CN101355966A - 双特异性单链Fv抗体分子及其使用方法 - Google Patents

双特异性单链Fv抗体分子及其使用方法 Download PDF

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Abstract

公开了可以有利地用于治疗各种形式的癌症的双特异性单链抗体分子，所述癌症与EGFR蛋白质家族成员的超表达有关。

Description

双特异性单链Fv抗体分子及其使用方法
与相关申请的交叉参考
本申请要求于2005年6月15日提交的USSN 11/154,103的优先权和利益，所述USSN 11/154,103为了所有目的整体引入本文作为参考。
关于在联邦赞助研究和开发下进行的发明权利的声明
这项工作部分得到来自下列机构的拨款支持：美国陆军医学研究和装备司令部乳腺癌研究计划(United States Army Medical Researchand Material Command Breast Cancer Research Program)，拨款号：DAMD 17-01-1-0520，和美国国立癌症研究所(The United StatesNational Cancer Institute)，研究所引导拨款号：NCI CA06927。美国政府在本发明中可以具有某些权利。
发明领域
本发明涉及免疫学和肿瘤学领域，且更具体而言，涉及可以有利地用于检测和/或治疗各种癌症的双特异性抗体分子(例如bs scFv)，所述癌症超表达表皮生长因子受体(EGFR)家族的蛋白质。本发明的某些举例说明性双特异性scFv抗体分子具有对于EGFR家族单个成员的任何2种不同表位的结合特异性，或可替代地具有对于EGFR家族的2种不同成员的特异性。
发明背景
表皮生长因子受体(EGFR)信号传导途径在癌症遍及身体的发展和扩散中起重要作用。EGFR也称为erb-b1是4基因家族的成员，所述4基因家族还包括HER2/neu(erb-b2)、HER3(erb-b3)和HER4(erb-b4)。EGFR在宽范围的实体瘤中表达，包括结肠癌、头与颈癌、胰癌、卵巢癌和乳腺癌。
HER2/neu是具有酪氨酸激酶活性的细胞表面受体蛋白。完整的蛋白由3个部分组成：细胞内胞质结构域、短疏水跨膜片段和负责配体结合的胞外结构域(ECD)。这种受体蛋白在多种上皮细胞类型的细胞膜上表达，且通过结合特异性生长因子，调节细胞生长分裂的各个方面。
编码HER2/neu蛋白质的基因Her2/neu是称为原癌基因的一组基因的成员。原癌基因编码涉及正常细胞生长和分化的重要蛋白质，例如生长因子、生长因子受体、和细胞凋亡蛋白质。当原癌基因经由点突变、易位或基因扩增被改变时，它们产生可以导致异常细胞转化和癌症发展的生长信号。
尽管Her2/neu可以在许多正常细胞中以低水平表达，但它在多种癌症中一般超表达。Her2/neu的超表达在大多数情况下由细胞中基因拷贝数(基因扩增)增加和/或Her2/neu基因表达水平增加而引起。这种生长因子受体的超表达通过引起更高的细胞生长和致癌性转化率在肿瘤进展中起关键作用。Her2/neu基因的基因扩增已在多种癌症类型中观察到，包括乳腺、卵巢、子宫内膜、胃、胰、前列腺和唾液腺(Hynes和Stern(1994)Biochim Biophys Acta.，1198：165-184)。在乳腺癌患者中，HER2/neu也已显示出具有临床重要性，因为它与乳腺癌患者中的预后不良、肿瘤复发和存活缩短有关(Seshadri等人(1993)J.Clin.Oncol.，11：1936-1942；Berger等人(1988)Cancer Res.，48：1238-1243；O′Reilly等人(1991)Br.J.Cancer，63：444-446)。
目前，大量注意力已集中在用于治疗癌症的新免疫疗法策略的开发上。一种此类策略是基于抗体的癌症疗法。基于抗体的癌症疗法的主要目标是将有毒有效负载例如放射性同位素、毒素或药物特异性递送给肿瘤。基于抗体结合部位的分子大小范围包括：IgM(1000kDa)、IgG(150kDa)、F(ab＝)2(100kDa)、Fab(50kDa)、(scFv＝)2(55kDa)和scFv(25kDa)。在免疫缺陷小鼠中，较大分子例如IgG和F(ab＝)2片段在人肿瘤异种移植物中保持在具有低特异性程度的高水平(Adams等人(1992)Antibody，Immunoconj.Radiopharm.，5：81-95；Milenic等人(1991)J.Cancer Res.51：6363-6371)，而较小分子例如scFv、(scFv＝)2和Fab在肿瘤中保持在具有极大改善的特异性的相对较低水平(Milenic等人(1991)J.Cancer Res.51：6363-6371；Adams等人(1993)Cancer Res.53：4026-4034；Beaumier等人(1985)J.Nucl.Med.26：1172-1179；Colcher等人(1990)J.Natl.Cancer Inst.82：1191-1197)。
上述靶向特性的最显著决定因素是，对于首过清除率(first passclearance)相对于肾阈值的基于抗体的分子的大小。基于抗体的分子的另一重要特征是效价，因为明显更大的肿瘤保留已伴随与靶抗原的多价结合(Milenic等人(1991)J.Cancer Res.51：6363-6371；Adams等人(1993)Cancer Res.53：4026-4034；Adams等人(1996)Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.37：472；Wolf等人(1993)Cancer Res.53：2560-2565)。
靶向乳腺癌的新型免疫疗法赫赛汀(Herceptin)7近来被开发以靶向超表达Her2/neu的癌细胞。这种治疗已在临床试验中显示对具有HER2/neu阳性转移性乳腺癌的患者提供有效治疗。然而，这种药物治疗是昂贵的且伴随显著的发病率和死亡率。
几种其他类型的疗法已显示在乳腺癌患者中或多或少有效，所述乳腺癌患者的肿瘤表达升高水平的Her2/neu。这些包括被认为在具有扩增的Her2/neu表达的患者中更有效的蒽环类抗生素疗法，和在Her2/neu表达水平高的患者中较不有效的激素疗法。
注意力也已集中在基于二价单链Fv的抗体分子的产生上，所述抗体分子具有对于首过清除率在肾阈值范围内的分子量。这些包括50kDa双抗体(Holliger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448)、55kDa(scFv＝)2(Adams等人(1993)Cancer Res.53：4026-4034)、60-65kDa基于两亲螺旋的scFv二聚体(Pack等人(1993)Bio/Technology 11：1271-1277；Pack(1992)Biochemistry 31：1579-1584)、以及80kDa(scFv-CH3)2LD小抗体(minibody)和Flex小抗体(Hu等人(1996)Cancer Res.56：3055-3061)。尽管这些蛋白质各自能够结合2种抗原分子，但它们在方向、柔性及其结合部位跨度方面不同。这些新和创新免疫疗法被认为将帮助改善乳腺癌及其他癌症中的结果，所述乳腺癌及其他癌症即使使用强烈的多模式治疗也过于频繁复发或进展。
发明概述
本发明涉及双特异性(或多特异性)抗体分子(例如bs scFv)的鉴定，所述抗体分子可以有利地用于检测和/或治疗超表达表皮生长因子受体(EGFR)家族蛋白质的各种癌症。因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含互相连接(直接或通过接头)的第一种抗体和第二种抗体的双特异性抗体，其中所述第一种抗体和所述第二种抗体与不同表位特异性结合，且所述第一种抗体具有对于表皮生长因子受体蛋白家族成员(例如，EGFR、HER2/neu、HER3、HER4)上的至少一种表位的结合特异性(特异性结合)，且所述第二种抗体具有对于表皮生长因子受体蛋白家族成员上的第二种表位的结合特异性(特异性结合)，所述第二种表位不同于所述第一种表位，是选自EGFR、HER2/neu、HER3和HER4的蛋白质上的表位。在某些实施方案中，抗体通过接头进行连接，更优选通过肽接头，且最优选通过缺乏蛋白酶剪切位点的肽接头(例如，具有SEQ ID NO：37的氨基酸序列的接头)。在某些实施方案中，第一种和/或第二种抗体特异性结合由选自下列的抗体特异性结合的表位：C6.5、C6ML3-9、C6MH3-B1、C6-B1D2、F5、HER3.A5、HER3.F4、HER3.H1、HER3.H3、HER3.E12、HER3.B12、EGFR.E12、EGFR.C10、EGFR.B11、EGFR.E8、HER4.B4、HER4.G4、HER4.F4、HER4.A8、HER4.B6、HER4.D4、HER4.D7、HER4.D11、HER4.D12、HER4.E3、HER4.E7、HER4.F8和HER4.C7。在某些实施方案中，第一种和/或第二种抗体包含选自下列的抗体的1个、2个或所有互补性决定区：C6.5、C6ML3-9、C6MH3-B1、C6-B1D2、F5、HER3.A5、HER3.F4、HER3.H1、HER3.H3、HER3.E12、HER3.B12、EGFR.E12、EGFR.C10、EGFR.B11、EGFR.E8、HER4.B4、HER4.G4、HER4.F4、HER4.A8、HER4.B6、HER4.D4、HER4.D7、HER4.D11、HER4.D12、HER4.E3、HER4.E7、HER4.F8和HER4.C7。在某些实施方案中，双特异性抗体或多特异性抗体由包含核酸的载体编码，所述核酸编码选自下列的多肽序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22。在某些实施方案中，双特异性或多特异性抗体由包含2种核酸序列的载体编码，所述2种核酸序列编码由如本文所述的2种核酸序列编码的多肽，例如独立地选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22的多肽。在某些情况下，双特异性抗体由载体编码，所述载体在某些情况下包含如本文所述的至少一种核酸序列，且在某些情况下包含如本文所述的至少2种核酸核酸序列，例如选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22。在某些情况下，载体进一步包含编码具有SEQ IDNO：37的序列的多肽的核酸序列。
在某些情况下，第一种和/或第二种抗体(例如，上述抗体)是单链抗体(例如sc Fv抗体)。当第一种和第二种抗体都是单链抗体时，抗体优选直接附着(以形成单链多肽)，或通过接头、更优选通过肽接头(例如缺乏蛋白酶剪切位点的肽接头)进行附着，以形成单链双特异性或多特异性抗体(例如bs-scFv)。双特异性(或多特异性)抗体是单链抗体，且所述第二种抗体是单链抗体，且所述第一种抗体通过肽接头与所述第二种抗体偶联。
在另一实施方案中，本发明包括组合物，所述组合物包含如本文公开和/或要求保护的双特异性或多特异性抗体、和药学可接受的载体。
本发明还提供了用于治疗癌症(例如减轻癌症的一种或多种症状)的方法。该方法一般包括给有此需要的患者(人或非人动物)施用治疗有效量的、如本文公开和/或要求保护的双特异性或多特异性抗体，和药学可接受的载体。癌症可以包括但不限于，选自乳腺、结肠、卵巢、子宫内膜、胃、胰、前列腺和唾液腺癌的癌症。施用可以通过多种方便方法中的任何一种来进行，包括全身可注射施用、注射入肿瘤或癌性组织内、经口施用等。
在另外一个实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症(例如减轻癌症的一种或多种症状)的方法。该方法一般包括给有此需要的患者(人或非人动物)施用与其他细胞毒剂组合的、治疗有效量的、如本文公开和/或要求保护的双特异性或多特异性抗体和药学可接受的载体，所述其他细胞毒剂选自化学治疗剂、外部束辐射、靶向的放射性同位素和信号转导抑制剂。癌症可以包括但不限于，选自乳腺、结肠、卵巢、子宫内膜、胃、胰、前列腺和唾液腺癌的癌症。施用可以通过多种方便方法中的任何一种来进行，包括全身可注射施用、注射入肿瘤或癌性组织内、经口施用等。
在再一实施方案中，本发明提供了嵌合部分，所述嵌合部分包含与效应物偶联的、如本文公开和/或要求保护的双特异性抗体或多特异性抗体。优选效应物包括但不限于，细胞毒素、标记、放射性核素、药物、脂质体、配体和抗体。在某些情况下，当效应物是多肽时，嵌合部分是融合蛋白、优选重组表达的融合蛋白。
本发明还提供了将效应分子特异性递送给细胞或靶向细胞的方法，所述细胞具有来自表皮生长因子受体蛋白家族(例如，EGFR、HER2/neu、HER3 HER4)的受体。该方法包括提供如本文描述和/或要求保护的嵌合部分，和使所述细胞与所述嵌合部分接触，由此所述嵌合部分与所述细胞特异性结合。优选效应物包括但不限于，细胞毒素、标记、放射性核素、药物、脂质体、配体、抗体等。在某些实施方案中，嵌合部分是融合蛋白。在某些实施方案中，细胞是癌细胞，优选超表达EGFR蛋白质家族的一个或多个成员的癌细胞。特别优选的癌细胞包括但不限于，乳腺、结肠、卵巢、子宫内膜、胃、胰、前列腺和唾液腺癌细胞。
还提供了特异性杀死和/或抑制细胞生长或增殖的方法，所述细胞具有来自表皮生长因子受体蛋白家族(例如，EGFR、HER2/neu、HER3、HER4)的受体。该方法一般包括提供与细胞毒性(cytoxic)或细胞抑制效应物(例如细胞毒素、放射性部分、和包含细胞毒性或细胞抑制剂的脂质体等)附着的、如本文描述和/或要求保护的嵌合部分；和使所述细胞与所述嵌合部分接触，由此所述嵌合部分与所述细胞特异性结合，从而导致细胞死亡、和/或抑制细胞生长和/或增殖。在某些实施方案中，嵌合部分是融合蛋白。在某些实施方案中，细胞是癌细胞，优选超表达EGFR蛋白质家族的一个或多个成员的癌细胞。特别优选的癌细胞包括但不限于，乳腺、结肠、卵巢、子宫内膜、胃、胰、前列腺和唾液腺癌细胞。
本发明还提供了检测和/或显现和/或诊断癌细胞或组织存在的方法。该方法一般包括使细胞或组织与嵌合部分接触，所述嵌合部分包含与可检测标记附着的、如本文描述的双特异性或多特异性抗体；和检测所述标记，其中与所述细胞或组织结合的所述标记的检测指示细胞或组织的存在，所述细胞或组织表达(或超表达表皮生长因子受体蛋白家族的一个或多个成员。优选的可检测标记包括但不限于，γ发射体、正电子发射体、MRI标记和荧光或比色标记。在某些情况下，可检测标记是γ发射体，且检测包含使用γ照相机成像。在某些情况下，可检测标记是正电子发射体，且检测包含使用正电子发射断层照相(PET)成像。在某些情况下，可检测标记是MRI标记，且检测包含使用磁共振成像检测。在某些实施方案中，表达表皮生长因子受体蛋白家族的一个或多个成员的细胞或组织是，超表达选自EGFR、HER2/neu、HER3和HER4的蛋白质的细胞或组织。表达表皮生长因子受体蛋白家族的一个或多个成员的细胞或组织是，可以是癌细胞或组织(例如，乳腺、结肠、卵巢、子宫内膜、胃、胰、前列腺或唾液腺癌)。注意到诊断测定可以是癌症鉴别诊断的组分，和/或可以用于验明(type)癌症作为超表达EGFR蛋白质家族的一个或成员的癌症，和/或测定可以用于显现已知癌症。在这些(及其他)情况下，测定无需决定癌细胞的存在，而是仅仅指示此类细胞或组织的可能存在。在某些实施方案中，检测包含非侵入性成像技术。在某些实施方案中，检测包含免疫组织化学。在某些实施方案中，检测包含在组织样品或活组织检查中的检测。在某些实施方案中，检测包含在组织切片中的检测。在某些实施方案中，检测包含是体内检测。
依照本发明，在某些实施方案中，提供了新型双特异性单链Fv抗体分子(bs-scFv)，所述抗体分子具有对于EGFR蛋白质家族成员的结合亲和力。
在本发明的某些优选实施方案中，bs-scFv抗体具有第一个和第二个臂，所述第一个和第二个臂具有对于EGFR蛋白质家族的不同成员(例如，EGFR、HER2/neu、HER3和HER4)上的2种不同表位的结合亲和力，或对于EGFR蛋白质家族的单个成员上的2种不同表位的结合亲和力，且经由缺乏蛋白酶剪切位点的新型接头分子可操作地连接。这种接头构成本发明的一个方面。配对在一起以形成bs-scFv抗体的臂可以是下列臂中的任何一个，包括C6.5、C6ML3-9、C6MH3-B1、C6-B1D2、F5、HER3.A5、HER3.F4、HER3.H1、HER3.H3、HER3.E12、HER3.B12、EGFR.E12、EGFR.C10、EGFR.B11、EGFR.E8、HER4.B4、HER4.G4、HER4.F4、HER4.A8、HER4.B6、HER4.D4、HER4.D7、HER4.D11、HER4.D12、HER4.E3、HER4.E7、HER4.F8和HER4.C7。在特别优选的实施方案中，臂由具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的接头分子连接在一起。还提供了包含核酸序列的载体和转化体，所述核酸序列编码scFv臂和接头分子。
具有对于EGFR蛋白质家族的2个成员的结合亲和力的示例性bs-scFv抗体是ALM，所述ALM具有对于HER3具有结合特异性的一个臂和对于HER2/neu具有结合特异性的第二个臂。具有对于EGFR蛋白质家族单个成员上的2种表位的结合亲和力的示例性bs-scFv抗体是ALF，所述ALF具有对于HER3上的表位具有结合特异性的一个臂、和对于HER3上的不同表位具有结合亲和力的第二个臂。
在本发明的另一实施方案中，bs-scFv抗体具有对于EGFR蛋白质家族成员的结合亲和力，所述EGFR蛋白质家族成员由肿瘤细胞超表达。
在本发明的再一实施方案中，提供了用于治疗癌症的组合物和方法，其中患者被施用在药学可接受的载体中、治疗有效量的本发明的bs-scFv抗体分子，单独或与其他细胞毒剂组合，例如化学治疗剂、外部束辐射、靶向的放射性同位素和信号转导抑制剂。
定义
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指氨基酸残基聚合物。该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人造化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。该术语还包括连接氨基酸构成多肽的常规肽键上的变体。优选的“肽”、“多肽”和“蛋白质”是其α碳通过肽键连接的氨基酸链。在链的一个末端(氨基端)处的末端氨基酸因此具有游离氨基，而链的另一个末端(羧基端)处的末端氨基酸具有游离羧基。如本文使用的，术语“氨基端”(缩写为N端)指肽氨基端处的氨基酸上的游离α氨基，或肽内任何其他位置处的氨基酸的α氨基(当参与肽键时为亚氨基)。类似地，术语“羧基端”指肽羧基端上的游离羧基，或肽内任何其他位置处的氨基酸的羧基。肽还基本上包括任何聚氨基酸，包括但不限于肽模拟物，例如与酰胺键相对通过醚连接的氨基酸。
如本文使用的，“抗体”指由一个或多个多肽组成的蛋白质，所述多肽基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其反过来限定免疫球蛋白分类，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
