ES2325492T3 - Fragmentos de anticuerpos especificos para el antigeno carcinoembrionario (ace) humano. - Google Patents
Fragmentos de anticuerpos especificos para el antigeno carcinoembrionario (ace) humano. Download PDFInfo
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Abstract
Fragmentos de anticuerpo tipo Fv de cadena sencilla (scFv) mono y divalente (diacuerpo), obtenidos por técnicas de ADN recombinante a partir del anticuerpo monoclonal (AcM) anti-antígeno carcinoembrionario (CEA) CB/ior-CEA.1. Este AcM tiene muy alta afinidad por el CEA y se emplea en el diagnóstico y seguimiento de tumores colorectales del hombre. Como el AcM original, los fragmentos scFv monovalente y diacuerpo exhiben altas afinidades por el CEA humano y reconocen un epítope dependiente de la conservación de carbohidratos. El fragmento scFv monovalente y diacuerpo tienen constantes de afinidad por el CEA de (5.0 ñ 0.4) x 109 L mol-1 y (2.8 ñ 0.3) x 1010 L mol-1, respectivamente. Estos dos fragmentos no presentan reactividad cruzada con células y tejidos humanos normales, excepto la mucosa colónica normal donde el CEA está ocasionalmente presente. Los fragmentos pueden producirse mediante la expresión en microorganismos recombinantes, a partir del clonaje de secuencias de ácidos nucleicoscodificantes para regiones variables obtenidas del hibridoma que produce el AcM CB/ior-CEA.1. Al igual que el AcM original, el scFv monovalente y el diacuerpo tienen la capacidad de identificar in vivo en ratones a células productoras de CEA humano que crecen formando tumores. El scFv monovalente y el diacuerpo tienen un tamaño molecular 5 y 2.5 veces inferior, respectivamente, que el AcM de ratón y no poseen dominios Fc, lo que les confiere el potencial de penetrar mejor los tejidos in vivo y de ser menos inmunogénicos en el hombre.
Description
Fragmentos de anticuerpos específicos para el
antígeno carcinoembrionario (ACE) humano.
La presente invención se refiere al campo de
inmunología, y en particular se refiere a fragmentos de anticuerpo
del tipo Fv de una sola cadena, en sus formas mono- y divalentes
(diacuerpo), obtenidas mediante técnicas de ADN recombinante a
partir de un anticuerpo monoclonal de ratón de eficacia clínicamente
probada, que es específica para el antígeno carcinoembrionario
humano.
El antígeno carcinoembrionario (ACE) es una
glicoproteína de180 kDa, secretada preferiblemente por las células
de los tumores humanos gastrointestinales y otros carcinomas incluso
aunque se pueden detectar en algunos tejidos no malignos como la
mucosa de colon. Su papel fisiológico no ha sido no ha sido
totalmente dilucidado, y hasta el momento se cree que está asociado
de alguna forma a los procesos de adhesión de células (Gold P,
Freedman SO. Journal of Experimental Medicine 122: 467: 1965;
Zimmermann W et al. PNAS USA 84: 2960-2964;
1987; Paxton RJ et al. PNAS USA 84: 920-924,
1987; Beauchemin N et al. Molec. Cellular Biol. 7:
3221-3230, 1987; Gold P, Goldenberg NA. MJM 3:
46-66,1997).
El ACE es un miembro de la superfamilia de
inmunoglobulina, debido a su estructura caracterizada por dominios
repetitivos (Oikawa S et al. BBRC 144:
634-642, 1987; Thompson J, Zimmermann W. Tumor
Biology 9: 63-83, 1988; Hammarstrom S. Seminars in
Cancer Biology 67-81, 1999). El ACE tiene una alta
homología con otras moléculas de esta superfamilia, tal como el NCA,
en antígeno de meconio, la Glicoproteína de tipo A de Biliar, y la
Glicoproteína b específica del embarazo (von Kleist S, Burtin P.
Immunodiagnosis of Cancer. Marcel Dekker. 322-341,
1979; Buchegger, F. et al. Int. J. Cancer 33;
643-649, 19984; Matsuoka Y et al. Cancer Res.
42: 2012-2018, 1982; Svenberg T. Int. J. Cancer 17:
588-596, 1976).
La elevación de los niveles circulantes de ACE
se considera desde hace muchos años como uno de los mejores
indicadores de una posible recaída y/o metástasis, en pacientes
sometidos a cirugía para los tumores colorrectales primarios que
expresan este antígeno (Gold P, Goldenberg NA. MJM 3:
46-66, 1997). La medición de ACE circulante también
se ha extendido como un procedimiento para el seguimiento de otros
carcinomas humanos (mama, pulmón), en los casos en los que se han
demostrado niveles antes de la cirugía significativos de este
marcador de tumor (Gold P, Goldenberg NA. MJM 3:
46-66, 1997). Desde el descubrimiento de la
tecnología de la tecnología para la generación de de anticuerpos
monoclonales (Mab; Kohler G, Milstein C. Nature 256:
52-53, 1975), los inmunoensayos para la medición de
ACE circulante han mejorado en especificidad y su uso se ha
extendido en gran medida.
El ACE también se ha estudiado desde hace muchos
años como una posible "célula diana" con el fin de dirigir de
manera específica los isótopos radiactivos para la diagnosis in
vivo (Goldenberg DM Int. J. of Biol. Markers 7;
183-188, 1992) y radioterapia in situ
(Ledermann et al., Int. J. Cancer 47;
659-664, 1991). Su uso también se ha previsto para
dirigir toxinas, fármacos, y otros productos bioactivos hacia las
células tumorales (Bagshawe KD. Drug Dev. Res. 34:
220-230, 1995).
Los anticuerpos anti ACE han sido los
principales vehículos para tales propósitos, a partir de
preparaciones policlonales, que siguen más tarde a Mab de ratón,
sus fragmentos Fab, fragmentos de anticuerpo obtenidos por
modificación genética a partir de Mab de ratón, y más recientemente,
a partir de genotecas de anticuerpos murinos y humanos desplegado
en fago filamentoso (Hammarstrom S et al. Cancer Res. 49,
4852-4858, 1989; Hudson PJ Curr. Opinion Inmunology
11: 548-557, 1999; Griffiths AD et al. EMBO
J. 12, 1993; 725-734; Griffiths AD et al.
EMBO J. 13 3245-3260, 1994; WO93/11236; Chester K
et al 1995, WO 95/15341; Allen DJ et al. 1996,
US5872215).
La expresión de anticuerpos fragmentos de
anticuerpo en células procarióticas de tipo E. coli, y en
otros microorganismos está bien establecida en la técnica
(Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551, 1991;
Gavilondo J, Larrick JW. Biotechniques 29: 128-132,
134-136, 2000). La expresión de anticuerpos y
fragmentos de anticuerpo, en células eucarióticas superiores en
cultivo también es conocida por los expertos en la técnica (Reff
ME. Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576, 1993; Trill
JJ et al. Curr. Opinion Biotech 6: 553-560,
1995).
Kim et al. (Hybridoma 20 (4), 2001, p.
265-271) caracterizan anticuerpos monoclonales
contra ACE producidos en líneas celulares obtenidas mediante la
fusión de células de bazo de ratones Balb/C inmunizados con ACE y
células de mieloma SP2/O.
El Mab de ratón denominado indistintamente
CB-ACE.1 o ior-ACE.1 (denominado de
aquí en adelante CB/ior-ACE. 1) se conoce en la
técnica. Este Mab tiene una alta especificidad para ACE, no tiene
reacciones cruzadas no deseadas con moléculas tales como NCA, ni
reconoce tejidos normales, a excepción de las células del epitelio
de colon normal, donde ACE se puede encontrar normalmente polarizado
(Tormo B et al. APMIS 97: 1073-1080,
1989). Este Mab tiene una afinidad muy alta por ACE (Pérez L et
al. Applied Biochem. Biotechnol. 24: 79-82,
1996). Este Mab marcado con ^{99m}Tc se ha empleado de manera
exitosa en la diagnosis y seguimiento de tumores colorrectales
humanos. Los estudios clínicos de radioinmunodetección mostraron que
tiene una sensibilidad de 91,3%, especificidad de 77,1%, y 82,8% de
valor predictivo positivo (Oliva JP et al. Rev Esp Med Nucl.
13: 4-10, 1994). Esto lo hace superior en
comportamiento con respecto a cualquier otro anticuerpo monoclonal
un anti-ACE empleado de forma clínica en el mundo
actualmente para tales propósitos, el ACE-Scan
(^{99m}Tc-Arcitumomab) de Immunomedics (Morris
Plains, NJ, Estados Unidos).
El desarrollo de un fragmento de anticuerpo de
Fv de una sola cadena (scFv), obtenido mediante la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) a partir del ARN extraído del
hibridoma que produce el Mab CB/ior-ACE. 1, se
reseñó en 1992 (Ayala M et al. Biotechniques 13:
790-799, 1992). En la estrategia experimental
seguida, la amplificación de los dominios variables de
CB/ior-ACE.1 se realizó con los oligonucleótidos
para las regiones marco conservadas de amos dominios variables. El
scFv se produjo en E. coli y demostró reconocimiento de ACE
en estudios de ELISA y citoquímica, pero con una afinidad por el
antígeno inmovilizado 200 veces menor que el Fab obtenido de forma
natural (Pérez L et al. Applied Biochem. Biotechnol. 24:
79-82, 1996). Se clonó este mismo fragmento scFv,
se clonó, se expresó y se produjo en Pichia pastoris
(Freyre FM et al. J Biotechnol. 76 (2-3):
157-163, 2000) sin ninguna mejora en afinidad por
ACE humano, y los estudios llevados a cabo en animales de
experimentación con el fragmento marcado radiactivamente indicaron
una biodistribución anómala (Pimentel GJ et al. Nud Med
Commun. 22: 1089-94, 2001), que motivaron que no
continuara su desarrollo posterior.
La presente invención se refiere a fragmentos de
anticuerpo Fv de una sola cadena (scFv) como se define en la
reivindicación 1, en sus formas mono y divalentes (diacuerpo). Estos
se pueden obtener mediante técnicas de ADN recombinantes partiendo
del anticuerpo monoclonal CB/ior-ACE. 1 del antígeno
anti-carcinoembrionario (ACE) (Tormo B et
al. APMIS 97: 1073-1080, 1989). Este Mab tiene
una afinidad muy alta por ACE (Pérez L et al. Applied
Biochem. Biotechnol. 24: 79-82, 1996) y se ha
empleado de manera exitosa en la diagnosis y seguimiento de tumores
colorrectales humanos (Oliva JP et al. Rev Esp Med Nud. 13:
4-10, 1994). Los fragmentos de scFv monovalentes y
diacuerpo reseñados en la presente invención se pueden producir a
través de de su expresión en microorganismos recombinantes, como
bacterias y levaduras. Como el Mab original, los fragmentos de scFv
monovalentes y diacuerpo son específicos para un epítope de ACE
humano que depende de la conservación de los carbohidratos y
muestran altas afinidades por este antígeno. Los fragmentos de scFv
monovalentes y diacuerpo tienen un patrón de reconocimiento in
vitro de de células normales y tumorales humanas como el Mab
original y, como éste, una vez que se ha marcado radiactivamente,
tienen la capacidad de identificar las células tumorales que
expresan ACE humano que se desarrollan en ratones congénitos
atímicos. Los fragmentos de scFv monovalentes y diacuerpo no tienen
dominios Fc y tienen un tamaño molecular inferior que el Mab de
ratón, esto les confiere que el potencial de penetrar mejor en los
tejidos in vivo y que sea menos inmunogénico cuando se
aplica a los seres humanos para propósitos de diagnóstico y
terapéuticos.
Los fragmentos de scFv monovalentes y diacuerpo
reseñados en la presente invención tienen diferencias importantes
en los aminoácidos en los dominios variables de cadena pesad (VH, y
cadena ligera (VL), con respecto a otro scFv desarrollado de manera
previa a partir del mismo Mab, y sobrepasarlo en afinidad por ACE,
en el comportamiento para el reconocimiento de células y tejidos, y
en eficacia para la localización de los tumores que producen
desarrollo de ACE humano in vivo en ratones.
