ES2251723T3 - Inmunoconjugados y anticuerpos humanizados especificos para linfoma de celulas b y celulas de leucemia. - Google Patents

Inmunoconjugados y anticuerpos humanizados especificos para linfoma de celulas b y celulas de leucemia.

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ES2251723T3 ES95929338T ES95929338T ES2251723T3 ES 2251723 T3 ES2251723 T3 ES 2251723T3 ES 95929338 T ES95929338 T ES 95929338T ES 95929338 T ES95929338 T ES 95929338T ES 2251723 T3 ES2251723 T3 ES 2251723T3
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Abstract

ANTICUERPO MONOCLONAL LL2 QUIMERICO Y HUMANIZADO, DNAS AISLADOS QUE CODIFICAN ESOS ANTICUERPOS, VECTORES QUE CONTIENEN EL DNA Y CONJUGADOS DE ANTICUERPOS LL2 QUIMERICOS Y QUIMERICOS HUMANIZADOS CON AGENTES CITOTOXICOS O ETIQUETAS PARA UTILIZAR EN LA TERAPIA Y DIAGNOSTICO DE LINFOMAS DE CELULAS B Y LEUCEMIAS.

Description

Inmunoconjugados y anticuerpos humanizados específicos para linfoma de células B y células de leucemia.
Antecedentes de la invención
La invención se refiere generalmente a inmunoconjugados para usos conjugados y terapéuticos en cáncer. En particular la invención se refiere a anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados producidos recombinantemente dirigidos contra linfoma de células B y células de leucemia, dichos anticuerpos se pueden conjugar covalentemente a un reactivo diagnóstico o terapéutico sin pérdida de unión de anticuerpo y función de internalización y con producción reducida de anticuerpos anti - ratón.
El linfoma de no Hodgkins (NHL) y leucemia linfocítica crónica son malignidades de células B que son contribuidores importantes a la mortalidad de cáncer. La respuesta de estas malignidades a diversas formas de tratamiento es mixta. Responden razonablemente bien a la quimioterapia, y, en los casos en los que es posible determinación de la fase clínica adecuada de NHL, como para pacientes con enfermedad localizada, se puede proporcionar tratamiento satisfactorio usando terapia de radiación de campo (Hall y col., radiology for the Radiologist, Lippincott, Philadelphia, 1989, pp. 365 - 376). Sin embargo, los efectos secundarios tóxicos asociados a la quimioterapia y la toxicidad al sistema hematopoyético a partir de radioterapia local, así como del cuerpo completo, limita el uso de estos procedimientos terapéuticos. Aproximadamente la mitad de los pacientes mueren de la enfermedad (Posner y col., Bood, 61: 705 (1983)).
El uso de anticuerpos monoclonales de dirección conjugados a radionúclidos u otros agentes citotóxicos ofrece la posibilidad de distribuir tales agentes directamente al sitio del tumor, limitando por lo tanto la exposición de tejidos normales a agentes tóxicos (Goldenberg, Semin. Nucl. Med., 19: 332 (1989)). En los años recientes, el potencial de terapia basada en anticuerpos y su precisión en la localización de antígenos asociados a tumores se ha demostrado tanto en los estudios de laboratorio como clínicos (véase, por ejemplo, Thorpe, TIBTECH, 11: 42 (1993); Goldenberg, Scientific American, Science & Medicine, 1: 64 (1994); Baldwin y col., documento de Estados Unidos Nº 4.925.922 y 4.916.213; Young, documento de Estados Unidos Nº 4918163; documento de Estados Unidos Nº 5.204.095; Irie y col., documento de Estados Unidos Nº 5.196.337; Hellstrom y col., documento de Estados Unidos Nº 5.134.075 y 5.171.665). En general el uso de anticuerpos marcados radiactivamente o fragmentos de anticuerpo contra marcadores asociados a tumores para la localización de tumores ha sido más exitoso que para terapia, en parte debido a que la recaptación de anticuerpo por el tumor es generalmente baja, variando entre solamente 0,01% a 0,001% de la dosis total inyectada (Vaughan y col., Brit. J. Radiol., 60: 567 (1987)). Incrementando la marca radiactiva para incrementar la dosificación al tumor es contraproductivo generalmente ya que esto también incrementa la exposición de tejido sano a la radiactividad.
LL-2 (EPB2) es un anticuerpo monoclonal (mAb) murino altamente específico de linfoma de células anti-B y de células de leucemia antilinfocítico que se internaliza rápidamente por tales células y que puede vencer alguna de las dificultades anteriormente mencionadas (Shih y col., Int. J. Cancer, 56: 538 (1994)). LL2, que es del tipo anticuerpo de IgG2a, se desarrolló usando la línea celular de Linfoma B de Raji como fuente de antígeno (Pawlak - Byczkowska y col., Cancer Res., 49: 4568 (1989)). LL2 murino (mLL2) se sabe que reacciona con un epítope de CD22 (Belisle y col., Proc Amer. Assn. Clin. Res., 34: A2873 (1993)). Las moléculas de CD22 se expresan en el citoplasma del progenitor y células tempranas pre-B, y aparecen en la superficie celular de las células B maduras.
Mediante la inmunotinción de las secciones de tejido, mLL2 se mostró que reaccionaron con 50 de 51 linfomas de células B ensayados. mLL2 es un medio altamente sensible de detección de célula de linfoma de células B in vivo, como se determina por un procedimiento de radiodetección (Murthy y col., Eur. J. Nucl. Med., 19: 394 (1992)). El fragmento Fab' de mLL2 marcado con ^{99m}Tc localizaba 63 de 65 lesiones conocidas en los pacientes de prueba de Fase II con linfomas de células B (Mills y col., Proc. Amer. Assn. Cancer Res., 14: A2857 (1993)). Además mLL2 marcado con ^{131}I era terapéuticamente eficaz en pacientes con linfoma de células B (Goldenberg y col., J. Clin. Oncol., 9: 548 (1991)). El Fab' de mLL2 conjugado a la exotoxina PE38KDEL inducía remisiones completas de xenógrafos (CA - 46) de linfomas humanos medibles que se desarrollan en ratones desnudos (Kreitman y col., Cancer Res., 53: 819 (1993)).
El uso clínico de mLL2, justo con otros anticuerpos murinos más prometedor, ha estado limitado por el desarrollo en seres humanos de respuesta de HAMA. Mientras una respuesta HAMA no se observa invariablemente después de la inyección de mLL2, en un número significativo de casos de pacientes que desarrollaban HAMA después de un único tratamiento con mLL2. Esto puede limitar la utilidad diagnóstica y terapéutica de tales conjugados de anticuerpos, no solamente debido al problema potencial anafiláctico, sino también como una parte principal del conjugado circulante se puede complejar a y secuestrar por los anticuerpos anti - ratón circulantes. Esto se ejemplifica por un estudio en el que aproximadamente 30% de los pacientes desarrollaban una respuesta de bajo nivel de HAMA después de una sola inyección de aproximadamente 6 mg de ^{131}I - IgG de mLL2 y casi todos desarrollan una fuerte respuesta HAMA con inyecciones adicionales. Por otra parte, con Fab' de mLL2 marcado con ^{99m}Tc, no se observó ninguna respuesta HAMA. Tales respuestas HAMA en general plantean un obstáculo potencial a la realización del potencial diagnóstico y terapéutico total del anticuerpo mLL2.
Aunque, como se ha indicado anteriormente, el uso de fragmentos de mLL2, tales como F(ab')_{2} y Fab', parcialmente alivian/evitan estos problemas de inmunogenicidad, existen circunstancias en las que la IgG completa es más deseable, tal como cuando se intenta la inducción de inmunidad celular para terapia, o cuando un se requiere un anticuerpo con tiempo de supervivencia potenciada.
Con el fin de maximizar el valor del anticuerpo de IgG de mLL2 como una modalidad terapéutica o de diagnóstico e incrementa su utilidad en modalidades de administración múltiples y continuos, es un objeto de esta invención producir un mAb quimérico de ratones/seres humanos (cLL2) y un mAb humanizado (hLL2) relacionado con mLL2 que conserva la especificidad de unión de antígeno de mLL2, pero que genera una HAMA reducida en un mismo sujeto receptor.
Otro objeto de esta invención es proporcionar secuencias de ADN que codifican las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de los mABs cLL2 y hLL2, que incluyen las regiones determinantes de la complementariedad (CDR).
También otro objeto de esta invención es proporcionar conjugados de los mAbs hLL2 y cLL2 que contienen modalidades terapéuticas o de diagnóstico.
Un objeto adicional de esta invención es proporcionar procedimientos de terapia y diagnosis que utilizan los mAb humanizados y quiméricos de la invención.
Estos objetos se han logrado mediante la invención descrita más adelante en la memoria descriptiva y reivindicaciones anexas.
Sumario de la invención
En un aspecto de la invención, se proporciona un mAb de cLL2 relacionado con mAb de mLL2, en el que las regiones variables de tipo murino de la cadena ligera (VK) y pesada (VH) se unen a las cadenas ligeras (kappa) y pesada (IgG1) constantes humanas. Este mAb quimérico conserva la dirección de las células de linfoma B y de leucemia y propiedades de internalización del mLL2 parental.
En otro aspecto de la invención se proporciona un mAb de mLL2 con relación a mAb de mLL2, en el que las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de las cadenas ligeras y pesadas del mAb de mLL2 se unen a la secuencia del marco conservado (FR) de las regiones VK y VH humanas, respectivamente, y posteriormente a los dominios de las regiones constantes kappa e IgG1 humanas, respectivamente. Este anticuerpo humanizado conserva las características de internalización y de dirección de células de linfoma B y leucemia del mAb de mLL2 parenteral, y puede mostrar una reacción de HAMA reducida.
Todavía en otro aspecto se proporcionan polinucleótidos aislados que comprenden secuencias de ADN que codifican las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras y pesadas variables, respectivamente, de los mAbs de hLL2 y cLL2.
En un aspecto adicional, se proporcionan las secuencias de aminoácidos de las CDR de las cadenas VK y VH.
