivável e o fármaco é liberado por degradação do anticorpo. (Ver Publicação dos E.U.A. No. 2005/0238649 incorporada aqui na sua totalidade e para todos os propósitos).

[00211] Mais particularmente, em modalidades preferenciais (apresentadas em U.S.P.N. 2011/0256157, que é incorporada aqui por referência na sua totalidade), os ligantes compatíveis compreenderão: onde o asterisco indica o ponto de anexação ao agente citotóxico, CBA é um agente de ligação da célula/modulador, L1 é um ligante, A é um grupo conectante conectando L1 ao agente de ligação da célula, L2 é uma ligação covalente ou, em conjunto com -OC(=O)-, forma um ligante autoimolador, e L1 ou L2 é um ligante clivável.

[00212] L1 é preferencialmente o ligante clivável, e pode ser referido como um desencadeador da ativação do ligante para clivagem.

[00213] A natureza de L1 e L2, onde presentes, pode variar amplamente. Estes grupos são escolhidos com base nas suas características de clivagem, o que pode ser ditado pelas condições no local ao qual o conjugado é distribuído. Aqueles ligantes que são clivados pela ação de enzimas são preferenciais, embora ligantes que são cliváveis por mudanças no pH (p.ex., lábil em ácido ou base), temperatura ou após irradiação (p.ex., fotolábil) possam ser também usados. Ligantes que são cliváveis sob condições redutoras ou oxidantes podem também encontrar uso na presente invenção.

[00214] L1 pode compreender uma sequência contígua de aminoácidos. A sequência de aminoácidos pode ser o substrato alvo para clivagem enzimática, permitindo deste modo liberação de R10 da posição N10.

[00215] Em uma modalidade, L1 é clivável pela ação de uma enzima. Em uma modalidade, a enzima é uma esterase ou uma peptidase.

[00216] Em uma modalidade, L2 está presente e, em conjunto com -C(=O)O-, forma um ligante autoimolador. Em uma modalidade, L2 é um substrato para atividade enzimática, permitindo deste modo liberação de R10 da posição N10.

[00217] Em uma modalidade, onde L1 é clivável pela ação de uma enzima e L2 está presente, a enzima cliva a ligação entre L1 e L2.

[00218] L1 e L2, onde presentes, podem estar conectados por uma ligação selecionada de: -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O- , -OC(=O)NH-, e -NHC(=O)NH-.

[00219] Um grupo amino de L1 que conecta L2 pode ser o terminal N de um aminoácido ou pode ser derivado de um grupo amino de uma cadeia lateral de aminoácido, por exemplo uma cadeia lateral do aminoácido lisina.

[00220] Um grupo carboxila de L1 que conecta L2 pode ser o terminal C de um aminoácido ou pode ser derivado de um grupo carboxila de uma cadeia lateral de aminoácido, por exemplo uma cadeia lateral do aminoácido ácido glutâmico.

[00221] Um grupo hidroxila de L1 que conecta L2 pode ser derivado de um grupo hidroxila de uma cadeia lateral de aminoácido, por exemplo, uma cadeia lateral do aminoácido serina.

[00222] O termo "cadeia lateral de aminoácido" inclui aqueles grupos encontrados em: (i) aminoácidos ocorrendo naturalmente tais como alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, e valina; (ii) aminoácidos menores tais como ornitina e citrulina; (iii) aminoácidos não naturais, beta-aminoácidos, análogos e derivados sintéticos de aminoácidos ocorrendo naturalmente; e (iv) todos os enantiômeros, diastereômeros, isomericamente enriquecidos, isotopicamente marcados (p.ex., 2H, 3H, 14C, 15N), formas protegidas, e suas misturas racêmicas.

[00223] Em uma modalidade, -C(=O)O- e L2 formam em conjunto o grupo:

[00224] onde o asterisco indica o ponto de anexação à posição do fármaco ou do agente citotóxico, a linha ondulada indica o ponto de anexação ao ligante L1, Y é -N(H)-, -O-, -C(=O)N(H)- ou -C(=O)O-, e n é 0 a 3. O anel de fenileno está opcionalmente substituído por um, dois ou três substituintes como descrito aqui. Em uma modalidade, o grupo fenileno está opcionalmente substituído por halo, NO2, R ou OR.

[00225] Em uma modalidade, Y é NH.

[00226] Em uma modalidade, n é 0 ou 1. Preferencialmente, n é 0.

[00227] Onde Y é NH e n é 0, o ligante autoimolador pode ser referido como ligante de p-aminobenzilcarbonila (PABC).

[00228] O ligante autoimolador permitirá liberação do composto protegido quando um local remoto é ativado, procedendo ao longo das linhas mostradas em baixo (para n=0):

[00229] onde L* é a forma ativada da porção restante do ligante. Estes grupos têm a vantagem de separar o local de ativação do composto sendo protegido. Como descrito acima, o grupo fenileno pode estar opcionalmente substituído.

[00230] Em uma modalidade descrita aqui, o grupo L* é um ligante L1 como descrito aqui, o que pode incluir um grupo dipeptídeo.

[00231] Em outra modalidade, -C(=O)O- e L2 formam em conjunto um grupo selecionado de:

[00232] onde o asterisco, a linha ondulada, Y, e n são como definidos acima. Cada anel de fenileno está opcionalmente substituído por um, dois ou três substituintes como descrito aqui. Em uma modalidade, o anel de fenileno tendo o substituinte Y está opcionalmente substituído e o anel de fenileno não tendo o substituinte Y está não substituído. Em uma modalidade, o anel de fenileno tendo o substituinte Y está não substituído e o anel de fenileno não tendo o substituinte Y está opcionalmente substituído.

[00233] Em outra modalidade, -C(=O)O- e L2 formam em conjunto um grupo selecionado de: onde o asterisco, a linha ondulada, Y, e n são como definidos acima, E é O, S ou NR, D é N, CH, ou CR, e F é N, CH, ou CR.

[00234] Em uma modalidade, D é N.

[00235] Em uma modalidade, D é CH.

[00236] Em uma modalidade, E é O ou S.

[00237] Em uma modalidade, F é CH.

[00238] Em uma modalidade preferencial, o ligante é um ligante lábil em catepsina.

[00239] Em uma modalidade, L1 compreende um dipeptídeo. O dipeptídeo pode ser representado como -NH-X1-X2-CO-, onde -NH- e - CO- representam os terminais N e C dos grupos de aminoácidos X1 e X2, respectivamente. Os aminoácidos no dipeptídeo podem ser qualquer combinação de aminoácidos naturais. Onde o ligante é um ligante lábil em catepsina, o dipeptídeo pode ser o local de ação para clivagem mediada por catepsina.

[00240] Adicionalmente, para aqueles grupos de aminoácidos tendo funcionalidade de cadeia lateral carboxila ou amino, por exemplo Glu e Lis, respectivamente, CO e NH podem representar essa funcionalidade de cadeia lateral.

[00241] Em uma modalidade, o grupo -X1-X2- no dipeptídeo, -NH- X1-X2-CO-, é selecionado de: -Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, -Val-Cit-, -Phe-Cit-, -Leu-Cit-, -Ile-Cit-, -Phe-Arg- e -Trp-Cit- onde Cit é citrulina.

[00242] Preferencialmente, o grupo -X1-X2- no dipeptídeo, -NH-X1- X2-CO-, é selecionado de: -Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, e -Val-Cit-.

[00243] O mais preferencialmente, o grupo -X1-X2- no dipeptídeo, - NH-X1-X2-CO-, é -Phe-Lys- ou -Val-Ala-.

[00244] Podem ser usadas outras combinações de dipeptídeo, incluindo aquelas descritas por Dubowchik e outros., Bioconjugate Chemistry, 2002, 13,855-869, que é incorporado aqui por referência.

[00245] Em uma modalidade, a cadeia lateral de aminoácido está derivada, onde apropriado. Por exemplo, um grupo amino ou grupo carboxi de uma cadeia lateral de aminoácido pode estar derivado.

[00246] Em uma modalidade, um grupo amino NH2 de um aminoácido da cadeia lateral, tal como lisina, é uma forma derivada selecionada do grupo consistindo em NHR e NRR’.

[00247] Em uma modalidade, um grupo carboxi COOH de um aminoácido da cadeia lateral, tal como ácido aspártico, é uma forma derivada selecionada do grupo consistindo em COOR, CONH2, CONHR e CONRR’.

[00248] Em uma modalidade, a cadeia lateral de aminoácido está quimicamente protegida, onde apropriado. O grupo protetor da cadeia lateral pode ser um grupo como discutido em baixo em relação ao grupo RL. Sequências de aminoácidos protegidas são cliváveis por enzimas. Por exemplo, foi estabelecido que uma sequência de dipeptídeo compreendendo um resíduo de Lys protegido por cadeia lateral Boc é clivável por catepsina.

[00249] Grupos protetores para as cadeias laterais de aminoácidos são bem conhecidos na técnica e são descritos no Catálogo da Novabiochem. Estratégias de grupos protetores adicionais são apresentados em Protective Groups in Organic Synthesis, Greene e Wuts.

[00250] Grupos protetores de cadeia lateral possíveis são mostrados em baixo para aqueles aminoácidos tendo funcionalidade de cadeia lateral reativa: Arg: Z, Mtr, Tos; Asn: Trt, Xan; Asp: Bzl, t-Bu; Cys: Acm, Bzl, Bzl-OMe, Bzl-Me, Trt; Glu: Bzl, t-Bu; Gln: Trt, Xan; His: Boc, Dnp, Tos, Trt; Lys: Boc, Z-Cl, Fmoc, Z, Alloc; Ser: Bzl, TBDMS, TBDPS; Thr: Bz; Trp: Boc; Tyr: Bzl, Z, Z-Br.

[00251] Em uma modalidade, a proteção da cadeia lateral é selecionada para ser ortogonal em relação a um grupo proporcionado como, ou como parte de, um grupo tamponante, onde presente. Assim, a remoção do grupo protetor da cadeia lateral não remove o grupo tamponante, ou qualquer funcionalidade do grupo protetor que é parte do grupo tamponante.

[00252] Em outras modalidades da invenção, os aminoácidos selecionados são aqueles não tendo nenhuma funcionalidade de cadeia lateral reativa. Por exemplo, os aminoácidos podem ser selecionados de: Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, e Val.

[00253] Em uma modalidade, o dipeptídeo é usado em combinação com um ligante autoimolador. O ligante autoimolador pode ser conectado a -X2-.

[00254] Onde um ligante autoimolador está presente, -X2- está conectado diretamente ao ligante autoimolador. Preferencialmente, o grupo -X2-CO- está conectado a Y, onde Y é NH, formando deste modo o grupo -X2-CO-NH-.

[00255] -NH-X1- está conectado diretamente a A. A pode compreender a funcionalidade -CO- para formar deste modo uma ligação amida com -X1-.

[00256] Em uma modalidade, L1 e L2 em conjunto com -OC(=O)- compreendem o grupo NH-X1-X2-CO-PABC-. O grupo PABC está conectado diretamente ao agente citotóxico. Preferencialmente, o ligante autoimolador e o dipeptídeo formam em conjunto o grupo -NH- Phe-Lys-CO-NH-PABC-, que é ilustrado em baixo:

[00257] onde o asterisco indica o ponto de anexação à porção citotóxica selecionada, e a linha ondulada indica o ponto de anexação à porção restante do ligante L1 ou o ponto de anexação a A. Preferencialmente, a linha ondulada indica o ponto de anexação a A. A cadeia lateral do aminoácido Lys pode estar protegida, por exemplo, com Boc, Fmoc, ou Alloc, como descrito acima.

[00258] Preferencialmente, o ligante autoimolador e o dipeptídeo formam em conjunto o grupo -NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-, que é ilustrado em baixo: onde o asterisco e a linha ondulada são como definidos acima.

[00259] Alternativamente, o ligante autoimolador e o dipeptídeo formam em conjunto o grupo -NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-, que é ilustrado em baixo:

[00260] onde o asterisco e a linha ondulada são como definidos acima.

[00261] Em algumas modalidades da presente invenção, pode ser preferencial que, se a porção de fármaco conter uma ligação imina não protegida, p.ex., se a porção B estiver presente, então o ligante não contém um grupo amino (H2K-) livre. Assim, se o ligante tiver a estrutura -A-L1-L2-, então, esta não conteria preferencialmente um grupo amino livre. Esta preferência é particularmente relevante quando o ligante contém um dipeptídeo, por exemplo, como L1; em esta modalidade, seria preferencial que um dos dois aminoácidos não fosse selecionado de lisina.

[00262] Sem desejar estar limitado pela teoria, a combinação de uma ligação imina não protegida na porção do fármaco e um grupo amino livre no ligante pode causar dimerização da porção fármaco- ligante o que pode interferir com a conjugação de tal porção fármaco- ligante com um anticorpo. A reação cruzada destes grupos pode ser acelerada no caso de o grupo amino livre estiver presente como um íon de amônio (H3K+-), tal como quando um ácido forte (p.ex., TFA) foi usado para desproteger o grupo amino livre.

[00263] Em uma modalidade, A é uma ligação covalente. Assim, L1 e o agente de ligação da célula estão diretamente conectados. Por exemplo, onde L1 compreende uma sequência de aminoácidos contígua, o terminal K da sequência pode se conectar diretamente com o agente de ligação da célula.

[00264] Assim, onde A é uma ligação covalente, a conexão entre o agente de ligação da célula e L1 pode ser selecionada de: -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O- , -OC(=O)NH-, -NHC(=O)NH-, -C(=O)NHC(=O)-, -S-, -S-S-, -CH2C(=O)-, e =N-NH-.

[00265] Um grupo amino de L1 que se conecta ao modulador SEZ6 pode ser o terminal N de um aminoácido ou pode ser derivado de um grupo amino de uma cadeia lateral de aminoácido, por exemplo uma cadeia lateral do aminoácido lisina.

[00266] Um grupo carboxila de L1 que se conecta ao modulador pode ser o terminal C de um aminoácido ou pode ser derivado de um grupo carboxila de uma cadeia lateral de aminoácido, por exemplo uma cadeia lateral do aminoácido ácido glutâmico.

[00267] Um grupo hidroxila de L1 que se conecta ao agente de ligação da célula pode ser derivado de um grupo hidroxila de uma cadeia lateral de aminoácido, por exemplo, uma cadeia lateral do aminoácido serina.

[00268] Um grupo tiol de L1 que se conecta ao modulador pode ser derivado de um grupo tiol de uma cadeia lateral de aminoácido, por exemplo uma cadeia lateral do aminoácido serina.

[00269] Os comentários acima em relação aos grupos amino, carboxila, hidroxila e tiol de L1 se aplicam também ao agente de ligação da célula.

[00270] Em uma modalidade, L2 representa em conjunto com - OC(=O)-:

[00271] onde o asterisco indica o ponto de anexação à posição N10, a linha ondulada indica o ponto de anexação a L1, n é 0 a 3, Y é uma ligação covalente ou um grupo funcional, E é um grupo ativável, por exemplo por ação enzimática ou luz, para gerar deste modo uma unidade autoimoladora. O anel de fenileno está opcionalmente adicionalmente substituído por um, dois ou três substituintes como descrito aqui. Em uma modalidade, o grupo fenileno está opcionalmente adicionalmente substituído por halo, NO2, R ou OR. Preferencialmente, n é 0 ou 1, o mais preferencialmente 0.

[00272] E é selecionado tal que o grupo seja suscetível a ativação, p.ex. por luz ou pela ação de uma enzima. E pode ser -NO2 ou ácido glucorônico. O primeiro pode ser suscetível à ação de uma nitroreductase, o último à ação de uma Q-glucoronidase.

[00273] Em esta modalidade, o ligante autoimolador permitirá liberação do composto protegido quando E é ativado, procedendo ao longo das linhas mostradas em baixo (para n=0):

[00274] onde o asterisco indica o ponto de anexação à posição N10, E* é a forma ativada de E, e Y é como descrito acima. Estes grupos têm a vantagem de separar o local de ativação do composto sendo protegido. Como descrito acima, o grupo fenileno pode estar opcionalmente adicionalmente substituído.

[00275] O grupo Y pode ser uma ligação covalente a L1.

[00276] O grupo Y pode ser um grupo funcional selecionado de: -C(=O)-, -NH-, -O-, -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, - OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, -NHC(=O)NH-, -NHC(=O)NH, - C(=O)NHC(=O)-, e -S-.

[00277] Onde L1 é um dipeptídeo, é preferencial que Y é -NH- ou - C(=O)-, para formar deste modo uma ligação amida entre L1 e Y. Em esta modalidade, a sequência de dipeptídeo não necessita de ser um substrato para uma atividade enzimática.

[00278] Em outra modalidade, A é um grupo espaçador. Assim, L1 e o agente de ligação da célula estão indiretamente conectados.

[00279] L1 e A podem estar conectados por uma ligação selecionada de: -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O- , -OC(=O)NH-, e -NHC(=O)NH-.

[00280] Preferencialmente, o ligante contém um grupo funcional eletrofílico para reação com um grupo funcional nucleofílico no modulador. Grupos nucleofílicos nos anticorpos incluem, mas não estão limitados a: (i) grupos amina N-terminais, (ii) grupos amina da cadeia lateral, p.ex. lisina, (iii) grupos tiol da cadeia lateral, p.ex. cisteína, e (iv) grupos hidroxila ou amino de açúcar onde o anticorpo está glicolisado. Grupos amina, tiol, e hidroxila são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos em frações ligantes e reagentes ligantes incluindo: (i) grupos maleimida, (ii) dissulfetos ativados, (iii) ésteres ativos tais como ésteres NHS (N-hidroxisuccinimida), ésteres HOBt (N- hidroxibenzotriazol), haloformatos, e haletos ácidos; (iv) haletos de alquila e benzila tais como haloacetamidas; e (v) aldeídos, cetonas, carboxila, e, alguns dos quais são exemplificados como se segue:

[00281] Certos anticorpos têm dissulfetos intercadeia reduzíveis, i.e., pontes de cisteína. Os anticorpos podem ser tornados reativos para conjugação com reagentes ligantes por tratamento com um agente redutor tal como DTT (ditiotreitol). Cada ponte de cisteína formará assim, teoricamente, dois nucleófilos de tiol reativos. Grupos nucleofílicos adicionais podem ser introduzidos em anticorpos através da reação de lisinas com 2-iminotiolano (reagente de Traut) resultando na conversão de uma amina em um tiol. Grupos de tiol reativos podem ser introduzidos no anticorpo (ou seu fragmento) por introdução de um, dois, três, quatro, ou mais resíduos de cisteína (p.ex., preparação de anticorpos mutantes compreendendo um ou mais resíduos do aminoácido cisteína não nativos). US 7521541 ensina métodos de manipulação por introdução de aminoácidos cisteína reativos.

[00282] Em algumas modalidades, o ligante tem um grupo nucleofílico reativo que é reativo com um grupo eletrofílico presente em um anticorpo. Grupos eletrofílicos úteis em um anticorpo incluem, mas não estão limitados a, grupos aldeído e cetona carbonila. O heteroátomo de um grupo nucleofílico de um Ligante pode reagir com um grupo eletrofílico em um anticorpo e formar uma ligação covalente a uma unidade de anticorpo. Grupos nucleofílicos úteis em um ligante incluem, mas não estão limitados a, hidrazida, oxima, amino, hidroxila, hidrazina, tiossemicarbazona, carboxilato de hidrazina, e arilhidrazida. O grupo eletrofílico em um anticorpo proporciona um local conveniente para anexação a um Ligante.

[00283] Em uma modalidade, o grupo A é:

[00284] onde o asterisco indica o ponto de anexação a L1, a linha ondulada indica o ponto de anexação ao agente de ligação de célula, e n é 0 a 6. Em uma modalidade, n é 5.

[00285] Em uma modalidade, o grupo A é:

[00286] onde o asterisco indica o ponto de anexação a L1, a linha ondulada indica o ponto de anexação ao agente de ligação de célula, e n é 0 a 6. Em uma modalidade, n é 5.

[00287] Em uma modalidade, o grupo A é: onde o asterisco indica o ponto de anexação a L1, a linha ondulada indica o ponto de anexação ao agente de ligação de célula, n é 0 ou 1, e m é 0 a 30. Em uma modalidade preferencial, n é 1 e m é 0 a 10, 1 a 8, preferencialmente 4 a 8, e o mais preferencialmente 4 ou 8. Em outra modalidade, m é 10 a 30, e preferencialmente 20 a 30. Alternativamente, m é 0 a 50. Em esta modalidade, m é preferencialmente 10-40 e n é 1.

[00288] Em uma modalidade, o grupo A é:

[00289] onde o asterisco indica o ponto de anexação a L1, a linha ondulada indica o ponto de anexação ao agente de ligação de célula, n é 0 ou 1, e m é 0 a 30. Em uma modalidade preferencial, n é 1 e m é 0 a 10, 1 a 8, preferencialmente 4 a 8, e o mais preferencialmente 4 ou 8. Em outra modalidade, m é 10 a 30, e preferencialmente 20 a 30. Alternativamente, m é 0 a 50. Em esta modalidade, m é preferencialmente 10-40 e n é 1.

[00290] Em uma modalidade, a conexão entre o agente de ligação da célula e A é através de um resíduo de tiol do agente de ligação da célula e um grupo maleimida de A.

[00291] Em uma modalidade, a conexão entre o agente de ligação da célula e A é: onde o asterisco indica o ponto de anexação à porção restante de A e a linha ondulada indica o ponto de anexação à porção restante do agente de ligação da célula. Em esta modalidade, o átomo de S é tipicamente derivado do modulador.

[00292] Em cada uma das modalidades acima, uma funcionalidade alternativa pode ser usada em lugar do grupo derivado de maleimida mostrado em baixo: onde a linha ondulada indica o ponto de anexação ao agente de ligação da célula como antes, e o asterisco indica a ligação à porção restante do grupo A.

[00293] Em uma modalidade, o grupo derivado de maleimida está substituído pelo grupo: onde a linha ondulada indica o ponto de anexação ao agente de ligação da célula, e o asterisco indica a ligação à porção restante do grupo A.

[00294] Em uma modalidade, o grupo derivado de maleimida está substituído por um grupo, que, opcionalmente em conjunto com a agente da ligação da célula, é selecionado de: -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O- , -OC(=O)NH-, -NHC(=O)NH-, -NHC(=O)NH, -C(=O)NHC(=O)-, -S-, -S- S-, -CH2C(=O)-, -C(=O)CH2-, =N-NH- e -NH-N=.

[00295] Em uma modalidade, o grupo derivado de maleimida está substituído por um grupo, que, opcionalmente em conjunto com a agente da ligação da célula, é selecionado de: onde a linha ondulada indica ou o ponto de anexação ao agente de ligação da célula ou a ligação à porção restante do grupo A, e o asterisco indica o outro do ponto de anexação ao agente de ligação da célula ou a ligação à porção restante do grupo A.

[00296] Outros grupos adequados para conexão de L1 ao modulador são descritos em WO 2005/082023.

[00297] Em outra modalidade preferencial, os moduladores da presente invenção podem estar associados a polímeros biocompatíveis compreendendo unidades ligantes de fármaco. A este respeito, um tal tipo de polímero compatível compreende polímeros Fleximer® (Mersana Therapeutics). Tais polímeros são supostamente biodegradáveis, bem tolerados e foram clinicamente validados. Além do mais, tais polímeros são compatíveis com um número de tecnologias e químicas de ligante customizáveis permitindo controle da farmacocinética, localização da liberação do fármaco e biodistribuição melhorada.

[00298] Os moduladores selecionados podem ser também radioisótopos diretamente conjugados ou podem compreender quelantes macrocíclicos úteis para conjugação de íons radiometálicos (como descrito aqui). Em certas modalidades, o quelante macrocíclico é ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N"-tetraacético (DOTA) que pode ser anexado ao anticorpo através de uma molécula ligante. Tais moléculas ligantes são comummente conhecidas na técnica e descritas em Denardo e outros., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483; Peterson e outros., 1999, Bioconjug. Chem. 10h55min; e Zimmerman e outros., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943.

[00299] Mais geralmente, técnicas para conjugação de frações terapêuticas ou agentes citotóxicos a moduladores são bem conhecidas. Como discutido acima, as frações podem ser conjugados com moduladores por qualquer método reconhecido pela técnica, incluindo, mas não se limitando a, ligação de aldeído/Schiff, ligação de sulfidrila, ligação lábil em ácido, ligação de cis-aconitila, ligação de hidrazona, ligação enzimaticalmente degradável (ver geralmente Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171). Ver também, p.ex., Amon e outros., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld e outros. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom e outros., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson e outros. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera e outros. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin e outros. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe e outros., 1982, Immunol. Rev. 62:119. Em modalidades adicionais, um modulador de SEZ6 que seja conjugado com uma porção terapêutica ou agente citotóxico pode ser internalizado por uma célula após ligação a uma molécula de SEZ6 associada à superfície da célula distribuindo deste modo a carga terapêutica.

C. Modificadores Biocompatíveis

[00300] Em modalidades selecionadas, os moduladores da invenção podem ser conjugados ou de outro modo associados a modificadores biocompatíveis que podem ser usados para ajustar, alterar, melhorar ou moderar as características do modulador como desejado. Por exemplo, podem ser gerados anticorpos ou constructos de fusão com meias-vidas in vivo aumentadas por anexação de moléculas de polímero de peso molecular relativamente elevado tais como polietileno glicol (PEG) comercialmente disponível ou polímeros biocompatíveis similares. Aqueles peritos na técnica apreciarão que o PEG pode ser obtido em muitos pesos moleculares e configurações moleculares diferentes que podem ser selecionados para conferir propriedades específicas ao anticorpo (p.ex., a meia-vida pode ser customizada). O PEG pode ser anexado aos moduladores ou fragmentos ou derivados de anticorpo com ou sem um ligante multifuncional através de conjugação sítio-específica do PEG ao terminal N ou C dos referidos anticorpos ou fragmentos de anticorpos ou através de grupos epsilon-amino presentes nos resíduos de lisina. Pode ser usada derivação de polímero linear ou ramificado que resulte em perda mínima de atividade biológica. O grau de conjugação pode ser intimamente monitorizado por SDS-PAGE e espectroscopia de massa para assegurar conjugação ótima de moléculas de PEG com moléculas de anticorpo. O PEG não reagido pode ser separado dos conjugados anticorpo-PEG por, p.ex., cromatografia de exclusão de tamanhos ou de permuta iônica. De um modo similar, os moduladores divulgados podem ser conjugados com albumina de modo a tornar o anticorpo ou fragmento de anticorpo mais estável in vivo ou ter uma meia-vida in vivo mais longa. As técnicas são bem conhecidas na técnica, ver, p.ex., Publicação Internacional Nos. WO 93/15199, WO 93/15200, e WO 01/77137; e Patente Europeia No. 0 413, 622. Outros conjugados biocompatíveis são evidentes àqueles com perícia vulgar na técnica e podem ser prontamente identificados de acordo com os ensinamentos aqui.

D. Agentes de Diagnóstico ou de Detecção

[00301] Em outras modalidades preferenciais, os moduladores da presente invenção, ou seus fragmentos ou derivados, são conjugados com um agente, marcador ou repórter de diagnóstico ou detectável que pode ser, por exemplo, uma molécula biológica (p.ex., um peptídeo ou nucleotídeo), uma pequena molécula, fluoróforo, ou radioisótopo. Os moduladores marcados podem ser úteis para monitorização do desenvolvimento ou progresso de um distúrbio hiperproliferativo ou como parte de um procedimento de teste clínico para determinar a eficácia de uma terapia particular incluindo os moduladores divulgados (i.e., teragnósticos) ou para determinar um curso de tratamento futuro. Tais marcadores ou repórteres podem ser também úteis na purificação do modulador selecionado, analíticos do modulador (p.ex., ligação do epítopo ou conjugação do epítopo), separação ou isolamento de TIC ou em procedimentos pré-clínicos ou estudos de toxicologia.

[00302] Tais análise de diagnóstico e/ou detecção podem ser alcançadas por acoplamento do modulador a substâncias detectáveis incluindo, mas não se limitando a, várias enzimas compreendendo por exemplo peroxidase de rábano-silvestre, fosfatase alcalina, betagalactosidase, ou acetilcolinesterase; grupos prostéticos, tais como mas não limitados a estreptavidina/biotina e avidina/biotina; materiais fluorescentes, tais como mas não limitados a umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloreto de dansila ou ficoeritrina; materiais luminescentes, tais como mas não limitados a luminol; materiais bioluminescentes, tais como mas não limitados a luciferase, luciferina, e aquorina; materiais radioativos, tais como mas não limitados a iodo (131I, 125I, 123I, 121I,), carbono (14C), enxofre (35S), trítio (3H), índio (115In, 113In, 112In, 111In,), e tecnécio (99Tc), tálio (201Ti), gálio (68Ga, 67Ga), paládio (103Pd), molibdénio (99Mo), xênon (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, e 117Tin; metais de emissão de pósitrons usando várias tomografias de emissão de pósitrons, íons metálicos paramagnéticos não radioativos, e moléculas que estão radiomarcadas ou conjugadas com radioisótopos específicos. Em tais modalidades, a metodologia de detecção apropriada é bem conhecida na técnica e está prontamente disponível de numerosas fontes comerciais.

[00303] Como indicado acima, em outras modalidades, os moduladores ou seus fragmentos podem ser usados ou conjugados com sequências ou compostos marcadores, tais como um peptídeo ou fluoróforo para facilitar a purificação ou procedimentos de diagnóstico ou analíticos tais como imunohistoquímica, interferometria de biocamada, ressonância de plasmon de superfície, citometria de fluxo, ELISA competitivo, FACS, etc.. Em modalidades preferenciais, o marcador compreende um marcador de his tal como aquele proporcionado pelo vetor pQE (Qiagen), entre outros, muitos dos quais estão comercialmente disponíveis. Outros marcadores de peptídeo úteis para purificação incluem o, mas não estão limitados ao, marcador da hemaglutinina "HA", que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina da gripe (Wilson e outros., 1984, Cell 37:767) e o marcador "flag" (U.S.P.N. 4,703,004).

E. Frações Terapêuticas

[00304] Como previamente aludido, os moduladores ou seus fragmentos ou derivados podem ser também conjugados, ligados ou fundidos com ou de outro modo associados a uma "porção terapêutica" ou "fármaco" tal como um agente antiproliferativo ou anticâncer incluindo, mas não se limitando a, agentes citotóxicos, agentes citostáticos, agentes anti-angiogênicos, agentes de diminuição de volume, agentes quimioterapêuticos, radioterapia e agentes radioterapêuticos, agentes anticâncer dirigidos, BRMs, anticorpos terapêuticos, vacinas contra o câncer, citocinas, terapias de hormônios, terapia de radiação e agentes antimetastáticos e agentes imunoterapêuticos.

[00305] Agentes anticâncer exemplares preferenciais incluem citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunrorubicina, antracina de diidroxi, maitansinoides tais como DM-1 e DM-4 (Immunogen, Inc.), diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, epirrubicina, e ciclofosfamida e seus análogos ou homólogos. Citotoxinas compatíveis adicionais compreendem dolastatinas e auristatinas, incluindo auristatina de monometila E (MMAE) e auristatina de monometila F (MMAF) (Seattle Genetics, Inc.), amanitinas tais como alfa-amanitina, beta-amanitina, gama-amanitina ou epsilon-amanitina (Heidelberg Pharma AG), agentes de ligação do sulco menor do DNA tais como derivados de duocarmicina (Syntarga, B.V.) e dímeros de pirrolobenzodiazepina modificados (Spirogen, Ltd.), inibidores do splicing tais como análogos ou derivados de meaiamicina (p.ex., FR901464 como apresentado em U.S.P.N. 7,825,267), agentes de ligação tubular tais como análogos de epotilona paclitaxel e agentes que danificam o DNA tais como caliqueamicinas e esperamicinas. Além do mais, em certas modalidades, os moduladores de SEZ6 da presente invenção podem estar associados a moléculas de ligação anti-CD3 para recrutar células T citotóxicas e fazê-las se dirigirem às células iniciadoras de tumor (tecnologia BiTE; ver, p.ex., Fuhrmann, S. e outros. Annual Meeting of AACR Resumo No. 5625 (2010) que é incorporado aqui por referência).

[00306] Agentes anticâncer compatíveis ainda adicionais incluem, mas não estão limitados a, antimetabolitos (p.ex., metotrexato, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, decarbazina de 5- fluorouracila), agentes alquilantes (p.ex., mecloretamina, tioepa, clorambucil, melfalan, carmustina (BCNU) e lomustina (CCNU), busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, e platina de cisdiclorodiamina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (p.ex., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (p.ex., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, e antramicina (AMC)), e agentes antimitóticos (p.ex., vincristina e vinblastina). Uma lista mais extensa de frações terapêuticas pode ser encontrada na publicação PCT WO 03/075957 e U.S.P.N. 2009/0155255, cada uma das quais é incorporada aqui por referência.

[00307] Como indicado acima, modalidades selecionadas da presente invenção estão dirigidas a moduladores de SEZ6 conjugados tais como conjugados anticorpo anti-SEZ6-fármaco que compreendem pirrolobenzodiazepina (PBD) como um agente citotóxico. Será apreciado que as PBDs são agentes alquilantes que exercem atividade antitumoral por ligação covalente a DNA no sulco menor e inibição da síntese de ácido nucleico. A este respeito, se mostrou que as PBDs têm potenciais propriedades antitumor enquanto exibem depressão mínima da medula óssea. As PBDs compatíveis com a presente invenção podem ser ligadas ao modulador de SEZ6 usando qualquer um de vários tipos de ligante (p.ex., um ligante de peptidila compreendendo uma porção de maleimido com uma sulfidrila livre) e, em certas modalidades, têm forma dimérica (i.e., dímeros de PBD). PBDs compatíveis (e ligantes opcionais) que podem ser conjugadas com os moduladores divulgados são descritas, por exemplo, em U.S.P.N.s 6,362,331, 7,049,311, 7,189,710, 7,429,658, 7,407,951, 7,741,319, 7,557,099, 8,034,808, 8,163,736, U.S.P.N. 2011/0256157 e depósitos PCT WO2011/130613, WO2011/128650 e WO2011/130616, cada um dos quais é incorporado aqui por referência. Conformemente, em modalidades particularmente preferenciais, o modulador compreenderá um anticorpo anti-SEZ6 conjugado com ou associado a um ou mais dímeros de PBD (i.e., um ADC SEZ6-PBD).