Los fragmentos de scFv monovalentes y diacuerpo
reseñados en la presente invención se desarrollaron usando técnicas
de PCR, clonación y expresión en microorganismos recombinantes, a
partir del ARN extraído del mismo hibridoma
CB/ior-ACE.1. Los conjuntos de oligonucleótidos
diferentes de los usados para obtener un scFv reseñado
anteriormente (Ayala et al. Biotechniques 13:
790-799, 1992), se emplearon para la amplificación y
aislamiento de las secuencias de base que codifican los dominios
Mab VH y VL. En la invención se muestra que el nuevo scFv
monovalente y diacuerpo tiene importantes diferencias en las
secuencias de aminoácidos de los dominios VH y VL, con respecto a
un scFv obtenido previamente, Y que éstos tienen la forma de 16
aminoácidos en los marcos conservados 1 (FR1) y 3 (FR3) y en la
región determinante complementaria 2 (CDR2) del dominio VH,
diferente con relación al scFv obtenido previamente, y 3
aminoácidos entre el FR1 y FR3 de los dominios VL, diferentes con
relación a scFv obtenido anteriormente. Esto indica que estos
dominios tienen un origen clonal diferente con respecto a los
reseñados en Ayala et al. Biotechniques 13:
790-799, 1992. En el caso del diacuerpo, éste
solamente se diferencia del scFv obtenido previamente en el tamaño y
composición de aminoácidos del segmento de unión (engarce) que se
emplea en la fabricación de la molécula de tipo scFv.
Los cambios se reflejan sorprendentemente en las
propiedades bioquímicas y biológicas de los nuevos fragmentos, y
les proporcionan un comportamiento muy similar al Mab
CB/ior-ACE.1, y mucho más superior que la del scFv
reseñada previamente. El nuevo fragmento de scFv monovalente, que
tiene un engarce idéntico al scFv reseñado previamente (Ayala et
al. Biotechniques 13: 790-799, 1992), pero los
cambios de aminoácidos anteriormente mencionados en los dominios
variables, tiene una afinidad constante para ACE mucho más alta que
la de scFv reseñada anteriormente.
También, el diacuerpo sobrepasa ambas formas de
scFv monovalentes en su afinidad constante para el ACE humano. Los
dos nuevos fragmentos de scFv monovalentes diacuerpo conservan las
propiedades de especificidad del Mab original con respecto al
reconocimiento de ACE, identificación de células y tejidos
tumorales, ausencia de reactividad cruzada con NCA, y capacidad
para acumularse de manera selectiva en un tumor que produce ACE
humano trasplantado en seres ratones, todos los cuales tienen un
comportamiento mucho más superior que los de scFv obtenidos
previamente.
Los dos nuevos scFv monovalente y diacuerpo
tienen tamaños moleculares de al menos 5 y 2,5 veces menor que el
MAb original, respectivamente, un hecho que confiere a éstos el
potencial para penetrar mejor los tejidos y ser menos inmunogénicos
en el ser humano, todo lo cual hace que sean más atractivos y
presumiblemente superiores al Mab CB/ior-ACE.1
original para dirigir radioisótopos, fármacos, toxinas, y otros
elementos bioactivos para los tumores que expresan ACE humano.
En la presente invención se sabe que es posible
amplificar mediante PCR los dominios VH y VL del Mab
vCB/ior-ACE.1 usando oligonucleótidos sintéticos
que se hibridan en las secuencias de base que codifican los
péptidos de señal y dominios constantes CH1 y Ck. También se
muestra la posibilidad de ensamblar los dominios VH y VL
amplificados, en este orden, usando PCR, y obteniendo diferentes
formas de fragmentos de scFv mediante manipulación del tamaño del
engarce que conecta los dominios. Usando 14 aminoácidos se originó
una forma de scFv monovalente, y reduciendo este número hasta
cinco, se produce una forma de scFv de tipo diacuerpo.
Se demuestra en la invención que es posible
expresar los fragmentos de scFv monovalentes y divalentes en la
bacteria E. coli y en la levadura Pichia pastoris, y
que estos fragmentos identifican in vitro el ACE humano,
unido o no a células tumorales, de una manera específica. En la
presente invención también se demuestra que el scFv marcado
radiactivamente a monovalente y diacuerpo identifican in vivo
células tumorales que expresan ACE humano y que se desarrollan como
tumores en ratones, mostrando un comportamiento muy similar al de
Mab CB/ior ACE.1, y un comportamiento muy superior al de scFv
obtenido previamente. En la presente invención también se muestran
procedimientos para purificar y caracterizar los nuevos fragmentos
de scFv monovalentes y diacuerpo.
Los fragmentos de anticuerpo descritos en esta
invención son útiles para aplicarse en la diagnosis y terapia de
cáncer, con las ventajas que éstos derivan de un Mab de eficacia
clínica probada, y que su menor tamaño y ausencia del dominio Fc
permiten que ambos una mejor penetración de tejidos, y su uso en
tratamientos repetidos debido a la menor capacidad de inducción de
una respuesta de inmunoglobulina anti-ratón humano
(HAMA; Schroff et al. Cancer Res 45:
879-885, 1985; DeJager et al. Proc. Am.
Assoc. Cancer Res. 29: 377, 1988). Las respuestas de HAMA son
inconvenientes para el tratamiento debido a la neutralización del
efecto biológico del anticuerpo administrado, la reducción de dosis
consecuente, y debido a que éstos pueden provocar respuestas
alérgicas, enfermedad de "suero", y afecciones renales.
\vskip1.000000\baselineskip
Los términos describen una inmunoglobulina de
partes de la misma con especificidad antigénica, siendo éstas
naturales o producidas parcialmente o completamente de una manera
sintética. Los términos también cubren cualquier polipéptido o
proteína que tiene un dominio de unión que sería el sitio de unión
del anticuerpo, u homólogo a él. Éstos se pueden producir
naturalmente o de una forma sintética, o bien parcialmente o
completamente. Los Ejemplos de anticuerpos son las diferentes
clases y subclases de inmunoglobulinas, y fragmentos de éstas que
contienen sitios de unión de antígeno Tales como Fab, scFv, Fv y los
diacuerpos.
Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo
incluyen cualquier polipéptido que comprende un dominio de unión de
inmunoglobulina, siendo éste natural o producido de manera
sintética, ambos completamente o parcialmente, y moléculas
quiméricas que comprenden un dominio de unión de inmunoglobulina, o
su equivalente, fusionado a otro polipéptido.
Se ha mostrado que los fragmentos de un
anticuerpo completo pueden llevar a cabo la función de antígenos de
unión. Los ejemplos de estos fragmentos de unión son: (i) el
fragmento Fab que incluye los dominios VL, VH, CL y CH1 de una
inmunoglobulina; (ii) y el fragmento Fd, que consta de los dominios
VH y CH1; (iii) el fragmento Fv, que consta de los dominios VL y VH
de un anticuerpo dado; (iv) el fragmento scFv, donde los dominios VH
y VL de un anticuerpo dado están unidos con un engarce peptídico
que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de
unión de antígeno (Bird et al, Science 242:
423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA 85:
5879-5883, 1988); (v) "diacuerpos", fragmentos
multivalentes o multiespecíficos construidos de una manera similar
a scFv pero donde el pequeño tamaño del engarce no permite que los
dominios VH y VL de la misma molécula de scFv se asocien entre
ellos, y los sitios de unión de antígeno se forman mediante la
asociación de dos o scFv (documento WO94/13804; Holliger P et
al. PNAS USA 90 6444-6448, 1993); (vi) otros
fragmentos como el dAb (Ward SE et al., Nature 341:
544-546, 1989), regiones aisladas de CDR, fragmentos
F(ab')_{2} y dímeros biespecíficos scFv (PCT/US92/09965;
Holliger P, Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4:
446-449, 1993; de Haard, H et al. Adv. Drug
Delivery Rev. 31: 5-31, 1998).
Los diacuerpos y scFv se pueden construir sin
regiones Fc, usando solamente los dominios variables, reduciendo
potencialmente los efectos de las reacciones
anti-isotipo cuando se administran a seres humanos.
También son particularmente útiles debido a su producción en E.
coli y levadura recombinante. Su tamaño inferior al de una
inmunoglobulina completa les proporciona un incremento de potencial
penetración de tejidos.
Este término describía la parte de un anticuerpo
que comprende el área que específicamente interactúa con todo el
antígeno, o parte de él. Cuando el antígeno es mayor, un anticuerpo
solamente se puede unir a una parte particular del antígeno,
denominado epítope. Un sitio de unión de anticuerpo se puede
proporcionar por uno o más dominios variables de anticuerpo.
Preferiblemente, un sitio de unión de antígeno comprende la región
variable (o dominio) de la cadena ligera (VL) y la región variable
(o dominio) de la cadena pesada (VH) de un anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se refiere a la situación de en la que un
anticuerpo o su fragmento no presenta una unión significativa a
otras moléculas diferentes de su par de unión específica. Este
término también es aplicable al caso en el que un sitio de unión de
antígeno es específico para un epítope particular que aparece en un
número de antígenos relacionados o no relacionados, en cuyo caso el
sitio de unión sería capaz de unirse a varios antígenos que llevan
el epítope.
\vskip1.000000\baselineskip
Mediante la presente invención, se obtienen
moléculas de polipéptido específico, formadas por uno o más sitios
de unión de antígeno, que proceden de un Mab de ratón que es
específico para ACE humano. El sitio de unión de antígeno se
ensambla en la forma de formas monovalente, divalente, y otras de
fragmentos de anticuerpo, dependiendo de la forma en la que la
molécula de polipéptido se construye.
La molécula de polipéptido en la forma de un
fragmento de scFv monovalente específico para ACE humano muestra
una afinidad constante para este antígeno de (5,0 \pm 0,4) x
10^{9} L mol^{-1}, y comprende los Dominios VH y VL, unidos en
este orden mediante un segmento de unión de
14-aminoácidos (engarce), con una secuencia de
aminoácidos como la presentada en la SEQ ID No. 16.
La molécula de polipéptido en la forma de un
fragmento de scFv divalente (diacuerpo) específico para ACE humano
muestra una constante de afinidad para este antígeno de (2,8 \pm
0,3) x 10^{10} L mol^{-1}, y comprende el apareamiento de dos
moléculas idénticas formadas cada una de ella por los dominios VH y
VL, unidos en este orden por un segmento de unión de
cinco-aminoácidos (engarce), con una secuencia de
aminoácidos como la presentada en la SEQ ID No. 17.
En otro aspecto de la invención, los fragmentos
de scFv monovalente y diacuerpo no se unen, o se unen de una
manera significativa, con tejidos normales, o células de los
siguientes tejidos normales: hígado, riñón, pulmón, testículo,
sangre, bazo, y páncreas. En el caso de la mucosa de colon, los
fragmentos de scFv monovalente y diacuerpo reaccionan de manera
exclusiva con los productos de secreción luminal y en las zonas
apicales o algunas glándulas. La ausencia de reactividad de los
fragmentos de scFv monovalente y diacuerpo con linfocitos normales
y neutrófilos es indicativo que no existe un nivel importante de
de reactividad cruzada con el antígeno NCA (von Kleist S, Burtin P.
Immunodiagnosis of Cancer. Marcel Dekker. 322-341,
1979; Buchegger, F. et al. Int. J. Cancer 33;
643-649, 1984).
Los fragmentos de scFv monovalente y diacuerpo
se pueden unir a ACE soluble, ACE absorbido a las superficies
sólidas, o ACE asociado a las células que los producen, y a tejidos
tumorales, entre los que destacan adenocarcinomas humanos
colorrectal, mama, pulmón, páncreas y estómago. Los fragmentos de
scFv monovalente y diacuerpo y el Mab
CB/ior-ACE.1. se unen a ACE soluble unido a
superficie sólida en una forma que depende de la conservación de la
glicosilación de ACE humano, sugiriendo que los carbohidratos de
este antígeno están implicados en el reconocimiento.
