ES2625818T3 - Anticuerpos biespecíficos anti-IGF-1R y anti-ErbB3 - Google Patents

Anticuerpos biespecíficos anti-IGF-1R y anti-ErbB3 Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo biespecífico polivalente (PBA), cuyo anticuerpo es una proteína que comprende dos pares de cadenas polipeptídicas, comprendiendo cada par de dichos dos pares una cadena pesada unida a una cadena ligera por al menos un enlace de cadena pesada; en el que cada par comprende al menos un sitio de unión a anti-IGF-1R y al menos un sitio de unión a anti-ErbB3; y cada par comprende un primer sitio de unión que comprende una porción N-terminal de la cadena pesada del PBA y una porción N-terminal de la cadena ligera del PBA, y un segundo sitio de unión que es un scFv C-terminal que está compuesto en su totalidad por la cadena pesada del PBA, conteniendo dicho scFv C-terminal una región variable de cadena pesada unida a una región variable de cadena ligera por un enlazador scFv; y el sitio de unión a anti-IGF-1R está unido al sitio de unión a anti- ErbB3 a través de una región constante de inmunoglobulina de cadena pesada (HC Ig) compuesta por la cadena pesada del PBA, y los dos pares están unidos mediante al menos un enlace entre las regiones constantes de HC Ig de cada par, y (i) el sitio de unión a anti-IGF-1R comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende un conjunto de tres regiones determinantes de la complementariedad VH (CDR) dispuesta en un orden lineal amino a carboxi de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3, y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende un conjunto de tres CDR VL dispuestas en un orden lineal amino a carboxi de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3, en el que a. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:8 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:32; o b. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:9 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:33; o c. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:10 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:34; o d. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:11 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:35; o e. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:8 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:33; o f. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:10 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:32; o (ii) el sitio de unión a anti-ErbB3 comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende un conjunto de tres CDR VH y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende un conjunto de tres CDR VL, comprendiendo además cada CDR un extremo amino y un extremo carboxi, en el que las CDR de cada conjunto de CDR se disponen en el anticuerpo en un orden lineal amino a carboxi de CDR 1, CDR2 y CDR3, en el que aa. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:134 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:166; o bb. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:135 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:167; o cc. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:136 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:168; o dd. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:137 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:169; o ee. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:138 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:170; o ff. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:139 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:171; o gg. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-5 ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:140 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:172; o hh. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:141 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 10 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:173; o ii. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:142 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:174; o jj. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:143 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:175; o kk. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:136 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacídica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:169; y (iii) en el que el PBA no comprende ni a) un módulo anti-IGF-1R que comprende las secuencias aminoacídicas de VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R de SEQ ID NO:11 y las secuencias aminoacídicas de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R de SEQ ID NO:35, ni b) un módulo anti-ErbB3 25 que comprende las secuencias aminoacídicas de VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti- ErbB3 de SEQ ID NO:143 y las secuencias aminoacídicas de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 de SEQ ID NO:175.

Description

Anticuerpos biespecfficos anti-IGF-IR y anti-ERBB3.
5 LISTA DE SECUENCIAS
La presente solicitud contiene una Lista de Secuencias que se ha enviado en formato ASCII a traves de EFS-Web y se incorpora por la presente por referencia en su totalidad. Dicha copia ASCII, creada el 5 de abril de 2012, se denomina 1141PC01.txt y tiene un tamano de 950.611 bytes.
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ANTECEDENTES
Las celulas tumorales expresan receptores para factores de crecimiento y citocinas que estimulan la proliferacion de las celulas. Los anticuerpos para dichos receptores pueden ser eficaces para bloquear la estimulacion de la 15 proliferacion celular mediada por factores de crecimiento y citocinas y pueden de este modo inhibir la proliferacion de celulas tumorales y el crecimiento tumoral. Los anticuerpos terapeuticos disponibles en el mercado que se dirigen a receptores en las celulas cancerosas incluyen, por ejemplo, trastuzumab, que se dirige al receptor HER2 (tambien conocido como ErbB2) para el tratamiento del cancer de mama, y cetuximab que se dirige al receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR, tambien conocido como HER1 o ErbB1) para el tratamiento del cancer colorrectal y 20 del cancer de cabeza y cuello.
Los anticuerpos monoclonales han avanzado significativamente nuestra capacidad para tratar canceres, sin embargo, los estudios clfnicos han demostrado que muchos pacientes no responden adecuadamente a la terapia monoespecffica. Esto se debe en parte a la naturaleza multigenica de los canceres, donde las celulas cancerosas se 25 basan en rutas multiples, y a menudo redundantes, para la proliferacion. Los anticuerpos bi o multi-especfficos capaces de bloquear multiples rutas de crecimiento y supervivencia a la vez tienen un potencial para satisfacer mejor el reto de bloquear el crecimiento del cancer, e incluso muchos de ellos estan avanzando en el desarrollo clfnico. Sin embargo, los anticuerpos biespecfficos presentan desaffos de diseno significativos, debido al gran numero de variables que deben considerarse en su diseno y optimizacion, asf como a sus diferencias estructurales con los 30 anticuerpos de origen natural.
Los anticuerpos monoclonales, tales como trastuzumab, cetuximab, bevacizumab y panitumumab han mejorado significativamente los resultados de los pacientes en la clfnica, y se estan ensayando actualmente en desarrollo clfnico mas de doscientos anticuerpos monoclonales terapeuticos. Sin embargo, se ha hecho evidente que los 35 tumores impulsados por oncogenes individuales no son la norma, y el tratamiento a menudo da como resultado la activacion de mecanismos de resistencia, que a su vez tambien requieren una intervencion dirigida. Por ejemplo, en multiples modelos preclfnicos de resistencia al trastuzumab, la inhibicion del IGF-1R restaura la sensibilidad al trastuzumab. Se ha intentado en la clfnica la combinacion de agentes dirigidos, pero hasta ahora han tenido un exito clfnico limitado y en combinacion pueden ser prohibitivamente costosos. La necesidad de inhibir multiples dianas ya 40 sea debido a la resistencia o debido a los tumores que son impulsados por multiples rutas de factores de crecimiento ha conducido a un mayor interes en los anticuerpos biespecfficos. Los anticuerpos biespecfficos desarrollados actualmente se disenaron tfpicamente de manera empfrica. Ademas, las propiedades farmaceuticas de estos anticuerpos biespecfficos eran casi invariablemente inferiores a las de los anticuerpos monoclonales. Estos factores representan un desaffo importante para el desarrollo de terapias contra el cancer biespecfficas. Se puede obtener un 45 beneficio anadido significativo a partir del direccionamiento de multiples rutas de supervivencia del cancer a partir de un aumento del trabajo dirigido a identificar e crear un anticuerpo biespecffico con caracterfsticas optimas. Esto requiere un enfoque iterativo que consiste en la simulacion computacional para identificar estrategias de direccionamiento optimas y especificaciones de diseno, creacion por ingenierfa de inhibidores que poseen estas caracterfsticas, y validacion experimental de la hipotesis terapeutica. Se separa este marco de ingenierfa en dos 50 categorfas: seleccion de un formato molecular apropiado con propiedades farmaceuticas robustas y simulacion computacional para identificar las mejores dianas y caracterfsticas optimas de diseno terapeutico, por ejemplo, en un anticuerpo biespecffico de tipo IgG (figura 8).
Una de las principales ventajas de los anticuerpos es su capacidad para unirse firmemente a practicamente 55 cualquier diana extracelular. Esta propiedad es impulsada por dos caracterfsticas de las regiones variables de anticuerpos (VR): la superficie plana grande de seis regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y el hecho de que los anticuerpos tienen dos brazos de union que pueden dirigirse a dos moleculas simultaneamente. En anticuerpos biespecfficos, la union diana doble da como resultado una afinidad mas estrecha, porque una vez que un brazo del anticuerpo esta unido a una diana extracelular, el segundo brazo esta restringido a una region estrecha
por encima de la membrana plasmatica (aproximadamente 100 angstroms) y, por lo tanto, se concentra cerca de la superficie celular. Esto da como resultado un evento de union secundario mucho mas rapido que no esta limitado por la difusion. Se denomina la aceleracion de un evento de union secundario. Tanto la afinidad como la avidez son propiedades racionalmente creadas por ingenierfa, ya que la primera se puede mejorar a traves de la maduracion de 5 afinidad in silico y la ultima puede mejorarse creando por ingenierfa brazos de direccionamiento adicionales al mismo o diferente antfgeno presente sobre la superficie celular. Ademas de sus capacidades de union, los anticuerpos pueden poseer multiples funciones efectoras mediadas por su dominio Fc: la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) que en seres humanos se determinan por interacciones con FcyRI de activacion, FcYRIIa/c, FcYRIIIa y receptores FcYRIIb inhibidores; la 10 citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) que se desencadena mediante la union del anticuerpo a los componentes del sistema de complemento; y una larga semivida que esta mediada a traves del reciclaje activo por el receptor Fc neonatal (FcRn). Todas estas funciones se pueden afinar para optimizar la eficacia de una terapia anticancerosa y se pueden conservar para aprovecharse en una protefna biespecffica.
15 El fragmento variable (Fv), compuesto por los dominios pesado variable (VH) y ligero variable (VL) de un anticuerpo IgG, es un fragmento de anticuerpo mfnimo que muestra la union completa al antfgeno. Estos dominios variables se pueden fusionar con exito en una construccion monocatenaria (scFv), aunque la afinidad se reduce a menudo en cierta medida en comparacion con un anticuerpo nativo completo. La mayorfa de los formatos biespecfficos actuales presentan uno o varios modulos scFv unidos al extremo N o C de una cadena pesada de IgG o cadena ligera de IgG 20 a traves de un enlazador de baja complejidad. Otro formato de anticuerpo biespecffico es la inmunoglobulina de dominio variable dual (DVD-lg). La DVD-lg consiste en una primera cadena pesada de IgG con un segundo dominio VH unido a su extremo N por un enlazador corto, y una primera cadena ligera de IgG con un segundo dominio VL unido de forma similar a su extremo N. Los segundos dominios VH/VL forman un par con especificidad para un antfgeno mientras que el primer VH/VL forma un sitio de union separado con especificidad para un antfgeno 25 diferente.
Los formatos bivalentes de anticuerpos de tipo IgG tienen una limitacion potencial; pueden entrecruzar antfgenos de superficie celular, algunos de los cuales son activados por dimerizacion, desencadenando eventos de senalizacion indeseables de una manera no controlada. Para abordar este desaffo, se han desarrollado formatos de anticuerpos 30 biespecfficos monovalentes sintonizables. MetMab, un anticuerpo terapeutico anti-c-Met armado creado mediante la incorporacion de "botones y ojales" asimetricos en el fragmento Fc, ha demostrado ser eficaz en modelos de cancer pancreatico y esta siendo investigado en multiples ensayos clfnicos. Este formato de "botones y ojales" se ha extendido recientemente para incorporar un fragmento de anticuerpo dirigido a EGFR, dando lugar a una protefna biespecffica funcionalmente monovalente dirigida a EGFR/ErbB1 y c-Met/HGFR. Gunasekaran et al. han descrito 35 una implementacion alternativa del concepto de "botones y ojales" mediante el diseno de superficies cargadas complementarias en el fragmento Fc. Davis et al. han descrito un enfoque "SEED" que uso Fc asimetrico modificado que contenfa fragmentos de IgG e IgA humanas para formar anticuerpos monovalentes heteromericos. Finalmente, Bostrom et al. han descrito un nuevo enfoque de diseno para construir un fragmento Fab bifuncional que puede unirse a HER2 o VEGF con alta afinidad. Al combinarse en una molecula de anticuerpo canonico, estos fragmentos 40 Fab se acoplaran a HER2 o VEGF con diferentes valencias que dependeran del entorno celular y de la concentracion del factor de crecimiento.
Otro componente importante de un diseno de anticuerpo biespecffico es la optimizacion de las propiedades farmaceuticas. Para ser clfnicamente util, una protefna terapeutica debe ser estable, permanecer soluble durante un 45 periodo prolongado de tiempo y poseer un perfil de fabricacion robusto. Los anticuerpos biespecfficos son tfpicamente menos estables que los anticuerpos monoclonales, e inicialmente pueden no poseer propiedades farmaceuticas adecuadas para el desarrollo. Pueden estabilizarse a traves de ingenierfa molecular, a traves de actividades de formulacion aguas abajo, o, como mas comunmente se practica, a traves de la combinacion de ambos enfoques.
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Desde hace mucho tiempo se ha reconocido la importancia de minimizar la fabricacion qufmica y las responsabilidades de control en los farmacos candidatos de molecula pequena, y se han propuesto las reglas para predecir la semejanza del farmaco. Muchos grupos han utilizado enfoques conceptualmente similares para evaluar la aptitud de las protefnas basadas en IgG evaluando las caracterfsticas de secuencia desfavorables tales como: 55 disulfuros no canonicos o cistefnas no apareadas, sitios de extra glicosilacion, motivos de sulfatacion de tirosina, metioninas accesibles a disolventes, motivos de desamidacion de asparagina, y sitios de escision de acido. Los sitios de glicosilacion adicionales y los sitios de desamidacion de asparagina son caracterfsticas bastante comunes de secuencias de anticuerpos naturales. De hecho, mas del 20 % de los dominios variables de cadenas pesadas se informa que estan glicosilados y mas del 5 % de los genes de lfneas germinales contienen motivos de desamidacion
de asparagina-glicina. Las tasas de desamidacion en anticuerpos se pueden estimar de forma fiable usando el metodo propuesto por Robinson que sugiere que los bucles estructuralmente restringidos no forman un intermedio succinimida de manera eficiente y, por lo tanto, son estables.
5 Aunque el motivo de glicosilacion ligado a N canonico (NXS y NXT, donde X es cualquier aa excepto prolina) se puede detectar facilmente en la secuencia de anticuerpos, sitios ligados a O, que son responsabilidades en el sentido de que tambien pueden afectar negativamente a las propiedades farmaceuticas, son mas diffciles de reconocer. Recientemente se han descrito varias modificaciones ligadas a O de dominios variables de cadenas ligeras de anticuerpo, principalmente en la proximidad de motivos de secuencia ricos en GS. Existen muchos 10 enfoques para mejorar la afinidad y estabilidad de una protefna candidata en la etapa de descubrimiento, incluyendo el diseno guiado por estructura, el cribado de biblioteca enfocado y la exposicion de levadura; por lo tanto, parece beneficioso eliminar responsabilidades potenciales en riesgo en las primeras protefnas de prueba de concepto.
Otras responsabilidades, tales como la agregacion y la inmunogenicidad son mas diffciles desde una perspectiva de 15 diseno. No solo son propiedades multifaceticas, sino que tambien es muy diffcil evaluarlas adecuadamente en las pruebas bioqufmicas y bioffsicas a pequena escala y, por lo tanto, tienden a ser detectadas mas tarde en el desarrollo. Posiblemente el mejor enfoque para reducir la inmunogenicidad del anticuerpo es a traves de la humanizacion. Este enfoque se ha validado ampliamente por una serie de anticuerpos humanizados que han sido bien tolerados en la clfnica. Un enfoque de "superhumanizacion" propuesto recientemente introduce las secuencias 20 de lfnea germinal humana en las CDR para producir anticuerpos "totalmente humanos". Este enfoque requiere que cada aminoacido ("aa") en las CDR sea mutado para determinar su contribucion a la union al antfgeno; el anticuerpo resultante puede ser menos inmunogeno. Aparte de las caracterfsticas basadas en secuencias, la inmunogenicidad de anticuerpos y protefnas de tipo anticuerpo puede ser dependiente de su estabilidad de agregacion. Curiosamente, la "humanidad" y la estabilidad en un modulo de anticuerpo, tal como scFv, pueden ser co-disenada a 25 traves de un enfoque basado en el conocimiento.
El diseno de la solubilidad de los anticuerpos de protefna es otra tarea desalentadora, ya que la propiedad es tambien un compuesto de varios parametros ffsico-qufmicos. Sin embargo, se han propuesto una serie de metodos para combatir la insolubilidad. Pepinsky et al. han utilizado glicolingenierfa, cambio de isotipo y mutagenesis guiada 30 por estructura, para aumentar la solubilidad de un anticuerpo monoclonal. Chennamsetty et al. han descrito un enfoque imparcial para mejorar la estabilidad con respecto a la agregacion que se basa en simulaciones de dinamica molecular para calcular un parametro denominado propension a la agregacion de superficie y aplicaron esta tecnica para introducir aminoacidos estabilizadores ("aa") en las regiones propensas a la agregacion de anticuerpos. De manera interesante, en su analisis de anticuerpos, las regiones propensas a la agregacion a menudo se colocalizan 35 con regiones funcionalmente importantes que confieren el receptor Fc o la union al antfgeno y, por lo tanto, no pueden ser facilmente eliminadas.
Tal acoplamiento entre la funcion molecular y las propiedades farmaceuticas en los anticuerpos es comun. Puede complicar significativamente la optimizacion de los anticuerpos biespecfficos, ya que se encuentran incluso partes 40 mas grandes de sus secuencias en las regiones funcionalmente importantes. Por lo tanto, para permitir un diseno exitoso, es importante identificar funciones moleculares crfticas y caracterfsticas optimas de diseno.
El documento US 2011/044980 desvela una diversidad de anticuerpos de dominio variable dual (DVD) que tienen un formato de anticuerpo especffico, entre los cuales un anticuerpo DVD biespecffico de IGF1R/ErbB3. El documento 45 US 2011/044980 no desvela un DVD que comprenda un scFV.
Simulacion computacional para identificar las mejores dianas y caracterfsticas de diseno terapeutico optimas
La simulacion computacional es una herramienta valiosa para guiar las decisiones de desarrollo de farmacos, tanto 50 en el laboratorio como en la clfnica. El modelo de farmacocinetica de poblacion es un ejemplo maduro del uso de modelos para optimizar la programacion de dosis y los disenos de ensayos clfnicos. Para terapias con dianas conocidas es posible utilizar la simulacion computacional mucho antes en el proceso de diseno. Los avances en las tecnologfas de medicion de protefnas cuantitativa multiples y de alto rendimiento han permitido la observacion de las dinamicas complejas que se producen en las redes de senalizacion celular. Estos datos permiten la creacion de 55 modelos de redes que capturan los comportamientos mecanicistas de los sistemas biologicos que son relevantes para enfermedades tal como el cancer. Mediante la simulacion de productos terapeuticos potenciales a traves del modelado de redes es posible disenar productos terapeuticos mas eficaces a un ritmo acelerado y predecir con mayor precision los parametros de diseno.
Tradicionalmente, la seleccion de un agente farmaceutico para una terapia dirigida comienza con una diana conocida que se selecciona de entre una multitud de datos moleculares, biologicos y fisiologicos. Sin embargo, incluso en sistemas biologicos ya estudiados y fuertemente dirigidos existen oportunidades para nuevos descubrimientos, que pueden facilitarse por la simulacion de modelos de ruta o de red.
5
Por consiguiente, son diffciles de obtener enfoques terapeuticos adicionales para el tratamiento del cancer, y en particular protefnas basadas en anticuerpos poliespecfficos que esten disenadas para tener propiedades bioffsicas y terapeuticas superiores, pero son necesarios para superar las limitaciones de las terapias de anticuerpos actuales y para proporcionar otros beneficios.
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RESUMEN
Se proporcionan en el presente documento anticuerpos biespecfficos polivalentes (PBA), cuyos anticuerpos son protefnas que comprenden dos pares de cadenas polipeptfdicas, comprendiendo cada par de dichos dos pares una 15 cadena pesada unida a una cadena ligera por al menos un enlace de cadena pesada; en el que (a) cada par comprende al menos un sitio de union a anti-IGF-IR y al menos un sitio de union a anti-ErbB3; y (b) cada par comprende un primer sitio de union que comprende una porcion N-terminal de la cadena pesada del PBA y una porcion N-terminal de la cadena ligera del PBA, y un segundo sitio de union que es un scFv C-terminal que esta compuesto en su totalidad por la cadena pesada del PBA, conteniendo dicho scFv C-terminal una VR de cadena 20 pesada unida a una VR de cadena ligera por un enlazador scFv; y el sitio de union a anti-IGF-IR esta unido al sitio de union a anti-ErbB3 a traves de una region constante (CR) de inmunoglobulina de cadena pesada (HC Ig) compuesta por la cadena pesada del PBA, y los dos pares estan unidos mediante al menos un enlace entre las CR de HC Ig de cada par, y
25 (i) el sitio de union a anti-IGF-IR comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende
un conjunto de tres regiones determinantes de la complementariedad VH (CDR) dispuesta en un orden lineal amino a carboxi de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3, y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende un conjunto de tres CDR VL dispuestas en un orden lineal amino a carboxi de VLCDRl, VLCDR2 y VLCDR3, en el que 30
a. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-IR comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:8 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:32; o
b. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacfdica de las
35 CDR correspondientes de SEQ ID NO:9 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R
comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:33; o
c. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:10 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:34; o
40 d. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacfdica de las
CDR correspondientes de SEQ ID NO:11 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:35; o
e. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:8 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R
45 comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:33; o
f. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:10 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:32; o
50 (ii) el sitio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende un
conjunto de tres CDR VH y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende un conjunto de tres CDR VL, comprendiendo ademas cada CDR un extremo amino y un extremo carboxi, en el que las CDR de cada conjunto de CDR se disponen en el anticuerpo en un orden lineal amino a carboxi de CDR 1, CDR2 y CDR3, en el que 55
aa. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:134 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:166; o bb. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacfdica de las
CDR correspondientes de SEQ ID NO:135 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoaddica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:167; o cc. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoaddica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:136 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 5 comprenden la secuencia aminoaddica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:168; o
dd. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoaddica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:137 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoaddica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:169; o ee. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoaddica de las 10 CDR correspondientes de SEQ ID NO:138 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3
comprenden la secuencia aminoaddica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:170; o ff. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoaddica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:139 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoaddica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:171; o 15 gg. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoaddica de las
CDR correspondientes de SEQ ID NO:140 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoaddica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:172; o hh. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoaddica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:141 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 20 comprenden la secuencia aminoaddica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:173; o
ii. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoaddica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:142 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoaddica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:174; o jj. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoaddica de las 25 CDR correspondientes de SEQ ID NO:143 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3
comprenden la secuencia aminoaddica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:175; o kk. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoaddica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:136 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoaddica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:169;
30
y
(iii) en el que el PBA no comprende ni a) un modulo anti-IGF-1R que comprende las secuencias aminoaddicas de VHCDR1, vHcDR2, VhCdR3 anti-IGF-1R de SEQ ID nO: 11 y las secuencias aminoaddicas de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R de SEQ ID NO:35, ni b) un modulo anti-ErbB3 35 que comprende las secuencias aminoaddicas de VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti- ErbB3 de SEQ ID
No:143 y las secuencias aminoaddicas de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 de SEQ ID NO:175.
El alcance de la patente esta unicamente determinado por las reivindicaciones adjuntas, que se incorporan en el presente documento por referencia.
40
Tambien se describe en el presente documento, el sitio de union a anti-IGF-1R comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende un conjunto de tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) VH que comprenden (a) VHCDR1 (numero de aa 26-35), VHCDR2 (numero de aa 51-66), y vHcDR3 (numero de aa 99-111), de una cadena pesada que tiene una secuencia de aa que comprende la secuencia de aa de (expuesta en) 45 una SEQ ID NO seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:1, SEQ ID NOs:8-31 y las SEQ ID NOs:384- 385; o (b) un conjunto de tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) VH que comprende VHCDR1 que comprende la SEQ ID NO:302, VHCDR2 que comprende la SEQ ID NO:303 y VHCDR3 que comprende la SEQ ID NO:304, y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende un conjunto de tres VLCDR que comprende (c) VLCDR1 (numero de aa 24-34), VLCDR2 (numero de aa 50-56) y VLCDR3 (numero de aa 89-97) de una cadena 50 ligera que tiene una secuencia de aa que comprende la secuencia de aa de una SEQ ID NO seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:2-3, SeQ ID Nos:32-133, y SEQ ID NOs:386-387; o (d) un conjunto de tres VLcDr que comprende VLCDR1 que comprende la SEQ ID nO:305, VLCDR2 que comprende la SEQ ID NO:306 y VLCDR3 que comprende la SEQ ID NO:307 o SEQ ID NO:308, y comprendiendo ademas cada CDR un extremo amino y un extremo carboxi, en el que las CDR de cada conjunto de CDR se disponen en la cadena pesada o ligera 55 correspondiente en un orden lineal de amino a carboxi de CDR1, CDR2 y CDR3, o en el que las secuencias de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 comprenden aa variables, que representan independientemente cualquier aa expuesto en la posicion correspondiente en la figura 1, y las secuencias de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 comprenden aa variables, que representan independientemente cualquier aa expuesto en la posicion correspondiente en la figura 2, con la condicion de que el PBA (i) no comprenda ni el modulo anti-IGF-1R SF ni el
modulo anti-ErbB3 C8; o (ii) comprende al menos una CDR o FR que difiere en uno o mas aa de una CDR o FR, respectivamente, del modulo SF o C8. Tambien se describe en el presente documento, el sitio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende un conjunto de tres VH CDR que comprende (e) VHCDR1 (numero de aa 26-35), VHCDR2 (numero de aa 51-66) y VHCDR3 (numero de aa 99-111) de una cadena pesada que tiene una 5 secuencia de aa que comprende la secuencia de SEQ ID NO seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:4-5, SEQ ID NOs: 134-165, y SEQ ID NO:388, o (f) un conjunto de tres CDR vH que comprende VHCDR1 que comprende la SEQ ID NO:309, VHCDR2 que comprende la SEQ ID NO:310 y VHCDR3 que comprende la SEQ ID NO:311, y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende un conjunto de tres VLCDR que comprende (g) VLCDR1 (numero de aa 23-33), VLCDR2 (numero de aa 49-55) y VLCDR3 (numero de aa 88-98), de una cadena 10 ligera que tiene una secuencia de aa que comprende la secuencia de aa de una SEQ ID NO seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:6-7 y SEQ ID NOs: 166-200; o (h) un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende un conjunto de tres VLCDR que comprende VLCDR1 que comprende la SEQ ID NO:312, VLCDR2 que comprende la SeQ ID NO:313 y VLCDR3 que comprende la SeQ ID NO:314 o la SEQ ID NO:315, y cada CDR comprende ademas un extremo amino y un extremo carboxi, en el que las CDR de cada conjunto de CDR se 15 disponen en el anticuerpo en un orden lineal de amino a carboxi de CDR1, CDR2 y CDR3, o en el que las secuencias de la VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 comprenden aa variables, que representan independientemente cualquier aa expuesto en la posicion correspondiente en la figura 3, y las secuencias de la VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 comprenden aa variables, que representan independientemente cualquier aa expuesto en la posicion correspondiente en la figura 4, en el que el PBA (i) no comprende ni el modulo anti-IGF-1R que comprende una 20 cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:35 y una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO:11 y b) un modulo anti-ErbB3 C8 que comprende una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO:175 y una cadena pesada que comprende SEQ ID NO:145. Tambien se describe en el presente documento, la VLCDR3 anti-IGF-1R comprende la SEQ ID NO:308 o la VLCDR3 anti-ErbB3 comprende la SEQ ID NO:315. En ciertas realizaciones, los dos pares de cadenas polipeptfdicas tienen secuencias basicamente identicas. Al menos uno de al menos un enlace 25 entre los enlaces de las CR de HC Ig es un enlace disulfuro y puede ser un enlace disulfuro o un enlace de van der Waals, o al menos uno de dichos al menos un enlace de cadena pesada-ligera es un enlace disulfuro y puede ser un enlace disulfuro o un enlace de van der Waals. En ciertas realizaciones, el sitio de union a anti-ErbB3 es el scFv C- terminal y en ciertas realizaciones, el sitio de union a anti-IGF-1R es el scFv C-terminal. El sitio de union a anti-IGF- 1R, la CR HC Ig y el sitio de union a anti-ErbB3 de un PBA puede comprender la cadena pesada de ese par, que 30 comprende una cadena polipeptfdica contigua e individual.
Un PBA puede (i) inhibir el crecimiento de las celulas tumorales in vitro a una concentracion de 1 pM o menos, o 100 nM o menos, o 10 nM o menos, o 1 nM o menos, o ii) inhibe la transduccion de senal inducida por cualquiera o ambos de heregulina y IGF1 con una CI50 de 10 nM o menos o 1 nM o menos o 100 pM o menos, o una inhibicion 35 porcentual maxima de al menos el 70 % o al menos el 80 % o al menos el 90 %, como se indica por la inhibicion de la fosforilacion de cualquiera o ambos de pErbB3 y pIGF-1R. La inhibicion del crecimiento puede medirse con un ensayo CTG en celulas DU145 en cultivo. La inhibicion de la transduccion de senal puede determinarse en celulas BxPC-3 en cultivo tras la estimulacion con IGF-1 a 80 ng/ml y heregulina a 20 ng/ml durante 15 minutos.
40 En ciertas realizaciones, cada CR HC Ig de un PBA comprende un dominio CH3 que media la union con el dominio CH3 del otro par. Cada CR HC Ig tambien puede comprender un dominio CH2, una bisagra, y un dominio CH1. En ciertas realizaciones, el dominio CH1 de un PBA esta unido en su extremo C al extremo N de una bisagra, que esta unido en su extremo C al extremo N de un dominio CH2, que esta unido en su extremo C al extremo N de un dominio CH3.
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Cada primer sitio de union puede comprender un primer dominio VH, y cada dominio CH1 de un PBA puede estar unido en su extremo N al extremo C del primer dominio VH. Cada dominio CH3 de un PBA puede estar unido en su extremo C al extremo N del scFv. Cada dominio CH3 de un PBA puede estar unido en su extremo C al extremo N de un enlazador conector, que esta unido en su extremo C al extremo N del scFv. Cada cadena ligera puede 50 comprender un primer dominio VL que esta asociado al primer dominio VH para formar el primer sitio de union. Cada primer dominio VL puede estar unido en su extremo C al extremo N de un dominio CL. Cada primer sitio de union puede ser un sitio de union a anti-IGF-1R y cada scFv puede ser un scFv anti-ErbB3. Cada primer sitio de union puede ser un sitio de union a anti-ErbB3 y cada scFv puede ser un scFv anti-IGF-1R. La CR HC Ig de un PBA puede ser una CR de IgG, por ejemplo, una CR de IgG1 o IgG2.
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En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R de un PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:8 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID nO:32. En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R de un PbA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes
de la SEQ ID NO:9 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-IR del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:33. En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R de un PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:10 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ 5 ID NO:34. En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R de un PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:11 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:35. En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R de un PbA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:8 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R del PBA comprenden la 10 secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:33. En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R de un PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:10 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:32.
15 En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 de un PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:134 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:166. En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 de un PbA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:135 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las 20 CDR correspondientes de la SEQ ID NO:167. En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 de un PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:136 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:168. En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 de un PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:137 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA 25 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:169. En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 de un PbA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:138 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:170. En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 de un PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:139 y las VLCDR1, 30 VLCDR2 y VLcDr3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:171. En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 de un PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:140 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:172. En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 de un PbA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes 35 de la SEQ ID NO:141 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de las SEQ ID NOs: 173. En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti- ErbB3 de un PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:142 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:174. En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 de un PBA comprenden la 40 secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:143 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:175. En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 de un PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:136 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:169.
45
En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R de un PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:8 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:32; y (a) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:134 y 50 las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:166; o (b) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:135 y las VECDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:167; o (c) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:136 y 55 las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:168; o (d) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:137 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:169; o (e) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:138 y
las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:170; o (f) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:139 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:171; o (g) las VHCDR1, VHCDR2, 5 VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:140 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:172; o (h) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:141 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de las SEQ ID NOs: 173; o (i) las VHCDR1, VHCDR2, 10 VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:142 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:174; o (j) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:143 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:175; o (k) las VHCDR1, VHCDR2, 15 VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:136 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:169.
En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R de un PBA comprenden la secuencia de aa 20 de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:9 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:33; y (a) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:134 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:166; o (b) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa 25 de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:135 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:167; o (c) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:136 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:168; o (d) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa 30 de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:137 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:169; o (e) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:138 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:170; o (f) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de 35 las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:139 y las VECDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:171; o (g) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:140 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:172; o (h) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa 40 de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:141 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de las SEQ ID NOs: 173; o (i) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:142 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:174; o (j) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de 45 las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:143 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:175; o (k) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:136 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:169.
50
En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R de un PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:10 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:34; y (a) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:134 y 55 las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:166; o (b) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:135 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:167; o (c) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:136 y
las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:168; o (d) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:137 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:169; o (e) las VHCDR1, VHCDR2, 5 VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:138 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:170; o (f) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:139 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:171; o (g) las VHCDR1, VHCDR2, 10 VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:140 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:172; o (h) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:141 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de las SEQ ID NOs: 173; o (i) las VHCDR1, VHCDR2, 15 VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:142 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:174; o (j) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:143 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:175; o (k) las VHCDR1, VHCDR2, 20 VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:136 y las VLCDR1 VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:169.
En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R de un PBA comprenden la secuencia de aa 25 de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:11 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:35; y (a) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:134 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:166; o (b) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa 30 de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:135 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:167; o (c) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:136 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:168; o (d) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa 35 de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:137 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:169; o (e) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:138 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:170; o (f) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de 40 las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:139 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:171; o (g) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:140 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:172; o (h) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa 45 de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:141 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de las SEQ ID NOs: 173; o (i) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:142 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:174; o (j) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de 50 las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:136 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:169.
En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R de un PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:8 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R del PBA 55 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:33; y (a) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:134 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:166; o (b) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:135 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA
comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:167; o (c) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:136 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:168; o (d) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa 5 de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:137 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:169; o (e) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:138 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:170; o (f) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de 10 las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:139 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:171; o (g) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:140 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:172; o (h) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa 15 de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:141 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de las SEQ ID NOs: 173; o (i) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:142 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:174; o (j) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de 20 las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:143 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:175; o (k) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:136 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:169.
25
En ciertas realizaciones, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R de un PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:10 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:32; y (a) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:134 y 30 las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:166; o (b) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:135 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:167; o (c) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:136 y 35 las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:168; o (d) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:137 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:169; o (e) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:138 y 40 las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:170; o (f) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:139 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:171; o (g) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:140 y 45 las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:172; o (h) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:141 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de las SEQ ID NOs: 173; o (i) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:142 y 50 las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:174; o (j) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:143 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:175; o (k) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:136 y 55 las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 del PBA comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:169.
En ciertas realizaciones, cada sitio de union a anti-IGF-1R de un PBA comprende un dominio VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:1, en la que la secuencia comprende aa variables, que representan independientemente
cualquier aa expuesto en la posicion correspondiente en la figura 1, y/o cada sitio de union a anti-IGF-IR de un PBA comprende un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:2 (o 3), en la que la secuencia comprende aa variables, que representan independientemente cualquier aa expuesto en la posicion correspondiente en la figura 2.
5 En ciertas realizaciones, cada sitio de union a anti-ErbB3 de un PBA comprende un dominio VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:4 (o 5), en el que la secuencia comprende aa variables, que representan independientemente cualquier aa expuesto en la posicion correspondiente en la figura 3 y/o cada sitio de union a anti-ErbB3 de un PBA comprende un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:6 (o 7), en el que la secuencia comprende aa variables, que representan independientemente cualquier aa expuesto en la posicion 10 correspondiente en la figura 4.
En ciertas realizaciones, cada sitio de union a anti-IGF-IR de un PBA comprende un dominio VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:1 y un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:2 (o 3) y cada sitio de union a anti-ErbB3 del PBA comprende un dominio VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:4 (o 5) y un 15 dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:6 (o 7).
En ciertas realizaciones, cada sitio de union a anti-IGF-1R de un PBA comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:1, en el que X1 no es T, X2 no es V, X6 no es R, X8 no es D o X10 no es I, o un dominio VL que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:3 o cada sitio de union a anti-ErbB3 de un PBA 20 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:5 o un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:7. En ciertas realizaciones, cada sitio de union a anti-IGF-1R de un PBA comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:1, en el que X1 no es T, X2 no es V, X6 no es R, X8 no es D o X10 no es I, un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:3; y cada sitio de union a anti- ErbB3 del PBA comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:5 y un dominio VL 25 que comprende la secuencia de SEQ ID NO:7.
En ciertas realizaciones, cada sitio de union a anti-IGF-1R de un PBA comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 8-31 y/o un dominio Vl que comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 32-133 y/o cada sitio de 30 union a anti-ErbB3 comprende una secuencia de aa VH seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 134-165; y/o una secuencia de aa VL seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 166-200. En ciertas realizaciones, (a) cada primer dominio VH comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NOs: 8-31, cada primer dominio VL comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 32-133, cada segundo dominio VH comprende una secuencia de aa seleccionada del 35 grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 134-165 y cada segundo dominio VL comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NOs: 166-200, o (b) cada primer dominio VH comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NOs: 134-165, cada primer dominio VL comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 166-200, cada segundo dominio VH comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NOs: 8-31 y cada 40 segundo dominio VL consiste en una secuencia de aa seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NOs: 32133.
En ciertas realizaciones, cada dominio VH anti-IGF-1R de un PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:8 y cada dominio VL anti-IGF-1R del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:32. En ciertas 45 realizaciones, cada dominio VH anti-IGF-1R de un PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:9 y cada dominio VL anti-IGF-1R del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:33. En ciertas realizaciones, cada dominio VH anti-IGF-1R de un PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:10 y cada dominio VL anti-IGF- 1R del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:34. En ciertas realizaciones, cada dominio VH anti-IGF- 1R de un PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:11 y cada dominio VL anti-IGF-1R del PBA 50 comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:35. En ciertas realizaciones, cada dominio VH anti-IGF-1R de un PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:8 y cada dominio VL anti-IGF-1R del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:33. En ciertas realizaciones, cada dominio VH anti-IGF-1R de un PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:10 y cada dominio VL anti-IGF-1R del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:32.
55
En ciertas realizaciones, cada dominio VH anti-ErbB3 de un PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:134 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:166. En ciertas realizaciones, cada dominio VH anti-ErbB3 de un PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:135 y el dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:167. En ciertas realizaciones, cada
dominio VH anti-ErbB3 de un PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:136 y cada dominio VL anti- ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:168. En ciertas realizaciones, cada dominio VH anti- ErbB3 de un PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:137 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:169. En ciertas realizaciones, cada dominio VH anti-ErbB3 de un 5 PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:138 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:170. En ciertas realizaciones, cada dominio VH anti-ErbB3 de un PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:139 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:171. En ciertas realizaciones, cada dominio VH anti-ErbB3 de un PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:140 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:172. En 10 ciertas realizaciones, cada dominio VH anti-ErbB3 de un PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:141 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:173. En ciertas realizaciones, cada dominio VH anti-ErbB3 de un PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:142 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:174. En ciertas realizaciones, cada dominio VH anti-ErbB3 de un PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:143 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA 15 comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:175. En ciertas realizaciones, cada dominio VH anti-ErbB3 de un PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:136 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de las SEQ ID NOs: 169.
En ciertas realizaciones, cada dominio VH anti-IGF-1R de un PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:8 20 y cada dominio VL anti-IGF-1R del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:32; y (a) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:134 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:166; o (b) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:135 y el dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:167; o (c) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:136 y cada 25 dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:168; o (d) cada dominio VH anti- ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:137 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA
comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:169; o (e) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la
secuencia de aa de la SEQ ID NO:138 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:170; o (f) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:139 y 30 cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:171; o (g) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:140 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:172; o (h) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:141 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:173; o (i) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:142 y 35 cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:174; o (j) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:143 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA
comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:175; o (k) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la
secuencia de aa de la SEQ ID NO:136 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de las SEQ ID NOs: 169.
40
En ciertas realizaciones, cada dominio VR anti-IGF-1R de un PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:9 y cada dominio VL anti-IGF-1R del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:33; y (a) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:134 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:166; o (b) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la 45 secuencia de aa de la SEQ ID NO:135 y el dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:167; o (c) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:136 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:168; o (d) cada dominio VH anti- ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:137 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA
comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:169; o (e) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la
50 secuencia de aa de la SEQ ID NO:138 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:170; o (f) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:139 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:171; o (g) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:140 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:172; o (h) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la 55 secuencia de aa de la SEQ ID NO:141 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:173; o (i) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:142 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:174; o (j) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:143 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA
comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:175; o (k) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la
secuencia de aa de la SEQ ID NO:136 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de las SEQ ID NOs: 169.
En ciertas realizaciones, cada dominio VH anti-IGF-1R comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:10 y cada 5 dominio VL anti-IGF-1R comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:34; y (a) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:134 y cada dominio Vl anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:166; o (b) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:135 y el dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:167; o (c) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:136 y cada dominio VL anti- 10 ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:168; o (d) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:137 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:169; o (e) cada dominio Vh anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:138 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:170; o (f) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:139 y cada dominio VL anti- 15 ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:171; o (g) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:140 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:172; o (h) cada dominio Vh anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:141 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:173; o (i) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:142 y cada dominio VL anti- 20 ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:174; o (j) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:143 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:175; o (k) cada dominio Vh anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:136 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de las SEQ ID NOs: 169.
25 En ciertas realizaciones, cada dominio VH anti-IGF-1R de un PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:11 y cada dominio VL anti-IGF-1R del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:35; y (a) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:134 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:166; o (b) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:135 y el dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia 30 de aa de la SEQ ID NO:167; o (c) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:136 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:168; o (d) cada dominio Vh anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:137 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:169; o (e) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:138 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la 35 secuencia de aa de la SEQ ID NO:170; o (f) cada dominio Vh anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:139 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:171; o (g) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:140 y cada dominio VL anti- ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:172; o (h) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:141 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la 40 secuencia de aa de la SEQ ID NO:173; o (i) cada dominio Vh anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:142 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:174; o (j) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:136 y cada dominio VL anti- ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de las SEQ ID NOs: 169.
45 En ciertas realizaciones, cada dominio VH anti-IGF-1R del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:8 y cada dominio VL anti-IGF-1R del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:33; y (a) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:134 y cada dominio Vl anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:166; o (b) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:135 y el dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ 50 ID NO:167; o (c) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:136 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:168; o (d) cada dominio VH anti- ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:137 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:169; o (e) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:138 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la 55 SEQ ID NO:170; o (f) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:139 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:171; o (g) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:140 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:172; o (h) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:141 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la
SEQ ID NO:173; o (i) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:142 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:174; o (j) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:143 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:175; o (k) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la 5 secuencia de aa de la SEQ ID NO:136 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de las SEQ ID NOs: 169.
En ciertas realizaciones, cada dominio VH anti-IGF-1R de un PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:10 y cada dominio VL anti-IGF-1R del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:32; y (a) cada
10 dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:134 y cada dominio VL anti-ErbB3
del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:166; o (b) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:135 y el dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:167; o (c) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:136 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:168; o (d) cada
15 dominio Vh anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:137 y cada dominio VL anti-ErbB3
del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:169; o (e) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:138 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:170; o (f) cada dominio Vh anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:139 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:171; o (g) 20 cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:140 y cada dominio VL anti- ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:172; o (h) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:141 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:173; o (i) cada dominio Vh anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:142 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:174; o (j) 25 cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:143 y cada dominio VL anti- ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:175; o (k) cada dominio VH anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:136 y cada dominio VL anti-ErbB3 del PBA comprende la secuencia de aa de las SEQ ID NOs: 169.
30 En ciertas realizaciones, (a) cada cadena pesada de un PBA comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en SF-G1-P1 (SEQ ID NO:212); SF-G1-M1.3 (SEQ ID NO:214); SF-G1-M27 (SEQ ID NO:216); SF-G1-P6 (SEQ ID NO:218); SF-G1-B69 (SEQ ID NO:220); P4-G1-C8 (SEQ ID NO:222); P4-G1-P1 (SEQ ID NO:224); P4-G1-M1.3 (SEQ ID NO:226); P4-G1-M27 (SEQ ID NO:228); P4-G1-P6 (SEQ ID NO:230); P4-G1-B69 (SEQ ID NO:232); M78-G1-C8 (SEQ ID NO:234); M78-G1-P1 (SEQ ID NO:236); M78-G1-M1.3 (SEQ ID NO:238); 35 M78-G1-M27 (SEQ ID NO:240); M78-G1-P6 (SEQ ID NO:242); M78-G1-B69 (SEQ ID NO:244); M57-G1-C8 (SEQ ID NO:246); M57-G1-P1 (SEQ ID NO:248); M57-G1-M1.3 (SEQ ID NO:250); M57-G1-M27 (SEQ ID NO:252); M57-G1- P6 (SeQ ID NO:254) y M57-G1-B69 (SEQ ID NO:256) y/o cada cadena ligera del PBA comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en la cadena ligera kappa SF (SEQ ID NO:202); cadena ligera kappa P4 (SEQ ID NO:204); cadena ligera kappa M78 (SEQ ID NO:206); y la cadena ligera kappa M57 (SEQ ID NO:208); o (b) 40 cada cadena pesada de un PBA comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que comprende P1-G1-P4 (SEQ ID NO:268); P1-G1-M57 (SEQ ID NO:270); P1-G1-M78 (SEQ ID NO:272); M27-G1-P4 (SEQ ID NO:274); M27- G1-M57 (SEQ ID NO:276); M27-G1-M78 (SEQ ID NO:278); M7-G1-P4 (SEQ ID NO:280); M7-G1-M57 ((SEQ ID NO:282); M7-G1-M78 (SEQ ID NO:284); B72-G1-P4 (SEQ ID NO:286); B72-G1-M57 (SEQ ID NO:288); B72-G1-M78 (SEQ ID NO:290); B60-G1-P4 (SEQ ID NO:292); B60-G1-M57 (SEQ ID NO:294); B60-G1-M78 (SEQ ID NO:296); 45 B60-G2-M78 (SEQ ID NO:355) y M7-G2-M78 (SeQ ID NO:357) y/o cada cadena ligera del PBA comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en una cadena ligera lambda P1 (SEQ ID NO:258); cadena ligera lambda M27 (SEQ ID NO:260); cadena ligera lambda M7 (SEQ ID NO:262); cadena ligera lambda B72 (SEQ ID NO:264); y una cadena ligera lambda B60 (SEQ ID NO:266).
50 En ciertas realizaciones, (a) cada cadena pesada de un PBA comprende una secuencia de aa que difiere en al menos una adicion, delecion o sustitucion de aa de una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en SF- G1-P1 (SEQ ID NO:212); SF-G1-M1.3 (SEQ ID NO:214); SF-G1-M27 (SEQ ID NO:216); SF-G1-P6 (SEQ ID NO:218); SF-G1-B69 (SEQ ID NO:220); P4-G1-C8 (SEQ ID NO:222); P4-G1-P1 (SEQ ID NO:224); P4-G1-M1.3 (SEQ ID NO:226); P4-G1-M27 (SEQ ID NO:228); P4-G1-P6 (SEQ ID NO:230); P4-G1-B69 (SEQ ID NO:232); M78- 55 G1-C8 (SEQ ID NO:234); M78-G1-P1 (SEQ ID NO:236); M78-G1-M1.3 (SEQ ID NO:238); M78-G1-M27 (SEQ ID NO:240); M78-G1-P6 (SEQ ID NO:242); M78-G1-B69 (SEQ ID NO:244); M57-G1-C8 (SEQ ID NO:246); M57-G1-P1 (SEQ ID NO:248); M57-G1-M1.3 (SEQ ID NO:250); M57-G1-M27 (SEQ ID NO:252); M57-G1-P6 (SEQ ID NO:254) y M57-G1-B69 (SEQ ID NO:256) y cada cadena ligera del PBA comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en la cadena ligera kappa SF (SEQ ID NO:202); cadena ligera kappa P4 (SEQ ID NO:204);
cadena ligera kappa M78 (SEQ ID NO:206); y la cadena ligera kappa M57 (SEQ ID NO:208); o (b) cada cadena pesada de un pBA comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en SF-G1-P1 (SEQ ID NO:212); SF-G1-M1.3 (SEQ ID NO:214); SF-G1-M27 (SEQ ID NO:216); SF-G1-P6 (SEQ ID NO:218); SF-G1-B69 (SEQ ID NO:220); P4-G1-C8 (SEQ ID NO:222); P4-G1-P1 (SEQ ID NO:224); P4-G1-M1.3 (SEQ ID NO:226); P4-G1- 5 M27 (SEQ ID NO:228); P4-G1-P6 (SEQ ID NO:230); P4-G1-B69 (SEQ ID NO:232); M78-G1-C8 (SEQ ID NO:234); M78-G1-P1 (SEQ ID NO:236); M78-G1-M1.3 (SEQ ID NO:238); M78-G1-M27 (SEQ ID NO:240); M78-G1-P6 (SEQ ID NO:242); M78-G1-B69 (SEQ ID NO:244); M57-G1-C8 (SEQ ID NO:246); M57-G1-P1 (SEQ ID NO:248); M57-G1- M1.3 (SEQ ID NO:250); M57-G1-M27 (SEQ ID NO:252); M57-G1-P6 (SEQ ID NO:254) y M57-G1-B69 (SEQ ID NO:256); y cada cadena ligera del PBA comprende una secuencia de aa que difiere en al menos una adicion, 10 delecion o sustitucion de aa de una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en la cadena ligera kappa SF (SEQ ID NO:202); cadena ligera kappa P4 (SEQ ID NO:204); cadena ligera kappa M78 (SEQ ID NO:206); y la cadena ligera kappa M57 (SEQ ID NO:208); o (c) cada cadena pesada de un PBA comprende una secuencia de aa que difiere en al menos una adicion, delecion o sustitucion de aa de una secuencia de aa seleccionada del grupo que comprende P1-G1-P4 (SEQ ID NO:268); P1-G1-M57 (SEQ ID NO:270); P1-G1-M78 (SEQ ID NO:272); M27-G1- 15 P4 (SEQ ID NO:274); M27-G1-M57 (SEQ ID NO:276); M27-G1-M78 (SEQ ID NO:278); M7-G1-P4 (SEQ ID NO:280); M7-G1-M57 ((SEQ ID NO:282); M7-G1-M78 (SEQ ID NO:284); B72-G1-P4 (SEQ ID NO:286); B72-G1-M57 (SEQ ID NO:288); B72-G1-M78 (SEQ ID NO:290); B60-G1-P4 (SEQ ID NO:292); B60-G1-M57 (SEQ ID NO:294); B60-G1- M78 (SEQ ID NO:296); B60-G2-M78 (SEQ ID NO:355) y M7-G2-M78 (SEQ ID NO:357) y cada cadena ligera del PBA comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en una cadena ligera lambda P1 (SEQ ID 20 NO:258); cadena ligera lambda M27 (SEQ ID NO:260); cadena ligera lambda M7 (SEQ ID NO:262); cadena ligera lambda B72 (SEQ ID NO:264); y la cadena ligera lambda B60 (SEQ ID NO:266); o (d) cada cadena pesada de un PBA comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que comprende P1-G1-P4 (SEQ ID NO:268); P1-G1- M57 (SEQ ID NO:270); P1-G1-M78 (SEQ ID NO:272); M27-G1-P4 (SEQ ID NO:274); M27-G1-M57 (SEQ ID NO:276); M27-G1-M78 (SEQ ID NO:278); M7-G1-P4 (SEQ ID NO:280); M7-G1-M57 ((SEQ ID NO:282); M7-G1-M78 25 (SEQ ID NO:284); B72-G1-P4 (SEQ ID NO:286); B72-G1-M57 (SEQ ID NO:288); B72-G1-M78 (SEQ ID NO:290); B60-G1-P4 (SEQ ID NO:292); B60-G1-M57 (SEQ ID NO:294); B60-G1-M78 (SEQ ID NO:296); B60-G2-M78 (SEQ ID NO:355) y M7-G2-M78 (SEQ ID NO:357) y cada cadena ligera del PBA comprende una secuencia de aa que difiere en al menos una adicion, delecion o sustitucion de aa de una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en una cadena ligera lambda P1 (SEQ ID NO:258); cadena ligera lambda M27 (SEQ ID NO:260); cadena 30 ligera lambda M7 (SEQ ID NO:262); cadena ligera lambda B72 (SEQ ID NO:264); y la cadena ligera lambda B60 (SEQ ID NO:266), en la que el PBA difiere de 16F en al menos un aa, CDR o dominio variable.
En ciertas realizaciones, (a) cada cadena pesada de un PBA, unida a la otra cadena pesada del PBA por al menos un enlace, comprende una secuencia de aa que es al menos un 90 % identica a una de las siguientes secuencias de 35 aa o difiere de una de las siguientes secuencias de aa en 1-30 sustituciones, deleciones y/o adicionales de aa: SF- G1-P1 (SEQ ID NO:212); SF-G1-M1.3 (SEQ ID NO:214); SF-G1-M27 (SEQ ID NO:216); SF-G1-P6 (SEQ ID NO:218); SF-G1-B69 (SEQ ID NO:220); P4-G1-C8 (SEQ ID NO:222); P4-G1-P1 (SEQ ID NO:224); P4-G1-M1.3 (SEQ ID NO:226); P4-G1-M27 (SEQ ID NO:228); P4-G1-P6 (SEQ ID NO:230); P4-G1-B69 (SEQ ID NO:232); M78- G1-C8 (SEQ ID NO:234); M78-G1-P1 (SEQ ID NO:236); M78-G1-M1.3 (SEQ ID NO:238); M78-G1-M27 (SEQ ID 40 NO:240); M78-G1-P6 (SEQ ID NO:242); M78-G1-B69 (SEQ ID NO:244); M57-G1-C8 (SEQ ID NO:246); M57-G1-P1 (SEQ ID NO:248); M57-G1-M1.3 (SEQ ID NO:250); M57-G1-M27 (SEQ ID NO:252); M57-G1-P6 (SEQ ID NO:254) y M57-G1-B69 (SEQ ID NO:256) y (b) cada cadena ligera del PBA, unida a una cadena pesada de (a) por al menos un enlace, comprende una secuencia de aa que es al menos un 90 % identica a una de las siguientes secuencias de aa o difiere de una de las siguientes secuencias de aa en 1-30 sustituciones, deleciones y/o adicionales de aa: cadena 45 ligera kappa SF (SEQ ID NO:202); cadena ligera kappa P4 (SEQ ID NO:204); cadena ligera kappa M78 (SEQ ID NO:206); y cadena ligera kappa M57 (SEQ ID NO:208); o (c) cada cadena pesada de un PBA, unida a la otra cadena pesada del PBA por al menos un enlace, comprende una secuencia de aa que es al menos un 90 % identica a una de las siguientes secuencias de aa o difiere de una de las siguientes secuencias de aa en 1-30 sustituciones, deleciones y/o adicionales de aa: P1-G1-P4 (SEQ ID NO:268); P1-G1-M57 (SEQ ID NO:270); P1-G1-M78 (SEQ ID 50 NO:272); M27-G1-P4 (SEQ ID NO:274); M27-G1-M57 (SEQ ID NO:276); M27-G1-M78 (SEQ ID NO:278); M7-G1-P4 (SEQ ID NO:280); M7-G1-M57 ((SEQ ID NO:282); M7-G1-M78 (SEQ ID NO:284); B72-G1-P4 (SEQ ID NO:286); B72-G1-M57 (SEQ ID NO:288); B72-G1-M78 (SEQ ID NO:290); B60-G1-P4 (SEQ ID NO:292); B60-G1-M57 (SEQ ID NO:294); y B60-G1-M78 (SEQ ID NO:296),); B60-G2-M78 (SEQ ID NO:355) y M7-G2-M78 (SEQ ID NO:357) y (d) cada cadena ligera del PBA, unida a una cadena pesada de (c) por al menos un enlace, comprende una secuencia 55 de aa que es al menos un 90 % identica a una de las siguientes secuencias de aa o que difiere de una de las siguientes secuencias de aa en 1-30 sustituciones, deleciones y/o adicionales de aa: cadena ligera lambda P1 (SEQ ID NO:258); cadena ligera lambda M27 (SEQ ID NO:260); cadena ligera lambda M7 (SEQ ID NO:262); cadena ligera lambda B72 (SEQ ID NO:264); y cadena ligera lambda B60 (SEQ ID NO:266).
En ciertas realizaciones, (a) cada cadena pesada de un PBA comprende una secuencia de aa que es al menos un 95 % identica a una de la siguientes secuencias de aa o difiere de una de las siguientes secuencias de aa en 1-10 sustituciones, deleciones y/o adicionales de aa: SF-G1-P1 (SEQ ID NO:212); SF-G1-M1.3 (SEQ ID NO:214); SF-G1- M27 (SEQ ID NO:216); SF-G1-P6 (SEQ ID NO:218); SF-G1-B69 (SEQ ID NO:220); P4-G1-C8 (SEQ ID NO:222);
5 P4-G1-P1 (SEQ ID NO:224); P4-G1-M1.3 (SEQ ID NO:226); P4-G1-M27 (SEQ ID NO:228); P4-G1-P6 (SEQ ID NO:230); P4-G1-B69 (SEQ ID NO:232); M78-G1-C8 (SEQ ID NO:234); M78-G1-P1 (SEQ ID NO:236); M78-G1-M1.3 (SEQ ID NO:238); M78-G1-M27 (SEQ ID NO:240); M78-G1-P6 (SEQ ID NO:242); M78-G1-B69 (SEQ ID NO:244); M57-G1-C8 (SEQ ID NO:246); M57-G1-P1 (SEQ ID NO:248); M57-G1-M1.3 (SEQ ID NO:250); M57-G1-M27 (SEQ ID NO:252); M57-G1-P6 (SEQ ID NO:254) y M57-G1-B69 (SEQ ID NO:256), y (b) cada cadena ligera del PBA 10 comprende una secuencia de aa que es al menos un 95 % identica a una de las siguientes secuencias de aa o difiere de una de las siguientes secuencias de aa en 1-10 sustituciones, deleciones y/o adicionales de aa: cadena ligera kappa SF (SEQ ID NO:202); cadena ligera kappa P4 (SEQ ID NO:204); cadena ligera kappa M78 (SEQ ID NO:206); y cadena ligera kappa M57 (SEQ ID NO:208); o (c) cada cadena pesada de un PBA comprende una secuencia de aa que es al menos un 95 % identica a una de las siguientes secuencias de aa o difiere de una de las 15 siguientes secuencias de aa en 1-10 sustituciones, deleciones y/o adicionales de aa: P1-G1-P4 (SEQ ID NO:268); P1-G1-M57 (SEQ ID NO:270); P1-G1-M78 (SEQ ID NO:272); M27-G1-P4 (SEQ ID NO:274); M27-G1-M57 (SEQ ID NO:276); M27-G1-M78 (SEQ ID NO:278); M7-G1-P4 (SEQ ID NO:280); M7-G1-M57 ((SEQ ID NO:282); M7-G1-M78 (SEQ ID NO:284); B72-G1-P4 (SEQ ID NO:286); B72-G1-M57 (SEQ ID NO:288); B72-G1-M78 (SEQ ID NO:290); B60-G1-P4 (SEQ ID NO:292); B60-G1-M57 (SEQ ID NO:294); y B60-G1-M78 (SEQ ID NO:296); B60-G2-M78 (SEQ 20 ID NO:355) y M7-G2-M78 (SEQ ID NO:357) y (d) cada cadena ligera del PBA comprende una secuencia de aa que es al menos un 95 % identica a una de las siguientes secuencias de aa o difiere de una de las siguientes secuencias de aa en 1-10 sustituciones, deleciones y/o adicionales de aa: cadena ligera lambda P1 (SEQ ID NO:258); cadena ligera lambda M27 (SEQ ID NO:260); cadena ligera lambda M7 (SEQ ID NO:262); cadena ligera lambda B72 (SEQ ID NO:264); y cadena ligera lambda B60 (SEQ ID NO:266).
