TWI631136B - 單特異性及雙特異性抗ｉｇｆ－１ｒ及抗ｅｒｂｂ３抗體 - Google Patents

單特異性及雙特異性抗ｉｇｆ－１ｒ及抗ｅｒｂｂ３抗體 Download PDF

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Abstract

本文提供適用作抗贅生劑且特異性結合人類IGF-1R及人類ErbB3之新穎單特異性及雙特異性抗體。示範性抗體抑制經由IGF-1R及ErbB3中之任一者或兩者進行之信號轉導。示範性多價蛋白質包含至少一個抗IGF-1R結合位點及至少一個抗ErbB3結合位點。在某些實施例中，結合位點可經由免疫球蛋白恆定區連接。亦提供新穎抗ErbB3及抗IGF-1R抗體(例如，單株抗體)。

Description

單特異性及雙特異性抗IGF-1R及抗ERBB3抗體 【相關申請案】
本申請案係關於2011年4月19日申請之美國臨時申請案第61/477,089號、2011年9月26日申請之美國臨時申請案第61/539,297號、2011年11月10日申請之美國臨時申請案第61/558,192號及2012年4月2日申請之美國臨時申請案第61/619,244號。前述申請案之內容藉此以全文引用之方式併入本文中。
本發明係關於單特異性及雙特異性抗IGF-1R及抗ERBB3抗體。
腫瘤細胞表現刺激細胞增殖之生長因子及細胞激素的受體。針對該等受體之抗體可有效阻斷由生長因子及細胞激素介導之細胞增殖刺激，且可由此抑制腫瘤細胞增殖及腫瘤生長。靶向癌細胞上之受體之市售治療性抗體包括例如曲妥珠單抗(trastuzumab)，其靶向HER2受體(亦稱為ErbB2)，用於治療乳癌；及西妥昔單抗(cetuximab)，其靶向表皮生長因子受體(EGFR，亦稱為HFR1或ErbB1)，用於治療結腸直腸癌及頭頸癌。
單株抗體已顯著提高吾等治療癌症之能力，然而臨床研究顯示許多患者對單特異性療法反應並不充分。此部分歸因於癌症之多基因性質，其中癌細胞依賴於多種且 通常冗餘之增殖路徑。能夠一次阻斷多種生長及存活路徑之雙特異性或多特異性抗體有可能更好地滿足阻斷癌症生長之挑戰，並且實際上其中多種正在進行臨床開發。然而，雙特異性抗體因在其設計及最佳化中需要考慮之變數的數量大為增加以及其與天然存在之抗體之結構差異而存在實質性設計難題。
諸如曲妥珠單抗、西妥昔單抗、貝伐單抗(bevacizumab)及盤尼圖單抗(panitumumab)之單株抗體在臨床上已顯著改善患者結果，且當前在臨床開發中有超過兩百種治療性單株抗體正在進行測試。然而，顯而易見受單個致癌基因促成之腫瘤並非常態，並且治療通常導致抗性機制活化，此轉而亦需要靶向介入。舉例而言，在曲妥珠單抗抗性之多種臨床前模型中，抑制IGF-1R使對曲妥珠單抗之敏感性恢復。已在臨床上嘗試靶向劑之組合，但迄今為止其僅獲得有限的臨床成功並且組合時可能過於昂貴。因抗性或因腫瘤受多個生長因子路徑促成而需要抑制多個目標使得對雙特異性抗體之關注增加。當前開發之雙特異性抗體通常以經驗方式設計。此外，此等雙特異性抗體之醫藥性質幾乎總是不如單株抗體。此等因素造成開發雙特異性抗癌療法之主要難題。由靶向多種癌症存活路徑獲得之重要附加效益可由在鑒別及工程改造具有最佳特徵之雙特異性抗體之前增加之工作得出。其需要由計算模擬以鑒別最佳靶向策略及設計規格、工程改造具有此等特徵之抑制劑及實驗驗證治療假設組成 之迭代方法。吾等將此工程改造框架分為兩個類別：選擇具有穩固醫藥性質之適當分子格式，及計算模擬以鑒別最佳目標及最佳治療設計特徵，例如在IgG樣雙特異性抗體中(第8圖)。
抗體之一個主要優勢為其緊密結合幾乎任何細胞外目標之能力。此性質由抗體可變區之兩個特徵促成：六個互補決定區(CDR)之大平坦表面及抗體實際上具有可同時靶向兩個分子之兩個結合臂。在雙特異性抗體中，雙重目標結合導致更緊密親和力，此係因為一旦抗體一個臂結合於細胞外目標，第二臂即被局限於質膜上方之狹窄區域(約100埃)且因此在細胞表面附近濃縮。此產生快得多的次級結合事件，該事件不受擴散限制。需要對次級結合事件進行加速。親和力及親合性均為可合理工程改造之性質，因為前者可經由電腦化親和力成熟進行改良且後者可藉由工程改造針對細胞表面上存在之相同或不同抗原之其他靶向臂而增強。除結合能力外，抗體亦可具有由其Fc域介導之多種效應功能：在人類中藉由與活化型Fc γ RI、Fc γ RIIa/c、Fc γ RIIIa及抑制性Fc γ RIIb受體相互作用而確定之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)；由抗體結合於補體系統之組分而觸發之補體依賴性細胞毒性(CDC)；及經由新生兒Fc受體(FcRn)之主動再循環而介導之長半衰期。所有此等功能均可調節以使抗癌療法之有效性最佳化且可保留以有益於雙特異性蛋白質。
由IgG抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)構成之可變片段(Fv)為顯示完整抗原結合之最小抗體片段。此等可變域可成功地融合成單鏈構築體(scFv)，不過親和力與完整原生抗體相比通常在一定程度上降低。大部分當前雙特異性格式之特徵在於一個或若干個scFv模組經由低複雜度連接子連接於IgG重鏈或IgG輕鏈之N端或C端。另一雙特異性抗體格式為雙可變域免疫球蛋白(DVD-Ig)。DVD-Ig由在N端有第二VH域經由短連接子連接之第一IgG重鏈及在N端有第二VL域類似地連接之第一IgG輕鏈組成。第二VH/VL域形成對一種抗原具有特異性之對，而第一VH/VL形成對不同抗原具有特異性之單獨結合位點。
IgG樣抗體之二價格式具有一個潛在限制；其可交聯細胞表面抗原，該等抗原中一些由二聚化活化，從而以不受控方式觸發不當信號傳遞事件。為解決此難題，已開發出可調節單價雙特異性抗體格式。藉由將不對稱「鈕-孔(knobs and holes)」併入Fc片段中產生之單臂抗c-Met治療性抗體MetMab已顯示在胰腺癌模型中有效且正在多個臨床試驗中進行研究。最近已對此「鈕-孔」格式進行擴充以併入靶向EGFR之抗體片段，產生靶向EGFR/ErbB1及c-Met/HGFR之功能性單價雙特異性蛋白質。Gunasekaran等人已描述藉由將互補性帶電表面工程改造至Fc片段中實施之「鈕-孔」構想之替代實施例。Davis等人已描述「SEED」方法，其使用含有來自人類IgG 及IgA之片段的經修飾之不對稱Fc來形成異聚單價抗體。最後，Bostrom等人已描述構建可以高親和力結合HER2或VEGF之雙功能Fab片段的新穎工程改造方法。在組合於典型抗體分子中時，此等Fab片段將以不同價數嚙合HER2或VEGF，該等價數將取決於細胞環境及生長因子濃度。
雙特異性抗體設計之另一重要組分為醫藥性質之最佳化。為在臨床上適用，治療性蛋白質須穩定，保持長時間可溶且具有穩固之可製造性概況。雙特異性抗體通常不如單株抗體穩定，且最初可能不具有足以用於開發之醫藥性質。其可經由分子工程改造、經由下游調配活動或如最通常所實施經由兩種方法之組合加以穩定化。
使小分子藥物候選物中之化學製造及控制不利條件降至最低的重要性已長期認識到並且已提出預測藥物相似性之準則。許多組使用概念上類似之方法藉由評估以下不利序列特徵來評定基於IgG之蛋白質的適合性：諸如非典型二硫鍵及未配對半胱胺酸、額外糖基化位點、酪胺酸硫酸化基元、溶劑可接近之甲硫胺酸、天冬醯胺去醯胺化基元及酸裂解位點。額外糖基化位點及天冬醯胺去醯胺化位點為天然抗體序列中十分常見之特徵。實際上據報導，超過20%之重鏈可變域經糖基化且超過5%之生殖系基因含有天冬醯胺-甘胺酸去醯胺化基元。抗體中之去醯胺化速率可使用Robinson提出之方法可靠地估算，Robinson提出結構限制性環並不有效形成丁二醯亞 胺中間物且因此為穩定的。
雖然典型N連接型糖基化基元(NXS及NXT，其中X為除脯胺酸以外之任何胺基酸)可在抗體序列中容易地偵測到，但O連接型位點(其因亦可負面影響醫藥性質而為不利條件)較難以識別。最近已報導抗體輕鏈可變域之若干O連接型修飾，主要在富含GS之序列基元附近。存在在發現階段改良候選蛋白質之親和力及穩定性的許多方法，包括結構指導之設計、聚焦文庫篩選及酵母呈現；因此，吾等發現在早期概念驗證蛋白質中移除具有風險之該等潛在不利條件為有益的。
其他不利條件，諸如聚集及免疫原性根據工程改造之觀點更具挑戰性。該兩種性質不僅為多方面性質，而且亦難以在小規模生物化學及生物物理學測試中對其進行充分評估，且因此其傾向於首先在開發之後期偵測。如所證明，降低抗體免疫原性之最佳方法為進行人類化。此方法已由多種在臨床上良好耐受之人類化抗體廣泛驗證。最近提出之「超人類化」方法將人類生殖系序列引入CDR中以產生『完全人類』抗體。此方法需要將CDR中之各胺基酸(『aa』)突變以便確定其在抗原結合中之貢獻；所得抗體可具有較低免疫原性。除基於序列之特徵外，抗體及抗體樣蛋白質之免疫原可取決於其聚集穩定性。有趣的是，抗體模組(諸如scFv)中之「人類性」及穩定性可經由在知識基礎上之方法共同工程改造。
蛋白質抗體溶解性之工程改造為另一項令人生畏之任 務，因為該性質亦綜合涉及若干項物理-化學參數。然而，已提出多種減輕不溶性之方法。Pepinsky等人使用糖基工程改造、同型轉換及結構指導之突變誘發來增強單株抗體之溶解性。Chennamsetty等人已描述依賴於分子動力學模擬來計算稱為表面聚集傾向之參數，從而相對於聚集改良溶解性之無偏方法，並且應用此技術在抗體之易聚集區中引入穩定化胺基酸(「aa」)。有趣的是，在其抗體分析中，易聚集區通常與賦予Fc受體或抗原結合之功能上重要之區共定位，並且因此不能輕易移除。
抗體中分子功能與醫藥性質之間的該種聯繫為常見的。其可使得雙特異性抗體之最佳化變得極為複雜，因為其序列之甚至更大的部分亦位於功能上重要之區中。因此，為能夠成功進行工程改造，鑒別關鍵分子功能及最佳設計特徵為重要的。
計算模擬以鑒別最佳目標及最佳治療設計特徵
計算模擬為在實驗室及臨床上指導藥物開發決定之極有用工具。群體藥物動力學模擬為使用模型來最佳化劑量時程及臨床試驗設計的成熟實例。對於具有已知目標之療法，可在設計過程中之極早期利用計算模擬。多工高流通量定量蛋白質量測技術之進展使得能夠觀測細胞信號傳遞網路中存在之複雜動力學。此等資料允許建立捕捉與諸如癌症之疾病相關之生物系統之機械行為的網路模型。藉由經由網路建模模擬潛在治療劑，可以加快之速度設計更有效之治療劑及更精確地預測設計參數。
傳統上，用於靶向療法之醫藥藥劑之選擇始於自大量分子、生物學及生理學資料選擇之已知目標。然而，甚至在已充分研究及大量靶向之生物系統中，仍存在新發現之機會，其可自模擬路徑或網路模型得到幫助。
因此，用於癌症治療之其他治療方法，並且尤其是經工程改造以具有優良生物物理學及治療性質之基於多特異性抗體之蛋白質難以獲得，但對其仍有需要以克服當前抗體療法之限制及提供其他效益。
本文提供多價雙特異性抗體(PBA)，該等抗體為包含兩對多肽鏈之蛋白質，該兩對中之各對包含重鏈藉由至少一個重鏈-輕鏈鍵聯結於輕鏈；其中(a)各對包含至少一個抗IGF-1R結合位點及至少一個抗ErB3結合位點；及(b)各對包含含有PBA重鏈之N端部分及PBA輕鏈之N端部分的第一結合位點，及為完全由PBA之重鏈包含之C端scFv的第二結合位點，該C端scFv含有重鏈可變區藉由scFv連接子聯結於輕鏈可變區；且抗IGF-1R結合位點經由由PBA之重鏈包含之重鏈免疫球蛋白(HC Ig)恆定區連接於抗ErbB3結合位點，且該兩對由各對之HC Ig恆定區之間的至少一個鍵聯接。在較佳實施例中，抗IGF-1R結合位點包含重鏈可變(VH)域，該重鏈可變(VH)域包含一組三個VH互補決定區(CDR)，該等CDR包含(a)具有包含選自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：8-31及SEQ ID NO：384-385 組成之群之SEQ ID NO之胺基酸序列的胺基酸序列之重鏈的VHCDR1(胺基酸編號26-35)、VHCDR2(胺基酸編號51-66)及VHCDR3(胺基酸編號99-111)；或(b)一組三個VH互補決定區(CDR)，該等CDR包含含有SEQ ID NO：302之VHCDR1、含有SEQ ID NO：303之VHCDR2及含有SEQ ID NO：304之VHCDR3，及輕鏈可變(VL)域，該輕鏈可變(VL)域包含一組三個VLCDR，該等VLCDR包含(c)具有包含選自由SEQ ID NO：2-3、SEQ ID NO：32-133及SEQ ID NO：386-387組成之群之SEQ ID NO之胺基酸序列的胺基酸序列之輕鏈的VLCDR1(胺基酸編號24-34)、VLCDR2(胺基酸編號50-56)及VLCDR3(胺基酸編號89-97)；或(d)一組三個VLCDR，該等VLCDR包含含有SEQ ID NO：305之VLCDR1、含有SEQ ID NO：306之VLCDR2及含有SEQ ID NO：307或SEQ ID NO：308之VLCDR3，且各CDR進一步包含胺基端及羧基端，其中各組CDR之CDR在相應重鏈或輕鏈中按CDR1、CDR2及CDR3之線性胺基至羧基順序排列，或其中VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3之序列包含獨立地表示在第1圖中之相應位置所示之任何aa的可變aa，且VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3之序列包含獨立地表示在第2圖中之相應位置所示之任何aa的可變aa，其限制條件為PBA(i)不包含抗IGF-1R SF模組與抗ErbB3 C8模組兩者；或(ii)包含一或多個aa分別不同於SF或C8模組之CDR或FR的至少一個CDR或FR。在某些實施例中，抗ErbB3結合位點包含VH域，該VH域包含一組三 個VH CDR，該等CDR包含(e)具有包含選自由SEQ ID NO：4-5、SEQ ID NO：134-165及SEQ ID NO：388組成之群之SEQ ID NO之胺基酸序列的胺基酸序列之重鏈的VHCDR1(胺基酸編號26-35)、VHCDR2(胺基酸編號51-66)及VHCDR3(胺基酸編號99-111)；或(f)一組三個VH CDR，該等CDR包含含有SEQ ID NO：309之VHCDR1、含有SEQ ID NO：310之VHCDR2及含有SEQ ID NO：311之VHCDR3，及輕鏈可變(VL)域，該輕鏈可變(VL)域包含一組三個VLCDR，該等VLCDR包含(g)具有包含選自由SEQ ID NO：6-7及SEQ ID NO：166-200組成之群之SEQ ID NO之胺基酸序列的胺基酸序列之輕鏈的VLCDR1(胺基酸編號23-33)、VLCDR2(胺基酸編號49-55)及VLCDR3(胺基酸編號88-98)；或(h)輕鏈可變(VL)域，該輕鏈可變(VL)域包含一組三個VLCDR，該等VLCDR包含含有SEQ ID NO：312之VLCDR1、含有SEQ ID NO：313之VLCDR2及含有SEQ ID NO：314或SEQ ID NO：315之VLCDR3，且各CDR進一步包含胺基端及羧基端，其中各組CDR之CDR在抗體中按CDR1、CDR2及CDR3之線性胺基至羧基順序排列，或其中VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3之序列包含獨立地表示在第3圖中之相應位置所示之任何aa的可變aa，且VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3之序列包含獨立地表示在第4圖中之相應位置所示之任何aa的可變aa，其限制條件為PBA(i)不包含含有包含SEQ ID NO：35之輕鏈及包含SEQ ID NO：11之重鏈的抗IGF-1R模組及b)含有包含SEQ ID NO：175之輕鏈及包含SEQ ID NO：145之重鏈的抗ErbB3 C8模組。在某些實施例中，抗IGF-1R VLCDR3包含SEQ ID NO：308或抗ErbB3 VLCDR3包含SEQ ID NO：315。在某些實施例中，兩對多肽鏈具有基本上一致之序列。HC Ig恆定區鍵之間的至少一個鍵中之至少一者為二硫鍵且可為二硫鍵或范德華鍵(van der Waals bond)，或該至少一個重鏈-輕鏈鍵中之至少一者為二硫鍵且可為二硫鍵或范德華鍵。在某些實施例中，抗ErbB3結合位點為C端scFv，且在某些實施例中，抗IGF-1R結合位點為C端scFv。PBA之抗IGF-1R結合位點、HC Ig恆定區及抗ErbB3結合位點可包含由單一連續多肽鏈包含之彼對的重鏈。
