ES2325492T3 - Fragmentos de anticuerpos especificos para el antigeno carcinoembrionario (ace) humano. - Google Patents

Abstract

Fragmentos de anticuerpo tipo Fv de cadena sencilla (scFv) mono y divalente (diacuerpo), obtenidos por técnicas de ADN recombinante a partir del anticuerpo monoclonal (AcM) anti-antígeno carcinoembrionario (CEA) CB/ior-CEA.1. Este AcM tiene muy alta afinidad por el CEA y se emplea en el diagnóstico y seguimiento de tumores colorectales del hombre. Como el AcM original, los fragmentos scFv monovalente y diacuerpo exhiben altas afinidades por el CEA humano y reconocen un epítope dependiente de la conservación de carbohidratos. El fragmento scFv monovalente y diacuerpo tienen constantes de afinidad por el CEA de (5.0 ñ 0.4) x 109 L mol-1 y (2.8 ñ 0.3) x 1010 L mol-1, respectivamente. Estos dos fragmentos no presentan reactividad cruzada con células y tejidos humanos normales, excepto la mucosa colónica normal donde el CEA está ocasionalmente presente. Los fragmentos pueden producirse mediante la expresión en microorganismos recombinantes, a partir del clonaje de secuencias de ácidos nucleicoscodificantes para regiones variables obtenidas del hibridoma que produce el AcM CB/ior-CEA.1. Al igual que el AcM original, el scFv monovalente y el diacuerpo tienen la capacidad de identificar in vivo en ratones a células productoras de CEA humano que crecen formando tumores. El scFv monovalente y el diacuerpo tienen un tamaño molecular 5 y 2.5 veces inferior, respectivamente, que el AcM de ratón y no poseen dominios Fc, lo que les confiere el potencial de penetrar mejor los tejidos in vivo y de ser menos inmunogénicos en el hombre.

Description

Fragmentos de anticuerpos específicos para el antígeno carcinoembrionario (ACE) humano.

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de inmunología, y en particular se refiere a fragmentos de anticuerpo del tipo Fv de una sola cadena, en sus formas mono- y divalentes (diacuerpo), obtenidas mediante técnicas de ADN recombinante a partir de un anticuerpo monoclonal de ratón de eficacia clínicamente probada, que es específica para el antígeno carcinoembrionario humano.

Antecedentes de la invención

El antígeno carcinoembrionario (ACE) es una glicoproteína de180 kDa, secretada preferiblemente por las células de los tumores humanos gastrointestinales y otros carcinomas incluso aunque se pueden detectar en algunos tejidos no malignos como la mucosa de colon. Su papel fisiológico no ha sido no ha sido totalmente dilucidado, y hasta el momento se cree que está asociado de alguna forma a los procesos de adhesión de células (Gold P, Freedman SO. Journal of Experimental Medicine 122: 467: 1965; Zimmermann W et al. PNAS USA 84: 2960-2964; 1987; Paxton RJ et al. PNAS USA 84: 920-924, 1987; Beauchemin N et al. Molec. Cellular Biol. 7: 3221-3230, 1987; Gold P, Goldenberg NA. MJM 3: 46-66,1997).

El ACE es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulina, debido a su estructura caracterizada por dominios repetitivos (Oikawa S et al. BBRC 144: 634-642, 1987; Thompson J, Zimmermann W. Tumor Biology 9: 63-83, 1988; Hammarstrom S. Seminars in Cancer Biology 67-81, 1999). El ACE tiene una alta homología con otras moléculas de esta superfamilia, tal como el NCA, en antígeno de meconio, la Glicoproteína de tipo A de Biliar, y la Glicoproteína b específica del embarazo (von Kleist S, Burtin P. Immunodiagnosis of Cancer. Marcel Dekker. 322-341, 1979; Buchegger, F. et al. Int. J. Cancer 33; 643-649, 19984; Matsuoka Y et al. Cancer Res. 42: 2012-2018, 1982; Svenberg T. Int. J. Cancer 17: 588-596, 1976).

La elevación de los niveles circulantes de ACE se considera desde hace muchos años como uno de los mejores indicadores de una posible recaída y/o metástasis, en pacientes sometidos a cirugía para los tumores colorrectales primarios que expresan este antígeno (Gold P, Goldenberg NA. MJM 3: 46-66, 1997). La medición de ACE circulante también se ha extendido como un procedimiento para el seguimiento de otros carcinomas humanos (mama, pulmón), en los casos en los que se han demostrado niveles antes de la cirugía significativos de este marcador de tumor (Gold P, Goldenberg NA. MJM 3: 46-66, 1997). Desde el descubrimiento de la tecnología de la tecnología para la generación de de anticuerpos monoclonales (Mab; Kohler G, Milstein C. Nature 256: 52-53, 1975), los inmunoensayos para la medición de ACE circulante han mejorado en especificidad y su uso se ha extendido en gran medida.

El ACE también se ha estudiado desde hace muchos años como una posible "célula diana" con el fin de dirigir de manera específica los isótopos radiactivos para la diagnosis in vivo (Goldenberg DM Int. J. of Biol. Markers 7; 183-188, 1992) y radioterapia in situ (Ledermann et al., Int. J. Cancer 47; 659-664, 1991). Su uso también se ha previsto para dirigir toxinas, fármacos, y otros productos bioactivos hacia las células tumorales (Bagshawe KD. Drug Dev. Res. 34: 220-230, 1995).

Los anticuerpos anti ACE han sido los principales vehículos para tales propósitos, a partir de preparaciones policlonales, que siguen más tarde a Mab de ratón, sus fragmentos Fab, fragmentos de anticuerpo obtenidos por modificación genética a partir de Mab de ratón, y más recientemente, a partir de genotecas de anticuerpos murinos y humanos desplegado en fago filamentoso (Hammarstrom S et al. Cancer Res. 49, 4852-4858, 1989; Hudson PJ Curr. Opinion Inmunology 11: 548-557, 1999; Griffiths AD et al. EMBO J. 12, 1993; 725-734; Griffiths AD et al. EMBO J. 13 3245-3260, 1994; WO93/11236; Chester K et al 1995, WO 95/15341; Allen DJ et al. 1996, US5872215).

La expresión de anticuerpos fragmentos de anticuerpo en células procarióticas de tipo E. coli, y en otros microorganismos está bien establecida en la técnica (Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551, 1991; Gavilondo J, Larrick JW. Biotechniques 29: 128-132, 134-136, 2000). La expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo, en células eucarióticas superiores en cultivo también es conocida por los expertos en la técnica (Reff ME. Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576, 1993; Trill JJ et al. Curr. Opinion Biotech 6: 553-560, 1995).

Kim et al. (Hybridoma 20 (4), 2001, p. 265-271) caracterizan anticuerpos monoclonales contra ACE producidos en líneas celulares obtenidas mediante la fusión de células de bazo de ratones Balb/C inmunizados con ACE y células de mieloma SP2/O.

El Mab de ratón denominado indistintamente CB-ACE.1 o ior-ACE.1 (denominado de aquí en adelante CB/ior-ACE. 1) se conoce en la técnica. Este Mab tiene una alta especificidad para ACE, no tiene reacciones cruzadas no deseadas con moléculas tales como NCA, ni reconoce tejidos normales, a excepción de las células del epitelio de colon normal, donde ACE se puede encontrar normalmente polarizado (Tormo B et al. APMIS 97: 1073-1080, 1989). Este Mab tiene una afinidad muy alta por ACE (Pérez L et al. Applied Biochem. Biotechnol. 24: 79-82, 1996). Este Mab marcado con ^{99m}Tc se ha empleado de manera exitosa en la diagnosis y seguimiento de tumores colorrectales humanos. Los estudios clínicos de radioinmunodetección mostraron que tiene una sensibilidad de 91,3%, especificidad de 77,1%, y 82,8% de valor predictivo positivo (Oliva JP et al. Rev Esp Med Nucl. 13: 4-10, 1994). Esto lo hace superior en comportamiento con respecto a cualquier otro anticuerpo monoclonal un anti-ACE empleado de forma clínica en el mundo actualmente para tales propósitos, el ACE-Scan (^{99m}Tc-Arcitumomab) de Immunomedics (Morris Plains, NJ, Estados Unidos).

El desarrollo de un fragmento de anticuerpo de Fv de una sola cadena (scFv), obtenido mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir del ARN extraído del hibridoma que produce el Mab CB/ior-ACE. 1, se reseñó en 1992 (Ayala M et al. Biotechniques 13: 790-799, 1992). En la estrategia experimental seguida, la amplificación de los dominios variables de CB/ior-ACE.1 se realizó con los oligonucleótidos para las regiones marco conservadas de amos dominios variables. El scFv se produjo en E. coli y demostró reconocimiento de ACE en estudios de ELISA y citoquímica, pero con una afinidad por el antígeno inmovilizado 200 veces menor que el Fab obtenido de forma natural (Pérez L et al. Applied Biochem. Biotechnol. 24: 79-82, 1996). Se clonó este mismo fragmento scFv, se clonó, se expresó y se produjo en Pichia pastoris (Freyre FM et al. J Biotechnol. 76 (2-3): 157-163, 2000) sin ninguna mejora en afinidad por ACE humano, y los estudios llevados a cabo en animales de experimentación con el fragmento marcado radiactivamente indicaron una biodistribución anómala (Pimentel GJ et al. Nud Med Commun. 22: 1089-94, 2001), que motivaron que no continuara su desarrollo posterior.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a fragmentos de anticuerpo Fv de una sola cadena (scFv) como se define en la reivindicación 1, en sus formas mono y divalentes (diacuerpo). Estos se pueden obtener mediante técnicas de ADN recombinantes partiendo del anticuerpo monoclonal CB/ior-ACE. 1 del antígeno anti-carcinoembrionario (ACE) (Tormo B et al. APMIS 97: 1073-1080, 1989). Este Mab tiene una afinidad muy alta por ACE (Pérez L et al. Applied Biochem. Biotechnol. 24: 79-82, 1996) y se ha empleado de manera exitosa en la diagnosis y seguimiento de tumores colorrectales humanos (Oliva JP et al. Rev Esp Med Nud. 13: 4-10, 1994). Los fragmentos de scFv monovalentes y diacuerpo reseñados en la presente invención se pueden producir a través de de su expresión en microorganismos recombinantes, como bacterias y levaduras. Como el Mab original, los fragmentos de scFv monovalentes y diacuerpo son específicos para un epítope de ACE humano que depende de la conservación de los carbohidratos y muestran altas afinidades por este antígeno. Los fragmentos de scFv monovalentes y diacuerpo tienen un patrón de reconocimiento in vitro de de células normales y tumorales humanas como el Mab original y, como éste, una vez que se ha marcado radiactivamente, tienen la capacidad de identificar las células tumorales que expresan ACE humano que se desarrollan en ratones congénitos atímicos. Los fragmentos de scFv monovalentes y diacuerpo no tienen dominios Fc y tienen un tamaño molecular inferior que el Mab de ratón, esto les confiere que el potencial de penetrar mejor en los tejidos in vivo y que sea menos inmunogénico cuando se aplica a los seres humanos para propósitos de diagnóstico y terapéuticos.

Los fragmentos de scFv monovalentes y diacuerpo reseñados en la presente invención tienen diferencias importantes en los aminoácidos en los dominios variables de cadena pesad (VH, y cadena ligera (VL), con respecto a otro scFv desarrollado de manera previa a partir del mismo Mab, y sobrepasarlo en afinidad por ACE, en el comportamiento para el reconocimiento de células y tejidos, y en eficacia para la localización de los tumores que producen desarrollo de ACE humano in vivo en ratones.