25
El PBA ejemplar incluye los siguientes: (a) un PBA SF-G1-P1 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:212; y dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia de cadena ligera de la SEQ ID NO:202; (b) un PBA SF-G1-M1.3 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:214; y dos 30 cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:202; (c) un PBA SF-G1-M27 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:216; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:202; (d) un PBA SF-G1-P6 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:218; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una 35 secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:202; (e) un PBA SF-G1-B69 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:220; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:202; (f) un PBA P4-G1-C8 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:222; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID 40 NO:204 (g) un PBA P4-G1-P1 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:224; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:204; (h) un PBA P4-G1-M1.3 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la sEq ID NO:226; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:204; (i) un PBA P4-G1-M27 que 45 comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:228; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:204; (j) un PBA P4-G1-P6 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:230; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:204; (h) un PBA P4-G1-B69 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una 50 comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:232; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:204; (i) un PBA M78-G1-C8 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:234; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:206; (j) un PBA M78-G1-P1 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de 55 aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:236; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:206; (k) un PBA M78-G1-M1.3 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:238; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:206; (l) un PBA M78-G1-M27 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID
NO:240; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:206; (m) un PBA M78-G1-P6 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:242; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:206; (n) un PBA M78-G1-B69 que comprende: dos cadenas pesadas, cada 5 una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:244; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:206; (o) un PBA M57-G1-C8 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:246; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:208; (p) un PBA M57-G1-P1 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de 10 aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:248; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:208; (r) un PBA M57-G1-M1.3 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la sEq ID NO:250; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:208; (s) un PBA M57-G1-M27 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID 15 NO:252; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:208; (t) un PBA M57-G1-P6 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:254; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:208; (u) un PBA M57-G1-B69 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la sEq ID NO:256; y dos cadenas ligeras cada una 20 comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:208; (v) un PBA P1-G1-P4 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:268; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:258; (w) un PBA P1-G1-M57 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:270; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena 25 ligera de la SEQ ID NO:258; (x) un PBA P1-G1-M78 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:272; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:258; (y) un PBA M27-G1-P4 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:274; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID 30 NO:260; (z) un PBA M27-G1-M57 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:276; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:260; (aa) un PBA M27-G1-M78 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:278; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:260; (ab) un PBA M7-G1-P4 que 35 comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:280; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:262; (ac) un PBA M7-G1-M57 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:282; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:262; (ad) un PBA M7-G1-M78 que comprende: dos cadenas pesadas, cada 40 una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:284; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:262; (ae) un PBA B72-G1-P4 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:286; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:264; (af) un PBA B72-G1-M57 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia 45 de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:288; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:264; (ag) un PBA B72-G1-M78 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:290; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:264; (ah) un PBA B60-G1-P4 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID 50 NO:292; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:266; (ai) un PBA B60-G1-M57 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:294; y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:266; y (aj) un PBA B60-G1-M78 que comprende: dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:296; y dos cadenas ligeras cada una 55 comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:266.
Tambien se describen en el presente documento anticuerpos monoespecfficos. Tambien descrito en el presente documento, un anticuerpo monoclonal anti-IGF-IR comprende una primera secuencia que comprende en orden de amino a carboxi una secuencia VLCDR1, una secuencia VLCDR2 y una secuencia VLCDR3 de cadena ligera kappa
SF como se indica por el subrayado discontinue en la figura 5A, SEQ ID NO:202, comprendiendo ademas el anticuerpo una segunda secuencia que comprende en orden de amino a carboxi una secuencia VHCDR1, una secuencia VHCDR2 y una secuencia VHCDR3 de cadena pesada SF como se indica por las primeras tres secuencias con subrayado discontinuo respectivamente en la figura 5A, SEQ ID NO:210, en la que la primera 5 secuencia y la segunda secuencia no son solapantes. Tambien descrito en el presente documento, un anticuerpo monoclonal anti-IGF-IR comprende en orden de amino a carboxi una secuencia VLCDR1, una secuencia VLCDR2 y una secuencia VLCDR3 de cadena ligera kappa P4 como se indica por el subrayado discontinuo en la figura 5A, SEQ ID NO:204, comprendiendo ademas el anticuerpo en el orden de amino a carboxi una secuencia VHCDR1, una secuencia VHCDR2 y una secuencia VHCDR3 de cadena pesada P4 como se indica por las primeras tres 10 secuencias de subrayado discontinuo respectivamente en la figura 5A, SEQ ID NO:222. Tambien descrito en el presente documento, un anticuerpo monoclonal anti-IGF-IR comprende en orden de amino a carboxi una secuencia VLCDR1, una secuencia VLCDR2 y una secuencia VLCDR3 de cadena ligera kappa M78 como se indica por el subrayado discontinuo en la figura 5A, SEQ ID NO:206, comprendiendo ademas el anticuerpo en el orden de amino a carboxi una secuencia VHCDR1, una secuencia VHCDR2 y una secuencia VHCDR3 de cadena pesada M78 como 15 se indica por las primeras tres secuencias de subrayado discontinuo respectivamente en la figura 5A, SEQ ID NO:234. Tambien descrito en el presente documento, un anticuerpo monoclonal anti-IGF-IR comprende en orden de amino a carboxi una secuencia VLCDR1, una secuencia VLCDR2 y una secuencia VLCDR3 de cadena ligera kappa M57 como se indica por el subrayado discontinuo en la figura 5a, SEQ ID NO:208, comprendiendo ademas el anticuerpo en el orden de amino a carboxi una secuencia VHCDR1, una secuencia VHCDR2 y una secuencia 20 VHCDR3 de cadena pesada M57 como se indica por las primeras tres secuencias de subrayado discontinuo respectivamente en la figura 5A, SEQ ID NO:246.
Tambien descrito en el presente documento, un anticuerpo anti-IGF-IR comprende un dominio VH que comprende un conjunto de tres CDR VH que comprende VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, y/o un dominio VL que comprende un 25 conjunto de tres CDR VL que comprende VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3, comprendiendo las CDR las secuencias de las SEQ ID NOs: 302, 303, 304, 305, 306, y 307, respectivamente, y comprendiendo cada CDR ademas un extremo amino y un extremo carboxi, en el que las CDR de cada conjunto de CDR se disponen en el anticuerpo en un orden lineal de amino a carboxi de CDR1, CDR2, y CDR3, en el que las CDR comprenden aa variables, que representan independientemente cualquier aa expuesto en la posicion correspondiente en la figura 1 (VH) o la figura 2 (VL), y el 30 anticuerpo no comprende el modulo SF. Tambien descrito en el presente documento, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de un anticuerpo anti-IGF-IR comprenden las secuencias de las SEQ ID NOs: 302, 303, 304, 305, 306 y 308, respectivamente. Tambien descrito en el presente documento, los dominios VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de un anticuerpo anti-IGF-IR comprenden las secuencias de aa correspondientes de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 8-10 y 12-31, y los dominios VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 del anticuerpo anti- 35 IGF-1R comprenden las secuencias de aa correspondientes de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 32-34 y 36-133. Tambien descrito en el presente documento, (a) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 de un anticuerpo anti-IGF-1R comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:8 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 del anticuerpo anti-IGF-1R comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:32; o (b) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 del anticuerpo anti-IGF-1R comprenden la secuencia de aa de las 40 CDR correspondientes de la SEQ ID NO:9 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 del anticuerpo anti-IGF-1R comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:33; o (c) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 del anticuerpo anti-IGF-1R comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:10, y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 del anticuerpo anti-IGF-1R comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ iD NO:34; o (d) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 del anticuerpo anti-IGF-1R 45 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO: 11 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 del anticuerpo anti-IGF-1R comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ iD NO:35; o (e) las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 del anticuerpo anti-IGF-1R comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:8 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 del anticuerpo anti-IGF-1R comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:33; o (f) las VHcDr1, VHCDR2, 50 VHCDR3 del anticuerpo anti-IGF-1R comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:10 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 del anticuerpo anti-IGF-1R comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:32.
Tambien descrito en el presente documento, el dominio VH de un anticuerpo anti-IGF-1R comprende la secuencia 55 de aa de la SEQ ID NO:1, cuya secuencia comprende aa variables, que representan independientemente cualquier aa expuesto en la posicion correspondiente en la figura 1; el dominio VL del anticuerpo anti-IGF-1R comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:2 (o 3), cuya secuencia comprende aa variables, que representan independientemente cualquier aa expuesto en la posicion correspondiente en la figura 2; o el dominio VH del anticuerpo anti-IGF-1R comprende la secuencia de aa de la SEQ iD NO:1, y el dominio VL del anticuerpo anti-IGF-
1R comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:2 o 3. Tambien descrito en el presente documento, el dominio VH de un anticuerpo anti-IGF-1R comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 8-10 y 12-31 y el dominio VL comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 32-34 y 36-133.
5
Tambien descrito en el presente documento, (a) el dominio VH de un anticuerpo anti-IGF-1R comprende una secuencia de aa que es al menos un 90 % identica a, o que difiere en 1-30 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de, una secuencia de aa de cualquiera de las SEQ ID NOs: 8-10 y 12-31, y/o (b) el dominio VL del anticuerpo anti-IGF-1R comprende una secuencia de aa que es al menos un 90 % identica a, o que difiere en 1-30 10 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de, una secuencia de aa de una secuencia de aa de cualquiera de las SEQ ID NOs: 32-34 y 36-133. Tambien descrito en el presente documento, (a) el dominio VH de un anticuerpo anti- IGF-1R comprende una secuencia de aa que es al menos un 95 % identica a, o que difiere en 1-10 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de, una secuencia de aa de cualquiera de las SEQ ID NOs: 8-10 y 12-31, y/o (b) el dominio VL comprende una secuencia de aa que es al menos un 95 % identica a, o que difiere en 1-10 15 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de, una secuencia de aa de una secuencia de aa de cualquiera de las SEQ ID NOs: 32-34 y 36-133.
Un anticuerpo anti-IGF-1R puede ser un anticuerpo IgG1, por ejemplo, un anticuerpo IgG1 aislado y/o monoclonal.
20 Tambien descrito en el presente documento, un anticuerpo anti-IGF-1R es una protefna que comprende dos pares de cadenas polipeptfdicas, comprendiendo cada par una cadena pesada y una cadena ligera; en el que (a) cada cadena pesada comprende una secuencia de aa de las SEQ ID NOs: 359, 360 o 361; y/o (b) cada cadena ligera comprende una secuencia de aa de las SEQ ID NOs: 204, 206 o 208. Tambien descrito en el presente documento, un anticuerpo anti-IGF-1R es una protefna que comprende dos pares de cadenas polipeptfdicas, comprendiendo 25 cada par una cadena pesada y una cadena ligera; en el que (a) cada cadena pesada comprende una secuencia de aa que es al menos un 90 % identica a, o que difiere en 1-30 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de, una secuencia de aa de cualquiera de las SEQ ID NOs:359, 360 o 361, y/o (b) cada cadena ligera comprende una secuencia de aa que es al menos un 90 % identica a, o que difiere en 1-30 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de, una secuencia de aa de una secuencia de aa de cualquiera de las SEQ ID NOs: 204, 206 o 208. Tambien 30 descrito en el presente documento, (a) cada cadena pesada de un anticuerpo anti-IGF-1R comprende una secuencia de aa que es al menos un 95 % identica a, o que difiere en 1-10 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de, una secuencia de aa de cualquiera de las SEQ ID NOs:359, 360 o 361, y/o (b) cada cadena ligera comprende una secuencia de aa que es al menos un 95 % identica a, o que difiere en 1-10 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de, una secuencia de aa de una secuencia de aa de cualquiera de las SEQ ID NOs: 204, 206 o 208.
35
Los anticuerpos ejemplares tambien descritos en el presente documento incluyen (a) un anticuerpo IgG1 monoclonal anti-IGF-R1 P4 que comprende dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:359 y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:204; (b) un anticuerpo IgG1 monoclonal anti-IGF-R1 M78 que comprende dos cadenas pesadas, 40 cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ Id NO:360 y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:206; (c) un anticuerpo IgG1 monoclonal anti-IGF-R1 M57 que comprende dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:361 y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:208; (d) un anticuerpo IgG1 monoclonal anti-IGF-R1 M57/M78 que comprende dos cadenas 45 pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID nO:361 y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:206; y (e) un anticuerpo IgG1 monoclonal anti-IGF-R1 P4/M57 que comprende dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:359 y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:208.
50
Los anticuerpos anti-IGF-1R pueden comprender uno o mas sitios de union adicionales, por ejemplo, un sitio de union a anti-ErbB3.
Tambien se proporcionan anticuerpos monoclonales anti-ErbB3, por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-ErbB3. 55 Tambien descrito en el presente documento, un anti-ErbB3 comprende en un orden de amino a carboxi una secuencia VLCDR1, una secuencia VLCDR2 y una secuencia VLCDR3 de cadena ligera lambda P1 como se indica por subrayado discontinuo en la figura 5B, SEQ ID NO:258, comprendiendo ademas el anticuerpo en orden de amino a carboxi una secuencia VHCDR1, una secuencia VHCDR2 y una secuencia VHCDR3 de cadena pesada P1 como se indica por las primeras tres secuencias con subrayado discontinuo respectivamente en la figura 5B, SEQ ID
NO:268. Tambien descrito en el presente documento, un anticuerpo monoclonal anti-ErbB3 comprende en orden de amino a carboxi una secuencia VLCDR1, una secuencia VLCDR2 y una secuencia VLCDR3 de cadena ligera lambda M27 como se indica por subrayado discontinuo en la figura 5B, SEQ ID NO:260, comprendiendo ademas el anticuerpo en orden de amino a carboxi una secuencia VHCDR1, una secuencia VHCDR2 y una secuencia 5 VHCDR3 de cadena pesada P1 como se indica por las primeras tres secuencias con subrayado discontinuo respectivamente en la figura 5B, SEQ ID NO:274. Tambien descrito en el presente documento, un anticuerpo monoclonal anti-ErbB3 comprende en un orden de amino a carboxi una secuencia VLCDR1, una secuencia VLCDR2 y una secuencia VLCDR3 de cadena ligera lambda M7 como se indica por subrayado discontinuo en la figura 5B, SEQ ID NO:262, comprendiendo ademas el anticuerpo en orden de amino a carboxi una secuencia VHCDR1, una 10 secuencia VHCDR2 y una secuencia VHCDR3 de cadena pesada M7 como se indica por las primeras tres secuencias con subrayado discontinuo respectivamente en la figura 5B, SEQ ID NO:280. Tambien descrito en el presente documento, un anticuerpo monoclonal anti-ErbB3 comprende en un orden de amino a carboxi una secuencia VLCDR1, una secuencia VLCDR2 y una secuencia VLCDR3 de cadena ligera lambda B72 como se indica por subrayado discontinuo en la figura 5B, SEQ ID NO:264, comprendiendo ademas el anticuerpo en orden de 15 amino a carboxi una secuencia VHCDR1, una secuencia VHCDR2 y una secuencia VHCDR3 de cadena pesada B72 como se indica por las primeras tres secuencias con subrayado discontinuo respectivamente en la figura 5B, SEQ ID NO:286. Tambien descrito en el presente documento, un anticuerpo monoclonal anti-ErbB3 comprende en un orden de amino a carboxi una secuencia VLCDR1, una secuencia VLCDR2 y una secuencia VLCDR3 de cadena ligera lambda B60 como se indica por subrayado discontinuo en la figura 5B, SEQ ID NO:266, comprendiendo 20 ademas el anticuerpo en orden de amino a carboxi una secuencia VHCDR1, una secuencia VHCDR2 y una secuencia VHCDR3 de cadena pesada B60 como se indica por las primeras tres secuencias con subrayado discontinuo respectivamente en la figura 5B, SEQ ID NO:292.
Tambien descrito en el presente documento, un anticuerpo anti-ErbB3 aislado que se une especfficamente a ErbB3 25 humano comprende un dominio VH que comprende un conjunto de tres CDR VH que comprende VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, y/o un dominio VL que comprende un conjunto de tres CDR VL que comprende VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3, comprendiendo las CDR las secuencias de las SEQ ID NOs: 309, 310, 311, 312, 313, y 314, respectivamente, y cada CDR comprende ademas un extremo amino y un extremo carboxi, en el que las CDR de cada conjunto de CDR se disponen en el anticuerpo en un orden lineal de amino a carboxi de CDR1, CDR2, y 30 CDR3, en el que las CDR comprenden aa variables, que representan independientemente cualquier aa expuesto en la posicion correspondiente en la figura 3 (VH) o la figura 4 (VL), y el anticuerpo no comprende el modulo C8. Tambien descrito en el presente documento, la VHCDR1, VHcDr2, VHCDR3, VlCdR1, VLCDR2 y VLCDR3 de un anticuerpo anti-ErbB3 comprende las secuencias de las SEQ ID NOs: 309, 310, 311, 312, 313 y 315, respectivamente. Tambien descrito en el presente documento, los dominios VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de un 35 anticuerpo anti-ErbB3 comprenden las secuencias de aa correspondientes de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 134-142 y 144-165, y los dominios VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 del anticuerpo comprenden las secuencias de aa correspondientes de una cualquiera de las SEQ ID NOs: 166-174 y 176-200.
Tambien descrito en el presente documento, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 de un anticuerpo anti-ErbB3 40 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:134 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 del anticuerpo anti-ErbB3 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:166. Tambien descrito en el presente documento, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 de un anticuerpo anti-ErbB3 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:13 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 del anticuerpo anti-ErbB3 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID 45 NO:167. Tambien descrito en el presente documento, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 de un anticuerpo anti-ErbB3 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:136 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 del anticuerpo anti-ErbB3 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:168. Tambien descrito en el presente documento, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 de un anticuerpo anti-ErbB3 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:137 y las VLCDR1, VLCDR2 y 50 VLCDR3 del anticuerpo anti-ErbB3 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:169. Tambien descrito en el presente documento, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 de un anticuerpo anti-ErbB3 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:138 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 del anticuerpo anti-ErbB3 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:170. Tambien descrito en el presente documento, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 del anticuerpo anti-ErbB3 55 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO: 139 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 del anticuerpo anti-ErbB3 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:171. Tambien descrito en el presente documento, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 de un anticuerpo anti-ErbB3 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:140 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 del anticuerpo comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:172.
Tambien descrito en el presente documento, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 de un anticuerpo anti-ErbB3 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:141 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 del anticuerpo anti-ErbB3 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de las SEQ ID NOs: 173. Tambien descrito en el presente documento, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 de un anticuerpo anti- 5 ErbB3 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:142 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 del anticuerpo anti-ErbB3 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:174. Tambien descrito en el presente documento, las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 de un anticuerpo anti-ErbB3 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID NO:136 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 del anticuerpo anti-ErbB3 comprenden la secuencia de aa de las CDR correspondientes de la SEQ ID 10 NO:169.
Tambien se describe en el presente documento, el dominio VH de un anticuerpo anti-ErbB3 comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:4 (o 5), cuya secuencia comprende aa variables, que representan independientemente cualquier aa expuesto en la posicion correspondiente en la figura 3 y/o el dominio VL del anticuerpo anti-ErbB3 15 comprende la secuencia de aa de la SEQ ID NO:6 (o 7), cuya secuencia comprende aa variables, que representan independientemente cualquier aa expuesto en la posicion correspondiente en la figura 4. Tambien descrito en el presente documento, el dominio VH de un anticuerpo anti-ErbB3 comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 134-142 y 144-165 y/o el dominio VL del anticuerpo anti-ErbB3 comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 166-174 y 176-200.
20
Tambien descrito en el presente documento, (a) el dominio VH de un anticuerpo anti-ErbB3 comprende una secuencia de aa que es al menos un 90 % identica a, o que difiere en 1-30 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de, una secuencia de aa de cualquiera de las SEQ ID NOs: 134-142 y 144-165, y/o (b) el dominio VL del anticuerpo anti-ErbB3 comprende una secuencia de aa que es al menos un 90 % identica a, o que difiere en 1-30 25 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de, una secuencia de aa de una secuencia de aa de cualquiera de las SEQ ID NOs: 166-174 y 176-200. Tambien descrito en el presente documento, (a) el dominio VH de un anticuerpo anti-ErbB3 comprende una secuencia de aa que es al menos un 95 % identica a, o que difiere en 1-10 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de, una secuencia de aa de cualquiera de las SEQ ID NOs: 134-142 y 144-165, y/o (b) el dominio VL comprende una secuencia de aa que es al menos un 95 % identica a, o que difiere en 1-10 30 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de, una secuencia de aa de una secuencia de aa de cualquiera de las SEQ ID NOs: 166-174 y 176-200.
Un anticuerpo anti-ErbB3 puede ser un anticuerpo IgG1, por ejemplo, un anticuerpo IgG1 monoclonal aislado.
35 Tambien descrito en el presente documento, un anticuerpo anti-ErbB3 es una protefna que comprende dos pares de cadenas polipeptfdicas, comprendiendo cada par una cadena pesada y una cadena ligera; en el que (a) cada cadena pesada comprende una secuencia de aa de las SEQ ID NOs: 362, 363, 364, 365 o 366; y/o (b) cada cadena ligera comprende una secuencia de aa de las SEQ ID NOs: 258, 260, 262, 264 o 266. Tambien descrito en el presente documento, un anticuerpo anti-ErbB3 es una protefna que comprende dos pares de cadenas 40 polipeptfdicas, comprendiendo cada par una cadena pesada y una cadena ligera; en el que (a) cada cadena pesada comprende una secuencia de aa que es al menos un 90 % identica a, o que difiere en 1-30 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de, una secuencia de aa de cualquiera de las SEQ ID NOs: 362, 363, 364, 365 o 366, y/o (b) cada cadena ligera comprende una secuencia de aa que es al menos un 90 % identica a, o que difiere en 1-30 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de, una secuencia de aa de una secuencia de aa de cualquiera de las 45 SEQ ID NOs: 258, 260, 262, 264 o 266. Tambien descrito en el presente documento, un anticuerpo anti-ErbB3 es una protefna que comprende dos pares de cadenas polipeptfdicas, comprendiendo cada par una cadena pesada y una cadena ligera; en el que (a) cada cadena pesada comprende una secuencia de aa que es al menos un 95 % identica a, o que difiere en 1-10 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de, una secuencia de aa de cualquiera de las SEQ ID NOs: 362, 363, 364, 365 o 366, y (b) cada cadena ligera comprende una secuencia de aa que es al 50 menos un 95 % identica a, o que difiere en 1-10 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de, una secuencia de aa de una secuencia de aa de cualquiera de las SEQ ID NOs: 258, 260, 262, 264 o 266.
Un anticuerpo anti-ErbB3 puede comprender uno o mas sitios de union diferentes, por ejemplo, un sitio de union a anti-IGF-1R.
55
Los anticuerpos anti-ErbB3 ejemplares tambien descritos en el presente documento incluyen: (a) un anticuerpo IgG1 monoclonal anti-ErbB3 P1 que comprende dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:362 y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:258; (b) un anticuerpo IgG1 monoclonal anti-ErbB3 M27 que comprende dos
cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:363 y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:260; (c) un anticuerpo IgG1 monoclonal anti-ErbB3 M7 que comprende dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:364 y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una 5 secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:262; (d) un anticuerpo IgG1 monoclonal anti-ErbB3 B72 que comprende dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:365 y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:264; (e) un anticuerpo IgG1 monoclonal anti-ErbB3 B60 que comprende dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:366 y dos cadenas ligeras cada una 10 comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:266; y (f) un anticuerpo IgG1 monoclonal anti-ErbB3 M27/M7 que comprende dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena pesada de la SEQ ID NO:363 y dos cadenas ligeras cada una comprendiendo una secuencia de aa de cadena ligera de la SEQ ID NO:262.
15 Tambien se describen en el presente documento scFv, que pueden ser scFv monoclonales. Los scFv ejemplares tambien descritos en el presente documento incluyen (a) anticuerpo scFv anti-IGF-RI P4 que comprende una secuencia de aa de la SEQ ID NO:367; (b) anticuerpo scFv anti-IGF-RI M57 que comprende una secuencia de aa de la SEQ ID NO:368; (c) anticuerpo scFv anti-IGF-R1 M78 que comprende una secuencia de aa de la SEQ ID NO:369; (d) anticuerpo scFv anti-ErbB3 C8 que comprende una secuencia de aa de la SEQ ID NO:370; (e) 20 anticuerpo scFv anti-ErbB3 P1 que comprende una secuencia de aa de la SEQ ID NO:371; (f) anticuerpo scFv anti- ErbB3 Ml.3 que comprende una secuencia de aa de la SEQ ID NO:372; (g) anticuerpo scFv anti-ErbB3 M27 que comprende una secuencia de aa de la SEQ ID NO:373; (h) anticuerpo scFv anti-ErbB3 P6 que comprende una secuencia de aa de la SEQ ID NO:374; e (i) anticuerpo scFv anti-ErbB3 B69 que comprende una secuencia de aa de la SEQ ID NO:375.
25
Tambien se proporcionan composiciones que comprenden un PBA y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
Tambien se proporcionan moleculas de acido nucleico, por ejemplo, que comprenden al menos una secuencia codificante, al menos una secuencia codificante que codifica un anticuerpo o una cadena del mismo, como se 30 expone en el presente documento. La molecula de acido nucleico puede comprender cualquiera o ambos de una secuencia nucleotfdica promotora y una secuencia nucleotfdica potenciadora, cuya secuencia nucleotfdica esta unida operativamente a la al menos una secuencia codificante y promueve o potencia la expresion del anticuerpo. Tambien se incluyen vectores, por ejemplo, vectores que comprenden una o mas moleculas de acido nucleico proporcionadas en el presente documento, asf como celulas huesped que comprenden uno o mas vectores 35 proporcionados en el presente documento. Tambien se proporcionan metodos para producir un PBA proporcionado en el presente documento, que comprenden cultivar una celula que comprende uno o mas acidos nucleicos que codifican los anticuerpos (por ejemplo, un PBA) o cadenas de los mismos proporcionadas en el presente documento en condiciones adecuadas para la expresion del PBA. Tambien se proporcionan metodos para tratar un sujeto que tiene cancer, comprendiendo dicho metodo administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente eficaz de uno o mas 40 anticuerpos o PBA o composiciones proporcionadas en el presente documento.
Tambien se proporcionan aquf PBA anti-IGF-1R+anti-ErbB3, en los que el PBA tiene una semivida de al menos 45 horas en un mono Cynomolgus, cuando el PBA se administra por via intravenosa a dosis iguales a o mayores de 5 mg/kg. En ciertas realizaciones, un PBA tiene una semivida que es estadfsticamente significativamente mas larga 45 (por ejemplo, en un 50 %, 2 veces o mas) en un organismo que es un raton o un mono cynomolgus que la semivida de otro ab biespecffico polivalente en el mismo organismo, que se une a los mismos epftopos, en el que la orientacion de las especificidades de union al antfgeno se invierte entre el fab y el scfv.
Los PBA pueden suprimir la senalizacion de pAKT inducida por heregulina en una celula, por ejemplo, una celula 50 cancerosa, en al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 %. Los PBA pueden suprimir la senalizacion de pAKT inducida por IGF-1 en una celula, por ejemplo, una celula cancerosa, en al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 %. Los PBA pueden suprimir la senalizacion de pAKT inducida por insulina en una celula, por ejemplo, una celula cancerosa, en al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 55 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 %. Los PBA pueden suprimir la senalizacion de pAKT inducida por IGF-2 en una celula, por ejemplo, una celula cancerosa, en al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 %.
Un PBA puede inhibir la activacion de mTOR (fosforilacion) en una celula tumoral in vivo o in vitro en mayor medida
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que un Ab# anti-IGF-IR A monoespecffico o que un Ab anti-IGF-IR monoespecffico que se une al mismo epftopo en IGF-1R que el PBA. Los PBA pueden reducir los niveles de protefna mTOR en una celula tumoral in vivo o in vitro en mayor medida que un Ab# anti-IGF-IR A monoespecffico o que un Ab anti-IGF-IR monoespecffico que se une al mismo epftopo en IGF-1R que el PBA. En ciertas realizaciones, un PBA reduce la activacion de mTOR o los niveles de protefna mTOR en una celula tumoral in vivo o in vitro en un factor de al menos el 50 %, o en 2, 3, 4 o 5 veces o mas de 5 veces con respecto al Ab# anti-IGF-1R A monoespecffico o con respecto al Ab anti-IGF-1R monoespecffico que se une al mismo epftopo en IGF-1R que el PBA. En ciertas realizaciones, un PBA es mas eficaz en la inhibicion del crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto humano en ratones nu/nu que es una cantidad equimolar de una IgG anti-IGF-1R. En algunas realizaciones, los modelos de xenoinjerto comprenden xenoinjertos de celulas humanas DU145, BxPC-3, SK-ES-1, o Caki-1. En otra realizacion, un anticuerpo biespecffico polivalente es mas eficaz en la inhibicion del crecimiento tumoral en un modelo de xenoinjerto humano en ratones nu/nu que es una cantidad equimolar de una IgG anti-IGF-1R combinada con una cantidad equimolar de una IgG anti-ErbB3.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Figura 1A-B: Un alineamiento de las secuencias VH IGF-1R ejemplares (SEQ ID NOs:8-31 y 384-385, numeradas consecutivamente de arriba a abajo) y una secuencia consenso (SEQ ID NO:1) derivada de las mismas. Las CDR estan subrayadas y las SEQ ID NOs de las CDR se proporcionan antes de las CDR como un numero entre corchetes (por ejemplo, "[S.302]").
Figura 2A-E: Un alineamiento de las secuencias VL iGf-1R ejemplares (SEQ ID NOs:32-133 y 386-387, numeradas consecutivamente de arriba a abajo) y dos secuencias de consenso (SEQ ID NOs:2 y 3) derivadas de las mismas. La SEQ ID NO:2 incluye el dominio VL de 16F, mientras que la SEQ ID NO:3 no. Las CDR estan subrayadas y las SEQ ID NOs de las CDR se proporcionan antes de las CDR como un numero entre corchetes.
Figura 3A-B: Un alineamiento de las secuencias VH ErbB3 ejemplares (SEQ ID NOs: 134-165 y 388, numeradas consecutivamente de arriba a abajo) y dos secuencias de consenso (SEQ ID NOs:4 y 5) derivadas de las mismas. La SEQ ID NO:4 incluye el dominio VH de 16F, mientras que la SEQ ID NO:5 no. Las CDR estan subrayadas y las SEQ ID NOs de las CDR se proporcionan antes de las CDR como un numero entre corchetes.
Figura 4A-B: Un alineamiento de las secuencias VL ErbB3 ejemplares (SEQ ID NOs:166-200, numeradas consecutivamente de arriba a abajo) y dos secuencias de consenso (SEQ ID NOs:6 y 7) derivadas de las mismas. La SEQ ID NO:6 incluye el dominio VL de 16F, mientras que la SEQ ID NO:7 no. Las CDR estan subrayadas y las SEQ ID NOs de las CDR se proporcionan antes de las CDR como un numero entre parentesis.
Figura 5: Secuencias de aa de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos biespecfficos polivalentes ejemplares anti-IGF-1R-IgG1-anti-ErbB3 (figura 5 A) y anti-ErbB3-IgG1-anti-IGF-1R (figura 5B).
La figura 5A muestra la secuencia de aa de las siguientes cadenas pesadas hfbridas anti-IGF-1R-IgG1-anti- ErbB3: SF-G1-C8 (es decir, 16F - SEQ ID NO:210); SF-G1-P1 (SEQ ID NO:212); SF-G1-M1.3 (SEQ ID NO:214); SF-G1-M27 (SEQ ID NO:216); SF-G1-P6 (SEQ ID NO:218); SF-G1-B69 (SEQ ID NO:220); P4- G1-C8 (SEQ ID NO:222); P4-G1-P1 (SEQ ID NO:224); P4-G1-M1.3 (SEQ ID NO:226); P4-G1-M27 (SEQ ID NO:228); P4-G1-P6 (SEQ ID NO:230); P4-G1-B69 (SEQ ID NO:232); M78-G1-C8 (SEQ ID NO:234); M78- G1-P1 (SEQ ID NO:236); M78-G1-M1.3 (SEQ ID NO:238); M78-G1-M27 (SEQ ID NO:240); M78-G1-P6 (SEQ ID NO:242); M78-G1-B69 (SEQ ID NO:244); M57-G1-C8 (SEQ ID NO:246); M57-G1-P1 (SEQ ID NO:248); M57-G1-M1.3 (SEQ ID NO:250); M57-G1-M27 (SEQ ID NO:252); M57-G1-P6 (SEQ ID NO:254) y M57-G1-B69 (SEQ ID NO:256).
La figura 5B muestra las secuencias de aa de las siguientes cadenas pesadas hfbridas anti-ErbB3-IgG1- anti-IGF-1R: P1-G1-P4 (SEQ ID NO:268); P1-G1-M57 (SEQ ID NO:270); P1-G1-M78 (SEQ ID NO:272); M27-G1-P4 (SEQ ID NO:274); M27-G1-M57 (SEQ ID NO:276); M27-G1-M78 (SEQ ID NO:278); M7-G1-P4 (SEQ ID NO:280); M7-G1-M57 ((SEQ ID NO:282); M7-G1-M78 (SEQ ID NO:284); B72-G1-P4 (SEQ ID NO:286); B72-G1-M57 (SEQ ID NO:288); B72-G1-M78 (SEQ ID NO:290); B60-G1-P4 (SEQ ID NO:292); B60-G1-M57 (SEQ ID NO:294); B60-G1-M78 (SEQ ID NO:296); B60-G2-M78 (SEQ ID NO:355) y M7-G2- M78 (SEQ ID NO:357).
Cada una de estas cadenas pesadas hfbridas de las figuras 5A y 5B comprende tres modulos nombrados y cada una se nombra de acuerdo con su composicion modular (vease la figura 8), con, a la izquierda, el nombre de un primer modulo amino-terminal, en el medio, el nombre del segundo modulo central (siempre G1 o G2, segun se indica, en los anticuerpos biespecfficos polivalentes cuyas secuencias se proporcionan en las figuras 5A y 5B), y a la derecha, el nombre del tercer modulo carboxi-terminal. Cada primer modulo amino-terminal comprende una VR de cadena pesada que comprende de izquierda a derecha una VHCDR1, una VHCDR2 y una VHCDR3, cada una indicada por subrayado discontinuo. Cada segundo
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modulo medio se denomina G1 o G2 y comprende una CR de IgG1, y no forma un sitio de union a antfgeno en un anticuerpo biespecffico polivalente. La bisagra, las porciones CH2 y CH3 de la secuencia del modulo G1 o G2, esta subrayada. La porcion CH1 comienza en ASTK (SEQ ID NO:392). Una secuencia enlazadora Gly-Ser que enlaza el modulo G1 con el tercer modulo tiene doble subrayado. Cada tercer modulo carboxi- terminal aparece a la derecha de esta secuencia de enlazador Gly-Ser y comprende un scFv que comprende una VR de cadena pesada que comprende de izquierda a derecha una VHCDR1, una VHCDR2 y una VHCDR3 (cada uno subrayado en discontinuo), un enlazador scFv Gly-Ser (subrayado ondulado doble), y una VR de cadena ligera que comprende una VLCDR1, una VLCDR2 y una VLCDR3 (cada una subrayada en discontinuo).
La especificidad de union de cada modulo de cadena pesada amino o carboxi-terminal es la misma que la cadena ligera nombrada correspondientemente de la figura 5A o 5B.
La figura 5A muestra secuencias de aa ("aa") de las siguientes cadenas ligeras anti-IGF-R1 kappa maduras: SF (SEQ ID NO:202), P4 (SEQ ID NO:204), M78 (SEQ ID NO:206) y M57 (SEQ ID NO:208).
La figura 5B muestra secuencias de aa de las siguientes cadenas ligeras anti-ErbB3 lambda maduras: P1 (SEQ ID NO:258), M27 (SEQ ID NO:260), M7 (SEQ ID NO:262), B72 (SEQ ID NO:264) y B60 (SEQ ID NO:266).
Cada cadena ligera de las figuras 5A y 5B comprende, de izquierda a derecha, una VLCDR1, una VLCDR2 y una VLCDR3 (cada una subrayada en discontinuo). El dominio CL comienza en "RTVAA" (SEQ ID NO:393) en el dominio VL anti-IGF-1R y en "QPKAA" (SEQ ID NO:394) en el dominio VL anti-ErbB3.
Para formar un anticuerpo biespecffico polivalente completo que comprende las cadenas pesada y ligera de las figuras 5A y 5B, cada cadena pesada se co-expresa con una cadena ligera que comparte el nombre del modulo amino-terminal de la cadena pesada. Cada uno de los anticuerpos biespecfficos polivalentes resultantes adopta la forma de un anticuerpo IgG (que comprende, al igual que los anticuerpos IgG nativos, dos sitios de union a antfgeno esencialmente identicos) con un scFv unido al extremo carboxi de cada una de las dos cadenas pesadas de la IgG.
Figura 6: Secuencias de aa de las cadenas pesadas de los 6A) anticuerpos IgG1 anti-IGF-1R y los 6B) anticuerpos IgG1 anti-ErbB3 ejemplares; y secuencias de aa de 6C) scFv anti-IGF-1R, y 6D) scFv anti- ErbB3.
Figura 7: Secuencias de aa de 7A) las cadenas pesadas y 7B) las cadenas ligeras, de SF-G1-C8 (16F), cada una con una secuencia lfder que esta ausente en el anticuerpo maduro. La secuencia de aa de cadena pesada (SEQ ID NO:300) es la de SF-G1-C8 (SEQ ID NO:210) con una secuencia lfder N-terminal anadida. La secuencia de aa de cadena ligera (SEQ ID NO:298) es la de cadena ligera kappa SF (SEQ ID NO:202) con una secuencia lfder N-terminal anadida. Las secuencias lfder estan en negrita y subrayadas; las secuencias subrayadas en discontinuo son CDR como se ha indicado anteriormente cada una; los enlazadores (bisagra, enlazador de conexion y enlazador scFv) se indican por encima de sus secuencias subrayadas, y los residuos de aa CH3 individuales E356 y M358 estan en negrita (estos son aa que pueden sustituirse como se indica a continuacion E356D y M358L). Las identidades de los dominios CH1, CH2, CH3, VH y VL en la figura 7A y el dominio CL en la figura 7B se indican por encima de cada dominio, con el punto de inicio de cada uno indicado por una flecha en angulo recto.
Figura 8: Vista esquematica que muestra la derivacion de los modulos de un anticuerpo biespecffico tetravalente de tipo Ig. Los anticuerpos a partir de los cuales se derivan los dominios de union ("modulo N- terminal" y "modulo C-terminal") se marcan anticuerpo monoclonal 1 y anticuerpo monoclonal 2. Los diagramas y modulos son de naturaleza conceptual; los fragmentos de aDn reales que estan unidos entre sf para preparar tal anticuerpo biespecffico pueden no coincidir con los lfmites de los modulos, pero el resultado final es esencialmente como se muestra. Ademas, el anticuerpo monoclonal 1 y el anticuerpo monoclonal 2 pueden no estar en el formato IgG como se muestra - por ejemplo, cualquiera o ambos pueden ser un scFv. Si se usa un scFv como la fuente de un modulo N-terminal, este se convierte del formato scFv en el formato Fv por la eliminacion de la secuencia de ADN que codifica el enlazador scFv para producir las regiones VH y VL que estan comprendidas por las cadenas polipeptfdicas pesada y ligera respectivamente.
Figura 9: La simulacion de la red ErbB predice el diseno de un producto terapeutico ErbB3 optimo. 9A) Complejidad de la red ErbB representada graficamente: Cada uno de la union al ligando, dimerizacion del receptor, trafico del receptor y senalizacion intracelular se capturaron en un modelo cinetico basado en la accion de la masa. 9B) Se uso la perturbacion simulada de cada protefna en la red ErbB para identificar la sensibilidad de la senal aguas abajo, phospho-Akt, hacia cada protefna en la estimulacion de heregulina o betacelulina. 9C) La capacidad de respuesta a la dosis de Akt con respecto a un anticuerpo anti-ErbB3 se examino para determinar una diversidad de constantes de union por afinidad de la tasa de disociacion. El orden de Kd enumeradas para cada grafico de arriba a abajo corresponde al orden de las curvas en cada grafico de izquierda a derecha.
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Figura 10: Se predice que la capacidad de un anticuerpo biespecffico para coinhibir dos rutas es dependiente de los niveles de receptor relativos. El efecto de un anticuerpo biespecffico computacionalmente simulado en el nivel activo de A) IGF-1R, B) ErbB3 y C) un elemento de la ruta de senalizacion aguas abajo comun, Akt (la Akt cinasa), se simulo computacionalmente para las celulas que expresaban tres relaciones molares diferentes en cada receptor con respecto al otro. Las tres curvas en cada grafico pueden identificarse por las posiciones relativas en las que cada uno de sus extremos a la derecha cruza el lfmite del grafico. Curva de interseccion del eje x izquierdo/eje y inferior = simulacion de 10 veces mas de IGF-1R que ErbB3, curva de interseccion central = simulacion de niveles iguales de IGF-1R y ErbB3, curva de interseccion del eje x derecho/eje y superior = Simulacion de 10 veces mas ErbB3 que IGF-1R. Debido a la afinidad inferior del biespecffico hacia IGF-1R, la potencia de la inhibicion de IGF-1R disminuye cuando los niveles de ErbB3 descienden, indicando el efecto de la avidez. El fallo para inhibir de forma potente IGF-1R conduce a un descenso de la capacidad para inhibir pAkt (derecha). La capacidad para inhibir ErbB3 no se ve afectada por el nivel de IGF-1R debido a la mayor afinidad del biespecffico hacia ErbB3.
Figura 11: La optimizacion concurrente de la afinidad y la estabilidad de scFv por presentacion de levadura covalente. 11A) Afinidad de los modulos scFv presentados por levadura aislada con estimulacion post- termica con respecto a GFR2 soluble (ErbB3)-Fc medido por clasificacion celular activada por fluorescencia. 11B) El ensayo de estimulacion termica en modulos scFv optimizados unidos covalentemente a la superficie de levadura confirma su mayor estabilidad termica. La actividad de union residual a ErbB3-Fc que quedo despues del estres termico durante 5 minutos a 65 °C se midio mediante clasificacion celular activada por fluorescencia. MFI = intensidad de fluorescencia media.
Figura 12: Puede usarse fluorescencia de barrido diferencial para estimar la estabilidad en suero. 12A) Medicion de la estabilidad microscopica por fluorometrfa de barrido diferencial. 12B) Estabilidad macroscopica medida por el porcentaje de actividad de union antes (100 %) y despues de 3 dfas de incubacion en suero de raton a 37 °C. La protefna biespecffica de demostracion conceptual muestra una estabilidad inferior en comparacion con un analogo estabilizado tanto en propiedades microscopicas (A) como macroscopicas (B).
Figura 13: El anticuerpo biespecffico optimizado muestra una union celular mas fuerte en comparacion con un anticuerpo biespecffico de prueba de concepto. La union a las celulas BxPC-3, que expresan tanto IGF- 1R como ErbB3, se midio por clasificacion celular activada por fluorescencia.
Figura 14: Union a las celulas ADRr y MCF7. 14A) Union a las celulas ADRr. Como se usa en esta figura y en las figuras 14B, 18, 19, 20A y 20B, a continuacion, "IgG del modulo 2-21" se refiere a un anticuerpo anti- ErbB3 que tiene las mismas VR anti-ErbB3 que en ILE-12. "IgG del modulo 2-3" se refiere a un anticuerpo anti-ErbB3 que tiene las mismas VR anti-ErbB3 que en ELI-7 e ILE-10. "IgG del modulo 5-7" se refiere a un anticuerpo anti-IGF-1R que tiene las mismas VR anti-IGF-1R que en ELI-7, ILE-10 e ILE-12. 14B) Union a las celulas MC7.
Figura 15: Inhibicion de pAKT por ILE-7 y ELI-7.
Figura 16: Efecto de ELI-7 sobre el crecimiento de celulas DU145 (medido por ensayo CTG). RLU = unidades relativas de luminiscencia.
Figura 17: Inhibicion del crecimiento de celulas BxPC-3 por ELI-7 medido por ensayo CTG.
Figura 18: Curvas del crecimiento tumoral de xenoinjerto. Se proporciona una descripcion de los anticuerpos IgG en la leyenda de la figura 14A.
Figura 19: Volumenes de tumor de xenoinjerto final de BxPC-3 el Dfa 41.
Figura 20: Velocidades y tamanos del crecimiento tumoral de xenoinjerto. 20A) Curvas del crecimiento tumoral de DU145. 20B) Volumenes tumorales de DU145 el Dfa 36.
Figura 21: Los anticuerpos biespecfficos polivalentes inhiben la senalizacion a traves de un amplio intervalo de niveles de receptores de ErbB3 e IGF-1R. ELI-7 muestra la inhibicion de pAkt a traves de las lfneas celulares BxPC-3 modificadas para contener un amplio intervalo de los niveles del receptor de IGF1R y ErbB3. "BxPC-3-Control" se refiere a las celulas BxPC-3 con niveles inalterados de IGF-1R y ErbB3. "BxPC- 3-IGF1R-Mod1" se refiere a las celulas BxPC-3 en las que el nivel de IGF-1R se reduce en un 37 %. "BxPC- 3-ErbB3-Mod1" se refiere a las celulas BxPC-3 en las que el nivel de ErbB3 se reduce en un 48 %. "BxPC- 3-ErbB3-Mod2" se refiere a las celulas BxPC-3 en las que el nivel de ErbB3 se reduce en un 88 %.
Figura 22: Reduccion de los niveles de pIGF-1R por 16F (SF-G1-C8) "biespecffico redisenado" y ELI-7 "biespecffico original" en las celulas BcPC3.
Figura 23: Inhibicion por 16F (SF-G1-C8), Ab#B Anti-IGF-1R (cixutumumab; SEQ ID 324 + SEQ ID 325), Ab# A Anti-ErbB3 (SEQ ID NO:336 + SEQ ID NO:337) o Ab#B Anti-IGF-1R + Ab# A Anti-ErbB3 de la fosforilacion de: 23A) IGF1R, 23B) ErbB3, y 23C) AKT, en celulas BxPC-3 e inhibicion por 16F (SF-G1-C8), Ab#B Anti-IGF-1R (cixutumumab; SEQ ID NO:324 + SEQ ID NO:325), Ab# A Anti-ErbB3 (SEQ ID NO:336 + SEQ ID NO:337) o Ab#B Anti-IGF-1R + Ab# A Anti-ErbB3 de la fosforilacion de: 23D) IGF1R, 23E) ErbB3, y
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23F) AKT, en celulas DU145.
Figura 24: Inhibicion de la senalizacion por 24A) 16F (SF-G1-C8) en comparacion con 24B) Ab# A ANTI- IGF-1R (ganitumab; SEQ ID NO:327 + SEQ ID NO:328), Ab# A anti-ErbB3 (SEQ ID NO:336 + SEQ ID NO:337) y Ab# A ANTI-IGF-1R + Ab# A anti-ErbB3. En cada una de 24A y 24B, la inhibicion de la fosforilacion de IGF1R se muestra en el grafico superior, la inhibicion de la fosforilacion de ErbB3 se muestra en el grafico central, y la inhibicion de la fosforilacion de AKT se muestra en el grafico inferior; todas en celulas BxPC-3.
Figura 25: Los anticuerpos biespecfficos muestran una fuerte union a las celulas BxPC-3. Curvas de union generadas despues de la incubacion de los anticuerpos indicados con las celulas BxPC-3 segun se mide por FACS.
Figura 26: Los anticuerpos biespecfficos muestran una fuerte union a la protefna ErbB3 recombinante. Curvas de union generadas despues de la incubacion de los anticuerpos indicados en placas recubiertas con ErbB3-His y la medicion de los niveles de anticuerpos unidos por ELISA.
Figura 27: Los anticuerpos biespecfficos muestran una fuerte inhibicion de la senalizacion de ruta dual. La inhibicion de senal de BxPC-3 de la generacion de pIGF1R, pErbB3 y pAKT, como se indica.
Figura 28: Estabilidad porcentual de los anticuerpos biespecfficos indicados en suero durante 72 h a 37 °C. Figura 29: A-D muestran la union de diversos anticuerpos biespecfficos (como se indica) a las celulas BxPC-3 segun se mide por FACS. En 29A), los modulos N-terminales de los anticuerpos biespecfficos M27/M7-IgG-P4, M27/M7-IgG-M57, y M27/M7-IgG-M78 contienen la cadena pesada M27 y la cadena ligera M7.
Figura 30: A-E muestran los datos de inhibicion de senal de BxPC-3 para diversos anticuerpos
biespecfficos (como se indica) segun se mide por los cambios en los niveles de pIGF1R.
Figura 31: A-F muestran los datos de inhibicion de senal de BxPC-3 para diversos anticuerpos
biespecfficos (como se indica) segun se mide por los cambios en los niveles de pErbB3.
Figura 32: A-E muestran los datos de inhibicion de senal de BxPC-3 para diversos anticuerpos
biespecfficos (como se indica) segun se mide por los cambios en los niveles de pAKT.
Figura 33: A-D muestran datos de inhibicion de senal de BxPC-3 para diversos anticuerpos biespecfficos (segun se indica) en comparacion con una combinacion de Ab# A anti-ErbB3 (SEQ ID NO:336 + SEQ ID NO:337) y Ab# A ANTI-IGF-1R (ganitumab; SEQ ID NO:327 + SEQ ID NO:328), segun se mide por cambios en los niveles de pIGF1R.
Figura 34: A-D muestran datos de inhibicion de senal de BxPC-3 para diversos anticuerpos biespecfficos (segun se indica) en comparacion con una combinacion de Ab# A anti-ErbB3 (SEQ ID NO:336 + SEQ ID NO:337) y Ab# A ANTI-IGF-1R (ganitumab; SEQ ID NO:327 + SEQ ID NO:328), segun se mide por cambios en los niveles de pErbB3.
Figura 35: A-D muestran datos de inhibicion de senal de BxPC-3 para diversos anticuerpos biespecfficos en comparacion con una combinacion de Ab# A anti-ErbB3 (SEQ ID NO:336 + SEQ ID NO:337) y Ab# A ANTI-IGF-1R (ganitumab; SEQ ID NO:327 + SEQ ID NO:328), segun se mide por cambios en los niveles de pAKT.
Figura 36: A-B muestran una estabilidad normalizada para diversos anticuerpos biespecfficos (como se indica) en suero de raton durante 5 dfas a 37 °C.
Figura 37: Secuencias de aa publicadas de cadenas pesadas, cadenas ligeras y scFv de anticuerpos anti- IGF-1R que pueden incorporarse en los anticuerpos biespecfficos polivalentes de acuerdo con la divulgacion del presente documento.
Figura 38: Secuencias de aa publicadas de cadenas pesadas, cadenas ligeras y scFv de anticuerpos anti- ErbB3 a incorporar en los anticuerpos biespecfficos polivalentes de acuerdo con la divulgacion del presente documento.
Figura 39: A-B muestran la inhibicion de la transduccion de senal de IGF1 y heregulina (HRG) en las celulas DU145 por los PBA A) M7-G1-M78 ("M7-M78"), P4-G1-M1.3 ("P4-M1.3"), P4-G1-C8 ("P4-C8") y B) SF-G1-C8 ("SF-C8") en comparacion con la ausencia de PBA ("IGF1 + HRG"); la ausencia de inductor y PBA ("Sin Tx"); mAB anti-EGF1R en solitario; mAb anti-ErbB3 en solitario; y una combinacion de anti-IGF- 1R + anti-ErbB3, segun se mide por la inhibicion de la fosforilacion de aKt. C-D muestran los datos de inhibicion obtenidos de forma similar a los de A-B, pero en celulas BxPC-3. Los mAb anti-IGF1R y anti- ErbB3 en esta figura y en las figuras 40-44 y 51 son Ab# A ANTI-IGF-1R (ganitumab; SEQ ID NO:327 + SEQ ID NO:328) y Ab# A anti-ErbB3 (SEQ ID NO:336 + SEQ ID NO:337), respectivamente.
Figura 40: A-C muestran la inhibicion de la transduccion de senal inducida por IGF1 y heregulina (HRG) por los PBA M7-G1-M78, P4-M 1.3, P4-C8 y SF-C8 en las celulas BxPC-3 que tienen A-D) niveles de tipo silvestre de IGF-1R y ErbB3; B-E) niveles de IGF-1R reducidos en aproximadamente el 50 %; o C-F) niveles de ErbB3 reducidos en aproximadamente el 50 %, segun se mide por la inhibicion de la fosforilacion de AKT.
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20
25
30
35
40
45
50
55
Figura 41: A-D muestran la inhibicion de la transduccion de senal inducida por A-B) 40 ng/ml de IGF1 o CD) o 400 ng/ml de IGF1 por los PBA M7-G1-M78, P4-M1.3, P4-C8 y SF-C8 en celulas BxPC-3, segun se mide por la inhibicion de la fosforilacion de AKT.
Figura 42: A-D muestran la inhibicion de la transduccion de senal inducida por A-B) 20 ng/ml de IGF1 o CD) o 200 ng/ml de heregulina (HRG) por los PBA M7-G1-M78, P4-M1.3, P4-C8 y SF-C8 en celulas BxPC-3, segun se mide por la inhibicion de la fosforilacion de AKT.
Figura 43: A-B muestran la inhibicion de la senalizacion basal en celulas A549 despues de A) 15 minutos de incubacion con los PBA M7-G1-M78, P4-M1.3, P4-C8 y SF-C8; o B) 24 horas de incubacion con los PBA. C-D muestran la inhibicion de la senalizacion basal en las celulas BxPC-3 despues de C) 15 minutos de incubacion con los PBA M7-G1-M78, P4-M1.3, P4-C8 y SF-C8; o D) 24 horas de incubacion con los PBA. Toda senalizacion se determina midiendo los niveles de pAKT.
Figura 44: A-B muestran el nivel de IGF1R total en A) celulas A549 y B) celulas BxPC-3, despues de 24 horas de tratamiento con P4-G1-C3 o P4-G1-M1.3.
Figura 45: Transferencia Western que muestra el nivel de protefna de pIGF1R, pAKt, y B-Actina en las celulas DU145 o MIA PaCa-2 (IR alto) que se privaron de suero ("privadas") o se trataron con IGF1 o IGF2 en solitario o en presencia del PBA P4-M1.3 o P4-C8.
Figura 46: Transferencia de Western que muestra el nivel de protefna de pIGF1R, pAKt, y B-Actina en las celulas DU145 que se privaron de suero ("privadas") o se trataron con IGF1; IGF1 en presencia de P4- M1.3; insulina o insulina en presencia de P4-M1.3.
Figura 47: Transferencia de Western que muestra el nivel de protefna de IGF1R, pIGF1R, ErbB3, pErbB3, pAkt y B-Actina en las celulas BxPC-3 incubadas en ausencia de ligando (filas 1-3) o en presencia de IGF1 y heregulina (HRG) (filas 4-6) y en ausencia de un PBA o en presencia del PBA M7-78 o P4-C8.
Figura 48: A-F muestran la cantidad de A-B) M7-G1-M78; C-D) P4-G1-M1.3; E-F) P4-G1-C8 presente despues de 0 o 5 dfas de incubacion en suero de raton o mono Cynomolgus. G-H muestran la cantidad de P4G1-M1.3 presente despues de 0 o 6 dfas en suero humano, en placas recubiertas con IGF-1R (G) o ErbB3 (H).
Figura 49: A-F muestran el nivel de union a A-C) ErbB3 humano, de raton, rata y Cynomolgus y D-F) EGF- 1R humano, de raton rata y Cynomolgus de los PBA P4-C8 (A, D), P4-M1.3 (B, E) y M7-M78 (C, F). No se proporciona la union de M7-M78 a IGF-1R de rata y Cynomolgus.
Figura 50: A-B muestran la concentracion de PBA P4-G1-M1.3 que es necesaria para desprender A) IGF1 y B) IGF2 de IGF-1R unido a una placa.
Figura 51: A-F muestran ng por mg total de protefna de Phospho-IGF-1R (A), Phospho-ErbB3 (B), Phospho-Akt (C), Phospho-ERK (p44/p42; D), Phospho-mTOR (Ser2448, E), y Phospho-S6 (Ser235/236; 5F) in vitro en el tiempo en las celulas BxPC-3 tratadas con IGF-1 + HRG o IGF-1 + HRG + P4-G1-M1.3. Figura 52: Niveles de pIGF1R, pAKT y B actina en las celulas BxPC-3 y A673 tratadas con suero, IGF1, IGF1 y P4M1.3 (P4-G1-M1.3), IGF2, IGF2 y P4M1.3 (P4-G1-M1.3), insulina, e insulina y P4M1.3 (P4-G1- M1.3).
Figura 53: A-B muestran el nivel de mTOR (A) y phospho-mTOR ("pmTOR") al final del estudio de tumores BxPC-3 de ratones en los que se inyecto uno de PbS, P4-G1-M1.3 o Ab# A anti-IGF-1R.
Figura 54: A-F muestran el nivel de IGF-1R y el receptor de insulina A), ErbB3 y EGFR (B), AKT fosforilado en el residuo S473 ("pAKT S473") y T308 ("pAKT T308") (C), phospho-Fox01 y Fox03a (D, "Phospho-Fox01 (Thr24)/Fox03a (Thr32")), mTOR fosforilado en el residuo S2448 y S2481 (E), y S6 fosforilado en el residuo S235/236 y S 240/244 (F, "pS6 S235/236" y "pS6 S240/244")) al final del estudio de tumores Caki-1 de ratones en los que se inyecto uno de PBS, P4-G1-M1.3, Ab# A anti-IGF-1R + IgG anti-ErbB3, y el inhibidor mTOR everolimus.
Figura 55: A-C muestran el nivel de IGF-1R y ErbB3 (A), phospho-EGFR (B, "pEGFR"), y phospho-mTOR ("pmTOR S2448") y phospho-S6 ("pS6 S235/236") (C) al final del estudio de tumores BxPC-3 de ratones en los que se inyecto uno de PBS, p4-G1-M1.3, y Ab# A anti-IGF-1R.
La figura 56 muestra el nivel de IGF-1 ("IGF1", panel de la izquierda) e IGF-2 ("IGF2", panel de la derecha) en un ensayo ELISA en el que las placas se recubrieron con IGF-1R-His y se anadio una dilucion seriada de P4-G1-M1.3 en los pocillos.
Figura 57: A-D muestran el volumen tumoral medio en el tiempo en un modelo de xenoinjerto de DU145 (A), BxPC-3 (B), SK-ES-1 (C), y Caki-1(D). A los ratones se les inyecto uno de PBS, 500 pg de P4-G1-M1.3, 100 pg de P4-G1-M1.3, 500 pg de P4-G1-C8, o 100 pg de P4-G1-C8 (A); PBS, 500 pg de P4-G1-M1.3, 300 pg de P4-G1-M1.3,100 pg de P4-G1-M1.3, 500 pg de P4-G1-C8, 300 pg de P4-G1-C8,100 pg de P4-G1- C8, 375 pg de Ab# A anti-IGF-1R (ganitumab; SEQ ID NO:327 + SEQ ID NO:328), 225 pg de Ab# A anti- IGF-1R (ganitumab; SEQ ID NO:327 + SEQ ID NO:328), o 75 pg de Ab# A anti-IGF-1R (ganitumab; SEQ ID NO:327 + SEQ ID NO:328) (B); PBS, 500 pg de P4-G1-M1.3, 300 pg de P4-G1-M1.3, o 100 pg de P4-G1- M1.3 (C); o PBS, 500 pg de P4-G1-M1.3, 300 pg de P4-G1-M1.3, 100 pg de P4-G1-M1.3, anti-IGF-1R+
anti-ErbB3 a una dosis de exposicion equivalente, o anti-IGF-1R+ anti-ErbB3 a una dosis equimolar (D).
La figura 58 muestra el ajuste del modelo de disposicion del farmaco mediado por diana con respecto a los datos experimentales de sangre de raton de ratones inyectados con M1.3-G1-P4. La lfnea continua es el ajuste de un raton al que se le dio una dosis de 500 pg, y la lfnea discontinua es el ajuste de un raton al que 5 se le dio una dosis de 100 pg.
Breve descripcion de las secuencias:
Las secuencias de aminoacidos ("aa") a las que se hace referencia en el presente documento y enumeradas en la 10 lista de secuencias se identifican a continuacion.
SEQ ID NO:1 es una secuencia consenso de aa derivada de secuencias VH de IGF-1R ejemplares.
SEQ ID NO:2 es una secuencia consenso de aa derivada de secuencias VL de IGF-1R ejemplares.
SEQ ID NO:3 es una secuencia consenso de aa derivada de secuencias VL de IGF-1R ejemplares, que excluye la secuencia VL del sitio de union a IGF-1R de 16F.
15 SEQ ID NO:4 es una secuencia consenso de aa derivada de secuencias VH de ErbB3 ejemplares.
SEQ ID NO:5 es una secuencia consenso de aa derivada de secuencias VH de ErbB3 ejemplares, que excluye el VH del sitio de union a ErbB3 de 16F.
SEQ ID NO:6 es una secuencia consenso de aa derivada de secuencias VL de ErbB3 ejemplares.
SEQ ID NO:7 es una secuencia consenso de aa derivada de secuencias VL de ErbB3 ejemplares, que excluye la 20 secuencia VL del sitio de union a ErbB3 de 16F.
SEQ ID NOs:8-31 son las secuencias de aa VH de IGF-1R de la figura 1.
SEQ ID NOs:32-133 son las secuencias de aa VL de IGF-1R de la figura 2.
SEQ ID NOs:134-165 son las secuencias de aa VH de ErbB3 de la figura 3.
SEQ ID NOs:166-200 son las secuencias de aa VL de ErbB3 de la figura 4.