PBA可(i)在活體外在1 μM或1 μM以下、或100 nM或100 nM以下、或10 nM或10 nM以下、或1 nM或1 nM以下之濃度下抑制腫瘤細胞之生長，或ii)以10 nM或10 nM以下、或1 nM或1 nM以下、或100 pM或100 pM以下之IC50，或至少70%、或至少80%、或至少90%之最大抑制百分比抑制異調蛋白(heregulin)及IGF1誘導之信號轉導中之任一者或兩者，如pErbB3及pIGF-1R中之任一者或兩者磷酸化之抑制所指示。生長抑制可在培養物中在DU145細胞中以CTG分析進行量測。信號轉導之抑制可在培養物中在BxPC-3細胞中在以80 ng/ml之IGF-1及20 ng/ml之異調蛋白刺激15分鐘後測定。
在某些實施例中，PBA之各HC Ig恆定區包含介導與另一對之CH3域接合的CH3域。各HC Ig恆定區亦可包含 CH2域、鉸鏈及CH1域。在某些實施例中，PBA之CH1域以其C端連接於鉸鏈之N端，該鉸鏈以其C端連接於CH2域之N端，該CH2域以其C端連接於CH3域之N端。各第一結合位點可包含第一VH域，且PBA之各CH1域可以其N端連接於第一VH域之C端。PBA之各CH3域可以其C端連接於scFv之N端。PBA之各CH3域可以其C端連接於連接型連接子之N端，該連接子以其C端連接於scFv之N端。各輕鏈可包含第一VL域，該第一VL域與第一VH域締合形成第一結合位點。各第一VL域可以其C端連接於CL域之N端。各第一結合位點可為抗IGF-1R結合位點且各scFv可為抗ErbB3 scFv。各第一結合位點可為抗ErbB3結合位點且各scFv可為抗IGF-1R scFv。PBA之HC Ig恆定區可為IgG恆定區，例如IgG1或IgG2恆定區。
在某些實施例中，PBA之抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：8中所述之相應CDR之aa序列，且PBA之抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：32中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，PBA之抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：9中所述之相應CDR之aa序列，且PBA之抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：33中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，PBA之抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：10中所述之相應CDR之aa序列，且PBA之抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2 及VLCDR3包含SEQ ID NO：34中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，PBA之抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：11中所述之相應CDR之aa序列，且PBA之抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：35中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，PBA之抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：8中所述之相應CDR之aa序列，且PBA之抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：33中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，PBA之抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：10中所述之相應CDR之aa序列，且PBA之抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：32中所述之相應CDR之aa序列。
在某些實施例中，PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：134中所述之相應CDR之aa序列，且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：166中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：135中所述之相應CDR之aa序列，且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID ND：167中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：136中所述之相應CDR之aa序列，且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：168中所述 之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：137中所述之相應CDR之aa序列，且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：169中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：138中所述之相應CDR之aa序列，且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：170中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：139中所述之相應CDR之aa序列，且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：171中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：140中所述之相應CDR之aa序列，且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：172中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：141中所述之相應CDR之aa序列，且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：173中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：142中所述之相應CDR之aa序列，且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：174中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包 含SEQ ID NO：143中所述之相應CDR之aa序列，且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：175中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：136中所述之相應CDR之aa序列，且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：169中所述之相應CDR之aa序列。
在某些實施例中，PBA之抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：8中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：32中所述之相應CDR之aa序列；且(a)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：134中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：166中所述之相應CDR之aa序列；或(b)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：135中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：167中所述之相應CDR之aa序列；或(c)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：136中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：168中所述之相應CDR之aa序列；或(d)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：137中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：169中所述之相應CDR之aa序列；或(e)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：138中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：170中所述之相應CDR之aa序列；或(f)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：139中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：171中所述之相應CDR之aa序列；或(g)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：140中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：172中所述之相應CDR之aa序列；或(h)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：141中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：173中所述之相應CDR之aa序列；或(i)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：142中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：174中所述之相應CDR之aa序列；或(j)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：143中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：175中所述之相應CDR之aa序列；或(k)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：136中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、 VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：169中所述之相應CDR之aa序列。
在某些實施例中，PBA之抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：9中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：33中所述之相應CDR之aa序列；且(a)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：134中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：166中所述之相應CDR之aa序列；或(b)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：135中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：167中所述之相應CDR之aa序列；或(c)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：136中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：168中所述之相應CDR之aa序列；或(d)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：137中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：169中所述之相應CDR之aa序列；或(e)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：138中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：170中所述之相應CDR之aa序列；或(f)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、 VHCDR3包含SEQ ID NO：139中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：171中所述之相應CDR之aa序列；或(g)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：140中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：172中所述之相應CDR之aa序列；或(h)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：141中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：173中所述之相應CDR之aa序列；或(i)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：142中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：174中所述之相應CDR之aa序列；或(j)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：143中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：175中所述之相應CDR之aa序列；或(k)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：136中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：169中所述之相應CDR之aa序列。