一般的免疫球蛋白(抗体)结构单位已知包含四聚体。每个四聚体由2对相同的多肽链组成，每对具有一个“轻”(约25kD)和一个“重”链(约50-70kD)。每条链的N端限定主要负责抗原识别的约100-110或更多氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻和重链。
抗体作为完整免疫球蛋白存在，或作为通过各种肽酶消化产生的众多充分表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中的二硫键下方消化抗体以产生F(ab)′2，Fab的二聚体，其自身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。F(ab)′2可以在温和条件下被还原，以断裂铰链区中的二硫键，从而使得(Fab′)2二聚体变成Fab′单体。Fab′单体基本上是具有部分铰链区的Fab(关于其他抗体片段的更详细描述参见，Fundamental Immunology，W.E.Paul，ed.，Raven Press，N.Y.(1993))。尽管各种抗体片段根据完整抗体的消化进行定义，但技术人员将理解，此类Fab’片段可以以化学方法或通过使用重组DNA方法从头合成。因此，如本文使用的，术语抗体还包括全抗体，通过全抗体修饰产生的抗体片段，或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段。优选抗体包括单链抗体(作为单个多肽链存在的抗体)，更优选单链Fv抗体(scFv)，在所述scFv中可变重链和可变轻链连接在一起(直接或通过肽接头)以形成连续多肽。单链Fv抗体是共价连接的VH-VL异二聚体，其可以由包括VH-和VL-编码序列的核酸表达，所述编码序列直接连接或通过编码肽的接头连接。Huston，等人(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85：5879-5883。尽管VH和VL互相连接为单多肽链，但VH和VL结构域非共价结合。在丝状噬菌体表面上表达的第一种功能性抗体分子是单链Fv′s(scFv)，然而，可替代的表达策略也已是成功的。例如Fab分子可以在噬菌体上展示，如果链(重或轻)之一与g3衣壳蛋白融合，且互补链作为可溶性分子输出至周质的话。2条链可以在相同或不同复制子上编码；重点是每个Fab分子中的2条抗体链翻译后装配，且二聚体经由链之一与例如g3p的连接掺入噬菌体颗粒内(参见，例如，美国专利号5,733,743)。scFv抗体和将来自抗体V区的天然聚集、但化学分开的轻和重多肽链转变成折叠成基本上类似于抗原结合部位结构的三维结构的分子的众多其他结构是本领域技术人员已知的(参见例如，美国专利号5,091,513、5,132,405和4,956,778)。特别优选的抗体应当包括已在噬菌体上展示的所有抗体(例如，scFv、Fv、Fab和二硫键连接的Fv(Reiter等人(1995)Protein Eng.8：1323-1331)，且还包括双特异性、三特异性、四特异性和一般多特异性的抗体(例如，bs scFv)。
就本发明的抗体而言，术语“免疫特异性”“特异性结合”指与目的蛋白质(例如HER2/neu)的一种或多种表位结合，但基本上不识别和结合样品中的其他分子的抗体，所述样品包含抗原生物分子的混合群体。
如本文使用的，术语“双特异性抗体”指包含2个抗原结合部位的抗体，第一个结合部位具有对于第一种抗原或表位的亲和力，且第二个结合部位具有对于不同于第一种的第二种抗原或表位的结合亲和力。
术语“核酸”或“寡核苷酸”或本文的语法等价词指共价连接在一起的至少2个核苷酸。本发明的核酸优选是单链或双链的且一般将包含磷酸二酯键，尽管在某些情况下，如下文概述的，包括可能具有可替代主链的核酸类似物，包含例如磷酰胺(Beaucage等人(1993)Tetrahedron 49(10)：1925)以及其中的参考文献；Letsinger(1970)J.Org.Chem.35：3800；Sprinzl等人(1977)Eur.J.Biochem.81：579；Letsinger等人(1986)Nucl.Acids Res.14：3487；Sawai等人(1984)Chem.Lett.805，Letsinger等人(1988)J.Am.Chem.Soc.110：4470；和Pauwels等人(1986)Chemica Scripta 26：1419)、硫代磷酸酯(Mag等人(1991)Nucleic Acids Res.19：1437；以及美国专利号5,644,048)、二硫代磷酸酯(Briu等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111：2321，O-甲基亚磷酰胺(O-methylphophoroamidite)键(参见Eckstein，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，Oxford UniversityPress)，以及肽核酸主链和键(参见Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.114：1895；Meier等人(1992)Chem.Int.Ed.Engl.31：1008；Nielsen(1993)Nature，365：566；Carlsson等人(1996)Nature 380：207)。其他类似物核酸包括具有阳性主链(Denpcy等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6097；非离子型主链(美国专利号5,386,023，5,637,684，5,602,240，5,216,141和4,469,863；Angew.(1991)Chem.Intl.Ed.English 30：423；Letsinger等人(1988)J.Am.Chem.Soc.110：4470；Letsinger等人(1994)Nucleoside&Nucleotide 13：1597；第2和3章，ASC Symposium Series 580，″Carbohydrate Modifications in AntisenseResearch″，Ed.Y.S.Sanghui和P.Dan Cook；Mesmaeker等人(1994)，Bioorganic&Medicinal Chem.Lett.4：395；Jeffs等人(1994)J.Biomolecular NMR 34：17；Tetrahedron Lett.37：743(1996))和非核糖主链的那些，包括美国专利号5,235,033和5,034,506，以及6和7章，ASC Symposium Series 580，Carbohydrate Modifications in AntisenseResearch，Ed.Y.S.Sanghui和P.Dan Cook中描述的那些。包含一种或多种碳环糖的核酸也包括在核酸定义内(参见Jenkins等人(1995)，Chem.Soc.Rev.第169-176页)。几种核酸类似物在Rawls，C&ENews 1997年6月2日第35页中得到描述。可以进行这些磷酸核糖主链的修饰，以促进另外部分例如标记的添加，或增加此类分子在生理环境中的稳定性和半衰期。
如本文使用的，术语“与......特异性杂交”和“特异性杂交”以及“与......选择性杂交”指核酸分子在严格条件下优先与特定核苷酸序列结合、双链体化或杂交。术语“严格条件”指在其中探针将优先与其靶子序列杂交，且与其他序列的杂交程度较低或根本不杂交的条件。在核酸杂交背景下的严格杂交和严格杂交的洗涤条件是序列依赖性的，且在不同环境参数下是不同的。关于核酸杂交的详尽指导在例如Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology--Hybridization with Nucleic Acid Probes第I部分，第2章，Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidprobe assays，Elsevier，NY(Tijssen)中可以找到。一般地，在限定离子强度和pH下，对于特定序列选择比热解链温度(Tm)低约5℃的高度严格杂交和洗涤条件。Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在限定离子强度和pH下)。选择等于对于特定探针的Tm的非常严格条件。在阵列上或在DNA印迹或RNA印迹中的过滤器上对于互补核酸杂交的严格杂交条件的例子是42℃，其中使用标准杂交溶液(参见例如，Sambrook(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版)第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborPress，NY，以及下文的详细讨论)，其中杂交进行过夜，所述互补核酸具有超过100个互补残基。高度严格的洗涤条件的例子是0.15MNaCl于72℃约15分钟。严格洗涤条件的例子是于65℃0.2x SSC洗涤15分钟(关于SSC缓冲液的描述参见例如，Sambrook同上))。通常，在高严格性洗涤之前进行低严格性洗涤以去除背景探针信号。关于例如超过100个核苷酸的双链体的中等严格性洗涤的例子，是1x SSC于45℃15分钟。关于例如超过100个核苷酸的双链体的低严格性洗涤的例子，是4x-6x SSC于40℃15分钟。
当应用于RNA时，术语“分离的核酸”主要指由如上文限定的分离的DNA分子编码的RNA分子。可替代地，该术语可以指已与在其天然状态(即，在细胞或组织中)中它将与之结合的其他核酸充分分离的RNA分子。“分离的核酸”(DNA或RNA)可以进一步表示通过生物或合成方法直接产生、且在其生产期间与存在的其他组分分离的分子。
“复制子”是能够在其自身控制下大量复制的任何遗传元件，例如质粒、粘粒、杆粒、质体、噬菌体或病毒。复制子可以是RNA或DNA且可以是单链或双链的。
“载体”是另一种遗传序列或元件(DNA或RNA)可以与之附着从而使所附着的序列或元件发生复制的复制子，例如质粒、粘粒、杆粒、噬菌体或病毒。
“表达操纵子”指可以具有转录和翻译控制序列，例如启动子、增强子、翻译起始信号(例如，ATG或AUG密码子)、多腺苷酸化信号、终止子等，且促进多肽编码序列在宿主细胞或生物中的表达的核酸片段。
如本文使用的，术语“引物”指当置于正确环境中时，能够在功能上充当模板依赖性核酸合成的起始物的寡核苷酸，其为RNA或DNA，单链或双链，来源于生物系统、由限制酶消化产生、或合成产生。当与合适的核酸模板，核酸的合适核苷三磷酸前体、聚合酶、合适辅因子和条件例如合适的温度和pH一起呈现时，引物可以通过聚合酶的作用或类似活性通过添加核苷酸在其3’端进行延伸，以产生引物延伸产物。引物的长度可以依赖于应用的具体条件和要求而变。通常引物长度为约15-约25个或更多个核苷酸。引物一般具有针对所需模板的足够互补性，以引发所需延伸产物的合成。换言之，引物能够以足够以合适的并列提供引物3’羟基部分的方式与所需模板链退火，以用于在通过聚合酶或类似酶的合成起始中使用。引物序列无需代表所需模板的精确互补物。例如，非互补的核苷酸序列可以与在其他方面互补的引物的5’端附着。可替代地，非互补碱基可以散布在寡核苷酸引物序列内，前提条件是引物序列与所需模板链序列具有足够的互补性，以在功能上提供模板-引物复合物用于合成延伸产物。
聚合酶链反应(PCR)已在美国专利4,683,195、4,800,195和4,965,188中得到描述，所述专利的完整公开内容引入本文作为参考。
如本文使用的，术语“报道分子”、“报道系统”、“报道基因”或“报道基因产物”应意指操作的遗传系统，其中核酸包含编码产物的基因，当所述产物被表达时产生可通过例如生物测定、免疫测定、放射免疫测定，或通过比色、荧光、化学发光或其他方法容易测量的报道信号。核酸可以是RNA或DNA，线性或环状，单链或双链，反义或有义极性的，且与对于报道基因产物表达的所需控制元件可操作地连接。控制元件将依照报道系统的性质而变，且无论报道基因是DNA还是RNA的形式，但可以包括但不限于，此类元件如启动子、增强子、翻译控制序列、加polyA信号、转录终止信号等。
术语“转化”、“转染”、“转导”应指通过其核酸被引入细胞或宿主生物内的任何方法或手段，且可以互换使用以传达相同含义。此类方法包括但不限于，转染、电穿孔、显微注射、PEG融合等。引入的核酸可以整合(共价连接)或不整合到受体细胞或生物的核酸内。例如，在细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞中，引入的核酸可以作为游离型元件或独立的复制子例如质粒被维持。可替代地，引入的核酸可以变得整合到受体细胞或生物的核酸内，且可以稳定地维持在那种细胞或生物中，且进一步传递或遗传给受体细胞或生物的后代细胞或生物。最后，引入的核酸可以仅仅短暂地存在于受体细胞或宿主生物中。
术语“选择标记基因”指当表达时赋予转化的细胞或植物选择表型例如抗生素抗性的基因。
术语“可操作地连接”意指编码序列表达所需的调节序列在DNA分子中以相对于编码序列的合适位置放置，以便实现编码序列的表达。这个相同定义有时应用于表达载体中转录单位和其他转录控制元件(例如增强子)的排列。
在2个或更多个核酸或多肽序列的背景中，术语“相同”或百分比“同一性”指，当对于最大的一致进行比较和比对时，相同或具有指定的相同氨基酸残基或核苷酸百分比的2个或更多个序列或子序列，如使用下列序列比较算法之一或通过目检测量的。就本发明的肽而言，序列同一性在肽的全长上进行测定。
对于序列比较，一般地一个序列充当参考序列，测试序列与之进行比较。当使用序列比较算法时，测试和参考序列都被输入计算机内，必要时指定子序列座标，且指定序列算法程序参数。序列比较算法随后基于指定的程序参数计算一种或多种测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
关于比较的最佳序列比对可以通过下列来进行：例如Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法、Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法、Pearson&Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444的搜索相似性方法、这些算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或目检(一般参见Ausubel等人，同上)。
有用的算法的一个例子是PILEUP。PILEUP使用渐进的逐对比对由一组相关序列产生多重序列比对，以显示关系和百分比序列同一性。它还描绘显示用于产生比对的聚类关系的树或系统树图(dendogram)。PILEUP使用简化的Feng&Doolittle(1987)J.Mol.Evol.35：351-360渐进比对法。使用的方法类似于由Higgins&Sharp(1989)CABIOS 5：151-153描述的方法。该程序可以比对最高达300个序列，所述序列各自具有最大5,000个核苷酸或氨基酸的长度。多重比对程序从2个最相似序列的逐对比对开始，从而产生2个比对序列的聚簇。这个聚簇随后与下一个最相关的序列或比对序列的聚簇进行比对。2个序列的聚簇通过2个单个序列的逐对比对的简单延伸进行比对。最终比对通过一系列渐进的逐对比对来完成。该程序通过指定关于序列比较区域的特定序列及其氨基酸或核苷酸座标，和通过指定程序参数来进行。例如，参考序列可以与其他测试序列进行比较，以使用下列参数测定百分比序列同一性关系：缺省缺口权重(3.00)、缺省缺口长度权重(0.10)和加权的末端缺口。
适合于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的另一个例子是BLAST算法，它在Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中得到描述。用于进行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)可公开获得。这种算法包括首先通过鉴定查询序列中长度W的短字来鉴定高得分序列对(HSPs)，当与数据库序列中相同长度的字进行比对时，所述HSPs匹配或满足某些正值阈值得分T。T称作邻域字得分阈值(Altschul等人，同上)。这些起始邻域字命中(hit)充当用于起始搜索的种子，以找到包含它们的更长HSPs。字命中随后沿着每个序列在2个方向上进行延伸，直到累积比对得分可以增加的程度。对于核苷酸序列，累积得分使用参数M(对于一对匹配残基的奖励得分；总是＞0)和N(对于错配残基的罚分；总是＜0)进行计算。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积得分。当：累积比对得分从其最大达到的值减少量X；由于一个或多个负得分残基比对的积聚，累积得分变成零或零以下；或达到任一序列末端时，字命中在每个方向上的延伸被停止。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望(E)10、M＝5、N＝-4、和2条链的比较作为缺省值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)3、期望(E)10、和BLOSUM62评分矩阵作为缺省值(参见Henikoff&Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。
除了计算百分比序列同一性之外，BLAST算法还进行2个序列之间的相似性的统计学分析(参见，例如，Karlin&Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5787)。由BLAST算法提供的一种相似性测量是最小总和概率(P(N))，它提供了通过其2个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配将偶然发生的概率指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.1，更优选小于约0.01，且最优选小于约0.001，那么核酸视为类似于参考序列。
短语“特异性靶向/递送”当例如关于本发明的嵌合部分使用时，指部分与靶(例如超表达一种或多种靶蛋白的细胞)的特异性结合，这导致与不使用“特异性”靶向所获得的那种相比，部分在细胞处或细胞内的局部持续时间和/或浓度增加。这种特异性无需是绝对的，而仅仅是与对于正常表达一种或多种靶蛋白的细胞(例如野生型)观察到的那种相比，或与对于不表达一种或多种靶蛋白的细胞观察到的那种相比，可检测地更大的/可测量地抗体亲抗原性/亲和力。
氨基酸残基在本申请中根据标准3字母或1字母缩写(例如，如WIPO标准ST 25中所示)和/或如表1中所示进行鉴定。
表1.氨基酸缩写。
Figure A20068002968700231
本文描述的对映体氨基酸优选“L”同分异构形式。然而，“D”同分异构形式的残基可以取代任何L氨基酸残基，前提条件是多肽的所需特性被保留。本文显示的所有氨基酸残基序列符合常规的左至右氨基端至羧基端方向。