Todavía en otro aspecto, se proporcionan conjugados en los que el mAb lLL2 o cLL2 está covalentemente unido a un reactivo de diagnóstico o terapéutico.
Todavía en otro aspecto, se proporcionan procedimientos en los que los conjugados de mAb anteriormente mencionados se pueden usar para diagnosticar o tratar linfomas de células B y leucemias linfocíticas.
Éstos y otros aspectos y realizaciones de la invención serán evidentes por referencia a la siguiente memoria descriptiva y reivindicaciones anexas.
Descripción de las figuras
La figura 1 es una comparación de los dominios de VK (figura 1A SEC ID Números 2 y 6) y VH (figura 1B SEQ ID números 4, 9 y 8) de LL2 murinos con los humanizados. Solamente se muestran las secuencias de hFR (designadas como REIHuVK y EUHuVH) distintas de las secuencias de mFR (designadas como murinas), y designadas por asteriscos. Más residuos en estas posiciones se retuvieron en la estructura humanizada. Las CDR están dentro de casillas. Los residuos de FR que muestran contactos de las CDR mediante un modelo de ordenador están subrayados.
La figura 2 muestra relaciones vecinales de las CDR de LL2 a sus regiones de marco conservado (FR). Se construyeron modelos de energía minimizada separados para los dominios de VL y VH de mLL2, y todos los residuos de FR dentro de un radio de 4,5 \ring{A} o cualquier átomo de CDR se identificaron como contactos de CDR - FR. Las CDR de las cadenas ligeras (L1, L2, y L3) y pesadas (H1, H2, y H3, figura 2B)) se muestran como representaciones "de bola y barra" sobrepuestas sobre sus respectivas FR con espacio relleno.
La figura 3 muestra los vectores de fase (VKpBR) y de expresión de (pKH) de mamífero de la cadena ligera (figura 3 A), y los vectores de fase (VKpBS) y de expresión de (pG1g) de mamífero de la cadena ligera (figura 3 B) de la cadena pesada.
La figura 4 muestra las secuencias de ADN de doble cadena y de aminoácidos del dominio VK de LL2 (figura 4 A SEQ ID números 1 y 2) y el dominio VH de LL2 (figura 4 B SEQ ID números 3 y 4). Las secuencias de aminoácidos codificadas por las secuencias de ADN correspondientes se proporcionan como códigos de letras. Las secuencias de aminoácidos de CDR están dentro de casillas. El sitio de glicosilación de Asn localizado en FR1 de LL2VK (figura 4 A SEQ ID Nº 2) se muestra como la secuencia NVT subrayada.
La figura 5 A muestra los residuos de ADN de doble cadena y de aminoácidos correspondientes del dominio VK de hLL2 (SEQ ID números 5 y 6). Las secuencias de aminoácidos de CDR están dentro de casillas. Los datos correspondientes para el dominio de VH se muestra en la figura 5 B (SEQ ID números 7 y 8).
La figura 6 es una representación esquemática de diagrama de la síntesis de PCR/génica de la región humanizada VH y la subclonación en el vector de fase, VHpBS.
La figura 7 muestra el análisis de SDS PAGE de los anticuerpos mLL2 y cLL2 en condiciones no reductoras (bandas 6 - 8) y reductoras (bandas 3 - 5, cadenas ligeras y pesadas). Las bandas 3 y 6 incluyen un anticuerpo control.
La figura 8 muestra análisis de SDS - PAGE de versiones diferentes de anticuerpos cLL2 y hLL2 en condiciones reductoras (bandas 3 - 5) y no reductoras (bandas 6 - 8).
La figura 9 muestra análisis de SDS - PAGE sobre anticuerpos cLL2 y hLL2 mixtos y emparejados en condiciones reductoras (bandas 3 - 6) y no reductoras (bandas 7 - 10). cLL2 sirve como control.
La figura 10 muestra los resultados de un ensayo comparativo de unión competitiva de anticuerpo de células Raji que implica anticuerpos competitivos de mLL2 y cLL2 que compiten por la unión a células contra el rastreador de mLL2 marcado radiactivamente.
La figura 11 muestra los resultados de un ensayo comparativo de unión competitiva de anticuerpo de células Raji en el que los LL2 mixtos humanizados/quiméricos se comparan con cLL2 (figura 11A), y dos versiones de hLL2 comparados con cLL2 (figura 11B).
La figura 12 muestra una comparación de relaciones de internalización de anticuerpos: unión de superficie como una función del tiempo para los anticuerpos cLL2, cLL2 (mutagénesis Q a V), hLL2 y mLL2.
La figura 13 muestra un análisis de SDS - PAGE de mLL2 y cLL2 después de la glucosialción por la endoglucosidasa F.
La figura 14 muestra el efecto de la desglucosialción de mLL2 en la afinidad de unión a células Raji.
Descripción detallada de la invención
Los ADNc que codifican las regiones VL y VH del mAb de mLL2 se han aislado y subclonado de manera recombinante separadamente en vectores de expresión de mamíferos que contienen los genes que codifican las regiones constantes kappa e IgG1, respectivamente, de anticuerpos humanos. La cotransfección de células de mamíferos con estos dos ADN recombinantes expresaba un mAb de cLL2, como el mAb de mLL2 precursor, unido de manera ávida a, y se internalizó rápidamente mediante, células de linfoma B.
Las CDR de los ADN de VK y VH se han unido de manera similar recombinantemente a las secuencias del marco conservado (FR) y regiones VK y VH, respectivamente, que están unidas posteriormente, respectivamente, a las regiones constantes kappa e IgG1 humanas, de manera que se expresan en células de mamíferos como se hLL2 descrito anteriormente.
En esta memoria descriptiva, las expresiones "cLL2" o "mAb de cLL2" pretenden referirse al anticuerpo monoclonal quimérico construido mediante la unión o subclonación de las regiones VK y VH murinas a las cadenas ligeras y pesadas constantes humanas, respectivamente. La expresión "hLL2" o "mAb de hLL2" pretenden referirse a la humanización del anticuerpo monoclonal quimérico reemplazando las secuencias de FR murinas en cLL2 con las de las regiones del marco conservado humanas.
Los conjugados covalentes entre los mAb de cLL2 y hLL2 y un reactivo de diagnóstico o quimioterapéutico, formulado en vehículos farmacéuticamente aceptables (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, edición 18ª, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990) se pueden preparar para que tengan las ventajas, comparados con los conjugados de anticuerpos de la técnica anterior, de dirección específica de células de leucemia y específica de linfoma de células B, internalización rápida en células diana, liberalización rápida del reactivo de diagnóstico o quimioterapéutico intracelularmente (por lo tanto incrementando la eficacia del reactivo), y una reducción potencial de la respuesta de HAMA en un paciente humano.
Ya que el resto carbohidrato anexo a VK del mAb de cLL2 se muestra en esta memoria descriptiva que no está implicado en la unión a células de linfoma B, se prefiere usar conjugados en los que el reactivo se une al anticuerpo a través de tales restos carbohidrato, tal como a través de derivados de carbohidratos oxidados. Se proporcionan procedimientos para la producción de tales conjugados y su uso en diagnosis y terapia, por ejemplo, en Shih y col., patente de Estados Unidos Nº 5.057.313, Shih y col., Int. J. Cancer 41: 832 (1988), y pendiente de aplicación, de propiedad común con la presente de Hansen y col., documento USSN 08/162.912. La unión directa del reactivo a carbohidrato oxidado sin el uso de un vehículo polimérico se describe en McKearn y col., patente de Estados Unidos Nº 5.156.840.
Se pueden conjugar de manera ventajosa una amplia diversidad de reactivos de diagnosis y terapéuticos a los anticuerpos de la invención. Éstos incluyen, fármacos quimioterapéuticos tales como doxorubicina, metotrexato, taxol, y similares; quelantes, tales como DTPA, a los que marcadores detectables tales como moléculas fluorescentes o agentes citotóxicos tales como metales pesados o radionúclidos se pueden complejar; y toxinas tales como la endotoxina de Pseudomonas, y similares. Se describen varias realizaciones de estos conjugados en los ejemplos a continuación.
Las líneas celulares y medios de cultivo usadas en la presente invención incluyen células de hibridoma LL2 (EPB-2) (Pawlak - Byczkowska y col, 1989 anteriormente), células de mieloma Sp2/0-Ag14 (ATCC, Rockville, MD) y células Raji. Estas células se cultivan preferiblemente en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con FCS al 10% (Gibco/BRL, Gaithersburg, MA), L-glutamina 2 mM y 75 \mug/ml de gentamicina, (DMEM completo). Las transfecciones se hacen crecer en medio sin suero de Hibridoma, HSFM, (Gibco/BRL, Gaithersburg, MA), que contiene 10% de FCS y 75 \mug/ml de gentamicina, (HSFM completo) o, cuando se indique, en HSFM que contiene solamente antibióticos. La selección de los transfectomas se puede llevar a cabo en HSFM completo que contiene 500 \mug/ml de higromiciina (Calbiochem, San Francisco, CA). Todas las líneas celulares se mantienen preferiblemente a 37ºC en CO_{2} al 5%.