在某些實施例中，PBA之抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：10中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：34中所述之相應CDR之aa序列；且(a)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：134中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：166中所述之相應CDR之aa序列；或(b)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：135中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：167中所述之相應CDR之aa序列；或(c)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：136中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：168中所述之相應CDR之aa序列；或(d)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：137中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：169中所述之相應CDR之aa序列；或(e)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：138中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：170中所述之相應CDR之aa序列；或(f)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：139中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：171中所述之相應CDR之aa序列；或(g)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：140中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、 VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：172中所述之相應CDR之aa序列；或(h)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：141中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：173中所述之相應CDR之aa序列；或(i)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：142中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：174中所述之相應CDR之aa序列；或(j)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：143中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：175中所述之相應CDR之aa序列；或(k)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：136中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：169中所述之相應CDR之aa序列。
在某些實施例中，PBA之抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：11中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：35中所述之相應CDR之aa序列；且(a)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：134中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：166中所述之相應CDR之aa序列；或(b)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、 VHCDR3包含SEQ ID NO：135中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：167中所述之相應CDR之aa序列；或(c)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：136中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：168中所述之相應CDR之aa序列；或(d)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：137中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：169中所述之相應CDR之aa序列；或(e)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：138中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：170中所述之相應CDR之aa序列；或(f)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：139中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：171中所述之相應CDR之aa序列；或(g)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：140中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：172中所述之相應CDR之aa序列；或(h)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ、 ID NO：141中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：173中所述之相應CDR之aa序列；或(i)PBA之抗 ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：142中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：174中所述之相應CDR之aa序列；或(j)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：136中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：169中所述之相應CDR之aa序列。
在某些實施例中，PBA之抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：8中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：33中所述之相應CDR之aa序列；且(a)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：134中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：166中所述之相應CDR之aa序列；或(b)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：135中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：167中所述之相應CDR之aa序列；或(c)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：136中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：168中所述之相應CDR之aa序列；或(d)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：137中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：169中所述之相應CDR之aa序列；或(e)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：138中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：170中所述之相應CDR之aa序列；或(f)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：139中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：171中所述之相應CDR之aa序列；或(g)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：140中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：172中所述之相應CDR之aa序列；或(h)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：141中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：173中所述之相應CDR之aa序列；或(i)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：142中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：174中所述之相應CDR之aa序列；或(j)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：143中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：175中所述之相應CDR之aa序列；或(k)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：136中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、 VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：169中所述之相應CDR之aa序列。
在某些實施例中，PBA之抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：10中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：32中所述之相應CDR之aa序列；且(a)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：134中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：166中所述之相應CDR之aa序列；或(b)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：135中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：167中所述之相應CDR之aa序列；或(c)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：136中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：168中所述之相應CDR之aa序列；或(d)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：137中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：169中所述之相應CDR之aa序列；或(e)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：138中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：170中所述之相應CDR之aa序列；或(f)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、 VHCDR3包含SEQ ID NO：139中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：171中所述之相應CDR之aa序列；或(g)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：140中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：172中所述之相應CDR之aa序列；或(h)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：141中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：173中所述之相應CDR之aa序列；或(i)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：142中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：174中所述之相應CDR之aa序列；或(j)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：143中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：175中所述之相應CDR之aa序列；或(k)PBA之抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：136中所述之相應CDR之aa序列且PBA之抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：169中所述之相應CDR之aa序列。
在某些實施例中，PBA之各抗IGF-1R結合位點包含含有SEQ ID NO：1中所述之序列的VH域，其中該序列包含獨立地表示在第1圖中之相應位置所示之任何aa的可變 aa，及/或PBA之各抗IGF-1R結合位點包含含有SEQ ID NO：2(或3)中所述之序列的VL域，其中該序列包含獨立地表示在第2圖中之相應位置所示之任何aa的可變aa。
在某些實施例中，PBA之各抗ErbB3結合位點包含含有SEQ ID NO：4(或5)中所述之序列的VH域，其中該序列包含獨立地表示在第3圖中之相應位置所示之任何aa的可變aa，及/或PBA之各抗ErbB3結合位點包含含有SEQ ID NO：6(或7)中所述之序列的VL域，其中該序列包含獨立地表示在第4圖中之相應位置所示之任何aa的可變aa。
在某些實施例中，PBA之各抗IGF-1R結合位點包含含有SEQ ID NO：1中所述之序列的VH域及含有SEQ ID NO：2(或3)中所述之序列的VL域，且PBA之各抗ErbB3結合位點包含含有SEQ ID NO：4(或5)中所述之序列的VH域及含有SEQ ID NO：6(或7)中所述之序列的VL域。
在某些實施例中，PBA之各抗IGF-1R結合位點包含含有SEQ ID NO：1中所述之aa序列的VH域，其中X1不為T、X2不為V、X6不為R、X8不為D或X10不為I，或含有SEQ ID NO：3中所述之aa序列的VL域，或PBA之各抗ErbB3結合位點包含含有SEQ ID NO：5中所述之aa序列的VH域或含有SEQ ID NO：7中所述之序列的VL域。在某些實施例中，PBA之各抗IGF-1R結合位點包含含有SEQ ID NO：1中所述之aa序列的VH域，其中X1不為T、X2不為V、X6不為R、X8不為D或X10不為I，含有SEQ ID NO：3中所述之序列的VL域；且PBA之各抗ErbB3結合位點包含含有SEQ ID NO：5中所述之aa序列的VH域及含有SEQ ID NO：7中所述之序列的VL域。
在某些實施例中，PBA之各抗IGF-1R結合位點包含含有選自由SEQ ID NO：8-31組成之群之aa序列的VH域及/或含有選自由SEQ ID NO：32-133組成之群之aa序列的VL域，及/或各抗ErbB3結合位點包含選自由SEQ ID NO：134-165組成之群之VH aa序列；及/或選自由SEQ ID NO：166-200組成之群之VL aa序列。在某些實施例中，(a)各第一VH域包含選自由SEQ ID NO：8-31組成之群之aa序列，各第一VL域包含選自由SEQ ID NO：32-133組成之群之aa序列，各第二VH域包含選自由SEQ ID NO：134-165組成之群之aa序列且各第二VL域包含選自由SEQ ID NO：166-200組成之群之aa序列，或(b)各第一VH域包含選自由SEQ ID NO：134-165組成之群之aa序列，各第一VL域包含選自由SEQ ID NO：166-200組成之群之aa序列，各第二VH域包含選自由SEQ ID NO：8-31組成之群之aa序列且各第二VL域由選自包含SEQ ID NO：32-133之群之aa序列組成。