Los fragmentos de scFv monovalentes y diacuerpo reseñados en la presente invención se desarrollaron usando técnicas de PCR, clonación y expresión en microorganismos recombinantes, a partir del ARN extraído del mismo hibridoma CB/ior-ACE.1. Los conjuntos de oligonucleótidos diferentes de los usados para obtener un scFv reseñado anteriormente (Ayala et al. Biotechniques 13: 790-799, 1992), se emplearon para la amplificación y aislamiento de las secuencias de base que codifican los dominios Mab VH y VL. En la invención se muestra que el nuevo scFv monovalente y diacuerpo tiene importantes diferencias en las secuencias de aminoácidos de los dominios VH y VL, con respecto a un scFv obtenido previamente, Y que éstos tienen la forma de 16 aminoácidos en los marcos conservados 1 (FR1) y 3 (FR3) y en la región determinante complementaria 2 (CDR2) del dominio VH, diferente con relación al scFv obtenido previamente, y 3 aminoácidos entre el FR1 y FR3 de los dominios VL, diferentes con relación a scFv obtenido anteriormente. Esto indica que estos dominios tienen un origen clonal diferente con respecto a los reseñados en Ayala et al. Biotechniques 13: 790-799, 1992. En el caso del diacuerpo, éste solamente se diferencia del scFv obtenido previamente en el tamaño y composición de aminoácidos del segmento de unión (engarce) que se emplea en la fabricación de la molécula de tipo scFv.

Los cambios se reflejan sorprendentemente en las propiedades bioquímicas y biológicas de los nuevos fragmentos, y les proporcionan un comportamiento muy similar al Mab CB/ior-ACE.1, y mucho más superior que la del scFv reseñada previamente. El nuevo fragmento de scFv monovalente, que tiene un engarce idéntico al scFv reseñado previamente (Ayala et al. Biotechniques 13: 790-799, 1992), pero los cambios de aminoácidos anteriormente mencionados en los dominios variables, tiene una afinidad constante para ACE mucho más alta que la de scFv reseñada anteriormente.

También, el diacuerpo sobrepasa ambas formas de scFv monovalentes en su afinidad constante para el ACE humano. Los dos nuevos fragmentos de scFv monovalentes diacuerpo conservan las propiedades de especificidad del Mab original con respecto al reconocimiento de ACE, identificación de células y tejidos tumorales, ausencia de reactividad cruzada con NCA, y capacidad para acumularse de manera selectiva en un tumor que produce ACE humano trasplantado en seres ratones, todos los cuales tienen un comportamiento mucho más superior que los de scFv obtenidos previamente.

Los dos nuevos scFv monovalente y diacuerpo tienen tamaños moleculares de al menos 5 y 2,5 veces menor que el MAb original, respectivamente, un hecho que confiere a éstos el potencial para penetrar mejor los tejidos y ser menos inmunogénicos en el ser humano, todo lo cual hace que sean más atractivos y presumiblemente superiores al Mab CB/ior-ACE.1 original para dirigir radioisótopos, fármacos, toxinas, y otros elementos bioactivos para los tumores que expresan ACE humano.

En la presente invención se sabe que es posible amplificar mediante PCR los dominios VH y VL del Mab vCB/ior-ACE.1 usando oligonucleótidos sintéticos que se hibridan en las secuencias de base que codifican los péptidos de señal y dominios constantes CH1 y Ck. También se muestra la posibilidad de ensamblar los dominios VH y VL amplificados, en este orden, usando PCR, y obteniendo diferentes formas de fragmentos de scFv mediante manipulación del tamaño del engarce que conecta los dominios. Usando 14 aminoácidos se originó una forma de scFv monovalente, y reduciendo este número hasta cinco, se produce una forma de scFv de tipo diacuerpo.

Se demuestra en la invención que es posible expresar los fragmentos de scFv monovalentes y divalentes en la bacteria E. coli y en la levadura Pichia pastoris, y que estos fragmentos identifican in vitro el ACE humano, unido o no a células tumorales, de una manera específica. En la presente invención también se demuestra que el scFv marcado radiactivamente a monovalente y diacuerpo identifican in vivo células tumorales que expresan ACE humano y que se desarrollan como tumores en ratones, mostrando un comportamiento muy similar al de Mab CB/ior ACE.1, y un comportamiento muy superior al de scFv obtenido previamente. En la presente invención también se muestran procedimientos para purificar y caracterizar los nuevos fragmentos de scFv monovalentes y diacuerpo.

Los fragmentos de anticuerpo descritos en esta invención son útiles para aplicarse en la diagnosis y terapia de cáncer, con las ventajas que éstos derivan de un Mab de eficacia clínica probada, y que su menor tamaño y ausencia del dominio Fc permiten que ambos una mejor penetración de tejidos, y su uso en tratamientos repetidos debido a la menor capacidad de inducción de una respuesta de inmunoglobulina anti-ratón humano (HAMA; Schroff et al. Cancer Res 45: 879-885, 1985; DeJager et al. Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 29: 377, 1988). Las respuestas de HAMA son inconvenientes para el tratamiento debido a la neutralización del efecto biológico del anticuerpo administrado, la reducción de dosis consecuente, y debido a que éstos pueden provocar respuestas alérgicas, enfermedad de "suero", y afecciones renales.

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Terminología Anticuerpos y sus Fragmentos específicos

Los términos describen una inmunoglobulina de partes de la misma con especificidad antigénica, siendo éstas naturales o producidas parcialmente o completamente de una manera sintética. Los términos también cubren cualquier polipéptido o proteína que tiene un dominio de unión que sería el sitio de unión del anticuerpo, u homólogo a él. Éstos se pueden producir naturalmente o de una forma sintética, o bien parcialmente o completamente. Los Ejemplos de anticuerpos son las diferentes clases y subclases de inmunoglobulinas, y fragmentos de éstas que contienen sitios de unión de antígeno Tales como Fab, scFv, Fv y los diacuerpos.

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo incluyen cualquier polipéptido que comprende un dominio de unión de inmunoglobulina, siendo éste natural o producido de manera sintética, ambos completamente o parcialmente, y moléculas quiméricas que comprenden un dominio de unión de inmunoglobulina, o su equivalente, fusionado a otro polipéptido.

Se ha mostrado que los fragmentos de un anticuerpo completo pueden llevar a cabo la función de antígenos de unión. Los ejemplos de estos fragmentos de unión son: (i) el fragmento Fab que incluye los dominios VL, VH, CL y CH1 de una inmunoglobulina; (ii) y el fragmento Fd, que consta de los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv, que consta de los dominios VL y VH de un anticuerpo dado; (iv) el fragmento scFv, donde los dominios VH y VL de un anticuerpo dado están unidos con un engarce peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión de antígeno (Bird et al, Science 242: 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA 85: 5879-5883, 1988); (v) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos de una manera similar a scFv pero donde el pequeño tamaño del engarce no permite que los dominios VH y VL de la misma molécula de scFv se asocien entre ellos, y los sitios de unión de antígeno se forman mediante la asociación de dos o scFv (documento WO94/13804; Holliger P et al. PNAS USA 90 6444-6448, 1993); (vi) otros fragmentos como el dAb (Ward SE et al., Nature 341: 544-546, 1989), regiones aisladas de CDR, fragmentos F(ab')_{2} y dímeros biespecíficos scFv (PCT/US92/09965; Holliger P, Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4: 446-449, 1993; de Haard, H et al. Adv. Drug Delivery Rev. 31: 5-31, 1998).

Los diacuerpos y scFv se pueden construir sin regiones Fc, usando solamente los dominios variables, reduciendo potencialmente los efectos de las reacciones anti-isotipo cuando se administran a seres humanos. También son particularmente útiles debido a su producción en E. coli y levadura recombinante. Su tamaño inferior al de una inmunoglobulina completa les proporciona un incremento de potencial penetración de tejidos.

Sitio de unión de antígeno

Este término describía la parte de un anticuerpo que comprende el área que específicamente interactúa con todo el antígeno, o parte de él. Cuando el antígeno es mayor, un anticuerpo solamente se puede unir a una parte particular del antígeno, denominado epítope. Un sitio de unión de anticuerpo se puede proporcionar por uno o más dominios variables de anticuerpo. Preferiblemente, un sitio de unión de antígeno comprende la región variable (o dominio) de la cadena ligera (VL) y la región variable (o dominio) de la cadena pesada (VH) de un anticuerpo.

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Específico

Se refiere a la situación de en la que un anticuerpo o su fragmento no presenta una unión significativa a otras moléculas diferentes de su par de unión específica. Este término también es aplicable al caso en el que un sitio de unión de antígeno es específico para un epítope particular que aparece en un número de antígenos relacionados o no relacionados, en cuyo caso el sitio de unión sería capaz de unirse a varios antígenos que llevan el epítope.

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Descripción detallada de la invención

Mediante la presente invención, se obtienen moléculas de polipéptido específico, formadas por uno o más sitios de unión de antígeno, que proceden de un Mab de ratón que es específico para ACE humano. El sitio de unión de antígeno se ensambla en la forma de formas monovalente, divalente, y otras de fragmentos de anticuerpo, dependiendo de la forma en la que la molécula de polipéptido se construye.

La molécula de polipéptido en la forma de un fragmento de scFv monovalente específico para ACE humano muestra una afinidad constante para este antígeno de (5,0 \pm 0,4) x 10^{9} L mol^{-1}, y comprende los Dominios VH y VL, unidos en este orden mediante un segmento de unión de 14-aminoácidos (engarce), con una secuencia de aminoácidos como la presentada en la SEQ ID No. 16.

La molécula de polipéptido en la forma de un fragmento de scFv divalente (diacuerpo) específico para ACE humano muestra una constante de afinidad para este antígeno de (2,8 \pm 0,3) x 10^{10} L mol^{-1}, y comprende el apareamiento de dos moléculas idénticas formadas cada una de ella por los dominios VH y VL, unidos en este orden por un segmento de unión de cinco-aminoácidos (engarce), con una secuencia de aminoácidos como la presentada en la SEQ ID No. 17.

En otro aspecto de la invención, los fragmentos de scFv monovalente y diacuerpo no se unen, o se unen de una manera significativa, con tejidos normales, o células de los siguientes tejidos normales: hígado, riñón, pulmón, testículo, sangre, bazo, y páncreas. En el caso de la mucosa de colon, los fragmentos de scFv monovalente y diacuerpo reaccionan de manera exclusiva con los productos de secreción luminal y en las zonas apicales o algunas glándulas. La ausencia de reactividad de los fragmentos de scFv monovalente y diacuerpo con linfocitos normales y neutrófilos es indicativo que no existe un nivel importante de de reactividad cruzada con el antígeno NCA (von Kleist S, Burtin P. Immunodiagnosis of Cancer. Marcel Dekker. 322-341, 1979; Buchegger, F. et al. Int. J. Cancer 33; 643-649, 1984).

Los fragmentos de scFv monovalente y diacuerpo se pueden unir a ACE soluble, ACE absorbido a las superficies sólidas, o ACE asociado a las células que los producen, y a tejidos tumorales, entre los que destacan adenocarcinomas humanos colorrectal, mama, pulmón, páncreas y estómago. Los fragmentos de scFv monovalente y diacuerpo y el Mab CB/ior-ACE.1. se unen a ACE soluble unido a superficie sólida en una forma que depende de la conservación de la glicosilación de ACE humano, sugiriendo que los carbohidratos de este antígeno están implicados en el reconocimiento.