Las moléculas de Polipéptido derivadas de los
fragmentos de scFv monovalente y diacuerpo reseñadas en esta
invención, que retienen la capacidad de unirse a ACE, su afinidad
reseñada, reconocimiento de epítope específico, y comportamiento
biológico y bioquímico similar y equivalente con los fragmentos
descritos en esta invención se consideran formas variantes
equivalentes y están contenidas en la presente invención. Estas
moléculas de polipéptido pueden tener la forma de otros fragmentos
de anticuerpo recombinantes, tales como scFv donde el dominio VL
precede a VH; o Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Facb, scFv
trimérico o tetramérico, etc. (Winter G, Milstein C. Nature 349:
293-299,1991; documento WO94/13804 de Haard, H et
al. Adv. Drug Delivery Rev. 31: 5-31, 1998), y
se usan otros segmentos de unión (engarces) conocidos en la técnica.
Éstos también pueden estar en la forma de moléculas de anticuerpo
biespecíficos, en las que una parte de tal conserva la especificidad
para ACE, y las otros tienen una especificidad diferente.
Igualmente se contienen en la presente invención
las formas variantes de los fragmentos de scFv monovalente y
diacuerpo que cumplen las características descritas en los párrafos
anteriores, y que se habrían derivado de la llamada "humanización
mediante reducción de la inmunogenicidad", en la que los epitomas
de las células B y T presentes en los dominios variables están
modificados de una forma en la que no se altera el reconocimiento
antigénico, pero la inmunogenicidad de la molécula resultante en
seres humanos se reduce, por ejemplo, como se revela en Carr FJ
et al. 2000 EP 983303A1 y en Rodríguez Pérez R et al.
US 5712120-A. Igualmente se consideran las formas
variantes contenidas en la presente invención son las producidas
por el llamado "transplante de CDR" en el que las secuencias
de CDR de un primer anticuerpo se colocan dentro del marco de
secuencias que no proceden de este anticuerpo, por ejemplo, como se
revela en los documentos
EP-B-0239400,
EP-A-184187, GB 2188638A o
EP-A-239400, y mantienen la
capacidad de unirse a ACE con afinidad similar, capacidad
competitiva, reconocimiento de epítope particular, y comportamiento
biológico y bioquímico similar y equivalente a los fragmentos de
scFv monovalente y diacuerpo descritos en esta invención.
Además de las secuencias de anticuerpo, las
moléculas de polipéptido contenidas en esta invención pueden
comprender otros aminoácidos que forman un péptido o polipéptido, o
que añaden a la molécula una característica funcional diferente de
la de unión del antígeno ACE, como por ejemplo una etiqueta para
la purificación de o identificación, una enzima o sus fragmentos,
un modificador de respuesta biológica, una toxina o fármaco, y
sucesivamente. De acuerdo con esta invención los fragmentos de scFv
monovalente y diacuerpo se pueden administrar en forma aislada o
purificada.
La presente invención prevé el uso de algunas de
las moléculas de polipéptido descritos anteriormente como un
reactivo de diagnóstico para formas de cáncer humano que expresan
ACE, como por ejemplo, adenocarcinomas de colon, pulmón, mama u
otros.
Las moléculas de polipéptido específicas para
ACE descritas anteriormente se pueden marcar radiactivamente y
emplear como agentes para obtener imágenes para demostrar de una
forma específica y emplearse como agentes para obtener imágenes
para demostrar de una forma específica la presencia y localización
de tumores que expresan ACE en seres humanos. La presente invención
proporciona un procedimiento para determinar la presencia de una
célula de tumor que expresa ACE, siendo dicho procedimiento el de
poner en contacto las células con las moléculas de polipéptido
como los descritos, y determinar la unión de éstas a las células.
El procedimiento se puede desarrollar in vivo, o en una
muestra de de células retiradas del cuerpo, siendo esto in
vitro o ex vivo.
La presente invención proporciona un
procedimiento para la unión de una molécula de polipéptido como las
descritas anteriormente, a ACE humano. Esta unión se puede producir
in vitro, ex vivo o in vivo. Si la unión es
in vivo, el procedimiento puede comprender la administración
de la molécula de polipéptido a mamíferos, siendo éstos uno o
varios individuos. Como se demuestra experimentalmente en el
presente documento, los fragmentos de scFv monovalente y diacuerpo
en esta invención se unen a ACE humano se expresan mediante células
tumorales de ratón transfectadas, que crecen como tumores una vez
que se han transplantado a ratones, proporcionando un modelo
experimental útil para el estudio, la investigación, y el desarrollo
de moléculas con unión específica de sus propiedades. La
reactividad de los anticuerpos sobre muestras celulares se puede
detector mediante cualquier medio apropiado. El marcaje con
moléculas indicadores individuales es una de tales posibilidades.
Las moléculas indicadoras pueden generar señales capaces de ser
detectadas directa o indirectamente y preferiblemente ser medidas.
El acoplamiento de las moléculas indicadoras puede ser covalente o
no covalente, directo o in directo. La unión mediante un enlace
peptídico se puede producir a partir de la expresión recombinante de
una fusión del gen que acopla el anticuerpo y la molécula
indicadora. La forma de determinación de acoplamiento no es una
característica de la presente invención, y los expertos en la
técnica son capaces de elegir un modelo adecuado de acuerdo con su
preferencia y conocimiento general.
Cuando se usa un radionúclido como ^{125}I,
^{111}In o ^{99m}Tc para marcar los fragmentos de scFv
monovalente y diacuerpo y sus formas equivalentes, si estas se
localizan preferiblemente en el tumor, y no en los tejidos
normales, la presencia del marcado radioactivo en el tejido tumoral
se puede detectar y cuantificar usando una cámara gamma. La calidad
de la imagen obtenida del tumor se correlaciona directamente con la
relación de señal:fondo (Goldenberg DM. Int. J. of Biol. Markers
1992, 7; 183-188). El uso experimental de ^{125}I
se ejemplifica en el texto.
La presente invención también ofrece elementos
de manera que los fragmentos de scFv monovalente y diacuerpo y sus
formas variantes equivalentes como se ha descrito anteriormente, se
pueden usar como un reactivo terapéutico, por ejemplo, cuando están
acoplados, conjugados o unidos a moléculas con poder terapéutico, o
se generan como una proteína de fusión recombinante. Los
fragmentos de scFv monovalentes y diacuerpo y sus formas variantes
equivalentes de acuerdo con la presente invención se pueden usar
para dirigir toxina, radioactividad, células T y NK, u otras
moléculas a los tumores que expresan ACE, o para desarrollar una
respuesta antiidiotípica en el organismo que podría conducir a un
efecto terapéutico deseado. De acuerdo con esto, otros aspectos de
la invención proporcionan elementos para los procedimientos de
tratamiento que implican la administración de fragmentos de scFv
monovalentes y diacuerpo o sus formas variantes equivalentes, como
medicamentos o composiciones farmacéuticas.
De acuerdo con la presente invención, las
composiciones se pueden administrar a individuos, preferiblemente
en una cantidad "terapéuticamente eficaz", suficiente para
demostrar un beneficio del paciente, en la forma de la mejora de al
menos un síntoma. Los detalles relacionados con la cantidad a
administrar, la frecuencia e intervalos de administración dependerá
de la naturaleza y gravedad de la enfermedad que se trata, y estas
decisiones son la responsabilidad de los especialistas y otros
doctores médicos. Las dosis apropiadas de un anticuerpo se conocen
bien en la técnica (Ledermann J. A. et al. Int J. Cancer
47: 659-664, 1991; Bagshawe KD et al.
Antibody, Immunoconjugates, and Radiopharmaceuticals 4:
915-922, 1991).
Se puede administrar una composición sola o en
combinación con otros tratamientos, o bien de manera simultánea o
secuencial, dependiendo de de la enfermedad a tratar.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con
la presente invención, y a emplear de acuerdo con la presente
invención, pueden comprender, además del ingrediente activo, un
excipiente, tampón, estabilizante o vehículo farmacéutico aceptado,
u otros materiales bien conocidos por los expertos en la técnica.
Estos materiales no deben ser tóxicos, no deben interferir con la
eficacia del ingrediente activo y su naturaleza precisa debe
depender de la vía de administración, siendo esta oral, o mediante
inyección, por ejemplo, por vía intravenosa.
Los fragmentos de scFv monovalentes y diacuerpo
y sus formas variantes equivalentes de acuerdo con la presente
invención se pueden fabricar mediante la expresión de del ácido
nucleico codificante. El ácido nucleico que codifica cualquiera de
estas moléculas de polipéptido descritas antes es parte de la
presente invención, como es un procedimiento para la expresión de
tal ácido nucleico. En una realización diferente, el ácido nucleico
puede codificar las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ
ID No. 16 y 17.
Para la expresión recombinante del scFv
monovalente y diacuerpo y sus formas variantes equivalentes,
vectores apropiados se pueden seleccionar o construir, con las
secuencias reguladoras adecuadas, incluyendo promotor, terminador,
potenciador, poliadenilación, genes marcadores, y otras secuencias
pertinentes. Los vectores pueden ser plásmidos. Se describen en
detalle en varias referencias muchos protocolos y técnicas para la
manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo, preparación de
construcciones de ácido nucleico, reacción en cadena de la
polimerasa, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en
células en células y expresión génica, análisis de proteínas, y
otros, como Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2ª edición,
Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 o
Short Protocols in Molecular Biology, 2ª edición, Ausubel et
al. eds., John Wiley y Sons, 1992 o Erlich HA PCR Technology,
Stockton Press, 1989.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona una célula huésped que contiene un ácido nucleico
extraño y los procedimientos para introducir tal ácido nucleico en
una célula huésped. La introducción puede emplear cualquiera de las
técnicas que existen para tal propósito. Para las células
bacterianas y de levaduras, esta técnica puede ser electroporación.
La introducción puede ser seguida de de la provocación o permisión
de la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, desarrollo de las
células huésped en condiciones favorables para la expresión del
gen. En una realización, el ácido nucleico de la invención se
integra en el genoma de las células huésped.
Después de su producción, los fragmentos de scFv
monovalente y diacuerpo y sus formas variantes equivalentes, se
pueden usar en cualquiera de las formas reveladas en el presente
documento, tal como en la formulación de una composición como un
producto farmacéutico o de diagnóstico, tal como en un conjunto de
reactivos que comprende además del miembro de unión específico, uno
o más reactivos para determinar la unión del miembro a las células
o a ACE no unido a las células, como se ha descrito antes. Otros
aspectos adicionales de esta invención y sus realizaciones serán
evidentes para los expertos en la técnica. Se proporcionan ejemplos
para el completo entendimiento de la presente invención, y no para
limitar su extensión ni su ámbito. Se hace referencia a las
siguientes figuras:
\vskip1.000000\baselineskip
En la Figura 1, se representa un esquema del
vector pJG-1m usado para la expresión del scFv
monovalente y diacuerpo en E. coli. En correspondencia con
la zona de vector marcada con la barra horizontal amplia, se
presentan las secuencias de base de los sitios de clonación de los
sitios de de fragmentos, el péptido c-myc, el
dominio 6-histidina, y alguno algunas regiones inter
y pos- dominio (SEQ ID No. 13).
En la Figura 2 se presentan la alineación de las
secuencias de aminoácidos (en código de una letra) deducido de los
nucleótidos para (1) el fragmento de scFv monovalente (SEQ ID No.
16), y (2) el fragmento (diacuerpo) (SEQ ID No. 17). El orden de
los dominios en ambas construcciones son VH-segmento
engarce-VL. Los aminoácidos de los segmentos de
engarce empleados en cada de las dos moléculas aparecen en
caracteres en letra negrita.