[00308] Em modalidades particularmente preferenciais, PBDs compatíveis que podem ser conjugadas com os moduladores divulgados são descritos em U.S.P.N. 2011/0,256,157. Em esta divulgação, podem ser preferenciais dímeros de PBD, i.e., aqueles compreendendo duas frações de PBD. Assim, conjugados preferenciais da presente invenção são aqueles tendo a fórmula (AB) ou (AC): em que: as linhas a sublinhado indicam a presença opcional de uma ligação dupla entre C1 e C2 ou C2 e C3;

[00309] R2 é independentemente selecionado de H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R e COR, e opcionalmente adicionalmente selecionado de halo ou dihalo; onde RD é independentemente selecionado de R, CO2R, COR, CHO, CO2H, e halo;

[00310] R6 e R9 são independentemente selecionados de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Me3Sn e halo;

[00311] R7 é independentemente selecionado de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Me3Sn e halo;

[00312] R10 é um ligante conectado com um modulador ou seu fragmento ou derivado, como descrito acima;

[00313] Q é independentemente selecionado de O, S e NH;

[00314] R11 é H, ou R ou, onde Q é O, SO3M, onde M é um cátion metálico;

[00315] R e R’ são cada um independentemente selecionados de grupos alquila C1-12 opcionalmente substituída, heterociclila C3-20 e arila C5-20, e opcionalmente em relação ao grupo NRR’, R e R’ em conjunto com o átomo de nitrogênio ao qual eles estão anexados formam um anel heterocíclico com 4, 5, 6 ou 7 membros; e

[00316] em que R2", R6", R7", R9", X", Q" e R11" e são como definidos de acordo com R2, R6, R7, R9, X, Q e R11 respectivamente, e RC é um grupo tamponante.

Ligação Dupla

[00317] Em uma modalidade, não existe nenhuma ligação dupla presente entre C1 e C2, e C2 e C3.

[00318] Em uma modalidade, as linhas a sublinhado indicam a presença opcional de uma ligação dupla entre C2 e C3, como mostrado em baixo:

[00319] Em uma modalidade, uma ligação dupla está presente entre C2 e C3 quando R2 é arila C5-20 ou alquila C1-12.

[00320] Em uma modalidade, as linhas a sublinhado indicam a presença opcional de uma ligação dupla entre C1 e C2, como mostrado em baixo:

[00321] Em uma modalidade, uma ligação dupla está presente entre C1 e C2 quando R2 é arila C5-20 ou alquila C1-12.

R2

[00322] Em uma modalidade, R2 é independentemente selecionado de H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R e COR, e opcionalmente adicionalmente selecionado de halo ou dihalo.

[00323] Em uma modalidade, R2 é independentemente selecionado de H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-RD, =C(RD)2, O-SO2-R, CO2R e COR.

[00324] Em uma modalidade, R2 é independentemente selecionado de H, =O, =CH2, R, =CH-RD, e =C(RD)2.

[00325] Em uma modalidade, R2 é independentemente H.

[00326] Em uma modalidade, R2 é independentemente =O.

[00327] Em uma modalidade, R2 é independentemente =CH2.

[00328] Em uma modalidade, R2 é independentemente =CH-RD. Dentro do composto de PBD, o grupo =CH-RD pode ter qualquer uma das configurações mostradas em baixo:

[00329] Em uma modalidade, a configuração é a configuração (I).

[00330] Em uma modalidade, R2 é independentemente =C(RD)2.

[00331] Em uma modalidade, R2 é independentemente =CF2.

[00332] Em uma modalidade, R2 é independentemente R.

[00333] Em uma modalidade, R2 é independentemente arila C5-20 opcionalmente substituída.

[00334] Em uma modalidade, R2 é independentemente alquila C1-12 opcionalmente substituída.

[00335] Em uma modalidade, R2 é independentemente arila C5-20 opcionalmente substituída.

[00336] Em uma modalidade, R2 é independentemente arila C5-7 opcionalmente substituída.

[00337] Em uma modalidade, R2 é independentemente arila C8-10 opcionalmente substituída.

[00338] Em uma modalidade, R2 é independentemente fenila opcionalmente substituída.

[00339] Em uma modalidade, R2 é independentemente naftila opcionalmente substituída.

[00340] Em uma modalidade, R2 é independentemente piridila opcionalmente substituída.

[00341] Em uma modalidade, R2 é independentemente quinolinila ou isoquinolinila opcionalmente substituída.

[00342] Em uma modalidade, R2 transporta um a três grupos substituintes, com 1 e 2 sendo mais preferenciais, e grupos unicamente substituídos sendo o mais preferencial. Os substituintes podem estar qualquer posição.

[00343] Onde R2 é um grupo arila C5-7, um substituinte único está preferencialmente em um átomo do anel que não seja adjacente à ligação ao resto do composto, i.e., é preferencialmente β ou Y em relação à ligação ao resto do composto. Portanto, onde o grupo arila C5-7 é fenila, o substituinte está preferencialmente nas posições meta ou para, e mais preferencialmente está na posição para.

[00344] Em uma modalidade, R2 é selecionado de: onde o asterisco indica o ponto de anexação.

[00345] Onde R2 é um grupo arila C8-10, por exemplo quinolinila ou isoquinolinila, pode transportar qualquer número de substituintes em qualquer posição dos anéis de quinolina ou isoquinolina. Em algumas modalidades, transporta um, dois ou três substituintes, e estes podem estar nos anéis mais próximo e mais distante ou ambos (se mais do que um substituinte).

[00346] Em uma modalidade, onde R2 está opcionalmente substituído, os substituintes são selecionados daqueles substituintes dados na seção de substituintes em baixo.

[00347] Onde R está opcionalmente substituído, os substituintes são preferencialmente selecionados de:

[00348] Halo, Hidroxila, Éter, Formila, Acila, Carboxi, Éster, Aciloxi, Amino, Amido, Acilamido, Aminocarboniloxi, Ureido, Nitro, Ciano e Tioéter.

[00349] Em uma modalidade, onde R ou R2 está opcionalmente substituído, os substituintes são selecionados do grupo consistindo em R, OR, SR, NRR’, NO2, halo, CO2R, COR, CONH2, CONHR, e CONRR’.

[00350] Onde R2 é alquila C1-12, o substituinte opcional pode adicionalmente incluir grupos heterociclila C3-20 e arila C5-20.

[00351] Onde R2 é heterociclila C3-20, o substituinte opcional pode adicionalmente incluir grupos alquila C1-12 e arila C5-20.

[00352] Onde R2 é grupos arila C5-20, o substituinte opcional pode adicionalmente incluir grupos heterociclila C3-20 e alquila C1-12.

[00353] É entendido que o termo "alquila" engloba as subclasses alquenila e alquinila bem como cicloalquila. Assim, onde R2 é alquila C1-12 opcionalmente substituída, é entendido que o grupo alquila contém preferencialmente uma ou mais ligações duplas ou triplas carbono-carbono, que podem formar parte de um sistema conjugado. Em uma modalidade, o grupo alquila C1-12 opcionalmente substituído contém pelo menos uma ligação dupla ou tripla carbono-carbono, e esta ligação é conjugada com uma ligação dupla presente entre C1 e C2, ou C2 e C3. Em uma modalidade, o grupo alquila C1-12 é um grupo selecionado de alquila C1-12 saturada, alquenila C2-12, alquinila C2-12 e cicloalquila C3-12.

[00354] Se um substituinte em R2 for halo, é preferencialmente F ou Cl, mais preferencialmente Cl.

[00355] Se um substituinte em R2 for éter, pode em algumas modalidades ser um grupo alcoxi, por exemplo, um grupo alcoxi C1-7 (p.ex., metoxi, etoxi) ou pode em algumas modalidades ser um grupo ariloxi C5-7 (p.ex., fenoxi, piridiloxi, furaniloxi).

[00356] Se um substituinte em R2 for alquila C1-7, pode preferencialmente ser um grupo alquila C1-4 (p.ex., metila, etila, propila, butila).

[00357] Se um substituinte em R2 for heterociclila C3-7, pode em algumas modalidades ser nitrogênio C6 contendo grupo heterociclila, p.ex., morfolino, tiomorfolino, piperidinila, piperazinila. Estes grupos podem estar ligados ao resto da porção de PBD através do átomo de nitrogênio. Estes grupos podem estar adicionalmente substituídos, por exemplo, por grupos alquila C1-4.

[00358] Se um substituinte em R2 for alquileno bis-oxi-C1-3, este é preferencialmente bis-oxi-metileno ou bis-oxi-etileno.

[00359] Substituintes particularmente preferenciais para R2 incluem metoxi, etoxi, flúor, cloro, ciano, bis-oxi-metileno, metil-piperazinila, morfolino e metil-tienila.

[00360] Grupos R2 substituídos particularmente preferenciais incluem, mas não estão limitados a, 4-metoxi-fenila, 3-metoxifenila, 4- etoxi-fenila, 3-etoxi-fenila, 4-fluoro-fenila, 4-cloro-fenila, 3,4- bisoximetileno-fenila, 4-metiltienila, 4-cianofenila, 4-fenoxifenila, quinolin-3-ila e quinolin-6-ila, isoquinolin-3-ila e isoquinolin-6-ila, 2- tienila, 2-furanila, metoxinaftila, e naftila.

[00361] Em uma modalidade, R2 é halo ou dihalo. Em uma modalidade, R2 é -F ou -F2, cujos substituintes são ilustrados em baixo como (III) e (IV), respectivamente:

RD

[00362] Em uma modalidade, RD é independentemente selecionado de R, CO2R, COR, CHO, CO2H, e halo.

[00363] Em uma modalidade, RD é independentemente R.

[00364] Em uma modalidade, RD é independentemente halo.

R6

[00365] Em uma modalidade, R6 é independentemente selecionado de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Me3Sn- e Halo.

[00366] Em uma modalidade, R6 é independentemente selecionado de H, OH, OR, SH, NH2, NO2 e Halo.

[00367] Em uma modalidade, R6 é independentemente selecionado de H e Halo.

[00368] Em uma modalidade, R6 é independentemente H.

[00369] Em uma modalidade, R6 e R7 formam em conjunto um grupo -O-(CH2)p-O-, onde p é 1 ou 2.

R7

[00370] R7 é independentemente selecionado de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Me3Sn e halo.

[00371] Em uma modalidade, R7 é independentemente OR.

[00372] Em uma modalidade, R7 é independentemente OR7A, onde R7A é independentemente alquila C1-6 opcionalmente substituída.

[00373] Em uma modalidade, R7A é independentemente alquila C1-6 saturada opcionalmente substituída.

[00374] Em uma modalidade, R7A é independentemente alquenila C2-4 opcionalmente substituída.

[00375] Em uma modalidade, R7A é independentemente Me.

[00376] Em uma modalidade, R7A é independentemente CH2Ph.

[00377] Em uma modalidade, R7A é independentemente alila.

[00378] Em uma modalidade, o composto é um dímero onde os grupos R7 de cada monômero formam em conjunto uma ponte de dímero tendo a fórmula X-R''-X ligando os monômeros.

R8

[00379] Em uma modalidade, o composto é um dímero onde os grupos R8 de cada monômero formam em conjunto uma ponte de dímero tendo a fórmula X-R''-X ligando os monômeros.

[00380] Em uma modalidade, R8 é independentemente OR8A, onde R8A é independentemente alquila C1-4 opcionalmente substituída.

[00381] Em uma modalidade, R8A é independentemente alquila C1-6 saturada opcionalmente substituída ou alquenila C2-4 opcionalmente substituída.

[00382] Em uma modalidade, R8A é independentemente Me.

[00383] Em uma modalidade, R8A é independentemente CH2Ph.

[00384] Em uma modalidade, R8A é independentemente alila.

[00385] Em uma modalidade, R8 e R7 formam em conjunto um grupo -O-(CH2)p-O-, onde p é 1 ou 2.

[00386] Em uma modalidade, R8 e R9 formam em conjunto um grupo -O-(CH2)p-O-, onde p é 1 ou 2.

R9

[00387] Em uma modalidade, R9 é independentemente selecionado de H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Me3Sn- e Halo.

[00388] Em uma modalidade, R9 é independentemente H.

[00389] Em uma modalidade, R9 é independentemente R ou OR.

R e R’

[00390] Em uma modalidade, R é independentemente selecionado de grupos alquila C1-12 opcionalmente substituída, heterociclila C3-20 e arila C5-20. Estes grupos são cada um definidos na seção dos substituintes abaixo.

[00391] Em uma modalidade, R é independentemente alquila C1-12 opcionalmente substituída.

[00392] Em uma modalidade, R é independentemente heterociclila C3-20 opcionalmente substituída.

[00393] Em uma modalidade, R é independentemente arila C5-20 opcionalmente substituída.

[00394] Em uma modalidade, R é independentemente alquila C1-12 opcionalmente substituída.

[00395] Descritos acima em relação a R2 são várias modalidades se relacionando com grupos alquila e arila preferenciais e a identidade e número de substituintes opcionais. As preferências apresentadas para R2 como se aplica a R são aplicáveis, onde apropriado, a todos os outros grupos R, por exemplo, onde R6, R7, R8 ou R9 é R.

[00396] As preferências para R se aplicam também a R'.

[00397] Em algumas modalidades da invenção, é proporcionado um composto tendo um grupo substituinte -NRR'. Em uma modalidade, R e R' em conjunto com átomo de nitrogênio ao qual eles estão anexados formam um anel heterocíclico com 4, 5, 6 ou 7 membros. O anel pode conter um heteroátomo adicional, por exemplo, N, O ou S.

[00398] Em uma modalidade, o anel heterocíclico está ele próprio substituído com um grupo R. Onde um heteroátomo N adicional está presente, o substituinte pode estar no heteroátomo N.

R"

[00399] R'' é um grupo alquileno C3-12, cuja cadeia pode estar interrompida por um ou mais heteroátomos, p.ex., O, S, N(H), NMe e/ou anéis aromáticos, p.ex., benzeno ou piridina, cujos anéis estão opcionalmente substituídos.

[00400] Em uma modalidade, R'' é um grupo alquileno C3-12, cuja cadeia pode estar interrompida por um ou mais heteroátomos e/ou anéis aromáticos, p.ex., benzeno ou piridina.

[00401] Em uma modalidade, o grupo alquileno está opcionalmente interrompido por um ou mais heteroátomos selecionados de O, S, e NMe e/ou anéis aromáticos, cujos anéis estão opcionalmente substituídos.

[00402] Em uma modalidade, o anel aromático é um grupo arileno C5-20, onde o arileno pertence a uma porção divalente obtida por remoção de dois átomos de hidrogênio de dois átomos no anel aromático de um composto aromático, cuja porção tem de 5 a 20 átomos no anel.

[00403] Em uma modalidade, R'' é um grupo alquileno C3-12, cuja cadeia pode estar interrompida por um ou mais heteroátomos, p.ex., O, S, N(H), NMe e/ou anéis aromáticos, p.ex., benzeno ou piridina, cujos anéis estão opcionalmente substituídos por NH2.

[00404] Em uma modalidade, R" é um grupo alquileno C3-12.

[00405] Em uma modalidade, R" é selecionado de um grupo alquileno C3, C5, C7, C9 e C11.

[00406] Em uma modalidade, R" é selecionado de um grupo alquileno C3, C5 e C7.

[00407] Em uma modalidade, R" é selecionado de um grupo alquileno C3 e C5.

[00408] Em uma modalidade, R" é um grupo alquileno C3.

[00409] Em uma modalidade, R" é um grupo alquileno C5.

[00410] Os grupos alquileno listados acima podem estar opcionalmente interrompidos por um ou mais heteroátomos e/ou anéis aromáticos, p.ex., benzeno ou piridina, cujos anéis estão opcionalmente substituídos.

[00411] Os grupos alquileno listados acima podem estar opcionalmente interrompidos por um ou mais heteroátomos e/ou anéis aromáticos, p.ex., benzeno ou piridina.

[00412] Os grupos alquileno listados acima podem ser grupos alquileno alifáticos lineares não substituídos.

X

[00413] Em uma modalidade, X é selecionado de O, S, ou N(H).

[00414] Preferencialmente, X é O.

R10

[00415] Preferencialmente, ligantes compatíveis tais como aqueles descritos acima anexam um modulador de SEZ6 (CBA/Ab/M), a uma porção de fármaco de PBD D através de ligação(ões) covalente(s) na posição R10 (i.e., N10). O ligante é uma porção bifuncional ou multifuncional que pode ser usada para ligar uma ou mais porções de fármaco (D) e um modulador (preferencialmente um anticorpo) para formar conjugados anticorpo-fármaco (ADC). O ligante (L) pode ser estável fora de uma célula, i.e., extracelular, ou pode ser clivável por atividade enzimática, hidrólise, ou outras condições metabólicas. Os conjugados anticorpo-fármaco (ADC) podem ser convenientemente preparados usando um ligante tendo funcionalidade reativa para ligação à porção de fármaco e ao anticorpo. Um tiol de cisteína, ou uma amina, p.ex., terminal N ou cadeia lateral de aminoácido tal como lisina, do anticorpo (Ab) pode formar uma ligação com um grupo funcional de um ligante ou reagente espaçador, porção de fármaco de PBD (D) ou reagente de ligante do fármaco (D-L).

[00416] Muitos grupos funcionais no ligante anexado à posição N10 da porção PBD podem ser úteis para reagir com o agente de ligação da célula. Por exemplo, ligações de éster, tioéster, amida, tioamida, carbamato, tiocarbamato, ureia, tioureia, éter, tioéter, ou dissulfeto podem ser formadas a partir da reação dos intermediários ligante- fármaco de PBD e o agente de ligação da célula.

[00417] Em outra modalidade, o ligante pode estar substituído por grupos que modulam a agregação, solubilidade ou reatividade. Por exemplo, um substituinte de sulfonato pode aumentar a solubilidade em água do reagente e facilitar a reação de acoplamento do reagente ligante com o anticorpo ou a porção de fármaco, ou facilitar a reação de acoplamento de Ab-L com D, ou D-L com Ab, dependendo da rota sintética empregue para preparar o ADC.

[00418] Em uma modalidade preferencial, R10 é um grupo: onde o asterisco indica o ponto de anexação à posição N10, CBA é um agente de ligação da célula/modulador, L1 é um ligante, A é um grupo conectante conectando L1 ao agente de ligação da célula, L2 é uma ligação covalente ou, em conjunto com -OC(=O)-, forma um ligante autoimolador, e L1 ou L2 é um ligante clivável.

[00419] L1 é preferencialmente o ligante clivável, e pode ser referido como um desencadeador da ativação do ligante para clivagem.

[00420] Como discutido na seção de ligantes acima, a natureza de L1 e L2, onde presentes, pode variar amplamente. Estes grupos são escolhidos com base nas suas características de clivagem, o que pode ser ditado pelas condições no local ao qual o conjugado é distribuído. Aqueles ligantes que são clivados pela ação de enzimas são preferenciais, embora ligantes que são cliváveis por mudanças no pH (p.ex., lábil em ácido ou base), temperatura ou após irradiação (p.ex., fotolábil) possam ser também usados. Ligantes que são cliváveis sob condições redutoras ou oxidantes podem também encontrar uso na presente invenção.

[00421] L1 pode compreender uma sequência contígua de aminoácidos. A sequência de aminoácidos pode ser o substrato-alvo para clivagem enzimática, permitindo deste modo liberação de R10 da posição N10.

[00422] Em uma modalidade, L1 é clivável pela ação de uma enzima. Em uma modalidade, a enzima é uma esterase ou uma peptidase.

[00423] Em uma modalidade, L2 está presente e, em conjunto com - C(=O)O-, forma um ligante autoimolador. Em uma modalidade, L2 é um substrato para atividade enzimática, permitindo deste modo liberação de R10 da posição N10.

[00424] Em uma modalidade, onde L1 é clivável pela ação de uma enzima e L2 está presente, a enzima cliva a ligação entre L1 e L2.

[00425] No que respeita à anexação do ligante escolhido a uma PBD selecionada, o grupo RC é removível da posição N10 de certas porções de PBD para deixar uma ligação imina N10-C11, uma carbinolamina, uma carbinolamina substituída, onde QR11 é OSO3M, um aducto de bissulfeto, uma tiocarbinolamina, uma tiocarbinolamina substituída, ou uma carbinalamina substituída.

[00426] Em uma modalidade, RC pode ser um grupo protetor que é removível para deixar uma ligação imina N10-C11, uma carbinolamina, uma carbinolamina substituída, ou onde QR11 é OSO3M, um aducto de bissulfeto. Em uma modalidade, RC é um grupo protetor que é removível para deixar uma ligação imina N10-C11.

[00427] O grupo RC se destina a ser removível sob as mesmas condições como aquelas requeridas para a remoção do grupo R10, por exemplo para originar uma ligação imina N10-C11, uma carbinolamina e assim por diante. O grupo tamponante atua como um grupo protetor para a funcionalidade pretendida à posição N10. O grupo tamponante se destina a não ser reativo com um agente de ligação da célula. Por exemplo, RC não é o mesmo do que RL.

[00428] Compostos tendo um grupo tamponante podem ser usados como intermediários na síntese de dímeros tendo um monômero de imina. Alternativamente, compostos tendo um grupo tamponante podem ser usados como conjugados, onde o grupo tamponante é removido na localização alvo para originar uma imina, uma carbinolamina, uma carbinolamina substituída e assim por diante. Assim, em modalidade, o grupo tamponante pode ser referido como um grupo protetor de nitrogênio terapeuticamente removível, como definido em WO 00/12507.

[00429] Em uma modalidade, o grupo RC é removível sob as condições que clivam o ligante RL do grupo R10. Assim, em uma modalidade, o grupo tamponante é clivável pela ação de uma enzima.

[00430] Em uma modalidade alternativa, o grupo tamponante é removível antes da conexão do ligante RL ao modulador. Em esta modalidade, o grupo tamponante é removível sob condições que não clivam o ligante RL.

[00431] Onde um composto inclui um grupo funcional G1 para formar uma conexão ao agente de ligação da célula, o grupo tamponante é removível antes da adição ou desmascaramento de G1.

[00432] O grupo tamponante pode ser usado como parte de uma estratégia de grupo protetor para assegurar que somente uma das unidades de monômero em um dímero está conectada a um agente de ligação da célula.

[00433] O grupo tamponante pode ser usado como uma máscara para uma ligação imina N10-C11. O grupo tamponante pode ser removido no momento em que a funcionalidade de imina seja requerida no composto. O grupo tamponante é também uma máscara para uma carbinolamina, uma carbinolamina substituída, e um aducto de bissulfeto, como descrito acima.

[00434] Em uma modalidade, Rc é um grupo protetor de carbamato.

[00435] Em uma modalidade, o grupo protetor de carbamato é selecionado de:

[00436] Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz e PNZ.

[00437] Opcionalmente, o grupo protetor de carbamato é adicionalmente selecionado de Moc.

[00438] Em uma modalidade, RC é um grupo ligante RL não tendo o grupo funcional para conexão ao agente de ligação da célula.

[00439] Este pedido está particularmente preocupado com aqueles grupos RC que são carbamatos.

[00440] Em uma modalidade, Rc é um grupo:

[00441] onde o asterisco indica o ponto de anexação à posição N10, G2 é um grupo terminador, L3 é uma ligação covalente ou um ligante clivável L1, L2 é uma ligação covalente ou em conjunto com OC(=O) forma um ligante autoimolador.

[00442] Onde L3 e L2 são ambos ligações covalentes, G2 e OC(=O) em conjunto formam um grupo protetor de carbamato como definido acima.

[00443] L1 é como definido acima em relação a R10.

[00444] L2 é como definido acima em relação a R10.

[00445] Vários grupos terminadores são descritos em baixo, incluindo aqueles baseados em grupos protetores bem conhecidos.

[00446] Em uma modalidade, L3 é um ligante clivável L1, e L2, em conjunto com OC(=O), forma um ligante autoimolador. Em esta modalidade, G2 é Ac (acetila) ou Moc, ou um grupo protetor de carbamato selecionado de: Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz e PNZ. Opcionalmente, o grupo protetor de carbamato é adicionalmente selecionado de Moc.

[00447] Em outra modalidade, G2 é um grupo acila -C(=O)G3, onde G3 é selecionado de alquila (incluindo cicloalquila, alquenila e alquinila), heteroalquila, heterociclila e arila (incluindo heteroarila e carboarila). Estes grupos podem estar opcionalmente substituídos. O grupo acila em conjunto com um grupo amino de L3 ou L2, onde apropriado, pode formar uma ligação amida. O grupo acila em conjunto com um grupo hidróxi de L3 ou L2, onde apropriado, pode formar uma ligação éster.

[00448] Em uma modalidade, G3 é heteroalquila. O grupo heteroalquila pode compreender polietileno glicol. O grupo heteroalquila pode ter um heteroátomo, tal como um O ou N, adjacente ao grupo acila, formando deste modo um grupo carbamato ou carbonato, onde apropriado, com um heteroátomo presente no grupo L3 ou L2, onde apropriado.

[00449] Em uma modalidade, G3 é selecionado de NH2, NHR e NRR'. Preferencialmente, G3 é NRR'.

[00450] Em uma modalidade, G2 é o grupo:

[00451] onde o asterisco indica o ponto de anexação a L3, n é 0 a 6 e G4 é selecionado de OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', NH2, NHR, NRR', NO2, e halo. Os grupos OH, SH, NH2 e NHR estão protegidos. Em uma modalidade, n é 1 a 6, e preferencialmente n é 5. Em uma modalidade, G4 é OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', e NRR'. Em uma modalidade, G4 é OR, SR, e NRR'. Preferencialmente, G4 é selecionado de OR e NRR', o mais preferencialmente, G4 é OR. O mais preferencialmente, G4 é OMe.

[00452] Em uma modalidade, o grupo G2 é: onde o asterisco indica o ponto de anexação a L3, e n e G4 são como definidos acima.

[00453] Em uma modalidade, o grupo G2 é:

[00454] onde o asterisco indica o ponto de anexação a L3, n é 0 ou 1, m é 0 a 50, e G4 é selecionado de OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', NH2, NHR, NRR', NO2, e halo. Em uma modalidade preferencial, n é 1 e m é 0 a 10, 1 a 2, preferencialmente 4 a 8, e o mais preferencialmente 4 ou 8. Em outra modalidade, n é 1 e m é 10 a 50, preferencialmente 20 a 40. Os grupos OH, SH, NH2 e NHR estão protegidos. Em uma modalidade, G4 é OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', e NRR'. Em uma modalidade, G4 é OR, SR, e NRR'. Preferencialmente, G4 é selecionado de OR e NRR', o mais preferencialmente, G4 é OR. Preferencialmente, G4 é OMe.

[00455] Em uma modalidade, o grupo G2 é: onde o asterisco indica o ponto de anexação a L3, e n, m e G4 são como definidos acima.

[00456] Em uma modalidade, o grupo G2 é:

[00457] onde n é 1-20, m é 0-6, e G4 é selecionado de OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', NH2, NHR, NRR', NO2, e halo. Em uma modalidade, n é 1-10. Em outra modalidade, n é 10 a 50, preferencialmente 20 a 40. Em uma modalidade, n é 1. Em uma modalidade, m é 1. Os grupos OH, SH, NH2 e NHR estão protegidos. Em uma modalidade, G4 é OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', e NRR'. Em uma modalidade, G4 é OR, SR, e NRR'. Preferencialmente, G4 é selecionado de OR e NRR', o mais preferencialmente, G4 é OR. Preferencialmente, G4 é OMe.

[00458] Em uma modalidade, o grupo G2 é: onde o asterisco indica o ponto de anexação a L3, e n, m e G4 são como definidos acima.

[00459] Em cada uma das modalidades acima, G4 pode ser OH, SH, NH2 e NHR. Estes grupos estão preferencialmente protegidos.

[00460] Em uma modalidade, OH está protegido com Bzl, TBDMS, ou TBDPS.

[00461] Em uma modalidade, SH está protegido com Acm, Bzl, Bzl- OMe, Bzl-Me, ou Trt.

[00462] Em uma modalidade, NH2 ou NHR estão protegidos com Boc, Moc, Z-Cl, Fmoc, Z, ou Alloc.

[00463] Em uma modalidade, o grupo G2 está presente em combinação com um grupo L3, cujo grupo é um dipeptídeo.

[00464] O grupo tamponante não se destina para conexão ao modulador. Assim, o outro monômero presente do dímero serve como o ponto de conexão ao modulador através de um ligante. Conformemente é preferencial que a funcionalidade presente no grupo tamponante não está disponível para reação com um modulador. Assim, grupos funcionais reativos tais como OH, SH, NH2, COOH são preferencialmente evitados. No entanto, tal funcionalidade pode estar presente no grupo tamponante se protegido, como descrito acima.

[00465] Assim, de acordo com os ensinamentos aqui, uma modalidade da invenção compreende um conjugado compreendendo um composto: em que CBA é um agente de ligação da célula/modulador, e n é 0 ou 1. L1 é como previamente definido, e RE e RE" são cada um independentemente selecionados de H ou RD.

[00466] Em outra modalidade, o conjugado compreende um composto: em que CBA é um agente de ligação da célula/modulador, L1 é como previamente definido, Ar1 e Ar2 são cada um independentemente arila C5-20 opcionalmente substituída, e n é 0 ou 1.

[00467] Aqueles versados na técnica apreciarão que outros dímeros e ligantes de PBD simétricos e assimétricos são compatíveis com a presente invenção e poderiam ser selecionados sem experimentação indevida com base nos ensinamentos aqui e na técnica prévia.

[00468] Outro aspeto da invenção inclui ADCs compreendendo radioisótopos. Radioisótopos exemplares que podem ser compatíveis com tais modalidades incluem, mas não estão limitados a, iodo (131I, 125I, 123I, 121I,), carbono (14C), cobre (62Cu, 64Cu, 67Cu), enxofre (35S), trítio (3H), índio (115In, 113In, 112In, 111In,), bismuto (212Bi, 213Bi), tecnécio (99Tc), tálio (201Ti), gálio (68Ga, 67Ga), paládio (103Pd), molibdénio (99Mo), xênon (133Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142 Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, 117Sn, 225Ac, 76Br, e 211At. Outros radionuclídeos estão também disponíveis como agentes de diagnóstico e terapêuticos, especialmente aqueles na gama de energia de 60 a 4.000 KeV. Dependendo da condição a ser tratada e do perfil terapêutico desejado, aqueles versados na técnica podem prontamente selecionar o radioisótopo apropriado para uso com os moduladores divulgados.

[00469] Os moduladores de SEZ6 da presente invenção podem ser também conjugados com uma porção terapêutica ou fármaco que modifica uma dada resposta biológica biológica (p.ex., modificadores da resposta biológica ou BRMs). Isto é, agentes ou porções terapêuticas compatíveis com a presente invenção não são para serem interpretados como limitados aos agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, em modalidades particularmente preferenciais, a porção de fármaco pode ser uma proteína ou polipeptídeo ou seu fragmento possuindo uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina tal como abrina, ricina A, Onconase (ou outra RNase citotóxica), endotoxina de pseudomonas, toxina da cólera, ou toxina da difteria; uma proteína tal como fator de necrose tumoral, α-interferon, β-interferon, fator de crescimento dos nervos, fator de crescimento derivados de plaquetas, ativador de plasminogênio de tecido, um agente apoptótico, p.ex., TNF-α, TNF-β, AIM I (ver, Publicação Internacional No. WO 97/33899), AIM II (ver, Publicação Internacional No. WO 97/34911), Ligando Fas (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567), e VEGI (ver, Publicação Internacional No. WO 99/23105), um agente trombótico ou um agente anti-angiogênico, p.ex., angiostatina ou endostatina; ou um modificador da resposta biológica tal como, por exemplo, uma linfocina (p.ex., interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL- 6"), fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos ("GM- CSF"), e fator estimulador de colônias de granulócitos ("G-CSF")), ou um fator de crescimento (p.ex., hormônio de crescimento ("GH")). Como apresentado acima, métodos para fusão ou conjugação de moduladores a porções de polipeptídeo são conhecidas na técnica. Adicionalmente às referências previamente divulgadas, ver, p.ex., U.S.P.Ns. 5,336,603; 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851, e 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; Publicações PCT WO 96/04388 e WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10535; Zheng et al., 1995, J Immunol 154:5590; e Vil et al., 1992, PNAS USA 89:11337, cada um dos quais é incorporado aqui por referência. Além do mais, como apresentado acima, a associação de um modulador a tais porções não necessita necessariamente de ser direta, mas pode ocorrer através de sequências ligantes. Como previamente aludido, tais moléculas ligantes são comummente conhecidas na técnica e descritas em Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res 4:2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug Chem 10:553; Zimmerman et al., 1999, Nucl Med Biol 26:943; Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171, cada um dos quais é incorporado aqui.

IX. Diagnósticos e Rastreio A. Diagnósticos

[00470] Ainda em outras modalidades, a invenção proporciona métodos in vitro ou in vivo para detecção, diagnóstico ou monitorização de distúrbios proliferativos e métodos de rastreio de células de um paciente para identificar células tumorigênicas incluindo CSCs. Tais métodos incluem identificação de um indivíduo tendo câncer para tratamento ou monitorização do progresso de um câncer compreendendo contato do paciente ou de uma amostra obtida de um paciente (i.e., ou in vivo ou in vitro) com um modulador como descrito aqui e detecção da presença ou ausência, ou nível de associação, do modulador em relação a moléculas-alvo ligadas ou livres na amostra. Em modalidades particularmente preferenciais, o modulador compreenderá uma molécula marcadora ou repórter detectável como descrito aqui.

