BRPI0611829A2 - moléculas de anticorpo fv de cadeia única biespecìfico e métodos de uso destas - Google Patents

Abstract

MOLéCULAS DE ANTICORPO FV DE CADEIA úNICA BIESPECìFICO E MéTODOS DE USO DESTAS. São reveladas moléculas de anticorpo Fv de cadeia única biespecífico que podem ser usadas para tratar vantajosamente várias formas de câncer associadas à superexpressão de membros da família da proteína do EGFR.

Description

MOLÉCULAS DE ANTICORPO FV DE CADEIA ÚNICA BIESPECÍFICO EMÉTODOS DE USO DESTAS

Referência Cruzada Com Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica prioridade e benefício de USSN11/154.103, depositado em 15 de junho de 2005, que é aquiincorporado por referência em sua totalidade para todas asfinalidades.

Declaração Sobre Os Direitos Ãs Invenções Feitas SobPesquisas E Desenvolvimentos Financiados Pelo GovernoFederal

Este trabalho foi parcialmente apoiado por umaSubvenção do "United States Army Medicai Research andMaterial Command Breast Câncer Research Program", SubvençãoN°: DAMD 17-01-1-0520 e do uThe United States NationalCâncer Institute", Subvenção "Institutional Pilot" N°: NCICA06927. O Governo dos Estados Unidos da América pode tercertos direitos sobre esta invenção.

Campo da Invenção

A presente invenção está relacionada aos campos daimunologia e oncologia e, mais especificamente, àsmoléculas de anticorpo biespecífico (por exemplo, bs scFv)que podem ser usadas vantajosamente na detecção e/outratamento de vários cânceres que superexpressam a famíliade proteínas do Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico(EGFR). Certas moléculas ilustrativas de anticorpo scFvbiespecífico da invenção possuem especificidades de ligaçãopara um dos dois epitopos distintos de um único membro dafamília de EGFR ou, alternativamente, especificidade paradois membros distintos da família de EGFR.

Fundamentos da InvençãoA via de sinalização do Receptor do Fator deCrescimento Epidérmico (EGFR) tem uma participaçãoimportante no desenvolvimento e disseminação do câncer pelocorpo. EGFR, também conhecido como erb-bl, é um membro dafamília de quatro genes que também inclui HER2/neu (erb-b2) , HER3 (erb-b3) e HER4 (erb-b4). EGFR é expresso em umaampla gama de tumores sólidos, incluindo cânceres do cólon,cânceres da cabeça e pescoço, cânceres pancreáticos,cânceres ovarianos e cânceres de mama.

HER2/neu é uma proteína receptora da superfíciecelular com atividade de tirosina quinase. A proteínacompleta consiste em três partes: um domínio citoplasmáticointracelular, um segmento transmembrana hidrofóbico, e umdomínio extracelular (ECD) que é responsável pela ligaçãode ligante. Essa proteína receptora é expressa na membranacelular de diversos tipos de células epiteliais e, atravésda ligação de fatores de crescimento específicos, regulavários aspectos da divisão de crescimento celular.

Her2/neu, o gene que codifica a proteína HER2/neu, éum membro de um grupo de genes conhecidos como proto-oncogenes. Proto-oncogenes codificam proteínas importantes,tais como fatores de crescimento, receptores de fator decrescimento e proteínas apoptóticas, que estão envolvidasno crescimento e diferenciação celulares normais. Quando osproto-oncogenes são alterados por mutação pontual,translocação ou amplificação gênica, eles produzem sinaisde crescimento que podem levar à transformação celularaberrante e ao desenvolvimento de câncer.

Embora Her2/neu possa ser expresso em níveis baixos emmuitas células normais, ele é tipicamente superexpresso emdiversos cânceres. A superexpressão de Her2/neu é causada,na maioria dos casos, por um aumento do número de cópia dogene (amplificação gênica) e/ou por um aumento no nível deexpressão dos genes Her2/neu na célula. A superexpressãodesse receptor de fator de crescimento tem uma participaçãofundamental na progressão tumoral ao causar uma taxa maiorde crescimento celular e transformação oncogênica. Aamplificação gênica do gene Her2/neu foi observada emvários tipos de cânceres, incluindo câncer de mama,ovariano, endometrial, gástrico, pancreático, de próstata ede glândula salivar (Hynes e Stern (1994) Biochim. Biophys.Acta., 1.198: 165-184). Em pacientes com câncer de mama,HER2/rzeu também demonstrou ter importância clínica, uma vezque está associado a um prognóstico ruim, recidiva tumorale sobrevida encurtada em pacientes com câncer de mama(Seshadri e cols. (1993) J. Clin. Oncol., 11: 1.936-1.942;Berger e cols. (1988) Câncer Res., 48: 1.238-1.243;0'Reilly e cols. (1991) Br. J. Câncer, 63: 444-446).

Atualmente, grande atenção tem se concentrado nodesenvolvimento de estratégias inéditas de imunoterapiapara o tratamento de câncer. Uma dessas estratégias é aterapia anticâncer baseada em anticorpos. Um objetivoprincipal da terapia anticâncer baseada em anticorpos éliberar especificamente cargas de substâncias tóxicas, taiscomo radioisótopos, toxinas ou fármacos, aos tumores. Afaixa de tamanho das moléculas baseadas em sítio de ligaçãode anticorpo inclui: IgM (1.000 kDa) , IgG (150 kDa) ,F (ab=) 2 (100 kDa), Fab (50 kDa), (scFv=)2 (55 kDa) e scFv(25 kDa). Em camundongos imunodeficientes, moléculasmaiores, tais como IgG e fragmentos F(ab=)2, são retidas emníveis elevados em xenoenxertos tumorais humanos com umgrau baixo de especificidade (Adams e cols. (1992)Antibodyf Immunoconj. Radiopharm., 5: 81-95; Milenic ecols. (1991) J. Câncer Res. 51: 6.363-6.371), enquantomoléculas menores, tais como scFv, (scFv=)2 e Fab, sãoretidas em tumores em níveis comparativamente menores comespecificidade acentuadamente aumentada (Milenic e cols.(1991) J. Câncer Res. 51: 6.363-6.371; Adams e cols. (1993)Câncer Res. 53: 4.026-4.034; Beaumier e cols. (1985) J.Nucl. Med. 26: 1.172-1.179; Colcher e cols. (1990) J. Natl.Câncer Inst. 82: 1.191-1.197).

O determinante mais proeminente das propriedades dedirecionamento acima é o tamanho da molécula baseada emanticorpo em relação ao limiar renal para a depuração naprimeira passagem. Outra característica importante dasmoléculas baseadas em anticorpo é a valência, na medida emque uma retenção tumoral significativamente maior tem sidoassociada à ligação multivalente ao antígeno-alvo (Milenice cols. (1991) J. Câncer Res. 51: 6.363-6.371; Adams ecols. (1993) Câncer Res. 53: 4.026-4.034; Adams e cols.(1996) Proc. Amer. Assoc. Câncer Res. 37: 472; Wolf e cols.(1993) Câncer Res. 53: 2.560-2.565).

Herceptina7, uma nova forma de imunoterapia que temcomo alvo o câncer de mama, foi desenvolvida recentementepara ter como alvo células cancerosas que superexpressamHer2/neu. Demonstrou-se em experimentos clínicos que essetratamento fornece tratamento eficaz para pacientes comcâncer de mama metastático HER2/neu-positivo. No entanto,esse tratamento farmacológico é caro e está associado a umamorbidade e uma mortalidade significativas.Vários outros tipos de terapia demonstraram ser maisou menos eficazes em pacientes com câncer de mama cujostumores expressam níveis elevados de Her2/neu. Essesincluem terapia com antraciclina, a qual se acredita queseja mais eficaz em pacientes com expressão de Her2/neuamplificada, e terapia hormonal, que é menos eficaz empacientes cujo nível de expressão de Her2/neu é elevado.

Também se concentrou atenção na geração de moléculasde anticorpo Fv baseado em cadeia única bivalente com pesosmoleculares na faixa do limiar renal para depuração naprimeira passagem. Essas incluem diabodies de 50 kDa(Holliger e cols. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6.444-6.448), (scFv=)2 de 55 kDa (Adams e cols. (1993)Câncer Res. 53: 4.026-4.034), 60-65 kDa dímeros scFvbaseados em hélice anfipática (Pack e cols. (1993)Bio/Technology 11: 1.271-1.277; Pack (1992) Biochemistry31: 1.579-1.584) e minibodies LD (scFv-CH3)2 de 80 kDa eminibodies Flex (Hu e cols. (1996) Câncer Res. 56: 3.055-3.061). Embora cada uma dessas proteínas seja capaz deligação a duas moléculas de antígeno, elas diferem naorientação, flexibilidade e na amplitude de seus sítios deligação. Acredita-se que essas novas e inovadorasimunoterapias irão ajudar a melhorar os resultados finaisno câncer de mama e em outros cânceres que muitofreqüentemente apresentam recidivas ou progridem apesar deuma terapia agressiva de multimodalidades.

Sumário da Invenção

Esta invenção pertence à identificação de moléculas deanticorpo biespecífico (ou poliespecífico) (por exemplo, bsscFv) que podem ser usadas vantajosamente na detecção e/ouno tratamento de vários cânceres que superexpressam afamília de proteínas do Receptor do Fator de CrescimentoEpidérmico (EGFR). Dessa forma, em uma modalidade, estainvenção fornece um anticorpo biespecífico que compreendeum primeiro anticorpo e um segundo anticorpo unidos(diretamente ou através de ligante) uns aos outros em que oprimeiro anticorpo e o segundo anticorpo se ligamespecificamente a epitopos diferentes, e o primeiroanticorpo tem especificidade de ligação por (se ligaespecificamente) pelo menos um epitopo em um membro dafamília da proteína do Receptor do Fator de CrescimentoEpidérmico (por exemplo, EGFR, HER2/neu, HER3, HER4), e osegundo anticorpo tem especificidade de ligação por (seliga especificamente) um segundo epitopo em um membro dafamília da proteína do Receptor do Fator de CrescimentoEpidérmico que é diferente do primeiro epitopo, e é umepitopo em uma proteína selecionada do grupo que consisteem EGFR, HER2/neu, HER3 e HER4. Em certas modalidades, osanticorpos são unidos por um ligante, mais preferivelmentepor um ligante peptídico e, principalmente, por um ligantepeptídico desprovido de um sítio de clivagem proteolítica(por exemplo, um ligante que possui a seqüência deaminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 37). Em certas modalidades,o primeiro e/ou o segundo anticorpo se ligamespecificamente a um epitopo especificamente ligado por umanticorpo selecionado do grupo que consiste em C6.5, C6ML3-9, C6MH3-Bl, C6-B1D2, F5, HER3.A5, HER3.F4, HER3.H1,HER3.H3, HER3.E12, HER3.B12, EGFR.E12, EGFR.C10, EGFR.Bll,EGFR.E8, HER4.B4, HER4.G4, HER4.F4, HER4.A8, HER4.B6,HER4.D4, HER4.D7, HER4.D11, HER4.D12, HER4.E3, HER4.E7,HER4.F8 e HER4.C7. Em certas modalidades, o primeiro e/ou osegundo anticorpo compreendem uma, duas ou todas as regiõesdeterminantes de complementaridade de um anticorposelecionado do grupo que consiste em C6.5, C6ML3-9, C6MH3-BI, C6-B1D2, F5, HER3.A5, HER3.F4, HER3.H1, HER3.H3,HER3.E12, HER3.B12, EGFR.E12, EGFR.C10, EGFR.Bll, EGFR.E8,HER4.B4, HER4.G4, HER4.F4, HER4.A8, HER4.B6, HER4.D4,HER4.D7, HER4.D11, HER4.D12, HER4.E3, HER4.E7, HER4.F8 eHER4.C7. Em certas modalidades, o anticorpo biespecífico ouo anticorpo poliespecífico é codificado por um vetor quecompreende um ácido nucléico que codifica uma seqüênciapolipeptídica selecionada do grupo que consiste no ID. DESEQ. N°: 1, ID. DE SEQ. N°: 2, ID. DE SEQ. N°: 3, ID. DESEQ. N°: 4, ID. DE SEQ. N°: 5, ID. DE SEQ. N°: 6, ID. DESEQ. N°: 7, ID. DE SEQ. N°: 8, ID. DE SEQ. N°: 9, ID. DESEQ. N°: 10, ID. DE SEQ. N°: 14, ID. DE SEQ. N°: 20 e ID.DE SEQ. N°: 22. Em certas modalidades, o anticorpobiespecífico ou poliespecífico é codificado por um vetorque compreende duas seqüências de ácidos nucléicos quecodificam polipeptídeos codificados por duas seqüências deácidos nucléicos como aqui descritas, por exemplo,selecionadas independentemente do grupo que consiste no ID.DE SEQ. N°: 1, ID. DE SEQ. N°: 2, ID. DE SEQ. N°: 3, ID. DESEQ. N°: 4, ID. DE SEQ. N°: 5, ID. DE SEQ. N°: 6, ID. DESEQ. N°: 7, ID. DE SEQ. N°: 8, ID. DE SEQ. N°: 9, ID. DESEQ. N°: 10, ID. DE SEQ. N°: 20 e ID. DE SEQ. N°: 22. Emcertos casos, o anticorpo biespecífico é codificado por umvetor que compreende, em certos casos, pelo menos uma e, emcertos casos, pelo menos duas seqüências de ácidosnucléicos como aqui descritas, por exemplo, selecionadas dogrupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 1, ID. DE SEQ. N°: 2,ID. DE SEQ. N° : 3, ID. DE SEQ. N°: 4, ID. DE SEQ. N°: 5,ID. DE SEQ. N°: 6, ID. DE SEQ. N°: 7, ID. DE SEQ. N°: 8,ID. DE SEQ. N°: 9, ID. DE SEQ. N°: 10, ID. DE SEQ. N°: 14,ID. DE SEQ. N°: 20 e ID. DE SEQ. N°: 22. Em certos casos, ovetor ainda compreende uma seqüência de ácidos nucléicosque codifica um polipeptídeo que possui a seqüência do ID.DE SEQ. N0: 37.

Em certas modalidades, o primeiro e/ou o segundoanticorpos (por exemplo, os anticorpos descritos acima) sãoanticorpos de cadeia única (por exemplo, anticorpos sc Fv).

Quando tanto o primeiro quanto o segundo anticorpos sãoambos anticorpos de cadeia única, os anticorpos sãoanexados, de preferência, diretamente (para formar umpolipeptídeo único) ou anexados através de um ligante, maispreferivelmente através de um ligante peptídico (porexemplo, um ligante peptídico desprovido de um sítio declivagem proteolítica) para formar um anticorpobiespecífico ou poliespecífico de cadeia única (porexemplo, bs-scFv). Um anticorpo biespecífico (oupoliespecífico) é um anticorpo de cadeia única, e oreferido segundo anticorpo é um anticorpo de cadeia única,e o referido primeiro anticorpo á acoplado ao referidosegundo anticorpo por um ligante peptídico.

Em outra modalidade, esta invenção inclui umacomposição que compreende um anticorpo biespecífico oupoliespecífico como aqui revelado e/ou reivindicado e umveículo farmaceuticamente aceitável.

Esta invenção também fornece um método para otratamento de câncer (por exemplo, atenuando um ou maissintomas de câncer). O método tipicamente envolve aadministração a um paciente (ser humano ou animal nãohumano) que dele necessita de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um anticorpo biespecifico oupoliespecífico como aqui revelado e/ou reivindicado e umveículo farmaceuticamente aceitável. 0 câncer pode incluir,sem limitação, um câncer selecionado do grupo que consisteem câncer de mama, cólon, ovariano, endometrial, gástrico,pancreático, prostático e da glândula salivar. Aadministração pode ser por qualquer um dentre diversosmétodos convenientes, incluindo administração sistêmicainjetável, injeção em um tumor ou tecido canceroso,administração oral, e semelhantes.

Ainda em outra modalidade, esta invenção fornece ummétodo para o tratamento de câncer (por exemplo, atenuandoum ou mais sintomas de câncer). O método tipicamenteenvolve a administração a um paciente (ser humano ou animalnão humano) que dele necessita de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um anticorpo biespecifico oupoliespecíf ico como aqui revelado e/ou reivindicado e umveículo farmaceuticamente aceitável, em combinação comoutro agente citotóxico selecionado do grupo que consisteem um agente quimioterápico, radiação de feixe externo, umradioisótopo direcionado e um inibidor da transdução desinal. O câncer pode incluir, sem limitação, um câncerselecionado do grupo que consiste em câncer de mama, cólon,ovariano, endometrial, gástrico, pancreático, prostático eda glândula salivar. A administração pode ser por qualquerum dentre diversos métodos convenientes, incluindoadministração sistêmica injetável, injeção em um tumor outecido canceroso, administração oral, e semelhantes.

Ainda em outra modalidade, esta invenção fornece umaporção quimérica que compreende um anticorpo biespecíficoou poliespecífico como aqui revelado e/ou reivindicadoacoplado a um efetor. Efetores preferidos incluem, semlimitação, uma citotoxina, um rótulo, um radionuclídeo, umfármaco, um lipossomo, um ligante e um anticorpo. Em certoscasos, quando o efetor for um polipeptideo, a porçãoquimérica será uma proteína de fusão, de preferência umaproteína de fusão expressa de forma recombinante.

Esta invenção também fornece um método de liberar oudirecionar especificamente uma molécula efetora a umacélula que abriga um receptor da família da proteína doReceptor do Fator de Crescimento Epidérmico (por exemplo,EGFR, HER2/neu, HER3, HER4). 0 método envolve ofornecimento de uma porção quimérica como aqui descritae/ou reivindicada, e o contato da célula com a porçãoquimérica, em que a porção quimérica se ligaespecificamente à célula. Efetores preferidos incluem, semlimitação, uma citotoxina, um rótulo, um radionuclídeo, umfármaco, um lipossomo, um ligante, um anticorpo etc. Emcertas modalidades, a porção quimérica é uma proteína defusão. Em certas modalidades, a célula é uma célulacancerosa, de preferência uma célula cancerosa quesuperexpressa um ou mais membros da família da proteína doEGFR. Células cancerosas particularmente preferidasincluem, sem limitação, células de câncer de mama, cólon,ovariano, endometrial, gástrico, pancreático, prostático eda glândula salivar.

Também é fornecido um método para especificamentematar e/ou inibir o crescimento ou a proliferação de umacélula que abriga um receptor da família da proteína doReceptor do Fator de Crescimento Epidérmico (por exemplo,EGFR, HER2/neu, HER3, HER4). 0 método tipicamente envolve ofornecimento de uma porção quimérica como aqui descritae/ou reivindicada anexada a um efetor citotóxico oucitostático (por exemplo, uma citotoxina, uma porçãoradioativa e um lipossomo que compreende um agentecitotóxico ou citostático, e semelhantes) ; e o contato dareferida célula com a porção quimérica, em que a porçãoquimérica se liga especificamente à célula, resultando namorte e/ou inibição do crescimento e/ou da proliferação dacélula. Em certas modalidades, a porção quimérica é umaproteína de fusão. Em certas modalidades, a célula é umacélula cancerosa, de preferência uma célula cancerosa quesuperexpressa um ou mais membros da família da proteína doEGFR. Células cancerosas particularmente preferidasincluem, sem limitação, células de câncer de mama, cólon,ovariano, endometrial, gástrico, pancreático, prostático eda glândula salivar.

Esta invenção também fornece métodos de detecção e/ouvisualização e/ou diagnóstico da presença de uma célula outecido canceroso. 0 método tipicamente envolve o contato deuma célula ou de um tecido com uma porção quimérica quecompreende um anticorpo biespecífico ou poliespecífico,como aqui descrito, anexado a um marcador detectável; e adetecção do rótulo, em que a detecção do rótulo emassociação com a célula ou tecido indica a presença de umacélula ou de um tecido que expressa (ou que superexpressa)um ou mais membros da família da proteína do Receptor doFator de Crescimento Epidérmico. Rótulos detectáveispreferidos incluem, sem limitação, um emissor gama, umemissor de pósitrons, um rótulo de RMN e um rótulofluorescente ou colorimétrico. Em certos casos, o marcadordetectável é um emissor gama, e a detecção compreende acriação de imagens com uma câmera gama. Em certos casos, omarcador detectável é um emissor de pósitrons, e a detecçãocompreende a criação de imagens com tomografia por emissãode pósitrons (PET). Em certos casos, o marcador detectávelé um rótulo de RMN, e a detecção compreende a detecção coma criação de imagens por ressonância magnética. Em certasmodalidades, a célula ou o tecido que expressa um ou maismembros da família da proteína do Receptor do Fator deCrescimento Epidérmico é uma célula ou um tecido quesuperexpressa uma proteína selecionada do grupo queconsiste em EGFR, HER2/neu, HER3 e HER4. A célula ou otecido que expressa um ou mais membros da família daproteína do Receptor do Fator de Crescimento Epidérmicopode ser uma célula ou tecido canceroso (por exemplo,câncer de mama, de cólon, ovariano, endometrial, gástrico,pancreático, de próstata ou de glândula salivar). Observa-se que o ensaio diagnóstico pode ser um componente de umdiagnóstico diferencial de um câncer e/ou pode ser usadopara tipificar um câncer como um que superexpressa um oumais membros da família da proteína do EGFR e/ou o ensaiopode ser usado para visualizar um câncer conhecido. Nessese em outros casos, o ensaio não precisa ser indicativo dapresença de uma célula cancerosa, mas simplesmenteindicativo da probabilidade da presença de uma célula outecido desse tipo. Em certas modalidades, a detecçãocompreende uma técnica não invasiva de formação de imagens.Em certas modalidades, a detecção compreendeimunoistoquímica. Em certas modalidades, a detecçãocompreende a detecção em uma amostra ou biópsia de tecido.

Em certas modalidades, a detecção compreende a detecção emum corte de tecido. Em certas modalidades, a detecção é adetecção in vivo.

De acordo com a presente invenção, em certasmodalidades, são fornecidas moléculas inéditas de anticorpoFv biespecífico de cadeia única (bs-scFv) que possuemafinidade de ligação por membros da família da proteína doEGFR.

Em certas modalidades preferidas da invenção, osanticorpos bs-scFv têm um primeiro e um segundo braços quepossuem afinidade de ligação por dois epitopos distintos emmembros diferentes da família da proteína do EGFR (porexemplo, EGFR, HER2/neu, HER3 e HER4) ou por dois epitoposdistintos em um único membro da família da proteína doEGFR, e estão ligados operacionalmente por meio de umamolécula ligantea inédita que é desprovida de sítios declivagem proteolítica. Esse ligante constitui um aspecto dapresente invenção. Os braços que são pareados em conjuntopara formar os anticorpos bs-scFv podem ser qualquer um dosseguintes braços, incluindo C6.5, C6ML3-9, C6MH3-B1, C6-B1D2, F5, HER3.A5, HER3.F4, HER3.H1, HER3.H3, HER3.E12,HER3.B12, EGFR.E12, EGFR.CIO, EGFR.Bll, EGFR.E8, HER4.B4,HER4.G4, HER4.F4, HER4.A8, HER4.B6, HER4.D4, HER4.D7,HER4.D11, HER4.D12, HER4.E3, HER4.E7, HER4.F8 e HER4.C7. Emuma modalidade particularmente preferida, os braços estãoligados em conjunto com uma molécula ligantea que possui aseqüência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 11. Também sãofornecidos vetores e transformantes que compreendem asseqüências de ácidos nucléicos que codificam os braços descFv e a molécula ligantea.

Um anticorpo bs-scFv exemplar que tem afinidade deligação por dois membros da família da proteína do EGFR éALM, que tem um braço que possui especificidade de ligaçãopor HER3 e um segundo braço que tem especificidade deligação por HER2/neu. Um anticorpo bs-scFv exemplar que temafinidade de ligação por dois epitopos em um único membroda família da proteína do EGFR é ALF, que tem um braço comespecificidade de ligação por um epitopo em HER3 e umsegundo braço com especificidade de ligação por um epitopodiferente em HER3.

Em outra modalidade da invenção, os anticorpos bs-scFvpossuem afinidade de ligação por membros da família daproteína do EGFR que são superexpressos por célulastumorais.

Ainda em outra modalidade da invenção, são fornecidoscomposições e métodos para o tratamento de câncer, em queum paciente recebe a administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz de uma molécula de anticorpo bs-scFv da invenção em um veículo farmaceuticamente aceitável,tanto isoladamente quanto em combinação com outros agentescitotóxicos, tais como agentes quimioterápicos, radiação defeixe externo, radioisótopos direcionados e inibidores datransdução de sinal.

Definições

Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" sãoaqui usados de forma intercambiável para se referirem a umpolímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicam apolímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos deaminoácidos são um análogo químico artificial de umaminoácido de ocorrência natural correspondente, além depolímeros de aminoácidos de ocorrência natural. 0 termotambém inclui variantes na ligação peptídica tradicionalque une os aminoácidos que constituem o polipeptídeo."Peptídeos", "polipeptídeos" e "proteínas" preferidos sãocadeias de aminoácidos cujos carbonos estão ligados atravésde ligações peptídicas. 0 aminoácido terminal em umaextremidade da cadeia (terminal amino) tem, portanto, umgrupo amino livre, enquanto o aminoácido terminal na outraextremidade da cadeia (terminal carboxi) tem um grupocarboxil livre. Como aqui usado, o termo "terminal amino"(abreviado N-terminal) refere-se ao grupo α-amino livre emum aminoácido no terminal amino de um peptídeo ou ao grupoα-amino (grupo imino, quando participa em uma ligaçãopeptídica) de um aminoácido em qualquer outra localizaçãodentro do peptídeo. Da mesma forma, o termo "terminalcarboxi" refere-se ao grupo carboxil livre no terminalcarboxi de um peptídeo ou ao grupo carboxil de umaminoácido em qualquer outra localização dentro dopeptídeo. Peptídeos também incluem essencialmente qualquerpoliaminoácido, incluindo, sem limitação, miméticos depeptídeos, tais como aminoácidos unidos por um éter, e nãopor uma ligação amida.

Como aqui usado, um "anticorpo" refere-se a umaproteína que consiste em um ou mais polipeptídeossubstancialmente codificados por genes de imunoglobulina oufragmentos de genes de imunoglobulina. Os genes deiraunoglobulina reconhecidos incluem os genes da regiãoconstante kappa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu,além de uma diversidade de genes da região variável deimunoglobulina. As cadeias leves são classificadas comokappa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas comogama, mu, alfa, delta, ou épsilon, as quais, por sua vez,definem as classes de imunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD eIgE, respectivamente.

Uma unidade estrutural típica de imunoglobulina(anticorpo) é conhecida por compreender um tetrâmero. Cadatetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeiaspolipeptídicas, cada par possuindo uma cadeia "leve" (cercade 25 kD) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kD) . 0 N-terminal de cada cadeia define uma região variável de cercade 100 a 110 ou mais aminoácidos responsáveis primariamentepelo reconhecimento de antígeno. Os termos cadeia variávelleve (Vl) e cadeia variável pesada (Vh) referem-se a essascadeias leves e pesadas, respectivamente.