25 SEQ ID NOs:201-256 son la secuencia nucleotfdica (numeros impares) y las secuencias de aa (numeros pares) de las cadenas ligera y pesada maduras de IgG1(scFv)2 anti-IGF-1R/anti-ErbB3 proporcionado en la figura 5a, cuyos numeros de ID de secuencia son como se indican a continuacion. Cadenas ligeras kappa: SF (SEQ ID NOs:201 y 202); P4 (SEQ ID NOs:203 y 204); M78 (SEQ ID NOs:205 y 206); y M57 (SEQ ID NOs:207 y 208). Fusiones scFv de cadena pesada (hfbridos): SF-G1-C8 (es decir, 16F; SEQ ID NOs:209 y 210); SF-G1-P1 (SEQ ID NOs:211 y 212); 30 SF-G1-M1.3 (SEQ ID NOs:213 y 214); SF-G1-M27 (SEQ ID NOs:215 y 216); SF-G1-P6 (SEQ ID NOs:217 y 218); SF-G1-B69 (SEQ ID NOs:219 y 220); P4-G1-C8 (SEQ ID NOs:221 y 222); P4-G1-P1 (SEQ ID NOs:223 y 224); P4-
G1-M1.3 (SEQ ID NOs:225 y 226); P4-G1-M27 (SEQ ID NOs:227 y 228); P4-G1-P6 (SEQ ID NOs:229 y 230); P4-
G1-B69 (SEQ ID NOs:231 y 232); M78-G1-C8 (SEQ ID NOs:233 y 234); M78-G1-P1 (SEQ ID NOs:235 y 236); M78- G1-M1.3 (SEQ ID NOs:237 y 238); M78-G1-M27 (SEQ ID NOs:239 y 240); M78-G1-P6 (SEQ ID NOs:241 y 242); 35 M78-G1-B69 (SEQ ID NOs:243 y 244); M57-G1-C8 (SEQ ID NOs:245 y 246); M57-G1-P1 (SEQ ID NOs:247 y 248); M57-G1-M1.3 (SEQ ID NOs:249 y 250); M57-G1-M27 (SEQ ID NOs:251 y 252); M57-G1-P6 (SEQ ID NOs:253 y 254) y M57-G1-B69 (SEQ ID NOs:255 y 256).
SEQ ID NOs:257-296 son la secuencia nucleotfdica (numeros impares) y las secuencias de aa (numeros pares) de las cadenas ligera y pesada maduras de IgG1(scFv)2 anti-ErbB3/anti-IGF-1R proporcionado en la figura 5B, cuyos 40 numeros de ID de secuencia son como se indican a continuacion. Cadenas ligeras lambda: P1 (SEQ ID NOs:257 y 258); M27 (SEQ ID NOs:259 y 260); M7 (SEQ ID NOs:261 y 262); B72 (SEQ ID NOs:263 y 264); y B60 (SEQ ID NOs:265 y 266). Fusiones scFv de cadena pesada (hfbridos): P1-G1-P4 (SEQ ID NOs:267 y 268); P1-G1-M57 (SEQ ID NOs:269 y 270); P1-G1-M78 (SEQ ID NOs:271 y 272); M27-G1-P4 (SEQ ID NOs:273 y 274); M27-G1-M57 (SEQ ID NOs:275 y 276); M27-G1-M78 (SEQ ID NOs:277 y 278); M7-G1-P4 (SEQ ID NOs:279 y 280); M7-G1-M57 ((SEQ 45 ID NOs:281 y 282); M7-G1-M78 (SEQ ID NOs:283 y 284); B72-G1-P4 (SEQ ID NOs:285 y 286); B72-G1-M57 (SEQ ID NOs:287 y 288); B72-G1-M78 (SEQ ID NOs:289 y 290); B60-G1-P4 (SEQ ID NOs:291 y 292); B60-G1-M57 (SEQ ID NOs:293 y 294); y B60-G1-M78 (SEQ ID NOs:295 y 296).
SEQ ID NOs:297 y 298 con las secuencias nucleotfdicas y de aa de la cadena ligera de 16F con una secuencia senal, como se muestra en la figura 7B.
50 SEQ ID NOs:299 y 300 con las secuencias nucleotfdicas y de aa de la cadena pesada de 16F con una secuencia senal, como se muestra en la figura 7A.
SEQ ID NO:301 es una porcion de un dominio de cadena pesada ejemplar, en el que se inserto una lisina entre el extremo C del dominio CH3 y el extremo N del enlazador SlSLSPGKGGGGS (SeQ ID NO:301 - la lisina adicional esta subrayada).
55 SEQ ID NOs:302-304 son secuencias consenso de los dominios VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 anti-IGF-1R, respectivamente, que son las secuencias CDR de la secuencia consenso VH de SEQ ID NO:1 y mostrada en la figura 1.
SEQ ID NOs:305-307 son secuencias consenso de una VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R, respectivamente, que son las secuencias CDR de la secuencia consenso VL de SEQ ID NO:2 y mostrada en la
figura 2.
SEQ ID NO:308 es una secuencia consenso de una VLCDR3 anti-IGF-IR, que es la secuencia CDR3 de la secuencia consenso VL de SEQ ID NO:3 y mostrada en la figura 2.
SEQ ID NOs:209-311 son secuencias consenso de los dominios VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 anti-ErbB3, 5 respectivamente, que son las secuencias CDR de la secuencia consenso VH de SEQ ID NO:4 y mostrada en la figura 3.
SEQ ID NOs:312-314 son secuencias consenso de los dominios VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3, respectivamente, que son las secuencias CDR de la secuencia consenso VL de la SEQ ID NO:6 y mostrada en la figura 4.
10 SEQ ID NO:315 es una secuencia consenso de una VLCDR3 anti-ErbB3, que es la secuencia CDR3 de la secuencia consenso VL de SEQ ID NO:7 y mostrada en la figura 4.
SEQ ID NO:316 es la secuencia de aa de la cadena pesada de la protefna biespecffica tetravalente de IgG2 anti- ErbB3/anti-IGF-IR ELI-7.
SEQ ID NO:317 es la secuencia de aa de la cadena ligera de la protefna biespecffica tetravalente de IgG2 anti- 15 ErbB3/anti-IGF-1R ELI-7.
SEQ ID NO:318 es la secuencia de aa de la cadena pesada de la protefna biespecffica tetravalente anti-IGF-1R/anti- ErbB3 ILE-10.
SEQ ID NO:319 es la secuencia de aa de la cadena pesada de la protefna biespecffica tetravalente anti-IGF-1R/anti- ErbB3 ILE-12.
20 SEQ ID NO:320 es la secuencia de aa de la cadena ligera de las protefnas biespecfficas tetravalentes anti-IGF- 1R/anti-ErbB3 ILE-10 e ILE-12.
SEQ ID NOs:321-335 son las secuencias de aa de las cadenas pesadas de Fab (Fab HC), cadenas ligeras de Fab (Fab LC) y scFv de los anticuerpos anti-IGF-1R de la T abla 1, cuyas secuencias son de la figura 37.
25 ________________________Tabla 1 - Anticuerpos anti-IGF-1R_______________________
Anti-IGF-1R
Fab scFv
Fab HC
Fab LC
Ab#C ANTI-IGF-1R (figitumumab)
SEQ ID NO:321 SEQ ID NO:322 SEQ ID NO:323
Ab#B ANTI-IGF-1R (cixutumumab)
SEQ ID NO:324 SEQ ID NO:325 SEQ ID NO:326
Ab# A ANTI-IGF-1R (ganitumab)
SEQ ID NO:327 SEQ ID NO:328 SEQ ID NO:329
BIIB-G11
SEQ ID NO:330 SEQ ID NO:331 SEQ ID NO:332
BIIB-C06
SEQ ID NO:333 SEQ ID NO:334 SEQ ID NO:335
SEQ ID NOs:336-353 son las secuencias de aa de cadenas pesadas de Fab (Fab HC), cadenas ligeras de Fab (Fab LC) y scFv de los anticuerpos anti-ErbB3 de la Tabla 2, cuyas secuencias son de la figura 38.
30 _________________Tabla 2 - Anticuerpos anti-ErbB3 _______________
Anti-ErbB3
Fab scFv
Fab HC
Fab LC
Ab# A ANTI-ErbB3
SEQ ID NO:336 SEQ ID NO:337 SEQ ID NO:338
H3
SEQ ID NO:339 SEQ ID NO:340 SEQ ID NO:341
Ab#3 MM
SEQ ID NO:342 SEQ ID NO:343 SEQ ID NO:344
Ab#14 MM
SEQ ID NO:345 SEQ ID NO:346 SEQ ID NO:347
Ab#17 MM
SEQ ID NO:348 SEQ ID NO:349 SEQ ID NO:350
Ab#19 MM
SEQ ID NO:351 SEQ ID NO:352 SEQ ID NO:353
SEQ ID NOs:354 y 355 son las secuencias nucleotfdicas y de aa para el anticuerpo biespecffico polivalente B60- IgG2-M78 mostrado en la figura 5B.
SEQ ID NOs:356 y 357 son las secuencias nucleotfdicas y de aa para el anticuerpo biespecffico polivalente M7- 35 IgG2-M78 mostrado en la figura 5B.
SEQ ID NOs:358-360 son secuencias de aa de cadenas pesadas de anticuerpo monoclonal IgG1 anti-IGF-1R SF, P4, M78, y M57 mostradas en la figura 6A.
SEQ ID NOs:362-366 son secuencias de aa de las cadenas pesadas de anticuerpo monoclonal de IgG1 anti-ErbB3 P1, M27, M7, B72, y B60 mostradas en la figura 6B.
40 SEQ ID NOs:367-369 son secuencias de aa de anticuerpos monoclonales scFv anti-IGF-1R P4, M57, y M78 mostrados en la figura 6C.
SEQ ID NOs:370-375 son secuencias de aa de anticuerpos monoclonales scFv C8 anti-ErbB3, P1, M1.3, M27, P6, y B69 mostrados en la figura 6D.
SEQ ID NOs:376-379 son secuencias de aa de las cadenas pesadas P4M-G1-M1.3, P4M-G1-C8, P33M-G1-M1.3, y P33M-G1-C8, respectivamente.
SEQ ID NOs:380 y 381 son secuencias de aa de cadena ligera kappa P33M y la cadena ligera kappa P4M, respectivamente.
5 SEQ ID NOs:382 y 383 son secuencias de aa del scFv anti-IGF-1R M76 y el scFv anti-ErbB3 P6L, respectivamente. Los dominios VH y VL del sitio de union M76 consisten en las secuencias de aa de las SEQ ID NOs:31 y 133, respectivamente.
SEQ ID NOs:384 y 385 son secuencias de aa del dominio VH de los modulos del sitio de union a anti-IGF-1R P4M y P33M, respectivamente.
10 SEQ ID NOs:386 y 387 son secuencias de aa del dominio VL de los modulos del sitio de union a anti-IGF-1R P4M y P33M, respectivamente.
SEQ ID NO:388 es el aa del dominio VH del modulo del sitio de union a anti-ErbB3 P6L. El dominio VL consiste en la secuencia de aa de la SEQ ID NO:173.
SEQ ID NOs: 389 y 390 son secuencias de aa de las cadenas pesadas anti-IGF-1R P4M-G1-P6L y P33M-G1-P6L, 15 respectivamente.
SEQ ID NO:391 es la secuencia de aa de la cadena pesada anti-ErbB3 P1-G1-M76.
SEQ ID NO:392 es la secuencia de aa del comienzo de la porcion CH1 de las cadenas pesadas hfbridas de las figuras 5A y 5B.
SEQ ID nO:393 y 394 son secuencias de aa del comienzo del dominio CL en los dominios VL anti-IGF-1R y ErbB3 20 de las cadenas ligeras de las figuras 5A y 5B, respectivamente.
SEQ ID NOs:395-402 son la secuencia de aa de los enlazadoras polipeptfdicos Gly-Ser ejemplares.
SEQ ID NO:403 es la secuencia de aa de un marcador de hexa-histidina.
SEQ ID NO:404 es la secuencia de aa del dominio constante de IgG2 (incluyendo las regiones CH1, bisagra, CH2 y CH3).
25 SEQ ID NOs:405-408 son la secuencia de aa de las cadenas pesadas de SF-G1-P1, SF-G1-M27, M57-G1-C8, M7- G1-M78, respectivamente, incluyendo la secuencia lfder (los 19 aa N-terminales de cada secuencia).
SEQ ID NO:409 es la secuencia nucleotfdica de la cadena pesada M7-G1-M78, incluyendo la secuencia lfder. SEQ ID NOs:410-411 son las secuencias de aa y nucleotfdicas de la cadena pesada P4-G1-M1.3, respectivamente, incluyendo la secuencia lfder (los 19 aa N-terminales de la secuencia de aa).
30 SEQ ID NOs:412-413 son las secuencias de aa y nucleotfdicas de la cadena pesada P4-G1-C8, respectivamente, incluyendo la secuencia lfder (los 19 aa N-terminales de la secuencia de aa).
SEQ ID NOs:414-415 son las secuencias de aa y nucleotfdicas de la cadena ligera M7 Lambda, respectivamente, incluyendo la secuencia lfder (los 21 aa N-terminales de la secuencia de aa).
SEQ ID NOs:416-417 son las secuencias de aa y nucleotfdicas de la cadena ligera kappa P4, respectivamente, 35 incluyendo la secuencia lfder (los 20 aa N-terminales de la secuencia de aa).
SEQ ID NO:418 es la secuencia de aa del modulo de IgG1 con las regiones bisagra, CH2 y CH3 (los 231 aa C- terminales de la secuencia).
SEQ ID NOs:419-424 son las secuencias nucleotfdicas de las cadenas pesadas P4M-G1-M1.3, P4M-G1-C8, P4M- G1-P6L, P33M-G1-M1.3, P33M-G1-C8, y P33M-G1-P6L respectivamente.
40 SEQ ID NO:425 es la secuencia nucleotfdica del anticuerpo biespecffico anti-ErbB3-G1/anti-EGF-1R P1-G1-M76. SEQ ID NOs:426 y 427 son secuencias nucleotfdicas de las cadenas ligeras kappa P33M y kappa P4M, respectivamente.
SEQ ID NO:428 es la secuencia nucleotfdica del scFv anti-IGF-1R M76.
SEQ ID NO:429 es la secuencia nucleotfdica del scFv P6L anti-ErbB3.
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DESCRIPCION DETALLADA
Se proporcionan en el presente documento anticuerpos biespecfficos, por ejemplo, anticuerpos biespecfficos polivalentes ("PBA") que se unen especfficamente al IGF-1R humano y al ErbB3 humano. Estas protefnas son 50 potentes inhibidores de la proliferacion de celulas tumorales y de la transduccion de senales a traves de cualquiera o ambos de IGF-1R y ErbB3. Las protefnas pueden usarse para tratar un trastorno proliferativo celular, por ejemplo, un cancer.
Definiciones
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Por comodidad, se proporciona a continuacion el significado de ciertos terminos y expresiones usados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas.
"Agente", se refiere a una molecula activa, por ejemplo, una protefna terapeutica, por ejemplo, un farmaco.
"Sustitucion aa" se refiere al reemplazo de un aa especffico ("aa") en una protefna con otro aa. Una sustitucion puede ser una sustitucion conservadora, como se define a continuacion.
5 "Sitio de union a anti-ErbB3" se refiere a un sitio de union que se une especfficamente a ErbB3 humano.
"Sitio de union a anti-IGF-IR" se refiere a un sitio de union que se une especfficamente a IGF-1R humano.
"Sitio de union al antfgeno" se refiere a un sitio de union que comprende el dominio VH y/o VL de un anticuerpo, o al 10 menos una CDR del mismo. Por ejemplo, un sitio de union al antfgeno puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en una VHCDR3 en solitario o junto con una VHCDR2 y opcionalmente una VHCDR1. En ciertas realizaciones, un sitio de union al antfgeno comprende un dominio VH y un dominio VL, que puede estar presente en el mismo polipeptido o en dos polipeptidos diferentes, por ejemplo, el dominio VH esta presente en una cadena pesada y un dominio VL esta presente en una cadena ligera.
15
"Porcion de union a antfgeno" de un anticuerpo se refiere a uno o mas fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse especfficamente a un antfgeno (por ejemplo, IGF-1R o ErbB3). Se ha demostrado que la funcion de union al antfgeno de un anticuerpo puede conservarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de union incluidos dentro de la expresion "porcion de union a antfgeno" de un 20 anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la region bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un unico brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb que consiste en un dominio VH; y (vi) una region determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Ademas, aunque VL y VH son 25 dos dominios de un fragmento Fv, VL y VH estan codificados por genes separados, se pueden unir, utilizando metodos recombinantes, mediante un enlazador sintetico que les permite fabricarse como una unica cadena proteica en la que las regiones VL y VH se unen para formar protefnas monovalentes, conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv), vease la Pat. de Estados Unidos N.° 5.892.019. Dichos anticuerpos de cadena unica tambien estan destinados a estar comprendidos dentro de la expresion "porcion de union a antfgeno" de un anticuerpo. Tambien se 30 incluyen otras formas de anticuerpos de cadena unica, tales como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos biespecfficos bivalentes en los que los dominios VH y VL se expresan en una unica cadena polipeptfdica, pero utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, obligando de este modo a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de union al antfgeno.
35
"Afinidad de union" se refiere a la fuerza de una interaccion de union e incluye tanto la afinidad de union real como la afinidad de union aparente. La afinidad de union real es una relacion de la tasa de asociacion sobre la velocidad de disociacion. La afinidad aparente puede incluir, por ejemplo, la avidez resultante de una interaccion polivalente. La constante de disociacion (Kd), es tfpicamente el recfproco de la afinidad de union, y puede medirse 40 convenientemente usando un ensayo de resonancia de plasmon superficial (por ejemplo, como se determina en un instrumento BIACORE 3000 (GE Healthcare), por ejemplo, usando ErbB3 recombinante como el analito y un anticuerpo anti-ErbB3 como el ligando) o un ensayo de union celular, cada uno de cuyos ensayos se describe en el Ejemplo 3 de la Patente de Estados Unidos n.° 7.846.440.
45 "Resto de union", "dominio de union", o "sitio de union", se refiere a la porcion, region o sitio de un polipeptido de union o, cuando se especifica, de una cadena pesada o ligera del mismo, que esta directamente implicada en la mediacion de la union especifica de un anticuerpo a una molecula diana (es decir, un antfgeno). Los dominios de union ejemplares incluyen un sitio de union a antfgeno, un dominio de union a receptor de un ligando, un dominio de union a ligando de un receptor o un dominio enzimatico. En las realizaciones preferidas, el dominio de union 50 comprende o consiste en un sitio de union al antfgeno (por ejemplo, que comprende una secuencia de cadena pesada variable (VH) y una secuencia de cadena ligera variable (VL) o seis CDR de un anticuerpo colocado en regiones marco alternativas (por ejemplo, regiones marco humanas que comprenden opcionalmente una o mas sustituciones de aa). En algunas realizaciones, un sitio de union puede estar compuesto esencialmente solamente por una secuencia de cadena VH o VL. Un sitio de union puede ser completamente de una especie, por ejemplo, 55 tiene solo secuencias que derivan de las secuencias de la lfnea germinal de una especie. Por ejemplo, un sitio de union puede ser humano (es decir, de la especie humana), de raton o rata. Un sitio de union tambien puede estar humanizado, es decir, las CDR son de una especie y las estructuras (FR) son de otra especie. Por ejemplo, un sitio de union puede tener CDR que se derivan de un anticuerpo de raton y FR que son de la especie humana. Ciertos sitios de union humanizados comprenden mutaciones en una o mas cDr para hacer que las CDR se parezcan mas
a las CDR del anticuerpo donante. Ciertos anticuerpos humanizados tambien pueden comprender mutaciones en una o mas FR. Generalmente, las mutaciones en un sitio de union pueden aumentar la afinidad de union del sitio de union a su antfgeno diana, y/o pueden estabilizar el sitio de union, por ejemplo, para extender su semivida.
5 "CDR" o "region determinante de la complementariedad" se refiere a los sitios de combinacion de antfgenos no contiguos encontrados dentro de la VR de los polipeptidos de cadena pesada y ligera. Estas regiones particulares han descrito por Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977) y Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991), y por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 9o1-9l7 (1987) y por MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996) donde las definiciones incluyen superposicion o subconjuntos de residuos de aa cuando 10 se comparan entre si. Los residuos de aa que incluyen las CdR como se definen por cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen para su comparacion. Como se usa en el presente documento, y si no se especifica de otro modo, "CDR" es como se define por Kabat.
Tabla 3. Definiciones CDR
Definiciones CDR
Kabat1 Chothia2 MacCallum3
VHCDR1
31-35 26-32 30-35
VHCDR2
50-65 53-55 47-58
VHCDR3
95-102 96-101 93-101
VLCDR1
24-34 26-32 30-36
VLCDR2
50-56 50-52 46-55
VLCDR3
89-97 91-96 89-96
1La numeracion de los residuos sigue la nomenclatura de Kabat et al., 1991, anteriormente 2La numeracion de los residuos sigue la nomenclatura de Chothia et al., anteriormente 3La numeracion de los residuos sigue la nomenclatura de MacCallum et al., anteriormente
15
"Dominio CH1" se refiere al dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada situado entre el dominio VH y la bisagra. Abarca las posiciones 118-215 de EU. Un dominio CH1 puede ser un dominio CH1 de origen natural, o un dominio CH1 de origen natural en el que uno o mas aa se han sustituido, anadido o eliminado, con la condicion de que el dominio CH1 tenga las propiedades biologicas deseadas. Una actividad biologica deseada puede ser una 20 actividad biologica natural, una actividad biologica mejorada o una actividad biologica reducida con respecto a la secuencia de origen natural.
"Dominio CH2" se refiere al dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada que esta situado entre la bisagra y el dominio CH3. Abarca las posiciones 231-340 de EU. Un dominio cH2 puede ser un dominio CH2 de 25 origen natural, o un dominio CH2 de origen natural en el que uno o mas aa se han sustituido, anadido o eliminado, con la condicion de que el dominio CH2 tenga las propiedades biologicas deseadas. Una actividad biologica deseada puede ser una actividad biologica natural, una actividad biologica mejorada o una actividad biologica reducida con respecto a la secuencia de origen natural.
30 "Dominio CH3" se refiere al dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada que esta situado en el extremo C del dominio CH2 y abarca aproximadamente 110 residuos del extremo N del dominio CH2, por ejemplo, en torno a las posiciones 341-446b (sistema de numeracion de EU). Un dominio CH3 puede ser un dominio CH3 de origen natural, o un dominio CH3 de origen natural en el que uno o mas aa se han sustituido, anadido o eliminado, con la condicion de que el dominio CH3 tenga las propiedades biologicas deseadas. Una actividad biologica deseada 35 puede ser una actividad biologica natural, una actividad biologica mejorada o una actividad biologica reducida con respecto a la secuencia de origen natural. Un dominio CH3 puede o no comprender una lisina C-terminal.
"Dominio CH4" se refiere al dominio constante de inmunoglobulina de cadena pesada que esta situado en el extremo C del dominio CH3 en los anticuerpos IgM e IgE. Un dominio CH4 puede ser un dominio CH4 de origen natural, o un 40 dominio CH4 de origen natural en el que uno o mas aa se han sustituido, anadido o eliminado, con la condicion de que el dominio CH4 tenga las propiedades biologicas deseadas. Una actividad biologica deseada puede ser una actividad biologica natural, una actividad biologica mejorada o una actividad biologica reducida con respecto a la secuencia de origen natural.
45 "Dominio CL" se refiere al dominio constante de inmunoglobulina de cadena ligera que esta situado en el extremo C con respecto al dominio VH. Se extiende en torno a las posiciones 107a-216 de Kabat. Un dominio CL puede ser un dominio CL de origen natural, o un dominio CL de origen natural en el que uno o mas aa se han sustituido, anadido o
eliminado, con la condicion de que el dominio CL tenga las propiedades biologicas deseadas. Una actividad biologica deseada puede ser una actividad biologica natural, una actividad biologica mejorada o una actividad biologica reducida con respecto a la secuencia de origen natural. Un dominio CL puede o no comprender una lisina C-terminal.
5
"Sustitucion conservadora" o "sustitucion conservadora de aa" se refiere a la sustitucion de uno o mas residuos de aa en una protefna o un peptido con, para cada residuo de aa particular de pre-sustitucion, un aa de reemplazo especffico que es conocido como poco probable para alterar la confirmacion o la funcion de una protefna o un peptido en el que tal residuo de aa particular se sustituye por tal aa de reemplazo especffico. Tales sustituciones 10 conservadoras tfpicamente implican reemplazar un aa con otro que sea similar en carga y/o tamano al primer aa, e incluyen el reemplazo de cualquiera de isoleucina (I), valina (V) o leucina (L) entre sf, sustituyendo acido aspartico (D) por acido glutamico (E) y viceversa; glutamina (Q) por asparagina (N) y viceversa; y serina (S) por treonina (T) y viceversa. Se conocen otras sustituciones en la tecnica como conservadoras en entornos de secuencia o estructurales particulares. Por ejemplo, la glicina (G) y la alanina (A) pueden sustituirse frecuentemente entre sf para
15 producir una sustitucion conservadora, tal como puede ser alanina y valina (V). La metionina (M), que es
relativamente hidrofoba, puede sustituir con frecuencia de manera conservadora o sustituirse conservativamente por leucina o isoleucina y a veces valina. La lisina (K) y la arginina (R) son frecuentemente intercambiables en lugares en los que la caracterfstica significativa del residuo de aa es su carga y no se espera que las pK diferentes de estos dos residuos de aa basicos sean significativas. Los efectos de tales sustituciones se pueden calcular usando
20 matrices de puntuacion de sustitucion tales como PAM120, PAM-200 y PAM-250. Se conocen bien otras
sustituciones conservadoras de este tipo, por ejemplo, sustituciones de regiones enteras que tienen caracterfsticas de hidrofobicidad similares (por ejemplo, dominios transmembrana).
Un dominio CR en una cadena ligera de una inmunoglobulina se denomina indistintamente como un "CL", "dominio 25 CR de cadena ligera", "region CL" o "dominio CL". Un dominio constante en una cadena pesada (por ejemplo, dominios bisagra, CH1, CH2 o CH3) de una inmunoglobulina se denomina indistintamente como un "CH", "dominio constante de cadena pesada", region "CH" o "dominio CH". Un dominio variable en una cadena ligera de inmunoglobulina se denomina indistintamente como un "VL", "dominio variable de cadena ligera", "region VL" o "dominio VL". Un dominio variable en una cadena pesada de inmunoglobulina se denomina indistintamente como un 30 "VH", "dominio variable de cadena pesada", "region VH" o "dominio VH".
"Dominio" se refiere a una region, por ejemplo, una region globular plegable independientemente o una region no globular (por ejemplo, un dominio enlazador), de un polipeptido de cadena pesada o ligera que puede comprender bucles peptfdicos (por ejemplo, de 1 a 4 bucles peptfdicos) que pueden estabilizarse, por ejemplo, mediante una 35 lamina plegada p y/o un enlace disulfuro intracadena. La constante y las VR de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina se pliegan tfpicamente en dominios. En particular, cada uno de los dominios CH1, CH2, CH3, CH4, CL, VH y VL forman tfpicamente una estructura de bucle.
"CE50" o "CE50" se refiere a la concentracion de una molecula, por ejemplo, un PBA, que proporciona el 50 % del 40 efecto maximo de la protefna en un sistema particular, tal como un ensayo de union o una ruta de transduccion de senal.
"ErbB3"y "HER3" se refieren a la protefna ErbB3, como se describe en la Pat. de Estados Unidos N.° 5.480.968. La secuencia de protefna ErbB3 humana se muestra en la figura 4 y la SEQ ID NO:4 de la Pat. de Estados Unidos N.° 45 5.480.968, en la que los primeros 19 aa corresponden a la secuencia lfder que se escinde de la protefna madura. ErbB3 es un miembro de la familia ErbB de receptores, cuyos otros miembros incluyen ErbB1 (EGFR), ErbB2 (HER2/Neu) y ErbB4. Si bien ErbB3 carece de actividad de tirosina cinasa, pero a su vez se fosforila tras la dimerizacion de ErbB3 con otro receptor de la familia ErbB, por ejemplo, ErbB1, ErbB2 y ErbB4, que son receptores tirosina cinasa. Los ligandos de la familia ErbB incluyen heregulina (HRG), betacelulina (BTC), factor de crecimiento 50 epidermico (EGF), factor de crecimiento epidermico de union a heparina (HB-EGF), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a), anfirregulina (AR), epigen (EPG) y epiregulina (EPR). La secuencia de aa de ErbB3 humano se proporciona en el Genbank n.° de acceso NP_001973.2 (precursor de isoforma 1 de erbB-3 del receptor tirosina-protefna cinasa) y se le asigna el ID genico: 2065.
55 "EU" indica que las posiciones de aa en una CR de cadena pesada, incluyendo las posiciones de aa en los dominios CH1, bisagra, CH2, y CH3, se numeran en el presente documento de acuerdo con el sistema de numeracion del fndice de EU (vease Kabat et al., en "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Dept. Health and Human Services, 5a edicion, 1991).
"Fab" se refiere a la porcion de union a antfgeno de un anticuerpo, que comprende dos cadenas: una primera cadena que comprende un dominio VH y un dominio CH1 y una segunda cadena que comprende un dominio VL y un dominio CL. Aunque un Fab se describe tfpicamente como el fragmento N-terminal de un anticuerpo que se trato con papafna y comprende una porcion de la region bisagra, tambien se usa en el presente documento como 5 referencia a un dominio de union en el que la cadena pesada no comprende una porcion de la bisagra.
La "region Fc" se refiere a la porcion de una unica cadena pesada de inmunoglobulina que comienza en la region bisagra justo aguas arriba del sitio de escision de papafna (es decir, el residuo 216 en IgG, tomando el primer residuo de CR de cadena pesada como 114) y que termina en el extremo C del anticuerpo. Por consiguiente, una 10 region Fc completa comprende al menos una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. Dos regiones Fc que estan dimerizadas se denominan "Fc" o "dfmero Fc". Una region Fc puede ser una region Fc de origen natural, o una region Fc de origen natural en la que uno o mas aa se han sustituido, anadido o suprimido, con la condicion de que la region Fc tenga las propiedades biologicas deseadas. Una actividad biologica deseada puede ser una actividad biologica natural, una actividad biologica mejorada o una actividad biologica reducida con respecto a la secuencia de 15 origen natural.
"Region estructural" o "FR" o "region FR" incluye los residuos aa que forman parte de la VR, pero no forman parte de las CDR (por ejemplo, utilizando la definicion de Kabat de CDR). Por lo tanto, una estructura VR esta entre aproximadamente 100-120 aa de longitud, pero incluye solo aquellos aa fuera de las CDR. Para el ejemplo 20 especifico de una VR de cadena pesada y para las CDR como se define por Kabat et al., 1991, ibid., la region estructural 1 corresponde al dominio de la VR que incluye los 1-30; la region estructural 2 corresponde al dominio de la VR que incluye los aa 36-49; la region estructural 3 corresponde al dominio de la VR que incluye los aa 66-94, y la region estructural 4 corresponde al dominio de la VR de los aa 103 al final de la VR. Las regiones estructurales para la cadena ligera estan separadas de manera similar por cada una de las CDR VR de cadena ligera. De forma similar, 25 utilizando la definicion de las CDR de Chothia et al. o McCallum et al., los lfmites de la region estructural estan separados por los extremos CDR respectivos como se ha descrito anteriormente. En realizaciones preferidas, las CDR son como se definen por Kabat.
"Anticuerpo de longitud completa" es un anticuerpo que comprende una o mas cadenas pesadas y una o mas 30 cadenas ligeras. Cada cadena pesada esta compuesta por una VR de cadena pesada (abreviada en el presente documento como VH) y una CR de cadena pesada. La CR de cadena pesada esta compuesta por tres dominios CH1, CH2 y CH3, y opcionalmente un cuarto dominio, CH4. Cada cadena ligera esta compuesta por una VR de cadena ligera (abreviada en el presente documento como VL) y una CR de cadena ligera. La CR de cadena ligera esta compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de 35 hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones mas conservadas, denominadas regiones estructurales (FR). Cada VH y VL esta compuesta tfpicamente por tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las protefnas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier clase de tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY) o, sublase (por ejemplo, IgG 1, IgG2, IgG 3, IgG4, IgAl e IgA2) o subclase.
40
"Enlazador Gly-Ser" o "peptido Gly-Ser" se refiere a un peptido que consiste en residuos de glicina y serina. Un peptido Gly-Ser ejemplar comprende la secuencia de aa (Gly4Ser)n (SEQ ID NO:395), en la que n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o mas. En ciertas realizaciones, n es un numero entre 1 y 5, n es un numero entre 6 y 10, n es un numero entre 11 y 15, n es un numero entre 16 y 20, n es un numero entre 21 y 25, o n 45 es un numero entre 26 y 30.
La "CR de inmunoglobulina de cadena pesada" o "CR de Ig HC" puede comprender un dominio CH1 y una region Fc, cuya region Fc puede comprender una bisagra, un dominio CH2, un dominio CH3 y/o un dominio CH4. Una CR de inmunoglobulina de cadena ligera puede comprender un dominio CL.
50
"Bisagra" o "region bisagra" o "dominio bisagra" se refiere a la porcion flexible de una cadena pesada situada entre el dominio CH1 y el dominio CH2. Tiene aproximadamente 25 aa de largo y se divide en una "bisagra superior", una "bisagra central" y una "bisagra inferior". Una bisagra puede ser una bisagra de origen natural, o una bisagra de origen natural en la que uno o mas aa se han sustituido, anadido o suprimido, con la condicion de que la bisagra 55 tenga las propiedades biologicas deseadas. Una actividad biologica deseada puede ser una actividad biologica natural, una actividad biologica mejorada o una actividad biologica reducida con respecto a la secuencia de origen natural.
"CI50" o "CI50" se refiere a la concentracion de una molecula, por ejemplo, un PBA, que proporciona una inhibicion
del 50 % de una actividad maxima (por ejemplo, una respuesta a un estfmulo o una actividad constitutiva), es decir, una concentracion que reduce la actividad a un nivel a medio camino entre la actividad maxima y el valor inicial. El valor de CI50 se puede convertir en una constante de inhibicion absoluta (Ki) usando, por ejemplo, la ecuacion de Cheng-Prusoff. En un sistema que esta inhibido por un agente de union, tal como un anticuerpo o una protefna de 5 union biespecffica proporcionada en el presente documento, la CI50 puede ser indistinguible de la CE50.
"IGF-1R" o "IGF1R" se refiere al receptor para el factor de crecimiento 1 de tipo insulina (IGF-1, anteriormente conocido como somatomedina C). IGF-1R tambien se une y se activa por el factor de crecimiento 2 de tipo insulina (IGF-2). IGF1-R es un receptor tirosina cinasa, que tras la activacion por IGF-1 o IGF-2 se autofosforila. La 10 secuencia de aa del precursor de IGF-1R humano se proporciona en el Genbank n.° de acceso NP_000866 y se le asigna el ID de gen: 3480.
"IgG-(scFv)2" indica un PBA tetravalente que consiste en una IgG que tiene dos sitios de union a Fab N-terminal, comprendiendo cada uno en una cadena pesada de IgG y una cadena ligera de IgG, en el que el extremo C de cada 15 cadena pesada esta unido a un scFv que tiene un sitio de union compuesto por un dominio VH y un dominio VL. Cuando las CR de inmunoglobulina son las de una IgG1, el PBA se denomina IgGl-(scFv)2". Los PBA IgGl-(scFv)2 ejemplares son aquellos en los que los cuatro sitios de union comprenden dos sitios de union a anti-IGF-1R esencialmente identicos y dos sitios de union a anti-ErbB3 esencialmente identicos. Los 38 PBA tetravalentes expuestos a continuacion en la Descripcion Detallada bajo el subencabezado "PBA IGF-1R+ErbB3 ejemplares que 20 comprenden CR de IgG1" (vease tambien las figuras 5A y B), comprenden cada uno dos subunidades identicas unidas esencialmente identicas, comprendiendo cada subunidad una cadena pesada y una cadena ligera que estan unidas por disulfuro entre si, por ejemplo, M7-G1-M78 (SEQ ID NO:284 y SEQ ID NO:262), P4-G1-M1.3 (SEQ ID NO:226 y SEQ ID NO:204), y P4-G1-c8(SEQ ID NO:222 y SEQ ID NO:204), son realizaciones ejemplares de dichas protefnas IgG1-(scFv)2. Cuando las CR de inmunoglobulina son las de una IgG2, la protefna se denomina como 25 "IgG2-(scFv)2". Una protefna "IgG2-(scFv)2" ejemplar es ELI-7. Cuando las CR de inmunoglobulina son parcialmente de una IgG1 y parcialmente de otro isotipo de IgG, por ejemplo, una IgG2, la protefna se denomina, por ejemplo, como "IgG1/2-(scFv)2".
"CR de inmunoglobulina" o "CR de Ig" se refiere a las partes de una inmunoglobulina (es decir, un anticuerpo), fuera 30 de sus dominios variables. En ciertas realizaciones, una CR de inmunoglobulina comprende una "CR de inmunoglobulina de cadena pesada" y una "CR de inmunoglobulina de cadena ligera".
La "inhibicion" de una actividad biologica por una protefna de union se refiere a cualquier disminucion reproduciblemente detectable en la actividad biologica mediada por la protefna de union. En algunas realizaciones, 35 la inhibicion proporciona una disminucion estadfsticamente significativa de la actividad biologica, por ejemplo, una disminucion de aproximadamente el 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o el 100 % en la actividad biologica con respecto a la actividad biologica determinada en ausencia de la protefna de union.
"Aislado", en referencia a polinucleotidos, polipeptidos o protefnas, significa que el polinucleotido, polipeptido o 40 protefna se elimina sustancialmente de polinucleotidos, polipeptidos, protefnas u otras macromoleculas con las que este, o sus analogos, se producen en la naturaleza. Aunque el termino "aislado" no pretende requerir un grado especffico de pureza, tfpicamente, la protefna sera al menos aproximadamente un 75 % pura, mas preferiblemente al menos aproximadamente un 80 % pura, mas preferiblemente al menos aproximadamente un 85 % pura, mas preferiblemente al menos aproximadamente un 90 % pura, mas preferiblemente aun al menos aproximadamente un 45 95 % pura, y mucho mas preferiblemente al menos aproximadamente un 99 % pura.
"Kabat" junto con la designacion de las posiciones de secuencia de aa de inmunoglobulina indica que las posiciones de aa en una CR de cadena ligera (por ejemplo, dominio CL) estan numeradas de acuerdo con el sistema de numeracion del fndice Kabat (vease Kabat et al., 1991., op. cit).
50
"Unido a" se refiere al enlace directo o indirecto o la conexion de, en el contexto, aa o nucleotidos. Un "enlace indirecto" se refiere a un enlace que esta mediado a traves de un enlazador o un dominio, que comprende, por ejemplo, uno o mas aa o nucleotidos. Un "enlace directo" o "unido directamente" cuando se refiere a dos segmentos polipeptfdicos se refiere a la presencia de enlace covalente entre los dos segmentos polipeptfdicos, por ejemplo, los 55 dos segmentos polipeptfdicos se unen contiguamente sin secuencias intermedias.
"Enlazador" se refiere a uno o mas aa que conectan dos dominios o regiones juntas. Un enlazador puede ser flexible para permitir que los dominios esten conectados por el enlazador para formar una estructura tridimensional apropiada permitiendo de este modo que tengan la actividad biologica requerida. Un enlazador que conecta el VH y
el VL de un scFv se denomina en el presente documento como un "enlazador scFv". Un enlazador que conecta el extremo N de un dominio VH o el extremo C del dominio CH3 a un segundo dominio VH, por ejemplo, el de un scFv se denomina un "enlazador de conexion".
5 "Modulo" se refiere a una parte estructural y/o funcionalmente distinta de un PBA, tal sitio de union (por ejemplo, un dominio scFv o un dominio Fab) y el dominio constante de Ig. Los modulos proporcionados en el presente documento pueden reordenarse (recombinando secuencias que los codifican, ya sea recombinando acidos nucleicos o mediante sfntesis de novo completa o fraccionada de nuevos polinucleotidos) en numerosas combinaciones con otros modulos para producir una amplia variedad de PBA, por ejemplo, como se desvela en el presente documento. 10 Por ejemplo, un modulo "SF" se refiere al sitio de union "SF", es decir, que comprende al menos las CDR de los dominios SF VH y SF VL. Un modulo "C8" se refiere al sitio de union "C8".
"PBA" se refiere a un anticuerpo biespecffico polivalente, una protefna hfbrida artificial que comprende al menos dos restos o dominios de union diferentes y, por tanto, al menos dos sitios de union diferentes (por ejemplo, dos sitios de 15 union de anticuerpo diferentes), en el que una o mas de las pluralidades de los sitios de union estan unidas covalentemente, por ejemplo, a traves de enlaces peptfdicos, entre si. Un PBA preferido descrito aquf es un anti- IGF-1R + anti-ErbB3 PBA, que es un anticuerpo biespecffico polivalente que comprende uno o mas primeros sitios de union que se unen especfficamente a una protefna IGF-1R, por ejemplo, una protefna IGF-1R humana, Y uno o mas segundos sitios de union que se unen especfficamente a una protefna ErbB3, por ejemplo, una protefna ErbB3 20 humana. Un PBA anti-IGF-1R + anti-ErbB3 se denomina asf independientemente de las orientaciones relativas de los sitios de union a anti-IGF-1R y anti-ErbB3 en la molecula, mientras que cuando el nombre del PBA comprende dos antfgenos separados por una barra (/), el antfgeno a la izquierda de la barra es amino terminal al antfgeno a la derecha de la barra. Un PBA puede ser una protefna de union bivalente, una protefna de union trivalente, una protefna de union tetravalente o una protefna de union con mas de 4 sitios de union. Un ejemplo de PBA es un 25 anticuerpo biespecffico tetravalente, es decir, un anticuerpo que tiene 4 sitios de union, pero se une a solo dos antfgenos o epftopos diferentes. Los anticuerpos biespecfficos ejemplares son PBA tetravalentes "anti-IGF-1R/anti- ErbB3" y PBA "anti-ErbB3/anti-IGF-1R". Tfpicamente, los sitios de union N-terminal de un PBA tetravalente son Fab y los sitios de union C-terminales son scFv.
30 "Porcentaje identico" o "% identico" se refiere a dos o mas secuencias o subsecuencias de acido nucleico o polipeptido que son iguales (100 % identicas) o tienen un porcentaje especificado de residuos nucleotfdicos o de aa que son iguales, cuando las dos secuencias se alinean para una correspondencia maxima y se comparan. Para alinear para una correspondencia maxima, se pueden introducir espacios en una de las secuencias que se comparan. Lo residuos de aa o nucleotidos en las posiciones correspondientes se comparan y se cuantifican. 35 Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo residuo que la posicion correspondiente en la segunda secuencia, entonces las secuencias son identicas en esa posicion. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias (por ejemplo,% de identidad = n.° de posiciones identicas/n.° total de posiciones (por ejemplo, posiciones superpuestas) x 100). En ciertas realizaciones, las dos secuencias tienen la misma longitud. La determinacion de que una secuencia es un % 40 medido identico con otra secuencia puede determinarse usando un algoritmo matematico. Un ejemplo no limitante de un algoritmo matematico utilizado para dicha comparacion de dos secuencias se incorpora en el programa ALIGN (version 2.0) que es parte del paquete de software de alineamiento de secuencias de GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN, por ejemplo, para comparar secuencias de aa, se puede usar una tabla de residuos de peso PAM120, una penalizacion de longitud de hueco de 12 y una penalizacion de hueco de 4. Se conocen bien en la 45 tecnica algoritmos adicionales para el analisis de secuencias y muchos estan disponibles en lfnea.
"Porcion" o "fragmento" (por ejemplo, de un dominio) de un resto de referencia se refiere a una parte discreta del resto de referencia completo (por ejemplo, dominio, por ejemplo, un dominio de origen natural) que es al menos, o como mucho el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, o el 99 % del tamano del resto 50 de referencia.
"Enlazador scFv" se refiere a un dominio peptfdico o polipeptido interpuesto entre los dominios VL y VH de un scFv. Los enlazadores scFv preferiblemente permiten la orientacion de los dominios VL y VH en una conformacion de union al antfgeno. En una realizacion, un enlazador scFv comprende o consiste en un enlazador peptfdico o 55 polipeptido que comprende solamente glicinas y serinas (un "enlazador Gly-Ser"). En ciertas realizaciones, un enlazador scFv comprende un enlace disulfuro.
"Protefna scFv" se refiere a una protefna de union que consiste en un unico polipeptido que comprende un dominio variable de cadena ligera (VL) y un dominio variable de cadena pesada (VH), en la que cada dominio variable se
deriva de los mismos o diferentes anticuerpos. Las protefnas scFv comprenden tfpicamente un enlazador scFv interpuesto entre el dominio VH y el dominio VL. Se conocen en la tecnica las protefnas ScFv y se describen, por ejemplo, en la Pat. de Estados Unidos N.° 5.892.019.
5 "Similitud" o "similitud porcentual" en el contexto de dos o mas secuencias polipeptfdicas, se refieren a dos o mas secuencias o subsecuencias que tienen un porcentaje especificado de residuos de aa que son iguales o sustituidos de forma conservadora cuando se comparan y se alinean para una correspondencia maxima. A modo de ejemplo, una primera secuencia de aa puede considerarse similar a una segunda secuencia de aa cuando la primera secuencia de aa es identica al menos en un 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 % o incluso en un 95 % o sustituido 10 de manera conservadora, a la segunda secuencia de aa cuando se compara con un numero igual de aa como el numero contenido en la primera secuencia, o cuando se comparan con una alineacion de polipeptidos que se ha alineado por un programa de similitud informatico conocido en la tecnica. Estos terminos son tambien aplicables a dos o mas secuencias de polinucleotidos.
15 "Enlace especffico", "se une especfficamente", "union selectiva" y "se une selectivamente", asf como "se une especfficamente", "se une selectivamente", "cuando se refiere a la union de un sitio de union a su epftopo diana o una combinacion de sitios de union a sus epftopos diana", significa que el sitio o sitios de union muestran una union inmunoespecffica al epftopo o epftopos diana. Un sitio de union que se une especfficamente a un epftopo muestra una afinidad apreciable por un epftopo diana y, generalmente, no muestra reactividad cruzada con otros epftopos ya 20 que no muestra afinidad apreciable a ningun epftopo no relacionado y preferiblemente no muestra afinidad por ningun epftopo no relacionado que es igual a, mayor que, o dentro de dos ordenes de magnitud menores que la afinidad para el epftopo diana. "Apreciable" o union preferida incluye la union con una constante de disociacion (Kd) de 10'8, 10'9 M, l0'10, 10-11, 10-12 M, 10'13 M o un valor de Kd incluso inferior. Cabe apreciar que los valores inferiores para Kd (constante de disociacion) indican una mayor afinidad de union, por lo tanto, una Kd de 10-7 es un valor de 25 Kd mayor que una Kd de 10-8, pero indica una afinidad de union inferior que una Kd de 10-8). Las constantes de disociacion con valores de aproximadamente 10-7 M, e incluso tan bajas como aproximadamente 10-8 M, estan en el extremo alto de las constantes de disociacion adecuadas para los anticuerpos terapeuticos. Las afinidades de union pueden indicarse por un intervalo de constantes de disociacion, por ejemplo, de 10-6 a 10-12 M, de 10-7 a 10-12 M, de 10-8 a 10-12 M o mejores (es decir, una constante de disociacion de valor inferior). Las constantes de disociacion en 30 el intervalo nanomolar (10-9 M) a picomolar (10-12 M) o inferior son tfpicamente mucho mas utiles para los anticuerpos terapeuticos. Las constantes de disociacion adecuadas son Kd de 50 nM o menos (es decir, una afinidad de union de 50 nM o superior, por ejemplo, una Kd de 45 nM) o Kd de 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 1 nm, 100 pM, 10 pM o 1 pM o menos. La union especffica o selectiva puede determinarse de acuerdo con cualquier medio reconocido en la tecnica para determinar dicha union, incluyendo, por ejemplo, de acuerdo con el analisis de 35 Scatchard y/o ensayos de union competitiva.
Anticuerpos biespecfficos polivalentes
Se proporcionan en el presente documento anticuerpos biespecfficos polivalentes ("PBA"), que pueden ser 40 anticuerpos monoclonales aislados. Los PBA de acuerdo con la invencion comprenden al menos dos sitios de union a anti-IGF-1R y al menos dos sitios de union a anti-ErbB3. En una realizacion preferida, el sitio de union a anti-IGF- 1R se une especfficamente a un IGF-1R humano y el sitio de union a anti-ErbB3 se une especfficamente a ErbB3 humano. En ciertas realizaciones, el PBA comprende dos pares de cadenas ligeras pesadas que se asocian entre sf para formar una unica protefna, en el que cada par de cadenas pesada-ligera comprende un sitio de union a anti- 45 IGF-1R y un sitio de union a anti-ErbB3. En ciertas realizaciones, el sitio de union a anti-IGF-1R y el sitio de union a anti-ErbB3 de un primer par de cadenas pesada-ligera estan conectadas a traves de una CR de inmunoglobulina que se asocia con la CR de inmunoglobulina de otro par de cadenas pesada-ligera (por ejemplo, por enlaces disulfuro) para formar, por ejemplo, una unica protefna de tipo IgG. Un PBA preferido como se describe en el presente documento tiene propiedades ventajosas, tales como la capacidad de inhibir la proliferacion de celulas 50 tumorales y de reducir o estabilizar el crecimiento tumoral de forma equivalente a o de forma mas potente que su resto de union aislado a anti-IGF-1R o su resto de union aislado a anti-ErbB3, y en ciertas realizaciones, la capacidad de inhibir cualquiera o tanto la invasividad tumoral como la metastasis tumoral. Un PBA ejemplar descrito en el presente documento puede inhibir cualquiera o ambas de la transduccion de senales mediada por IGF-1R y ErbB3, tal como la fosforilacion de IGF-1R, ErbB3 y AKT, de forma equivalente a o mas potentemente que su resto 55 aislado de union aislado a anti-IGF-1R o su resto de union aislado a anti-ErbB3. Un PBA ejemplar (i) inhibira el crecimiento de celulas tumorales, por ejemplo, en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o mas; o (ii) inhibira la fosforilacion de IGF-1r, ErbB3 o Akt, por ejemplo, en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o mas, por ejemplo, a una extension similar o de forma mas potente que cualquiera de su resto de union aislado a anti-IGF-1R o sus resto de union aislado a anti-ErbB3, o tanto (i) como (ii). Un PBA
ejemplar (iii) sera estable, por ejemplo, sera al menos un 80 % monomerico en una solucion despues de 1, 2, 3, 4, 5 o mas dfas a 4 °C, temperatura ambiente o 37 °C, o (iv) tendra una Tm (por ejemplo, como se determina por DSF) de al menos 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C o mas, o tanto (iii) como (iv). Los PBA descritos en el presente documento pueden usarse, por ejemplo, para tratar un sujeto que tiene un cancer.
5
En ciertas realizaciones, la CR de inmunoglobulina de un PBA puede comprender la CR de una cadena pesada de IgG, que puede comprender una region Fc. Un dominio constante de inmunoglobulina puede existir como un par de cadenas pesada-ligera, cuya region Fc de cadena pesada puede comprender un dominio CH3 que se asocia (por ejemplo, por enlaces disulfuro) con el dominio CH3 de otro par de cadena ligera pesada-ligera de este tipo. El resto 10 de CR de inmunoglobulina puede comprender tambien un dominio CH2, un dominio bisagra y/o CH1. Como se describe adicionalmente en el presente documento, cada uno de un dominio CH1, bisagra, CH2 o CH3 de un PBA puede ser un dominio de origen natural (o de tipo silvestre), o puede diferir de un dominio de origen natural en una o mas sustituciones de aa (por ejemplo, sustituciones conservadoras), adiciones o supresiones, siempre que el dominio particular conserve su actividad biologica deseada, tal como cualquiera ambas de la actividad de asociacion 15 de CH3 y CL. Cuando estan presentes, los dominios CH1, bisagra, CH2 y CH3 estan preferiblemente en orden N a C-terminal ya que se producen naturalmente, es decir CH1, bisagra, CH2, CH3. Estos dominios pueden estar conectados, o unidos, entre sf directa o indirectamente. Un enlace indirecto es un enlace que esta mediado a traves de un enlazador de uno o mas aa. En una realizacion, cada dominio CH esta directamente unido a sus dominios adyacentes. Por consiguiente, en una realizacion, un dominio CH1 esta unido en su extremo C al extremo N de un 20 dominio bisagra, que esta unido en su extremo C al extremo N de un dominio CH2, que esta unido en su extremo C al extremo N de un dominio CH3.
De acuerdo con la invencion, los PBA comprenden al menos dos sitios de union a anti-IGF-1R y al menos dos sitios de union a anti-ErbB3, cada uno de los cuales se une espedficamente a IGF-1R o ErbB3, respectivamente. Por 25 ejemplo, un sitio de union puede ser un dominio Fab, un scFv, o un fragmento de un anticuerpo de dominio unico. Por ejemplo, los sitios de union a anti-IGF-1R pueden ser Fab y los sitios de union a anti-ErbB3 pueden ser scFv. Como alternativa, los sitios de union a anti-IGF-1R pueden ser scFv y los sitios de union a anti-ErbB3 pueden ser Fab. En otra realizacion, un sitio de union a anti-ErbB3 es un Fab y otro sitio de union a anti-ErbB3 es un scFv; en otra realizacion, un sitio de union a anti-IGF-1R es un Fab y otro sitio de union a anti-IGF-1R es un scFv. En algunas 30 realizaciones, un primer y un segundo Fab estan unidos al extremo N y al extremo C del dominio CR de inmunoglobulina, respectivamente. Tambien se describe en el presente documento, un primer y segundo scFv estan unidos al extremo N y al extremo C del dominio CR de inmunoglobulina, respectivamente. De acuerdo con la invencion, al menos un dominio Fab esta unido al extremo N de la CR de inmunoglobulina (por ejemplo, en la disposicion natural de Fab y las CR) y al menos un scFv esta unido al extremo C de la CR de inmunoglobulina. 35 Tambien se describe en el presente documento, al menos un scFv esta unido al extremo N de la CR de inmunoglobulina y al menos un Fab esta unido al extremo C de la CR de inmunoglobulina. Las disposiciones ejemplares de los anticuerpos biespedficos Fab y scFv y anti-IGF-1R y anti-ErbB3 se encuentran en la Tabla 4.
Tabla 4: Disposiciones anti-IGF-1R y anti-ErbB3 ejemplares en PBA
Union al extremo N de la CR de inmunoglobulina
scFv anti- IGF-1R
Fab anti- IGF-1R scFv anti- ErbB3 Fab anti- ErbB3
Union al extremo C de la CR de inmunoglobulina
scFv anti- IGF-1R sf
Fab anti- IGF-1R
scFv anti- ErbB3
sf
Fab anti- ErbB3
40
En ciertas realizaciones, la CR de inmunoglobulina de un PBA comprende un dominio CH1 que esta unido a un primer dominio variable de cadena pesada (VH). Por ejemplo, el dominio CH1 puede estar unido en el extremo N al extremo C de un primer dominio VH.
45 En ciertas realizaciones, la CR de inmunoglobulina de un PBA comprende un CH3 que esta unido a un segundo dominio VH. Cuando se hace referencia al primer y segundo sitios de union de un PBA basado en IgG (por ejemplo, derivado de o que comprende al menos parte de la CR de e IgG) proporcionado en el presente documento, el "primer" sitio de union se refiere al sitio de union que esta situado en el extremo N con respecto al resto de la CR de
inmunoglobulina, mientras que el "segundo" sitio de union es el sitio de union que se encuentra en el extremo C con respecto al resto de la CR de inmunoglobulina. Por ejemplo, un dominio CH3 puede estar unido en su extremo C al extremo N de un segundo dominio VH. El dominio CH3 puede estar unido en su extremo C al extremo N de un enlazador, cuyo enlazador esta unido en su extremo C al extremo N del segundo dominio VH. Tal enlazador puede 5 ser util para proporcionar flexibilidad entre la region constante de inmunoglobulina constante y el segundo dominio VH, de tal manera que se puede obtener una estructura tridimensional apropiada para permitir que la protefna tenga una actividad biologica.
En ciertas realizaciones, un PBA comprende dos sitios de union que son sitios de union al antfgeno como se 10 encuentran tfpicamente en los anticuerpos (es decir, comprende dos Fab). Tales PBA comprenden normalmente dos cadenas ligeras, en los que cada cadena ligera comprende un dominio variable (VL) de cadena ligera que se asocia con (por ejemplo, mediante union a disulfuro) el dominio VH de cada una de dos cadenas pesadas, para formar dos sitios de union. El dominio VL puede estar unido a un dominio de cadena ligera constante (CL) y formar una region Fab de cadena ligera. Por ejemplo, un dominio VL puede estar unido en su extremo C al extremo N de un dominio 15 CL. En realizaciones en las que el primer y el segundo sitios de union son Fab, el PBA tiene dos cadenas ligeras diferentes, denominadas como una primera y una segunda cadenas ligeras, en las que la primera y la segunda cadenas ligeras comprenden un primer y segundo dominio VL, respectivamente, y opcionalmente un primer y un segundo dominio CL, respectivamente, y se asocian (por ejemplo, se dimerizan) con el primer y el segundo dominio VH y opcionalmente un primer y un segundo dominio CH1, respectivamente.
20
De acuerdo con la invencion, el dominio VH de cada scFv esta unido a un enlazador scFv, que esta unido a un dominio VL, y un dominio VH y un dominio VL asociados entre si para formar un sitio de union a antfgeno. En una realizacion, un dominio VH esta unido en su extremo C al extremo N de un enlazador scFv, que esta unido en su extremo C al extremo N de un dominio VL. En realizaciones en las que un scFv esta unido al extremo N de una CR 25 de inmunoglobulina y un scFv esta unido a su extremo C, el extremo N de la CR de inmunoglobulina esta unido a un primer dominio VH, que esta unido a un primer ScFv, que esta unido a un primer dominio VL, y el primer dominio VH y el primer dominio Vl forman el primer sitio de union; y el extremo C de la CR de inmunoglobulina esta unido a un segundo dominio VH, que esta unido a un segundo enlazador scFv, que esta unido a un segundo dominio VL, y el segundo dominio VH y el segundo dominio VL forman el segundo sitio de union y dos CR de inmunoglobulina de 30 este tipo estan dimerizados o asociados de otro modo (por ejemplo, por al menos un enlace, por ejemplo, un enlace disulfuro o un enlace van der Waals) para formar una unica protefna tetravalente.
En realizaciones preferidas, la CR de inmunoglobulina es una CR de inmunoglobulina humana, es decir, consiste esencialmente en una secuencia de aa obtenida del repertorio de inmunoglobulina humana. La CR de 35 inmunoglobulina puede ser la de cualquier isotipo, clase o subclase de inmunoglobulina. En una realizacion, una CR de inmunoglobulina es una CR de IgG, tal como CR de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En ciertas realizaciones, la CR es un hfbrido que esta constituido por al menos dos clases o subclases diferentes o tipos de inmunoglobulinas. Por ejemplo, una CR de inmunoglobulina puede tener un dominio de IgG1 y uno o mas dominios diferentes de una protefna IgG4. Como se describe adicionalmente en el presente documento, en ciertas realizaciones, un dominio 40 (por ejemplo CH1, bisagra, CH2 o CH3) dentro de la CR de inmunoglobulina puede ser principalmente de un isotipo de inmunoglobulina, pero puede tener una o mas mutaciones de aa (por ejemplo, sustitucion, adicion o delecion), por ejemplo, para proporcionar a la CR de inmunoglobulina mutada un atributo de otro tipo o clase de CR de inmunoglobulina.
45 En ciertas realizaciones, un PBA tiene una estructura IgG-(scFv)2. Tales protefnas comprenden un anticuerpo IgG que tiene dos primeros sitios de union, a los que esta unido un scFv que tiene un segundo sitio de union, por ejemplo, a cada uno de los dos extremos C de la protefna IgG. Un IgG-(scFv)2 ejemplar es un IgG1-(scFv)2, en el que la IgG es una IgG1.
50 En ciertas realizaciones, un PBA comprende una cadena pesada que tiene la estructura representada por scFv-Fc- scFv y el PBA puede tener la estructura (scFv-Fc-scFv)2. La Fc puede ser una region Fc que comprende una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. En ciertas realizaciones, dichas protefnas no comprenden un dominio CH1 o un dominio CL.