[00471] Em algumas modalidades, a associação do modulador, tal como um anticorpo, a células particulares na amostra denota provavelmente que a amostra pode conter CSCs, indicando deste modo que o indivíduo tendo câncer pode ser eficazmente tratado com um modulador como descrito aqui. Os métodos podem adicionalmente compreender uma etapa de comparação do nível de ligação com um controle. Reciprocamente, quando o modulador é um constructo de Fc, as propriedades de ligação podem ser exploradas e monitorizadas (diretamente ou indiretamente, in vivo ou in vitro) quando em contato com a amostra para proporcionar a informação desejada.

[00472] Métodos de ensaio compatíveis exemplares incluem radioimunoensaios, imunoensaios de enzima, ensaios de ligação competitiva, imunoensaio fluorescente, ensaios de imunotransferência, análise de Transferência de Western, ensaios de citometria de fluxo, e ensaios ELISA. Teragnósticos ou diagnósticos in vivo compatíveis podem compreender técnicas de imagiologia ou monitorização reconhecidas pela técnica tais como imagiologia de ressonância magnética, tomografia computorizada (p.ex., scan CAT), tomografia de pósitrons (p.ex., scan PET), radiografia, ultrassons, etc., como seria conhecido por aqueles versados na técnica.

[00473] Em outra modalidade, a invenção proporciona um método de análise do progresso e/ou patogênese do câncer in vivo. Em outra modalidade, a análise do progresso e/ou patogênese do câncer in vivo compreende determinação da extensão do progresso do tumor. Em outra modalidade, a análise compreende a identificação do tumor. Em outra modalidade, a análise do progresso do tumor é realizada no tumor primário. Em outra modalidade, a análise é realizada ao longo do tempo dependendo do tipo de câncer como conhecido de um versado na técnica. Em outra modalidade, a análise adicional de tumores secundários tendo origem da metastização de células do tumor primário é analisada in vivo. Em outra modalidade, o tamanho e a forma dos tumores secundários são analisados. Em algumas modalidades, é realizada análise ex vivo.

[00474] Em outra modalidade, a invenção proporciona um método de análise do progresso e/ou patogênese do câncer in vivo incluindo determinação da metastização das células ou detecção e quantificação do nível de células do tumor circulantes. Ainda em outra modalidade, a análise da metastização das células compreende determinação do crescimento progressivo das células em um local que é descontínuo do tumor primário. Em outra modalidade, o local da análise da metastização das células compreende a rota da disseminação neoplásica. Em alguma modalidade, as células podem se dispersar através da vasculatura sanguínea, linfáticos, dentro de cavidades corporais ou suas combinações. Em outra modalidade, a análise da metastização das células é realizada tendo em vista a migração, disseminação, extravasamento, proliferação das células ou suas combinações.

[00475] Conformemente, em uma modalidade particularmente preferencial, os moduladores da presente invenção podem ser usados para detectar e quantificar níveis de SEZ6 em uma amostra de um paciente (p.ex., plasma ou sangue) que podem, por seu turno, ser usados para detectar, diagnosticar ou monitorizar distúrbios associados a SEZ6 incluindo distúrbios proliferativos. Em modalidades relacionadas, os moduladores da presente invenção podem ser usados para detectar, monitorizar e/ou quantificar células de tumor circulantes ou in vivo ou in vitro (ver, por exemplo, WO 2012/0128801, que é aqui incorporada por referência). Ainda em outras modalidades preferenciais, as células de tumor circulantes podem compreender células-tronco do câncer.

[00476] Em certos exemplos, as células tumorigênicas em um sujeito ou uma amostra de um sujeito podem ser avaliadas ou caracterizadas usando os moduladores divulgados antes de terapia ou regime para estabelecer uma linha de base. Em outros exemplos, a amostra é derivada de um sujeito que foi tratado. Em alguns exemplos, a amostra é tirada do sujeito a pelo menos cerca de 1, 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 30, 60, 90 dias, 6 meses, 9 meses, 12 meses, ou >12 meses após o sujeito começar ou terminar o tratamento. Em certos exemplos, as células tumorigênicas são avaliadas ou caracterizadas após um certo número de doses (p.ex., após 2, 5, 10, 20, 30 ou mais doses de uma terapia). Em outros exemplos, as células tumorigênicas são caracterizadas ou avaliadas após 1 semana, 2 semanas, 1 mês, 2 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos ou mais após receção de uma ou mais terapias.

[00477] Em outro aspeto, e como discutido em mais detalhe em baixo, a presente invenção proporciona conjuntos para detecção, monitorização ou diagnóstico de um distúrbio hiperproliferativo, identificação de um indivíduo tendo um tal distúrbio para tratamento possível ou monitorização do progresso (ou regressão) do distúrbio em um paciente, em que o conjunto compreende um modulador como descrito aqui, e reagentes para detecção do impacto do modulador em uma amostra.

[00478] Ainda outro aspeto da presente invenção compreende o uso de SEZ6 marcado para imunohistoquímica (IHC). A este respeito, a IHC de SEZ6 pode ser usada como uma ferramenta de diagnóstico para auxiliar no diagnóstico de vários distúrbios proliferativos e para monitorizar a potencial resposta a tratamentos incluindo terapia de modulação de SEZ6. Ensaios de diagnóstico compatíveis podem ser realizados em tecidos que foram quimicamente fixos (incluindo, mas não se limitando a: formaldeído, gluteraldeído, tetróxido de ósmio, dicromato de potássio, ácido acético, alcoóis, sais de zinco, cloreto mercúrico, tetróxido de crómio e ácido pícrico) e embebidos (incluindo mas não se limitando a: metacrilato de glicol, parafina e resinas) ou conservados através de congelamento. Como discutido em mais detalhe em baixo, tais ensaios poderiam ser usados para orientar decisões de tratamento e determinar regimes e programação de dosagens.

B. Rastreio

[00479] Em certas modalidades, os moduladores podem ser também usados para rastrear ou identificar compostos ou agentes (p.ex., fármacos) que alteram uma função ou atividade de células tumorigênicas ou sua descendência por interação com um antigênio (p.ex., seus componentes genotípicos ou fenotípicos). Tais compostos e agentes podem ser candidatos a fármacos que são rastreados para o tratamento de um distúrbio proliferativo, por exemplo. Em uma modalidade, um sistema ou método inclui células tumorigênicas compreendendo SEZ6 e um composto ou agente (p.ex., fármaco), em que as células e composto ou agente estão em contato uns com os outros. Em tais modalidades, as células objeto podem ter sido identificadas, monitorizadas e/ou enriquecidas usando os moduladores divulgados.

[00480] Ainda em outra modalidade, um método inclui contato, diretamente ou indiretamente, células tumorigênicas ou sua descendência com um agente ou composto de teste e determinação se o agente ou composto de teste modula uma atividade ou função das células tumorigênicas associadas ao antigênio. Um exemplo de uma interação indireta é interação física, enquanto uma interação indireta inclui a ação de uma composição sobre uma molécula intermediária a qual, por seu turno, atua sobre a entidade referenciada (p.ex., célula ou cultura de células). Atividades ou funções exemplares que podem ser moduladas incluem mudanças na morfologia ou viabilidade das células, expressão de um marcador, diferenciação ou desdiferenciação, respiração das células, atividade mitocondrial, integridade da membrana, maturação, proliferação, viabilidade, apoptose ou morte das células.

[00481] Métodos de rastreio e identificação de agentes e compostos incluem aqueles adequados para rastreio de elevada produtividade, que inclui redes de células (p.ex., microdisposições) posicionadas ou colocadas, opcionalmente, em localizações ou locais predeterminados. Por exemplo, as células podem ser posicionadas ou colocadas (pré- semeadas) em um prato, tubo, frasco, garrafa rolante ou placa de células (p.ex., uma única placa ou prato multipoços tal como uma placa ou prato com 8, 16, 32, 64, 96, 384 e 1536 multipoços). Métodos robóticos ou de manuseamento manual de elevada produtividade podem sondar interações químicas e determinar os níveis de expressão de muitos genes em um curto período de tempo. Foram desenvolvidas técnicas que utilizam sinais moleculares (p.ex., através de fluoróforos) e análises automáticas que processam informação a uma taxa muito rápida (ver, p.ex., Pinhasov et al., Comb. Chem. High Throughput Screen. 7:133 (2004)). Por exemplo, a tecnologia de microdisposições tem sido extensivamente usada para sondar as interações de milhares de genes de uma só vez, enquanto proporciona informação para genes específicos (ver, p.ex., Mocellin e Rossi, Adv. Exp. Med. Biol. 593:19 (2007)).

[00482] Bibliotecas que podem ser rastreadas incluem, por exemplo, bibliotecas de pequenas moléculas, bibliotecas de exibição de fagos, bibliotecas de exibição de levaduras de anticorpos completamente humanos (Adimab, LLC), bibliotecas de siRNA, e vetores de transfecção adenovirais.

X. Preparações Farmacêuticas e Usos Terapêuticos A. Formulações e Rotas de Administração

[00483] Dependendo da forma do modulador em conjunto com qualquer conjugado opcional, do modo de distribuição pretendida, da doença sendo tratada ou monitorizada e de numerosas outras variáveis, as composições da invenção podem ser formuladas como desejado usando técnicas reconhecidas pela técnica. Em algumas modalidades, as composições terapêuticas da invenção podem ser administradas puras ou com um mínimo de componentes adicionais enquanto outras podem ser opcionalmente formuladas para conterem transportadores farmaceuticamente aceitáveis adequados compreendendo excipientes e auxiliares que são bem conhecidos na técnica (ver, p.ex., Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20a ed. (2003); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a ed., Lippencott Williams e Wilkins (2004); Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a ed., Pharmaceutical Press (2000)). Vários transportadores farmaceuticamente aceitáveis, que incluem veículos, adjuvantes, e diluentes, estão prontamente disponíveis de numerosas fontes comerciais. Além do mais, um sortido de substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de ajuste do pH e tamponantes, agentes de ajuste da tonicidade, estabilizantes, agentes molhantes e similares está também disponível. Certos transportadores exemplares não limitantes incluem salino, salino tamponado, dextrose, água, glicerol, etanol, e suas combinações.

[00484] Mais particularmente, será apreciado que, em algumas modalidades, as composições terapêuticas da invenção podem ser administradas puras ou com um mínimo de componentes adicionais. Reciprocamente, os moduladores de SEZ6 da presente invenção podem ser opcionalmente formulados para conterem transportadores farmaceuticamente adequados compreendendo excipientes e auxiliares que são bem conhecidos na técnica e são substâncias relativamente inertes que facilitam a administração do modulador ou cujo processamento de auxiliar dos compostos ativos em preparações que são farmaceuticamente otimizadas para distribuição ao local de ação. Por exemplo, um excipiente pode dar forma ou consistência ou atuar como um diluente para melhorar a farmacocinética ou estabilidade do modulador. Excipientes ou aditivos adequados incluem, mas não estão limitados a, agentes estabilizantes, agentes molhantes e emulsificantes, sais para variação da osmolaridade, agentes encapsulantes, tampões, e intensificadores da penetração na pele. Em certas modalidades preferenciais, as composições farmacêuticas podem ser proporcionadas em uma forma liofilizada e reconstituídas em, por exemplo, salino tamponando antes da administração.

[00485] Os moduladores divulgados para administração sistêmica podem ser formulados para administração enteral, parenteral ou tópica. De fato, todos os três tipos de formulação podem ser usados simultaneamente para alcançar administração sistêmica do ingrediente ativo. Excipientes bem como formulações para distribuição de fármacos parenteral e não parenteral são apresentados em Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20a Ed. Mack Publishing (2000). Formulações adequadas para administração parenteral incluem soluções aquosas dos compostos ativos em forma solúvel em água, por exemplo, sais solúveis em água. Adicionalmente, podem ser administradas suspensões dos compostos ativos como apropriado para suspensões de injeção oleosa. Solventes ou veículos lipofílicos adequados incluem óleos graxos, por exemplo, poli(lactídeo) hexilsubstituído, óleo de sésamo, ou ésteres de ácido graxo sintéticos, por exemplo, oleato de etila ou triglicerídeos. Suspensões de injeção aquosa podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão e incluem, por exemplo, celulose de carboximetila e sódio, sorbitol, e/ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabilizantes. Lipossomas podem ser também usados para encapsular o agente para distribuição na célula.

[00486] Formulações adequadas para administração enteral incluem cápsulas de gelatina dura ou mole, pílulas, comprimidos, incluindo comprimidos revestidos, elixires, suspensões, xaropes ou inalações e suas formas de liberação controlada.

[00487] Em geral, os compostos e composições da invenção, compreendendo moduladores de SEZ6, podem ser administrados in vivo, a um sujeito com sua necessidade, por várias rotas, incluindo, mas não se limitando a, oral, intravenosa, intra-arterial, subcutânea, parenteral, intranasal, intramuscular, intracraniana, intracardíaca, intraventricular, intratraqueal, bucal, retal, intraperitoneal, intradérmica, tópica, transdérmica, e intratecal, ou de outro modo por implante ou inalação. As composições objeto podem ser formuladas em preparações em formas sólida, semissólida, líquida, ou gasosa; incluindo, mas não se limitando a, comprimidos, cápsulas, pós, grânulos, pomadas, soluções, supositórios, enemas, injeções, inalantes, e aerossóis. A formulação e rota de administração apropriadas podem ser selecionadas de acordo com a aplicação e regime terapêutico pretendidos.

B. Dosagens

[00488] Similarmente, o regime de dosagem particular, i.e., dose, programação e repetição, dependerá do indivíduo particular e da história médica desse indivíduo, bem como considerações empíricas tais como farmacocinética (p.ex., meia-vida, taxa de depuração, etc.). A frequência de administração pode ser determinada e ajustada ao longo do curso de terapia, e é baseada na redução do número de células proliferativas ou tumorigênicas, manutenção da redução de tais células neoplásicas, redução da proliferação de células neoplásicas, ou atraso do desenvolvimento da metastização. Em outras modalidades, a dosagem administrada pode ser ajustada ou atenuada para gerir potenciais efeitos secundários e/ou toxicidade. Alternativamente, podem ser apropriadas formulações de liberação contínua sustentada de uma composição terapêutica objeto.

[00489] Em geral, os moduladores da invenção podem ser administrados em várias gamas. Estas incluem cerca de 10 μg/kg de peso corporal a cerca de 100 mg/kg de peso corporal por dose; cerca de 50 μg/kg de peso corporal a cerca de 5 mg/kg de peso corporal por dose; cerca de 100 μg/kg de peso corporal a cerca de 10 mg/kg de peso corporal por dose. Outras gamas incluem cerca de 100 μg/kg de peso corporal a cerca de 20 mg/kg de peso corporal por dose e cerca de 0,5 mg/kg de peso corporal a cerca de 20 mg/kg de peso corporal por dose. Em certas modalidades, a dosagem é pelo menos cerca de 100 μg/kg de peso corporal, pelo menos cerca de 250 μg/kg de peso corporal, pelo menos cerca de 750 μg/kg de peso corporal, pelo menos cerca de 3 mg/kg de peso corporal, pelo menos cerca de 5 mg/kg de peso corporal, pelo menos cerca de 10 mg/kg de peso corporal.

[00490] Em modalidades selecionadas, os moduladores serão administrados a aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 μg/kg de peso corporal por dose. Outras modalidades compreenderão a administração de moduladores a 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 ou 900 μg/kg de peso corporal por dose. Em outras modalidades preferenciais, os moduladores divulgados serão administrados a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 mg/kg. Ainda em outras modalidades, os moduladores podem ser administrados a 12, 14, 16, 18 ou 20 mg/kg de peso corporal por dose. Ainda em outras modalidades, os moduladores podem ser administrados a 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 ou 100 mg/kg de peso corporal por dose. De acordo com os ensinamentos aqui, será apreciado que as dosagens acima mencionadas são aplicáveis a moduladores não conjugados e moduladores conjugados com um agente citotóxicos. Uns versados na técnica poderiam prontamente determinar dosagens apropriadas para vários moduladores conjugados e não conjugados com base em estudos animais pré-clínicos, observações clínicas e técnicas e medições médicas e bioquímicas padrão.

[00491] No que diz respeito a moduladores conjugados, modalidades particularmente preferenciais compreenderão dosagens de entre cerca de 50 μg/kg a cerca de 5 mg/kg de peso corporal por dose. A este respeito, os moduladores conjugados podem ser administrados a 50, 75 ou 100 μg/kg ou a 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1 mg/kg de peso corporal por dose. Em outras modalidades preferenciais, os moduladores conjugados da presente invenção podem ser administrados a 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 3,5, 3,75, 4, 4,25, 4,5, 4,75 ou 5 mg/kg de peso corporal por dose. Em modalidades particularmente preferenciais, tais dosagens de modulador conjugado serão administradas intravenosamente ao longo de um período de tempo. Além do mais, tais dosagens podem ser administradas múltiplas vezes ao longo de um curso de tratamento definido.

[00492] Outros regimes de dosagem podem ser baseados em cálculos de Área Superficial Corporal (BSA) como divulgado em U.S.P.N. 7.744.877. Como é bem conhecido, a BSA é calculada usando a altura e peso do paciente e proporciona uma medida do tamanho de um sujeito como representado pela área superficial do seu corpo. Em certas modalidades, os moduladores podem ser administrados em dosagens de 10 mg/m2 a 800 mg/m2, de 50 mg/m2 a 500 mg/m2 e a dosagens de 100 mg/m2, 150 mg/m2, 200 mg/m2, 250 mg/m2, 300 mg/m2, 350 mg/m2, 400 mg/m2 ou 450 mg/m2.

[00493] Será apreciado que técnicas reconhecidas pela técnica e empíricas podem ser usadas para determinar dosagem apropriada para moduladores conjugados (i.e., ADCs).

[00494] Em qualquer caso, os moduladores de SEZ6 (tanto conjugados como não conjugados) são preferencialmente administrados como necessário a sujeitos com sua necessidade. A determinação da frequência de administração pode ser feita por pessoas versadas na técnica, tal como um médico assistente com base em considerações da condição sendo tratada, idade do sujeito sendo tratado, gravidade da condição sendo tratada, estado geral de saúde do sujeito sendo tratado e similares. Geralmente, uma dose eficaz do modulador de SEZ6 é administrada a um sujeito uma ou mais vezes. Mais particularmente, uma dose eficaz do modulador é administrada ao sujeito uma vez por mês, mais do que uma vez por mês, ou menos do que uma vez por mês. Em certas modalidades, a dose eficaz do modulador de SEZ6 pode ser administrada múltiplas vezes, incluindo durante períodos de pelo menos um mês, pelo menos seis meses, pelo menos um ano, pelo menos dois anos ou um período de vários anos. Ainda em outras modalidades (2, 3, 4, 5, 6 ou 7), várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) ou vários meses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) ou mesmo um ano ou vários anos podem existir entre a administração dos moduladores divulgados.

[00495] Em certas modalidades preferenciais, o curso de tratamento envolvendo moduladores conjugados compreenderão múltiplas doses do produto de fármaco selecionado (i.e., um ADC) ao longo de um período de semanas ou meses. Mais especificamente, os moduladores conjugados da presente invenção podem administrados uma vez todos os dias, a cada dois dias, a cada quatro dias, todas as semanas, a cada dez dias, a cada duas semanas, a cada três semanas, todos os meses, a cada seis meses, a cada dois meses, a cada dez semanas ou a cada três meses. A este respeito, será apreciado que as dosagens podem ser alteradas ou o intervalo pode ser ajustado com base na resposta do paciente e práticas clínicas.

[00496] As dosagens e regimes podem ser também determinados empiricamente para as composições terapêuticas divulgadas em indivíduos aos quais foi dada uma ou mais administração(ões). Por exemplo, pode ser dado aos indivíduos dosagens crescentes de uma composição terapêutica produzida como descrito aqui. Em modalidades selecionadas, a dosagem pode ser gradualmente aumentada ou reduzida ou atenuada com base respectivamente nos efeitos secundários ou toxicidade empiricamente determinados ou observados. Para avaliar a eficácia da composição selecionada, um marcador da doença, distúrbio ou condição específico pode ser seguido como previamente descrito. Em modalidades onde o indivíduo tem câncer, estes incluem medições diretas do tamanho do tumor através de palpação ou observação visual, mediação indireta do tamanho do tumor por raios X ou outras técnicas de imagiologia; uma melhoria como avaliada por biópsia direta do tumor e exame microscópico da amostra de tumor; a medição de um marcador de tumor indireto (p.ex., PSA para câncer da próstata) ou um antigênio identificado de acordo com os métodos descritos aqui, uma diminuição na dor ou paralisia; fala, visão, respiração melhoradas ou outra deficiência associada ao tumor; apetite aumentado; ou um aumento na qualidade de vida como medido por teste aceites ou prolongamento da sobrevivência. Será aparente a um versado na técnica que a dosagem variará dependendo do indivíduo, do tipo de condição neoplásica, do estágio da condição neoplásica, se a condição neoplásica começou a metastizar para outra localização no indivíduo, e os tratamentos passados e simultâneos sendo usados.

C. Terapias de Combinação

[00497] Terapias de combinação podem ser particularmente úteis na diminuição ou inibição da proliferação de células neoplásicas indesejadas, diminuição da ocorrência do câncer, diminuição ou prevenção da recorrência do câncer, ou diminuição ou prevenção da disseminação ou metastização do câncer. Em tais casos, os moduladores da presente invenção podem funcionar como agentes sensibilizantes ou quimiossensibilizantes por remoção das CSCs que de outro modo apareceriam e perpetuariam a massa do tumor e permitindo deste modo um uso mais eficaz de agentes de diminuição de volume ou anticâncer padrão correntes. Isto é, os moduladores divulgados podem, em certas modalidades, proporcionar um efeito intensificado (p.ex., de natureza aditiva ou sinérgica) que potencia o modo de ação de outro agente terapêutico administrado. No contexto da presente invenção, "terapia de combinação" deve ser interpretada amplamente e se refere meramente à administração de um modulador e um ou mais agentes anticâncer que incluem, mas não estão limitados a, agentes citotóxicos, agentes citostáticos, agentes anti- angiogênicos, agentes de diminuição de volume, agentes quimioterapêuticos, radioterapia e agentes radioterapêuticos, agentes anticâncer dirigidos (incluindo anticorpos monoclonais e entidades de pequenas moléculas), BRMs, anticorpos terapêuticos, vacinas contra o câncer, citocinas, terapias de hormônios, terapia de radiação e agentes antimetastáticos e agentes imunoterapêuticos, incluindo abordagens específicas e não específicas.

[00498] Não existe nenhum requisito para que os resultados combinados sejam aditivos dos efeitos observados quando cada tratamento (p.ex., anticorpo e agente anticâncer) é conduzido separadamente. Embora sejam desejáveis efeitos pelo menos aditivos, qualquer efeito antitumor aumentado acima de uma das terapias únicas é benéfico. Além do mais, a invenção não requer que o tratamento combinado exiba efeitos sinérgicos. No entanto, aqueles versados na técnica apreciarão que, com certas combinações selecionadas que compreendem modalidades adicionais, pode ser observado sinergismo.

[00499] Na prática de terapia de combinação, o modulador e o agente anticâncer podem ser administrados ao sujeito simultaneamente, em uma composição única, ou como duas ou mais composições distintas usando a mesma ou diferentes rotas de administração. Alternativamente, o modulador pode preceder, ou seguir, o tratamento com agente anticâncer por, p.ex., intervalos variando de minutos a semanas. O período de tempo entre cada distribuição é tal que o agente anticâncer e o modulador sejam capazes de exercer um efeito combinado no tumor. Em pelo menos uma modalidade, ambos o agente anticâncer e o modulador são administrados no espaço de cerca de 5 minutos a cerca de duas semanas um do outro. Ainda em outras modalidades (2, 3, 4, 5, 6 ou 7), várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) ou vários meses (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) podem existir entre a administração do modulador e do agente anticâncer.

[00500] A terapia de combinação pode ser administrada uma vez, duas vezes ou pelo menos durante um período de tempo até a condição ser tratada, atenuada ou curada. Em algumas modalidades, a terapia de combinação é administrada múltiplas vezes, por exemplo, de três vezes diariamente a uma vez a cada seis meses. A administração pode ser em um programa tal como três vezes diariamente, duas vezes diariamente, uma vez a cada dois dias, uma vez a cada três dias, uma vez semanalmente, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada seis meses ou pode ser administrada continuamente através de uma minibomba. A terapia de combinação pode ser administrada através de qualquer rota, como notado previamente. A terapia de combinação pode ser administrada em um local distante do local do tumor.

[00501] Em uma modalidade, um modulador é administrado em combinação com um ou mais agentes anticâncer durante um curto ciclo de tratamento a um sujeito com sua necessidade. A invenção engloba também administração descontínua ou doses diárias divididas em várias administrações parciais. O modulador e o agente anticâncer podem ser administrados indistintamente, em dias ou semanas alternados; ou pode ser dada uma sequência de tratamentos com anticorpo, seguida por um ou mais tratamentos de terapia com agente anticâncer. Em qualquer caso, como será entendido por aqueles versados na técnica, as doses apropriadas de agentes quimioterapêuticos serão geralmente em torno daquelas já empregues em terapias clínicas em que os quimioterapêuticos são administrados sozinhos ou em combinação com outros quimioterapêuticos.

[00502] Em outra modalidade preferencial, os moduladores de SEZ6 da presente invenção podem ser usados em terapia de manutenção para reduzir ou eliminar a probabilidade de recorrência do tumor após a apresentação inicial da doença. Preferencialmente, o distúrbio será sido tratado e a massa de tumor inicial eliminada, reduzida ou de outro modo melhorada tal que o paciente esteja assintomático ou em remissão. Em tal momento, podem ser administradas ao sujeito quantidades farmaceuticamente aceitáveis dos moduladores divulgados uma ou mais vezes embora exista pouca ou nula indicação da doença usando procedimentos de diagnóstico padrão. Em algumas modalidades, os moduladores serão administrados em um programa regular ao longo de um período de tempo, tal como semanalmente, a cada duas semanas, mensalmente, a cada seis semanas, a cada dois meses, a cada três meses, a cada seis meses ou anualmente. Dados os ensinamentos aqui, um versado na técnica poderia prontamente determinar dosagens e regimes de dosagem favoráveis para reduzir o potencial de recorrência da doença. Além do mais, tais tratamentos poderiam ser continuados durante um período de semanas, meses, anos ou mesmo indefinidamente dependendo da resposta do paciente e parâmetros clínicos e de diagnóstico.

[00503] Ainda em outra modalidade preferencial, os moduladores da presente invenção podem ser usados para prevenir ou reduzir profilaticamente ou como uma terapia de adjuvante a possibilidade de metastização do tumor após um procedimento de diminuição de volume. Como usado na presente descrição, um "procedimento de diminuição de volume" é definido amplamente e deve significar qualquer procedimento, técnica ou método que elimine, reduza, trate ou melhore um tumor ou proliferação de um tumor. Procedimentos de diminuição de volume exemplares incluem, mas não estão limitados a, cirurgia, tratamentos de radiação (i.e., radiação com feixes), quimioterapia, imunoterapia ou ablação. Em momentos apropriados prontamente determinados por um versado na técnica tendo em vista a presente descrição, os moduladores divulgados podem ser administrados como sugerido por procedimentos clínicos, de diagnóstico ou teragnóstico para reduzir a metastização do tumor. Os moduladores podem ser administrados uma ou mais vezes em dosagens farmaceuticamente eficazes como determinado usando técnicas padrão. Preferencialmente, o regime de dosagem será acompanhado por técnicas de diagnóstico ou monitorização apropriadas que permitem que seja modificado.

[00504] Ainda outras modalidades da invenção compreendem administração dos moduladores divulgados a sujeitos que sejam assintomáticos, mas em risco de desenvolverem um distúrbio proliferativo. Isto é, os moduladores da presente invenção podem ser usados em um sentido verdadeiramente preventivo e dados a pacientes que foram examinados ou testados e têm um ou mais fatores de risco notados (p.ex., indicações genômicas, história familiar, resultados de teste in vivo ou in vitro, etc.), mas não desenvolveram neoplasia. Em tais casos, aqueles versados na técnica seriam capazes de determinar um regime de dosagem eficaz através de observação empírica ou através de práticas clínicas aceitas.

D. Agentes Anticâncer

[00505] O termo "agente anticâncer" ou "agente antiproliferativo" significa qualquer agente que pode ser usado para tratar um distúrbio proliferativo das células tal como câncer, e inclui, mas não está limitado a, agentes citotóxicos, agentes citostáticos, agentes anti- angiogênicos, agentes de diminuição de volume, agentes quimioterapêuticos, radioterapia e agentes radioterapêuticos, agentes anticâncer dirigidos, BRMs, anticorpos terapêuticos, vacinas contra o câncer, citocinas, terapias de hormônios, terapia de radiação e agentes antimetastáticos e agentes imunoterapêuticos. Será apreciado que, em modalidades selecionadas como discutido acima, tais agentes anticâncer podem compreender conjugados e podem estar associados a moduladores antes da administração. Em certas modalidades, o agente anticâncer divulgado estará ligado a um modulador de SEZ6 para proporcionar um ADC como apresentado aqui.

[00506] Como usado aqui, o termo "agente citotóxico" significa uma substância que é tóxica para as células e diminui ou inibe a função de células e/ou causa destruição de células. Tipicamente, a substância é uma molécula ocorrendo naturalmente derivada de um organismo vivo. Exemplos de agentes citotóxicos incluem, mas não estão limitados a, toxinas de pequena molécula ou toxinas enzimaticamente ativas de bactérias (p.ex., toxina da Difteria, endotoxina e exotozina de Pseudomonas, enterotoxina A de Staphylococcus), fúngicas (p.ex., α- sarcina, restrictocina), de plantas (p.ex., abrina, ricina, modeccina, viscumina, proteína antiviral da uva-de-rato, saporina, gelonina, momoridina, tricosantina, toxina da cevada, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitegelina, restrictocina, fenomicina, neomicina, e os tricotecenos) ou animais (p.ex., RNases citotóxicas, tais como RNases pancreáticas extracelulares; DNase I, incluindo seus fragmentos e/ou variantes).

[00507] Para os propósitos da presente invenção, um "agente quimioterapêutico" compreende um composto químico que diminui ou inibe não especificamente o crescimento, proliferação, e/ou sobrevivência de células cancerígenas (p.ex., agentes citotóxicos ou citostáticos). Tais agentes químicos são frequentemente dirigidos a processos intracelulares necessários para crescimento ou divisão das células, e são assim particularmente eficazes contra células cancerígenas, que geralmente crescem e se dividem rapidamente. Por exemplo, a vincristina despolimeriza os microtúbulos, e inibe assim as células de entrarem na mitose. Em geral, os agentes quimioterapêuticos podem incluir qualquer agente químico que iniba, ou seja desenhado para inibir, uma célula cancerígena ou uma célula suscetível a se tornar cancerígena ou gerar descendência tumorigênica (p.ex., TIC). Tais agentes são frequentemente administrados, e são frequentemente o mais eficazes, em combinação, p.ex., em regimes tais como CHOP ou FOLFIRI. Novamente, em modalidades selecionadas, tais agentes quimioterapêuticos podem ser conjugados com os moduladores divulgados.

[00508] Exemplos de agentes anticâncer que podem ser usados em combinação com (ou conjugados com) os moduladores da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, agentes alquilantes, sulfonatos de alquila, aziridinas, etileniminas e metilamelaminas, acetogeninas, uma camptotecina, briostatina, calistatina, CC-1065, criptoficinas, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, uma sarcodictiina, espongistatina, mostardas de nitrogênio, antibióticos, antibióticos de enediina, dinemicina, bisfosfonatos, esperamicina, cromóforos de antobiótico de enediina de cromoproteína, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L- norleucina, doxorrubicina ADRIAMYCIN®, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, erlotinib, vemurafenib, crizotinib, sorafenib, ibrutinib, enzalutamida, análogos do ácido fólico, análogos da purina, androgênios, antiadrenais, repositor de ácido fólico tal como ácido frolínico, aceglatona, glicosídeo de aldofosfamida, ácido aminolevulínico, eniluracil, amsacrina, bestrabucil, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de eliptínio, uma epotilona, etoglucid, nitrato de gálio, hidroxiureia, lentinan, lonidainina, maitansinoides, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, ácido podofilínico, 2-etilhidrazida, procarbazina, complexo de polissacarídeo PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR), razoxano; rizoxina; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"- triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosídeo ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, cloranbucil; gemcitabina GEMZAR®; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina, vinblastina; platina; etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE®; novantrona; teniposídeo; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecano (Camptosar, CPT-11), inibidor da topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina; retinoides; capecitabina; combretastatina; leucovorina; oxaliplatina; inibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR e VEGF-A que reduzem a proliferação de células e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima. Também incluídos em esta definição estão agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação de hormônios em tumores tais como antiestrogênios e moduladores de receptor de estrogênio seletivos, inibidores da aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogênios nas glândulas adrenais, e antiandrogênios; bem como troxacitabina (um análogo da citocina de nucleosídeo de 1,3-dioxolano); oligonucleotídeos antissenso, ribozimas tais como inibidor da expressão de VEGF e um inibidor da expressão de HER2; vacinas, rIL-2 PROLEUKIN®; inibidor da topoisomerase I LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; Vinorelbina e Esperamicinas e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima.