Las moléculas de Polipéptido derivadas de los fragmentos de scFv monovalente y diacuerpo reseñadas en esta invención, que retienen la capacidad de unirse a ACE, su afinidad reseñada, reconocimiento de epítope específico, y comportamiento biológico y bioquímico similar y equivalente con los fragmentos descritos en esta invención se consideran formas variantes equivalentes y están contenidas en la presente invención. Estas moléculas de polipéptido pueden tener la forma de otros fragmentos de anticuerpo recombinantes, tales como scFv donde el dominio VL precede a VH; o Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Facb, scFv trimérico o tetramérico, etc. (Winter G, Milstein C. Nature 349: 293-299,1991; documento WO94/13804 de Haard, H et al. Adv. Drug Delivery Rev. 31: 5-31, 1998), y se usan otros segmentos de unión (engarces) conocidos en la técnica. Éstos también pueden estar en la forma de moléculas de anticuerpo biespecíficos, en las que una parte de tal conserva la especificidad para ACE, y las otros tienen una especificidad diferente.

Igualmente se contienen en la presente invención las formas variantes de los fragmentos de scFv monovalente y diacuerpo que cumplen las características descritas en los párrafos anteriores, y que se habrían derivado de la llamada "humanización mediante reducción de la inmunogenicidad", en la que los epitomas de las células B y T presentes en los dominios variables están modificados de una forma en la que no se altera el reconocimiento antigénico, pero la inmunogenicidad de la molécula resultante en seres humanos se reduce, por ejemplo, como se revela en Carr FJ et al. 2000 EP 983303A1 y en Rodríguez Pérez R et al. US 5712120-A. Igualmente se consideran las formas variantes contenidas en la presente invención son las producidas por el llamado "transplante de CDR" en el que las secuencias de CDR de un primer anticuerpo se colocan dentro del marco de secuencias que no proceden de este anticuerpo, por ejemplo, como se revela en los documentos EP-B-0239400, EP-A-184187, GB 2188638A o EP-A-239400, y mantienen la capacidad de unirse a ACE con afinidad similar, capacidad competitiva, reconocimiento de epítope particular, y comportamiento biológico y bioquímico similar y equivalente a los fragmentos de scFv monovalente y diacuerpo descritos en esta invención.

Además de las secuencias de anticuerpo, las moléculas de polipéptido contenidas en esta invención pueden comprender otros aminoácidos que forman un péptido o polipéptido, o que añaden a la molécula una característica funcional diferente de la de unión del antígeno ACE, como por ejemplo una etiqueta para la purificación de o identificación, una enzima o sus fragmentos, un modificador de respuesta biológica, una toxina o fármaco, y sucesivamente. De acuerdo con esta invención los fragmentos de scFv monovalente y diacuerpo se pueden administrar en forma aislada o purificada.

La presente invención prevé el uso de algunas de las moléculas de polipéptido descritos anteriormente como un reactivo de diagnóstico para formas de cáncer humano que expresan ACE, como por ejemplo, adenocarcinomas de colon, pulmón, mama u otros.

Las moléculas de polipéptido específicas para ACE descritas anteriormente se pueden marcar radiactivamente y emplear como agentes para obtener imágenes para demostrar de una forma específica y emplearse como agentes para obtener imágenes para demostrar de una forma específica la presencia y localización de tumores que expresan ACE en seres humanos. La presente invención proporciona un procedimiento para determinar la presencia de una célula de tumor que expresa ACE, siendo dicho procedimiento el de poner en contacto las células con las moléculas de polipéptido como los descritos, y determinar la unión de éstas a las células. El procedimiento se puede desarrollar in vivo, o en una muestra de de células retiradas del cuerpo, siendo esto in vitro o ex vivo.

La presente invención proporciona un procedimiento para la unión de una molécula de polipéptido como las descritas anteriormente, a ACE humano. Esta unión se puede producir in vitro, ex vivo o in vivo. Si la unión es in vivo, el procedimiento puede comprender la administración de la molécula de polipéptido a mamíferos, siendo éstos uno o varios individuos. Como se demuestra experimentalmente en el presente documento, los fragmentos de scFv monovalente y diacuerpo en esta invención se unen a ACE humano se expresan mediante células tumorales de ratón transfectadas, que crecen como tumores una vez que se han transplantado a ratones, proporcionando un modelo experimental útil para el estudio, la investigación, y el desarrollo de moléculas con unión específica de sus propiedades. La reactividad de los anticuerpos sobre muestras celulares se puede detector mediante cualquier medio apropiado. El marcaje con moléculas indicadores individuales es una de tales posibilidades. Las moléculas indicadoras pueden generar señales capaces de ser detectadas directa o indirectamente y preferiblemente ser medidas. El acoplamiento de las moléculas indicadoras puede ser covalente o no covalente, directo o in directo. La unión mediante un enlace peptídico se puede producir a partir de la expresión recombinante de una fusión del gen que acopla el anticuerpo y la molécula indicadora. La forma de determinación de acoplamiento no es una característica de la presente invención, y los expertos en la técnica son capaces de elegir un modelo adecuado de acuerdo con su preferencia y conocimiento general.

Cuando se usa un radionúclido como ^{125}I, ^{111}In o ^{99m}Tc para marcar los fragmentos de scFv monovalente y diacuerpo y sus formas equivalentes, si estas se localizan preferiblemente en el tumor, y no en los tejidos normales, la presencia del marcado radioactivo en el tejido tumoral se puede detectar y cuantificar usando una cámara gamma. La calidad de la imagen obtenida del tumor se correlaciona directamente con la relación de señal:fondo (Goldenberg DM. Int. J. of Biol. Markers 1992, 7; 183-188). El uso experimental de ^{125}I se ejemplifica en el texto.

La presente invención también ofrece elementos de manera que los fragmentos de scFv monovalente y diacuerpo y sus formas variantes equivalentes como se ha descrito anteriormente, se pueden usar como un reactivo terapéutico, por ejemplo, cuando están acoplados, conjugados o unidos a moléculas con poder terapéutico, o se generan como una proteína de fusión recombinante. Los fragmentos de scFv monovalentes y diacuerpo y sus formas variantes equivalentes de acuerdo con la presente invención se pueden usar para dirigir toxina, radioactividad, células T y NK, u otras moléculas a los tumores que expresan ACE, o para desarrollar una respuesta antiidiotípica en el organismo que podría conducir a un efecto terapéutico deseado. De acuerdo con esto, otros aspectos de la invención proporcionan elementos para los procedimientos de tratamiento que implican la administración de fragmentos de scFv monovalentes y diacuerpo o sus formas variantes equivalentes, como medicamentos o composiciones farmacéuticas.

De acuerdo con la presente invención, las composiciones se pueden administrar a individuos, preferiblemente en una cantidad "terapéuticamente eficaz", suficiente para demostrar un beneficio del paciente, en la forma de la mejora de al menos un síntoma. Los detalles relacionados con la cantidad a administrar, la frecuencia e intervalos de administración dependerá de la naturaleza y gravedad de la enfermedad que se trata, y estas decisiones son la responsabilidad de los especialistas y otros doctores médicos. Las dosis apropiadas de un anticuerpo se conocen bien en la técnica (Ledermann J. A. et al. Int J. Cancer 47: 659-664, 1991; Bagshawe KD et al. Antibody, Immunoconjugates, and Radiopharmaceuticals 4: 915-922, 1991).

Se puede administrar una composición sola o en combinación con otros tratamientos, o bien de manera simultánea o secuencial, dependiendo de de la enfermedad a tratar.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención, y a emplear de acuerdo con la presente invención, pueden comprender, además del ingrediente activo, un excipiente, tampón, estabilizante o vehículo farmacéutico aceptado, u otros materiales bien conocidos por los expertos en la técnica. Estos materiales no deben ser tóxicos, no deben interferir con la eficacia del ingrediente activo y su naturaleza precisa debe depender de la vía de administración, siendo esta oral, o mediante inyección, por ejemplo, por vía intravenosa.

Los fragmentos de scFv monovalentes y diacuerpo y sus formas variantes equivalentes de acuerdo con la presente invención se pueden fabricar mediante la expresión de del ácido nucleico codificante. El ácido nucleico que codifica cualquiera de estas moléculas de polipéptido descritas antes es parte de la presente invención, como es un procedimiento para la expresión de tal ácido nucleico. En una realización diferente, el ácido nucleico puede codificar las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID No. 16 y 17.

Para la expresión recombinante del scFv monovalente y diacuerpo y sus formas variantes equivalentes, vectores apropiados se pueden seleccionar o construir, con las secuencias reguladoras adecuadas, incluyendo promotor, terminador, potenciador, poliadenilación, genes marcadores, y otras secuencias pertinentes. Los vectores pueden ser plásmidos. Se describen en detalle en varias referencias muchos protocolos y técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo, preparación de construcciones de ácido nucleico, reacción en cadena de la polimerasa, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células en células y expresión génica, análisis de proteínas, y otros, como Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2ª edición, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 o Short Protocols in Molecular Biology, 2ª edición, Ausubel et al. eds., John Wiley y Sons, 1992 o Erlich HA PCR Technology, Stockton Press, 1989.

Otro aspecto de la presente invención proporciona una célula huésped que contiene un ácido nucleico extraño y los procedimientos para introducir tal ácido nucleico en una célula huésped. La introducción puede emplear cualquiera de las técnicas que existen para tal propósito. Para las células bacterianas y de levaduras, esta técnica puede ser electroporación. La introducción puede ser seguida de de la provocación o permisión de la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, desarrollo de las células huésped en condiciones favorables para la expresión del gen. En una realización, el ácido nucleico de la invención se integra en el genoma de las células huésped.

Después de su producción, los fragmentos de scFv monovalente y diacuerpo y sus formas variantes equivalentes, se pueden usar en cualquiera de las formas reveladas en el presente documento, tal como en la formulación de una composición como un producto farmacéutico o de diagnóstico, tal como en un conjunto de reactivos que comprende además del miembro de unión específico, uno o más reactivos para determinar la unión del miembro a las células o a ACE no unido a las células, como se ha descrito antes. Otros aspectos adicionales de esta invención y sus realizaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Se proporcionan ejemplos para el completo entendimiento de la presente invención, y no para limitar su extensión ni su ámbito. Se hace referencia a las siguientes figuras:

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Breve descripción de las figuras

En la Figura 1, se representa un esquema del vector pJG-1m usado para la expresión del scFv monovalente y diacuerpo en E. coli. En correspondencia con la zona de vector marcada con la barra horizontal amplia, se presentan las secuencias de base de los sitios de clonación de los sitios de de fragmentos, el péptido c-myc, el dominio 6-histidina, y alguno algunas regiones inter y pos- dominio (SEQ ID No. 13).

En la Figura 2 se presentan la alineación de las secuencias de aminoácidos (en código de una letra) deducido de los nucleótidos para (1) el fragmento de scFv monovalente (SEQ ID No. 16), y (2) el fragmento (diacuerpo) (SEQ ID No. 17). El orden de los dominios en ambas construcciones son VH-segmento engarce-VL. Los aminoácidos de los segmentos de engarce empleados en cada de las dos moléculas aparecen en caracteres en letra negrita.

En la Figura 3 se ejemplifica el reconocimiento de (A) Mab CB/ior-ACE. 1, (B) scFv monovalente, y (C) diacuerpo, para el ACE expresado en células tumorales de cultivo AsPC-1 (ATCC CRL-1682), mediante la técnica de inmunofluorescencia indirecta. En A, B, y C, se observa la membrana característica y fluorescencia de citoplasma próxima. La ampliación es 200x.