术语“分离的蛋白质”或“分离和纯化的蛋白质”在本文中有时使用。这个术语主要指通过本发明的分离的核酸分子表达产生的蛋白质。可替代地，这个术语可以指已与它将与之天然结合的其他蛋白质充分分离的蛋白质，从而以“基本上纯”的形式存在。“分离的”不意味着排除与其他化合物或材料的人造或合成混合物，或杂质的存在，所述杂质不干扰基本活性，且可以例如由于不完全纯化、稳定剂的添加、或化合到例如免疫原性制剂或药学可接受的制剂内而存在。
术语“基本上纯”指包含至少50-60重量％的给定材料(例如，核酸、寡核苷酸、蛋白质等)的制剂。更优选地，制剂包含至少75重量％，且最优选90-95重量％的给定化合物。纯度通过对给定化合物合适的方法(例如，层析法、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等)进行测量。
如本文使用的，术语“有功能的”意指核酸或氨基酸序列对于所述测定或目的是有功能的。
短语“基本上由......组成”当指特定核苷酸或氨基酸时，意指具有给定SEQ ID NO的特性的序列。例如，当关于氨基酸序列使用时，该短语包括该序列本身和不会影响序列的基本和新型特征的分子修饰。
术语“标记”、“标记序列”或“蛋白质标记”指当加入另一个序列中时，特别是在那种序列的检测或分离中提供另外效用或赋予有用特性的化学部分，其是核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸或氨基酸、肽或蛋白质或其他化学制品。因此，例如，同聚物核酸序列或与捕获寡核苷酸互补的核酸序列可以加入引物或探针序列中，以促进延伸产物或杂交产物的后续分离。在蛋白质标记的情况下，组氨酸残基(例如，4-8个连续组氨酸残基)可以加入蛋白质的氨基或羧基端，以促进通过螯合金属层析的蛋白质分离。可替代地，表现与特异性抗体分子或其他分子反应的表位或结合决定簇的氨基酸序列、肽、蛋白质或融合配偶体(例如，flag表位、c-myc表位、流感A病毒血凝素蛋白质的跨膜表位、A蛋白、纤维素结合结构域、钙调蛋白结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、壳多糖结合结构域、谷胱甘肽S-转移酶等)可以加入蛋白质中，以促进通过程序例如亲和或免疫亲和层析的蛋白质分离。化学标记部分包括此类分子如生物素，它可以加入核酸或蛋白质中且通过与抗生物素蛋白试剂等的相互作用促进分离或检测。众多其他标记部分是技术人员已知的，且可以由技术人员预想，且预期在这个定义的范围内。
“克隆”或“克隆细胞群体”是由单细胞或共同祖先例如通过有丝分裂获得的细胞群体。
“细胞系”是能够在体外稳定生长许多代的原代细胞克隆或细胞群体。
附图简述
图1显示了pUC/ALM载体的示意图。
图2显示的图举例说明了ALM蛋白质与BIAcore芯片上的HER3胞外结构域的结合。
图3显示的图举例说明了ALM蛋白质与BIAcore芯片上的HER2/neu胞外结构域的结合。
图4显示的图举例说明了ALM蛋白质与BIAcore芯片上的HER3和HER2/neu的同时结合。
图5A和5B所示的流式细胞术结果图显示，在ALM与表达HER2/neu和HER3两者的人BT-474乳腺癌细胞在体外温育后，细胞表面HER2/neu和HER3中的减少。
图6所示的MTT测定结果图证明，ALM使表达HER2/neu和HER3两者的BT-474乳腺癌细胞增殖减少。
图7显示的图举例说明了17天克隆发生测定的结果，从而证明BT-474细胞与ALM温育导致集落形成(细胞存活)的50％减少，所述ALM的浓度与细胞表面的HER2/neu表达等摩尔(equalimolar)。
图8所示的蛋白质印迹分析显示，在不同浓度的ALM与表达HER2/neu和HER3两者的人BT-474乳腺癌细胞在体外温育后，在48小时内AKT磷酸化中的改变。
图9显示的图绘制了I标记的ALM在48小时内在免疫缺陷小鼠中的生物分布。
图10举例说明了用于标记根据本发明的双特异性抗体的螯合物211At-SAPS。
图11A至11C显示了与未处理的对照(图11A)相比，211At缀合的ALM在10μg的低剂量(图11C)和80μg的高剂量(图11B)的效应。
图12举例说明了使用124I标记的双特异性抗体(ALM)在小鼠中的特异性肿瘤标记。scid小鼠的PET(上右)和CT(上左)图像，所述scid小鼠具有表达HER2/neu和HER3抗原的SK-OV-3卵巢癌异种移植物，且在FCCC的G.E.Discovery LS上注射后48小时成像。CT载玻片厚度为0.63mm。图像融合(下右)使用MIM软件来进行。
图13显示了如由Adams实验室测定且在某些bs-scFv分子构建中使用的ScFv轻和重链序列。给出了关于C6.5重链(SEQ ID NO：38)、G98A重链(SEQ ID NO：39)、ML3-9重链(SEQ ID NO：40)、H3B1重链(SEQ ID NO：41)、B1D2重链(SEQ ID NO：42)、C6.5轻链(SEQID NO：43)、G98A轻链(SEQ ID NO：44)、ML3-9轻链(SEQ ID NO：45)、H3B1轻链(SEQ ID NO：46)和B1D2轻链(SEQ ID NO：47)的序列。
图14显示了在由Marks实验室提供的IDEC载体中生产的所有IgG的重和轻链可变区的推导蛋白质序列。在某些实施方案中，scFvs的序列可以不同于这个。给出了关于C6.5重链(SEQ ID NO：48)、G98A重链(SEQ ID NO：49)、ML3-9重链(SEQ ID NO：50)、H3B1重链(SEQ ID NO：51)、B1D2重链(SEQ ID NO：52)、C6.5轻链(SEQ IDNO：53)、G98A轻链(SEQ ID NO：54)、ML3-9轻链(SEQ ID NO：55)、H3B1轻链(SEQ ID NO：56)和B 1D2轻链(SEQ ID NO：57)的序列。
详述
肿瘤通常超表达结合各种配体配体的生长因子受体，且促进无限制的肿瘤生长。此类生长因子受体的一个例子是表皮生长因子受体(EGFR)蛋白质家族。
通过表皮生长因子受体(EGFR)蛋白质家族成员的信号转导依赖于由配体结合触发的同二聚体或异二聚体形成。这个受体家族包含4种膜结合蛋白：EGFR、HER2/neu、HER3和HER4。这些蛋白质的超表达已与许多癌症类型中的预后不良相互关联，所述癌症包括但不限于，乳腺、结肠、卵巢、子宫内膜、胃、胰、前列腺和唾液腺癌。尽管许多组已开发了靶向EGFR蛋白质家族的单个成员(例如，HER2/neu或EGFR)以抑制肿瘤生长的策略，但这些处理中没有一个已证明最终治愈这些癌症形式。
依照本发明，已开发了能够同时靶向EGFR蛋白质家族的多个成员多个成员(或给定成员上的多个位点)的新型抗体构建体。该抗体构建体一般包含互相连接的第一种抗体和第二种抗体，其中所述第一种抗体和所述第二种抗体与EGFR蛋白质家族的相同或不同成员上的不同表位特异性结合。在某些实施方案中，双特异性抗体构建体是双特异性单链分子(例如双特异性单链Fv(bs-scFv))，但该构建体不必被如此限制。因此，例如，化学缀合的全抗体或抗体片段也预期在本发明的范围内。一般而言，当本文描述双特异性抗体时，应当理解三特异性或更一般而言多特异性抗体也是被预期的。
本发明的双特异性抗体与EGFR蛋白质家族的选择的成员(例如，EGFR、HER2/neu、HER3、HER4)结合，以阻止配体诱导的信号传导和/或触发细胞抑制和/或细胞毒性效应。双特异性抗体还可以用于特异性标记癌细胞、实体瘤等，且更一般而言，用于将任何缀合或以其他方式偶联的效应物(例如，放射性同位素、标记、细胞毒素、药物、脂质体、抗体、核酸、树状聚体(dendrimer)等)特异性靶向/递送给癌细胞，所述癌细胞包括但不限于，分离的癌细胞、转移细胞、实体瘤细胞等。
在某些优选实施方案中，本发明的双特异性抗体是双特异性单链Fv抗体(bs-scFv)。单链Fv抗体片段是工程改造的抗体衍生物，所述抗体衍生物包括通过肽接头分子连接的重和轻链可变区且可能比未修饰的IgG抗体更有效，因为它们减少的大小允许它们比IgG抗体更容易地穿透组织和实体瘤。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体(例如bs-scFv抗体分子)包含提供2种不同结合特异性的2个结构域。第一个结构域具有对于EGFR蛋白质家族的一个成员上的表位的结合特异性，且第二个结构域具有对于EGFR蛋白质家族的第二个成员上的表位的结合特异性。本发明的示例性bs-scFv分子是“ALM”；生成的具有显示对HER2/neu上的表位的结合特异性的一个臂(结构域)和显示对HER3上的表位的结合特异性的第二个臂(结构域)的双特异性抗体。
可替代地，本发明的双特异性抗体可以如此产生，从而使得一个结构域具有对于EGFR蛋白质家族成员上的一种表位的结合特异性，且第二个结构域具有对于EGFR蛋白质家族的相同成员上的第二个不同表位的结合特异性。这种类型的示例性bs-scFv是“ALF”，它由具有对于HER3的特异性的2种不同scFV分子组成。
I.形成本发明的双特异性或多特异性抗体的抗体
如上文指出的，本发明的双特异性或多特异性抗体一般包含2个或更多个结合结构域，所述结合结构域中的至少2个对于EGFR蛋白质家族的不同表位特异。本发明的优选抗体包含对于EGFR、HER2/neu、HER3和HER4的表位特异的结构域。
使用噬菌体展示方法，已产生了对于EGFR蛋白质家族的这些成员上的各种表位特异的许多单链抗体。这些单链Fv抗体可以用作结构域/臂，以构建根据本发明的双特异性或多特异性抗体。在下表2以及图13和14中提供了许多这些抗体。每个臂(抗体)可以与不同臂进行配对以形成具有对于EGFR蛋白质家族的不同成员上的2种不同表位的结合特异性的bs-scFv抗体，或具有对于EGFR蛋白质家族的相同成员上的2种不同表位的结合特异性的bs-scFv抗体。
表2.针对EGFR蛋白质家族的表位的单链Fv抗体。
Figure A20068002968700291
*序列公开于Schier等人(1996).J.Mol.Biol.，255(1)：28-43。还参见Schier等人(1995)Immunotechnology，1：73-81。
**序列在下文的附录A中提供；
***序列还在图13和14中显示。
然而本发明的双特异性或多特异性抗体无需限制于表2和/或图13或14中列举的具体抗体的使用。实际上，表2和/或图13或14中列举的每种抗体鉴定EGFR蛋白质家族成员的表位，且这些抗体可以容易地用于鉴定与相同表位结合的其他抗体。因此，在某些实施方案中，本发明的双特异性或多特异性抗体包含一个或多个结构域，所述结构域特异性结合由表2和/或图13或14的抗体(例如，选自C6.5、C6ML3-9、C6MH3-B1、C6-B1D2、F5、HER3.A5、HER3.F4、HER3.H1、HER3.H3、HER3.E12、HER3.B12、EGFR.E12、EGFR.C10、EGFR.B11、EGFR.E8、HER4.B4、HER4.G4、HER4.F4、HER4.A8、HER4.B6、HER4.D4、HER4.D7、HER4.D11、HER4.D 12、HER4.E3、HER4.E7、HER4.F8和HER4.C7的抗体)特异性结合的表位。
此类抗体通过筛选全抗体、抗体片段或单链抗体与表2中列举的抗体竞争结合包含靶表位的蛋白质的能力容易地鉴定。换言之，可以筛选候选抗体与表2和/或图13或14中列举的抗体针对EGFR蛋白质家族中的靶蛋白的交叉反应性。
在优选实施方案中，本发明的抗体与由表2和/或图13或14中列举的抗体识别的一种或多种表位特异性结合。换言之，特别优选的抗体与这些抗体中的一种或多种交叉反应。测定交叉反应性的方法是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，Dowbenko等人(1988)J.Virol.62：4703-4711)。
例如，在某些实施方案中，交叉反应性可以通过下列进行确定：提供与固体支持体附着的分离的EGFR家族成员(例如，EGFR、HER2/neu、HER3和HER4或其片段)，和测定测试抗体与表2中列举的一种或多种抗体竞争结合靶蛋白的能力。因此，竞争结合形式的免疫测定可以用于交叉反应性测定。例如，在一个实施方案中，EGFR家族成员多肽被固定化在固体支持体上。将待测试的抗体(例如，通过从噬菌体展示文库中选择产生的，或在全抗体文库中产生的)加入测定中，与表2和/或图13或14中列举的抗体中的一种或多种竞争结合固定化多肽。比较测试抗体与表2和/或图13或14的抗体竞争结合固定化蛋白质的能力。随后可以使用标准计算来计算上述蛋白质的百分比交叉反应性。如果测试抗体与表2和/或图13或14抗体中的一种或多种竞争，且具有可比较的结合亲和力，或大于约1×10-8M、更优选大于1×10-9、或1×10-10的结合亲和力，或更一般而言具有等于或大于例如表2的相应(竞争)抗体的亲和力，那么该抗体非常适合于在本发明中使用。
在特别优选的实施方案中，交叉反应性通过在BIAcore中使用表面等离子体共振来进行。在BIAcore流动池中，EGFR蛋白质与传感器芯片偶联。使用5(1/分钟的一般流速，在流动池表面上注射100nM-1(M抗体的滴定约5分钟，以测定导致表面接近饱和的抗体浓度。表位作图或交叉反应性随后使用抗体对进行评估，所述抗体对的浓度导致接近饱和以及至少100RU结合的抗体。对于对的每个成员测定结合的抗体的量，且随后将2个抗体混合在一起以得到等于用于测量单个抗体的浓度的终浓度。当一起注射时识别不同表位的抗体显示结合的RU中基本上加性的增加，而识别相同表位的抗体只显示RU中最低的增加。在特别优选的实施方案中，如果当一起“注射”时，它们显示基本上加性的增加(优选增加至少约1.4倍，更优选增加至少约1.6倍，且最优选增加至少约1.8或2倍，那么抗体被说成是可交叉反应的。
由表2和/或图13或图14中列举的抗体识别的表位处的交叉反应性可以通过许多其他标准技术来确定(参见，例如，Geysen等人(1987)J.Immunol.Meth.102：259-274)。
此外，表2中鉴定的许多抗体已被测序(参见，例如图13和14)。包含互补性决定区(CDRs)的氨基酸序列因此是已知的。使用这种序列信息，相同或相似的互补性决定区可以被工程改造到其他抗体内，以产生嵌合型实际尺寸抗体和/或抗体片段，例如，以确保种类相容性、增加血清半衰期等。产生嵌合抗体的大量方法是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，美国专利号：5,502,167、5,500,362、5,491,088、5,482,856、5,472,693、5,354,847、5,292,867、5,231,026、5,204,244、5,202,238、5,169,939、5,081,235、5,075,431和4,975,369)。
简言之，使用常规方法，表2中列举的抗体可以容易地用于产生或鉴定与相同表位结合的其他抗体(全长、抗体片段、单链等)。类似地，表2中列举的抗体可以容易地用于产生具有相同或相似互补性决定区(CDRs)的其他抗体。
II.双特异性抗体分子的制备：
针对EGFR蛋白质家族成员上发现的表位的抗体(例如表2中列举的抗体)可以用于制备本发明的双特异性或多特异性抗体。2个(或更多个)抗体可以使用多种方法进行制备。例如，抗体可以分开制备(例如，使用化学蛋白质合成、重组表达方法、杂交瘤技术等)且随后以化学方法直接或通过接头互相附着。当2个抗体都是在末端处直接连接或通过肽接头连接的单链抗体时，双特异性或多特异性分子可以以化学方法合成，或更优选地重组表达。
以化学方法缀合分子的方法是本领域技术人员众所周知的。用于以化学方法偶联2个抗体的程序是简明的。多肽一般包含多种官能团；例如，可用于与相应抗体或接头上的合适官能团反应的羧酸(COOH)或游离胺(-NH2)基团。
可替代地，抗体可以进行衍生以暴露或附着另外的活性官能团。衍生可以包括附着许多接头分子中的任何一种，所述接头分子例如可从Pierce Chemical Company，Rockford Illinois获得的那些。多种合适的接头是本领域技术人员已知的(参见，例如，欧洲专利申请号188,256；美国专利号4,671,958，4,659,839，4,414,148，4,699,784；4,680,338；4,569,789；和4,589,071；和Borlinghaus等人(1987)Cancer Res.47：4071-4075)，且合适的接头也在下文关于效应物与双特异性抗体的偶联进行描述。
在本发明的某些优选实施方案中，bs-scFv抗体分子通过在宿主细胞中表达产生的重组抗体片段来产生。关于靶向EGFR蛋白质家族成员上的各种表位的几种scFv分子的基因已被克隆(参见，例如，附录A和Schier等人(1996)J.Mol.Biol.，(1)：28-43)，且这些scFv基因的对(或其他组合)可以直接或经由接头分子可操作地进行连接。将所得到的编码bs-scFv抗体片段的核酸分子插入表达载体内且引入宿主细胞内。所得到的bs-scFv抗体分子随后从表达系统中进行分离和纯化。
在本发明的某些优选实施方案中，scFv抗体分子与新型接头分子配对在一起，所述接头分子被设计成保护bs-scFv抗体分子不受蛋白水解降解。这种接头一般缺乏蛋白酶剪切位点且一般特征在于主要包含中性(不带电的)氨基酸。一种此类接头序列具有下述序列：Asn Ser GlyAla Gly Thr Ser Gly Ser Gly Ala Ser Gly Glu Gly Ser Gly Ser Lys Leu(SEQ ID NO：37)。
基于下述因素将表2中提供的scFv掺入新bs-scFv内：(1)对于给定靶的递减亲和力，(2)缺乏交叉反应性表位(如通过在BIAcore上的结合抑制和夹心测定所测定的)，(3)靶向仍未配对的EGFR家族成员对的组合，和(4)包含scFv臂，所述scFv臂当在其他bs-scFv组合中使用时，已导致生长抑制和信号转导改变。
本发明的bs-scFv抗体分子的纯度可以使用本领域技术人员已知的标准方法进行评估，所述方法包括但不限于，ELISA、免疫组织化学、离子交换层析、亲和层析、固定化金属亲和层析(IMAC)、大小排阻层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、蛋白质印迹、表面等离子体共振和质谱分析。
使用本文提供的抗体、核酸序列和其他教导，本发明的双特异性或多特异性抗体可以使用常规方法进行重组表达，所述方法例如Sambrook等人(1989)Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratory，或Ausubel等人(eds)(1997)Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons N.Y.中所述的那些。此外生产本发明的重组双特异性单链抗体的举例说明性方法在实施例中阐述。就提及的具体材料而言，它仅仅用于举例说明性目的且不预期限制本发明。
III.包含双特异性和/或多特异性抗体的嵌合部分
在许多实施方案中，无需使用任何另外的“效应物”，本发明的双特异性和/或多特异性抗EGFR家族成员抗体即能抑制癌细胞生长和/或增殖，在某些实施方案中，双特异性和/或多特异性抗体另外与效应物偶联，从而形成将效应物优先靶向/递送给细胞的嵌合部分，所述细胞超表达EGFR家族的一个或多个成员。
因为EGFR蛋白质经常在癌细胞中发现是上调的，所以这些蛋白质可以可以用作将效应物(例如效应分子，例如细胞毒素、放射性标记等)有效和特异性递送给各种癌细胞(例如，分离的细胞、转移的细胞、实体瘤细胞等)，特别是上皮癌细胞(例如乳腺癌细胞)的一种或多种靶。一种或多种靶EGFR蛋白无需单独存在于癌细胞上以提供有效靶。与健康细胞相比较，EGFR在癌细胞上的差异表达足以提供显著和有用的靶向优势，即导致效应物部分优先递送给靶(例如癌)细胞和/或递送到靶(例如癌)细胞内。
在某些优选实施方案中，本发明的双特异性或多特异性抗体在“预靶向(pretargeting)”策略中使用(从而导致在效应物部分施用后在靶位点处形成嵌合部分)，或在“靶向”策略中使用，在所述“靶向”策略中双特异性和/或多特异性抗体在用于提供嵌合部分之前与效应分子偶联。
嵌合分子或嵌合组合物或嵌合部分指分子或组合物，其中在其天然状态下分开存在的2个或更多个分子或组合物被连接在一起，以形成具有其成分成员的所需功能性的单分子部分或组合物。一般地，嵌合部分(poetu)的成分分子之一是“靶向分子”，即在本文情况下是特异性结合EGFR家族的一个或多个成员的双特异性或多特异性抗体。
嵌合分子的另一个成分是“效应物”。效应分子指被特异性转运到靶细胞(例如，超表达EGFR家族成员的细胞)的分子或一组分子。效应分子一般具有被递送给靶细胞的特征活性。效应分子包括但不限于，细胞毒素、标记、放射性核素、配体、抗体、药物、脂质体等。
在某些实施方案中，效应物是可检测标记，而优选的可检测标记包括放射性核素。在本发明的放射性核素-螯合剂-(例如生物素)缀合物中有用的放射性核素和标记中，γ发射体、正电子发射体、X射线发射体和荧光发射体适合于定位、诊断和/或疾病分期、和/或治疗，而β和α发射体以及电子和中子俘获剂，例如硼和铀，也可以用于治疗。
可检测标记可以与外部检测器和/或内部检测器结合使用，且提供有效定位和/或显现，例如超表达一个或多个EGFR家族成员的癌细胞的手段。此类检测/显现可以在各种背景中有用，包括但不限于手术前和手术内设置。因此，在某些实施方案中，本发明涉及手术内检测和定位哺乳动物身体内具有EGFR家族标记的组织的方法。这些方法一般包括给哺乳动物施用包含足以通过检测器(例如，γ检测探针)进行检测的量的本发明的双特异性和/或多特异性抗体的组合物，所述本发明的双特异性和/或多特异性抗体用可检测标记进行标记(例如用放射性同位素，例如161Tb、123I、125I等标记的本发明的抗MUC-1抗体)，和允许活性物质被靶组织吸收后，且优选在标记的血液清除后，在身体的相关区域中对哺乳动物实施放射免疫检测技术，例如通过使用γ检测探针。
标记结合的双特异性和/或多特异性抗体抗体可以在放射导向(radioguided)外科手术技术中使用，其中受试者身体内的相关组织可以借助于检测器例如γ检测探针进行手术内检测和定位。外科医生可以在手术内使用这种探针以发现其中已发生用放射性同位素标记的化合物的摄取的组织，所述放射性同位素即例如低能量γ光子发射体。
除了可检测标记之外，优选效应物包括细胞毒素(例如，假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、白喉毒素等)、或细胞毒性药物或前体药物，在这种情况下嵌合部分可以充当有效的细胞杀死剂，将细胞毒素特异性靶向具有一种或多种EGFR家族成员的细胞。
在再其他的实施方案中，效应物可以包括胶囊化药物(例如抗癌药，例如阿霉素(doxirubicin)、长春碱、紫杉醇等)、通过免疫系统组分刺激识别结合的细胞的抗原、特异性结合免疫系统组分且将它们导向一种或多种靶细胞的抗体等的脂质体。
A)双特异性或多特异性抗EGFR家族成员靶向分子。
在本发明的方法和组合物的优选实施方案中，靶向部分是如本文所述的、与EGFR家族的一个或多个成员特异性结合的双特异性和/或多特异性抗体。双特异性和/或多特异性抗体可以包含全长抗体、一种或多种抗体片段(例如，Fv、Fab等)、和/或单链抗体(例如scFv)。
B)某些优选效应物。
1)成像组合物。
在某些实施方案中，本发明的嵌合分子可以用于将可检测标记导向肿瘤位点。这可以促进肿瘤检测和/或定位。在某些特别优选的实施方案中，嵌合分子的效应物组分是“不透射线的”标记，例如，可以使用X射线容易显现的标记。不透射线的材料是本领域技术人员众所周知的。最常见的不透射线的材料包括碘化物、溴化物或钡盐。其他不透射线的材料也是已知的，且包括但不限于，有机铋衍生物(参见，例如，美国专利5,939,045)、不透射线的聚氨基甲酸酯(参见美国专利5,346,9810、有机铋复合材料(参见，例如，美国专利5,256,334)、不透射线的钡聚合物复合物(参见，例如，美国专利4,866,132)等。
本发明的双特异性和/或多特异性抗体)可以直接与不透射线的部分偶联，或它们可以如下文所述与携带或包含不透射线的材料的“包装”(例如，螯合物、脂质体、聚合物微珠等)附着。
除了不透射线的标记之外，其他标记也适合于在本发明中使用。适合于用作本发明嵌合分子的效应分子组分的可检测标记包括通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电、光学或化学方法可检测的任何组合物。在本发明中有用的标记包括磁珠(例如Dynabeads TM)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和在ELISA中常用的其他酶)、以及比色标记例如胶态金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)珠。
各种优选的放射性标记包括但不限于，99Tc、203Pb、67Ga、68Ga、72As、111In、113mIn、97Ru、62Cu、64lCu、52Fe、52mMn、51Cr、186Re、188Re、77As、90Y、67Cu、169Er、121Sn、127Te、142Pr、143Pr、198Au、199Au、161Tb、109Pd、165Dy、149Pm、151Pm、153Sm、157Gd、159Gd、166Ho、172Tm、169Yb、175Yb、177Lu、105Rh和111Ag。
检测此类标记的方法是本领域技术人员众所周知的。因此，例如，放射性标记可以使用照相软片、闪烁检测器等进行检测。荧光标记可以使用光检测器进行检测以检测发射的照明。酶促标记一般通过下述进行检测：提供酶与底物，且检测通过酶对底物的作用产生的反应产物，且比色标记通过简单地显现有色标记进行检测。
在某些具体实施方案中，本发明预期使用免疫缀合物(嵌合部分)用于检测肿瘤和/或其他癌细胞。因此，例如，本发明的双特异性抗体可以与γ发射性放射性同位素(例如，Na-22、Cr-51、Co-60、Tc-99、I-125、I-131、Cs-137、GA-67、Mo-99)缀合以用于使用γ照相机检测，与正电子发射性同位素(例如C-11、N-13、O-15、F-18等)缀合用于在正电子发射断层照相(PET)仪器上检测，和与金属造影剂(例如包含Gd的试剂、包含Eu的试剂等)缀合以用于磁共振成像(MRI)，此外，本发明的双特异性抗体可以在常规免疫组织化学(例如荧光标记、纳米晶体(nanocrystal)标记、酶促和比色(colormetric)标记等)中使用。
2)辐射敏化剂。
在另一实施方案中，效应物可以是增强细胞上的电离辐射(例如，可以由60Co或X射线源产生)的细胞毒性效应的辐射敏化剂。众多辐射敏化剂是已知的，且包括但不限于，苯并卟啉衍生化合物(参见，例如美国专利5,945,439)、1，2，4-苯并三嗪氧化物(参见，例如美国专利5,849,738)、包含某些二胺的化合物(参见，例如美国专利5,700,825)、BCNT(参见，例如美国专利5,872,107)、辐射敏化性硝基苯甲酸酰胺衍生物(参见，例如，美国专利4,474,814)、各种杂环衍生物(参见，例如美国专利5,064,849)、铂络合物(参见，例如美国专利4,921,963)等。
3)配体。
效应分子还可以是配体、附加表位或抗体。特别优选的配体和抗体是与免疫细胞上的表面标记结合的那些。使用此类抗体作为效应分子的嵌合分子充当双功能接头，从而确立免疫细胞和肿瘤细胞之间的结合，所述免疫细胞具有关于配体或抗体的结合配偶体，且所述肿瘤细胞表达一种或多种EGFR家族成员。
3)螯合物。
本文描述的许多药物和/或放射性标记优选作为螯合物提供，特别是利用预靶向策略时。螯合分子一般与特异性结合附加表位的分子(例如，生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白等)偶联，所述附加表位与双特异性和/或多特异性抗体附着。
螯合基团是本领域技术人员众所周知的。在某些实施方案中，螯合基团来源于乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、环己基1，2-二胺四乙酸(CDTA)、乙二醇-O，O′-双(2-氨乙基)-N，N，N′，N′-四乙酸(EGTA)、N，N-双(羟苄基)-乙二胺-N，N′-二乙酸(HBED)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(DOTA)、羟乙二胺三乙酸(HEDTA)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸(TETA)、取代的DTPA、取代的EDTA等。
某些优选螯合剂的例子包括未取代的或取代的2-亚氨基硫杂环戊烷(2-iminothiolane)和2-亚氨基硫杂环己烷(2-iminothiacyclohexane)，特别是2-亚氨基-4-巯甲基硫杂环戊烷(mercaptomethylthiolane)，和SAPS(N-(4-[211At]砹代苯乙基)琥珀酰胺酸酯(N-(4-[211At]astatophenethyl)succinimate))。
一种螯合剂1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N，N″，N″′-四乙酸(DOTA)是特别重要的，这是因为其能够螯合许多诊断和治疗上重要的金属，例如放射性核素和放射性标记。
DOTA和蛋白质例如抗体的缀合物已得到描述。例如，美国专利号5,428,156教导了用于使DOTA与抗体和抗体片段缀合的方法。为了制备这些缀合物，DOTA的一个羧酸基团被转变成活性酯，所述活性酯可以与抗体或抗体片段上的胺或巯基基团反应。Lewis等人(1994)Bioconjugate Chem.5：565-576描述了类似方法，其中DOTA的一个羧基被转变成活性酯，且使活化的DOTA与抗体混合，经由抗体赖氨酸残基的ε氨基使抗体与DOTA连接，从而使DOTA的一个羧基转变成酰胺部分。
可替代地，螯合剂可以直接或通过接头与附加表位或结合附加表位的部分偶联。DOTA和生物素的缀合已得到描述(参见，例如，Su(1995)J.Nucl.Med.，36(5Suppl)：154P，它公开了经由可获得的氨基侧链生物素衍生物的DOTA与生物素的连接，例如DOTA-LC-生物素或DOTA-苄基-4-(6-氨基-己酰胺)-生物素)。Yau等人，WO95/15335公开了产生可以与生物素缀合的硝基-苄基-DOTA化合物的方法。该方法包括经由羟基的瞬时突出(projection)的环化反应；胺的甲苯磺酰化；暂时保护的羟基的脱保护；脱保护的羟基的甲苯磺酰化；和分子内的甲苯磺酸盐环化。Wu等人(1992)Nucl.Med.Biol.，19(2)：239-244公开了用于用111IN和90Y放射性标记蛋白质的大环螯合剂的合成。Wu等人制备了标记的DOTA-生物素缀合物，以研究与用于研究的模型蛋白质抗生物素蛋白的缀合物的稳定性和生物分布。这种缀合物使用生物素酰肼进行制备，所述生物素酰肼包含与原位产生的活化DOTA衍生物反应的游离氨基。
4)细胞毒素。
特别优选的细胞毒素包括假单胞菌属外毒素、白喉毒素、蓖麻毒蛋白和相思豆毒蛋白。假单胞菌属外毒素和白喉毒素是最优选的。
假单胞菌属外毒素A(PE)是由铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)分泌的极其活泼的单体蛋白质(分子量66kD)，它通过催化其ADP-核糖基化(催化氧化的NAD的ADP核糖基部分转移到EF-2上)经由灭活延伸因子2(EF-2)抑制真核细胞中的蛋白质合成。
该毒素包含一致发挥作用以引起细胞毒性的3个结构域。结构域Ia(氨基酸1-252)介导细胞结合。结构域II(氨基酸253-364)负责转运到细胞溶胶内，且结构域III(氨基酸400-613)介导延伸因子2的ADP核糖基化，这灭活蛋白质且促成细胞死亡。结构域Ib(氨基酸365-399)的功能仍未确定，尽管其的大部分，氨基酸365-380可以被缺失而不丧失细胞毒性。参见Siegall等人(1989)J.Biol.Chem.264：14256-14261。
当靶向分子(例如，抗MUC-1)与PE融合时，优选的PE分子是其中结构域Ia(氨基酸1-252)被缺失，且氨基酸365-380已从结构域Ib中缺失的PE分子。然而结构域Ib的全部和结构域II的部分(氨基酸350-394)可以被缺失，特别是如果被缺失的序列用连接肽例如GGGGS(SEQ ID NO：11)替换的话。
此外，PE分子可以使用定点诱变或本领域已知的其他技术进一步修饰，以改变分子用于特定需要的应用。也可以使用以这样的方式改变PE分子的方法，其方式基本上不影响由本文描述的PE分子提供的功能优点，且此类所得到的分子预期由本文包含。
为了优选PE分子最大的细胞毒性特性，推荐对分子的几种修饰。对于重组分子的合适羧基末端序列是优选的，以使分子转运到靶细胞的细胞溶胶内。已发现有效的氨基酸序列包括REDLK(SEQ ID NO：23)(如在天然PE中)、REDL(SEQ ID NO：24)、RDEL(SEQ ID NO：25)、或KDEL(SEQ ID NO：26)、这些序列的重复、或发挥功能以维持或使蛋白质再循环到内质网内的其他序列，在本文中称作“内质保留序列”。参见，例如，Chaudhary等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：308-312和Seetharam等人，J.Biol.Chem.266：17376-17381。优选的PE形式包含命名为PE38QQR的PE分子(Debinski等人Bioconj.Chem.，5：40(1994))、和PE4E(参见，例如Chaudhary等人(1995)J.Biol.Chem.，265：16306)。
克隆编码与各种配体融合的PE的基因的方法是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，Siegall等人(1989)FASEB J.，3：2647-2652；和Chaudhary等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：4538-4542)。
如同PE，白喉毒素(DT)通过ADP核糖基化延伸因子2从而抑制蛋白质合成来杀死细胞。然而，白喉毒素分成由二硫键连接的2条链，A和B。与PE相对照，在羧基末端上的DT B链负责受体结合，且呈现于氨基末端上的A链包含酶促活性(Uchida等人(1972)Science，175：901-903；Uchida等人(1973)J.Biol.Chem.，248：3838-3844)。
在优选实施方案中，本发明的靶向分子-白喉毒素融合蛋白具有通过白喉毒素B链平截去除的天然受体结合结构域。特别优选的是DT388，其中从残基389开始的羧基末端序列被去除的DT。Chaudhary等人(1991)Bioch.Biophys.Res.Comm.，180：545-551。如同PE嵌合细胞毒素，DT分子可以以化学方法与MUC-1抗体缀合，但在某些优选实施方案中，靶向分子将通过重组方法与白喉毒素融合(参见，例如，Williams等人(1990)J.Biol.Chem.265：11885-11889)。
5)其他治疗部分。
其他合适的效应分子包括药理剂或包含各种药理剂的胶囊化系统。因此，嵌合分子的靶向分子可以直接与药物附着，所述药物将直接递送给肿瘤。此类药物是本领域技术人员众所周知的，且包括但不限于，阿霉素、长春碱、金雀异黄素、反义分子等。
可替代地，效应分子可以是胶囊化系统，例如，病毒壳体、脂质体、或包含治疗组合物的微团，所述治疗组合物例如药物、核酸(例如反义核酸)、或优选被保护避免直接暴露于循环系统的另一种治疗部分。制备与抗体附着的脂质体的方法是本领域技术人员众所周知的。参见，例如，美国专利号.4,957,735，Connor等人(1985)Pharm.Ther.，28：341-365。
C)靶向分子与效应分子的附着。
技术人员应当理解本发明的双特异性和/或多特异性抗体和效应物部分一般可以以任何顺序连接在一起。因此，例如，当靶向分子是单链蛋白质时，效应分子可以与靶向分子的氨基或羧基末端连接。效应物还可以与双特异性和/或多特异性抗体的内部区域连接，或相反。类似地，双特异性和/或多特异性抗体可以与效应分子的内部位置或末端连接。在任何情况下，选择不干扰双特异性和/或多特异性抗体或效应物的各自活性的附着点。
双特异性和/或多特异性抗体和效应分子可以通过本领域技术人员众所周知的许多方法中的任何一种进行附着。一般地，效应分子直接或通过接头(间隔区)与双特异性抗体缀合。然而，当效应分子和双特异性抗体都是多肽时，优选作为单链融合蛋白重组表达嵌合分子。
1)效应分子与靶向分子的缀合。
在一个实施方案中，双特异性和/或多特异性抗体以化学方法与效应分子(例如，细胞毒素、标记、配体、药物、抗体、脂质体等)缀合。以化学方法缀合分子的方法是本领域技术人员众所周知的。
用于使试剂与抗体或其他多肽靶向分子附着的程序将根据试剂的化学结构而变。多肽一般包含多种官能团；例如，羧酸(COOH)或游离胺(-NH2)基团，所述官能团可用于与效应分子上的合适官能团反应以向该处结合效应物。
可替代地，双特异性抗体和/或效应分子可以进行衍生化以暴露或附着另外的反应官能团。衍生化可以包括附着许多接头分子中的任何一种，所述接头分子例如可从Pierce Chemical Company，RockfordIllinois获得的那些。
如本文使用的，“接头”是用于使靶向分子与效应分子连接的分子。接头能够与靶向分子和效应分子形成共价键。合适的接头是本领域技术人员众所周知的，且包括但不限于，直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。当双特异性和/或多特异性抗体和效应分子都是多肽时，接头可以通过其侧基(例如，通过与半胱氨酸的二硫键)与成分氨基酸连接。然而，在优选实施方案中，接头将与末端氨基酸的α碳氨基和羧基连接。
具有与特定试剂上的基团反应性的一个官能团，和与抗体反应的另一个基团的双功能接头可以用于形成所需免疫缀合物。可替代地，衍生化可以包括双特异性和/或多特异性抗体的化学处理，例如，用高碘酸盐二醇断裂(glycol cleavage)糖蛋白抗体的糖部分以产生游离醛基团。抗体上的游离醛基团可以与试剂上的游离胺或肼基团反应以向该处结合试剂。(参见美国专利号4,671,958)。用于在多肽例如抗体或抗体片段上产生游离巯基的程序也是已知的(参见美国专利号4,659,839)。