En la Figura 3 se ejemplifica el reconocimiento
de (A) Mab CB/ior-ACE. 1, (B) scFv monovalente, y
(C) diacuerpo, para el ACE expresado en células tumorales de cultivo
AsPC-1 (ATCC CRL-1682), mediante la
técnica de inmunofluorescencia indirecta. En A, B, y C, se observa
la membrana característica y fluorescencia de citoplasma próxima. La
ampliación es 200x.
En la Figura 4 se presenta perfil cromatográfico
de la digestión proteolítica del diacuerpo y la asignación de los
péptidos trípticos obtenidos mediante espectrometría de masas.
Arriba: Perfil cromatográfico de la digestión tríptica del
diacuerpo. Abajo: Tabla sumario de la asignación de los péptidos
trípticos del diacuerpo. M/z exp: masa experimental; m/z teórica:
masa teórica; Z: carga. En los espectros obtenidos no se obtuvieron
las señales correspondientes a cisternas de engarce incorrectas.
La Figura 5 es un sumario de la verificación de
la secuencia de aminoácidos del diacuerpo (SEQ ID No. 21). Las
regiones de la secuencia de proteínas que se verificaron mediante
espectrometría de masas se indican en caracteres en negrita, y las
zonas de la secuencia que no se recuperaron después de la digestión
tríptica aparecen en letra itálica. Las zonas en letra negrita
coinciden en total con la secuencia de aminoácidos deducida de la
secuencia de base del diacuerpo. La secuencia del péptido
c-myc y las 6 histidinas finales, proporcionadas por
el vector pJG-1 m (Figura 1), también se observan
en la parte del extremo C.
La Figura 6 presenta el porcentaje de la dosis
inyectada por gramo de tejido, después de 24 (barras de rayas) y 48
(barras no rayadas) horas de inoculación de ratones que llevan
tumores que expresan ACE humano con las siguientes moléculas
marcadas radiactivamente con ^{125}I; de izquierda a derecha, y en
grupos de cuatro barras dobles: (a) diacuerpo, (b) scFv, (c) F3, y
(d) Mab CB/ior-ACE.1. Cada una de las barras
representa la media de las cuentas recuperadas de los órganos
obtenidos a partir de 12 ratones. Los resultados demuestran que
entre 24 y 48 horas, la relación de radiactividad en tumor:
radiactividad en sangre se mantiene alta para el diacuerpo, el scFv,
y Mab, con los valores mayores para este último, seguido de la
molécula dimérica. F3 mostró valores muy bajos, con un
comportamiento in vivo inadecuado que se puede correlacionar
por su afinidad disminuida para ACE.
\vskip1.000000\baselineskip
1. Amplificación mediante PCR, clonación y
secuenciación de los dominios variables de Mab
CB/ior-ACE.1.
2. Ensamblaje de scFv y diacuerpo, expresión en
E. coli, y demostración de su reconocimiento de ACE
humano.
3. Expresión del scFv y diacuerpo en Pichia
pastoris y demostración de su reconocimiento de ACE humano.
4. Purificación del scFv y diacuerpo producido
en bacterias.
5. Caracterización del diacuerpo mediante la
digestión proteolítica y espectrometría de masas.
6. Estudios de reconocimiento de ACE
desglicosilado.
7. Estudio Inmunocito- e
histo-químico en tejidos normales y tumorales.
8. Determinación de la constante de
afinidad.
9. Determinación del reconocimiento específico
in vivo de fragmentos y anticuerpo marcado con ^{125}I, en
ratones C57BI/6 que llevan tumores inducidos por la inoculación de
células B16-CEA13.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento
(a)
ARN total de 10^{6} células del hibridoma de
ratón CB/ior-ACE.1 (Tormo B. et al. APMIS.
97: 1073-1080, 1989) se extrajo con el reactivo
TriPure^{TM} (Boehringer-Mannheim). Se sintrizó el
ADN complementario (ADnc) usando el kit de síntesis de ADNc de
primera hebra para RT-PCR
(Boehringer-Mannheim), usando oligo dT como
cebador. Se usó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) para la amplificación específica de los genes de los dominios
variables de cadena pesada y ligera. Los cebadores sintéticos
empleados se diseñaron en la base de las secuencias de consenso
para IgG de ratón y las cadenas kappa, reseñadas por Kabat E. et
al. (Departamento Salud y Servicios Humanos de los Estados
Unidos, NIH, 1991) y experimentos desarrollados anteriormente en
este laboratorio (Coloma, MJ et al. Biotechniques 11:
152-156, 1991). Las secuencias de oligonucleótidos
usadas en PCR aparecen en la
Tabla I.
Tabla I.
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\vskip1.000000\baselineskip
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Para la PCR, se usó el Kit PCR Core
(Boehringer-Mannheim). Las condiciones de la PCR
fueron: desnaturalización a 94ºC, 1 minuto, hibridación a 55ºC, 1
minuto, extensión a 72ºC, 1 minuto, 25 ciclos, con minutos 5
adicionales de extensión a la temperatura ya descrita en el último
ciclo, todo en un equipo MJ Research Miniciclor. Los volúmenes
finales de cada reacción fueron 100 \muL. Se usaron todos los
oligonucleótidos a una concentración final de 1 \muM.
Los fragmentos amplificados de ADN, con el
tamaño esperado de aproximadamente 320-530 pares de
bases, se purificaron en geles de agarosa bajo punto de fusión
(Sigma), usando el kit de Extracción de gel QlAquick QIAGEN,
GmbH), y se clonaron independientemente en el vector pMOS (Amersham
Pharmacia Biotech), diseñado para la clonación "ciega" de
fragmentos de ADN.
Procedimiento
(b)
Para la determinación de la secuencia de
nucleótidos de los dominios variables de las cadenas ligera y pesada
clonados en el vector pMOS, se usaron los oligonucleótidos
recomendados por el fabricante (Amersham Pharmacia Biotech). La
secuencia de base se realizó por medio de procedimientos
automáticos, usando un equipo ALFexpress II de Pharmacia (Amersham
Biosciences), y el "Kit Thermus Sequenase 5 Cy Dye Terminator".
Los plásmidos pVL2 y pVH5 se seleccionaron como representantes de
las secuencias de VL y VH, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento
(a)
Se usó la PCR para el ensamblaje, en la forma de
scFv y diacuerpo, de los dominios VH y VL contenidos en los
plásmidos pVH5 y pVL2.
Los oligonucleótidos sintéticos se diseñaron en
base a las secuencias de VH y VL en los plásmidos pVH5 y pVL2.
éstos incluían los sitios de restricción pla clonación en el
vector pJG-1 m e incorporaban los segmentos de
engarce 14 y 5 aminoácidos para el ensamblaje de scFv monomérico y
diacuerpo (Tablas II y III).
\vskip1.000000\baselineskip
Para el ensamblaje de fragmentos, se realizó una
PCR independiente en una primera etapa para amplificar:
- 1.
- Para los dominios que proporcionarían el origen al scFv monovalente. - Reacción 1: usando el plásmido pVH5 como molde con los oligonucleótidos 5 y 6 (Tabla III). Reacción 2: usando el plásmido pVL2 con los oligonucleótidos 7 y 8 (Tabla III).
- 2.
- Para los dominios que proporcionarían el origen al diacuerpo. - Reacción 3: usando el plásmido pVH5 con oligonucleótidos 5 y 9 (Tabla III). Reacción 4: usando el plásmido pVL2 como molde con los oligonucleótidos 8 y 10 (Tabla III).
- Las condiciones y reactivos usados para PCR ya se han descrito anteriormente. Todos los oligonucleótidos se usaron a una concentración final de 1 \muM.
Para el ensamblaje de scFv se realizó una nueva
PCR mezclando 4 \mul de reacciones 1 y 2 con los oligonucleótidos
5 y 8 (Tabla III) a una concentración final de 1 \muM, y los
oligonucleótidos 6 y 7 (Tabla III) a una concentración final de 0,01
\muM.
Para el ensamblaje del diacuerpo se realizó una
nueva PCR mezclando 4 \mul de reacciones 3 y 4 con
oligonucleótidos 5 y 8 (Tabla III) a una concentración final de 1
\muM, y los oligonucleótidos 6 y 7 (Tabla III) a una concentración
final de 0,01 \muM.
Los fragmentos de ADN amplificados se detectaron
como bandas mayoritarias de aproximadamente 700 pares de bases, y
se aislaron en los geles de agarosa de bajo punto de fusión, como se
ha descrito anteriormente.
Procedimiento
(b)
El vector pJG-1 m es un plásmido
diseñado para la expresión de fragmentos de anticuerpo en el
periplasma de E. coli (Figura 1). Como elementos principales
tiene el promotor LacZ, un péptido de señal, sitios de restricción
ApaL I y Not I para la inserción del gen del fragmento, un péptido
c-myc y una secuencia que codifica 6 histidinas.
Éste último se usa como etiqueta para la purificación de los
productos de expresión por iones de metales inmovilizados (IMAC;
Porath J. Prot. Expr. Purif. 3: 263-281, 1992). Las
secuencias de base de la clonación de los sitios de restricción o
para la clonación de scFv en cuestión en el vector, y de los
aminoácidos del extremo C que se añaden al scFv, aparecen en la
Figura 1 (SEQ ID No. 13).
Los fragmentos de ADN que corresponden a scFv y
diacuerpo, y el vector pJG-1 m vector se digirieron
con las enzimas de restricción ApaLI y Not I (Promega) y las bandas
y vector ligados independientemente usado T4 ADN ligasa (Promega).
Los productos de las reacciones de ligación se usaron para la
transformación de E. coli competente (cepa
XL-1Blue; Stratagene) mediante electroporación, y se
desarrollaron las células transformadas en medio selectivo sólido
(agar LB, con 100 \mug/ml de ampicilina) durante 16 horas a 37ºC.
Los procedimientos usados se describen en Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Segunda Edición. Sambrook, Fritsch, Maniatis.
1989.
Los plásmidos recombinantes se seleccionaron
después de la purificación del ADN de plásmido de varias colonias
(QIAGEN MiniPrep kit), y la correspondiente comprobación mediante
digestión con las enzimas de restricción ya descritas para los
productos de ligamiento esperados. En los análisis de restricción,
se obtuvieron bandas de aproximadamente 3,5 kb correspondientes al
vector linealizado, y las bandas de aproximadamente 700 pares de
bases para los genes que codifican los fragmentos de anticuerpo de
scFv y diacuerpo.
Se secuenciaron cinco clones de cada
construcción usando cebadores diseñados específicamente que se
hibridan de manera externa las regiones de clonación del vector
pJG-1m (Tabla IV), mediante los procedimientos
descritos anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias de aminoácidos derivadas de las
secuencias de base obtenidas para el scFv monovalente (clon
pJG1m-25) y el diacuerpo (clon
pJG1m-18) aparecen en la Figura 2 (SEQ ID No. 16 y
SEQ ID No. 17). Con respecto a un scFv desarrollado anteriormente
(Ayala M et al. Biotechniques 13: 790-799,
1992), las secuencias de VH y VL obtenidas ahora para el nuevo
scFv monovalente y diacuerpo muestran 16 aminoácidos diferentes
dentro de los dominios VH FR1, CDR2 y FR3, y 3 aminoácidos
diferentes dentro de los dominios VL FR1 y FR3.
Estos resultados indican que los dominios
variables amplificados y clonados a partir del hibridoma
CB/ior-ACE.1 para construir el nuevo scFv
monovalente y diacuerpo pueden provenir a partir de ARN diferente
con respecto a los usados en las amplificaciones para la clonación
del scFv. reseñado anteriormente
El segmento de engarce del nuevo scFv
monovalente es idéntico al de scFv reseñado anteriormente. El
segmento de unión del nuevo scFv divalente (diacuerpo) es diferente
del scFv obtenido anteriormente, debido a que solamente incluye 5
aminoácidos. En estos experimentos también se verificaron las
secuencias de los segmentos de engarce L1 y L2, que aparecen en la
Tabla II.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento
(c)
Células de E. coli competentes TG1 se
transformaron de manera independiente con plásmidos
pJG1m-25 y pJG1m-18, que contienen
la información para ambos fragmentos de anticuerpo. Esta cepa
permite la expresión periplásmica de la proteína heteróloga, o su
secreción hacia el medio de cultivo.