Un aspecto importante de esta invención es que los dominios variables de anticuerpos se pueden modelar mediante modelado por ordenador (véase, por ejemplo, Dion, en Goldenberg y col., eds., Cancer Therapy With Radiolabeled Antibodies, CRC Press, Boca Raton, FL 1994). En general, la estructura en 3 dimensiones para tanto los mAbs de mLL2 como de hLL2 se modelan mejor por homología. La alta frecuencia de identidades de residuo (75,0 a 92,3%) entre las secuencias primarias deducidas de las regiones FR de la cadena ligera mLL2 y REI humana (VK) facilita este planteamiento debido a la biodisponibilidad de datos cristalográficos del banco de datos de proteínas (Código de PDR 1REI, Bernstein y col., J. Mol. Biol. 112: 535 (1977)). De manera similar, las secuencias de anticuerpo EU (VH) se pueden seleccionar como los homólogos de ordenador para FR1 o FR3 de la cadena pesada de mLL2; FR4 se basó en NEWM. Ya que los datos coordinados de rayos X carecen actualmente de la secuencia EU, se pueden usar los datos estructurales de NEWM (código de PDR 3FAB) para las FR 1 a 4, y los grupos secundarios de aminoácidos se pueden reemplazar con los correspondientes mLL2 o EU (hLL2) según sea necesario. La CDR de la cadena ligera se puede modelar a partir de la secuencia correspondiente de 1MCP (L1 y L2) y 1REI (L3). Para las CDR de las cadenas pesadas, H1 y H2 se pueden basar en 2HFL y 1MCP, respectivamente, mientras que H3 se puede modelar de nuevo. Siempre que sea posible, los reemplazos de los grupos secundarios se deben realizar de manera que mantenga en ángulo de torsión entre C\alpha y C\beta. La minimización de energía se puede realizar mediante el campo de fuerza AMBER (Weiner y col., J. Amer. Chem. Soc. 106: 76 (1984) usando el procedimiento convergente. Las interacciones FR - CDR potencialmente críticas se pueden determinar modelando inicialmente las cadenas ligeras y pesadas de mLL2. Todos los residuos FR dentro de un radio de 4,5 \ring{A} de todos los átomos dentro de cada CDR se pueden por lo tanto identificar y retener en el modelo de diseño final de hLL2.
Una vez que se diseñan las secuencias para los dominios VK y VH de hLL2, la inserción de CDR se puede llevar a cabo mediante síntesis génica usando oligonucleótidos largos de ADN sintético como moldes y oligonucleótidos cortos como cebadores en una reacción de PCR. En la mayoría los casos, el ADN que codifica el dominio VK o VH será aproximadamente de 350 pares de bases de longitud. Teniendo en cuenta la degeneración de codones, se puede introducir fácilmente un único sitio de restricción, sin cambiar los aminoácidos codificados, en las regiones cerca de la mitad del al secuencia de ADN de los genes de V. Por ejemplo, en las posiciones de los nucleótidos de ADN 157 - 162 (posiciones de aminoácidos 53 y 54) para el dominio VH de hLL2, un único sitio ArvII se puede introducir mientras que se mantiene la secuencia de aminoácidos diseñada originalmente (Fig. 4 B). Se pueden generar dos oligonucleótidos de ADN de cadena sencilla no superpuestos (aproximadamente 150 pares de bases) cadena arriba y cadena abajo del sitio AvrII (véase, por ejemplo, oligo A y oligo B, ejemplo 3 más adelante) mediante un sintetizador automático de oligonucleótidos de ADN (sintetizador de ADN Cyclone Plus, Milligen - Biosearch). Ya que los campos de oligonucleótidos de ADN de longitud completa tales como los oligos A y B se puede esperar que se acorten, se pueden amplificar en dos pares de oligonucleótidos flanqueantes (SEQ ID números 10 y 11 de oligo para el oligo A; SEQ ID números 12 y 13 de oligo para el oligo B, ejemplo 3) en una reacción de PCR. Los cebadores se pueden diseñar con los sitios de restricción necesarios para facilitar la subclonación posterior. Los cebadores para el oligo A y oligo B deben contener secuencia de solapamiento en el sitio ArvII de manera que el producto resultante de PCR para los oligos A y B, respectivamente, se pueden unir en fase en el sitio ArvII para formar una secuencia de ADN de longitud completa (aproximadamente 350 pares de bases) que codifican el dominio VH de hLL2. La ligadura de los productos de PCR para el oligo A (digerido por restricción con PstI y ArvII) y B (digerido por restricción con ArvII y BstEII) en el sitio ArvII y su subclonación en los sitios PstII/BstEII del vector resultante, VHpBS, se puede completar en una etapa de ligadura de tres fragmentos (véase, por ejemplo, el ejemplo 3). La subclonación de la secuencia correcta en VHpBS se puede analizar primero mediante análisis de digestión de restricción y posteriormente confirmado por la reacción de secuenciación según Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 (1977)).
El fragmento HindIII/BamHI que contiene el promotor de Ig, secuencia guía y la secuencia de VH de hLL2 se puede escindir del vector de fase y subclonarse a los sitios correspondientes en el vector basado en pSVgpt, pG1g, que contiene la secuencia genómica de la región constante IgG humana, un potenciador de Ig y un marcados de selección gpt, que forma el vector de expresión final, hLL2pG1g. Estrategias similares se pueden emplear para la construcción de la secuencia VK de hLL2. El sitio de restricción elegido para la ligadura de los productos de PCR para los oligonucleótidos largos (oligos C y D, véase los ejemplos más adelante) pueden ser NruI en este caso.
La secuencia de ADN que contiene el promotor de Ig, secuencia guía y al secuencia VK de hLL2 se puede escindir del vector de fase VKpBP mediante tratamiento con BamHI/HindIII, y se puede subclonar en los sitios correspondientes de un vector basado en pSVhyg, pKh, que contiene la secuencia genómica de las regiones constantes de la cadena kappa humanas, un marcador de selección de higromicina, un potenciador de Ig y de kappa, que forma el vector de expresión final, hLL2pKh.
Ya que la humanización algunas veces da como resultado una reducción o incluso pérdida de afinidad de anticuerpo, se podría requerir modificación adicional con el fin de restablecer la afinidad original (véase, por ejemplo, Tempest y col., Bio/Technology 9: 266 (1991); Verhoeyen y col., Science 239: 1534 (1988)). Sabiendo que cLL2 muestra una afinidad de unión comparable a la de su homólogo murino (véase el ejemplo 5 más adelante), los diseños de defectuosos, si los hay, en la versión original de hLL2 se pueden identificar mezclando y emparejando las cadenas pesadas de cLL2 con las de la versión humanizada. El análisis de SDS - PAGE de los LL2 diferentes quiméricos mixto y emparejado humanizados en condiciones no reductoras (las conexiones de las cadenas L - H disulfuro permanecen intactas) y reductoras (las cadenas se separan, permitiendo el análisis de las relaciones de los diferentes tipos de cadenas pesadas y ligeras de las propiedades de la molécula). Por ejemplo, la migración como múltiples bandas o como un tamaño molecular aparente más alto puede ser debido la presencia de un grupo glicano en el sitio de glucosialción unido a N encontrado en al región FR1 del dominio VK murino de LL2. En otro ejemplo, una banda discreta que migra a aproximadamente 25 kDa es el tamaño molecular esperado para una cadena ligera no glucosilada.
En general, para preparar mAb de cLL2, las cadenas VH y VK de mLL2 se pueden obtener mediante clonación de PCR usando productos y cebadores de ADN. Orlandi y col., infra, y Leung y col., infra. Los cebadores de PCR de VK se pueden subclonar en un vector de fase basado en pBR327 (VKpBR) como se ha descrito anteriormente. Los productos de PCR de VH se pueden subclonar en un vector de fase basado en pBluescript (VHpBS) como se ha descrito anteriormente. Los fragmentos que contienen las secuencias de VK y VH, junto con el promotor y secuencias de péptido señal, se pueden escindir de los vectores de fase usando endonucleasas de restricción de HindIII y BamHI. Los fragmentos VK (aproximadamente 600 pares de bases) se pueden subclonar en un vector de expresión de mamífero (por ejemplo, pKh) convencionalmente. pKh es un vector de expresión basado en pSVhyg que contiene la secuencia genómica de la región constante kappa humana, un potenciador de Ig, un potenciador de kappa y el gen de resistencia a higromicina. De manera similar, los fragmentos de VH de 800 pares de bases se pueden subclonar en pG1g, un vector de expresión basado en pSVgpt que lleva la secuencia genómica de la región constante de IgG1 humana, un potenciador de Ig y el gen de la xantina - guanina fosforibosil tranferasa (gpt). Los dos plásmidos se pueden transfectar en células de expresión de mamíferos, tales como células Sp2/0-Ag14, mediante electroporación y seleccionarse para resistencia a higromicina. Las colonias que sobreviven a la selección se expanden, y los fluidos sobrenadantes se controlan para evaluar la producción de cLL2 mediante un procedimiento ELISA. Es deseable una eficacia de transfección de aproximadamente 1 - 10 x 10^{6} células. Se puede esperar con este sistema un nivel de expresión de anticuerpos de entre 0,10 y 2,5 \mug/ml.
El aislamiento de ARN, síntesis de ADNc, y amplificación se puede llevar a cabo como sigue. ARN total de células se puede preparara partir de una línea celular de hibridoma LL2, usando un total de aproximadamente 10^{7} células, de acuerdo con Sambrook y col., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, edición segunda., Cold Spring Harbor Press, 1989). Primero ADNc de cadena se puede transcribir de manera inversa a partir de ARN total convencionalmente, tal como usando el sistema de preamplificación Superscript (Gibcol/BRL., Gaithersburg, MD). En resumen, en un volumen de reacción de 20 \mul, 50 ng de cebadores al azar se pueden hibridar a 5 \mug de ARN en presencia de 2 \mul de tampón de síntesis 10X [Tris - HCl 200 mM (pH 8,4), KCl 500 mM, MgCl_{2} 25 mM, 1mg/ml de BSA], 1 \mul de dNTP 10 mM, 2 \mul de DTT 0,1 M, y 200 unidades de transcriptasa inversa SuperScript. La etapa de elongación se permite inicialmente que proceda a temperatura ambiente durante 10 minutos seguida de incubación a 42ºC durante 50 minutos. La reacción se puede terminar calentando la mezcla de reacción a 90ºC durante 5 minutos.