用于使各种化合物，包括放射性核素金属螯合物、毒素和药物，与蛋白质例如抗体附着的许多程序和接头分子是已知的(参见，例如，欧洲专利申请号188,256；美国专利号4,671,958，4,659,839，4,414,148，4,699,784；4,680,338；4,569,789；和4,589,071；和Borlinghaus等人(1987)Cancer Res.47：4071-4075)。特别地，各种免疫毒素的生产是本领域众所周知的，且可以在例如″Monoclonal Antibody-Toxin Conjugates：Aiming the Magic Bullet，″Thorpe等人，Monoclonal Antibodies inClinical Medicine，Academic Press，第168-190页(1982)，Waldmann(1991)Science，252：1657，美国专利号4,545,985和4,894,443中找到。
在某些情况下，当嵌合分子已到达其靶位点时，需要从双特异性和/或多特异性抗体中释放效应分子。因此，当效应物将在靶位点被释放时，可以使用包含在靶位点附近可切割的键的嵌合缀合物。切割键以从抗体中释放试剂可以通过酶促活性或条件来促使，所述条件在靶细胞内或在靶位点附近对免疫组合物实施。当靶位点是肿瘤时，可以使用在肿瘤位点处呈现的条件下(例如，当暴露于肿瘤相关酶或酸性pH)可切割的接头。
许多不同的可切割接头是本领域技术人员已知的。参见美国专利号4,618,492；4,542,225和4,625,014。从这些接头基团中释放试剂的机制包括，例如照射光不稳定键和酸催化的水解。例如，美国专利号4,671,958包括免疫缀合物的描述，所述免疫缀合物包含在体内靶位点处通过患者补体系统的蛋白水解酶切割的接头。考虑到已报道用于使多种放射诊断化合物、放射治疗化合物、药物、毒素及其他试剂与抗体附着的大量方法，本领域技术人员将能够确定用于使给定试剂与抗体或其他多肽附着的合适方法。
2)螯合物的缀合。
在某些优选实施方案中，效应物包含与抗体或附加表位附着的螯合物。双特异性和/或多特异性抗体具有相应的附加表位或抗体，从而使得仅仅使双特异性和/或多特异性抗体与螯合物接触，就导致抗体与效应物附着。组合步骤可以在部分被使用之后进行(预靶向策略)，或靶组织可以在螯合物递送之前与双特异性和/或多特异性抗体结合。产生适合于与各种靶向部分偶联的螯合物的方法是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，美国专利号：6,190,923、6,187,285、6,183,721、6,177,562、6,159,445、6,153,775、6,149,890、6,143,276、6,143,274、6,139,819、6,132,764、6,123,923、6,123,921、6,120,768、6,120,751、6,117,412、6,106,866、6,096,290、6,093,382、6,090,800、6,090,408、6,088,613、6,077,499、6,075,010、6,071,494、6,071,490、6,060,040、6,056,939、6,051,207、6,048,979、6,045,821、6,045,775、6,030,840、6,028,066、6,022,966、6,022,523、6,022,522、6,017,522、6,015,897、6,010,682、6,010,681、6,004,533和6,001,329)。
3)融合蛋白的产生。
当双特异性和/或多特异性抗体和/或效应分子都是单链蛋白质且相对短(即，少于约50个氨基酸)时，它们可以使用标准化学肽合成技术来合成。当2种组分(componets)都相对短时，嵌合部分可以作为单个连续多肽来合成。可替代地，双特异性和/或多特异性抗体和效应分子可以分开合成，且然后通过一个分子的氨基端与另一个分子的羧基端缩合从而形成肽键进行融合。可替代地，双特异性和/或多特异性抗体和效应分子可以各自与肽间隔分子的一个末端进行缩合，从而形成连续的融合蛋白。
其中序列的C末端氨基酸与不溶性支持体附着，随后顺序添加序列中的剩余氨基酸的固相合成是用于化学合成本发明多肽的优选方法。关于固相合成的技术由Barany和Merrifield，Solid-Phase PeptideSynthesis；第3-284页in The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis，Part A.，Merrifield，等人J.Am.Chem.Soc.，85：2149-2156(1963)，和Stewart等人，Solid PhasePeptide Synthesis，第2版.Pierce Chem.Co.，Rockford，Ill.(1984)描述。
在优选实施方案中，当双特异性和/或多特异性抗体是单链多肽且效应物是多肽时，本发明的嵌合融合蛋白使用重组DNA方法来合成。这一般包括：生成编码融合蛋白的DNA序列，将DNA置于在特定启动子控制下的表达盒中，在宿主中表达蛋白质，分离表达的蛋白质，且在需要时使蛋白质复性。
编码本发明的融合蛋白(例如ALM-PE38QQR)的DNA可以通过任何合适的方法进行制备，包括例如，克隆和限制合适序列或通过下述方法的直接化学合成：例如Narang等人(1979)Meth.Enzymol.68：90-99的磷酸三酯法；Brown等人(1979)Meth.Enzymol.68：109-151的磷酸二酯法；Beaucage等人(1981)Tetra.Lett.，22：1859-1862的二乙基亚磷酰胺法；和美国专利号4,458,066的固体支持体法。
化学合成产生单链寡核苷酸。这可以通过与互补序列杂交，或通过使用单链作为模板由利用DNA聚合酶的聚合转变成双链DNA。技术人员将认识到尽管DNA的化学合成限制于约100个碱基的序列，但较长的序列可以通过连接较短的序列来获得。
可替代地，子序列可以被克隆且合适的子序列使用合适的限制酶进行切割。片段随后可以进行连接以产生所需DNA序列。
在优选实施方案中，编码本发明的融合蛋白的DNA可以使用DNA扩增法，例如聚合酶链反应(PCR)进行克隆。因此，例如，编码双特异性和/或多特异性抗体的核酸是PCR扩增的，其中使用包含关于NdeI的限制位点的有义引物，和包含关于HindIII的限制位点的反义引物。这产生了编码双特异性和/或多特异性抗体序列且具有末端限制位点的核酸。PE38QQR片段可以通过Debinski等人(1994)Int.J.Cancer，58：744-748所述从质粒pWDMH4-38QQR或质粒pSGC242FdN1中切出。将双特异性和/或多特异性抗体与PE38QQR序列连接且插入载体内，产生编码与PE38QQR氨基端(PE的第253位)连接的双特异性和/或多特异性抗体的载体。2种分子通过由限制位点引入的三氨基酸接点进行连接，所述三氨基酸接点由谷氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸组成。
尽管2种分子优选基本上直接连接在一起，但技术人员将理解分子可以通过由一个或多个氨基酸组成的肽间隔区分开。一般而言除连接蛋白质、或保持它们之间的某些最低距离或其他空间关系之外，间隔区将不具有特殊生物活性。然而，可以选择间隔区的成分氨基酸以影响分子的某些特性，例如折叠、净电荷或疏水性。
编码融合蛋白的核酸序列可以在多种宿主细胞中表达，包括大肠杆菌(E.coli)、其他细菌宿主、酵母、以及各种高等真核细胞例如COS、CHO和HeLa细胞系和骨髓瘤细胞系。重组蛋白质基因将与对于每种宿主合适的表达控制序列可操作地连接。对于大肠杆菌，这包括启动子例如T7、trp或λ启动子，核糖体结合位点和优选地转录终止信号。对于真核细胞，控制序列将包括来源于免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒等的启动子和优选地增强子，以及聚腺苷酸化序列，且可以包括剪接供体和受体序列。
本发明的质粒可以通过众所周知的方法转移到所选宿主细胞内，所述方法例如对于大肠杆菌的氯化钙转化和对于哺乳动物细胞的磷酸钙处理或电穿孔。由质粒转化的细胞可以通过针对抗生素的抗性进行选择，所述抗性由质粒上包含的基因赋予，所述基因例如amp、gpt、neo和hyg基因。
一旦被表达，重组融合蛋白就可以根据本领域的标准程序进行纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等(一般参见，R.Scopes(1982)Protein Purification，Springer-Verlag，N.Y.；Deutscher(1990)Methods in Enzymology第182卷：Guide to Protein Purification.，Academic Press，Inc.N.Y.)。至少约90-95％同质性的基本上纯的组合物是优选的，且对于药学用途98-99％或更多的同质性是最优选的。一旦被纯化，根据需要部分地或至同质性，多肽随后就可以在治疗上使用。
本领域技术人员将认识到在化学合成、生物学表达或纯化后，EGFR多肽靶向的融合蛋白可以具有基本上不同于成分多肽的天然构象的构象。在这种情况下，可能必需使多肽变性和还原，且随后促使多肽重折叠成优选构象。使蛋白质还原和变性且诱导重折叠的方法是本领域技术人员众所周知的(参见，Debinski等人(1993)J.Biol.Chem.，268：14065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconjug.Chem.，4：581-585；和Buchner，等人(1992)Anal.Biochem.，205：263-270)。
技术人员将认识到可以对融合蛋白进行修饰而不减少其生物学活性。可以进行某些修饰以促进靶向分子克隆、表达，或使靶向分子掺入融合蛋白内。此类修饰是本领域技术人员众所周知的，且包括例如在氨基端添加的甲硫氨酸以提供起始位点、或置于任一末端上的另外氨基酸以产生方便定位的限制位点或终止密码子。
IV.双特异性抗体分子和/或嵌合部分的用途：
具有对于2种不同抗原的亲和力的双特异性抗体在治疗和诊断中具有广泛应用。具体地，本发明的bs抗体分子(例如bs-scFv)，可以用于：(1)直接改变超表达EGFR蛋白质家族成员的肿瘤的生长；(2)与其他细胞毒剂(例如化学治疗剂、外部束辐射、靶向的放射性同位素、和其他抗体或信号转导抑制剂)组合；和(3)募集针对靶向的肿瘤细胞的多种不同细胞毒剂或效应分子，所述肿瘤细胞表达EGFR蛋白质家族成员。
由于相对于正常组织这些靶在肿瘤细胞上的表达增加，利用本发明的bs-scFv抗体分子使细胞毒剂或效应分子靶向特异性肿瘤细胞，提供了增加的肿瘤定向特异性。此外，双特异性抗体可以与多重受体或受体组分结合，从而使受体或受体组分交联，从而产生细胞毒性和/或细胞抑制效应。只与正常组织上的1个靶结合的基于抗体的试剂一般将不交联受体和触发细胞毒性结果。
此外，单特异性抗体一般显示对于靶细胞较低的抗体亲抗原性。相反，本发明的双特异性抗体显示对于一种或多种靶细胞较高的抗体亲抗原性，这帮助稳定抗体/靶复合物且提供抗体与细胞的长期结合，从而提供试剂对超表达2种靶的肿瘤细胞的增加的特异性。
此外，抗体与EGFR蛋白质家族成员的结合经常触发这些蛋白质的内在化，从而使得这些抗体成为递送毒素、药物、放射性同位素或其他细胞毒剂的有效平台。ALM介导肿瘤细胞表面上的HER2/neu和HER3量的减少，从而暗示类似的内在化机制。因此，这些bs-scFv分子与细胞毒性或其他试剂(效应物)例如在嵌合部分中的组合，将导致有效递送给超表达2种靶的细胞，从而增加治疗的特异性和功效。通过掺入与效应细胞相互作用的另外序列(例如，Fc受体靶向臂)，靶向特异性中的类似增加也可以掺入基于效应细胞的治疗策略内。
本发明的双特异性抗体分子也可以在基因治疗中用于编码治疗剂(例如假单胞菌外毒素、白喉毒素、各种肿瘤抑制基因、各种标记等)的核酸的直接靶向和内在化。此外，双特异性抗体可以例如经由螯合物与细胞毒性放射性部分(例如211At)、辐射增强剂和各种可检测标记(例如不透射线的标记)缀合。此外，双特异性抗体分子可以与脂质、脂质体、树状聚体等偶联。脂质、脂质体和树状聚体可以与各种治疗部分(例如抗癌药，包括但不限于，烷化剂例如白消安、苯丁酸氮芥(chlorambuicl)、顺铂、氰吗啉代阿霉素(cyanomorpholinodoxorubicin)等，抗有丝分裂剂例如同分异构秋水仙碱(allocolchicine)、秋水仙碱(cohchicine)、紫杉醇、长春碱、长春新碱等，拓扑异构酶I抑制剂例如喜树碱、氨基喜树碱等，拓扑异构酶II抑制剂例如阿霉素、氨萘非特、柔红霉素、脱氧阿霉素、米托蒽醌等，RNA/DNA抗代谢物例如异噁唑醋酸、呋氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、曲美沙特等；DNA抗代谢物例如2’脱氧-5-氟尿苷、环胞苷、胍唑等)组合，和/或胶囊化所述各种治疗部分。脂质、脂质体和树状聚体还可以与蛋白质治疗剂、编码例如治疗部分的核酸等复合。
当如上所述用作嵌合部分的靶向组分时，本发明的双特异性和/或多特异性抗体优先将结合的效应物靶向/递送给表达靶EGFR蛋白质的一种或多种靶细胞。通过增加效应物与细胞(接触或紧密接近)的结合(例如，接触持续时间或接触量)，本发明的抗体增加效应物内在化到细胞内和/或对那种细胞发挥其特征活性的可能性。
因此，例如，双特异性或多特异性抗体靶向的脂质体或其他治疗小泡(脂质体、病毒等)显示增加的向靶肿瘤的暴露(持续时间/浓度)。在示例性实施方案中，脂质体可以散布有本发明的bs-scFv抗体分子，以促进肿瘤特异性靶向。抗癌剂例如化学治疗剂、抗体、反义分子和/或放射性同位素可以胶囊化在这样修饰的脂质体内。
在另一实施方案中，双特异性或多特异性抗体(例如，bs-scFv抗体)分子可以用于将基因治疗载体，包括但不限于改良病毒，导向表达2种靶抗原的细胞。病毒还可以用于将这些bs-scFv抗体分子的基因递送给肿瘤细胞，在其中它们可以被生产且分泌到细胞微环境内，或通过添加另外的细胞内靶向序列，它们可以变成定位于特定细胞区室和敲除其靶的表达的胞内抗体。
此外，本发明的双特异性或多特异性抗体(例如，bs-scFv抗体)分子可以有利地用于检测EGFR蛋白质家族成员的异常表达。此类检测可以导致与异常肿瘤生长相关的癌症的早期诊断，所述异常肿瘤生长由这些细胞表面蛋白质促进。一般而言，免疫复合物(immunocomplex)形成的检测是本领域众所周知的，且可以通过应用众多方法来完成。这些方法一般基于标签或标记的检测，例如本领域标准使用的任何放射性、荧光、生物或酶促标记或标签。关于此类标签使用的美国专利包括美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。当然，如本领域已知的，人们可以通过使用次级结合配体例如第二抗体或生物素/抗生物素蛋白配体结合排列获得另外的优点。
V.bs-scFv抗体分子的施用：
A)药物制剂。
如本文所述的双特异性抗体或bs-scFv抗体分子或嵌合部分包括在非药学组合物(例如，不纯或非无菌组合物)和药学组合物(即，适合于给受试者或患者(即，人或非人受试者)施用的组合物)制备中有用的大量药物组合物，所述药学组合物可以直接使用和/或在单位剂型制备中使用。在某些实施方案中，此类组合物包含治疗有效量的一种或多种治疗剂(例如双特异性和/或多特异性抗体，和/或包含此类抗体的嵌合部分)和药学可接受的载体。
如上文指出的，本发明的试剂可以在广泛多样的背景中使用，包括但不限于肿瘤或癌细胞的检测和/或成像、肿瘤生长和/或癌细胞生长和/或增殖的抑制等。本发明的一种或多种双特异性抗体、和/或官能化双特异性抗体、和/或嵌合部分可以通过注射施用，即静脉内、肌内、皮内、皮下、十二指肠内或腹膜内。同样，在某些实施方案中，化合物可以通过吸入，例如鼻内施用。另外，某些化合物可以经口或经皮施用。
在具体实施方案中，术语“药学可接受的”意指由联邦或州政府管理机构批准的，或在美国药典或其他一般公认药典中列出的，用于在动物、且更优选在人中使用，或适合于给动物或人施用。术语“载体”或指稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全))、赋形剂、或与其一起施用治疗剂的媒介物。此类药学载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药学组合物静脉内施用时，水是优选载体。盐水溶液以及水性葡萄糖和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药学赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以包含少量湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂等的形式。
一般地，本发明的组合物的成分分开供应，或在单位剂型中混合在一起供应，例如，作为在标明活性剂量的密封容器例如安瓿或小袋(sachette)中的干燥冻干粉末或无水浓缩物。当组合物将通过输注进行施用时，它可以用包含无菌药学级别的水或盐水的输注瓶进行分配。当组合物将通过注射进行施用时，可以提供注射用无菌水或盐水的安瓿，从而使得成分可以在施用前进行混合。
本发明的组合物可以作为中性或盐形式提供。药学可接受的盐包括由阴离子形成的那些，例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，和由阳离子形成的那些，例如来源于氢氧化钠、钾、铵、钙、铁，异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。
包含本发明的双特异性抗体、和/或官能化双特异性抗体、和/或嵌合部分的药学组合物可以借助于常规混合、溶解、粒化、锭剂形成、研磨、乳化、胶囊化、包埋或冻干方法进行制备。药学组合物可以使用一种或多种生理学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或促进分子加工成可以药学使用的制剂的助剂以常规方式进行配制。合适的制剂取决于所选择的施用途径。
对于局部或经皮施用，如本领域众所周知的，本发明的双特异性抗体、和/或官能化双特异性抗体、和/或嵌合部分可以配制为溶液、凝胶、软膏、乳膏、洗剂、乳状液、悬浮液等。全身制剂包括设计用于通过注射，例如皮下、静脉内、肌内、鞘内或腹膜内注射施用的那些，以及设计用于经皮、跨粘膜、吸入、经口或肺用的那些。
对于注射，本发明的双特异性抗体、和/或官能化双特异性抗体、和/或嵌合部分可以在水溶液中，优选在生理学相容缓冲液例如Hanks氏液、林格溶液、或生理盐水缓冲液中进行配制。溶液可以包含配制剂，例如悬浮、稳定和/或分散剂。可替代地，包含一种或多种铁螯合剂的组合物可以是粉末形式的，用于在使用前由合适的媒介物例如无菌无致热原水构建。
对于跨粘膜施用，在制剂中使用适合于待穿透的屏障的渗透剂。此类渗透剂是本领域普遍知道的。
对于经口施用，本发明的双特异性抗体、和/或官能化双特异性抗体、和/或嵌合部分可以通过将一种或多种试剂与本领域众所周知的药学可接受的载体组合而容易地配制。此类载体使得一种或多种试剂能够被配制为片剂、丸剂、锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、膏剂、悬浮液等，用于由待治疗的患者经口摄食。对于经口固体制剂，例如粉末、胶囊和片剂，合适的赋形剂包括填料例如糖，例如乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨糖醇；纤维素制剂例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；粒化剂；和粘合剂。如果需要，可以添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或藻酸或其盐例如藻酸钠。