Las bacterias transformadas se sembraron sobre
un medio de soporte sólido y se desarrollaron a 37ºC durante 16
horas. Se desarrolló una colonia representativa de cada una de las
dos construcciones sobre medio líquido hasta una DO_{530nm} = 1
y se indujo durante 12 horas añadiendo 1 mM de IPTG al medio de
cultivo. Se centrifugaron las células y el contenido periplasmático
se aisló mediante choque osmótico y breve sonicación (segundos)
para su evaluación en electroforesis en geles de 12% de
SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Este
ensayo reveló la expersión en ambos casos de proteínas del tamaño
molecular esperado (aproximadamente 27 kDa), que se evaluaron
posteriormente mediante transferencia de Western usando como
anticuerpo primario un Mab (9E10) específico contra el péptido
derivado de c-myc que contiene esta proteína (1
\mug/ml), seguidos de anticuerpos conejo
anti-ratón IgG conjugados con peroxidasa de rábano
picante (Sigma). La transferencia de proteínas del
SDS-PAGE a Hybond C Extra nitrocelulosa (Amersham
Life Sciences) se realizó en un equipo de transferencia
semi-seco (BioRad). Se usó sustrato insoluble DAB
(Sigma) en el desarrollo.
Para las dos construcciones, las proteínas
recombinantes con el tamaño mencionado se identificaron con el Mab
9E10.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento
(d)
Se realizó un ensayo ELISA recubriendo placas de
polivinilo (Costar, placas de ensayo de polivinilo de 96 pocillos)
con ACE humano (Calbochem 219369), a una concentración de 1
\mug/ml. Después de bloquear las placas con leche desnatada, las
muestras de periplasma bacteriano correspondiente a las dos
construcciones se añadieron en diluciones de 1:5, 1: 10, y 1:20 en
PBS-2% de leche desnatada, y se incubaron durante 2
horas a temperatura ambiente.
Para la detección de la unión de fragmentos al
ACE, se usó Mab 9E10 (1 \mug/ml), seguido de anticuerpos anti
ratón IgG conjugados con peroxidasa de rábano picante de Sigma.
Después de varios lavados, se usaron OPD (Sigma) y H_{2}O_{2}
como cromógeno y sustrato para desarrollar las reacciones, y la
evaluación cuantitativa de las reacciones se leyeron a 492 nm en un
LabSystems Multiskan MS.
En el ensayo, se usó Mab
CB/ior-ACE.1 como un control positivo. Las
fracciones de periplasma correspondientes a las células TG1
transformadas con el vector pJG-1m sin inserción, y
un Mab no relacionado, se usaron como controles negativos. También,
las placas se recubrieron con los siguientes antígenos
irrelevantes: 10 \mug/ml de seroalbúmina bovina (BSA, Sigma), 10
\mug/ml de ovoalbúmina, 10 \mug/ml de lisozima, 10 \mug/ml de
hemocianina de lapa bocallave californiana (Sigma). En todas las
placas se incluyeron incluidos si solamente se colocó solución
salina tamponada con fosfato (PBS) sin antígeno (blanco). Se
consideraron positivos los valores de absorbancia al menos 4 veces
mayor que los producidos por los controles negativos.
En estos experimentos las muestras de periplasma
de las construcciones de scFv y diacuerpo resultaron positivos con
respecto a su capacidad de reconocimiento de ACE humano y se
adsorbieron a placas de polivinilo. Estas mismas muestras eran
negativas para todos los antígenos irrelevantes.
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Procedimiento
(e)
Las líneas celulares de tumor humano LoVo (ATCC
CCL-229), AsPC-1 (ATCC
CRL-1682), y LS 174T (ATCC CL-188),
todas las cuales expresan ACE en cultivo, se sembraron en placas de
poliestireno de 96 pocillos (Costar). Una vez se alcanzó la
confluencia se lavaron los pocillos dos veces con PBS, se retiraron
por drenado, y se secaron al aire. Después las células se fijaron
al plástico mediante el uso de una mezcla 1:1 (v:v) de
acetona-metanol fríos, durante 3 minutos. Después
de varios lavados con agua destilada para eliminar restos, las
placas se usaron como fase sólida en ensayos de ELISA donde se
añadieron las muestras de periplasma bacteriano correspondiente a
las dos construcciones en diluciones de 1:2, 1:8, y 1:16, en
PBS-2% de leche desnatada, y se incubaron durante 2
horas a temperatura ambiente. Después de varios lavados, se usó Mab
9E10 (1 \mug/ml), seguido de anticuerpos anti ratón IgG
conjugados con peroxidasa de rábano picante (Sigma) para la
detección de la unión de fragmentos a ACE. Después de varios
lavados, se usaron el cromógeno OPD (Sigma) y H_{2}O_{2} como
substrato para desarrollar las reacciones, y se empleó un lector
LabSystems Multiskan. MS para la evaluación cuantitativa de las
reacciones a 492 nm. Para la etapa de lectura, se transfirieron los
sobrenadantes a una placa reciente. El Mab
CB/ior-ACE.1 se usó como control positivo en el
ensayo. Las fracciones de periplasma correspondientes a las células
TG1 transformadas con el vector pJG-1m sin
inserción, y un Mab no relacionado, se usaron como controles
negativos. Una placa con células HEK 293 humanas (ATCC
CRL-1573), que no expresan ACE, también se usaron
como control negativo. Los criterios de positividad eran similares a
los usados en ELISA descritos en el procedimiento anterior. En este
experimento las muestras de periplasma de las construcciones de
scFv y diacuerpo solamente reconocieron células LoVo,
AsPC-1 y LS 174T. Todos los controles negativos eran
negativos. De esta forma, se demostró la capacidad del scFv y
diacuerpo para identificar el ACE humano sobre células tumorales
humanas que expresan este antígeno, fijadas sobre placas de
poliestireno, mediante célula-ELISA.
En otro experimento, se sembraron células LoVo,
AsPC-1 y LS 174T en placas de poliestireno de 35 mm
de diámetro (COSTAR) y se cultivaron hasta que se alcanzó
confluencia. Se lavaron las placas dos veces con PBS, se retiraron
por drenaje, se secaron al aire, y las se fijaron al plástico
mediante el uso de una mezcla 1:1 (v:v) de
acetona-metanol fríos. Después de varios lavados con
agua destilada para eliminar restos, las placas se usaron como fase
sólida en ensayos de inmunofluorescencia indirecta. Para esto se
definieron zonas circulares de en la superficie con células
fijadas, en las que las muestras de periplasma bacteriano
correspondientes a las dos construcciones en diluciones de 1:2,
1:4 y 1:8 con PBS-3% de BSA, se incubaron
independientemente. Se emplearon los mismos controles positivos y
negativos en el célula-ELISA.
La incubación fue a temperatura ambiente (TA)
durante 1 hora en cámara húmeda, seguido de varios lavados con
PBS-3% BSA frío, y la adición de Mab 9E10 (10
\mug/ml) a la monofase durante una hora a TA, también en cámara
húmeda. Después de varios lavados con PBS-3% BSA
frío, se incubó la monofase con anticuerpos anti ratón IgG
conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC, Sigma) diluido
1:64 en PBS-3% BSA, durante 30 minutos, en la
oscuridad y cámara húmeda, después se lavaron cinco veces con PBS-
3% BSA, una vez más con PBS, y finalmente se tiñeron con solución
Evans Blue durante unos pocos minutos.
La monofase se cubrió con
PBS-10% glicerol, se selló con un cubre objetos y se
examinó con un accesorio de luz fluorescente Olympus
BH2-RFL, se montó sobre un microscopio Olympus BHT.
También se usaron células humanas HEK 293 como control negativo. La
presencia de membrana y fluorescencia de verde manzana de citoplasma
se estableció como criterio de resultado positivo, mientras que
esto no existiera en las muestras de control negativo, o en las
células humanas negativas para ACE. En este experimento, las
muestras de periplasma de las construcciones de scFv y diacuerpo
solamente reconocieron las células LoVo, AsPC-1 y LS
174T. Los controles negativos eran negativos. De esta manera, se
demostró la capacidad del scFv y diacuerpo para identificar el ACE
humano sobre células tumorales que expresan este antígeno, fijadas
sobre placas de poliestireno, mediante inmunofluorescencia
indirecta. Un ejemplo de los resultados se muestra en la Figura
3.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento
(a)
Los genes que codifican el scFv y diacuerpo se
amplificaron mediante PCR usando como moldes las construcciones
pJG1-25 y pJG1-18, respectivamente,
y oligonucleótidos diseñados para añadir el sitio Ncol en los
extremos 5' y 3' de los genes (Oligos 13 y 14; Tabla V), con el
propósito de clonación en el vector de expresión pPS7 de Pichia
pastoris. El procedimiento de amplificación era similar al
descrito anteriormente. El plásmido pPS7 es un vector integrador
que contiene un fragmento de 1,15Kb que corresponde al promotor de
la enzima alcohol oxidasa (AOX.1) seguido del gen que codifica la
señal de secreción de la sacarosa invertasa (sucll) de
Saccharamyces cerevisae, un único sitio de clonación Ncol, un
fragmento de 960 pares de bases de la enzima gliceraldehído
3-fosfato deshidrogenasa (Gapt) para garantizar la
finalización de la transcripción, y el gen HIS3 de
Saccharamyces cerevisae como marcador de selección.
Además este vector contiene un fragmento de 2,1 kb, que corresponde
a la secuencia 3' del gen AOX.1 gene. Todos estos elementos se
insertan en un vector pUC18 (Herrera Martínez LS et al.,
documento EP0438200 A1).
Después de la digestión con NcoI (Promega) de
las bandas amplificadas correspondientes al scFv y diacuerpo, éstos
se ligaron independientemente al vector pPS7 digerido previamente
con la misma enzima, y los productos de la ligadura se usaron para
transformar de una forma la cepa XL-1 Blue de E.
coli.
Las colonias aisladas correspondientes a la
transformación de la cepa con cada vector recombinante se analizaron
usando la PCR colonias con un cebador que se en el promotor (Oligo
15, Tabla V) y otro para el extremo de VL (Oligo 8, Tabla III). Se
seleccionaron las colonias que contienen la inserción correcta
orientada. La secuencia de los genes clonados se realizaron de
acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente (Ejemplo 1
Procedimiento b), usando Oligo 15 (Tabla V). Las secuencias
obtenidas para los dominios VH y VL de los plásmidos recombinantes
pPSM2 (scFv) y pPSM3 (diacuerpo) de acuerdo con lo citado
anteriormente en SEQ ID No. 16 y SEQ No. 17.
Las cepas recombinantes de Pichia
pastoris se obtuvieron con estos dos plásmidos mediante la
electroporación de la cepa silvestre MP36 his 3 (Yong V ET to.
Biotechnol. Applic. 9: 55-61, 1992) con ambos
plásmidos mencionados, digeridos previamente con la enzima de
restricción Pvull (Promega), y selección de medio mínimo deficiente
en histidina. Como resultado de los diferentes mecanismos de
recombinación de los plásmidos recombinantes con sitios específicos
en el genoma de Pichia pastoris, era posible aislar para cada
construcción dos tipos diferentes de fenotipos de cepas secretoras:
(a) cepas en las que el gen AOX.1 no estaba afectado durante el
episodio de recombinación y por lo tanto se desarrollaron en medio
con metanol y se mostró que desarrollaron de manera similar a a la
cepa silvestre (Mut^{+}), y (b) cepas en las que el gen AOX.1 se
reemplazó por el módulo de expresión y mostró un lento desarrollo
en la presencia de metanol (Mut s).