Anticorpos existem como imunoglobulinas intactas oucomo diversos fragmentos bem caracterizados produzidos pordigestão com várias peptidases. Dessa forma, por exemplo, apepsina digere um anticorpo abaixo das ligações dissulfetona região de dobradiça para produzir F(ab)'2, um dímero deFab que, ele próprio, é uma cadeia leve unida a Vh-Ch 1 poruma ligação dissulfeto. 0 F(ab)'2 pode ser reduzido sobcondições leves para quebrar a ligação dissulfeto na regiãode dobradiça convertendo, dessa forma, o dímero (Fab1)2 emum monômero Fab1. O monômero Fab1 é essencialmente um Fabcom parte da região de dobradiça (veja, "FundamentalImmunology", W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993), parauma descrição mais detalhada de outros fragmentos deanticorpos). Embora vários fragmentos de anticorpos sejamdefinidos em termos da digestão de um anticorpo intacto,aqueles habilitados na técnica observarão que taisfragmentos Fab1 podem ser sintetizados de novo tantoquimicamente quanto pela utilização de metodologia de DNArecombinante. Dessa forma, o termo anticorpo, como aquiusado, também inclui anticorpos inteiros, fragmentos deanticorpos tanto produzidos pela modificação de anticorposinteiros quanto sintetizados de novo com o uso demetodologias de DNA recombinante. Anticorpos preferidosincluem anticorpos de cadeia única (anticorpos que existemcomo uma única cadeia polipeptidica), mais preferivelmenteanticorpos Fv de cadeia única (scFv), nos quais uma cadeiavariável pesada e uma cadeia variável leve são unidas emconjunto (diretamente ou através de um ligante peptídico)para formar um polipeptideo contínuo. 0 anticorpo Fv decadeia única é um heterodímero Vh-Vl ligado de formacovalente que pode ser expresso por um ácido nucléico queinclui seqüências codificadoras de Vh e Vl tanto unidasdiretamente quanto unidas por um ligante peptídicocodificador. Huston, e cols. (1988) Proc. Nat. Acad. Sei.USA, 85: 5.879-5.883. Embora a Vh e a Vl estejam conectadasentre elas por uma única cadeia polipeptidica, os domíniosVh e Vl se associam de forma não covalente. As primeirasmoléculas funcionais de anticorpo a serem expressas nasuperfície de fago filamentoso foram Fv1s (scFv) de cadeiaúnica; no entanto, estratégias de expressão alternativastambém foram bem sucedidas. Por exemplo, moléculas Fabpodem ser exibidas em fago se uma das cadeias (pesada ouleve) for fundida à proteína do capsídeo g3 e a cadeiacomplementar exportada para o periplasma como uma moléculasolúvel. As duas cadeias podem ser codificadas no mesmoreplicou ou em replicons diferentes; o ponto importante éque as duas cadeias de anticorpo em cada molécula Fab sãomontadas pós-tradução e o dímero é incorporado na partículade fago por meio de ligação de uma das cadeias a, porexemplo, g3p (veja, por exemplo, Patente U.S. N°:5.733.743). Os anticorpos scFv e várias outras estruturasque convertem as cadeias polipeptídicas leves e pesadasnaturalmente agregadas, mas quimicamente separadas de umaregião V de anticorpo em uma molécula que se dobra em umaestrutura tridimensional substancialmente similar àestrutura de um sítio de ligação de antígeno, sãoconhecidos por aqueles habilitados na técnica (veja, porexemplo, Patentes U.S. Nos 5.091.513, 5.132.405 e4.956.778). Anticorpos particularmente preferidos devemincluir tudo que foi exibido no fago (por exemplo, sc Fv,Fv, Fab e Fv ligado por dissulfeto (Reiter e cols. (1995)Protein Eng. 8: 1.323-1.331), e também incluem anticorposbiespecíficos, triespecíficos, quadriespecíficos, egeralmente anticorpos poliespecíficos (por exemplo, bsscFv).

Com relação aos anticorpos da invenção, o termo"imunologicamente específico" ou "se liga especificamente"refere-se aos anticorpos que se ligam a um ou mais epitoposde uma proteína de interesse (por exemplo, HER2/neu), masque não reconhecem substancialmente e não se ligam a outrasmoléculas em uma amostra que contém uma população mista demoléculas biológicas antigênicas.O termo "anticorpo biespecífico", como aqui usado,refere-se a um anticorpo que compreende dois sitios deligação de antígeno, um primeiro sítio de ligação quepossui afinidade por um primeiro antígeno ou epitopo e umsegundo sítio de ligação que possui afinidade de ligaçãopor um segundo antígeno ou epitopo diferente do primeiro.

Os termos "ácido nucléico" ou "oligonucleotídeo" ouequivalentes gramaticais aqui citados referem-se a pelomenos dois nucleotídeos ligados em conjunto de formacovalente. Um ácido nucléico da presente invenção é, depreferência, de fita simples ou de fita dupla e conterágeralmente ligações fosfodiéster, embora, em alguns casos,como descrito abaixo, sejam incluídos análogos de ácidosnucléicos que podem ter estruturas centrais alternativasque compreendem, por exemplo, fosforamida (Beaucage e cols.(1993) Tetrahedron 49(10): 1.925) e referências nelecitadas; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3.800; Sprinzl ecols. (1977) Eur. J. Biochem. 81: 579; Letsinger e cols.(1986) Nucl. Acids Res. 14: 3.487; Sawai e cols. (1984)Chem. Lett. 805, Letsinger e cols. (1988) J. Am. Chem. Soe.110: 4.470; e Pauwels e cols. (1986) Chemica Scripta 26:141-9), fosforotioato (Mag e cols. (1991) Nucleic AcidsRes. 19: 1.437; e Patente U.S. N0 5.644.048),fosforoditioato (Briu e cols. (1989) J. Am. Chem. Soe. 111:2.321, ligações O-metilfosforoamidita (veja Eckstein,"Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach",Oxford University Press), e estruturas centrais e ligaçõespeptídicas de ácido nucléico (veja Egholm (1992) J. Am.Chem. Soe. 114: 1.895; Meier e cols. (1992) Chem. Int. Ed.Engl. 31: 1.008; Nielsen (1993) Naturel 365: 566; Carlssone cols. (1996) Nature 380: 207). Outros ácidos nucléicosanálogos incluem aqueles com estruturas centrais positivas(Denpcy e cols. (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:6.097); estruturas centrais aniônicas (Patentes U.S. Nos5.386.023, 5.637.684, 5.602.240, 5.216.141 e 4.469.863;Angew. (1991) Chem. Intl. Ed. English 30: 423; Letsinger ecols. (1988) J. Am. Chem. Soe. 110: 4.470; Letsinger ecols. (1994) "Nucleoside & Nucleotide" 13: 1.597; Capítulos2 e 3, ASC Symposium Series 580, "CarbohydrateModifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui e P.Dan Cook; Mesmaeker e cols. (1994), Bioorganic & MedicinalChem. Lett. 4: 395; Jeffs e cols. (1994) J.Biomolecular NMR 34: 17; Tetrahedron Lett. 37: 743 (1996))e estruturas centrais de não ribose, incluindo aquelasdescritas nas Patentes U.S. Nos 5.235.033 e 5.034.506, eCapítulos 6 e 7, ASC Symposium Series 580, "CarbohydrateModifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui e P.Dan Cook. Ácidos nucléicos que contêm um ou mais açúcarescarbocíclicos também estão incluídos dentro da definição deácidos nucléicos (veja Jenkins e cols. (1995), Chem. Soe.Rev. páginas 169-176) . Vários análogos de ácidos nucléicossão descritos em Rawls, C & E News 2 de junho de 1997,página 35. Essas modificações da estrutura central deribose-fosfato podem ser feitas para facilitar a adição deporções adicionais, tais como rótulos, ou para aumentar aestabilidade e a meia-vida dessas moléculas em ambientesfisiológicos.

Os termos "que hibridiza especificamente para","hibridização específica" e "hibridiza seletivamente para",como aqui usados, referem-se à ligação, formação deduplexos ou hibridização de uma molécula de ácido nucléicode preferência para uma seqüência de nucleotídeos emparticular sob condições altamente controladas. O termo"condições altamente controladas" refere-se às condiçõessob as quais uma sonda irá hibridizar preferencialmentepara sua subseqüência-alvo e, em menor grau, não iráhibridizar para outras seqüências. Condições dehibridização altamente controladas e condições de lavagemde hibridização altamente controladas no contexto dehibridização de ácidos nucléicos são seqüência-dependentes,e são diferentes sob parâmetros ambientais diferentes. Umguia detalhado sobre a hibridização de ácidos nucléicos éencontrado, por exemplo, em Tijssen (1993) "LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization With Nucleic Acid Probes" parte I, capitulo2, "Overview of principies of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, NY(Tijssen). Geralmente, condições de hibridização econdições de lavagem altamente controladas são selecionadaspara serem cerca de 50C mais baixas do que o ponto térmicode fusão (Tra) para a seqüência específica em uma forçaiônica e pH definidos. A Tra é a temperatura (sob forçaiônica e pH definidos) na qual 50% da seqüência-alvohibridiza para uma sonda que combina perfeitamente.

Condições altamente controladas são selecionadas para seremiguais à Tra para uma sonda em particular. Um exemplo decondições de hibridização altamente controladas para ahibridização de ácidos nucléicos complementares que possuemmais de 100 resíduos complementares em um arranjo ou em umfiltro em um blot Southern ou Northern é de 42°C usandosoluções padronizadas de hibridização (veja, por exemplo,Sambrook (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"(2 a ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpring Harbor Press, NY, e a discussão detalhada, abaixo),com a hibridização sendo realizada de um dia para o outro.Um exemplo de condições de lavagem altamente controladas é0,15 M de NaCl a 72°C por cerca de 15 minutos. Um exemplode condições de lavagem controladas é uma lavagem 0,2 χ SSCa 65°C por 15 minutos (veja, por exemplo, Sambrook suprapara uma descrição do tampão SSC) . Freqüentemente, umalavagem altamente controlada é precedida por uma lavagemsob baixo rigor para a remoção do sinal de fundo da sonda.Um exemplo de lavagem com rigor médio para um duplex de,por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 1 χ SSC a 450C por15 minutos. Um exemplo de uma lavagem com baixo rigor paraum duplex de, por exemplo, mais de 100 nucleotídeos, é 4x a6χ SSC a 40°C por 15 minutos.

Quando aplicado ao RNA, o termo "ácido nucléicoisolado" refere-se primariamente a uma molécula de RNAcodificada por uma molécula isolada de DNA, como definidaacima. Alternativamente, o termo pode se referir a umamolécula de RNA que foi suficientemente separada de outrosácidos nucléicos com os quais estaria associada em seuestado natural (ou seja, em células ou tecidos). Um "ácidonucléico isolado" (tanto DNA quanto RNA) pode aindarepresentar uma molécula produzida diretamente por meiosbiológicos ou sintéticos, e separada de outros componentespresentes durante sua produção.

Um "replicon" é qualquer elemento genético, porexemplo, um plasmídeo, cosmídeo, bacmídeo, plastídeo, fagoou vírus, que seja capaz de replicação amplamente sob seupróprio controle. Um replicou pode ser tanto RNA quantoDNA, e pode ser de fita simples ou de fita dupla.

Um "vetor" é um replicou, por exemplo, um plasmídeo,cosmídeo, bacmídeo, fago ou vírus, ao qual outra seqüênciaou elemento genético (tanto DNA quanto RNA) pode seranexado de forma a produzir a replicação da seqüência ouelemento anexado.

Um "óperon de expressão" refere-se a um segmento deácido nucléico que pode possuir seqüências de controle detranscrição e tradução, por exemplo, promotores,intensificadores, .sinais de início da tradução (porexemplo, códons ATG ou AUG), sinais de poliadenilação,finalizadores, e semelhantes, e que facilita a expressão deuma seqüência codificadora de polipeptídeo em uma célulahospedeira ou organismo.

O termo "iniciador", como aqui usado, refere-se a umoligonucleotídeo, tanto RNA quanto DNA, tanto de fitasimples quanto de fita dupla, derivado de um sistemabiológico, gerado por digestão por enzima de restrição ouproduzido sinteticamente que, quando colocado no ambienteadequado, é capaz de atuar funcionalmente como um iniciadorda síntese de ácido nucléico modelo-dependente. Quandoapresentado com um modelo de ácido nucléico apropriado,precursores de nucleosídeo trifosfato adequados de ácidosnucléicos, uma enzima polimerase, co-fatores adequados econdições como temperatura e pH apropriados, o iniciadorpode ser estendido em seu terminal 31 pela adição denucleotídeos pela ação de uma polimerase ou atividadesimilar para gerar um produto da extensão do iniciador. 0comprimento do iniciador pode variar, dependendo dascondições e exigências específicas da aplicação.

Freqüentemente, o comprimento dos iniciadores varia decerca de 15 a cerca de 25 ou mais nucleotídeos. Osiniciadores são tipicamente de complementaridade suficientepara o modelo desejado para iniciar a síntese do produto deextensão desejado. Em outras palavras, os iniciadores sãocapazes de anelar com a fita-modelo desejada de formasuficiente para fornecer a porção 31 hidroxil do iniciadorem justaposição apropriada para uso na iniciação da síntesepor uma polimerase ou uma enzima similar. Não é necessárioque a seqüência do iniciador represente um complementoexato do modelo desejado. Por exemplo, uma seqüência denucleotídeos não complementar pode ser anexada àextremidade 5' de um iniciador de outra forma complementar.

Alternativamente, bases não complementares podem serentremeadas dentro da seqüência de oligonucleotídeos doiniciador, desde que a seqüência do iniciador tenhacomplementaridade suficiente com a seqüência da fita-modelodesejada para fornecer funcionalmente um complexo modelo-iniciador para a síntese do produto de extensão.

A reação em cadeia de polimerase (PCR) foi descritanas Patentes U.S. 4.683.195, 4.800.195 e 4.965.188, cujasrevelações totais são aqui incorporadas por referência.

Como aqui usado, os termos "repórter", "sistemarepórter", "gene repórter" ou "produto do gene repórter"significam um sistema genético operacional, no qual umácido nucléico que compreende um gene que codifica umproduto que, quando expresso, produz um sinal repórter queé prontamente mensurável, por exemplo, por ensaiosbiológicos, imunoensaio, radioimunoensaio ou por métodoscolorimétricos, fluorogênicos, quimioluminescentes ou poroutros métodos. O ácido nucléico pode ser tanto RNA quantoDNA, linear ou circular, de fita única ou de fita dupla,com polaridade anti-senso ou senso, e é ligadooperacionalmente aos elementos de controle necessários paraa expressão do produto do gene repórter. Os elementos decontrole irão variar de acordo com a natureza do sistemarepórter e se o gene repórter está na forma de DNA ou deRNA, mas podem incluir, sem limitação, elementos comopromotores, intensificadores, seqüências de controle datradução, sinais de adição poli A, sinais de terminação datranscrição e semelhantes.

Os termos "transformar", "transfectar" e "transduzir"referem-se a qualquer método ou meio através do qual umácido nucléico é introduzido em uma célula ou organismohospedeiro, e podem ser usados de forma intercambiável pararepresentar o mesmo significado. Tais métodos incluem, semlimitação, transfecção, eletroporação, microinjeção, PEG-fusão e semelhantes. 0 ácido nucléico introduzido pode ounão ser integrado (ligado de forma covalente) no ácidonucléico da célula ou organismo receptor. Em célulasbacterianas, de leveduras, plantas e mamíferas, porexemplo, o ácido nucléico introduzido pode ser mantido comoum elemento do epissoma ou replicon independente, porexemplo, um plasmídeo. Alternativamente, o ácido nucléicointroduzido pode se tornar integrado no ácido nucléico dacélula ou organismo receptor e ser mantido estavelmentenaquela célula ou organismo e adicionalmente passado ouherdado às células ou organismos da progênie da célula ouorganismo receptor. Finalmente, o ácido nucléicointroduzido pode existir na célula ou organismo hospedeiroreceptor apenas transitoriamente.

O termo "gene de marcador selecionável" refere-se a umgene que, quando expresso, confere um fenótiposelecionável, por exemplo, resistência a antibiótico, emuma célula ou planta transformada.

O termo "ligado operacionalmente" significa queseqüências reguladoras necessárias à expressão da seqüênciacodificadora são colocadas na molécula de DNA nas posiçõesapropriadas em relação à seqüência codificadora de modo aefetuar a expressão da seqüência codificadora. Essa mesmadefinição é algumas vezes aplicada ao arranjo de unidadesde transcrição e de outros elementos de controle datranscrição (por exemplo, intensificadores) em um vetor deexpressão.

Os termos "idênticos" ou percentual de "identidade",no contexto de dois ou mais ácidos nucléicos ou seqüênciaspolipeptídicas, referem-se a duas ou mais seqüências ousubseqüências que são iguais ou que possuem uma percentagemespecificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos quesão iguais, quando comparadas e alinhadas para umacorrespondência máxima, medida com a utilização de um dosseguintes algoritmos de comparação de seqüências ou porinspeção visual. Com relação aos peptídeos desta invenção,a identidade de seqüência é determinada sobre o comprimentototal do peptídeo.

Para a comparação de seqüências, tipicamente umaseqüência atua como uma seqüência de referência, com a qualseqüências de teste são comparadas. Quando se utiliza umalgoritmo de comparação de seqüências, seqüências de testee de referência são inseridas em um computador, sãoatribuídas coordenadas da subseqüência, se necessário, esão atribuídos os parâmetros do programa do algoritmo deseqüência. 0 algoritmo de comparação de seqüências entãocalcula o percentual de identidade de seqüência para a(s)seqüência(s) de teste(s) em relação à seqüência dereferência, com base nos parâmetros atribuídos ao programa.

0 alinhamento de seqüências ótimo para comparação podeser realizado, por exemplo, pelo algoritmo de homologialocal de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981),pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman &Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), pelo método depesquisa de similaridade de Pearson & Lipman (1988) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 85: 2.444, por implementaçõescomputadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA eTFASTA na suíte de programas wWisconsin Genetics", GeneticsComputer Group, 575 Science Dr. , Madison, WI) ou porinspeção visual (veja geralmente Ausubel e cols., supra).

Um exemplo de um algoritmo útil é PILEUP. PILEUP criaum alinhamento de múltiplas seqüências a partir de um grupode seqüências relacionadas usando alinhamentosprogressivos, pareados, para exibir o relacionamento e opercentual de identidade de seqüências. Ele também cria umaárvore ou dendograma que mostra os relacionamentos deagrupamento usados para criar o alinhamento. PILEUP usa umasimplificação do método de alinhamento progressivo de FengSc Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 35: 351-360. 0 métodousado é similar ao método descrito por Higgins & Sharp(1989) CABIOS 5: 151-153. 0 programa pode alinhar até 300seqüências, cada uma com um comprimento máximo de 5.000nucleotídeos ou aminoácidos. 0 procedimento de alinhamentomúltiplo começa com o alinhamento pareado das duasseqüências mais similares, produzindo um agrupamento deduas seqüências alinhadas. Esse agrupamento é entãoalinhado até a seqüência ou o agrupamento mais relacionadoseguinte de seqüências alinhadas. Dois agrupamentos deseqüências são alinhados por uma extensão simples doalinhamento pareado de duas seqüências individuais. Oalinhamento final é obtido por uma série de alinhamentospareados progressivos. 0 programa é executado atribuindo-seseqüências específicas e suas coordenadas de aminoácidos ounucleotídeos a regiões de comparação de seqüências, eatribuindo-se os parâmetros do programa. Por exemplo, umaseqüência de referência pode ser comparada com outrasseqüências de teste para determinar o relacionamento dopercentual de identidade de seqüência com o uso dosseguintes parâmetros: peso-padrão de lacuna (3,00), peso-padrão do comprimento da lacuna (0,10) e lacunas finaisponderadas.

Outro exemplo de algoritmo adequado para adeterminação do percentual de identidade de seqüência e desimilaridade de seqüência é o algoritmo BLAST, que édescrito em Altschul e cols. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. O software para a realização da análise BLAST estádisponível publicamente através do "National Center forBiotechnology Information" (http://www.ncbi.nlm.nih.govf).Esse algoritmo envolve a identificação inicial dos pares deseqüências de pontuação elevada (HSPs) pela identificaçãode palavras curtas de comprimento W na seqüência emquestão, a qual combina ou satisfaz uma pontuação-limiar Tde valor positivo, quando alinhada com uma palavra do mesmocomprimento em uma seqüência da base de dados. T édenominado o limiar de pontuação da palavra vizinha(Altschul e cols., supra). Esses hits de palavras vizinhasiniciais agem como sementes para iniciar as pesquisas embusca dos HSPs mais longos que os contêm. Os hits depalavras são então estendidos em ambas as direções ao longode cada seqüência pelo máximo que a pontuação cumulativa dealinhamento puder ser aumentada. As pontuações cumulativassão calculadas usando, para seqüências de nucleotídeos, osparâmetros M (pontuação de recompensa para um par deresíduos compatíveis; sempre > 0) e N (pontuação depenalidade para resíduos não compatíveis; sempre < 0) . Paraseqüências de aminoácidos, é usada uma matriz de pontuaçãopara calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos hitsde palavras em cada direção é interrompida quando: apontuação cumulativa de alinhamento cai pela quantidade X apartir de seu valor máximo obtido; a pontuação cumulativacai a zero ou menos, em função do acúmulo de um ou maisalinhamentos de resíduos de pontuação negativa; ou éalcançado o final de uma das seqüências. Os parâmetros doalgoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade evelocidade do alinhamento. 0 programa BLASTN (paraseqüências de nucleotídeos) usa como padrão um comprimentode palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M = 5, N =-4, e uma comparação de ambas as fitas. Para seqüências deaminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão umcomprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10,e a matriz de pontuação BLOSUM62 (veja Henikoff & Henikoff(1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10.915).

Além do cálculo do percentual de identidade deseqüência, o algoritmo BLAST também realiza uma análiseestatística da similaridade entre duas seqüências (veja,por exemplo, Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad.Sei. USA ,90: 5.873-5.787). Uma medida de similaridadefornecida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade da menorsoma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidadepela qual uma combinação entre duas seqüências denucleotídeos ou de aminoácidos ocorreria ao acaso. Porexemplo, um ácido nucléico é considerado similar a umaseqüência de referência se a probabilidade da menor soma emuma comparação do ácido nucléico de teste com o ácidonucléico de referência for menor do que cerca de 0,1, maispreferivelmente, menor do que cerca de 0,01 e,principalmente, menor do que cerca de 0,001.

A frase "se dirige/libera especificamente", quandousada, por exemplo, com referência a uma porção quiméricadesta invenção, refere-se à ligação específica da porção aum alvo (por exemplo, uma célula que superexpressa a(s)proteína(s)-alvo), e isso resulta em um aumento na duraçãoe/ou concentração local da porção na célula ou dentro dela,comparada com aquela que seria obtida sem direcionamento"específico". A especificidade não precisa ser absoluta,mas simplesmente com avidez/afinidadedetectavelmente/mensuravelmente maior do que aquelaobservada para uma célula que expressa a(s) proteína(s)-alvo normalmente (por exemplo, do tipo selvagem) ou do queaquela observada para uma célula que não expressa a(s)proteína(s)-alvo.Os resíduos de aminoácidos são identificados nopresente pedido de acordo com abreviações padronizadas de 3 letras ou de 1 letra (por exemplo, como apresentado em padrão WIPO ST 25) e/ou como apresentado na Tabela 1. tabela 1. abreviações de aminoácidos.

<table>table see original document page 32</column></row><table>

Prefere-se que os aminoácidos enantioméricos aquidescritos estejam na forma isomérica "L" . No entanto,resíduos na forma isomérica "D" podem substituir qualquerresíduo de L-aminoácido, desde que as propriedadesdesejadas do polipeptídeo sejam preservadas. Todas asseqüências de resíduos de aminoácido aqui representadasestão de acordo com a orientação convencional da esquerdapara a direita, do terminal amino ao terminal carboxi.

Algumas vezes, o termo "proteína isolada" ou "proteínaisolada e purificada" é aqui utilizado. Esse termo refere-se primariamente a uma proteína produzida por expressão deuma molécula de ácido nucléico isolado da invenção.

Alternativamente, esse termo pode se referir a uma proteínaque foi suficientemente separada de outras proteínas com asquais estaria naturalmente associada, de modo a existir emforma "substancialmente pura". "Isolada" não visa a excluirmisturas artificiais ou sintéticas com outros compostos oumateriais, ou a presença de impurezas que não interferemcom a atividade fundamental, e que podem estar presentes,por exemplo, em função de purificação incompleta, adição deestabilizantes, ou que compõem, por exemplo, preparaçõesimunogênicas ou preparações farmaceuticamente aceitáveis.

O termo "substancialmente pura" refere-se a umapreparação que compreende pelo menos 50-60% por peso decerto material (por exemplo, ácido nucléico,oligonucleotídeo, proteína etc.). Mais preferivelmente, apreparação compreende pelo menos 75% por peso e,principalmente, 90-95% por peso do certo composto. A purezaé medida por métodos adequados para o certo composto (porexemplo, métodos cromatográficos, eletroforese em gel deagarose ou poliacrilamida, análise HPLC, e semelhantes).

O termo "funcional", como aqui usado, implica em que aseqüência de ácidos nucléicos ou de aminoácidos é funcionalpara o ensaio ou objetivo especificado.

A frase "que consiste essencialmente em", quando serefere a um nucleotídeo ou aminoácido em particular,significa uma seqüência que possui as propriedades de certoID. DE SEQ. N°. Por exemplo, quando usada em referência auma seqüência de aminoácidos, a frase inclui a seqüênciapor si e modificações moleculares que não afetem ascaracterísticas básicas e inéditas da seqüência.

0 termo ntag", "seqüência tag" ou "tag de proteína"refere-se a uma porção química, seja um nucleotídeo,oligonucleotídeo, polinucleotídeo ou um aminoácido,peptídeo ou proteína ou outra substância química, que,quando adicionada outra seqüência, gera utilidade adicionalou confere propriedades úteis, particularmente na detecçãoou isolamento daquela seqüência. Dessa forma, por exemplo,uma seqüência de homopolímero de ácidos nucléicos ou umaseqüência de ácidos nucléicos complementares a umoligonucleotídeo de captura pode ser adicionada a umaseqüência iniciadora ou sonda para facilitar o isolamentosubseqüente de um produto de extensão ou produtohibridizado. No caso de tags de proteína, resíduos dehistidina (por exemplo, 4 a 8 resíduos de histidinaconsecutivos) podem ser adicionados a um dos terminaisamino ou carboxi de uma proteína para facilitar oisolamento da proteína por cromatografia por metalqueIante. Alternativamente, seqüências de aminoácidos,peptídeos, proteínas ou parceiros de fusão que representamepitopos ou determinantes de ligação reativos às moléculasde anticorpos específicos ou outras moléculas (por exemplo,epitopo flag, epitopo c-myc, epitopo transmembrana daproteína hemaglutinina do vírus da influenza A, proteína A,domínio de ligação de celulose, proteína de ligação decalmodulina, proteína de ligação de maltose, domínio deligação de quitina, glutationa S-transferase, esemelhantes) podem ser adicionados às proteínas parafacilitar o isolamento da proteína por procedimentos como,por exemplo, cromatografia de afinidade ou imunoafinidade.

Porções tagr químicas incluem moléculas como, por exemplo,biotina, que podem ser adicionadas aos ácidos nucléicos ouàs proteínas, e facilitam o isolamento ou detecção porinteração com reagentes de avidina, e semelhantes. Váriasoutras porções tagr são conhecidas e podem ser previstaspelo técnico experiente, e são contempladas como estandoincluídas no escopo desta definição.

Um "clone" ou "população clonal de células" é umapopulação de células derivadas de uma única célula ouancestral comum, por exemplo, por mitose.

Uma "linhagem celular" é um clone de uma célula ou deuma população de células primárias que é capaz decrescimento estável in vitro por muitas gerações.

Breve Descrição Dos Desenhos

A Figura 1 mostra um diagrama esquemático do vetorpUC/ALM.

A Figura 2 mostra um gráfico que ilustra a ligação deproteínas ALM ao domínio extracelular HER3 em um chipBIAcore.

A Figura 3 mostra um gráfico que ilustra a ligação deproteínas ALM ao domínio extracelular HER2/neu em um chipBIAcore.

A Figura 4 mostra um gráfico que ilustra a ligaçãosimultânea de proteínas ALM a HER3 e HER2/neu em um chipBIAcore.

As Figuras 5A e 5B mostram gráficos de resultados decitometria de fluxo que exibem uma redução em HER2/neu eHER3 na superfície celular após incubação in vitro de ALMcom células de câncer de mama humano BT-474 que expressamtanto HER2/neu quanto HER3.

A Figura 6 mostra um gráfico dos resultados de umensaio MTT que demonstra que ALM diminui a proliferação decélulas de câncer de mama BT-474 que expressam tantoHER2/neu quanto HER3.