如果需要，固体剂型可以是使用标准技术包有糖衣或肠溶衣的。
对于经口液体制剂，例如悬浮液、酏剂和溶液，合适的载体、赋形剂或稀释剂包括水、乙二醇、油、醇等。此外，可以添加调味剂、防腐剂、着色剂等。
对于口腔含化剂施用，一种或多种铁螯合剂可以采取以常规方式配制的片剂、糖锭等的形式。
对于通过吸入施用，本发明的双特异性抗体、和/或官能化双特异性抗体、和/或嵌合部分借助于合适的推进剂，以气溶胶喷雾剂的形式从加压包或雾化器中方便地递送，所述推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适气体。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀来确定以递送计量的量。可以配制用于在吸入器或吹入器中使用的明胶胶囊和药筒，其包含一种或多种铁螯合剂与合适的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本发明的双特异性抗体、和/或官能化双特异性抗体、和/或嵌合部分(也可以在直肠或阴道组合物例如栓剂或保留灌肠剂中进行配制，例如包含常规栓剂基质例如可可脂或其他甘油酯。
除了先前描述的制剂之外，本发明的双特异性抗体、和/或官能化双特异性抗体、和/或嵌合部分也可以配制积存(depot)制剂。此类长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射进行施用。因此，例如，本发明的一种或多种试剂可以与合适的聚合或疏水材料(例如作为在可接受的油中的乳状液)或离子交换树脂一起配制，或配制为微溶衍生物，例如作为微溶盐。
其他药物递送系统也可以使用。脂质体和乳状液是可以用于递送本发明的双特异性抗体、和/或官能化双特异性抗体、和/或嵌合部分的众所周知的递送媒介物的例子。某些有机溶剂例如二甲基亚砜也可以使用，尽管通常以较大的毒性作代价。此外，本发明的双特异性抗体、和/或官能化双特异性抗体、和/或嵌合部分可以使用持续释放系统进行递送，例如包含治疗剂的固体聚合物的半透性基质。各种持续释放材料已被确定且是本领域技术人员众所周知的。取决于其化学性质，持续释放胶囊可以经过几日、几周、或最高达经过100天释放一种或多种活性试剂。取决于一种或多种试剂的化学性质和生物学稳定性，可以使用另外的稳定化策略。
因为本发明的双特异性抗体、和/或官能化双特异性抗体、和/或嵌合部分可以包含带电侧链或末端，所以它们可以作为游离酸或碱或作为药学可接受的盐包括在任何上述制剂中。药学可接受的盐是基本上保留游离碱的生物学活性且通过与无机酸反应制备的那些。药学盐在水性和其他质子溶剂中倾向于比相应的游离碱形式更可溶。
B)有效剂量。
本发明的双特异性抗体、和/或官能化双特异性抗体、和/或嵌合部分一般将以有效达到预期目的(例如，使肿瘤或癌细胞成像，抑制癌细胞生长和/或增殖等)的量使用。在某些优选实施方案中，在本发明方法中使用的双特异性抗体、和/或官能化双特异性抗体、和/或嵌合部分以这样的剂量施用，所述剂量有效地部分或完全抑制癌细胞或肿瘤增殖和/或生长，或使得能够使其显现，所述癌细胞或肿瘤特征在于EGFR家族蛋白质的超表达。在某些实施方案中，选择在90％、更优选在95％、且最优选在98％或99％置信水平上抑制癌细胞生长和/或增殖的剂量。优选的有效量是减少或阻止肿瘤生长、或促进癌细胞检测和/或显现的那些。就细胞生长和增殖的抑制剂而言，化合物也可以在相同的剂量水平预防地(prophalactically)使用。
一般地，本发明的双特异性抗体、和/或官能化双特异性抗体、和/或嵌合部分、或其药学组合物，以治疗有效量施用或应用。治疗有效量是有效减少或阻止癌细胞和/或肿瘤发作或进展(例如，生长和/或增殖)的量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力内，尤其是依据本文提供的详细公开内容。
对于全身施用，治疗有效剂量最初可以由体外测定来估计。例如，剂量可以在动物模型中配制以达到包括如在细胞培养中测定的IC50的循环浓度范围。此类信息可以用于更精确地确定在人中的有用剂量。
初始剂量也可以使用本领域众所周知的技术由体内数据例如动物模型来估计。本领域技术人员可以基于动物数据容易地最优化对人的施用。
剂量的量和时间间隔可以个别调整以提供足以维持治疗效果的抑制剂的血浆水平。
关于一般治疗的剂量是本领域技术人员已知的。此外，此类剂量在性质上一般是咨询的，且可以取决于具体治疗背景、患者耐受性等进行调整。取决于需要和患者耐受的剂量和频率，可以施用组合物的单次或多次施用。
在某些实施方案中，每日约1μg、优选约1mg-约1000mg/千克的初始剂量将是有效的。约5-约75mg的日剂量范围是优选的。然而，剂量可以依赖于患者需要、待治疗状况的严重性和使用的化合物而变。关于具体情况的正确剂量的确定完全在本领域技术内。一般地，治疗以小于化合物最佳剂量的较小剂量开始。其后，剂量通过小增量来增加直至达到该环境下的最佳效果。为了方便起见，如果需要，总日剂量可以被分开且在当日期间部分地施用。一般剂量将是约0.1-约500mg/kg，且理想地约25-约250mg/kg。
在局部施用或选择性摄取的情况下，双特异性抗体和/或嵌合分子的有效局部浓度可以与血浆浓度无关。无需过度实验本领域技术人员就将能够最优化治疗有效局部剂量。当然抗体和/或嵌合部分的量将取决于待治疗的受试者、受试者的重量、痛苦的严重性、施用方式和开处方医师的判断。
治疗可以间歇地重复。在某些实施方案中，包含双特异性抗体分子的药物制剂可以以合适的时间间隔进行施用，例如每天至少2次或更多次直至病理学症状减少或减轻，这之后剂量可以被减少至维持水平。在具体情况下的合适时间间隔通常可取决于患者的状况。治疗可以单独提供，或与其他药物、和/或放射疗法、和/或外科手术操作组合提供。
C)毒性。
优选地，本文描述的本发明的双特异性抗体、和/或官能化双特异性抗体、和/或嵌合部分的治疗有效剂量将提供治疗利益而不引起相当大毒性。
本文所述试剂的毒性可以通过标准药学操作在细胞培养或实验动物中进行确定，例如通过测定LD50(群体50％致死的剂量)或LD100(群体100％致死的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数。显示高治疗指数的试剂是优选的。从细胞培养测定和动物研究中获得的数据可以用于配制对于在人中的使用无毒的剂量范围。本发明的双特异性抗体、和/或官能化双特异性抗体、和/或嵌合部分的剂量优选位于循环浓度范围内，所述循环浓度包括具有少许毒性或无毒性的有效剂量。取决于使用的剂型和利用的施用途径，剂量可以在这个范围内变化。确切制剂、施用途径和剂量可以由个别医师考虑到患者状况来选择(参见，例如，Fingl等人(1975)In：The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第1章，第1页)。
VI.试剂盒。
本发明进一步包含用于在体内和/或生物学样品中检测细胞中使用的试剂盒，所述细胞表达或超表达EGFR蛋白质家族成员。还提供了用于抑制细胞生长和/或增殖的试剂盒，所述细胞表达或超表达表皮生长因子家族成员(例如癌细胞)。
在某些实施方案中，试剂盒包含对于EGFR蛋白质家族成员上的至少2种表位特异的、本发明的一种或多种双特异性和/或多特异性抗体。在某些优选实施方案中，抗体是双特异性scFv抗体。取决于用途，抗体可以用接头和/或螯合剂进行官能化，以用于与如本文所述的效应物(例如放射性部分、脂质体、细胞毒素(cytoxin)、另一种抗体等)偶联。
在某些实施方案中，试剂盒可以包含，例如对于EGFR蛋白质家族成员特异的本发明的bs-scFv抗体分子，以及缓冲剂和用于检测bs-scFv抗体分子的其他组合物。
试剂盒还可以包括说明材料，所述说明材料教导抗体用于检测例如癌细胞的用途，和/或教导抗体与官能化试剂的组合，或教导官能化抗体用于成像和/或治疗应用的用途。在某些实施方案中，提供用接头和/或螯合剂(在一个容器中)连同一种或多种效应物例如细胞毒素、放射性标记(在第二个容器中)一起官能化的抗体，从而使得2种组分可以分开施用(例如在预靶向方法中)或从而使得2种组分可以在使用前不久进行施用。
某些说明材料将提供推荐的剂量方案、计数器指示等。尽管说明材料一般包含书面或印刷的材料，但它们并不限于此类材料。能够贮存此类说明书且将它们传达给最终用户的任何介质都由本发明预期。此类介质包括但不限于，电子贮存介质(例如，磁盘、磁带、盒式存储器、芯片)、光学介质(例如，CD ROM)等。此类介质可以包括提供此类信息的因特网站点的地址。
实施例
下列实施例被提供以举例说明但不是限制请求保护的本发明。
实施例1
Bs-Scfv抗体分子的制备
EGFR和HER2/neu的超表达已与许多实体瘤中的预后不良相关联。干扰通过这些受体的信号传导的抗体，例如赫赛汀7(抗HER2)和C225(抗EGFR)已在癌症治疗中显示显著效用。通过EGFR家族成员(EGFR、Her-2/neu、Her3和Her4)的信号转导依赖于由配体结合触发的、这些受体的同二聚体、异二聚体或异源多聚体形成。连接这些受体蛋白的多重表位对的双特异性scFv抗体分子已如下文所述产生，以用于在阻止癌性肿瘤细胞中这些信号传导复合物的形成中使用。
I.材料和方法：
提供下列材料和方法以促进本发明的实践：
A.克隆：
编码对于EGFR家族的不同成员(EGFR、HER-2/neu、HER3、HER4)特异的单链Fv(scFv)抗体分子的所有基因都从Dr.Jim Marks(University of California San Francisco)获得。scFv基因从大型首次用于实验的人scFv文库中分离。对于EGFR蛋白质特异的scFv基因通过针对这些蛋白质的胞外结构域的选择进行分离。所有scFv基因都作为在pUC119myc/his载体中、在NcoI和NotI限制位点之间的插入片段提供。关于这些臂的序列在附录A(SEQ ID NOS：1-10、19和21)中阐述。
1.20个氨基酸的接头分子的构建：
bs-scFv抗体分子在循环中的蛋白水解降解可能限制其效力。因此，设计并合成了缺乏所有已知蛋白水解位点的新型20个氨基酸的接头。在接头构建中使用的氨基酸被选择为主要是中性的(不带电、疏水或亲水的)，以促进蛋白质有效运输到细菌壁膜间隙内。合成下述2种引物，它们编码新接头分子：LW583(5＝-AAT TCA GGT GCT GGT ACTTCA GGT TCA GGT GCT TCA GGT GAA GGT TCA GGT TCA A-3＝，SEQ ID NO：12)；和LW584(5＝-AGC TTT GAA CCT GAA CCT TCACCT GAA GCA CCT GAA CCT GAA GTA CCA GCA CCT G-3＝，SEQID NO：13)。
这些寡核苷酸杂交形成具有EcoRI和HindIII消化的末端的“粘性”末端接头。将这种产物插入先前用EcoRI和HindIII消化的pET20b(+)载体内。质粒DNA使用商购可得的用于DNA质粒分离和纯化的试剂盒(Qiagen或Gibco BRL Co.)由转化的DH5α大肠杆菌产生，且随后命名为“pET20b(+)/接头”。接头分子由下述核酸序列编码：5′-AAT TCAGGT GCT GGT ACT TCA GGT TCA GGT GCT TCA GGT GAA GGTTCA GGT TCA AAG CTA-＞3(SEQ ID NO：14)，且所得到的接头分子具有下述氨基酸序列：NSG AGT SGS GAS GEG SGS KL(SEQ ID NO：11)。
2.将抗HER3基因克隆到pET20b(+)/接头载体内：
编码抗HER3 scFv抗体分子的基因A5使用下述2种引物由A5-pUC119myc/his质粒进行扩增：LW687(5＝-CGA CCA TGG CCCAGG TGC AGC TGG TGC AG-3′，SEQ ID NO：15)；和LW688(5＝-CGAATT CAC CTA GGA CGG TCA GCT TGG-3＝，SEQ ID NO：16)。
扩增产物和载体pET20b(+)/接头都用NcoI和EcoRI酶进行消化、连接且转化到感受态的DH5α大肠杆菌内，用于生产质粒DNA。选择的酶针对接头上游的A5基因。随后分离和纯化命名为“pET20b(+)A5/接头”的新质粒。
3.将抗HER2/neu基因克隆到pET20b(+)A5/接头载体内：
编码抗HER2/neu scFv抗体分子的基因ML3.9使用下述2种引物由ML3.9-pUC119myc/his质粒进行扩增：LW697(5＝-GGG AAG CTTCAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG-3＝，SEQ ID NO：17)；和LW698(5＝-GGG CTC GAG ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGTTCC-3＝，SEQ ID NO：18)。
PCR扩增产物和质粒DNA，pET20b(+)A5/接头都用HindIII和XhoI限制酶进行消化、连接且转化到感受态的DH5α大肠杆菌内，用于生产新质粒DNA，pET20b(+)A5/接头/ML3.9。选择的酶针对接头序列上游的ML3.9基因。随后分离和纯化命名为“ApET20b(+)A5/接头/ML3.9”的新质粒。
4.将A5/接头/ML3.9基因克隆到pUC119/myc/his载体内：
将来自pET20b(+)编码bs-scFv产物的核酸分子克隆到pUC119myc/his载体内。将pET载体部分的(组氨酸)6标记和1个“终止”密码子连同A5/接头/ML3.9核酸构建体一起进行扩增。PCR扩增使用下述2种引物进行：LW687(5＝-CGA CCA TGG CCC AGG TGC AGCTGG TGC AG-3′，SEQ ID NO：5)；和LW686(5＝-GAT ATA ATG CGGCCG CTC AGT GGT GGT GGT GGT G-3＝，SEQ ID NO：9)。
用NcoI和NotI酶消化pUC 119myc/his载体和扩增产物，随后为连接步骤和转化DH5α大肠杆菌。随后纯化和分离所得到的命名为“pUC/ALM”的质粒DNA(图1)。
B.表达克隆的转化，TG1：
将pUC/ALM转化到大肠杆菌株TG1内，且如下分离产生A5/接头/ML3.9bs-scFv抗体分子的克隆。将bs-scFv分子透析过夜，使用Ni-NTA树脂(Qiagen)通过固定化金属亲和层析，随后在HPLC系统上使用Superdex-75柱(Pharmacia)通过大小排阻层析纯化。
II.结果：
作为概念证明，生成了2种不同的bs-scFv抗体分子。命名为“ALM”的第一种由分别与HER3和HER2/neu特异性结合的A5scFv和ML3.9scFv组成。命名为“ALF”的第二种bs-scFv抗体分子由2种不同的scFv分子A5和F4组成，所述A5和F4都具有对于HER3的特异性。2种bs-scFv抗体分子被克隆且由大肠杆菌表达。
ALM在一系列体外和体内测定中进行评估。其个别和同时与HER3和HER2/neu两者同时结合的能力，通过在BIAcore仪器上的表面等离子体共振进行证实(图2、3和4)。在体外，ALM与超表达HER3和HER2/neu两者的人BT-474乳腺癌细胞温育，导致HER2/neu和HER3的细胞表面表达减少(图5)、在MTT测定中的增殖减少(图6)、在克隆发生测定中的存活减少(图7)和磷酸化增加随后为AKT2显著去磷酸化(图8)，所述AKT2是细胞凋亡途径中的重要蛋白质。这些效应与使用赫赛汀7观察到的那些是可比较的(MTT测定)，或大于(AKT2去磷酸化)使用赫赛汀7观察到的那些(数据未显示)。
在体内，放射性碘标记的ALM在给免疫缺陷小鼠施用后24小时内显示增强的特异性肿瘤靶向，所述免疫缺陷小鼠具有皮下(s.c.)人BT-474肿瘤异种移植物(图9)。
这些结果证实本发明的bs-scFv抗体分子用于治疗超表达EGFR蛋白质的肿瘤细胞的效用。新型bs-scFv抗体分子可以单独使用，或与现有的化学治疗方法组合使用，以治疗多种癌症，包括但不限于，乳腺、结肠、卵巢、子宫内膜、胃、胰、前列腺和唾液腺癌。
实施例2
组合的化学治疗方法
HER2/neu是关于组合化学治疗方法的引人注目的靶，因为它在多种肿瘤中是超表达的且其超表达已与预后不良相关联。尽管HER2/neu缺乏可以通过其酪氨酸激酶结构域触发信号传导的配体，但当以高浓度超表达时，HER2/neu可以自发地形成同二聚体(Yarden和Sliwkowski(2001)Nature Reviews，Molecular Cell Biology 2：127-137)。HER3在许多方面是HER2/neu的对立面。它与配体活跃地结合但缺乏功能性酪氨酸激酶结构域，因此需要与HER2/neu异二聚化以用于信号传导。事实上，这种组合被许多人认为是由EGFR家族成员形成的最有效的信号传导复合物(Lohrisch和Piccart(2001)Sem.Oncology(28)Suppl18：3-11)。
许多化学治疗剂导致在正常细胞中将触发细胞凋亡的损害。然而，某些肿瘤细胞具有干扰正常细胞凋亡信号传导途径的异常信号传导。HER2/neu超表达的肿瘤细胞中的AKT2磷酸化导致抗细胞凋亡级联，这可以干扰化学治疗剂或生物学试剂的抗肿瘤作用(Zhou等人(2000)J.Biol.Chem.，275：8027-8031)。因此，使用与现有化学疗法组合的bs-scFv抗体分子靶向HER2/neu在杀死肿瘤细胞方面将比单独的化学疗法更有效。
实施例3
211 At标记的双特异性scFv的体内功效
进行体内研究以评估211At标记的双特异性scFv针对肿瘤的功效。双特异性抗体使用211At-SAPS螯合物(N-(4-[211At]砹代苯乙基)琥珀酰胺酸酯)(参见，例如，图10)进行标记。
在注射BT474乳腺癌细胞前4天，小鼠被植入β雌二醇片剂。在第0天，小鼠被注射5×106BT474乳腺癌细胞。在第14天，以80μg的高剂量和10μg的低剂量腹膜内(i.p.)施用第一种治疗剂量的211AT缀合的双特异性抗体(ALM)。后续治疗剂量在第16天和第18天时施用。肿瘤体积随后如图11A到11C中所示进行追踪。
与未处理的对照(图11A)相比较，肿瘤体积在处理的动物(图11B和11C)中一般较小。
实施例4
癌症成像
图12显示使用碘-124标记的ALM双特异性单链Fv的2只小鼠的PET-CT图像。小鼠静脉内(i.v.)注射50微居里(50微克)标记的ALM且在48小时后成像。
这应当举例说明了本发明的双特异性抗体用于检测癌症的功效。
应当理解本文描述的实施例和实施方案仅用于举例说明性目的，而且对于本领域技术人员将提示根据其的各种修改和变化，且其将包括在本申请的范围和附加权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请以及伴随的附录为了所有目的在此整体引入作为参考。
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序列表
<110>ADAMS，GREGORY P.
HORAK，EVA M.
WEINER，LOUIS M.
JAMES，MARKS D.