Procedimiento
(b)
Los estudios de expresión de fragmento de
anticuerpo se realizaron a partir de las colonias fototrópicas
His^{+} desarrolladas en placas con medio MD (base de levadura de
nitrógeno, biotina, dextrosa). Las colonias seleccionadas se
inocularon en 10 ml de medio rico tamponado BMGY (extracto de
levadura, peptona, fosfato de potasio, base de levadura de
nitrógeno, biotina, y glicerol) en tubos de 50 ml, y se colocaron a
28ºC con rotación a 150 rpm. Cuando los cultivos alcanzaron 2
unidades de DO 600 nm, medida en un equipo SPECTRONIC GENESIS 2,
éstos se centrifugaron a 2000 rpm, durante 10 minutos. Los
sedimentos celulares se suspendieron en 10 ml de medio rico con
metanol (BMMY) como única fuente de carbono, en lugar de glicerol. A
partir de este momento y durante 96 horas se indujeron las
proteínas de interés, con la adición diaria de metanol hasta una
concentración final de 1% en el cultivo. Como control negativo se
usó la cepa MP36his3 transformada con el vector sin inserción.
Finalizado el período de cultivo, se
centrifugaron las células, el medio de cultivo metabolizado durante
la fase de inducción se recogió, se centrifugó una vez más de nuevo
para su clarificación y detección final de scFv o diacuerpo
realizado mediante electroforesis en 15% de geles de
SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). Este
ensayó reveló que la expresión de de las proteínas del peso
molecular esperado en ambos casos (aprox. 27 kDa), que se evaluaron
posteriormente mediante transferencia de Western usando Mab 9E10
como anticuerpo primario, y anticuerpos conejo
anti-ratón IgG conjugados con peroxidasa de rábano
picante (Sigma) como anticuerpo secundario. Se realizaron las
transferencias como se ha descrito anteriormente. En el desarrollo,
se usó DAB (Sigma) como sustrato insoluble. Para las dos
construcciones, las proteínas recombinantes se identificaron con el
Mab 9E10.
Procedimiento
(c)
Se realizó un ensayo de ELISA, muy similar al
descrito previamente para el material derivado de E. coli,
usando fases sólidas, reactivos y recubrimiento, desarrollo, y
condiciones de control similares. Las muestras de cultivo
metabolizadas de las cepas recombinantes inducidas se diluyeron en
PBS-1% de leche y se añadieron a una velocidad de
100 \mul/pocillo, y se incubaron durante 2 horas a temperatura
ambiente. Como controles negativos, se usaron medio metabolizado
correspondiente a la cepa MP36his 3, y un Mab no relacionado. Los
valores se consideraron positivos cuando la absorbancia era al menos
4 veces mayor que la producida por los controles negativos. En este
experimento las muestras de medio metabolizado en fase de inducción
de las construcciones de scFv y diacuerpo expresados en Pichia
pastoris eran positivos con relación a su capacidad de
reconocimiento de ACE humano adsorbidos en placas de
polivinilo.
Procedimiento
(d)
Se realizó un ensayo de ELISA, muy similar al
descrito previamente para el material derivado de E. coli,
usando fases sólidas, reactivos y recubrimiento, incubación,
desarrollo, y condiciones de control similares. Las muestras de
cultivo metabolizadas de las cepas recombinantes inducidas se
diluyeron en PBS-2% de leche y se añadieron a las
placas con células LoVo, AsPC-1, y LS 174T, y se
incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación
suave. En el ensayo, se usó Mab CB/ior-ACE.1 como
control positivo. Los cultivos de fase de inducción metabolizados
de la cepa MP36his transformados con el vector pPS7 sin inserción, y
el Mab no relacionado, se usaron como controles negativos. También,
como control negativa, se usó una placa con células HEK 293
humanas.
En este experimento se demostró la capacidad del
scFv y diacuerpo para la identificación específica de ACE humano
sobre células tumorales humanas fijadas sobre soportes de
poliestireno, mediante ELISA.
Se usó un ensayo de inmunofluorescencia
indirecta, muy similar al descrito anteriormente para el material
derivado de E. coli, empleando células de cultivo, y
condiciones de fijación, reactivos, incubación, desarrollo, montaje,
observación de microscopio y posible criterio similares. Las zonas
independientes se definieron a las placas con células LoVo,
AsPC-1 y LS 174T fijadas, en las que se aplicaron
las muestras de cultivos inducidos de los almacenamientos
recombinantes correspondientes a las dos construcciones, y las
negativas, diluidas en PBS-3% de BSA, 0,02% de
azida de sodio. La incubación se realizó a temperatura ambiente
(TA) durante 1 hora en cámara húmeda, seguido de varios lavados con
PBS-BSA-azida de sodio frío, y la
adición de Mab 9E10 a toda la monofase durante 1 hora a TA, también
en cámara húmeda. Después de varios lavados con
PBS-3% de BSA fríos, la monofase se incubó con
anticuerpos anti ratón IgG conjugados con isotiocianato de
fluoresceína (Sigma) diluido 1:64 en PBS-3% de BSA
durante 30 minutos en la oscuridad y cámara húmeda. Las placas se
lavaron cinco veces con PBS 3% de BSA, una vez más con PBS, y
finalmente se tiñó con solución Azul Evans durante unos pocos
minutos. La monofase cubierta con PBS-10% de
glicerol se montó con cubre objetos y se examinó en microscopio de
luz ultravioleta.
En el ensayo, se usó Mab
CB/ior-ACE.1 como control positivo. Como controles
negativos se usaron el medio de cultivo inducido de MP36his3
transformado con pPS7 sin inserción, y el Mab no relacionado.
También se usó un portaobjetos con células HEK 293 como control
negativo. En este experimento las muestras de los cultivos
inducidos que secretaron el scFv recombinante y diacuerpo
reconocieron solamente las células LoVo, AsPC-1 y
LS 174T. Los controles negativos eran negativos. Se demostró la
capacidad del scFv y diacuerpo producida en Pichia pastoris
para identificar ACE humano sobre células tumorales humanas que
expresan este antígeno fijado sobre placas de poliestireno,
mediante inmunofluorescencia indirecta.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento
(a)
Se usó la presencia del dominio de seis
histidinas en la proteína recombinante, donada por el vector
pJG-1m para purificación. Estas secuencias
confieren a las proteínas una afinidad muy alta para iones metálicos
(por ejemplo Zn^{+2}, Cu^{+2}, Ni^{+2}) que se pueden quelar
en diferentes soportes cromatográficos, permitiendo una purificación
fácil y reproducible.
Las bacterias recombinantes obtenidas como se ha
descrito antes se centrifugaron y los contenidos de periplasma se
aislaron mediante choque osmótico y sonicación breve (segundos), y
después se dializó durante 72 horas en tampón de acoplamiento
(Tris-HCl 20 mM, 1 M NaCl, 20 mM Imidazol, pH 7,0).
Las preparaciones de periplasma bacteriano que contenían el scFv y
el diacuerpo se aplicaron directamente e independientemente a una
matriz Sepharose-IDA-Cu^{+2}
(Pharmacia). Una vez que se acoplaron las proteínas se lavaron
primero los geles con 10 veces su volumen usando tampón de
acoplamiento, seguido de una manera similar con tampón de lavado
(Tris-HCl 20 mM, 1 M NaCl, 150 mM Imidazol, pH 7,0)
para eliminar las proteínas contaminantes de E. coli. La
elución del scFv y el diacuerpo se realizó con
Tris-HCl 20 mM, 1 M NaCl, 250 mM Imidazol, pH 7,0.
Las muestras de los máximos de elusiones sometieron a un 12%
SDS-PAGE para verificar la presencia de las
proteínas de interés. Las fracciones eluidas que contenían el scFv
y el diacuerpo se concentraron en dispositivos UltraFree 15
(Amicon), se dializaron en una solución tampón que contenía
Tris-HCl 20 mM, pH 8,7, y se sometieron a una
segunda etapa de purificación usando intercambio iónico.
Para esto, las muestras se aplicaron a una
columna Mono Q (Pharmacia), y se fluyeron mediante un gradiente
lineal de NaCl (0 a 1 M). Las muestras de los máximos recogidos se
comprobaron en 12% SDS-PAGE. Se verificó la
presencia del scFv y diacuerpo en los tamaños esperados
(aproximadamente 27 kDa). La pureza lograda final para las dos
moléculas era muy similar y cercana a 95%, se estimó a través de
SDS-PAGE y tinción de plata. Los máximos de scFv y
diacuerpo puros se concentraron en dispositivos UltraFree 15
(Amicon) hasta 2 mg/ml. Se verificó la actividad biológica de las
preparaciones usando ELISA, siguiendo un procedimiento similar al
descrito anteriormente en esta invención. Todas las muestras se
conservaron a 4ºC.
Procedimiento
(b)
El scFv y diacuerpo purificados como se ha
descrito mediante el procedimiento anterior se estudiaron usando
cromatografía de tamices moleculares para determinar la homogeneidad
de las muestras y la presencia de multímeros. Para esto se usó
Superdex 200 (Pharmacia), y un procedimiento convencional de
filtración en gel en un equipo de HPLC. Se determinó que el scFv
concentrado en un máximo principal de aproximadamente 27 kDa,
correspondiente a una forma monomérica. El diacuerpo apareció
principalmente con un tamaño de aproximadamente 45 kDa,
correspondiente a una forma dimérica.
\vskip1.000000\baselineskip
El diacuerpo purificado se dializó durante toda
una noche a 4ºC contra una solución tampón que contenía 1%
NH_{4}HCO_{3} a pH = 8,3, que contenía urea a una concentración
de 2 mol/l. La proteína dializada se digirió con tripsina de
calidad secuencia (Promega) a una realización enzima:sustrato de
1:50 durante 4 horas a 37ºC. La digestión proteolítica se detuvo
mediante la acidificación con un volumen igual de una solución
acuosa de 1% de ácido trifluoroacético, y se almacenó a -20ºC hasta
el momento de análisis mediante cromatografía líquida acoplada al
espectrómetro de masas (LC-MS).
Se separaron las digestiones mediante
cromatografía de fase inversa en un cromatógrafo líquido AKTA
Basic (Amersham Pharmacia Biotech) usando a un gradiente lineal
entre 0% y 80% de solución B en 100 minutos. Las soluciones usadas
para generar el gradiente eran: A: H_{2}O/TFA 0,05% y B:
Acetonitrilo/TFA 0,05%.
Las fracciones obtenidas durante la digestión
proteolítica se analizaron mediante espectrometría de masas usando
ionización de electropulverización (ESI-MS),
mediante la conexión en línea con el sistema cromatográfico
espectrómetro de masas híbrido LC-MS con geometría
ortogonal QTOF-2 (Micromass Ltd.). Durante la
medición de LC-MS, se adquirieron los espectros de
masas entre 350 y 1800 en 0,98 segundos y usando 0,02 segundos entre
cada barrido. Se calibró el espectrómetro de masas con una solución
salina compuesta de una mezcla de yoduro de sodio y de cesio. Las
tensiones usadas en el cono y el capilar eran de 50 y 3000
voltios, respectivamente. Se procesaron los espectros usando el
paquete de programas MassLinx v 3,5 (Micromass Ltd).
En la Figura 4 y su Tabla adjunta se pueden
observar el perfil cromatográfico de la digestión tríptica del
diacuerpo, y el sumario de la asignación de los péptidos trípticos
del diacuerpo. En los espectros ESI-MS no se
detectaron señales que indican cisternas unidas de manera
incorrecta, evidente de los sumarios de las fracciones 8 y 12 de la
Tabla adjunta a la Figura 4, que contiene los péptidos
(20Phe-Arg31)-S-S-(87Ser-Arg97)
y
(143Val-Lys148)-S-S-(186Ile-Lys228)
unidos mediante enlaces disulfuro (-S-S-) entre las
cisteínas 22 y 95, y 147 y 212, respectivamente.