A Figura 7 mostra um gráfico que ilustra os resultadosde um ensaio de clonogenicidade de 17 dias que demonstraque a incubação de células BT-4 74 com ALM em umaconcentração eqüimolar à expressão de HER2/neu dasuperfície celular leva a uma redução de 50% na formação decolônias (sobrevida celular).

A Figura 8 mostra uma análise western JbIot que exibealterações na fosforilação de AKT ao longo de 4 8 horas apósincubação in vitro de diferentes concentrações de ALM comcélulas de câncer de mama humano BT-474 que expressam tantoHER2/neu quanto HER3.

A Figura 9 mostra um mapeamento gráfico dabiodistribuição de ALM marcado com I ao longo de 48 horasem camundongos imunodeficientes.

A Figura 10 ilustra um quelato 211At-SAPS usado pararotular um anticorpo biespecífico de acordo com estainvenção.

As Figuras IlA a IlC mostram os efeitos de ALMconjugado a 211At em uma dosagem baixa de 10 pg (Figura 11C)e em uma dose alta de 80 pg (Figura 11B) , comparado comcontroles não tratados (Figura .11 A).

A Figura 12 ilustra rotulagem tumor-específica em umcamundongo com o uso de um anticorpo biespecífico rotuladocom 124I (ALM) . Imagens de PET (superior direita) e TC(superior esquerda) de camundongos scid com xenoenxerto decarcinoma ovariano SK-OV-3 que expressa antígenos HER2/neue HER3 e obtidas 48 horas pós-injeção em um LS G.E.Discovery rm FCCC. A espessura do corte de TC é de 0,63 mm.A fusão de imagens (inferior direita) foi realizada com oprograma de computador com MIM.

A Figura 13 mostra as seqüências de cadeias leves epesadas de ScFv como determinadas pelo Adams Lab e usadasna construção de certas moléculas de bs-scFv. As seqüênciassão fornecidas para a cadeia pesada C6.5 (ID. DE SEQ. N°:38), cadeia pesada G98A (ID. DE SEQ. N°: 39), cadeia pesadaML3-9 (ID. DE SEQ. N°: 40), cadeia pesada H3B1 (ID. DE SEQ.N°: 41), cadeia pesada B1D2 (ID. DE SEQ. N°: 42), cadeialeve C6.5 (ID. DE SEQ. N°: 43), cadeia leve G98A (ID. DESEQ. N°: 44), cadeia leve ML3-9 (ID. DE SEQ. N°: 45),cadeia leve H3B1 (ID. DE SEQ. N°: 46) e cadeia leve B1D2(ID. DE SEQ. N°: 47).

A Figura 14 mostra seqüências de proteínas deduzidasde regiões variáveis de cadeia pesada e leve de toda a IgGproduzida no vetor IDEC fornecida pelo Marks Iab. Em certasmodalidades, a seqüência de scFvs pode diferir desta. Sãofornecidas seqüências para cadeia pesada C6.5 (ID. DE SEQ.N° : 48), cadeia pesada G98A (ID. DE SEQ. N°: 49), cadeiapesada ML3-9 (ID. DE SEQ. N°: 50), cadeia pesada H3B1 (ID.DE SEQ. N°: 51), cadeia pesada B1D2 (ID. DE SEQ. N°: 52),cadeia leve C6.5 (ID. DE SEQ. N°: 53), cadeia leve G98A(ID. DE SEQ. N°: 54), cadeia leve ML3-9 (ID. DE SEQ. N°:55), cadeia leve H3B1 (ID. DE SEQ. N°: 56) e cadeia leveB1D2 (ID. DE SEQ. N° : 57).

Descrição Detalhada

Tumores freqüentemente superexpressam receptores defator de crescimento que se ligam a vários ligantes efacilitam o crescimento irrestrito do tumor. Um exemplo detais receptores de fator de crescimento é a família daproteína do Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico(EGFR).

A transdução de sinal através de membros da família daproteína do Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico(EGFR) depende da formação de homodímeros ou heterodímerosdesencadeada por uma ligação de ligante. Essa família dereceptores é composta por quatro proteínas ligadas àmembrana: EGFR, HER2/neu, HER3 e HERO. A superexpressãodessas proteínas foi correlacionada com um prognóstico ruimem diversos tipos de câncer, incluindo, sem limitação,câncer de mama, cólon, ovariano, endometrial, gástrico,pancreático, prostático e das glândulas salivares. Emboravários grupos tenham desenvolvido estratégias para ter comoalvo membros individuais da família da proteína do EGFR(por exemplo, HER2/neu ou EGFR) para inibir o crescimentotumoral, nenhum dos tratamentos provou curar ao final essasformas de câncer.

De acordo com a presente invenção, foram desenvolvidasconstruções de anticorpos inéditas que são capazes de sedirigir simultaneamente a múltiplos membros (ou múltiplossítios em certo membro) da família da proteína do EGFR. Asconstruções de anticorpos tipicamente compreendem umprimeiro anticorpo e um segundo anticorpo, unidos entre si,em que o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo se ligamespecificamente a epitopos diferentes no mesmo membro ou emmembros diferentes da família da proteína do EGFR. Emcertas modalidades, as construções de anticorpobiespecífico são moléculas bispecíficas de cadeia única(por exemplo, cadeia Fv biespecífica única (bs-scFv)) , masas construções não se limitam a essas. Dessa forma, porexemplo, anticorpos inteiros conjugados quimicamente, oufragmentos de anticorpos, também são incluídos dentro doescopo desta invenção. Em geral, quando são aqui descritosanticorpos biespecíficos, será observado que anticorpostriespecíficos ou, mais geralmente, anticorpospoliespecíficos, também são contemplados.

Os anticorpos biespecíficos desta invenção se ligam amembros selecionados da família da proteína do EGFR (porexemplo, EGFR, HER2/neu, HER3, HER4) para evitar asinalização induzida por ligante e/ou para desencadearefeitos citostáticos e/ou citotóxicos. Os anticorposbiespecíficos também podem ser usados para rotularespecificamente células cancerosas, tumores sólidos, esemelhantes e, mais geralmente, para direcionar/liberarespecificamente qualquer efetor conjugado ou de algum outromodo acoplado (por exemplo, radioisótopo, rótulo,citotoxina, fármaco, lipossomo, anticorpo, ácido nucléico,dendrímero etc.) a células cancerosas incluindo, semlimitação, células cancerosas isoladas, célulasmetastáticas, células de tumores sólidos, e semelhantes.

Em certas modalidades preferidas, os anticorposbiespecíficos desta invenção são anticorpos Fv de cadeiaúnica biespecíficos (bs-scFv). Fragmentos de anticorpo Fvde cadeia única são derivados projetados de anticorpos queincluem uma região variável tanto de uma cadeia pesadaquanto de uma cadeia leve, unidas por uma molécula liganteapeptídica, e são potencialmente mais eficazes do queanticorpos IgG não modificados, um vez que seu tamanhoreduzido permite que eles penetrem em tecidos e tumoressólidos mais prontamente do que anticorpos IgG.

Em uma modalidade, os anticorpos biespecíficos destainvenção (por exemplo, as moléculas de anticorpo bs-scFv)compreendem dois domínios que geram duas especificidades deligação distintas. Um primeiro domínio tem especificidadede ligação por um epitopo em um membro da família daproteína do EGFR, e o segundo domínio tem especificidade deligação por um epitopo em um segundo membro da família daproteína do EGFR. Uma molécula de bs-scFv da invençãoexemplar é wALM"; um anticorpo biespecífico que foi criadocom um braço (domínio) que exibe especificidade de ligaçãopor um epitopo em HER2/neu e um segundo braço (domínio) queexibe especificidade de ligação por um epitopo em HER3.

Alternativamente, os anticorpos biespecíficos dainvenção podem ser gerados de tal forma que um domínio temespecificidade de ligação por um epitopo em um membro dafamília da proteína do EGFR e um segundo domínio temespecificidade de ligação por um segundo epitopo distintono mesmo membro da família da proteína do EGFR. Um bs-scFvdesse tipo exemplar é "ALF", que é composto por duasmoléculas de scFV distintas, ambas com especificidade paraHER3.I. Anticorpos que formam os anticorpos biespecíficos oupoliespecíficos desta invenção.

Como indicado acima, os anticorpos biespecíficos oupoliespecíficos desta invenção tipicamente compreendem doisou mais domínios de ligação, pelo menos dois dos quais sãoespecíficos para epitopos diferentes da família da proteínado EGFR. Anticorpos preferidos desta invenção compreendemdomínios específicos para epitopos de EGFR, HER2/neu, HER3e HER4.

Com o uso de abordagens de exibição de fago, foramdesenvolvidos diversos anticorpos de cadeia única que sãoespecíficos para vários epitopos nesses membros da famíliada proteína do EGFR. Esses anticorpos Fv de cadeia únicapodem ser usados como domínios/braços para a construção deum anticorpo biespecífico ou poliespecífico de acordo comesta invenção. São fornecidos vários desses anticorpos,abaixo, na Tabela 2 e nas Figuras 13 e 14. Cada braço(anticorpo) pode ser pareado com um braço diferente paraformar um anticorpo bs-scFv com especificidade de ligaçãopor dois epitopos distintos em membros diferentes dafamília da proteína do EGFR ou um anticorpo bs-scFv comespecificidade de ligação por dois epitopos distintos nomesmo membro da família da proteína do EGFR.

Tabela 2. Anticorpos fv de cadeia única dirigidos contraepitopos da família da proteína do EGFR.

<table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table>

* Seqüências são reveladas em Schier e cols. (1996). J.Mol. Biol., 25 5 (1): 28-43. Veja também Schier e cols.(1995) Iimriunotechnology, 1: 73-81.** Seqüências são fornecidas no Anexo A abaixo;

*** Seqüências também são mostradas nas Figuras 13 e 14.

Os anticorpos biespecíficos ou poliespecificos destainvénção, no entanto, não se limitam ao uso dos anticorposespecíficos enumerados na Tabela 2 e/ou nas Figuras 13 ou14. Na verdade, cada um dos anticorpos listados na Tabela 2e/ou nas Figuras 13 ou 14 identifica um epitopo de ummembro da família da proteína do EGFR, e esses anticorpospodem prontamente ser usados para identificar outrosanticorpos que se ligam aos mesmos epitopos. Dessa forma,em certas modalidades, os anticorpos biespecíficos oupoliespecificos desta invenção compreendem um ou maisdomínios que se ligam especificamente a um epitopo ligadoespecificamente por um anticorpo da Tabela 2 e/ou dasFiguras 13 ou 14 (por exemplo, um anticorpo selecionado dogrupo que consiste em C6.5, C6ML3-9, C6MH3-B1, C6-B1D2, F5,HER3.A5, HER3.F4, HER3.Hl, HER3.H3, HER3.E12, HER3.B12,EGFR.E12, EGFR.ClO, EGFR.B11, EGFR.E8, HER4.B4, HER4.G4,HER4.F4, HER4.A8, HER4.B6, HER4.D4, HER4.D7, HER4.D11,HER4.D12, HER4.E3, HER4.E7, HER4.F8 e HER4.C7).

Tais anticorpos são prontamente identificados porpesquisa de anticorpos inteiros, fragmentos de anticorpos,ou anticorpos de cadeia única quanto à sua habilidade paracompetir com os anticorpos listados na Tabela 2, quanto àsua habilidade para se ligar a uma proteína que compreendeo epitopo-alvo. Em outras palavras, anticorpos candidatospodem ser pesquisados quanto à reatividade cruzada com osanticorpos listados na Tabela 2 e/ou nas Figuras 13 ou 14contra a proteína-alvo na família da proteína do EGFR.

Em uma modalidade preferida, os anticorpos destainvenção se ligam especificamente a um ou mais epitoposreconhecidos por anticorpos listados na Tabela 2 e/ou nasFiguras 13 ou 14. Em outras palavras, anticorposparticularmente preferidos reagem de forma cruzada com umou mais desses anticorpos. Meios para testar a reatividadecruzada são bem conhecidos por aqueles habilitados natécnica (veja, por exemplo, Dowbenko e cols. (1988) J.Viral. 62: 4.703-4.711).

Por exemplo, em certas modalidades, a reatividadecruzada pode ser confirmada fornecendo-se um membro isoladoda família de EGFR (por exemplo, EGFR, HER2/neu, HER3 eHER4 ou um fragmento destes) anexado a um suporte sólido etestando-se a habilidade de um anticorpo de teste paracompetir com um ou mais dos anticorpos listados na Tabela 2pela ligação à proteína-alvo. Dessa forma, podem ser usadosimunoensaios em um formato de ligação competitiva paradeterminações da reatividade cruzada. Por exemplo, em umamodalidade, o polipeptídeo do membro da família de EGFR éimobilizado a um suporte sólido. Os anticorpos a seremtestados (por exemplo, gerados por seleção a partir de umabiblioteca de exibição de fago, ou gerados em umabiblioteca de anticorpos inteiros) são adicionados aoensaio para competir com um ou mais dos anticorpos listadosna Tabela 2 e/ou nas Figuras 13 ou 14 pela ligação aopolipeptídeo imobilizado. É comparada a habilidade dosanticorpos de teste para competir com a ligação dosanticorpos da Tabela 2 e/ou das Figuras 13 ou 14 à proteínaimobilizada. O percentual de reatividade cruzada dasproteínas acima pode então ser calculado com o uso decálculos padronizados. Caso o anticorpo de teste compitacom um ou mais anticorpos da Tabela 2 e/ou das Figuras 13ou 14 e tenha uma afinidade de ligação comparável ou acimade cerca de 1 χ IO"8 Μ, mais preferivelmente acima de 1 χ10"9, ou 1 χ IO"10 ou, mais geralmente, com uma afinidadeigual ou maior do que o anticorpo correspondente (quecompete), por exemplo, da Tabela 2, então o anticorpo éadequado para ser utilizado na presente invenção.

Em uma modalidade particularmente preferida, areatividade cruzada é realizada com o uso de ressonância deplasmônio de superfície em um BIAcore. Em uma célula defluxo BIAcore, a proteína EGFR é acoplada a um chip sensor.Com uma taxa de fluxo típica de 5 l/min, uma titulação de100 nM a 1 M de anticorpo é injetada sobre a superfície dacélula de fluxo por cerca de 5 minutos para determinar umaconcentração de anticorpo que resulte na quase saturação dasuperfície. 0 mapeamento de epitopo ou a reatividadecruzada é então avaliado com o uso de pares de anticorposem concentrações que resultam na quase saturação e pelomenos 100 RU de anticorpo ligado. A quantidade de anticorpoligado é determinada para cada membro de um par, e depoisos dois anticorpos são misturados em conjunto para geraruma concentração final igual à concentração usada para asmedidas dos anticorpos individuais. Anticorpos quereconhecem diferentes epitopos exibem um aumentoessencialmente aditivo na RU ligada quando injetados emconjunto, enquanto anticorpos que reconhecem epitoposidênticos só exibem um aumento mínimo em RU. Em umamodalidade particularmente preferida, anticorpos sãoconsiderados como tendo reação cruzada se, quando"injetados" em conjunto, exibem um aumento essencialmenteaditivo (de preferência um aumento em pelo menos um fatorde cerca de 1,4, mais preferivelmente um aumento em pelomenos um fator de cerca de 1,6 e, principalmente, umaumento em pelo menos um fator de cerca de 1,8 ou 2) .

A reatividade cruzada em epitopos reconhecidos pelosanticorpos listados na Tabela 2 e/ou nas Figuras 13 ou 14pode ser confirmada por várias outras técnicas padronizadas(veja, por exemplo, Geysen e cols. (1987) J. Immuno1. Meth.102: 259-274).

Além disso, vários anticorpos identificados na Tabela2 foram seqüenciados (veja, por exemplo, as Figuras 13 e14) . As seqüências de aminoácidos que compreendem asregiões determinantes de complementaridade (CDRs) são,portanto, conhecidas. Com o uso dessas informações deseqüências, as mesmas . regiões determinantes decomplementaridade ou regiões determinantes decomplementaridade similares podem ser projetadas em outrosanticorpos para a produção de anticorpos quiméricosinteiros e/ou fragmentos de anticorpos, por exemplo, paraassegurar a compatibilidade de espécies, para aumentar ameia-vida sérica, e semelhantes. Diversos métodos degeração de anticorpos quiméricos são conhecidos por aqueleshabilitados na técnica (veja, por exemplo, Patentes U.S.Nos: 5.502.167, 5.500.362, 5.491.088, 5.482.856, 5.472.693,5.354.847, 5.292.867, 5.231.026, 5.204.244, 5.202.238,5.169.939, 5.081.235, 5.075.431 e 4,975,369).

Resumidamente, com a utilização de métodos rotineiros,os anticorpos listados na Tabela 2 podem ser prontamenteusados para gerar ou identificar outros anticorpos (decomprimento total, fragmentos de anticorpos, de cadeiaúnica, e semelhantes) que se ligam ao mesmo epitopo. Damesma forma, os anticorpos listados na Tabela 2 podemprontamente ser utilizados para gerar outros anticorpos quepossuem as mesmas regiões determinantes decomplementaridade (CDRs) ou regiões determinantes decomplementaridade similares.

II. Preparação De Moléculas De Anticorpo Biespecífico:

Os anticorpos dirigidos aos epitopos encontrados emmembros da família da proteína do EGFR (por exemplo, osanticorpos listados na Tabela 2) podem ser usados para apreparação de anticorpos biespecíficos ou poliespecíficosdesta invenção. Os dois (ou mais) anticorpos podem serpreparados com o uso de diversos métodos. Por exemplo, osanticorpos podem ser preparados separadamente (por exemplo,com o uso de síntese protéica química, métodos de expressãorecombinante, tecnologia de hibridoma etc.) e depoisanexados quimicamente uns aos outros, diretamente ouatravés de ligante. Quando ambos os anticorpos foremanticorpos de cadeia única unidos diretamente nos terminaisou através de um ligante peptídico, a molécula biespecíficaou poliespecífica poderá ser sintetizada quimicamente ou,mais preferivelmente, será expressa de forma recombinante.

Meios para se conjugar quimicamente moléculas são bemconhecidos por aqueles habilitados na técnica. Osprocedimentos para se acoplar quimicamente dois anticorpossão diretos. Os polipeptídeos tipicamente contêm váriosgrupos funcionais; por exemplo, grupos de ácido carboxílico(C00H) ou amina livre (-NH2) , que são disponíveis parareação com grupos funcionais adequados no anticorpocorrespondente ou em um ligante.Alternativamente, os anticorpos podem serderivatizados para expor ou anexar grupos funcionaisreativos adicionais. A derivatização pode envolver a adesãode qualquer uma dentre diversas moléculas liganteas, taiscomo aquelas disponíveis por Pierce Chemical Company,Rockford Illinois. Diversos ligantees adequados sãoconhecidos por aqueles habilitados na técnica (veja, porexemplo, Pedido de Patente Européia N0 188.256; PatentesU.S. Nos 4.671.958, 4.659.839, 4.414.148, 4.699.784;4,680,338; 4,569,789; e 4,589,071; e Borlinghaus e cols.(1987) Câncer Res. 47: 4.071-4.075), e ligantees adequadostambém serão descritos abaixo com relação ao acoplamento deefetores para anticorpos biespecíficos.

Em certas modalidades preferidas da invenção, asmoléculas de anticorpo bs-scFv são produzidas por expressãode fragmentos de anticorpos recombinantes produzidos emcélulas hospedeiras. Foram clonados genes das váriasmoléculas de scFv que têm como alvo vários epitopos emmembros da família da proteína do EGFR (veja, por exemplo,Anexo A e Schier e cols. (1996) J. Mol. Biol., (1): 28-43)e pares (ou outras combinações) desses genes scFv podem serligados operacionalmente diretamente ou por meio de umamolécula ligantea. As moléculas de ácido nucléicoresultantes que codificam os fragmentos de anticorpo bs-scFv são inseridas em vetores de expressão, e introduzidasem células hospedeiras. As moléculas de anticorpo bs-scFvresultantes são então isoladas e purificadas pelo sistemade expressão.

Em certas modalidades preferidas da invenção, asmoléculas de anticorpo scFv são pareadas juntamente com umamolécula ligantea inédita projetada para proteger contra adegradação proteolítica das moléculas de anticorpo bs-scFv.Esse ligante tipicamente é desprovido de um sitio declivagem proteolítica e é tipicamente caracterizado porconter aminoácidos primariamente neutros (não carregados) .Uma dessas seqüências liganteas tem a seqüência: Asn SerGly Ala Gly Thr Ser Gly Ser Gly Ala Ser Gly Glu Gly Ser GlySer Lys Leu (ID. DE SEQ. N°: 37).

Os scFv apresentados na Tabela 2 são incorporados emnovos bs-scFv com base nos seguintes fatores: (1) afinidadedescendente por certo alvo, (2) ausência de epitopos comreatividade cruzada (determinada por inibição da ligação eensaios em sanduíche em um BIAcore) , (3) combinações quetêm como alvo pares de membros da família de EGFR que aindanão foram pareados, e (4) inclusão de braços de scFv quelevaram à inibição do crescimento e alteraram a transduçãode sinal quando empregados em outras combinações de bs-scFv.

A pureza das moléculas de anticorpo bs-scFv dainvenção pode ser avaliada com a utilização de métodospadronizados conhecidos por aqueles habilitados na técnica,incluindo, sem limitação, ELISA, imunoistoquímica,cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade,cromatografia de afinidade em metal imobilizado (IMAC),cromatografia de exclusão de tamanho, eletroforese em gelde poliacrilamida (PAGE), western blotting, ressonância deplasmônio de superfície, e espectroscopia de massa.

Com o uso dos anticorpos, seqüências de ácidosnucléicos, e outros ensinamentos aqui apresentados, osanticorpos biespecíficos ou poliespecíficos desta invençãopodem ser expressos de forma recombinante com o uso demétodos rotineiro, tais como aqueles apresentados emSambrook e cols. (198 9) Molecular Cloning, Cold SpringHarbor Laboratory, ou Ausubel e cols. (eds) (1997) CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons N.Y. .Além disso, métodos ilustrativos de produção de anticorposbiespecíficos de cadeia única recombinantes desta invençãoserão apresentados nos Exemplos. Quando forem mencionadosmateriais específicos, será apenas para fins ilustrativos,e não com o objetivo de limitar a invenção.

III. Porções Quiméricas Que Compreendem AnticorposBiespecíficos E/Ou Poliespecíficos.

Em muitas modalidades, os anticorpos biespecíficose/ou poliespecíficos anti-membro da família de EGFR destainvenção são capazes de inibir o crescimento e/ou aproliferação de células cancerosas, sem a utilização denenhum "efetor" adicional; em certas modalidades, osanticorpos biespecíficos e/ou poliespecíficos sãoadicionalmente acoplados a um efetor, formando, desse modo,porções quiméricas que preferencialmente dirigem/liberam oefetor a uma célula que superexpressa o membro ou osmembros da família de EGFR.

Como as proteínas EGFR são freqüentemente encontradassupra-reguladas em células cancerosas, essas proteínaspodem ser exploradas como alvo(s) para a liberaçãoeficiente e específica de um efetor (por exemplo, umamolécula efetora, por exemplo, uma citotoxina, um marcadorradioativo etc.) a várias células cancerosas (por exemplo,células isoladas, células metastáticas, células de tumoressólidos etc.), em particular a células cancerosasepiteliais (por exemplo, células de câncer de mama). Aproteína(s) EGFR-alvo não precisa existir somente emcélulas cancerosas para gerar um alvo eficaz. A expressãodiferencial de EGFR em células cancerosas, comparadas comcélulas saudáveis, é suficiente para fornecer uma vantagemde direcionamento significativa e útil, ou seja, queresulte na liberação preferencial da porção efetora e/ou nacélula-alvo (por exemplo, de câncer).

Em certas modalidades preferidas, os anticorposbiespecíficos ou poliespecíficos desta invenção sãoutilizados em uma estratégia de "pré-direcionamento" (queresulta na formação de uma porção quimérica no sítio-alvoapós administração da porção efetora) ou em uma estratégiade "direcionamento", em que o anticorpo biespecífico e/oupoliespecífico é acoplado a uma molécula efetora antes douso para fornecer uma porção quimérica.

Uma molécula quimérica ou composição quimérica ouporção quimérica refere-se a uma molécula ou composição emque duas ou mais moléculas ou composições que existemseparadamente em seu estado nativo são unidas em conjuntopara formar uma única molécula, porção ou composição quepossui a funcionalidade desejada de seus membrosconstituintes. Tipicamente, uma das moléculas constituintesde porção quimérica é uma "molécula de direcionamento", ouseja, no presente caso, um anticorpo biespecífico oupoliespecíf ico que se liga especificamente a um ou maismembros da família de EGFR.

Outro constituinte da molécula quimérica é um"efetor". A molécula efetora refere-se a uma molécula ougrupo de moléculas que deve ser especificamentetransportada até a célula-alvo (por exemplo, uma célula quesuperexpressa um membro da família de EGFR). A moléculaefetora tipicamente tem uma atividade característica quedeve ser liberada à célula-alvo. Moléculas efetorasincluem, sem limitação, citotoxinas, marcadores,radionuclídeos, ligantes, anticorpos, fármacos, lipossomos,e semelhantes.

Em certas modalidades, o efetor é um marcadordetectável, com marcadores detectáveis preferidos incluindoradionuclídeos. Dentre os radionuclídeos e marcadores úteisnos conjugados de radionuclídeo-quelante (por exemplo,biotina) da presente invenção, emissores gama, emissores depósitrons, emissores de raios-x e emissores defluorescência são adequados para localização, diagnósticoe/ou estadiamento e/ou terapia, enquanto emissores beta ealfa e agentes de captura de elétrons e nêutrons, tais comoboro e urânio, também podem ser usados para terapia.

Os marcadores detectáveis podem ser usados em conjuntocom um detector externo e/ou um detector interno e fornecemum meio de localizar e/ou visualizar eficazmente, porexemplo, células cancerosas que superexpressam um ou maismembros da família de EGFR. Essa detecção/visualização podeser útil em vários contextos, incluindo, sem limitação,quadros pré-operatórios e intra-operatórios. Dessa forma,em certa modalidade, esta invenção está relacionada a ummétodo de detectar e localizar intra-operatoriamentetecidos que possuem marcadores da família de EGFR no corpode um mamífero. Esses métodos tipicamente envolvem aadministração ao mamífero de uma composição que compreende,em uma quantidade suficiente para detecção por um detector(por exemplo, a sonda de detecção gama), um anticorpobiespecífico e/ou poliespecífico desta invenção rotuladocom um marcador detectável (por exemplo, anticorpos anti-MUC-I desta invenção rotulados com um radioisótopo, porexemplo, 161Tb, 123I, 125J^ e semelhantes) e, após permitirque a substância ativa seja captada pelo tecido-alvo e, depreferência, após depuração sangüínea do marcador, submetero mamífero a uma técnica de radioimunodetecção na árearelevante do corpo, por exemplo, com a utilização de umasonda de detecção gama.

O anticorpo biespecífico e/ou anticorpo poliespecíficoligado ao marcador pode ser usado na técnica de cirurgiaradioguiada, em que tecidos relevantes no corpo de umindivíduo podem ser detectados e localizados intra-operatoriamente por meio de um detector, por exemplo, umasonda de detecção gama. O cirurgião pode, intra-operatoriamente, usar essa sonda para encontrar os tecidosnos quais a captação do composto rotulado com umradioisótopo, ou seja, por exemplo, um emissor de fóton debaixa energia, ocorreu.

Além dos marcadores detectáveis, efetores preferidosincluem citotoxinas (por exemplo, exotoxina de Pseudomonas,ricina, abrina, toxina diftérica, e semelhantes) oufármacos ou pró-fármacos citotóxicos, quando então a porçãoquimérica pode atuar como um potente agente de mortecelular que direciona especificamente as citotoxina àscélulas que abrigam o(s) membro(s) da família de EGFR.