En la Figura 4 se presenta perfil cromatográfico de la digestión proteolítica del diacuerpo y la asignación de los péptidos trípticos obtenidos mediante espectrometría de masas. Arriba: Perfil cromatográfico de la digestión tríptica del diacuerpo. Abajo: Tabla sumario de la asignación de los péptidos trípticos del diacuerpo. M/z exp: masa experimental; m/z teórica: masa teórica; Z: carga. En los espectros obtenidos no se obtuvieron las señales correspondientes a cisternas de engarce incorrectas.

La Figura 5 es un sumario de la verificación de la secuencia de aminoácidos del diacuerpo (SEQ ID No. 21). Las regiones de la secuencia de proteínas que se verificaron mediante espectrometría de masas se indican en caracteres en negrita, y las zonas de la secuencia que no se recuperaron después de la digestión tríptica aparecen en letra itálica. Las zonas en letra negrita coinciden en total con la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de base del diacuerpo. La secuencia del péptido c-myc y las 6 histidinas finales, proporcionadas por el vector pJG-1 m (Figura 1), también se observan en la parte del extremo C.

La Figura 6 presenta el porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido, después de 24 (barras de rayas) y 48 (barras no rayadas) horas de inoculación de ratones que llevan tumores que expresan ACE humano con las siguientes moléculas marcadas radiactivamente con ^{125}I; de izquierda a derecha, y en grupos de cuatro barras dobles: (a) diacuerpo, (b) scFv, (c) F3, y (d) Mab CB/ior-ACE.1. Cada una de las barras representa la media de las cuentas recuperadas de los órganos obtenidos a partir de 12 ratones. Los resultados demuestran que entre 24 y 48 horas, la relación de radiactividad en tumor: radiactividad en sangre se mantiene alta para el diacuerpo, el scFv, y Mab, con los valores mayores para este último, seguido de la molécula dimérica. F3 mostró valores muy bajos, con un comportamiento in vivo inadecuado que se puede correlacionar por su afinidad disminuida para ACE.

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Ejemplos

1. Amplificación mediante PCR, clonación y secuenciación de los dominios variables de Mab CB/ior-ACE.1.

2. Ensamblaje de scFv y diacuerpo, expresión en E. coli, y demostración de su reconocimiento de ACE humano.

3. Expresión del scFv y diacuerpo en Pichia pastoris y demostración de su reconocimiento de ACE humano.

4. Purificación del scFv y diacuerpo producido en bacterias.

5. Caracterización del diacuerpo mediante la digestión proteolítica y espectrometría de masas.

6. Estudios de reconocimiento de ACE desglicosilado.

7. Estudio Inmunocito- e histo-químico en tejidos normales y tumorales.

8. Determinación de la constante de afinidad.

9. Determinación del reconocimiento específico in vivo de fragmentos y anticuerpo marcado con ^{125}I, en ratones C57BI/6 que llevan tumores inducidos por la inoculación de células B16-CEA13.

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Ejemplo 1 Amplificación mediante PCR, clonación, y secuenciación de los dominios variables del Mab CB/ior-ACE.1

Procedimiento (a)

Purificación de ARN y amplificación de las regiones variables

ARN total de 10^{6} células del hibridoma de ratón CB/ior-ACE.1 (Tormo B. et al. APMIS. 97: 1073-1080, 1989) se extrajo con el reactivo TriPure^{TM} (Boehringer-Mannheim). Se sintrizó el ADN complementario (ADnc) usando el kit de síntesis de ADNc de primera hebra para RT-PCR (Boehringer-Mannheim), usando oligo dT como cebador. Se usó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificación específica de los genes de los dominios variables de cadena pesada y ligera. Los cebadores sintéticos empleados se diseñaron en la base de las secuencias de consenso para IgG de ratón y las cadenas kappa, reseñadas por Kabat E. et al. (Departamento Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, NIH, 1991) y experimentos desarrollados anteriormente en este laboratorio (Coloma, MJ et al. Biotechniques 11: 152-156, 1991). Las secuencias de oligonucleótidos usadas en PCR aparecen en la
Tabla I.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA I Oligonucleótidos sintéticos usados en la PCR para la amplificación de las secuencias que codifican los dominios variables de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) del Mab. CB/Ior-CEA.1

1

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Para la PCR, se usó el Kit PCR Core (Boehringer-Mannheim). Las condiciones de la PCR fueron: desnaturalización a 94ºC, 1 minuto, hibridación a 55ºC, 1 minuto, extensión a 72ºC, 1 minuto, 25 ciclos, con minutos 5 adicionales de extensión a la temperatura ya descrita en el último ciclo, todo en un equipo MJ Research Miniciclor. Los volúmenes finales de cada reacción fueron 100 \muL. Se usaron todos los oligonucleótidos a una concentración final de 1 \muM.

Los fragmentos amplificados de ADN, con el tamaño esperado de aproximadamente 320-530 pares de bases, se purificaron en geles de agarosa bajo punto de fusión (Sigma), usando el kit de Extracción de gel QlAquick QIAGEN, GmbH), y se clonaron independientemente en el vector pMOS (Amersham Pharmacia Biotech), diseñado para la clonación "ciega" de fragmentos de ADN.

Procedimiento (b)

Secuencia de nucleótidos de los dominios variables

Para la determinación de la secuencia de nucleótidos de los dominios variables de las cadenas ligera y pesada clonados en el vector pMOS, se usaron los oligonucleótidos recomendados por el fabricante (Amersham Pharmacia Biotech). La secuencia de base se realizó por medio de procedimientos automáticos, usando un equipo ALFexpress II de Pharmacia (Amersham Biosciences), y el "Kit Thermus Sequenase 5 Cy Dye Terminator". Los plásmidos pVL2 y pVH5 se seleccionaron como representantes de las secuencias de VL y VH, respectivamente.

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Ejemplo 2 Ensamblaje del scFv y diacuerpo, expresión en E. coli y demostración de su reconocimiento de ACE humano

Procedimiento (a)

Re-amplificación de los dominios variables y ensamblaje de scFv y diacuerpo

Se usó la PCR para el ensamblaje, en la forma de scFv y diacuerpo, de los dominios VH y VL contenidos en los plásmidos pVH5 y pVL2.

Los oligonucleótidos sintéticos se diseñaron en base a las secuencias de VH y VL en los plásmidos pVH5 y pVL2. éstos incluían los sitios de restricción pla clonación en el vector pJG-1 m e incorporaban los segmentos de engarce 14 y 5 aminoácidos para el ensamblaje de scFv monomérico y diacuerpo (Tablas II y III).

TABLA II Secuencias de aminoácidos de los segmentos de unión (engarces) usados para la construcción de los fragmentos scFv y diacuerpo

2

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TABLA III Oligonucleótidos sintéticos usados en la PCR para el ensamblaje de scFv y diacuerpo

100

3

Para el ensamblaje de fragmentos, se realizó una PCR independiente en una primera etapa para amplificar:

1.

Para los dominios que proporcionarían el origen al scFv monovalente. - Reacción 1: usando el plásmido pVH5 como molde con los oligonucleótidos 5 y 6 (Tabla III). Reacción 2: usando el plásmido pVL2 con los oligonucleótidos 7 y 8 (Tabla III).

2.

Para los dominios que proporcionarían el origen al diacuerpo. - Reacción 3: usando el plásmido pVH5 con oligonucleótidos 5 y 9 (Tabla III). Reacción 4: usando el plásmido pVL2 como molde con los oligonucleótidos 8 y 10 (Tabla III).

Las condiciones y reactivos usados para PCR ya se han descrito anteriormente. Todos los oligonucleótidos se usaron a una concentración final de 1 \muM.

Para el ensamblaje de scFv se realizó una nueva PCR mezclando 4 \mul de reacciones 1 y 2 con los oligonucleótidos 5 y 8 (Tabla III) a una concentración final de 1 \muM, y los oligonucleótidos 6 y 7 (Tabla III) a una concentración final de 0,01 \muM.

Para el ensamblaje del diacuerpo se realizó una nueva PCR mezclando 4 \mul de reacciones 3 y 4 con oligonucleótidos 5 y 8 (Tabla III) a una concentración final de 1 \muM, y los oligonucleótidos 6 y 7 (Tabla III) a una concentración final de 0,01 \muM.

Los fragmentos de ADN amplificados se detectaron como bandas mayoritarias de aproximadamente 700 pares de bases, y se aislaron en los geles de agarosa de bajo punto de fusión, como se ha descrito anteriormente.

Procedimiento (b)

Clonación en el vector pJG-1m

El vector pJG-1 m es un plásmido diseñado para la expresión de fragmentos de anticuerpo en el periplasma de E. coli (Figura 1). Como elementos principales tiene el promotor LacZ, un péptido de señal, sitios de restricción ApaL I y Not I para la inserción del gen del fragmento, un péptido c-myc y una secuencia que codifica 6 histidinas. Éste último se usa como etiqueta para la purificación de los productos de expresión por iones de metales inmovilizados (IMAC; Porath J. Prot. Expr. Purif. 3: 263-281, 1992). Las secuencias de base de la clonación de los sitios de restricción o para la clonación de scFv en cuestión en el vector, y de los aminoácidos del extremo C que se añaden al scFv, aparecen en la Figura 1 (SEQ ID No. 13).

Los fragmentos de ADN que corresponden a scFv y diacuerpo, y el vector pJG-1 m vector se digirieron con las enzimas de restricción ApaLI y Not I (Promega) y las bandas y vector ligados independientemente usado T4 ADN ligasa (Promega). Los productos de las reacciones de ligación se usaron para la transformación de E. coli competente (cepa XL-1Blue; Stratagene) mediante electroporación, y se desarrollaron las células transformadas en medio selectivo sólido (agar LB, con 100 \mug/ml de ampicilina) durante 16 horas a 37ºC. Los procedimientos usados se describen en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Segunda Edición. Sambrook, Fritsch, Maniatis. 1989.

Los plásmidos recombinantes se seleccionaron después de la purificación del ADN de plásmido de varias colonias (QIAGEN MiniPrep kit), y la correspondiente comprobación mediante digestión con las enzimas de restricción ya descritas para los productos de ligamiento esperados. En los análisis de restricción, se obtuvieron bandas de aproximadamente 3,5 kb correspondientes al vector linealizado, y las bandas de aproximadamente 700 pares de bases para los genes que codifican los fragmentos de anticuerpo de scFv y diacuerpo.

Se secuenciaron cinco clones de cada construcción usando cebadores diseñados específicamente que se hibridan de manera externa las regiones de clonación del vector pJG-1m (Tabla IV), mediante los procedimientos descritos anteriormente.

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TABLA IV Oligonucleótidos sintéticos para la secuenciación de bases del scFv y diacuerpo ensamblado por PCR y clonado en el vector pJG-1m

4

Las secuencias de aminoácidos derivadas de las secuencias de base obtenidas para el scFv monovalente (clon pJG1m-25) y el diacuerpo (clon pJG1m-18) aparecen en la Figura 2 (SEQ ID No. 16 y SEQ ID No. 17). Con respecto a un scFv desarrollado anteriormente (Ayala M et al. Biotechniques 13: 790-799, 1992), las secuencias de VH y VL obtenidas ahora para el nuevo scFv monovalente y diacuerpo muestran 16 aminoácidos diferentes dentro de los dominios VH FR1, CDR2 y FR3, y 3 aminoácidos diferentes dentro de los dominios VL FR1 y FR3.

Estos resultados indican que los dominios variables amplificados y clonados a partir del hibridoma CB/ior-ACE.1 para construir el nuevo scFv monovalente y diacuerpo pueden provenir a partir de ARN diferente con respecto a los usados en las amplificaciones para la clonación del scFv. reseñado anteriormente

El segmento de engarce del nuevo scFv monovalente es idéntico al de scFv reseñado anteriormente. El segmento de unión del nuevo scFv divalente (diacuerpo) es diferente del scFv obtenido anteriormente, debido a que solamente incluye 5 aminoácidos. En estos experimentos también se verificaron las secuencias de los segmentos de engarce L1 y L2, que aparecen en la Tabla II.