[00509] Em outras modalidades, os moduladores da presente invenção podem ser usados em combinação com qualquer um de um número de anticorpos (ou agentes imunoterapêuticos) presentemente em ensaios clínicos ou comercialmente disponíveis. Para esta finalidade, os moduladores divulgados podem ser usados em combinação com um anticorpo selecionado do grupo consistindo em abagovomab, adecatumumab, afutuzumab, alemtuzumab, altumomab, amatuximab, anatumomab, arcitumomab, bavituximab, bectumomab, bevacizumab, bivatuzumab, blinatumomab, brentuximab, cantuzumab, catumaxomab, cetuximab, citatuzumab, cixutumumab, clivatuzumab, conatumumab, daratumumab, drozitumab, duligotumab, dusigitumab, detumomab, dacetuzumab, dalotuzumab, ecromeximab, elotuzumab, ensituximab, ertumaxomab, etaracizumab, farletuzumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanvotumab, futuximab, ganitumab, gemtuzumab, girentuximab, glembatumumab, ibritumomab, igovomab, imgatuzumab, indatuximab, inotuzumab, intetumumab, ipilimumab, iratumumab, labetuzumab, lexatumumab, lintuzumab, lorvotuzumab, lucatumumab, ofatumumab, olaratumab, onartuzumab, oportuzumab, oregovomab, panitumumab, parsatuzumab, patritumab, pemtumomab, pertuzumab, pintumomab, pritumumab, racotumomab, radretumab, rilotumumab, rituximab, robatumumab, satumomab, sibrotuzumab, siltuximab, simtuzumab, solitomab, tacatuzumab, taplitumomab, tenatumomab, teprotumumab, tigatuzumab, tositumomab, trastuzumab, tucotuzumab, ublituximab, veltuzumab, vorsetuzumab, votumumab, zalutumumab, CC49, 3F8 e suas combinações.

[00510] Ainda outras modalidades particularmente preferenciais compreenderão o uso de anticorpos aprovados para terapia contra o câncer incluindo, mas não se limitando a, rituximab, trastuzumab, gemtuzumab ozogamcina, alemtuzumab, tiuxetano de ibritumomab, tositumomab, bevacizumab, cetuximab, panitumumab, ofatumumab, ipilimumab e vedotina de brentuximab. Aqueles versados na técnica serão capazes de prontamente identificar agentes anticâncer adicionais que sejam compatíveis com os ensinamentos aqui.

E. Radioterapia

[00511] A presente invenção proporciona também a combinação dos moduladores com radioterapia (i.e., qualquer mecanismo para indução de danos no DNA localmente dentro das células de tumor tais como irradiação gama, raios X, irradiação UV, micro-ondas, emissões eletrônicas e similares). A terapia de combinação usando a distribuição dirigida de radioisótopos a células de tumor está também contemplada, e pode ser usada em conexão com um agente anticâncer dirigido ou outros meios de direcionamento. Tipicamente, a terapia de radiação é administrada em pulsos ao longo de um período de tempo de cerca de 1 a cerca de 2 semanas. A terapia de radiação pode ser administrada a sujeitos tendo câncer da cabeça e pescoço durante cerca de 6 a 7 semanas. Opcionalmente, a terapia de radiação pode ser administrada como uma única dose ou como doses múltiplas, sequenciais.

XI. Indicações

[00512] Será apreciado que os moduladores da presente invenção podem ser usados para diagnosticar, tratar ou inibir a ocorrência ou recorrência de qualquer distúrbio associado a SEZ6. Conformemente, quer administrados sozinhos ou em combinação com um agente anticâncer ou radioterapia, os moduladores da invenção são particularmente úteis para tratamento geral de condições neoplásicas em pacientes ou sujeitos que podem incluir tumores benignos ou malignos (p.ex., carcinomas adrenal, do fígado, do rim, da bexiga, da mama, gástrico, dos ovários, colorretais, da próstata, pancreático, do pulmão, da tiroide, hepático, cervical, do endométrio, do esófago e do útero; sarcomas; glioblastomas; e vários tumores da cabeça e pescoço); leucemias e malignidades da linfoide; outros distúrbios tais como distúrbios neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicos e outros glandulares, macrofagais, epiteliais, estromais e blastocélicos; e distúrbios inflamatórios, angiogênicos, imunológicos e distúrbios causados por patogênios. Particularmente, alvos chave para tratamento são condições neoplásicas compreendendo tumores sólidos, embora malignidades hematológicas estejam dentro do escopo da invenção. Preferencialmente, o "sujeito" ou "paciente" a ser tratado será ser humano, embora, como usados aqui, os termos sejam expressamente considerados como compreendendo qualquer espécie de mamífero.

[00513] Mais especificamente, as condições neoplásicas sujeitas a tratamento de acordo com a presente invenção podem ser selecionadas do grupo incluindo, mas não se limitando a, tumores da glândula adrenal, cânceres associados a AIDS, sarcoma de partes moles do alvéolo, tumores astrocíticos, câncer da bexiga (carcinoma das células escamosas e carcinoma das células transitórias), câncer do osso (adamantinoma, cistos ósseos aneurismáticos, osteocondroma, osteossarcoma), cânceres do cérebro e cordão espinhal, tumores do cérebro metastáticos, câncer da mama, tumores do corpo carotídeo, câncer cervical, condrossarcoma, cordoma, carcinoma das células renais cromófobas, carcinoma de células claras, câncer do cólon, câncer colorretal, histiocitomas fibrosos benignos cutâneos, tumores desmoplásicos de pequenas células redondas, ependimomas, tumores de Ewing, condrossarcoma mixoide extraesquelético, fibrogênese do osso imperfeito, displasia fibrosa do osso, cânceres da vesícula e vias biliares, doença tromboembólica gestacional, tumores das células germinativas, cânceres da cabeça e pescoço, tumores das células das ilhotas, Sarcoma de Kaposi, câncer do rim (nefroblastoma, carcinoma das células renais papilares), leucemias, lipoma/tumores lipomatosos benignos, lipossarcoma/tumores lipomatosos malignos, câncer do fígado (hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular), linfomas, cânceres do pulmão (carcinoma das células pequenas, adenocarcinoma, carcinoma das células escamosas, carcinoma das células grandes, etc.), meduloblastoma, melanoma, meningiomas, neoplasia endócrina múltipla, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplásico, neuroblastoma, tumores neuroendócrinos, câncer dos ovários, cânceres pancreáticos, carcinomas da tiroide papilar, tumores da paratiroide, cânceres pediátricos, tumores da bainha dos nervos periféricos, feocromocitoma, tumores da pituitária, câncer da próstata, melanoma uveal posterior, distúrbios hematológicos renais, câncer metastático renal, tumor rabdoide, rabdomissarcoma, sarcomas, câncer da pele, sarcomas de tecido mole, câncer das células escamosas, câncer do estômago, sarcoma sinovial, câncer dos testículos, carcinoma tímico, timoma, câncer metastático da tiroide, e cânceres do útero (carcinoma do colo do útero, carcinoma do endométrio, e leiomioma).

[00514] Em certas modalidades preferenciais, o distúrbio proliferativo compreenderá um tumor sólido incluindo, mas não se limitando a, carcinomas adrenais, do fígado, do rim, da bexiga, da mama, gástricos, dos ovários, cervical, do útero, do esófago, colorretais, da próstata, pancreáticos, do pulmão (células pequenas e células não pequenas), da tiroide, sarcomas, glioblastomas e vários tumores da cabeça e pescoço. Em outras modalidades preferenciais, e como mostrado nos Exemplos em baixo, os moduladores divulgados são especialmente eficazes no tratamento do câncer de pulmão de células pequenas (SCLC) e câncer das células não pequenas do pulmão (NSCLC) (p.ex., câncer das células não pequenas das células escamosas do pulmão ou câncer das células pequenas das células escamosas do pulmão). Em uma modalidade, o câncer do pulmão é refratário, recidiva ou resistente a um agente à base de platina (p.ex., carboplatina, cisplatina, oxaliplatina, topotecano) e/ou um taxano (p.ex., docetaxel, paclitaxel, larotaxel ou cabazitaxel). Adicionalmente, em modalidades particularmente preferenciais, os moduladores divulgados podem ser usados em uma forma conjugada para tratar câncer de pulmão de células pequenas.

[00515] No que diz respeito ao câncer de pulmão de células pequenas, modalidades particularmente preferenciais compreenderão a administração de moduladores conjugados (ADCs). Em modalidades selecionadas, os moduladores conjugados serão administrados a pacientes exibindo doença em estágio limitado. Em outras modalidades, os moduladores conjugados serão administrados a pacientes exibindo doença em estágio prolongado. Em outras modalidades preferenciais, os moduladores conjugados divulgados serão administrados a pacientes refratários (i.e., aqueles que recorrem durante ou imediatamente após completação de um curso de terapia inicial). Ainda outras modalidades compreendem a administração dos moduladores divulgados a pacientes sensíveis (i.e., aqueles cuja recaída é mais longa do que 2-3 meses após terapia primária). Em cada caso, será apreciado que os moduladores conjugados podem estar em um estado conjugado ou não conjugado dependendo do regime de dosagem escolhido e do diagnóstico clínico.

[00516] Como discutido acima, os moduladores divulgados podem ser adicionalmente usados para prevenir, tratar ou diagnosticar tumores com características ou fenótipos neuroendócrinos incluindo tumores neuroendócrinos. Os tumores neuroendócrinos (NETs) verdadeiros ou canônicos surgindo no sistema endócrino disperso são relativamente raros, com uma incidência de 2-5 por 100.000 pessoas, mas altamente agressivos. Os tumores neuroendócrinos ocorrem no rim, trato genitourinário (bexiga, próstata, ovários, colo do útero, e endométrio), trato gastrointestinal (cólon, estômago), tiroide (câncer da tiroide medular), e pulmão (carcinoma das células pequenas do pulmão e carcinoma neuroendócrino das células grandes). Estes tumores podem secretar vários hormônios incluindo serotonina e/ou cromogranina A que podem causar sintomas debilitantes conhecidos como síndrome carcinoide. Tais tumores podem ser denotados por marcadores imunohistoquímicos positivos tais como enolase específica dos neurônios (NSE, também conhecida como enolase gama, símbolo do gene = ENO2), CD56 (ou NCAM1), cromogranina A (CHGA), e sinaptofisina (SYP) ou por genes que se sabe que exibem a expressão elevada tal como ASCL1. Infelizmente, as quimioterapias tradicionais não têm sido particularmente eficazes no tratamentos de NETs e a metastização do fígado é um resultado comum.

[00517] Embora os moduladores divulgados possam ser vantajosamente usados para tratar tumores neuroendócrinos, eles podem ser também usados para tratar, prevenir ou diagnosticar pseudotumores neuroendócrinos (pNETs) que mimetizam, se assemelham a ou exibem genotipicamente ou fenotipicamente traços comuns com tumores neuroendócrinos canônicos. Pseudotumores neuroendócrinos ou tumores com características neuroendócrinos são tumores que têm origem em células do sistema neuroendócrino difuso ou em células nas quais uma cascata de diferenciação neuroendócrina foi aberrantemente reativada durante o processo oncogênico. Tais pNETs partilham comummente certas características fenotípicas ou bioquímicas com tumores neuroendócrinos tradicionalmente definidos, incluindo a capacidade de produzirem subconjuntos de aminas biologicamente ativas, neurotransmissores, e hormônios de peptídeo. Histologicamente, tais tumores (NETs e pNETs) partilham uma aparência comum mostrando frequentemente células pequenas densamente conectadas com citoplasma mínimo de citopatologia branda e núcleos pontilhados redondos a ovais. Para os propósitos da presente invenção, marcadores histológicos ou marcadores genéticos comummente expressos que podem ser usados para definir tumores neuroendócrinos e pseudo neuroendócrinos incluem, mas não estão limitados a, cromogranina A, CD56, sinaptofisina, PGP9.5, ASCL1 e enolase específica dos neurônios (NSE).

[00518] Conformemente, os moduladores da presente invenção podem ser beneficamente usados para tratar pseudotumores neuroendócrinos e tumores neuroendócrinos canônicos. A este respeito, os moduladores podem ser usados como descrito aqui para tratar tumores neuroendócrinos (tanto NET como pNET) surgindo no rim, trato genitourinário (bexiga, próstata, ovários, colo do útero, e endométrio), trato gastrointestinal (cólon, estômago), tiroide (câncer da tiroide medular), e pulmão (carcinoma das células pequenas do pulmão e carcinoma neuroendócrino das células grandes). Além do mais, os moduladores da presente invenção podem ser usados para tratar tumores expressando um ou mais marcadores selecionados do grupo consistindo em NSE, CD56, sinaptofisina, cromogranina A, ASCL1 e PGP9.5 (UCHL1). Isto é, a presente invenção pode ser usada para tratar um sujeito sofrendo de um tumor que é NSE+ ou CD56+ ou PGP9.5+ ou ASCL1+ ou SYP+ ou CHGA+ ou alguma sua combinação.

[00519] No que respeita a malignidades hematológicas, será adicionalmente apreciado que os compostos e métodos da presente invenção podem ser particularmente eficazes no tratamento de uma variedade de linfomas das células B, incluindo linfoma das células foliculares (FCC) NHL/baixo grau, linfoma das células do manto (MCL), linfoma das células grandes difusas (DLCL), NHL linfocítico pequeno (SL), NHL folicular/grau intermediário, NHL difuso de grau intermediário, NHL imunoblástico de elevado grau, NHL linfoblástico de elevado grau, NHL de células não clivadas pequenas de elevado grau, NHL de doença volumosa, Macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma linfoplasmacitoide (LPL), linfoma das células do manto (MCL), linfoma folicular (FL), linfoma das células grandes difusas (DLCL), linfoma de Burkitt (BL), linfomas relacionados com AIDS, linfoma das células B monocíticas, linfoadenopatia angioimunoblástica, linfocítico pequeno, folicular, células grandes difusas, células clivadas pequenas difusas, linfoblastoma imunoblástico das células grandes, pequenas, não clivadas, Burkitt e não Burkitt, células predominantemente grandes, foliculares; células clivadas predominantemente pequenas; e linfomas de células pequenas clivadas e grandes mistas. Ver, Gaidono et al., "Lymphomas", EM CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, Vol. 2: 2131-2145 (DeVita et al., eds., 5.sup.th ed. 1997). Deve ser claro àqueles versados na técnica que estes linfomas terão frequentemente nomes devido a sistemas de classificação em mudança, e que os pacientes tendo linfomas classificados sob diferentes nomes podem também beneficiar dos regimes terapêuticos combinados da presente invenção.

[00520] A presente invenção proporciona também um tratamento preventivo ou profilático de sujeitos que apresentam tumores benignos ou pré-cancerígenos. Para além de ser um distúrbio associado a SEZ6, não se acredita que qualquer tipo de tumor ou distúrbio proliferativo deva ser excluído de tratamento usando a presente invenção. No entanto, o tipo de células do tumor pode ser relevante ao uso da invenção em combinação com agentes terapêuticos secundários, particularmente agentes quimioterapêuticos e agentes anticâncer dirigidos.

XII. Artigos de Fabricação

[00521] Pacotes e conjuntos farmacêuticos compreendendo um ou mais recipientes, compreendendo uma ou mais doses de um modulador de SEZ6, são também proporcionados. Em certas modalidades, é proporciona uma dosagem unitária em que a dosagem unitária contém uma quantidade predeterminada de uma composição compreendendo, por exemplo, um anticorpo anti-SEZ6, com ou sem um ou mais agentes adicionais. Para outras modalidades, uma tal dosagem unitária é fornecida em seringa pré-enchida de uso único para injeção. Ainda em outras modalidades, a composição contida na dosagem unitária pode compreender salino, sacarose, ou similares; um tampão, tal como fosfato, ou similares; e/ou ser formulada dentro uma gama de pH estável e eficaz. Alternativamente, em certas modalidades, a composição pode ser proporcionada como um pó liofilizado que pode ser reconstituído após adição de um líquido apropriado, por exemplo, água estéril. Em certas modalidades, a composição compreende uma ou mais substâncias que inibem a agregação de proteínas, incluindo, mas não se limitando a, sacarose e arginina. Qualquer etiqueta no(s), ou associados ao(s), recipiente(s) indica que a composição encerrada é usada para diagnóstico ou tratamento da condição de doença de escolha.

[00522] A presente invenção proporciona também conjuntos para produção de unidades de administração de dose única e multidose de um modulador de SEZ6 e, opcionalmente, um ou mais agentes anticâncer. O conjunto compreende um recipiente e uma etiqueta ou pacote inserido no ou associado ao recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc.. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro e plástico e contêm uma quantidade farmaceuticamente aceitável dos moduladores divulgados em uma forma conjugada ou não conjugada. Em outras modalidades, o(s) recipiente(s) compreende(m) uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco tendo uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Tais conjuntos conterão geralmente em um recipiente adequado uma formação farmaceuticamente aceitável do modulador de SEZ6 e, opcionalmente, um ou mais agentes anticâncer nos mesmos ou diferentes recipientes. Os conjuntos podem também conter outras formulações farmaceuticamente aceitáveis, para diagnóstico ou terapia combinada. Por exemplo, adicionalmente ao modulador de SEZ6 da invenção, tais conjuntos podem conter qualquer um ou mais de uma gama de agentes anticâncer tais como fármacos quimioterapêuticos ou radioterapêuticos; agentes anti-angiogênicos; agentes antimetastáticos; agentes anticâncer dirigidos; agentes citotóxicos; e/ou outros agentes anticâncer. Tais conjuntos podem também proporcionar reagentes apropriados para conjugar o modulador de SEZ6 com um agente anticâncer ou agente de diagnóstico (p.ex., ver U.S.P.N. 7,422,739 que é incorporada aqui por referência na sua totalidade).

[00523] Mais especificamente, os conjuntos podem ter um único recipiente que contém o modulador de SEZ6, com ou sem componentes adicionais, ou podem ter recipientes distintos para cada agente desejado. Onde são proporcionados terapêuticos combinados para conjugação, uma solução única pode ser pré-misturada, em uma combinação equivalente molar, ou com um componente em excesso do outro. Alternativamente, o modulador de SEZ6 e qualquer agente anticâncer opcional do conjunto podem ser mantidos separadamente dentro de recipientes distintos antes da administração a um paciente. Os conjuntos podem também compreender um segundo/terceiro meio recipiente para contenção de uma tampão estéril, farmaceuticamente aceitável ou outro diluente tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), salino tamponado com fosfato (PBS), solução de Ringer e solução de dextrose.

[00524] Quando os componentes do conjunto são proporcionados em uma ou mais soluções líquidas, a solução líquida é preferencialmente uma solução aquosa, com uma solução aquosa estéril sendo particularmente preferencial. No entanto, os componentes do conjunto podem ser proporcionados como pó(s) seco(s). Quando os reagentes ou componentes são proporcionados como um pó seco, o pó pode ser reconstituído pela adição de um solvente adequado. Prevê-se que o solvente possa ser também proporcionado em outro recipiente.

[00525] Como indicado brevemente acima, os conjuntos podem conter também um meio pelo qual se administram o anticorpo e quaisquer componentes opcionais a um animal ou paciente, p.ex., uma ou mais agulhas ou seringas, ou mesmo um conta-gotas, pipeta, ou outro tal dispositivo similar, a partir do qual a formulação pode ser injetada ou introduzida no animal ou aplicada a uma área doente do corpo. Os conjuntos da presente invenção irão tipicamente incluir um meio para contenção dos frascos, ou tais similares, e outro componente em confinamento para venda comercial, tal como, p.ex., recipientes plásticos moldados por injeção ou sopro nos quais os frascos desejados e outros dispositivos são colocados e retidos. Qualquer inserção de etiqueta ou pacote indica que a composição de modulador de SEZ6 é usada para tratamento do câncer, por exemplo, câncer de pulmão de células pequenas.

[00526] Em outras modalidades preferenciais, os moduladores da presente invenção podem ser usados em conjunto com, ou compreender, dispositivos de diagnóstico ou terapêuticos no diagnóstico ou tratamento de distúrbios proliferativos. Por exemplo, em uma modalidade preferencial, os compostos e composições da presente invenção podem ser combinados com certos dispositivos ou instrumentos de diagnóstico que podem ser usados para detectar, monitorizar, quantificar ou caracterizar células ou compostos marcadores envolvidos na etiologia ou manifestação de distúrbios proliferativos. Para modalidades selecionadas, os compostos marcadores podem compreender NSE, CD56, sinaptofisina, cromogranina A, e PGP9.5.

[00527] Em modalidades particularmente preferenciais, os dispositivos podem ser usados para detectar, monitorizar e/ou quantificar células de tumor circulantes ou in vivo ou in vitro (ver, por exemplo, WO 2012/0128801, que é incorporada aqui por referência). Ainda em outras modalidades preferenciais, e como discutido acima, as células de tumor circulantes podem compreender células-tronco do câncer.

XIII. Reagentes de Pesquisa

[00528] Outras modalidades preferenciais da invenção exploram também as propriedades dos moduladores divulgados como um instrumento útil para identificação, monitorização, isolamento, secionamento ou enriquecimento de populações ou subpopulações de células iniciadoras de tumor através de métodos tais como citometria de fluxo, separação de células ativada por fluorescência (FACS), separação de células ativada por magnetismo (MACS) ou secionamento mediado por laser. Aqueles versados na técnica apreciarão que os moduladores podem ser usados em várias técnicas compatíveis para a caracterização e manipulação de TIC incluindo células-tronco do câncer (p.ex., ver U.S.S.Ns. 12/686,359, 12/669,136 e 12/757,649, cada um dos quais é incorporado aqui por referência na sua totalidade).

XIV. Diversos

[00529] A não ser que definido de outro modo aqui, os termos científicos e técnicos usados em conjunto com a presente invenção devem ter os significados que são comummente entendidos por aqueles versados na técnica. Adicionalmente, a não ser que requerido de outro modo pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular. Mais especificamente, como usadas em esta especificação e nas reivindicações anexadas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" incluem referentes plurais a não ser que o contexto dite claramente de outro modo. Assim, por exemplo, a referência a "uma proteína" inclui uma pluralidade de proteínas; a referência a "uma célula" inclui misturas de células, e similares. Adicionalmente, as gamas proporcionadas na especificação e nas reivindicações anexadas incluem ambos os pontos finais e todos os pontos entre os pontos finais. Portanto, uma gama de 2,0 a 3,0 inclui 2,0, 3,0, e todos os pontos entre 2,0 e 3,0.

[00530] Geralmente, a nomenclatura usada em conexão com, e técnicas de, cultura de células e tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química de proteínas e ácidos nucleicos e hibridação descrita aqui é aquela bem conhecida e comummente usada na técnica. Os métodos e técnicas da presente invenção são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo da presente especificação a não ser que indicado que outro modo. Ver, p.ex.., Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6a ed., W.B. Saunders Company (2010); Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow e Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.I. (1998); e Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). As reações enzimáticas e as técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como comummente alcançado na técnica ou como descrito aqui. A nomenclatura usada em conexão com, e os procedimentos e técnicas laboratoriais de, química analítica, química orgânica sintética, e química medicinal e farmacêutica descrita aqui é aquela bem conhecida e comummente usada na técnica. Além do mais, quaisquer títulos de seção usados aqui são para propósitos de organização somente e não são para serem interpretados como limitando a matéria descrita.

XV. Referências SEZ6

[00531] Todas as referências ou documentos divulgados ou citados em esta especificação, são, sem limitação, incorporados aqui por referência na sua totalidade. Além do mais, quaisquer títulos de seção usados aqui são para propósitos de organização somente e não são para serem interpretados como limitando a matéria descrita. 1. Bork P, Beckmann G. (1993). The CUB domain. A widespread module in developmentally regulated proteins. J Mol Biol. 231:539-45. PMID: 8510165. 2. Galluzzo P, e Bocchetta M (2011). Notch signaling in lung cancer. Expert Rev Anticancer Ther. 11:533-40. PMID: 21504320. 3. Gunnersen JM et al. (2007). Sez-6 proteins affect dendritic arborization patterns and excitability of cortical pyramidal neurons. Neuron. 56:621-39. PMID: 18031681. 4. Gunnersen JM et al. (2009). Seizure-related gene 6 (Sez- 6) in amacrine cells of the rodent retina and the consequence of gene deletion. PLoS One. 4:e6546. PMID:19662096. 5. Herbst R, Nicklin MJ (1997). SEZ-6: promoter selectivity, genomic structure and localized expression in the brain. Brain Res Mol Brain Res. 44:309-22. PMID: 9073173. 6. Klimstra DS, et al. (2010). The pathologic classification of neuroendocrine tumors: a review of nomenclature, grading, and staging systems. Pancreas. 39:707-12. PMID: 20664470. 7. Kloppel G. (2011). Classification and pathology of gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasms. Endocr Relat Cancer. 18 Supl 1:S1-16. PMID: 22005112. 8. Mulley JC et al. (2011). The Role of Seizure-Related SEZ6 as a Susceptibility Gene in Febrile Seizures. Neurol Res Int. 2011:917565. PMID: 21785725. 9. Shimizu-Nishikawa K et al., (1995). Cloning and expression of SEZ-6, a brain-specific and seizure-related cDNA. Brain Res Mol Brain Res. 28:201-10. PMID: 7723619. 10. Yao JC et al. (2008). One hundred years after "carcinoid": epidemiology of and prognostic factors for neuroendocrine tumors in 35,825 cases in the United States. J Clin Oncol. 26:3063-72. PMID: 18565894. 11. Yu ZL et al., (2007). Febrile seizures are associated with mutation of seizure-related (SEZ) 6, a brain-specific gene. J Neurosci Res. 85:166-72. PMID: 17086543.