Ainda em outras modalidades, o efetor pode incluir umlipossomo que encapsula um fármaco (por exemplo, um fármacoanticâncer, por exemplo, doxirrubicina, vinblastina, taxoletc.), um antígeno que estimula o reconhecimento da célulaligada por componentes do sistema imunológico, um anticorpoque se liga especificamente aos componentes do sistemaimunológico e os direciona à(s) célula(s)-alvo, esemelhantes.

a) A Molécula De Direcionamento Biespecífica OuPoliespecxfica Anti-Membro Da Família De EGFR.

Em modalidades preferidas dos métodos e dascomposições desta invenção, a porção de direcionamento é umanticorpo biespecífico e/ou poliespecífico que se ligaespecificamente a um ou mais membros da família de EGFRaqui descritos. 0 anticorpo biespecífico e/oupoliespecífico pode compreender anticorpos de comprimentototal, fragmento(s) de anticorpos (por exemplo, Fv, Fabetc.) e/ou anticorpos de cadeia única (por exemplo, scFv).

b) Alguns Efetores Preferidos.

1) Composições De Imagens.

Em certas modalidades, as moléculas quiméricas destainvenção podem ser usadas para o direcionamento demarcadores detectáveis a um sítio tumoral. Isso podefacilitar a detecção e/ou localização do tumor. Em certasmodalidades particularmente preferidas, o componente efetorda molécula quimérica é um marcador "radiopaco", porexemplo, um marcador que possa ser facilmente visualizadocom o uso de raios-x. Materiais radiopacos são bemconhecidos por aqueles habilitados na técnica. Os materiaisradiopacos mais comuns incluem sais de iodeto, brometo oude bário. Outros materiais radiopacos também são conhecidose incluem, sem limitação, derivados orgânicos de bismuto(veja, por exemplo, Patente U.S. 5.939.045), poliuretanosradiopacos (veja Patente U.S. 5.346.9810), compostos deorgano-bismuto (veja, por exemplo, Patente U.S. 5.256.334),complexos poliméricos radiopacos de bário (veja, porexemplo, Patente U.S. 4.866.132), e semelhantes.

Os anticorpos biespecíficos e/ou poliespecíficos destainvenção podem ser acoplados diretamente à porçãoradiopaca, ou podem ser anexados a um "pacote" (porexemplo, um quelato, um lipossomo, um microglóbulo depolímero etc.) que carrega ou que contém o materialradiopaco, como descrito abaixo.

Além dos marcadores radiopacos, outros marcadorestambém são adequados para uso nesta invenção. Marcadoresdetectáveis adequados para uso como componente da moléculaefetora das moléculas quiméricas desta invenção incluemqualquer composição detectável por meios espectroscópicos,fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, elétricos,ópticos ou químicos. Marcadores úteis na presente invençãoincluem glóbulos magnéticos (por exemplo, Dynabeads™) ,corantes fluorescentes (por exemplo, isotiocianato defluoresceína, vermelho texas, rodamina, proteína verdefluorescente, e semelhantes), marcadores radioativos (porexemplo, 3H, 125I, 35S, 14C ou 32P) , enzimas (por exemplo,peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina e outroscomumente usados em um ELISA), e marcadores colorimétricos,por exemplo, outro coloidal ou glóbulos coloridos de vidroou de plástico (por exemplo, poliestireno, polipropileno,látex etc.).

Vários marcadores radioativos preferidos incluem, semlimitação, "Tc, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 72As, 111In, 113mIn, 97Ru,62Cu, 641Cu, 52Fe, 52mMn, 51Cr, 186Re, 188Re, 77As, 90Y, 67Cu,169Er, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 198Au, 199Au, 161Tb, 109Pd, 165Dyi149Pm, 151Pm, 153Sm, 157Gd, 159Gd, 166Ho, 172Tm, 169Yb, 175Yb, 177Lu,105Rh e 111Ag.

Meios para a detecção desses marcadores são bemconhecidos por aqueles habilitados na técnica. Dessa forma,por exemplo, marcadores radioativos podem ser detectadoscom o uso de filmes fotográficos, detectores de cintilação,e semelhantes. Marcadores fluorescentes podem serdetectados com o uso de um fotodetector para detectar ailuminação emitida. Marcadores enzimáticos são detectadostipicamente fornecendo-se a enzima com um substrato, edetectando-se o produto de reação produzido pela ação daenzima sobre o substrato, e marcadores colorimétricos sãodetectados simplesmente visualizando-se o marcador colorido.

Em certas modalidades especificas, esta invençãocontempla o uso de imunoconjugados (porções quiméricas)para a detecção de tumores e/ou de outras célulascancerosas. Dessa forma, por exemplo, os anticorposbiespecificos desta invenção podem ser conjugados aradioisótopos emissores gama (por exemplo, Na-22, Cr-51,Co-60, Tc-99, 1-125, 1-131, Cs-137, GA-67, Mo-99) paradetecção com uma câmera gama, a isótopos emissores depósitrons (por exemplo, C-ll, N-13, 0-15, F-18, esemelhantes) para detecção em um instrumento de Tomografiade Emissão de Pósitrons (PET), e a agentes de contrastemetálicos (por exemplo, reagentes contendo Gd, reagentescontendo Eu, e semelhantes) para a criação de imagens porressonância magnética (RMN). Além disso, os anticorposbiespecificos desta invenção podem ser usados emimunoistoquímica tradicional (por exemplo, rótulosfluorescentes, marcadores nanocristais, marcadoresenzimáticos e colorimétricos etc.).

2) Radiossensibilizantes.

Em outra modalidade, o efetor pode ser umradiossensibilizante que intensifica o efeito citotóxico daradiação ionizante (por exemplo, a que pode ser produzidapor uma 60Co ou fonte de raios-x) sobre uma célula. Sãoconhecidos vários agentes radiossensibilizantes queincluem, sem limitação, compostos derivados debenzoporfirina (veja, por exemplo, Patente U.S. 5.945.439),óxidos de 1,2,4-benzotriazina (veja, por exemplo, PatenteU.S. 5.849.738), compostos que contêm certas diaminas(veja, por exemplo, Patente U.S. 5.700.825), BCNT (veja,por exemplo, Patente U.S. 5.872.107), derivadosradiossensibilizantes da amida de ácido nitrobenzóico(veja, por exemplo, Patente U.S. 4.474.814), váriosderivados heterocíclicos (veja, por exemplo, Patente U.S.5.064.849), complexos de platina (veja, por exemplo,Patente U.S. 4.921.963), e semelhantes.

3) Ligantes.

A molécula efetora também pode ser um ligante, um tagde epitopo ou um anticorpo. Ligantes e anticorposparticularmente preferidos são aqueles que se ligam aosmarcadores de superfície em células imunológicas. Moléculasquiméricas que utilizam tais anticorpos como moléculasefetoras atuam como ligantees bifuncionais que estabelecemuma associação entre as células imunológicas que abrigam oparceiro de ligação para o ligante ou anticorpo e ascélulas tumorais que expressam o(s) membro(s) da família deEGFR.

3) Quelatos

Muitas das substâncias farmacêuticas e/ou dosmarcadores radioativos aqui descritos são fornecidos, depreferência, como um quelato, particularmente quando forutilizada uma estratégia de pré-direcionamento. A moléculaquelante é tipicamente acoplada a uma molécula (porexemplo, biotina, avidina, estreptavidina etc.) que se ligaespecificamente a um tag de epitopo anexado a um anticorpobiespecífico e/ou poliespecífico.

Grupos quelantes são bem conhecidos por aqueleshabilitados na técnica. Em certas modalidades, gruposquelantes são derivados de ácido etileno diamina tetra-acético (EDTA), ácido dietileno triamina penta-acético(DTPA), ácido ciclohexil 1,2-diamina tetra-acético (CDTA),ácido etilenoglicol-0,01-bis(2-aminoetil)-Ν,Ν,Ν',N'-tetra-acético (EGTA), ácido N,N-bis(hidroxibenzil)-etilenodiamina-N,N'-diacético (HEED), ácido trietilenotetramina hexa-acético (TTNA), ácido 1,4,7,10tetraazaciclododecano-Ν,Ν',N'1,N11'-tetra-acético (DOTA),ácido hidroxietildiamina triacético (HEDTA), 1,4,8,11-ácido tetra-azaciclotetradecano-N,N1,N11,N111-tetra-acético(TETA), DTPA substituído, EDTA substituído, e semelhantes.

Exemplos de certos quelantes preferidos incluem 2-iminotiolanos e 2-iminotiaciclohexanos não substituídos ousubstituídos, em particular 2-imino-4-mercaptometiltiolano,e SAPS (N-(4-[211At]astatofenetil)succinimato).

Um agente quelante, ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N,N'',N'-tetra-acético (DOTA), é deinteresse particular em função de sua habilidade de quelardiversos metais importantes em termos diagnósticos eterapêuticos, tais como radionuclideos e marcadoresradioativos.

Foram descritos conjugados de DOTA e proteínas, porexemplo, anticorpos. Por exemplo, a Patente U.S. N05.428.156 ensina um método para a conjugação de DOTA aanticorpos e fragmentos de anticorpos. Para a produçãodesses conjugados, um grupo ácido carboxílico de DOTA éconvertido em um éster ativo que pode reagir com um grupoamina ou sulfidril no anticorpo ou fragmento de anticorpo.Lewis e cols. (1994) Bioconjugate Chem. 5: 565-576 descreveum método similar em que um grupo carboxil de DOTA éconvertido em um éster ativo, e o DOTA ativado é misturadocom um anticorpo, ligando o anticorpo ao DOTA por meio dogrupo épsilon-amino de um resíduo de lisina do anticorpo,convertendo, desse modo, um grupo carboxil de DOTA em umaporção amida.

Alternativamente, o agente quelante pode ser acoplado,diretamente ou através de um ligante, a um tagr de epitopoou a uma porção que se liga a um tagr de epitopo. Foramdescritos conjugados de DOTA e biotina (veja, por exemplo,Su (1995) J. Nucl. Med., 36 (5 Suppl) : 154P, que revela aligação de DOTA à biotina por meio de derivados de biotinade cadeia lateral amino disponível, por exemplo, DOTA-LC-biotina ou DOTA-benzil-4-(6-amino-caproamida)-biotina). Yaue cols., WO 95/15335, revelam um método de produção decompostos de nitro-benzil-DOTA que podem ser conjugados àbiotina. O método compreende uma reação de ciclização pormeio da projeção transitória de um grupo hidroxi; atosilação de uma amina; desproteção do grupo hidroxiprotegido transitoriamente; tosilação do grupo hidroxidesprotegido; e ciclização intramolecular do tosilato. Wu ecols. (1992) Nucl. Med Biol., 19(2): 239-244 revelam asíntese de agentes quelantes macrocíclicos para proteínasde marcação radioativa com 111IN e 90Y. Wu e cols.produziram um conjugado marcado de DOTA-biotina paraestudar a estabilidade e a biodistribuição de conjugadoscom avidina, uma proteína-modelo para estudos. Esseconjugado foi feito com a utilização de uma hidrazida debiotina que continha um grupo amino livre para reagir comum derivado DOTA ativado gerado in si tu.

4) Citotoxinas.

Citotoxinas particularmente preferidas incluemexotoxinas de Pseudomonas, toxinas diftéricas, ricina eabrina. A exotoxina de Pseudomonas e a toxina diftérica sãoas mais preferidas.

A exotoxina A de Pseudomonas (PE) é uma proteínamonomérica extremamente ativa (peso molecular de 66 kD) ,secretada por Pseudomonas aeruginosa, que inibe a sínteseprotéica em células eucarióticas através da inativação dofator de alongamento 2 (EF-2) por catalisação de sua ADP-ribosilação (catalisando a transferência da porção ADPribosil de NAD oxidado em EF-2).

A toxina contém três domínios estruturais que atuam deforma coordenada para causar citotoxicidade. 0 domínio Ia(aminoácidos 1-252) medeia a ligação celular. 0 domínio II(aminoácidos 253-364) é responsável pela translocação nocitosol, e o domínio III (aminoácidos 400-613) medeia aribosilação de ADP do fator de alongamento 2, que inativa aproteína e causa a morte celular. A função do domínio Ib(aminoácidos 3 65-399) permanece indefinida, embora umagrande parte dele, aminoácidos 365-380, possa ser eliminadasem perda de citotoxicidade. Veja Siegall e cols. (198 9) J.Biol. Chem. 264: 14.256-14.261.

Onde a molécula de direcionamento (por exemplo, anti-MUC-1) é fundida a PE, uma molécula da PE preferida seráaquela em que o domínio Ia (aminoácidos 1 a 252) foreliminado, e os aminoácidos 365 a 380 tiverem sidoeliminados do domínio Ib. No entanto, todo o domínio Ib euma porção do domínio II (aminoácidos 350 a 394) podem sereliminados, particularmente se as seqüências eliminadasforem substituídas por um peptídeo de ligação, por exemplo,GGGGS (ID. DE SEQ. N°: 11).

Além disso, as moléculas da PE podem ainda sermodificadas com o uso de metagênese sítio-dirigida ou deoutras metodologias conhecidas na técnica, para alterar amolécula para uma aplicação desejada em particular. Tambémpodem ser usados meios para alteração da molécula da PE deforma a não afetar substancialmente as vantagens funcionaisfornecidas pelas moléculas da PE aqui descritas, epretende-se que essas moléculas resultantes sejam aquienglobadas.

Para se maximizar as propriedades citotóxicas de umamolécula da PE preferida, são recomendadas váriasmodificações à molécula. Prefere-se uma seqüência carboxilterminal apropriada para a molécula recombinante paratranslocar a molécula no citosol de células-alvo.Seqüências de aminoácidos constatadas como eficazes incluemREDLK (ID. DE SEQ. N°: 23) (como em PE nativa), REDL (ID.DE SEQ. N°: 24), RDEL (ID. DE SEQ. N°: 25) ou KDEL (ID. DESEQ. N°: 26), repetições dessas ou outras seqüências queagem para manter ou reciclar proteínas no retículoendoplasmático, aqui denominadas "seqüências de retençãoendoplasmática". Veja, por exemplo, Chaudhary e cols.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 308-312 e Seetharam ecols., J. Biol. Chem. 266: 17.376-17.381. Formas de PEpreferidas compreendem a molécula da PE designada PE38QQR(Debinski e cols. Bioconj. Chem., 5: 40 (1994)) e PE4E(veja, por exemplo, Chaudhary e cols. (1995) J. Biol.Chem., 265: 16.306).

Métodos para a clonagem de genes que codificam PEfundida a vários ligantes são bem conhecidos por aqueleshabilitados na técnica (veja, por exemplo, Siegall e cols.(1989) FASEB J., 3: 2.647-2.652; e Chaudhary e cols. (1987)Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84: 4.538-4.542).

Da mesma forma que a PE, a toxina diftérica (DT) mataas células por ADP-ribosilação do fator de alongamento 2,inibindo, desse modo, a síntese protéica. A toxinadiftérica, no entanto, é dividida em duas cadeias, AeB,ligadas por uma ponte dissulfeto. Ao contrário da PE, acadeia B de DT, que se localiza na extremidade carboxil, éresponsável por ligação ao receptor, e a cadeia A, que estápresente na extremidade amino, contém a atividadeenzimática (Uchida e cols.(1972) Science, 175: 901-903;Uchida e cols. (1973) J. Biol. Chem., 248: 3 .838-3. . 844) .

Em uma modalidade preferida, as proteínas de fusão demolécula de direcionamento-toxina diftérica desta invençãopossuem o domínio de ligação ao receptor nativo removidopor truncamento da cadeia B da toxina diftérica. Prefere-separticularmente DT3 88, uma DT na qual a seqüência doterminal carboxil que começa no resíduo 389 é removida(Chaudhary e cols. (1991) Bioch. Biophys. Res. Conwn., 180:545-551). Da mesma forma que as citotoxinas quiméricas dePE, as moléculas de DT podem ser quimicamente conjugadas aoanticorpo MUC-1, mas, em certas modalidades preferidas, amolécula de direcionamento será fundida à toxina diftéricapor meios recombinantes (veja, por exemplo, Williams ecols. (1990) J. Biol. Chem. 265: 11.885-11.889).

5) Outras porções terapêuticas.

Outras moléculas efetoras adequadas incluem agentesfarmacológicos ou sistemas de encapsulação que contêmvários agentes farmacológicos. Dessa forma, a molécula dedirecionamento da molécula quimérica pode ser anexadadiretamente a um fármaco que deve ser liberado diretamenteno tumor. Tais fármacos são bem conhecidos por aqueleshabilitados na técnica e incluem, sem limitação,doxirrubicina, vinblastina, genisteína, uma molécula anti-senso, e semelhantes.

Alternativamente, a molécula efetora pode ser umsistema de encapsulação, por exemplo, um capsídeo viral, umlipossomo ou micela que contém uma composição terapêutica,por exemplo, um fármaco, um ácido nucléico (por exemplo, umácido nucléico anti-senso) ou outra porção terapêutica queseja, de preferência, protegida da exposição direta aosistema circulatório. Meios para a preparação de lipossomosanexados a anticorpos são bem conhecidos por aqueleshabilitados na técnica. Veja, por exemplo, a Patente U.S.N° 4.957.735, Connor e cols. (1985) Pharm. Ther., 28: 341- 365.

c) Anexação Da Molécula De Direcionamento À MoléculaEfetora.

Aqueles habilitados na técnica observarão que umanticorpo biespecífico e/ou poliespecífico desta invenção eas porções efetoras podem tipicamente ser unidos emconjunto em qualquer ordem. Dessa forma, por exemplo,quando a molécula de direcionamento for uma proteína decadeia única, a molécula efetora poderá ser unida a um dosterminais amino ou carboxi da molécula de direcionamento. Oefetor também pode ser unido a uma região interna de umanticorpo biespecífico e/ou poliespecífico, ouinversamente. Da mesma forma, um anticorpo biespecíficoe/ou poliespecífico pode ser unido em uma localizaçãointerna ou a um terminal da molécula efetora. Em qualquercaso, são selecionados pontos de adesão que não interfiramcom as respectivas atividades do anticorpo biespecíficoe/ou poliespecífico ou do efetor.

O anticorpo biespecífico e/ou poliespecífico e amolécula efetora podem ser anexados por qualquer um dentrediversos meios bem conhecidos por aqueles habilitados natécnica. Tipicamente, a molécula efetora é conjugada,diretamente ou através de ligante (espaçador) , ao anticorpobiespecífico. No entanto, quando tanto a molécula efetoraquanto o anticorpo biespecífico forem ambos polipeptídeos,será preferível expressar de forma recombinante a moléculaquimérica como uma proteína de fusão de cadeia única.

1) Conjugação da molécula efetora à molécula dedirecionamento.

Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico e/oupoliespecífico é conjugado quimicamente à molécula efetora(por exemplo, uma citotoxina, um rótulo, um ligante, umfármaco, um anticorpo, um lipossomo etc.). Meios para aconjugação química de moléculas são bem conhecidos poraqueles habilitados na técnica.

O procedimento para a anexação de um agente a umanticorpo ou a outra molécula de direcionamentopolipeptídica irá variar de acordo com a estrutura químicado agente. Polipeptídeos tipicamente contêm diversos gruposfuncionais; por exemplo, grupos ácido carboxílico (COOH) ouamina livre (-NH2), os quais estão disponíveis para reaçãocom um grupo funcional adequado em uma molécula efetorapara ligar o efetor a ele.

Alternativamente, o anticorpo biespecífico e/ou amolécula efetora podem ser derivatizados para expor ouanexar grupos funcionais reativos adicionais. Aderivatização pode envolver a anexação de qualquer umadentre diversas moléculas liganteas, tais como aquelasdisponíveis por Pierce Chemical Company, Rockford Illinois.

Um "ligante", como aqui usado, é uma molécula que éutilizada para unir a molécula de direcionamento à moléculaefetora. 0 ligante é capaz de formar ligações covalentestanto com a molécula de direcionamento quanto com amolécula efetora. Ligantees adequados são bem conhecidospor aqueles habilitados na técnica, e incluem, semlimitação, ligantees de carbono de cadeia linear ouramificada, ligantees heterocíclicos de carbono ouligantees peptídicos. Quando o anticorpo biespecífico e/oupoliespecífico e a molécula efetora forem polipeptídeos, osligantees poderão ser unidos aos aminoácidos constituintesatravés de seus grupos laterais (por exemplo, através deuma ligação dissulfeto à cisteína) . No entanto, em umamodalidade preferida, os ligantees serão unidos aos gruposamino carbono alfa e carboxil dos aminoácidos terminais.

Pode ser usado um ligante bifuncional que possui umgrupo funcional que reage com um grupo em um agenteespecifico, e outro grupo que reage com um anticorpo paraformar o imunoconjugado desejado. Alternativamente, aderivatização pode envolver o tratamento químico doanticorpo biespecifico e/ou poliespecifico, por exemplo, aclivagem de glicol de uma porção de açúcar de um anticorpode glicoproteína com periodato para gerar grupos aldeídolivres. Os grupos aldeído livres no anticorpo podem serreagidos com grupos amina livre ou hidrazina em um agentepara ligar o agente a ele (veja a Patente U.S. N04.671.958). Procedimentos para a geração de grupossulfidril livres no polipeptídeo, tais como anticorpos oufragmentos de anticorpos, também são conhecidos (veja aPatente U.S. N0 4.659.839).

São conhecidos muitos procedimentos e moléculasliganteas para a adesão de vários compostos, incluindoquelatos de radionuclídeo de metal, toxinas e fármacos,proteínas, por exemplo, anticorpos (veja, por exemplo,Pedido de Patente Européia N0 188.256; Patentes U.S. Nos4.671.958, 4.659.839, 4.414.148, 4.699.784, 4.680.338,4.569.789 e 4.589,071; e Borlinghaus e cols. (1987) CâncerRes. 47: 4.071-4.075). Em particular, a produção de váriasimunotoxinas é bem conhecida na técnica, e pode serencontrada, por exemplo, em "Monoclonal Antibody-ToxinCònjugates: Aiming the Magic Bullet", Thorpe e cols.,Monoclonal Antibodies in Clinicai Medicine, Academic Press,pp. 168-190 (1982), Waldmann (1991) Science, 252: 1.657,Patentes U.S. Nos 4.545.985 e 4.894.443.

Em alguns casos, é desejável liberar a moléculaefetora do anticorpo biespecífico e/ou poliespecíficoquando a porção quimérica tiver alcançado seu sítio-alvo.

Portanto, conjugados quiméricos que compreendem ligaçõesque são passíveis de clivagem nas vizinhanças do sítio-alvopodem ser utilizados quando o efetor tiver que ser liberadono sítio-alvo. A clivagem da ligação para a liberação doagente do anticorpo pode ser acelerada por atividadeenzimática ou por condições às quais o imunoconjugado ésubmetido, tanto dentro da célula-alvo quanto nasvizinhanças do sítio-alvo. Quando o sítio-alvo for umtumor, poderá ser utilizado um ligante que seja passível declivagem sob condições presentes no sítio tumoral (porexemplo, quando exposto às enzimas associadas ao tumor oupH ácido).

Diversos ligantees passíveis de clivagem diferentessão conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Veja asPatentes U.S. Nos 4.618.492, 4.542.225 e 4.625.014. Osmecanismos para a liberação de um agente desses gruposligantees incluem, por exemplo, irradiação de uma ligaçãofotolábil e hidrólise catalisada por ácido. A Patente U.S.N° 4.671.958, por exemplo, inclui uma descrição deimunoconjugados que compreendem ligantees que são clivadosno sítio-alvo in vivo pelas enzimas proteolíticas dosistema complemento do paciente. Em função do grande númerode métodos que foram descritos para a adesão de diversoscompostos radiodiagnósticos, compostos radioterapêuticos,fármacos, toxinas e de outros agentes a anticorpos, aqueleshabilitados na técnica serão capazes de determinar ummétodo adequado para a adesão de certo agente a umanticorpo ou a outro polipeptídeo.

2) Conjugação de quelatos.

Em certas modalidades preferidas, o efetor compreendeum quelato que é anexado a um anticorpo ou a um tag deepitopo. 0 anticorpo biespecífico e/ou poliespecíficoabriga um tag de epitopo ou de anticorpo correspondente, deforma que o contato simples do anticorpo biespecífico e/oupoliespecífico ao quelato causa a adesão do anticorpo aoefetor. A etapa de combinação pode ser realizada após aporção ser usada (estratégia pré-direcionamento) ou otecido-alvo pode ser ligado ao anticorpo biespecífico e/oupoliespecífico, antes de o quelato ser liberado. Métodos deprodução de quelatos adequados para o acoplamento a váriasporções de direcionamento são bem conhecidos por aqueleshabilitados na técnica (veja, por exemplo, Patentes U.S.Nos: 6.190.923, 6.187.285, 6.183.721, 6.177.562, 6.159.445,6.153.775, 6.149.890, 6.143.276, 6.143.274, 6.139.819,6.132.764, 6.123.923, 6.123.921, 6.120.768, 6.120.751,6.117.412, 6.106.866, 6.096.290, 6.093.382, 6.090.800,6.090.408, 6.088.613, 6.077.499, 6.075.010, 6.071.494,6.071.490, 6.060.040, 6.056.939, 6.051.207, 6.048.979,6.045.821, 6.045.775, 6.030.840, 6.028.066, 6.022.966,6.022.523, 6.022.522, 6.017.522, 6.015.897, 6.010.682,6.010.681, 6.004.533 e 6.001.329).

3) Produção De Proteínas De Fusão.

Quando o anticorpo biespecífico e/ou poliespecíficoe/ou a molécula efetora forem proteínas de cadeia única erelativamente curtas (ou seja, menores do que cerca de 50aminoácidos), eles poderão ser sintetizados com o uso detécnicas padronizadas de síntese química de peptídeos.Quando ambos os componentes forem relativamente curtos, aporção quimérica poderá ser sintetizada como umpolipeptídeo contíguo único. Alternativamente, o anticorpobiespecífico e/ou poliespecífico e a molécula efetora podemser sintetizados separadamente e depois fundidos porcondensação do terminal amino de uma molécula com oterminal carboxil da outra molécula formando, dessa forma,uma ligação peptídica. Alternativamente, o anticorpobiespecífico e/ou poliespecífico e as moléculas efetoraspodem, cada um deles, ser condensados com uma extremidadede uma molécula peptídica espaçadora formando, dessa forma,uma proteína de fusão contígua.

A síntese de fase sólida na qual o aminoácido doterminal C da seqüência é anexado a um suporte insolúvel,seguido por adição seqüencial dos aminoácidos restantes naseqüência, é o método preferido para a síntese química dospolipeptídeos desta invenção. Técnicas para a síntese defase sólida são descritas por Barany e Merrifield, "Solid-Phase Peptide Synthesis"/ pp. 3-284 em uThe Peptides:Analysis, Synthesis, Biology". Vol. 2: "Special Methods inPeptide Synthesis, Part A.", Merrifield, e cols. J. Am.Chem. Soc., 85: 2.149-2.156 (1963) e Stewart e cols.,"Solid Phase Peptide Synthesis", 2" ed. Pierce Chem. Co.,Rockford, 111. (1984).

Em uma modalidade preferida, em que o anticorpobiespecífico e/ou poliespecífico é um polipeptídeo decadeia única e o efetor é um polipeptídeo, as proteínas defusão quiméricas da presente invenção são sintetizadas coma utilização de metodologia de DNA recombinante.Geralmente, isso envolve a criação de uma seqüência de DNAque codifica a proteína de fusão, a colocação do DNA em umcassete expressão sob controle de um promotor específico, aexpressão da proteína em um hospedeiro, o isolamento daproteína expressa e, se necessário, a renaturação daproteína.

0 DNA que codifica as proteínas de fusão (por exemplo,ALM-PE3 8QQR) desta invenção pode ser preparado por qualquermétodo adequado, incluindo, por exemplo, a clonagem erestrição de seqüências apropriadas ou a síntese químicadireta por métodos como, por exemplo, o método defosfotriéster de Narang e cols. (1979) Meth. Enzymol. 68:90-99; o método de fosfodiéster de Brown e cols. (1979)Meth. Enzymol. 68: 109-151; o método de dietilfosforamiditade Beaucage e cols. (1981) Tetra. Lett., 22: 1.859-1.862; eo método de suporte sólido da Patente U.S. N° 4.458.066.