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Procedimiento (c)

Verificación de la expresión en E. coli del scFv y diacuerpo mediante SDS-PAGE y transferencia de Western

Células de E. coli competentes TG1 se transformaron de manera independiente con plásmidos pJG1m-25 y pJG1m-18, que contienen la información para ambos fragmentos de anticuerpo. Esta cepa permite la expresión periplásmica de la proteína heteróloga, o su secreción hacia el medio de cultivo.

Las bacterias transformadas se sembraron sobre un medio de soporte sólido y se desarrollaron a 37ºC durante 16 horas. Se desarrolló una colonia representativa de cada una de las dos construcciones sobre medio líquido hasta una DO_{530nm} = 1 y se indujo durante 12 horas añadiendo 1 mM de IPTG al medio de cultivo. Se centrifugaron las células y el contenido periplasmático se aisló mediante choque osmótico y breve sonicación (segundos) para su evaluación en electroforesis en geles de 12% de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Este ensayo reveló la expersión en ambos casos de proteínas del tamaño molecular esperado (aproximadamente 27 kDa), que se evaluaron posteriormente mediante transferencia de Western usando como anticuerpo primario un Mab (9E10) específico contra el péptido derivado de c-myc que contiene esta proteína (1 \mug/ml), seguidos de anticuerpos conejo anti-ratón IgG conjugados con peroxidasa de rábano picante (Sigma). La transferencia de proteínas del SDS-PAGE a Hybond C Extra nitrocelulosa (Amersham Life Sciences) se realizó en un equipo de transferencia semi-seco (BioRad). Se usó sustrato insoluble DAB (Sigma) en el desarrollo.

Para las dos construcciones, las proteínas recombinantes con el tamaño mencionado se identificaron con el Mab 9E10.

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Procedimiento (d)

Reconocimiento específico del ACE humano mediante scFv y diacuerpo mediante ELISA

Se realizó un ensayo ELISA recubriendo placas de polivinilo (Costar, placas de ensayo de polivinilo de 96 pocillos) con ACE humano (Calbochem 219369), a una concentración de 1 \mug/ml. Después de bloquear las placas con leche desnatada, las muestras de periplasma bacteriano correspondiente a las dos construcciones se añadieron en diluciones de 1:5, 1: 10, y 1:20 en PBS-2% de leche desnatada, y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente.

Para la detección de la unión de fragmentos al ACE, se usó Mab 9E10 (1 \mug/ml), seguido de anticuerpos anti ratón IgG conjugados con peroxidasa de rábano picante de Sigma. Después de varios lavados, se usaron OPD (Sigma) y H_{2}O_{2} como cromógeno y sustrato para desarrollar las reacciones, y la evaluación cuantitativa de las reacciones se leyeron a 492 nm en un LabSystems Multiskan MS.

En el ensayo, se usó Mab CB/ior-ACE.1 como un control positivo. Las fracciones de periplasma correspondientes a las células TG1 transformadas con el vector pJG-1m sin inserción, y un Mab no relacionado, se usaron como controles negativos. También, las placas se recubrieron con los siguientes antígenos irrelevantes: 10 \mug/ml de seroalbúmina bovina (BSA, Sigma), 10 \mug/ml de ovoalbúmina, 10 \mug/ml de lisozima, 10 \mug/ml de hemocianina de lapa bocallave californiana (Sigma). En todas las placas se incluyeron incluidos si solamente se colocó solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin antígeno (blanco). Se consideraron positivos los valores de absorbancia al menos 4 veces mayor que los producidos por los controles negativos.

En estos experimentos las muestras de periplasma de las construcciones de scFv y diacuerpo resultaron positivos con respecto a su capacidad de reconocimiento de ACE humano y se adsorbieron a placas de polivinilo. Estas mismas muestras eran negativas para todos los antígenos irrelevantes.

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Procedimiento (e)

Reconocimiento de ACE humano asociado a las células por el scFv y diacuerpo en ELISA e inmunofluorescencia indirecta

Las líneas celulares de tumor humano LoVo (ATCC CCL-229), AsPC-1 (ATCC CRL-1682), y LS 174T (ATCC CL-188), todas las cuales expresan ACE en cultivo, se sembraron en placas de poliestireno de 96 pocillos (Costar). Una vez se alcanzó la confluencia se lavaron los pocillos dos veces con PBS, se retiraron por drenado, y se secaron al aire. Después las células se fijaron al plástico mediante el uso de una mezcla 1:1 (v:v) de acetona-metanol fríos, durante 3 minutos. Después de varios lavados con agua destilada para eliminar restos, las placas se usaron como fase sólida en ensayos de ELISA donde se añadieron las muestras de periplasma bacteriano correspondiente a las dos construcciones en diluciones de 1:2, 1:8, y 1:16, en PBS-2% de leche desnatada, y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de varios lavados, se usó Mab 9E10 (1 \mug/ml), seguido de anticuerpos anti ratón IgG conjugados con peroxidasa de rábano picante (Sigma) para la detección de la unión de fragmentos a ACE. Después de varios lavados, se usaron el cromógeno OPD (Sigma) y H_{2}O_{2} como substrato para desarrollar las reacciones, y se empleó un lector LabSystems Multiskan. MS para la evaluación cuantitativa de las reacciones a 492 nm. Para la etapa de lectura, se transfirieron los sobrenadantes a una placa reciente. El Mab CB/ior-ACE.1 se usó como control positivo en el ensayo. Las fracciones de periplasma correspondientes a las células TG1 transformadas con el vector pJG-1m sin inserción, y un Mab no relacionado, se usaron como controles negativos. Una placa con células HEK 293 humanas (ATCC CRL-1573), que no expresan ACE, también se usaron como control negativo. Los criterios de positividad eran similares a los usados en ELISA descritos en el procedimiento anterior. En este experimento las muestras de periplasma de las construcciones de scFv y diacuerpo solamente reconocieron células LoVo, AsPC-1 y LS 174T. Todos los controles negativos eran negativos. De esta forma, se demostró la capacidad del scFv y diacuerpo para identificar el ACE humano sobre células tumorales humanas que expresan este antígeno, fijadas sobre placas de poliestireno, mediante célula-ELISA.

En otro experimento, se sembraron células LoVo, AsPC-1 y LS 174T en placas de poliestireno de 35 mm de diámetro (COSTAR) y se cultivaron hasta que se alcanzó confluencia. Se lavaron las placas dos veces con PBS, se retiraron por drenaje, se secaron al aire, y las se fijaron al plástico mediante el uso de una mezcla 1:1 (v:v) de acetona-metanol fríos. Después de varios lavados con agua destilada para eliminar restos, las placas se usaron como fase sólida en ensayos de inmunofluorescencia indirecta. Para esto se definieron zonas circulares de en la superficie con células fijadas, en las que las muestras de periplasma bacteriano correspondientes a las dos construcciones en diluciones de 1:2, 1:4 y 1:8 con PBS-3% de BSA, se incubaron independientemente. Se emplearon los mismos controles positivos y negativos en el célula-ELISA.

La incubación fue a temperatura ambiente (TA) durante 1 hora en cámara húmeda, seguido de varios lavados con PBS-3% BSA frío, y la adición de Mab 9E10 (10 \mug/ml) a la monofase durante una hora a TA, también en cámara húmeda. Después de varios lavados con PBS-3% BSA frío, se incubó la monofase con anticuerpos anti ratón IgG conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC, Sigma) diluido 1:64 en PBS-3% BSA, durante 30 minutos, en la oscuridad y cámara húmeda, después se lavaron cinco veces con PBS- 3% BSA, una vez más con PBS, y finalmente se tiñeron con solución Evans Blue durante unos pocos minutos.

La monofase se cubrió con PBS-10% glicerol, se selló con un cubre objetos y se examinó con un accesorio de luz fluorescente Olympus BH2-RFL, se montó sobre un microscopio Olympus BHT. También se usaron células humanas HEK 293 como control negativo. La presencia de membrana y fluorescencia de verde manzana de citoplasma se estableció como criterio de resultado positivo, mientras que esto no existiera en las muestras de control negativo, o en las células humanas negativas para ACE. En este experimento, las muestras de periplasma de las construcciones de scFv y diacuerpo solamente reconocieron las células LoVo, AsPC-1 y LS 174T. Los controles negativos eran negativos. De esta manera, se demostró la capacidad del scFv y diacuerpo para identificar el ACE humano sobre células tumorales que expresan este antígeno, fijadas sobre placas de poliestireno, mediante inmunofluorescencia indirecta. Un ejemplo de los resultados se muestra en la Figura 3.

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Ejemplo 3 Expresión de scFv y diacuerpo en Pichia pastoris y demostración de su reconocimiento de ACE humano

Procedimiento (a)

Re-amplificación de scFv y diacuerpo y clonación en el vector pPS7

Los genes que codifican el scFv y diacuerpo se amplificaron mediante PCR usando como moldes las construcciones pJG1-25 y pJG1-18, respectivamente, y oligonucleótidos diseñados para añadir el sitio Ncol en los extremos 5' y 3' de los genes (Oligos 13 y 14; Tabla V), con el propósito de clonación en el vector de expresión pPS7 de Pichia pastoris. El procedimiento de amplificación era similar al descrito anteriormente. El plásmido pPS7 es un vector integrador que contiene un fragmento de 1,15Kb que corresponde al promotor de la enzima alcohol oxidasa (AOX.1) seguido del gen que codifica la señal de secreción de la sacarosa invertasa (sucll) de Saccharamyces cerevisae, un único sitio de clonación Ncol, un fragmento de 960 pares de bases de la enzima gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (Gapt) para garantizar la finalización de la transcripción, y el gen HIS3 de Saccharamyces cerevisae como marcador de selección. Además este vector contiene un fragmento de 2,1 kb, que corresponde a la secuencia 3' del gen AOX.1 gene. Todos estos elementos se insertan en un vector pUC18 (Herrera Martínez LS et al., documento EP0438200 A1).

TABLA V Oligonucleótidos sintéticos empleados en la PCR para la amplificación y modificación de de las secuencias que codifican las primeras bases de VH y el último de VL, para la clonación del scFv y diacuerpo en el vector pPS7, y en la secuenciación de estas clonaciones

5

Después de la digestión con NcoI (Promega) de las bandas amplificadas correspondientes al scFv y diacuerpo, éstos se ligaron independientemente al vector pPS7 digerido previamente con la misma enzima, y los productos de la ligadura se usaron para transformar de una forma la cepa XL-1 Blue de E. coli.

Las colonias aisladas correspondientes a la transformación de la cepa con cada vector recombinante se analizaron usando la PCR colonias con un cebador que se en el promotor (Oligo 15, Tabla V) y otro para el extremo de VL (Oligo 8, Tabla III). Se seleccionaron las colonias que contienen la inserción correcta orientada. La secuencia de los genes clonados se realizaron de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente (Ejemplo 1 Procedimiento b), usando Oligo 15 (Tabla V). Las secuencias obtenidas para los dominios VH y VL de los plásmidos recombinantes pPSM2 (scFv) y pPSM3 (diacuerpo) de acuerdo con lo citado anteriormente en SEQ ID No. 16 y SEQ No. 17.