Las secuencias de VK y VH para cLL2 y hLL2 se pueden amplificar mediante PCR como describen Orlandi y col., Proc Natl. Acad. Sci., USA, 86: 3833 (1989)). Las secuencias de VK se pueden amplificar usando los cebadores CK3BH y VK5-3 (Leung y col., BioTechniques, 15: 286 (1993), que se incorpora en esta memoria descriptiva como referencia), mientras que las secuencias de VH se pueden amplificar usando el cebador CH1B que se hibrida a la región CH1 de IgG murina, y VHIBACK (Orlandi y col., 1989 anterior). Las mezclas de reacción de PCR que contienen 10 \mul del producto de las cadenas de ADNc, 9 \mul de tampón de PCR 10 X [KCl 500 mM, Tris - HCl 100 mM (pH 8,3), MgCl_{2} 15 mM, y gelatina al 0,01% (p/v)] (Perkin Elmer CETUR, Norwalk, CT), se puede someter a 30 ciclos de PCR. Cada ciclo de PCR preferiblemente consiste en la desnaturalización a 94ºC durante 1 minutos, hibridación a 50ºC durante 1,5 minutos, y polimerización a 72ºC durante 1,5 minutos. Los fragmentos amplificados de VKJ y VH se pueden purificar sobre agarosa al 2% (BioRad, Rich, CA). Véase el ejemplo 3 para un procedimiento para la síntesis de un oligo A (149 - mer) y un oligo B (140-mer) en un sintetizador de ADN automático Cyclone Plus (Milligan - Biosearch) para uso en la construcción de genes V humanizados.
Los productos de PCR para VK se pueden subclonar en un vector de fase, tal como un vector de fase basado en pBR327 VPkpBR que contiene un promotor de Ig, una secuencia de péptido señal y sitios de restricción convenientes para facilitar la ligadura en fase de los productos de PCR VK. Los productos de PCR para VH se pueden subclonar en un vector de fase similar, tal como el vector basado en pBluescript VHpBS. Los clones individuales que contienen los productos respectivos de PCR se pueden secuenciar, mediante, por ejemplo, el procedimiento de Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74: 5463 (1977)).
Las secuencias de ADN descritas en esta memoria descriptiva se toman para que incluyan todos los alelos, mutantes y variantes de los mismos, si son de origen natural o inducidos.
Los dos plásmidos se pueden co - tranfectar en una célula apropiada, por ejemplo, Sp2/0 - Ag14 de mieloma, colonias seleccionadas para resistencia a higromicina, y fluidos sobrenadantes para la producción de anticuerpos de cLL2 o hLL2 mediante, por ejemplo, un ensayo ELISA, como se describe más adelante.
La transfección, y ensayo para anticuerpos que secretan clones mediante ELISA, se pueden llevar acabo como sigue. Aproximadamente 10 \mug de hLL22pKh (vector de expresión de las cadenas ligeras) y 20 \mug de hLL2pG1g (vector de expresión de las cadenas pesadas) se pueden usar para la trasnfección de 5 x 10^{6} células de mieloma SP2 mediante electroporación (BioRad, Richmond, CA) de acuerdo con Co y col., J. Immunol., 148: 1149 (1992). Después de la transfección, las células se pueden hacer crecer en placas de microvaloración de 96 pocillos en medio HSFM completo (GIBCO, Gaithersburg, MD) a 37ºC, CO_{2} al 5%. El procedimiento de selección se puede iniciar después de dos días mediante la adición de medio de selección de higromicina (Calbiochem, San Diego, CA) a una concentración final de 500 \mug/ml de higromicina. Las colonias típicamente emergen 2 - 3 semanas después de la electroporación. Después las colonias se pueden expandir para análisis adicionales.
Los clones de transfectoma que son positivos para la secreción de la cadena pesada quimérica o humanizada se pueden identificar mediante un ensayo ELISA. En resumen, las muestras de sobrenadante (100 \mul) de cultivos de transfectomas se añaden por triplicado a placas de microvaloración de ELISA revestidas previamente con anticuerpo específico de fragmento F(ab')_{2}, anti humano (GAH) - IgG, (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Las placas se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente. Las proteínas no unidas se retiran lavando tres veces con tampón de lavado (PBS que contiene polisorbato 20 al 0,05%). Se añaden peroxidasa de rábano picante (HPR) conjugada a GAH - IgG, anticuerpos específicos del fragmento Fc (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) a los pocillos, (100 \mul de existencias de anticuerpos diluidas x 10^{4}, suplementadas con el anticuerpo no conjugado hasta una concentración final de 1,0 \mug/ml). Después de una incubación de 1 hora, se lavan las placas, típicamente tres veces. Una solución de reacción, [100 \mul, que contiene 167 \mug de ortofenileno - diamina (OPD) (Sigma, San Luis, MO), peróxido de hidrógeno al 0,025% en PBS], se añade a los pocillos. Se deja que se desarrolle el color en la oscuridad durante 30 minutos. La reacción se para mediante la adición de 50 \mul de solución de HCl 4 N en cada pocillo antes de medir la absorbancia 490 nm en un lector de ELISA automático (instrumentos Bio - Tek, Winooski, VT). Los anticuerpos quiméricos unidos se determinan después con relación a un patrón de anticuerpo quimérico irrelevante (obtenible de Scotgen, Ltd., Edimburgo, Escocia).
Los anticuerpos se pueden aislar del medio de cultivo como sigue. Los cultivos de transfectoma se adaptan a medio sin suero. Para la producción de anticuerpo quimérico, se hacen crecer células como 500 ml de cultivo en botellas rodantes usando HSFM. Los cultivos se centrifugan y el sobrenadante se filtra a través de una membrana de 0,2 micrones. El medio filtrado se pasa a través de una columna de proteína A (1 x 3 cm) a un caudal de 1 ml/min. Después la resina se lava con aproximadamente eo volúmenes de columna de PBS y se eluye el anticuerpo nido a proteína A de la columna con tampón glicina 0,1 M (pH 3,59 que contiene EDTA 10 mM. Las fracciones de 1,0 ml se recogen en tubos que contienen 10 \mul de Tris 3 M (pH 8,6), se determinan las concentraciones de proteína a partir de las absorbancias a 280/260 nm. Las fracciones de los picos se reúnen, se dializan contra PBS, y el anticuerpo se concentra, por ejemplo, con el Centricon 30 (Amican, Beverly, MA). La concentración de anticuerpos se determina mediante ELISA, como antes, y su concentración se ajusta hasta aproximadamente 1 mg/ml usando PBS. Se añade de manera convenientemente azida de sodio, 0,01% (p/v) a la muestra como conservante.
Las afinidades de unión comparativa de los anticuerpos mLL2, cLL2 y hcLL2 así aisladas se pueden determinar mediante ensayo de radioinmunidad directa. mLL2 se puede marcar con ^{131}I o ^{125}I usando el procedimiento de cloramina T (véase, por ejemplo, Greenwood y col., Biochem. J., 89: 123 (1963)) La actividad específica del anticuerpo yodado se ajusta típicamente hasta aproximadamente 10 \muCi/ \mug. Los anticuerpos marcados y no marcados se diluyen hasta las concentraciones apropiadas usando medio de reacción (HSFM suplementado con suero de caballo al 1% y 100 \mug/ml de gentamicina). Las concentraciones apropiadas de los anticuerpos tanto marcados como no marcados se añaden juntos a los tubos de reacción en un volumen total de 100 \mul. Se muestrea un cultivo de células Raji y se determina la concentración de células. Se centrifuga el cultivo y las células se lavan una vez en medio de reacción seguido de resuspensión en medio de reacción hasta una concentración final de aproximadamente 10^{7} células/ml. Todos los procedimientos se llevan a cabo en frío a 4ºC. La suspensión de células, 10 se muestrea, se añade a los tubos de reacción. La reacción se lleva a cabo a 4ºC durante 2 horas con agitación cuidadosa periódica de los tubos de reacción para resuspender las células. Después del período de reacción, se añaden 5 ml de tampón de lavado (PBS que contiene BSA al 1%) a cada tubo. La suspensión se centrifuga y el sedimento celular se lava una segunda vez con otros cinco ml de tampón de lavado. Después de la centrifugación, la cantidad de radiación restante que permanece en el sedimento celular se determina en un contador gamma (Minaxi, Packard Instruments, Sterling, VA). Las afinidades de unión a antígeno de la superficie de células Raji se los anticuerpos mixtos y emparejados y completamente humanizados se pueden comparar con la de cLL2 usando diversas concentraciones de la porción de Fc como competidores, como se evaluó mediante ensayo de citometría de flujo. Los anticuerpos LL2 residuales unidos a superficie que llevan las pociones de Fc humanas (cLL2 y LL2 mixto y emparejado) se pueden detectar mediante un anticuerpo específico de Fc anti - humano marcado con FITC en un ensayo de citometría de flujo. Cuando los anticuerpos LL2 mixtos y emparejado muestran afinidades de unión a antígeno similares a la de cLL2, se puede concluir que los diseños originales para la humanización de cadenas tanto pesadas como ligeras conservan la inmunorreactividad de mLL2.
A la internalización de los anticuerpos mLL2, cLL2 y hLL2 en células diana puede seguir el marcaje por fluorescencia, esencialmente de acuerdo con el procedimiento de Pirker y col., J. Clin. Invest., 76: 1261 (1985). Células cultivadas Raji se centrifugan y las células se resuspenden en medio limpio a una centrifugación de aproximadamente 5 x 10^{6} células/ml. A cada pocillo de placa de microvaloración de 96 pocillos, se añaden 100 \mul de la suspensión de células. Los anticuerpos, 40 \mug/ml en un volumen de 100 \mu se añaden a los pocillos de reacción a intervalos de tiempo de manera que terminen todas las reacciones simultáneamente. La placa se incuba a 37ºC en un incubador de cultivo de células de CO_{2}. Los anticuerpos no unidos se retiran por lavado de las células tres veces con FCS al 1%/PBS frío al final de la incubación. Después las células se tratan con 1 ml de Formaid - limpio [solución de formalina al 10% (Fisher, Fair Lawn, NJ)] durante 15 minutos a 4ºC. Después de lavar, los anticuerpos presentes bien sobre la superficie celular o dentro de las células se detectan mediante tratamiento con anticuerpos anti - ratón de cabra marcado con FITC (Tago, Burlingame, CA), o anticuerpo anti - humano de cabra marcado con FITC (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), dependiendo de si el anticuerpo que se está ensayando es murino, quimérico o humanizado, respectivamente. Las distribuciones de fluorescencia se evalúan usando un microscopio de fluorescencia BH - 2 (Olympus, Lake Success, NY).