A partir de los péptidos analizados mediante
ESI-MS, 92% de la secuencia de diacuerpo se podría
obtener en una sola digestión proteolítica (Figura 5). En esta
secuencia existe una total coincidencia con las secuencias de
aminoácidos deducidas de la secuencia de base de los dominios VH y
VL (SEQ ID No. 16 y 17), se amplificaron mediante PCR partiendo del
ARN total del hibridoma que produce el Mab
CB/ior-ACE.1, del segmento de engarce de
5-aminoácidos (SEQ ID No. 10), y en la parte C
terminal, de la secuencia del péptido c-myc y 6
histidinas finales, proporcionadas por el vector
pJG-1m (Figura 2).
ACE humano (Calbochem) se desglicosiló
enzimáticamente con la endoglicosidasa PNGasa F (New England
Biolabs) específica para N-glicosilación. El ACE se
disolvió en tampón fosfato 20 mM pH 7,8 y se desnaturalizó con SDS
y 2-mercaptoetanol a 100ºC durante 5 min.
NP-40 y 1 PL de PNGasa F se añadieron después
durante 2 horas a 37ºC. Las muestras de control y deglicosiladas se
analizaron en SDS-PAGE con tinción de azul de
Coomasie dando como resultado una reducción significativa de tamaño
molecular (aproximadamente 50%) después de la digestión con la
endoglicosidasa. Se llevó a cabo una transferencia de Western usando
(a) Mab CB/ior-ACE.1, (b) elt scFv divalente
purificado (diacuerpo) o (c) un antisuero humano
anti-ACE obtenido en ratón, como anticuerpos
primarios, seguido de anticuerpos policlonales contra el Fab de Mab
CB/ior-ACE.1 conjugados a la peroxidasa de rábano
picante para (a) y (b), y anticuerpos anti-ratón IgG
conjugados a la peroxidasa de rábano picante para (c). La
transferencia y desarrollo eran similares como se ha descrito
anteriormente en esta invención para las transferencias de
Western. El Mab CB/ior-ACE.1 y el diacuerpo
solamente reconocieron el antígeno no desglicosilado. El antisuero
policlonal reconoció ACE antes y después de la desglicosilación.
Se analizaron muestras de ACE humano nativo
mediante un sistema de transferencia de puntos para el
reconocimiento de lectinas específicas. Las lectinas empleadas eran
la aglutinina de Sambucus nigra (SNA) y la aglutinina de
Maackia amurensis (MAA), específicas para el ácido siálico
terminal, ligado alfa 2,6 y alfa 2,3, respectivamente. Las lectinas
empleadas en estos experimentos se habían conjugado con
Digoxigenina, que se identifica mediante anticuerpo
anti-Digoxigenina marcada con fosfatasa alcalina.
Las muestras positivas para la interacción de
lectina-oligosacárido se desarrollaron mediante
reacción con un sustrato específico para fosfatasa (una mezcla de
cloruro de 4-nitro azul tetrazolio y
5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato).
Se usó Fetuina en este experimento como control positivo de ambas
lectinas. El ACE nativo se reconoció mediante SNA y no mediante MAA,
un hecho que indica una alta prevalencia de ácidos siálicos
terminales unidos a alfa 2,6.
El ACE humano se digirió después con la enzima
NANAsa II, y exoglicosidasa (sialidase) capaz de hidrolizar los
ácidos siálicos terminales alfa 2,6. Los productos de digestión se
separaron en SDS-PAGE, y se realizó el estudio de
su reconocimiento mediante transferencia de Western, usando como
anticuerpos primarios el Mab CB/ior-ACE.1 y un
antisuero de ACE anti-humano obtenido en ratón. Los
resultados indicaron que el control de ACE era reconocido por
ambas muestras, mientras solamente el antisuero
anti-ACE de ratón reconocía el ACE digerido con
NANAsa II.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó el estudio de tejidos en las muestras
seleccionadas entre archivos normales y tumorales, que provienen de
material de autopsia. Se usó un panel mínimo de tejidos para
verificar el reconocimiento ya descrito para Mab
CB/ior-ACE.1 (Tormo B et al. APMIS 97:
1073-1080, 1989). Los especímenes incluían:
carcinomas del pulmón, piel, mama, cerviz, esófago, y riñón,
adenocarcinomas de colon, próstata, páncreas, vesícula biliar,
intestino delgado estómago, tumores de origen neural, hematopoyético
y sarcomatoso, así como mucosa de colon normal, y tejidos normales
como hígado, riñón, pulmón, testículo, bazo y páncreas, incluyendo
también células sanguíneas.
Se realizó el estudio siguiendo los
procedimientos reseñados anteriormente (Tormo B et al. APMIS
97: 1073-1080, 1989), con algunas variaciones. Los
especímenes de tejido se fijaron en 10% de formalina tamponada, se
deshidrataron, se limpiaron y se embebieron en parafina de acuerdo
con los procedimientos de rutina. Se evaluó la histopatología en
secciones coloreadas con hematoxilina-eosina. Las
secciones consecutivas de los bloques evaluador mediante
histopatología se usaron para la técnica de inmunoperoxidasa.
Las secciones sin parafina, rehidratadas se
trataron con 3% de H_{2}O_{2} durante 30 minutos para bloquear
la peroxidasa endógena, se lavaron en solución salina tamponada con
fosfato (PBS), y se incubaron con las muestras, éstas se diluyeron
en PBS-1% de albúmina sérica bovina (tampón de
dilución), durante una hora. Después, los cubreobjetos se incubaron
durante 30 minutos con una dilución 1:100 de anticuerpos
policlonales IgG de conejo, obtenidos mediante inmunización con el
Fab de Mab CB/ior-ACE.1, y finalmente durante un
tiempo similar con una dilución 1:500 de un complejo
peroxidasa-estreptavidina (Amersham).
Las muestras examinadas eran:
- (a)
- Mab CB/ior-_ACE.1 (control positivo) a una concentración de 20 \mug/ml
- (b)
- scFv purificado de E. coli, como se ha descrito en el Ejemplo 4, procedimiento (a), a una concentración de 50 \mug/ml
- (c)
- diacuerpo purificado de E. coli, como se describe en el Ejemplo 4, procedimiento (a), a una concentración de 50 \mug/ml
- (d)
- El scFv obtenido anteriormente, denominado "F3" en estos Ejemplos (Ayala et al. Biotechniques 13: 790-799, 1992; Pérez L et al. Applied Biochem. Biotechnol. 24: 79-82, 1996), purificado y a concentraciones de 50 y 100 \mug/ml Todas las diluciones de realizaron en tampón de dilución, y las incubaciones a temperatura ambiente, en cámara húmeda. Entre las etapas, se realizaron 3 lavados de 1 minuto cada una con tampón de dilución o PBS. La reacción de inmunoperoxidasa se desarrolló mediante una incubación 5-10 minutos con una solución que contenía 3 mg de diaminobencidina, 5 ml de LPBS y 5 ml de 30% de H_{2}O_{2}. Los cubre objetos se tiñeron en contraste de fase con hematoxilina de Meyer. La reacción de color marrón característica se registró como: negativo o positivo, en tres niveles de intensidad crecientes (1+, 2+, 3+). En cada cubreobjetos se realizó el marcado con la muestra en cuestión, y una zona cercana con el tampón de dilución como control negativo. Para el estudio de células sanguíneas, se retiraron primero los eritrocitos, y los glóbulos blancos remanentes se aplicaron sobre portaobjetos de vidrio cubiertos con gelatina, y se fijaron con acetona:metanol 1:1 (v:v). El resto de la técnica se desarrolló básicamente como se ha descrito anteriormente.
Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla
VI, con respecto al tejido estudiado. Los tejidos normales
estudiados (hígado, riñón, pulmón, testículos, sangre, bazo,
páncreas) no se identificaron mediante los fragmentos o mediante el
Mab. En el caso de la mucosa de colon, y en coincidencia con la que
se ha obtenido antes para Mab CB/ior-ACE.1, el F3
scFv, y los nuevos scFv y diacuerpo, reaccionaron exclusivamente con
los productos de secreción luminal y las zonas apicales de algunas
glándulas. La intensidad de la reacción en el caso de F3 scFv era
menor, algo que se observó más tarde para varios tumores. En el caso
de células sanguíneas, el Mab, el scFv y diacuerpo no mostraron
reacción con linfocitos normales y neutrófilos, indicando la
ausencia de una reactividad cruzada importante con el antígeno
NCA. Por el contrario, el F3 scFv mostró algún reconocimiento
secundario de estas células.
El Mab, el scFv, y el diacuerpo reaccionaron con
la mayoría de los tumores de origen gastrointestinal, y se observó
el fuerte marcado en la mayoría de los casos tanto en la superficie
apical de las células tumorales, como en el citoplasma. Ninguna de
estas muestras de tumores marcados de origen hematopoyético y
sarcomatosa, u otras derivadas de epitelio, excepción hecha de
carcinoma de mama canalicular, y un carcinoma de de células grandes
de pulmón. En los adenocarcinomas de colon bien diferenciados el
marcado era intenso en la zona apical del citoplasma, y en los
productos de secreción luminal, mientras en los adenocarcinomas
moderadamente y escasamente diferenciados se observó el marcado en
todo el citoplasma. Excepción hecha de muy pocas muestras, las
intensidades de tinción eran muy similares para estas tres
moléculas.
En el caso de F3, se observó una reducción
general de la intensidad de tinción, incluso aunque en algunas
ocasiones, se emplearon concentraciones dos veces mayores que las
usadas para scFv y diacuerpo. La menor intensidad de tinción podría
provocar que algunas muestras identificadas por los otros
anticuerpos no fueran reconocidas por F3.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Nota. Los números en la Tabla representan los
casos con tinción positiva/número total de casos estudiados. Si no
se presentan paréntesis, la intensidad de tinción en los positivos
estaba entre 2+ y 3+; Ca: carcinoma; ADC: adenocarcinoma; HDG:
Hodgkin; BD: bien diferenciado; MD: diferenciación media; PD:
escasamente diferenciado; (*) la marca aparece circunscrita a los
productos de la secreción luminar y zonas apicales de algunas
glándulas; (a): los casos positivos tenían tinción que se podría
clasificar como 1+, (b) reconocimiento de linfocitos y eosinófilos
con intensidad que se podría clasificar como 1+; (c) 2 de los 6
casos positivos mostraron tinción con intensidad que se podría
clasificar como 1+.
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Para la determinación de la constante de
afinidad se usó un procedimiento ELISA no competitivo (Beatty JD
et al. J. Inmunol Meth. 100: 173-184, 1987)
basado en la ley de acción de masas. La constante de afinidad Kaff
es igual a [AgAb] /[Ag][Ab], donde AgAb es el complejo antígeno -
anticuerpo en l/mol (M^{-1}), [Ag] es la concentración del
antígeno libre (mol), y [Ab] es la concentración del anticuerpo
libre (mol).
Se usaron cuatro diluciones en serie doble de
ACE humano (Calbochem) en el revestimiento de placas ELISA de
polivinilo (Costar). Se bloquearon las placas usando
PBS-leche desnatada 1%. Las muestras (scFv F3, scFv,
diacuerpo, Mab CB/ior-ACE.1, todas purificadas) se
aplicaron a las placas a diversas concentraciones. Después de los
lavados, los pocillos correspondientes a las tres primeras muestras
se incubaron con el Mab 9E10 (10 \mug/ml), mientras en las
correspondientes a Mab CB/ior-ACE.1 se usó la
solución de bloqueo. En la siguiente etapa se añadió un
anticuerpo anti ratón IgG conjugado a peroxidasa (Sigma) en
dilución 1:2500 durante una hora, a 37ºC. El sustrato usado era
OPD, y la reacción se desarrolló durante 15 minutos. La lectura de
absorbancia se realizó a 492 nm en un equipo LabSystems Multiskan
MS.