Las cepas recombinantes de Pichia pastoris se obtuvieron con estos dos plásmidos mediante la electroporación de la cepa silvestre MP36 his 3 (Yong V ET to. Biotechnol. Applic. 9: 55-61, 1992) con ambos plásmidos mencionados, digeridos previamente con la enzima de restricción Pvull (Promega), y selección de medio mínimo deficiente en histidina. Como resultado de los diferentes mecanismos de recombinación de los plásmidos recombinantes con sitios específicos en el genoma de Pichia pastoris, era posible aislar para cada construcción dos tipos diferentes de fenotipos de cepas secretoras: (a) cepas en las que el gen AOX.1 no estaba afectado durante el episodio de recombinación y por lo tanto se desarrollaron en medio con metanol y se mostró que desarrollaron de manera similar a a la cepa silvestre (Mut^{+}), y (b) cepas en las que el gen AOX.1 se reemplazó por el módulo de expresión y mostró un lento desarrollo en la presencia de metanol (Mut s).

Procedimiento (b)

Estudios de expresión

Los estudios de expresión de fragmento de anticuerpo se realizaron a partir de las colonias fototrópicas His^{+} desarrolladas en placas con medio MD (base de levadura de nitrógeno, biotina, dextrosa). Las colonias seleccionadas se inocularon en 10 ml de medio rico tamponado BMGY (extracto de levadura, peptona, fosfato de potasio, base de levadura de nitrógeno, biotina, y glicerol) en tubos de 50 ml, y se colocaron a 28ºC con rotación a 150 rpm. Cuando los cultivos alcanzaron 2 unidades de DO 600 nm, medida en un equipo SPECTRONIC GENESIS 2, éstos se centrifugaron a 2000 rpm, durante 10 minutos. Los sedimentos celulares se suspendieron en 10 ml de medio rico con metanol (BMMY) como única fuente de carbono, en lugar de glicerol. A partir de este momento y durante 96 horas se indujeron las proteínas de interés, con la adición diaria de metanol hasta una concentración final de 1% en el cultivo. Como control negativo se usó la cepa MP36his3 transformada con el vector sin inserción.

Finalizado el período de cultivo, se centrifugaron las células, el medio de cultivo metabolizado durante la fase de inducción se recogió, se centrifugó una vez más de nuevo para su clarificación y detección final de scFv o diacuerpo realizado mediante electroforesis en 15% de geles de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Este ensayó reveló que la expresión de de las proteínas del peso molecular esperado en ambos casos (aprox. 27 kDa), que se evaluaron posteriormente mediante transferencia de Western usando Mab 9E10 como anticuerpo primario, y anticuerpos conejo anti-ratón IgG conjugados con peroxidasa de rábano picante (Sigma) como anticuerpo secundario. Se realizaron las transferencias como se ha descrito anteriormente. En el desarrollo, se usó DAB (Sigma) como sustrato insoluble. Para las dos construcciones, las proteínas recombinantes se identificaron con el Mab 9E10.

Procedimiento (c)

Reconocimiento del ACE humano mediante scFv y diacuerpo en ELISA

Se realizó un ensayo de ELISA, muy similar al descrito previamente para el material derivado de E. coli, usando fases sólidas, reactivos y recubrimiento, desarrollo, y condiciones de control similares. Las muestras de cultivo metabolizadas de las cepas recombinantes inducidas se diluyeron en PBS-1% de leche y se añadieron a una velocidad de 100 \mul/pocillo, y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Como controles negativos, se usaron medio metabolizado correspondiente a la cepa MP36his 3, y un Mab no relacionado. Los valores se consideraron positivos cuando la absorbancia era al menos 4 veces mayor que la producida por los controles negativos. En este experimento las muestras de medio metabolizado en fase de inducción de las construcciones de scFv y diacuerpo expresados en Pichia pastoris eran positivos con relación a su capacidad de reconocimiento de ACE humano adsorbidos en placas de polivinilo.

Procedimiento (d)

Reconocimiento del ACE humano asociado a las células mediante célula-ELISA e inmunofluorescencia indirecta

Se realizó un ensayo de ELISA, muy similar al descrito previamente para el material derivado de E. coli, usando fases sólidas, reactivos y recubrimiento, incubación, desarrollo, y condiciones de control similares. Las muestras de cultivo metabolizadas de las cepas recombinantes inducidas se diluyeron en PBS-2% de leche y se añadieron a las placas con células LoVo, AsPC-1, y LS 174T, y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. En el ensayo, se usó Mab CB/ior-ACE.1 como control positivo. Los cultivos de fase de inducción metabolizados de la cepa MP36his transformados con el vector pPS7 sin inserción, y el Mab no relacionado, se usaron como controles negativos. También, como control negativa, se usó una placa con células HEK 293 humanas.

En este experimento se demostró la capacidad del scFv y diacuerpo para la identificación específica de ACE humano sobre células tumorales humanas fijadas sobre soportes de poliestireno, mediante ELISA.

Se usó un ensayo de inmunofluorescencia indirecta, muy similar al descrito anteriormente para el material derivado de E. coli, empleando células de cultivo, y condiciones de fijación, reactivos, incubación, desarrollo, montaje, observación de microscopio y posible criterio similares. Las zonas independientes se definieron a las placas con células LoVo, AsPC-1 y LS 174T fijadas, en las que se aplicaron las muestras de cultivos inducidos de los almacenamientos recombinantes correspondientes a las dos construcciones, y las negativas, diluidas en PBS-3% de BSA, 0,02% de azida de sodio. La incubación se realizó a temperatura ambiente (TA) durante 1 hora en cámara húmeda, seguido de varios lavados con PBS-BSA-azida de sodio frío, y la adición de Mab 9E10 a toda la monofase durante 1 hora a TA, también en cámara húmeda. Después de varios lavados con PBS-3% de BSA fríos, la monofase se incubó con anticuerpos anti ratón IgG conjugados con isotiocianato de fluoresceína (Sigma) diluido 1:64 en PBS-3% de BSA durante 30 minutos en la oscuridad y cámara húmeda. Las placas se lavaron cinco veces con PBS 3% de BSA, una vez más con PBS, y finalmente se tiñó con solución Azul Evans durante unos pocos minutos. La monofase cubierta con PBS-10% de glicerol se montó con cubre objetos y se examinó en microscopio de luz ultravioleta.

En el ensayo, se usó Mab CB/ior-ACE.1 como control positivo. Como controles negativos se usaron el medio de cultivo inducido de MP36his3 transformado con pPS7 sin inserción, y el Mab no relacionado. También se usó un portaobjetos con células HEK 293 como control negativo. En este experimento las muestras de los cultivos inducidos que secretaron el scFv recombinante y diacuerpo reconocieron solamente las células LoVo, AsPC-1 y LS 174T. Los controles negativos eran negativos. Se demostró la capacidad del scFv y diacuerpo producida en Pichia pastoris para identificar ACE humano sobre células tumorales humanas que expresan este antígeno fijado sobre placas de poliestireno, mediante inmunofluorescencia indirecta.

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Ejemplo 4 Purificación del scFv y diacuerpo producidos en bacterias

Procedimiento (a)

Purificación de los fragmentos de scFv y diacuerpo usando cromatografía de afinidad de metales de iones inmovilizados (IMAC) e intercambio iónico

Se usó la presencia del dominio de seis histidinas en la proteína recombinante, donada por el vector pJG-1m para purificación. Estas secuencias confieren a las proteínas una afinidad muy alta para iones metálicos (por ejemplo Zn^{+2}, Cu^{+2}, Ni^{+2}) que se pueden quelar en diferentes soportes cromatográficos, permitiendo una purificación fácil y reproducible.

Las bacterias recombinantes obtenidas como se ha descrito antes se centrifugaron y los contenidos de periplasma se aislaron mediante choque osmótico y sonicación breve (segundos), y después se dializó durante 72 horas en tampón de acoplamiento (Tris-HCl 20 mM, 1 M NaCl, 20 mM Imidazol, pH 7,0). Las preparaciones de periplasma bacteriano que contenían el scFv y el diacuerpo se aplicaron directamente e independientemente a una matriz Sepharose-IDA-Cu^{+2} (Pharmacia). Una vez que se acoplaron las proteínas se lavaron primero los geles con 10 veces su volumen usando tampón de acoplamiento, seguido de una manera similar con tampón de lavado (Tris-HCl 20 mM, 1 M NaCl, 150 mM Imidazol, pH 7,0) para eliminar las proteínas contaminantes de E. coli. La elución del scFv y el diacuerpo se realizó con Tris-HCl 20 mM, 1 M NaCl, 250 mM Imidazol, pH 7,0. Las muestras de los máximos de elusiones sometieron a un 12% SDS-PAGE para verificar la presencia de las proteínas de interés. Las fracciones eluidas que contenían el scFv y el diacuerpo se concentraron en dispositivos UltraFree 15 (Amicon), se dializaron en una solución tampón que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,7, y se sometieron a una segunda etapa de purificación usando intercambio iónico.

Para esto, las muestras se aplicaron a una columna Mono Q (Pharmacia), y se fluyeron mediante un gradiente lineal de NaCl (0 a 1 M). Las muestras de los máximos recogidos se comprobaron en 12% SDS-PAGE. Se verificó la presencia del scFv y diacuerpo en los tamaños esperados (aproximadamente 27 kDa). La pureza lograda final para las dos moléculas era muy similar y cercana a 95%, se estimó a través de SDS-PAGE y tinción de plata. Los máximos de scFv y diacuerpo puros se concentraron en dispositivos UltraFree 15 (Amicon) hasta 2 mg/ml. Se verificó la actividad biológica de las preparaciones usando ELISA, siguiendo un procedimiento similar al descrito anteriormente en esta invención. Todas las muestras se conservaron a 4ºC.

Procedimiento (b)

Análisis del scFv y diacuerpo mediante filtración en gel

El scFv y diacuerpo purificados como se ha descrito mediante el procedimiento anterior se estudiaron usando cromatografía de tamices moleculares para determinar la homogeneidad de las muestras y la presencia de multímeros. Para esto se usó Superdex 200 (Pharmacia), y un procedimiento convencional de filtración en gel en un equipo de HPLC. Se determinó que el scFv concentrado en un máximo principal de aproximadamente 27 kDa, correspondiente a una forma monomérica. El diacuerpo apareció principalmente con un tamaño de aproximadamente 45 kDa, correspondiente a una forma dimérica.

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Ejemplo 5 Caracterización del diacuerpo mediante digestión proteolítica y espectrometría de masas

El diacuerpo purificado se dializó durante toda una noche a 4ºC contra una solución tampón que contenía 1% NH_{4}HCO_{3} a pH = 8,3, que contenía urea a una concentración de 2 mol/l. La proteína dializada se digirió con tripsina de calidad secuencia (Promega) a una realización enzima:sustrato de 1:50 durante 4 horas a 37ºC. La digestión proteolítica se detuvo mediante la acidificación con un volumen igual de una solución acuosa de 1% de ácido trifluoroacético, y se almacenó a -20ºC hasta el momento de análisis mediante cromatografía líquida acoplada al espectrómetro de masas (LC-MS).

Se separaron las digestiones mediante cromatografía de fase inversa en un cromatógrafo líquido AKTA Basic (Amersham Pharmacia Biotech) usando a un gradiente lineal entre 0% y 80% de solución B en 100 minutos. Las soluciones usadas para generar el gradiente eran: A: H_{2}O/TFA 0,05% y B: Acetonitrilo/TFA 0,05%.

Las fracciones obtenidas durante la digestión proteolítica se analizaron mediante espectrometría de masas usando ionización de electropulverización (ESI-MS), mediante la conexión en línea con el sistema cromatográfico espectrómetro de masas híbrido LC-MS con geometría ortogonal QTOF-2 (Micromass Ltd.). Durante la medición de LC-MS, se adquirieron los espectros de masas entre 350 y 1800 en 0,98 segundos y usando 0,02 segundos entre cada barrido. Se calibró el espectrómetro de masas con una solución salina compuesta de una mezcla de yoduro de sodio y de cesio. Las tensiones usadas en el cono y el capilar eran de 50 y 3000 voltios, respectivamente. Se procesaron los espectros usando el paquete de programas MassLinx v 3,5 (Micromass Ltd).