A síntese química produz um oligonucleotídeo de fitaúnica. Esse pode ser convertido em DNA de fita dupla porhibridização com uma seqüência complementar, ou porpolimerização com uma DNA polimerase com o uso da fitaúnica como modelo. Aqueles habilitados na técnicareconhecerão que, embora a síntese química de DNA se limitea seqüências de cerca de 100 bases, seqüências mais longaspodem ser obtidas pela ligação de seqüências mais curtas.

Alternativamente, podem ser clonadas subseqüências eas subseqüências apropriadas clivadas com o uso de enzimasde restrição adequadas. Os fragmentos podem então serligados para a produção da seqüência de DNA desejada.

Em uma modalidade preferida, o DNA que codifica asproteínas de fusão da presente invenção pode ser clonadocom a utilização de métodos de amplificação de DNA como,por exemplo, a reação em cadeia de polimerase (PCR) . Dessaforma, por exemplo, o ácido nucléico que codifica umanticorpo biespecífico e/ou poliespecífico é amplificadopor PCR, com o uso de um iniciador senso contendo o sítiode restrição para NdeI e um iniciador anti-senso contendo osítio de restrição para HindIII. Isso produz um ácidonucléico que codifica a seqüência do anticorpo biespecíficoe/ou poliespecífico e que possui sítios de restriçãoterminais. Um fragmento de PE38QQR pode ser retirado doplasmídeo pWDMH4 3 8QQR ou do plasmídeo pSGC242FdNl descritopor Debinski e cols. (1994) Int. J. Câncer, 58: 744-748. Aligação do anticorpo biespecífico e/ou poliespecífico e dasseqüências PE3 8QQR e a inserção em um vetor produz um vetorque codifica o anticorpo biespecífico e/ou poliespecíficounido ao amino terminal de PE38QQR (posição 253 a PE) . Asduas moléculas são unidas por uma junção de trêsaminoácidos que consiste em ácido glutâmico, alanina efenilalanina introduzidas pelo sítio de restrição.

Embora as duas moléculas sejam, de preferência,essencialmente unidas diretamente, aqueles habilitados natécnica observarão que as moléculas podem ser separadas porum espaçador peptídico que consiste em um ou maisaminoácidos. Geralmente, o espaçador não terá outraatividade biológica específica que não unir as proteínas oupreservar uma distância mínima ou outro relacionamentoespacial entre elas. No entanto, os aminoácidosconstituintes do espaçador podem ser selecionados de modo ainfluenciar alguma propriedade da molécula, por exemplo,dobra, carga total ou hidrofobicidade.As seqüências de ácidos nucléicos que codificam asproteínas de fusão podem ser expressas em diversas célulashospedeiras, incluindo E. coli, outros hospedeirosbacterianos, de levedura, e várias células eucarióticassuperiores, tais como as linhagens de células COS, CHO eHeLa e linhagens de células de mieloma. 0 gene da proteínarecombinante será ligado operacionalmente às seqüências decontrole de expressão apropriadas para cada hospedeiro.

Para E. coli, isso inclui um promotor como, por exemplo, ospromotores T7, trp ou lambda, um sítio de ligação deribossomo e, de preferência, um sinal de terminação detranscrição. Para células eucarióticas, as seqüências decontrole incluirão um promotor e, de preferência, umintensificador derivado de genes de imunoglobulina, SV4 0,citomegalovírus etc., e uma seqüência de poliadenilação, epodem incluir seqüências de junção doadoras e receptoras.

Os plasmídeos da invenção podem ser transferidos paraa célula hospedeira escolhida por métodos bem conhecidos,tais como transformação de cloreto de cálcio para E. coli,e tratamento de fosfato de cálcio ou eletroporação paracélulas mamíferas. As células transformadas pelosplasmídeos podem ser selecionadas por resistência aantibióticos conferida por genes contidos nos plasmídeos,por exemplo, os genes amp, gpt, neo e hyg.

Uma vez expressadas, as proteínas de fusãorecombinantes podem ser purificadas de acordo comprocedimentos padronizados na técnica, incluindoprecipitação de sulfato de amônio, colunas de afinidade,cromatografia em coluna, eletroforese em gel, e semelhantes(veja, geralmente, R. Scopes (1982) "Protein Purification",Springer-Verlag, Ν.Y.; Deutscher (1990) Methods inEnzymology Vol. 182: "Guide to Protein Purification",Academic Press, Inc. Ν.Y.). Preferem-se composiçõessubstancialmente puras de pelo menos cerca de 90 a 95% dehomogeneidade, e 98 a 99% ou mais de homogeneidade são osmais preferidos para usos farmacêuticos. Uma vezpurificados, parcialmente ou até a homogeneidade, comodesejado, os polipeptídeos podem então ser usadosterapeuticamente.

Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que, apóssíntese química, expressão biológica ou purificação, aproteína de fusão dirigida ao polipeptídeo EGFR podepossuir uma conformação substancialmente diferente do queas conformações nativas dos polipeptídeos constituintes.

Nesse caso, pode ser necessário desnaturar e reduzir opolipeptídeo, e depois fazer com que o polipeptídeo sejadobrado novamente na conformação preferida. Métodos deredução e desnaturação de proteínas e indução do re-dobramento são bem conhecidos por aqueles habilitados natécnica (veja Debinski e cols. (1993) J. Biol. Chem., 268:14.065-14.070; Kreitman e Pastan (1993) Bioconjug. Chem.,4: 581-585; e Buchner, e cols. (1992) Anal. Biochem., 205:263-270).

Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que podemser feitas modificações às proteínas de fusão sem diminuirsua atividade biológica. Podem ser feitas algumasmodificações para facilitar a clonagem, expressão, ouincorporação da molécula de direcionamento em uma proteínade fusão. Tais modificações são bem conhecidas por aqueleshabilitados na técnica, e incluem, por exemplo, a metioninaadicionada ao terminal amino para fornecer um sítio deiniciação, ou aminoácidos adicionais colocados em um dosterminais para criar sítios de restrição localizadosconvenientemente ou códons de terminação.

IV. Usos de moléculas de anticorpo biespecífico e/ouporções quiméricas:

Anticorpos biespecíficos que possuem afinidade pordois antígenos distintos têm amplas aplicações em terapia ediagnóstico. Especificamente, as moléculas de anticorpobiespecífico da invenção (por exemplo, bs-scFv), podem serusadas: (1) para alterar diretamente o crescimento detumores que superexpressam membros da família da proteínado EGFR; (2) em combinação com outros agentes citotóxicos(por exemplo, agentes quimioterápicos, radiação de feixeexterno, radioisótopos direcionados, e outros anticorpos ouinibidores da transdução de sinal); e (3) para recrutardiversos agentes citotóxicos ou células efetoras diferentesdiretamente para células tumorais-alvo que expressammembros da família da proteína do EGFR.

O direcionamento de agentes citotóxicos ou de célulasefetoras a células tumorais específicas que utilizam asmoléculas de anticorpo bs-scFv da invenção fornece umacréscimo da especificidade dirigida a um tumor em funçãoda expressão aumentada desses alvos sobre células tumoraisem relação ao tecido normal. Além disso, os anticorposbiespecíficos podem se ligar a múltiplos receptores oucomponentes receptores entrecruzando, dessa forma,receptores ou componentes receptores produzindo um efeitocitotóxico e/ou citostático. Agentes baseados em anticorposque se ligam a apenas um alvo no tecido normal tipicamentenão apresentarão entrecruzamento dos receptores edesencadearão resultados tóxicos.

Além disso, anticorpos monoespecíficos tipicamenteapresentam uma avidez menor para a célula-alvo. Emcontraste, os anticorpos biespecíficos desta invençãoexibem uma maior avidez para a(s) célula(s)-alvo, o queajuda a estabilizar o complexo anticorpo/alvo, geram umaassociação de longo prazo do anticorpo com a célula e,desse modo, fornecem um acréscimo da especificidade para oagente sobre células tumorais que superexpressam ambos osalvos.

Além disso, a ligação de anticorpos aos membros dafamília da proteína do EGFR freqüentemente desencadeia ainternalização dessas proteínas, o que torna essesanticorpos plataformas eficazes para a liberação detoxinas, fármacos, radioisótopos ou de outros agentescitotóxicos. ALM medeia uma redução na quantidade deHER2/neu e LER3 na superfície de células tumorais,sugerindo um mecanismo de internalização similar. Portanto,a combinação dessas moléculas de bs-scFv com agentescitotóxicos ou outros agentes (efetores), por exemplo, emuma porção quimérica, resultará na liberação eficaz paracélulas que superexpressam ambos os alvos aumentando, dessaforma, a especificidade e a eficácia da terapia. Pelaincorporação de seqüências adicionais (por exemplo, braçosde direcionamento a receptor Fc) que interagem com célulasefetoras, um aumento similar na especificidade dedirecionamento também pode ser incorporado nas estratégiasde tratamento baseadas em células efetoras.

As moléculas de anticorpo biespecífico da invençãotambém podem ser usadas em terapia gênica para odirecionamento direto e a internalização de ácidosnucléicos que codificam agentes terapêuticos (por exemplo,exotoxina de pseudomonas, toxina diftérica, vários genessupressores de tumores, vários marcadores etc.). Alémdisso, os anticorpos biespecificos podem ser conjugados,por exemplo, por meio de um quelato, a porções citotóxicasradioativadas (por exemplo, 211At) , a agentesintensificadores da radiação e a vários marcadoresdetectáveis (por exemplo, marcadores radiopacos). Alémdisso, as moléculas de anticorpo biespecífico podem seracopladas a lipídeos, lipossomos, dendrimeros esemelhantes. Os lipídeos, lipossomos e dendrimeros podem secombinar e/ou encapsular várias porções terapêuticas (porexemplo, fármacos anticâncer, incluindo, sem limitação,agentes alquilantes tais como busulfan, clorambucil, cis-platina, cianomorfolinodoxorrubicina etc., agentesantimitóticos, tais como alocolchicina, colchicina, taxol,vinblastina, vincristina, e semelhantes, inibidores datopoisomerase I, tais como camptotecina, aminocamptotecina,e semelhantes, inibidores da topoisomerase II, tais comodoxorrubicina, amonafida, daunorrubicina,desoxidoxorrubicina, mitoxantrona, e semelhantes,antimetabólitos de RNA/DNA, tais como acivicina, ftorafur,metotrexato, trimetrexato, e semelhantes; antimetabólitosde DNA7 tais como as 2' -desoxi-5-f luoruridina,ciclocitidina, guanazol, e semelhantes) . Lipídeos,lipossomos e dendrimeros também podem formar complexos comsubstâncias terapêuticas protéicas, ácidos nucléicos quecodificam, por exemplo, porções terapêuticas, esemelhantes.

Quando usados como um componente de direcionamento deuma porção quimérica, como descrito acima, os anticorposbiespecíficos e/ou poliespecíficos desta invençãopreferencialmente se dirigem a/liberam o efetor associado àcélula(s)-alvo que expressam as proteínas EGFR-alvo.Aumentando-se a associação (por exemplo, duração de contatoou quantidade de contato) do efetor com a célula (emcontato ou íntima proximidade), os anticorpos destainvenção aumentam a probabilidade de que o efetor sejainternalizado na célula e/ou de que exerça sua atividadecaracterística naquela célula.

Dessa forma, por exemplo, os lipossomos direcionadosao anticorpo biespecífico ou poliespecífico ou outrasvesículas terapêuticas (lipossomos, vírus etc.) exibemexposição aumentada (duração/concentração) aos tumores-alvo. Em uma modalidade exemplar, lipossomos podem serguarnecidos pelas moléculas de anticorpo bs-scFv dainvenção para facilitar o direcionamento com especificidadetumoral. Agentes anticâncer, por exemplo, agentesquimioterápicos, anticorpos, anti-senso moléculas e/ouradioisótopos, podem ser encapsulados nos lipossomos assimmodificados.

Em outra modalidade, as moléculas do anticorpobiespecífico ou poliespecífico (por exemplo, anticorpo bs-scFv) podem ser usadas para dirigir vetores de terapiagênica, incluindo, sem limitação, vírus modificados, àscélulas que expressam ambos os antígenos-alvo. Vírus tambémpodem ser utilizados para liberar os genes para essasmoléculas de anticorpo bs-scFv às células tumorais ondepoderiam ser produzidos e secretados no microambientecelular ou, através da adição de seqüências intracelularesde direcionamento adicionais, eles seriam transformados emintra.bod.ies que se localizam em compartimentos celularesespecíficos e knockout a expressão de seus alvos.

Além disso, as moléculas de anticorpo biespecífico oupoliespecífico (por exemplo, anticorpo bs-scFv) da invençãopodem ser usadas para detectar vantajosamente a expressãoaberrante de membros da família da proteína do EGFR. Taldetecção pode levar a um diagnóstico precoce de cânceresassociados ao crescimento tumoral aberrante facilitado poressas proteínas da superfície celular. Em geral, a detecçãode formação de imunocomplexo é bem conhecida na técnica epode ser obtida através da aplicação de várias abordagens.

Esses métodos são geralmente baseados na detecção de umrótulo ou marcador, por exemplo, quaisquer rótulos oumarcadores radioativos, fluorescentes, biológicos ouenzimáticos de uso padrão na técnica. As Patentes U.S.relacionadas ao uso de tais marcadores incluem PatentesU.S. Nos 3.817.837, 3.850.752, 3.939.350, 3.996.345,4.277.437, 4.275.149 e 4.366.241. Evidentemente, podem serobtidas vantagens adicionais através do uso de um ligantede ligação secundário como um segundo anticorpo ou umarranjo de ligação de ligante de biotina/avidina, como éconhecido na técnica.

V. Administração de moléculas de anticorpo bs-scFv:

A) Formulações farmacêuticas.

Anticorpos biespecíficos ou moléculas de anticorpo bs-scFv ou porções quiméricas, como aqui descritas, incluemcomposições de fármaco a granel úteis na fabricação decomposições não farmacêuticas (por exemplo, composiçõesimpuras ou não estéreis) e composições farmacêuticas (ouseja, composições que são adequadas para administração a umindivíduo ou paciente, ou seja, um indivíduo humano ou nãohumano) que podem ser usadas diretamente e/ou na preparaçãode formas de dosagem unitária. Em certas modalidades, taiscomposições compreendem uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um ou mais agentes terapêuticos (por exemplo,anticorpos biespecíficos e/ou poliespecíficos e/ou porçõesquiméricas que compreendem tais anticorpos) e um veículofarmaceuticamente aceitável.

Como indicado acima, os agentes desta invenção podemser usados em uma ampla variedade de contextos incluindo,sem limitação, a detecção e/ou formação de imagens detumores ou células cancerosas, inibição do crescimentotumoral e/ou do crescimento e/ou proliferação de célulascancerosas, e semelhantes. Um ou mais anticorposbiespecíficos e/ou anticorpos biespecíficos funcionalizadose/ou porções quiméricas desta invenção podem seradministrados por injeção, ou seja, por via intravenosa,intramuscular, intracutânea, subcutânea, intraduodenal ouintraperitoneal. Além disso, em certas modalidades, oscompostos também podem ser administrados por inalação, porexemplo, por via intranasal. Adicionalmente, certoscompostos podem ser administrados por via oral outransdérmica.

Em uma modalidade específica, o termo"farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por umórgão regulador do governo federal ou estadual na "U.S.Pharmacopeia" ou em outra farmacopéia geralmentereconhecida para uso em animais e, mais particularmente, emseres humanos, ou adequado para administração a um animalou ser humano. O termo "transportador" refere-se a umdiluente, adjuvante (por exemplo, adjuvante de Freund(completo e incompleto)), excipiente ou veículo com o quala substância terapêutica é administrada. Tais veículosfarmacêuticos podem ser líquidos estéreis, por exemplo,água e óleos, incluindo aqueles derivados de petróleo, deorigem animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo deamendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim esemelhantes. A água é um veículo preferido quando acomposição farmacêutica for administrada por viaintravenosa. Soluções salinas e soluções aquosas dedextrose e glicerol também podem ser empregadas comoveículos líquidos, particularmente para soluçõesinjetáveis. Excipientes farmacêuticos adequados incluemamido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz,farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearatode glicerol, talco, cloreto de sódio, leite em pódesnatado, glicerol, propileno, glicol, água, etanol esemelhantes. A composição, se desejado, também pode conterquantidades menores de agentes umidificantes ouemulsificantes, ou agentes de tamponamento do pH. Essascomposições podem assumir a forma de soluções, suspensões,emulsão, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulaçõesde liberação sustentada e semelhantes.

Geralmente, os ingredientes das composições dainvenção são fornecidos separadamente ou misturados emconjunto na forma de dosagem unitária, por exemplo, como umpó seco liofilizado ou concentrado livre de água em umrecipiente hermeticamente lacrado, por exemplo, uma ampolaou sachê que indica a quantidade de agente ativo. Quando acomposição for administrada por infusão, ela poderá serapresentada com um frasco de infusão que contém água degrau farmacêutico ou soro fisiológico estéreis. Quando acomposição for administrada por injeção, uma ampola de águaestéril para injeção ou de soro fisiológico poderá serfornecida, de forma que os ingredientes possam sermisturados antes da administração.

As composições da invenção podem ser fornecidas emforma neutra ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveisincluem aqueles formados com ânions, por exemplo, aquelesderivados dos ácidos clorídrico, fosfórico, acético,oxálico, tartárico etc., e aqueles formados com cátions,por exemplo, aqueles derivados de hidróxidos de sódio,potássio, amônio, cálcio, férrico, isopropilamina,trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína etc.

Composições farmacêuticas que compreendem osanticorpos biespecíficos e/ou os anticorpos biespecíficosfuncionalizados e/ou porções quiméricas desta invençãopodem ser fabricados através de processos convencionais demistura, dissolução, granulação, produção de drágeas,trituração, emulsificação, encapsulação, captura ouliofilização. As composições farmacêuticas podem serformuladas de forma convencional com o uso de um ou maisveículos, diluentes, excipientes ou auxiliaresfisiologicamente aceitáveis que facilitam o processamentodas moléculas em preparações que podem ser usadasfarmaceuticamente. A formulação adequada depende da via deadministração escolhida.Para administração tópica ou transdérmica, osanticorpos biespecíficos e/ou os anticorpos biespecíficosfuncionalizados e/ou porções quiméricas desta invençãopodem ser formulados como soluções, géis, pomadas, cremes,loção, emulsão, suspensões etc., como são bem conhecidos natécnica. Formulações sistêmicas incluem aquelas projetadasà administração por injeção, por exemplo, injeçãosubcutânea, intravenosa, intramuscular, intratecal ouintraperitoneal, bem como aquelas projetadas àadministração transdérmica, transmucosa, por inalação, oralou pulmonar.

Para injeção, os anticorpos biespecíficos e/ouanticorpos biespecíficos funcionalizados e/ou porçõesquiméricas desta invenção podem ser formulados em soluçõesaquosas, de preferência em tampões fisiologicamentecompatíveis, tais como solução de Hanks, solução de Ringerou tampão de soro fisiológico. A solução pode conteragentes de formulação, tais como agentes de suspensão,estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente,composições que compreendem os agentes quelantes de ferropodem estar na forma de pó para constituição com um veículoadequado, por exemplo, água estéril livre de pirogênio,antes do uso.

Para administração transmucosa, são usados naformulação penetrantes adequados para a barreira a serpermeada. Tais penetrantes são geralmente conhecidos natécnica.

Para administração oral, os anticorpos biespecíficose/ou os anticorpos biespecíficos funcionalizados e/ouporções quiméricas desta invenção podem ser prontamenteformulados pela combinação do(s) agente(s) com veículosfarmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica.

Tais veículos permitem que o(s) agente(s) seja formuladocomo comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos,géis, xaropes, caldos, suspensões e semelhantes, paraingestão oral pelo paciente a ser tratado. Para formulaçõesorais sólidas, por exemplo, pós, cápsulas e comprimidos,excipientes adequados incluem enchimentos, tais comoaçúcares, por exemplo, lactose, sacarose, manitol esorbitol; preparações de celulose, tais como amido demilho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata,gelatina, goma tragacanto, metil celulose,hidroxipropilmetil-celulose, carboximetilcelulose sódicae/ou polivinilpirrolidona (PVP); agentes de granulação; eagentes ligantes. Se desejado, agentes de desintegraçãopodem ser adicionados, tais como a polivinilpirrolidonaentrecruzada, ágar ou ácido algínico ou um sal deste, porexemplo, alginato de sódio.

Se desejado, as formas sólidas de dosagem podem terrevestimento de açúcar ou revestimento entérico com o usode técnicas padronizadas.

Para preparações orais líquidas como, por exemplo,suspensões, elixires e soluções, veículos, excipientes oudiluentes adequados incluem água, glicóis, óleos, álcooisetc. Adicionalmente, agentes flavorizantes, conservantes,agentes corantes e semelhantes podem ser incluídos.

Para administração bucal, os agentes quelantes deferro podem assumir a forma de comprimidos, pílulas etc.formulados de forma convencional.

Para administração por inalação, anticorposbiespecíficos e/ou anticorpos biespecíficos funcionalizadose/ou porções quiméricas desta invenção são liberadosconvenientemente na forma de um spray de aerossol porembalagens pressurizadas ou por um nebulizador, com o usode um propelente adequado, por exemplo,diclorodifluormetano, triclorofluormetano,diclorotetrafluoretano, dióxido de carbono ou outro gásadequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade dedosagem pode ser determinada colocando-se uma válvula paraliberar uma quantidade metrificada. Cápsulas e cartuchos degelatina para uso em um inalador ou insuflador podem serformulados contendo uma mistura em pó dos quelantes agentesde ferro e uma base de pó adequada, por exemplo, Iactose ouamido.

Os anticorpos biespecíficos e/ou os anticorposbiespecíficos funcionalizados e/ou porções quiméricas destainvenção também podem ser formulados em composições retaisou vaginais, tais como supositórios ou enemas de retenção,por exemplo, contendo bases de supositório convencionais,por exemplo, manteiga de cacau ou outros glicerídeos.

Além das formulações descritas previamente, osanticorpos biespecíficos e/ou anticorpos biespecíficosfuncionalizados e/ou porções quiméricas desta invençãotambém podem ser formulados como uma preparação dedepósito. Essas formulações de ação longa podem seradministradas por implantação (por exemplo, por viasubcutânea ou intramuscular) ou por injeção intramuscular.

Dessa forma, por exemplo, o(s) agente(s) desta invençãopode ser formulado com materiais poliméricos ouhidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em umóleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou comoderivados moderadamente solúveis, por exemplo, como um salmoderadamente solúvel.

Outros sistemas de liberação farmacêutica também podemser empregados. Lipossomos e emulsões são exemplos bemconhecidos de veículos de liberação que podem ser usadospara liberar os anticorpos biespecificos e/ou os anticorposbiespecíficos funcionalizados e/ou porções quiméricas destainvenção. Certos solventes orgânicos como, por exemplo,dimetilsulfóxido, também podem ser empregados, emboranormalmente à custa de uma toxicidade maior.Adicionalmente, os anticorpos biespecíficos e/ou anticorposbiespecíficos funcionalizados e/ou porções quiméricas destainvenção podem ser liberados com o uso de um sistema deliberação sustentada, por exemplo, matrizes semipermeáveisde polímeros sólidos que contêm o agente terapêutico.Vários materiais de liberação sustentada foramestabelecidos e são bem conhecidos por aqueles habilitadosna técnica. Cápsulas de liberação sustentada podem,dependendo de sua natureza química, liberar o(s) agente(s)ativo por alguns dias, algumas semanas ou por mais de 100dias. Dependendo da natureza química e da estabilidadebiológica do(s) agente(s), podem ser empregadas estratégiasadicionais para estabilização.

Como os anticorpos biespecíficos e/ou os anticorposbiespecíficos funcionalizados e/ou porções quiméricas destainvenção podem conter cadeias laterais ou terminais comcarga, eles podem ser incluídos em qualquer uma dasformulações acima descritas com os ácidos ou bases livresou como sais farmaceuticamente aceitáveis. Saisfarmaceuticamente aceitáveis são aqueles sais quesubstancialmente retêm a atividade biológica das baseslivres e que são preparados por reação com ácidosinorgânicos. Sais farmacêuticos tendem a ser mais solúveisem solventes aquosos e outros solventes próticos do que nasformas de base livre correspondente.

B) Dosagens eficazes.

Os anticorpos biespecificos e/ou anticorposbiespecíficos funcionalizados e/ou porções quiméricas destainvenção serão usados geralmente em uma quantidade eficazpara se obter a finalidade desejada (por exemplo, paracriar imagens de um tumor ou de uma célula cancerosa, parainibir o crescimento e/ou a proliferação de célulascancerosas etc.). Em certas modalidades preferidas, osanticorpos biespecificos e/ou os anticorpos biespecificosfuncionalizados e/ou porções quiméricas utilizados nosmétodos desta invenção são administrados em uma dose queseja eficaz para inibir parcial ou totalmente aproliferação e/ou o crescimento celular, ou para permitir avisualização de uma célula cancerosa ou de um tumorcaracterizado por superexpressão de uma proteína da famíliade EGFR. Em certas modalidades, são selecionadas dosagensque inibem o crescimento e/ou a proliferação de célulascancerosas com nível de confiança de 90%, maispreferivelmente 95% e, principalmente, 98% ou 99%.

Quantidades eficazes preferidas são aquelas que reduzem ouevitam o crescimento tumoral ou que facilitam a detecçãoe/ou visualização de células cancerosas. Com relação aosinibidores do crescimento e da proliferação celulares, oscompostos também podem ser usados profilaticamente nosmesmos níveis de dose.

Tipicamente, anticorpos biespecíficos e/ou anticorposbiespecíficos funcionalizados e/ou porções quiméricas destainvenção, ou composições farmacêuticas destes, sãoadministrados ou aplicados em uma quantidadeterapeuticamente eficaz. Uma quantidade terapeuticamenteeficaz é uma quantidade eficaz para reduzir ou evitar osurgimento ou a progressão (por exemplo, o crescimento e/oua proliferação) de uma célula cancerosa e/ou de um tumor. Adeterminação de uma quantidade terapeuticamente eficaz estádentro das capacidades daqueles habilitados na técnica,especialmente à luz da apresentação detalhada aquiapresentada.

Para administração sistêmica, uma doseterapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente apartir de ensaios in vitro. Por exemplo, uma dose pode serformulada em modelos animais para a obtenção de umintervalo de concentração circulante que inclui a IC50determinada em cultura de células. Essas informações podemser usadas para determinar com mais precisão doses úteis emseres humanos.

Dosagens iniciais também podem ser estimadas a partirde dados in vivo, por exemplo, modelos animais, com o usode metodologias conhecidas por aqueles habilitados natécnica. Aqueles habilitados na técnica podem prontamenteotimizar a administração a seres humanos com base em dadosem animais.

A quantidade e o intervalo da dosagem podem serajustados individualmente para gerar níveis plasmáticos dosinibidores que sejam suficientes para manter o efeitoterapêutico.

Dosagens para substâncias terapêuticas típicas sãoconhecidas por aqueles habilitados na técnica. Além disso,tais dosagens são tipicamente dosagens recomendadas, epodem ser ajustadas, dependendo do contexto terapêuticoespecífico, da tolerância do paciente etc. Podem seradministradas administrações únicas ou múltiplas dascomposições, dependendo da dosagem e da freqüência, comofor necessário e tolerado pelo paciente.

Em certas modalidades, uma dosagem inicial de cerca de1 pg, de preferência de cerca de 1 mg a cerca de 1.000 mgpor quilograma diariamente, será eficaz. Uma faixa dedosagem diária de cerca de 5 a cerca de 75 mg é preferida.