55 En una realizacion, un PBA comprende dos pares de cadenas pesada-ligera identicas que forman una molecula de tipo IgG, en el que cada par comprende un resto de union que es un Fab anti-IGF-1R y otro resto de union que es un ScFv anti-ErbB3 y en el que los dos restos de union estan conectados a traves de una CR de inmunoglobulina, que comprende en un orden N-terminal a C-terminal un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. El scFv puede estar unido al dominio CH3 a traves de un enlazador. En una realizacion ejemplar, un PBA comprende dos
cadenas pesadas identicas que forman un dfmero y dos cadenas ligeras identicas, en las que cada cadena ligera se asocia a una cadena pesada, y en la que cada cadena pesada comprende: un primer dominio VH que esta unido en su extremo C al extremo N de un dominio CH1, cuyo dominio CH1 esta unido en su extremo C al extremo N de un dominio bisagra, cuyo dominio bisagra esta unido en su extremo C al extremo N de un dominio CH2, cuyo dominio 5 CH2 esta unido en su extremo C al extremo N de un dominio CH3, cuyo dominio CH3 esta unido en su extremo C al extremo N de un enlazador, cuyo enlazador esta unido en su extremo C al extremo N de un segundo dominio VH, cuyo segundo dominio VH esta unido en su extremo C al extremo N de un enlazador scFv, cuyo enlazador scFv esta unido en su extremo C al extremo N de un segundo dominio VL, cuyo segundo dominio VL se asocia al segundo dominio VH para formar el segundo sitio de union; y en el que cada cadena ligera comprende un primer dominio VL 10 que esta unido en su extremo C al extremo N de un dominio CL, en el que el primer dominio VH y el primer dominio Vl forman el primer sitio de union. En una realizacion, el primer sitio de union es un sitio de union a anti-IGF-IR y el segundo sitio de union es un sitio de union a anti-ErbB3. En otra realizacion, el primer sitio de union es un sitio de union a anti-ErbB3 y el segundo sitio de union es un sitio de union a anti-IGF-IR.
15 Tambien descrito en el presente documento, un PBA comprende un sitio de union a IGF-1R que comprende una VHCDR3 que consiste en la secuencia consenso de SEQ ID NO:304 y opcionalmente una VHCDRl y/o una VHCDR2 que consiste en las secuencias consenso de SEQ ID NOs:302 y 303, respectivamente (vease la figura 1). Tambien descrito en el presente documento, el ultimo aa X (C-terminal) de SEQ ID NO:304 no es I. Un PBA tambien puede comprender un sitio de union a anti-IGF-IR que comprende una VLCDR3 que consiste en la secuencia 20 consenso de SEQ ID NO:307 o 308, y opcionalmente cualquiera o ambas de una VLCDR1 y una VLCDR2 que consiste en las secuencias de SEQ ID NOs:305 y 306, respectivamente (vease la figura 2). Tambien descrito en el presente documento, un PBA comprende un sitio de union a anti-IGF-IR que comprende una VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 que consisten en las secuencias consenso de las SEQ ID NOs: 302, 303, 304, 305, 306 y 307 (o 308), respectivamente.
25
Tambien descrito en el presente documento, un PBA comprende un sitio de union a anti-ErbB3 que comprende una VHCDR3 que consiste en la secuencia consenso de la SEQ ID NO:311, y opcionalmente una VHCDR1 y/o una VHCDR2 que consisten en las secuencias de las SEQ ID NOs:309 y 310, respectivamente (vease la figura 3). Un PBA tambien puede comprender un sitio de union a anti-IGF-1R que comprende una VLCDR3 que consiste en la 30 secuencia consenso de la SEQ ID NO:314 o 315, y opcionalmente una VLCDR1 y/o una VLCDR2 que consiste en las secuencias de las SEQ ID NOs:312 y 313, respectivamente (vease la figura 4). Tambien descrito en el presente documento, un PBA comprende un sitio de union a anti-IGF-1R que comprende una VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2 y VlCdR3 que consiste en las secuencias de las SeQ ID NOs:309, 310, 311, 312, 313 y 314 (o 315), respectivamente.
35
Las secuencias de las SEQ ID NOs:302-315 se exponen a continuacion:
CDR anti-IGF-1R:
40 secuencia consenso de VHCDR1: GFX1FSX2YPMH (SEQ ID NO:302)
secuencia consenso de VHCDR2: ISX1X2GGATX3YADSVKG (SEQ ID NO:303) secuencia consenso de VHCDR3: DFYX1X2LTGNAFDX3 (SEQ ID NO:304) secuencia de VLCDR1: RASQGISSYLA (SEQ ID NO:305) secuencia consenso de VLCDR2: AX1STX2QS (SEQ ID No:306)
45 secuencia consenso de VLCDR3: QQYX1X2X3PLT (SEQ ID NO:307) y QQYWX1X2PLT (SEQ ID NO:308)
CDR anti-ErbB3:
secuencia VHCDR1: GFTFDDYAMH (SEQ ID NO:309)
50 secuencia consenso de VHCDR2: ISWX1SGSX2GYADSVKG (SEQ ID NO:310)
secuencia consenso de VHCDR3: DLGX1X2QWX3X4GFDY (SEQ ID NO:311) secuencia de VLCDR1: QGDSLRSYYAS (SEQ ID NO:312) secuencia de VLCDR2: GKNNRPS (SEQ ID NO:313)
secuencia consenso de VLCDR3: X1SRDX2X3GX4X5WV (SEQ ID NO:314) y X1SRDX2PGX3X4WV (SEQ 55 ID NO:315)
Cada aa "X" seguido de un numero es un aa variable, que representa independientemente cualquier aa, tal como cualquier aa situado en una posicion correspondiente en las figuras 1, 2, 3 o 4. Los aa ejemplares para X1-X2 de la SEQ ID NO:302, X1-X2 de la SEQ ID NO:303 y X1-X3 de la SEQ ID NO:304 se proporcionan en las posiciones
correspondientes en las secuencias de aa en la figura 1. Los aa ejemplares para X1-X2 de la SEQ ID NO:306, X1- X3 de la SEQ ID NO:307 y X1-X2 de la SEQ ID NO:308 se proporcionan en las posiciones correspondientes en las secuencias de aa en la figura 2. Los aa ejemplares para X1-X2 de la SEQ ID NO:310 y X1-X4 de la SEQ ID NO:311 se proporcionan en las posiciones correspondientes en las secuencias de aa en la figura 3. Los aa ejemplares para 5 X1-X5 de la SEQ ID nO:314 o X1-X4 de la SEQ ID NO:315 se proporcionan en las posiciones correspondientes en las secuencias de aa en la figura 4.
Un PBA ejemplar comprende un sitio de union a anti-IGF-1R que comprende una VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 que consiste en la secuencia de las SeQ ID NOs:302, 303, 304, 305, 306, y 307 (o 10 308), respectivamente, y el sitio de union a anti-ErbB3 que comprende una VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3, VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 que consiste en las secuencias de las sEq ID NOs:309, 310, 311, 312, 313, y 314 (o 315), respectivamente.
Los PBA ejemplares comprenden una o mas CDR de una o mas de las VR proporcionadas en las figuras 1-4. En 15 ciertas realizaciones, un sitio de union a anti-IGF-1R comprende 1, 2 o 3 CDR de uno de los dominios VH de la figura 1 y/o 1, 2 o 3 CDR de uno de los dominios VL de la figura 2. Por ejemplo, un resto de union a anti-IGF-1R puede comprender las CDR1, CDR2 y/o CDR3 de la SEQ ID NO:11 y/o las CDR1, CDR2 y/o CDR3 de la SEQ ID NO:35 (CDR de 16F). En ciertas realizaciones, un resto de union a anti-IGF-1R comprende una combinacion de CDR de las figuras 1 y 2, con la condicion de que (es decir, en el que) (i) el resto de union no sea el de 16F, o (ii) 1, 20 2, 3, 4, 5 o 6 de las CDR de las entidades de union a anti-IGF-1R no esten presentes en la entidad de union a anti- IGF-1R de 16F, o (iii) los dominios VH o VL de la entidad de union a anti-IGF-1R no sean identicos a los dominios VH o VL correspondientes en 16F, respectivamente.
Los PBA ejemplares comprenden una entidad de union a anti-IGF-1R que comprende un dominio VH que 25 comprende las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de una secuencia en la figura 1, por ejemplo, una de las SEQ ID Nos:8, 9, 10 y 11 (la ubicacion de estas CDR se muestra en la figura 1). Los PBA tambien pueden comprender una entidad de union a anti-IGF-1R que comprende un dominio VL que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de una de las SEQ ID Nos:32, 33, 34 y 35 (la ubicacion de estas CDR se muestra en la figura 2). En ciertas realizaciones, los PBA comprenden una entidad de union a anti-IGF-1R 30 que comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de una de las SEQ ID Nos:8, 9, 10 y 11, y un dominio VL que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de una de las SEQ ID Nos:32, 33, 34 y 35. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti-IGF- 1R comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aa VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEQ ID No:8 y un dominio VL que comprende las secuencias de aa VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de la SEQ ID No:32. En 35 realizaciones particulares, un dominio de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aa VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEQ ID No:9 y un dominio VL que comprende las secuencias de aa VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de la SEQ ID No:33. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aa VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEQ ID No: 10 y un dominio VL que comprende las secuencias de aa VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de la SEQ 40 ID No: 34 En realizaciones particulares, un dominio de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aa VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEQ ID No:11 y un dominio VL que comprende las secuencias de aa VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de la SEQ ID No:35. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aa VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEQ ID No:8 y un dominio VL que comprende las secuencias de aa VLCDR1, VLCDR2 y 45 VLCDR3 de la SEQ ID No:33. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aa VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEQ ID No: 10 y un dominio VL que comprende las secuencias de aa VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de la SEQ ID No: 32
En ciertas realizaciones, un sitio de union a anti-ErbB3 comprende 1, 2 o 3 CDR de uno de los dominios VH de la 50 figura 3 y/o 1, 2 o 3 CDR de uno de los dominios VL de la figura 4. Por ejemplo, un resto de union a anti-ErbB3 puede comprender las CDR1, CDR2 y/o CDR3 de la SEQ ID NO:143 y/o las cDr1, CDR2 y/o CDR3 de la SEQ ID NO:175 (CDR de 16F). En ciertas realizaciones, un resto de union a anti-ErbB3 comprende una combinacion de CDR de las figuras 1 y 2, con la condicion de que (es decir, en el que) (i) el resto de union no sea el de 16F, o (ii) 1, 2, 3, 4, 5 o 6 de las CDR de las entidades de union a anti-ErbB3 no esten presentes en la entidad de union a anti- 55 ErbB3 de 16F, o (iii) los dominios VH o VL de la entidad de union a anti-ErbB3 no sean identicos a los dominios VH o VL correspondientes en 16F, respectivamente.
Los PBA ejemplares comprenden una entidad de union a anti-ErbB3 que comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de una secuencia en la figura 3, por ejemplo, una de las
SEQ ID Nos: 134-143 (la ubicacion de estas CDR se proporciona en la figura 3). Los PBA tambien pueden comprender una entidad de union a anti-ErbB3 que comprende un dominio VL que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de una de las SEQ ID Nos:166-175 (la ubicacion de estas CDR se proporciona en la figura 4). En ciertas realizaciones, los PBA comprenden una entidad de union a anti-ErbB3 que comprende un 5 dominio vH que comprende las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de una de las SEQ iD Nos:134- 143, y un dominio VL que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de una de las SEQ ID NOs:166-175. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aa VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEQ ID No: 134 y un dominio VL que comprende las secuencias de aa VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de la SEQ ID No:166. En realizaciones particulares, 10 un dominio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aa VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEQ ID No:135 y un dominio VL que comprende las secuencias de aa VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de la SEQ ID No:167. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aa VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEQ ID No:136 y un dominio VL que comprende las secuencias de aa VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de la SEQ ID No:168. En realizaciones 15 particulares, un dominio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aa VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEQ ID No:137 y un dominio VL que comprende las secuencias de aa VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de la SEQ ID No:169. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aa VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEQ ID No:138 y un dominio VL que comprende las secuencias de aa VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de la SEQ ID No:. 170. 20 En realizaciones particulares, un dominio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aa VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEQ ID No:139 y un dominio VL que comprende las secuencias de aa VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de la SEQ ID No:171. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aa VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEQ ID No: 140 y un dominio VL que comprende las secuencias de aa VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de la 25 SEQ ID No: 172. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aa VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEQ ID No:141 y un dominio VL que comprende las secuencias de aa VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de la SEQ ID No:. 173. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aa VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEQ ID No: 142 y un dominio VL que comprende las secuencias de aa 30 VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de la SEQ ID No: 174. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti- ErbB3 comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aa VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEQ ID No: 143 y un dominio VL que comprende las secuencias de aa VLCDR1, VLCDR2 y VLcDr3 de la SEQ ID No: 175. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende las secuencias de aa VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de la SEQ ID No:136 y un dominio VL que comprende las 35 secuencias de aa VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de la SEQ ID No:169.
Los sitios de union tambien pueden comprender una o mas CDR de las VR de las figuras 1-4, en los que 1, 2 o 3 aa se han cambiado, por ejemplo, sustituido, anadido o eliminado, con la condition de que los sitios de union sean todavfa capaces de unirse especfficamente a su diana.
40
En ciertas realizaciones, un sitio de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende la siguiente secuencia consenso:
EV QLLQSGGGLV QPGGSLRLSC AASGFX1FSX2YPMHWVRQAPGKGLEWVX3SISX4X5 GGATX6YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRX7EDTAVYYCAKDFYX8X9LTGNA
FDX1OWOOGTX11VTVSS (SEQ ID NO:l; las CDR estSn subrayadas)
45
Esta secuencia consenso se obtuvo alineando las secuencias VH de 24 sitios de union a anti-IGF-1R de alta afinidad. El alineamiento se muestra en la figura 1.
50 En ciertas realizaciones, cada uno de los aa X1-X11 de la SEQ ID NO: representa independientemente cualquier aa. En otras realizaciones, cada uno de los aa X1-X11 de SEQ ID NO:1 representa independientemente cualquier aa expuesto en las posiciones en cualquiera de las secuencias en la figura 1. En una realization de este tipo, X1 es T, X2 es V, X3 es S, X4 es S, X5 es S, X6 es R, X7 es A, X8 es D, X9 es I, X10 es I y X11 es T (16F de cadena pesada SF; SEQ ID NO:11). Las secuencias VH de IGF-1R ejemplares se exponen como las SEQ ID NOs:8-31.
En ciertas realizaciones, un dominio VH de un sitio de union a anti-IGF-1R comprende la secuencia consenso de la SEQ ID NO:1 con la condicion de que (es decir, en la que) la secuencia no sea la de 16F de cadena pesada SF, por
ejemplo, difiriendo de esta en al menos un aa. En ciertas realizaciones, un dominio VH de un sitio de union a anti- IGF-1R comprende la secuencia consenso de la SEQ ID NO:1 con la condicion de que (es decir, en la que) X1 no sea T, X2 no sea V, X6 no sea R, X8 no sea D o X10 no sea I. Las secuencias VH anti-IGF-1R ejemplares se exponen como las SEQ ID NOs:8-10 y 12-31.
5
En ciertas realizaciones, un sitio de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VL que comprende la siguiente secuencia consenso:
D[OXnOSPSSESASX2GDRVTIT( RAS0GISSYI,AWY00KPGKAPKI,I,1YAX3STX40SG VI>SRIS(;SC;S(;TX5l'H:HSSLOPI'DX6X7TYYCOOYXXX9Xl()l>i:H'CiG(iTKVI-IK(Sl-0 ID NO:2; las CDR estan subrayadas)
10
Esta secuencia consenso se obtuvo alineando las secuencias VL de aproximadamente 100 sitios de union a anti- IGF-1R de alta afinidad. El alineamiento se muestra en la figura 2.
En ciertas realizaciones, cada uno de los aa X1-X10 de la SEQ ID NO:2 representa independientemente cualquier 15 aa. En otras realizaciones, cada uno de los aa X1-X10 de la SEQ ID NO:2 representa independientemente cualquier aa expuesto en las posiciones en cualquiera de las secuencias en la figura 2. En tal realizacion, X1 es M, X2 es T, X3 es A, X4 es L, X5 es D, X6 es F, X7 es A, X8 es F, X9 es T y X10 es F (cadena ligera kappa SF 16F; SEQ ID NO:35). Las secuencias VL de IGF-1R ejemplares se exponen como las SEQ ID NOs:32-133.
20 En ciertas realizaciones, un dominio VL de un sitio de union a anti-IGF-1R comprende la secuencia consenso de la SEQ ID NO:2 con la condicion de que (es decir, en la que) la secuencia no sea la de 16F de cadena ligera SF, por ejemplo, difiriendo de esta en al menos un aa. En ciertas realizaciones, un dominio VL de un sitio de union a anti- IGF-1R comprende la secuencia consenso de la SEQ ID NO:2, con la condicion de que (es decir, en la que) X2 no sea T, X6 no sea F o X8 no sea F. Cuando X2 no es T, X6 no es F y/o X8 no es F, X2 puede ser L, X6 puede ser F 25 y/o X8 puede ser F, segun la secuencia consenso:
DI0XlT0SPSSLSASLGDRVTri(’RAS0GlSSYLAWY00KPGKAPKLLIYAX2STX30SGV PSRFSGSGSGTX4FTLTISSLOPEDSX5TYYCOOYWX6X7PLIIGGGTKVEIK (SEQ ID NO:3; las CDR estan subrayadas)
En ciertas realizaciones, un dominio VL de un sitio de union a anti-IGF-1R comprende la secuencia consenso de la 30 SEQ ID NO:3, en la que cada uno de los aa X1-X7 de la SEQ ID NO:3 representa independientemente cualquier aa. En otras realizaciones, cada uno de los aa X1-X7 de la SEQ ID NO:3 representa independientemente cualquier aa expuesto en las posiciones en cualquiera de las secuencias en la figura 2. Las secuencias VL de IGF-1R VL ejemplares se exponen como las SEQ ID NOs:32-34 y 36-133.
35 En ciertas realizaciones, un sitio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende la siguiente secuencia consenso:
X1VOLVX2SGGGLVOPGX3SLRLSC A ASGFTFDD Y AM 11W V ROAPGKOLEWVX4GIS W X5SGSX6GYADSVKGRFTISRDNAKNSLYI.OMNSLRX7EDTAX8YYCARDI.GX9X1QOW X11X12GFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID N():4; las CDR estan subrayadas)
40 Esta secuencia consenso se obtuvo alineando las secuencias VH de 32 sitios de union a anti-IGF-1R de alta afinidad. El alineamiento se muestra en la figura 3.
En ciertas realizaciones, cada uno de los aa X1-X12 de la SEQ ID NO:4 representa independientemente cualquier aa. En otras realizaciones, cada uno de los aa X1-X12 de la SEQ ID NO:4 representa independientemente cualquier 45 aa expuesto en las posiciones en cualquiera de las secuencias en la figura 3. En una realizacion de este tipo, X1 es Q, X2 es Q, X3 es G, X4 es A, X5 es N, X6 es I, X7 es P, X8 es V, X9 es Y, X10 es N, X11 es V y X12 es E (16F de cadena pesada C8; SEQ ID NO:143). Las secuencias VH de ErbB3 ejemplares se exponen como las SEQ ID NOs:134-165.
En ciertas realizaciones, un dominio VH de un sitio de union a anti-ErbB3 comprende la secuencia consenso de la SEQ ID NO:4, con la condicion de que (es decir, en la que) la secuencia no sea la de 16F de cadena pesada C8, por ejemplo, difiriendo de esta en al menos un aa. En ciertas realizaciones, un dominio VH de un sitio de union a anti- 5 ErbB3 comprende la secuencia consenso de la SEQ ID NO:4 con la condicion de que (es decir, en la que) el aa X7 no sea P o X8 no sea V. Cuando X7 no es P y/o X8 no es V, X7 puede ser A y/o X8 puede ser be L, segun la siguiente secuencia consenso:
X1VQI.VX2SGGGLVQPGX3SI-Rl-S( AASGITI DDYAM11WVRQAPGKGLEWVX4CilSW X5SGSX6GYADSVKGRITISRDNAKNSLYEOMNSLRAEDTAEYYCARDEGX7X8QWX9 X10GFDYWGOGTLVTVSS (SEQ ID NQ:5; las CDR estan subrayadas)
10
En ciertas realizaciones, un dominio VH de un sitio de union a anti-ErbB3 comprende la secuencia consenso de la SEQ ID NO:5, en la que cada uno de los aa X1-X10 de la SEQ ID NO:5 representa independientemente cualquier aa. En otras realizaciones, cada uno de los aa X1-X10 de la SEQ ID NO:5 representa independientemente cualquier aa expuesto en las posiciones en cualquiera de las secuencias en la figura 3. Las secuencias VH de ErbB3 15 ejemplares se exponen como las SEQ ID Nos:134-142 y 144-165.
En ciertas realizaciones, un sitio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VL que comprende la siguiente secuencia consenso:
SXIEETODPAVSVAI.GOTVRITCOGDSI.RSYYASWVOOICPGOAPVI.VIYGKNNRPSGIP
DRI SGSX2SGiNX3ASi:HTGAOAi:DEADYY( X4SRDX5X6GX7X8WVI GGGTKVTVXtX;
(SEQ ID NO:6; las CDR estan subrayadas)
20 '
Esta secuencia consenso se obtuvo alineando las secuencias VL de 35 sitios de union a anti-IGF-1R de alta afinidad. El alineamiento se muestra en la figura 4.
25 En ciertas realizaciones, cada uno de los aa X1-X9 de la SEQ ID NO:6 representa independientemente cualquier aa. En otras realizaciones, cada uno de los aa X1-X10 de la SEQ ID NO:6 representa independientemente cualquier aa expuesto en las posiciones en cualquiera de las secuencias en la figura 4. En una realizacion, X1 es Y, X2 es T, X3 es S, X4 es N, X5 es S, X6 es S, X7 es N, X8 es H, y X9 es L (16F de cadena ligera lambda C8; SEQ ID NO:175). Las secuencias VL de ErbB3 ejemplares se exponen como las SEQ ID NOs:166-200.
30
En ciertas realizaciones, un dominio VL de un sitio de union a anti-ErbB3 comprende la secuencia consenso de la SEQ ID NO:6, con la condicion de que (es decir, en la que) la secuencia no sea la de 16F de cadena ligera lambda C8, por ejemplo, difiriendo de esta en al menos un aa. En ciertas realizaciones, un dominio VL de un sitio de union anti-ErbB3 comprende la secuencia consenso de la SEQ ID NO:6 con la condicion de que (es decir, en la que) X6 no 35 sea S. Cuando X6 no es S, X6 puede ser P, segun la siguiente secuencia consenso:
SXIEI.TODPAVSVAI.GOTVRITCOGDSI.RSYYASWYOOKPGOAPVEVIYGKNNRPSGIP DRI;SGSX2SGNX3ASETITGAOAEDEADYY('X4SRDX5PGXftX7WVI:GGGTKVTVX8G (SEQ ID N():7; las CDR estan subrayadas)
En ciertas realizaciones, un dominio VL de un sitio de union a anti-ErbB3 comprende la secuencia consenso de la 40 SEQ ID NO:7, cada uno de los aa X1-X8 de la SEQ ID NO:7 representa independientemente cualquier aa. En otras realizaciones, cada uno de los aa X1-X8 de la SEQ ID NO:7 representa independientemente cualquier aa expuesto en las posiciones en cualquiera de las secuencias en la figura 4. Las secuencias VL de ErbB3 se exponen como las SEQ ID NOs:166-174 y 176-200.
45 Los dominio VH anti-IGF-1R ejemplares incluyen el dominio VH M57 (SEQ ID NO:8), el dominio VH M78 (SEQ ID NO:9), el dominio VH P4 (SEQ ID NO:10) y el dominio VH SF (SEQ ID NOs:11). Los dominio VL anti-IGF-1R ejemplares incluyen el dominio VL M57 (SeQ ID NO:32), el dominio VL M78 (SEQ ID NO:33), el dominio VL P4 (SEQ ID NO:34) y el dominio VL SF (SEQ ID NO:35).
Los dominios VH anti-ErbB3 ejemplares incluyen el dominio VH B60 (SEQ ID NO:134), el dominio VH B72 (SEQ ID NO:135), el dominio VH M27 (SEQ ID NO:136), el dominio VH M7 (SEQ ID NO:137), el dominio VH P1 (SEQ ID NO:138), el dominio VH M27 (SEQ ID NO:139), el dominio VH B69 (SEQ ID NO:140), el dominio VH P6 (SEQ ID 5 NO:141), el dominio VH M1.3 (SEQ ID NO:142), y el dominio VH C8 (SEQ ID NO:143). Los dominios VL anti-ErbB3 ejemplares incluyen el dominio VL B60 (SEQ iD NO:166), el dominio VL B72 (SEQ ID NO:167), el dominio VL M27 (SEQ ID NO:168), el dominio VL M7 (SEQ ID NO:169), el dominio VL P1 (SEQ ID NO:170), el dominio VL M27 (SEQ ID NO:171), el dominio VL B69 (SEQ ID NO:172), el dominio VH P6 (SEQ ID NO:173), el dominio VL M1.3 (SEQ ID NO:174), y el dominio VL C8 (SEQ ID NO:175).
10
Los sitios de union pueden comprender un dominio VH y un dominio VL que tienen el mismo nombre de modulo (por ejemplo, "M57", "M78" y "P4"), es decir, que son los dominios VH y VL de un anticuerpo de un sitio de union del mismo aislados originalmente, o pueden mezclarse y emparejarse. Por ejemplo, los restos de union a anti-IGF-1R pueden comprender: (i) el dominio VH del modulo M57 (SEQ ID NO:8) y el dominio VL del modulo M57 (SEQ ID 15 NO:32); el dominio VH del modulo M78 (SEQ ID NO:9) y el dominio VL del modulo M78 (SEQ ID NO:33); (iii) el dominio VH del modulo P4 (SEQ ID NO:10) y el dominio VL del modulo P4 (SEQ ID NO:34) o (iv) el dominio VH del modulo SF (SEQ ID NO:11) y el dominio VL del modulo SF (SEQ ID NO:35). Un resto de union a anti-ErbB3 puede comprender: (i) el dominio VH del modulo B60 (SEQ ID NO:134) y el dominio VL del modulo B60 (SEQ ID NO:166); (ii) el dominio VH del modulo B72 (SEQ ID NO:135) y el dominio VL del modulo B72 (SEQ ID NO:167); (iii) el 20 dominio VH del modulo M27 (SEQ ID NO:136) y el dominio VL del modulo M27 (SEQ ID NO:168); (iv) el dominio VH del modulo M7 (SEQ ID NO:137) y el dominio VL del modulo M7 (SEQ ID NO:169); (v) el dominio VH del modulo P1 (SEQ ID NO:138) y el dominio VL del modulo P1 (SEQ ID NO:170); (vi) el dominio VH del modulo M27 (SEQ ID NO:139) y el dominio VL del modulo M27 (SEQ ID NO:171); (vii) el dominio VH del modulo B69 (SEQ ID NO:140) y el dominio VL del modulo B69 (SEQ ID nO:172); (viii) el dominio VH del modulo P6 (SEQ ID nO:141) y el dominio 25 VL del modulo P6 (SEQ ID NO:173); (ix) el dominio VH del modulo M1.3 (SEQ ID NO:142) y el dominio VL del modulo M1.3 (SEQ ID NO:174); y (x) el dominio VH del modulo C8 (SEQ ID No:143) y el dominio VL del modulo C8 (SEQ ID NO:175).
Los restos de union de los PBA tambien pueden comprender dominios VH y VL mixtos o emparejados, es decir, un 30 resto de union puede comprender un dominio VH de un modulo y un dominio VL de otro modulo. Por ejemplo, un resto de union a IGF-1R puede comprender el dominio VH del modulo M57 (SEQ ID NO:8) y el dominio VL del modulo M78 (SEQ ID NO:33) o el dominio VH del modulo P4 (SEQ ID NO:10) y el dominio VL del modulo M57 (SEQ ID NO:32). Un resto de union a anti-ErbB3 puede comprender el dominio VH del modulo M27 (SEQ ID NO:136) y el dominio VL del modulo M7 (SEQ ID NO:169; vease, por ejemplo, el Ejemplo 7). Se prefieren los restos de union de 35 cadena mixta que se unen con alta afinidad a sus dianas.
Un PBA tambien puede comprender secuencias de aa que estan dentro de mas de una de las secuencias consenso VH IGF-1R (SEQ ID NO:1), VL IGF-1R (SEQ ID NO:2), VH ErbB3 (SEQ ID NO:4) y VL ErbB3 (SEQ ID NO:6) descritas en el presente documento, con la condicion de que el PBA se una especfficamente a IGF-1R y ErbB3. Por 40 ejemplo, un PBA puede comprender cualquiera de:
- un dominio VH de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:1 y un dominio VL IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:2;
- un dominio VH de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:1 y un dominio VH de ErbB3 que comprende la
45 SEQ ID NO:4;
- un dominio VH de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:1 y un dominio VL de ErbB3 que comprende la SEQ ID NO:6;
- un dominio VH de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:1, un dominio VL de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:2, y un dominio VH de ErbB3 que comprende la SEQ ID NO:4;
50 - un dominio VH de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:1, un dominio VL de IGF-1R que comprende la
SEQ ID NO:2, y un dominio VL de ErbB3 que comprende la SEQ ID NO:6;
- un dominio VH de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:1, un dominio VL de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:2, un dominio vH de ErbB3 que comprende la SEQ ID NO:4, y un dominio Vl de ErbB3 que comprende la SEQ ID NO:6;
55 - un dominio VL de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:2 y un dominio VH de ErbB3 que comprende la
SEQ ID NO:4;
- un dominio VL de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:2 y un dominio VL de ErbB3 que comprende la SEQ ID NO:6;
- un dominio VL de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:2, un dominio VH de ErbB3 que comprende la
SEQ ID NO:4, y un dominio VL de ErbB3 que comprende la SEQ ID NO:6; o
- un dominio VH de ErbB3 que comprende la SEQ ID NO:4 y un dominio VL de ErbB3 que comprende la SEQ ID NO:6;
5 en el que los aa variables son independientemente cualquier aa, o en el que los aa variables son independientemente cualquiera de los aa expuestos en la posicion correspondiente para cada una de estas secuencias consenso de las figuras 1-4, con la condicion de que el PBA se una especfficamente a IGF-1R y a ErbB3.
10 Un PBA tambien puede comprender secuencias de aa que estan dentro de mas de una de las secuencias consenso VH IGF-1R (SEQ ID NO:1), VL IGF-1R (SEQ ID NO:2), VH ErbB3 (SEQ ID NO:4) y VL ErbB3 (SEQ ID NO:6) descritas en el presente documento, con la condicion de que el PBA se una especfficamente a IGF-1R y ErbB3, con la condicion de que (es decir, en las que) el PBA no sea 16F. Por ejemplo, un PBA puede comprender secuencias de aa que estan dentro de mas de una de las secuencias consenso Vh IGF-1R (SEQ ID NO:1), VL IGF-1R (SEQ ID
15 NO:3), VH ErbB3 (SEQ ID NO:5) y VL ErbB3 (SEQ ID NOs:7) descritas en el presente documento, con la condicion de que se unan especfficamente a IGF-1R y ErbB3. Por ejemplo, un PBA puede comprender:
- un dominio VH de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO: 1 y un dominio VL de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:3;
20 - un dominio VH de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:1 y un dominio VH de ErbB3 que comprende la
SEQ ID NO:5;
- un dominio VH de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:1 y un dominio VL de ErbB3 que comprende la SEQ ID NO:7;
- un dominio VH de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:1, un dominio VL de IGF-1R que comprende la
25 SEQ ID NO:3, y un dominio VH de ErbB3 que comprende la SEQ ID NO:5;
- un dominio VH de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:1, un dominio VL de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:3, y un dominio VL de ErbB3 que comprende la SEQ ID NO:7;
- un dominio VH de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:1, un dominio VL de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:3, un dominio vH de ErbB3 que comprende la SEQ ID NO:5, y un dominio Vl de ErbB3 que
30 comprende la SEQ ID NO:7;
- un dominio VL de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:3 y un dominio VH de ErbB3 que comprende la SEQ ID NO:5;
- un dominio VL de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:3 y un dominio VL de ErbB3 que comprende la SEQ ID NO:7;
35 - un dominio VL de IGF-1R que comprende la SEQ ID NO:3, un dominio VH de ErbB3 que comprende la
SEQ ID NO:5, y un dominio VL de ErbB3 que comprende la SEQ ID NO:7; o
- un dominio VH de ErbB3 que comprende la SEQ ID NO:5 y un dominio VL de ErbB3 que comprende la SEQ ID NO:7;
40 en el que los aa variables son independientemente cualquier aa, o en el que los aa variables son independientemente cualquiera de los aa expuestos en la posicion correspondiente para cada una de estas secuencias consenso de las figuras 1-4, con la condicion de que el PBA se una especfficamente a IGF-1R y a ErbB3.
45 Los PBA ejemplares comprenden una entidad de union a anti-IGF-1R que comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aa en la figura 1, por ejemplo, la secuencia de aa de una de las SEQ ID Nos:8, 9, 10 y 11. Los PBA ejemplares tambien pueden comprender una entidad de union a anti-IGF-1R que comprende un dominio VL que comprende una secuencia de aa en la figura 2, por ejemplo, la secuencia de aa de una de las SEQ ID Nos:32, 33, 34 y 35. En ciertas realizaciones, los PBA comprenden una entidad de union a anti-IGF-1R que
50 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de una de las SEQ ID Nos:8, 9, 10 y 11 y un dominio VL que comprende la secuencia de aa de una de las SEQ ID Nos:32, 33, 34 y 35. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No:8 y un dominio VL que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No:32. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No:9 y un dominio
55 VL que comprende la secuencia de aa de la sEq ID No:33. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No: 10 y un dominio VL que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No:34. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No:11 y un dominio VL que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No:35. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti-IGF-1R comprende
un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No:8 y un dominio VL que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No:33. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti-IGF-IR comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No: 10 y un dominio VL que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No:32.
5
Los PBA ejemplares comprenden una entidad de union a anti-ErbB3 que comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de una de las SEQ ID Nos:134-143. Los PBA tambien pueden comprender una entidad de union a anti-ErbB3 que comprende un dominio VL que comprende la secuencia de aa de una de las SEQ ID Nos:166-175. En ciertas realizaciones, los PBA comprenden una entidad de union a anti-ErbB3 que comprende un dominio VH 10 que comprende la secuencia de aa de una de las SEQ ID Nos:134-143 y un dominio VL que comprende la secuencia de aa de una de las SEQ ID NOs:166-175. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti- ErbB3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No: 134 y un dominio VL que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No:166. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti- ErbB3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No: 135 y un dominio VL que 15 comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No:167. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti- ErbB3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No: 136 y un dominio VL que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No:168. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti- ErbB3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No: 137 y un dominio VL que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No:169. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti- 20 ErbB3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No:138 y un dominio VL que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No: 170. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti- ErbB3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No: 139 y un dominio VL que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No: 171. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti- ErbB3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No: 140 y un dominio VL que 25 comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No: 172. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti- ErbB3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No:141 y un dominio VL que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No: 173. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti- ErbB3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No: 142 y un dominio VL que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No: 174. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti- 30 ErbB3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No: 143 y un dominio VL que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No: 175. En realizaciones particulares, un dominio de union a anti- ErbB3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No: 136 y un dominio VL que comprende la secuencia de aa de la SEQ ID No:169.
35 En una realizacion ejemplar, un PBA comprende una cadena pesada que comprende una CR de inmunoglobulina que comprende, que consiste esencialmente en, o que consiste en el dominio CH1, bisagra, dominio CH2 y dominio CH3 de una IgG1 (denominada como "CR de IgG1"). Los PBA ejemplares comprenden una CR de IgG1 y una o mas de las siguientes secuencias de aa: un dominio VH de IGF-1R que comprende una secuencia consenso de la SEQ ID NO:1; un dominio VL de IGF-1R que comprende una secuencia consenso de la SEQ ID NO:2; un dominio VH de 40 ErbB3 que comprende la secuencia consenso de la SEQ ID NO:4; y un dominio VL de ErbB3 que comprende la secuencia consenso de la SEQ ID NO:6, y comprenden PBA que comprenden las secuencias de aa de cadena pesada y ligera de las figuras 5A, 5B, 7A y 7B.
Otros PBA ejemplares comprenden una cadena pesada que comprende un CR de IgG1 y una o mas de las 45 siguientes secuencias de aa: un dominio VH de IGF-1R que comprende una secuencia consenso de la SEQ ID NO:1; un dominio VL de IGF-1R que comprende una secuencia consenso de la SEQ ID NO:3; un dominio VH de ErbB3 que comprende la secuencia consenso de la SEQ ID NO:5; y un dominio VL de ErbB3 que comprende la secuencia consenso de la SEQ ID NO:7, y comprenden PBA que comprenden las secuencias de aa de cadena pesada y ligera de las figuras 5A y 5B, pero excluyendo 16 cadenas pesadas y ligeras.
50
Los PBA que comprenden un extremo carboxi que de otro modo terminaran con una lisina o una arginina pueden tener su aa carboxi-terminal cortado por una carboxipeptidasa. Para evitar esto, puede ser beneficioso anadir uno o mas aa en tal extremo carboxi. Por ejemplo, cuando una protefna tenga de otro modo "VEIK" en su extremo carboxi, pueden anadirse 1, 2, 3, 4, 5 o mas aa al extremo carboxi para impedir la eliminacion de la lisina. En ciertas 55 realizaciones, estos aa adicionales pueden originarse del dominio CL. Por lo tanto, por ejemplo, en casos en los que un PBA termina en una secuencia Vl anti-IGF-1R, que termina con "VEIK," el aa "RT" puede anadirse en el extremo carboxi (vease, por ejemplo, P1-G1-P4; SEQ ID NO:268).
Los PBA anti-IGF-1R/ErbB3 pueden comprender una cadena pesada que comprende una secuencia de aa
seleccionada del grupo que consiste en fusiones de cadena pesada (hfbridos): SF-G1-C8 (es decir, 16F; SEQ ID NO:210); SF-G1-P1 (SEQ ID NO:212); SF-G1-M1.3 (SEQ ID NO:214); SF-G1-M27 (SEQ ID NO:216); SF-G1-P6 (SEQ ID NO:218); SF-G1-B69 (SEQ ID NO:220); P4-G1-C8 (SEQ ID NO:222); P4-G1-P1 (SEQ ID NO:224); P4-G1- M1.3 (SEQ ID NO:226); P4-G1-M27 (SEQ ID NO:228); P4-G1-P6 (SEQ ID NO:230); P4-G1-B69 (SEQ ID NO:232);
5 M78-G1-C8 (SEQ ID NO:234); M78-G1-P1 (SEQ ID NO:236); M78-G1-M1.3 (SEQ ID NO:238); M78-G1-M27 (SEQ ID NO:240); M78-G1-P6 (SEQ ID NO:242); M78-G1-B69 (SEQ ID NO:244); M57-G1-C8 (SEQ ID NO:246); M57-G1- P1 (SEQ ID NO:248); M57-G1-M1.3 (SEQ ID NO:250); M57-G1-M27 (SEQ ID NO:252); M57-G1-P6 (SEQ ID NO:254) y M57-G1-B69 (SEQ ID NO:256). Los PBA anti-IGF-1R/ErbB3 pueden comprender una cadena ligera que comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en cadenas ligeras Kappa: SF (SEQ ID 10 NO:202); P4 (SEQ ID NO:204); M78 (SEQ ID NO:206); y M57 (SEQ ID NO:208).
Los PBA anti-ErbB3/IGF-1R pueden comprender una cadena pesada que comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en fusiones de cadena pesada (hfbridos): P1-G1-P4 (SEQ ID NO:268); P1-G1- M57 (SEQ ID NO:270); P1-G1-M78 (SEQ ID NO:272); M27-G1-P4 (SEQ ID NO:274); M27-G1-M57 (SEQ ID 15 NO:276); M27-G1-M78 (SEQ ID NO:278); M7-G1-P4 (SEQ ID NO:280); M7-G1-M57 ((SEQ ID NO:282); M7-G1-M78 (SEQ ID NO:284); B72-G1-P4 (SEQ ID NO:286); B72-G1-M57 (SEQ ID NO:288); B72-G1-M78 (SEQ ID NO:290); B60-G1-P4 (SEQ ID NO:292); B60-G1-M57 (SEQ ID NO:294); B60-G1-M78 (SEQ ID NO:296); B60-G2-M78 (SEQ ID NO:355) y M7-G2-M78 (sEq ID NO:357). Los PBA anti-ErbB3/IGF-1R pueden comprender una cadena ligera que comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en cadenas ligeras lambda: P1 (SEQ ID 20 NO:258), M27 (SEQ ID NO:260), M7 (SEQ ID NO:262), B72 (SEQ ID NO:264), y B60 (SEQ ID NO:266).
Una cadena pesada puede emparejarse con una cadena ligera que comprende un dominio VL del mismo modulo que el dominio VH de la cadena pesada. Sin embargo, las cadenas pesadas y cadenas ligeras pueden tambien mezclarse y emparejarse, con la condicion de que los sitios de union conserven una union de alta afinidad a sus 25 diana.
IGF-1R+ErbB3 ejemplares que comprenden CR de IgG1
Los nombres de 38 PBA IGF-1R+ErbB3 ejemplares que comprenden CR de IgG1 se exponen aquf a continuacion 30 en la Tabla 5, cada uno de cuyos nombres se sigue de (entre parentesis, en orden) SEQ ID NO de cadena pesada y SEQ ID NO de cadena ligera. Estos PBA de tipo IgG comprenden dos cadenas pesadas esencialmente identicas y dos cadenas ligeras esencialmente identicas.
Tabla 5 - PBA IGF-1R+ErbB3 ejemplares que comprenden CR de IgG1
SF-G1-P1 (SEQ ID NO:212 y SEQ ID NO:202)
SF-G1-M1.3 (SEQ ID NO:214 y SEQ ID NO:202)
SF-G1-M27 (SEQ ID NO:216 y SEQ ID NO:202)
SF-G1-P6 (SEQ ID NO:218 y SEQ ID NO:202)
SF-G1-B69 (SEQ ID NO:220 y SEQ ID NO:202)
P4-G1-C8 (SEQ ID NO:222 y SEQ ID NO:204)
P4-G1-P1 (SEQ ID NO:224 y SEQ ID NO:204)
P4-G1-M1.3 (SEQ ID NO:226 y SEQ ID NO:204)
P4-G1-M27 (SEQ ID NO:228 y SEQ ID NO:204)
P4-G1-P6 (SEQ ID NO:230 y SEQ ID NO:204)
P4-G1-B69 (SEQ ID NO:232 y SEQ ID NO:204)
M78-G1-C8 (SEQ ID NO:234 y SEQ ID NO:206)
M78-G1-P1 (SEQ ID NO:236 y SEQ ID NO:206)
M78-G1-M1.3 (SEQ ID NO:238 y SEQ ID NO:206)
M78-G1-M27 (SEQ ID NO:240 y SEQ ID NO:206)
M78-G1-P6 (SEQ ID NO:242 y SEQ ID NO:206)
M78-G1-B69 (SEQ ID NO:244 y SEQ ID NO:206)
M57-G1-C8 (SEQ ID NO:246 y SEQ ID NO:208)
M57-G1-P1 (SEQ ID NO:248 y SEQ ID NO:208)
M57-Gl-M1.3 (SEQ ID NO:250 y SEQ ID NO:208)
M57-G1-M27 (SEQ ID NO:252 y SEQ ID NO:208)
M57-G1-P6 (SEQ ID NO:254 y SEQ ID NO:208)
M57-G1-B69 (SEQ ID NO:256 y SEQ ID NO:208)
P1-G1-P4 (SEQ ID NO:268 y SEQ ID NO:258)
P1-G1-M57 (SEQ ID NO:270 y SEQ ID NO:258)
P1-G1-M78 (SEQ ID NO:272 y SEQ ID NO:258)
M27-G1-P4 (SEQ ID NO:274 y SEQ ID NO:260)
M27-G1-M57 (SEQ ID NO:276 y SEQ ID NO:260)
M27-G1-M78 (SEQ ID NO:278 y SEQ ID NO:260)
M7-G1-P4 (SEQ ID NO:280 y SEQ ID NO:262)
M7-G1-M57 ((SEQ ID NO:282 y SEQ ID NO:262)
M7-G1-M78 (SEQ ID NO:284 y SEQ ID NO:262)
B72-G1-P4 (SEQ ID NO:286 y SEQ ID NO:264)
B72-G1-M57 (SEQ ID NO:288 y SEQ ID NO:264)
B72-G1-M78 (SEQ ID NO:290 y SEQ ID NO:264)
B60-G1-P4 (SEQ ID NO:292 y SEQ ID NO:266)
B60-G1-M57 (SEQ ID NO:294 y SEQ ID NO:266)
B60-G1-M78 (SEQ ID NO:296 y SEQ ID NO:266).
P4M-G1-M1.3 (SEQ ID NO:376 y SEQ ID NO:381)
P4M-G1-C8 (SEQ ID NO:377 y SEQ ID NO:381)
P33M-G1-M1.3 (SEQ ID NO:378 y SEQ ID NO:380)
P33M-G1-C8 (SEQ ID NO:379 y SEQ ID NO:380)
P4M-G1-P6L (SEQ ID NO:389 y SEQ ID NO:381)
P33M-G1-P6L (SEQ ID NO:390 y SEQ ID NO:380)
P1-G1-M76 (SEQ ID NO:391 y SEQ ID NO:258)
En una realizacion ejemplar, un PBA comprende dos cadenas pesadas identicas y dos cadenas ligeras identicas, en el que la secuencia de cada una de las cadenas pesadas comprende, consiste esencialmente en, o consiste en la SEQ ID NO:210 o 300, y en el que la secuencia de cada una de los dominios de cadena ligera comprenden, consisten esencialmente en, o consisten en la SEQ ID NO:202 o 298. Los PBA pueden comprender tambien una 5 cadena pesada y/o una cadena ligera que comprenden una secuencia de aa que difiere de la SEQ ID NO:202 o 298 o la SeQ ID NO:210 o 300, respectivamente, en exactamente o en como mucho 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 200, o 300 aa, con la condicion de que el PBA tenga la caracterfstica o caracterfsticas biologicas deseadas, como se describe adicionalmente en el presente documento. En una realizacion, un PBA comprende una secuencia de aa que difiere de la SEQ ID NO:210 o 300 por la adicion de una lisina (K) en el extremo del dominio 10 CH3, es decir, creando la secuencia... SLSLSPGKGGGGS.... (SEQ ID NO:301). Un pBa tambien puede comprende una secuencia de aa que difiere de la SEQ ID NO:210 o 300 comprendiendo una o mas de las siguientes sustituciones de aa en el dominio CH3: S239D, N297Q, S298A ,T299A, T299C, T299K, A330L, I332E, E333A, K334A, E356D, M358L, N434A, N343K (numeracion de EU; vease la figura 7A).
15 Los PBA tambien pueden comprender dos cadenas pesadas identicas y dos cadenas ligeras identicas, en los que la secuencia de cada una de las cadenas pesadas y de cada una de las cadenas ligeras comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia de la figura 5A o 5B (es decir, incluso cualquier secuencia numerada de SEQ ID seleccionada de las SEQ ID NOs:202-296). Los PBA tambien pueden comprender una cadena pesada y/o una cadena ligera que compren de una secuencia de aa que difiere de una secuencia en la figura 5A o 5B en 20 exactamente o en como mucho 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 200, o 300 aa, con la condicion de que el PBA tenga la caracterfstica o caracterfsticas biologicas deseadas, como se describe adicionalmente en el presente documento. Las diferencias en aa pueden ser deleciones, adiciones o sustituciones de aa (por ejemplo, sustituciones conservadoras). Por ejemplo, un PBA puede comprender una secuencia de aa que difiere de una secuencia de aa de la figura 5A o 5B, mediante la adicion (o delecion) de una lisina en el extremo de un dominio 25 CH3, y/o comprendiendo una o mas de las siguientes sustituciones de aa en el dominio CH3: S239D, N297Q, S298A ,T299A, T299C, T299K, A330L, I332E, E333A, K334A, E356D, M358L, N434A, N343K (vease la figura 7A). Una o mas diferencias de aa pueden estar presentes en uno o ambos de los dos dominios VH o en uno o ambos de los dos dominios VL, por ejemplo, en una o mas CDR o en una o mas regiones estructurales (FR). Una o mas diferencias de aa tambien pueden estar presentes en uno o mas de los dominios de CR de inmunoglobulina, por 30 ejemplo, en el dominio CH1, el dominio CL, la bisagra, el dominio CH2 y/o el dominio CH3. Los cambios de aa particulares que pueden hacerse a una CR de inmunoglobulina, por ejemplo, para cambiar una o mas caracterfsticas de una inmunoglobulina, se describen adicionalmente en el presente documento. Los cambios de aa tambien pueden estar presentes en el enlazador que conecta el extremo C del dominio CH3 al extremo N del scFv y/o el enlazador scFv que conecta el extremo C del dominio VH del scFv al extremo N del dominio VL del scFv. Las 35 modificaciones ejemplares que pueden hacerse en un enlazador de conexion y un enlazador scFv se analizan adicionalmente en el presente documento.
Tambien pueden usarse los siguientes PBA:
40 - Los PBA que comprenden una cadena pesada y/o una cadena ligera que comprende una secuencia de aa
que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % identica a la secuencia de aa del dominio de cadena pesada que tiene la SEQ ID NO:210 o 300 y/o el dominio de cadena ligera que tiene la SEQ ID NO:202 o 298 (SEQ ID NOs de 16F), en los que los PbA tienen la caracterfstica o caracterfsticas biologicas deseadas;
45 - los PBA que son biosimilares o bioequivalentes de un PBA que consiste en dos dominios de cadena
pesada, cada uno de los cuales consiste en la SEQ ID NO:210 o 300 y dos dominios de cadena ligera, cada uno de los cuales consiste en la SEQ ID NO:202 o 298;
- los PBA que comprenden uno o mas dominios, por ejemplo, el dominio VH, el dominio VL, el dominio CDR, el dominio FR, el dominio CH1, el dominio CL, la bisagra, el dominio CH2, el dominio CH3, el
50 enlazador, el dominio VH scFv, el enlazador scFv, y el dominio VL scFv que comprende una secuencia de
aa que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % identica a la secuencia de aa del uno o mas dominios correspondientes en la SEQ ID NO:202, 210, 298 o 300;
- los PBA que comprenden un dominio de cadena pesada y/o un dominio de cadena ligera que comprenden una secuencia de aa que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 %
55 identica a la secuencia de aa de un dominio de cadena pesada de la figura 5A o 5B y/o un dominio de
cadena ligera de la figura 5A o 5B, en los que los PBA tienen la caracterfstica o caracterfsticas biologicas deseadas;
- los PBA que son biosimilares o bioequivalentes de un PBA que consiste en dos dominios de cadena pesada, cada uno de los cuales comprende una secuencia de aa de la figura 5A o 5B y dos dominios de
cadena ligera, cada una de las cuales comprende una secuencia de aa de la figura 5A o 5B;
- los PBA que comprenden uno o mas dominios, por ejemplo, un dominio VH, un dominio VL, un dominio CDR, un dominio FR, un dominio CH1, un dominio CL, un dominio bisagra, un dominio CH2, un dominio CH3, un dominio enlazador, un dominio VH scFv, un dominio enlazador scFv, y un dominio VL scFv que 5 comprende una secuencia de aa que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o
un 99 % identica a la secuencia de aa del uno o mas dominios correspondientes en una cualquiera de las secuencias de aa de la figura 5A o 5B.
En ciertas realizaciones, en las que un PBA comprende una secuencia de aa que difiere de una secuencia de aa (tal 10 como un aa de las figuras 5 o 6) expuesta en el presente documento, el PBA no es 16F (es decir, no comprende dos cadenas pesadas que consisten en la SEQ ID NO:210 y dos cadenas ligeras que consisten en la SEQ ID NO:202).
En ciertas realizaciones, un PBA comprende dos pares de cadenas pesada-ligera que se asocian entre si, en el que cada par de cadena pesada-ligera comprende un sitio de union a anti-IGF-IR y un sitio de union a anti-ErbB3, y en 15 el que los pares de cadenas pesada-ligera difieren entre si. Los pares de cadena pesada-ligera pueden diferir en uno o mas aa (por ejemplo, en exactamente o en como mucho 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, o hasta 100 aa). Por ejemplo, un primer par de cadena pesada-ligera puede comprender una CR de cadena pesada y un segundo par de cadena pesada-ligera puede comprender una segunda CR de cadena pesada, donde la primera y la segunda CR de cadena pesada tienen diferencias de aa que favorecen su asociacion entre si (por ejemplo, "botones 20 y ojales").
En ciertas realizaciones, una protefna polivalente comprende mas de cuatro sitios de union. Por ejemplo, una protefna de union hexavalente puede comprender un IgG-(scFv)2, es decir, una protefna que comprende dos sitios de union que son parte de la IgG, un scFv esta unido al extremo C de cada uno de los dominios CH3 de la IgG, y 25 que comprende ademas otro Fab o scFv, unido, por ejemplo, a traves de un enlazador, al extremo N de la protefna IgG o al extremo C de cada uno de los scFv. Una protefna de union octavalente puede comprender la misma estructura que una protefna de union hexavalente, que comprende ademas dos sitios de union adicionales.
Tambien descrito en el presente documento, un PBA puede comprender un sitio de union que se deriva de una 30 protefna de union o anticuerpo que se conoce en la tecnica, tal como los descritos ademas en el presente documento. Por ejemplo, un PBA puede comprender una o mas CDR de un anticuerpo anti-IGF-1R seleccionado del grupo que consiste en CP-751,871; IMC-A12; Ab# A ANTI-IGF-1R; BIIB-G11; y C06, cuyas secuencias de aa de cadena pesada y ligera son de la figura 37. Por ejemplo, un sitio de union a anti-IGF-1R para su uso en un PBA puede comprender un dominio VHCDR3 y/o VLCDR3 y opcionalmente la VHCDR1, VLCDR1, VHCDR2 y/o VLCDR2 35 de una cualquiera de las SEQ ID NOs:321-335. En cierta realizacion, un PBA comprende un sitio de union a anti- IGF-1R que comprende 1, 2, 3, 4, 5, o 6 CDR que comprenden una secuencia de aa que difiere de la correspondiente de una de las SEQ ID NOs:321-335 en 1, 2 o 3 adiciones, deleciones o sustituciones de aa, con la condicion de que el sitio de union se una especfficamente a su diana (antfgeno). Tambien descrito en el presente documento, un PBA comprende sitio de union a anti-IGF-1R que comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR que comprenden 40 una secuencia de aa que es al menos un 70 %, 80 %, 90 % o un 95 % identica o similar a la CDR correspondiente de una de las SEQ ID NOs:321-335. Tambien descrito en el presente documento, un PBA comprende una cadena VH y/o una cadena VL que comprende una secuencia de aa de una cualquiera de las SEQ ID NOs:321-335. En otras realizaciones, un PBA comprende una cadena VH y/o una cadena VL que comprende una secuencia de aa que difiere de una cualquiera de las SEQ ID NOs:321-335 en como mucho 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 o 30 45 deleciones, adiciones o sustituciones de aa, o que es al menos un 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o un 99 % identica a una secuencia en las SEQ ID NOs:321-335, con la condicion de que el sitio de union se una especfficamente a su diana. Tambien descrito en el presente documento, un PBA comprende un sitio de union que comprende una cadena ligera y/o una cadena pesada que comprende una secuencia de aa de las SEQ ID NOs:321- 335, o que difiere de esta en como mucho 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 deleciones, 50 adiciones o sustituciones de aa, o que es al menos un 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o un 99 % identica a una secuencia en las SEQ ID NOs:321-335, con la condicion de que el sitio de union conserve la union especffica a su diana. Por ejemplo, un PBA puede comprender (i) un dominio VH y un dominio VL; (ii) una cadena pesada y una cadena ligera; o (iii) un scFv que comprende las cadenas VH y VL, de un anticuerpo seleccionado del grupo de anticuerpos que consiste en CP-751,871; IMC-A12; Ab# A ANTI-iGf-1R; BIIB-G11; y C06. Tal PBA puede 55 comprender un sitio de union a anti-ErbB3 que se describe en el presente documento.
Un PBA puede comprender una o mas CDR de un anticuerpo anti-ErbB3, por ejemplo, Ab# A anti-ErbB3; H3 (Pat. de Estados Unidos n.° 7.332.580), Ab#3 MM; Ab#14 MM; Ab#17 MM o Ab#19 MM, cuyas secuencias de aa de cadena pesada y ligera son de la figura 38. Por ejemplo, un sitio de union a anti-ErbB3 para su uso en un PBA
puede comprender un dominio VHCDR3 y/o VLCDR3 y opcionalmente una VHCDR1, VLCDR1, VHCDR2 y/o VLCDR2 de una cualquiera de las SEQ ID NOs:336-353. En cierta realizacion, un PBA comprende un sitio de union a anti-ErbB3 que comprende 1, 2, 3, 4, 5, o 6 CDR que comprenden una secuencia de aa que difiere de la correspondiente de una de las SEQ ID NOs:336-353 en 1, 2 o 3 adiciones, deleciones o sustituciones de aa, con la 5 condicion de que el sitio de union se una especfficamente a su diana. Tambien descrito en el presente documento, un PBA comprende sitio de union a anti-ErbB3 que comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR que comprenden una secuencia de aa que es al menos un 70 %, 80 %, 90 % o un 95 % identica o similar a la CDR correspondiente de una de las SEQ iD NOs:336-353. Tambien descrito en el presente documento, un PBA comprende una cadena VH y/o una cadena VL que comprende una secuencia de aa de una cualquiera de las SEQ ID NOs:336-353. En otras 10 realizaciones, un PBA comprende una cadena VH y/o VL que comprende una secuencia de aa que difiere de una cualquiera de las SEQ ID Nos:336-353 en como mucho 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25 o 30 deleciones, adiciones o sustituciones de aa, con la condicion de que el sitio de union conserve la union especffica a su diana, o que sea al menos un 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o un 99 % identica a una secuencia en las SEQ ID NOs:336- 353. Tambien descrito en el presente documento, un PBA comprende un sitio de union que comprende una cadena 15 ligera y/o una cadena pesada que comprende una secuencia de aa de las SEQ ID NOs:336-353, o que difiere de esta en como mucho 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 deleciones, adiciones o sustituciones de aa, o que es al menos un 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o un 99 % identica a una secuencia en las SEQ ID NOs:336-353, con la condicion de que el sitio de union se una especfficamente a su diana. Por ejemplo, un PBA puede comprender (i) un dominio VH y un dominio VL; (ii) una cadena pesada y una cadena 20 ligera; o (iii) un scFv que comprende las cadenas VH y VL, de un anticuerpo seleccionado del grupo de anticuerpos que consiste en Ab# A anti-ErbB3; H3 (Pat. Estados Unidos n.° 7.332.585), Ab#3 MM; Ab#14 MM; Ab#17 MM y Ab#19 MM. Aun otros sitios de union a anti-ErbB3 (o porciones de los mismos, tales como CDR, dominios V o cadenas) que pueden usarse son los de los anticuerpos anti-ErbB3 1B4C3 (cat. n.° sc-23865, Santa Cruz Biotechnology) y 2D1D12 (U3 Pharma AG), ambos de los cuales se describen, por ejemplo, en la Pub. de Pat. de 25 Estados Unidos n.° 20040197332, y se producen por las lfneas celulares de hibridoma DSM ACC 2527 o DSM ACC 2517 (depositadas en DSMZ), AV-203 (SEQ ID No:190 (cadena pesada) y SEQ ID NO:206 (cadena ligera) en el documento WO 2011/136911, Aveo Pharmaceuticals) o 8B8 (producida por ATCC® hybridoma #HB-12070™, y descrita en el documento WO 1997/035885) las descritas en la Pat. de Estados Unidos n.° 7.846.440, el anticuerpo monoclonal Mab 205.10.2 (SEQ ID NO:8 (cadena pesada) y SEQ ID NO:10 (cadena ligera) en la Pub. de Pat. de 30 Estados Unidos n.° 20110171222, Roche Glycart), el anticuerpo murino anti-ErbB3 descrito en la Pub. de Pat. de Estados Unidos n.° 20100310557 (Trellis Biosciences) o un anticuerpo biespecffico anti-ErbB3/anti-EGFR (por ejemplo, SEQ ID NO:14 (cadena pesada) y SEQ ID No:13 (cadena pesada), Genentech). Dichos PBA pueden comprender un sitio de union a anti-IGF-1R que se describe en el presente documento.
35 Los PBA tambien pueden comprenden un sitio de union que se une al mismo epftopo en IGF-1R humano o ErbB3 humano como los restos de union proporcionados en el presente documento, por ejemplo, puede competir con los restos de union que tienen secuencias segun las figuras 5A y 5B. Los restos de union incluidos en el presente documento tambien pueden competir por la union a antfgeno con un resto de union descrito en el presente documento, por ejemplo, puede competir con los restos de union que tienen las secuencias segun las figuras 5A y 40 5B. Una protefna de union que comprende un resto de union que compite con un resto de union descrito en el presente documento para la union a un antfgeno o epftopo diana puede ser un resto de union que es capaz de desplazar el resto de union descrito en el presente documento al anadirse a un ELISA antes o despues del resto de union descrito en el presente documento.
45 En ciertas realizaciones, los PBA proporcionados en el presente documento no incluyen PBA que son del documento PCT/US2010/052712, en otras realizaciones, los PBA proporcionados en el presente documento no incluyen dominios variables de PBA que son del documento PCT/US2010/052712.