La velocidad de internalización de anticuerpos se puede determinar se acuerdo con Opresko y col., (J. Biol. Chem., 262: 416 (1987)), usando anticuerpo radioyodado como marcador. En resumen, anticuerpos marcados radiactivamente (1 x 10^{4} cpm) se incuban con las células Raji (1 x 106 células / ml) a 4ºC durante 2 horas en 0,5 ml de medio DMEM que contiene suero humano al 1%. Después del intervalo de reacción, los anticuerpos unidos no específicamente se retiran mediante lavado tres veces con 0,5 ml de solución de DMEM. A cada uno de los tubos de reacción se añaden 0,5 ml de medio DMEM y la suspensión se incuba a 37ºC para la determinación de internalización. A intervalos de tiempo, se retiran triplicados de células y se enfrían inmediatamente en un baño de hielo para detener la internalización adicional. Las células se centrifugan a 1000 X g durante 5 minutos a 4ºC. El sobrenadante se retira y se cuenta para evaluar la radiactividad. La radiactividad unida a superficie se retira mediante tratamiento con 1 ml de tampón acetato 0,1 M/glicina 0,1 M a pH 3,0 durante 8 minutos en frío. Se determinan la radiactividad eliminada mediante tratamiento de ácido, y la que permanece asociada a las células. La relación de CPM_{internalización}/CPM_{superficie} se representa gráficamente frente al tiempo, para determinar la velocidad de internalización de la pendiente.
Se conocen bien los protocolos detallados para la mutagénesis dirigida por oligonucleótidos y técnicas relacionadas para mutagénesis de ADN clonado. Por ejemplo, véase Sambrook y col., Ausubel y col., anteriormente.
Los sitios de glicosilación unidos a Asn se pueden introducir en anticuerpo usando reacciones convencionales de mutagénesis de oligonucleótidos dirigida al sitio. Por ejemplo, para introducir un Asn en la posición 18 de una proteína kappa, se puede alterar un codón 18 de AGG a AAC. Para lograr esto, un molde de ADN de cadena sencilla se prepara a partir de una cepa adecuada de E. coli (por ejemplo, dutung-) con el fin de obtener una molécula de ADN que contiene un número pequeño de uracilos en lugar de timidina. Tal molde de ADN se puede obtener mediante clonación de M13 o mediante transcripción in vivo usando un promotor SP6. Véase, por ejemplo, Ausubel y col., eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECUALR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY, 1987. Un oligonucleótido que contiene la secuencia mutada se sintetiza convencionalmente, se hibrida al molde de cadena sencilla y se trata del producto con ADN polimerasa de T4 y ADN ligasa de T4 para producir una molécula de ADN de cadena doble. La transformación de las células de E. coli (dut^{+} ung^{+}) de tipo salvaje con el ADN de cadena doble proporciona una recuperación eficaz de ADN mutado.
Como alternativa, un sitio de glicosilación unido a Asn se puede introducir en una cadena ligera de anticuerpo usando un oligonucleótido que contienen la mutación deseada como cebador y clones de ADN de las regiones variables para la cadena VL, o usando ARN de células que producen el anticuerpo de interés como molde. También véase, Huse, en ANTIBODY ENGINEERING: A PRACTICAL GUIDE, Borrebaeck, ed., W. H. Freeman & Co., pp. 103 - 120, 1992. La mutagénesis dirigida al sitio se puede realizar, por ejemplo, usando el kit TRANFORMER™ (Clontech, Palo Alto, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Como alternativa, un sitio de glicosilación se puede introducir sintetizando una cadena de anticuerpo con oligonucleótidos de cebado mutuamente, uno de tales que contiene la mutación deseada. Véase, por ejemplo, Uhlmann, Gene 71: 29 (1988); Wosnick y col., Gene 60: 115 (1988); Ausubel y col., anterior, que se incorporan como referencia.
Aunque la descripción general mencionada anteriormente a la introducción de un sitio de glicosilación Asn en la posición 18 de la cadena ligera de un anticuerpo, tiene lugar para el experto en la técnica que es posible introducir sitios de glicosilación unidos en cualquier parte den la cadena ligera, o incluso en la región variable de la cadena pesada.
Las realizaciones representativas descritas más adelante se usan únicamente para ilustrar la invención. Los expertos en estas técnicas reconocerán que variaciones de los presentes materiales caen dentro del amplio alcance genérico de al invención reivindicada.
Ejemplo 1 Elección de marcos conservados humanos y diseño de secuencia para la humanización de anticuerpo monoclonado LL2
Comparando las secuencias de marcos conservado (FR) de las regiones variables (V) de tipo murino de LL2 con las de los anticuerpos humanos en la base de datos Kabat (Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Ofician de Impresión del gobierno de los Estados Unidos, Washington, D. C.), que se incorpora como referencia, las secuencias de REI humanas (Figura 1 A, secuencia ID Nº 6) y EU (figura 1 B, Secuencia ID números 9 y 10) se encontraron que mostraban el grado más alto de homología de secuencia a las FR de los dominios VK y VH de LL2, respectivamente. Por lo tanto, las FR de REI y EU se seleccionaron como los marcos conservados humanos en los que se injertaron las CDR para VK y VH de LL2, respectivamente. Sin embargo, la secuencia de FR4 de NEWM en lugar de la de EU, se usó para reemplazar la secuencia de FR4 de EU para la humanización de la cadena pesada de LL2. Basándose en los resultados de estudios de modelado por ordenador (figuras 2 A y 2 B), residuos de FR murinos que tienen contactos potenciales de CDR, que pudieran afectar a la afinidad y especificidad del anticuerpo resultante, se retuvieron en el diseño de las secuencias humanizadas de FR (figura 1).
Se construyeron dos versiones de cadena pesada humanizada. En la primera versión (hLL2-1, SEQ ID Nº 9), la glutamina (Q) en al posición de aminoácido 5 (numeración de Kabat) se introdujo para incluir un sitio de restricción PstI para facilitar su subclonación en el vector de fase (Figura 3). Este residuo murino se convirtió, mediante mutagénesis dirigida a oligo, al residuo de EU humano valina (V) en hLL2-2 (SEQ ID nº 8). Se debe observar que en al secuencia variable de la cadena kappa murina original, se identificó un sitio de glicosilación potencial unido a N en las posiciones 18 - 20 (figura 1, SEQ ID Nº 2) y se usó para la adición de carbohidratos. Este sitio de glicosilación no se incluyó en al secuencia de FR de REI usado para la humanización de la cadena ligera de LL2.
Véase el ejemplo 3 para más detalle de oligonucleótidos.
Ejemplo 2 Clonación de PCR y elucidación de secuencia para las regiones variables de cadena pesada y ligera de LL2
Las regiones variables para tanto las cadenas pesadas (VH) como ligeras (VL) de mLL2 (IgG2a) se obtuvieron mediante clonación de PCR usando cebadores de ADN como se describe en general anteriormente y en mayor detalle en el ejemplo 3, más adelante. Como la PCR es propensa a mutaciones, la secuencia de región variable de clones individuales múltiples para las cadenas o bien ligeras o pesadas se determinó para seis clones y se confirmó que eran idénticas antes del uso para la construcción del anticuerpo quimérico.
Los productos de PCR para VK se subclonaron en un vector de fase basado en pBR327, VKpBR, que contenía un promotor de Ig, una secuencia de péptido señal y sitios de restricción convenientes para facilitar la ligadura en fase de los productos de PCR de VK (figura 3 A). Los productos de PCR para VH se subclonaron en un vector de fase basado en pBluescript, VHpBS (figura 3 B).
Como se ha indicado anteriormente, al menos seis clones individuales que contenían los productos de PCR respectivos se secuenciaron de acuerdo con el procedimiento de Sanger y col., 1977, anterior. Todos se mostraron que llevan secuencias idénticas y se esclarecieron sus secuencias respectivas, como se muestra en la figura 4 A para la VK de LL2 (Secuencia ID Nº 1) y en la figura 4 B para VH de LL2 (Secuencia ID Nº 3). No se identificó ninguna mutación defectuosa dentro de las secuencias que codifican las regiones VK y VH. La comparación de las secuencias de las regiones variables amplificadas por PCR de LL2 con la base de datos de Kabat (Kabat y col., anteriormente) sugerían que las secuencias de VK y VH de LL2 pertenecen al subgrupo 5 y 2 B, respectivamente. Los residuos importantes tales como Cys para el enlace disulfuro entre dominios se retuvieron en las posiciones apropiadas.
En la región de marco conservado FR1 de VK, se identificó un sitio de unión de carbohidratos unido a N, Asn - Val - Thr, en la posición 18 - 20 (figura 4 A, SEQ ID Nº 2), sugiriendo que la VK de LL2 se podría glicosilar. Como se detallará más adelante, el análisis de SDS - PAGE en condiciones reductoras demostraron que este sitio de glicosilación Asn se utiliza de hecho para la adición de carbohidratos. Sin embargo, la presencia del sitio de glicosilación en la región variable no parece que afecte la inmunorreactividad del anticuerpo. Una comparación de la inmunorreactividad de mLL2 con al de cLL2 en un RIA competitivo mostró que los dos anticuerpos tienen actividades casi idénticas.
\newpage
Ejemplo 3 Síntesis de PCR/génica de los genes V humanizados
La secuencia diseñada para el dominio VH de hLL2, la construcción del dominio VH de hLL2 mediante oligonucleótidos largos y PCR, y el vector de fase VHpBS que contenía el dominio VH de hLL2 se resumen en el esquema mostrado en la figura 6.
Para la construcción del dominio de VH de hLL2, oligo A (149 - mer) y oligo B (140 -mer) se sintetizaron en un sintetizador automático de ADN automático CYCLONE PLUS™ (Milligen - Bioserch).
Oligo A (secuencia ID Nº 10 más adelante) representa la hebra negativa del dominio VH de h LL2 complementario a los nucleótidos 24 a 172.
Secuencia ID Nº 10
1
Oligo B (secuencia ID Nº 11 más adelante) representa la hebra negativa del dominio VH de hLL2 complementario a los nucleótidos 180 a 320.