在某些實施例中，PBA之各抗IGF-1R VH域包含SEQ ID NO：8中所述之aa序列且PBA之各抗IGF-1R VL域包含SEQ ID NO：32中所述之aa序列。在某些實施例中，PBA之各抗IGF-1R VH域包含SEQ ID NO：9中所述之aa序列且PBA之各抗IGF-1R VL域包含SEQ ID NO：33中所述之aa序列。 在某些實施例中，PBA之各抗IGF-1R VH域包含SEQ ID NO：10中所述之aa序列且PBA之各抗IGF-1R VL域包含SEQ ID NO：34中所述之aa序列。在某些實施例中，PBA之各抗IGF-1R VH域包含SEQ ID NO：11中所述之aa序列且PBA之各抗IGF-1R VL域包含SEQ ID NO：35中所述之aa序列。在某些實施例中，PBA之各抗IGF-1R VH域包含SEQ ID NO：8中所述之aa序列且PBA之各抗IGF-1R VL域包含SEQ ID NO：33中所述之aa序列。在某些實施例中，PBA之各抗IGF-1R VH域包含SEQ ID NO：10中所述之aa序列且PBA之各抗IGF-1R VL域包含SEQ ID NO：32中所述之aa序列。
在某些實施例中，PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：134中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：166中所述之aa序列。在某些實施例中，PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：135中所述之aa序列且PBA之抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：167中所述之aa序列。在某些實施例中，PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：136中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：168中所述之aa序列。在某些實施例中，PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：137中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：169中所述之aa序列。在某些實施例中，PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：138中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：170中所述之aa序列。在某 些實施例中，PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：139中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：171中所述之aa序列。在某些實施例中，PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：140中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：172中所述之aa序列。在某些實施例中，PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：141中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：173中所述之aa序列。在某些實施例中，PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：142中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：174中所述之aa序列。在某些實施例中，PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：143中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：175中所述之aa序列。在某些實施例中，PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：136中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：169中所述之aa序列。
在某些實施例中，PBA之各抗IGF-1R VH域包含SEQ ID NO：8中所述之aa序列且PBA之各抗IGF-1R VL域包含SEQ ID NO：32中所述之aa序列；且(a)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：134中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：166中所述之aa序列；或(b)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：135中所述之aa序列且PBA之ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：167中所述之aa序列；或(c)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：136中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：168中所述之aa序列；或(d)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：137中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：169中所述之aa序列；或(e)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：138中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：170中所述之aa序列；或(f)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：139中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：171中所述之aa序列；或(g)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：140中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：172中所述之aa序列；或(h)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：141中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：173中所述之aa序列；或(i)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：142中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：174中所述之aa序列；或(j)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：143中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：175中所述之aa序列；或(k)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：136中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：169中所述之aa序列。
在某些實施例中，PBA之各抗IGF-1R VH域包含SEQ ID NO：9中所述之aa序列且PBA之各抗IGF-1R VL域包含SEQ ID NO：33中所述之aa序列；且(a)PBA之各抗ErbB3 VH 域包含SEQ ID NO：134中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：166中所述之aa序列；或(b)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：135中所述之aa序列且PBA之ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：167中所述之aa序列；或(c)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：136中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：168中所述之aa序列；或(d)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：137中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：169中所述之aa序列；或(e)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：138中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：170中所述之aa序列；或(f)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：139中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：171中所述之aa序列；或(g)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：140中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：172中所述之aa序列；或(h)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：141中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：173中所述之aa序列；或(i)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：142中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：174中所述之aa序列；或(j)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：143中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：175中所述之aa序列；或(k)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：136中所述之 aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：169中所述之aa序列。
在某些實施例中，各抗IGF-1R VH域包含SEQ ID NO：10中所述之aa序列且各抗IGF-1R VL域包含SEQ ID NO：34中所述之aa序列；且(a)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：134中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：166中所述之aa序列；或(b)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：135中所述之aa序列且PBA之ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：167中所述之aa序列；或(c)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：136中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：168中所述之aa序列；或(d)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：137中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：169中所述之aa序列；或(e)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：138中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：170中所述之aa序列；或(f)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：139中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：171中所述之aa序列；或(g)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：140中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：172中所述之aa序列；或(h)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：141中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：173中所述之aa序列；或(i)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：142中所述之 aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：174中所述之aa序列；或(j)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：143中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：175中所述之aa序列；或(k)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：136中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：169中所述之aa序列。
在某些實施例中，PBA之各抗IGF-1R VH域包含SEQ ID NO：11中所述之aa序列且PBA之各抗IGF-1R VL域包含SEQ ID NO：35中所述之aa序列；且(a)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：134中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：166中所述之aa序列；或(b)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：135中所述之aa序列且PBA之ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：167中所述之aa序列；或(c)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：136中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：168中所述之aa序列；或(d)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：137中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：169中所述之aa序列；或(e)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：138中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：170中所述之aa序列；或(f)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：139中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：171中所述之aa序列；或(g)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：140中所述之aa序列且PBA之各抗 ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：172中所述之aa序列；或(h)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：141中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：173中所述之aa序列；或(i)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：142中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：174中所述之aa序列；或(j)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：136中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：169中所述之aa序列。