CR de inmunoglobulina ejemplares 50
En ciertas realizaciones, un PBA comprende dos cadenas pesadas, en el que cada una comprende una CR de inmunoglobulina. El dominio de union polivalente tambien puede comprender dos cadenas ligeras, en las que cada cadena ligera comprende un dominio Cl. La CR de inmunoglobulina puede ser de una Ig humana, por ejemplo, una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana, o de mas de un isotipo de inmunoglobulina. Por ejemplo, un dominio puede ser de 55 una IgG1, y otros dominios pueden ser de otros isotipos de IgG. En ciertas realizaciones, una porcion de un dominio es de un isotipo de IgG y los otros dominios son de otro isotipo de IgG.
Una CR de inmunoglobulina de cadena pesada, que puede comprender uno o mas de un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2, un dominio CH3, y un dominio CH4, puede comprender o consistir en una secuencia de aa que es
al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % identica a una CR de inmunoglobulina de cadena pesada en un dominio constante de origen natural o de tipo silvestre de un isotipo de IgG particular, por ejemplo, IgG1, o una CR de una de las secuencias de aa expuestas en el presente documento. Un dominio CL tambien puede comprender o consistir en una secuencia de aa que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 5 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % identica a un dominio CL en una cadena ligera kappa o lambda de origen natural o de tipo silvestre o un dominio CL en una de las secuencias de aa expuestas en el presente documento.
Una CR de inmunoglobulina de cadena pesada, que puede comprender uno o mas de un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2, un dominio CH3, y un dominio CH4, puede comprender exactamente, o como mucho 1, 2, 3, 4, 5, 10 6, 7, 8, 9, 10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50, 50-100 o mas sustituciones, adiciones y/o deleciones de aa con respecto a la misma CR de inmunoglobulina de cadena pesada en un dominio constante de origen natural o de tipo silvestre de un isotipo de IgG particular, por ejemplo, IgG1, o con respecto a una CR de inmunoglobulina de cadena pesada expuesta en el presente documento, por ejemplo, en las figuras 5-7. Un dominio CL puede comprender exactamente o como mucho 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 3615 40, 41-45, 46-50, 50-100 o mas sustituciones, adiciones y/o deleciones de aa con respecto a un dominio CL en una cadena ligera kappa o lambda de origen natural o de tipo silvestre o un dominio CL expuesto en el presente documento.
Cada dominio de una CR, es decir, un dominio CH1, bisagra, dominio CH2, dominio CH3 y dominio CL puede 20 comprender una o mas (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas) sustituciones, adiciones y/o deleciones de aa con respecto a un dominio constante de origen natural o de tipo silvestre de un isotipo IgG particular, por ejemplo, IgG1, o un dominio constante expuesto en el presente documento. Cada dominio de una CR, es decir, un dominio CH1, bisagra, dominio CH2, dominio CH3 y dominio CL puede comprender una secuencia de aa que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % identica al mismo dominio en un dominio constante de 25 origen natural o de tipo silvestre de un isotipo de IgG particular, por ejemplo, IgG1, o un dominio expuesto en el presente documento.
Las sustituciones, adiciones o deleciones de aa pueden estar situadas espacialmente con respecto una a la otra en un intervalo de al menos 1 posicion de aa o mas, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 posiciones de aa o 30 mas. En ciertas realizaciones, los aa disenados estan situados espacialmente separados entre si en un intervalo de al menos 5, 10, 15, 20 o 25 posiciones de aa o mas.
En ciertas realizaciones, los PBA comprenden una CR, por ejemplo, una region Fc o dominio de los mismos, que comprende una secuencia de aa expuesta en el presente documento. En ciertas realizaciones, los PBA comprenden 35 una CR, por ejemplo, una region Fc o dominio de los mismos, que comprende una secuencia de aa expuesta en el presente documento, en la que 1 o mas aa se han eliminado, anadido o sustituido, o que comprende una secuencia de aa que es al menos aproximadamente un 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % identica a una secuencia expuesta en el presente documento. Por ejemplo, los aa 356 y 358 en el dominio CH3 de la SEQ ID NO:300, o cualquier otra secuencia de aa en las figuras 5 y 6, pueden estar sustituidos, por ejemplo, E356D y M358L, para 40 reflejar la secuencia CH3 de IgG1 de tipo silvestre. Cualquier variante de dominio constante que representa cualquier haplotipo tambien se incluye en el presente documento.
El efecto de ciertos cambios de aa a un dominio constante puede determinarse como se describe adicionalmente en el presente documento o como se conoce en la tecnica.
45
Los reemplazos de residuos de aa en la porcion Fc para alterar la funcion efector de anticuerpo se conocen en la tecnica (Patentes de Estados Unidos n.° 5.648.260 y 5.624.821). La porcion Fc de un anticuerpo media varias funciones efectoras importantes, por ejemplo, la induccion de citocinas, ADCC, fagocitosis, citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y semivida/tasa de depuracion de anticuerpo y complejos de antfgeno-anticuerpo. En 50 algunos casos, estas funciones efectoras son deseables para un anticuerpo terapeutico, pero en otros casos, pueden ser innecesarias o incluso perjudiciales, dependiendo de los objetivos terapeuticos. Ciertos isotipos de IgG humanos, particularmente IgG1 e IgG3, median ADCC y CDC a traves de la union a FcyR y CIq de complemento, respectivamente. Los receptores Fc neonatales (FcRn) son los componentes crfticos que determinan la semivida circulante de los anticuerpos. Aun en otra realizacion, al menos un residuo de aa se reemplaza en la CR del 55 anticuerpo, por ejemplo, la region Fc del anticuerpo, de tal forma que las funciones efectoras del anticuerpo se alteran. La dimerizacion de dos cadenas pesadas identicas de una inmunoglobulina esta mediada por la dimerizacion del dominio CH3 y es estabiliza por los enlaces disulfuro dentro de la region bisagra.
En una realizacion, un PBA conserva uno o mas, y preferiblemente cada uno de los siguientes atributos: la
citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) que en seres humanos se determinan por interacciones con FcyRI de activacion, FcYRIIa/c, FcYRIIIa y receptores FcYRIIb inhibidores; la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) que se desencadena a traves de la union del anticuerpo a los componentes del sistema de complemento; y una larga semivida que esta mediada a traves del 5 reciclaje activo por el receptor Fc neonatal (FcRn). Todas estas funciones se pueden afinar para optimizar la eficacia de una terapia anticancerosa y se conservan preferiblemente en un PBA.
Pueden hacerse ciertas modificaciones de aa a una CR de inmunoglobulina para reducir o aumentar las actividades biologicamente naturales de los dominios constantes, tales como las expuestas anteriormente. Por consiguiente, en 10 ciertas realizaciones, una region de inmunoglobulina constante comprende una sustitucion, delecion o adicion de aa en una posicion de aa que esta dentro de la "zona de contacto de l5 angstrom" de una Fc. La zona de 15 Angstrom incluye los residuos situados en las posiciones de EU 243 a 261, 275 a 280, 282-293, 302 a 319, 336 a 348, 367, 369, 372 a 389, 391, 393, 408, y 424-440 de un resto Fc de longitud completa de tipo silvestre.
15 En ciertas realizaciones, una protefna de union (por ejemplo, un PBA, un sitio de union a anti-IgG-1R y un sitio de union a anti-ErbB3) comprende un cambio de aa (por ejemplo, una sustitucion, adicion o delecion de aa) en un dominio Fc que altera una o mas funciones efectoras independientes de antfgeno del dominio, por ejemplo, la semivida circulante de una protefna que comprende el dominio. Los anticuerpos ejemplares muestran el aumento o descenso de la union a FcRn en comparacion con los anticuerpos que carecen de dichos cambios de aa y, por lo 20 tanto, tienen un aumento o descenso de la semivida en suero, respectivamente. Los anticuerpos que comprenden las variantes Fc con una mejor afinidad para FcRn se anticipan para tener mayores semividas en suero, mientras que los que comprenden variantes Fc con una disminucion de la afinidad de union a FcRn se espera que tengan semividas mas cortas. En una realizacion, una protefna de union con una union a FcRn alterada comprende al menos un dominio Fc que tiene uno o mas cambios de aa en el "bucle de union a FcRn" de un dominio Fc. El bucle 25 de union a FcRn esta compuesto por los residuos de aa 280-299 (EU) de un Fc de tipo silvestre de longitud completa. En otras realizaciones, una protefna de union que tiene una afinidad de union a FcRn alterada comprende al menos un dominio Fc que tiene una o mas sustituciones de aa en la "zona de contacto" de FcRn de 15 A. La expresion "zona de contacto" de FcRn de 15 A incluye los residuos en las siguientes posiciones de un dominio Fc de tipo silvestre de longitud completa: 243-261, 275-280, 282-293, 302-319, 336-348, 367, 369, 372-389, 391, 393, 408, 30 424, 425-440 (EU). En ciertas realizaciones, una protefna de union que tiene una afinidad de union a FcRn alterada comprende al menos un dominio Fc (por ejemplo, uno o dos restos Fc) que tiene uno o mas cambios de aa en una posicion de aa correspondiente a una cualquiera de las siguientes posiciones de EU: 256, 277-281, 283-288, 303309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434 (por ejemplo, N434A o N434K), y 438. Los cambios de aa ejemplares que alteran la actividad de union a FcRn se desvelan en la Publicacion PCT Internacional n.° 35 WO05/047327.
En algunas realizaciones, una protefna de union comprende una variante Fc que comprende un cambio de aa que altera las funciones efectoras dependientes de antfgeno del polipeptido, en particular ADCC o activacion de complemento, por ejemplo, en comparacion con una region Fc de tipo silvestre. En una realizacion ejemplar, dichos 40 anticuerpos muestran una union alterada a un receptor gamma Fc (por ejemplo, CD16). Dichos anticuerpos muestran un aumento o descenso de la union a FcyR en comparacion con polipeptidos de tipo silvestre y, por lo tanto, median una mejor o reducida funcion efectora, respectivamente. Las variantes Fc con mejor afinidad para los FcyR se anticipan para mejorar la funcion efectora, y dichas protefnas pueden tener aplicaciones utiles en metodos para tratar mamfferos donde se desea la destruccion de moleculas diana, por ejemplo, en terapia tumoral. Por el 45 contrario, se espera que las variantes Fc con una afinidad de union a FcyR disminuida reduzcan la funcion efectora. En una realizacion, una protefna de union comprende al menos una funcion efectora dependiente de antfgeno alterada seleccionada del grupo que consiste en opsonizacion, fagocitosis, citotoxicidad dependiente de complemento, citotoxicidad celular dependiente de antfgeno (ADCC), o modulacion de celulas efectoras en comparacion con una protefna de union que comprende una region Fc de tipo silvestre.
50
En una realizacion, una protefna de union muestra una union alterada a un FcyR de activacion (por ejemplo, FcyRI, FcYRIla, o FcYRIIIa). En otra realizacion, una protefna de union muestra una afinidad de union alterada a un FcyR inhibitorio (por ejemplo, FcYRIIb). En otras realizaciones, una protefna de union que tiene un aumento de la afinidad de union a FcyR (por ejemplo, afinidad de union a FcYRIIIa aumentada) comprende al menos un dominio Fc que 55 tiene un cambio de aa en una posicion de aa correspondiente a una o mas de las siguientes posiciones: 239, 268, 298, 332, 334, y 378 (EU). En ciertas realizaciones, una protefna de union que tiene una afinidad de union a FcyR disminuida (por ejemplo, afinidad de union a FcyRI, FcyRIi, o FcYRIIIa disminuida) comprende al menos un dominio Fc que tiene una sustitucion de aa en una posicion de aa correspondiente a una o mas de las siguientes posiciones: 234, 236, 239, 241, 251, 252, 261, 265, 268, 293, 294, 296, 298, 299, 301, 326, 328, 332, 334, 338, 376, 378, y 435
(EU).
En ciertas realizaciones, una protefna de union que tiene una afinidad de union a complemento aumentada (por ejemplo, una afinidad de union a C1q aumentada) comprende un dominio Fc que tiene un cambio de aa en una 5 posicion de aa correspondiente a una o mas de las siguientes posiciones: 251, 334, 378, y 435 (EU). En ciertas realizaciones, una protefna de union que tiene una afinidad de union a complemento disminuida (por ejemplo, una afinidad de union a C1q disminuida) que comprende un dominio Fc que tiene una sustitucion de aa en una posicion de aa correspondiente a una o mas de las siguientes posiciones: 239, 294, 296, 301, 328, 333, y 376 (EU). Los cambios de aa ejemplares que alteran la actividad de union a FcyR o a complemento se desvelan en la Publicacion 10 PCT Internacional n.° WO05/063815. En ciertas realizaciones, un resto de union puede comprender una o mas de las siguientes sustituciones de la region Fc especffica: S239D, S239E, M252T, H268D, H268E, I332D, I332E, N434A, y N434K (EU).
Una protefna de union tambien puede comprender una sustitucion de aa que altera la glicosilacion de la protefna de 15 union. Por ejemplo, una CR de inmunoglobulina de una protefna de union puede comprender un dominio Fc que tiene una mutacion que conduce a una glicosilacion reducida (por ejemplo, glicosilacion unida a N u O) o puede comprender una glicoforma alterada del dominio Fc de tipo silvestre (por ejemplo, un glicano con bajo contenido de fucosa y libre de fucosa). Una "glicoforma disenada" se refiere a una composicion de carbohidratos que esta unida covalentemente a una region Fc, en la que dicha composicion de carbohidratos difiere qufmicamente de la de una 20 region Fc de partida. Las glicoformas disenadas pueden ser utiles para una diversidad de propositos, incluyendo, pero sin limitacion, mejorar o reducir la funcion efectora. Las glicoformas disenadas pueden generarse por una diversidad de metodos conocidos en la tecnica (Documento US 6.602.684; Pub. de Pat. de Estados Unidos n.° 20100255013; Pub. de Pat. de Estados Unidos n.° 20030003097; WO 00/61739A1; WO 01/29246A1 ; WO 02/31140A1 ; WO 02/30954A1) ; (tecnologfa Potelligent™ (Biowa, Inc., Princeton, NJ); y tecnologfa de diseno de glicosilacion 25 GlycoMAb™ (Glycart Biotechnology AG, Zurich, Suiza). Muchas de estas tecnicas se basan en el control del nivel de oligosacaridos fucosilados y/o de biseccion que estan unidos covalentemente a la region Fc, por ejemplo, expresando un polipeptido Fc en diversos organismos o lfneas celulares, disenados o de otro modo (por ejemplo, celulas CHO Lec-13 o celulas YB2/0 de hibridoma de rata), regulando las enzimas implicadas en la ruta de glicosilacion (por ejemplo, FUT8 [a1, 6-fucosiltranserasa] y/o (31-4-N-acetilglucosaminilo, transferasa III [GnTIll]), o 30 modificando uno o mas carbohidratos despues de que se haya expresado el polipeptido Fc.
En realizaciones ejemplares, un cambio de aa, por ejemplo, una sustitucion de aa da como resultado una region Fc que comprende una glicosilacion reducida del glicano unido a N que se encuentra normalmente en la posicion de aa 297 (EU). La region Fc puede comprender tambien un glicano de bajo contenido en fucosa o libre de fucosa en la 35 posicion de aa 297 (EU). En ciertas realizaciones, la protefna de union tiene una sustitucion de aa cerca o dentro de un motivo de glicosilacion, por ejemplo, un motivo de glicosilacion unido a N que contiene la secuencia de aa NXT o NXS. En una realizacion particular, una protefna de union comprende una sustitucion de aa en una posicion de aa correspondiente a 297 o 299 de Fc (EU). Las sustituciones de aa ejemplares que reducen o alteran la glicosilacion se desvelan en la Publicacion PCT Internacional n.° WO05/018572 y la Pub. de Pat. de Estados Unidos n.° 40 20070111281.
En otras realizaciones, una protefna de union comprende al menos un dominio Fc que tiene uno o mas residuos de cistefna disenados o analogos de los mismos que se situan en la superficie expuesta a disolvente. Preferiblemente, el residuo de cistefna disenado o analogo del mismo, no interfiere con la actividad biologica deseada de la protefna 45 de union. Por ejemplo, puede ser deseable que la alteracion no interfiera con la capacidad del Fc para unirse a los receptores Fc (por ejemplo, FcyRI, FcyRII, o FcyRIII) o protefnas de complemento (por ejemplo, C1q), o para desencadenar la funcion efectora inmune (por ejemplo, citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC), fagocitosis, o citotoxicidad dependiente de complemento (CDCC)). En ciertas realizaciones, los anticuerpos comprenden un dominio Fc que comprende al menos un residuo de cistefna libre disenado o analogo del mismo, que esta 50 sustancialmente libre de enlace disulfuro con un segundo residuo de cistefna. Los anticuerpos pueden comprender un dominio Fc que tiene residuos de cistefna disenados o analogos de los mismos, en una o mas de las siguientes posiciones en el dominio CH3: 349-371, 390, 392, 394-423, 441-446, y 446b (EU). Los anticuerpos pueden comprender una variante Fc que tiene residuos de cistefna disenados o analogos de los mismos, en una cualquiera de las siguientes posiciones: 350, 355, 359, 360, 361, 389, 413, 415, 418, 422, 441, 443, y la posicion de EU 446b.
55
Las funciones efectoras deseadas tambien pueden obtenerse escogiendo un Fc de una clase o subclase de inmunoglobulina particular, o combinando regiones particulares de clases o subclases de inmunoglobulina particulares, por ejemplo, IgG1, IgG2, etc. Por ejemplo, dado que ADCC y CDC (a traves de la union de IgG a los FcyR y C1q, respectivamente) esta mediado por residuos situados en la bisagra y el dominio CH2, y ya que IgG4
carece esencialmente de funciones efectoras, un Fc no efector puede construirse combinando la bisagra y el dominio CH2 de IgG4 y el dominio CH3 de IgG1. El intercambio del brazo Fab en las protefnas que comprende una bisagra de IgG4 puede reducirse por la sustitucion S228P en la bisagra.
5 Una CR de inmunoglobulina tambien puede modificarse haciendo cambios, por ejemplo, en los dominios CH3, denominados en la tecnica como "botones en ojales" y descrito, por ejemplo, en la Pat. de Estados Unidos N.° 7.183.076). En esta estrategia, las porciones Fc de dos cadenas pesadas estan disenadas para dar una un "boton" sobresaliente, y la otra un "ojal" complementario, favoreciendo asf la asociacion de las cadenas pesadas.
10 Enlazadores ejemplares
Los enlazadores pueden usarse para conectar dos dominios o regiones entre si, por ejemplo, un dominio variable a un dominio constante, un dominio variable a un dominio variable y un dominio constante a un dominio constante. Un enlazador que conecta el dominio VH de un scFv al dominio VL del scFv se denomina como "enlazador scFv". Un 15 enlazador que conecta un scFv a un dominio constante, por ejemplo, un dominio CH3, se denomina como un "enlazador de conexion".
Los enlazadores son preferiblemente de suficiente longitud para permitir el plegado apropiado de los dominios o regiones que se conectan. Por ejemplo, un enlazador puede ser de 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 20 70-80, 80-90 o al menos 90-100 aa de largo.
En ciertas realizaciones, un enlazador es biologicamente inerte, por ejemplo, en su mayor parte incapaz de inducir una respuesta biologica, por ejemplo, una respuesta inmune.
25 Un enlazador polipeptfdico puede comprender o consistir en un enlazador Gly-Ser. Un "enlazador Gly-Ser" se refiere a un peptido que consiste en residuos de glicina y serina. Un enlazador Gly-Ser ejemplar comprende una secuencia de aa que tiene la formula (Gly4Ser)n (SEQ ID NO:395), en la que n es un numero entero positivo (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20). Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un enlazador de conexion comprende o consiste en (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO:396) o (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO:397) o (Gly4Ser)5(SEQ ID 30 NO:398). En ciertas realizaciones, un enlazador scFv comprende o consiste en (Gly4Ser)3 o (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO:397) o (Gly4Ser)5 (SEQ ID NO:398). Ademas de una secuencia (Gly4Ser)n, un enlazador puede comprender tambien uno o mas aa adicionales situados en el extremo N o C con respecto a la secuencia (Gly4Ser)n. Por ejemplo, un enlazador scFv puede comprender 3 aa, por ejemplo, AST situado en el extremo N con respecto a la secuencia (Gly4Ser)n (SEQ ID NO:399) (vease, por ejemplo, en la secuencia de cadena pesada de 16F de la figura 7 y como la 35 SEQ ID NO:300. En esa secuencia, el enlazador scFv consiste en la secuencia de aa AST (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO:400).
Caracteristicas biologicas ejemplares de PBA
40 En ciertas realizaciones, un PBA inhibe el crecimiento de celulas tumorales in vitro. Como se muestra en el Ejemplo 3(C) y en las figuras 16 y 17, un PBA IgG2(scfv)2 anti-ErbB3/anti-IGF-1R inhibio la proliferacion de dos lfneas de celulas tumorales diferentes en cultivos bidimensionales, mientras que cualquier sitio de union en solitario no inhibio significativamente su proliferacion. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, los PBA inhiben la proliferacion de celulas tumorales in vitro de forma mas potente (por ejemplo, segun se mide por el porcentaje de inhibicion en un cultivo de 45 6 dfas, por ejemplo, el cultivo descrito en el Ejemplo 3(C)), que cualquiera de los sitios de union en solitario. La proliferacion por un PBA puede inhibirse en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70&, 80 %, 90 % o mas, con respecto a la proliferacion de las celulas en ausencia del PBA.
En ciertas realizaciones, un PBA inhibe la proliferacion de celulas tumorales in vivo. Como se muestra en el Ejemplo 50 3 (D) y las figuras 18A a 20B, un PBA IgG2(scfv)2 anti-ErbB3/anti-IGF-1R inhibio la proliferacion de dos lfneas de celulas tumorales diferentes en un modelo de raton de cancer en una mayor medida con respecto a la de mediante los sitios de union individuales. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, los PBA inhiben la proliferacion de celulas tumorales in vivo de forma mas potente (por ejemplo, segun se mide comparando el tamano tumoral al final del experimento, por ejemplo, que se describe en el Ejemplo 3(D)), que cualquiera de los sitios de union en solitario. El 55 crecimiento tumoral por un PBA puede inhibirse en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o mas, con respecto al crecimiento tumoral en ausencia del PBA.
"En comparacion con cualquiera de los sitios de union en solitario" se refiere a una comparacion con uno o el otro de los sitios de union de un PBA, cuando ese sitio de union comprende las mismas VR que las del sitio de union en el
PBA, y esta, por ejemplo, en forma de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo IgG1 (como se muestra, por ejemplo, en los Ejemplos).
En ciertas realizaciones, un PBA inhibe la transduccion de senal mediada a traves de cualquiera o ambos de IGF-1R 5 y ErbB3. Como se muestra en los Ejemplos 3(B), 4 y 5(C), diversos PBA inhibieron la transduccion de senal a traves de IGF-1R y ErbB3, segun se midio por la inhibicion de la fosforilacion de IGF-1R, ErbB3 y AKT. Los ejemplos muestran que los PBA pueden inhibir la transduccion de senal en un grado o extension similar o mayor con respecto a un anticuerpo anti-IGF-1R de la tecnica anterior (Ab# A ANTI-IGF-1R - SEQ ID NO:327 para la HC y SEQ ID NO:328 para la LC) o el anticuerpo anti-ErbB3 (Ab# A anti-ErbB3 - SEQ ID NO:336 para HC y 337 para Lc) o una 10 combinacion de los mismos. En ciertas realizaciones, el porcentaje de reduccion de los niveles de una cualquiera o una combinacion de dos o tres de pIGF-1R, pErbB3 y pAKT es comparable con (por ejemplo, en un 1 %, 5 %, o un 10 %), mayor de (por ejemplo, en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 % o un 5o %) o menos de (por ejemplo, en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %) el de Ab# A ANTI-IGF-1R o Ab# A anti-ErbB3, o una combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, la inhibicion de la fosforilacion (por ejemplo, % de inhibicion) al final del experimento, por ejemplo, 15 como se describe en los Ejemplos, es comparable, con, o mayor, o inferior, que la de un anticuerpo anti-IGF-1R o anti-ErbB3 de la tecnica anterior, o una combinacion de los mismos. En ciertas realizaciones, un PBA inhibe la fosforilacion de IGF-1R, ErbB3 y/o AKT en al menos un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % o mas, con respecto a la fosforilacion en ausencia del PBA, al determinarse, por ejemplo, al final del experimento, por ejemplo, segun los Ejemplos. Los PBA preferidos inhiben la transduccion de senal de IGF-1R y/o 20 ErbB3, por ejemplo, medida por la inhibicion de la fosforilacion de IGF-1R y ErbB3, casi completamente, por ejemplo, en al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o un 99,5 %.
La inhibicion de la a) fosforilacion mediada por ligando de ErbB3, y la b) fosforilacion mediada por IGF-1 o IGF-2 del IGF-1R respectivamente puede demostrarse por la capacidad de un PBA para disminuir de forma reproducible el 25 nivel de fosforilacion de a) ErbB3 inducida por un ligando de la familia ErbB (por ejemplo, heregulina), b) de IGF-1R inducida por un ligando de IGF-1R (es decir, IGF-1 o IGF-2), o c) de AKT inducida por un ligando IGF-1R o un ligando ErbB3, cada uno con respecto a la fosforilacion en celulas de control que no estan en contacto con el PBA. La celula que expresa ErbB3 y/o IGF-1R puede ser una celula de origen natural o una celula de una lfnea celular o puede producirse de forma recombinante introduciendo ErbB3 y/o IGF-1R que codifican acidos nucleicos en una 30 celula huesped. En una realizacion, el PBA inhibe un ligando de la familia ErbB mediado por la fosforilacion de ErbB3 en al menos aproximadamente el 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 %, o mas, segun se determina, por ejemplo, por transferencia de Western seguido del sondeo con un anticuerpo anti-fosfotirosina como se describe en los Ejemplos a continuacion. En otra realizacion, el PBA inhibe la fosforilacion mediada por IGF-1 o IGF-2 de IGF-1 R en al menos 35 aproximadamente el 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 %, o mas, segun se determina, por ejemplo, por transferencia de Western seguido del sondeo con un anticuerpo anti-fosfotirosina como se describe en los Ejemplos a continuacion.
Los PBA pueden suprimir la senalizacion de pAKT inducida por heregulina en una celula, por ejemplo, una celula 40 cancerosa, en al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 %. Los PBA pueden suprimir la senalizacion de pAKT inducida por IGF-1 en una celula, por ejemplo, una celula cancerosa, en al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 %. Los PBA pueden suprimir la senalizacion de pAKT inducida por insulina en una celula, por ejemplo, una celula cancerosa, en al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 45 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 %. Los PBA pueden suprimir la senalizacion de pAKT inducida por IGF-2 en una celula, por ejemplo, una celula cancerosa, en al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o el 100 %. La inhibicion de la senalizacion de pAKT puede determinarse como se describe adicionalmente en el presente documento, por ejemplo, en los Ejemplos.
50 Los PBA pueden inhibir la fosforilacion inducida por ligando de IGF-1R en al menos un 70 % u 80 %, la fosforilacion inducida por ligando de ErbB3 en al menos un 70 % o un 80 %, y opcionalmente la fosforilacion inducida por ligando de AKT en al menos un 30 % o un 40 %. Los PBA tambien pueden inhibir la fosforilacion inducida por ligando de IGF-1R en al menos un 85 %, la fosforilacion inducida por ligando de ErbB3 en al menos un 85 %, y opcionalmente la fosforilacion inducida por ligando de AKT en al menos un 75 %. En ciertas realizaciones, los pBa inhiben la 55 fosforilacion inducida por ligando de IGF-1R en al menos un 50 %, y la fosforilacion inducida por ligando de ErbB3 en al menos un 90 %, y opcionalmente la fosforilacion inducida por ligando de AKT en al menos un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o un 90 %.
Los PBA tambien pueden definirse por la CE50 (es decir, la concentracion de PBA a la que se obtiene un 50 % de
inhibicion maxima) de su inhibicion de la fosforilacion de uno o mas de IGF-1R, ErbB3 y AKT, cuyos CE50 pueden determinarse como se describe adicionalmente en el presente documento. Por ejemplo, los PBA desvelados en el presente documento pueden inhibir la fosforilacion de IGF-1R con una CE50 de 10-9 M, 10-10 M o inferior. Pueden inhibir la fosforilacion de ErbB3 con una CE50 de 10-9 M, 10-10 M o inferior. Pueden inhibir la fosforilacion de AKT con 5 una CE50 de 10-7 M, 10-1 M, 10-9 M, 10"10 M o inferior. Algunos PBA desvelados en el presente documento inhiben la fosforilacion de IGF-1R en al menos un 80 % o un 85 % con una CE50 de 10-9 M, 10-10 M o inferior; inhiben la fosforilacion de ErbB3 en al menos un 80 % o un 85 % con una CE50 de 10-9 M, 10-10 M o inferior; e inhiben opcionalmente la fosforilacion de AKT en al menos un 55 % o 65 % o 75 % con una CE50 de 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M o inferior. En algunos casos, el bloqueo esencialmente completo de cualquiera o tanto la fosforilacion de 10 IGF-1R como la fosforilacion de ErbB3 podra obtenerse con un PBA desvelado en el presente documento.
En algunas realizaciones, un PBA proporcionado en el presente documento se une a las celulas que expresan una o ambas de sus dianas (es decir, uno o mas antfgenos unidos por el PBA) con una CE50 de aproximadamente 0,02 nM o inferior a aproximadamente 10 nM, o con una Kd de aproximadamente 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M, o 10-12 15 M, o inferior; cada una segun se mide, por ejemplo, por citometrfa de flujo usando dichas celulas que expresan uno o ambos de los antfgenos diana del PBA. En otras realizaciones, un PBA proporcionado en el presente documento se une a su diana o dianas (por ejemplo, cualquiera o ambos de IGF-1R humano y ErbB3 humano) con una Kd de aproximadamente 10'6 M, 10'7 M, 10'8 M, 10'9 M, 10'10 M, 10'11 M, o 10'12 M, o inferior, segun se mide, por ejemplo, por resonancia de plasmon superficial usando un aparato BIAcore. Por ejemplo, se mostro que un PBA IgG2(scfv)2 20 anti-ErbB3/anti-IGF-1R proporcionado en el presente documento se unfa a las celulas ADRr y MCF7 con una Kd de 2,5 y 2,1 nM, respectivamente (vease el Ejemplo 3A). El Ejemplo 5(A) muestra que varias PBA distintas se unen a las celulas BxPC-3 con una CE50 de aproximadamente 2-5 nM. El Ejemplo 5(B) muestra que varios PBA se unen a ErbB3 con una CE50 de aproximadamente 0,2-0,4 nM. Otros PBA se unen a las celulas BxPC-3 con una CE50 que varfa de 0,02 nM (por ejemplo, P4-G1-P6) a aproximadamente 1 nM o a aproximadamente 2 nM.
25
En ciertas realizaciones, un PBA se une a un antfgeno (por ejemplo, ErbB3 o IGF-1R) con una constante de disociacion (Kd) de 50 nM o menos (es decir, una afinidad de union al menos tan alta como la indicada por una Kd de 50 nM) (por ejemplo, una Kd de 40 nM o 30 nM o 20 nM o 10 nM o 1 nm, o 100 pM o 10 pM o 1 pM o menos). En una realizacion particular, un PBA se une a un antfgeno (ErbB3 o IGF-1R) con una Kd de 8 nM o mejor (por ejemplo, 30 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 2 nM, 1,5 nM, 1,4 nM, 1,3 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM o 1 pM o 0,1 pM o menos). En otras realizaciones, la protefna de union, el resto de union o el sitio de union se une a un antfgeno (por ejemplo, ErbB3 o IGF-1R) con una constante de disociacion (Kd) de menos de aproximadamente 10'7 M, tal como menos de aproximadamente 10'8 M, 10'9 M, 10'10 M, 10'11 M o 10'12 M o incluso inferior, y se une al antfgeno con una afinidad que es de al menos un orden de magnitud mayor (es decir, un valor Kd que es al menos diez veces inferior) que su 35 afinidad de union a un antfgeno no especffico (por ejemplo, KLH, BSA o casefna).
Los PBA pueden inhibir la union de un ligando a IGF-1R y/o ErbB3. Por ejemplo, los PBA pueden inhibir la union de un ligando a IGF-1R y/o ErbB3 en al menos un 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 %, segun se mide, por ejemplo, en las celulas o in vitro. Los determinados PBA inhiben el nivel de union de un ligando a IGF-1R y/o ErbB3 40 cuando el ligando se anade antes o despues del PBA.
En ciertas realizaciones, una solucion que comprende los PBA a una concentracion de 0,3, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 mg/ml o mas (o intervalos de concentracion entre cualquiera de estos dos numeros) comprende mas del 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 % de los PBA de forma no 45 agregada (que se denomina en este contexto como monomeros) segun se determina, por ejemplo, por cromatograffa de exclusion por tamano (SEC), por ejemplo, siguiendo un ensayo de estabilidad como se describe a continuacion. El porcentaje de monomeros puede determinarse en una solucion despues de uno de los siguientes ensayos de estabilidad: a) incubacion a 4 °C durante 1, 2, 3, 4, 5 o 6 dfas, o , 2, 3 o mas semanas; b) incubacion a temperatura ambiente durante 1, 2, 3, 4, 5 o 6 dfas, o 1, 2, 3 o mas semanas; c) incubacion a 37 °C durante 1, 2, 3, 50 4, 5 o 6 dfas, o 1, 2, 3 o mas semanas; d) 1, 2, 3, 4 o 5 ciclos de congelacion/descongelacion, y e) agitacion, por ejemplo, agitacion suave en el agitador orbital a temperatura ambiente, por ejemplo, durante 1, 2, 3, 4, 5 o mas horas.
En ciertas realizaciones, un PBA muestra una estabilidad despues de 1, 2, 3, 4 o 5 dfas de incubacion en suero a 37 55 °C de al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o el 99 %, con respecto a su estabilidad el dfa 0, donde la estabilidad de una protefna se determina, por ejemplo, midiendo su capacidad para unirse a uno o mas de sus antfgenos diana despues de la incubacion, segun se determina, por ELISA (vease, por ejemplo, el Ejemplo 7).
En ciertas realizaciones, un PBA tiene una temperatura de fusion (Tm) segun se determina, por ejemplo, por fluorometrfa diferencial de barrido (DSF) de al menos 50 °C, 55 °C, 60 °C, 61 °C, 62 °C, 63 °C, 64 °C, 65 °C, 66 °C, 67 °C, 68 °C, 69 °C o 70 °C, como se describe en los Ejemplos.
5 En ciertas realizaciones, un PBA inhibe eficazmente la transduccion de senal a traves de IGF-1R y/o ErbB3 cuando el ligando esta presente a una concentracion alta o una concentracion baja. En ciertas realizaciones, un PBA suprime la senalizacion basal, por ejemplo, suprime el nivel de pAKT presente en una celula en ausencia de induccion de ligando. Un PBA tambien puede regular en descenso IGF-1R y/o ErbB3, por ejemplo, el receptor fosforilado y/o no fosforilado, en la superficie celular, por ejemplo, en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 10 %, 70 %, 80 %, 90 % o mas, con respecto a una celula que no se expuso al PBA. Un PBA puede inhibir tambien la senalizacion de insulina en las celulas, por ejemplo, en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o mas, con respecto a una celula que no se expuso al PBA.
Los PBA pueden tener una estabilidad de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 dfas en suero de raton o humano. 15 Los PBA pueden tener una semivida de al menos 10 horas, 20 horas, 30 horas, 40 horas, 45 horas, 50 horas, 60 horas, 70 horas, 80 horas, 90 horas, 100 horas, 110 horas, 115 horas o mas en monos Cynomolgus al inyectar a los ratones 5 o 25 mg/kg. En ciertas realizaciones, un PBA tiene una semivida que es estadfsticamente significativamente mas larga, por ejemplo, al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 % (es decir, 2 veces), 150 % o un 200 % mas larga, en un organismo que es un raton o un mono 20 cynomolgus que la semivida de otro ab biespecffico polivalente en el mismo organismo, que se une a los mismos epftopos, en el que la orientacion de las especificidades de union al antfgeno se invierte entre el fab y el scfv.
En ciertas realizaciones, un PBA reprime el nivel de protefna de mTOR o el nivel de phospho-mTOR, o reduce o inhibe la activacion de mTOR (es decir, reduce los niveles de pmTOR), por ejemplo, en aproximadamente un 50 %, 25 en 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, o mas con respecto a un anticuerpo anti-IGF-1R monoespecffico que se une al mismo epftopo en IGF-1R que el PBA.
Los PBA pueden tener una combinacion de dos o mas de las caracterfsticas expuestas en el presente documento. Por ejemplo, un PBA puede inhibir la fosforilacion inducida por ligando de IGF-1R en al menos un 80 % y la 30 fosforilacion inducida por ligando de ErbB3 en al menos un 80 %, y tambien muestran una o mas de las siguientes caracterfsticas: (i) una Tm, segun se determino por DSF, de al menos 60 °C o 65 °C; (ii) son al menos un 80 %, 90 % o 95 % monomericos en PBS en 10 mg/ml despues de 5 dfas a temperatura ambiente; (iii) y tienen una estabilidad de al menos un 70 %, 80 % o 90 % despues de 5 dfas de incubacion en suero a 37 °C. En ciertas realizaciones, los PBA tienen una Tm de al menos 60 °C y una estabilidad en suero de al menos un 90 %. En otras realizaciones, los 35 PBA (i) inhiben el crecimiento de las celulas tumorales, por ejemplo, en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o mas; (ii) inhiben la transduccion de senal mediada a traves de IGF-1R y ErbB3, por ejemplo, en al menos un 70 %, 80 %, 90 % o mas, (iii) son estables, por ejemplo, son al menos un 80 % monomericos en una solucion despues de 1, 2, 3, 4, 5 o mas dfas a 4 °C, a temperatura ambiente, o a 37 °C, y/o (iv) tienen una Tm, segun se determina por DSF, de al menos 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C o mas, por ejemplo, a una 40 extension similar o mas de forma mas eficiente o potente que la entidad de union en solitario o en conjunto.
Pueden usarse ensayos estandar para determinar la actividad biologica y las caracterfsticas de los PBA anti-IGF- 1R+anti-ErbB3. Los ensayos ejemplares para los siguientes ensayos se proporcionan en el presente documento en los Ejemplos: (a) ensayos para determinar la afinidad de union o Kd de un sitio de union a su diana; (b) ensayos 45 para determinar la capacidad de una protefna de union para unirse a una celula; (c) ensayos para determinar la capacidad de una protefna de union para inhibir la transduccion de senal, midiendo la inhibicion de fosforilacion de IGF-1R, ErbB3 o AkT; (d) ensayos para determinar la capacidad de un PBA para inhibir la proliferacion celular in vitro; (e) ensayos para determinar el efecto de un PBA en celulas tumorales in vivo; y (f) ensayos para determinar la estabilidad de un PBA.
50
Anticuerpos monoespecfficos monovalentes y divalentes
Tambien se describen en el presente documento anticuerpos monoespecfficos monovalentes y bivalentes que son 1) anticuerpos IgG bivalentes que pueden hacerse por la co-expresion de al menos una molecula de acido nucleico 55 que cosifica la cadena pesada y al menos una molecula de acido nucleico, que puede ser igual que o diferente de la molecula que codifica la cadena pesada, que codifica la cadena ligera del anticuerpo, o 2) anticuerpos Fv de cadena sencilla monovalentes (scFv) que pueden hacerse por la expresion de al menos una molecula de acido nucleico que codifica el scFv; cada uno expresado en un sistema de expresion adecuado, como se describe en el presente documento, incluyendo sistemas de expresion disponibles en el mercado y otros que se conocen bien en la tecnica.
Estos anticuerpos pueden ser monoclonales. Anticuerpos anti-IGF-1R
5 Tambien se describen en el presente documento anticuerpos anti-IGF-IR, que se unen especfficamente a IGF-1R humano. Tambien descrito en el presente documento, una protefna de union a IGF-1R comprende una cadena pesada y una cadena ligera que se asocian entre si para formar un resto de union, por ejemplo, un anticuerpo, o un dominio de union a antfgeno del mismo. La descripcion proporcionada en el presente documento se aplica a anticuerpos anti-IGF-IR, pero tambien a restos de union a anti-IGF-IR que estan comprendidos en los PBA. Por el 10 contrario, la descripcion de los restos de union a anti-IGF-IR se aplica a anticuerpos anti-IGF-IR o a sitios de union a antfgenos de los mismos.
Tambien descrito en el presente documento, una protefna de union a anti-IGF-1R comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR seleccionadas del grupo que consiste en una secuencia de aa de VHCDR1 que esta incluida en la secuencia 15 consenso de la SEQ ID NO:302, una secuencia de aa de VHCDR2 que esta incluida en la secuencia consenso de la SEQ ID NO:303, una secuencia de aa de VHCDR3 que esta incluida en la secuencia consenso de la SEQ ID NO:304, la secuencia de aa de VLCDR1 de SEQ ID NO:305, una secuencia de aa de VLCDR2 que esta incluida en la secuencia consenso de la SEQ ID NO:306, y una secuencia de aa de VLCDR3 que esta incluida en la secuencia consenso de la SEQ ID NO:307 (o 308). Por ejemplo, una protefna de union a anti-IGF-1R puede comprender 1, 2, 20 3, 4, 5 o 6 CDR seleccionadas del grupo que consiste en secuencias de aa VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 en una de las secuencias de aa de la figura 1, por ejemplo, una cualquiera de las SEQ ID NOs:8-31, y una secuencia de aa VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 en una de las secuencias de aa de la figura 2, por ejemplo, una de las SEQ ID NOs:32-133. Tambien descrito en el presente documento, una protefna de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende 1, 2, o 3, 4, 5 o 6 CDR seleccionadas del grupo que consiste en una secuencia de aa 25 VHCDR1, VHCDR2 o VHCDR3 de la SEQ ID NO: 11 y una secuencia de aa VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de las SEQ ID NO:35 (CDR de 16F). Tambien descrito en el presente documento, una protefna de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR seleccionadas del grupo que consiste en una secuencia de aa VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de una secuencia en la figura 1, por ejemplo, las SEQ ID NOs:8-10 y 12-31, y una secuencia de aa VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 que es de una secuencia en la figura 2, por ejemplo, 30 las SEQ ID NOs:32-34 y 36-133.
Tambien descrito en el presente documento, una protefna de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aa que se incluye por la secuencia consenso de la SEQ ID NO:1 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aa que se incluye por la secuencia consenso de la SEQ ID NO:2. Las secuencias 35 de aa VH ejemplares son aquellas de la figura 1, por ejemplo, las SEQ ID NOs:8-31. Las secuencias de aa VL ejemplares son aquellas de la figura 2, por ejemplo, las SEQ ID NO:32-133. En una realizacion, una protefna de union a anti-IGF-1R comprende una secuencia de aa VH que comprende la SEQ ID NO:11 y/o una secuencia de aa VL que comprende la SEQ ID NO:35 (dominios variables de 16F).
40 Tambien descrito en el presente documento, una protefna de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aa que esta incluida por la secuencia consenso de la SEQ ID NO:1 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aa que esta incluida por la secuencia consenso de la sEq ID NO:3. Las secuencias de aa VH ejemplares son las expuestas como las SEQ ID NOs:8-10 y 12-31. Las secuencias de aa VL ejemplares son las expuestas como las SEQ ID NOs:32-34 y 36-133.
45
Tambien se proporcionan en el presente documento anticuerpos anti-IGF-1R que se unen especfficamente a IGF-1, en los que el dominio VH comprende una secuencia de aa que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % identica a la secuencia de aa de una secuencia de aa VH de la figura 1, por ejemplo, SEQ ID NOs:8-31, y/o en los que el dominio VL comprende una secuencia de aa que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 50 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % identica a la secuencia de aa de una secuencia de aa VL de la figura 2, por ejemplo, SEQ ID NOs:32-133. Tambien descrito en el presente documento, la secuencia VH de SEQ ID NO:11 y/o se excluye la secuencia VL de SEQ ID NO:35.
Tambien se proporcionan en el presente documento anticuerpos anti-IGF-1R que se unen especfficamente a IGF- 55 1R, en los que el dominio VH comprende una secuencia de aa que difiere en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o en 1-5, 610, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50 o 50-100 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de, una secuencia de aa de la figura 1, por ejemplo, las SEQ ID NOs:8-31, y el dominio VL comprende una secuencia de aa que difiere en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o en 1-5, 6-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50 o 50-100 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de, una secuencia de aa de la figura 2, por ejemplo, las SEQ ID
NOs:32-133. Tambien descrito en el presente documento, la secuencia VH de SEQ ID NO:11 y/o se excluye la secuencia VL de SEQ ID NO:35.
Los anticuerpos anti-IGF-1R pueden tener la estructura de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo de longitud 5 completa, o un fragmento de union a antfgeno del mismo. Por ejemplo, una protefna de union a anti-IGF-1R puede comprender una cadena pesada y una cadena ligera, en la que la cadena pesada comprende en un orden N- a C- terminal: un dominio VH, un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2, un dominio CH3, y opcionalmente un dominio CH4, y en la que la cadena ligera comprende en un orden N- a C-terminal: un dominio Vl y un dominio CL. Los dominios constantes son preferiblemente humanos y pueden ser de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o una combinacion 10 de las mismas. Los dominios constantes pueden ser secuencias de origen natural o secuencias mutadas, en las que se ha hecho una o mas sustituciones, adiciones o deleciones de aa en la secuencia o secuencias de origen natural.
Una protefna de union a anti-IGF-1R puede comprender una cadena pesada que comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en cadena pesada SF (SEQ ID NO:358); cadena pesada P4 (SEQ ID NO:359); 15 cadena pesada M78 (SEQ ID NO:360) y cadena pesada M57 (SEQ ID NO:361) (figura 6A). Una protefna de union a anti-IGF-1R puede comprender tambien una cadena ligera que comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en la cadena ligera kappa SF (SEQ ID NO:202); cadena ligera kappa P4 (SEQ ID NO:204); cadena ligera kappa M78 (SEQ ID NO:206); y cadena ligera kappa M57 (SEQ ID NO:208) (figura 5A). Una protefna de union a anti-IGF-1R puede comprender una cadena pesada que comprende una secuencia de aa seleccionada 20 del grupo que consiste en una cadena pesada SF (SEQ ID NO:358); cadena pesada P4 (SEQ ID NO:359); cadena pesada M78 (SEQ ID NO:360) y una cadena pesada M57 (SEQ ID NO:361) y una cadena ligera que comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en la cadena ligera kappa SF (SEQ ID NO:202); cadena ligera kappa P4 (SEQ ID NO:204); cadena ligera kappa M78 (SEQ ID NO:206); y la cadena ligera kappa M57 (SEQ ID nO:208). En realizaciones especfficas, los anticuerpos IGF-1R comprenden una cadena pesada y una cadena ligera 25 que tienen secuencias de aa que tienen el mismo nombre, por ejemplo, una cadena pesada SF y una cadena ligera SF, una cadena pesada P4 y una cadena ligera P4, una cadena pesada M78 y una cadena ligera M78, y una cadena pesada M57 y una cadena ligera M57. Sin embargo, las cadenas pesadas y ligeras tambien pueden mezclarse y emparejarse. Por ejemplo, una cadena pesada M57 puede emparejarse con una cadena ligera M7, y una cadena pesada P4 puede emparejarse con una cadena ligera M57.
30
Se proporcionan en particular anticuerpos IgG anti-IGF-1R SF (cadena pesada SEQ ID NO:358, cadena ligera kappa SeQ iD NO:202); p4 (cadena pesada SEQ ID NO:359, cadena ligera kappa SEQ ID NO:204) M78 (cadena pesada SEQ ID NO:360, cadena ligera kappa SEQ ID NO:206) y M57 (cadena pesada SEQ ID NO:361, cadena ligera kappa SEQ ID NO:208); todos del isotipo IgG1.
35
Tambien descrito en el presente documento, una protefna de union a anti-IGF-1R comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aa que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % identica a una secuencia de aa de las SEQ ID NOs:358, 359, 360 y 361 y/o una cadena ligera que comprende una secuencia de aa que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % identica a una 40 secuencia de aa de las SEQ ID NOs:202, 204, 206 y 208.
En otras realizaciones, una protefna de union a IGF-1R comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aa que difiere en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o en 1-5, 6-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50 o 50-100 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de una secuencia de las SEQ ID NOs:358, 359, 45 360 y 361 y/o una cadena ligera comprende una secuencia de aa que difiere en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o en 1-5, 6-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50 o 50-100 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:202, 204, 206 y 208.
Las actividades y caracterfsticas biologicas de los anticuerpos anti-ErbB3 pueden determinarse con ensayos, por 50 ejemplo, los descritos en el presente documento para los PBA. Las protefnas anti-ErbB3 pueden inhibir por ligando la fosforilacion de ErbB3, la proliferacion de celulas tumorales y/o la inhibicion del crecimiento tumoral in vivo.
Los restos de union a anti-ErbB3 pueden comprender, o estar unidos a, 1, 2, 3, 4 o mas sitios de union diferente, que pueden estar en forma de un Fab, un scFv u otra forma del sitio de union. Por ejemplo, una protefna de union a 55 anti-IGF-1R puede comprender un sitio de union a anti-ErbB3, por ejemplo, un scFv anti-ErbB3.
Anticuerpos anti-ErbB3
Tambien se describen en el presente documento anticuerpos anti-ErbB3, que se unen especfficamente a ErbB3
humano. Tambien descrito en el presente documento, una protefna de union a ErbB3 comprende una cadena pesada y una cadena ligera que se asocian entre si y forman una protefna de union, por ejemplo, un anticuerpo, o un dominio de union a antfgeno del mismo. La descripcion proporcionada a continuacion se aplica a anticuerpos anti-ErbB3, pero tambien a sitios de union a anti-ErbB3 que estan comprendidos en los PBA. Por el contrario, la 5 descripcion de los sitios de union a anti-ErbB3 se aplica a anticuerpos anti-ErbB3 o sitios de union a antfgeno de los mismos.
Tambien descrito en el presente documento, una protefna de union a anti-ErbB3 comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR seleccionadas del grupo que consiste en la secuencia de aa VHCDR1 de la SEQ ID NO:309, una secuencia de aa 10 VHCDR2 que esta incluida en la secuencia consenso de la SEQ ID NO:310, una secuencia de aa VHCDR3 que esta incluida en la secuencia consenso de la SEQ ID NO:311, la secuencia de aa VLCDR1 que es de la SEQ ID NO:312, la secuencia de aa VLCDR2 que es de la SEQ ID NO:313, y una secuencia de aa VLCDR3 que esta incluida en la secuencia consenso de la SEQ ID NO:314 (o 315). Por ejemplo, una protefna de union a anti-ErbB3 puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR seleccionadas del grupo que consiste en una secuencia de aa VHCDR1, VHCDR2 15 y VHCDR3 de una secuencia en la figura 3, por ejemplo, en una cualquiera de las SEQ ID NOs:134-165, y una secuencia de aa VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de una secuencia en la figura 4, por ejemplo, en las SEQ ID NOs:166-200. En una realizacion particular, una protefna de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende 1, 2, o 3, 4, 5, o 6 CDR seleccionadas del grupo que consiste en una secuencia de aa de VHCDR1, VHCDR2 o VHCDR3 de la SEQ ID NO:143 y una secuencia de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de la SEQ ID 20 NO:175 (CDR de 16F). Tambien descrito en el presente documento, una protefna de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende 1, 2, 3, 4, 5 o 6 CDR seleccionadas del grupo que consiste en una secuencia de aa de VHCDR1, VHCDR2 o VHCDR3 de la figura 3, por ejemplo, una cualquiera de las SEQ ID NOs:134-142 y 144165, y una secuencia de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 que es de la figura 4, por ejemplo, una cualquiera de las SEQ ID NOs:166-174 y 176-200.
25
Tambien descrito en el presente documento, una protefna de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende una secuencia de aa que se incluye por la secuencia consenso de la SEQ ID NO:4 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aa que se incluye por la secuencia consenso de la SEQ ID NO:6. Las secuencias de aa VH ejemplares son aquellas de la figura 3, por ejemplo, las SEQ ID NOs:34-165. Las secuencias de aa VL 30 ejemplares son las de la Tabla 4, por ejemplo, la SEQ ID NO:166-200. En una realizacion, una protefna de union a anti-ErbB3 comprende una secuencia de aa VH que comprende la SEQ ID NO:143 y/o una secuencia de aa VL que comprende la SEQ ID NO:175 (dominios variables de 16F).
Tambien descrito en el presente documento, una protefna de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que 35 comprende una secuencia de aa que se incluye por la secuencia consenso de la SEQ ID NO:5 y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aa que se incluye por la secuencia consenso de la SEQ ID NO:7. Las secuencias de aa VH ejemplares son las expuestas como las SEQ ID NOs:134-142 y 145-165. Las secuencias de aa VL ejemplares son las expuestas como las SEQ ID NOs:166-174 y 176-200.
40 Tambien se describen en el presente documento anticuerpos anti-ErbB3 que se unen especfficamente a ErbB3, en los que el dominio VH comprende una secuencia de aa que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % identica a la secuencia de aa de una secuencia de aa VH de la figura 3, por ejemplo, SEQ ID NOs:134-165, y/o en los que el dominio VL comprende una secuencia de aa que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % identica a la secuencia de aa de una secuencia de aa VL de la figura 4, 45 por ejemplo, SEQ ID NOs:166-200. Tambien descrito en el presente documento, la secuencia VH de SEQ ID NO:143 y/o se excluye la secuencia VL de SEQ ID NO:175.
Tambien se proporcionan en el presente documento anticuerpos anti-ErbB3 que se unen especfficamente a ErbB3, en los que el dominio VH comprende una secuencia de aa que difiere en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o menos de 1-5, 50 6-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50 o 50-100 sustituciones, adiciones o eliminaciones de aa de, la secuencia de aa de la figura 3, por ejemplo, las SEQ ID NOs:134-165, y el dominio VL comprende una secuencia de aa que difiere en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o menos de 1-5, 6-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50 o 50-100 sustituciones, adiciones o eliminaciones de aa de, la secuencia de aa de la figura 4, por ejemplo, las SEQ ID NOs:166-200. Tambien descrito en el presente documento, la secuencia VH de SEQ ID 55 NO:143 y/o se excluye la secuencia VL de SEQ ID NO:175.
Los anticuerpos anti-ErbB3 pueden tener la estructura de un anticuerpo, por ejemplo, un holo-anticuerpo (anticuerpo de longitud completa) o un fragmento de union a antfgeno del mismo. Por ejemplo, una protefna de union a anti- ErbB3 puede comprender una cadena pesada y una cadena ligera, en la que la cadena pesada comprende en un
orden N- a C-terminal: un dominio VH, un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2, un dominio CH3, y opcionalmente un dominio CH4, y en la que la cadena ligera comprende en un orden N- a C-terminal: un dominio vL y un dominio CL. Los dominios constantes son preferiblemente humanos y pueden ser de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o una combinacion de las mismas. Los dominios constantes pueden ser secuencias de origen natural o secuencias 5 mutadas, en las que se ha hecho una o mas sustituciones, adiciones o deleciones de aa en la secuencia o secuencias de origen natural.
Una protefna de union a anti-ErbB3 puede comprender una cadena pesada que comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en cadena pesada P1 (SEQ ID NO:362); cadena pesada M27 (SEQ ID 10 NO:363); cadena pesada M7 (SEQ ID NO:364), cadena pesada B72 (SEQ ID NO:365) y B60 (SEQ ID NO:366) (figura 5B). Una protefna de union a anti-ErbB3 tambien puede comprender una cadena ligera que comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en una cadena ligera lambda P1 (SEQ ID NO:258); cadena ligera lambda M27 (SEQ ID NO:260); cadena ligera lambda M7 (SEQ ID NO:262); cadena ligera lambda B72 (SEQ ID NO:264) y cadena ligera lambda B60 (SEQ ID NO:266) (figura 5B). Una protefna de union a anti-ErbB3 puede 15 comprender una cadena pesada que comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en cadena pesada P1 (SEQ ID NO:362); cadena pesada M27 (SEQ ID NO:363); cadena pesada M7 (SEQ ID NO:364) cadena pesada B72 (SEQ ID NO:365) y B60 (SEQ ID NO:366), y una cadena ligera que comprende una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en una cadena ligera lambda P1 (SEQ ID NO:258); cadena ligera lambda M27 (SEQ ID NO:260); cadena ligera lambda M7 (SEQ ID NO:262); cadena ligera lambda B72 (SEQ ID NO:264) y 20 cadena ligera lambda B60 (SEQ ID NO:266). En realizaciones especfficas, los anticuerpos IGF-1R comprenden una cadena pesada y una cadena ligera que tienen secuencias de aa que tienen el mismo nombre, por ejemplo, una cadena pesada P1 y una cadena ligera P1, una cadena pesada M27 y una cadena ligera M27, una cadena pesada M7 y una cadena ligera M7, una cadena pesada B72 y una cadena ligera B72, y una cadena pesada B60 y una cadena ligera B60. Sin embargo, las cadenas pesadas y ligeras tambien pueden mezclarse y emparejarse. Por 25 ejemplo, una cadena pesada M57 puede emparejarse con una cadena ligera M7, y una cadena pesada P4 puede emparejarse con una cadena ligera M57.
Tambien se proporcionan los anticuerpos anti-ErbB3 P1 (cadena pesada SEQ ID NO:362, cadena ligera lambda SEQ ID NO:258); M27 (cadena pesada SEQ ID NO:363, cadena ligera lambda SEQ ID NO:260); M7 (cadena 30 pesada SEQ ID NO:364, cadena ligera lambda SEQ ID NO:262); B72 (cadena pesada SEQ ID nO:365, cadena ligera lambda SEQ ID NO:264); y B60 (cadena pesada SEQ ID NO:366, cadena ligera lambda SEQ ID NO:266); todos del isotipo IgG1.
Tambien descrito en el presente documento, una protefna de union a anti-ErbB3 comprende una cadena pesada que 35 comprende una secuencia de aa que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % identica a una secuencia de aa de las SEQ ID NOs:362,363, 364, 365 y 366 y/o una cadena ligera que comprende una secuencia de aa que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % identica a una secuencia de aa de las SEQ ID NOs:258, 260, 262, 264 y 266.
40 En otras realizaciones, una protefna de union a ErbB3 comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aa que difiere en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o en 1-5, 6-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50 o 50-100 sustituciones, adiciones o deleciones de aa de una secuencia de las SEQ ID NOs:362,363, 364, 365 y 366 y/o una cadena ligera comprende una secuencia de aa que difiere en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o en 1-5, 6-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50 o 50-100 sustituciones, adiciones o deleciones de 45 aa de una secuencia de aa seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:258, 260, 262, 264 y 266.
Las actividades y caracterfsticas biologicas de los anticuerpos anti-ErbB3 pueden determinarse con ensayos, por ejemplo, los descritos en el presente documento para los PBA. Las protefnas anti-ErbB3 pueden inhibir por ligando la fosforilacion de ErbB3, la proliferacion de celulas tumorales y/o la inhibicion del crecimiento tumoral in vivo. Los 50 restos de union a anti-ErbB3 pueden comprender, o estar unidos a, 1, 2, 3, 4 o mas sitios de union diferente, que pueden estar en forma de un Fab, un scFv u otra forma del sitio de union. Por ejemplo, una protefna de union a anti- ErbB3 puede comprender un sitio de union a anti-IGF-1R, por ejemplo, un scFv anti-IGF-1R.
Anticuerpos scFv 55
Tambien se describen en el presente documento scFv, por ejemplo, scFv monoclonales aislados. Los scFv ejemplares son scFv anti-IGF-1R y scFv anti-ErbB3. Los scFv ejemplares son polipeptidos que comprenden un dominio VH y un dominio VL que estan unidos entre sf por un enlazador scFv. Las cadenas VH y VL de un scFv se unen entre sf por un enlazador scFv que se interpone entre las cadenas VH y VL. Los enlazadores scFv pueden
consistir en una secuencia de aa contigua de 10-30 aa, tal como de 15 a 20 aa. Los enlazadores scFv ejemplares son enlazadores Gly-Ser (SEQ ID NO:399),
que pueden ser (Gly4Ser)n (SEQ ID NO:401), en la que n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. Los enlazadores scFv preferidos comprenden (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO:396) o (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO:397). Otros enlazadores scFv 5 preferidos comprenden 1-5 aa ademas de (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO:396) o (Gly4Ser)4 (SEQ ID NO:397), por ejemplo, AST, y pueden comprender la siguiente secuencia de aa: AST(Gly4Ser)3 (SeQ ID No:400) o AST(Gly4Ser)4 (SeQ ID NO:402).