Los valores de densidad óptica (DO) para cada
caso se representaron gráficamente en el eje de ordenadas (y), y la
concentración en ng/ml en el eje de abcisas (x), en una escala de
base logarítmica 10, la DO se recogió de manera en esas señales
se mantenía al máximo. Para cada curva, se calculó la mitad de los
valores DO 100 (DO 50). Se determinaron los valores de
concentración de cada muestra a DO 50 para cada curva, y los
cálculos de afinidad se llevaron a cabo con la siguiente fórmula:
Kaff = (n-1)/2(n), donde n =
[Ab']t/[Ab]t.[Ab'] es el valor de concentración de la
muestra que corresponde a un valor de DO 50 para la concentración
más alta de antígeno para comparar, y
[Ab]_t es el valor de concentración de la muestra que corresponde a un valor de OD 50 para la concentración más baja de antígeno para comparar. Las seis posibles de terminaciones de las 4 curvas obtenidas, estimando el Kaff final como la media de éstos.
[Ab]_t es el valor de concentración de la muestra que corresponde a un valor de OD 50 para la concentración más baja de antígeno para comparar. Las seis posibles de terminaciones de las 4 curvas obtenidas, estimando el Kaff final como la media de éstos.
\newpage
La Tabla VII refleja los valores de Kaff
calculados para las variantes ensayadas. El scFv tiene un Kaff
de
(5,0 \pm 0,4) x 10^{9} l mol^{-1}, una magnitud de más que un orden y la mitad mayor que la obtenida para F3 (Kaff= (9,2 \pm 0,8) x 10^{7} l mol^{-1}). Este ultimo valor básicamente con el calculado para F3 en las mediciones realizados mediante un procedimiento diferente (Pérez L et al. Applied Biochem. Biotechnol. 24: 79-82, 1996). El diacuerpo tiene un Kaff de (2,8 \pm 0,3) x 10^{10}l mol-1, mientras que el Mab CB/ior-ACE.1 tenía el valor Kaff (6,1 \pm 0,5) x 10^{10} l mol-1.
(5,0 \pm 0,4) x 10^{9} l mol^{-1}, una magnitud de más que un orden y la mitad mayor que la obtenida para F3 (Kaff= (9,2 \pm 0,8) x 10^{7} l mol^{-1}). Este ultimo valor básicamente con el calculado para F3 en las mediciones realizados mediante un procedimiento diferente (Pérez L et al. Applied Biochem. Biotechnol. 24: 79-82, 1996). El diacuerpo tiene un Kaff de (2,8 \pm 0,3) x 10^{10}l mol-1, mientras que el Mab CB/ior-ACE.1 tenía el valor Kaff (6,1 \pm 0,5) x 10^{10} l mol-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la de determinación del reconocimiento
in vivo específico de los fragmentos de anticuerpo, se
marcaron las siguientes moléculas con ^{125}I (Amersham, UK)
usando el procedimiento lodogen (Fraker PJ, Speck JC Jr. Biochem
Biophys Res Comm 80: 849-857, 1978):
- (a)
- scFv purificado a partir de E. coli; (actividad específica 1,1 MBq/5 \mug)
- (b)
- diacuerpo purificado a partir de E. coli; (actividad específica: 1.2 MBq/\mug)
- (c)
- Mab CB/ior-_CE4.1; (actividad específica: 1,8 MBq/5 \mug)
- (d)
- ScFv F3 purificado (Ayala et al. Biotechniques 13: 790-799, 1992; Pérez L et al. Applied Biochem. Biotechnol. 24: 79-82, 1996) (actividad específica: 1,0 MBq/5 \mug).
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos marcados radiactivamente se
analizaron en cromatografía de capa fina para determinar la
incorporación a proteína y se encontraron los valores entre 95 y
98% de la radiactividad. La capacidad de los productos marcados
radiactivamente para detectar ACE se ensayó en un sistema en el que
se recubrieron tubos de poliestireno con ACE (5 \mug/ml;
Calbochem), se bloquearon y las muestras de productos marcados
radiactivamente se ajustaron a las cantidades de anticuerpo que
podrían estar atrapados por esta fase sólida. Después de la
incubación un lavado, se determine que 80, 79, 83, y 81% de la
radiactividad se atrapó por la fase sólida, respectivamente, para
las muestras (a)-(d) descritas anteriormente, demostrando que el
procedimiento de marcado por radiactividad no afectó a la
sensibilidad de la actividad biológica de los anticuerpos.
Para estudiar la biodistribución, se formaron 4
grupos de animales, cada uno de 12 ratones C57BI/6 (CENPALAB,
Cuba). Los animales se inocularon con 1 x 10^{6}
B16-CEA13 células por animal, usando la vía
intraaxilar. Los tumores fueron visibles y palpables
(aproximadamente 0,3-0,5 g) después de 7 días,
después de lo cual a los ratones se les inyectó el producto marcado
radiactivamente en cuestión por la vena de la cola, y se
sacrificaron después de 12, 24 y 48 horas, con la retirada
quirúrgica del tumor y los siguientes tejidos normales: bazo,
hígado, riñón, intestino, músculo, médula ósea, y sangre. La
acumulación de radiactividad se expresó como porcentaje de la dosis
inyectada por gramo de tejido. Se realizó la calibración mediante
una muestra patrón de la dosis inyectada. Se determinó la
radiactividad usando un contador de centelleo gamma.
Las células B16-CEA13 usadas en
estos experimentos se obtuvieron mediante la transfección de un gen
que codifica los dominios extracelulares de ACE humano, clonados en
el vector pDisplay^{TM} (Nº de Cat. V660-20,
Invitrogen). El gen se obtuvo mediante PCR a partir del ARN
extraído de las células CRL-1682, con los
oligonucleótidos diseñados alteran la secuencia publicada de ACE
humano. El plásmido recombinante pDisplay-CEA se
purificó y se transfectó en células de melanoma
B16-F10 de ratón C57BI/6 (ATCC
CRL-6475) usando Lipofectamine PLUS^{TM}
(Gibco-_BRL) y 5 \mug de ADN por transfección. Se
realizó la selección de trasfectantes estables con 4,0 mg/ml de
sulfato de geneticina (G418; Gibco-BRL) durante 14
días, después de lo cual las células cultivadas seleccionadas se
clonaron mediante dilución limitante y los clones que expresaban
ACE humano INEN su superficie se identificaron mediante
inmunofluorescencia indirecta, usando Mab
CB/ior-ACE.1 como primer anticuerpo, y anticuerpos
anti ratón IgG conjugados con FITC (Sigma) para desarrollo. Se
encontró que el 73% de los clones presentaban más de un 80% de las
células con fluorescencia de membrana específica indicando que el
ACE humano estaba expuesto correctamente plegado y glicosilado en
su superficie.
Las células B16-F10 no
transfectadas se emplearon como controles. Se multiplicaron as
réplicas de los clones seleccionados como positivas mediante
inmunofluorescencia indirecta y se inyectaron independientemente en
ratones C57BI/6, 1 x 10^{6} células por animal, usando la vía
intraaxilar. De los 10 clones que dieron lugar a tumores, uno más
rápido y con características de crecimiento progresiva, denominado
B16-CEA13, se seleccionó para los experimentos
reseñados en el presente documento.
La Figura 6 muestra el porcentaje de
radiactividad recuperada por tejido estudiado, a tiempos diferentes
(con respecto al total inyectado), t la relación de radiactividad
en el tumor: radiactividad en sangre. Los resultados incluidos en
la Tabla VIII demuestran que entre 24 y 48 horas, la relación de
radiactividad en el tumor: radiactividad en sangre se mantiene alta
para el diacuerpo, el scFv, y el Mab, con los valores más altos para
el último, seguido de la molécula dimérica. El F3 scFv obtenido
anteriormente mostró valores muy bajos, con un comportamiento
inadecuado in vivo que se puede correlacionar con su afinidad
reducida por ACE.
\vskip1.000000\baselineskip
<110> Centro para la Ingeniería Genética y
Biotecnología
\vskip0.400000\baselineskip
<120> FRAGMENTOS DE ANTICUERPO ESPECÍFICOS
PARA ANTÍGENO CARCINOEMBRIONARIO HUMANO (ACE)
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Ejemplo listado de secuencias
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 01
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-04-03
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
artificial: oligo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
artificial: oligo
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<400> 2
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\hskip1cm
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<210> 3
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<211> 40
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: oligo
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<400> 3
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<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: oligo
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<400> 4
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\hskip1cm
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: engarce I
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<400> 5
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\hskip1cm
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<210> 6
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: engarce II
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<400> 6
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\hskip1cm
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<210> 7
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<211> 39
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: oligo
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 63
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: oligo
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<400> 8
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<211> 62
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: oligo
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 37
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: oligo
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: oligo
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<400> 11
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\hskip1cm
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<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: oligo
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<210> 13
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<211> 108
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: vector
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<400> 13
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: oligo
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<400> 14
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: oligo
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<400> 15
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<210>
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<211> 241
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: scFv
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<400> 16
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<210> 17
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<211> 232
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: diacuerpo
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<400> 17
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<210> 18
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<211> 35
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<212> ADN
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: oligo
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<400> 18
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: oligo
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<400> 19
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: diacuerpo MS
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<400> 20
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<211> 255
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
artificial: diacuerpo MS
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<400> 21
Claims (13)
1. Un fragmento de anticuerpo de scFV específico
para el antígeno carcinoembrionario humano (ACE), que tiene un
sitio de unión a antígeno que comprende la región variable de la
cadena ligera (VL) y la región variable de la cadena pesada (VH)
del anticuerpo como se define en SEX ID NO 16 o SEX ID NO 17 y en el
que dicha región variable de la cadena ligera (VL) y dicha región
variable de la cadena pesada (VH) están unidas mediante un engarce
peptídico.
2. Fragmento de anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho fragmento de anticuerpo scFv es
un scFv monovalente y en el que dicho engarce de péptido tiene la
secuencia de aminoácidos EGKSSGSGSESKVD.
3. Fragmento de anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho fragmento de anticuerpo scFV es
un scFV divalente y en el que dicho engarce de péptido tiene la
secuencia de aminoácidos GGGGS.
4. Fragmento de anticuerpo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el
reconocimiento de ACE humano es dependiente de la conservación de la
glicosilación de ACE.
5. Fragmento de anticuerpo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado
porque se producen en bacterias o levaduras recombinantes, en
células transfectadas de insecto o de mamífero, o en organismos no
humanos modificados genéticamente.
6. Fragmento de anticuerpo de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado
porque dicho fragmento adicionalmente contiene una marca
detectable, o un agente químico o biológico con potencial
antitumoral.
7. Composición farmacéutica que comprende un
fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, para el tratamiento de tumores
humanos que expresan ACE.
8. Composición farmacéutica que comprende un
fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, para la radiolocalización
in vivo de tumores humanos que expresan ACE, usando técnicas
de formación de imágenes.
9. Reactivo para la diagnosis in vitro o
ex vivo que contiene un fragmento de anticuerpo de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, para
la detección de ACE humano, unido o no a células.
10. Células aisladas que expresan un fragmento
de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1-6, obtenidas mediante manipulación genética por
medio de ADN recombinante, en las que dichas células son
bacterias, levaduras, células de insectos, células de mamíferos, o
células de plantas.
11. Organismo multicelular que expresa un
fragmento de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, obtenido mediante
manipulación genética por medio de ADN recombinante, en el que
dicho organismo es un animal no transgénico humano o planta
transgénica.
12. Vectores que codifican un fragmento de
anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1-6, obtenido mediante manipulación genética por
medio de ADN recombinante, en los que dichos vectores son plásmidos
o secuencias capaces de integrarse en células huésped.
13. Un procedimiento ex vivo para
determinar la presencia de una célula que expresa ACE,
comprendiendo dicho procedimiento proporcionar una muestra de
células y poner en contacto dichas células con un fragmento de
anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1-6 y determinar la unión del fragmento de
anticuerpo a las células.
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