在某些實施例中，PBA之各抗IGF-1R VH域包含SEQ ID NO：8中所述之aa序列且PBA之各抗IGF-1R VL域包含SEQ ID NO：33中所述之aa序列；且(a)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：134中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：166中所述之aa序列；或(b)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：135中所述之aa序列且PBA之ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：167中所述之aa序列；或(c)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：136中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：168中所述之aa序列；或(d)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：137中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：169中所述之aa序列；或(e)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：138中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：170中所述之aa序列；或(f)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：139中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含 SEQ ID NO：171中所述之aa序列；或(g)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：140中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：172中所述之aa序列；或(h)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：141中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：173中所述之aa序列；或(i)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：142中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：174中所述之aa序列；或(j)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：143中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：175中所述之aa序列；或(k)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：136中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：169中所述之aa序列。
在某些實施例中，PBA之各抗IGF-1R VH域包含SEQ ID NO：10中所述之aa序列且PBA之各抗IGF-1R VL域包含SEQ ID NO：32中所述之aa序列；且(a)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：134中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：166中所述之aa序列；或(b)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：135中所述之aa序列且PBA之ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：167中所述之aa序列；或(c)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：136中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：168中所述之aa序列；或(d)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：137中所述之aa序列且PBA之各抗 ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：169中所述之aa序列；或(e)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：138中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：170中所述之aa序列；或(f)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：139中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：171中所述之aa序列；或(g)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：140中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：172中所述之aa序列；或(h)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：141中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：173中所述之aa序列；或(i)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：142中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：174中所述之aa序列；或(j)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：143中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：175中所述之aa序列；或(k)PBA之各抗ErbB3 VH域包含SEQ ID NO：136中所述之aa序列且PBA之各抗ErbB3 VL域包含SEQ ID NO：169中所述之aa序列。
在某些實施例中，(a)PBA之各重鏈包含選自由以下組成之群之aa序列：SF-G1-P1(SEQ ID NO：212)；SF-G1-M1.3(SEQ ID NO：214)；SF-G1-M27(SEQ ID NO：216)；SF-G1-P6(SEQ 1D NO：218)；SF-G1-B69(SEQ ID NO：220)；P4-G1-C8(SEQ ID NO：222)；P4-G1-P1(SEQ ID NO：224)；P4-G1-M1.3(SEQ ID NO：226)；P4-G1-M27(SEQ ID NO：228)； P4-G1-P6(SEQ ID NO：230)；P4-G1-B69(SEQ ID NO：232)；M78-G1-C8(SEQ ID NO：234)；M78-G1-P1(SEQ ID NO：236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO：238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO：240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO：242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO：244)；M57-G1-C8(SEQ ID NO：246)；M57-G1-P1(SEQ ID NO：248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO：250)；M57-G1-M27(SEQ ID NO：252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO：254)及M57-G1-B69(SEQ ID NO：256)及/或PBA之各輕鏈包含選自由以下組成之群之aa序列：SF κ輕鏈(SEQ ID NO：202)；P4 κ輕鏈(SEQ ID NO：204)；M78 κ輕鏈(SEQ ID NO：206)；及M57 κ輕鏈(SEQ ID NO：208)；或(b)PBA之各重鏈包含選自由以下組成之群之aa序列：P1-G1-P4(SEQ ID NO：268)；P1-G1-M57(SEQ ID NO：270)；P1-G1-M78(SEQ ID NO：272)；M27-G1-P4(SEQ ID NO：274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO：276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO：278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO：280)；M7-G1-M57(SEQ ID NO：282)；M7-G1-M78(SEQ ID NO：284)；B72-G1-P4(SEQ ID NO：286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO：288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO：290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO：292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO：294)；B60-G1-M78(SEQ ID NO：296)；B60-G2-M78(SEQ ID NO：355)及M7-G2-M78(SEQ ID NO：357)及/或PBA之各輕鏈包含選自由以下組成之群之aa序列：P1 λ輕鏈(SEQ ID NO：258)；M27 λ輕鏈(SEQ ID NO：260)；M7 λ輕鏈(SEQ ID NO：262)；B72 λ輕鏈(SEQ ID NO：264)；及B60 λ輕鏈(SEQ ID NO：266)。
在某些實施例中，(a)PBA之各重鏈包含因至少一個aa添加、缺失或取代而與選自由以下組成之群之aa序列不同的aa序列：SF-G1-P1(SEQ ID NO：212)；SF-G1-M1.3(SEQ ID NO：214)；SF-G1-M27(SEQ ID NO：216)；SF-G1-P6(SEQ ID NO：218)；SF-G1-B69(SEQ ID NO：220)；P4-G1-C8(SEQ ID NO：222)；P4-G1-P1(SEQ ID NO：224)；P4-G1-M1.3(SEQ ID NO：226)；P4-G1-M27(SEQ ID NO：228)；P4-G1-P6(SEQ ID NO：230)；P4-G1-B69(SEQ ID NO：232)；M78-G1-C8(SEQ ID NO：234)；M78-G1-P1(SEQ ID NO：236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO：238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO：240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO：242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO：244)；M57-G1-C8(SEQ ID NO：246)；M57-G1-P1(SEQ ID NO：248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO：250)；M57-G1-M27(SEQ ID NO：252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO：254)及M57-G1-B69(SEQ ID NO：256)且PBA之各輕鏈包含選自由以下組成之群之aa序列：SF κ輕鏈(SEQ ID NO：202)；P4 κ輕鏈(SEQ ID NO：204)；M78 κ輕鏈(SEQ ID NO：206)；及M57 κ輕鏈(SEQ ID NO：208)；或(b)PBA之各重鏈包含選自由以下組成之群之aa序列：SF-G1-P1(SEQ ID NO：212)；SF-G1-M1.3(SEQ ID NO：214)；SF-G1-M27(SEQ ID NO：216)；SF-G1-P6(SEQ ID NO：218)；SF-G1-B69(SEQ ID NO：220)；P4-G1-C8(SEQ ID NO：222)；P4-G1-P1(SEQ ID NO：224)；P4-G1-M1.3(SEQ ID NO：226)；P4-G1-M27(SEQ ID NO：228)；P4-G1-P6(SEQ ID NO：230)；P4-G1-B69(SEQ ID NO：232)；M78-G1-C8(SEQ ID NO：234)；M78-G1-P1(SEQ ID NO：236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO：238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO：240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO：242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO：244)；M57-G1-C8(SEQ ID NO：246)；M57-G1-P1(SEQ ID NO：248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO：250)；M57-G1-M27(SEQ ID NO：252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO：254)及M57-G1-B69(SEQ ID NO：256)；且PBA之各輕鏈包含因至少一個aa添加、缺失或取代而與選自由以下組成之群之aa序列不同的aa序列：SF κ輕鏈(SEQ ID NO：202)；P4 κ輕鏈(SEQ ID NO：204)；M78 κ輕鏈(SEQ ID NO：206)；及M57 κ輕鏈(SEQ ID NO：208)；或(c)PBA之各重鏈包含因至少一個aa添加、缺失或取代而與選自包含以下之群之aa序列不同的aa序列：P1-G1-P4(SEQ ID NO：268)；P1-G1-M57(SEQ ID NO：270)；P1-G1-M78(SEQ ID NO：272)；M27-G1-P4(SEQ ID NO：274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO：276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO：278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO：280)；M7-G1-M57(SEQ ID NO：282)；M7-G1-M78(SEQ ID NO：284)；B72-G1-P4(SEQ ID NO：286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO：288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO：290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO：292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO：294)；B60-G1-M78(SEQ ID NO：296)；B60-G2-M78(SEQ ID NO：355)及M7-G2-M78(SEQ ID NO：357)且PBA之各輕鏈包含選自由以下組成之群之aa序列：P1 λ輕鏈(SEQ ID NO：258)；M27 λ輕鏈(SEQ ID NO：260)；M7 λ輕鏈(SEQ ID NO：262)；B72 λ輕鏈(SEQ ID NO：264)；及B60 λ輕鏈(SEQ ID NO：266)；或(d)PBA之各重鏈包含選自包含以下之群之aa序列：P1-G1-P4(SEQ ID NO：268)；P1-G1-M57(SEQ ID NO：270)；P1-G1-M78(SEQ ID NO：272)；M27-G1-P4(SEQ ID NO：274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO：276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO：278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO：280)；M7-G1-M57(SEQ ID NO：282)；M7-G1-M78(SEQ ID NO：284)；B72-G1-P4(SEQ ID NO：286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO：288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO：290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO：292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO：294)；B60-G1-M78(SEQ ID NO：296)；B60-G2-M78(SEQ ID NO：355)及M7-G2-M78(SEQ ID NO：357)且PBA之各輕鏈包含因至少一個aa添加、缺失或取代而與選自由以下組成之群之aa序列不同的aa序列：P1 λ輕鏈(SEQ ID NO：258)；M27 λ輕鏈(SEQ ID NO：260)；M7 λ輕鏈(SEQ ID NO：262)；B72 λ輕鏈(SEQ ID NO：264)；及B60 λ輕鏈(SEQ ID NO：266)，其中PBA因至少一個aa、CDR或可變域而與16F不同。
在某些實施例中，(a)藉由至少一個鍵結合於PBA之另一重鏈的PBA之各重鏈包含與以下aa序列之一至少90%一致或因1-30個aa取代、缺失及/或添加而與以下aa序列之一不同的aa序列：SF-G1-P1(SEQ ID NO：212)；SF-G1-M1.3(SEQ ID NO：214)；SF-G1-M27(SEQ ID NO：216)；SF-G1-P6(SEQ ID NO：218)；SF-G1-B69(SEQ ID NO：220)；P4-G1-C8(SEQ ID NO：222)；P4-G1-P1(SEQ ID NO：224)；P4-G1-M1.3(SEQ ID NO：226)；P4-G1-M27(SEQ ID NO：228)；P4-G1-P6(SEQ ID NO：230)；P4-G1-B69(SEQ ID NO：232)；M78-G1-C8(SEQ ID NO：234)；M78-G1-P1(SEQ ID NO：236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO：238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO：240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO：242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO：244)；M57-G1-C8(SEQ ID NO：246)；M57-G1-P1(SEQ ID NO：248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO：250)；M57-G1-M27(SEQ ID NO：252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO：254)及M57-G1-B69(SEQ ID NO：256)，及(b)藉由至少一個鍵結合於(a)之一個重鏈的PBA之各輕鏈包含與以下aa序列之一至少90%一致或因1-30個aa取代、缺失及/或添加而與以下aa序列之一不同的aa序列：SF κ輕鏈(SEQ ID NO：202)；P4 κ輕鏈(SEQ ID NO：204)；M78 κ輕鏈(SEQ ID NO：206)；及M57 κ輕鏈(SEQ ID NO：208)；或(c)藉由至少一個鍵結合於PBA之另一重鏈的PBA之各重鏈包含與以 下aa序列之一至少90%一致或因1-30個aa取代、缺失及/或添加而與以下aa序列之一不同的aa序列：P1-G1-P4(SEQ ID NO：268)；P1-G1-M57(SEQ ID NO：270)；P1-G1-M78(SEQ ID NO：272)；M27-G1-P4(SEQ ID NO：274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO：276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO：278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO：280)；M7-G1-M57(SEQ ID NO：282)；M7-G1-M78(SEQ ID NO：284)；B72-G1-P4(SEQ ID NO：286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO：288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO：290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO：292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO：294)；及B60-G1-M78(SEQ ID NO：296)；B60-G2-M78(SEQ ID NO：355)及M7-G2-M78(SEQ ID NO：357)，及(d)藉由至少一個鍵結合於(c)之一個重鏈的PBA之各輕鏈包含與以下aa序列之一至少90%一致或因1-30個aa取代、缺失及/或添加而與以下aa序列之一不同的aa序列：P1 λ輕鏈(SEQ ID NO：258)；M27 λ輕鏈(SEQ ID NO：260)；M7 λ輕鏈(SEQ ID NO：262)；B72 λ輕鏈(SEQ ID NO：264)；及B60 λ輕鏈(SEQ ID NO：266)。
在某些實施例中，(a)PBA之各重鏈包含與以下aa序列之一至少95%一致或因1-10個aa取代、缺失及/或添加而與以下aa序列之一不同的aa序列：SF-G1-P1(SEQ ID NO：212)；SF-G1-M1.3(SEQ ID NO：214)；SF-G1-M27(SEQ ID NO：216)；SF-G1-P6(SEQ ID NO：218)；SF-G1-B69(SEQ ID NO：220)；P4-G1-C8(SEQ ID NO：222)；P4-G1-P1(SEQ ID NO：224)；P4-G1-M1.3(SEQ ID NO：226)；P4-G1-M27(SEQ ID NO：228)；P4-G1-P6(SEQ ID NO：230)；P4-G1-B69(SEQ ID NO：232)；M78-G1-C8(SEQ ID NO：234)；M78-G1-P1(SEQ ID NO：236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO：238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO：240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO：242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO：244)；M57-G1-C8(SEQ ID NO：246)；M57-G1-P1(SEQ ID NO：248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO：250)；M57-G1-M27(SEQ ID NO：252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO：254)及M57-G1-B69(SEQ ID NO：256)，及(b)PBA之各輕鏈包含與以下aa序列之一至少95%一致或因1-10個aa取代、缺失及/或添加而與以下aa序列之一不同的aa序列：SF κ輕鏈(SEQ ID NO：202)；P4 κ輕鏈(SEQ ID NO：204)；M78 κ輕鏈(SEQ ID NO：206)；及M57 κ輕鏈(SEQ ID NO：208)；或(c)PBA各重鏈包含與以下aa序列之一至少95%一致或因1-10個aa取代、缺失及/或添加而與以下aa序列之一不同的aa序列：P1-G1-P4(SEQ ID NO：268)；P1-G1-M57(SEQ ID NO：270)；P1-G1-M78(SEQ ID NO：272)；M27-G1-P4(SEQ ID NO：274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO：276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO：278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO：280)；M7-G1-M57(SEQ ID NO：282)；M7-G1-M78(SEQ ID NO：284)；B72-G1-P4(SEQ ID NO：286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO：288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO：290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO：292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO：294)；及B60-G1-M78(SEQ ID NO：296)；B60-G2-M78(SEQ ID NO：355)及M7-G2-M78(SEQ ID NO：357)，及(d)PBA之各輕鏈包含與以下aa序列之一至少95%一致或因1-10個aa取代、缺失及/或添加而與以下aa序列之一不同的aa序列：P1 λ輕鏈(SEQ ID NO：258)；M27 λ輕鏈(SEQ ID NO：260)；M7 λ輕鏈(SEQ ID NO：262)；B72 λ輕鏈(SEQ ID NO：264)；B60 λ輕鏈(SEQ ID NO：266)。
示範性PBA包括以下：(a)包含以下之SF-G1-P1 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：212之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：202之輕鏈序列；(b)包含以下之SF-G1-M1.3 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：214之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：202之輕鏈aa序列；(c)包含以下之SF-G1-M27 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：216之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：202之輕鏈aa序列；(d)包含以下之SF-G1-P6 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：218之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：202之輕鏈aa序列；(e)包含以下之SF-G1-B69 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：220之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：202之輕鏈aa序列；(f) 包含以下之P4-G1-C8 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：222之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：204之輕鏈aa序列；(g)包含以下之P4-G1-P1 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：224之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：204之輕鏈aa序列；(h)包含以下之P4-G1-M1.3 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：226之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：204之輕鏈aa序列；(i)包含以下之P4-G1-M27 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：228之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：204之輕鏈aa序列；(j)包含以下之P4-G1-P6 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：230之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：204之輕鏈aa序列；(h)包含以下之P4-G1-B69 PBA兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：232之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：204之輕鏈aa序列；(i)包含以下之M78-G1-C8 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：234之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：206之輕鏈aa序列；(i)包含以下之M78-G1-P1 