Un anticuerpo scFv anti-IGF-1R puede comprender un dominio VH que comprende un conjunto de tres VHCDR que 10 comprende VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3, y un dominio VL que comprende un conjunto de tres VLCDR que comprende VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3, comprendiendo dichas CDR las secuencias de aa de las SEQ ID NOs:302, 303 o 304, 305, 306 o 307 (o 308), respectivamente, y en el que cada CDR comprende ademas un extremo amino y un extremo carboxi, en el que las CDR de cada conjunto de CDR se disponen en el dominio variable en un orden lineal de amino a carboxi de CDR1, CDR2 y CDR3, y en el que X aa en las SEQ ID NOs:302, 15 304, 305, 306, 307 (o 308) representan un aa variable, que puede ser cualquier aa situado en la posicion correspondiente en la figura 1 (para VH) y la figura 2 (para VL). Los scFv anti-IGF-1R pueden comprender una VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de un dominio VH que consiste en una secuencia de aa del grupo de secuencias de aa VH en la figura 1, por ejemplo, que consiste en las SEQ ID NOs:8-31, y/o una VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de un dominio VL que consiste en una secuencia de aa del grupo de secuencias de aa VL en la figura 2, por ejemplo, 20 que consiste en las SEQ ID NOs:32-133. Tambien se describe en el presente documento, un scFv anti-IGF-1R no comprende ninguna de las seis CDR de 16F o no comprende ni el dominio VH de 16F ni el dominio VL de 16F. Por ejemplo, un scFv comprende las secuencias de aa VH y VL que difieren de las de 16F en al menos un aa.
Los anticuerpos scFv anti-IGF-1R pueden comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ 25 ID NO:1 y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aa expuesta en la SEQ ID NO:2 (o 3), en la que los aa X en las sEq ID NOs:1, 2 y 3 son aa variables que pueden ser cualquier aa en la posicion correspondiente en la figura 1 (para el dominio VH) y la figura 2 (para el dominio VL). Los anticuerpos scFv anti-IGF-1R pueden comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aa de la figura 1, por ejemplo, seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:8-31, y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aa de la figura 2, por ejemplo, 30 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:32-133.
Los scFv anti-IGF-1R ejemplares comprenden un dominio VH que consiste, o al menos que comprende, en las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de, una secuencia de aa seleccionada del grupo de secuencias de aa VH que consiste en las SEQ ID Nos:8, 9, 10 y 11 (la ubicacion de estas CDR se muestra en la figura 1). Los 35 scFv anti-IGF-1R tambien pueden comprender un dominio VL que consiste en, o al menos que comprende, las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de, una secuencia de aa seleccionada del grupo de secuencias de aa VL que consiste en las SEQ ID Nos:32, 33, 34 y 35 (la ubicacion de estas CDR se muestra en la figura 2). Tambien descrito en el presente documento, los scFv anti-IGF-1R comprenden un dominio VH que consiste en, o al menos que comprende, las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de, una secuencia de aa 40 seleccionada del grupo de secuencias de aa VH que consiste en las SEQ ID Nos:8, 9, 10 y 11 y un dominio VL que consiste en, o al menos que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de, una secuencia de aa seleccionada del grupo de secuencias de aa VL que consiste en las SEQ ID Nos:32, 33, 34 y 35. En realizaciones particulares, un scFv anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende el dominio VH que consiste en, o al menos que comprende, las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de, SEQ ID No:8 y 45 un dominio VL que consiste en, o al menos que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de, una secuencia de aa que consiste en la SEQ ID No:32 (modulo M57). En realizaciones particulares, un scFv anti- IGF-1R comprende un dominio VH que comprende el dominio VH que consiste en, o al menos que comprende, las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de, SEQ ID No:9 y un dominio VL que consiste en, o al menos que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de, una secuencia de aa que consiste en la 50 SEQ ID No:33 (modulo M78). En realizaciones particulares, un scFv anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende el dominio VH que consiste en, o al menos que comprende, las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de, SEQ ID No: 10 y un dominio VL que consiste en, o al menos que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de, una secuencia de aa que consiste en la sEq ID No:34 (modulo P4). En realizaciones particulares, un scFv anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende el dominio VH que 55 consiste en, o al menos que comprende, las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de, SEQ ID No:8 y un dominio VL que consiste en, o al menos que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de, una secuencia de aa que consiste en la SEQ ID No:33 (modulo M57/M78). En realizaciones particulares, un scFv anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende el dominio VH que consiste en, o al menos que comprende, las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de, SEQ ID No: 10 y un dominio VL que consiste en, o al
Un anticuerpo scFv anti-ErbB3 puede comprender un dominio VH que comprende un conjunto de tres VHCDR que 5 comprende VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3, y un dominio VL que comprende un conjunto de tres VLCDR que comprende VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3, comprendiendo dichas CDR las secuencias de aa de las SEQ ID NOs:309, 310 o 311, 312, 313 o 314 (o 315), respectivamente, y en el que cada CDR comprende ademas un extremo amino y un extremo carboxi, en el que las CDR de cada conjunto de CDR se disponen en el dominio variable en un orden lineal de amino a carboxi de CDR1, CDR2 y CDR3, y en el que X aa en 309, 310 o 311, 312, 10 313 o 314 (o 315) representan un aa variable, que puede ser cualquier aa localizado en la posicion correspondiente en la figura 1 (para VH) y la figura 2 (para VL). Los scFv anti-ErbB3 pueden comprender una VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de un dominio VH que consiste en una secuencia de aa del grupo de secuencias de aa VH en la figura 3, por ejemplo, que consiste en las SEQ ID NOs:134-165, y/o una VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de un dominio VL que consiste en una secuencia de aa del grupo de secuencias de aa VL en la figura 4, por ejemplo, que consiste en las 15 SEQ ID NOs:166-200. Tambien se describe en el presente documento, un scFv anti-ErbB3 no comprende ninguna de las seis CDR de 16F o no comprende ni el dominio VH de 16F ni el dominio VL de 16F. Por ejemplo, un scFv comprende las secuencias de aa VH y VL que difieren de las de 16F en al menos un aa.
Los anticuerpos scFv anti-ErbB3 pueden comprender un dominio VH que comprende la secuencia de aa de la SEQ 20 ID NO:4 (o 5) y/o un dominio VL que comprende la secuencia de aa expuesta en la SEQ ID NO:6 (o 7), en la que los aa X en las sEq ID NOs:4, 5, 6 y 7 son aa variables que pueden ser cualquier aa en la posicion correspondiente en la figura 3 (para el dominio VH) y la figura 4 (para el dominio VL). Los anticuerpos scFv anti-ErbB3 pueden comprender un dominio VH que comprende una secuencia de aa en la figura 3, por ejemplo, seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:134-165, y/o un dominio VL que comprende una secuencia de aa en la figura 4, por 25 ejemplo, seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:166-200.
Los scFv anti-ErbB3 ejemplares comprenden un dominio VH que consiste, o al menos que comprende, en las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de, una secuencia de aa seleccionada del grupo de secuencias de aa VH que consiste en las SEQ ID Nos:134-143 (la ubicacion de estas CDR se muestra en la figura 3). Los scFv 30 anti-ErbB3 tambien pueden comprender un dominio VL que consiste en, o al menos que comprende, las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de, una secuencia de aa seleccionada del grupo de secuencias de aa VL que consiste en las SEQ ID Nos:166-175 (la ubicacion de estas CDR se muestra en la figura 4). Tambien descrito en el presente documento, los scFv anti-ErbB3 comprenden un dominio VH que consiste en, o al menos que comprende, las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de, una secuencia de aa seleccionada del 35 grupo de secuencias de aa VH que consiste en las SEQ ID Nos:134-143 y un dominio VL que consiste en, o al menos que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de, una secuencia de aa seleccionada del grupo de secuencias de aa VL que consiste en las SEQ ID Nos:166-175. En realizaciones particulares, un scFv anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende el dominio VH que consiste en, o al menos que comprende, las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de, SEQ ID No: 134 y un dominio 40 VL que consiste en, o al menos que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de, una secuencia de aa que consiste en la SEQ ID No:166 (modulo B60). En realizaciones particulares, un scFv anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende el dominio VH que consiste en, o al menos que comprende, las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de, SEQ ID No: 135 y un dominio VL que consiste en, o al menos que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de, una secuencia de aa que 45 consiste en la sEq ID No:167 (B72). En realizaciones particulares, un scFv anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende el dominio VH que consiste en, o al menos que comprende, las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de, SEQ ID No:136 y un dominio VL que consiste en, o al menos que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de, una secuencia de aa que consiste en la SEQ ID No:168 (modulo M27). En realizaciones particulares, un scFv anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende el 50 dominio VH que consiste en, o al menos que comprende, las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de, SEQ ID No:137 y un dominio VL que consiste en, o al menos que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de, una secuencia de aa que consiste en la SEQ ID No:169 (modulo M7). En realizaciones particulares, un scFv anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende el dominio VH que consiste en, o al menos que comprende, las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de, SEQ ID No:138 y un dominio 55 VL que consiste en, o al menos que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de, una secuencia de aa que consiste en la SEQ ID No: 170 (modulo P1). En realizaciones particulares, un scFv anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende el dominio VH que consiste en, o al menos que comprende, las secuencias de aa de VHCDR1, VHcDr2 y VHCDR3 de, SEQ ID No:139 y un dominio VL que consiste en, o al menos que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de, una secuencia de aa que
consiste en la SEQ ID No: 171 (modulo M27). En realizaciones particulares, un scFv anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende el dominio VH que consiste en, o al menos que comprende, las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de, SEQ ID No: 140 y un dominio VL que consiste en, o al menos que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de, una secuencia de aa que consiste en la SEQ ID No: 172 5 (modulo B69). En realizaciones particulares, un scFv anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende el dominio VH que consiste en, o al menos que comprende, las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de, SEQ ID No:141 y un dominio VL que consiste en, o al menos que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de, una secuencia de aa que consiste en la SEQ ID No: 173 (modulo P6). En realizaciones particulares, un scFv anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende el dominio VH que consiste en, o al 10 menos que comprende, las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de, SEQ ID No: 142 y un dominio VL que consiste en, o al menos que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de, una secuencia de aa que consiste en la SEQ ID No: 174 (modulo M1.3). En realizaciones particulares, un scFv anti- ErbB3 comprende un dominio VH que comprende el dominio VH que consiste en, o al menos que comprende, las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de, SEQ ID No: 143 y un dominio VL que consiste en, o al 15 menos que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de, una secuencia de aa que consiste en la SEQ ID No: 175 (modulo C8). En realizaciones particulares, un scFv anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende el dominio VH que consiste en, o al menos que comprende, las secuencias de aa de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3 de, SEQ ID No:136 y un dominio VL que consiste en, o al menos que comprende las secuencias de aa de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 de, una secuencia de aa que consiste en la SEQ ID No:169 20 (modulo M27/M7).
Los scFv ejemplares son los anticuerpos scFv anti-IGF-1R P4 (SEQ ID NO:367), M57(SEQ ID NO:368), M78, (SEQ ID NO:369), y M76 (SEQ ID NO:382); asf como los anticuerpos scFv anti-ErbB3 C8 (SEQ ID NO:370), P1 (SEQ ID NO:371), M1.3 (SEQ ID NO:372), M27 (SEQ ID NO:373), P6 (SEQ ID NO:374), B69 (SEQ ID NO:375) y P6L (SEQ 25 ID NO:383).
Los scFv tambien pueden comprender una CDR, un dominio variable o su aa de longitud completa que difiere de una CDR, un dominio variable, o un scFv de longitud completa, respectivamente, que se exponen en el presente documento en una o mas adiciones, deleciones o sustituciones de aa, conservando al mismo tiempo sus 30 propiedades de union. Por ejemplo, una CDR puede diferir en 1 o 2 aa de una secuencia CDR proporcionada en el presente documento; un dominio variable puede diferir en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aa de una secuencia de dominio variable proporcionada en el presente documento; y un scFv puede diferir en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 o 50 aa de un scFv, respectivamente, proporcionado en el presente documento. Un scFv tambien puede comprender una CDR, un dominio variable o su secuencia de aa de longitud completa que es al menos un 70 %, 80 35 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o un 99 % identica a una secuencia de una CDR, dominio variable o secuencia scFv de longitud completa que se proporciona en el presente documento. En una realizacion, un scFv comprende una secuencia de aa que es al menos un 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, o un 99 % identica a una secuencia de aa seleccionada del grupo de secuencias scFv que consisten en la SEQ ID NO:367, 368, 369, 370, 372, 373, 374, y 375.
40
Tambien descrito en el presente documento, los scFv comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aa en el extremo amino o el extremo carboxi del dominio VL. Por ejemplo, si el extremo carboxi de un scFv de interes sera un aa que puede estar recortado por una enzima, tal como una carboxipeptidasa (por ejemplo, una lisina o una arginina), se pueden anadir uno o mas aa para evitar que el aa se recorte. Por ejemplo, el "RT" de aa del dominio CL puede 45 anadirse al extremo carboxi "VEIK" en los scFv anti-IGF-1R, como se muestra, por ejemplo, en las SEQ ID NOs:367- 369.
Acidos nucleicos, vectores de expresion y celulas huesped
50 Se proporcionan en el presente documento acidos nucleicos, por ejemplo, ADN o ARN, que codifican los polipeptidos descritos en el presente documento. Las secuencias nucleotfdicas ejemplares proporcionadas en el presente documento son las que codifican las secuencias de aa de las figuras 1-7, tal como las secuencias nucleotfdicas del Apendice, o porciones de las mismas, tales como porciones que codifican 1, 2, 3, 4 o 5 dominios. Tambien se incluyen las secuencias nucleotfdicas que son al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 55 95 %, 97 %, 98 %, o un 99 % identicas a una secuencia nucleotfdica que codifica una secuencia de aa expuesta en el presente documento, por ejemplo, las secuencias nucleotfdicas expuestas en el presente documento. Dichas secuencias nucleotfdicas pueden codificar una protefna expuesta en el presente documento o pueden codificar una protefna que es al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o un 99 % identica o similar a una protefna expuesta en el presente documento o una porcion de la misma (por ejemplo, un dominio), tal como una
Una secuencia nucleotfdica que codifica la cadena pesada de 16F con una secuencia lider (secuencia de aa SEQ ID NO:300) se expone como la SEQ ID NO:299. Una secuencia nucleotfdica que codifica la cadena ligera de 16F con 5 una secuencia lider (secuencia de aa SEQ ID NO:298) se expone como la SEQ ID NO:297.
En ciertas realizaciones, un acido nucleico codifica la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo que comprende una secuencia lider (o peptido senal). Una secuencia lider ejemplar es la mostrada en la figura 7 para 16F. Por consiguiente, tambien se proporcionan en el presente documento anticuerpos, por ejemplo, los mostrados en las 10 figuras 5 y 6, unidos a una secuencia lider, tal como la mostrada en la figura 7, y acidos nucleicos que codifican los mismos.
En ciertas realizaciones, un acido nucleico esta unido a una secuencia que potencia o promueve la expresion de la secuencia nucleotfdica en una celula para producir una protefna. Dichos acidos nucleicos pueden incluirse dentro de 15 un vector, por ejemplo, un vector de expresion. Para expresar una protefna que es una protefna transmembrana, es tambien preferible incluir una secuencia senal, por ejemplo, la de la figura 7A, cuya secuencia senal se elimina frecuentemente para formar una protefna madura.
Tambien se incluyen en el presente documento celulas, por ejemplo, una celula huesped que comprende un acido 20 nucleico o un vector proporcionado en el presente documento.
Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden producirse por medios recombinantes. Los metodos para la produccion recombinante son ampliamente conocidos en el estado de la tecnica y comprenden la expresion de protefnas en celulas procariotas y eucariotas con el posterior aislamiento del anticuerpo y habitualmente 25 purificacion hasta una pureza farmaceuticamente aceptable. Para la expresion de los anticuerpos en una celula huesped, los acidos nucleicos que codifican los respectivos polipeptidos, por ejemplo, cadenas ligeras y pesadas, se insertan en vectores de expresion por metodos estandar. La expresion se realiza en celulas huesped procariotas o eucarioticas apropiadas, tales como celulas CHO, celulas NSO, celulas SP2/0, celulas HEK293, celulas COS, celulas PER.C6, levaduras o celulas de E. coli, y la protefna de union se recupera de las celulas (sobrenadante o 30 celulas despues de la lisis). Los metodos generales para la produccion recombinante de anticuerpos se conocen bien en la tecnica.
Los anticuerpos pueden separarse adecuadamente del medio de cultivo mediante procedimientos convencionales de purificacion de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, protefna A-Sepharose, cromatograffa de 35 hidroxilapatito, electroforesis en gel, dialisis o cromatograffa de afinidad. El ADN y el ARN que codifican los anticuerpos se afslan facilmente y se secuencian usando procedimientos convencionales. Las celulas de hibridoma pueden servir como una fuente de dicho ADN y ARN. Una vez aislado, el ADN puede insertarse en los vectores de expresion, que se transfectan a continuacion en celulas huesped tales como celulas HEK 293, celulas CHO o celulas de mieloma que de otro modo no producen protefna de inmunoglobulina, para obtener la sfntesis de anticuerpos 40 recombinantes en las celulas huesped.
Las variantes de secuencia de aa (por ejemplo, mutantes) de los anticuerpos pueden prepararse introduciendo cambios de nucleotidos apropiados en el ADN del anticuerpo, o mediante sfntesis de nucleotidos.
45 La "celula huesped" representa cualquier tipo de sistema celular que puede disenarse para generar los anticuerpos descritos en el presente documento. En una realizacion, se usan celulas HEK293 y celulas CHO como celulas huesped, en otras se usan celulas CHO o NSO.
Las secuencias de control que son adecuadas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente 50 una secuencia operadora, y un sitio de union al ribosoma. Se sabe que las celulas eucarioticas utilizan promotores, potenciadores y senales de poliadenilacion.
Un acido nucleico esta "unido operativamente" cuando se coloca en una relacion funcional con otra secuencia de acido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una secuencia pre-secuencia lider o secretora esta unido operativamente 55 al ADN para un polipeptido si se expresa como una pre-protefna que participa en la secrecion del polipeptido; un promotor o potenciador esta operativamente unido a una secuencia codificante si afecta a la transcripcion de la secuencia; o un sitio de union al ribosoma esta operativamente unido a una secuencia de codificacion si esta situado para facilitar la traduccion. Generalmente, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que estan unidas son contiguas y, en el caso de un lider de secrecion, contiguas y en el marco de lectura. Sin embargo, los
potenciadores no tienen que ser contiguos. La union se logra mediante ligacion en sitios de restriccion convenientes. Si dichos sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleotidos sinteticos se usan de acuerdo con la practica convencional.
5 La purificacion de anticuerpos puede llevarse a cabo con el fin de eliminar componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros acidos nucleicos o protefnas celulares, mediante tecnicas estandar, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, bandas CsCl, cromatograffa en columna, electroforesis en gel de agarosa y otros ya conocidos en la tecnica. Diferentes metodos estan bien establecidos y se utilizan ampliamente para la purificacion de protefnas, tales como cromatograffa de afinidad con protefnas microbianas (por ejemplo, cromatograffa de afinidad 10 de protefna A o protefna G), cromatograffa de intercambio ionico (por ejemplo, intercambio cationico (resinas de carboximetilo), intercambio anionico (resinas de amino etilo), e intercambio en modo mixto), adsorcion tiofila (por ejemplo, con beta-mercaptoetanol y otros ligandos SH), interaccion hidrofoba o cromatograffa de adsorcion aromatica (por ejemplo, con fenil-sepharose, resinas aza-arenofflicas o acido m-aminofenilboronico), cromatograffa de afinidad de quelatos metalicos (por ejemplo, con material de afinidad con Ni (II) y Cu (II), cromatograffa de 15 exclusion por tamanos, y metodos electroforeticos (tales como electroforesis en gel, electroforesis capilar).
Metodos de uso de los anticuerpos proporcionados en el presente documento
Se proporcionan en el presente documento metodos para utilizar los anticuerpos descritos en el presente 20 documento, por ejemplo, un PBA anti-IGF-IR + anti-ErbB3, un anticuerpo anti-IGF-IR y un anticuerpo anti-ErbB3, para aplicaciones terapeuticas. Los anticuerpos desvelados en el presente documento pueden usarse para tratar una enfermedad o trastorno asociado con una senalizacion dependiente de ErbB3 y/o IGF-1R, incluyendo una diversidad de canceres.
25 En una realizacion, se proporciona un metodo para inhibir la proliferacion de una celula tumoral que expresa IGF-1R y ErbB3 que comprende poner en contacto la celula tumoral con un anticuerpo biespecffico (opcionalmente polivalente) anti-IGF-1R + anti-ErbB3, de manera que la proliferacion de la celula tumoral se inhibe, se ralentiza o se detiene, o de tal forma que la celula tumoral muere.
30 Se proporcionan en el presente documento metodos para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la senalizacion dependiente de ErbB3 y/o IGF-1R administrando a un paciente un anticuerpo desvelado en el presente documento en una cantidad eficaz para tratar la enfermedad o trastorno. Las enfermedades o trastornos adecuados incluyen, por ejemplo, una variedad de canceres que incluyen, pero sin limitacion, cancer de mama y los que se exponen a continuacion. En una realizacion, un metodo para tratar un sujeto que tiene una enfermedad proliferativa, 35 tal como cancer, comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapeuticamente eficaz de uno o mas anticuerpos descritos en el presente documento, tales como un anticuerpo biespecffico anti-IGF-1R + ErbB3.
Tambien se proporciona un metodo para (o un anticuerpo biespecffico, por ejemplo, en un medicamento para) tratar un tumor que expresa IGF-1R y ErbB3 en un paciente, comprendiendo el metodo administrar una cantidad eficaz de 40 un anticuerpo como se describe en el presente documento (por ejemplo, eficaz para retardar o detener el crecimiento del tumor, o para encoger un tumor o para retardar o detener la invasividad tumoral o la metastasis tumoral). Se puede tratar cualquier tumor que exprese IGF-1R y ErbB3, incluyendo tumores de los siguientes canceres: cancer de pulmon, sarcoma, cancer colorrectal, cancer pancreatico, cancer de prostata, carcinoma de celulas renales, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), melanoma y cancer de mama. Los 45 ejemplos particulares de dichos tumores incluyen: cancer de pulmon de celulas no pequenas, sarcoma de Ewing, cancer de mama positivo para el receptor de estrogenos resistente al tamoxifeno, cancer de mama metastasico HER2-positivo resistente a trastuzumab o resistente a lapatinib, cancer de pulmon resistente a gefitinib o erlotinib, cancer colorrectal resistente a cetuximab o resistente a panitumumab, carcinoma de celulas escamosas de cabeza y cuello resistente a cetuximab (HNSCC) y cancer de pancreas resistente a erlotinib.
50
Tambien se proporcionan kits que comprenden uno o mas anticuerpos desvelados en el presente documento. Los kits pueden incluir una etiqueta que indique el uso pretendido del contenido del kit y opcionalmente incluir instrucciones para el uso del kit en el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado a la senalizacion dependiente de ErbB3 y/o IGF-1R, por ejemplo, el tratamiento de un tumor. El termino etiqueta incluye cualquier 55 material de escritura, marketing o material grabado suministrado en o con el kit, o que de otro modo acompana al kit.
Un metodo para tratar un tumor proporcionado en el presente documento puede comprender ademas la administracion de un segundo agente anticanceroso en combinacion con el anticuerpo. Por lo tanto, se contemplan nuevas composiciones farmaceuticas que comprenden un anticuerpo desvelado en el presente documento, junto
con un segundo agente anticanceroso, tfpicamente un agente biologico, junto con al menos un vehfculo o excipiente farmaceuticamente aceptable.
Composiciones farmaceuticas 5
En otro aspecto, se proporciona una composicion, por ejemplo, una composicion farmaceutica, para el tratamiento de un tumor en un paciente, asf como metodos de uso de cada una de dichas composiciones para tratar un tumor en un paciente. Las composiciones proporcionadas en el presente documento contienen uno o mas de los anticuerpos desvelados en el presente documento, formulados junto con un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Como se 10 usa en el presente documento, "vehfculo farmaceuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardadores de la absorcion y similares, que son fisiologicamente compatibles. Preferiblemente, el vehfculo es adecuado para administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea, parenteral, espinal o epidermica (por ejemplo, por inyeccion o infusion). Dependiendo de la via de administracion, el anticuerpo puede recubrirse con un material para protegerlo 15 de la accion de acidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar las protefnas.
Las composiciones farmaceuticas pueden administrarse en solitario o en terapia de combinacion, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinacion puede incluir un anticuerpo de la presente divulgacion con al menos un agente terapeutico adicional, tal como un agente anticanceroso. Las composiciones 20 farmaceuticas tambien se pueden administrar junto con otra modalidad de tratamiento contra el cancer, tal como radioterapia y/o cirugfa.
Una composicion de la presente divulgacion puede administrarse por una diversidad de metodos conocidos en la tecnica. Como se apreciara por el experto en la tecnica, la via y/o el modo de administracion variaran dependiendo 25 de los resultados deseados.
Para administrar una composicion proporcionada en el presente documento por ciertas vfas de administracion, puede ser necesario o deseable recubrir el anticuerpo con, o coadministrar el anticuerpo con, un material para evitar su inactivacion. Por ejemplo, el anticuerpo puede administrarse a un paciente en un vehfculo apropiado, por ejemplo, 30 en liposomas, o un diluyente. Los diluyentes farmaceuticamente aceptables incluyen una solucion salina y soluciones tampon acuosas. Los liposomas incluyen emulsiones CGF de agua en aceite en agua, asf como liposomas convencionales.
Los vehfculos farmaceuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles y polvos esteriles 35 para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmaceuticamente activas se conoce en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier excipiente, diluyente o agente sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmaceuticas proporcionadas en el presente documento. Los compuestos activos complementarios (por ejemplo, agentes anticancerosos adicionales) tambien pueden incorporarse en las composiciones.
40
Las composiciones terapeuticas tfpicamente deben ser esteriles y estables bajo las condiciones de fabricacion y almacenamiento. La composicion se puede formular como una solucion, microemulsion, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una concentracion elevada de farmaco. El vehfculo puede ser un disolvente o medio de dispersion que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol 45 lfquido y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Pueden emplearse soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehfculos lfquidos, particularmente para soluciones inyectables. La composicion, si se desea, tambien puede contener cantidades menores de agentes humectantes o potenciadores de la solubilidad, estabilizadores, conservantes o agentes tamponantes del pH. En muchos casos, sera util incluir agentes isotonicos, por ejemplo, cloruro sodico, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, glicerol, 50 propilenglicol y polietilenglicol lfquido en la composicion. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede llevarse a cabo incluyendo en la composicion un agente que retrase la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos no deben interpretarse como limitativos del alcance de esta divulgacion.
Materiales y metodos
A lo largo de los ejemplos, se utilizan los siguientes materiales y metodos, a menos que se indique otra cosa. En general, la practica de las tecnicas de la presente divulgacion emplea, a menos que se indique otra cosa, tecnicas 5 convencionales de qufmica, biologfa molecular, tecnologfa de ADN recombinante, inmunologfa (especialmente, por ejemplo, tecnologfa de anticuerpos), farmacologfa, farmacia y tecnicas estandar en la preparacion de polipeptidos.
Ligandos
10 Como se usa en estos Ejemplos y en las figuras, "HRG" se refiere a la isoforma de heregulina conocida como heregulina 1 beta 1 (a veces denominada como HRG1-B, HRG-p1, neuregulina 1, NRG1, neuregulina 1 beta 1, NRG1-b1, o HRG eCd), por ejemplo, R&D Systems, 377-HB-050/CF. Como se usa en estos Ejemplos y en las figuras, IGF-1 se refiere al factor de crecimiento de tipo insulina 1, por ejemplo, R&D Systems, 291-GI-O50/CF.
15 Lfneas celulares
Todas las lfneas celulares humanas para su uso en los experimentos descritos a continuacion pueden obtenerse, segun se indica, a partir de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (ATCC, Manassas, VA) o el US National Cancer Institute (NCI), por ejemplo, de la Division of Cancer T reatment and Diagnostics (DCTD).
20
- MCF7 - ATCC® cat. N.° HTB-22™
- ADRr-NCI (redesignado NCI/ADR-RES)
- BxPC-3 - ATCC® cat. N.° CRL-1687™
- DU145 - ATCC® cat. N.° HTB-81™
25 - Caki-1-ATCC® cat. N.° HTB-46™
- SK-ES-1 - ATCC® cat. N.° HTB-86™
El anticuerpo monoclonal anti-humano-IGF-1R de raton mAb391 (IgG1, R & D Systems MAB391) se usa como un control de anticuerpo de IgG anti-IGF-1R.
30
Ejemplo 1: Diseno racional de productos terapeuticos de anticuerpo que se dirigen a multiples rutas de senalizacion
La ruta ErbB ha sido durante mucho tiempo el foco de la investigacion contra el cancer debido a la alta expresion de 35 los receptores ErbB en tipos especfficos de cancer: HER2/ErbB2 se amplifica geneticamente en algunos canceres de mama, y EGFR/ErbB1 esta altamente expresado en canceres de colon y NSCLC. Para dos miembros de la ruta EGFR/ErbB1 y HER2/ErbB2, hay agentes anticuerpos monoclonales aprobados (por ejemplo, cetuximab y trastuzumab) e inhibidores de tirosina cinasa de molecula pequena (por ejemplo, erlotinib, lapatinib). Estos productos terapeuticos alteran la capacidad de los estfmulos extracelulares para activar las redes de senalizacion intracelular 40 aguas abajo; sin embargo, es diffcil determinar que representa una estrategia terapeutica optima dado que la red de senalizacion de ErbB es bastante compleja (figura 9A). Ademas de EGFR/ErbB1 y HER2/ErbB2 (sin actividad de union a ligando), hay otros dos miembros de la ruta ErbB - ErbB3 (sin actividad cinasa) y ErbB4. Los cuatro receptores pueden dimerizarse entre sf a varios grados despues de la activacion del ligando, contribuyendo a una etapa esencial requerida para la transmision de senal intracelular. Despues de la dimerizacion, los receptores 45 pueden internalizarse y reciclarse a velocidades que dependen del tipo de dfmero, asf como del estado de activacion de las rutas de senalizacion aguas abajo, tal como la ruta PI3K.
La complejidad de la red ErbB, combinada con la capacidad para medir la abundancia y el estado de activacion de los componentes clave, presta la red al modelado computacional. Mediante el uso de modelos computacionales 50 puede describirse una serie de fenomenos biologicos, tal como la dependencia de la dimerizacion del trafico de receptores, el control de la amplificacion de la senal a traves de bucles de retroalimentacion y la dependencia del ligando de la propagacion de senal. Por ejemplo, para determinar una estrategia optima para inhibir la ruta ErbB, se construyo un modelo de red para describir la activacion de la ruta PI3K/AKT en respuesta a los ligandos betacelulina e heregulina, que activan selectivamente los heterodfmeros EGFR/ErbB1 o ErbB3, respectivamente. El modelo 55 mecanico represento los procesos de: union a ligando; dimerizacion del receptor; trafico de receptores y la propagacion de senales, con una serie de reacciones definidas por cinetica de accion masiva. Con el fin de hacer predicciones fiables, los modelos mecanicos tienen que ser entrenados en primer lugar usando experimentos temporales y dependientes de la dosis que capturan eventos dinamicos clave, especfficamente la activacion de los receptores ErbB y la ruta PI3K/AKT. Los componentes de red con mayor influencia se identificaron por analisis de
sensibilidad, donde cada componente de la red se altera sutilmente y se evalua la contribucion relativa a la salida de aguas abajo (figura 9B).
Usando estos metodos se genero un modelo computacional de la red ErbB, que identifico el ErbB3 sin actividad 5 cinasa como el activador mas fuerte de la ruta PI3K/AKT. De hecho, a pesar de su bajo nivel de expresion, en presencia de heregulina o betacelulina, ErbB3 proporciono la mayor contribucion a la activacion de la ruta PI3K/AKT en el modelo. En particular, esta observacion in silico se aplico incluso a lfneas celulares que expresan niveles relativamente bajos de ErbB3 y niveles 10 veces superiores de EGFR/ErbB1 o HER2/ErbB2.
10 Ademas de identificar dianas optimas, el modelado mecanico puede usarse tambien para determinar caracterfsticas optimas de diseno terapeutico. En el caso de dirigir el ErbB3 sin actividad cinasa, las simulaciones de optimizacion de un anticuerpo monoclonal terapeutico exploraron varias caracterfsticas de diseno, tales como la union a ErbB3, la prevencion de la union a la heregulina, y el bloqueo de la dimerizacion, con un enfoque especial en el bloqueo de la dimerizacion de EGFR/ErbB3 inducida por ligando. La simulacion se uso para determinar la afinidad requerida para 15 conseguir la inhibicion maxima de la fosforilacion de AKT a traves de la simulacion de inhibidores dentro de un intervalo de constantes de velocidad de disociacion. A partir de esta simulacion, se predijo que una afinidad de 1 nanomolar era suficiente para la potencia maxima del inhibidor, mostrando los inhibidores de mayor afinidad solo una mejora limitada (figura 9C).
20 La complejidad anadida de un agente biespecffico que interactua con un sistema biologico crea una oportunidad aun mayor de utilizar el modelado mecanico para guiar los esfuerzos de ingenierfa. Todas las protefnas biespecfficas se unen a sus dianas de una manera dependiente de la afinidad para cada diana, la capacidad de entrecruzamiento mejorada por avidez y la abundancia relativa de cada diana. El diseno de biespecificidad optimizada para la potente inhibicion tambien requiere el conocimiento de la afinidad de los ligandos competidores y los companeros de 25 dimerizacion, si los hay, asf como la fuerza relativa de cada diana en la activacion de cascadas de senalizacion aguas abajo comunes y mecanismos posteriores de supervivencia y crecimiento celular. La Kd deseable aparente puede lograrse a traves de multiples rondas de afinidad y mejoras de avidez, y el modelo de simulacion puede guiar los esfuerzos de ingenierfa hacia el formato molecular mas adecuado y la ruta de optimizacion simplificada La simulacion puede usarse para explorar el rendimiento de un concepto de protefna biespecffica para permutaciones 30 de afinidad diana, avidez y niveles de expresion de diana.
Un anticuerpo biespecffico disenado para inhibir dos receptores del factor de crecimiento de superficie celular (IGF- 1R, ERBB3) con un unico resto de union dirigido hacia cada diana
35 Todas las protefnas biespecfficas se unen a sus dianas de una manera dependiente de la afinidad para cada diana, la capacidad de entrecruzamiento mejorada por avidez y la abundancia relativa de cada diana; la complejidad anadida de una interaccion biespecffica con un sistema biologico crea una oportunidad aun mayor de utilizar el modelado mecanico para guiar los esfuerzos de ingenierfa. El diseno de biespecificidad optimizada para la potente inhibicion tambien requiere el conocimiento de la afinidad de los ligandos competidores y los companeros de 40 dimerizacion, si los hay, asf como la fuerza relativa de cada diana en la activacion de cascadas de senalizacion aguas abajo comunes y mecanismos posteriores de supervivencia y crecimiento celular. La Kd deseable aparente puede lograrse a traves de multiples rondas de afinidad y mejoras de avidez, y el modelo de simulacion puede guiar los esfuerzos de ingenierfa hacia el formato molecular mas adecuado y la ruta de optimizacion simplificada La simulacion puede usarse para explorar el rendimiento de un concepto de protefna biespecffica para permutaciones 45 de afinidad diana, avidez y niveles de expresion de diana.
La simulacion del comportamiento dosis-respuesta de un anticuerpo biespecffico disenado para inhibir dos receptores del factor de crecimiento de la superficie celular (IGF-1R y ErbB3) con un unico resto de union dirigido hacia cada diana en este sistema revela que IGF-1R se inhibe de manera mas potente cuando ErbB3 esta mas 50 altamente expresado y menos potentemente inhibido cuando ErbB3 mas apenas se expresa (figura 10A). Por lo tanto, la capacidad del anticuerpo biespecffico para inhibir IGF-1R depende de su avida union. Este fenomeno es especffico tanto para la expresion relativa de las dianas como para las afinidades relativas del anticuerpo biespecffico hacia las dianas: la inhibicion de ErbB3 esta menos afectada por la expresion de IGF-1R, ya que el anticuerpo biespecffico se simula para unirse a ErbB3 con una afinidad mayor que IGF-1R (figura 10B). Para un 55 inhibidor biespecffico, este comportamiento dependiente del nivel del receptor puede limitar seriamente la eficacia global, como se representa en el efecto simulado en una lectura intracelular aguas abajo con respecto a ambas rutas, AKT: se predice una mala inhibicion de pAKT cuando ErbB3 se subexpresa ya que IGF-1R no se inhibe suficientemente (figura 10C). La simulacion de este sistema modelo revela que el rendimiento de inhibidores biespecfficos hacia cada diana puede ser altamente dependiente de la expresion relativa de ambas dianas;
informacion que puede ser util para el diseno terapeutico.
El impacto de la dependencia del nivel del receptor sobre la potencia de un biespedfico puede explorarse extensamente a traves de la simulacion de muchas celulas cancerosas hipoteticas donde el nivel de expresion de 5 cada diana vana en un intervalo clmicamente relevante y la CI50 de cada diana y la lectura aguas abajo se calcula y se representa en una superficie de respuesta. La forma de la superficie de respuesta de CI50 depende de las interacciones de la ruta subyacente. ErbB3 es el activador mas fuerte de la senalizacion aguas abajo, y define el area donde el inhibidor biespedfico sena mas eficaz. La simulacion de un biespedfico con restos de union individuales a cada diana revela que la inhibicion mas potente de la diana aguas abajo esta centrada en regiones de 10 expresion diana equivalente. De hecho, cuando la diana se sobreexpresa en tan solo 5 veces el valor de CI50 puede aumentar tanto como 100 veces, con una perdida sustancial de potencia.
El mapeo de los niveles diana reales en lmeas celulares tumorales o muestras clmicas sobre la superficie de respuesta de CI50 puede usarse para guiar los esfuerzos de mejora terapeutica revelando si la region de la 15 inhibicion mas potente se superpone con la poblacion de pacientes relevante. Las estrategias para cambiar la region de potencia optima predicha para tratar una poblacion diferente o mas amplia de pacientes pueden explorarse en primer lugar a traves de la simulacion. Los anticuerpos biespedficos de tipo IgG tienen dos restos de union hacia cada diana y, por lo tanto, muestran la misma avidez de diana ademas de la avidez cruzada de la diana, mejorando la afinidad de union eficaz para cada diana. La simulacion del anticuerpo biespedfico de tipo IgG que tiene 20 afinidades de union monovalentes equivalentes a la protema biespedfica bivalente muestra que este formato es menos dependiente de la avidez de diana cruzada para el rendimiento: La region de potencia optima es mas amplia que el biespedfico monovalente. Por lo tanto, si el objetivo es tratar una amplia poblacion de pacientes, la prediccion del modelo sera utilizar un diseno biespedfico de tipo IgG.
25 El beneficio de la maduracion por afinidad de la funcion del anticuerpo en la mejora de la region de potencia optima tambien se puede examinar a traves de la simulacion. La simulacion de la inhibicion de la diana aguas abajo a traves del espacio receptor mediante un biespedfico tetravalente no optimo identifica areas de mala inhibicion, particularmente cuando IGF-1R se expresa mas altamente. El aumento de la afinidad de union monovalente del biespedfico hacia IGF-1R en 10 veces a traves de la reduccion de la tasa de disociacion predice que se conseguira 30 la maduracion de la afinidad de mejora. La diana aguas abajo se inhibe significativamente de manera mas potente tanto cuando el IGF-1R se expresa mas altamente como cuando ErbB3 esta mas altamente expresado, lo que indica que la maduracion de afinidad hacia una diana esta mejorando la potencia hacia la segunda diana a traves de la avidez de diana cruzada.
35 Estas consideraciones se establecieron como criterios para una campana de optimizacion de una protema terapeutica biespedfica de tipo IgG de prueba de concepto que mostro una potente inhibicion de la senalizacion inducida por el factor de crecimiento y la inhibicion tumoral en modelos de xenoinjerto que validaban los criterios de diseno. Esta protema comprendfa un marco de anticuerpos IgG dirigido a IGF-1R y dos modulos scFv fusionados en C terminal dirigidos a ErbB3, pero no era adecuado para el desarrollo aguas abajo, ya que contema modulos scFv 40 no estabilizados que no tienen suficiente estabilidad intrmseca. Este fenomeno se entiende bien y se ha descrito el diseno de los modulos scFv para determinar la estabilidad usando una diversidad de tecnicas, incluyendo optimizacion del enlazador, ingeniena de disulfuro, mutagenesis dirigida, analisis de co-variacion, injerto de bucles en un marco estable, diseno guiado por estructura, diseno enfocado y expresion de fago.
45 Para combinar la optimizacion de la afinidad y estabilidad de los modulos scFv en una unica campana, se utilizo una combinacion de diseno guiado por estructura, visualizacion de superficie de levadura y caracterizacion bioffsica a micro-escala. Las variantes de scFv guiadas por estructura se disenaron cuando se introdujeron mutaciones que mejoran la estabilidad, los motivos que confieren potenciales responsabilidades CMC se mutaron, se eliminaron o reemplazaron aa de estructura atfpica, y se introdujo variacion en porciones de baja diversidad de las CDR. Dado 50 que las celulas de levadura tienen modificacion postraduccional eucariota y maquinaria de exportacion de polipeptidos, se controlaron los niveles de expresion de superficie que se informaron para predecir la estabilidad termica y la eficiencia de secrecion soluble. Ademas, se desarrollo un protocolo de "preparar y enlazar" de desafm termico. En este experimento, los modulos scFv inestables se desplegaron, mientras que las protemas de alta afinidad estables reteman la union al antfgeno y, por lo tanto, se enriquecieron (figura 11A). Despues del aislamiento 55 de clones individuales, los scFv fusionados a la superficie de la levadura se estimularon y los clones se seleccionaron basandose en la afinidad residual medida mediante una citometna de flujo (figura 11B). Los modulos scFv termoestables que mostraron una mejora de mas 10 veces en Kd sobre la superficie de la levadura se produjeron como protemas solubles y se seleccionaron aquellas que mostraron una union a antfgeno mejorada, inhibicion de la senalizacion del factor de crecimiento y una estabilidad aceptable. Estos modulos scFv optimizados
se fusionaron en el extremo C al anticuerpo IGF-R1. Las protefnas de tipo IgG resultantes se expresaron en un sistema de expresion transitorio, se purificaron usando cromatograffa de protefna A, y se perfilaron utilizando ensayos bioffsicos, bioqufmicos y de senalizacion celular. Entre muchas tecnicas bioffsicas utiles, la fluorescencia diferencial de barrido y los ensayos de inactivacion termica resultaron ser los mas informativos a escala de 1 a 5 5 microgramos. El triaje a micro-escala compuesto por perfiles analisis diferencial de fluorescencia de barrido y los ensayos de inactivacion termica permiten la seleccion de biespecfficos con estabilidades de suero y agregacion mejoradas. Los perfiles de fluorescencia diferencial de barrido y los ensayos de inactivacion termica proporcionan informacion complementaria sobre la velocidad de despliegue y la velocidad de agregacion para el dominio de protefna menos estable. Estos datos predicen cualitativamente la estabilidad del suero y la agregacion de un 10 anticuerpo biespecffico de tipo IgG (figura 12). Es diffcil sobreestimar la importancia de tener un analisis a micro- escala sensible y robusto, ya que se traduce directamente en la capacidad de interrogar a un mayor numero de candidatos diversos dentro de una unica campana de diseno. La potencia y estabilidad mejoradas de la protefna biespecffica de tipo IgG disenada se confirmaron usando un ensayo a escala normal: union a celulas BxPC-3 que expresan ambas dianas (figura 13). Esto demuestra que un enfoque que presenta un diseno enfocado en paralelo 15 de los modulos de una protefna multifuncional, seguido de una produccion y caracterizacion de alto rendimiento, es aplicable generalmente para mejorar la potencia y la capacidad de fabricacion de protefnas de tipo anticuerpo biespecfficas diana en el contexto de un ciclo de diseno terapeutico.
Ejemplo 2: Preparacion. expresion y purificacion de protefnas biespecfficas tetravalentes de IaG
20
Tres protefnas biespecfficas tetravalentes de IgG2 anti-ErbB3-anti-IGF-1R ("ELI-7," "ILE-10" e "ILE-12") y otras protefnas de control para su uso en los experimentos descritos en el Ejemplo 3, se prepararon esencialmente como se indica a continuacion. ELI-7, ILE-10 e ILE-12 tienen la estructura IgG2(scFv)2.
25 ELI-7 es una protefna biespecffica tetravalente de IgG2 anti-ErbB3/anti-IGF-1R que comprende un anticuerpo IgG2 anti-ErbB3, al que se une un scFv anti-IGF-1R a cada uno de los extremos C de las cadenas pesadas de la protefna IgG2.
ILE-10 e ILE-12 son protefnas biespecfficas tetravalentes de IgG2 anti-IGF-1R/anti-ErbB3 que comprenden un 30 anticuerpo IgG2 anti-IGF-1R, al que esta unido un scFv anti-ErbB3 a cada uno de los extremos C de las cadenas pesadas de la protefna IgG2.
La estructura y relaciones de ELI-7, ILE-10 e ILE-12 se exponen en la Tabla 6. En resumen, todas comprenden la misma secuencia VH anti-IGF-1R ("modulo 5-7"). ILE-10 e ILE-12 difieren unicamente en la secuencia del scFv 35 ErbB3. ILE-10 y ELI-7 comprenden las mismas secuencias VH anti-IGF-1R y anti-ErbB3, y difieren en que ILE-10 tiene un Fab IGF-1R y un scFv ErbB3 ("ILE") y ELI-7 tiene la configuracion opuesta ("ELI"). Los anticuerpos de control son monoespecfficos y cada uno comprende un sitio de union homologo a los encontrados en los anticuerpos biespecfficos.
40 ___________Tabla 6: Descripcion de las protefnas usadas en los ejemplos 2 y 3___________
Modulo anti-IGF-1R Modulo anti-ErbB3 Orientacion
ELI-7
5-7 2-3 ErbB3 - IGF-1R
ILE-10
5-7 2-3 IGF-1R-ErbB3
ILE-12
5-7 2-21 IGF-1R-ErbB3
Modulo 5-7 de Ab anti-IGF-1R
5-7 - -
Modulo 2-3 de Ab anti-ErbB3
- 2-3 -
Modulo 2-21 de Ab anti-ErbB3
- 2-21 -
Muchas de las divulgaciones de los Ejemplos 2-3 en el presente documento, incluyendo ELI-7, ILE-10 e ILE-12, se encuentran en la solicitud PCT PCT/US2010/052712.
45 Las secuencias de aa de las cadenas ligeras y pesadas de cada una de las protefnas son como se indica a continuacion: Cadena pesada de ELI-7: SEQ ID NO:316. Cadena ligera de ELI-7: SEQ ID NO:317. Cadena pesada de ILE-10: SEQ ID NO:318. Cadena pesada de ILE-12: SEQ ID NO:319. Cadena ligera de ILE-10 e IL-12: SEQ ID NO:320.
50 Los acidos nucleicos que codifican las protefnas (denominadas como "protefnas de fusion") se clonan como protefnas individuales en los plasmidos de expresion usando tecnicas estandar de ADN recombinante. Un vector de expresion empleado es pMP 10K (SELEXIS). Los plasmidos de expresion se linealizan, se purifican usando el kit de
purificacion QIAquick® (QIAGEN) y se co-transfectan en celulas CHO usando Lipofectamine™ LTX (Invitrogen). Las celulas transfectadas se recuperan con medio F12Hams que contiene FBS al 10 % durante 2 dfas sin presion de seleccion, a continuacion con presion de seleccion durante 4 dfas. Despues de 4 dfas, se cambian en medio libre de suero (Hyclone) que contiene glutamina con presion de seleccion. Despues de una semana, se comprueban las 5 celulas para determinar la expresion y se aumentan al volumen deseado. Todas las protemas se purifican usando una combinacion de tres etapas de cromatograffa: afinidad de protema A, intercambio cationico e intercambio anionico. Cada una se realiza de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La etapa de afinidad de la protema A se usa para unir selectiva y eficientemente las protemas de fusion de los fluidos de cultivo de celulas recogidos (HCCF). Esto elimina >95 % de las impurezas del producto en una unica etapa con altos rendimientos y alta 10 produccion. La porcion de la forma molecular deseada para las protemas de fusion despues de esta etapa estaba en el intervalo del 60 al 98 por ciento. MABSELECT de Ge se usa como resina de afinidad de Protema A. Se utiliza SPFF (flujo rapido de sulfopropilo) de GE, una resina a base de agarosa, como la resina de intercambio cationico en la segunda etapa de cromatograffa. La porcion de la forma molecular deseada para las protemas de fusion despues de esta etapa estaba en el intervalo del 90 al 99 por ciento. Se usa QSFF (flujo rapido de sepharose de amina 15 cuaternaria) de GE, una resina de intercambio anionico a base de agarosa, en una tercera y ultima etapa de cromatograffa. El material purificado se concentro y se dializo en PBS. El rendimiento final de las protemas de fusion despues de esta etapa se encuentra en el intervalo de 20 mg-100 mg/l.
Ejemplo 3: Union y actividad bioloaica de protemas biespecificas tetravalentes de IaG anti-ErbB3+anti-IGF- 20 1R
Este Ejemplo muestra que una protema biespedfica tetravalente de IgG anti-IGF-IR + anti-ErbB3 (ELI-7) se une con alta afinidad a IGF-1R y a ErbB3 (como se muestra tambien para dos protemas similares ILE-10 e ILE-12), inhibe de forma potente 1) la transduccion de senal de los receptores IGF-1R y ErbB3, 2) la fosforilacion de AKT, y 3) la 25 proliferacion de celulas tumorales in vitro e in vivo. Los resultados se obtuvieron esencialmente como se indica a continuacion.
A) Union de ELI-7, ILE-10 e ILE-12 a IGF-1R y ErbB3
30 Se incuban 1 x 105 celulas MCF7 o 1 x 105 celulas ADRr a temperatura ambiente durante 2 horas con cada una de ELI-7, ILE-10 e ILE-12, dos anticuerpos anti-ErbB3 y un anticuerpo anti-IGF-1R a 2 uM seguido de 12 diluciones por triplicado posteriores. Despues, usando anticuerpo conjugado con anti-HSA-Alexa647 de cabra como el anticuerpo de deteccion, las celulas se incuban en hielo durante 40 minutos. Las constantes de disociacion de union a las celulas (medidas de afinidades de union) de los anticuerpos en celulas MCF7 y ADRr se evaluan mediante FACS y 35 se determinan las constantes de disociacion aparentes para cada protema. Se obtuvieron los siguientes resultados (veanse tambien las figuras 14A y 14B):
Tabla 7: Kd de union de ^ protemas biespecificas
Inhibidor
Kd (nM)
ADRr (n = 3)
MCF7 (n = 1)
ELI-7
2,5 2,1
ILE-10
7,1 4,5
ILE-12
0,3 0,6
IgG anti-ErbB3 (modulo 2-21)
0,4 0,04
Ig anti-ErbB3 (modulo 2-3)
1,2 0,9
Ig anti-IGF-1R (modulo 5-7)
5,1 5,6
40 Los resultados muestran que los biespedficos de IgG (es decir, ELI-7, ILE-10, ILE-12) se unen a ambos tipos de celulas, en algunos casos con mayor union a bajas concentraciones, indicando una union avida y la capacidad de unirse a cada receptor. Los biespedficos de IgG teman una Kd similar al componente de anticuerpo monoclonal equivalente.
45 B) Inhibicion de senal de IGF-1R, ErbB3 y Akt por ELI-7 e ILE-7
La capacidad de ELI-7 e ILE-7 para antagonizar IGF-1R y ErbB3 e inhibir la activacion (fosforilacion) de componentes aguas abajo, IGF-1R, ErbB3 y Akt; se examina la fosforilacion. Se incuban previamente 3,5 x 104 celulas BxPC-3 durante 1 hora con un anticuerpo a 0,3 pM seguido de 9 diluciones por triplicado posteriores para 50 dar una curva de 10 puntos. Las celulas se tratan con IGF-1 a 80 ng/ml y heregulina a 20 ng/ml durante 15 minutos. La fosforilacion de iGf-1R para producir phospho-IGF-1R (pIGF-1R) se mide por ELISA (R & D Systems; Cat. n.°
DYC1770) para evaluar la capacidad de los agentes para inhibir la formacion de pIGF-1R. La fosforilacion de ErbB3 se mide por ELISA (R & D Systems; Cat. n.° DYC1769) para evaluar la capacidad de los agentes para inhibir la formacion de pErbB3. La fosforilacion de AKT se mide por ELISA usando los siguientes anticuerpos: anti-AKT, clon SKB1 (Millipore, Cat. n.° 05-591); anti-fosfo-AKT biotinilado (especffico de Ser473; Cell Signaling Technology Cat. n.° 5 5102). ILE-7 es una protefna trivalente que tiene los mismos sitios de union que ELI-7 y se describe en el documento PCT/US2010/052712. Las figuras 15A-15C muestran los resultados que se obtuvieron esencialmente como se ha descrito anteriormente para ILE-7 y ELI-7. Los resultados que se obtuvieron tambien se resumen en la tabla a continuacion.
10 Tabla 8: Inhibicion de la fosforilacion de ErbB3, IGF-1R y AKT por ELI-7
Ki (nM)
ELI-7
ILE-7
pAKT
6,3 1,3
pErbB3
1,3 0,6
pIGF-1R
14,1 0,8
Los resultados muestran que ELI-7 inhibe la fosforilacion de ErbB3, IGF-1R y Akt, incluso con la estimulacion simultanea con IGF-1 y HRG.
15 C) Inhibicion del crecimiento celular por ELI-7 en cultivo bidimensional
El efecto de ELI-7 sobre la proliferacion de las celulas tumorales se examina in vitro usando un ensayo CTG, que es un ensayo basado en luminiscencia que mide la cantidad de ATP celular presente (Promega; Cat. n.° PR-G7572), que se indica como unidades relativas de luz (RLU). Se incuban 500 celulas por pocillo de celulas DU145 durante 6 20 dfas en medio con 80 ng/ml de IGF-1 y 20 ng/ml de HRG y que contenfa una dilucion por triplicado de inhibidores partiendo de 2 uM. El control consiste en celulas DU145 incubadas sin factores de crecimiento ni anticuerpos.
Los resultados obtenidos esencialmente como se ha descrito anteriormente indican que ELI-7 inhibio el crecimiento de las celulas DU145 (Ki = 12 nM, vease la figura 16), mientras que los inhibidores de IGF-1R o ErbB3 no tenfan 25 ningun efecto sobre el crecimiento celular.
Se realizo un experimento similar en otra lfnea celular. Se incuban 2000 celulas BxPC-3 por pocillo durante 6 dfas en medio que contiene una dilucion por triplicado de inhibidores que parten de 1 uM. El control consiste en IgG2 Kappa de plasma de mieloma humano (Sigma Aldrich catalogo n.° I5405).
30
Los resultados obtenidos esencialmente como se ha descrito anteriormente indican que ELI-7 inhibieron el crecimiento de BxPC-3 en un 46 % (p <0,001, prueba t de Student) (figura 17).
D) Inhibicion del crecimiento tumoral por protefnas biespecfficas en modelos de raton de xenoinjerto 35 humano de cancer
Este ejemplo muestra que ELI-7 inhibe el crecimiento tumoral en modelos de raton de cancer en dos modelos diferentes.
40 En primer lugar, se calcularon las propiedades farmacocineticas de cada protefna biespecffica en ratones. Se inyectaron 600 ug de ELI-7 o 500 ug de cada protefna de control trivalente ligada a HSA (ILE-3, ILE-7, y ILE-9; descrito en el documento PCT/US2010/052712) a traves de la vena de la cola en cada raton (4 ratones por inhibidor y punto temporal). Posteriormente, se extrajo sangre en varios puntos de tiempo (los ratones se sacrificaron primero y despues se extrajo sangre por puncion cardiaca). Los puntos de tiempo para ELI-7 son: 0,5, 4, 24, 72, 120, 168 y 45 240 horas. Los puntos de tiempo para las protefnas de control trivalentes son: 0,5, 4, 8, 24, 28, 72 y 120 horas. Para ELI-7, la concentracion sangufnea se mide usando un kit ELISA de IgG anti-humano (Bethyl labs Cat. n.° E80-104) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para las protefnas trivalentes, la concentracion en la sangre se mide usando un kit ELISA que detecta especfficamente la union de IGF-1R y ErbB3, las placas se cubren con IGF-1R humano etiquetado con His, se incuban con las protefnas trivalentes o ELI-7, y despues se detectan con un ErbB3- 50 Fc humano (R & D Systems) y un reactivo de deteccion anti-Fc-HRP. Las propiedades farmacocineticas (semivida y Cmax) para cada protefna se calculan usando un modelo de un compartimento. Se obtuvieron los siguientes resultados:
Tabla 9: Semivida y Cmax de ELI-7 en sangre de raton
Anticuerpo
Semivida (horas) Cmax (ug/ml)
ELI-7
48 612
ILE-3
15 410
ILE-7
14 516
ILE-9
17 447
IgG anti-IGF-1R (modulo 5-7)
124 517
IgG anti-ErbB3 (modulo 2-3)
58 645
La simulacion de las semividas espedficas de los farmacos condujo a la prediccion de que las siguientes dosis daran como resultado una exposicion equivalente (o en el caso de ILE-7 un 50 % de exposicion comparable):
Tabla 10: Dosis pronosticada para una exposicion equivalente
Tabla 10
Dosis (ug)
ELI-7
600
ILE-7
800
IgG anti-IGF-1R (modulo 5-7)
300
IgG anti-ErbB3 (modulo 2-3)
500
El efecto de ELI-7 en el crecimiento de tumor de xenoinjerto de cancer de pancreas humano en modelos de raton se evaluo despues inyectando 5 x 106 celulas BxPC-3 (resuspendidas en una mezcla 1:1 de PBS y matrigel reducido 10 con factor de crecimiento; BD Biosciences Cat. n.° 354230) en el espacio subcutaneo en el costado de cada raton. Se dejo que los tumores se desarrollaran durante 7-10 dfas (hasta que alcanzaron un volumen de aproximadamente 100-200 mm3), y despues se midio el tamano del tumor para cada raton (pi/6 x longitud x anchura2, donde la anchura es la medida mas pequena). A continuacion, los ratones se emparejaron por tamano y luego se asignaron aleatoriamente a grupos de tratamiento. Despues, se inyecto cada tres dfas ELI-7, una protema 15 de control trivalente (ILE-7), un anticuerpo anti-ErbB3, un anticuerpo anti-IGF-1R o un control de PBS hasta la finalizacion del estudio.
Los resultados, (figuras 18 y 19), muestran que ELI-7 inhibio significativamente el crecimiento de tumor de xenoinjerto de tumores BxPC-3 en comparacion con el control de PBS: El volumen tumoral final era un 77 % inferior 20 en tumores tratados con ELI-7 en comparacion con el control de PBS (los valores de p se determinaron por la prueba t de Student). Dfa 0 se refiere al primer dfa de dosificacion.
El efecto de ELI-7 en el crecimiento de tumor de xenoinjerto de cancer de prostata humano en un modelo de raton se evaluo inyectando 5 x 106 celulas DU145 (resuspendidas en una mezcla 1:1 de PBS y matrigel reducido con 25 factor de crecimiento; BD Biosciences Cat. n.° 354230) en el espacio subcutaneo en el costado de cada raton. Se dejo que los tumores se desarrollaran durante 7-10 dfas (hasta que cada uno alcanzo un volumen de aproximadamente 100-200 mm3), y despues se midio el tamano del tumor para cada raton (pi/6 x longitud x anchura2, donde la anchura es la medida mas pequena). A continuacion, los ratones se emparejaron por tamano de tumor y luego se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento. Despues, se inyecto cada tres dfas ELI-7, 30 una protema de control trivalente (ILE-7), un anticuerpo anti-ErbB3, un anticuerpo anti-IGF-1R o un control de PBS hasta la finalizacion del estudio.
Los resultados, (figuras 20A y 20B), muestran que ELI-7 inhibio significativamente el crecimiento de tumor de xenoinjerto de celulas DU145, mientras que los anticuerpos de control anti-IGF-1R y anti-ErbB3 no: El volumen 35 tumoral final fue un 50 % inferior en los tumores tratados con ELI-7 en comparacion con el control de PBS (los valores de p se determinaron por la prueba t de Student). Dfa 0 se refiere al primer dfa de dosificacion.
E) ELI-7 inhibe la senalizacion a traves de un amplio intervalo de niveles de receptores ErbB3 e IGF-1R
40 Para determinar si ELI-7 puede inhibir la senalizacion aguas abajo a traves de un amplio intervalo de niveles de receptores ErbB3 e IGF-1R, se realizo el siguiente experimento:
Los niveles de receptores de celulas BxPC-3 se vanan mediante la atenuacion mediada por shRNA de IGF- 1R o ErbB3 en celulas BxPC-3 utilizando el vector pLKO.1 PURO (Sigma). Las secuencias de shRNA se 45 proporcionan en el documento PCT/US2010/052712. Los niveles de ErbB3 e IGF-1R se miden a
continuacion mediante FACS cuantitativa y los niveles de receptor medios se calculan a partir de la
distribucion resultante (vease la Tabla 11 para los niveles de expresion relativa). Para determinar la potencia de ELI-7, las celulas se privaron de suero y se trataron previamente con ELI-7 durante 1 hora a 37 °C seguido de una estimulacion de 15 minutos con 20 ng/ml de HRG + 80 ng/ml de IGF 1. La inhibicion de la senal se evalua mediante ELISA para pAKT.