XVI. Modalidades Selecionadas da Invenção

[00532] Adicionalmente à descrição e Exemplos aqui, a presente invenção está dirigida a modalidades selecionadas especificamente apresentadas imediatamente em baixo. Reivindicações Putativas 1. Um modulador de SEZ6 isolado. 2. O modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 1, em que o modulador de SEZ6 compreende um antagonista de SEZ6. 3. O modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 1, em que o modulador de SEZ6 compreende um anticorpo ou seu fragmento imunorreativo. 4. O modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpo ou seu fragmento imunorreativo compreende um anticorpo monoclonal. 5. O modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo monoclonal é selecionado do grupo consistindo em anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos humanos. 6. O modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 4, em que o referido anticorpo monoclonal compreende um anticorpo neutralizante. 7. O modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 4, em que o referido anticorpo monoclonal compreende um anticorpo esgotante. 8. O modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 4, em que o referido anticorpo monoclonal compreende um anticorpo internalizante. 9. O modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 8, em que o referido anticorpo monoclonal compreende ainda um agente citotóxico. 10. O modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 4 em que o referido anticorpo monoclonal compreende uma região variável da cadeia leve tendo três regiões determinadoras da complementaridade e uma região variável da cadeia pesada tendo três regiões determinadoras da complementaridade em que as regiões determinadoras da complementaridade da cadeia pesada e leve compreendem pelo menos uma região determinadora da complementaridade apresentada na FIG. 10A ou FIG. 10B, respectivamente. 11. O modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 4 em que o referido anticorpo monoclonal compreende uma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada em que a referida região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos como apresentadas em SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166 e SEQ ID NO: 168 e em que a referida região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos como apresentadas em SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167 e SEQ ID NO: 169. 12. Um modulador de SEZ6 isolado compreendendo uma CDR de qualquer uma das regiões variáveis da cadeia pesada ou leve apresentadas na reivindicação 11. 13. Um modulador de SEZ6 isolado compreendendo um anticorpo concorrente em que o referido anticorpo concorrente inibe a ligação de um modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 10 ou 11 a SEZ6 em pelo menos cerca de 40%. 14. Um ácido nucleico codificando uma região variável da cadeia pesada de aminoácido ou uma região variável da cadeia leve de aminoácido de acordo com a reivindicação 11. 15. Um vetor compreendendo o ácido nucleico de acordo com a reivindicação 14. 16. O modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e seus fragmentos. 17. O modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 16, em que o modulador de SEZ6 compreende ainda pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina. 18. O modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 1 em que o referido modulador reduz a frequência de células iniciadoras de tumor após administração a um sujeito em sua necessidade. 19. O modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 18 em que a redução da frequência é determinada usando análise de citometria de fluxo de marcadores da superfície de células do tumor que se sabe que enriquecem quanto a células iniciadoras de tumor. 20. O modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 18 em que a redução da frequência é determinada usando detecção imunohistoquímica de marcadores da superfície de células do tumor que se sabe que enriquecem quanto a células iniciadoras de tumor. 21. O modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 18, em que as referidas células iniciadoras de tumor compreendem células perpetuadoras de tumor. 22. O modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 1 compreendendo ainda um agente citotóxico. 23. Uma composição farmacêutica compreendendo o modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 1. 24. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 23, em que o referido modulador de SEZ6 isolado compreende um anticorpo monoclonal. 25. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 24, em que o referido anticorpo monoclonal compreende um anticorpo humanizado. 26. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 25, em que o referido anticorpo humanizado compreende um agente citotóxico. 27. O modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 26, em que o referido agente citotóxico compreende uma pirrolobenzodiazepina. 28. O modulador de SEZ6 isolado de acordo com a reivindicação 26, em que o referido agente citotóxico compreende uma auristatina. 29. Um método de tratamento de um distúrbio associado a SEZ6 compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um modulador SEZ6 em um sujeito necessitado. 30. O método de acordo com a reivindicação 29, em que o referido modulador de SEZ6 compreende um antagonista de SEZ6. 31. O método de acordo com a reivindicação 29, em que o referido modulador de SEZ6 compreende um anticorpo ou seu fragmento imunorreativo. 32. O método de acordo com a reivindicação 31, em que o anticorpo ou seu fragmento imunorreativo compreende um anticorpo monoclonal. 33. O método de acordo com a reivindicação 32, em que o anticorpo monoclonal é selecionado do grupo consistindo em anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos humanos. 34. O método de acordo com a reivindicação 33 em que o referido anticorpo monoclonal compreende uma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada em que a referida região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos como apresentadas em SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162, SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166 e SEQ ID NO: 168 e em que a referida região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas sequências de aminoácidos como apresentadas em SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167 e SEQ ID NO: 169. 35. O método de acordo com a reivindicação 34, em que o referido anticorpo monoclonal é um anticorpo humanizado. 36. O método de acordo com a reivindicação 32, em que o referido anticorpo monoclonal compreende um anticorpo neutralizante. 37. O método de acordo com a reivindicação 32, em que o referido anticorpo monoclonal compreende um anticorpo internalizante. 38. O método de acordo com a reivindicação 37, em que o referido anticorpo internalizante compreende um agente citotóxico. 39. O método de acordo com a reivindicação 38, em que o referido agente citotóxico compreende uma pirrolobenzodiazepina. 40. O método de acordo com a reivindicação 38, em que o referido agente citotóxico compreende uma auristatina. 41. O método de acordo com a reivindicação 39, em que o distúrbio associado a SEZ6 compreende um distúrbio neoplásico. 42. O método de acordo com a reivindicação 41 em que o referido distúrbio neoplásico compreende um tumor exibindo características neuroendócrinas. 43. O método de acordo com a reivindicação 42 em que o referido tumor exibindo características neuroendócrinas compreende um tumor neuroendócrino. 44. O método de acordo com a reivindicação 41 em que o sujeito sofre de um distúrbio neoplásico selecionado do grupo consistindo em câncer adrenal, câncer da bexiga, câncer cervical, câncer do endométrio, câncer gástrico, câncer do rim, câncer do fígado, câncer do pulmão, câncer dos ovários, câncer colorretal, câncer pancreático, câncer da próstata e câncer da mama. 45. O método de acordo com a reivindicação 44 em que o sujeito sofre de câncer do pulmão. 46. O método de acordo com a reivindicação 45 em que o sujeito sofre de câncer de pulmão de células pequenas. 47. O método de acordo com a reivindicação 41 em que o sujeito sofrendo do referido distúrbio neoplásico exibe tumores compreendendo células iniciadoras de tumor. 48. O método de acordo com a reivindicação 47 compreendendo ainda a etapa de redução da frequência de células iniciadoras de tumor no referido sujeito. 49. O método de acordo com a reivindicação 48 em que a redução da frequência é determinada usando análise de citometria de fluxo de marcadores da superfície de células do tumor que se sabe que enriquecem quanto a células iniciadoras de tumor ou detecção imunohistoquímica de marcadores da superfície de células do tumor que se sabe que enriquecem quanto a células iniciadoras de tumor. 50. O método de acordo com a reivindicação 48 em que a redução da frequência é determinada usando um método do grupo consistindo em análise de diluição limitante in vitro e in vivo. 51. O método de acordo com a reivindicação 50 em que a redução da frequência é determinada usando análise de diluição limitante in vivo compreendendo transplante de células de tumor humano vivas em camundongos imunocomprometidos. 52. O método de acordo com a reivindicação 51 em que a redução da frequência é determinada usando análise de diluição limitante in vivo compreendendo quantificação da frequência de células iniciadoras de tumor usando estatística de distribuição de Poisson. 53. O método de acordo com a reivindicação 50 em que a redução da frequência é determinada usando análise de diluição limitante in vitro compreendendo deposição de diluição limitante de células de tumor humano vivas em condições apoiando colônias in vitro. 54. O método de acordo com a reivindicação 53 em que a redução da frequência determinada usando análise de diluição limitante in vitro compreende quantificação da frequência de células iniciadoras de tumor usando estatística de distribuição de Poisson. 55. O método de acordo com a reivindicação 29 compreendendo ainda a etapa de administrar um agente anticâncer. 56. O método de acordo com a reivindicação 29 em que o referido modulador de SEZ6 compreende uma ou mais CDRs de qualquer um dos SEQ ID NOS: 20 a 169. 57. O método de acordo com a reivindicação 29, em que o referido modulador de SEZ6 compreende um modulador de pan-SEZ6. 58. O método de acordo com a reivindicação 57, em que o referido modulador de SEZ6 compreende um agente citotóxico. 59. Um método de redução da frequência de células iniciadoras de tumor em um sujeito com sua necessidade compreendendo a etapa de administração de um modulador de SEZ6 ao referido sujeito. 60. O método de acordo com a reivindicação 59, em que as células iniciadoras de tumor compreendem células perpetuadoras de tumor. 61. O método de acordo com a reivindicação 60 em que as referidas células perpetuadoras de tumor são selecionadas de células expressando marcadores selecionados do grupo consistindo em células CD44+, CD324+ e CD133+. 62. O método de acordo com a reivindicação 59, em que o referido modulador de SEZ6 compreende um anticorpo. 63. O método de acordo com a reivindicação 62, em que o referido anticorpo compreende um anticorpo monoclonal. 64. O método de acordo com a reivindicação 63, em que o referido anticorpo monoclonal compreende ainda um agente citotóxico. 65. O método de acordo com a reivindicação 59 em que o sujeito sofre de um distúrbio neoplásico selecionado do grupo consistindo em câncer adrenal, câncer da bexiga, câncer cervical, câncer do endométrio, câncer do rim, câncer do fígado, câncer do pulmão, câncer dos ovários, câncer colorretal, câncer pancreático, câncer da próstata e câncer da mama. 66. O método de acordo com a reivindicação 65 em que o sujeito sofre de câncer do pulmão. 67. O método de acordo com a reivindicação 66 em que o sujeito sofre de câncer de pulmão de células pequenas. 68. O método de acordo com a reivindicação 59 em que a frequência de células iniciadoras de tumor é reduzida em pelo menos 10%. 69. O método de acordo com a reivindicação 59 em que a redução da frequência é determinada usando análise de citometria de fluxo de marcadores da superfície de células do tumor que se sabe que enriquecem quanto a células iniciadoras de tumor ou detecção imunohistoquímica de marcadores da superfície de células do tumor que se sabe que enriquecem quanto a células iniciadoras de tumor. 70. Um método de sensibilização de um tumor em um sujeito para tratamento com um agente anticâncer compreendendo a etapa de administração de um modulador de SEZ6 ao referido sujeito. 71. O método de acordo com a reivindicação 70, em que o referido modulador de SEZ6 compreende um anticorpo. 72. O método de acordo com a reivindicação 70, em que o referido tumor é um tumor sólido. 73. O método de acordo com a reivindicação 70, em que o referido agente anticâncer compreende um agente quimioterapêutico. 74. O método de acordo com a reivindicação 70, em que o referido agente anticâncer compreende um agente imunoterapêutico. 75. Um método de diagnóstico de um distúrbio proliferativo em um sujeito com sua necessidade compreendendo as etapas de: i . obter uma amostra de tecido do referido sujeito; ii .contatar a amostra de tecido com pelo menos um modulador de SEZ6; e iii .detectar ou quantificar o modulador de SEZ6 associado à amostra. 76. O método de acordo com a reivindicação 75, em que o referido modulador de SEZ6 compreende um anticorpo monoclonal. 77. O método de acordo com a reivindicação 76 em que o anticorpo monoclonal é operavelmente associado com um repórter. 78. Um artigo de fabricação útil para diagnóstico ou tratamento de distúrbios associados a SEZ6 compreendendo um receptáculo compreendendo um modulador de SEZ6 e materiais didáticos para uso do referido modulador de SEZ6 para tratar ou diagnosticar o distúrbio associado a SEZ6. 79. O artigo de fabricação de acordo com a reivindicação 78, em que o referido modulador de SEZ6 é um anticorpo monoclonal. 80. O artigo de fabricação de acordo com a reivindicação 78, em que o receptáculo compreende uma placa legível. 81. Um método de tratamento de um sujeito sofrendo de um distúrbio neoplásico compreendendo a etapa de administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um modulador de SEZ6 internalizante. 82. O método de acordo com a reivindicação 81, em que o referido modulador de SEZ6 compreende um anticorpo. 83. O método de acordo com a reivindicação 82, em que o referido anticorpo compreende um anticorpo monoclonal. 84. O método de acordo com a reivindicação 83, em que o referido anticorpo monoclonal compreende um anticorpo humanizado. 85. O método de acordo com a reivindicação 83, em que o referido anticorpo monoclonal compreende ainda um agente citotóxico. 86. O método de acordo com a reivindicação 81 compreendendo ainda a etapa de administrar um agente anticâncer. 87. O método de acordo com a reivindicação 81 em que o distúrbio neoplásico compreende um tumor exibindo características neuroendócrinas. 88. O método de acordo com a reivindicação 81 em que o distúrbio neoplásico compreende um tumor exibindo características neurais. 89. O método de acordo com a reivindicação 81 em que o distúrbio neoplásico compreende câncer do pulmão. 90. O método de acordo com a reivindicação 81 em que o distúrbio neoplásico compreende câncer de pulmão de células pequenas. 91. Um método de tratamento de um sujeito sofrendo de um distúrbio neoplásico compreendendo a etapa de administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um modulador de SEZ6 neutralizante. 92. O método de acordo com a reivindicação 91, em que o referido modulador de SEZ6 compreende um anticorpo. 93. O método de acordo com a reivindicação 92, em que o referido anticorpo compreende um anticorpo monoclonal. 94. O método de acordo com a reivindicação 93, em que o referido anticorpo monoclonal compreende um anticorpo humanizado. 95. O método de acordo com a reivindicação 94, em que o referido anticorpo humanizado compreende ainda um agente citotóxico. 96. O método de acordo com a reivindicação 91 compreendendo ainda a etapa de administrar um agente anticâncer. 97. O método de acordo com a reivindicação 91 em que o distúrbio neoplásico compreende um tumor exibindo características neurais. 98. O método de acordo com a reivindicação 91 em que o distúrbio neoplásico compreende um tumor exibindo características neuroendócrinas. 99. O método de acordo com a reivindicação 91 em que o distúrbio neoplásico compreende câncer do pulmão. 100. O método de acordo com a reivindicação 99 em que o distúrbio neoplásico compreende câncer de pulmão de células pequenas. 101. Um método de identificação, isolamento, secionamento ou enriquecimento de uma população de células iniciadoras de tumor compreendendo a etapa de contato das referidas células iniciadoras de tumor com um modulador de SEZ6. 102. O método de acordo com a reivindicação 101, em que o referido modulador de SEZ6 compreende um anticorpo. 103. Um modulador de SEZ6 compreendendo um anticorpo humanizado em que o referido anticorpo humanizado compreende uma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada em que a referida região variável da cadeia leve compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de identidade com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190 e SEQ ID NO: 192 em que a referida região variável da cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de identidade com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em sequências de aminoácidos selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198 e SEQ ID NO: 199. 104. Um método de inibição ou prevenção de metastização em um sujeito em sua necessidade compreendendo a etapa de administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um modulador de SEZ6. 105. O método de acordo com a reivindicação 104 em que o sujeito é submetido a um procedimento de pré-compactação antes ou depois da administração do modulador de SEZ6. 106. O método de acordo com a reivindicação 105 em que o referido procedimento de pré-compactação compreende a administração de pelo menos um agente anticâncer. 107. Um método de realizar terapia de manutenção em um sujeito em sua necessidade compreendendo a etapa de administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um modulador de SEZ6. 108. O método de acordo com a reivindicação 107 em que o referido sujeito é tratado por um distúrbio neoplásico antes da administração do modulador de SEZ6. 109. Um método de esgotar células iniciadoras de tumor em um sujeito que sofre de um distúrbio proliferativo compreendendo a etapa de administração de um modulador de SEZ6. 110. Um método de diagnóstico, detecção ou monitorização de um distúrbio associado a SEZ6 in vivo em um sujeito com sua necessidade compreendendo a etapa de administração de um modulador de SEZ6. 111. Um método de diagnóstico, detecção ou monitorização de um distúrbio associado a SEZ6 em um sujeito com sua necessidade compreendendo a etapa de contatar células de tumor circulantes com um modulador de SEZ6. 112. O método de acordo com a reivindicação 111 em que a referida etapa de contato é realizado in vivo. 113. O método de acordo com a reivindicação 111 em que a referida etapa de contato ocorre in vitro. 114. Um método de tratamento de um tumor exibindo características neuroendócrinas em um sujeito em sua necessidade compreendendo a etapa de administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um modulador de SEZ6. 115. O método de acordo com a reivindicação 114 em que o referido tumor exibindo características neuroendócrinas é um tumor neuroendócrino. 116. Um modulador de SEZ6 derivado de um anticorpo selecionado do grupo consistindo em SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10, SC17.11, SC17.14, SC17.15, SC17.16, SC17.17, SC17.18, SC17.19, SC17.22, SC17.24, SC17.27, SC17.28, SC17.29, SC17.30, SC17.32, SC17.34, SC17.35, SC17.36, SC17.38, SC17.39, SC17.40, SC17.41, SC17.42, SC17.45, SC17.46, SC17.47, SC17.49, SC17.50, SC17.53, SC17.54, SC17.56, SC17.57, SC17.59, SC17.61, SC17.63, SC17.71, SC17.72, SC17.74, SC17.76, SC17.77, SC17.79, SC17.81, SC17.82, SC17.84, SC17.85, SC17.87, SC17.89, SC17.90, SC17.91, SC17.93, SC17.95, SC17.97, SC17.99, SC17.102, SC17.114, SC17.115, SC17.120, SC17121, SC17.122, SC17.140, SC17.151, SC17.156, SC17.161, SC17.166, SC17.187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 e SC17.200. 117. Um modulador de SEZ6 isolado que se liga a um epítopo associado ao domínio Sushi 1 de SEZ6. 118. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 117, em que o modulador de SEZ6 compreende um anticorpo ou seu fragmento imunorreativo. 119. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 118, em que o referido anticorpo ou seu fragmento imunorreativo compreende um anticorpo monoclonal. 120. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 119, em que o referido modulador de SEZ6 compreende um ADC. 121. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 120, em que o referido ADC compreende uma pirrolobenzodiazepina. 122. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 121 compreendendo adicionalmente um ligante. 123. Um modulador de SEZ6 isolado que se liga a um epítopo associado ao domínio Sushi 2 de SEZ6. 124. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 123, em que o modulador de SEZ6 compreende um anticorpo ou seu fragmento imunorreativo. 125. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 124, em que o referido anticorpo ou seu fragmento imunorreativo compreende um anticorpo monoclonal. 126. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 125, em que o referido modulador de SEZ6 compreende um ADC. 127. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 126, em que o referido ADC compreende uma pirrolobenzodiazepina. 128. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 127 compreendendo adicionalmente um ligante. 129. Um modulador de SEZ6 isolado que se liga a um epítopo associado ao domínio Sushi 3 de SEZ6. 130. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 129, em que o modulador de SEZ6 compreende um anticorpo ou seu fragmento imunorreativo. 131. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 130, em que o referido anticorpo ou seu fragmento imunorreativo compreende um anticorpo monoclonal. 132. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 131, em que o referido modulador de SEZ6 compreende um ADC. 133. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 132, em que o referido ADC compreende uma pirrolobenzodiazepina. 134. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 133 compreendendo adicionalmente um ligante. 135. Um modulador de SEZ6 isolado que se liga a um epítopo associado ao domínio Sushi 4 de SEZ6. 136. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 135, em que o modulador de SEZ6 compreende um anticorpo ou seu fragmento imunorreativo. 137. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 136, em que o referido anticorpo ou seu fragmento imunorreativo compreende um anticorpo monoclonal. 138. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 137, em que o referido modulador de SEZ6 compreende um ADC. 139. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 138, em que o referido ADC compreende uma pirrolobenzodiazepina. 140. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 139 compreendendo adicionalmente um ligante. 141. Um modulador de SEZ6 isolado que se liga a um epítopo associado ao domínio Sushi 5 de SEZ6. 142. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 141, em que o modulador de SEZ6 compreende um anticorpo ou seu fragmento imunorreativo. 143. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 142, em que o referido anticorpo ou seu fragmento imunorreativo compreende um anticorpo monoclonal. 144. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 143, em que o referido modulador de SEZ6 compreende um ADC. 145. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 144, em que o referido ADC compreende uma pirrolobenzodiazepina. 146. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 145 compreendendo adicionalmente um ligante. 147. Um modulador de SEZ6 isolado que se liga a um epítopo associado ao domínio CUB 1 de SEZ6. 148. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 147, em que o modulador de SEZ6 compreende um anticorpo ou seu fragmento imunorreativo. 149. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 148, em que o referido anticorpo ou seu fragmento imunorreativo compreende um anticorpo monoclonal. 150. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 149, em que o referido modulador de SEZ6 compreende um ADC. 151. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 150, em que o referido ADC compreende uma pirrolobenzodiazepina. 152. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 151 compreendendo adicionalmente um ligante. 153. Um modulador de SEZ6 isolado que se liga a um epítopo associado ao domínio CUB 2 de SEZ6. 154. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 153, em que o modulador de SEZ6 compreende um anticorpo ou seu fragmento imunorreativo. 155. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 154, em que o referido anticorpo ou seu fragmento imunorreativo compreende um anticorpo monoclonal. 156. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 155, em que o referido modulador de SEZ6 compreende um ADC. 157. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 156, em que o referido ADC compreende uma pirrolobenzodiazepina. 158. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 157 compreendendo adicionalmente um ligante. 159. Um modulador de SEZ6 isolado que se liga a um epítopo associado ao domínio N-terminal de SEZ6. 160. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 159, em que o modulador de SEZ6 compreende um anticorpo ou seu fragmento imunorreativo. 161. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 160, em que o referido anticorpo ou seu fragmento imunorreativo compreende um anticorpo monoclonal. 162. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 161, em que o referido modulador de SEZ6 compreende um ADC. 163. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 162, em que o referido ADC compreende uma pirrolobenzodiazepina. 164. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 163 compreendendo adicionalmente um ligante. 165. Um modulador de SEZ6 isolado residindo em um conjugado selecionado do grupo consistindo em conjugado A, conjugado B, conjugado C, conjugado D, conjugado E, conjugado F e conjugado U. 166. Um modulador de SEZ6 isolado residindo em um conjugado definido por um anticorpo de referência selecionado do grupo consistindo em SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10, SC17.11, SC17.14, SC17.15, SC17.16, SC17.17, SC17.18, SC17.19, SC17.22, SC17.24, SC17.27, SC17.28, SC17.29, SC17.30, SC17.32, SC17.34, SC17.35, SC17.36, SC17.38, SC17.39, SC17.40, SC17.41, SC17.42, SC17.45, SC17.46, SC17.47, SC17.49, SC17.50, SC17.53, SC17.54, SC17.56, SC17.57, SC17.59, SC17.61, SC17.63, SC17.71, SC17.72, SC17.74, SC17.76, SC17.77, SC17.79, SC17.81, SC17.82, SC17.84, SC17.85, SC17.87, SC17.89, SC17.90, 167. Um conjugado anticorpo-fármaco da fórmula M-[L-D]n ou um seu sal farmaceuticamente aceitável em que: M compreende um modulador de SEZ6; L compreende um ligante; D é um agente antiproliferativo; e n é um inteiro de cerca de 1 a cerca de 20. 168. O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 167, em que o referido modulador de SEZ6 compreende um anticorpo ou seu fragmento imunorreativo. 169. O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 168, em que o referido anticorpo compreende um anticorpo monoclonal. 170. O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 169 em que o referido anticorpo é derivado de um anticorpo selecionado do grupo consistindo em SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10, SC17.11, SC17.14, SC17.15, SC17.16, SC17.17, SC17.18, SC17.19, SC17.22, SC17.24, SC17.27, SC17.28, SC17.29, SC17.30, SC17.32, SC17.34, SC17.35, SC17.36, SC17.38, SC17.39, SC17.40, SC17.41, SC17.42, SC17.45, SC17.46, SC17.47, SC17.49, SC17.50, SC17.53, SC17.54, SC17.56, SC17.57, SC17.59, SC17.61, SC17.63, SC17.71, SC17.72, SC17.74, SC17.76, SC17.77, SC17.79, SC17.81, SC17.82, SC17.84, SC17.85, SC17.87, SC17.89, SC17.90, SC17.91, SC17.93, SC17.95, SC17.97, SC17.99, SC17.102, SC17.114, SC17.115, SC17.120, SC17.121, SC17.122, SC17.140, SC17.151, SC17.156, SC17.161, SC17.166, SC17.187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 e SC17.200. 171. O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 169, em que o referido anticorpo está humanizado. 172. O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 167, em que o ligante compreende um ligante clivável. 173. O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 172 em que o referido ligante clivável compreende um ligante de peptidila. 174. O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 167, em que o referido agente antiproliferativo compreende um agente citotóxico. 175. O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 174, em que o referido agente citotóxico compreende uma pirrolobenzodiazepina. 176. O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 175 em que a referida pirrolobenzodiazepina compreende um dímero de pirrolobenzodiazepina. 177. Um modulador de SEZ6 isolado residindo em um conjugado selecionado do grupo consistindo em conjugado A, conjugado B, conjugado C, conjugado D, conjugado E, conjugado F e conjugado U. 178. Um modulador de SEZ6 isolado residindo em um conjugado definido por um anticorpo de referência selecionado do grupo consistindo em SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10, SC17.11, SC17.14, SC17.15, SC17.16, SC17.17, SC17.18, SC17.19, SC17.22, SC17.24, SC17.27, SC17.28, SC17.29, SC17.30, SC17.32, SC17.34, SC17.35, SC17.36, SC17.38, SC17.39, SC17.40, SC17.41, SC17.42, SC17.45, SC17.46, SC17.47, SC17.49, SC17.50, SC17.53, SC17.54, SC17.56, SC17.57, SC17.59, SC17.61, SC17.63, SC17.71, SC17.72, SC17.74, SC17.76, SC17.77, SC17.79, SC17.81, SC17.82, SC17.84, SC17.85, SC17.87, SC17.89, SC17.90, 179. Um conjugado anticorpo-fármaco da fórmula: M-[L-D]n ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que a) M compreende um modulador de SEZ6; b) L compreende um ligante opcional; c) D é um agente citotóxico selecionado do grupo consistindo em auristatinas, maitansinoides, amanitinas e dímeros de pirrolobenzodiazepina. d) n é um inteiro de cerca de 1 a cerca de 20. 180. O conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 179, em que o referido modulador de SEZ6 compreende um anticorpo ou seu fragmento imunorreativo. 181. O conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 180, em que o referido anticorpo compreende um anticorpo monoclonal. 182. O conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 181 em que o referido anticorpo é derivado de um anticorpo selecionado do grupo consistindo em SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10, SC17.11, SC17.14, SC17.15, SC17.16, SC17.17, SC17.18, SC17.19, SC17.22, SC17.24, SC17.27, SC17.28, SC17.29, SC17.30, SC17.32, SC17.34, SC17.35, SC17.36, SC17.38, SC17.39, SC17.40, SC17.41, SC17.42, SC17.45, SC17.46, SC17.47, SC17.49, SC17.50, SC17.53, SC17.54, SC17.56, SC17.57, SC17.59, SC17.61, SC17.63, SC17.71, SC17.72, SC17.74, SC17.76, SC17.77, SC17.79, SC17.81, SC17.82, SC17.84, SC17.85, SC17.87, SC17.89, SC17.90, SC17.91, SC17.93, SC17.95, SC17.97, SC17.99, SC17.102, SC17.114, SC17.115, SC17.120, SC17.121, SC17.122, SC17.140, SC17.151, SC17.156, SC17.161, SC17.166, SC17.187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 e SC17.200. 183. O conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 182, em que o referido anticorpo está humanizado. 184. O conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 183, em que o ligante compreende um ligante clivável. 185. O conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 184, em que o referido ligante clivável compreende um ligante de peptidila. 186. O conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 185, em que o referido agente antiproliferativo compreende um agente citotóxico. 187. O conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 186, em que o referido agente citotóxico compreende uma pirrolobenzodiazepina. 188. O conjugado anticorpo-fármaco da reivindicação 187, em que a referida pirrolobenzodiazepina compreende um dímero de pirrolobenzodiazepina. 189. Um modulador de SEZ6 compreendendo uma CDR de qualquer um de SEQ ID NOS: 20-203. 190. O modulador de SEZ6 de acordo com a reivindicação 189, em que o referido modulador compreende uma pluralidade de CDRs de qualquer um de SEQ ID NOS: 20-203. 191. Um modulador de anticorpo de SEZ6 que compete pela ligação a uma proteína SEZ6 com um anticorpo de referência selecionado do grupo consistindo em SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10, SC17.11, SC17.14, SC17.15, SC17.16, SC17.17, SC17.18, SC17.19, SC17.22, SC17.24, SC17.27, SC17.28, SC17.29, SC17.30, SC17.32, SC17.34, SC17.35, SC17.36, SC17.38, SC17.39, SC17.40, SC17.41, SC17.42, SC17.45, SC17.46, SC17.47, SC17.49, SC17.50, SC17.53, SC17.54, SC17.56, SC17.57, SC17.59, SC17.61, SC17.63, SC17.71, SC17.72, SC17.74, SC17.76, SC17.77, SC17.79, SC17.81, SC17.82, SC17.84, SC17.85, SC17.87, SC17.89, SC17.90, SC17.91, SC17.93, SC17.95, SC17.97, SC17.99, SC17.102, SC17.114, SC17.115, SC17.120, SC17.121, SC17.122, SC17.140, SC17.151, SC17.156, SC17.161, SC17.166, SC17.187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 e SC17.200 em que a ligação do modulador de anticorpo de SEZ6 à proteína SEZ6 é inibida em pelo menos 30%. 192. Um modulador de SEZ6 que se liga a um epítopo da proteína SEZ6 compreendendo os aminoácidos Q12, P14, I16, E17 e E18 (SEQ ID NO: 401). 193. Um modulador de SEZ6 que se liga a um epítopo da proteína SEZ6 compreendendo os aminoácidos L73, P74, F75, Q76, P77, D78 e P79 (SEQ ID NO: 402). 194. Um método de tratamento de um sujeito sofrendo de um distúrbio proliferativo compreendendo a etapa de administração de um modulador de SEZ6 que se liga a um epítopo contido em um domínio SEZ6 selecionado do grupo consistindo no domínio N- terminal, do domínio Sushi 1, do domínio Cub 1, do domínio Sushi 2, do domínio Cub 2, do domínio Sushi 3, do domínio Sushi 4 e do domínio Sushi 5. 195. Um modulador de SEZ6 de anticorpos humanizado selecionado do grupo consistindo em hSC17.16, hSC17.17, hSC17.24, hSC17.28, SC17.34, hSC17.46, SC17.151, SC17.155, SC17.156, SC17.161 e SC17.200.

Exemplos

[00533] A presente invenção, assim geralmente descrita acima, será entendida mais prontamente por referência aos seguintes exemplos, que são proporcionados a título de ilustração e não se destinam a ser limitantes da presente invenção. Os exemplos não se destinam a representar que as experiências em baixo são todas as ou as únicas experiências realizadas. A não ser que indicado que outro modo, as partes são partes por peso, o peso molecular é peso molecular médio ponderal, a temperatura é em graus Centígrados, e a pressão é a ou próxima da atmosférica.

Exemplo 1 Identificação de Tumores possuindo Características Neuroendócrinas e Análise de Expressão de Marcador usando Sequenciamento de Transcriptoma Inteiro

[00534] Os tumores neuroendócrinos (NETs) surgindo no sistema endócrino disperso são raros, com uma incidência de 2-5 por 100.000 pessoas, mas altamente agressivos. Os tumores neuroendócrinos ocorrem na glândula adrenal, rim, trato genitourinário (bexiga, próstata, ovários, colo do útero, e endométrio), pâncreas, trato gastrointestinal (estômago e cólon), tiroide (câncer da tiroide medular), e pulmão (carcinoma das células pequenas do pulmão, carcinoma neuroendócrino das células grandes, e carcinoide). Estes tumores podem secretar vários hormônios incluindo serotonina e/ou cromogranina A que podem causar sintomas debilitantes conhecidos como síndrome carcinoide. Tais tumores podem ser denotados por marcadores imunohistoquímicos positivos tais como enolase específica dos neurônios (NSE, também conhecida como enolase gama, símbolo do gene = ENO2), CD56/NCAM1, e sinaptofisina. As quimioterapias tradicionais não têm sido bem-sucedidas no tratamento de NETs, e mortalidade devido a disseminação metastática é um resultado comum. Infelizmente, na maioria dos casos, a cirurgia é o único potencial tratamento curativo, contanto que tenha lugar após detecção precoce e antes da metastização do tumor. Em este contexto, foi realizado trabalho para identificar novos alvos terapêuticos associados a tumores compreendendo características neuroendócrinas.

[00535] Para identificar e caracterizar tais tumores, pois eles existem em pacientes com câncer, foi desenvolvido e mantido um grande banco de tumores de xenoenxerto não tradicional (NTX) usando técnicas reconhecidas pela técnica. O banco de tumores NTX, compreendendo um número substancial de linhas de células de tumor discretas, foi propagado em camundongos imunocomprometidos através de múltiplas passagens de células de tumor heterogêneas originalmente obtidas de numerosos pacientes com câncer afligidos por uma variedade de malignidades de tumor sólido. (Note que, em alguns dos Exemplos e FIGS. aqui, o número de passagem da amostra testada é indicado por p0-pNo. anexado à designação da amostra onde p0 é indicativo de uma amostra não passada obtida diretamente do tumor de um paciente e pNo. é indicativo do número de vezes que o tumor foi passado através de um camundongo antes de teste.) A disponibilidade continuada de um grande número de linhas de células de tumor NTX de passagem precoce discretas tendo linhagens bem definidas facilita a identificação e caracterização de células purificadas a partir das linhas de células. Em tal trabalho, o uso de linhas de células NTX minimamente passadas simplifica a experimentação in vivo e proporciona resultados prontamente verificáveis. Além do mais, tumores NTX de passagem precoce respondem a agentes terapêuticos tais como irinotecano (i.e., Camptosar®) e regimes de Cisplatina/Etoposídeo, o que proporciona conhecimentos clinicamente relevantes sobre os mecanismos subjacentes dirigindo o crescimento do tumor, resistência a terapias correntes e recorrência do tumor.

[00536] À medida que as linhas de células de tumor NTX foram estabelecidas, seu fenótipo foi caracterizado de várias maneiras para examinar a expressão de genes global. Para identificar que linhas de NTX no banco poderiam ser NETs, foram gerados perfis da expressão de genes por sequenciação do transcriptoma inteiro e/ou análise de microdisposição. Especificamente, os dados foram examinados para identificar tumores expressando elevados níveis de genes específicos que se sabe que são elevados em NETs ou usados como marcadores histoquímicos da diferenciação neuroendócrina (p.ex., ASCL1, NCAM1, CHGA) bem como tumores com mudanças em genes da via NOTCH indicativos da supressão da sinalização NOTCH (p.ex., níveis reduzidos de receptores NOTCH, e mudanças em ligandos e moléculas efetoras).

[00537] Mais particularmente, após estabelecimento de várias linhas de células de tumores NTX como é comummente feito para tumores humanos em camundongos gravemente imunocomprometidos, os tumores foram ressecados após alcançarem 800 - 2.000 mm3 e as células foram dispersas em suspensão usando técnicas de digestão enzimática reconhecidas pela técnica (ver, por exemplo, U.S.P.N. 2007/0292414, que é incorporada aqui). As preparações de células dissociadas destas linhas NTX foram depois esgotadas em células de murino, e as subpopulações de células de tumor humano foram depois adicionalmente isoladas por separação de células ativada por fluorescência e lisadas em tampão de lise de RNA RLTplus (Qiagen). Estes lisatos foram depois armazenados a -80°C até usados. Após descongelamento, o RNA total foi extraído usando um conjunto de isolamento RNeasy (Qiagen) seguindo as instruções do vendedor em um espectrofotômero Nanodrop (Thermo Scientific) e um Bioanalisador 2100 (Agilent Technologies) novamente usando os protocolos do fabricante e definições do instrumento recomendadas. As preparações de RNA total resultantes estavam adequadas para sequenciação genética e análise da expressão de genes.

[00538] Foi realizada sequenciação do transcriptoma inteiro usando uma SOLiD (Sequenciação por Ligação/Detecção de Oligo) 4.5 da Applied Biosystems (ABI) ou sistema de sequenciação SOLiD 5500xl de próxima geração (Life Technologies) em amostras de RNA de linhas NTX. cDNA foi gerado de amostras de RNA total usando ou um protocolo de transcriptoma inteiro (WT) modificado da ABI desenhado para RNA total de baixa entrada ou Sistema Ovation RNA-Seq V2™ (NuGEN Technologies Inc.). O protocolo de WT de baixa entrada modificado usa 1,0 ng de RNA total para amplificar mRNA na extremidade 3' o que leva a um viés 3' pesado da expressão de genes mapeada, enquanto o sistema da NuGen permite uma amplificação mais consistente ao longo do transcripto, e inclui amplificação de mRNA e cDNA do transcripto não poliadenilado usando hexâmeros aleatórios. A biblioteca de cDNA foi fragmentada, e foram adicionados adaptadores de códigos de barras para permitir agrupamento de bibliotecas de fragmentos de diferentes amostras.

[00539] As plataformas de sequenciação SOLiD 4.5 da ABI e SOLiD 5500xl de próxima geração permitem sequenciação paralela de transcriptomas de múltiplas linhas NTX e populações separadas. Uma biblioteca de cDNA é construída a partir de cada amostra de RNA, que é fragmentada e marcada com código de barras. Os códigos de barra em cada biblioteca de fragmentos permitem que múltiplas amostras sejam agrupadas em concentrações iguais e processadas em conjunto enquanto se assegura a especificidade da amostra. As amostras são tiradas através de PCR em emulsão usando sistema robótico SOLiD™ EZ Bead™ da ABI, que assegura a consistência das amostras. A sequenciação com extremidade de pares gera uma leitura de 50 bases na direção 5' para 3' e uma leitura de 25 bases na direção 3' para 5' para cada fragmento clonalmente amplificado em uma única esférula que existe no agrupamento. No caso da plataforma 5500xI, para cada conjunto de 8 amostras agrupadas no método mencionado acima, as esférulas são uniformemente depositadas em 6 linhas de canal único em um único chip. Isto irá, em média, gerar mais do que 50 milhões de leituras de 50 bases e 50 milhões de leituras de 25 bases para cada uma das 8 amostras e gera uma representação muito precisa do nível de transcripto de mRNA nas células de tumor. Os dados gerados pela plataforma SOLiD mapearam 34.609 como anotado por RefSeq versão 47 usando NCBI versão hg19.2 do genoma humano publicado e proporcionaram mediações verificáveis de níveis de RNA na maioria das amostras.

[00540] A plataforma SOLiD é capaz de capturar não só a expressão, mas SNPs, eventos de splicing alternativo conhecidos e desconhecidos, pequenos RNAs não codificantes, e descobertas de éxons potencialmente novos com base somente na abrangência da leitura (as leituras mapeadas unicamente em localizações genômicas previamente não anotadas). Assim, o uso desta plataforma de sequenciação de próxima geração emparelhada com análise de dados proprietários e software de visualização permitiu assim a descoberta de expressão de transcripto diferencial bem como diferenças e/ou preferências para variantes de splice específicas de transcriptos de mRNA expressos. Os dados da sequenciação da plataforma SOLiD são nominalmente representados como um valor de expressão de transcripto usando as métricas RPM (leituras por milhão) e RPKM (leituras por quilobase por milhão), permitindo análise de expressão diferencial como é prática padrão.

[00541] A sequenciação de transcriptoma inteiro de quatro tumores de câncer de pulmão de células pequenas (SCLC) (LU73, LU64, LU86 e LU95), um tumor dos ovários (OV26) e um carcinoma neuroendócrino de células grandes (LCNEC; LU37) resultou na determinação de padrões de expressão de genes comummente encontrados em NETs (FIG. 6A). Mais especificamente, estes tumores tinham elevada expressão de marcadores de NET (ASCL1, NCAM1, CHGA) bem como níveis reduzidos de receptores Notch e moléculas efetoras (p.ex., HES1, HEY1) e marcadores elevados de supressão Notch (p.ex., DLL3 e HES6). Em contraste, 4 amostras de pulmão normal, 3 tumores de adenocarcinoma do pulmão (LU137, LU146 e LU153), e 3 carcinomas das células escamosas do pulmão (LU49, LU70 e LU76) têm todos expressão de vários receptores Notch e moléculas efetoras, e não mostram expressão elevada de supressores Notch tais como HES6 e DLL3.

[00542] Além disso, como visto na FIG. 6B, uma análise dos dados do transcriptoma inteiro comparando amostras de tecido normal com várias populações de pulmão NTX possuindo características neuroendócrinas, mostrou que SEZ6 foi aumentado ao nível do transcripto mRNA em quatro populações de câncer do pulmão possuindo características neuroendócrinas (LU73, LU64, LU86 e LU95) em comparação com expressão de transcripto extremamente baixa ou inexistente nos tecidos normais testados. Esses resultados sugerem que SEZ6 pode desempenhar um papel importante na tumorigênese e manutenção de cânceres particulares (incluindo cânceres do pulmão com características neuroendócrinas). Nessa base, SEZ6 foi selecionado para posterior análise como um potencial alvo imunoterapêutico.

Exemplo 2 Análise de Microdisposição e RT-PCR da Expressão de Genes em Tumores NTX Selecionados com Características Neuroendócrinas

[00543] Em um esforço de identificar NETs adicionais no banco de NTX acima mencionado para além daqueles para os quais existiam dados do transcriptoma inteiro por SOLiD, foi examinado um conjunto maior de linhas de NTX usando análise de microdisposições. Especificamente, 2-6 μg de amostras de RNA total derivadas de tumores inteiros em 46 linhas de NTX ou de 2 tecidos normais foram analisados usando plataforma de microdisposição OneArray® (Phalanx Biotech Group), que contém 29.187 sondas desenhadas contra 19.380 genes no genoma humano. Mais especificamente, as amostras de RNA foram obtidas (como descrito no Exemplo 1) de tumores NTX derivados de quarenta e seis pacientes compreendendo cânceres colorretal (CR), melanoma (SK), do rim (KD), do pulmão (LU), dos ovários (OV), do endométrio (EM), da mama (BR), do fígado (LIV), ou pancreático (PA). Tecidos colorretais normais (NormCR) e do pâncreas normal (NormPA) foram usados como controles. Ainda mais especificamente, os tumores do pulmão foram adicionalmente subclassificados como cânceres das células pequenas do pulmão (SCLC), cânceres das células escamosas (SCC), ou carcinoma neuroendócrino das células grandes (LCNEC). As amostras de RNA foram processadas em triplicado usando os protocolos do fabricante e os dados resultantes foram analisados usando práticas da indústria padrão para normalização e transformação dos valores de intensidade medidos obtidos para o gene objeto em cada amostra. Um algoritmo de aglomeramento hierárquico Pearson Spearman imparcial na suíte de pacotes R/BioConductor chamada hclust.2 foi usado para criar um dendrograma de microdisposições padrão para estas 48 amostras. Como conhecido na técnica, R/BioConductor é uma linguagem de programação estatística, de fonte aberta amplamente usada no mundo acadêmico, finanças e na indústria farmacêutica para análise de dados. Geralmente, os tumores foram dispostos e aglomerados com base nos padrões da expressão de genes, intensidade da expressão, etc..