Secuencia ID Nº 11
2
Los oligos A y B se escindieron del soporte y se desprotegieron mediante tratamiento con hidróxido amónico. Después las muestras se secaron a vacío (SpeedVac, Savant, Farmingdale, NY) y se volvieron a suspender en 100 \mul de agua, se retiraron oligómeros incompletos (menos que 100 - mer) mediante centrifugación a través de una columna de CHROMOSPIN - 100™ (Clonetech, Palo Alto, CA) antes de que los oligómeros de ADN se amplificaran mediante PCR. Todos los cebadores flanqueantes para las amplificaciones separadas y la clonación de PCR de oligos A y b se purificaron mediante SDS - PAGE esencialmente de acuerdo con los procedimientos de Sambrook y col., 1989, anterior. A partir del oligo purificado por CHROMASPIN, 1 \mul de solución madre muestra se amplificó por PCR en un volumen de reacción de 100 \mul añadiendo 5 \mu de secuencia de 5 \muM de Secuencia ID Nº 12 de oligo:
5'-CCA GCT GCA GCA ATC AGG GGC TGA AGT CAA GAA ACC TG-3'
y secuencia ID Nº 13 de oligo:
5'-AAG TGG ATC CTA TAA TCA TTC CTA GGA TTA ATG-3'
en presencia de 10 \mul de tampón PCR 10 X (KCl 500 mM, Tris . HCL 100 mM, pH 8,32, MgCl_{2} 15 mM) y 5 unidades de ADN polimerasa AMPLITAQ™ (Perkin Elmer CETUR, Norwalk, Ct). Esta mezcla de reacción se sometió a 30 ciclos de reacción de PCR que consistían en desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto, hibridación a 50ºC durante 1,5 minutos, y polimerización a 72ºC durante 1,5 minutos.
El oligo B se amplificó por PCR mediante los pares de cebadores de la Secuencia ID nº 14:
5'-TAA TCC TAG GAA TGA TTA TAC TGA GTA CAA TCA GAA CTT CAA GGA CCA G-3'
y la secuencia ID Nº 15
5'-GGA GAC GGT GAC CGT GGT GCC TTG GCC CCA GTA GAA CGT AGT AA-3'
en condiciones similares.
Los productos amplificados de PCR de doble cadena para los oligos A y B se purificaron por gel, se digirieron por restricción con PsTI/ArvII (producto de PCR de oligo) y BstEII/ArvII (producto de PCR de oligo B), y se subclonaron en los sitios PstI/BstEII del vector de fase de la cadena pesada, VHpBS. La secuencia de VH humanizada se subclonó en el vector pG1g, dando como resultado el vector de expresión de cadena pesada de IgG1, hLL2pG1g.
Para la construcción del ADN de longitud completa de la secuencia de VK humanizada, oligo E (150 - mer) y ligo F (121 - mer) se sintetizaron como se ha descrito anteriormente.
Secuencia ID Nº 16 de oligo E:
3
representa la hebra negativa del dominio VK humanizado complementario a los nucleótidos 31 a 180, y esta secuencia se amplificó mediante la Secuencia ID Nº 17 de oligo:
5'-GAC AAG CTT CAG CTG ACC CAG TCT CCA TCA TCT CTG AGC GCA TCT GTT GGA G-3'
y la secuencia ID Nº 18 de oligo:
5'-AGA GAA TCG CGA AGG GAC ACC AGA TTC CCT AGT GGA TGC CCA GTA-3'.
Secuencia ID Nº 19 de oligo F:
4
representa la hebra negativa del dominio VK de LL2 humanizado complementario a los nucleótidos 208 a 328, y se amplificó mediante la secuencia ID Nº 20 de oligo:
5'-GAC AAG CTT TCG CGA TTC TCT\GGC AGC GGA TCT GGG ACA G-3'
y la secuencia ID Nº 21 de oligo
5'-GAC CGG CAG ATC TGC ACC TTG GTC CCT CCA CCG-3'.
Los productos purificados por gel para los oligos E y F se digirieron por restricción con PvuII/NruI y NruI/BglIII, respectivamente. Los dos fragmentos de PCR E y F se unieron después al sitio NruI y se ligaron a los sitios complementarios PvuI/BcII del vector de fase de la cadena ligera, VKpBR. La secuencia de VK humanizada se subclonó en el vector pKh para formar en el vector de expresión de la cadena kappa humana final, hLL2pKh.
Para expresar los anticuerpos humanizados, se usaron aproximadamente 10 \mug de hLL2pKh linealizado y 20 \mug de hLL2pG1g linealizado para transfectar 5 x 10^{6} células SP2/0 mediante electroporación. Los transfectomas se seleccionaron con higromicina a 500 \mug/ml y el anticuerpo secretado se purificó sobre una columna de 1 x 3 cm de proteína A. Después de concentrar el anticuerpo purificado mediante centrifugación con un Centricon 30, la concentración de anticuerpos se determinó mediante ELISA. La concentración final del anticuerpo se ajustó hasta 1 mg/ml en tampón PBS que contenía 0,1% (p/v) de azida sódica como conservante.
En la figura 1, se compara la secuencia de aminoácidos entre los dominios VK de LL2 de tipo murino y humanizado (figura 1 A, SEQ ID números 2 y 6) y entre los dominios VH de LL2 de tipo murino y humanizado (figura 1 B, SEQ ID números 4, 9 y 8) En la cadena VK, las secuencias de marco conservado REI se usaron para todas las FR. En la cadena VH, las secuencias del marco conservado EU se usaron para FR 1 - 3, y se muestran las secuencias de FR que son diferentes de las del ratón. Los asteriscos indican las secuencias de FR murinas que son diferentes de las de FR de tipo humano en las posiciones correspondientes. Los residuos murinos en estas posiciones se retuvieron en al estructura humanizada, las CDR están dentro de casillas.
En la figura 4 A (Secuencias ID números 1 y 2) muestran las secuencias de ADN de doble cadena y de aminoácidos correspondientes (mostrado por el código de letras individuales) del dominio VK de LL2 de tipo murino. Las secuencias de aminoácidos de CDR 1 - 3 están dentro de casillas. La exposición correspondiente para VH se muestra en la figura 4 B (secuencias ID números 3 y 4).
En la figura 5 A (secuencias ID números 7 y 8) muestran las secuencias de ADN de doble cadena y las secuencias de aminoácidos de VK de LL2 y VH de LL2 humanizadas, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos se muestran mediante el código de letras individuales, y las secuencias de aminoácidos de CDR están dentro de casillas.
Ejemplo 4 Construcción, expresión y purificación de anticuerpos de LL2 quiméricos
Los fragmentos que contienen las secuencias de VK y VH de LL2, junto con las secuencias del promotor y del péptido señal, se escindieron de LL2VKpBR y LL2VHpBS, respectivamente, mediante digestión de restricción doble con HindIII y BamHI. Los fragmentos de VK de aproximadamente 600 pares de bases se subclonaron después en el sitio HindIII / BamHI de un vector de expresión de mamíferos, pKh (figura 3 A). pKh es un vector de expresión basado en pSVhyg que contiene la secuencia genómica de la región constante kappa humana, un potenciador de Ig, un potenciador de kappa y el gen de resistencia a higromicoina. De manera similar, los fragmentos de aproximadamente 800 pares de bases se subclonaron en el sitio HindIII / BamHI correspondiente de pG1g (Figura 3 B), un vector de expresión basado en pSVgpt que lleva la secuencia genómica de la región constante de IgG1, un potenciador de Ig y el gen de la xantina - guanina fosforibosil tranferasa (gpt). Los vectores finales de expresión finales se designan LL2pKh y LL2pG1g, respectivamente.
Los dos plásmidos se co - transfectaron en células Sp2 / 0 - Ag 14 mediante electroporación y se seleccionaron para resistencia a higromicina. Los sobrenadantes de las colonias que sobreviven en la selección se controlaron para secreción de anticuerpos quiméricos mediante ensayo ELISA (véase anteriormente). La eficacia de transfección era aproximadamente 1 - 10 x 10^{6} células. El nivel de expresión de anticuerpos, en un cultivo terminal, se encontró que variaba en el intervalo entre < 0,10 y 2,5 / \mug/ml.
La figura 7 muestra los resultados de analizar mLL2 (bandas 4 y 7) y cLL2 (bandas 5 y 8) purificados por la proteína A mediante SDS - PAGE en condiciones reductoras y no reductoras, respectivamente. HWS tolera marcadores de peso molecular alto, y LWS marcadores de peso molecular ligero. Las cadenas ligeras de tanto mLL2 como cLL2 (bandas 4 y 5) migraban principalmente como una banda doble, con un peso molecular aparente mayor que el esperado. Como la región constante kappa humana de cLL2 se sabe que no contiene ningún sitio potencial de glicosilación, se puede inferir que se utilizó el sitio potencial de glicosilación identificado en la región del dominio VK de LL2.
La figura 8 muestra los resultados de analizar diferentes versiones de los anticuerpos hLL2 y cLL2 mediante SDS - PAGE en condiciones reductoras y no reductoras. Como se ha indicado antes, LWM y HMW son marcadores de peso molecular. Las bandas 3 y 6 son anticuerpos cLL2. Las bandas 4 y 7 son hLL2 con siete residuos FR murinos en el dominio VH (hLL2 - 1). Las bandas 5 y 8 son hLL2 con 6 residuos FR murinos en el dominio VH (hLL2 - 2). Las cadenas ligeras humanizadas migraban más rápidamente y como bandas más discretas comparadas con las cadenas ligeras quiméricas.
La figura 9 muestra los resultados del análisis SDS - PAGE sobre anticuerpos mixtos y emparejados y cLL2 y hLL2 tanto en condiciones reductoras y no reductoras. Las bandas 1 y 2 son marcadores de peso molecular. Las bandas 3 y 7 son cLL2. Las bandas 4 y 8 son mixtos y emparejados con una cadena ligera humanizada y pesada quimérica [(hL/cH) LL2]. Las bandas 5 y 9 son cadenas ligeras quiméricas y pesadas humanizadas (versión 1) [(cL/hH) LL2 - 1]. Las bandas 6 y 10 son cadenas ligeras quiméricas y una pesada humanizada (versión 2) [(cL/hH) LL2 - 2]. La versión 1 de LL2 humanizada contiene 7 residuos FR murinos en el dominio VH, mientras que las versión 2 contiene 6 residuos FR murinos en el dominio VH. Es digno de mención que la posición de la cadena ligera de (hL/cH) LL2 (banda 4) es diferente de la de los otros, sugiriendo que no existe ninguna unión de carbohidratos a la cadena ligera de LL2 humanizado.