5
Los resultados indican que ELI-7 mostro una potencia similar a traves de las lfneas de celulas BxPC-3 con niveles de receptores modificados como se indica por sus valores de CI50 e intervalos de confianza superpuestos (vease la Tabla 11), lo que indica que ELI-7 tiene una actividad amplia frente a un intervalo de perfiles de receptor (figura 21).
10i_______Tabla 11: Niveles de receptor relativos y valores de CI50 de pAkt para cuatro lineas celulares BxPC-3:
Lfnea celular BxPC-3 disenada
% de nivel de receptor de control CI50 de pAkt Intervalo de confianza al 95 % Sigma-Aldrich Catalogo n.°
Control no dirigido a BxPC-3
Niveles de IGF-1R y ErbB3 inalterados 3,6 nM 0,9 - 14,7 nM SHC002V
BxPC-3-IGF-1R- mod.1
Nivel de IGF-1R reducido en un 37 % 6,4 nM 2,9 - 14,1 nM SHCLNV-NM 000875- TRCN0000039673
BxPC-3-ErbB3- mod.1
Nivel de ErbB3 reducido en un 48 % 3,3 nM 1,4 - 8,0 nM SHCLNV-NM 001982- TRCN0000230091
BxPC-3-ErbB3- mod.2
Nivel de ErbB3 reducido en un 88 % 7,6 nM 1,2-50,0 nM SHCLNV-NM 001982- TRCN0000018327
Ejemplo 4: Actividad bioloaica de una proteina biespecifica tetravalente anti-IGF-1R/anti-ErbB3 con actividades mejoradas (16F) con respecto a ELI-7
15 La proteina de demostracion conceptual (ELI-7) descrita en los Ejemplos 2 y 3 se mejoro adicionalmente para aumentar su afinidad de union a IGF-1R y ErbB3, la actividad biologica, la estabilidad y solubilidad; como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se hicieron los siguientes cambios: (i) la orientacion se cambio de anti-ErbB3 como el componente de IgG a anti-IGF-1R como el componente de IgG; (ii) se uso un resto de union a anti-ErbB3 que se union a un epitopo diferente; (iii) su region VH CDR3 se maduro por afinidad; (iv) se muto el componente de IgG 20 anti-IGF-1R para estabilizarlo (mutaciones estabilizantes) y (v) su estructura principal se cambio de IgG2 a IgG1. La proteina resultante es 16F, cuyas secuencias de aa son de la figura 7.
El aumento de la potencia anti-IGF-1R de 16F con respecto al de ELI-7, en funcion de la inhibicion de la fosforilacion de IGF-1R, se mide como se describe en el Ejemplo 3. Los resultados que se obtuvieron esencialmente como se ha 25 descrito anteriormente, (figura 22), indican que la proteina redisenada es un inhibidor significativamente mas potente de la transduccion de senal de IGF-1R.
La potencia de inhibicion de la transduccion de senal a traves de ErbB3 y a traves de la inhibicion de la fosforilacion de AKT se mide esencialmente como se describe en el Ejemplo 3 para 16F, ELI-7 y una combinacion de Ab# A 30 ANTI-IGF-1R (ganitumab; SEQ ID 327 + SEQ ID 328) y Ab# A anti-ErbB3 (SEQ ID 336 + SEQ ID 337). Estas mediciones se realizan en celulas BxPC-3 en presencia de HRG e IGF1. Los resultados que se obtuvieron esencialmente como se ha descrito anteriormente (Tabla 12), indican que el 16F tiene una eficacia mejorada en la inhibicion de la transduccion de senal en comparacion con ELI-7, cuya eficacia es comparable a la de una combinacion de los inhibidores de grado clfnico Ab# A ANTI-IGF-1R + Ab# A anti-ErbB3.
35
Tabla 12: Comparacion de 16F con Eli-7 e inhibidores de grado clfnico
Inhibidor
CI50 de pErbB3 (nM) CI50 de pIGF-1R (nM) CI50 de pAKT (nM)
ELI-7
3,7 10 9,4
16F
0,5 1,1 2,5
Ab# A ANTI-IGF-1R (ganitumab; SEQ ID NO:327 + SEQ ID NO:328) + Ab# A ANTI-ErbB3 (SEQ ID NO:336 + SEQ ID NO:337)
0,8 0,9 2,2
Como se describe en el Ejemplo 1, se mostro tambien que el biespecffico redisenado, es decir, 16F, es mas termoestable y estable en suero que ELI-7. Ademas, 16F es menos propenso a la agregacion: (i) 16F es estable a 40 19 mg/ml en PBS a 4 °C, con unicamente aproximadamente el 2 % de agregacion en 33 dfas; (ii) no se observo
ningun cambio significativo en el % de monomeros despues de 3 ciclos de congelacion-descongelacion; (iii) no se observo ningun cambio significativo en el % de monomeros despues de la agitacion a 4 °C durante un dfa; y (iv) no se observo ningun cambio significativo en el % de monomeros en incubacion a 37 °C durante 6 dfas.
5 Los resultados de experimentos comparativos adicionales descritos a continuacion tambien muestran que 16F es al menos tan eficaz como una combinacion de anti-IGF-IR y anti-ErbB3 comercial en la inhibicion de la transduccion de senales.
En un primer conjunto de experimentos, la eficacia de 16F (SF-G1-C8) en la inhibicion de la fosforilacion de IGF-1R, 10 ErbB3 o AKT se comparo con la de Ab#B anti-IGF-1R (cixutumumab; SEQ ID 324 + SEQ ID 325), Ab# A anti-ErbB3 (SEQ ID 336 + SEQ ID 337) o Ab#B anti-IGF-1R + Ab# A anti-ErbB3 en dos lmeas celulares diferentes (BxPC-3 y DU145).
Las celulas BxPC-3 y DU145 se mantienen en medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal bovino al 15 10 %, penicilina/estreptomicina y L-glutamina. Para los experimentos de senalizacion, 3,5 x 104 celulas se colocan en placas en medio completo en placas de cultivo de 96 pocillos. Al dfa siguiente, el medio completo se reemplaza con medio libre de suero, y las celulas se incuban durante una noche a 37 °C. Las celulas se tratan previamente durante 1 hora con las dosis indicadas de anticuerpo, y despues se estimularon durante 15 minutos con 100 ng/ml de IGF-1 (Calbiochem) y 30 ng/ml de HRG (R & D Systems). Las celulas se lavan con PBS y se lisan en tampon 20 MPer complementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa.
Los ELISA para phospho-IGF-1R (pIGF-1R) y phospho-ErbB3 (pErbB3) se preforman de acuerdo con los protocolos del fabricante (R & D Systems). Se realiza un ELISA para phospho-AKT (pAKT) con los siguientes reactivos: anticuerpo de captura anti-AKT (Millipore), anticuerpo de deteccion anti-pAKT (Ser473) (Cell Signaling) y 25 estreptavidina-HRP (R & D Systems). Se anade el sustrato quimioluminiscente SuPErSiGNAL eLiSA PICO (Pierce) y las placas se leen en un lector de placas PerkinElmer EnVision®. Los valores de luminiscencia se representan en graficos y los valores de CI50 se calculan usando el software Graphpad Prism 5.
Los resultados, que se obtuvieron esencialmente como se ha descrito anteriormente y se muestran en la figura 23 30 (celulas BxPC-3) y la figura 24 (celulas DU145) y en la Tabla 13, indican que 16F muestra una inhibicion sorprendentemente mas potente de la senalizacion de doble ruta a traves de pErbB3 y pAKT que la combinacion de Ab# B anti-IGF-1R y Ab# A anti-ErbB3.
Tabla 13: Valores de CI50 para los tratamientos de inhibidores presentados en la fic
ura 23.
pIGF- 1R pErb B3 pAK T
Lfnea celular
Inhibidor CI50 CI50 CI50
BxPC-3
16F (SF-G1-C8) 7,7E-10 2,4E-10 2,3E- 09
BxPC-3
Ab# B anti-IGF-1R (cixutumumab; SEQ ID NO:324 + SEQ ID NO:325) 2,4E-09 nd 1,4E- 08
BxPC-3
Ab# A ANTI-ErbB3 (SEQ ID NO:336 + SEQ ID NO:337) nd 5,1E-11 3,9E- 10
BxPC-3
Ab# B ANTI-IGF-1R + Ab# A ANTI-ErbB3 1,9E-09 3,2E-10 3,2E- 09
DU145
16F (SF-G1-C8) 1,1E-09 2,0E-10 5,1E- 10
DU145
Ab# B anti-IGF-1R (cixutumumab; SEQ ID NO:324 + SEQ ID NO:325) 9,1E-10 nd 9,8E- 09
DU145
Ab# A ANTI-ErbB3 (SEQ ID NO:336 + SEQ ID NO:337) nd 8,2E-11 2,8E- 10
DU145
Ab# B ANTI-IGF-1R + Ab# A ANTI-ErbB3 1,0E-09 3,2E-10 9,3E- 10
En un segundo conjunto de experimentos, la eficacia de 16F (SF-G1-C8) en la inhibicion de la fosforilacion de IGF- 1R, ErbB3 o AKT se comparo con la del anticuerpo anti-IGF-1R Ab # A AnTI-IGF-1R, el anticuerpo anti-ErbB3 Ab # A anti-ErbB3, o una combinacion de los dos ultimos anticuerpos en celulas BxPC-3.
Los resultados, que se obtuvieron esencialmente como se ha descrito anteriormente y se muestran en la figura 24 y la Tabla 14, indican una inhibicion sorprendentemente mas potente de la senalizacion de doble ruta a traves de pErbB3 y pIGF-1R por 16F que por la combinacion de Ab # A ANTI-IGF-1R y Ab # A anti-ErbB3.
Tabla 14: Valores de CI50 para los tratamientos de inhibidores presentados en la figura 24.
pErbB3 pIGF-1R pAKT
Inhibidor
CI50 CI50 CI50
16F (SF-G1-C8)
5,0E-10 1,1E-09 2,5E-09
Ab# A ANTI-IGF-1R (ganitumab; SEQ ID NO:327 + SEQ ID NO:328)
ND 1,5E-10 2,6E-10
Ab# A ANTI-ErbB3 (SEQ ID NO:336 + SEQ ID NO:337)
4,3E-10 ND 5,7E-09
Ab# A ANTI-IGF-1R + Ab# A ANTI-ErbB3
8,2E-10 9,3E-10 2,2E-09
Ejemplo 5: Union y actividad bioloaica de anticuerpos biespecificos tetravalentes de IaG anti-IGF-1R/anti- ErbB3 adicionales que comprenden el modulo SF
10
Se construyeron anticuerpos biespecificos tetravalentes de IgG anti-IGF-IR + anti-ErbB3 adicionales. Cada uno de estos PBA se ensamblo combinando tres modulos, esencialmente como se muestra en la figura 8. Cada PBA comprende un par de polipeptidos de fusion de cadena pesada (comprendiendo cada uno al menos una parte de cada uno de los tres modulos), estando cada miembro del par de cadenas pesadas unido al otro y estando cada uno 15 unido ademas unido a uno de un par de cadenas ligeras. Los tres modulos ensamblados en cada PBA son:
1. un modulo de dominio variable Fab N-terminal (amino terminal) que comprende tanto las cadenas ligeras (esencialmente identicas) como los extremos N de ambas cadenas pesadas;
2. un modulo scFv; y
20 3. un modulo CR de IgG HC interpuesto entre el modulo de dominio variable Fab N-terminal y el modulo
scFv.
Las cadenas pesadas que son polipeptidos de fusion comprenden la porcion de cadena pesada del modulo Fab N- terminal, un modulo CR de IgG y el modulo scFv C-terminal.
25
Los nuevos anticuerpos anti-IGF-1R + anti-ErbB3 se hicieron de una combinacion de los restos anti-IGF-1R y anti- ErbB3 de la Tabla 15, ensamblados como modulos dispuestos en diferentes orientaciones. Para cada una de las Tablas 15 y 16, cada PBA que se construyo comprende una proteina de fusion que comprende un par de polipeptidos de cadena pesada esencialmente identicos, cada uno de los cuales comprende una combinacion, en
30 orden N-terminal a C-terminal (amino a carboxi) de cada modulo Fab nombrado en la columna de la izquierda con una CR de IgG1 (G1) y con cualquier modulo scFv nombrado en la columna derecha en la misma Tabla. Las secuencias de aa de las cadenas pesadas y ligeras de estos PBA adicionales son de la figura 5A (anti-IGF-1R + anti-ErbB3) y la figura 5B (anti-ErbB3 y anti-IGF-1R).
35
Tabla 15: Proteinas anti-IGF-1R-anti-ErbB3
Fab anti-IGF-1R
scFv anti-ErbB3
SF
C8
P4
P1
M78
M1.3
M57
M27
P6
B69
Tabla 16: Proteinas anti-ErbB3-anti-IGF-1R
Fab anti-ErbB3
scFv anti-IGF-1R
P1
P4
M27
M78
M7
B72
B60
Este ejemplo muestra que los anticuerpos que comprenden un modulo "SF" N-terminal unen celulas BxPC-3, unen
ErbB3, inhiben la fosforilacion de IGF-1R, ErbB3 y AKT y son estables. Los resultados obtenidos con las otras protefnas son del Ejemplo 6.
A) Datos de union a celulas BxPC-3
5
La union de SF-G1-P1, SF-G1-P6, SF-G1-M27, SF-G1-B69, SF-G1-M1.3 y SF-G1-C8 (16F) a BxPC-3 se midio esencialmente como se indica a continuacion.
Las celulas BxPC-3 se mantienen en medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal bovino al 10 %, penicilina/estreptomicina y L-glutamina. El medio se elimino y las celulas BxPC-3 se lavaron con PBS. Se anade tripsina hasta que las celulas se separan de la placa, y despues se neutralizan con medio + suero al 10 %. Las celulas se centrifugan y se suspenden de nuevo en tampon FACS (1 x PBS + suero al 2 % + azida al 0,1 %). Los agregados se dividen en celulas individuales por pipeteo arriba y abajo y poniendo las celulas a traves de un colador de celulas. Las celulas se centrifugan y se suspenden de nuevo en tampon FACS a una densidad de 2 x 106 celulas/ml. En una placa de fondo conico de 96 pocillos, 50 pl de suspension celular se alicuotan por pocillo para dar 105 celulas/pocillo.
Los anticuerpos se diluyen a 1 pM en tampon FACS, y se hacen 10 diluciones de 3 veces, con un pocillo final que consiste unicamente en tampon FACS (sin anticuerpo primario). Se anaden 50 ul de anticuerpos a 50 ul de celulas de manera que la concentracion final de anticuerpos mas alta sea de 500 nM en el primer pocillo. Las celulas y los anticuerpos se incuban a temperatura ambiente con agitacion suave durante 2 horas. Las placas se centrifugan a 1.500 RPM durante 5 min, y el sobrenadante se elimina. Los sedimentos se lavan tres veces en tampon FACS. Despues del lavado final, se separa el tampon FACS y se anaden 50 ul de anticuerpo secundario ant-Fc-DyLight 649 (Abcam) a 1:100 en tampon FACS. Las celulas se incuban en la sala frfa en la oscuridad con agitacion suave durante 1 hora, se lavan de nuevo tres veces y se suspenden de nuevo en tampon de fijacion de 100 ul (PBS con paraformaldehfdo al 1 %, FBS al 2 %). Las muestras se transfieren a placas FACS de fondo en U de 96 pocillos (Becton Dickinson) y se mantienen en la oscuridad a 4 grados hasta su uso. Las muestras se leyeron utilizando un FACSCalibur (Becton Dickinson), y las intensidades de fluorescente medias (MFI) se determinaron usando FlowJo. El analisis se realizo con GraphPad PRISM, utilizando un ajuste de curva de regresion no lineal de logaritmo (agonista) frente a respuesta (tres parametros).
Los resultados (figura 25) y en la Tabla 17, indican que estos anticuerpos biespecfficos muestran una fuerte union a celulas BxPC-3.
35 Tabla 17: Valores de CE50^ para la union a anticuerpo biespecifico ^ presentada en la figura 25.
Anticuerpo biespecifico
CE50 (nM)
SF-G1-C8
3,1
SF-G1-P1
4,9
SF-G1-P6
2,9
SF-G1-M27
2,7
SF-G1-B69
2,1
SF-G1-M1.3
3,5
B) Datos de union a ErbB3
La union de SF-G1-P1, SF-G1-P6, SF-G1-M27, SF-G1-B69, SF-G1-M1.3 y SF-G1-C8 (16F) a ErbB-3 recombinante 40 se midio esencialmente como se indica a continuacion.
Se recubren placas REACTI-BIND de 96 pocillos (Pierce) con 50 ul de ErbB3-His (ErbB3 con una etiqueta hexa- histidina C-terminal - 2 ug/ml en PBS) ("hexa-histidina" desvelada como SEQ ID NO:403) y se incubaron durante una noche a 4 °C. Al dfa siguiente, las placas se lavan con PBS + Tween-20 al 0,05 % (PBS-T) y se bloquean durante 1 45 h a temperatura ambiente con 100 ul de tampon de bloqueo libre de protefnas (Pierce). Las placas se lavan con PBS-T y se anaden por duplicado 50 ul de cada anticuerpo biespecifico. Las concentraciones comienzan a 500 nM (en PBS-T) e incluyen diez diluciones adicionales de dos veces y una en blanco (solo PBS-T). Las placas se incuban a temperatura ambiente durante dos horas y luego se lavan con PBS-T. Se anaden 50 ul de anti-Fc-HRP (Jackson Labs) a 1:40.000 en PBS-T, y las placas se incuban en la oscuridad durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas 50 se lavan de nuevo con PBS-T y se anaden 100 ul de sustrato de TMB (Thermo Scientific, TMB y solucion de peroxido mezclados 1:1). Las placas se incuban durante 5-15 minutos a temperatura ambiente hasta que se desarrolla un color azul, y la reaccion se detiene con 100 ul de solucion STOP (Cell Signaling Technology). La
20
25
30
10
15
absorbancia se leyo a 450 nm en un lector de placas PerkinElmer Envision, y se generaron curvas de union con GraphPad PRISM, utilizando un ajuste de curva de regresion no lineal de logaritmo (agonista) frente a respuesta (tres parametros).
5 Los resultados (figura 26 y Tabla 18), indican que los anticuerpos biespecfficos muestran una fuerte union a la protefna ErbB3 recombinante.
Tabla 18: Valores de CE50^ para la union a anticuerpo biespecifico ^ presentada en la figura 26.
Anticuerpo biespecifico
CE50 (nM)
SF-G1-C8
0,3
SF-G1-P1
0,4
SF-G1-P6
0,3
SF-G1-M27
0,4
SF-G1-B69
0,4
SF-G1-M1.3
0,2
10 C) Inhibicion de la transduccion de senal
La inhibicion de la transduccion de senal por SF-G1-P1, SF-G1-P6, SF-G1-M27, SF-G1-B69, SF-G1-M1.3 y SF-G1- C8 (16F) se midio esencialmente como se indica a continuacion.
15 Las celulas BxPC-3 se mantienen en medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal bovino al 10 %, penicilina/estreptomicina y L-glutamina. Se colocan en placas 3,5 x 104 celulas en medio completo en placas de cultivo de 96 pocillos. Al dfa siguiente, el medio completo se reemplaza con medio libre de suero, y las celulas se incuban durante una noche a 37 °C. Las celulas se tratan previamente durante 1 hora con las dosis indicadas de farmaco, y despues se estimularon durante 15 minutos con 100 ng/ml de IGF-1 (Calbiochem) y 30 ng/ml de HRG (R 20 & D Systems). Las celulas se lavan con PBS y se lisan en tampon MPer ("reactivo de extraccion de protefna de mamffero" Pierce Thermo Scientific) complementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa.
Los analisis ELISA para phospho-IGF1R (pIGF1R) phospho-ErbB3 (pErbB3) y phospho-AKT (pAKT) se forman previamente como se ha descrito en el Ejemplo 4, anteriormente. Las unidades relativas de luminiscencia (RLU) se 25 representan en graficos y los valores de CI50 se calculan usando el software Graphpad Prism 5.
Los resultados (figura 27 y Tabla 19), indican que las protefnas biespecfficas inhiben fuertemente la senalizacion de ruta doble.
30 Tabla 19: Valores de CI50 y valores de inhibicion porcentual para los tratamientos de inhibidores mostrados en la
figura 27.
pIGFIR pIGF1R
Inhibidor
CI50 % de inhibicion
SF-G1-P6
8,2E-10 91,2
SF-G1-M1.3
8,0E-10 87,9
SF-G1-B69
1,2E-09 91,1
SF-G1-P1
9,2E-10 91,3
SF-G1-M27
6,0E-10 90,7
SF-G1-C8
9,5E-10 93,0
pErbB3 pErbB3
Inhibidor
CI50 % de inhibicion
SF-G1-P6
2,9E-10 96,6
SF-G1-M1.3
2,5E-10 97,0
SF-G1-B69
5,2E-10 97,8
SF-G1-P1
6,9E-10 95,3
SF-G1-M27
2,5E-10 98,1
SF-G1-C8
2,4E-10 94,9
pAKT pAKT
Inhibidor
CI50 % de inhibicion
SF-G1-P6
1,9E-09 75,6
SF-G1-M1.3
1,2E-09 77,4
SF-G1-B69
2,7E-09 72,7
SF-G1-P1
2,4E-09 71,7
SF-G1-M27
1,4E-09 73,8
SF-G1-C8
1,5E-09 72,3
D) Estabilidad de las protefnas biespecfficas
Se han realizado diversos estudios de estabilidad y muestran que SF-G1-P1, SF-G1-P6, SF-G1-M27, SF-G1-B69, SF-G1-M1.3 son estables en suero, son termicamente estables, y son estables a bajo pH.
5
Para determinar la estabilidad en suero, las protefnas se incuban en suero de raton (Sigma) a una concentracion final de 2,5 uM durante 0 h o 72 h a 37 °C. Las muestras se ensayan a continuacion usando el ensayo de union ELISA colorimetrico descrito anteriormente, y se generan curvas de union con GraphPad Prism. Los valores de absorbancia se normalizan a 0 h en el punto de inflexion de cada curva para determinar el porcentaje de union 10 conservado despues de 72 h en suero a 37 °C.
Los resultados que se obtuvieron esencialmente como se ha descrito anteriormente (figura 28), indican que cada una de los PBA ensayados tiene una estabilidad en suero (normalizada) despues de 72 horas de al menos el 70 %. Ciertos PBA tienen una estabilidad de aproximadamente el 100 %.
15
Para determinar la estabilidad termica, se calcularon los valores de CE90 para cada PBA usando las curvas de union generadas en el experimento de union ELISA descrito anteriormente. Cada PBA se prepara en 5 x su valor de CE90 en PBS y se transfiere a placas de PCR (Bio-Rad) a 50 ul por pocillo. Las placas se centrifugan y se colocan en la maquina de PCR de gradiente ICYCLER IQ (Biorad) para calentar los anticuerpos durante 1 h desde 47-72 °C. 20 Las alfcuotas de cada anticuerpo tambien se mantienen a 25 °C y 37 °C durante 1 h. A continuacion, las placas se centrifugan a 2.000 RPM durante 5 minutos y los sobrenadantes se diluyen cinco veces en PBS-T hasta su concentracion de CE90. Las muestras se ensayan a continuacion usando el ensayo de union ELISA colorimetrico descrito anteriormente, y las absorbancias se normalizan a 25 °C. Las curvas de union se generaron con GraphPad Prism para determinar los valores de T50.
25
Los resultados que se obtuvieron esencialmente como se ha descrito anteriormente (Tabla 20), indican que los valores de T50 varfan de 46,7 °C a 62,6 °C.
Tabla 20: Valores de T50 para cada anticuerpo biespecffico incubado a 25-72 °C durante 1 h
Anticuerpo biespecffico
T50
SF-G1-C8
62,1 °C
SF-G1-P1
46,7 °C
SF-G1-P6
62,4 °C
SF-G1-M27
56 °C
SF-G1-B69
62,6 °C
SF-G1-M1.3
46,7 °C
30
La temperatura a la que los PBA se desplegaron se determino por fluorimetrfa diferencial de barrido (DSF). El ensayo DSF se realiza en el sistema de deteccion en tiempo real IQ5 (Bio-Rad). Se anadieron soluciones de 20 pl de anticuerpo biespecffico 15 uM, 1 x Sypro Orange (Invitrogen Life Technologies) y 1 x PBS a los pocillos de una placa de 96 pocillos. La placa se calento de 20 °C a 90 °C con una velocidad de calentamiento de 1 °C/min. Los 35 datos se transfirieron a GraphPad Prism para su analisis.
Los resultados que se obtuvieron esencialmente como se ha descrito anteriormente (Tabla 21), indican que las protefnas se despliegan a diferentes temperaturas.
40 Tabla 21: Valores de Tm para cada anticuerpo biespecffico, segun se determino por DSF
Anticuerpo biespecffico
Tm
SF-G1-C8
69 °C
SF-G1-P1
54 °C
SF-G1-P6
61 °C
SF-G1-M27
55 °C
SF-G1-B69
61 °C
SF-G1-M1.3
64 °C
Para la determinacion de la estabilidad a pH 3, la solucion madre de SF-G1-C8 se diluye en acido acetico 0,1 M (pH 3,0) y se incuba durante 1 hora. La solucion se neutraliza a continuacion con Tros Base 1 M, se dializa contra PBS y se concentra. El dializado se somete a ensayo mediante SEC (Cromatograffa de exclusion por tamano) y ELISA 5 colorimetrico contra una muestra de SF-G1-C8 neutralizada inmediatamente despues de la purificacion de la protefna A. El analisis por SEC se realiza utilizando el sistema de HPLC Agilent Serie 1100. Se inyectan 50 ug de SF-G1-C8 en una columna de gel TSK Super SW3000 (Tosoh Biosciences, P/N 18675). Se utiliza PBS como tampon de realizacion y de equilibrado a un caudal de 0,35 ml/min. El ELISA se realiza como se ha descrito anteriormente, recubriendo las placas con IGF1R-His o ErbB3-His recombinante.
10
Los resultados que se obtuvieron esencialmente como se ha descrito anteriormente indican que SF-G1-C8 es estable, con la union a IGF1R y ErbB3-His sustancialmente no afectada, despues de una incubacion con pH bajo (pH 3) durante 1 hora.
15 Para determinar la estabilidad de SF-G1-C8 durante un tiempo prolongado a 4 °C, SF-G1-C8 (19 mg/ml) se incubo en PBS a 4 °C durante 1, 6 o 33 dfas y se sometio a SEC. El porcentaje de monomero se determino mediante SEC como se ha descrito anteriormente. Los resultados indican que SF-G1-C8 muestra una estabilidad del 98 % despues de 33 dfas a 4 °C.
20 Ejemplo 6: Caracterizacion de PBA anti-IGF-1R/ErbB3 y anti-ErbB3/IGF-1R adicionales A) Union a las celulas BxPC-3
La union de los PBA a las celulas BxPC-3 se determina como se indica a continuacion. Las celulas BxPC-3 se 25 mantienen en medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal bovino al 10 %, penicilina/estreptomicina y L-glutamina. El medio se elimina y las celulas BxPC-3 se lavan con PBS. Se anade tripsina hasta que las celulas se separan de la placa, y despues se neutralizan con medio + suero al 10 %. Las celulas se centrifugan y se suspenden de nuevo en tampon FACs (1 x PBS + suero al 2 % + azida al 0,1 %). Los agregados se dividen en celulas individuales por pipeteo arriba y abajo y poniendo las celulas a traves de un colador de celulas. Las celulas se 30 centrifugan y se suspenden de nuevo en tampon FACS a una densidad de 1 x 106 celulas/ml. En una placa de fondo conico de 96 pocillos, 50 pl de suspension celular se alicuota por pocillo para dar 5 x 104 celulas/pocillo.
Los PBA se diluyen a 2 uM en tampon FACS, y se hacen 10 diluciones de 3 veces, con un pocillo final que consiste unicamente en tampon FACS (sin anticuerpo primario). Se anaden 50 ul de los anticuerpos diluidos en serie a 50 ul 35 de celulas de manera que la concentracion final de anticuerpos mas alta sea de 1 uM en el primer pocillo. Las celulas y los anticuerpos se incuban a temperatura ambiente con agitacion suave durante 2 horas. Las placas se centrifugan a 1.500 RPM durante 5 min, y el sobrenadante se elimina. Los sedimentos se lavan tres veces en tampon FACS. Despues del lavado final, se separa el tampon FACS y se anaden 50 ul de anticuerpo secundario anti-Fc-DyLight 649 (Abcam) a 1:100 en tampon FACS. Las celulas se incuban en la sala frfa en la oscuridad con 40 agitacion suave durante 1 hora, se lavan de nuevo tres veces y se suspenden de nuevo en tampon de fijacion de 100 ul (PBS con paraformaldehfdo al 1 %, FBS al 2 %). Las muestras se transfieren a placas FACS de fondo en U de 96 pocillos (Becton Dickinson) y se mantienen en la oscuridad a 4 grados hasta su uso. Las muestras se leyeron utilizando un FACS Calibur (Becton Dickinson), y las intensidades de fluorescente medias (MFI) se determinaron usando FlowJo. Se uso una union total de un sitio para determinar los valores de CE50 con GraphPad PRISM.
45
Los resultados que se obtuvieron esencialmente como se ha descrito anteriormente y se muestran en la figura 29 (AC) y en la Tabla 22 a continuacion, indican que los PBA muestran una fuerte union a las celulas BxPC-3. La figura 29 (D) y la Tabla 22 a continuacion muestran los datos de union analizados usando un ajuste de la curva de union total de un sitio.
Tabla 22: Valores de CE50 de los experimentos de union separados presentados en cada una de las figuras 29A-D
Anticuerpo biespecffico CE50 (nM)
Figura 29A
SF-G1-C8 (16F)
0,6
M27-G1-P4
1,2
M27-G1-M57
1
M27-G1-M78
2,1
B60-G1-P4
0,5
B60-G1-M57
0,3
B60-G1-M78
0,3
M27/M7-G1-P4
2,2
M27/M7-G1-M57
2
M27/M7-G1-M78
1,7
Figura 29B
SF-G1-C8 (16F)
0,3
M57-G1-M1.3
0,2
M57-G1-P6
0,2
M57-G1-V8
0,1
M78-G1-M1.3
0,2
M78-G1-P6
0,4
M78-G1-V8
0,3
Figura 29A
SF-G1-C8 (16F)
0,3
P4-G1-M1.3
0,03
P4-G1-P6
0,02
P4-G1-V8
0,1
M7-G1-M57
0,6
M7-G1-M78
1
M7-G1-P4
2,8
Figura 29D
SF-G1-C8
1,2
SF-G1-P1
2
SF-G1-P6
1,1
SF-G1-M27
1,5
SF-G1-B69
1,1
SF-G1-M1.3
1,4
B) Inhibicion de la senalizacion celular
La inhibicion de la senalizacion celular por PBA se determina esencialmente como se indica a continuacion. Las celulas BxPC-3 se mantienen en medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal bovino al 10 %, 5 penicilina/estreptomicina y L-glutamina. Se colocan en placas 3,5 x 104 celulas en medio completo en placas de cultivo de 96 pocillos. Al dfa siguiente, el medio completo se reemplaza con medio libre de suero, y las celulas se incuban durante una noche a 37 °C. Las celulas se tratan previamente durante 1 hora con las dosis indicadas de farmaco, y despues se estimularon durante 15 minutos con 100 ng/ml de IGF-1 (Calbiochem) y 30 ng/ml de HRG (R & D Systems). Las celulas se lavan con PBS y se lisan en tampon MPer complementado con inhibidores de proteasa 10 y fosfatasa.
Los analisis ELISA para phospho-IGF1R (pIGF1R) phospho-ErbB3 (pErbB3) y phospho-AKT (pAKT) se realizan previamente como se ha descrito en el Ejemplo 4, anteriormente.
15 Se usan ILE-10 (14F o 14f)) y ELI-7 (5F o 5f), ambos de los cuales se han descrito anteriormente, como protefnas de referencia.
Los resultados que se obtuvieron esencialmente como se ha descrito anteriormente y se muestran en las figuras 30 (pIGF-1R), 31 (pErbB3) y 32 (pAKT), y en la Tabla 23 a continuacion, indican que los PBA muestran una fuerte 20 inhibicion de la senalizacion de doble ruta.
T abla 23: Valores de CI50 y valores de inhibicion porcentual para los tratamientos de inhibidores mostrados en las _____________________________________figuras 30, 31 y 32 __________________________________
scFv de ErbB3 IgG-IGF1R
CI50 % de inhibicion CI50 % de inhibicion CI50 % de inhibicion
pIGF1R
pIGF1R
pErbB3 pErbB3 pAKT pAKT
B60-G1-P4
4,4E-09 88 4,0E-11 99 5,5E-10 86
B60-G1-M57
1,0E-08 85 1,2E-09 162 7,3E-10 83
B60-G1-M78
3,5E-09 86 8,0E-11 115 6,4E-10 78
M27-G1-P4
3,0E-09 88 1,0E-10 106 5,7E-10 90
M27-G1-M57
8,1 E-09 83 3,1E-10 88 1,3E-09 84
M27-G1-M78
1,4E-09 87 1,2E-10 107 6,6E-10 92
M27/M7-G1-P4
1,3E-08 99 4,0E-11 111 2,5E-10 92
M27/M7-G1-M57
7,5E-09 91 1,5E-10 179 5,3E-10 91
M27/M7-G1-M78
1,0E-09 91 1,1E-10 140 3,5E-10 92
M7-G1-M57
2,10E-08 82 5,2E-11 124 2,8E-10 88
M7-G1-M78
1,30E-09 88 2,6E-11 I 111 3,7E-10 95
M7-G1-P4
2,40E-09 93 2,4E-11 109 1,8E-10 95
scFv de IGF1R IgG - ErbB3
CI50 % de inhibicion CI50 % de inhibicion CI50 % de inhibicion
pIGF1R
pIGF1R
pErbB3 pErbB3 pAKT pAKT
M57-G1-M1.3
4,1E-10 94 1,4E-10 99 2,3E-09 85
M57-G1-P6
2,5E-10 92 7,0E-11 98 2,1 E-09 79
M57-G1-C8
2,5E-10 93 6,5E-11 98 2,0E-09 80
M78-G1-M1.3
5,0E-10 97 1,4E-10 99 2,2E-09 92
M78-G1-P6
4,2E-10 95 1,4E-10 100 2,1 E-09 86
M78-G1-C8
6,8E-10 96 2,3E-10 98 4,1 E-09 84
P4-G1-M1.3
1,8E-10 92 5,5E-11 94 1,1 E-09 86
P4-G1-P6
1,6E-10 91 3,9E-11 95 1,2E-09 82
P4-G1-C8
1,3E-10 91 3,6E-11 94 1,2E-09 78
SF-G1-C8
5,2E-10 91 1,9E-10 98 3,9E-09 71
En otro conjunto de experimentos, se comparo el nivel de inhibicion de la transduccion de senal inducida por ligando por los PBA con el obtenido con anticuerpos anti-IGF-1R de la tecnica anterior (Ab # A anti-ErbB3 - SEQ ID NO: 336 para HC y 337 para LC) y anticuerpos anti-ErbB3 (Ab # A ANTI-IGF-1R - SEQ ID NO: 327 para la HC y SEQ ID NO: 5 328 para la LC). Los experimentos se realizaron esencialmente como se ha descrito inmediatamente anterior en este Ejemplo.
Los resultados, (figuras 33, 34 y 35 y Tabla 24), indican que los PBA muestran niveles sorprendentemente altos de inhibicion de la senalizacion de doble ruta con respecto a la combinacion de Ab# A ANTI-IGF-1R y Ab# A anti-ErbB3.
10
Tabla 24: Valores de CI50 para los tratamientos de inhibidores presentados en las fic
uras 33, 34 y 35
pIGF1R pErbB3 pAKT
Lfnea celular
Inhibidor CI50 CI50 CI50
BxPC-3
B60-G1-M57 4,4E-09 2,3E-11 6,5E-10
BxPC-3
B60-G1-M78 1,4E-09 1,0E-11 3,4E-10
BxPC-3
B60-G1-P4 2,2E-08 ~2,4e-14 1,1 E-10
BxPC-3
M7-G1-M57 2,1 E-08 5,2E-11 2,8E-10
BxPC-3
M7-G1-M78 1,3E-09 2,6E-11 3,7E-10
BxPC-3
M7-G1-P4 2,4E-09 2,4E-11 1,8E-10
BxPC-3
P4-G1-M1.3 1,1 E-09 5,3E-11 3,4E-10
BxPC-3
P4-G1-C8 1,3E-09 5,8E-07 3,1 E-10
BxPC-3
SF-G1-C8 2,6E-09 2,1 E-10 6,5E-10
BxPC-3
Ab# A ANTI-IGF-1R (ganitumab; SEQ ID 327 + SEQ ID 328) 1,6E-09 4,3E-09 8,0E-11
BxPC-3
Ab# A anti-ErbB3 (SEQ ID 336 + SEQ ID 337) 2,3E-10 9,2E-11 3,5E-10
BxPC-3
Ab# A ANTI-IGF-1R + Ab# A anti-ErbB3 1,5E-09 9,4E-11 4,3E-10
C) Estabilidad de las protefnas biespecfficas
15 Se realizaron diversos estudios de estabilidad esencialmente como se describe en el Ejemplo 5D anterior, y sus resultados muestran que los PBA ensayados eran estables en suero y eran termicamente estables.
Los resultados de estabilidad en suero, (figura 36), indican que los PBA presentan algunas diferencias en la estabilidad en suero. La estabilidad mas baja fue de aproximadamente el 65 % y la estabilidad mas alta fue de 20 aproximadamente el 100 %. Aquellos que tienen un numero de aproximadamente 1 (o superior) se considera que tienen alrededor del 100 % de estabilidad.
Los resultados de las temperaturas de fusion son de la Tabla 25. Los resultados indican que los PBA se despliegan a temperaturas variables.
Tabla 25: Valores de Tm para cada anticuerpo biespecffico, segun se determino por DSF M27/M7 se refiere a un sitio de union que tiene una cadena pesada M27 y una cadena ligera M7.
Anticuerpo biespecffico
Tm (°C)
B60-G1-P4
66,5
B60-G1-M57
67,8
B60-G1-M78
67,5
M27-G1-P4
66,5
M27-G1-M57
67,2
M27-G1-M78
66,8
M27/M7-G1-P4
66,5
M27/M7-G1-M57
68,5
M27/M7-G1-M78
67,5
M57-G1-M1.3
64,5
M57-G1-P6
65,5
M57-G1-C8
66,5
M78-G1-M1.3
68,5
M78-G1-P6
66,5
M78-G1-C8
-
P4-G1-M1.3
62,5
P4-G1-P6
63,5
P4-G1-C8
66,5
M7-G1-M57
70,5
M7-G1-M78
67,5
M7-G1-P4
66,5
5 Los resultados de estabilidad por SEC se muestran en la Tabla 26, e indican que los PBA son en su mayor parte monomericos.
Tabla 26: Porcentaje de monomero determinado por SEC para cada anticuerpo biespecffico
Anticuerpo biespecffico
Porcentaje de monomero
B60-G1-P4
91
B60-G1-M57
92
B60-G1-M78
87
M27-G1-P4
84
M27-G1-M57
87
M27-G1-M78
83
M27/M7-G1-P4
90
M27/M7-G1-M57
93
M27/M7-G1-M78
78
M7-G1-P4
82,4
M7-G1-M57
87,4
M7-G1-M78
82
M57-G1-M1.3
79
M57-G1-P6
77
M57-G1-C8
77
M78-G1-M1.3
79
M78-G1-P6
80
M78-G1-C8
77
P4-G1-M1.3
92
P4-G1-P6
86
P4-G1-C8
95
10 Ejemplo 8: Identificacion de dominios de union adicionales de alta afinidad a anti-IGF-1R y anti-ErbB3
Se aislaron muchos mas dominios de union a anti-IGF-IR y anti-ErbB3 de alta afinidad a traves del cribado de fagos. Las secuencias de la cadena pesada y ligera de estas protefnas son de las figuras 1-4 en las secuencias de 16F.
Las secuencias de los sitios de union anti-IGF-IR comienzan con "5-7" y las secuencias de los sitios de union a anti- ErbB3 comienzan con "E3B".
Ejemplo 9: Potente inhibicion de la senalizacion doble estimulada por IGF1 y HRG mediante PBA anti- 5 EGF1R-anti + ErbB3
Este Ejemplo muestra que los PBA anti-EGF1R+anti-ErbB3 son potentes inhibidores de transduccion de senal estimulada por IGF1 y hRg doble en las celulas DU145 y BxPC-3.
10 Los resultados se obtuvieron esencialmente como se indica a continuacion. Se ponen en placas 35.000 celulas BxPC-3 en suero al 10 % durante una noche a 37 °C. Al dfa siguiente, las celulas se privan en medio que contiene suero al 0,5 % y se incuban durante una noche a 37 °C. Las celulas se trataron previamente durante una hora con las concentraciones indicadas de Ab, y despues se estimulan durante 15 minutos con 30 ng/ml de HRG1b1-ECD + 100 ng/ml de IGF1. En este Ejemplo, y en los Ejemplos 10-13 y 21, los mAb de control anti-IGF1R y anti-ErbB3 son 15 Ab# A ANTI-IGF-1R y Ab# A anti-ErbB3, respectivamente. Las celulas se lisan en tampon M-Per (inhibidores + proteasa/fosfatasa) y se realizan en ELISA para pAKT. Para el ensayo ELISA de pAKT, las placas se recubren con anti-AKT (Millipore), se bloquean con PBS + BSA al 2 %, se incuban con lisados y estandares, y se detectan con un anti-pAKT biotinilado (Ser473) y estreptavidina-HRP. Se anade el sustrato quimioluminiscente de ELISA PICO y se leen las placas en un lector de placas Perkin-Elmer Envision. Todas las curvas CI50 y los valores calculados se 20 generan en Graphpad Prism.
Los resultados (figura 39) indican que los PBA M7-G1-M78, P4-G1-M1.3, P4-G1-C8 y SF-G1-C8 inhiben potentemente la transduccion de senal inducida por IGF-1 y HRG en ambas celulas DU145 y BxPC-3, segun se determina midiendo el AKT fosforilado (pAKT).
25
Ejemplo 10: La potencia de BPA anti-EGF1R+anti-ErbB3 se mantiene en una amplia gama de perfiles de receptor
Este Ejemplo muestra que los PBA anti-EGF1R+anti-ErbB3 son potentes inhibidores de la transduccion de senal 30 doble estimulada por IGF 1 y HRG en celulas que tienen diversos niveles de IGF1R o ErbB3.
Los resultados se obtuvieron esencialmente como se indica a continuacion. Las celulas BxPC-3 se infectan con lentivirus que expresan una horquilla de control, o con shRNA especffico de IGF1R o ErbB3 (Sigma) que reduce la expresion de estas protefnas en aproximadamente el 50 %. La desactivacion se confirma por analisis de FACS y 35 transferencia de Western. Las celulas se cubren y se tratan como se describe en el Ejemplo 9. Los niveles de pAKT se determinan como se describe en el Ejemplo 9.
Los resultados (figura 40 y Tabla 27) indican que los PBA M7-G1-M78, P4-G1-M1.3, P4-G1-C8 y SF-G1-C8 inhiben potentemente la transduccion de senal inducida por IGF-1 y HRG en celulas BxPC-3 que tienen niveles altos o mas 40 bajos (niveles reducidos al 50 %) de IGF1R o ErbB3, como se determina midiendo AKT fosforilado (pAKT).
Tabla 27: La CI50 de los PBA (en M) y el porcentaje de inhibicion de los resultados mostrados en la figura 40
pAKT pAKT
Lfnea celular
Inhibidor % de inhibicion CI50
BxPC-3 (Control de Vector)
M7-M78 89,8 1,1E- 09
BxPC-3 (Control de Vector)
P4-M1.3 87,9 7,1E- 10
BxPC-3 (Control de Vector)
P4-C8 78,3 1,4E- 09
BxPC-3 (Control de Vector)
SF-C8 68,8 3,5E- 09
BxPC-3 (Control de Vector)
Ab# A ANTI-IGF-1R (Ganitumab; SEQ ID 327 + SEQ ID 328) 38,2 2,1E- 08
BxPC-3 (Control de Vector)
Ab# A ANTI-ErbB3 (SEQ ID 336 + SEQ ID 337) 47,2 2,5E- 09
BxPC-3 (Control de Vector)
Ab# A ANTI-IGF-1R + Ab# A ANTI-ErbB3 90,6 3,3E- 09
BxPC-3 (50 % de IGF1R KD)
M7-M78 90,9 3,4E- 10
BxPC-3 (50 % de IGF1R KD)
P4-M1.3 91,1 3,8E- 10
BxPC-3 (50 % de IGF1R KD)
P4-C8 80,4 7,6E- 10
BxPC-3 (50 % de IGF1R KD)
SF-C8 74,5 6,3E- 09
BxPC-3 (50 % de IGF1R KD)
Ab# A ANTI-IGF-1 R (Ganitumab; SEQ ID 327 + SEQ ID 328) 51 4,0E- 08
BxPC-3 (50 % de IGF1R KD)
Ab# A ANTI-ErbB3 (SEQ ID 336 + SEQ ID 337) 58,2 §"w m l
BxPC-3 (50 % de IGF1R KD)
Ab# A ANTI-IGF-1 R + Ab# A ANTI-ErbB3 89,8 §"w m l
BxPC-3 (50 % de IGF1R KD)
M7-M78 91,2 4,0E- 10
BxPC-3 (50 % de IGF1R KD)
P4-M1.3 90,7 3,2E- 10
BxPC-3 (50 % de IGF1R KD)
P4-C8 90,9 3,3E- 10
BxPC-3 (50 % de IGF1R KD)
SF-C8 82,7 2,1E- 09
BxPC-3 (50 % de IGF1R KD)
Ab# A ANTI-IGF-1R (Ganitumab; SEQ ID 327 + SEQ ID 328) 47,7 Oy m l
BxPC-3 (50 % de IGF1R KD)
Ab# A ANTI-ErbB3 (SEQ ID 336 + SEQ ID 337) 59,7 2,8E- 10
BxPC-3 (50 % de IGF1R KD)
Ab# A ANTI-IGF-1 R + Ab# A ANTI-ErbB3 92,8 6,0E- 10
Los BPA se indican con "G1" en la Tabla 27. Por ejemplo, "M7-M78" se refiere a "M7-G1-M78".
Ejemplo 11: Los PBA anti-EGF1R+anti-ErbB3 son inhibidores potentes de la senalizacion inducida por IGF1 o HRG de baja dosis o alta dosis
5 Este Ejemplo muestra que los PBA anti-EGFIR + anti-ErbB3 son potentes inhibidores de la transduccion de senal doble estimulada por IGF1 y HRG en respuesta a la alta o baja concentracion de ligando (IGF1 o HRG).
Los resultados se obtuvieron esencialmente como se indica a continuacion. Se colocan en placas 35.000 celulas BxPC-3 en suero al 10 % durante una noche a 37 °C. Al dfa siguiente, las celulas se privaron en medios que 10 contenfan suero al 0,5 % y se incuban durante una noche a 37 °C. Las celulas se tratan previamente durante una hora con las concentraciones indicadas de PBA, y luego se estimularon durante 15 minutos con IGF1 bajo (40 ng/ml) o alto (400 ng/ml), o HRG1b1-ECD bajo (20 ng/ml) o alto (200 ng/ml). Los analisis ELISA para pErbB3, pIGF1R y tIGF1R son de fuentes comerciales (R & D Systems). Para el ensayo ELISA de pAKT, las placas se recubren con anti-AKT (Millipore), se bloquean con PBS + BSA al 2 %, se incuban con lisados y estandares, y se detectan con un 15 anti-pAKT biotinilado (Ser473) y estreptavidina-HRP. Se anade el sustrato quimioluminiscente de ELISA PICO y se leen las placas en un lector de placas Perkin-Elmer Envision. Todas las curvas CI50 y los valores calculados se generan en Graphpad Prism.
Los resultados, (figuras 41, 42 y Tabla 28), indican que los PBA M7-G1-M78, P4-G1-M1.3, P4-G1-C8 y SF-G1-C8 20 inhiben potentemente la transduccion de la senal Inducida por niveles mas altos o mas bajos de IGF-1 y HRG en celulas BxPC-3, como se determina midiendo los niveles de pAKT (pAKT), pIGF-1R y pErbB3.
Tabla 28: CI50 de los PBA (en M) y porcentaje de inhibicion de los resultados mostrados en las figuras 41 y 42
Ligando
Conc. de ligando Lectura Ab# A ANTI-IGF-1R (ganitumab; SEQ ID NO:327 + SEQ ID NO:328) M7-G1- M78 P4-G1- C8 P4-G1- M1.3 SF-G1- C8
IGF1
40 ng/ml pIGF1R 7,80E-10 1,00E-09 o o m LU o o CM ^ 5,10E- 10
IGF1
400 ng/ml pIGF1R 2,50E-10 2,40E-09 8,80E- 11 9,90E- 11 4,40E- 10
IGF1
40 ng/ml pAKT 7,40E-09 3,80E-10 3,80E- 10 1,40E- 10 1,30E- 09
IGF1
400 ng/ml pAKT 9,10E-09 6,40E-10 3,40E- 10 2,10E- 10 5,90E- 10
Ligando
Conc. de ligando Lectura Ab# A ANTI-ErbB3 (SEQ ID NO:336 + SEQ ID NO:337) M7- G1M78 P4-G1- C8 P4-G1- M1.3 SF-G1- C8
HRG
20 ng/ml pErbB3 2,41E-10 6,16E-11 6,76E- 11 3,12E- 11 2,69E- 10
HRG
200 ng/ml pErbB3 1,98E-10 6,53E-11 5,70E- 11 2,72E- 11 2,66E- 10
HRG
20 ng/ml pAKT 3,06E-10 7,12E-11 1,06E- 10 3,97E- 11 LU CM O co *-
HRG
200 ng/ml pAKT 3,26E-10 6,46E-11 1,01E- 10 4,09E- 11 5,50E- 10
Ejemplo 12: Los PBA anti-EGF1R+anti-ErbB3 suprimen la senalizacion basal
Este Ejemplo muestra que los PBA anti-EGF1R+anti-ErbB3 inhiben los niveles basales de transduccion de senal.
5
Los resultados se obtuvieron esencialmente como se indica a continuacion. Se colocan en placas 35.000 celulas BxPC-3 en suero al 10 % durante una noche a 37 °C. Al dfa siguiente, las celulas se privan en medio que contienen suero al 0,5 % y se incuban durante una noche a 37 °C. Las celulas se tratan previamente durante 15 minutos o 24 horas en presencia de la concentracion indicada de Ab, pero en ausencia de estimulacion de ligando. Las celulas se 10 lisan en tampon M-Per (inhibidores + proteasa/fosfatasa) y se realizan en ELISA para pAKT, como se describe en el Ejemplo 9.
Los resultados (figura 43) indican que los PBA M7-G1-M78, P4-G1-M1.3, y P4-G1-C8 suprimen el nivel basal de pAKT.
15
Ejemplo 13: Los PBA anti-EGF1R+anti-ErbB3 regulan en descenso de forma potente IGF1R
Este Ejemplo muestra que los PBA anti-EGF1R+anti-ErbB3 regulan en descenso IGF1R.
20 Los resultados se obtuvieron esencialmente como se indica a continuacion. Se colocan en placas 35.000 celulas BxPC-3 en suero al 10 % durante una noche a 37 °C. Al dfa siguiente, las celulas se privan en medio que contiene suero al 0,5 % y se incuban durante una noche a 37 °C. Las celulas se incuban despues durante 24 horas en medio que contiene suero al 0,5 % y las concentraciones indicadas de anticuerpo (comenzando a una dosis alta de 5E-07M con las posteriores diluciones de 3 veces). Las celulas se lisan y el IGF1R total se mide mediante ELISA utilizando 25 un kit comercial de R & D Systems. El porcentaje de regulacion en descenso se calcula a partir de Prism usando la siguiente formula: 100*((ajuste.max-mfn.observado)/(ajuste.max-sin estimulacion).
Los resultados (figura 44 y Tabla 29), indican que los PBA M7-G1-M78, P4-G1-M1.3, y P4-G1-C8 reducen el nivel de IGF1R en celulas A549 y BxPC-3.
30
Tabla 29: Regulacion descendente potente de IGF1R por PBA.
Lfnea celular
Molecula % de regulacion descendente de IGF1R
A549
M7-G1-M78 48
A549
P4-G1-C8 70
A549
P4-G1-M1.3 72
A549
Ab# A ANTI-IGF-1R (Ganitumab; SEQ ID 327 + SEQ ID 328) 57
BxPC-3
M7-G1-M78 53
BxPC-3
P4-G1-C8 67
BxPC-3
P4-G1-M1.3 71
BxPC-3
Ab# A ANTI-IGF-1R (Ganitumab; SEQ ID 327 + SEQ ID 328) 51
Ejemplo 14: Los BPA anti-EGF1R+anti-ErbB3 inhiben la senalizacion mediada tanto por IGF1 como por IGF2
Este ejemplo muestra que los BPA anti-EGFIR + anti-ErbB3 inhiben la senalizacion inducida por IGF1 e IGF2.
5
Los resultados se obtuvieron esencialmente como se indica a continuacion. Se colocan en placas de 12 pocillos
500.000 celulas DU145 y Mia PaCa-2 por pocillo durante una noche en suero al 10 %. El dfa 2 las celulas se privan de suero durante una noche. El dfa 3 se realizan las preincubaciones de anticuerpo durante 1 h (250 nM de P4-G1- M1.3 o P4-G1-C8) y se anaden factores de crecimiento (IGF1 o IGF2 a 100 ng/ml) durante 15 minutos antes de la
10 lisis. Todas las celulas se lavan con PBS y se lisan en 100 ul de tampon MPer complementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa. Antes de cargar las muestras sobre geles bis-Tris al 4-12 %, se anadio tampon de carga que contenfa b-mercaptoetanol (b-ME) y los lisados se hirvieron durante 5 minutos a 95 °C. Los geles se realizaron a una constante de 150 voltios durante aproximadamente 90 minutos y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa usando el programa de transferencia de 8 minutos del sistema de transferencia iBlot (Invitrogen). Las membranas se 15 bloquean en tampon de bloqueo Odyssey (Licor Biosciences) durante 1 hora a temperatura ambiente, y luego se incubaron con anticuerpos primarios durante una noche a 4 °C en BSA al 5 % en TBS-T. Los anticuerpos usados son pAkt, pIGF1R, Beta Actina (todos de Cell Signaling Technologies). Se uso B-actina a 1:5.000, Phospho-Akt a 1:2.000, y todos los demas a 1:1.000. Las membranas del dfa siguiente se lavan 3 x 5 minutos cada una con TBS-T y luego se incuban con IgG anti-conejo-DyLight800 (Cell Signaling) a 1:15.000 en leche al 5 % en TBS-T durante 1 20 hora a temperatura ambiente. A continuacion, las membranas se lavan 3 x 5 minutos cada una con TBS-T y se escanean usando el sistema Licor Odyssey (Licor Biosciences). Las intensidades integradas se calculan y se normalizan a los niveles de beta-actina.
Los resultados (figura 45) muestran que los BPA P4-G1-M1.3 y P4-G1-C8 inhiben la fosforilacion de AKT inducida 25 por IGF1 o IGF2.
Ejemplo 15: Los BPA anti-EGF1R+anti-ErbB3 inhiben parcialmente la senalizacion de insulina
Este ejemplo muestra que los BPA anti-EGF1R + anti-ErbB3 inhiben parcialmente la senalizacion de insulina en 30 celulas DU145.
Los resultados se obtuvieron esencialmente como se indica a continuacion. Se colocan en placas de 12 pocillos
500.000 celulas DU145 por pocillo durante una noche en suero al 10 %. El dfa 2 las celulas se privan de suero durante una noche. El dfa 3 se realizan las preincubaciones de Ab durante 1 h (500 nM de P4-G1-M1.3) y se anaden
35 factores de crecimiento (IGF1 a 100 ng/ml o insulina a 5 ug/ml) durante 15 minutos antes de la lisis. Los lisados y las transferencias de Western se preparan como se describe en el Ejemplo 14.
Los resultados (figura 46) indican que BPA P4-G1-M1.3 inhibe parcialmente la transduccion de senal inducida por insulina, segun se mide por los niveles de pAKT.
40
Ejemplo 16: Los BPA anti-EGF1R+anti-ErbB3 reaulan en descenso los niveles de receptor totales de ErbB3 e IGF1R
Este Ejemplo muestra que los BPA anti-EGF1R+anti-ErbB3 regulan en descenso los niveles de ErbB3 e IGF1R en 45 las celulas que se inducen por IGF1 y HRG o no se inducen.
Los resultados se obtuvieron esencialmente como se indica a continuacion. Se colocan en placas de 12 pocillos
500.000 celulas BxPC-3 por pocillo durante una noche en suero al 10 %. El dfa 2 las celulas se privan de suero durante una noche. El dfa 3, las preincubaciones de anticuerpos se realizan durante 6 horas (250 nM de M7-G1-M78
50 o P4-G1-C8). A la mitad de las muestras se les anaden tambien factores de crecimiento (IGF1 a 100 ng/ml y HRG a 30 ng/ml) durante 15 minutos antes de la lisis. Los lisados y las transferencias de Western se preparan como se describe en el Ejemplo 14. IGF1R, ErbB3 y pErbB3 son tambien de Cell Signaling Technologies.
Los resultados (figura 47) indican que los niveles totales (fosforilados y no fosforilados) de ErbB3 e IGF1R se 55 reducen por los BPA M7-G1-M78 y P4-G1-C8.
Este Ejemplo muestra que los BPA anti-EGF1R+anti-ErbB3 son estables en suero humano, de raton y de mono.
5
Los resultados se obtuvieron esencialmente como se indica a continuacion. Los PBA se incuban en suero humano combinado (Innovative Research), suero de raton (Sigma) o suero de mono Cynomolgous (Innovative Research) a una concentracion final de 2,5 pM durante 0 dfas o 5 dfas a 37 °C. Las muestras se ensayan a continuacion utilizando un ensayo de union ELISA colorimetrico. Se recubren placas Reacti-bind de 96 pocillos (Pierce, Fisher cat. 10 N.° PI-15041) con 50 ul de la protefna correspondiente al scFv del anticuerpo (ya sea ErbB3-His o IGF1R-His (R & D Systems, cat. N.° 348-RB y 305-GR, respectivamente) a 2 ug/ml en PBS) y se incuban durante una noche a 4 °C. Al dfa siguiente, las placas se lavan con pBs + Tween-20 al 0,05 % (PBS-T) y se bloquean durante 1 h a temperatura ambiente con 100 ul de tampon de bloqueo libre de protefnas (Pierce). Las placas se lavan con PBS-T y se anaden por duplicado 50 ul de cada BPA. Las concentraciones comienzan a 500 nM (dilucion 1:5 de bsAb 2,5 uM en suero) 15 en PBS-T e incluyen diez diluciones de dos veces adicionales (en PBS-T + suero al 20 %) y una en blanco (PBS-T + suero solamente). Las placas se incuban a temperatura ambiente durante dos horas y luego se lavan con PBS-T. Se anaden 50 ul de anti-Fc-HRP (Jackson Labs) a 1:40.000 en PBS-T, y las placas se incuban en la oscuridad durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavan de nuevo con PBS-T y se anaden 100 ul de sustrato de TMB (Thermo Scientific, TMB y solucion de peroxido mezclados 1:1). Las placas se incuban durante 5-15 minutos a 20 temperatura ambiente hasta que se desarrolla un color azul, y la reaccion se detiene con 100 ul de solucion STOP (Cell Signaling Technology). La absorbancia se lee a 450 nm en un lector de placas PerkinElmer Envision, y las curvas de union se generan con GraphPad Prism.
Los resultados (figura 48) muestran que los BPA M7-G1-M78, P4-G1-M1.3 y P4-G1-C8 son estables durante al 25 menos 5 dfas en suero de raton y cyno y que P4 -G1-M1.3 es estable durante al menos 6 dfas en suero humano.
Ejemplo 18: Los BPA anti-EGF1R+anti-ErbB3 muestran la reactividad cruzada con IGF1R y ErbB3 humanos, de raton, de rata y de mono
30 Este ejemplo muestra que los BPA anti-EGF1R + anti-ErbB3 son reactivos cruzados con IGF1R y ErbB3 humanos, de raton, de rata y de mono.