<120>双特异性单链Fv抗体分子及其使用方法
<130>407T-000420US
<150>US 60/370,276
<151>2002-04-02
<150>US10/406,830
<151>2003-04-04
<160>57
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>291
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的抗体
<400>1
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
        35                  40                  45
Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
    50                  55                  60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Arg Gly Asp Asn Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
                85                  90                  95
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
            100                 105                 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Met Thr Ser Asn Ala Phe Ala Phe
        115                 120                 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu
145                 150                 155                 160
Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile
                165                 170                 175
Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Gly Val His
            180                 185                 190
Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly
        195                 200                 205
Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Phe Lys
    210                 215                 220
Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp
225                 230                 235                 240
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Trp
                245                 250                 255
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu
            260                 265                 270
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His
        275                 280                 285
His His His
    290
<210>2
<211>291
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的抗体
<400>2
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
        35                  40                  45
Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
    50                  55                  60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Arg Gly Asp Asn Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
                85                  90                  95
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
            100                 105                 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Met Thr Ser Asn Ala Phe Ala Phe
        115                 120                 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu
145                 150                 155                 160
Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile
                165                 170                 175
Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Gly Val His
            180                 185                 190
Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly
        195                 200                 205
Asn Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Phe Lys
    210                 215                 220
Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp
225                 230                 235                 240
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Trp
                245                 250                 255
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu
            260                 265                 270
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His
        275                 280                 285
His His His
    290
<210>3
<211>288
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的抗体
<400>3
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
        35                  40                  45
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Val Pro Gly
    50                  55                  60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile
65                  70                  75                  80
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
                85                  90                  95
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp
            100                 105                 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Gly Pro Pro Ile Gln His
        115                 120                 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Arg Gly Gly Gly Ser
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Ser Gln
145                 150                 155                 160
Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys
                165                 170                 175
Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Ser Phe Asp Val Gln Trp Tyr
            180                 185                 190
Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Asn
        195                 200                 205
Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ala Ser Lys Ser Gly
    210                 215                 220
Thr Ser Ala Ser Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln Ile Gly Asp Glu Ala
225                 230                 235                 240
Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Tyr Thr Gly Thr Tyr Ser Trp Val Phe Gly
                245                 250                 255
Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu
            260                 265                 270
Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His
        275                 280                 285
<210>4
<211>290
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的抗体
<400>4
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
        35                  40                  45
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
    50                  55                  60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile Asn Arg Asp Gly Ser Ala Ser
65                  70                  75                  80
Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp
                85                  90                  95
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
            100                 105                 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Val Gly Tyr Phe Asp
        115                 120                 125
Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr
145                 150                 155                 160
Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser
                165                 170                 175
Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Phe Val Ser Trp
            180                 185                 190
Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val
        195                 200                 205
Ser Asp Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser
    210                 215                 220
Gly Asn Thr Ala Ser Leu Ile Ile Ser Gly Leu Gln Ala Asp Asp Glu
225                 230                 235                 240
Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Gly Ser Ser Ser Thr His Val Ile
                245                 250                 255
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu Gln
            260                 265                 270
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His
        275                 280                 285
His His
    290
<210>5
<211>287
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的抗体
<400>5
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
        35                  40                  45
Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
    50                  55                  60
Lys Gly Leu Glu Trp Met Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys
65                  70                  75                  80
Tyr Tyr Ala Ala Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
                85                  90                  95
Ser Lys Asn Thr Val Ser Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
            100                 105                 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Tyr Gly Asp Tyr Ala Leu
        115                 120                 125
Asp TyrTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
145                 150                 155                 160
Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr
                165                 170                 175
Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp Leu Ala Trp Tyr
            180                 185                 190
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser
        195                 200                 205
Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly
    210                 215                 220
Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
225                 230                 235                 240
Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Leu Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly
                245                 250                 255
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile
            260                 265                 270
Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His
275                 280                 285
<210>6
<211>291
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的抗体
<400>6
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
        35                  40                  45
Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
    50                  55                  60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ile
65                  70                  75                  80
Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
                85                  90                  95
Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp
            100                 105                 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Gly Ala Lys Gln Trp Leu
        115                 120                 125
Glu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
    130                 135                 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn
145                 150                 155                 160
Phe Met Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr
                165                 170                 175
Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser
            180                 185                 190
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly
        195                 200                 205
Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Thr
    210                 215                 220
Ser Gly Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp
225                 230                 235                 240
Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Trp
                245                 250                 255
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Ala Ala Ala Glu
            260                 265                 270
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His
        275                 280                 285
His His His
    290
<210>7
<211>295
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的抗体
<400>7
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
            20                  25                  30
Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
        35                  40                  45
Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
    50                  55                  60
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala
65                  70                  75                  80
Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu
                85                  90                  95
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Val Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
            100                 105                 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Glu Gly Pro Tyr Cys Ser Ser
        115                 120                 125
Thr Ser Cys Tyr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
    130                 135                 140
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145                 150                 155                 160
Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala
                165                 170                 175
Leu Gly Gln Thr Val Lys Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser
            180                 185                 190
Tyr Phe Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Thr Leu
        195                 200                 205
Val Met Tyr Ala Arg Asn Asp Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe
    210                 215                 220
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu
225                 230                 235                 240
Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser
                245                 250                 255
Leu Asn Gly Tyr Leu Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            260                 265                 270
Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala
        275                 280                 285
Ala His His His His His His
    290                 295
<210>8
<211>286
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的抗体
<400>8
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly
            20                  25                  30
Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
        35                  40                  45
Gly Ser Phe Arg Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Pro Pro Gly Lys
    50                  55                  60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr
65                  70                  75                  80
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys
                85                  90                  95
Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala
            100                 105                 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly His Leu Gly Glu Leu Gly Trp Phe Asp
        115                 120                 125
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr
145                 150                 155                 160
Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
                165                 170                 175
Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln
            180                 185                 190
Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Arg
        195                 200                 205
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
    210                 215                 220
Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr
225                 230                 235                 240
Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Ser Asp Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly
                245                 250                 255
Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser
            260                 265                 270
Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His
        275                 280                 285
<210>9
<211>291
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的抗体
<400>9
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Pro Ala Met AlaGln Val Gln Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gly
            20                 25                  30
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
        35                  40                  45
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
    50                  55                  60
Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
                85                  90                  95
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
            100                 105                 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Asn Trp Asn
        115                 120                 125
Asn Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
    130                 135                 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145                 150                 155                 160
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
                165                 170                 175
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            180                 185                 190
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile
        195                 200                 205
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    210                 215                 220
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
225                 230                 235                 240
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Gly Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Trp
                245                 250                 255
Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Glu
            260                 265                 270
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His
        275                 280                 285
His His His
    290
<210>10
<211>291
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的抗体
<400>10
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Met Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
        35                  40                  45
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
    50                  55                  60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
                85                  90                  95
Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
            100                 105                 110
Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Tyr Ser Ser Asn Trp Asn
        115                 120                 125
Asn Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
    130                 135                 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145                 150                 155                 160
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
                165                 170                 175
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            180                 185                 190
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        195                 200                 205
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    210                 215                 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
225                 230                 235                 240
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Trp
                245                 250                 255
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala Glu
            260                 265                 270
Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His
        275                 280                 285
His His His
    290
<210>11
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽接头
<400>11
Gly Gly Gly Gly Ser
1                 5
<210>12
<211>55
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>12
aattcaggtg ctggtacttc aggttcaggt gcttcaggtg aaggttcagg ttcaa         55
<210>13
<211>55
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>13
agctttgaac ctgaaccttc acctgaagca cctgaacctg aagtaccagc acctg         55
<210>14
<211>60
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>14
aattcaggtg ctggtacttc aggttcaggt gcttcaggtg aaggttcagg ttcaaagcta    60
<210>15
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>15
cgaccatggc ccaggtgcag ctggtgcag         29
<210>16
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>16
cgaattcacc taggacggtc agcttgg           27
<210>17
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>17
gggaagcttc aggtgcagct ggtgcagtct gg     32
<210>18
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>18
gggctcgaga cctaggacgg tcagcttggt tcc    33
<210>19
<211>243
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的抗体
<400>19
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro
1               5                   10                  15
Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
            20                  25                  30
Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Glu Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro Leu Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
            100                 105                 110
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro
    130                 135                 140
Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly
145                 150                 155                 160
Gly Tyr Asn Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro
                165                 170                 175
Lys Leu Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Phe Asn
            180                 185                 190
Arg Phe Ser Gly Ala Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser
        195                 200                 205
Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Thr
    210                 215                 220
Ser Ser Ser Thr Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
225                 230                 235                 240
Gly Asn Ser
<210>20
<211>729
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码单链抗体的核酸
<400>20
atggcccagg tgcagctggt ggagtctggg ggaggcgtgg tccagcctgg gaggtccctg    60
agactctcct gtgcagcctc tggattcacc ttcagtagct atggcatgca ctgggtccgc    120
caggctccag gcaaggggct ggagtgggtg gcagttatat catatgatgg aagtaataaa    180
tactatgcag actccgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaattc caagaacacg  240
ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagct gaggacacgg ctgagtatta ctgtgcgaag  300
tatcctttaa actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctcaggtgg aggcggttca  360
ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg cagtctgctc tgactcagcc tgcctccgtg  420
tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt  480
ggttataact atgcttcctg gtaccaacag cacccaggca aggcccccaa actcatgatt  540
tatgaggtca gtaatcggcc ctcaggggtt ttcaatcgct tctctggcgc caagtctggc  600
aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc caggctgagg acgaggctga ttattactgc  660
aactcatata caagcagcag cacttgggtg ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta  720
gggaattcc                                                          729
<210>21
<211>295
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>合成的抗体
<400>21
Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro
1               5                   10                  15
Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys
            20                  25                  30
Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Val Ser Ala Ile Ser Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
    50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asn Ser Glu Asn Ser
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Ser Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr
    130                 135                 140
Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
145                 150                 155                 160
Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
                165                 170                 175
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala
            180                 185                 190
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Thr Ile Thr Cys
        195                 200                 205
Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
    210                 215                 220
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala
225                 230                 235                 240
Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
                245                 250                 255
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr
            260                 265                 270
Cys Gln Gln Tyr Tyr Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
        275                 280                 285
Leu Glu Asn Lys Arg Asn Ser
    290                 295
<210>22
<211>885
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码单链抗体的核酸
<400>22
atggcccagg tgcagctgca ggagtcgggg ggaggcgtgg tccagcctgg gaggtccctg  60
agactctcct gtgcagcgtc cggattcacc ttcaagagct atggcatgca ctgggtccgc  120
caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcagctatta gtgctagtgg tggtagcaca  180
tactacgcag actccgtgaa gggccgcttc accatcttca gagacaattc cgagaactca  240
ctgtatcttc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtctatta ctgtgcgaga  300
gattcaagtg ggtcctttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcaggt  360
ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc ggtggcggat cggacatcgt gatgacccag  420
tctccttcca ccctgtccgc atctattgga gacagagtca ccatcacctg ccgggccagt  480
gagggtattt atcactggtt ggcctggtat cagcagaagc cagggaaagc ccctaaactc  540
ctgatctata aggcctctag tttagccagt ggggccccat caaggttcag cggcagtgga  600
tctgggacag ataccatcac ctgccgggcc agtgagggta tttatcactg gttggcctgg  660
tatcagcaga agccagggaa agcccctaaa ctcctgatct ataaggcctc tagtttagcc  720
agtggggccc catcaaggtt cagcggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc  780
agcagcctgc aggctgaaga tgtggcagta tactactgtc agcaatatta tagaagtccg  840
ctcactttcg gtggagggac caagctggag aacaaacgga attcc                  885
<210>23
<211>5
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>运输信号传导序列
<400>23
Arg Glu Asp Leu Lys
1               5
<210>24
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>运输信号传导序列
<400>24
Arg Glu Asp Leu
1
<210>25
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>运输信号传导序列
<400>25
Arg Asp Glu Leu
1
<210>26
<211>4
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>运输信号传导序列
<400>26
Lys Asp Glu Leu
1
<210>27
<211>873
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码单链抗体的核酸
<400>27
atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc  60
atggcccagg tgcagctggt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg  120
agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttcgcagct atgccatgag ctgggtccgc  180
caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcagctatta gtggtcgtgg tgataacaca  240
tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg  300
ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtttatta ctgtgcgaaa  360
atgacaagta acgcgttcgc atttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc  420
tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcgca gtctgtgttg  480
acgcagccgc cctcagtgtc tggggcccca gggcagaggg tcaccatctc ctgcactggg  540
agcagctcca acatcggggc aggttatggt gtacactggt accagcagct tccaggaaca  600
gcccccaaac tcctcatcta tggtaacacc aatcggccct caggggtccc tgaccgattc  660
tctggcttca agtctggcac ctcagcctcc ctggccatca ctgggctcca ggctgaggat  720
gaggctgatt attactgcca gtcctatgac agcagcctga gtggttgggt gttcggcgga  780
gggaccaagc tgaccgtcct aggtgcggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat  840
ctgaatgggg ccgcacatca ccatcatcac cat                               873
<210>28
<211>873
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码单链抗体的核酸
<400>28
atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc  60
atggcccagg tgcagctggt ggagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg  120
agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttcgcagct atgccatgag ctgggtccgc  180
caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcagctatta gtggtcgtgg tgataacaca  240
tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg  300
ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtttatta ctgtgcgaaa  360
atgacaagta acgcgttcgc atttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc  420
tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcgca gtctgtgttg  480
acgcagccgc cctcagtgtc tggggcccca gggcagaggg tcaccatctc ctgcactggg  540
agcagctcca acatcggggc aggttatggt gtacactggt accagcagct tccaggaaca  600
gcccccaaac tcctcatcta tggtaacacc aatcggccct caggggtccc tgaccgattc  660
tctggcttca agtctggcac ctcagcctcc ctggccatca ctgggctcca ggctgaggat  720
gaggctgatt attactgcca gtcctatgac agcagcctga gtggttgggt gttcggcgga  780
gggaccaagc tgaccgtcct aggtgcggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat  840
ctgaatgggg ccgcacatca ccatcatcac cat                               873
<210>29
<211>864
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码单链抗体的核酸
<400>29
atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc  60
atggcccagg tacagctgca gcagtcaggg ggaggcctgg tcaaacctgg ggggtccctg  120
agactctcct gtgcagcctc tggattcacc ttcagtagct atagcatgaa ctgggtccgc  180
caggtcccag ggaaggggct ggagtgggtc tcatccatta gtagtagtag tagttacata  240
tactacgcag actctgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaatgc caagaactca  300
ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagac gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga  360
gatgacggtc cccccatcca gcactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcacgt  420
ggaggcggtt caggcggagg tggctctggc ggtggcggat cgcagtctgt gttgagccag  480
ccgccctcgg tatctggggc cccagggcag agggtcacca tctcctgcac tgggagcagc  540
tccaacatcg gggcaagttt tgatgtacag tggtaccagc aacttccagg aacagccccc  600
aaactcctca tctatggtaa caacaatcgg ccctcagggg tccctgaccg attctctgcc  660
tccaagtctg gcacctcagc ctccctgggc atcaccggac tccagatcgg ggacgaggcc  720
gattattact gcggctcata tacaggcacc tactcttggg tgttcggcgg agggaccaag  780
gtcaccgtcc taggtgcggc cgcagaacaa asactcatct cagaagagga tctgaatggg  840
gccgcacatc accatcatca ccat                                         864
<210>30
<211>870
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码单链抗体的核酸
<400>30
atgaaatacc tattgccgac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc  60
atggcccagg tgcagctgca ggagtcgggg ggaggcttgg tcaagcctgg ggggtccctg  120
agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttagtagct attggatgag ctgggtccgc  180
caggctccag gaaaggggct ggagtgggtc gccaacataa accgcgatgg aagtgccagt  240
tattatgtgg actctgtgaa gggccgattc accatctcca gagacgacgc caagaactca  300
ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga  360
gatcggggcg tggggtactt cgatctctgg ggccgtggca ccctggtcac cgtctcctca  420
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcgcagtc tgccctgact  480
cagcctgcct ccgtgtctgg atctcctgga cagtcgatca ccatctcctg cactggaacc  540
agcagtgatg ttggtggtta taactttgtc tcctggtacc aacagcaccc aggcaaagcc  600
cccaaactca tgatttatga tgtcagtgat cgaccctcag gggtctctga tcggttctct  660
ggctccaagt ctggcaacac ggcctccctg atcatctctg gcctccaggc tgacgacgag  720
gctgattatt actgcagctc atatggaagc agcagcaccc atgtgatttt cggcggaggg  780
accaaggtca ccgtcctagg tgcggccgca gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg  840
aatggggccg cacatcacca tcatcaccat                                   870
<210>31
<211>861
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码单链抗体的核酸
<400>31
atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc  60
atggcccagg tgcagctggt ggagtctggg ggaggcgtgg tccagcctgg gaggtccctg  120
agactctcct gtgcagcctc tggattcacc ttcagtgact attatataca ctgggtccgc  180
caggctccag gcaaggggct ggagtggatg gcagttattt catatgatgg caataataaa  240
tactacgccg cctccgtgaa ggaccgattc accatctcca gagacaattc caagaacacg  300
gtgtctctgc aaatgaacag cctgagagct gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga  360
gatctctacg gtgactacgc tcttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc  420
tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcgga catccagatg  480
acccagtctc cttccaccct gtctgcatct ctgggagaca gagtcaccat cacttgccgg  540
gccagtcaga gtattggtag ctggttggcc tggtatcagc agaaaccagg gaaagcccct  600
aaactcctga tctataaggc gtctacttta gaaagtgggg tcccatcaag gttcaccggc  660
agtggatctg ggacagaatt cactctcaca atcagcggcc tccagcctga agattttgca  720
acttattact gtcagaagct tagtagttac ccgctcactt tcggcggagg gaccaaggtg  780
gaaatcaaac gtgcggccgc agaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct gaatggggcc  840
gcacatcacc atcatcacca t                                            861
<210>32
<211>873
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码单链抗体的核酸
<400>32
atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc  60
atggcccagg tgcagctggt gcagtctggg ggaggcttgg tacagcctgg caggtccctg  120
agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttgatgatt atgccatgca ctgggtccgg  180
caagctccag ggaagggcct ggagtgggtc tcaggtatta gttggaatag tggtagcata  240
ggctatgcgg actctgtgaa gggccgattc accatctcca gagacaacgc caagaactca  300
ctgtatctgc aaatgaacag cctgagacct gaggacacgg ctgtgtatta ctgtgcgaga  360
gatcttggtg ccaagcagtg gctggagggg tttgactact ggggccaggg caccctggtc  420
accgtctcct caggtggagg cggttcaggc ggaggtggct ctggcggtgg cggatcgaat  480
tttatgctga ctcaggaccc tgctgtgtct gtggccttgg gacagacagt caggatcaca  540
tgccaaggag acagcctcag aagctattat gcaagctggt accagcagaa gccaggacag  600
gcccctgtac ttgtcatcta tggtaaaaac aaccggccct cagggatccc agaccgattc  660
tctggctcca cctcaggaaa ctcagcttcc ttgaccatca ctggggctca ggcggaagat  720
gaggctgact attactgtaa ctcccgggac agcagtggta accattgggt gttcggcgga  780
gggaccaagg tcaccgtcct aggtgcggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat  840
ctgaatgggg ccgcacatca ccatcatcac cat                                 873
<210>33
<211>885
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码单链抗体的核酸
<400>33
atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc  60
atggccgagg tgcagctggt gcagtctggg gctgaggtga agaagcctgg gtcctcggtg  120
aaggtctcct gcaaggcttc tggaggcacc ttcagcagct atgctatcag ctgggtgcga  180
caggcccctg gacaaggcct tgagtggatg ggagggatca tccctatctt tggtacagca  240
aactacgcac agaagttcca gggcagagtc acgattaccg cggacgaatc cacgagcaca  300
gcctacatgg aggtgagcag cctgagatct gaggacacgg ccgtgtatta ctgtgcgaga  360
gaggaggggc catattgtag tagtaccagc tgctatgggg cttttgatat ctggggccaa  420
ggcaccctgg tcaccgtctc ctcaggtgga ggcggttcag gcggaggtgg ctctggcggt  480
ggcggatcgc agtctgtgct gactcaggac cctgctgtgt ctgtggcctt gggacagaca  540
gtcaagatca catgccaagg agacagcctc agaagctatt ttgcaagctg gtaccagcag  600
aagccaggac aggcccctac acttgtcatg tatgctagaa atgaccggcc cgcaggggtc  660
cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cagtgggctc  720
cagtctgagg atgaggctga ttattattgt gcagcatggg atgacagcct gaatggttat  780
ctcttcggag ctgggaccaa gctgaccgtc ctaggtgcgg ccgcagaaca aaaactcatc  840
tcagaagagg atctgaatgg ggccgcacat caccatcatc accat                  885
<210>34
<211>861
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码单链抗体的核酸
<400>34
atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc  60
atggcccagg tgcagctgca ggagtcgggc ccaggactgg tgaagccttc ggagaccctg  120
tccctcacct gcactgtctc tggtggctcc ttcagaagtt actactggag ctggatccgg  180
tagcccccag ggaagggact ggagtggata gggtatatct tttacagtgg gagcaccaac  240
tacaatccct ccctcaagag tcgagtcacc atatcagtag acacgtccaa gaaccagttc  300
tccctgaagc tgagctcttt gaccgctgcg gacacggccg tgtattattg tgcgagagga  360
catttggggg agttaggatg gttcgacccc tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc  420
tcaagtggag gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcgga catccagatg  480
acccagtctc catcctccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcaccat cacttgccag  540
gcgagtcagg acattagcaa ctatttaaat tggtatcagc agaagccggg gaaagcccct  600
aaactcctga tctttgctgc atcccgttta gcgagcgggg tcccctcaag attcagcggc  660
agtggatctg gcacagattt cagtctcacc atcagcagcc tgcagcctga cgattttgca  720
acttattatt gtctacaaga ttccgattac cccctcactt tcggcggagg gaccaaggtg  780
gaaatcaaac gtgcggccgc agaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct gaatggggcc  840
gcacatcacc atcatcacca t                                            861
<210>35
<211>873
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的抗体
<400>35
atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc  60
atggcccagg tgcagctgtt gcagttcggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg  120
agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttagcagct atgccatgag ctgggtccgc  180
caggctccag ggaaggggct ggagtggctg tcagctatta gtggtagtgg tggtagcaca  240
tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg  300
ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccgtatatta ctgtgcaaga  360
gagggatata gcagcaactg gaataactgg tacttcgatc tctggggccg tggcaccctg  420
gtcaccgtct cctcaggtgg aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg  480
gatgttgtga tgactcagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc  540
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca  600
gggaaggccc ctgaactcct gatctatgct gcatcccgtt tacaaagtgg ggtcccatca  660
aggttcagtg gcagtggatc tgggaccgaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct  720
gatgattttg caacttatta cggccaacaa tattataatt atccgtggac gttcggccga  780
gggaccaagg tggaaatcaa acgtgcggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat  840
ctgaatgggg ccgcacatca ccatcatcac cat                               873
<210>36
<211>873
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码单链抗体的核酸
<400>36
atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgcggc ccagccggcc  60
atggcccagg tgcagctgca ggagtcgggg ggaggcatgg tccagcctgg gaggtccctg  120
agactctcct gtgcagcctc tggattcacc tttagcagct atgccatgag ctgggtccgc  180
caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc tcagctatta gtggtagtgg tggtagcaca  240
tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacaattc caagaacacg  300
ctgtatctgc aaatgaacag cctgagagcc gaggacacgg ccctgtatta ctgtgcaaga  360
gagggatata gcagcaactg gaataactgg tacttcgatc tctggggccg tggcaccctg  420
gtcaccgtct cctcaggtgg aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg  480
gaaattgtgc tgactcagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc  540
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca  600
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca  660
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct  720
gacgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccttggac gttcggccaa  780
gggaccaagc tggagatcaa acgtgcggcc gcagaacaaa aactcatctc agaagaggat  840
ctgaatgggg ccgcacatca ccatcatcac cat                               873
<210>37
<211>20
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽接头
<400>37
Asn Ser Gly Ala Gly Thr Ser Gly Ser Gly Ala Ser Gly Glu Gly Ser
1               5                   10                  15
Gly Ser Lys Leu
            20
<210>38
<211>129
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的抗体VH序列
<400>38
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
        35                  40                  45
Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala Lys Trp
            100                 105                 110
Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
       115                 120                 125
Ser
<210>39
<211>129
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的抗体VH序列
<400>39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
        35                  40                  45
Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Asp Val Ala Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala Lys Trp
            100                 105                 110
Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
Ser
<210>40
<211>129
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的抗体VH序列
<400>40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
        35                  40                  45
Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala Lys Trp
            100                 105                 110
Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
Ser
<210>41
<211>129
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的抗体VH序列
<400>41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
        35                  40                  45
Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Thr Asp Arg Thr Cys Ala Lys Trp
            100                 105                 110
Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
Ser
<210>42
<211>129
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的抗体VH序列
<400>42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
        35                  40                  45
Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Thr Asp Arg Thr Cys Ala Lys Trp
            100                 105                 110
Pro Glu Trp Leu Gly Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
Ser
<210>43
<211>111
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的抗体VL序列
<400>43
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            100                 105                 110
<210>44
<211>111
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的抗体VL序列
<400>44
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            100                 105                 110
<210>45
<211>111
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的抗体VL序列
<400>45
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            100                 105                 110
<210>46
<211>111
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的抗体VL序列
<400>46
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
            100                 105                 110
<210>47
<211>111
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的抗体VL序列
<400>47
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
            100                 105                 110
<210>48
<211>129
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的抗体VH序列
<400>48
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
        35                  40                  45
Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala Lys Trp
            100                 105                 110
Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
Ser
<210>49
<211>129
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的抗体VH序列
<400>49
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
        35                  40                  45
Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Asp Val Ala Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala Lys Trp
            100                 105                 110
Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
Ser
<210>50
<211>129
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的抗体VH序列
<400>50
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
        35                  40                  45
Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Ser Ser Ser Asn Cys Ala Lys Trp
            100                 105                 110
Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
Ser
<210>51
<211>129
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的抗体VH序列
<400>51
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
        35                  40                  45
Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Thr Asp Arg Thr Cys Ala Lys Trp
            100                 105                 110
Pro Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
Ser
<210>52
<211>129
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的抗体VH序列
<400>52
Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Met
        35                  40                  45
Gly Leu Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Lys Tyr Ser Pro Ser Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg His Asp Val Gly Tyr Cys Thr Asp Arg Thr Cys Ala Lys Trp
            100                 105                 110
Pro Glu Trp Leu Gly Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
Ser
<210>53
<211>111
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的抗体VL序列
<400>53
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            100                 105                 110
<210>54
<211>111
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的抗体VL序列
<400>54
Glu Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            100                 105                 110
<210>55
<211>111
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的抗体VL序列
<400>55
Glu Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            100                 105                 110
<210>56
<211>111
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的抗体VL序列
<400>56
Glu Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            100                 105                 110
<210>57
<211>111
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>人工的抗体VL序列
<400>57
Glu Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala AlaPro Gly Gln
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys  Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Asp His Thr Asn Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Phe Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Tyr Thr Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
            100                 105                 110
B10，抗-EGFR ECD
ATGGCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTC
TGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGATTACTACTGGAGTTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGT
ACATCTATTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCCCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATGTCAGTAGACACGTCCAAGAAC
CAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGTAAAGATAGTAGTCGG
GGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCATCGGCCTCGGGGGCCGAATTGGGCGGCGGCGGCT
CCGGAGGAGGAGGATCTGGTGGTGGTGGTTCGACTAGTGAAATTGTGATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCT
CCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGG
CCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTG
GGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCA
CCCATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGCTCGAGC
B2，抗-EGFR ECD
ATGGCCCAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATC
TGGATACACCTTCACCAGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAATAATCA
ACCCTAGTGGTGGTAGCACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACA
GTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGAGGGACTACGGGGGAGAA
CATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCATCGGCCTCGGGGGCCGAATTGGGCGGCGGCGGCTCCG
GAGGAGGAGGATCTGGTGGTGGTGGTTCGACTAGTGACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTA
GGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAA
AGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGA
CAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAGGCTAACAGTTTCCCG
ATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGCTCGAGC
H2，抗-Her2 ECD
ATGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTN
TGGTGGGTCCTTCAGTGGTTACTACTGGAGTTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAGTCA
ATCATAGTGGAAGGACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTC
TCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGCATAGCAGCTCCTATGATGC
TTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCATCGGCCTCGGGGGCCGAATTGGGCGGCGGCGGCTCCG
GANGAGGAGGATCTGGTGGTGGTGGTTCGACTAGTCAGACTGTGGTGACCCAGGAGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGG
CAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTTCACTGGTACCGGCAGCTTCC
AGGAACAGTCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACACCAATCGGCCCTCAGGGGTCACTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGT
CTGGCTCCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGC
ATCCTGAGTGGTTATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGGCTCGAG
H3抗-Her2 ECD
ATGGCCCAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATC
TGGATACACCTTCACCAGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAATAATCA
ACCCTAGTGGTGGTAGCACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACA
GTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGGAGCAGTTGATGCTTT
TGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCATCGGCCTCGGGGGCCGAATTGGGCGGCGGCGGCTCCGGAG
GAGGAGGATCTGGTGGTGGTGGTTCGACTAGTGATGTTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGA
CAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCGTATACAGTGATGGATACACCTACTTGAGTTGGTTTCACCA
GAGGCCAGGCCAATCTCCAAGGCGCCTAATTTATAAGGTTTCTAACCGGGACTCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCA
GTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCATGCAAGGT
ACACACTGGCCCCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGCTCGAGGC

Claims (57)

1.一种双特异性抗体，其包含互相连接的第一种抗体和第二种抗体，其中所述第一种抗体和所述第二种抗体与不同表位特异性结合，其中所述第一种抗体具有对于表皮生长因子受体蛋白家族成员上的至少一种表位的结合特异性，所述成员选自EGFR、HER2/neu、HER3和HER4，且所述第二种抗体具有对于表皮生长因子受体蛋白家族成员上的第二种表位的结合特异性，所述第二种表位不同于所述第一种表位，且是选自EGFR、HER2/neu、HER3和HER4的蛋白质上的表位，其中所述抗体由包含核酸序列的载体编码，所述核酸序列选自SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37。
2.权利要求1的双特异性抗体，其中所述抗体由包含2种核酸序列的载体编码，所述2种核酸序列独立地选自SEQ ID NO：27、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ IDNO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ IDNO：36和SEQ ID NO：37。
3.权利要求1的双特异性抗体，其中所述抗体由包含核酸序列的载体编码，所述核酸序列编码选自下列的多肽：SEQ ID NO：38、SEQID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57。
4.权利要求1的双特异性抗体，其中所述抗体由包含2种核酸序列的载体编码，所述2种核酸序列独立地选自编码选自下列的多肽的核酸序列：SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQID NO：57。
5.权利要求2的双特异性抗体，其中所述载体进一步包含编码SEQ ID NO：37的多肽的核酸。
6.一种组合物，其包含权利要求1的双特异性抗体和药学可接受的载体。
7.一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用治疗有效量的权利要求6的组合物。
8.权利要求7的方法，其中所述癌症选自乳腺、结肠、卵巢、子宫内膜、胃、胰、前列腺和唾液腺癌。
9.一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用与其他细胞毒剂组合的治疗有效量的权利要求6的组合物，所述其他细胞毒剂选自化学治疗剂、外部束辐射、靶向的放射性同位素和信号转导抑制剂。
10.一种嵌合部分，其包含与效应物偶联的权利要求1的双特异性抗体。
11.权利要求10的嵌合部分，其中所述效应物选自细胞毒素、标记、放射性核素、药物、脂质体、配体和抗体。
12.权利要求10的嵌合部分，其中所述嵌合部分是融合蛋白。
13.一种将效应分子特异性递送给细胞的方法，所述细胞具有来自表皮生长因子受体蛋白家族的受体，所述受体选自EGFR、HER2/neu、HER3和HER4，所述方法包括：
提供包含与权利要求1的抗体附着的所述效应分子的嵌合部分；和
使所述细胞与所述嵌合部分接触，由此所述嵌合部分与所述细胞特异性结合。
14.权利要求13的方法，其中所述效应分子选自细胞毒素、标记、放射性核素、药物、脂质体、配体和抗体。
15.权利要求13的方法，其中所述嵌合部分是融合蛋白。
16.权利要求13的方法，其中所述细胞是癌细胞。
17.权利要求16的方法，其中所述细胞是选自乳腺、结肠、卵巢、子宫内膜、胃、胰、前列腺和唾液腺癌的癌细胞。
18.一种特异性杀死细胞的方法，所述细胞具有来自表皮生长因子受体蛋白家族的受体，所述受体选自EGFR、HER2/neu、HER3和HER4，所述方法包括：
提供包含与效应物附着的、权利要求1的抗体的嵌合部分，所述效应物选自细胞毒素、放射性部分、和包含细胞毒性或细胞抑制剂的脂质体；和
使所述细胞与所述嵌合部分接触，由此所述嵌合部分与所述细胞特异性结合，从而导致所述细胞死亡。
19.权利要求18的方法，其中所述嵌合部分是融合蛋白。
20.权利要求18的方法，其中所述细胞是癌细胞。
21.权利要求20的方法，其中所述细胞是选自乳腺、结肠、卵巢、子宫内膜、胃、胰、前列腺和唾液腺癌的癌细胞。
22.一种检测细胞或组织的方法，所述细胞或组织表达表皮生长因子受体蛋白家族的一个或多个成员，所述方法包括：
使细胞或组织与嵌合部分接触，所述嵌合部分包含与可检测标记附着的、权利要求1的双特异性抗体；和
检测所述标记，其中与所述细胞或组织结合的所述标记的检测指示细胞或组织的存在，所述细胞或组织表达表皮生长因子受体蛋白家族的一个或多个成员。
23.权利要求22的方法，其中所述可检测标记选自γ发射体、正电子发射体、MRI标记和荧光标记。
24.权利要求22的方法，其中所述可检测标记是γ发射体，且所述检测包含使用γ照相机成像。
25.权利要求22的方法，其中所述可检测标记是正电子发射体，且所述检测包含使用正电子发射断层照相(PET)成像。
26.权利要求22的方法，其中所述可检测标记是MRI标记，且所述检测包含使用磁共振成像检测。
27.权利要求22的方法，其中表达表皮生长因子受体蛋白家族的一个或多个成员的细胞或组织是超表达选自EGFR、HER2/neu、HER3和HER4的蛋白质的细胞或组织。
28.权利要求22的方法，其中表达表皮生长因子受体蛋白家族的一个或多个成员的细胞或组织是癌细胞或组织。
29.权利要求22的方法，其中表达表皮生长因子受体蛋白家族的一个或多个成员的细胞或组织是，选自乳腺、结肠、卵巢、子宫内膜、胃、胰、前列腺和唾液腺癌的癌细胞或组织。
30.权利要求22的方法，其中所述检测包含非侵入性成像技术。
31.权利要求22的方法，其中所述检测包含免疫组织化学。
32.权利要求22的方法，其中所述检测包含在组织样品或活组织检查中的检测。
33.权利要求22的方法，其中所述检测包含在组织切片中的检测。
34.权利要求22的方法，其中所述检测包含在人中检测所述细胞或组织。
35.权利要求22的方法，其中所述检测包含在取自人的生物学样品中检测所述细胞或组织。
36.一种具有第一个和第二个臂的双特异性单链Fv抗体，所述第一个和第二个臂与2种不同表位特异性结合、且经由缺乏蛋白酶剪切位点的接头分子可操作地连接，所述臂之一具有对于表皮生长因子受体蛋白家族成员上的至少一种表位的结合特异性，所述成员选自EGFR、HER2/neu、HER3和HER4，且所述另一个臂具有对于表皮生长因子受体蛋白家族成员上的第二种表位的结合特异性，所述第二种表位不同于所述第一种表位且选自EGFR、HER2/neu、HER3和HER4。
37.权利要求36的双特异性单链Fv抗体，其中所述第一个和第二个臂选自C6.5、C6ML3-9、C6MH3-B1、C6-B1D2、F5、HER3.A5、HER3.F4、HER3.H1、HER3.H3、HER3.E12、HER3.B12、EGFR.E12、EGFR.C10、EGFR.B11、EGFR.E8、HER4.B4、HER4.G4、HER4.F4、HER4.A8、HER4.B6、HER4.D4、HER4.D7、HER4.D11、HER4.D12、HER4.E3、HER4.E7、HER4.F8和HER4.C7。
38.权利要求36的双特异性单链Fv抗体，其是重组产生的。
39.一种接头分子，其适合于可操作地连接双特异性单链Fv抗体的所述第一个和第二个臂，所述接头由长度为约3-约30个氨基酸的氨基酸序列组成，其中所述接头缺乏蛋白酶剪切位点。
40.一种接头分子，其适合于可操作地连接双特异性单链Fv抗体的所述第一个和第二个臂，所述接头分子具有SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
41.一种具有第一个和第二个臂的双特异性单链Fv抗体，所述第一个和第二个臂与2种不同表位特异性结合，且经由权利要求40或41中任何一项的接头分子可操作地连接，所述第一个和第二个臂具有对于表皮生长因子受体蛋白家族成员上的2种不同表位的结合特异性，所述成员选自EGFR、HER2/neu、HER3和HER4。
42.权利要求41的双特异性单链Fv抗体，其中所述第一个和第二个臂选自C6.5、C6ML3-9、C6MH3-B1、C6-B1D2、F5、HER3.A5、HER3.F4、HER3.H1、HER3.H3、HER3.E12、HER3.B12、EGFR.E12、EGFR.C10、EGFR.B11、EGFR.E8、HER4.B4、HER4.G4、HER4.F4、HER4.A8、HER4.B6、HER4.D4、HER4.D7、HER4.D11、HER4.D12、HER4.E3、HER4.E7、HER4.F8和HER4.C7。
43.权利要求41的双特异性单链Fv抗体，其是重组产生的。
44.权利要求41的双特异性单链Fv抗体，其中所述第一个和第二个臂与肿瘤细胞上表达的不同表位特异性结合，且所述双特异性单链Fv抗体与所述表位的结合导致所述肿瘤细胞存活减少。
45.权利要求44的双特异性单链Fv抗体，其中所述第一个和第二个臂选自C6.5、C6ML3-9、C6MH3-B1、C6-B1D2、F5、HER3.A5、HER3.F4、HER3.H1、HER3.H3、HER3.E12、HER3.B12、EGFR.E12、EGFR.C10、EGFR.B11、EGFR.E8、HER4.B4、HER4.G4、HER4.F4、HER4.A8、HER4.B6、HER4.D4、HER4.D7、HER4.D11、HER4.D12、HER4.E3、HER4.E7、HER4.F8和HER4.C7。
46.一种组合物，其包含权利要求8的双特异性单链Fv抗体和药学可接受的载体。
47.一种用于治疗癌症的方法，其包括给有此需要的患者施用治疗有效量的权利要求46的组合物。
48.权利要求47的方法，其中所述癌症选自乳腺、结肠、卵巢、子宫内膜、胃、胰、前列腺和唾液腺癌。
49.一种用于治疗癌症的方法，其包括给有此需要的患者施用与其他细胞毒剂组合的治疗有效量的权利要求10的组合物，所述其他细胞毒剂选自化学治疗剂、外部束辐射、靶向的放射性同位素和信号转导抑制剂。
50.一种载体，其包含编码权利要求36的双特异性单链Fv抗体的所述核酸序列。
51.权利要求50的载体，其选自质粒、粘粒、噬菌体和病毒。
52.权利要求50的载体，其中所述载体包含选自下列的核酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：14。
53.权利要求50的载体，其中所述载体包含编码选自下列的多肽的核酸序列：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37。
54.一种宿主细胞，其用权利要求50的载体转化。
55.权利要求52的宿主细胞，其是肿瘤细胞。
56.双特异性单链Fv抗体ALM，其包含具有对于HER3的结合特异性的第一个臂和具有对于HER2/neu的结合特异性的第二个臂。
57.双特异性单链Fv抗体ALF，其包含具有对于HER3上的2种不同表位的结合特异性的第一个臂和第二个臂。
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