Ejemplo 5 Unión de anticuerpo cLL2 a antígenos de superficie de células Raji
Se llevó a cabo un ensayo de unión de células de competición para determinar la inmunorreactividad de cLL2 con relación a mLL2 precursor. Usando mLL2 marcado con ^{131}I (0,025 \mug/ml) como sonda, se incubaron células Raji con los anticuerpos y se determinó la unión relativa a las células a partir de la cantidad de mLL2 marcado unido a células (véase anteriormente). Como se muestra por los ensayos de competición descritos en la figura 10, tanto los anticuerpos mLL2 como cLL2 mostraron actividades de unión similares.
Los resultados se confirmaron mediante un segundo ensayo de competición sobre citometría de flujo. En resumen, usando las células Raji como antes y variando la concentración de un anticuerpo con relación a otro, como antes, la cantidad de mLL2 o cLL2 se determinó con anticuerpos anti - ratón Fc o anti - humano Fc marcados con FITC seguido de análisis usando citometría de flujo.
Ejemplo 6 Unión de anticuerpos hLL2 a antígenos a células Raji
En experimentos similares a los del ejemplo 5, las afinidades de unión a antígeno de las tres combinaciones diferentes de LL2 mixto y emparejado o humanizado se compararon con la de cLL2 en el ensayo de citometría de flujo.
En resumen, 1 \mug de anticuerpos cLL2, LL2 mixto y emparejado, hLL2 - 1, o hLL2 - 2 se incubaron con 10^{8} células Raji en presencia de concentraciones variables de fragmentos mLL2 F (ab')_{2} (como competidor) en un volumen final de 100 \mul de tampón PBS suplementado con FCS al 1% y azida sódica al 0,01%. La mezcla se incubó durante 30 minutos a 4ºC, y se lavó tres veces con PBS para retirar los anticuerpos no unidos. Teniendo ventaja de la presencia de porciones de Fc humanas en los anticuerpos, los niveles de unión de los anticuerpos se determinaron mediante la adición de un IgG1 anti - humano de cabra marcado con FITC diluido 20 X, anticuerpos específicos del fragmento Fc (Jackson UmmunoResearch, West Grove, PA). Las células se lavaron tres veces con PBS, e intensidades de fluorescencia medidas por un separador de células activadas por fluorescencia FACSCAN (Becton - Dickinson, Bedford, MA). Los resultados se muestran en la figura 1 A.
Usando los mismos procedimientos, cLL2 se comparó con dos versiones de hLL2 (figura 11 B).
Los resultados mostrados en la figuras 11 A y B demuestran que la inmunorreactividad de cLL2 es similar o idéntica a la de anticuerpos humanizados o mixtos y emparejados. Tomados junto con la comparación de cLL2 y mLL2 (figura 10), se establece la autenticidad de las secuencias para VK y VH quiméricos y humanizados obtenidos, y se confirma la funcionalidad de cLL2 y hLL2.
Ejemplo 7 Internalización de mLL2 y cLL2 mediante células Raji
Una de las características únicas del anticuerpo LL2 es su rápida internalización tras la unión a células Raji (Shi y col., 1994 anteriormente). LL2 murino después de la internalización es probable que se transfiera rápidamente al aparato de Golgi y a partir de ahí a los lisosomas, el orgánulo responsable de la degradación de una amplia diversidad de agentes bioquímicos (Keisari y col., Immunochem., 10: 565 (1973)).
Las velocidades de internalización de anticuerpos se determinaron de acuerdo con Opresko y col., 1987, anteriormente. La relación de CPM _{intracelular} / CPM _{superficie} se determinó en función del tiempo.
Las velocidades de internalización de anticuerpo LL2 se determinaron incubando el anticuerpo LL2 marcado radiactivamente (1 x 10^{6} cpm) con 0,5 x 106 células Raji en 0,5 ml de tampón DMEM que contienen suero humano al 1% durante 2 horas a 4ºC. El exceso de suero humano se incluyó para saturar los receptores de Fc de superficie de células Raji con el fin de excluir o minimizar la internalización específica de no antígeno mediada a través de los receptores de Fc. Los anticuerpos LL2 marcados radiactivamente no unidos se retiraron de las células lavando tres veces con porciones de 0,5 ml de DMEM a 4ºC. Después las células se incubaron a 37ºC, y, a intervalos de tiempo, se transfirieron alícuotas de las suspensión de células a hielo con el fin de detener la internalización. Las células en estas alícuotas se aislaron mediante centrifugación a 1000 x g durante 5 minutos a 4ºC, y LL2 marcado radiactivamente unido a superficie se depuró de células con 1 ml de acetato de glicina 0,1 M, pH 3, durante 8 minutos a 4ºC. Se determinaron la radiactividad así obtenida (CPM de superficie) y radiactividad restante en las células (CPM intracelular). Las velocidades de internalización se calcularon a partir de la pendiente de la representación gráfica de relaciones de radiactividad intracelular de superficie en función del tiempo.
Como se muestra en la figura 12, los anticuerpos mLL2, cLL2, cLL2Q y hLL2 se internalizaron a una velocidad similar (Ke = 0,107 (mLL2) a 0,1221 (cLL2Q, mutación NVT a QVT) Esos números sugirieron que aproximadamente el 50% del anticuerpo unido a superficie se puede internalizar en 10 minutos. Los resultados muestran que ni la quimerización ni la humanización ni la desglicosilación por mutagénesis de los anticuerpos mLL2 alteran las velocidades de internalización.
Los patrones de internalización para mLL2, cLL2 y hLL2 también se controlaron mediante microscopía de fluorescencia en una base del transcurso del tiempo usando una segunda sonda de anticuerpo marcada con FITC como se describe en la memoria descriptiva. La internalización de ambos anticuerpos se observó en el momento más temprano que se puede medir. A los 5 minutos, se observaron anticuerpos tanto en la superficie de la célula como internalizados en áreas inmediatamente adyacentes a la membrana como microvesículas citoplásmicas. A los 15 minutos después de la incubación, los puntos finos dispersados alrededor de la intramembrana comenzaron a emerger en un grupo de gránulos, en localizaciones que se cree que son el aparato de Golgi. Ya que se internalizaron más anticuerpos después de 30 minutos de incubación, se observó la redistribución de los anticuerpos agrupados a localizaciones dispersadas, probablemente los lisosomas en los que los anticuerpos se degradaron. A las 2 horas después de la incubación, la mayoría de los anticuerpos se encontró en el interior de la célula. Solamente una fuerte tinción de superficie se observó cuando LL2 se incubó durante 20 minutos en hielo. Tanto mLL2 como cLL2 se internalizaron con un patrón similar. La internalización de LL2 se asoció específicamente con unión antígeno - anticuerpo, como el anticuerpo humanizado de control irrelevante demostró solamente tinción de superficie sin interés.
El anticuerpo A103 (un anticuerpo IgG2a que se une a la superficie de todas las células epiteliales humanas pero no se internaliza de manera eficaz (Mattes y col., Hybridoma, 2: 253 (1983)) mostró tinción de membrana fuerte a hasta 2 horas, mientras el anticuerpo del receptor anti - tranferina (5F9) se internalizó rápidamente, justo como hizo LL2.
Ejemplo 8 Función del sitio de glicosilación en la región FR1 de la secuencia VK de LL2
De particular interés en la invención es la identificación de un sitio de glicosilación de Asn en la posición 18 - 20 dentro de la región FR1 de la secuencia de la cadena ligera de NVT de LL2 (figura 4 A SEQ ID Nº 2). Como se ha mostrado anteriormente, el análisis SDS -PAGE en condición reductora sugiere que el sitio de glicosilación de Asn se utiliza para la adición de carbohidratos.
En este ejemplo, se examinó la influencia del resto de carbohidrato en la posición 18 - 20 sobre las actividades funcionales de las cadenas ligeras.
Las cadenas ligeras de LL2 murinas y quiméricas se trataron con (+) o sin (-) endoglicosidasa F convencionalmente, y los productos de anticuerpos examinados por SDS - PAGE en condiciones reductoras y no reductoras (figura 13). No había distinción entre los tipos de anticuerpo con relación al comportamiento electroforético. En ambos casos, la desglicosilación reducía la velocidad de migración de la cadena ligera.
El efecto de glicosilación sobre al afinidad de unión a células Raji del anticuerpo mLL2 se muestra en al figura 14. La eliminación de carbohidratos mediante la endonucleasa F no tenía influencia sobre la actividad de unión.
Se introdujo una mutación en la posición 18 de la cadena ligera de manera que el Asn se reemplazó con Gln para producir FR1 de VK del LL2Q. Los análisis de SDS - PAGE demostraron que la mutación de NVT a QVT anulaba la glicosilación del anticuerpo. La comparación de la afinidad de unión de las células Raji para cLL2 con y sin glicosilación de VK de las cadenas ligeras demostró que el resto carbohidrato no tenía influencia sobre la unión del anticuerpo a estas células.
Se puede concluir que la presencia del sitio carbohidrato en la región variable no afecta a la inmunorreactividad del anticuerpo. Los estudios de modelo por ordenador sugirieron que el resto carbohidrato de VK en LL2 se posiciona remotamente a partir de las CDR y forma un "remate" sobre los bucles de la parte inferior de los carriles \beta asociados a FR que soportan las CDR.
La humanización sin inclusión del sitio de glicosilación original dio como resultado un anticuerpo LL2 injertado en CDR con inmunorreactividad comparable a la de su homólogo murino.
Estas características indican que el sitio de glicosilación se puede usar para conjugar agentes terapéuticos o de diagnosis a LL2 sin comprometer la capacidad del anticuerpo de unirse e internalizarse en linfoma B o células de leucemia.