Los resultados se obtuvieron esencialmente como se indica a continuacion. Se recubren placas Reacti-bind® de 96 pocillos (Pierce, Fisher cat. N.° PI-15041) con 50 ul de ErbB3-His o IGF-1R-His especfficos de la especie (R&D 35 Systems, cat. N.° 348-RB y 305-GR, respectivamente) a 2 ug/ml en PBS y se incuban durante una noche a 4 °C. Al dfa siguiente, las placas se lavan con pBs + Tween-20 al 0,05 % (PBS-T) y se bloquean durante 1 h a temperatura ambiente con 100 ul de tampon de bloqueo libre de protefnas (Pierce). Las placas se lavan con PBS-T y se anaden por duplicado 50 ul de cada PBA. Las concentraciones comienzan a 500 nM (en PBS-T) e incluyen diez diluciones adicionales de dos veces y una en blanco (solo PBS-T). Las placas se incuban a temperatura ambiente durante dos 40 horas y luego se lavan con PBS-T. Se anaden 50 ul de anti-Fc-HRP (Jackson Labs) a 1:40.000 en PBS-T, y las placas se incuban en la oscuridad durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavan de nuevo con PBS-T y se anaden 100 ul de sustrato de TMB (Thermo Scientific, TMB y solucion de peroxido mezclados 1:1). Las placas se incuban durante 5-15 minutos a temperatura ambiente hasta que se desarrolla un color azul, y la reaccion se detiene con 100 ul de solucion STOP (Cell Signaling Technology). La absorbancia se lee a 450 nm en un lector de placas 45 PerkinElmer Envision, y las curvas de union se generan usando GraphPad Prism.
Los resultados (figura 49) muestran que los BPA P4-G1-C8, P4-G1-M1.3 y M7-G1-M78 se unen eficientemente a IGF1R y ErbB3 de humano, raton, rata y mono.
50 Ejemplo 19: Los BPA anti-EGF1R+anti-ErbB3 bloquean la union a IGF1 e IGF2 a su receptor IGF1R
Este Ejemplo muestra que los BPA anti-EGF1R+anti-ErbB3 bloquean la union tanto de IGF1 como de IGF2 a IGF1R.
Los resultados se obtuvieron esencialmente como se indica a continuacion. Las placas de ELISA se recubren con 55 IGF1R-His y se bloquean como se describe en el Ejemplo 18. Despues de la etapa de bloqueo, las placas se lavan y se incuban con IGF1 (100 ng/ml) o IGF2 (100 ng/ml) (EMD Chemicals) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan con PBS-T y se anaden por duplicado 100 ul de cada Ab. Las concentraciones comienzan a 500 nM (en PBS-T) e incluyen diez diluciones adicionales de dos veces y una en blanco (solo PBS-T). Las placas se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora y despues se lavan con PBS-T. Se anaden 50 pl de IGF1 anti-humano de
conejo (Thermo Scientific) o IGF2 anti-humano de conejo (Abcam) a 1:1.000 en PBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan de nuevo y se incuban en HRP anti-conejo (Cell Signaling) a 1:1.000 en PBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se desarrollan, se leen y se analizan como se ha descrito anteriormente.
5
Los resultados (figura 50) indican que P4-G1-M1.3 inhibio la union tanto de IGF1 como de IGF2 de union a IGF1R.
Ejemplo 20: Los BPA anti-EGF1R+anti-ErbB3 muestran semividas dependientes de la dosis v diferentes en ratones v semividas laraas en monos Cvnomolaus
10
Este Ejemplo proporciona propiedades farmacocineticas de BPA anti-EGF1R + anti-ErbB3 en ratones y monos Cynomolgus.
Los resultados se obtuvieron esencialmente como se indica a continuacion. Dosificacion y recogida de muestras: 15 Los ratones se dosifican mediante bolo IV con P4-G1-M1.3 o M7-G1-M78 a 100 ug/raton o 500 ug/raton y se recoge sangre a las 0,25, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96 y 168 horas. Se sangran cuatro ratones por punto de tiempo. La infusion IV de monos Cynomolgus (WIL Research Laboratories) se realiza con P4-C8 y P4-M1.3. Dos monos de cada grupo se dosifican a 5 mg/kg o 25 mg/kg y se sangran a las 0,08, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 96 y 168 horas. Ensayo de union de ELISA y analisis de modelado: Se recubren placas Reacti-bind® de 96 pocillos (Pierce, Fisher cat. N.° PI-15041) con 20 50 ul de IGF1R (sin etiqueta) a 2 ug/ml en PBS y se incuban durante una noche a 4 °C. Las placas se lavan con PBS-Tween-20 al 0,05 % (PBS-T) y se bloquean durante 1 hora a temperatura ambiente con 100 ul de tampon de bloqueo libre de protefnas Pierce. Las placas se lavan de nuevo con PBS-T. Se anaden 100 ul de muestras y estandares a las placas y se incuban durante 2 h a temperatura ambiente. Para las curvas estandar, los anticuerpos se diluyen a 12 ug/ml en PBS-T, luego 10 diluciones adicionales de 3 veces con el pocillo final en blanco. Las 25 muestras en suero se diluyen a 1:50 en PBS-T con 10 diluciones adicionales de 3 veces y una muestra final en blanco. Las placas se lavan con PBS-T y se anaden 100 ul de ErbB3-His a 1 ug/ml en PBS-T durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavan y se anaden 100 ul de anti-His-HRP (Abcam) a 1:10.000 en PBS-T y se incuban (recubiertas) durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavan de nuevo con PBS-T y se anaden 100 ul de sustrato de TMB (Thermo Scientific, TMB y solucion de peroxido mezclados 1:1). Las placas se incuban 30 durante 5-15 minutos a temperatura ambiente hasta que se desarrolla un color azul, y la reaccion se detiene con 100 ul de solucion STOP (Cell Signaling Technology). La absorbancia se lee a 450 nm en un lector de placas PerkinElmer Envision, y el analisis de datos se realiza usando MATLAB (Mathworks -
www.mathworks.com) y WinNonLin (Pharsight -
www.pharsight.com) de acuerdo con los protocolos estandar.
35 Los resultados en ratones (Tabla 30), indican que los BPA M7-G1-M78 y P4-G1-M1.3 tienen una semivida en ratones que varfa de 3,33 a 41,90 horas de media, dependiendo del BPA y de la concentracion de BPA administrada al raton. Los resultados en mono Cynomolgus, (Tabla 31), indican que la semivida de P4-G1-C8 y P4-G1-M1.3 es de 51 y 61 horas, respectivamente, para 5 mg/kg, y 115 y 78 horas, respectivamente, para 25 mg/kg de PBA. Por lo tanto, los PBA que tienen la orientacion anti-IGF1R-anti-ErbB3 (es decir, en la que la porcion anti-IGF1R es un Ab de 40 longitud completa y la porcion anti-ErbB3 esta compuesta por dos scFv) son mas estables que un PBA que tiene la conformacion contraria (es decir, en la que el anti-ErbB3 es un Ab de longitud completa y la porcion anti-IGF1R esta compuesta por dos scFv).
Tabla 30: Semivida (en horas) de BPA en ratones
Molecula
Dosis (ug/raton) T 1/2 (h)
Media
95 % de intervalo de conf.
M7-G1-M78
100 3,33 2,43 5,32
500
11,16 9,40 13,75
P4-G1-M1.3
100 10,91 8,24 16,11
500
41,90 28,79 76,98
Tabla 31: Semivida (en horas) de BPA en monos Cynomolgus
MATLAB WinNonLin
Molecula
Dosis (mg/kg) T1/2 Terminal (h) 95 % de IC T/12 Terminal (h) Rsq
P4-C8
5 51 39-73 46,8529 0,9998
25
115 83-189 93,5036 0,959
P4-M1.3
5 61 39-140 62,1732 0,9901
25
78 57-123 80,8655 0,9934
Ejemplo 21: P4-G1-M1.3 muestra la inhibicion in vitro de la activacion de receptor inducida por liaando y la senalizacion de Akt/mTOR/ERK en el tiempo
5 Este Ejemplo muestra que P4-G1-M1.3 inhibe la fosforilacion inducida por ligando de IGF-1R y ErbB3, asf como las protefnas aguas abajo de Akt, Erk, mTOR y S6 en celulas cultivadas BxPC-3 en el tiempo.
Metodos
10 Las celulas BxPC-3 se mantienen en medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal bovino al 10 %, penicilina/estreptomicina y L-glutamina. Se colocan en placas 3,5 x 104 celulas en medio completo en placas de cultivo de 96 pocillos. Al dfa siguiente, el medio completo se reemplaza con medio libre de suero, y las celulas se incuban durante una noche a 37 °C. Las celulas se tratan previamente durante 1 hora con 1 pM de P4-G1-M1.3 o se mantienen en medio libre de suero sin inhibidor, y luego todas las celulas se estimulan durante 5, 15, 30, 60 o 120 15 minutos con 100 ng/ml de IGF1 (Calbiochem) y 70 ng/ml de HRG (R&D Systems). Las celulas se lavan con PBS y se lisan en tampon MPer complementado con inhibidores de proteasa y fosfatasa.
Los analisis ELISA para phospho-IGF1R (pIGF1R) phospho-ErbB3 (pErbB3) y phospho-AKT (pAKT) se realizan previamente como se ha descrito en el Ejemplo 4, anteriormente. Los analisis ELISA para phospho-ERK (pERK, Cell 20 Signaling Technology catalogo n.° 7246), phospho-S6 (pS6, R&D Systems catalogo n.° DYC3918) y phospho-mTOR (pmTOR, R&D Systems catalogo n.° DYC1665) se realizan de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las concentraciones resultantes de cada protefna fosforilada se normalizan a los niveles de protefna total, determinada usando el metodo BCA.
25 Los resultados (figura 51), indican que P4-G1-M1.3 es capaz de bloquear significativamente la produccion inducida por ligando de Phospho-IGF-1R (51A), Phospho-ErbB3 (51B), Phospho-Akt (51C), Phospho-ERK (p44/p42; 51D), Phospho-mTOR (Ser2448, 51E), y Phospho-S6 (Ser235/236; 51F) en presencia de IGF-1 y HRG.
Ejemplo 22: Los PBA anti-EGF1R + anti-ErbB3 bloquean la senalizacion mediada por heterodimeros de 30 lGF1R-receptor de insulina
Este Ejemplo muestra que la inhibicion de la senalizacion de insulina e IGF2 por PBA anti-EGF1R + anti-ErbB3 esta mediada por los heterodimeros de IGF1R-receptor de insulina.
35 Los resultados se obtuvieron esencialmente como se indica a continuacion. Se colocan en placas de 12 pocillos
500.000 celulas BxPC-3 y A673 por pocillo durante una noche en suero al 10 %. El dfa 2 las celulas se privan de suero durante una noche. El dfa 3 se realizan las preincubaciones de anticuerpos durante 1 h (500 nM de P4-G1- M1.3) y se anaden factores de crecimiento (IGF1, IGF2 a 100 ng/ml o insulina a 5 ug/ml) durante 15 minutos antes de la lisis.
40
Los resultados (figura 52) indican que P4-G1-M1.3 es capaz de bloquear significativamente la senalizacion de IGF2 e insulina en celulas A673, que expresan niveles altos del receptor de insulina (IR). Este nivel de inhibicion no se observo en las celulas BxPC-3 que expresan bajos niveles de IR.
45 Ejemplo 23: PBA P4-G1-M1.3 muestra reducciones superiores de la activacion de mTOR y niveles de protefna mTOR en relacion con un mAb anti-IGF-1R
Este Ejemplo muestra que P4-G1-M1.3 muestra un control superior de la activacion de mTOR en relacion con un mAb anti-IGF-1R en tumores BxPC-3 al final del estudio.
50
El perfil de tumores de un estudio de xenoinjerto BxPC-3 se realizo esencialmente como se indica a continuacion. Se prepararon ratones con xenoinjertos de lfneas celulares tumorales humanos y se administraron diversos tratamientos esencialmente como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 3D. Se recogieron cinco tumores de fin de estudio del grupo de control de PBS, el grupo de dosis mas alta de P4-G1-M1.3 (500 ug/raton q3d), y el grupo de dosis mas 55 alta de Ab# A anti-IGF1R (ganitumab; SEQ ID NO:327 + SEQ ID nO:328) (368 ug/raton q3d), y se preparan esencialmente como se indica a continuacion. Los lisados se generan por pulverizacion tisular y lisis en tampon TER1 (Invitrogen). La protefna total se cuantifica por el metodo BCA, y la protefna total equivalente se realiza en geles SDS-PAGE al 4-12 %. Los geles se transfieren a nitrocelulosa usando metodos estandar. La transferencia de Western se realiza usando: anticuerpos primarios anti-mTOR y anti-phospho-mTOR (Ser2448) (todos de Cell
Signaling Technology). El anticuerpo secundario utilizado es IgG anti-conejo - DyeLight800 (Cell Signaling Technology). Las transferencias se desarrollan usando el sistema Li-Cor Odyssey. La normalizacion a p-actina se realiza dividiendo la intensidad de la banda diana por su banda de control p-actina asociada.
5 Los resultados, (figuras 53A y B y la Tabla 32), indican que los niveles de mTOR y phospho-mTOR(Ser2448) son significativamente inferiores en tumores de ratones tratados con el PBA P4-G1-M1.3, con respecto a los ratones tratados con el Ab# A anti-IGF-IR.
Tabla 32. P4-G1-M1.3 muestra un control superior de la actividad de mTOR, con respecto a Ab# A anti-IGF-IR en 10 tumores de BxPC-3 de fin de estudio
Muestras
Niveles de mTOR con Niveles de phospho-mTOR con
respecto al control de tampon
respecto al control de tampon
Control de tampon
1,0 1,0
P4-G1-M1.3
2,4 1,1
Ab# A ANTI-IGF-1R (ganitumab; SEQ ID NO:327+SEQ ID NO:328)
10,5 2,3
Ejemplo 24: P4-G1-M1.3 regula en descenso los receptores e inhibe la senalizacion de PI3K/Akt/mTOR en modelos de xenoinjerto Caki-1 y BxPC-3
15 Este Ejemplo muestra que P4-G1-M1.3 regula en descenso los receptores e inhibe la senalizacion de PI3K/Akt/mTOR en modelos de xenoinjerto de carcinoma de celulas limpias humanas Caki-1 y de adenocarcinoma pancreatico humano BxPC-3 en tumores de final de estudio.
El perfil de tumores de un estudio de xenoinjerto Caki-1 se realizo esencialmente como se indica a continuacion. Se 20 prepararon ratones con xenoinjertos de lfneas celulares tumorales humanos y se administraron diversos tratamientos esencialmente como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 3D. Para el estudio de xenoinjerto Caki-1, se establecieron 3 grupos, conteniendo cada uno 5 ratones. Estos inclufan control, P4-G1-M1.3 (600 pg), y Ab# A anti- IGF-1R (291 pg de la dosis 1, 320 pg de la dosis 2). Los anticuerpos se dosificaron dos veces, IP, en un intervalo de tres dfas. El everolimus se dosifico PO, qd. Los tumores se cosecharon 24 horas despues de la segunda dosis de 25 anticuerpo.
El perfil de tumores de un estudio de xenoinjerto BxPC-3 se realizo esencialmente como se describe en el Ejemplo 23.
30 Los tumores se pesaron inicialmente y se pulverizaron en un pulverizador de tejido CryoPrep (Modelo CP-02, Covaris). El reactivo de extraccion de tejido 1 (TER1, Life Technologies™) que contiene inhibidores de proteasa y fosfatasa se anadio al tumor en una relacion de 1 ml de TER1 por 100 mg de tejido. Las muestras se incubaron en hielo durante 30 minutos para solubilizar el tejido y se colocaron a traves de una columna QIAshredder™ (Qiagen) de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. Se realizo un ensayo de BCA (Pierce) para determinar la 35 concentracion de protefna de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Las muestras se analizaron por transferencia de western. Se anadio un tampon de carga que contenfa p- mercaptoetanol (p-ME) y los lisados se hirvieron durante 5 minutos a 95 °C. Aproximadamente 40 pg de protefna y dos escaleras (Invitrogen) se realizaron en cada pocillo de un gel de 18 pocillos (BioRad). Los geles se realizaron a 40 una constante de 150 voltios durante aproximadamente 90 minutos y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa usando el programa de transferencia de 8 minutos del sistema de transferencia iBlot® (Invitrogen). Las membranas se bloquearon en tampon de bloqueo Odyssey® (Licor® Biosciences) durante 1 hora a temperatura ambiente, y luego se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C en BSA al 5 % en TBS-T. Todos los anticuerpos se adquirieron en Cell Signaling y se usaron en la dilucion recomendada. Las membranas del dfa 45 siguiente se lavaron 3 x 5 minutos cada una con TBS-T y luego se incubaron con IgG anti-conejo DyLight® 800 (Cell Signaling) o IRDye® 800 anti-conejo (Licor® Biosciences) a 1:10.000-15.000 en leche al 5 % en TBS-T durante 1 hora a temperatura ambiente. Despues, las membranas se lavaron 3 x 5 minutos cada una con TBS-T y se escanearon usando el sistema Licor® Odyssey® (Licor® Biosciences). Las intensidades de banda se cuantificaron usando Image Studio 2.0 y se normalizaron a los niveles de p-actina. En los xenoinjertos Caki-1, los tumores de 50 control se compararon con los tratados con P4-G1-M1.3, Ab#A Anti-IGF-1R + Ab#A Anti-ErbB3 o everolimus.
Los resultados del estudio de perfil de Caki-1 (figuras 54A-F), indican que los niveles de IGF-1R, receptor de insulina, ErbB3, EGFR, pAKT (Ser473 o Thr308), pFox01(Thr24)/Fox03a (Thr32) y phospho-mTOR (Ser2448 o
Ser2481) son todos similares a los niveles en ratones de control o inferiores en tumores de ratones tratados con P4- G1-M1.3, en relacion con ratones tratados con la combinacion Ab#A Anti-IGF-IR + Ab#A Anti-ErbB3 o el inhibidor de mTOR everolimus.
5 Los resultados del estudio de perfil de BxPC-3 (figuras 55A-C), indican que IGF-1R, ErbB3, pEGFR, pmTOR (S2448) y pS6 (S235/236) son todos mas bajos en tumores de ratones tratados con P4-G1-M1.3, con respecto a los ratones tratados con el Ab#A Anti-IGF-1R o PBS en solitario.
Ejemplo 25: P4-G1-M1.3 bloquea la union de IGF-1 e IGF-2 a los receptores.
10
Este Ejemplo muestra por medio de un ensayo ELISA que P4-G1-M1.3 bloquea eficazmente la union de IGF-1 e IGF-2 a IGF-1R.
Las placas Reacti-bind® de 96 pocillos (Pierce) se recubrieron con 50 pl de IGF-1R-His (R&D Systems cat. N.° 30515 GR; 2 pg/ml en PBS) y se incubaron durante una noche a 4 °C. Al dfa siguiente, las placas se lavaron con PBS + Tween-20 al 0,05 % (PBS-T) y se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente con 100 pl de tampon de bloqueo libre de protefnas (Pierce). Las placas se lavaron con PBS-T y se anadieron 100 pl de P4-G1-M1.3 por duplicado. La concentracion de anticuerpos comenzo a 500 nM (en PBS-T) e incluyo diez diluciones adicionales de dos veces y una en blanco (PBS-T en solitario). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante dos horas y luego se 20 lavaron con pBs-T. Se anadieron 100 pl de IGF-1 o IGF-2 (eMd Chemicals) a 100 ng/ml y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora. Despues del lavado, se anadieron a las placas 100 pl de Anti-IGF-1 de conejo o Anti-IGF-2 de conejo (ambos Abcam, 5 pg/ml) y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Despues las placas se lavaron y se incubaron con 100 pl de HRP anti-conejo (Cell Signaling) durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron de nuevo y se anadieron 100 pl de sustrato de TMB (Cell Signaling). Las placas se 25 incubaron durante 5-15 minutos a temperatura ambiente hasta que se desarrollo un color azul, y la reaccion se detuvo con 100 pl de solucion STOP (Cell Signaling Technology). La absorbancia se leyo a 450 nm en un lector de placas PerkinElmer Envision, y las curvas de union se generaron usando GraphPad Prism®.
Los resultados del ensayo ELISA (figura 56), muestran que P4-G1-M1.3 bloquea tanto la union de IGF-1 como IGF-2 30 a IGF-1R de una manera dependiente de la dosis.
Ejemplo 26: P4-G1-M1.3 y P4-G1-C8 en modelos de xenoinjerto de tumor DU145, BxPC-3, SK-ES-1, y Caki-1
Para cada uno de los estudios A-D siguientes, las celulas se suspendieron de nuevo 1:1 con PBS:Matrigel® con 35 reduccion del factor de crecimiento y se inyectaron por via subcutanea en ratones Nu/Nu. Los tumores se dejaron desarrollar durante 8 dfas. Se inyectaron anticuerpos por via intraperitoneal cada 3 dfas (q3d) a las dosis indicadas/raton. Las longitudes y anchuras de los tumores se midieron dos veces a la semana manualmente por un calibrador, y el volumen tumoral se calculo usando la siguiente formula: n/6(L x W2). Cada brazo del estudio contenfa 10 animales.
40
A. P4-G1-C8 y P4-G1-M1.3 suprimen el crecimiento tumoral de celulas de cancer de prostata DU145 in vivo.
Para este estudio de xenoinjerto DU145, se prepararon 8 x 106 celulas DU145 y se usaron como se ha descrito anteriormente.
45
Los resultados (figura 57A), muestran que tanto P4-G1-C8 como P4-G1-M3 suprimen el crecimiento de celulas de cancer de prostata in vivo.
B. P4-G1-C8 y P4-G1-M1.3 suprimen el crecimiento tumoral de celulas de cancer pancreatico BxPC-3 in vivo 50 mejor que una IaG anti-IGF-1R.
Para este estudio, se prepararon 5 x 106 celulas BxPC-3 y se usaron como se ha descrito anteriormente.
Los resultados (figura 57B) muestran que P4-G1-C8 y P4-G1-M1.3 suprimen el crecimiento tumoral de celulas de 55 cancer de pancreas BxPC-3 in vivo y que ambos son superiores a los Ab# A anti-IGF-1R en la inhibicion del crecimiento de celulas tumorales.
C. P4-G1-M1.3 suprime el crecimiento tumoral de celulas de cancer de sarcoma de Ewing SK-ES-1 in vivo
Para este estudio de xenoinjerto, se prepararon 10 x 106 celulas SK-ES-1 y se usaron como se ha descrito anteriormente.
Los resultados (figura 57C), muestran que P4-G1-M1.3 suprime el crecimiento de celulas tumorales de una manera 5 dependiente de la dosis.
D. P4-G1-M1.3 suprime el crecimiento tumoral de las celulas cancerosas de celulas renales Caki-1 in vivo y muestra una supresion superior en comparacion con la combinacion de una IgG anti-IGF-1R y una IgG anti- ErbB3.
10
Para este estudio, se prepararon 8 x 106 celulas Caki-1 y se usaron como se ha descrito anteriormente.
Los resultados (figura 57D) muestran que P4-G1-M1.3 suprime el crecimiento de celulas tumorales de una manera dependiente de la dosis y es mas eficaz en la inhibition del crecimiento de celulas tumorales que una combinacion 15 de anticuerpos Ab # A anti-IGF-1R (ganitumab; SEQ ID NO: 327 + SEQ ID NO: 328) y anticuerpo Ab # A anti-ErbB3 (SEQ ID NO: 336 + SEQ ID NO: 337), independientemente de que estos anticuerpos se administren a una exposicion igual o una dosificacion equimolar.
Ejemplo 27: Analisis computacional de los datos de PK para disenar estudios de PD/eficacia en ratones
20
Este Ejemplo describe la metodologfa computacional utilizada para ajustar el modelo matematico a datos experimentales para estimar los parametros farmacocineticos (PK) de M1.3-G1-P4.
Ajuste del modelado matematico a datos PK 25
Los parametros de PK de M1.3-G1-P4 se dedujeron mediante la implementation del modelo de disposition de farmaco mediado por diana (TMDD) de bolo intravenoso (IV). La TMDD IV es un modelo de PK de 2 compartimentos estructurado como un conjunto de 4 ecuaciones diferenciales acopladas, como se indica a continuation:
30
<i[De3
dt
Cld [Dc] - t\d [Dp] -+-Ct[Dc]~ k07l M [D c] - koff [D:fl]
(1A)
Vc
— Ci j [Dc]
dt ‘'CL J Vp
imagen1
35 En las ecuaciones 1A-1D, Dc y Dp son las concentraciones del farmaco en los compartimentos central y periferico, Vc y Vp son los volumenes de los compartimentos centrales y perifericos, mientras que R y D:R representan las concentraciones del receptor diana libre y el complejo farmaco-receptor en el compartimiento central. Ademas, Cid, Ci, kin, kout, kon, koff y kei representan respectivamente las constantes de velocidad de transporte a traves de los compartimentos, la depuration del farmaco desde el compartimento central, la sfntesis del receptor, la degradation 40 del receptor, la asociacion de farmaco-receptor, la disociacion de farmaco-receptor y la depuracion de farmaco- receptor del compartimento central. El modelo de TMDD IV describe los procesos dinamicos de union de farmaco al receptor diana y la depuracion de farmaco en el compartimiento central, asf como el proceso de transporte de farmaco desde el compartimento central al periferico cuando el farmaco de interes se inyecta directamente en el compartimento central (sangre). El ajuste del modelo TMDD a los datos experimentales obtenidos de la sangre de 45 los ratones permite estimar las propiedades de PK de M1.3-G1-P4.
La figura 58 muestra el ajuste del modelo TMDD a los datos experimentales (lfnea continua = ajuste de dosis de 500 pg/raton dada i.v., lfnea discontinua = ajuste de dosis de 100 pg/raton dada i.v.). Los parametros de PK M1.3-G1-P4 se enumeran en la Tabla 24 a continuacion.
Tabla 24. Parametros de PK de M1.3-G1-P4 inferidos a partir del ajuste del modelado de TMDD IV a los datos de _______________________ PK obtenidos de sangre de ratones_________________________
Cld Ci kin kout kon koff kel Vc Vt
(h1)
(h-1) (ng ml-1 h-1) (h-1) (ng ml-1 h-1) (h-1) (h-1) ml ml
M1.3-G1-P4
0,203 0,030 1020,44 0,0415 0,06 0,01 0,0001 1,386 57,745

Claims (16)

1. Un anticuerpo biespecffico polivalente (PBA), cuyo anticuerpo es una protefna que comprende dos
pares de cadenas polipeptfdicas, comprendiendo cada par de dichos dos pares una cadena pesada unida a una 5 cadena ligera por al menos un enlace de cadena pesada; en el que cada par comprende al menos un sitio de union a anti-IGF-IR y al menos un sitio de union a anti-ErbB3; y cada par comprende un primer sitio de union que comprende una porcion N-terminal de la cadena pesada del PBA y una porcion N-terminal de la cadena ligera del PBA, y un segundo sitio de union que es un scFv C-terminal que esta compuesto en su totalidad por la cadena pesada del PBA, conteniendo dicho scFv C-terminal una region variable de cadena pesada unida a una region 10 variable de cadena ligera por un enlazador scFv; y el sitio de union a anti-IGF-IR esta unido al sitio de union a anti- ErbB3 a traves de una region constante de inmunoglobulina de cadena pesada (HC Ig) compuesta por la cadena pesada del PBA, y los dos pares estan unidos mediante al menos un enlace entre las regiones constantes de HC Ig de cada par, y
15 (i) el sitio de union a anti-IGF-IR comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende
un conjunto de tres regiones determinantes de la complementariedad VH (CDR) dispuesta en un orden lineal amino a carboxi de VHCDR1, VHCDR2 y VHCDR3, y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende un conjunto de tres CDR VL dispuestas en un orden lineal amino a carboxi de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3, en el que
20
a. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:8 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:32; o
b. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacfdica de las
25 CDR correspondientes de SEQ ID NO:9 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R
comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:33; o
c. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:10 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:34; o
30 d. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacfdica de las
CDR correspondientes de SEQ ID NO:11 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:35; o
e. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:8 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R
35 comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:33; o
f. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:10 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:32; o
40 (ii) el sitio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) que comprende un
conjunto de tres CDR VH y un dominio variable de cadena ligera (VL) que comprende un conjunto de tres CDR VL, comprendiendo ademas cada CDR un extremo amino y un extremo carboxi, en el que las CDR de cada conjunto de CDR se disponen en el anticuerpo en un orden lineal amino a carboxi de CDR 1, CDR2 y CDR3, en el que 45
aa. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:134 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:166; o bb. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacfdica de las 50 CDR correspondientes de SEQ ID NO:135 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3
comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:167; o cc. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:136 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:168; o 55 dd. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacfdica de las
CDR correspondientes de SEQ ID NO:137 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:169; o ee. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:138 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:170; o
ff. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacfdica de las
CDR correspondientes de SEQ ID NO:139 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3
comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:171; o
gg. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacfdica de las
CDR correspondientes de SEQ ID NO:140 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3
comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:172; o
hh. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacfdica de las
CDR correspondientes de SEQ ID NO:141 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3
comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:173; o
ii. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacfdica de las
CDR correspondientes de SEQ ID NO:142 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3
comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:174; o
jj. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacfdica de las
CDR correspondientes de SEQ ID NO:143 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3
comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:175; o
kk. las VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti-ErbB3 comprenden la secuencia aminoacfdica de las
CDR correspondientes de SEQ ID NO:136 y las VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3
comprenden la secuencia aminoacfdica de las CDR correspondientes de SEQ ID NO:169;
y
(iii) en el que el PBA no comprende ni a) un modulo anti-IGF-1R que comprende las secuencias aminoacfdicas de VHCDR1, vHcDR2, VhCdR3 anti-IGF-1R de SEQ ID nO: 11 y las secuencias aminoacfdicas de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-IGF-1R de SEQ ID NO:35, ni b) un modulo anti-ErbB3 que comprende las secuencias aminoacfdicas de VHCDR1, VHCDR2, VHCDR3 anti- ErbB3 de SEQ ID No:143 y las secuencias aminoacfdicas de VLCDR1, VLCDR2 y VLCDR3 anti-ErbB3 de SEQ ID NO:175.
El anticuerpo biespecffico polivalente segun la reivindicacion 1, en el que
- cada dicho sitio de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:1, en el que la secuencia comprende aminoacidos variables, que representan independientemente cualquier aminoacido expuesto en la posicion correspondiente en la figura 1; y/o
- cada dicho sitio de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:2, en el que la secuencia comprende aminoacidos variables, que representan independientemente cualquier aminoacido expuesto en la posicion correspondiente en la figura 2; y/o
- cada dicho sitio de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:1 y un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:2, en el que las secuencias comprenden aminoacidos variables, que representan independientemente cualquier aminoacido expuesto en la posicion correspondiente en la figura 1 (para VH) y la figura 2 (para VL); y/o
- cada dicho sitio de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:3, en el que la secuencia comprende aminoacidos variables, que representan independientemente cualquier aminoacido expuesto en la posicion correspondiente en la figura 2; y/o
- cada dicho sitio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:4, en el que la secuencia comprende aminoacidos variables, que representan independientemente cualquier aminoacido expuesto en la posicion correspondiente en la figura 3; y/o
- cada dicho sitio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:6, en el que la secuencia comprende aminoacidos variables, que representan independientemente cualquier aminoacido expuesto en la posicion correspondiente en la figura 4; y/o
- cada dicho sitio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:5, en el que la secuencia comprende aminoacidos variables, que representan independientemente cualquier aminoacido expuesto en la posicion correspondiente en la figura 3; y/o
- cada dicho sitio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:7, en el que la secuencia comprende aminoacidos variables, que representan independientemente cualquier aminoacido expuesto en la posicion correspondiente en la figura 4.
El anticuerpo biespecffico polivalente segun la reivindicacion 2, en el que
- cada dicho sitio de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:1 y un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:3; y/o
- cada dicho sitio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:4 y un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:6 o comprende un dominio VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:5 y un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:7.
5 4. El anticuerpo biespecffico polivalente segun la reivindicacion 3, en el que cada dicho sitio de union a
anti-IGF-IR comprende un dominio VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:1 y un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:2 y cada dicho sitio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:4 y un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:6.
10 5. El anticuerpo biespecffico polivalente segun la reivindicacion 3, en el que cada dicho sitio de union a
anti-IGF-IR comprende un dominio VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:1 y un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:3 y el sitio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia de SEQ ID NO:5 y un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:7.
15 6. El anticuerpo biespecffico polivalente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que cada
dicho sitio de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:1, en el que X1 no es T, X2 no es V, X6 no es R, X8 no es D o X10 no es I, o un dominio VL que comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:3, o en el que cada dicho sitio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:5 o un dominio VL que comprende la secuencia de 20 SEQ ID NO:7.
7. El anticuerpo biespecffico polivalente segun 6, en el que cada dicho sitio de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:1, en el que X1 no es T, X2 no es V, X6 no es R, X8 no es D o X10 no es I, un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:3; y cada
25 dicho sitio de union a anti-ErbB3 comprende un dominio VH que comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:5 y un dominio VL que comprende la secuencia de SEQ ID NO:7.
8. El anticuerpo biespecffico polivalente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que
30 - cada dicho sitio de union a anti-IGF-1R comprende un dominio VH que comprende una secuencia
aminoacfdica seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:8-31; y/o
- cada dicho sitio de union a anti-IGF-1 R comprende un dominio VL que comprende una secuencia aminoacfdica seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:32-133; y/o
- cada dicho sitio de union a anti-ErbB3 comprende una secuencia aminoacfdica VH seleccionada del grupo
35 que consiste en las SEQ ID NOs:134-165; y/o
- cada dicho sitio de union a anti-ErbB3 comprende una secuencia aminoacfdica VL seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:166-200.
9. El anticuerpo biespecffico polivalente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que 40
a. cada dicho primer dominio VH comprende una secuencia aminoacfdica seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NOs:8-31, cada dicho primer dominio VL comprende una secuencia aminoacfdica seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:32-133, cada dicho segundo dominio VH comprende una secuencia aminoacfdica seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:134-165 y
45 cada dicho segundo dominio VL comprende una secuencia aminoacfdica seleccionada del grupo que
comprende las SEQ ID NOs:166-200, o
b. cada dicho primer dominio VH comprende una secuencia aminoacfdica seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NOs:134-165, cada dicho primer dominio VL comprende una secuencia aminoacfdica seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:166-200, cada dicho segundo
50 dominio VH comprende una secuencia aminoacfdica seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID
NOs:8-31 y cada dicho segundo dominio VL consiste en una secuencia aminoacfdica seleccionada del grupo que comprende las SEQ ID NOs:32-133.
10. El anticuerpo biespecffico polivalente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que 55
a. cada dicho dominio VH anti-IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:8 y cada dicho dominio VL anti-IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:32; o
b. cada dicho dominio VH anti-IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:9 y cada dicho dominio VL anti-IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:33; o
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
c. cada dicho dominio VH anti-IGF-IR comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:10 y cada dicho dominio VL anti-IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:34; o
d. cada dicho dominio VH anti-IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:11 y cada dicho dominio VL anti-IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:35; o
e. cada dicho dominio VH anti-IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:8 y cada dicho dominio VL anti-IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:33; o
f. cada dicho dominio VH anti-IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:10 y cada dicho dominio VL anti-IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:32; o
g. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:134 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:166; o
h. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:135 y el dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:167; o
i. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:136 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:168; o
j. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:137 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:169; o
k. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:138 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:170; o
l. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:139 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:171; o
m. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:140 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:172; o
n. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:141 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:173; o
o. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:142 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:174; o
p. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:143 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:175; o
q. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:136 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:169.
11. El anticuerpo biespecffico polivalente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que cada dicho dominio VH anti-IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:8 y cada dicho dominio VL anti- IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:32; y
a. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:134 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:166; o
b. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:135 y el dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:167; o
c. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:136 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:168; o
d. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:137 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:169; o
e. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:138 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:170; o
f. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:139 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:171; o
g. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:140 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO: 172; o
h. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:141 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:173; o
i. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:142 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:174; o
j. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:143 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:175; o
k. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:136 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:169.
12. El anticuerpo biespecffico polivalente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que cada
dicho dominio VH anti-IGF-IR comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:9 y cada dicho dominio VL anti- IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:33; y
a. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:134 y cada
5 dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:166; o
b. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:135 y el dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:167; o
c. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:136 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:168; o
10 d. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:137 y cada
dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:169; o
e. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:138 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:170; o
f. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:139 y cada
15 dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:171; o
g. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:140 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:172; o
h. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:141 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:173; o
20 i. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:142 y cada dicho
dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:174; o
j. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:143 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:175; o
k. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:136 y cada
25 dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:169.
13. El anticuerpo biespecffico polivalente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que cada dicho dominio VH anti-IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:10 y cada dicho dominio VL anti-IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:34; y
30
a. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:134 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:166; o
b. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:135 y el dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:167; o
35 c. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:136 y cada
dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:168; o
d. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:137 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:169; o
e. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:138 y cada
40 dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:170; o
f. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:139 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:171; o
g. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:140 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:172; o
45 h. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:141 y cada
dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:173; o
i. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:142 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:174; o
j. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:143 y cada dicho
50 dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:175; o
k. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:136 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:169.
14. El anticuerpo biespecffico polivalente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que cada 55 dicho dominio VH anti-IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:11 y cada dicho dominio VL
anti-IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:35; y
a. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:134 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:166; o
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
b. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:135 y el dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:167; o
c. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:136 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:168; o
d. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:137 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:169; o
e. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:138 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:170; o
f. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:139 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:171; o
g. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:140 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:172; o
h. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:141 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:173; o
i. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:142 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:174; o
j. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:136 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:169.
15. El anticuerpo biespecffico polivalente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que cada dicho dominio VH anti-IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:8 y cada dicho dominio VL anti- IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:33; y
a. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO: 134 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:166; o
b. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO: 135 y el dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:167; o
c. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:136 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:168; o
d. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:137 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:169; o
e. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:138 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:170; o
f. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:139 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:171; o
g. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:140 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:172; o
h. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:141 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:173; o
i. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:142 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:174; o
j. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:143 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:175; o
k. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:136 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:169.
16. El anticuerpo biespecffico polivalente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que cada dicho dominio VH anti-IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:10 y cada dicho dominio VL anti-IGF-1R comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:32; y
a. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:134 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:166; o
b. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:135 y el dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:167; o
c. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:136 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:168; o
d. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:137 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:169; o
e. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:138 y cada
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:170; o
f. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:139 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:171; o
g. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:140 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:172; o
h. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:141 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:173; o
i. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:142 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:174; o
j. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:143 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:175; o
k. cada dicho dominio VH anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:136 y cada dicho dominio VL anti-ErbB3 comprende la secuencia aminoacfdica de SEQ ID NO:169.
El anticuerpo biespecffico polivalente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que
a. cada dicha cadena pesada comprende una secuencia aminoacfdica seleccionada del grupo que consiste en SF-G1-P1 (SEQ ID NO:212); SF-G1-M1.3 (SEQ ID NO:214); SF-G1-M27 (SEQ ID NO:216); SF-G1-P6 (SEQ ID NO:218); SF-G1-B69 (SEQ ID NO:220); P4-G1-C8 (SEQ ID NO:222); P4-G1-P1 (SEQ ID NO:224); P4-G1-M1.3 (SEQ ID NO:226); P4-G1-M27 (SEQ ID NO:228); P4-G1-P6 (SEQ ID NO:230); P4-G1-B69 (SEQ ID NO:232); M78-G1-C8 (SEQ ID NO:234); M78-G1-P1 (SEQ ID NO:236); M78-G1-M1.3 (SEQ ID NO:238); M78-G1-M27 (SEQ ID NO:240); M78-G1-P6 (SEQ ID NO:242); M78-G1-B69 (SEQ ID NO:244); M57-G1-C8 (SEQ ID NO:246); M57-G1-P1 (SEQ ID NO:248); M57-G1-M1.3 (SEQ ID NO:250); M57-G1- M27 (SEQ ID NO:252); M57-G1-P6 (SEQ ID NO:254) y M57-G1-B69 (SEQ ID NO:256), y cada dicha cadena ligera comprende una secuencia aminoacfdica seleccionada del grupo que consiste en la cadena ligera kappa SF (SEQ ID NO:202); cadena ligera kappa P4 (SEQ ID NO:204); cadena ligera kappa M78 (SEQ ID NO:206); y la cadena ligera kappa M57 (SEQ ID NO:208); o
b. cada dicha cadena pesada comprende una secuencia aminoacfdica seleccionada del grupo que comprende P1-G1-P4 (SEQ ID NO:268); P1-G1-M57 (SEQ ID NO:270); P1-G1-M78 (SEQ ID NO:272); M27-G1-P4 (SEQ ID NO:274); M27-G1-M57 (SEQ ID NO:276); M27-G1-M78 (SEQ ID NO:278); M7-G1-P4 (SEQ ID NO:280); M7-G1-M57 ((SEQ ID NO:282); M7-G1-M78 (SEQ ID NO:284); B72-G1-P4 (SEQ ID NO:286); B72-G1-M57 (SEQ ID NO:288); B72-G1-M78 (SEQ ID NO:290); B60-G1-P4 (SEQ ID NO:292); B60-G1-M57 (SEQ ID NO:294); B60-G1-M78 (SEQ ID NO:296); B60-G2-M78 (SEQ ID NO:355) y M7-G2- M78 (SEQ ID NO:357) y cada dicha cadena ligera comprende una secuencia aminoacfdica seleccionada del grupo que consiste en la cadena ligera lambda P1 (SEQ ID NO:258); cadena ligera lambda M27 (SEQ ID NO:260); cadena ligera lambda M7 (SEQ ID NO:262); cadena ligera lambda B72 (SEQ ID NO:264); y la cadena ligera lambda B60 (SEQ ID NO:266).
El anticuerpo biespecffico polivalente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que
a. cada dicha cadena pesada comprende una secuencia aminoacfdica que difiere en al menos una adicion, delecion o sustitucion aminoacfdica de una secuencia aminoacfdica seleccionada del grupo que consiste en SF-G1-P1 (SEQ ID NO:212); SF-G1-M1.3 (SEQ ID NO:214); SF-G1-M27 (SEQ ID NO:216); SF-G1-P6 (SEQ ID NO:218); SF-G1-B69 (SEQ ID NO:220); P4-G1-C8 (SEQ ID NO:222); P4-G1-P1 (SEQ ID NO:224); P4-G1-M1.3 (SEQ ID NO:226); P4-G1-M27 (SEQ ID NO:228); P4-G1-P6 (SEQ ID NO:230); P4-G1-B69 (SEQ ID NO:232); M78-G1-C8 (SEQ ID NO:234); M78-G1-P1 (SEQ ID NO:236); M78-G1-M1.3 (SEQ ID NO:238); M78-G1-M27 (SEQ ID NO:240); M78-G1-P6 (SEQ ID NO:242); M78-G1-B69 (SEQ ID NO:244); M57-G1-C8 (SEQ ID NO:246); M57-G1-P1 (SEQ ID NO:248); M57-G1-M1.3 (SEQ ID NO:250); M57-G1- M27 (SEQ ID NO:252); M57-G1-P6 (SEQ ID NO:254) y M57-G1-B69 (SEQ ID NO:256), y cada dicha cadena ligera comprende una secuencia aminoacfdica seleccionada del grupo que consiste en la cadena ligera kappa SF (SEQ ID NO:202); cadena ligera kappa P4 (SEQ ID NO:204); cadena ligera kappa M78 (SEQ ID NO:206); y la cadena ligera kappa M57 (SEQ ID NO:208); o
b. cada dicha cadena pesada comprende una secuencia aminoacfdica seleccionada del grupo que consiste en SF-G1-P1 (SEQ ID NO:212); SF-G1-M1.3 (SEQ ID NO:214); SF-G1-M27 (SEQ ID NO:216); SF-G1-P6 (SEQ ID NO:218); SF-G1-B69 (SEQ ID NO:220); P4-G1-C8 (SEQ ID NO:222); P4-G1-P1 (SEQ ID NO:224); P4-G1-M1.3 (SEQ ID NO:226); P4-G1-M27 (SEQ ID NO:228); P4-G1-P6 (SEQ ID NO:230); P4-G1-B69 (SEQ ID NO:232); M78-G1-C8 (SEQ ID NO:234); M78-G1-P1 (SEQ ID NO:236); M78-G1-M1.3 (SEQ ID NO:238); M78-G1-M27 (SEQ ID NO:240); M78-G1-P6 (SEQ ID NO:242); M78-G1-B69 (SEQ ID NO:244); M57-G1-C8 (SEQ ID NO:246); M57-G1-P1 (SEQ ID NO:248); M57-G1-M1.3 (SEQ ID NO:250); M57-G1-
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M27 (SEQ ID NO:252); M57-G1-P6 (SEQ ID NO:254) y M57-G1-B69 (SEQ ID NO:256), y cada dicha cadena ligera comprende una secuencia aminoaddica que difiere en al menos una adicion, delecion o sustitucion aminoaddica de una secuencia aminoaddica seleccionada del grupo que consiste en la cadena ligera kappa SF (SEQ ID NO:202); cadena ligera kappa P4 (SEQ ID NO:204); cadena ligera kappa M78 (SEQ ID NO:206); y la cadena ligera kappa M57 (SEQ ID NO:208); o
c. cada dicha cadena pesada comprende una secuencia aminoaddica que difiere en al menos una adicion, delecion o sustitucion aminoaddica de una secuencia aminoaddica seleccionada del grupo que comprende P1-G1-P4 (SEQ ID NO:268); P1-G1-M57 (SEQ ID NO:270); P1-G1-M78 (SEQ ID NO:272); M27-G1-P4 (SEQ ID NO:274); M27-G1-M57 (SEQ ID NO:276); M27-G1-M78 (SEQ ID NO:278); M7-G1-P4 (SEQ ID NO:280); M7-G1-M57 ((SEQ ID NO:282); M7-G1-M78 (SEQ ID NO:284); B72-G1-P4 (SEQ ID NO:286); B72-G1-M57 (SEQ ID NO:288); B72-G1-M78 (SEQ ID NO:290); B60-G1-P4 (SEQ ID NO:292); B60-G1-M57 (SEQ ID NO:294); B60-G1-M78 (SEQ ID NO:296); B60-G2-M78 (SEQ ID NO:355) y M7-G2-M78 (SEQ ID NO:357) y cada dicha cadena ligera comprende una secuencia aminoaddica seleccionada del grupo que consiste en la cadena ligera lambda P1 (SEQ ID NO:258); cadena ligera lambda M27 (SEQ ID nO:260); cadena ligera lambda M7 (SEQ ID NO:262); cadena ligera lambda B72 (SEQ ID NO:264); y la cadena ligera lambda B60 (SEQ ID NO:266); o
d. cada dicha cadena pesada comprende una secuencia aminoaddica seleccionada del grupo que comprende P1-G1-P4 (SEQ ID NO:268); P1-G1-M57 (SEQ ID NO:270); P1-G1-M78 (SEQ ID NO:272); M27-G1-P4 (SEQ ID NO:274); M27-G1-M57 (SEQ ID NO:276); M27-G1-M78 (SEQ ID NO:278); M7-G1-P4 (SEQ ID NO:280); M7-G1-M57 ((SEQ ID NO:282); M7-G1-M78 (SEQ ID NO:284); B72-G1-P4 (SEQ ID NO:286); B72-G1-M57 (SEQ ID NO:288); B72-G1-M78 (SEQ ID NO:290); B60-G1-P4 (SEQ ID NO:292); B60-G1-M57 (SEQ ID NO:294); B60-G1-M78 (SEQ ID NO:296); B60-G2-M78 (SEQ ID NO:355) y M7-G2- M78 (SEQ ID NO:357), y cada dicha cadena ligera comprende una secuencia aminoaddica que difiere en al menos una adicion, delecion o sustitucion aminoaddica de una secuencia aminoaddica seleccionada del grupo que consiste en la cadena ligera lambda P1 (SEQ ID NO:258); cadena ligera lambda M27 (SEQ ID NO:260); cadena ligera lambda M7 (SEQ ID NO:262); cadena ligera lambda B72 (SEQ ID NO:264); y la cadena ligera lambda B60 (SEQ ID NO:266).
Un anticuerpo biespedfico polivalente segun la reivindicacion 18, en el que
a. cada dicha cadena pesada, unida a la otra cadena pesada por al menos un enlace, comprende una secuencia aminoaddica que es al menos un 90 % identica a una de las siguientes secuencias aminoaddicas o difiere de una de las siguientes secuencias aminoaddicas en 1-30 sustituciones, deleciones y/o adiciones aminoaddicas: SF-G1-P1 (SEQ ID NO:212); SF-G1-M1.3 (SEQ ID NO:214); SF- G1-M27 (SEQ ID NO:216); SF-G1-P6 (SEQ ID NO:218); SF-G1-B69 (SEQ ID NO:220); P4-G1-C8 (SEQ ID NO:222); P4-G1-P1 (SEQ ID NO:224); P4-G1-M1.3 (SEQ ID NO:226); P4-G1-M27 (SEQ ID NO:228); P4- G1-P6 (SEQ ID NO:230); P4-G1-B69 (SEQ ID NO:232); M78-G1-C8 (SEQ ID NO:234); M78-G1-P1 (SEQ ID NO:236); M78-G1-M1.3 (SEQ ID NO:238); M78-G1-M27 (SEQ ID NO:240); M78-G1-P6 (SEQ ID NO:242); M78-G1-B69 (SEQ ID NO:244); M57-G1-C8 (SEQ ID NO:246); M57-G1-P1 (SEQ ID NO:248); M57-G1-M1.3 (SEQ ID NO:250); M57-G1-M27 (SEQ ID NO:252); M57-G1-P6 (SEQ ID NO:254) y M57-G1- B69 (SEQ ID NO:256) y
b. cada dicha cadena ligera, unida a una cadena pesada de (a) por al menos un enlace, comprende una
secuencia aminoaddica que es al menos un 90 % identica a una de las siguientes secuencias
aminoaddicas o difiere de una de las siguientes secuencias aminoaddicas en 1-30 sustituciones,
deleciones y/o adiciones aminoaddicas: cadena ligera kappa SF (SEQ ID NO:202); cadena ligera kappa P4 (SEQ ID NO:204); cadena ligera kappa M78 (SEQ ID NO:206); y cadena ligera kappa M57 (sEq ID NO:208); o
c. cada dicha cadena pesada, unida a la otra cadena pesada por al menos un enlace, comprende una
secuencia aminoaddica que es al menos un 90 % identica a una de las siguientes secuencias
aminoaddicas o difiere de una de las siguientes secuencias aminoaddicas en 1-30 sustituciones,
deleciones y/o adiciones aminoaddicas: P1-G1-P4 (SEQ ID NO:268); P1-G1-M57 (SEQ ID NO:270); P1- G1-M78 (SEQ ID NO:272); M27-G1-P4 (SEQ ID NO:274); M27-G1-M57 (SEQ ID NO:276); M27-G1-M78 (SEQ ID NO:278); M7-G1-P4 (SEQ ID NO:280); M7-G1-M57 ((SEQ ID NO:282); M7-G1-M78 (SEQ ID NO:284); B72-G1-P4 (SEQ ID NO:286); B72-G1-M57 (SEQ ID NO:288); B72-G1-M78 (SEQ ID NO:290); B60-G1-P4 (SEQ ID NO:292); B60-G1-M57 (SEQ ID NO:294); y B60-G1-M78 (SEQ ID NO:296),); B60-G2- M78 (SEQ ID NO:355) y M7-G2-M78 (SEQ ID NO:357) y
d. cada dicha cadena ligera, unida a una cadena pesada de (c) por al menos un enlace, comprende una secuencia aminoaddica que es al menos un 90 % identica a una de las siguientes secuencias aminoaddicas o que difiere de una de las siguientes secuencias aminoaddicas en 1-30 sustituciones,
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deleciones y/o adiciones aminoacfdicas: cadena ligera lambda P1 (SEQ ID NO:258); cadena ligera lambda M27 (SEQ ID NO:260); cadena ligera lambda M7 (SEQ ID NO:262); cadena ligera lambda B72 (SEQ ID NO:264); y cadena ligera lambda B60 (SEQ ID NO:266).
El anticuerpo biespecffico polivalente segun la reivindicacion 19, en el que
a. cada dicha cadena pesada comprende una secuencia aminoacfdica que es al menos un 95 % identica a una de la siguiente secuencia aminoacfdica o difiere de una de las siguientes secuencias aminoacfdicas en 1-10 sustituciones, deleciones y/o adiciones aminoacfdicas: SF-G1-P1 (SEQ ID NO:212); SF-G1-M1.3 (SEQ ID NO:214); SF-G1-M27 (SEQ ID NO:216); SF-G1-P6 (SEQ ID NO:218); SF-G1-B69 (SEQ ID NO:220); P4-G1-C8 (SEQ ID NO:222); P4-G1-P1 (SEQ ID NO:224); P4-G1-M1.3 (SEQ ID NO:226); P4-G1- M27 (SEQ ID NO:228); P4-G1-P6 (SEQ ID NO:230); P4-G1-B69 (SEQ ID NO:232); M78-G1-C8 (SEQ ID NO:234); M78-G1-P1 (SEQ ID NO:236); M78-G1-M1.3 (SEQ ID NO:238); M78-G1-M27 (SEQ ID NO:240); M78-G1-P6 (SEQ ID NO:242); M78-G1-B69 (SEQ ID NO:244); M57-G1-C8 (SEQ ID NO:246); M57-G1-P1 (SEQ ID NO:248); M57-G1-M1.3 (SEQ ID NO:250); M57-G1-M27 (SEQ ID NO:252); M57-G1-P6 (SEQ ID NO:254) y M57-G1-B69 (SEQ ID NO:256), y
b. cada dicha cadena ligera comprende una secuencia aminoacfdica que es al menos un 95 % identica a una de las siguientes secuencias aminoacfdicas o difiere de una de las siguientes secuencias aminoacfdicas en 1-10 sustituciones, deleciones y/o adiciones aminoacfdicas: cadena ligera kappa SF (SEQ ID NO:202); cadena ligera kappa P4 (SEQ ID NO:204); cadena ligera kappa M78 (SEQ ID NO:206); y cadena ligera kappa M57 (SEQ ID No:208); o
c. cada dicha cadena pesada comprende una secuencia aminoacfdica que es al menos un 95 % identica a una de las siguientes secuencias aminoacfdicas o difiere de una de las siguientes secuencias aminoacfdicas en 1-10 sustituciones, deleciones y/o adiciones aminoacfdicas: P1-G1-P4 (SEQ ID NO:268); P1-G1-M57 (SEQ ID NO:270); P1-G1-M78 (SEQ ID NO:272); M27-G1-P4 (SEQ ID NO:274); M27-G1-M57 (SEQ ID NO:276); M27-G1-M78 (SEQ ID NO:278); M7-G1-P4 (SEQ ID NO:280); M7-G1-M57 ((SEQ ID NO:282); M7-G1-M78 (SEQ ID NO:284); B72-G1-P4 (SEQ ID NO:286); B72-G1-M57 (SEQ ID NO:288); B72-G1-M78 (SEQ ID NO:290); B60-G1-P4 (SEQ ID NO:292); B60-G1-M57 (SEQ ID NO:294); y B60-G1- M78 (SEQ ID NO:296); B60-G2-M78 (SEQ ID NO:355) y M7-G2-M78 (SEQ ID NO:357) y
d. cada dicha cadena ligera comprende una secuencia aminoacfdica que es al menos un 95 % identica a una de las siguientes secuencias aminoacfdicas o difiere de una de las siguientes secuencias aminoacfdicas en 1-10 sustituciones, deleciones y/o adiciones aminoacfdicas: cadena ligera lambda P1 (SEQ ID NO:258); cadena ligera lambda M27 (SEQ ID NO:260); cadena ligera lambda M7 (SEQ ID NO:262); cadena ligera lambda B72 (SEQ ID NO:264); y cadena ligera lambda B60 (SEQ ID NO:266).
Un anticuerpo biespecffico polivalente seleccionado del grupo que consiste en:
a. Un anticuerpo biespecffico polivalente SF-G1-P1 que comprende dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:212; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia de cadena ligera de SEQ ID NO:202;
b. Un anticuerpo biespecffico polivalente SF-G1-M1.3 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:214; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:202;
c. Un anticuerpo biespecffico polivalente SF-G1-M27 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:216; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:202;
d. Un anticuerpo biespecffico polivalente SF-G1-P6 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:218; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de
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SEQ ID NO:202;
e. Un anticuerpo biespecffico polivalente SF-G1-B69 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:220; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:202;
f. Un anticuerpo biespecffico polivalente P4-G1-C8 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:222; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:204;
g. Un anticuerpo biespecffico polivalente P4-G1-P1 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:224; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:204;
h. Un anticuerpo biespecffico polivalente P4-G1-M1.3 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:226; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:204;
i. Un anticuerpo biespecffico polivalente P4-G1-M27 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:228; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:204;
j. Un anticuerpo biespecffico polivalente P4-G1-P6 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:230; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:204;
k. Un anticuerpo biespecffico polivalente P4-G1-B69 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:232; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:204;
l. Un anticuerpo biespecffico polivalente M78-G1-C8 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:234; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:206;
m. Un anticuerpo biespecffico polivalente M78-G1-P1 que comprende:
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dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:236; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:206;
n. Un anticuerpo biespecffico polivalente M78-G1-M1.3 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:238; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:206;
o. Un anticuerpo biespecffico polivalente M78-G1-M27 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:240; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:206;
p. Un anticuerpo biespecffico polivalente M78-G1-P6 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:242; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:206;
q. Un anticuerpo biespecffico polivalente M78-G1-B69 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:244; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:206;
r. Un anticuerpo biespecffico polivalente M57-G1-C8 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:246; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:208;
s. Un anticuerpo biespecffico polivalente M57-G1-P1 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:248; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:208;
t. Un anticuerpo biespecffico polivalente M57-G1-M1.3 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:250; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:208;
u. Un anticuerpo biespecffico polivalente M57-G1-M27 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:252; y
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dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:208;
v. Un anticuerpo biespecffico polivalente M57-G1-P6 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:254; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:208;
w. Un anticuerpo biespecffico polivalente M57-G1-B69 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:256; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:208;
x. Un anticuerpo biespecffico polivalente P1-G1-P4 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:268; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:258;
y. Un anticuerpo biespecffico polivalente P1-G1-M57 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:270; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:258;
z. Un anticuerpo biespecffico polivalente P1-G1-M78 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:272; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:258;
aa. Un anticuerpo biespecffico polivalente M27-G1-P4 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:274; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:260;
bb. Un anticuerpo biespecffico polivalente M27-G1-M57 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:276; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:260;
cc. Un anticuerpo biespecffico polivalente M27-G1-M78 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:278; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:260;
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30
35
40
45
50
55
dd. Un anticuerpo biespecffico polivalente M7-G1-P4 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:280; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:262;
ee. Un anticuerpo biespecffico polivalente M7-G1-M57 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:282; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:262;
ff. Un anticuerpo biespecffico polivalente M7-G1-M78 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:284; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:262;
gg. Un anticuerpo biespecffico polivalente B72-G1-P4 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:286; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:264;
hh. Un anticuerpo biespecffico polivalente B72-G1-M57 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:288; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:264;
ii. Un anticuerpo biespecffico polivalente B72-G1-M78 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:290; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:264;
jj. Un anticuerpo biespecffico polivalente B60-G1-P4 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:292; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:266;
kk. Un anticuerpo biespecffico polivalente B60-G1-M57 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada de SEQ ID NO:294; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:266; y
ll. Un anticuerpo biespecffico polivalente B60-G1-M78 que comprende:
dos cadenas pesadas, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena pesada
de SEQ ID NO:296; y
dos cadenas ligeras, cada una comprendiendo una secuencia aminoacfdica de cadena ligera de SEQ ID NO:266.
5 22. Una composicion que comprende un anticuerpo biespecffico polivalente segun una cualquiera de las
reivindicaciones 1-21 y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
23. Una molecula de acido nucleico que comprende al menos una secuencia codificante, codificando dicha al menos una secuencia codificante un anticuerpo a partir de una cualquiera de las reivindicaciones 1-21.
10
24. La molecula de acido nucleico de la reivindicacion 23, comprendiendo dicha molecula de acido nucleico cualquiera o ambos de una secuencia nucleotfdica promotora y una secuencia nucleotfdica potenciadora, cuya secuencia nucleotfdica esta unida operativamente a la al menos una secuencia codificante y promueve o potencia la expresion del anticuerpo.
15
25. Un vector que comprende una o mas moleculas de acido nucleico de la reivindicacion de la reivindicacion 23 o 24.
26. Una celula aislada que comprende uno o mas vectores de la reivindicacion 25.
20
27. Un metodo para producir un anticuerpo biespecffico polivalente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, que comprende cultivar una celula de la reivindicacion 26 en las condiciones adecuadas para la expresion del anticuerpo biespecffico polivalente.
25 28. El anticuerpo biespecffico polivalente segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, o la
composicion segun la reivindicacion 22 para su uso en el tratamiento de cancer.
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