En la Figura 4 y su Tabla adjunta se pueden observar el perfil cromatográfico de la digestión tríptica del diacuerpo, y el sumario de la asignación de los péptidos trípticos del diacuerpo. En los espectros ESI-MS no se detectaron señales que indican cisternas unidas de manera incorrecta, evidente de los sumarios de las fracciones 8 y 12 de la Tabla adjunta a la Figura 4, que contiene los péptidos (20Phe-Arg31)-S-S-(87Ser-Arg97) y (143Val-Lys148)-S-S-(186Ile-Lys228) unidos mediante enlaces disulfuro (-S-S-) entre las cisteínas 22 y 95, y 147 y 212, respectivamente.

A partir de los péptidos analizados mediante ESI-MS, 92% de la secuencia de diacuerpo se podría obtener en una sola digestión proteolítica (Figura 5). En esta secuencia existe una total coincidencia con las secuencias de aminoácidos deducidas de la secuencia de base de los dominios VH y VL (SEQ ID No. 16 y 17), se amplificaron mediante PCR partiendo del ARN total del hibridoma que produce el Mab CB/ior-ACE.1, del segmento de engarce de 5-aminoácidos (SEQ ID No. 10), y en la parte C terminal, de la secuencia del péptido c-myc y 6 histidinas finales, proporcionadas por el vector pJG-1m (Figura 2).

Ejemplo 6 Estudios de reconocimiento de ACE desglicosilado

ACE humano (Calbochem) se desglicosiló enzimáticamente con la endoglicosidasa PNGasa F (New England Biolabs) específica para N-glicosilación. El ACE se disolvió en tampón fosfato 20 mM pH 7,8 y se desnaturalizó con SDS y 2-mercaptoetanol a 100ºC durante 5 min. NP-40 y 1 PL de PNGasa F se añadieron después durante 2 horas a 37ºC. Las muestras de control y deglicosiladas se analizaron en SDS-PAGE con tinción de azul de Coomasie dando como resultado una reducción significativa de tamaño molecular (aproximadamente 50%) después de la digestión con la endoglicosidasa. Se llevó a cabo una transferencia de Western usando (a) Mab CB/ior-ACE.1, (b) elt scFv divalente purificado (diacuerpo) o (c) un antisuero humano anti-ACE obtenido en ratón, como anticuerpos primarios, seguido de anticuerpos policlonales contra el Fab de Mab CB/ior-ACE.1 conjugados a la peroxidasa de rábano picante para (a) y (b), y anticuerpos anti-ratón IgG conjugados a la peroxidasa de rábano picante para (c). La transferencia y desarrollo eran similares como se ha descrito anteriormente en esta invención para las transferencias de Western. El Mab CB/ior-ACE.1 y el diacuerpo solamente reconocieron el antígeno no desglicosilado. El antisuero policlonal reconoció ACE antes y después de la desglicosilación.

Se analizaron muestras de ACE humano nativo mediante un sistema de transferencia de puntos para el reconocimiento de lectinas específicas. Las lectinas empleadas eran la aglutinina de Sambucus nigra (SNA) y la aglutinina de Maackia amurensis (MAA), específicas para el ácido siálico terminal, ligado alfa 2,6 y alfa 2,3, respectivamente. Las lectinas empleadas en estos experimentos se habían conjugado con Digoxigenina, que se identifica mediante anticuerpo anti-Digoxigenina marcada con fosfatasa alcalina. Las muestras positivas para la interacción de lectina-oligosacárido se desarrollaron mediante reacción con un sustrato específico para fosfatasa (una mezcla de cloruro de 4-nitro azul tetrazolio y 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato). Se usó Fetuina en este experimento como control positivo de ambas lectinas. El ACE nativo se reconoció mediante SNA y no mediante MAA, un hecho que indica una alta prevalencia de ácidos siálicos terminales unidos a alfa 2,6.

El ACE humano se digirió después con la enzima NANAsa II, y exoglicosidasa (sialidase) capaz de hidrolizar los ácidos siálicos terminales alfa 2,6. Los productos de digestión se separaron en SDS-PAGE, y se realizó el estudio de su reconocimiento mediante transferencia de Western, usando como anticuerpos primarios el Mab CB/ior-ACE.1 y un antisuero de ACE anti-humano obtenido en ratón. Los resultados indicaron que el control de ACE era reconocido por ambas muestras, mientras solamente el antisuero anti-ACE de ratón reconocía el ACE digerido con NANAsa II.

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Ejemplo 7 Estudio Inmunocito- e histoquímico en tejidos normales y tumorales humanos

Se realizó el estudio de tejidos en las muestras seleccionadas entre archivos normales y tumorales, que provienen de material de autopsia. Se usó un panel mínimo de tejidos para verificar el reconocimiento ya descrito para Mab CB/ior-ACE.1 (Tormo B et al. APMIS 97: 1073-1080, 1989). Los especímenes incluían: carcinomas del pulmón, piel, mama, cerviz, esófago, y riñón, adenocarcinomas de colon, próstata, páncreas, vesícula biliar, intestino delgado estómago, tumores de origen neural, hematopoyético y sarcomatoso, así como mucosa de colon normal, y tejidos normales como hígado, riñón, pulmón, testículo, bazo y páncreas, incluyendo también células sanguíneas.

Se realizó el estudio siguiendo los procedimientos reseñados anteriormente (Tormo B et al. APMIS 97: 1073-1080, 1989), con algunas variaciones. Los especímenes de tejido se fijaron en 10% de formalina tamponada, se deshidrataron, se limpiaron y se embebieron en parafina de acuerdo con los procedimientos de rutina. Se evaluó la histopatología en secciones coloreadas con hematoxilina-eosina. Las secciones consecutivas de los bloques evaluador mediante histopatología se usaron para la técnica de inmunoperoxidasa.

Las secciones sin parafina, rehidratadas se trataron con 3% de H_{2}O_{2} durante 30 minutos para bloquear la peroxidasa endógena, se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se incubaron con las muestras, éstas se diluyeron en PBS-1% de albúmina sérica bovina (tampón de dilución), durante una hora. Después, los cubreobjetos se incubaron durante 30 minutos con una dilución 1:100 de anticuerpos policlonales IgG de conejo, obtenidos mediante inmunización con el Fab de Mab CB/ior-ACE.1, y finalmente durante un tiempo similar con una dilución 1:500 de un complejo peroxidasa-estreptavidina (Amersham).

Las muestras examinadas eran:

(a)

Mab CB/ior-_ACE.1 (control positivo) a una concentración de 20 \mug/ml

(b)

scFv purificado de E. coli, como se ha descrito en el Ejemplo 4, procedimiento (a), a una concentración de 50 \mug/ml

(c)

diacuerpo purificado de E. coli, como se describe en el Ejemplo 4, procedimiento (a), a una concentración de 50 \mug/ml

(d)

El scFv obtenido anteriormente, denominado "F3" en estos Ejemplos (Ayala et al. Biotechniques 13: 790-799, 1992; Pérez L et al. Applied Biochem. Biotechnol. 24: 79-82, 1996), purificado y a concentraciones de 50 y 100 \mug/ml Todas las diluciones de realizaron en tampón de dilución, y las incubaciones a temperatura ambiente, en cámara húmeda. Entre las etapas, se realizaron 3 lavados de 1 minuto cada una con tampón de dilución o PBS. La reacción de inmunoperoxidasa se desarrolló mediante una incubación 5-10 minutos con una solución que contenía 3 mg de diaminobencidina, 5 ml de LPBS y 5 ml de 30% de H_{2}O_{2}. Los cubre objetos se tiñeron en contraste de fase con hematoxilina de Meyer. La reacción de color marrón característica se registró como: negativo o positivo, en tres niveles de intensidad crecientes (1+, 2+, 3+). En cada cubreobjetos se realizó el marcado con la muestra en cuestión, y una zona cercana con el tampón de dilución como control negativo. Para el estudio de células sanguíneas, se retiraron primero los eritrocitos, y los glóbulos blancos remanentes se aplicaron sobre portaobjetos de vidrio cubiertos con gelatina, y se fijaron con acetona:metanol 1:1 (v:v). El resto de la técnica se desarrolló básicamente como se ha descrito anteriormente.

Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla VI, con respecto al tejido estudiado. Los tejidos normales estudiados (hígado, riñón, pulmón, testículos, sangre, bazo, páncreas) no se identificaron mediante los fragmentos o mediante el Mab. En el caso de la mucosa de colon, y en coincidencia con la que se ha obtenido antes para Mab CB/ior-ACE.1, el F3 scFv, y los nuevos scFv y diacuerpo, reaccionaron exclusivamente con los productos de secreción luminal y las zonas apicales de algunas glándulas. La intensidad de la reacción en el caso de F3 scFv era menor, algo que se observó más tarde para varios tumores. En el caso de células sanguíneas, el Mab, el scFv y diacuerpo no mostraron reacción con linfocitos normales y neutrófilos, indicando la ausencia de una reactividad cruzada importante con el antígeno NCA. Por el contrario, el F3 scFv mostró algún reconocimiento secundario de estas células.

El Mab, el scFv, y el diacuerpo reaccionaron con la mayoría de los tumores de origen gastrointestinal, y se observó el fuerte marcado en la mayoría de los casos tanto en la superficie apical de las células tumorales, como en el citoplasma. Ninguna de estas muestras de tumores marcados de origen hematopoyético y sarcomatosa, u otras derivadas de epitelio, excepción hecha de carcinoma de mama canalicular, y un carcinoma de de células grandes de pulmón. En los adenocarcinomas de colon bien diferenciados el marcado era intenso en la zona apical del citoplasma, y en los productos de secreción luminal, mientras en los adenocarcinomas moderadamente y escasamente diferenciados se observó el marcado en todo el citoplasma. Excepción hecha de muy pocas muestras, las intensidades de tinción eran muy similares para estas tres moléculas.

En el caso de F3, se observó una reducción general de la intensidad de tinción, incluso aunque en algunas ocasiones, se emplearon concentraciones dos veces mayores que las usadas para scFv y diacuerpo. La menor intensidad de tinción podría provocar que algunas muestras identificadas por los otros anticuerpos no fueran reconocidas por F3.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA VI Estudio inmunecito e histoquímica con anticuerpos diferentes

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Nota. Los números en la Tabla representan los casos con tinción positiva/número total de casos estudiados. Si no se presentan paréntesis, la intensidad de tinción en los positivos estaba entre 2+ y 3+; Ca: carcinoma; ADC: adenocarcinoma; HDG: Hodgkin; BD: bien diferenciado; MD: diferenciación media; PD: escasamente diferenciado; (*) la marca aparece circunscrita a los productos de la secreción luminar y zonas apicales de algunas glándulas; (a): los casos positivos tenían tinción que se podría clasificar como 1+, (b) reconocimiento de linfocitos y eosinófilos con intensidad que se podría clasificar como 1+; (c) 2 de los 6 casos positivos mostraron tinción con intensidad que se podría clasificar como 1+.

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Ejemplo 8 Determinación de la constante de afinidad

Para la determinación de la constante de afinidad se usó un procedimiento ELISA no competitivo (Beatty JD et al. J. Inmunol Meth. 100: 173-184, 1987) basado en la ley de acción de masas. La constante de afinidad Kaff es igual a [AgAb] /[Ag][Ab], donde AgAb es el complejo antígeno - anticuerpo en l/mol (M^{-1}), [Ag] es la concentración del antígeno libre (mol), y [Ab] es la concentración del anticuerpo libre (mol).