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：236之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：206之輕鏈aa序列；(k)包含以下之M78-G1-M1.3 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：238之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：206之輕鏈aa序列；(l)包含以下之M78-G1-M27 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：240之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：206之輕鏈aa序列；(m)包含以下之M78-G1-P6 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：242之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：206之輕鏈aa序列；(n)包含以下之M78-G1-B69 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：244之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：206之輕鏈aa序列；(o)包含以下之M57-G1-C8 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：246之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：208之輕鏈aa序列；(p)包含以下之M57-G1-P1 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：248之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：208之輕鏈aa序列；(r)包含以下之M57-G1-M1.3 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：250之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：208之輕鏈aa序列；(s)包含以下之M57-G1-M27 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：252之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：208之輕鏈aa序列；(t)包含以下之M57-G1-P6 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：254之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：208之輕鏈aa序列；(u)包含以下之M57-G1-B69 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：256之重鏈aa序列； 及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：208之輕鏈aa序列；(v)包含以下之P1-G1-P4 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：268之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：258之輕鏈aa序列；(w)包含以下之P1-G1-M57 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：270之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：258之輕鏈aa序列；(x)包含以下之P1-G1-M78 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：272之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：258之輕鏈aa序列；(y)包含以下之M27-G1-P4 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：274之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：260之輕鏈aa序列；(z)包含以下之M27-G1-M57 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：276之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：260之輕鏈aa序列；(aa)包含以下之M27-G1-M78 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：278之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：260之輕鏈aa序列；(ab)包含以下之M7-G1-P4 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：280之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：262之輕鏈aa序列；(ac)包含以下之M7-G1-M57 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：282之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：262之輕鏈aa序列；(ad)包含以下之M7-G1-M78 PBA：兩條重鏈，各自包含 SEQ ID NO：284之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：262之輕鏈aa序列；(ae)包含以下之B72-G1-P4 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：286之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：264之輕鏈aa序列；(af)包含以下之B72-G1-M57 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：288之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：264之輕鏈aa序列；(ag)包含以下之B72-G1-M78 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：290之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：264之輕鏈aa序列；(ah)包含以下之B60-G1-P4 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：292之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：266之輕鏈aa序列；(ai)包含以下之B60-G1-M57 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：294之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：266之輕鏈aa序列；及(aj)包含以下之B60-G1-M78 PBA：兩條重鏈，各自包含SEQ ID NO：296之重鏈aa序列；及兩條輕鏈，各自包含SEQ ID NO：266之輕鏈aa序列。
本文亦提供單特異性抗體。在某些實施例中，抗IGF-1R單株抗體包含按胺基至羧基順序包含如第5A圖之SEQ ID NO：202中加點狀底線所示SF κ輕鏈之VLCDR1序列、VLCDR2序列及VLCDR3序列的第一序列，抗體進一步包含按胺基至羧基順序包含如第5A圖之SEQ ID NO：210中 分別前三個加點狀底線序列所示SF重鏈之VHCDR1序列、VHCDR2序列及VHCDR3序列的第二序列，其中第一序列與第二序列不重疊。在某些實施例中，抗IGF-1R單株抗體按胺基至羧基順序包含如第5A圖之SEQ ID NO：204中加點狀底線所示P4 κ輕鏈之VLCDR1序列、VLCDR2序列及VLCDR3序列，抗體進一步按胺基至羧基順序包含如第5A圖之SEQ ID NO：222中分別前三個加點狀底線序列所示P4重鏈之VHCDR1序列、VHCDR2序列及VHCDR3序列。在某些實施例中，抗IGF-1R單株抗體按胺基至羧基順序包含如第5A圖之SEQ ID NO：206中加點狀底線所示M78 κ輕鏈之VLCDR1序列、VLCDR2序列及VLCDR3序列，抗體進一步按胺基至羧基順序包含如第5A圖之SEQ ID NO：234中分別前三個加點狀底線序列所示M78重鏈之VHCDR1序列、VHCDR2序列及VHCDR3序列。在某些實施例中，抗IGF-1R單株抗體按胺基至羧基順序包含如第5A圖之SEQ ID NO：208中加點狀底線所示M57 κ輕鏈之VLCDR1序列、VLCDR2序列及VLCDR3序列，抗體進一步按胺基至羧基順序包含如第5A圖之SEQ ID NO：246中分別前三個加點狀底線序列所示M57重鏈之VHCDR1序列、VHCDR2序列及VHCDR3序列。
在某些實施例中，抗IGF-1R抗體包含含有一組三個包含VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3之VH CDR的VH域，及/ 或含有一組三個包含VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3之VLCDR的VL域，CDR分別包含SEQ ID NO：302、303、304、305、306及307中所述之序列，且各CDR進一步包含胺基端及羧基端，其中各組CDR之CDR在抗體中按CDR1、CDR2及CDR3之線性胺基至羧基順序排列，其中CDR包含獨立地表示第1圖(VH)或第2圖(VL)中相應位置所示之任何aa的可變aa，且抗體不包含SF模組。在某些實施例中，抗IGF-1R抗體之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3分別包含SEQ ID NO：302、303、304、305、306及308中所述之序列。在某些實施例中，抗IGF-1R抗體之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3域包含SEQ ID NO：8-10及12-31中任一者中所述之相應aa序列，且抗IGF-1R抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3域包含SEQ ID NO：32-34及36-133中任一者中所述之相應aa序列。在某些實施例中，(a)抗IGF-1R抗體之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：8中所述之相應CDR的aa序列且抗IGF-1R抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：32中所述之相應CDR的aa序列；或(b)抗IGF-1R抗體之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：9中所述之相應CDR的aa序列且抗IGF-1R抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：33中所述之相應CDR的aa序列；或(c)抗IGF-1R抗體之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：10中所述之相應CDR的aa序列且抗IGF-1R抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：34中所述之相應CDR的aa序列；或(d)抗IGF-1R抗體之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：11中所述之相應CDR的aa序列且抗IGF-1R抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：35中所述之相應CDR的aa序列；或(e)抗IGF-1R抗體之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：8中所述之相應CDR的aa序列且抗IGF-1R抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：33中所述之相應CDR的aa序列；或(f)抗IGF-1R抗體之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：10中所述之相應CDR的aa序列且抗IGF-1R抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：32中所述之相應CDR的aa序列。
在某些實施例中，抗IGF-1R抗體之VH域包含SEQ ID NO：1中所述之aa序列，該序列包含獨立地表示第1圖中相應位置所示之任何aa的可變aa；抗IGF-1R抗體之VL域包含SEQ ID NO：2(或3)中所述之aa序列，該序列包含獨立地表示第2圖中相應位置所示之任何aa的可變aa；或抗IGF-1R抗體之VH域包含SEQ ID NO：1中所述之aa序列且抗IGF-1R抗體之VL域包含SEQ ID NO：2或3中所述之aa序列。在某些實施例中，抗IGF-1R抗體之VH域包含選自由SEQ ID NO：8-10及12-31組成之群的aa序列且VL域包含選自由SEQ ID NO：32-34及36-133組成之群的aa序列。
在某些實施例中，(a)抗IGF-1R抗體之VH域包含與SEQ ID NO：8-10及12-31中任一者所述之aa序列至少90%一致或因1-30個aa之aa取代、添加或缺失而與SEQ ID NO：8-10及12-31中任一者所述之aa序列不同的aa序列，及/或(b)抗IGF-1R抗體之VL域包含與SEQ ID NO：32-34及36-133中任一者所述之aa序列至少90%一致或因1-30個aa之aa取代、添加或缺失而與SEQ ID NO：32-34及36-133中任一者所述之aa序列不同的aa序列。在某些實施例中，(a)抗IGF-1R抗體之VH域包含與SEQ ID NO：8-10及12-31中任一者所述之aa序列至少95%一致或因1-10個aa之aa取代、添加或缺失而與SEQ ID NO：8-10及12-31中任一者所述之aa序列不同的aa序列，及/或(b)VL域包含與SEQ ID NO：32-34及36-133中任一者所述之aa序列至少95%一致或因1-10個aa之aa取代、添加或缺失而與SEQ ID NO：32-34及36-133中任一者所述之aa序列不同的aa序列。
抗IGF-1R抗體可為IgG1抗體，例如經分離之及/或單株IgG1抗體。
在某些實施例中，抗IGF-1R抗體為包含兩對多肽鏈之蛋白質，各對包含重鏈及輕鏈；其中(a)各重鏈包含SEQ ID NO：359、360或361中所述之aa序列；及/或(b)各輕鏈包含SEQ ID NO：204、206或208中所述之aa序列。在某些實施例中，抗IGF-1R抗體為包含兩對多肽鏈之蛋白質，各對包含重鏈及輕鏈；其中(a)各重鏈包含與SEQ ID NO：359、360或361中任一者所述之aa序列至少90%一致或因1-30個aa之aa取代、添加或缺失而與SEQ ID NO：359、360或361中任一者所述之aa序列不同的aa序列，及/或(b)各輕鏈包含與SEQ ID NO：204、206或208中任一者所述之aa序列至少90%一致或因1-30個aa之aa取代、添加或缺失而與SEQ ID NO：204、206或208中任一者所述之aa序列不同的aa序列。在某些實施例中，(a)抗IGF-1R抗體之各重鏈包含與SEQ ID NO：359、360或361中任一者所述之aa序列至少95%一致或因1-10個aa之aa取代、添加或缺失而與SEQ ID NO：359、360或361中任一者所述之aa序列不同的aa序列，及/或(b)各輕鏈包含與SEQ ID NO：204、206或208中任一者所述之aa序列至少95%一致或因1-10個aa之aa取代、添加或缺失而與SEQ ID NO：204、206或208中任一者所述之aa序列不同的aa序列。