[00544] Como mostrado na FIG. 7A, o dendrograma derivado das 48 amostras e ao longo de todos os 19380 genes aglomerou linhas de NTX em conjunto com base no seu tipo de tumor ou tecido de origem. Vários tumores tipicamente associados a fenótipos neuroendócrinos se aglomeraram em conjunto no ramo denotado por (1); estes incluíram cânceres da pele, numerosos cânceres do pulmão e outros NETs. Interessantemente, um subramo, denotado por (2), mostrou que dois cânceres das células grandes do pulmão com características neuroendócrinas (LU50.LCNEC e LU37.LCNEC) e um câncer de pulmão de células pequenas (LU102.SCLC) se aglomeraram com um tumor dos ovários (OV26) e do rim (KD66) (aglomerado C) sugerindo que estes últimos tumores possuíam também fenótipos neuroendócrinos. Além do mais, a FIG. 7A mostra o aglomerado D que consiste em 3 tumores SCLC adicionais, e à sua direita está um pequeno aglomerado (aglomerado E) contendo um tumor SCLC adicional (LU100) e um tumor neuroendócrino endometrial (EM6). Todos os tumores nos aglomerados D e E são geralmente entendidos como possuindo algumas características neuroendócrinas com base na literatura acadêmica e experiência de patologia na clínica. O fato de que o aglomerado G, compreendendo SCC, pode ser encontrado em um ramo completamente diferente do dendrograma da FIG. 7A indica que o aglomeramento não é dirigido exclusivamente pelo órgão de origem do tumor.

[00545] Uma inspeção mais próxima de uma coleção de marcadores de genes associados a NETs (FIG. 7B) mostra que eles são fortemente expressos em tumores compreendendo os aglomerados C e D, embora sejam minimamente expressos em tumores no Aglomerado G (carcinoma das células escamosas do pulmão), sugerindo que os aglomerados C e D representam NETs ou tumores com um fenótipo neuroendócrino. Mais especificamente, os NETs do aglomerado C expressam altamente ASCL1, CALCA, CHGA, SST e NKX2-1, enquanto os NETs do aglomerado D expressam altamente CHGA, ENO2, e NCAM1, e é a expressão destes genes do fenótipo neuroendócrino que é em parte responsável pelo aglomeramento destes tumores. Uma característica interessante é a expressão forte de KIT no aglomerado D, um gene ocasionalmente alegado como estando associado a tumores neuroendócrinos, mas claramente ligado a oncogênese em outros contextos. Isto está em contraste com os tumores SCC no aglomerado G que não têm expressão forte de qualquer um destes genes (FIG. 7B).

[00546] Os tumores no aglomerado C mostram um fenótipo consistente com uma redução na sinalização Notch: uma falta de expressão de qualquer receptor Notch, uma falta relativa de expressão de JAG1 e HES1, e níveis fortes de expressão de ASCL1 (FIG. 7C). Interessantemente, o aglomerado D mostra elevada expressão de HES6, um fator de transcrição que pode apoiar a atividade de ASCL1 por antagonismo da atividade de HES1 através da formação de heterodímeros.

[00547] Tendo em vista os resultados acima mencionados, a expressão de mRNA de HES6 foi examinada a partir de várias linhas de NTX e tecidos normais usando uma Máquina 7900HT da Applied Biosystems (Life Technologies) para realizar RT-PCR quantitativa em tempo real Taqman (qRT-PCR) de acordo com os protocolos do fabricante. O RNA foi isolado como descrito acima e checado para assegurar que a qualidade era adequada para análise da expressão de genes. O RNA de tecidos normais foi comprado (Agilent Technologies e Life Technologies). 200 ng de RNA foram usados para síntese de cDNA usando o conjunto de arquivo de cDNA (Life Technologies). O cDNA foi usado para análise de qRT-PCR em Redes de Baixa Densidade Taqman (TLDA; Life Technologies) que continham o ensaio Taqman de HES6 para medir os níveis de mRNA de HES6.

[00548] Os níveis de mRNA de HES6 são mostrados para cada linha de NTX ou amostra de tecido normal (ponto único no gráfico) após normalização em controles endógenos. Os valores normalizados são representados graficamente em relação à expressão normal nos tecidos normais de preocupação de toxicidade (NormTox). Esta técnica permitiu a identificação e caracterização rápidas de uma variedade de tumores tendo características neuroendócrinas do banco de tumores NTX através da medição de HES6 e outros marcadores relevantes. A FIG. 7D ilustra a sobre-expressão geral de HES6 nos tumores amostrados com características neuroendócrinas (p.ex., LU- SCLC, LU-LCNEC) em comparação com tecidos normais, tumores da mama, do cólon, do fígado, e outros selecionados. Significativamente, estes dados de microdisposições e qPCR mostram que pelo menos alguns tumores do endométrio, rim, e ovários podem exibir características de tumor neuroendócrino (FIGS. 7A e 7D).

[00549] Os dados de microdisposição gerados como acima descrito não apenas mostraram que os tumores nos aglomerados C, D e E exibiam vários marcadores neuroendócrinos, mas também mostraram que os tumores em esses aglomerados expressavam marcadores indicativos de neurogênese, compromisso neural ou diferenciação em relação a destinos neurais (FIG. 7E). De interesse particular, os tumores no Aglomerado D mostram frequentemente uma regulação por cima mais forte e mais consistente de muitos desses marcadores (por exemplo, receptores BEX1 e BEX4, CD56, NRCAM, SEMA, fatores SOX e ZIC) e regulação por cima de hormonas frequentemente reduzida versus outros aglomerados, sugerindo um fenótipo mais neural.

Exemplo 3 Expressão de mRNA de SEZ6 em Tumores Com Características Neuroendócrinas e Neurais

[00550] Foram usadas várias técnicas para identificar tumores exibindo características neuroendócrinas incluindo sequenciação de transcriptoma inteiro (Exemplo 1) e microdisposição e qRT-PCR (Exemplo 2). Os dados assim gerados foram posteriormente analisados para descobrir potenciais alvos terapêuticos que são altamente expressos em tumores neuroendócrinos em comparação com tumores não neuroendócrinos e tecidos normais. Como discutido no Exemplo 1, descobriu-se que SEZ6, uma proteína de transmembrana de passagem única que é fundamentalmente expressa no cérebro normal, tem uma elevada expressão em muitos tumores neuroendócrinos (FIG. 6B).

[00551] Os dados de microdisposição gerados no Exemplo 2 mostraram que tumores localizados nos aglomerados C, D e E expressavam marcadores neuroendócrinos (FIG. 7B) e marcadores neurais (FIG. 7E). Notavelmente, os tumores nesses mesmos aglomerados também mostraram níveis elevados de transcripto de SEZ6, sugerindo que SEZ6 se encontra associado com tumores com características neuroendócrinas e neurais (FIG. 7F). Isto está em linha com o papel conhecido de SEZ6 no desenvolvimento do prosencéfalo pós-natal e expressão continuada nas regiões específicas do hipocampo no adulto. Pensa-se que SEZ6 desempenha um papel importante no reconhecimento e sinalização de células. Muitas vezes, as vias de desenvolvimento são erradamente expressas em tumores.

[00552] De forma a determinar os níveis de expressão de mRNA SEZ6 em várias linhas de tumores NTX de amostra, foi realizado qRT- PCR usando o ensaio Taqman SEZ6 essencialmente como descrito no Exemplo 2 acima, A FIG. 8A mostra a expressão de SEZ6 em relação à expressão média em tecidos normais e normalizada quanto à expressão do gene de controle endógeno ALAS1. A expressão de gene SEZ6 é elevada mais de 10,000,000 vezes em populações de NTX neuroendócrinas versus tecidos normais. Cinco das linhas NTX SCLC mostradas na FIG. 8A são amostras de mRNA extraídas diretamente de biópsias primárias (p0). A expressão de SEZ6 em esses tumores não passados demonstra que a expressão de SEZ6 não é um artefacto que resulta de tumores humanos em crescimento em camundongos. Três subtipos de NSCLC são também representados na FIG. 8A: LU25 é um carcinoma das células fusiformes, LU50 é um carcinoma neuroendócrino das células grandes (LCNEC), e LU85 é um carcinoma das células escamosas (SCC). KDY66 e OV26, um tumor do rim e dos ovários, respectivamente, se aglomeraram na microdisposição com os tumores SCLC e LCNEC (FIG. 7A), sugerindo que também têm características neuroendócrinas.

[00553] Para estender a análise da expressão de SEZ6 a uma rede mais ampla de espécimens de tumor, foi realizada qRT-PCR usando o sistema Fluidigm BioMark™ HD. Resumidamente, 1 ng de RNA, preparado como descrito no Exemplo 1, foi convertido para cDNA usando o conjunto de arquivo de cDNA (Life Technologies). O cDNA foi pré-amplificado usando um ensaio Taqman específico para SEZ6 e foi então usado para realizar qRT-PCR. A expressão em tecido normais (NormTox ou Norm) foi comparada com expressão nas seguintes linhas NTX, em que o número entre parênteses indica o número de linhas NTX únicas testadas: BR (5), CR (6), KDY (9), OV (16), PA (9), adenocarcinoma do pulmão (LU-Adeno) (7), LCNEC (2), SCC (11) e SCLC (15) (FIG. 8B). SCLC e LCNEC NTX apresentam a expressão mais elevada de SEZ6, apesar de também ter sido vista alguma expressão de SEZ6 em linhas NTX OV, PA, CR e LU-Adeno em comparação com amostras de tecido normal.

[00554] "NormTox" representa as seguintes amostras de tecido normal: duas de cólon, duas de rim duas de fígado, duas de pulmão, duas de pâncreas, duas do coração, uma do esófago, uma do músculo esquelético, uma de pele, uma do intestino delgado, uma do baço, uma do estômago e uma amostra da traqueia. Outro conjunto de tecidos normais designado "Norm" representa as seguintes amostras de tecido normal: cérebro, mama, colo do útero, ovários, células mononucleares do sangue periférico, placenta, próstata, timo e tiroide. A maior parte dos tecidos normais não tem expressão de SEZ6, ao passo que se pode ver uma fraca expressão no pâncreas, cólon, fígado e pulmão e uma expressão elevada no cérebro. Um diferente ensaio Taqman específico para SEZ6, usando essencialmente o mesmo método acima, foi realizado em várias linhas de tumores NTX. O número de linhas de tumores que foram testadas para cada tipo de tumor é denotado como o denominador, enquanto o número de tumores que expressaram SEZ6 é denotado como o numerador: 1/5 CR, 2/2 GA, 1/1 GB (glioblastoma), 1/1 KDY, 2/6 SK, 2/4 LU-Adeno, 2/2 LCNEC, 3/10 LU-SCC, 10/10 SCLC e 1/2 OV (dados não apresentados).

[00555] Em conjunto, esses dados sugerem que SEZ6 é regulado por cima em tumores exibindo características neuroendócrinas e neurais sugerindo que poderá servir como alvo terapêutico para o tratamento desse tipo de tumores.

Exemplo 4 Expressão de mRNA de SEZ6 em Vários Espécimens de Tecido de Tumores e Tecido Normal usando qRT-PCR

[00556] Para estender a análise da expressão de SEZ6 a uma rede mais ampla de espécimens de tumor, qRT-PCR Taqman foi realizada substancialmente como descrito nos prévios Exemplos em uma rede de 384 poços de qPCR TissueScan™ (Origene Technologies). Esta rede permite a comparação da expressão de genes ao longo de 18 diferentes tipos de tumores sólidos, com múltiplas amostras derivadas de pacientes para cada tipo de tumor e de tecido adjacente normal.

[00557] A este respeito, as FIGS. 9A e 9B mostram os níveis de expressão de genes absoluta e relativa, respectivamente, de SEZ6 em espécimens de tumor inteiro (pontos cinzentos) ou tecido adjacente normal (NAT; pontos brancos) de pacientes com um dos dezoito tipos de tumores sólidos. Mais especificamente, a FIG. 9A mostra o nível de expressão mRNA de SEZ6 em vários espécimens ou tecido adjacente normal correspondente. A FIG. 9B mostra o nível de expressão de SEZ6 como normalizado contra β-actina e representado graficamente em relação à expressão em tecido adjacente normal para cada tipo de tumor analisado. Aos espécimens nos quais SEZ6 não foi detectado foi atribuído um valor Ct de 50, que representa o último ciclo de amplificação no protocolo experimental. Cada ponto representa um único espécimen de tecido, com o valor médio geométrico representado como uma linha preta.

[00558] Usando esta Rede da Origene, a sobre-expressão de SEZ6 foi vista em um subconjunto de cânceres adrenal, do fígado, do pulmão, dos ovários e pancreático, muitos dos quais podem representar tumores neuroendócrinos ou tumores com fenótipos neuroendócrinos fracamente diferenciados. Como mostrado pela expressão de genes absoluta na FIG. 9A, o testículo normal e o pâncreas são os únicos tecidos normais com elevada expressão de SEZ6. Isso sugere que SEZ6 pode desempenhar um papel na tumorigênese e/ou progressão do tumor em uma ampla variedade de tumores incluindo, mas não se limitando aos que apresentam características neuroendócrinas e neurais.

Exemplo 5 Clonagem e Expressão de Proteínas SEZ6 Recombinantes SEZ6 Humano

[00559] De forma a gerar e desenvolver todos os materiais moleculares e celulares exigidos na presente invenção pertencendo a SEZ6 humano, foi criado cDNA (FIG 3A; SEQ ID NO: 5) codificando a proteína completa SEZ6 humana madura (FIG. 3B, SEQ ID NO: 6) da seguinte forma. Um cDNA comercial de SEZ6 humano foi adquirido à Open Biosystems em que essa sequência de cDNA correspondia ao número de acesso NCBI BC146292. Os alinhamentos de sequência mostraram que a proteína codificada por BC146292 era diferente em vários resíduos da de RefSeq NP_849191 (ver resíduos 414, 415 e 417, FIG. 3C), codificando a proteína SEZ6 humana endógena. Foi usado PCR para separar dois fragmentos de cDNA separados do clone BC146292, em que os iniciadores usados introduziram as alterações desejadas no cDNA nos resíduos 414-417 durante o processo de sobreposição de PCR para criar um cDNA codificando uma proteína SEZ6 madura com sequência idêntica àquela codificada por NM_178860, a sequência mRNA codificando a proteína SEZ6 humana endógena. O clone de cDNA reparado, designado hSCRx17 (FIG. 3A), foi usado para toda a manipulação subsequente de constructos expressando a proteína SEZ6 humana madura ou seus fragmentos.

[00560] De forma a gerar moduladores imunorreativos ou imunoespecíficos para a molécula de SEZ6, foi gerado um gene de fusão quimérico no qual a porção de ECD da proteína SEZ6 humana foi fundida para o domínio IgG2 Fc humano (FIG. 4A, SEQ ID NO: 8). Isso foi feito da seguinte forma: cDNA codificando o ECD de SEZ6 foi amplificado por PCR a partir do clone de cDNA hSCRx17 (FIG. 3A), e esse produto PCR foi subsequentemente subclonado em um vetor de expressão regulado por CMV enquadrado e a jusante de uma sequência de peptídeo de sinal IgK e a montante de um cDNA de IgG2 Fc humano, usando técnicas moleculares padrão. A sequência de cDNA codificando a proteína de fusão hSEZ6-Fc, designada hSCRx17-Fc ORF, é mostrada na FIG. 4A; a sequência de proteína correspondente codificada por hSCRx17-Fc ORF é mostrada na FIG. 4B (SEQ ID NO: 9). As regiões sublinhadas correspondem ao IgG2 Fc humano. As regiões sublinhadas a negrito correspondem ao peptídeo de sinal lgK e as sequências a negrito correspondem às porções da proteína de fusão codificada pelos locais de restrição de clonagem flanqueando o ECD de SEZ6.

[00561] Para gerar uma proteína ECD de hSEZ6 recombinante foi usada uma estratégia similar com base em PCR. O fragmento de cDNA codificando o ECD de SEZ6 foi amplificado a partir do clone de cDNA hSCRx17 e subclonado em um vetor de expressão regulado por CMV enquadrado e a jusante de uma sequência de peptídeo de sinal lgK e enquadrado a montante de uma sequência codificando um marcador epítopo de 9-Histidina (SEQ ID NO: 400).

[00562] O vetor de expressão regulado por CMV permite expressão transiente de elevado nível em células HEK-293T e/ou CHO-S. As culturas em suspensão ou aderentes de células HEK-293T, ou células de CHO-S em suspensão foram transfectadas com constructos de expressão codificando as proteínas hSEZ6 ECD-Fc ou hSEZ6-ECD- His, usando polímero de polietilenimina como o reagente de transfectação. Três a cinco dias após transfecção, as proteínas hSEZ6 ECD-Fc ou hSEZ6-ECD-His foram purificadas de sobrenadantes de células clarificadas usando um explorador AKTA e colunas MabSelect SuRe™ Protein A (GE Healthcare Life Sciences) ou Nickel-EDTA (Qiagen), respectivamente.

[00563] Foi construída uma linha celular estável sobre-expressando SEZ6 humano recombinante usando vetores lentivirais para transduzir células HEK-293T da seguinte forma: foi realizada amplificação PCR usando o clone hSCRx17 como modelo para produzir um fragmento de cDNA codificando a proteína SEZ6 humana madura. O fragmento que foi gerado foi subclonado enquadrado a jusante de uma sequência codificando um peptídeo de sinal lgK e marcador de epítopo DDK previamente manipulado a montante do local de clonagem múltipla de pCDH-EF1-MCS-T2A-GFP (System Biosciences) usando técnicas de clonagem molecular padrão. O vetor bicistrônico resultante foi usado para manipular linhas celulares sobre-expressando um polipeptídeo peptídeo-GFP humano de SEZ6-T2A. A sequência T2A promove o pulo ribossômico de uma condensação de ligação peptídea, resultando em duas proteínas independentes, em esse caso SEZ6 e GFP.

SEZ6 de Murino

[00564] Foi manipulada uma linha de células estáveis superexpressando SEZ6 recombinante de murino essencialmente como descrito acima para SEZ6 recombinante de humano. As células HEK-293T foram transduzidas com um vetor lentiviral expressando SEZ6 murino. O vetor foi manipulado essencialmente da seguinte forma. Um fragmento de cDNA (FIG. 5A; SEQ ID NO: 10) codificando a proteína SEZ6 de murino madura listada como RefSeq NM_021286 na base de dados NCBI (FIG. 5B; SEQ ID NO: 11) foi obtido por amplificação PCR a partir de um cDNA de SEZ6 de murino comercial (Origene; No. MC203634) e subclonado a jusante de uma sequência de peptídeo sinal IgK e marcador epítopo DDK previamente manipulado a montante do local de clonagem múltipla de pCDH-EF1- MCS-IRES-RFP (System Biosciences) usando técnicas de clonagem molecular padrão. Isso produziu um vetor lentiviral bicistrônico que foi usado para produzir uma linha celular HEK-293T sobre-expressando SEZ6 e RFP murino.

SEZ6 de rato

[00565] Para gerar e desenvolver todos os materiais moleculares e celulares exigidos na presente invenção pertencendo a proteínas SEZ6 de rato, foi obtido cDNA (FIG. 5C, SEQ ID NO: 12) codificando a proteína completa SEZ6 de rato madura (FIG. 5D, SEQ ID NO: 13) da seguinte forma. Um cDNA codificando a proteína de rato madura de comprimento total (ou seja, a proteína de comprimento total menos o peptídeo de sinal de tipo selvagem) foi amplificado a partir de cDNA de cérebro de rato marathon-ready (Clontech No. 639412). Alinhamentos de sequências mostraram que o ECD da proteína codificada era homólogo à proteína SEZ6 de rato endógena listada como RefSeq NP_001099224 na base de dados NCBI. Esse clone de cDNA, designado rSCRx17 (FIG. 5D), foi usado para a manipulação subsequente de constructos expressando os fragmentos de proteína SEZ6 de rato.

SEZ6 de Cinomolgo

[00566] Para gerar e desenvolver todos os materiais moleculares e celulares exigidos na presente invenção pertencendo a proteínas SEZ6 de cinomolgo, foi obtido cDNA (FIG. 5E, SEQ ID NO: 14) codificando a proteína SEZ6 de cinomolgo (FIG. 5F, SEQ ID NO: 15) da seguinte forma: Uma sequência ORF de SEZ6 de cinomolgo foi montada por análise bioinformática da seguinte forma: o ORF do gene SEZ6 humano foi obtido a partir do acesso NCBI NM_178860 e comparado, usando o algoritmo BLAST, com todos os contigs de sequenciação shotgun de genoma inteiro na base de dados NCBI. Os resultados BLAST foram então usados para montar um ORF de SEZ6 de cinomolgo putativo. A sequência codificando o peptídeo de sinal de tipo selvagem previsto de SEZ6 de cinomolgo foi removida dessa sequência derivada de BLAST e substituída com uma sequência codificando uma sequência de peptídeo de sinal lgK. Após otimização de códon para produção em células de mamífero, essa sequência completa de ORF híbrido foi ordenada como um gene sintético (GeneWiz). Esse clone de cDNA otimizado, designado cSCRx17 (FIG. 3E), foi usado para a manipulação subsequente de constructos expressando os fragmentos de proteína SEZ6 de cinomolgo.

SEZ6L e SEZ6L2 de Humano

[00567] No genoma humano, há dois genes relacionados de perto com SEZ6 - tipo homólogo 6 relacionado com convulsões (SEZ6L) e tipo homólogo 6 relacionado com convulsões 2 (SEZ6L2). Apesar da identidade percentual geral ser relativamente baixa entre as três proteínas (~42%), há trechos mais pequenos de identidade perfeita entre pares ou todas as três proteínas. De forma a investigar qualquer possível reatividade cruzada dos moduladores anti-SEZ6 com proteínas humanas SEZ6L e SEZ6L2, as matrizes de leitura aberta codificando os ECD da proteína humana de SEZ6L (NP_0066938) e proteína humana de SEZ6L2 (NP_001230261) foram otimizadas quanto a códons e sintetizadas (GeneWiz). Essas sequências otimizadas de cDNA codificando os ECD de proteínas humanas SEZ6L ou SEZ6L2 são mostradas nas FIGS. 5G e 5I.

Material para estudos de reatividade cruzada

[00568] Foi gerado material para estudar se os moduladores de SEZ6 da invenção reagiam de modo cruzado com homólogos de SEZ6 de rato e/ou cinomolgo, ou com as proteínas humanas de SEZ6L e SEZ6L2 relacionadas de perto. Foram concebidos genes de fusão quimérica nos quais a porção de ECD da proteína SEZ6 de rato ou de cinomolgo (sublinhada nas FIGS. 5D e 5F, respectivamente) foi fundida para um marcador de epítopo 9-Histidina (SEQ ID NO: 400). Usando PCR, o fragmento de cDNA codificando o ECD de SEZ6 de rato ou cinomolgo foi amplificado a partir de rSCRx17 ou cSCRx17, respectivamente, e subclonado em um vetor de expressão regulado por CMV enquadrado e a jusante de uma sequência de peptídeo de sinal lgK e enquadrado e a montante de uma sequência codificando um marcador epítopo de 9-Histidina (SEQ ID NO: 400). Similarmente, genes de fusão quiméricos foram concebidos nos quais a matriz de leitura aberta codificando a porção ECD das proteínas SEZ6L ou SEZ6L2 de humano foi subclonada em um vetor de expressão regulado por CMV enquadrado e a jusante de uma sequência de peptídeo de sinal lgK e enquadrado e a montante de uma sequência codificando um marcador epítopo de 9-Histidina (SEQ ID NO: 400). As sequências de proteína codificadas resultantes para essas proteínas de fusão são mostradas nas FIGS. 5H e 5J, respectivamente, com a sequência sublinhada representando o ECD da proteína particular em consideração.

[00569] Os vetores ECD-His de SEZ6 de rato e cinomolgo acima gerados foram usados para produzir e purificar proteína recombinante rSEZ6-ECD-His e proteína cSEZ6-ECD-His, respectivamente, da seguinte forma: Usando técnicas reconhecidas na arte, suspensão ou culturas aderentes de células HEK-293T, ou células CHO-S em suspensão foram transfectadas com os vetores de expressão codificando a proteína rSEZ6-ECD-His ou cSEZ6-ECD-His. Foi usado polímero de polietilenimina como reagente transfectante. Três a cinco dias após a transfecção, a proteína rSEZ6-ECD-His ou cSEZ6-ECD- His foi purificada a partir de sobrenadantes de células clarificadas usando colunas AKTA Explorer e Nickel-EDTA (Qiagen). Similarmente, os vetores ECD-His de SEZ6L e SEZ6L2 humano foram usados para produzir e purificar proteínas ECD-His recombinantes de SEZ6L humano e SEZ6L2 humano, como descrito para os homólogos de rato e cinomolgo.

Exemplo 6 Geração de Moduladores de Anti-SEZ6 de Murino

[00570] Moduladores de SEZ6 em forma de anticorpos de murino foram produzidos de acordo com os ensinamentos aqui através de inoculação com SEZ6-Fc de humano. A esse respeito, foram usadas três estirpes de camundongos para gerar moduladores de anticorpo monoclonal murinos de elevada afinidade que podem ser usados para associar com e/ou inibir a ação de SEZ6 para a prevenção e/ou tratamento de vários distúrbios proliferativos. Especificamente, as estirpes de camundongo Balb/c, CD-1 e FVB com SEZ6-Fc humano recombinante e usadas para produzir Hibridomas.

[00571] O antigênio SEZ6-Fc foi purificado de sobrenadante de células CHO-S sobre-expressando o constructo SEZ6-Fc como apresentado no Exemplo 5 (FIGS. 4A e 4B). 10 μg de imunogênio SEZ6-Fc foram usados para a primeira imunização, seguidos de 5 μg e 2,5 μg de imunogênio SEZ6-Fc para as subsequentes três imunizações e cinco imunizações, respectivamente.. Todas as imunizações foram realizadas com o imunogênio emulsificado com um volume igual de Ouro TITERMAX® (CytRx Corporation) ou adjuvante de alúmen. Foram gerados anticorpos murinos imunizando seis fêmeas (duas cada de: Balb/c, CD-1, FVB) através da rota da almofada do pé para todas as injeções.

[00572] Ensaios ELISA de fase sólida foram usados para rastrear soros de camundongo quanto a anticorpos de IgG de camundongo específicos quanto a SEZ6 de humano. Um sinal positivo acima do fundo era indicativo de anticorpos específicos quanto a SEZ6. Brevemente, placas de 96 poços (VWR International, Cat. No. 610744) foram revestidas com SEZ6 recombinante-His a 0,5 μg/mL em ELISA contendo tampão durante a noite. Após lavagem com PBS contendo Tween 20 a 0,02% (v/v), os poços foram bloqueados com BSA a 3% (p/v) em PBS, 200 μL/poço durante 1 hora à temperatura ambiente (TA). O soro de camundongo foi titulado (1:100, 1:200, 1:400, e 1:800) e adicionado às placas revestidas com SEZ6 a 50 μL/poço e incubado à TA durante 1 hora. As placas foram lavadas e depois incubadas com 50 μL/poço de IgG anticamundongo de cabra marcada com HRP diluída 1:10.000 em BSA-PBS a 3% ou FCS a 2% em PBS durante 1 hora à TA. Novamente, as placas foram lavadas e 40 μL/poço de uma solução de substrato TMB (Thermo Scientific 34028) foram adicionados durante 15 minutos à TA. Após desenvolvimento, um volume igual de H2SO4 a 2N foi adicionado para parar o desenvolvimento do substrato e as placas foram analisadas por espectrofotômetro a OD 450.

[00573] Os camundongos imunizados positivos quanto ao soro foram sacrificados e os linfonodos drenantes (popliteais e inguinais, e ilíacos médios se ampliados) foram dissecados e usados como uma fonte de células produzindo anticorpos. Uma suspensão de células únicas de células B (228,9x106 células) foi fundida com células do mieloma P3x63Ag8.653 (ATCC No. CRL-1580) a uma razão de 1:1 por eletrofusão. A eletrofusão foi realizada usando o Sistema BTX Hybrimmune™ (BTX Harvard Apparatus) conforme as direções do fabricante. Após o procedimento de fusão, as células foram ressuspensas em meio de seleção de hibridoma suplementado com Azaserina (Sigma No. A9666), meio DMEM de elevada glucose com piruvato de sódio (Cellgro cat No. 15-017-CM) contendo soro de Clone Fetal I a 15% (Hyclone), BM Condimeda 10% (Roche Applied Sciences), L-glutamina a 4 mM, 100 IU de Penicilina-Estreptomicina e 2-mercaptoetanol a 50 μM e depois plaqueadas em três frascos T225 em 90 mL de meio de seleção por frasco. Os frascos foram depois colocados em um incubador a 37°C umidificado contendo CO2 a 5% e ar a 95% durante 6-7 dias.

[00574] Após seis a sete dias de crescimento, a biblioteca consistindo nas células cultivadas em massa nos T225s foi plaqueada a 1 célula por poço em placas de fundo em U de 96 poços Falcon usando o separador de células Aria I. Os hibridomas selecionados foram depois cultivados em 200 μL de meio de cultura contendo soro de Clone Fetal I a 15% (Hyclone), BM-Condimed a 10% (Roche Applied Sciences), piruvato de sódio a 1 mM, L-glutamina a 4 mM, 100 IU de Penicilina-Estreptamicina, 2-mercaptoetanol a 50 μM, e hipoxantina a 100 μM. Quaisquer células da biblioteca de hibridoma não usadas restantes foram congeladas para teste de biblioteca futuro. Após dez a onze dias de crescimento, os sobrenadantes de cada poço das células plaqueadas foram avaliados quanto a anticorpos reativos quanto a SEZ6 por ensaios ELISA e FACS.

[00575] Para rastreio por ELISA, placas de 96 poços foram revestidas com SEZ6-Fc a 0,3 μg/mL em PBS durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas e bloqueadas com BSA a 3% em PBS/Tween durante uma hora a 37°C e usadas imediatamente ou mantidas a 4°C. Os sobrenadantes do hibridoma não diluídos foram incubados nas placas durante uma hora à TA. As placas foram lavadas e sondadas com IgG anticamundongo de cabra marcada com HRP diluída 1:10.000 em BSA-PBS a 3% durante uma hora à TA. As placas foram depois incubadas com solução de substrato como descrito acima e lidas a OD 450. Os poços contendo imunoglobulina que se liga preferencialmente a SEZ6 humano, como determinado por um sinal acima do fundo, foram transferidos e expandidos.

[00576] Os poços de hibridoma positivos quanto ao crescimento selecionados secretando imunoglobulina de murino foram também rastreados quanto a especificidade SEZ6 de humano e reatividade cruzada de SEZ6 de cinomolgo, rato e murino usando um ensaio baseado em citometria de fluxo com 293 células manipuladas para sobre-expressarem o antigênio ou constructos selecionados fabricados no Exemplo anterior.

[00577] Para os ensaios de citometria de fluxo, 50x104 células h293 transduzidas respectivamente com SEZ6 humano, de cinomolgo, de rato ou de murino foram incubadas durante 30 minutos com 25-100 μL de sobrenadante de hibridoma. As células foram lavadas com PBS, FCS a 2%, duas vezes e depois incubadas com 50 μL de um fragmento Fc de IgG de cabra-anticamundongo específico conjugado de modo secundário com DyLight 649 diluído a 1:200 em PBS/FCS a 2%. Após 15 minutos de incubação, as células foram lavadas duas vezes com PBS/FCS a 2% e ressuspensas no mesmo tampão com DAPI e analisadas por citometria de fluxo usando um FACSCanto II conforme as instruções do fabricante. Os poços contendo imunoglobulina que se liga preferencialmente às células SEZ6+ GFP+ foram transferidos e expandidos. Os hibridomas clonais específicos quanto a hSEZ6 foram criopreservados em meio congelante CS-10 (Biolife Solutions) e armazenados em nitrogênio líquido. Os anticorpos que se ligam a células SEZ6 de humano, cinomolgo, rato ou murino foram notados como reativos de modo cruzado (ver FIG. 11A).

[00578] O ELISA e a análise do citometria de fluxo confirmaram que o anticorpo purificado da maioria destes ou todos estes hibridomas se ligou a SEZ6 de um modo dependente da concentração. Os poços contendo imunoglobulina que se liga às células GFP SEZ6 foram transferidos e expandidos. Os hibridomas clonais resultantes foram criopreservados em meio congelante CS-10 (Biolife Solutions) e armazenados em nitrogênio líquido.

[00579] Uma fusão foi realizada e semeada em 48 placas (4608 poços com aproximadamente 40% de eficácia de clonagem). O rastreio inicial originou sessenta e três anticorpos de murino que se associaram a SEZ6 humano. Foi subsequentemente realizado um segundo rastreio que originou 134 anticorpos que se associaram a SEZ6 humano.

Exemplo 7 Sequenciação de Moduladores de SEZ6 de Murino

[00580] Com base no acima mencionado, um número de anticorpos monoclonais distintos exemplares que se ligam a SEZ6 humano imobilizado ou células h293-hSEZ6 com afinidade aparentemente elevada foi selecionado para sequenciação e análise adicional. Como mostrado de um modo tabular nas FIGS. 10A e 10B, a análise de sequência das regiões variáveis da cadeia leve (FIG. 10A) e regiões variáveis da cadeia pesada (FIG. 10B) de anticorpos monoclonais selecionados gerados no Exemplo 6 confirmou que muitos tinham novas regiões determinadoras da complementaridade e exibiam frequentemente novas redisposições de VDJ. Note que as regiões determinadoras da complementaridade apresentadas nas FIGS. 10A e 10B são como definidas como por Chothia et al., supra.