Se usaron cuatro diluciones en serie doble de ACE humano (Calbochem) en el revestimiento de placas ELISA de polivinilo (Costar). Se bloquearon las placas usando PBS-leche desnatada 1%. Las muestras (scFv F3, scFv, diacuerpo, Mab CB/ior-ACE.1, todas purificadas) se aplicaron a las placas a diversas concentraciones. Después de los lavados, los pocillos correspondientes a las tres primeras muestras se incubaron con el Mab 9E10 (10 \mug/ml), mientras en las correspondientes a Mab CB/ior-ACE.1 se usó la solución de bloqueo. En la siguiente etapa se añadió un anticuerpo anti ratón IgG conjugado a peroxidasa (Sigma) en dilución 1:2500 durante una hora, a 37ºC. El sustrato usado era OPD, y la reacción se desarrolló durante 15 minutos. La lectura de absorbancia se realizó a 492 nm en un equipo LabSystems Multiskan MS.

Los valores de densidad óptica (DO) para cada caso se representaron gráficamente en el eje de ordenadas (y), y la concentración en ng/ml en el eje de abcisas (x), en una escala de base logarítmica 10, la DO se recogió de manera en esas señales se mantenía al máximo. Para cada curva, se calculó la mitad de los valores DO 100 (DO 50). Se determinaron los valores de concentración de cada muestra a DO 50 para cada curva, y los cálculos de afinidad se llevaron a cabo con la siguiente fórmula: Kaff = (n-1)/2(n), donde n = [Ab']t/[Ab]t.[Ab'] es el valor de concentración de la muestra que corresponde a un valor de DO 50 para la concentración más alta de antígeno para comparar, y
[Ab]_t es el valor de concentración de la muestra que corresponde a un valor de OD 50 para la concentración más baja de antígeno para comparar. Las seis posibles de terminaciones de las 4 curvas obtenidas, estimando el Kaff final como la media de éstos.

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La Tabla VII refleja los valores de Kaff calculados para las variantes ensayadas. El scFv tiene un Kaff de
(5,0 \pm 0,4) x 10^{9} l mol^{-1}, una magnitud de más que un orden y la mitad mayor que la obtenida para F3 (Kaff= (9,2 \pm 0,8) x 10^{7} l mol^{-1}). Este ultimo valor básicamente con el calculado para F3 en las mediciones realizados mediante un procedimiento diferente (Pérez L et al. Applied Biochem. Biotechnol. 24: 79-82, 1996). El diacuerpo tiene un Kaff de (2,8 \pm 0,3) x 10^{10}l mol-1, mientras que el Mab CB/ior-ACE.1 tenía el valor Kaff (6,1 \pm 0,5) x 10^{10} l mol-1.

TABLA VII Valores de afinidad calculados para los experimentos desarrollados

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Ejemplo 9 Determinación de reconocimiento específico in vivo de fragmentos y anticuerpo marcado con ^{125}I, en ratones C57BI/6 que llevan tumores inducidos por la inoculación de células B16-CEA13

Para la de determinación del reconocimiento in vivo específico de los fragmentos de anticuerpo, se marcaron las siguientes moléculas con ^{125}I (Amersham, UK) usando el procedimiento lodogen (Fraker PJ, Speck JC Jr. Biochem Biophys Res Comm 80: 849-857, 1978):

(a)

scFv purificado a partir de E. coli; (actividad específica 1,1 MBq/5 \mug)

(b)

diacuerpo purificado a partir de E. coli; (actividad específica: 1.2 MBq/\mug)

(c)

Mab CB/ior-_CE4.1; (actividad específica: 1,8 MBq/5 \mug)

(d)

ScFv F3 purificado (Ayala et al. Biotechniques 13: 790-799, 1992; Pérez L et al. Applied Biochem. Biotechnol. 24: 79-82, 1996) (actividad específica: 1,0 MBq/5 \mug).

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Los productos marcados radiactivamente se analizaron en cromatografía de capa fina para determinar la incorporación a proteína y se encontraron los valores entre 95 y 98% de la radiactividad. La capacidad de los productos marcados radiactivamente para detectar ACE se ensayó en un sistema en el que se recubrieron tubos de poliestireno con ACE (5 \mug/ml; Calbochem), se bloquearon y las muestras de productos marcados radiactivamente se ajustaron a las cantidades de anticuerpo que podrían estar atrapados por esta fase sólida. Después de la incubación un lavado, se determine que 80, 79, 83, y 81% de la radiactividad se atrapó por la fase sólida, respectivamente, para las muestras (a)-(d) descritas anteriormente, demostrando que el procedimiento de marcado por radiactividad no afectó a la sensibilidad de la actividad biológica de los anticuerpos.

Para estudiar la biodistribución, se formaron 4 grupos de animales, cada uno de 12 ratones C57BI/6 (CENPALAB, Cuba). Los animales se inocularon con 1 x 10^{6} B16-CEA13 células por animal, usando la vía intraaxilar. Los tumores fueron visibles y palpables (aproximadamente 0,3-0,5 g) después de 7 días, después de lo cual a los ratones se les inyectó el producto marcado radiactivamente en cuestión por la vena de la cola, y se sacrificaron después de 12, 24 y 48 horas, con la retirada quirúrgica del tumor y los siguientes tejidos normales: bazo, hígado, riñón, intestino, músculo, médula ósea, y sangre. La acumulación de radiactividad se expresó como porcentaje de la dosis inyectada por gramo de tejido. Se realizó la calibración mediante una muestra patrón de la dosis inyectada. Se determinó la radiactividad usando un contador de centelleo gamma.

Las células B16-CEA13 usadas en estos experimentos se obtuvieron mediante la transfección de un gen que codifica los dominios extracelulares de ACE humano, clonados en el vector pDisplay^{TM} (Nº de Cat. V660-20, Invitrogen). El gen se obtuvo mediante PCR a partir del ARN extraído de las células CRL-1682, con los oligonucleótidos diseñados alteran la secuencia publicada de ACE humano. El plásmido recombinante pDisplay-CEA se purificó y se transfectó en células de melanoma B16-F10 de ratón C57BI/6 (ATCC CRL-6475) usando Lipofectamine PLUS^{TM} (Gibco-_BRL) y 5 \mug de ADN por transfección. Se realizó la selección de trasfectantes estables con 4,0 mg/ml de sulfato de geneticina (G418; Gibco-BRL) durante 14 días, después de lo cual las células cultivadas seleccionadas se clonaron mediante dilución limitante y los clones que expresaban ACE humano INEN su superficie se identificaron mediante inmunofluorescencia indirecta, usando Mab CB/ior-ACE.1 como primer anticuerpo, y anticuerpos anti ratón IgG conjugados con FITC (Sigma) para desarrollo. Se encontró que el 73% de los clones presentaban más de un 80% de las células con fluorescencia de membrana específica indicando que el ACE humano estaba expuesto correctamente plegado y glicosilado en su superficie.

Las células B16-F10 no transfectadas se emplearon como controles. Se multiplicaron as réplicas de los clones seleccionados como positivas mediante inmunofluorescencia indirecta y se inyectaron independientemente en ratones C57BI/6, 1 x 10^{6} células por animal, usando la vía intraaxilar. De los 10 clones que dieron lugar a tumores, uno más rápido y con características de crecimiento progresiva, denominado B16-CEA13, se seleccionó para los experimentos reseñados en el presente documento.

La Figura 6 muestra el porcentaje de radiactividad recuperada por tejido estudiado, a tiempos diferentes (con respecto al total inyectado), t la relación de radiactividad en el tumor: radiactividad en sangre. Los resultados incluidos en la Tabla VIII demuestran que entre 24 y 48 horas, la relación de radiactividad en el tumor: radiactividad en sangre se mantiene alta para el diacuerpo, el scFv, y el Mab, con los valores más altos para el último, seguido de la molécula dimérica. El F3 scFv obtenido anteriormente mostró valores muy bajos, con un comportamiento inadecuado in vivo que se puede correlacionar con su afinidad reducida por ACE.

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TABLA VIII Relación de radiactividades tumor: radiactividad en sangre para los ratones C57BI/6 transplantados con melanoma B16-CEA13 de ratón, que expresa ACE humano. Los valores corresponden a 24 y 48 horas después que a los animales se les inyectara diferentes moléculas marcadas radiactivamente con ^{125}I. Cada relación se calculó a partir de los valores medios derivados de los tejidos recuperados de 12 ratones

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<110> Centro para la Ingeniería Genética y Biotecnología

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<120> FRAGMENTOS DE ANTICUERPO ESPECÍFICOS PARA ANTÍGENO CARCINOEMBRIONARIO HUMANO (ACE)

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<130> Ejemplo listado de secuencias

\vskip0.400000\baselineskip

<140> 01

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2002-04-03

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: oligo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: oligo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: oligo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: oligo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: engarce I

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: engarce II

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: oligo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: oligo

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: oligo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: oligo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: oligo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: oligo

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: vector

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: oligo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: oligo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210>

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 241

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: scFv

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

25

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: diacuerpo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: oligo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: oligo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: diacuerpo MS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 255

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la Secuencia artificial: diacuerpo MS

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

31

Claims (13)

1. Un fragmento de anticuerpo de scFV específico para el antígeno carcinoembrionario humano (ACE), que tiene un sitio de unión a antígeno que comprende la región variable de la cadena ligera (VL) y la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo como se define en SEX ID NO 16 o SEX ID NO 17 y en el que dicha región variable de la cadena ligera (VL) y dicha región variable de la cadena pesada (VH) están unidas mediante un engarce peptídico.

2. Fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho fragmento de anticuerpo scFv es un scFv monovalente y en el que dicho engarce de péptido tiene la secuencia de aminoácidos EGKSSGSGSESKVD.

3. Fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho fragmento de anticuerpo scFV es un scFV divalente y en el que dicho engarce de péptido tiene la secuencia de aminoácidos GGGGS.

4. Fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el reconocimiento de ACE humano es dependiente de la conservación de la glicosilación de ACE.

5. Fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se producen en bacterias o levaduras recombinantes, en células transfectadas de insecto o de mamífero, o en organismos no humanos modificados genéticamente.

6. Fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dicho fragmento adicionalmente contiene una marca detectable, o un agente químico o biológico con potencial antitumoral.

7. Composición farmacéutica que comprende un fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para el tratamiento de tumores humanos que expresan ACE.

8. Composición farmacéutica que comprende un fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para la radiolocalización in vivo de tumores humanos que expresan ACE, usando técnicas de formación de imágenes.

9. Reactivo para la diagnosis in vitro o ex vivo que contiene un fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para la detección de ACE humano, unido o no a células.

10. Células aisladas que expresan un fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, obtenidas mediante manipulación genética por medio de ADN recombinante, en las que dichas células son bacterias, levaduras, células de insectos, células de mamíferos, o células de plantas.

11. Organismo multicelular que expresa un fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, obtenido mediante manipulación genética por medio de ADN recombinante, en el que dicho organismo es un animal no transgénico humano o planta transgénica.

12. Vectores que codifican un fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, obtenido mediante manipulación genética por medio de ADN recombinante, en los que dichos vectores son plásmidos o secuencias capaces de integrarse en células huésped.

13. Un procedimiento ex vivo para determinar la presencia de una célula que expresa ACE, comprendiendo dicho procedimiento proporcionar una muestra de células y poner en contacto dichas células con un fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y determinar la unión del fragmento de anticuerpo a las células.