As dosagens, no entanto, podem variar, dependendo dasnecessidades do paciente, da gravidade da condição tratadae do composto empregado. A determinação da dosagemapropriada para uma situação específica faz parte dosconhecimentos da técnica. Geralmente, o tratamento éiniciado com dosagens menores que são menores do que a doseótima do composto. Portanto, a dosagem é aumentada porpequenos incrementos, até que o efeito máximo sob ascircunstâncias seja alcançado. Por conveniência, a dosediária total pode ser dividida e administrada em porçõesdurante o dia, se desejado. Dosagens típicas serão de cercade 0,1 a cerca de 500 mg/kg, e idealmente cerca de 25 acerca de 250 mg/kg.

No caso de administração local ou captação seletiva, aconcentração local eficaz dos anticorpos biespecíficos e/ouconcentração plasmática. Aqueles habilitados na técnicaserão capazes de otimizar dosagens locais terapeuticamenteeficazes, sem experimentação desnecessária. A quantidade deanticorpo e/ou da porção quimérica dependerá,evidentemente, do indivíduo tratado, do peso do indivíduo,da gravidade da doença, da forma de administração e daavaliação do médico responsável pela prescrição.

A terapia pode ser repetida intermitentemente. Emcertas modalidades, a preparação farmacêutica quecompreende as moléculas de anticorpo biespecífico pode seradministrada em intervalos adequados, por exemplo, pelomenos duas vezes ao dia ou mais, até que os sintomaspatológicos sejam reduzidos ou aliviados, quando então adosagem pode ser reduzida a um nível de manutenção. 0intervalo apropriado em um caso específico dependerianormalmente da condição do paciente. A terapia pode serfornecida isoladamente ou em combinação com outros fármacose/ou radioterapia e/ou procedimentos cirúrgicos.C) Toxicidade.

De preferência, uma dose terapeuticamente eficaz dosanticorpos biespecíficos e/ou dos anticorpos biespecíficosfuncionalizados e/ou das porções quiméricas desta invençãoaqui descritos fornecerá benefício terapêutico, sem causartoxicidade substancial.

A toxicidade dos agentes aqui descritos pode serdeterminada por procedimentos farmacêuticos padronizados emculturas de células ou animais experimentais, por exemplo,pela determinação da LD50 (a dose letal para 50% dapopulação) ou da LDioo (a· dose letal para 100% dapopulação). A proporção de dose entre o efeito tóxico eterapêutico é o índice terapêutico. Agentes que exibemaltos índices terapêuticos são preferidos. Os dados obtidospor ensaios de cultura de células e estudos animais podemser usados na formulação de uma faixa de dosagem que nãoseja tóxica para uso em seres humanos. A dosagem dosanticorpos biespecíficos e/ou dos anticorpos biespecificosfuncionalizados e/ou das porções quiméricas desta invençãopreferivelmente se situa em um intervalo de concentraçõescirculantes que incluem a dose eficaz com pouca ou nenhumatoxicidade. A dosagem pode variar dentro desse intervalo,dependendo da forma de dosagem empregada e da via deadministração utilizada. A formulação, a via deadministração e a dosagem exatas podem ser escolhidas pelomédico do paciente de acordo com a condição do paciente(veja, por exemplo, Fingi e cols. (1975) Em: "ThePharmacological Basis of Therapeutics", Capítulo 1, página 1).

VI. Kits.

A presente invenção ainda engloba kits para uso nadetecção de células que expressam ou superexpressam membrosda família da proteína do EGFR in vivo e/ou em amostrasbiológicas. Também são fornecidos kits para a inibição docrescimento e/ou da proliferação de células que expressamou superexpressam membros da família do fator decrescimento epidérmico (por exemplo, células cancerosas).

Em certas modalidades, os kits compreendem um ou maisanticorpos biespecíficos e/ou poliespecíficos destainvenção, específicos por pelo menos dois epitopos emmembros da família da proteína do EGFR. Em certasmodalidades preferidas, os anticorpos são anticorpos scFvbiespecíficos. Dependendo do uso, os anticorpos podem serfuncionalizados com ligantees e/ou quelantes para oacoplamento a um efetor (por exemplo, uma porçãoradioativa, um lipossomo, uma citotoxina, outro anticorpoetc.), como aqui descrito.

Em certas modalidades, os kits podem compreender, porexemplo, as moléculas de anticorpo bs-scFv da invençãoespecificas para membros da família da proteína do EGFR,além de tampões e outras composições a serem usadas paradetecção das moléculas de anticorpo bs-scFv.

Os kits também incluem materiais de orientação queensinam o uso dos anticorpos para detecção, por exemplo, decélulas cancerosas, e/ou que ensinam a combinação dosanticorpos com reagentes de funcionalização, ou que ensinamo uso de anticorpos funcionalizados para a criação deimagens e/ou aplicações terapêuticas. Em certasmodalidades, o anticorpo é fornecido funcionalizado com umligante e/ou um quelante (em um recipiente) juntamente comum ou mais efetores, por exemplo, citotoxinas, marcadoresradioativos (em um segundo recipiente) , de tal forma que osdois componentes possam ser administrados separadamente(por exemplo, em abordagens de pré-direcionamento) ou detal forma que os dois componentes possam ser administradosimediatamente antes do uso.

Certos materiais de orientação fornecerão um regime dedosagem recomendado, contra-indicações, e semelhantes.

Embora os materiais de orientação tipicamente compreendammateriais escritos ou impressos, eles não se limitam aesses. Qualquer meio capaz de estocar tais instruções ecomunicá-las a um usuário final é contemplado por estainvenção. Tais meios incluem, sem limitação, meioseletrônicos de estocagem (por exemplo, discos magnéticos,fitas, cartuchos, chips), meios ópticos (por exemplo, CD-ROM) , e semelhantes. Tais meios podem incluir endereços desítios da Internet que possam fornecer as instruçõesnecessárias.

Exemplos

Os exemplos a seguir são apresentados para ilustrar,mas não limitar, a invenção reivindicada.

Exemplo 1

Preparação de moléculas de anticorpo Bs-Scfv

A superexpressão de EGFR e HER2/neu foi correlacionadaa um prognóstico ruim em muitos tumores sólidos. Anticorposque perturbem a sinalização através desses receptores, taiscomo Herceptina7 (anti-HER2) e C225 (anti-EGFR) ,demonstraram utilidade significativa no tratamento docâncer. A transdução de sinal através de membros da famíliade EGFR (EGFR, Her-2/neu, Her3 e Her4) depende da formaçãode homodímeros, heterodímeros ou multímeros heterogêneosdesses receptores desencadeada pela ligação de ligante.Foram geradas moléculas de anticorpo scFv biespecífico quese encaixam a múltiplos pares de epitopos dessas proteínasreceptoras, como aqui descrito a seguir, para uso naprevenção da formação desses complexos de sinalização emcélulas tumorais cancerosas.

I. Materiais e métodos:

Os materiais e métodos a seguir são fornecidos parafacilitar a prática da presente invenção:

A. Clonagem:

Todos os genes que codificam moléculas de anticorpo decadeia única Fv (scFv) específico para os diferentesmembros da família de EGFR (EGFR, HER2/neu, HER3, HER4)foram obtidos pelo Dr. Jim Marks (Universidade daCalifórnia, São Francisco). Os genes scFv foram isolados degrandes bibliotecas de scFv humano naive. Os genes scFvespecíficos para as proteínas EGFR foram isolados porseleção contra os domínios extracelulares dessas proteínas.

Todos os genes scFv foram fornecidos como inserções em umvetor pUC119myc/his, entre os sítios de restrição NcoI eNotI. As seqüências para esses braços são apresentadas noAnexo A (IDS. DE SEQ. Nos: 1-10, 19 e 21).

1. Construção de molécula ligantea de 20 aminoácidos:

A degradação proteolítica das moléculas de anticorpobs-scFv em circulação pode limitar sua eficácia. Dessaforma, foi projetado e sintetizado um ligante de 20aminoácidos inédito desprovido de todos os sítiosproteolíticos conhecidos. Os aminoácidos empregados naconstrução do ligante foram selecionados para seremprimariamente neutros (sem carga, hidrofóbicos ouhidrofílicos) para facilitar o transporte eficiente daproteína para dentro do espaço periplasmático bacteriano.Foram sintetizados os dois iniciadores a seguir quecodificam a nova molécula ligantea:

LW583 (5 =-AAT TCA GGT GCT GGT ACT TCA GGT TCA GGT GCT TCAGGT GAA GGT TCA GGT TCA A- 3 = , ID. DE SEQ. N°: 12); e LW584(5=-AGC TTT GAA CCT GAA CCT TCA CCT GAA GCA CCT GAA CCT GAAGTA CCA GCA CCT G- 3 = , ID. DE SEQ. N°: 13).

A hibridização desses oligonucleotídeos formou umligante com extremidades "pegajosas" com extremidades EcoRIe HindIII digeridas. Esse produto foi inserido no vetorpET20b(+) previamente digerido com EcoRI e HindIII. 0 DNAde plasmídeo foi gerado a partir de E. coli DH5atransformada com o uso de um kit disponível comercialmentepara isolamento e purificação de plasmídeo de DNA (Qiagenou Gibco BRL Co.), e foi subseqüentemente denominado"pET20b(+)/Ligante". A molécula ligantea é codificada pelaseguinte seqüência de ácidos nucléicos: 51-AAT TCA GGT GCTGGT ACT TCA GGT TCA GGT GCT TCA GGT GAA GGT TCA GGT TCA AAGCTA->3 (ID. DE SEQ. N°: 14), e a molécula ligantearesultante tem a seguinte seqüência de aminoácidos: NSG AGTSGS GAS GEG SGS KL (ID. DE SEQ. N°: 11).

2. Clonagem de gene anti-HERS em vetorpET2Ob(+)/Ligante:

O gene que codifica a molécula de anticorpo scFv anti-HER3, A5, foi amplificado a partir do plasmídeo A5-pUC119myc/his com os dois iniciadores a seguir: LW687 (5=-CGA CCA TGG CCC AGG TGC AGC TGG TGC AG- 3', ID. DE SEQ. N°:15) ; e LW688 (5 = -CGA ATT CAC CTA GGA CGG TCA GCT TGG-3 =,ID. DE SEQ. N0: 16).

Tanto o produto amplificado quanto o vetor,pET20b(+)/Ligante, foram digeridos com enzimas NcoI eEcoRI, ligados e transformados em E. coli DH5a competentepara a produção de DNA de plasmídeo. As enzimasselecionadas direcionaram o gene A5 acima do ligante. 0novo plasmídeo, denominado "pET20b( + )A5/Ligante" , foi entãoisolado e purificado.

3. Clonagem do gene a.nti-HER2/neu no vetorpET20b(+)A5/Ligante:

O gene que codifica a molécula do anticorpo scFv anti-HER2/neu, ML3.9 foi amplificado a partir do plasmídeoML3.9-pUC119myc/his usando os dois iniciadores a seguir:LW697 (5 =-GGG AAG CTT CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG-3 = ,ID. DE SEQ. N°: 17); e LW698 (5 = -GGG CTC GAG ACC TAG GACGGT CAG CTT GGT TCC-3=, ID. DE SEQ. N°: 18).

O produto de PCR amplificado e o DNA de plasmídeo,pET20b(+)A5/Ligante, foram digeridos com enzimas derestrição HindIII e XhoI, ligados e transformados em E.coli DH5a competente para produção do novo DNA deplasmídeo, pET20b(+)A5/Ligante/ML3.9. As enzimasselecionadas direcionaram o gene ML3.9 abaixo da seqüênciado ligante. O novo plasmídeo, denominadoApET20b(+)A5/Ligante/ML3.9", foi então isolado epurificado.

4. Clonagem do gene A5/Ligante/ML3.9 no vetorpUC119/myc/his:

A molécula de ácido nucléico que codifica o produtobs-scFv de pET20b(+) foi clonada em um vetor pUC119myc/his.Um tag de (histidina) 6 e um códon de "parada", que sãoparte do vetor pET, foram amplificados juntos com aconstrução de ácido nucléico A5/Ligante/ML3.9. Aamplificação por PCR foi realizada com a utilização dosdois iniciadores a seguir: LW687 (5 = -CGA CCA TGG CCC AGGTGC AGC TGG TGC AG- 3', ID. DE SEQ. N°: 5); e LW686 (5=-GATATA ATG CGG CCG CTC AGT GGT GGT GGT GGT G-3 = , ID. DE SEQ.N0: 9).

A digestão do vetor pUC119myc/his e do produtoamplificado com enzimas NcoI e NotI foi seguida por umaetapa de ligação e transformação da E. coli DH5a. 0 DNA deplasmídeo resultante, denominado "pUC/ALM", foi entãopurificado e isolado (Figura 1).

B. Transformação do clone de expressão, TGl:pUC/ALM foi transformado em E. coli cepa TGl, e osclones que produzem as moléculas de anticorpo bs-scFvA5/Ligante/ML3.9 foram isoladas da seguinte forma: asmoléculas de bs-scFv foram dialisadas de um dia para ooutro, purificadas por cromatografia de afinidade em metalimobilizado usando resina de Ni-NTA (Qiagen), seguida porcromatografia por exclusão de tamanho em um sistema de HPLCcom o uso de uma coluna Superdex-75 (Pharmacia).

II. Resultados:

Como prova do conceito, foram criadas duas moléculasdiferentes de anticorpo bs-scFv. A primeira, denominada"ALM", era composta do scFv de A5 e do scFv de ML3.9 que seliga especificamente tanto a HER3 quanto a HER2/neu,respectivamente. A segunda molécula de anticorpo bs-scFv,denominada "ALF", era composta de duas moléculas de scFvdistintas, A5 e F4, ambas com especificidade para HER3.

Ambas as moléculas de anticorpo bs-scFv foram clonadas eexpressas por E. coli.

ALM foi avaliada em uma série de ensaios in vitro e invivo. Sua habilidade para se ligar simultaneamente tanto aHER3 quanto a HER2/neu, individual e simultaneamente, foidemonstrada por ressonância de plasmônio de superfície emum instrumento BIAcore (Figuras 2, 3 e 4) . In vitro, aincubação de ALM com células de câncer de mama humano BT-474 que superexpressam tanto HER3 quanto HER2/neu leva àexpressão reduzida na superfície celular de HER2/neu e HER3(Figura 5), proliferação diminuída em ensaios MTT (Figura6) , sobrevida reduzida em um ensaio de clonogenicidade(Figura 7) e fosforilação aumentada seguida pordefosforilação de AKT2 acentuada (Figura 8), uma proteínaimportante na via apoptótica. Esses efeitos eramcomparáveis (ensaio MTT) ou maiores (defosforilação deAKT2) do que aqueles observados com o uso de Herceptina7(dados não mostrados).

In vivo, ALM com iodo radioativo exibiu aumento dodirecionamento com especificidade para o tumor em até 24horas após administração a camundongos imunodeficientes queabrigam xenoenxertos tumorais s.c. de BT-474 humano (Figura9).

Esses resultados demonstram a utilidade das moléculasde anticorpo bs-scFv da invenção para o tratamento decélulas tumorais que superexpressam proteínas EGFR. Asmoléculas de anticorpo bs-scFv inéditas podem ser usadasisoladamente ou em combinação com métodos quimioterápicosexistentes para tratar diversos cânceres, incluindo, semlimitação, câncer de mama, cólon, ovariano, endometrial,gástrico, pancreático, prostático e das glândulassalivares.

Exemplo 2

Abordagens quimioterápicas combinadas

HER2/neu é um alvo importante para abordagensquimioterápicas combinadas, uma vez que é superexpressa emdiversos tumores, e sua superexpressão foi correlacionada aum prognóstico ruim. Embora HER2/neu seja desprovida de umligante que possa desencadear a sinalização através de seudomínio de tirosina quinase, quando superexpressa em altasconcentrações, HER2/neu pode formar espontaneamentehomodímeros (Yarden e Sliwkowski (2001) Nature Reviews,Molecular Cell Biology 2: 127-137). HER3 é, de váriasformas, o oposto de HER2/ neu. Ela se liga ativamente aoligante, mas é desprovida de um domínio funcional detirosina quinase, necessitando, desse modo, deheterodimerização com HER2/neu para sinalização. Naverdade, acredita-se que essa combinação seja, de longe, omais potente dos complexos de sinalização formados pelosmembros da família de EGFR (Lohrisch e Piccart (2001) Sem.Oncology (28) Supl. 18: 3-11).

Muitos agentes quimioterápicos causam danos que, emuma célula normal, irão desencadear a apoptose. No entanto,algumas células tumorais possuem uma sinalização aberranteque interfere com a via de sinalização normal da apoptose.

A fosforilação de AKT2 em células tumorais quesuperexpressam HER2/neu leva a uma cascata anti-apoptóticaque poderia interferir com os efeitos antitumorais deagentes quimioterápicos ou biológicos (Zhou e cols. (2000)J. Biol. Chem., 275: 8.027-8.031). Dessa forma, visando-seHER2/neu com moléculas de anticorpo, bs-scFv em combinaçãocom tratamentos quimioterápicos existentes será mais eficazna destruição das células tumorais do que a quimioterapiaisoladamente.

Exemplo 3

Eficácia in vivo de scFv biespecífico marcado com 211At

Foi realizado um estudo in vivo para avaliar aeficácia de scFv biespecífico marcado com 211At contratumores. 0 anticorpo biespecífico é marcado com autilização de quelato 211At-SAPS (N- (4- [211At] astatofenetil)succinimato) (veja, por exemplo, Figura 10).

Quatro dias antes da injeção de células de câncer demama BT4 74, os camundongos receberam um implante de umcomprimido de β-estradiol. No dia zero, os camundongosforam injetados com 5 χ IO6 células de câncer de mamaBT474. No 14° dia, a primeira dose terapêutica de anticorpobiespecífico conjugado a 211AT (ALM) foi administrada i.p.em uma dose elevada de 80 pg e em uma dose baixa de 10 pg.

Doses terapêuticas subseqüentes foram administradas no 16°dia e no 18° dia. 0 volume do tumor foi então acompanhado,como mostrado nas Figuras IlA a IlC.

O volume do tumor foi geralmente menor nos animaistratados (Figuras IlB e 11C), comparado com o controle nãotratado (Figura 11A).

Exemplo 4

Formação de imagens do câncer

A Figura 12 mostra uma imagem de PET-TC de doiscamundongos com o uso de ALM biespecífico de cadeia únicaFv marcado com Iodo-124. Os camundongos foram injetadosi.v. com 50 microCuries (50 microgramas) de ALM marcado eas imagens foram feitas 4 8 horas mais tarde.

Isso ilustra a eficácia dos anticorpos biespecificosdesta invenção para a detecção de câncer.

Entende-se que os exemplos e as modalidades aquidescritas possuem apenas finalidade ilustrativa, e quevárias modificações ou alterações à luz destes serãosugeridas por aqueles habilitados na técnica, e devem serincluídos dentro da abrangência deste pedido e do escopodas reivindicações em anexo. Todas as publicações, patentese pedidos de patente aqui citados e os anexos que osacompanham são aqui incorporados por referência em suatotalidade para todos os fins.<table>table see original document page 100</column></row><table><table>table see original document page 101</column></row><table><table>table see original document page 102</column></row><table><table>table see original document page 103</column></row><table><table>table see original document page 104</column></row><table><table>table see original document page 105</column></row><table><table>table see original document page 106</column></row><table><table>table see original document page 107</column></row><table><table>table see original document page 108</column></row><table><table>table see original document page 109</column></row><table><table>table see original document page 110</column></row><table><table>table see original document page 111</column></row><table><table>table see original document page 112</column></row><table><table>table see original document page 113</column></row><table><table>table see original document page 114</column></row><table><table>table see original document page 115</column></row><table><table>table see original document page 116</column></row><table><table>table see original document page 117</column></row><table><table>table see original document page 118</column></row><table><table>table see original document page 119</column></row><table><table>table see original document page 120</column></row><table><table>table see original document page 121</column></row><table><table>table see original document page 122</column></row><table><table>table see original document page 123</column></row><table><table>table see original document page 124</column></row><table><table>table see original document page 125</column></row><table><table>table see original document page 126</column></row><table><table>table see original document page 127</column></row><table><table>table see original document page 137</column></row><table><table>table see original document page 129</column></row><table><table>table see original document page 130</column></row><table><table>table see original document page 131</column></row><table><table>table see original document page 132</column></row><table><table>table see original document page 133</column></row><table><table>table see original document page 134</column></row><table><table>table see original document page 135</column></row><table><table>table see original document page 136</column></row><table><table>table see original document page 137</column></row><table><table>table see original document page 138</column></row><table><table>table see original document page 139</column></row><table><table>table see original document page 140</column></row><table><table>table see original document page 141</column></row><table><table>table see original document page 142</column></row><table><table>table see original document page 143</column></row><table><table>table see original document page 144</column></row><table><table>table see original document page 145</column></row><table><table>table see original document page 146</column></row><table>Listagem de Seqüência

<110> ADAMS, GREGORY P.HORAKr BVA M.WEINBR, IiOUIS 11.JAMES, MARKS D.

<120s. MOLÉCULAS DE ANTICORPO FV DE CADEIA ÚNICA BIESPECÍFICO E MÉTODOS DE USODESTAS

<130> 407T-000420ÜS

<150> US 60/370,27S<151> 02/04/2002

<150> US10/406,a30<15l> 04/04/2003

<160> 57

<170> Patentln versão 3.3

<210> 1

<211> 251

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Anticorpo sintético.<400> 1

Met Ifys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Ibeu Leu Leu Ala15 10 IS

Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly20 25 30

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly35 40 45

Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp vai Ser Ala Ile Ser Gly Arg Gly Asp Asn Tfar65 70 75 80

Iyr Tyr Ala Asp ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Xle Ser Arg Asp Asn85 30 95

Ser Lys Aan Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp100 10S 110Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Met Thr Ser Asn Ala Phe Ala Phe115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Sêr Ser Gly Gly Gly130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu145 150 155 160

Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Xle165 170 175

Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Gly Val His180 185 190

Txp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly195 200 205

Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Phe Lys210 215 220

Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Letx Gla Ala Glu Asp225 230 235 240

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Trp245 250 2SS

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu260 265 270

Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His275 280 285

HÍ3 Hia Hig290

<210> 2

<21X> 291

<212 > BRT

<213 > Artificia1

<220>

<223 > Anticorpo sintético.

<400>Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Iieu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15

Ala Qln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly20 25 30

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Iieu Ser Cys Ala Ala Ser Gly35 40 45

Plie Thr Phe Arg Ser Tyr Ala Met Ser Trp Vail Arg Gln Ala Pro GlySO 55 60

Lys Gly Leiu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Arg Gly Aap Asn Thres 70 75 80

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Axg Asp Asn85 90 95

Ser Lys Asa Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp100 105 110

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Met Thr Ser Asn Ala Phe Ala Phe115 120 125

Asp Tyr Tzp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu145 150 155 160

liar Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Tlir Xle165 170 175

Sex Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn He Gly Ala Gly Tyr Gly vai His180 195 190

Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly195 200 205

Asn Thr Asn Arg Pro ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Phe Lys210 215 220

Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp225 230 235 240Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Txp245 250 255

Val Bae Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu260 265 270

Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glti Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His275 280 285

HiS HiS HiS290

<210> 3

<211> 288

<212> PRT

<213 > Artificial

<220»

<223> Anticorpo sintético<400> 3

Met Lys Tyr Lsu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala15 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly20 25 30

Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly35 40 45

Phe Tbr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp vai Arg Gla vai Pro Gly50 55 60

Lys Gly Leu Glu Txp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser ser Tyr Iie65 70 75 80

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Fhe fItir Ile Ser Arg Asp Asn85 90 95

Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp100 105 110

Thr Ala Val TVr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Gly Pro Pro Xle Gln His115 120 125TTp Gly Gln Gly Thr Leu Vial Thr Val Ser Ser Arg Gly Gly Gly Ser130 13 S 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Iteu Ser Gln145 150 155 160

Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys165 170 175

Thr Gly Ser Ser ser Asn Ile Gly Ala Ser Phe Asp Val Gln Trp Tyr180 185 190

Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Aen195 200 205

Asn Arg Fro Ser Gly Val Pró Asp Arg Phe Ser Ala Ser Lys Ser Gly210 215 220

Tfer Ser Ala Ser Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln Ile Gly Asp Glu Ala225 230 235 240

Asp Tyr Tyr Cys Gly ser Tyr Thr Gly Thr Tyr Ser Trp Val Phe Gly245 2S0 255

Gly Gly Thr LyS Val Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu260 265 270

Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His Hls His Hiã His275 260 285

<210> 4

<211> 290

<212> PRT

<2I3> Artificial

<220 >

<223 > Anticorpo Sintético

<400> 4

Met Lys τyr Leu Leu Pro Hir Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 S 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly20 25 30

Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly35

40

45

Phe Tlir Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser 1Wp Val Arg Gln Ala Pro Gly50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile Asn Arg Asp Gly Ser Ala ser65 70 75 80

Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Plie Thr Ile Ser Arg Asp Asp85 90 95

Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp100 105 110

Thr Ala Val Tyr Tyr cye Ala Arg Asp Arg Gly Val Gly Tyr Phe Asp115 120 125

Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Tfer Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr145 150 155 160

Gln Pxo Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln ser Ile Thr Ile Ser165 170 175

Cys Thr Gly Thr Sex Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Phe Val Sex Trp180 185 190

Tyr Gln GIn His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val195 200 205

Ser Asp Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser210 215 220

Gly Asn Tiixr AXsi Ss3r Xls XX@ Scx GXy GXu AX& Asp Asp GXn225 230 235 240

Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Gly Ser Ser Ser Thr His Val Ile245 250 255

Plie Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu Gln260 265 270Bys Leu Xle Ser Glti Glu ASp Xteu Asn Gly Ala Ala His His His Hie275 280 265

His His250

«210> 5

<211> 287

<212> PRT

<213> Artificial

<220 >

<223 > Anticorpo sintético<l4Q0> 5

Met Lya Tyr Leu Leu Pxo Tljr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala15 10 15

Ala GlH Pro Ala Met Ala Gln Val GIji Ijeu vai Glu Ser Gly Gly Gly20 25 30

Val Val Gla Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly35 40 45

Piie Thx Phe Ser Asp Tyr Tyr Ile HiS Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly50 SS SO

Lys Gly Leu Glti Trp Met Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys65 70 75 80

Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys Asp Arg Pfte Thr Ile Ser Arg Asp AsnSS 90 95

Ser Lys Asn Thr Val Ser Len Gln Met Asn Ser Leu Arg Ale Glu Asp100 105 HO

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Tyr Gly Asp Tyr Ala Leu115 120 125

Aap Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Tlir Val Ser Ser Gly Gly Gly130 135 140

Gly ser Gly Gly Gly Gly ser Gly Gly Gly Gly Ser Aep Ile Gln Ket14S ISO 15S 160

Thx Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr165 170 175

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp Leu Ma Trp Tyr180 ISS 190

Gln Gla Lys Pro Gly Lye Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser135 200 205

Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Bhe Thr Gly Ser Gly Ser GlyZtQ 215 220

Tlir Slu Fhe Thr Leu Títtr Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Pite Ala225 230 235 240

Tbx Tyr Tyr Cys Gltt Lys Leu Ser Ser Tyr Pro Leu Thr SIiq Gly Gly245 250 255

Gly Ttor Lys Val Glu Ile Lys Arg Alá Ala Ala Glu Gln LyS Leu Xle260 265 270

Ser Glu Glu Asp Leu Asai Gly Ma Ala His His His His His His275 280 285

<21Q> 6

«211> 291

«212> PRT

< 213> Artificial

<22 Q >

<223 > Anticorpo sintético

<400> 6

Met Lys Tyr Leu Leu Iro Ite Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 IS

Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu vai Gln. Ser Gly Gly Gly20 25 30

Leu Val Gln Prd Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly35 40 45

Fhe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg GIb Ala Pro Gly50 55 SO

Lys Gly Leu Glu Trp Val ser Gly Ile ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile65 70 75 80GXy Tyr Ala Asp ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile ser Arg Asp Asn85 50 95

Ala Iiys Asn Ser Leu Tyr Lett Gla Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp100 IOS 110

Thr Ala Vsa Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Gly Ala Lys Gln Trp Leu115 120 125