[00581] Como uma primeira etapa na sequenciação de moduladores exemplares, as células de hibridoma selecionadas foram lisadas em reagente Trizol® (Trizol Plus RNA Purification System, Life Technologies) para preparar o RNA. A este respeito, entre 104 e 105 células foram ressuspensas em 1 mL de Trizol e misturadas vigorosamente após adição de 200 μL de clorofórmio. As amostras foram depois centrifugadas a 4°C durante 10 minutos e a fase aquosa foi transferida para um tubo de microcentrífuga fresco onde um volume igual de isopropanol foi adicionado. Os tubos foram novamente vigorosamente agitados e se permitiu que incubassem à TA durante 10 minutos antes de serem centrifugados a 4°C durante 10 minutos. Os péletes de RNA resultantes foram lavados uma vez com 1 mL de etanol a 70% e secos brevemente à TA antes de serem ressuspensos em 40 μL de água tratada com DEPC. A qualidade das preparações de RNA foi determinada por fracionamento de 3 μL em um gel de agarose a 1% antes de serem armazenadas a -80°C até usadas.

[00582] A região variável da cadeia pesada de Ig de cada hibridoma foi amplificada usando uma mistura de iniciadores 5' compreendendo trinta e dois iniciadores da sequência líder específica de camundongos, desenhados para se dirigirem ao repertório de VH de camundongo completo, em combinação com um iniciador CY de camundongo 3' específico para todos os isotipos de Ig de camundongo. Um fragmento de PCR de 400 bp da VH foi sequenciado a partir de ambas as extremidades usando os mesmos iniciadores de PCR. Similarmente, uma mistura de trinta e dois iniciadores da sequência líder de VK 5' desenhados para amplificarem cada uma das famílias de VK de camundongo combinados com um único iniciador reverso específico quanto à região constante kappa do camundongo foi usada para amplificar e sequenciar a cadeia leve kappa. Os transcriptos de VH e VL foram amplificados a partir de 100 ng de RNA total usando reação em cadeia da polimerase com transcriptase reversa (RT-PCR).

[00583] Um total de oito reações de RT-PCR foi realizado para cada hibridoma: quatro da cadeia leve Vk e quatro para a cadeia pesada de gama V (y1). O conjunto de RT-PCR de Etapa Única foi usado para amplificação (Qiagen). Este conjunto proporciona uma combinação de Transcriptases Reversas Sensiscript e Omniscript, DNA Polimerase HotStarTaq, mistura de dNTP, tampão e Q-Solução, um novo aditivo que permite amplificação eficaz de moldes "difíceis" (p.ex., ricos em GC). Foram preparadas misturas reacionais que incluíram 3 μL de RNA, 0,5 de 100 μM de iniciadores de cadeia pesada ou cadeia leve kappa (sintetizados à medida por IDT), 5 μL de tampão 5x RT-PCR, 1 μL de dNTPs, 1 μL de mistura de enzimas contendo transcriptase reversa e DNA polimerase, e 0,4 μL de inibidor da ribonuclease RNasina (1 unidade). A mistura reacional contém todos os reagentes requeridos para transcrição reversa e PCR. O programa de ciclo térmico foi definido para uma etapa RT 50°C durante 30 minutos, 95°C durante 15 minutos, seguido por 30 ciclos de PCR (95°C durante 30 segundos, 48°C durante 30 segundos, 72°C durante um minuto). Existiu depois uma incubação final a 72°C durante 10 minutos.

[00584] Para preparar os produtos de PCR para sequenciação de DNA direta, eles foram purificados usando o Conjunto de Purificação de PCR QIAquick™ (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. O DNA foi eluído da coluna spin usando 50 μL de água estéril e depois sequenciado diretamente a partir de ambas as fitas. Os produtos de PCR extraídos foram diretamente sequenciados usando iniciadores da região V específicos. As sequências de nucleotídeos foram analisadas usando IMGT para identificar membros dos genes V, D e J da linha germinativa com a homologia de sequência mais elevada. As sequências derivadas foram comparadas com sequências de DNA da linha germinativa das regiões V e J de Ig usando V-BASE2 (Retter et al., supra) e por alinhamento de genes de VH e VL com a base de dados da linha germinativa de camundongo para proporcionar as sequências anotadas apresentadas nas FIGS. 10A e 10B.

[00585] Mais especificamente, a FIG. 10A ilustra as sequências de aminoácidos contíguas de setenta e cinco novas regiões variáveis da cadeia leve de murino de anticorpos anti-SEZ6 (SEQ ID NOS: 20 - 168, números pares) e onze regiões variáveis da cadeia leve humanizadas (SEQ ID NOS: 170 - 192, números pares) derivadas de cadeias leves de murino representativas. Similarmente, a FIG. 10B ilustra as sequências de aminoácidos contíguas de setenta e cinco novas regiões variáveis da cadeia pesada de murino (SEQ ID NOS: 21 - 169, números ímpares) dos mesmos anticorpos anti-SEZ6 e onze regiões variáveis da cadeia pesada humanizadas (SEQ ID NOS: 171 - 193, números ímpares) dos mesmos anticorpos de murino proporcionando as cadeias leves humanizadas. Assim, tomadas em conjunto, as FIGS. 10A e 10B providenciam as sequências anotadas de setenta e cinco anticorpos anti-SEZ6 de murino operáveis (denominados SC17.1, SC17.2, SC17.3, SC17.4, SC17.8, SC17.9, SC17.10, SC17.11, SC17.14, SC17.15, SC17.16, SC17.17, SC17.18, SC17.19, SC17.22, SC17.24, SC17.27, SC17.28, SC17.29, SC17.30, SC17.32, SC17.34, SC17.35, SC17.36, SC17.38, SC17.39, SC17.40, SC17.41, SC17.42, SC17.45, SC17.46, SC17.47, SC17.49, SC17.50, SC17.53, SC17.54, SC17.56, SC17.57, SC17.59, SC17.61, SC17.63, SC17.71, SC17.72, SC17.74, SC17.76, SC17.77, SC17.79, SC17.81, SC17.82, SC17.84, SC17.85, SC17.87, SC17.89, SC17.90, SC17.91, SC17.93, SC17.95, SC17.97, SC17.99, SC17.102, SC17.114, SC17.115, SC17.120, SC17.121, SC17.122, SC17.140, SC17.151, SC17.156, SC17.161, SC17.166, SC17.187, SC17.191, SC17.193, SC17.199 e SC17.200) e onze anticorpos humanizados (denominados hSC17.16, hSC17.17, hSC17.24, hSC17.28, hSC17.34, hSC17.46, hSC17.151, hSC17.155, hSC17.156, hSC17.161 e hSC17.200). Note que estas mesmas designações podem se referir ao clone que produz o anticorpo objeto e, como tal, o uso de qualquer designação particular deve ser interpretado no contexto da descrição envolvente.

[00586] Adicionalmente, hSC17.200vL1 (SEQ ID NO: 192) é uma variante do constructo da cadeia leve humanizada hSC17.200 (SEQ ID NO: 190), hSC17.155vH1 - vH6 (SEQ ID NOS: 193-198) são variantes do constructo da cadeia pesada hSC.155 (SEQ ID NO: 184) que é derivada de SC17.90 (SEQ ID NO: 127) e que hSC161vH1 (SEQ ID NO: 199) é uma variante do constructo da cadeia pesada hSC17.161 (SEQ ID NO: 189). Como será discutido em maior detalhe abaixo, essas variantes serão construídas e testadas para otimizar uma ou mais propriedades bioquímicas do anticorpo principal.

[00587] Além disso, as correspondentes sequências de ácido nucleico de cada um dos setenta e cinco moduladores de murino exemplares e onze moduladores humanizados e variantes apresentados nas FIGS. 10A e 10B estão incluídas na listagem de sequências do presente pedido (SEQ ID NOS: 220 - 399).

[00588] Para o propósito do presente pedido, os SEQ ID NOS de cada anticorpo particular são sequenciais. Assim, mAb SC17.1 compreende SEQ ID NOS: 20 e 21 para as regiões variáveis da cadeia pesada e leve, respectivamente. A este respeito, SC17.2 compreende SEQ ID NOS: 22 e 23, SC17.9 compreende SEQ ID NOS: 24 e 25, e assim por diante. Além do mais, as sequências de ácido nucleico correspondentes para cada sequência de aminoácidos de anticorpo nas FIGS. 10A e 10B estão anexadas ao presente pedido na listagem de sequências depositada aqui. Na listagem de sequências objeto, as sequências de ácidos nucleicos incluídas compreendem SEQ ID NOS que são duzentas mais do que a correspondente sequência de aminoácidos (cadeia leve ou pesada). Assim, as sequências de ácido nucleico codificando as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia leve e pesada do mAb SC17.1 (i.e., SEQ ID NOS: 20 e 21) compreendem SEQ ID NOS: 220 e 221 na listagem de sequências. A este respeito, as sequências de ácido nucleico codificando todas as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia leve e pesada divulgadas, incluindo aquelas codificando os constructos humanizados e suas variantes, são numeradas similarmente e compreendem SEQ ID NOS: 220 - 399.

Exemplo 8 Geração de Moduladores SEZ6 Quiméricos e Humanizados

[00589] Como aludido acima, onze dos anticorpos de murino do Exemplo 7 foram humanizados usando enxerto de região determinadora da complementaridade (CDR). Frameworks humanos para cadeias pesada e leve foram selecionados com base na similaridade de sequência e estrutura no que diz respeito a genes da linha germinativa humana funcionais. A este respeito, a similaridade estrutural foi avaliada por comparação da estrutura de CDR canônica de camundongo com candidatos humanos com as mesmas estruturas canônicas como descrito em Chothia et al. (supra).

[00590] Mais particularmente, onze anticorpos de murino SC17.16, SC17.17, SC17.24, SC17.28, SC17.34, SC17.46, SC17.151, SC17.155, SC17.156, SC17.161 e SC17.200 foram humanizados usando um método de enxerto de CDR (Abysis Database, UCL Business Plc.) e técnicas de manipulação molecular padrão para proporcionar os moduladores hSC17.16, hSC17.17, hSC17.24, hSC17.28, hSC17.34, hSC17.46, hSC17.151, hSC17.155, hSC17.156, hSC17.161 e hSC17.200. As regiões framework humanas das regiões variáveis foram selecionadas com base na sua homologia de sequência mais elevada com a sequência de framework de camundongo objeto e sua estrutura canônica. Para os propósitos da análise de humanização, a atribuição de aminoácidos a cada um dos domínios da CDR é de acordo com a numeração de Kabat et al. (supra).

[00591] Procedimentos de manipulação molecular foram conduzidos usando técnicas reconhecidas pela técnica. Para essa finalidade, o mRNA total foi extraído dos hibridomas e amplificado como apresentado no Exemplo 7 imediatamente acima.

[00592] A partir da informação das sequências de nucleotídeos, foram obtidos dados dizendo respeito aos segmentos dos genes V, D e J das cadeias pesada e leve dos anticorpos de murino objeto. Com base nos dados das sequências, novos conjuntos de iniciadores específicos quanto à sequência líder da cadeia leve VH e VK de Ig dos anticorpos foram desenhados para clonagem do anticorpo monoclonal recombinante. Subsequentemente, as sequências V-(D)-J foram alinhadas com sequências da linha germinativa de Ig de camundongo. As disposições genéticas resultantes para cada um dos onze constructos humanizados são mostradas na Tabela 1 imediatamente em baixo. TABELA 1

[00593] Os anticorpos humanizados listados na Tabela 1 correspondem às sequências da cadeia leve e pesada anotadas apresentadas nas FIGS. 10A e 10B (SEQ ID NOS: 170-191). As sequências de ácido nucleico correspondentes das regiões variáveis de cadeia pesada e leve são apresentadas na lista de sequências. A TABELA 1 demonstra ainda que foram necessárias muito poucas mudanças de framework para manter as propriedades favoráveis dos moduladores de ligação. A esse respeito, só foram feitas alterações de framework ou retromutações em três das regiões variáveis da cadeia pesada e apenas duas modificações de framework foram realizadas nas regiões variáveis da cadeia leve.

[00594] Note que para algumas regiões variáveis de cadeia leve e pesada (por exemplo hSC17.200, hSC17.155 e hSC17.161), foram introduzidas mutações aminoácidas conservadoras nos CDR para abordar preocupações de estabilidade ao mesmo tempo que se mantém a ligação do antigênio. Em cada caso, descobriu-se que a afinidade de ligação dos anticorpos com CDRs modificados era equivalente ao anticorpo quimérico ou murino correspondente. As sequências de nove cadeias variantes humanizadas exemplificativas (leves e pesadas) são listadas no fim das FIGS. 10A e 10B (SEQ ID NOS: 192 - 199) onde retêm a designação de cadeia principal humanizada com referência a indicar que foram alteradas (por exemplo, hSC17.200vL1, hSC17.155vH1-6 e hSC17.161vH1).

[00595] Após humanização de todos os anticorpos selecionados por enxerto de CDR, as resultantes sequências de aminoácidos da região variável da cadeia leve e pesada foram analisadas para determinar sua homologia no que diz respeito às regiões variáveis da cadeia leve e pesada dadoras de murino e aceitadoras humanas. Os resultados, mostrados na Tabela 2 em baixo, revelam que os constructos humanizados exibiram consistentemente uma homologia mais elevada no que diz respeito às sequências aceitadoras humanas do que com as sequências dadoras de murino. Mais especificamente, as regiões variáveis da cadeia pesada e leve de humano mostram uma maior percentagem de homologia global para uma correspondência mais próxima de genes da linha germinativa humana (84%-95%) em comparação com a homologia das sequências de região variáveis humanizadas e as sequências de proteína de hibridoma dador (74%- 89%). TABELA 2

[00596] Após teste, e como será discutido no Exemplo 9, cada um dos constructos humanizados exibiu características de ligação favoráveis grosseiramente comparáveis com aquelas mostradas pelos anticorpos genitores de murino (dados não apresentados).

[00597] Se humanizados ou de murino, logo que as sequências de ácido nucleico das regiões variáveis sejam determinadas, os anticorpos da presente invenção podem ser expressos e isolados usando técnicas reconhecidas pela técnica. Para essa finalidade, os fragmentos de DNA sintéticos da região variável da cadeia pesada escolhida (humanizados ou de murino) foram clonados em um vetor de expressão de IgG1 humano. Similarmente, o fragmento de DNA da região variável da cadeia leve (novamente humanizado ou de murino) foi clonado em um vetor de expressão de cadeia leve humano. O anticorpo selecionado foi depois expresso por cotransfecção dos constructos de ácido nucleico da cadeia pesada e leve derivados em células CHO.

[00598] Mais particularmente, um método compatível de produção de anticorpos compreendeu clonagem direcional de genes da região variável de murino ou humanizada (amplificados usando PCR) em vetores de expressão de imunoglobulina humana selecionados. Todos os iniciadores usados nas PCRs específicas quanto ao gene de Ig incluíram locais de restrição que permitiram clonagem direta em vetores de expressão contendo regiões constantes da cadeia pesada e da cadeia leve de IgG1 humana. Brevemente, os produtos de PCR foram purificados com conjunto de purificação de PCR Qiaquick (Qiagen) seguido por digestão com AgeI e XhoI (para a cadeia pesada) e XmaI e DraIII (para a cadeia leve), respectivamente. Os produtos de PCR digeridos foram purificados antes da ligação em vetores de expressão. As reações de ligação foram realizadas em um volume total de 10 μL com 200U T4-DNA Ligase (New England Biolabs), 7,5 μL de produto de PCR específico quanto a gene digerido e purificado e 25 ng de DNA de vetor linearizado. Bactérias de E. coli DH10B competentes (Life Technologies) foram transformadas através de choque térmico a 42°C com 3 μL de produto de ligação e plaqueadas em placas de ampicilina (100 μg/mL). O fragmento AgeI- EcoRI da região VH foi depois inserido nos mesmos locais do vetor de expressão pEE6.4HuIgG1 enquanto a inserção de XmaI-DraIII VK sintética foi clonada nos locais XmaI-DraIII do respectivo vetor de expressão pEE12.4Hu-Kappa.

[00599] Foram geradas células produzindo o anticorpo selecionado por transfecção de células HEK 293 com os plasmídeos apropriados usando 293fectina. A este respeito, DNA de plasmídeo foi purificado com colunas QIAprep Spin (Qiagen). Células do rim embriônico humano (HEK) 293T (No de ATCC CRL-11268) foram cultivadas em placas de 150 mm (Falcon, Becton Dickinson) sob condições padrão em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com FCS a 10% inativado pelo calor, estreptomicina a 100 μg/mL, penicilina G a 100 U/mL (todos da Life Technologies).

[00600] Para as transfecções transientes, as células foram cultivadas até confluência de 80%. Quantidades iguais de DNA de IgH e correspondente vetor de cadeia IgL (12,5 μg de cada) foram adicionadas a 1,5 mL de Opti-MEM misturados com 50 μL de reagente de transfecção HEK 293 em 1,5 mL de opti-MEM. A mistura foi incubada durante 30 min à temperatura ambiente e distribuída uniformemente à placa de cultura. Os sobrenadantes foram coletados três dias após transfecção, substituídos por 20 mL de DMEM fresco suplementado com FBS a 10% e coletados novamente ao dia 6 após transfecção. Os sobrenadantes da cultura foram clarificados de detritos celulares por centrifugação a 800xg durante 10 min e armazenados a 4°C. Os anticorpos quiméricos e humanizados recombinantes foram purificados com esférulas da Proteína G (GE Healthcare) e armazenados sob condições apropriadas.

Exemplo 9 Características de Moduladores de SEZ6

[00601] Vários métodos foram usados para analisar as características de ligação e imunoquímicas de moduladores de SEZ6 selecionados gerados como apresentado acima. Especificamente, um número de moduladores de anticorpo foi caracterizado no que toca a afinidade, conjugação e reatividade cruzada em relação a antigênio de SEZ6 de humano, cinomolgo, rato e camundongo juntamente com proteínas SEZ6L e SEZ6L2 por métodos reconhecidos pela técnica incluindo citometria de fluxo. As afinidades e as constantes cinéticas kon e koff dos moduladores selecionados foram medidas usando análise de interferometria de biocamada em um ForteBio RED (ForteBio, Inc.) ou ressonância de plasmon de superfície usando um Biacore 2000, cada um de acordo com as instruções do fabricante.

[00602] Os resultados da caracterização são apresentados em forma tabular na FIG. 11A onde pode ser visto que os moduladores selecionados exibiram geralmente afinidades relativamente elevadas na gama nanomolar e, em muitos casos, eram reativos de modo cruzado com um ou mais ortólogos de SEZ6. A FIG. 12 lista ainda o conjugado empiricamente determinado ocupado pelo modulador do sujeito. Tomados em conjunto, estes dados demonstram as propriedades de ligação variadas dos moduladores divulgados bem como a sua potencial adequação para desenvolvimento farmacêutico com base na sua reatividade em modelos animais.

[00603] A esse respeito, foi realizada citometria de fluxo usando um FACSCanto II conforme as instruções do fabricante de forma a confirmar que os moduladores de anticorpos SC17 selecionados podem associar-se imunoespecificamente com SEZ6 humano e para determinar se os mesmos moduladores reagem de modo cruzado com SEZ6 de cinomolgo, rato e/ou murino, para além de SEZ6L e SEZ6L2. Mais particularmente, foram testados moduladores quanto a reatividade cruzada a SEZ6 de murino e SEZ6 de rato por citometria de fluxo contra linhas celulares Neuro2a (ATCC Cat No. CCL131) e RIN-m5F (ATCC cat No. CRL-11605) que expressam SEZ6 de camundongo e SEZ6 de rato, respectivamente. Para examinar reatividade cruzada para SEZ6 de cinomolgo, foram usadas leveduras exibindo o domínio extracelular de SEZ6 de cinomolgo (Boder et al, 1997) para análise de citometria de fluxo.

[00604] Brevemente, 1x105 células por poço de Neuro2a, RIN-5mF, ou leveduras exibindo células SEZ6 de cinomolgo foram incubadas durante 30 minutos com tampão PBS de 50 μL (2%FCS) com anticorpo de 5 μg/mL. As células foram lavadas duas vezes com o mesmo tampão e depois incubadas com 50 μL de um fragmento Fc de IgG de cabra-anticamundongo específico secundário por amostra DyLight 649 diluído a 1:200 em tampão PBS. Após incubação durante 15 minutos, as células foram lavadas duas vezes com o tampão PBS e novamente suspensas no mesmo com DAPI para análise de citometria de fluxo de Neuro2a e Rin-m5F ou tampão sem DAPI para análise de citometria de fluxo de células de levedura com cSEZ6. Anticorpos que se ligam com as linhas celulares Neuro2a ou RIN-m5F ou leveduras exibindo células SEZ6 de cinomolgo foram consideradas reativas de modo cruzado com SEZ6 de murino, SEZ6 de rato ou SEZ6 de cinomolgo, respectivamente. A FIG. 11A mostra os resultados de reatividade cruzada. Seis anticorpos foram reativos de modo cruzado para SEZ6 de humano e de camundongo (SC17.6, SC17.7, SC17.19, SC17.24, SC17.26 e SC17.42); seis para SEZ6 de humano e de rato (SC17.6, SC17.17, SC17.19, SC17.26, SC17.28, SC17.34 e SC17.42); e seis para SEZ6 de humano e de cinomolgo (SC17.17, SC17.24, SC17.26, SC17.34, SC17.36 e SC17.45). De referir que SC17.6 é duplicativo de SC17.16 e exibe as mesmas características de ligação.

[00605] Para verificar os dados de reatividade cruzada acima para SEZ6 de rato e para determinar as afinidades e constantes cinéticas kon e koff dos efectores selecionados, foi realizada análise de interferometria de biocamada em um ForteBio RED (ForteBio, Inc.) ou ressonância de plasmon de superfície em um Biacore 2000 (GE Healthcare). As afinidades foram determinadas para SEZ6-His humano recombinante e SEZ6-His de rato recombinante gerados no Exemplo 5. Como visto na FIG. 11A, vários dos anticorpos testados reagiram de modo cruzado com SEZ6 de rato. Os moduladores selecionados exibiram afinidades relativamente elevadas para SEZ6 humano e de rato na gama nanomolar.

[00606] Para determinar a reatividade cruzada para proteínas de membros da família SEZ6L e SEZ6L2 foi usado um ensaio de base ELISA. Foram revestidas placas com proteínas SEZ6, SEZ6L, ou SEZ6L2 a 0,2 μg/mL em PBS de um dia para o outro. Após lavagem com PBS contendo Tween 20 (PBST) a 0,05% (v/v), os poços foram bloqueados com BSA a 2% (p/v) em PBS (PBSA), 100 μL/poço durante 1 hora à temperatura ambiente. Foi então adicionado anticorpo a 1 μg/mL em 100 μL de PBSA durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem com PBST, 100 μL/poço de IgG anticamundongo de cabra marcada com HRP diluíram em 1:2.000 em PBSA durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas e 100 μL/poço da solução de substrato TMB (Thermo Scientific 34028) foram adicionados durante 15 minutos à temperatura ambiente. Após desenvolvimento, um volume igual de H2SO4 a 2M foi adicionado para parar o desenvolvimento do substrato e foi analisado por espectrofotômetro a OD 450. A FIG. 11A mostra que um anticorpo foi reativo de modo cruzado com SEZ6L (SC17.7) e cinco foram reativos de modo cruzado com SEZ6L2 (SC17.6, SC17.7, SC17.19, SC17.26 e SC17.28). Como discutido acima, tais anticorpos pan-SEZ6 são compatíveis com os ensinamentos aqui e podem ser usados em conjunto com os métodos revelados.

[00607] As características de ligação dos seguintes constructos humanizados do Exemplo 8, hSC17.16, hSC17.17, hSC17.24, hSC17.28, hSC17.34 e hSC17.46, foram analisadas para determinar se o processo de enxerto de CDR tinha alterado de forma apreciável as suas características. Os constructos humanizados (enxertados com CDR) foram comparados com anticorpos quiméricos "tradicionais" compreendendo os domínios variáveis da cadeia pesada e leve de genitor (ou dador) murino e uma região constante humana substancialmente equivalente àquela usada nos constructos humanizados. Com estes constructos, ressonância de plasmon de superfície foi conduzida usando um Biacore 2000 (GE Healthcare) para identificar quaisquer mudanças sutis nas constantes das taxas originadas pelo processo de humanização. Em todos os casos, os anticorpos humanizados tinham afinidade de ligação equivalente ou melhor do que os anticorpos de murino correspondentes (dados não apresentados).

[00608] A conjugação de anticorpos foi determinada para vários moduladores de SEZ6 como mostrado na FIG. 11A. Um ForteBio RED foi usado pelas instruções do fabricante para identificar anticorpos competitivos que se ligam aos mesmos ou diferentes conjugados. Brevemente, um anticorpo de referência (Ab1) foi capturado em um chip de captura anticamundongo, uma concentração elevada de anticorpo não ligante foi depois usada para bloquear o chip e foi coletada uma linha de base. SEZ6 humano recombinante, monomérico (descrito no Exemplo 5) foi então capturado pelo anticorpo específico (Ab1) e a ponta foi imersa em um poço com o mesmo anticorpo (Ab1) como um controle ou em um poço com um anticorpo de teste diferente (Ab2). Se fosse observada ligação adicional com um novo anticorpo, então, se determinou que Ab1 e Ab2 estavam em um conjugado diferente. Se não ocorresse nenhuma ligação adicional, como determinado por comparação dos níveis de ligação com o Ab1 de controle, então se determinou que Ab2 estava no mesmo conjugado. Como conhecido na técnica, este processo pode ser expandido para rastrear grandes bibliotecas de anticorpos únicos usando uma linha completa de anticorpos representando conjugados únicos em uma placa de 96 poços. No presente caso, este processo de conjugação mostrou que os anticorpos rastreados se ligam a pelo menos sete conjugados diferentes na proteína de SEZ6. Os conjugados A-F são conjugados únicos e os anticorpos contidos em cada um desses conjugados competem uns com os outros (mas não com anticorpos de outros conjugados definidos) para ligação à proteína SEZ6. O conjugado U contém anticorpos que não competem com anticorpos em conjugados A-F, mas que podem competir com ligação uns aos outros.

Exemplo 10 Mapeamento de Epítopo de Moduladores de SEZ6

[00609] De modo a caracterizar os epítopos aos quais os moduladores de anticorpos de SEZ6 divulgados se associam ou se ligam, foi realizado mapeamento de epítopo ao nível do domínio usando uma modificação do protocolo descrito por Cochran et al. (J Immunol Methods. 287 (1-2):147-158 (2004), que é incorporado aqui por referência). Os domínios individuais de SEZ6 foram expressos na superfície de levedura e a ligação por cada anticorpo de SEZ6 foi determinada através de citometria de fluxo.

[00610] Foram criados constructos de plasmídeo de exibição em levedura para a expressão dos seguintes constructos: domínio extracelular SEZ6 (aminoácidos 1-904); Domínio Sushi 1 (aminoácidos 336-395), Domínio CUB 1 (aminoácidos 297-508), Domínio Sushi 2 (aminoácidos 511-572), Domínio CUB 2 (aminoácidos 574-685), Domínio Sushi 3 (aminoácidos 690-748), Domínio Sushi 4 (aminoácidos 750-813), Domínio Sushi 5 (aminoácidos 817-878), e Domínio Sushi 5 + terminal C (aminoácidos 817-904). Adicionalmente, o domínio de N terminal (aminoácidos 1-335) foi dividido em 3 fragmentos designados N1 (aminoácidos 1-70), N2 (aminoácidos 71169) e N3 (aminoácidos 169-335), cada um dos quais foi clonado no plasmídeo de exibição em levedura. A numeração de aminoácidos não inclui o peptídeo líder. Para informação de domínio ver geralmente a entrada Q53EL9 da base de dados UniProtKB/Swiss-Prot. Estes plasmídeos foram transformados em leveduras, que foram depois cultivadas e induzidas como descrito em Cochran et al. De notar que toda a numeração de aminoácidos se baseia em proteína SEZ6 madura sem a sequência líder 19 aa.

[00611] Para testar quanto a ligação a um constructo particular, 200.000 células induzidas por levedura expressando o constructo desejado foram lavadas duas vezes em PBS + BSA a 1 mg/mL (PBSA), e incubadas em 50 μL de PBSA com anti c-myc de frango (Life Technologies) a 0,1 μg/mL e anticorpo purificado a 50 nM ou diluição 1:2 de sobrenadante não purificado de hibridomas cultivados durante 7 dias. As células foram incubadas durante 90 minutos em gelo e depois lavadas em PBSA. As células foram depois incubadas em 50 μL de PBSA com os anticorpos secundários apropriados: para anticorpos de murino, anti-frango conjugado com Alexa 488, e anticamundongo de cabra conjugado com Alexa 647 (ambos Life Technologies) foram adicionados a 1 μg/mL cada, e para anticorpos humanizados ou quiméricos, anti-frango conjugado com Alexa 647 (Life Technologies) e anti-humano de cabra conjugado com R- ficoeritrina (Jackson Immunoresearch) foram adicionados a 1 μg/mL cada. Após uma incubação de vinte minutos em gelo, as células foram lavadas duas vezes com PBSA e analisadas em um FACS Canto II.

[00612] Todos os moduladores se ligaram de forma única a um domínio único expresso em células de leveduras. Em alguns casos, os clones de anticorpos ligaram-se especificamente a leveduras expressando Domínio Sushi 5 + C-terminal, mas não a leveduras expressando Domínio Sushi 5. Esses clones de anticorpos foram concluídos para apenas se ligarem à região de C-terminal (aminoácidos 879-904).

[00613] Os epítopos foram classificados quer como conformacionais (ou seja, descontínuos) ou lineares. Leveduras exibindo o constructo ECD de SEZ6 foram tratadas com calor durante 30 minutos a 80°C de forma a desnaturar o antigênio, lavadas duas vezes em PBSA gelado e depois submetidas ao mesmo protocolo de coloração e análise de citometria de fluxo acima descritos. Os anticorpos que se ligavam a leveduras desnaturadas e nativas foram classificados como se ligando a um epítopo linear, ao passo que os anticorpos que se ligavam a leveduras nativas, mas não leveduras desnaturadas foram classificados como conformacionalmente específicos.

[00614] Um sumário dos dados do mapeamento de epítopos ao nível do domínio dos anticorpos testados é apresentado na TABELA 3 abaixo. Anticorpos que ligam um epítopo linear são sublinhados e anticorpos que ligam os membros da família SEZ6, SEZ6L e SEZ6L2, são designados com um asterisco e/ou punhal, respetivamente. TABELA 3

[00615] Foi observada uma tendência interessante e surpreendente quando foi realizado um ensaio de morte de células in vitro usando os moduladores de anticorpos SEZ6 com domínios mapeados descritos nesse Exemplo 10. O ensaio de morte in vitro, realizado essencialmente como descrito embaixo no Exemplo 14, determinou a capacidade de um anticorpo particular internalizar e matar células HEK-293. A FIG. 11B é um gráfico de eficácia dos anticorpos testados versus os domínios aos quais se ligam. Anticorpos que se ligam a certos domínios incluindo: N1, N3, Domínio Sushi 1 e Domínio Sushi 4 exibiram mais mortes in vitro. Os anticorpos que se associam com o Domínio Sushi 4, que são muito eficazes na internalização e morte de células, exibem uma forte correlação com as regiões de framework de linha germinativa de murino IGHV1-34 e IKV4-59.

[00616] Foi ainda realizado mapeamento de epítopo fino em anticorpos selecionados para determinar os aminoácidos específicos a que se ligam. Anticorpos que se ligam a um epítopo linear foram mapeados usando o conjunto de biblioteca de peptídeos de exibição em fagos Ph.D.-12 (New England Biolabs E8110S). O anticorpo selecionado para o mapeamento de epítopos foi revestido em um tubo Nunc MaxiSorp (Nunc) a 50 μg/mL em 3 mL de solução de bicarbonato de sódio a 0,1 M, pH 8 e incubado de um dia para o outro. O tubo foi bloqueado com solução de BSA a 3% em solução de bicarbonato. Depois, se permitiu que 1011 fagos de entrada em PBS + Tween-20 a 0,1% se ligassem, seguido de dez lavagens consecutivas com Tween- 20 a 0,1% para lavar os fagos não ligantes. Os fagos restantes foram eluídos com 1 mL de glicina a 0,2 M durante 10 minutos à temperatura ambiente com agitação gentil, seguida por neutralização com 150 μL de Tris-HCl a 1 M pH 9. Os fagos eluídos foram amplificados e contatados novamente com 1011 fagos de entrada, usando Tween-20 a 0,5% durante etapas de lavagem para aumentar a estringência da seleção. DNA de 24 placas dos fagos eluídos da segunda ronda foi isolado usando o conjunto Qiaprep M13 Spin (Qiagen) e sequenciado. A ligação dos fagos clonais foi confirmada usando um ensaio ELISA, onde o anticorpo mapeado ou um anticorpo de controle foi revestido em uma placa de ELISA, bloqueado, e exposto a cada clone de fago. A ligação dos fagos foi detectada usando anticorpo anti-M13 conjugado com peroxidase de rábano-silvestre (GE Healthcare), e a solução 1-Step Turbo TMB ELISA (Pierce). As sequências de peptídeo dos fagos de fagos especificamente ligantes foram alinhadas usando Vetor NTI (Life Technologies) contra a sequência de peptídeo de ECD do antigênio para determinar o epítopo da ligação.