Ejemplo 9 Conjugación de LL2 en su sitio que lleva carbohidrato
La carencia aparente de implicación del resto carbohidrato de las regiones variables en las actividades funcionales de los mAB mLL2, cLL2 y hLL2 indica que este resto podría usarse rentablemente como el sitio de unión de agentes citotóxicos o de detección tales como radionúclidos o toxinas, y por lo tanto evitar la interferencia potencial con la unión del conjugado a una superficie celular.
Usando los procedimientos descritos en Shih y col., patente de Estados Unidos Nº 5.057.313 (que se incorpora como referencia) para preparar conjugados de anticuerpos a través de un resto carbohidrato oxidado del anticuerpo y un grupo alquilamino primario de un vehículo polimérico al que se unen covalentemente uno o más de una diversidad de fármacos, toxinas, quelantes y marcadores detectables, un fragmento de anticuerpo de LL2 doxorubicina - dextrano desprovisto de glicanos anexos se produjo conteniendo copias múltiples del fármaco. Los restos carbohidratos de la región de FR1 de VK de cLL2 implicada estaban unidas covalentemente al sitio de glicosilación de Asn.
En una síntesis, dextrano (18 - 40 kDa) se convirtió en un amino dextrano mediante la oxidación del dextrano por NaIO_{4}, formación de base de Shijj con NH_{2}-CH_{2}-CHOH-CH_{2}-NH_{2}, y reducción con NaBH_{4}. El amino dextrano después se condensó con doxorubicina (DOX) en presencia de anhídrido succínico y 1-etil-3-(3-diemtilaminopropil)carbodiimida para producir DOX-aminodextrano. Esto último se condensó después con un grupo aldehído sobre FR - 1 de VK de LL2 producido por oxidación del resto carbohidrato del fragmento de anticuerpo con NaIO4.
En una preparación de DOX - LL2, el número de moles de DOX unida a dextrano era 14 moles por mol de dextrano, y el número de moles de doxorubicina por mol de F (ab')2 era 8,9. La inmunorreactividad en el ensayo de unión de células Raji anterior era aproximadamente el 80% de los valores control.
Este sistema de conjugación no se limita al anticuerpo mLL2. En un estudio comparativo, se encontraron 15 - 19 moles de DOX/mol de cLL2.
Las posibilidades de conjugación no se limitan al uso de un dextrano vehículo como en el ejemplo anterior. Por ejemplo, el resto carbohidrato de la región FR1 de VK de LL2 se puede oxidar para producir grupos aldehídos. Éstos a su vez pueden reaccionar con un grupo amino o cualquier fármaco para producir una base de Schiff que, tras reducción, produce múltiples copias de fármaco unido de manera estable al anticuerpo mediante grupos alquilamina.
Por ejemplo, cuando el fármaco es aminohexilo DTPA (un agente quelante), se produce un LL2 unido covalentemente a un quelante. El quelante se puede utilizar para administrar a los tejidos diana, por ejemplo, un radionúclido o ion metálico paramagnético, con un potencial para usos diagnósticos y terapéuticos. Los conjugados DTPA - LL2 se produjeron conteniendo 5,5 moles de quelante/mol de anticuerpo que, a su vez, quelaba el 47,3% de Y-90 y el 97,4% de In-111.
Se debe enfatizar que los ejemplos descritos anteriormente describen solamente realizaciones específicas de la invención, y los solicitantes no pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones por estos ejemplos específicos.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: IMMUNOMEDICS, INC.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 300 American Road
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
(C) CIUDAD: Morris Plains
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO O PROVINCIA: New Jersey
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 07950
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ANTICUERPOS INMUNOCONJUGADOS E HUMANIZADOS ESPECÍFICOS PARA LINFOMA DE CÉLULAS B Y CÉLULAS DE LEUCEMIA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 21
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE DE ORDENADOR:
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(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC - DOS/MS - DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn liberación nº 1,0, versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FECHA DE SOLICITUD ACTUAL
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US95/09641
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 11 de agosto de 1995
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FECHAS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/289.576
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 12 de agosto de 1994
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 339 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 .. 339
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 1:
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 113 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 2:
6 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 348 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 .. 348
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 4:
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 339 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 .. 339
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 5:
10 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 113 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 6:
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 348 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LOCALIZACIÓN: 1 .. 348
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 7:
12 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 8:
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 149 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEQ ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 134 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEQ ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEQ ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCAGCTGCAG CAATCAGGGG CTGAAGTCAA GAAACCTG 
\hfill
38 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEQ ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGTGGATCC TATAATCATT CCTAGGATTA ATG 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEQ ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAATCCTAGG AATGATTATA CTGAGTACAA TCAGAACTTC AAGGACCAG 
\hfill
49 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEQ ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGAGACGGTG ACCGTGGTGC CTTGGCCCCA GTAGAACGTA GTAA 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 150 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEQ ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 52 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEQ ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GACAAGCTTC AGCTGACCCA GTCTCCATCA TCTCTGAGCG CATCTGTTGG AG 
\hfill
52 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEQ ID Nº: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGAGAATCGC GAAGGGACAC CAGATTCCCT AGTGGATGCC CAGTA 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 121 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEQ ID Nº: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEQ ID Nº: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GACAAGCTTT CGCGATTCTC TGGCAGCGGA TCTGGGACAG 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: SEQ ID Nº: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GACCGGCAGA TCTGCACCTT GGTCCCTCCA CCG 
\hfill
33

Claims (22)

1. Un polinucleótido aislado que codifica la secuencia de aminoácidos de una región variable de las cadenas pesadas de un anticuerpo monoclonal (mAb) de células de leucemia antilinfocítica (LL2) que comprende:
i)
las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena pesada de un LL2 murino (mLL2), en las que CDR1 comprende los aminoácidos 31 a 35 de la SDEQ ID Nº 4, CDR2 comprende los aminoácidos 50 a 66 de la SEQ ID Nº 4 y CDR3 comprende 99 a 105 de la SEQ ID Nº 4, en la que el mAb de LL2 conserva la inmunorreactividad del mLL2; y
ii)
regiones de marco conservado (FR) de una región variable de las cadenas pesadas de al menos un anticuerpo humano;
en el que el mAB de LL2 conserva la inmunorreactividad de mLL2.
2. Un polinucleótido aislado de la reivindicación 1 que codifica la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Números 8 ó 9.
3. Un polinucleótido aislado de la reivindicación 1 o reivindicación 2 que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID Nº 7.
4. Un polinucleótido aislado que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable de las cadenas ligeras del anticuerpo monoclonal (mAb) de células de leucemia antilinfocítica (LL2) que comprende:
i)
las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena ligera de un LL2 murino (mLL2), en el que CDR1 comprende los aminoácidos 24 a 40 de la SDEQ ID Nº 2, y CDR2 comprende los aminoácidos 56 a 62 de la SEQ ID Nº 2 y CDR3 comprende 95 a 102 de la SEQ ID Nº 2; y
ii)
regiones de marco conservado (FR) de una región variable de las cadenas ligeras de al menos un anticuerpo humano;
en el que el mAB de LL2 conserva la inmunorreactividad de mLL2.
5. Un polinucleótido aislado de la reivindicación 4 que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID Nº 6.
6. Un polinucleótido aislado de la reivindicación 4 o reivindicación 5 que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID Nº 5.
7. Un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
8. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Una célula hospedadora que comprende un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. Una célula hospedadora de la reivindicación 9, en la que dicha célula es una célula de mamífero.
11. Una célula hospedadora de la reivindicación 10, en la que dicha célula de mamífero es una célula de mieloma.
12. Un procedimiento para la expresión de una región variable de las cadenas pesadas de un anticuerpo monoclonal (mAb) de LL2 que comprende:
(a)
transfectar una célula de mamífero con un polinucleótido que comprende un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y
(b)
cultivar dicha célula que secreta dicha región variable de las cadenas pesadas de un mAb de LL2 o dicho fragmento del mismo.
13. Un procedimiento para la expresión de una región variable de las cadenas ligeras de un anticuerpo monoclonal (mAb) de LL2 que comprende:
(a)
transfectar una célula de mamífero con un polinucleótido que comprende un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6; y
(b)
cultivar dicha célula que secreta dicha región variable de las cadenas pesadas de un mAb de LL2 o dicho fragmento del mismo.
14. Un procedimiento para la expresión de un anticuerpo monoclonal (mAb) de LL2 que comprende:
(a)
transfectar una célula de mamífero con un polinucleótido que comprende un polinucleótido de la reivindicación 7; y
(b)
cultivar dicha célula que secreta dicho mAb de LL2 o dicho fragmento del mismo.
15. Una cadena pesada del anticuerpo monoclonal (mAb) de LL2 que comprende una región variable codificada por un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
16. Una cadena ligera del anticuerpo monoclonal (mAb) de LL2 que comprende una región variable codificada por un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
17. Un anticuerpo monoclonal (mAb) de LL2 o un fragmento de unión a antígeno que comprende una cadena pesada del anticuerpo monoclonal (mAb) de acuerdo con la reivindicación 15 y una cadena ligera del anticuerpo monoclonal de LL2 de acuerdo con la reivindicación 16.
18. Una célula de células de linfoma B y célula de leucemia que dirige el conjugado de diagnóstico o terapéutico, que comprende un mAb de LL2 de la reivindicación 17 que se une a dichas células, en la que dicho mAb de LL2 o fragmento del mismo se une a un reactivo diagnóstico o terapéutico.
19. Un conjugado de la reivindicación 18, en el que dicho reactivo diagnóstico o terapéutico comprende un fármaco quimioterapéutico, tal como doxorubicina, metotrexato, taxol, un marcador detectable, tal como una molécula fluorescente, o un agente citotóxico, tal como un metal pesado, un radionúclido o una toxina, tal como endotoxina de Pseudomonas.
20. Un conjugado de la reivindicación 18, en el que dicho agente se une a dicho mAb o fragmento del mismo, por medio de un resto carbohidrato de dicho mAb o fragmento del mismo.
21. Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 17 o un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 para uso en terapia.
22. Uso de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 17 o un conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 en la fabricación de un medicamento para diagnosis de tratamiento de linfoma de células B o leucemia linfocítica.
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