Giu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Uto- Leu Val Thr Val Ser Ser130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn145 150 155 160

Phe Met Leu Thr GlJi Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr165 170 17S

Val Arg Xle Thr Cya Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser180 185 190

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gls Alá Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly195 200 205

Lys Asn Asii Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe ser GIy Ser Thx210 2IS 220

Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Thr Xle Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp225 230 235 240

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Trp245 250 255

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu260 265 270

Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His275 280 28S

HiS His His290

<21Q> 7<211> 295

<212> PRT

<213 > Artificial

<220>

<223 > Anticorpo sintético

<400> 7

Met Ijys Tyr Leu Deu Pro Tbr Ala Ala Ala Qly Leu Lêu Leu Leu Ala1 5 10 IS

Ala Gln Pro Ala Met Ala Olu Val Gla Leu Vsl Glri Ser Gly Ala Glu20 25 30

Vatl Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly35 40 45

Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly50 55 SO

Gla Gly Lea Glti Trp Met Gly Gly Ile Ile PJfO Ile Phe Gly Thr Ala65 70 15 80

Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gliv Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu85 90 95

Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Val Ser Ser Leu100 105

Ser Glu Asp110

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Glu Gly Pro Tyr Cys Sfer ser115 120 125

Thr Sex Cys Tyr Gly Ala Fhe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val130 135 140

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly145 150 155 160

Gly Gly Ser Gln ser Val Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala165 170 175

Leu Gly Gln Thx Val Lys Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser180 185 190

Tyr Phe Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gla Ala Pro Thr Leu195 200 205Val Met Tyr Ala Arg Asn Asp Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe210 215 220

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu225 230 235 240

Gla Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser245 250 255

Leu Asn Gly Tyr Leu Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly260 265 270

Ala Ala Ala Glu Gln Eiys Beti Jle Ser Glu Glu Asp Iieu Asn Gly Ala275 280 285

Ala His His His His His Bis250 295

<210> 8

<211> 286

<212> PST

<213> Artificial

«220>

<223> Anticorpo Sintético<400> 8

Met Lys Tyr leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Iaeu Leu Leu Ala15 10 15

Ala Gln Fro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Fro Gly20 25 30

Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly35 40 45

Gly Ser Ptm Arg Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Xle Arg Pro Pro Gly Lys50 SS 60

Gly Leu Glu Trp lie Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr65 70 75 80

Asa Pro Ser Leu LyS Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys85 90 95Asn Gia Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Hir Ala100 105 110

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Qly His Leu Gly Glu Leu Gly Trp Phe Asp115 120 125

Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vlal Tbr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly130 13S 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr145 150 155 160

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Aãp Arg Val Thr Ile165 170 175

Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Aen Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln180 185 190

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Argr155 200 205

Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr210 215 220

Asp Phe Ser Leu Thr Ile ser ser Leu Glii Pro Asp Asp Phe Ala Thr225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly245 2.50 255

Tbr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser260 265 270

Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala Kis His His His His Hls275 280 2BS

<210 > 9

<211 > 291

<212> FRT

<213> Artificial

<220>

<223 > AnticorpoSintetico

<400> 9Ket Lys Tyr Leu Leu Pro Tbr Ala Ala AlaIS 10

Leu Leu Leu Leu Ala15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Glfl Leu Ijeu Gln Phe Gly Gly Gly20 25 30

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly35 40 45

Kie Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Axg Gla Ala Pro Gly50 SS 60

Lys Gly Leu Gla Txp Leu Ser Ala Ile Ser Gly ser Gly Gly Ser Thr65 70 75 80

Tyr Tyr Ala

ser vai85

Gly Arg PJtie Ttor Xle Ser Arf Asp Asn90 SS

Ser Lys Asn Tlir Leu Tyr Lea Qln Met Aan Ser Leu Arg Ala Glu .Asp100 105 110

T&r Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser .Asn Trp Asa

115 120 ias

Asn T±p150

Phe Asp Leu Trp Gly Argr Gly Thr Leu Val Tfor Val Ser135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Qly Gly Gly Gly Ser145 150 155

Gly Gly Ser150

Asp 'Val Val Met Tiir Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly165 170 175

Asp Arg' Val Thr lie Xfor Cya Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser TyrISO 185 ISO

Leu Asxi Trp Tyr Gln Glii Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Xle195 200 205

Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Axg Phe Ser Gly210 215 220

Ser Gly Ser Gly Thr Glu lhe Ite Leu ISir lie Ser Ser Leu Gla Pro225 230 235 240Asp Asp Piie Ala Thr Tyr Tyx Gly Gln Gla Tyr Ty* ASrt Tyr Pro Trp245 250 255

Thr PJxe Gly Arg Gly THr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Glu260 265 270

Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala Eis Sis His275 280 285

Hia His His290

<210> 10<211> 291<212> PRT<213 > Artificial<220 s» <223 3» Anticorpo sintético<4Ô0> 10

Met Lys Tyr Lsu Leu Fro Tiir Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 S 10 IS

Ala Giu Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Glti Glu Ser Gly Gly Gly20 25 30

Met Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly35 40 45

Plie Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser TSrp Val Arg Glil Ala Pro Gly50 55 60

Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly ser Gly Gly ser Thr65 70 7 S 80

Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr xie Ser Arg Asp Asn85 90 95

Ser Lys Asn TJãr Lem Tyr Leu Gln Refc Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp100 105 110

Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Asa Trp AsnIlS 120 125Asn Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Aarg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser145 ISO ISS 160

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly165 170 17S

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gla Ser Ile ser Ser Tyr180 185 190

Leu Asn Trp Tyr Gla Gla Lys Pro Gly I»ys Ala Pro Lys Leu Leu Ile195 200 205

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phs Ser Gly210 215 220

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro225 230 23S 240

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gla Tyr Asa Ser Tyr Pro Trp245 250 255

Thr Phe Gly Gla Gly Thr ijys Leu Glu Xle Lys Arg Ala Ala Ala Glu2fi0 255 270

Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ma His Uls His2?S 280 285

His His HisZS 0

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

«213 > Artificial

<22Q>

<223 > Ligante peptídico

<400> 11

Gly Gly GIy Oly Ser

1 5

<210> 12<211> 55

<2Χ2> DNA

<213> Artificial

<220>

<223 > iniciador oligonucleotídico

<400> 12

aattcaggtg ctggtacttc aggttcaggt gcttcaggtg aaggttcagg ttcaa 55

<210> 13

<211> 55

<212> DHA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador oligonucleotídico

<400> 13

agctttgaac ctgaaccttc acctgaagca cctgaacctg aagtaccagc acctg 55

<210> 14

<211> 60

<212 > DNA

<213 > Artificial

<220>

<223 > Iniciador oligonucleotídico

<4OOi 14

aattcaggtg ctggtacttc aggttcaggt gcttcaggtg aaggttcagg ttcaaagcta 60

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223 > Iniciador oligonucleotídico<400> 15

cgaccatggc ccaggtgcag ctggtgcag 29

<210:» 16

<2ll> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Iniciador oligonucleotídico

<400> 16

cgaattcacc taggacggtc agcttgg

27<210 > 17<211> 32<212 > Dm<213> Artificial<220> <223 > Iniciador oligonucleotídico<400> 17

gggaagcttc aggtgcagct ggtgcagtct gg 32

<210> 18<211> 33<212> DNA<213 > Artificial<220> <223> Iniciador oligonucleotídico<400> 18

gggctcgaga cctaggacgg tcágcttggt tcc 33

«210> 19<211> 243<212» PRT<213> Artificial<220> <223> Anticorpo sintético<400> 19

Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro1 5 10 15

Gly Arg Ser leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 'Ito Plie Ser20 25 30

Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Bys Gly Leu Glu35 40 45

Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr ABp Giy Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala AspSO 55 SO

Ser Val Uys Gly Arg PUe Thr Ile Ser Arg Asp Abü Ser Lys Asn Thr65 70 7S 80

Leu Tyr Leu Gla Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Glu Tyr85 30 95

Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro Leu Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr100

105

110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly115 120 125

Gly Ser Gln ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala ser Val Ser Gly Ser Pro130 135 140

Gly Gln ser Xle Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly145 150 155 ISO

Gly Tyr Asn Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro165 170 175

Lys Leu Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Phe Asn180 185 190

Arg Phe Ser Gly Ala Lys Ser Gly Aan Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser195 200 205

Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Thr210 215 220

Ser Ser Ser Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leti225 230 235 240

Gly Asn Ser

<210> 20

<2ll> 729

<212> DNA

<213 > Artificial

<22Q>

<223> Ácido nucléico que codifica anticorpo de cadeia única.

<400> 20

atggcccagg tgeagctggt ggagtctggg ggaggcgtgg tccagcctgg gaggtccctg £0agactctcct gtgcagcctc tggattcacc ttcagtagct atggcatgca ctgggtccgc 120caggctccag gcaaggggct ggagtgggtg gcagttatat catatgatgg aagtaataaa 180tactatgcag actccgtg-aa gggccgattc accatctcca gagacaattc caagaacacg 240ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagct gaggacacgg ctgagtatta ctgtgcgaag 300tatcctttaa actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctcaggtgg aggcggttca 350ggcggaggtg gctctggçgg tggcggatcg cagtctgctc tgactcagcc tgcctccgtg 420tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt 480ggttataact atgcttcctg gtaccaacag cacccaggca aggcccccaa actcatgatt 540tatgaggtca gtaatcggcc ctcaggggtt ttcaatcgct tctctggcgc caagtctggc 600aacacggcct cccegaecat ctctgggctc caggctgagg acgaggctga ttattactgc 660aactcatata caagcagcag cacfctgggtg ttcggcggag ggaecaagct gaccgtccta 720gggaattcc 729

<210> 21<211> 295<212> PRT<2I3> Artificial«220» <223 > Anticorpo sintético<400> 21

Met Ala Gln Val GXn Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro15 10 15

Gly Arg Ser Iieu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Slie Thr Phe Lys20 25 30

Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Iys Gly Leu Glu35 40 45

Trp Val Ser Ala Ile Ser Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp50 55 60

Ser vai Lys Gly Arg Phe Ttir Ile Phe Arg Asp Asn Ser Glu Asn Ser€5 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Tbr Ala Val Tyr85 90 55

Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Ser Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110

Thr Leu Val Thr vai Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr130

135

140

Iieu Ser Ala ser Xle Gly Asp Arg vai Thr He Thr Cys Arg Ala Ser145 150 155 160

Glu Gly Ile Tyr His Tirp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys165 170 " 175

Ala Pro Lys Leu Leu Xle Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala180 185 190

Pro Ser Arg Piie Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Thr Ile Thr Cys195 200 205

Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys210 215 220

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Xle Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala225 230 235 240

Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Agp Phe245 250 255

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val AIa Val Tyr Tyr260 265 270

Cys Gln Gln Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys275 280 285

Leu Glu Asn Lys Arg Asn Ser290 295

<210> 22

<211» 885

<212> DNA<213 >

<220>

<223> Ácido nucléico que codifica anticorpo de cadeia única.<400> 22

atggeccagg tgcagctgca ggagtcgggg ggaggcgtgg tccagcctgg gaggtccctg 60agactctcct gtgcagcgtc cggatfccacc ttcaagaget atggcatgca ctgggtccge 120caggctccag ggaaggggct ggagtgggte teagctatta gtgctagtgg tggtageaca 180tactacgcag actccgtgaa gggccgcttc accatcttca gagacaattc cgagaactca 240ctgtatcttc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg Ccgtctatta ctgtgcgaga 300gattcaagtg ggtcctttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcaggt 360ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc ggtggcggat cggacatcgt gatgacccag 420tctccttcca ccctgtccgc atctattgga gacagagtca ccatcacctg cegggccagt 480gagggtattt atcactggtt ggcctggtat cagcagaagc cagggaaagc ccctaaactc 540ctgatctata aggccfcctag tttagccagt ggggccccat caaggfctcag cggcagtgga 600tctgggacag ataccatcac ctgccgggcc agtgagggta tttatcactg gttggcctgg 660tatcagcaga agccagggaa agcccctaaa ctcctgatct ataaggcctc tagtttagcc 720agtggggccc catcaaggtt cagcggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc 780ageagcctgc aggctgaaga tgtggcagta tactactgtc agcaatatta tagaagtccg 840ctcactttcg gtggagggac caagctggag aacaaaegga attcc 88S

<210> 23

<211> 5

<212> PRT

<213 > Artificial

<220>

<223> Seqüência de sinalização de translocação

<400> 23

Arg Glu Asp Leu Lys1 5

<210> 24

<211> 4

<212> PRT

< 213 > Arti ficial

<220>

<223 > Seqüência de sinalização de translocação

<4D0> 24

Arg Glu Asp Leu1

<210> 25

<2ll> 4

<212> PRT

<213» Artificial

<22Q>

<223> Seqüência de sinalização de translocação<400> 25

Argr Asp Glu Leu1

<210> 26<211:» 4<2Χ2> PRT<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de sinalização de translocação.<400> 26

Lys Asp Glu teu

1

<210> 27

<211> 873

<212> DWA

<213> Artificial

<220>

<223> Ácido nucléico que codifica anticorpo de cadeia única.

<400* 27

atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc SOatggcccagg tgcagctggt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 120agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttcgcagct atgccatgag ctgggtccgc 180caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcagctacta gtggtcgtgg tgataacaca 240tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg 300ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtttatta ctgtgcgaaa 360atgacaagta acgcgttcgc atttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 420tcãggtggag gcggttcagg cggaggtggç tctggcggtg gcggatcgca gtctgtgttg 480acgcagccgc cctcagtgtc Cggggcccca gggcagaggg tcaccatctc ctgcactggg S40agcagctcea acatcggggc aggttatggt gtacactggt accagcagct tccaggaaca 600gcccccaaac tcctcatcta tggtaacacc aatcggccct caggggtccc tgaccgattc 660fcctggcttca agtctggcac ctcagcctcc ctggccatca ctgggctcca ggctgaggat 720gaggctgatt. attactgcca gtcctatgac agcagcctga gtggttgggt gttcggcgga 780gggaecaagc tgaccgtcct aggtgcggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat 840ctgaatgggg ccgcacatca ccatcatcac cat 873<210> 28

<211> 873

<212> DNA

<212> Artificial

<220>

<223 > Ácido nucléico que codifica anticorpo de cadeia única.

<400> 28

atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60atggcccagg tgcagctggt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 120agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttcgcagct atgccatgag ctgggtccgc 180caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcagctatta gtggtcgtgg tgataacaCa 240tactacgcag actccgtgaa gggccggtte accatctcca gagacaattc caagaacacg 300ctgtatctgc aaatgaacag cetgagagcc gaggacacgg ccgtttatta ctgtgcgaaa 350atgacaagta acgcgttcgc atttgactac tggggecagg gaaccctggt caccgtctcc 4:20tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcgca gtctgtgttg 480acgcagccgc cctcagtgtc tggggcccca gggcagaggg tcaccatctc ctgcactggg 540agcagctcca acatcggggc aggttatggt gtacactggt accagcagct tccaggaaca soogcccccaaac tcctcatcta tggtaacacc aatcggccct caggggtccc tgaccgattc 660tctggcttca .agtctggcac eteagcctec ctggccatea ctgggctcca ggctgaggat 720gaggctgatt attactgcca gtcctatgac agcagcctga gtggttgggt gttcggcgga 780gggaçcaagc tgaccgtcct aggtgcggec gcagaacaaa aaetcatetc agaagaggat 840ctgaatgggg ccgcacatca ccatcatcac cat 873

<210> 29

<2U> 854

<212 > DNÃ.

< 213 > Jirti f icial

<22G>

<223» Ácido nucléico que codifica anticorpo de cadeia única.<400> 29

atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttát tactcgcggc ccagccggcc SOatggcccagg tacagctgca gcagtcaggg ggaggcctgg tcaaacctgg ggggtccctg 120agactctcct gtgcagcctc tggattcacc ttcagtagct atagcatgaa ctgggtccgc 180caggtcccag ggaaggggct ggagtgggtc tcatccatta gtagtagtag tagttacata 240tactacgcag actctgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaatgc caagaactca 300ctgtatctgc aaatgaacag ectgagagac gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga 360gatgacggtc cccccatcca gcactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcacgt 420ggaggcggtt eaggcggagg tggctctggc ggtggcggat cgcagtctgt Sttgagccag 480ccgccctcgg tatctggggc cccagggcag agggtcacca tctcctgcac tgggagcagc 54 0tccaacatcg gggcaagttt tgatgtacag tggtaccagc aacttccagg aacagccccc 600aaactcctca tctatggtaa caacaatcgg ccctcagggg tccctgaccg attctctgcc 660tccaagtctg gcacctcagc ctccctgggc atcaccggac tccagatcgg ggacgaggcc 720gattattact gcggctcata tacaggcacc tactcttggg tgttcggcgg agggaccaag ■760gtcaccgtcc taggtgcggc cgcagaacaa aaactcatct cagaagagga tctgaatggg 840gccgcacatc accatcatca ccat 864

<210> 30<211> 870

<212 > Dim

<2l3> Artificial

<220>

<223 > Ácido nucléico que codifica anticorpo de cadeia única.

<400> 30 atgaaatacc tattgccgac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60atggcccagg tgcagctgca ggagtcgggg ggaggcttgg tcaagcctgg ggggtccctg 120agactctcct gtgcagcetc tggattcacc tttagtagct attggatgag ctgggtccgc 180caggctccag gaaaggggct ggagtgggtc gccaacataa accgcgatgg aagtgccagt 240tattatgtgg actctgtgaa gggccgattc accatctcca gagacgacgc caagaactca 300ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga 360gatcggggcg tggggtactt cgatctctgg ggccgtggca ccctggtcac cgtctcctca 420ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcgcagtc tgccctgact 480cagcctgcct ccgtgtctgg atctcctgga cagtcgatca ccatctcctg cactggaacc S40agcagtgatg ttggtggtta taactttgtc tcctggtacc aacagcacec aggcaaagcc 600cccaaactca tgattfcatga tgtcagtgat cgaccctcag gggtctctga tcggttctct 660ggctccaagt ctggcaacac ggcctccctg atcatctctg gcctccaggc tgacgacgag 720gctgattatt actgcagctc atatggaagc agcagcaccc atgtgatttt cggcggaggg 780accaaggtca ccgtcctagg tgcggccgca gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg 840aafcggggccg cacatcacca tcatcaccat 870

<210> 31

<211> 8G1

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ácido nucléico que codifica anticorpo de cadeia única.

<400> 31

atgaaatacc tafctgcctac ggcagecgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60atggcccagg tgcagctggt ggagtctggg ggaggcgtgg tccagcctgg gaggtccctg 120agactctcct gtgcagcctc tggattcacc ttcagtgact attatataca ctgggtccgc 180caggctecag gcaaggggct ggagtggatg gcagttattt catatgatgg caataataaa 240tactacgccg cctccgtgaa ggaccgattc accatctcca gagacaattc caagaacacg 300gtgtctctgc aaatgaacag cctgagagct gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgegaga 3€0gatctctacg gtgactacgc fccttgactac tggggeeagg gaaççctggt cacegtctçc 420tcaggtggag gcggfctcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcgga catccagatg 480acccagtctc cttccacccfc gtctgcatct cfcgggagaca gagtcaccat cacttgccgg 540gccagteaga gtattggtag ctggttggcc tggtatcagc agaaaccagg gaaagccect 600aaactcctga tctataaggc gtctaettta gaaagtgggg tcccateaag gttcaccggc 6€Qagtggatctg ggacagaafct eaeteteaca atcagcggcc tceagrcetga agattttgea 720acttattact gtcagaagct tagtagttac ccgctcactt tcggcggagg gaccaaggtg 760gaaatcaaac gtgcggccgc agaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct gaatggggcc 840gcacatcacc atcatcacca t 861

<210> 32

<211> 873

<212> DNA

< 213 > Artificial

<220>

<223 > Ácido nucléico que codifica anticorpo de cadeia única.<400> 32

atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc SOatggcccagg tgcagctggt gcagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg caggtccctg 120agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttgatgatt atgccatgca ctgggtccgg 180caagctccag ggaagggcct ggagtgggtc tcaggtatta gttggaatag tggtagcata 240ggctatgcgg actetgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaacgc caagaactca 300ctgtatctge aaatgaacag cetgagacct gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga 360gatcttggtg ccaagcagtg gctggagggg tttgactact ggggccaggg caccctggtc 420accgtctcct caggtggagg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcgaat 480tttatgctga ctcaggaccc tgctgtgtct gtggccttgg gacagaeagt caggatcaca 540tgccaaggag acagcctcag aagctattat gcaagctggt accagcagaa gccaggacag €00gcccctgtac ttgtcatcta tggtaaaaac aaccggccct cagggatccc agaccgattc 660tctggctcca ccteaggaaa ctcagcttcc ttgaccatca ctggggctca ggcggaagat 720gaggctgact attaetgtaa ctcccgggac agcagtggta accattgggt gttcggcgga 780gggaccaagg tCaccgtcct aggtgcggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat 840ctgaatgggg ccgcacatca ccatcatcac cat 873

<210> 33

<211> 885

<212> DNA

^t 2'2.3 > Artificial

<22 Ο >

<223> Ácido nucléico que codifica anticorpo de cadeia única.

<4O0> 33 atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc €0atggccgagg tgcagctggt gcagtctggg gctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg 120aaggtctcct gcaaggcttc tggaggcacc ttcagcagct atgctatcag ctgggtgega 180caggcccctg gacaaggcct tgagtggatg ggagggatca tccctatett tggtacagca 240aactacgcac agaagttcca gggcagagtc acgattaccg cggacgaatc cacgagcaca 300gcctacatgg aggtgagcag cctgagatct gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga 360gaggaggggc catattgtag tagtaccagc tgctatgggg cttttgatat ctggggccaa 420ggcaccctgg tcaccgtctc ctcaggtgga ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt 480ggcggatcgc agtctgtgct gactcaggac cctgctgtgt ctgtggcctt gggacagaea 540gtcaagatca catgccaagg agacagcctc agaagctatt ttgcaagctg gtaccagcag SOOaagccaggae aggcccctac acttgtcatg tatgctagaa atgaccggcc cgcaggggtc €60eetgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cagtgggctc 720cagtctgagg atgaggctga ttattattgt gcagcatggg atgacagcct gaatggttat 780ctcttcggag ctgggaccaa gctgaccgtc ctaggtgcgg ccgcagaaca aaaactcatc 840tcagaagagg atctgaatgg ggccgcacat caccatcatc accat 885

<210> 34

<211> 861

<212> DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> Ácido nucléico que codifica anticorpo de cadeia única.

<400> 34 atgaaataec tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60atggcccagg tgcagctgca ggagtcgggc ccaggactgg tgaagccttc ggagaccctg 120tccctcacct gcactgtctc tggtggctcc ttcagaagtt actactggag ctggatccgg 180tagcccccag ggaagggact ggagtggata gggtatatct tttacagtgg gagcaccaac 240tacaatccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc 300tccctgaagc tgagctcttt gaccgctgcg gacacggccg tgtattattg tgcgagaggá 360cafcttggggg agttaggatg gttcgacccc tSaSSrccagg gaaccctggt caccgtctcc 420tcaagtggag gcggttcagg cggâggtggc tctggcggtg gcggatcgga catccagatg 480acccagtctc catcctccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcaccat cacttgccag 540gcgagfccagg acattagcaa ctatttaaat tgsftatcagc agaagccggg gaaagcccct 600aaactcctga tctttgctgc atcccgttta gcgagcgggg tcccctcaag attcagcggc 660agtggatctg gcacagattt cagtctcacc atcagcagcc tgcagcctga cgattttgca 720acttattatt gtctacaaga ttccgattac cccctcactt tcggeggagg gaccaaggtg 780gaaatcaaac gtgcggccgc agaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct gaatggggcc 840gcacatcacc atcatcacca t 861<210> 35 <211> 873 <212> DNA <213> Artificial <220> <223 > Anticorpo sintético <400> 35 atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60atggcccagg tgcagctgtt gcagttcggg geaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 120agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttagcagct atgccatgag ctgggtccgc 130caggctccag ggaaggggct ggagtggctg tcagctatta gtggtagtgg tggtagcaca 240tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg 300ctgtatctgc asatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtatatta ctgtgcaaga 360gagggatata gcagcaactg gaataactgg tacttcgatc tctggggccg tggcaccctg 420gtcaccgtct cctcaggtgg aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg 480gatgttgtga tgactcagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 540atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 600gggaaggccc ctgaacfccct gatctatgct gcatcccgtt tacaaagtgg ggtcccatca 660aggttcagtg gcagtggatc tgggaccgaa ttcactctca ccafccagcag cctgcagcct 720gatgattttg caacttatta cggccaacaa tattataatt atccgtggac gttcggccga 780gggaccaagg tggaaatcaa acgtgcggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat 840ctgaatgggg ccgcacatca ccatcatcae cat 873c210> 36 <211> B73 <212> DNA <213> Artificial <220> , <223> Acido nucleico que codifica anticorpo de cadeia única. <400> 36 atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc 60atggcccagg tgcagctgca ggagtcgggg ggaggcatgg tccagcctgg gaggtccctg 120agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttagcagct atgccatgag ctgggtccgc 180caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcagctatta gtggtagtgg tggtagcaca 240tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg 300ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccctgtatta ctgtgcaaga 360gagggatata gcagcaactg gaataactgg tacttcgatc tctggggccg tggcaccctg 420gtcaccgtct cctcaggtgg aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg 480gaaattgtgc tgactcagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 5ê0atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 600gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 660aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 720gacgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccttggac gttcggccaa 780gggaccaagc tggagatcaa acgtgcggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat 840ctgaatgggg ccgcacatca ccatcatcac cat 873

<210> 37

<211> 20

<2X2> PEI

<213> Artificial

<220>

<223 > Ligante peptídico<400> 37

Asn Ser Qly Ala Gly Thr Ser Gly Ser Gly Ala Ser Gly Glu Gly SerIS 10 IS

Gly Ser Lye Leu20

<210> 38

<211> 129

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência VH de anticorpo artificiai<400> 38

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lya Lys Pro Gly Glu15 10 15

Ser Leu Lys Xle Ser Cys Lys Gly Ser Qly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20 25 30

Trp lie Ala Trp Val Arg Gln Ket Fro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met3S 40 45

Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60

Gla Gly Gln Val Tte Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala Lys Tip100 IOS 110

Pro Glu Tyr Phe Glia His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr vai ser115 120 ias

Ser

<210> 39

<211> 129

<212> PRT

<213 > Artificial

<220 >

<223 > Seqüência VH de anticorpo artificial<400> 35

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu15 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser CyS Lys Gly Ser Gly Tyx Ser 'Phe ISbr Ser Tyr20 25 30

Tzp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met35 40 45

Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Tta Lys Tyr Ser Pro Ser PheSO 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95

Ala Arg His Asp Val Ala Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala Lys Trp10Ô IOS 110

Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser115 120 125

Ser40

129

PRT

Artificial

Seqüência VH de anticorpo artificiai40

Sln VaI Glft Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr2 0 25 30

Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Fro Gly Iiys Gly Leu Glu Tyr Met35 40 45

Gly Leu Xle Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe50 SS 60

<210><211><212><213>

<220><223>

<400>

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Leu Gln Tsrp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95

Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn çys Ala Lys Trp100 IOS 110

Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser115 120 125

Ser

<210> 41

<211> 129

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência VH de anticorpo artificial

<400> 41

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys PifO Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ihr Ser Tyr20 25 30

Trp Ile Ala Trp Val Arg Gla Met Pro Gly Lys Gly Lêu Glvi Tyr Met35 40 45

Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60

Gla Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95

Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Thx Asp Arg Thr Cys Ala Lys Trp100 105 110

Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser115 120 125

Ser

<210> 42

<211> 129

<212> PRT

«213> Artificial

<220>

<223> Seqüência VH de anticorpo artificial

<400> 42

Gln Val Glii Leu Val Gla Ser Gly Ala Glu Val Lys Lye Pro Gly Glu1 5 10 . 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser rIyr20 25 30

Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met35 40 45

Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Hir Lys Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 €0Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser vai Sey Thr Ala Tyr65 70 75 80

Leu Gln Txp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Plie Cys85 90 95

Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Thr Asp Arg Thr Cys Ala Lys Trp100 105 110

Pro Glu Trp Leu Gly Val Trp Gly GIb Gly Thr Leu vai Thr vai ser115 120 125

Ser

<210> 43

<21I> 111

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223 > Seqüência VL de anticorpo artificial<400> 43

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser AStt Ile Gly Asn Asn20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu35 40 45

Ile Tyr Gly His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60

Gly Ser Lys Ssr Gly Tfer Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala ASp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu85 90 95

Ssr Gly Txp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110

<210> 44<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência VL de anticorpo artificial

<400> 44

Qln Ser Val Leu Thr Gln Pro Fro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly GlnX 5 10 IS

Lys Val Thr Ile Sex Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asq Ile Gly Aan Asa20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gla Gln Leu Pro Gly Tfar Ala Pro Lys Leu Leu35 40 4S

Ile Tyr Gly His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 SS eo

Gly Ser Lys Ser Gly Itir Ser Ala Ser Lexi Ala Ile Ser Gly Phe Arg65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu85 90 95

Ser Gly Tip Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Le« Gly100 105 210

<210> 45

■β». 2 JL χ

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

Seqüência VL de anticorpo artificial<400> 45

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln15 10 IS

Lys Val Tbx Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn He Gly Asn Asn20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gla Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leii Leu35 40 45Ile Tyr Asp Hls Tbr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe ser50 SS 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe ArgSS 70 75 βΟ

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu85 90 95

Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Tlir LyS Leu Thr Val Leu Gly

100

105

HO

<210> 46

<2il> 111

<2i2> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência VL de anticorpo artificial

<4Q0> 46

Gln Ser Val Leu Ttir Oln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala PrO Gly Gln1 S 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asa Ile Gly Asn Asn20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Glia Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu35 40 45

Ile Tyr Asp His Thr Asu Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Tlir Leu85 90 95

Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lya vai Thr Val Iieu Gly100 105 110

<210> 47

<211> 11.1

<212i- PRT

<213> Artificial<220>

<223> Seqüência VL de anticorpo artificial<400> 47

Gla Ser Val Leu Thx Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln

1 S 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asa Ile Gly Asn Asiv20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gla Leu FrO Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu35 40 45

Ile Tyr Asp His Tlar As» Arg Pro Ala Gly Val Pro AiSp Arg Piie Ser50 · 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Tkr Ser Ala Ser Ites .Ala lie Ser Gly Phe Arg65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr- Tyr CyB Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu85 90 35

Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly100 105 110

<210> 48

<211> 129

<212» KlT

«213» Artificial

<220>

<223> Seqüência VH de anticorpo artificial

<400> 4 B

Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glti Leu Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Gya Lye Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20 25 30

Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Gltt Tyr Met35 40 45

Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60Gla Gly Gln Val Thr Ile ser VaIG5 70

Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr75 80

Lea Gln Trp Ser Ser Iieu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Bhe Cys85 SQ SS

Ala Argr His Asp Val Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asxi Cys Ala Lys TTp100 105 110

Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Iaeu Val Thr Val Serlis 120 125

Ser

<210> 49

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência VH de anticorpo artificial<400> 49

Gln Val Gln Iaeu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lysi Lys Pro Gly Glu1 5 10 IS

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Ptoe Thr Ser Tyr20 25 30

Trp lie Ala Trp Val Axg Gln. Met Pro Gly Lya Gly Leu Glu Tyr Met35 49 45

Gly Leu He Tyr .Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Fhe50 55 SO

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys ser Val Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Leu Gls Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 9 S

Ala Arg His Aap Val Ala Tyr Cys Ser Ser Ser Asa Cys Ala Lys Trp100 105 110

Pro Glu Tyr Phe Gla His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val SerSer

115

120

125

<21Q> 50

<211> 129

<212> PRT

<213 > Artificial

<22Q>

<223> Seqüência VH de anticorpo artificiai

<4Q0> 50

Glii Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ma Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15

Ser Iseu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Fhe Thr Ser Tyr20 25 30

Trp lie Ala Trp Val Arg Gls Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met35 40 45

Gly Leu Xle Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr LyS Tyr Ser Pro Ser Phe50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Ihr Ala Tyr55 70 75 80

Leu Gln Trp Sex Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95

Ala Arg His Asp Val Gly Tyr çys ser Ser ser Asn Cys Ala Lys Trp100 IOS 110

Pro Glu Tyr Phe Gla His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser115 1.20 125

Ser

<210> 51

<211> 129

<212> PRT

< 213 > Artificial

<220><223> Seqüência VH de anticorpo artificial<400> 51

Gln Val Glu Leu Leu Qln Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15

Ser Leu Lys Xle Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Plie Thr Ser Tyr20 25 30

Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met35 40 45

Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Hir Lys Tyr Ser Pro Ser Pbe50 55 60

Gln Gly GIh Val Tbr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Sar Thr Ala Tyr65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser ser Leu Lys Pro ser Asp ser Ala Val Tyr Plie Cys85 90 95

Ala Arg His Asp vai Gly Tyr Cys Thr Asp Arg Thr Cys Ala Lys Trp100 105 110

Pro Glu Tyr Plie Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser115 120 1.25

Ser

<210> 52

<211> 129

<2X2> PRT

<213 > Artificial

<220>

<223> Seqüência VH de anticorpo artificial<40Q> 52

Gla Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glul 5 10 15

Ser Leu Lys Ile Ser Cya Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr20 25 30

Trp Ile Ala Txp vai Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met35 40 45

Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe50 SS 60

Gln Gly Gln Val Thr He Ser Val Asp X»ys Ser Val Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leti Lys Pro Ser Aap Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95

Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Thr Asp Arg Thr Cys Alá Lys Trp100 105 110

Pro Glu Trp Leu Gly Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser115 120 125

Ser

<210> 53

XX^ X X1

<212 > PRT

<213> Artificial

<220>

<223 > Seqüência VL de anticorpo artificial<400> S3

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly GlnIS 10 IS

Lys vai Hir rle Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn20 25 30

Tyr vai Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu35 40 45

lie Tyr Gly His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Ilir Ser Ala Ser Leu Ala Xle ser Gly Pbe Arg65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Aap Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser LeuSS 90 95Ser Gly Trp Val Fhe Gly Gly Gly Thr Lys I»eu Thr Val Leu Gly100 105 110

<210> 54

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência VL de anticorpo artificial

<400> 54

Glu Ser Val Iieu Ttxr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln1 5 10 15

Iiya Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn20 25 30

Tyr Val Ser Trp35

Gln GlB Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu40 45

Ile Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro Ala Gly vai Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser teu Ala Ile Ser Gly Phe Arg65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu85 90 95

Ser Gly Txp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Iieu Gly100 105 110

<210> 55

<2I!> 111

<212> PRT

<213 > Artificial

<22Ô>

<223> Artificial antifcody VL sequence.<400> 55

Glu Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln1 5 10 IS

Lys vai Thr Ile ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn20 25 30

Tyr VaI Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Tlsr Ala Pro Lys Leu Leu35 40 45

lie Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro Mft Gly Val Pro Aap Arg Phe Ser50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg65 70 75 80

Ser Gla Asp Glu Ala Asp Tyte Tyr Cys Ma Ser Trp Asp Tyr Thr Leu.

85 90 95

Ser Gly Trp Vsl Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110

«210> SS

«211» 111

<2!2> PHT

«213> Â2> ^ 3> £ Ii C

«220>

<223» Seqüência VL de anticorpo artificial

«400 > 56

Glu Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln15 10 15

Lys Val Thr II© Scr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Asn Asn20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Glft- Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu35 40 45

Tle Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Aap Arg Phe Scr50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Ser Gly Phe Arg65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Tzp Asp Tyr Thr Leuβ5 90 95

Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110<210> 57

<211> 1Ϊ1

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223 > Seqüência VL de anticorpo artificial<400> 57

Glu Ser V&l Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Alia Ala Pro Gly Gln1 5 10 15

Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asa Ile Gly Asn Asn20 25 30

Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu35 40 45

Xle Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Plie Ser50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu85 90 95

Ser Gly Trp Vâl Phe Gly Gly Gly Thr Iiys Leu Thr Val Leu Gly100 105 110

BlO, anti-EGFR ECD

ATGGCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCrGTCCCTCACCTGGACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGATTACTACTGGAGTTGGATCCXSCCAGCCCCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCCCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATGTCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTAAAGATAGTAGTCGGGGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCATCGGCCTCGGGGGCCGAATTGGGCGGCGGCGGCTCCGGAGGAGGAGGATCTGGTGGTGGTGGTTCGACTAGTGAAATTGTGATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCCATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGCTCGAGCΒ2, anti-IGFR ECD

atgcscccaggtccagctggtac^tctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtrrcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaagctacgcacagaagttccagGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCrACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATctgaggacacggccgtgtattacrgtgcgagaggagggactacgggggagaacatggacgtctggggcaaagggaccacggtcaccgtctcctcatcggcctcgggggccgaattgggcggcggcggctccggaggaggaggatctggtggtggtggttcgaci-agaoacatccagttgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccaggcgagtcaggacattagcaacxatttaaattggtatci^cagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctacgatgcatccaatttggaaacaggggtcccatcaaggttcagtggaagtggatctgggacagattttactttcaccatcagcagcctgcagcctgaagatattgcaacatattactgtcaacaggctaacagtttcccgatcaccttcggcc aagggacacgactggagattaaacgctcgagc

H2, anti-Her2 EOD

atggcccaggtgcagctacagcagtggggcgcaggactgttgaagccttcggagaccctgtcccxcacctgcgctgtctntggtgggtccttcagtggttactactggagttggatccgccagcccccagggaaggggctggagtggattggggaagtcaatcatagtggaaggaccaactacaacccctccctcaagagtcgagtcaccatatcagtagaa\cgtccaagaaccagttctccctgaagctgagctctgtgaccgctgcggacacggctgtgtattactgtgcgagagagcatagcagctcctatgatgcttttgatatctggggccaagggacaatggtcaccgtctcttcatcggcctcgggggccgaattgggcggcggcggctccggangaggaggatctggtggtggtggttcgactagtcagactgtggtgacccaggagccctcagtgtciggggccccagggcagagggtcaccatctcctgcactgggagcagctccaacatcggggcaggttatga

tgttcactggtaccggcagcttccaggaacagtccccaaactcctcatctatggraacaccaatcggcccrrcaggggtcactgaccgattctctggctccaagtctggctcctcagcctccctggccatcactgggctccaggctgaggatgaggctgattattactgccagtcctatgacagcatcctgagtggttatgtcttcggaactgggaccaaggtcaccgtcctaggctcgag

H3 anti~Her2 BCD

atggcccaggtccagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccagctactatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcaaccctagtggtggtagcacaa^gctacgcací^aagttccagggcagagtc^cc^tgacc^gggacacgtccacgagcacagtctacatggagctgagcagcctgagat

ctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagagagggagcagttgatgcttttgatatctggggcca

agggacaatggtcaccgtctcttcatcggcctcgggggccgaattgggcggcggcggctccggagga

ggaggatctggtggtggtggttcgactagtgatgttgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccttggacagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcgtatacagtgatggatacacctacttgagttggtttcaccagaggccaggccaatctccaaggcgcctaat-rtataaggtttctaaccgggactctggggtccc^gacagattcagcggcagtgggtcaggcactgatttcacactgaaaatcagcagggtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcaaggtacacactggcccctcac

tttcggcggagggaccaagctggagatcaaacgctcgaggc

Claims (57)

1. Anticorpo biespecífico caracterizado porcompreender um primeiro anticorpo e um segundo anticorpounidos entre si, em que o referido primeiro anticorpo e oreferido segundo anticorpo se ligam especificamente aepitopos diferentes, em que o referido primeiro anticorpotem especificidade de ligação para pelo menos um epitopo emum membro da família da proteína do receptor do fator decrescimento epidérmico, selecionado do grupo que consisteem EGFR, HER2/neu, HER3 e HER4, e o segundo anticorpo temespecificidade de ligação para um segundo epitopo em ummembro da família da proteína do receptor do fator decrescimento epidérmico que é diferente do referido primeiroepitopo e é um epitopo em uma proteína selecionada do grupoque consiste em EGFR, HER2/neu, HER3 e HER4, em que oreferido anticorpo é codificado por um vetor que compreendeuma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo queconsiste no ID. DE SEQ. N°: 27, ID. DE SEQ. N°: 28, ID. DESEQ. N°: 29, ID. DE SEQ. N°: 30, ID. DE SEQ. N°: 31, ID. DESEQ. N°: 32, ID. DE SEQ. N°: 33, ID. DE SEQ. N°: 34, ID. DESEQ. N°: 35, ID. DE SEQ. N°: 36 e ID. DE SEQ. N°: 37.

2. Anticorpo biespecífico, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referidoanticorpo é codificado por um vetor que compreende duasseqüências de ácidos nucléicos selecionadasindependentemente do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N0-36 e ID. DE SEQ. N°: 37.

3. Anticorpo biespecífico, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referidoanticorpo é codificado por um vetor que compreende umaseqüência de ácidos nucléicos que codifica um polipeptideoselecionado do grupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 38,ID. DE SEQ. N°: 39, ID. DE SEQ. N°: 40, ID. DE SEQ. N°: 41,ID. DE SEQ. N°: 42, ID. DE SEQ. N°: 43, ID. DE SEQ. N°: 44,ID. DE SEQ. N°: 45, ID. DE SEQ. N°: 46, ID. DE SEQ. N°: 47,ID. DE SEQ. N°: 48, ID. DE SEQ. N°: 49, ID. DE SEQ. N°: 50,ID. DE SEQ. N°: 51, ID. DE SEQ. N°: 52, ID. DE SEQ. N°: 53,ID. DE SEQ. N°: 54, ID. DE SEQ. N°: 55, ID. DE SEQ. N°: 56e ID. DE SEQ. N0 : 57.

4. Anticorpo biespecífico, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referidoanticorpo é codificado por um vetor que compreende duasseqüências de ácidos nucléicos selecionadasindependentemente do grupo que consiste em uma seqüência deácidos nucléicos que codifica um polipeptideo selecionadodo grupo que consiste no ID. DE SEQ. N°: 38, ID. DE SEQ.N°: 39, ID. DE SEQ. N°: 40, ID. DE SEQ. N°: 41, ID. DE SEQ.N°: 42, ID. DE SEQ. N°: 43, ID. DE SEQ. N°: 44, ID. DE SEQ.N°: 45, ID. DE SEQ. N°: 46, ID. DE SEQ. N°: 47, ID. DE SEQ.N°: 48, ID. DE SEQ. N° : 49, ID. DE SEQ. N°: 50, ID. DE SEQ.N°: 51, ID. DE SEQ. N°: 52, ID. DE SEQ. N°: 53, ID. DE SEQ.N°: 54, ID. DE SEQ. N°: 55, ID. DE SEQ. N°: 56 e ID. DESEQ. N°: 57.

5. Anticorpo biespecífico, de acordo com areivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referidovetor ainda compreende um ácido nucléico que codifica opolipeptideo do ID. DE SEQ. N°: 37.

6. Composição caracterizada por compreender umanticorpo biespecífico da reivindicação 1 e um veículofarmaceuticamente aceitável.

7. Método para o tratamento de câncer, o referidométodo caracterizado por compreender a administração a umpaciente que dele necessite de uma quantidadeterapeuticamente eficaz da composição da reivindicação 6.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o referido câncer éselecionado do grupo que consiste em câncer de mama, cólon,ovariano, endometrial, gástrico, pancreático, prostático eda glândula salivar.

9. Método para o tratamento de câncer, o referidométodo caracterizado por compreender a administração a umpaciente que dele necessite de uma quantidadeterapeuticamente eficaz da composição da reivindicação 6 emcombinação com um outro agente citotóxico selecionado dogrupo que consiste em um agente quimioterápico, radiação defeixe externo, um radioisótopo direcionado e um inibidor datransdução de sinal.

10. Porção quimérica caracterizada por compreender oanticorpo biespecífico da reivindicação 1 acoplado a umefetor.

11. Porção quimérica, de acordo com a reivindicação-10, caracterizada pelo fato de que o referido efetor éselecionado do grupo que consiste em uma citotoxina, umrótulo, um radionuclídeo, um fármaco, um lipossomo, umligante e um anticorpo.

12. Porção quimérica, de acordo com a reivindicação-10, caracterizada pelo fato de que a referida porçãoquimérica é uma proteína de fusão

13. Método para liberar especificamente uma moléculaefetora a uma célula que abriga um receptor da família daproteína do receptor do fator de crescimento epidérmico,selecionado do grupo que consiste em EGFR, HER2/neu, HER3 eHER4, o referido método caracterizado por compreender:o fornecimento de uma porção quimérica que compreendea referida molécula efetora anexada a um anticorpo dareivindicação 1; eo contato da referida célula com a referida porçãoquimérica, em que a referida porção quimérica se ligaespecificamente à referida célula.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que a referida molécula efetoraé selecionada do grupo que consiste em uma citotoxina, umrótulo, um radionuclídeo, um fármaco, um lipossomo, umligante e um anticorpo.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que a referida porção quiméricaé uma proteína de fusão.

16. Método, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que a referida célula é umacélula cancerosa.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que a referida célula é umacélula cancerosa selecionada do grupo que consiste emcâncer de mama, cólon, ovariano, endometrial, gástrico,pancreático, prostático e da glândula salivar.

18. Método para matar especificamente uma célula queabriga um receptor da família da proteína do receptor dofator de crescimento epidérmico, selecionado do grupo queconsiste em EGFR, HER2/neu, HER3 e HER4, o referido métodocaracterizado por compreender:o fornecimento de uma porção quimérica que compreendeum anticorpo da reivindicação 1 anexado a um efetorselecionado do grupo que consiste em uma citotoxina, umaporção radioativa e um lipossomo que compreende um agentecitotóxico ou citostático; eo contato da referida célula com a referida porçãoquimérica, em que a referida porção quimérica se ligaespecificamente à referida célula, resultando na morte dareferida célula.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que a referida porção quiméricaé uma proteína de fusão.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que a referida célula é umacélula cancerosa.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que a referida célula é umacélula cancerosa selecionada do grupo que consiste emcâncer de mama, cólon, ovariano, endometrial, gástrico,pancreático, prostático e da glândula salivar.

22. Método de detecção de uma célula ou um tecido queexpressa um ou mais membros da família da proteína doreceptor do fator de crescimento epidérmico, o referidométodo caracterizado por compreender:o contato de uma célula ou um tecido com uma porçãoquimérica que compreende anticorpo biespecífico daO reivindicação 1 anexado a um rótulo detectável; ea detecção do referido rótulo, em que a detecção doreferido rótulo em associação com a referida célula outecido indica a presença de uma célula ou um tecido queexpressa um ou mais membros da família da proteína doreceptor do fator de crescimento epidérmico.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que o referido rótulo detectávelé selecionado do grupo que consiste em um emissor gama, umemissor de pósitrons, um rótulo de RMN e um rótulofluorescente.

24. Método, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que o referido rótulo detectávelé um emissor gama e a referida detecção compreende acriação de imagens com uma câmera gama.

25. Método, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que o referido rótulo detectávelé um emissor de pósitrons e a referida detecção compreendea criação de imagens com tomografia por emissão depósitrons (PET).

26. Método, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que o referido rótulo detectávelé um rótulo de RMN e a referida detecção compreende adetecção com a criação de imagens por ressonânciamagnética.

27. Método, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que célula ou tecido queexpressa um ou mais membros da família da proteína doreceptor do fator de crescimento epidérmico é uma célula ouum tecido que superexpressa uma proteína selecionada dogrupo que consiste em EGFR, HER2/neu, HER3 e HER4.

28. Método, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que a célula ou o tecido queexpressa um ou mais membros da família da proteína doreceptor do fator de crescimento epidérmico é uma célula outecido canceroso.

29. Método, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que a célula ou o tecido queexpressa um ou mais membros da família da proteína doreceptor do fator de crescimento epidérmico é uma célula outecido canceroso selecionado do grupo que consiste emcâncer de mama, cólon, ovariano, endometrial, gástrico,pancreático, prostático e da glândula salivar.

30. Método, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que a referida detecçãocompreende uma técnica não invasiva de criação de imagens.

31. Método, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que a referida detecçãocompreende imunoistoquímica.

32. Método, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que a referida detecçãocompreende a detecção em uma amostra ou biópsia de tecido.

33. Método, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que a referida detecçãocompreende a detecção em um corte de tecido.

34. Método, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que a referida detecçãocompreende a detecção da referida célula ou tecido em umser humano.

35. Método, de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que a referida detecçãocompreende a detecção da referida célula ou tecido em umaamostra biológica retirada de um ser humano.

36. Anticorpo Fv de cadeia única biespecíficocaracterizado por possuir um primeiro e um segundo braçosque se ligam especificamente a dois epitopos distintos eestão ligados operacionalmente por meio de uma moléculavinculadora que não possui sítios de clivagem proteolítica,um dos referidos braços possuindo especificidade de ligaçãopara pelo menos um epitopo em um membro da família daproteína do receptor do fator de crescimento epidérmicoselecionado do grupo que consiste em EGFR, HER2/neu, HER3 eHER4, e o outro braço possuindo especificidade de ligaçãopara um segundo epitopo em um membro da família da proteínado receptor do fator de crescimento epidérmico que édiferente do referido primeiro epitopo e é selecionado dogrupo que consiste em EGFR, HER2/neu, HER3 e HER4.

37. Anticorpo Fv de cadeia única biespecífico, deacordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato deque os referidos primeiro e segundo braços são selecionadosdo grupo que consiste em C6.5, C6ML3-9, C6MH3B-1, C6-B1D2,F5, HER3.A5, HER3.F4, HER3.H1, HER3.H3, HER3.E12, HER3.B12,EGFR.E12, EGFR.CIO, EGFR.Bll, EGFR.E8, HER4.B4, HER4.G4,HER4.F4, HER4.A8, HER4.B6, HER4.D4, HER4.D7, HER4.D11,HER4.D12, HER4.E3, HER4.E7, HER4.F8 e HER4.C7.

38. Anticorpo Fv de cadeia única biespecífico, deacordo com a reivindicação 36, caracterizado por serproduzido de forma recombinante.

39. Molécula vinculadora adequada para se ligaroperacionalmente ao primeiro e segundo braços de umanticorpo Fv de cadeia única biespecífico, a referidamolécula vinculadora caracterizada por consistir em umaseqüência de aminoácidos com comprimento que varia de cercade 3 a cerca de 3 0 aminoácidos, em que a referida moléculavinculadora não possui um sítio de clivagem proteolítica.

40. Molécula vinculadora adequada para se ligaroperacionalmente ao primeiro e segundo braços de umanticorpo Fv de cadeia única biespecífico, a referidamolécula vinculadora caracterizada por possuir a seqüênciade aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 11.

41. Anticorpo Fv de cadeia única biespecífico,caracterizado por ter um primeiro e segundo braços que seligam especificamente a dois epitopos distintos e estãoligados operacionalmente por meio da molécula vinculadorade qualquer uma das reivindicações 40 ou 41, os referidosprimeiro e segundo braços possuindo especificidade deligação para dois epitopos distintos em um membro dafamília da proteína do receptor do fator de crescimentoepidérmico selecionado do grupo que consiste em EGFR,HER2/neu, HER3 e HER4.

42. Anticorpo Fv de cadeia única biespecífico, deacordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato deque os referidos primeiro e segundo braços são selecionadosdo grupo que consiste em C6.5, C6ML3-9, C6MH3-B1, C6-B1D2,F5, HER3.A5, HER3.F4, HER3.H1, HER3.H3, HER3.E12, HER3.B12,EGFR.E12, EGFR.CIO, EGFR.Bll, EGFR.E8, HER4.B4, HER4.G4,HER4.F4, HER4.A8, HER4.B6, HER4.D4, HER4.D7, HER4.D11,HER4.D12, HER4.E3, HER4.E7 , HER4.F8 e HER4.C7.

43. Anticorpo Fv de cadeia única biespecífico, deacordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo por serproduzido de forma recombinante.

44. Anticorpo Fv de cadeia única biespecífico, deacordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato deque os referidos primeiro e segundo braços se ligamespecificamente a epitopos distintos expressos em umacélula tumoral, e a ligação do referido anticorpo Fv decadeia única biespecífico aos referidos epitopos causa umadiminuição na sobrevida da referida célula tumoral.

45. Anticorpo Fv de cadeia única biespecífico, deacordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato deque os referidos primeiro e segundo braços são selecionadosdo grupo que consiste em C6.5, C6ML3-9, C6MH3-B 1, C6-B1D2,F5, HER3.A5, HER3.F4, HER3.H1, HER3.H3, HER3.E12, HER3.B12,EGFR.E12, EGFR.ClO, EGFR.B11, EGFR.E8, HER4.B4, HER4.G4,HER4.F4, HER4.A8, HER4.B6, HER4.D4, HER4.D7, HER4.D11,HER4.D12, HER4.E3, HER4.E7, HER4.F8 e HER4.C7.

46. Composição caracterizada por compreender umanticorpo Fv de cadeia única biespecífico da reivindicação 8 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

47. Método para o tratamento de câncer, caracterizadopor compreender a administração a um paciente que delenecessite de uma quantidade terapeuticamente eficaz dacomposição da reivindicação 46.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47,caracterizado pelo fato de que o referido câncer éselecionado do grupo que consiste em câncer de mama, cólon,ovariano, endometrial, gástrico, pancreático, prostático eda glândula salivar.

49. Método para o tratamento de câncer, caracterizadopor compreender a administração a um paciente que delenecessite de uma quantidade terapeuticamente eficaz dacomposição da reivindicação 10 em combinação com outrosagentes citotóxicos selecionados do grupo que consiste emagentes quimioterápicos, radiação de feixe externo,radioisótopos direcionados e inibidores da transdução desinal.

50. Vetor caracterizado por compreender a seqüência deácidos nucléicos que codifica um anticorpo Fv de cadeiaúnica biespecífico da reivindicação 36.

51. Vetor, de acordo com a reivindicação 50,caracterizado por ser selecionado do grupo que consiste emum plasmídeo, cosmídeo, fago e vírus.

52. Vetor, de acordo com a reivindicação 50,caracterizado pelo fato de que o referido vetor compreendeseqüências de ácidos nucléicos selecionado do grupo queconsiste no ID. DE SEQ. N° : 1, ID. DE SEQ. N°: 2, ID. DESEQ. N°: 3, ID. DE SEQ. N°: 4, ID. DE SEQ. N°: 5, ID. DESEQ. N°: 6, ID. DE SEQ. N°: 7, ID. DE SEQ. N°: 8, ID. DESEQ. N°: 9, ID. DE SEQ. N°: 10 e ID. DE SEQ. N°: 14.

53. Vetor, de acordo com a reivindicação 50,caracterizado pelo fato de que o referido vetor compreendeseqüências de ácidos nucléicos que codificam umpolipeptídeo selecionado do grupo que consiste no ID. DESEQ. N°: 27, ID. DE SEQ. N° : 28, ID. DE SEQ. N°: 29, ID. DESEQ. N°: 30, ID. DE SEQ. N°: 31, ID. DE SEQ. N°: 32, ID. DESEQ. N°: 33, ID. DE SEQ. N°: 34, ID. DE SEQ. N° : 35, ID. DESEQ. N°: 36 e ID. DE SEQ. N°: 37.

54. Célula hospedeira caracterizada por sertransformada com o vetor da reivindicação 50.

55. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação-52, caracterizada por ser uma célula tumoral.

56. Anticorpo Fv de cadeia única biespecífico, ALM,caracterizado por compreender um primeiro braço que possuiespecificidade de ligação para HER3, e um segundo braço quepossui especificidade de ligação para HER2/neu.

57. Anticorpo Fv de cadeia única biespecífico, ALF,caracterizado por compreender primeiros e segundos braçosque possuem afinidade de ligação para dois epitoposdistintos em HER3.