[00617] Os anticorpos que se ligaram a um epítopo descontínuo foram mapeados usando a técnica descrita por Chao et al. (2007). Foram geradas bibliotecas de mutantes de ECD de SEZ6 com PCR propenso a erros usando os análogos de nucleotídeos 8-oxo- 2'deoxiguanosina-5'-trifosfato e 2'-deoxi-p-nucleosídeo-5'trifosfato (ambos da TriLink Bio) para uma taxa de mutagênese alvo de uma mutação de aminoácidos por clone. Estas foram transformadas em um formato de exibição de levedura. Usando a técnica descrita acima para mapeamento ao nível dos domínios, a biblioteca foi corada quanto a ligação de c-myc e anticorpo a 50 nM. Usando um FACS Aria (BD), os clones que exibiram uma perda de ligação em comparação com ECD de SEZ6 de tipo selvagem foram separados. Estes clones foram recultivados, e sujeitos a outra ronde de separação por FACS quanto a perda de ligação ao anticorpo alvo. Usando o conjunto Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep (Zymo Research), os clones de ECD individuais foram isolados e sequenciados. Onde necessário, as mutações foram reformatadas como clones de ECD de mutante único usando o conjunto de mutagênese sítio-dirigida Quikchange (Agilent).

[00618] Os clones de ECD individuais foram de seguida rastreados para determinar se a perda de ligação era devido a uma mutação no epítopo, ou uma mutação que causava dobragem incorreta. As mutações que envolveram cisteína, prolina, e códons de paragem foram automaticamente descartadas devido à elevada probabilidade de uma mutação de dobragem incorreta. Os clones de ECD restantes foram depois rastreados quanto a ligação a um anticorpo conformacionalmente específico, não competitivo. Se concluiu que os clones de ECD que perderam a ligação a anticorpos conformacionalmente específicos, não competitivos continham mutações de dobragem incorreta, ao passo que se concluiu que os clones de ECD que retiveram ligação equivalente como ECD de SEZ6 de tipo selvagem estavam apropriadamente dobrados. Se concluiu que as mutações nos clones de ECD neste último grupo estavam no epítopo. Os modelos de homologia de domínios isolados foram também construídos usando MODELLER para confirmar que os resíduos identificados como estando no epítopo: 1) estavam localizados próximos uns dos outros no modelo de homologia dobrado, e 2) tinham cadeias laterais que foram expostas a solventes, e não enterradas, uma vez que os resíduos enterrados teriam maior probabilidade de causar dobragem incorreta e teriam poucas probabilidades de fazer parte do epítopo de ligação. Um sumário de anticorpos com os seus epítopos é listado na Tabela 4. TABELA 4

[00619] N R indica que não foi atribuído nenhum SEQ ID NO, já que os epítopos eram descontínuos.

[00620] No caso de SC17.34, SC17.36 e SC17.46, as mutações pontuais foram construídas no domínio isolado, Domínio Sushi 1, que foi determinado para ser o domínio de ligação por mapeamento de epítopo ao nível do domínio. No caso de SC17.46, as mutações candidatas para rastreio não foram identificadas em um rastreio com base em uma biblioteca; ao invés, foram identificadas com base no mapeamento de domínios, falta de reatividade cruzada para ECD de SEZ6 de cinomolgo e ECD de SEZ6 de rato e alinhamentos de sequências das diferentes espécies para identificar diferenças na sequência primária da espécie. Essas mutações candidatas foram submetidas à mesma análise dos outros anticorpos para confirmar o epítopo de SC17.46.

Exemplo 11 Detecção de Expressão de Superfície de SEZ6 por Citometria de Fluxo

[00621] Foi usada citometria de fluxo para avaliar a especificidade dos anticorpos anti-SEZ6 que foram gerados para detectar a presença da proteína SEZ6 humana na superfície das linhas celulares HEK- 293T manipuladas, construídas como descrito no Exemplo 5. Controles corados com isotipo e de fluorescência menos um (FMO) foram empregues para confirmar a especificidade da coloração. Brevemente, HEK-293T transduzido com SEZ6 e GFP humano (ver Exemplo 5) ou amostras de tumor NTX colhidas foram dissociadas e dispersas em suspensão usando técnicas de digestão enzimáticas reconhecidas na técnica (ver, por exemplo, U.S.P.N. 2007/0292414 que é aqui incorporado), foram incubadas durante 30 minutos com um anticorpo anti-SEZ6. As células foram lavadas duas vezes em PBS (2%FCS) e depois incubadas com 50 μL de um fragmento Fc de IgG de cabra-anticamundongo específico secundário por amostra DyLight 649 diluído a 1:200 em tampão PBS. Após uma incubação de 15 minutos, as células foram lavadas duas vezes com PBS e novamente suspensa em PBS com DAPI e analisadas por citometria de fluxo como previamente discutido.

[00622] Como demonstrado pelos dados representativos mostrados na FIG.12A para SC17.33, o modulador de SEZ6 reconheceu fortemente células HEK-293T-HuSEZ6. Esses dados demonstram que foram produzidos moduladores que reconheceram especificamente SEZ6 humano expresso na superfície da célula.

[00623] A expressão de proteína SEZ6 humana na superfície de tumores NTX selecionados foi avaliada por citometria de fluxo usando vários anticorpos SC17 exemplares. A expressão de SEZ6 em LU37, LU86 e KDY66 foi testada usando o anticorpo SC17.6 enquanto a expressão de SEZ6 em LU50, LU100 e LU73 foi testada usando os anticorpos SC17.10, SC17.42 e SC17.28, respectivamente. Os resultados são apresentados na FIG. 13A. Os tumores NTX foram coletados, dissociados, e cocorados com CD45 anticamundongo, H- 2Kd anticamundongo, EpCAM anti-humano comercialmente disponíveis e um dos anticorpos de SEZ6 anti-humano de camundongo acima descritos. Os dados mostrados na FIG. 13A foram gerados usando células que não coraram positivamente para os anticorpos anti-camundongo acima mencionados, mas coraram positivamente para EpCAM anti-humano. Similarmente às experiências de coloração de HEK-293Tdescritas acima, controles corados com isotipo e de fluorescência menos um (FMO) foram empregues para confirmar a especificidade da coloração. Como visto na FIG. 13A, a coloração anti-SEZ6 foi mais elevada do que FMO em todas as células de tumor NTX humano, como indicado pelo desvio do perfil fluorescente para a direita, e por mudanças nos valores da intensidade de fluorescência média (MFI), para os tumores NTX do pulmão LU37, LU50 e LU86 e tumor NTX do rim KDY66 Estes dados sugerem que a proteína SEZ6 é expressa na superfície de vários tumores NTX e, portanto passível de modulação usando um anticorpo anti-SEZ6.

Exemplo 12 Expressão da Proteína SEZ6 em Vários Tumores

[00624] Dados os elevados níveis de transcripto de mRNA de SEZ6 associados a vários tumores, foi realizado trabalho para demonstrar um aumento correspondente na expressão da proteína SEZ6 em tumores NTX. A expressão de proteína SEZ6 foi detectada com (i) um ensaio ELISA de sanduíche de eletroquimioluminescência SEZ6 usando a Plataforma MSD Discovery (Meso Scale Discovery, LLC); e (ii) Coloração Imunohistoquímica.

[00625] Os tumores NTX foram excisados de camundongos e congelados instantaneamente em gelo seco/etanol. Foi adicionado Tampão de Extração de Proteína (Biochain Institute, Inc.) aos pedaços de tumor congelados e os tumores foram pulverizados usando um sistema Tissue Lyser (Qiagen). Os lisatos foram clarificados por centrifugação (20.000g, 20 minutos, 4°C) e a concentração de proteína total em cada lisato foi quantificada usando ácido bicinconínico. Os lisatos de proteína foram armazenados a -80°C até avaliados. Foram comprados lisatos com tecidos normais à Novus Biologicals.

[00626] As concentrações de proteína SEZ6 das amostras de lisatos foram determinadas por interpolação dos valores de uma curva de concentração de proteína padrão que foi gerada usando proteína SEZ6 recombinante purificada (Exemplo 5). A curva padrão de proteína SEZ6 e ensaio de quantificação de proteína foram conduzidos da seguinte forma:

[00627] Placas MSD padrão foram revestidas de um dia para o outro a 4°C com 30 μL de anticorpo SC17.17 a 2 μg/mL em PBS. As placas foram lavadas em PBST e bloqueadas em 150 μL em solução Bloqueante A a 3% da MSD durante 1 hora. As placas foram novamente lavadas em PBST. O anticorpo SC17.36 foi então conjugado com o marcador sulfo da MSD e 25 μL do SC17.36 marcado foram adicionados às placas lavadas a 0,5 μg/mL em Bloqueante A a 1% da MSD. 25 μL de lisato diluído 10x em Bloqueante A a 1% da MSD ou padrão de SEZ6 recombinante diluído em série em Bloqueante A a 1% da MSD contendo Tampão de Extração de Proteína a 10% foram também adicionados aos poços e incubados durante duas horas. As placas foram lavadas em PBST. O Tampão de Leitura T da MSD com tensioativo foi diluído até 1X em água e 150 μL foram adicionados a cada poço. As placas foram lidas em um Sector Imager 2400 da MSD usando um programa de análise com software integrado para derivar as concentrações de SEZ6 em amostras de NTX através de interpolação da curva padrão. Os valores foram depois divididos pela concentração de proteína total para originar nanogramas de SEZ6 por miligrama de proteína total no lisato. As concentrações resultantes são apresentadas na FIG. 12B, em que cada ponto representa concentrações de proteína SEZ6 derivadas de uma única linha de tumores NTX. Embora cada ponto seja derivado de uma única linha de NTX, na maioria dos casos, foram testadas amostras biológicas múltiplas da mesma linha de NTX e foi calculada a média dos valores para proporcionar os pontos de dados.

[00628] A FIG. 12B mostra que em comparação com lisatos de tecido normal, as amostras de tumor selecionadas de rim, ovários e LCNEC exibiram expressão de proteína SEZ6 moderada enquanto a expressão de proteína SEZ6 mais elevada foi vista em tumores SCLC. Todos os lisatos de tecido normal apresentaram-se negativos para expressão de proteína SEZ6 com a exceção de cérebro humano normal e lisato de olho.

[00629] Foi realizada Imunohistoquímica (IHC) em tumores PDX para confirmar que SEZ6 é expresso na superfície de certos tumores PDX; e por forma a determinar a localização da proteína SEZ6 na arquitetura do tumor.

[00630] A IHC foi realizada em seções de tecidos embebidos em parafina fixa em formalina, usando um método de detecção indireto, que inclua um anticorpo primário monoclonal de murino contra SEZ6 (clone 17.140), anticorpos secundários conjugados com biotina específicos de camundongo, complexo de avidina/biotina acoplado a peroxidase de rábano-silvestre e detecção de DAB (Nakene PK 1968; 16:557-60). Ao corar tumores de xenoenxerto PDX, foi usado um agente de bloqueio de IgG de camundongo (Vector Laboratories; número de catálogo PK-2200). SC17.140 foi validado e confirmado como sendo apropriado para IHC ao mostrar coloração específica em secções de pelétes de células HEK-293T sobre-expressando SEZ6 em comparação com pelétes de células HEK-293T ingênuas, preparados como conhecido na técnica. A especificidade foi ainda confirmada por competidor com um excesso molar 5 de SEZ6 recombinante purificado em células HEK-293T sobre-expressando SEZ6 humano e tumores xenoenxertados que foram mostrados por IHC para expressar SEZ6 (dados não apresentados). A FIG. 16 mostra expressão de SEZ6 como medida por IHC em tumores NTX SCLC. A intensidade de coloração foi pontuada para levar em consideração a intensidade da coloração de 0 (negativa) a 3 (coloração forte). Os resultados mostram que 64% dos tumores NTX SCLC testados expressaram SEZ6.

[00631] Estes dados, combinados com os dados de transcrição de mRNA para a expressão de SEZ6 apresentados acima (Exemplo 4), e expressão de proteína da superfície da célula de SEZ6 (Exemplo 11), reforçam fortemente a proposição de que os determinantes de SEZ6 proporcionam alvos atrativos para intervenção terapêutica.

Exemplo 13 Enriquecimento de Populações de Células Iniciadoras de Tumor

[00632] As células de tumor podem ser divididas em dois tipos de subpopulações de células: células não tumorigênicas (NTG) e células iniciadoras de tumor (TICs). As TICs têm a capacidade de formar tumores quando implantadas em camundongos imunocomprometidos. As células-tronco do câncer (CSCs) são um subconjunto de TICs e conseguem autoreplicar-se indefinidamente ao mesmo tempo que mantêm a capacidade para diferenciação multilinhagem. Para determinar se a expressão de SEZ6 poderia ser correlacionada com maior tumorigenicidade, foram realizados sequenciação de transcriptoma, citometria de fluxo e um ensaio de tumorigenicidade, sendo todos descritos abaixo.

[00633] A análise do transcriptoma inteiro de expressão SEZ6 em várias amostras de tumor foi realizada como descrito no Exemplo 1. CSCs foram identificados na base da expressão de CD324 que se tem provado ser um marcador de células-tronco em vários tumores (ver o pedido PCT 2012/031280). Os resultados na FIG. 6A mostram que a expressão de mRNA de SEZ6 foi elevada em CSCs em comparação com células NTG isoladas de duas linhas de tumores NTX SCLC (LU86 e LU95).

[00634] Foi realizada citometria de fluxo em células de tumores NTX do pulmão essencialmente como descrito no Exemplo 11. As células LU86, LU117 e LU64 foram cocoradas com CD324, um marcador de populações CSC (ver o pedido PCT 2012/031280), e o anticorpo anti-SEZ6, SC17.10, SC17.28 ou SC17.42, respectivamente para determinar se SEZ6 é expresso de forma diferente em essas populações. Como indicado na FIG. 13B, as células LU86, LU117 e LU64 corando positivamente para CD324 e SEZ6 (linha negra sólida) deslocam-se mais para a direita em comparação com células corando positivamente só para SEZ6 (linha negra pontilhada), indicando que SEZ6 é mais expresso em CSCs do que em comparação com a população de células NTG. O controle de isotipo de população bulk é mostrado como um histograma com enchimento a cinzento (MOPC = IgG1).

[00635] Para determinar se a expressão de SEZ6 na superfície da célula poderia ser correlacionada com maior capacidade de gerar tumores foi realizado um estudo de tumorigenicidade. As amostras de tumores NTX foram dissociadas e dispersas em suspensão usando técnicas de digestão enzimática reconhecidas na técnica (ver, por exemplo, U.S.P.N. 2007/0292414, que é incorporada aqui). As preparações de células dissociadas dessas linhas NTX foram coradas com anticorpos conjugados de forma fluorescente especificamente reconhecendo CD45 e H2kD murino, CD324 humano, e SEZ6 humano, clone SC17.42. Dois subconjuntos de células humanas, ambos identificados com base na ausência de coloração com CD45 ou H2kD murino (para esgotar as preparações de células de células de murino) foram isolados usando um Citômetro de Fluxo FACSAria™ (BD Biosciences). Um subconjunto foi isolado na base de uma coexpressão CD324 e SEZ6, enquanto o outro subconjunto foi isolado na base de um fenótipo CD324+SEZ6-. As diferentes subpopulações enriquecidas com marcadores foram subsequentemente transplantadas para camundongos fêmea NOD/SCID imunocomprometidos por injeção subcutânea na gordura mamária em uma dose de aproximadamente 50 células por camundongo.

[00636] As FIGS. 14A e 14B ilustram os resultados de tais experiências conduzidas usando linhas celulares NTX representativas derivadas de tumores NSCLC obtidos de pacientes. A FIG. 14A é um gráfico de dispersão (fechado usando CD324 e SEZ6) mostrando a distribuição do subconjunto mCD45-H2kD- do tumor genitor e células tumorigênicas putativas separadas. A FIG. 14B mostra graficamente o volume de tumor medido surgindo da implantação de subpopulações de células separadas em camundongos imunocomprometidos. Os valores em parênteses indicam o número de tumores gerados por camundongo implantado.

[00637] Significativamente, os dados da FIG. 14 mostram que a tumorigenicidade estava consistentemente associada com a subpopulação de células expressando SEZ6 em combinação com níveis elevados de CD324. Reciprocamente, esses mesmo dados demonstram que células de tumor não expressando ou expressando níveis baixos de SEZ6 eram muito menos tumorigênicas do que os seus correspondentes elevados ou positivos. Com base nos dados gerados, foi surpreendentemente descoberto que subpopulações de células de tumores expressando o fenótipo CD324+SEZ6+ geralmente contêm a vasta maioria da capacidade tumorigênica e sugere que SEZ6 pode providenciar um alvo terapêutico eficaz para a modulação de células tumorigênicas.

Exemplo 14 Moduladores de SEZ6 Facilitam a Distribuição de Agentes Citotóxicos para Células HEK-293T expressando SEZ6

[00638] Para demonstrar que os moduladores de SEZ6 da presente invenção são capazes de mediar a distribuição de um agente citotóxico a células vivas, foi realizado um ensaio de morte de células in vitro usando moduladores de anticorpo de SEZ6 ligados a uma toxina da saporina. A saporina mata células através da desativação de ribossomas no citoplasma. Assim, a morte da célula usando o ensaio que se segue é uma indicação de que os anticorpos de SEZ6 são capazes de internalizar e distribuir agentes citotóxicos ao citoplasma de uma célula-alvo.

[00639] Um fragmento Fab de IgG anticamundongo covalentemente ligado a saporina ("Fab-Saporina") (Advanced Targeting Systems, No. IT-48) foi combinado com anticorpos SEZ6 não marcados e incubado com células HEK-293T expressando SEZ6 humano (ver Exemplo 5). A capacidade dos complexos de saporina resultantes se internalizarem e matarem células foi medida 72 horas depois por medição da viabilidade das células.

[00640] Especificamente, 500 células por poço em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino foram plaqueadas em placas tratadas de cultura de tecido com 96 poços um dia antes da adição dos anticorpos e da toxina. Células HEK-293T expressando SEZ6 humano foram tratadas com um controle (IgG1, IgG2a ou IgG2b) ou moduladores de SEZ6 de murino purificado a uma concentração de 100, 50 ou 10 pM, juntamente com 2 nM Fab-Saporina. As células foram cultivadas durante três dias, após o que foram enumerados números de célula viáveis usando Cell Titer Glo® (Promega) conforme as instruções do fabricante. As Unidades de Luminescência em Bruto (RLU) usando culturas contendo células com o fragmento Fab da Saporina foram definidas como valores de referências a 100% e todas as outras contagens calculadas conformemente (referidas como RLU Normalizadas ou "% de células vivas"). A FIG. 15A mostra que muitos dos moduladores de SEZ6 testados mediaram a morte de células HEK-293T de uma forma dependente da concentração. Os controles de isotipos (IgG2a, IgG2b, e IgG1) não afetaram as contagens de células como mostrado pelos resultados nas três primeiras filas da FIG. 15A (ND = Não Determinado).

[00641] Esse ensaio demonstra que pode ocorrer internalização aquando da ligação do anticorpo específico de SEZ6 à superfície da célula, sem ser necessária reticulação ou dimerização adicional.

Exemplo 15 Moduladores de SEZ6 Medeiam a Citotoxicidade em Células de Tumor do Pulmão in vitro

[00642] Para corroborar os resultados do Exemplo 14 e determinar se os moduladores de SEZ6 conseguem mediar a internalização de toxinas e a morte de células de células de tumor humanas (por contraste com células manipuladas), foram plaqueadas células NTX de camundongo de linhagem esgotada e subsequentemente expostas a anticorpos anti-SEZ6 e Fab-Saporina.

[00643] Tumores NTX foram dissociados em uma suspensão de célula única e plaqueados em placas PrimariaTM (BD Biosciences) em meio isento de soro suplementado com fator de crescimento como é conhecido na técnica. Após cultivo das células durante um dia a 37°C/5%CO2/5%O2, essas foram tratadas com um controle (IgG1, IgG2a ou IgG2b) ou um modulador de SEZ6 de murino e Fab-saporina como descrito no Exemplo 14. Após sete dias, a citotoxicidade da saporina mediada por modulador foi avaliada quantificando o número restante de células vivas usando Cell Titer Glo.

[00644] Como visto na FIG. 15B, foi evidente uma redução no número de células de tumor quando LU37, um tumor NSCLC e LU80, um tumor SCLC, foram expostos aos moduladores de SEZ6 SC17.6 (duplicativo de SC17.16) e SC17.33. Similarmente, quando LU100, um tumor SCLC foi exposto a quatro moduladores de SEZ6, SC17.6, SC17.19, SC17.33 e SC17.34, a 50 e 500 pM, ocorreu uma redução de células de tumor. Em contraste, anticorpos de controle de isotipo não tiveram impacto no número de células vivas após tratamento.

[00645] Esses dados não demonstram apenas que anticorpos exemplares descritos aqui são capazes de ligar antigênio de SEZ6 na superfície da célula e facilitar a distribuição de uma carga citotóxica resultando em morte das células, mas os dados acima também demonstraram que múltiplos anticorpos anti-SEZ6 podem mediar a morte de várias células de tumor NTX.

Exemplo 16 Preparação de Conjugados Anticorpo de SEZ6-Fármaco

[00646] Com base nos ensaios de morte in vitro com saporina nos Exemplos 14 e 15 e para demonstrar adicionalmente a versatilidade da presente invenção, foram preparados conjugados anticorpo anti-SEZ6- fármaco com a estrutura M-[L-D] como acima descrito. Ou seja, conjugados anticorpo anti-SEZ6-fármaco (SEZ6-ADCs) foram preparados usando agentes citotóxicos covalentemente ligados. Mais especificamente, foram preparados SEZ6-ADCs compreendendo um ligante como descrito aqui, ou nas referências imediatamente em baixo, e dímeros de pirrolobenzodiazepina (PBD) selecionados que foram covalentemente anexados aos moduladores divulgados (ver, p.ex., U.S.P.Ns. 2011/0256157 e 2012/0078028 e U.S.P.N 6,214,345, cada uma das quais é incorporada aqui por referência na sua totalidade).

[00647] Combinações de fármaco PBD-ligante foram sintetizadas e purificadas usando técnicas reconhecidas pela técnica tendo em vista as referências citadas. Enquanto os vários dímeros e PBD e ligantes foram empregues para fabricar as combinações fármaco-ligante selecionadas, cada unidade de ligante compreendeu uma porção de maleimido terminal com uma sulfidrila livre. Usando estes ligantes, as conjugações foram preparadas através de redução parcial do mAb com tris (2-carboxietil)-fosfina (TCEP) seguida por reação dos resíduos de Cys reduzidos com a carga de maleimido-ligante.

[00648] Mais particularmente, o modulador de anticorpo de SEZ6 foi reduzido com 1,3 mol de TCEP por mol de mAb durante 2 hr a 37°C em Tris HCl a 25 mM pH 7,5 e tampão EDTA a 5 mM. Se permitiu que a reação arrefecesse até 15°C e a carga de ligante em DMSO foi adicionada a uma razão de 2,7 mol/mol de mAb seguida por uma quantidade adicional de DMSO até uma concentração final de 6% (v/v). Se permitiu que a reação prosseguisse durante 1 hora. O fármaco-ligante não reagido foi tamponado por adição de um excesso de cisteína de N-acetila. O SEZ6-ADC (ou SC17-ADC) foi depois purificado por coluna de permuta iônica usando um sistema AKTA Explorer FPLC (G.E. Healthcare) para remover anticorpo de elevado peso molecular agregado, cossolvente e pequenas moléculas. O ADC eluído foi submetido depois a troca de tampões por filtração de fluxo tangencial (TFF) em tampão de formulação seguida por ajuste da concentração e adição de um detergente. O ADC final foi analisado quanto a concentração de proteína (por medição de UV), agregação (SEC), razão de fármaco em relação a anticorpo (DAR) por HPLC de fase reversa (RP), presença de anticorpo não conjugado por HPLC de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), materiais não proteináceos por RP HPLC e citotoxicidade in vitro usando uma linha de células expressando SEZ6.

[00649] Usando o procedimento acima mencionado, ou metodologia substancialmente similar, um número de ADCs (i.e., M-[L-D]n) compreendendo vários moduladores de SEZ6 e dímeros de PBD foi gerado e testado em uma variedade de modelos in vivo e in vitro. Para os propósitos destes Exemplos e das presentes divulgações, tais ADCs podem ser geralmente denominados SEZ6-ADCs ou SC17- ADCs. Os ADCs discretos serão denominados de acordo com o anticorpo (p.ex., SC17.17) e a designação ligante-agente citotóxico específica ADC1, ADC2, etc. Assim, moduladores exemplares compatíveis com a presente invenção podem compreender SC17.17- ADC1 ou SC17.24-ADC2 onde ADC1 e ADC2 representam agentes citotóxicos de dímero de PBD individuais (e opcionalmente um ligante).

[00650] Como referência inicial, a citotoxicidade in vitro de hSC17.17-ADC1 foi medida em um IC50 de 11nM quando exposto a células HEK293 sobreexpressando SEZ6 (dados não apresentados).

Exemplo 17 Moduladores de SEZ6 Conjugados Medeiam a Citotoxicidade em Células de Tumor do Pulmão in Vitro

[00651] Os ADCs gerados no Exemplo 16 acima foram testados para determinar se eram capazes de mediar internalização de toxina e matar células de células de tumor humanas primárias in vitro.

[00652] Células de tumor NTX de camundongo de linhagem esgotada foram expostas a ADCs anti-SEZ6 ou a um controle de isotipo de camundongo (msIgG1) usando o mesmo método descrito no Exemplo 15, com a exceção que não foi adicionada Fab-saporina. Quando LU64, um tumor SCLC e OV26, um tumor dos ovários NET foram tratados com ADCs anti-SEZ6 (SC17.24-ADC2, SC17.28-ADC2 e SC17.34-ADC2), foi observada uma maior redução na percentagem de células viáveis em comparação com o msIgG1 de controle (FIG. 17A). Enquanto msIgG1 pode ser citotóxico para células a concentrações elevadas, todos os três ADCs anti-SEZ6 testados foram mais potentes, indicando uma resposta imunoespecífica a SEZ6 em vez de uma resposta geral à citotoxina PBD.

Exemplo 18 Moduladores de SEZ6 Conjugados Suprimem o Crescimento de Tumores In Vivo

[00653] Os ADC gerados no Exemplo 16 acima foram testados para demonstrar a sua capacidade de encolher e suprimir o crescimento de tumores NTX humanos em camundongos imunodeficientes.

[00654] Tumores NTX derivados de pacientes foram cultivados subcutaneamente nos flancos de camundongos recipientes fêmeas NOD/SCID usando técnicas reconhecidas pela técnica. Os volumes dos tumores e os pesos dos camundongos foram monitorizados duas vezes por semana. Quando os volumes de tumor atingiram 150-250 mm3, os camundongos foram aleatoriamente colocados em grupos de tratamento e injetados intraperitonealmente com SC17-ADC1 ou um MsIgG1-ADC1 anti-hapteno de controle. Os camundongos receberam três injeções de 1 mg/kg (indicado pelas linhas verticais na FIG. 17B e FIGS. 18A e 18B) ao longo de um período de sete dias. Após tratamento, os volumes dos tumores e os pesos dos camundongos foram monitorizados até os tumores excederem 800 mm3 ou os camundongos ficarem doentes.

[00655] A FIG. 17B mostra que ADCs anti-SEZ6 conseguem inibir o crescimento in vivo de um tumor SCLC (LU86) e um LCNEC (LU50) em camundongos. No caso de LU86, os cinco ADC testados (SC17.3- ADC1, SC17.24-ADC1, SC17.26-ADC1, SC17.28-ADC1 e SC17.34- ADC1) produziram remissões duráveis durando, em alguns casos, para lá de 120 dias pós-tratamento. Em particular, o tratamento SC17.34-ADC1 inibiu o crescimento do tumor durante a duração do estudo a essa dose, enquanto SC17.24-ADC1 conduziu a uma significativa inibição do crescimento do tumor com tempo para progressão superior a 50 dias. Similarmente, o tratamento de LU50 com cinco ADC exemplares (SC17.3-ADC1, SC17.17-ADC1, SC17.24- ADC1, SC17.34-ADC1 e SC17.46-ADC1) resultou na supressão do crescimento do tumor durante até 35 dias com SC17.46. Além disso, os camundongos tratados com SC17-ADC1 não exibiram efeitos adversos à saúde para além daqueles tipicamente vistos com camundongos NOD/SCID imunodeficientes transportando tumores. Esses resultados sugerem que os ADC revelados podem ser usados para suprimir efetivamente o crescimento de tumores e que os particulares da ligação de modulador SC17 podem ter um impacto na eficácia in vivo.

[00656] Mais diretamente, a capacidade de uma variedade de moduladores conjugados de retardarem ou suprimirem dramaticamente o crescimento de tumores in vivo durante períodos prolongados valida adicionalmente o uso do SEZ6 como um alvo terapêutico para o tratamento de distúrbios proliferativos.

Exemplo 19 Moduladores de SEZ6 humanizados Conjugados Suprimem o Crescimento de Tumores In Vivo

[00657] Dados os resultados impressionantes obtidos com moduladores ADC anti-SEZ6 de murino, foram realizadas experiências adicionais para demonstrar a eficácia de moduladores ADC anti-SEZ6 humanizados no tratamento de tumores SCLC in vivo. ADCs anti- SEZ6 humanizados selecionados (usando moduladores hSC17.17, hSC17.24, hSC17.34 e hSC17.46), produzidos como apresentado no Exemplo 16, e o ADC de controle de isotipo IgG1 humano (huIgG1) foram administrados a camundongos imunodeficientes com vários tumores NTX. O regime de dosagem foi o mesmo do apresentado no Exemplo 18.

[00658] Os resultados destas experiências são apresentados nas FIGS.18A e 18B. A eliminação completa e durável de massa de tumor foi alcançada pela administração de ADCs anti-SEZ6 humanizados em quatro tumores SCLC. A FIG. 18A mostra a redução do tumor LU80 por hSC17.17-ADC1 e hSC17.46-ADC1; e eliminação do tumor LU64 por hSC17.17-ADC1, hSC17.34-ADC1 e hSC17.46-ADC1. A FIG. 18B mostra a redução do tumor LU117 por hSC17.17-ADC1 e hSC17.46- ADC1; e redução do tumor LU111 por hSC17.34-ADC1 e hSC17.46- ADC1. A ausência de recorrência do tumor foi observada por mais de 50 dias em 3 em cada 4 desses estudos. Em cada estudo, os volumes dos tumores e os pesos dos camundongos dos animais de controle foram monitorizados até os tumores excederem 800 mm3 ou os camundongos ficarem doentes.

[00659] Esses resultados demonstram a aplicabilidade surpreendente de uma variedade de moduladores de SEZ6 humanizados para retardar efetivamente o crescimento de diferentes tumores.

[00660] Os versados na técnica apreciarão ainda que a presente invenção pode ser realizada de outras formas específicas sem abandonar o seu espírito e atributos centrais. À medida que a descrição anterior da presente invenção revela apenas suas modalidades exemplares, deve ser entendido que outras variações são contempladas como estando dentro do escopo da presente invenção. Em conformidade, a presente invenção não se limita às modalidades particulares que aqui foram descritas em detalhe. Ao invés, deve ser feita referência às reivindicações em anexo como indicadoras do escopo e conteúdo da invenção.

Claims (12)

1. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que compreende ou compete pela ligação a uma proteína SEZ6 humana e compreende uma região variável da cadeia leve e uma região variável da cadeia pesada, em que o anticorpo monoclonal compreende: (a) resíduos 24-34 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L1, resíduos 50-56 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L2, resíduos 89-97 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L3, resíduos 31-35 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H1, resíduos 50-65 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H2 e resíduos 95-102 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H3, em que os resíduos são numerados de acordo com Kabat; (b) resíduos 23-34 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L1, resíduos 50-56 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L2, resíduos 89-97 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L3, resíduos 26-32 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H1, resíduos 50-58 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H2 e resíduos 95-102 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H3, em que os resíduos são numerados de acordo com Chotia; ou (c) resíduos 30-36 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L1, resíduos 46-55 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L2, resíduos 89-96 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L3, resíduos 30-35 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H1, resíduos 47-58 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H2 e resíduos 93-101 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H3, em que os resíduos são numerados de acordo com MacCallum.

2. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável da cadeia leve definida na SEQ ID NO: 190, e uma compreende uma região variável da cadeia pesada definida na SEQ ID NO: 191.

3. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo monoclonal compreende um anticorpo monoclonal selecionado do grupo consistindo em anticorpos quiméricos, um anticorpo enxertado com CDR e um anticorpo humanizado.

4. Conjugado anticorpo-fármaco, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo monoclonal conjugado a um agente citotóxico, em que o anticorpo monoclonal compreende o anticorpo monoclonal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende a fórmula: M-[L-D]n, em que a) M compreende o anticorpo monoclonal ; b) L compreende o ligante opcional; c) D compreende um fármaco, que é o agente citotóxico; e d) n é um inteiro de 1 a 20.

6. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o agente citotóxico é uma pirrolobenzodiazepina, uma duocarmicina, uma amanitina, uma auristatina, uma maitansinoide, uma caliqueamicina, ou um radioisótopo.

7. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal compreende resíduos 24-34 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L1, resíduos 50-56 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L2, resíduos 89-97 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L3, resíduos 31-35 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H1, resíduos 50-65 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H2 e resíduos 95-102 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H3, em que os resíduos são numerados de acordo com Kabat, e em que o agente citotóxico é uma caliqueamicina.

8. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal compreende resíduos 23-34 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L1, resíduos 50-56 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L2, resíduos 89-97 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L3, resíduos 26-32 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H1, resíduos 50-58 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H2 e resíduos 95-102 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H3, em que os resíduos são numerados de acordo com Chotia; e em que o agente citotóxico é uma caliqueamicina.

9. Conjugado anticorpo-fármaco de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal compreende resíduos 30-36 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L1, resíduos 46-55 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L2, resíduos 89-96 de SEQ ID NO: 190 para CDR-L3, resíduos 30-35 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H1, resíduos 47-58 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H2 e resíduos 93-101 de SEQ ID NO: 191 para CDR-H3, em que os resíduos são numerados de acordo com MacCallum; e em que o agente citotóxico é uma caliqueamicina.

10. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, caracterizado pelo fato de que o conjugado anticorpo-fármaco compreende um ligante.

11. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende um ligante não clivável.

12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou o conjugado anticorpo-fármaco, como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 11.