示範性抗體包括(a)包含各自含有SEQ ID NO：359之重鏈aa序列之兩條重鏈及各自含有SEQ ID NO：204之輕鏈aa序列之兩條輕鏈的抗IGF-R1單株IgG1抗體P4；(b)包含各自含有SEQ ID NO：360之重鏈aa序列之兩條重鏈及各自含有SEQ ID NO：206之輕鏈aa序列之兩條輕鏈的抗IGF-R1單株IgG1抗體M78；(c)包含各自含有SEQ ID NO：361之重鏈aa序列之兩條重鏈及各自含有SEQ ID NO：208之輕鏈aa序列之兩條輕鏈的抗IGF-R1單株IgG1抗體M57；(d)包含各自含有SEQ ID NO：361之重鏈aa序 列之兩條重鏈及各自含有SEQ ID NO：206之輕鏈aa序列之兩條輕鏈的抗IGF-R1單株IgG1抗體M57/M78；及(e)包含各自含有SEQ ID NO：359之重鏈aa序列之兩條重鏈及各自含有SEQ ID NO：208之輕鏈aa序列之兩條輕鏈的抗IGF-R1單株IgG1抗體P4/M57。
抗IGF-1R抗體可包含一或多個其他結合位點，例如抗ErbB3結合位點。
亦提供抗ErbB3單株抗體，例如單株抗ErbB3抗體。在某些實施例中，抗ErbB3按胺基至羧基順序包含如第5B圖之SEQ ID NO：258中加點狀底線所示P1 λ輕鏈之VLCDR1序列、VLCDR2序列及VLCDR3序列，抗體進一步按胺基至羧基順序包含如第5B圖之SEQ ID NO：268中分別前三個加點狀底線序列所示P1重鏈之VHCDR1序列、VHCDR2序列及VHCDR3序列。在某些實施例中，抗ErbB3單株抗體按胺基至羧基順序包含如第5B圖之SEQ ID NO：260中加點狀底線所示M27 λ輕鏈之VLCDR1序列、VLCDR2序列及VLCDR3序列，抗體進一步按胺基至羧基順序包含如第5B圖之SEQ ID NO：274中分別前三個加點狀底線序列所示M27重鏈之VHCDR1序列、VHCDR2序列及VHCDR3序列。在某些實施例中，抗ErbB3單株抗體按胺基至羧基順序包含如第5B圖之SEQ ID NO：262中加點狀底線所示M7 λ輕鏈之VLCDR1序列、VLCDR2序列及VLCDR3序列，抗體進一步按胺基至羧基順序包含如第5B 圖之SEQ ID NO：280中分別前三個加點狀底線序列所示M7重鏈之VHCDR1序列、VHCDR2序列及VHCDR3序列。在某些實施例中，抗ErbB3單株抗體按胺基至羧基順序包含如第5B圖之SEQ ID NO：264中加點狀底線所示B72 λ輕鏈之VLCDR1序列、VLCDR2序列及VLCDR3序列，抗體進一步按胺基至羧基順序包含如第5B圖之SEQ ID NO：286中分別前三個加點狀底線序列所示B72重鏈之VHCDR1序列、VHCDR2序列及VHCDR3序列。在某些實施例中，抗ErbB3單株抗體按胺基至羧基順序包含如第5B圖之SEQ ID NO：266中加點狀底線所示B60 λ輕鏈之VLCDR1序列、VLCDR2序列及VLCDR3序列，抗體進一步按胺基至羧基順序包含如第5B圖之SEQ ID NO：292中分別前三個加點狀底線序列所示B60重鏈之VHCDR1序列、VHCDR2序列及VHCDR3序列。
在某些實施例中，特異性結合人類ErbB3之經分離抗ErbB3抗體包含含有一組三個包含VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3之VH CDR的VH域，及/或含有一組三個包含VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3之VL CDR的VL域，CDR分別包含SEQ ID NO：309、310、311、312、313及314中所述之序列，且各CDR進一步包含胺基端及羧基端，其中各組CDR之CDR在抗體中按CDR1、CDR2及CDR3之線性胺基至羧基順序排列，其中CDR包含獨立地表示第3圖(VH)或第4圖(VL)中相應位置所示之任何aa的可變aa，且抗體不包含C8模組。在某些實施例中，抗ErbB3抗體 之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3分別包含SEQ ID NO：309、310、311、312、313及315中所述之序列。在某些實施例中，抗ErbB3抗體之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3域包含SEQ ID NO：134-142及144-165中任一者中所述之相應aa序列，且抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3域包含SEQ ID NO：166-174及176-200中任一者中所述之相應aa序列。
在某些實施例中，抗ErbB3抗體之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：134中所述之相應CDR之aa序列，且抗ErbB3抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：166中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，抗ErbB3抗體之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：135中所述之相應CDR之aa序列，且抗ErbB3抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：167中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，抗ErbB3抗體之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：136中所述之相應CDR之aa序列，且抗ErbB3抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：168中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，抗ErbB3抗體之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：137中所述之相應CDR之aa序列，且抗ErbB3抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：169中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，抗ErbB3抗體之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：138中所述之相應CDR 之aa序列，且抗ErbB3抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：170中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，抗ErbB3抗體之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：139中所述之相應CDR之aa序列，且抗ErbB3抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：171中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，抗ErbB3抗體之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：140中所述之相應CDR之aa序列，且抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：172中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，抗ErbB3抗體之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：141中所述之相應CDR之aa序列，且抗ErbB3抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：173中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，抗ErbB3抗體之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：142中所述之相應CDR之aa序列，且抗ErbB3抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：174中所述之相應CDR之aa序列。在某些實施例中，抗ErbB3抗體之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3包含SEQ ID NO：136中所述之相應CDR之aa序列，且抗ErbB3抗體之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3包含SEQ ID NO：169中所述之相應CDR之aa序列。
在某些實施例中，抗ErbB3抗體之VH域包含SEQ ID NO：4(或5)中所述之aa序列，該序列包含獨立地表示第3圖中相應位置所示之任何aa的可變aa，及/或抗ErbB3 抗體之VL域包含SEQ ID NO：6(或7)中所述之aa序列，該序列包含獨立地表示第4圖中相應位置所示之任何aa的可變aa。在某些實施例中，抗ErbB3抗體之VH域包含選自由SEQ ID NO：134-142及144-165組成之群的aa序列且抗ErbB3抗體之VL域包含選自由SEQ ID NO：166-174及176-200組成之群的aa序列。
在某些實施例中，(a)抗ErbB3抗體之VH域包含與SEQ ID NO：134-142及144-165中任一者所述之aa序列至少90%一致或因1-30個aa之aa取代、添加或缺失而與SEQ ID NO：134-142及144-165中任一者所述之aa序列不同的aa序列，及/或(b)抗ErbB3抗體之VL域包含與SEQ ID NO：166-174及176-200中任一者所述之aa序列至少90%一致或因1-30個aa之aa取代、添加或缺失而與SEQ ID NO：166-174及176-200中任一者所述之aa序列不同的aa序列。在某些實施例中，(a)抗ErbB3抗體之VH域包含與SEQ ID NO：134-142及144-165中任一者所述之aa序列至少95%一致或因1-10個aa之aa取代、添加或缺失而與SEQ ID NO：134-142及144-165中任一者所述之aa序列不同的aa序列，及/或(b)VL域包含與SEQ ID NO：166-174及176-200中任一者所述之aa序列至少95%一致或因1-10個aa之aa取代、添加或缺失而與SEQ ID NO：166-174及176-200中任一者所述之aa序列不同的aa序列。
抗ErbB3抗體可為IgG1抗體，例如經分離之單株IgG1 抗體。
在某些實施例中，抗ErbB3抗體為包含兩對多肽鏈之蛋白質，各對包含重鏈及輕鏈；其中(a)各重鏈包含SEQ ID NO：362、363、364、365或366中所述之aa序列；及/或(b)各輕鏈包含SEQ ID NO：258、260、262、264或266中所述之aa序列。在某些實施例中，抗ErbB3抗體為包含兩對多肽鏈之蛋白質，各對包含重鏈及輕鏈；其中(a)各重鏈包含與SEQ ID NO：362、363、364、365或366中任一者所述之aa序列至少90%一致或因1-30個aa之aa取代、添加或缺失而與SEQ ID NO：362、363、364、365或366中任一者所述之aa序列不同的aa序列，及/或(b)各輕鏈包含與SEQ ID NO：258、260、262、264或266中任一者所述之aa序列至少90%一致或因1-30個aa之aa取代、添加或缺失而與SEQ ID NO：258、260、262、264或266中任一者所述之aa序列不同的aa序列。在某些實施例中，抗ErbB3抗體為包含兩對多肽鏈之蛋白質，各對包含重鏈及輕鏈；其中(a)各重鏈包含與SEQ ID NO：362、363、364、365或366中任一者所述之aa序列至少95%一致或因1-10個aa之aa取代、添加或缺失而與SEQ ID NO：362、363、364、365或366中任一者所述之aa序列不同的aa序列，及(b)各輕鏈包含與SEQ ID NO：258、260、262、264或266中任一者所述之aa序列至少95%一致或因1-10個aa之aa取代、添加或缺失而與SEQ ID NO：258、260、262、264或266中任一者所述 之aa序列不同的aa序列。
抗ErbB3抗體可包含一或多個其他結合位點，例如抗IGF-1R結合位點。
示範性抗ErbB3抗體包括：(a)包含各自含有SEQ ID NO：362之重鏈aa序列之兩條重鏈及各自含有SEQ ID NO：258之輕鏈aa序列之兩條輕鏈的抗ErbB3單株IgG1抗體P1；(b)包含各自含有SEQ ID NO：363之重鏈aa序列之兩條重鏈及各自含有SEQ ID NO：260之輕鏈aa序列之兩條輕鏈的抗ErbB3單株IgG1抗體M27；(c)包含各自含有SEQ ID NO：364之重鏈aa序列之兩條重鏈及各自含有SEQ ID NO：262之輕鏈aa序列之兩條輕鏈的抗ErbB3單株IgG1抗體M7；(d)包含各自含有SEQ ID NO：365之重鏈aa序列之兩條重鏈及各自含有SEQ ID NO：264之輕鏈aa序列之兩條輕鏈的抗ErbB3單株IgG1抗體B72；(e)包含各自含有SEQ ID NO：366之重鏈aa序列之兩條重鏈及各自含有SEQ ID NO：266之輕鏈aa序列之兩條輕鏈的抗ErbB3單株IgG1抗體B60；及(f)包含各自含有SEQ ID NO：363之重鏈aa序列之兩條重鏈及各自含有SEQ ID NO：262之輕鏈aa序列之兩條輕鏈的抗ErbB3單株IgG1抗體M27/M7。
亦提供scFv，其可為單株scFv。示範性scFv包括(a)包含SEQ ID NO：367之aa序列之抗IGF-R1 scFv抗體P4；(b)包含SEQ ID NO：368之aa序列之抗IGF-R1 scFv抗體M57；(c)包含SEQ ID NO：369之aa序列之抗IGF-R1 scFv 抗體M78；(d)包含SEQ ID NO：370之aa序列之抗ErbB3 scFv抗體C8；(e)包含SEQ ID NO：371之aa序列之抗ErbB3 scFv抗體P1；(f)包含SEQ ID NO：372之aa序列之抗ErbB3 scFv抗體M1.3；(g)包含SEQ ID NO：373之aa序列之抗ErbB3 scFv抗體M27；(h)包含SEQ ID NO：374之aa序列之抗ErbB3 scFv抗體P6；及(i)包含SEQ ID NO：375之aa序列之抗ErbB3 scFv抗體B69。
亦提供包含PBA；抗IGF-1R抗體；或抗ErbB3抗體及醫藥學上可接受之載劑的組合物。包含抗IGF-1R抗體之組合物可進一步包含抗ErbB3抗體。包含抗ErbB3抗體之組合物可進一步包含抗IGF-1R抗體。
亦提供例如包含至少一個編碼序列之核酸分子，至少一個編碼序列編碼如本文所述之抗體或其鏈。核酸分子可包含啟動子核苷酸序列及強化子核苷酸序列中之任一者或兩者，該核苷酸序列可操作地連接於至少一個編碼序列且促進或增強抗體之表現。亦涵蓋載體，例如包含一或多種本文提供之核酸分子之載體，以及包含一或多個本文提供之載體的宿主細胞。亦提供產生本文提供之PBA、抗IGF-1抗體或抗ErbB3抗體之方法，其包含在適於表現PBA、抗IGF-1抗體或抗ErbB3抗體之條件下培養包含一或多種編碼本文提供之抗體(例如PBA)或其鏈之核酸的細胞。進一步提供治療患有癌症之個體之方法，該方法包含向個體投與治療有效量之一或多種本文提供之抗體或PBA或組合物。
本文亦提供抗IGF-1R+抗ErbB3 PBA，其中當PBA以等於或高於5 mg/kg之劑量靜脈內投與時，PBA在石蟹獼猴(Cynomolgus monkey)體內具有至少45小時之半衰期。在某些實施例中，PBA在為小鼠或石蟹獼猴之生物體體內具有比另一結合相同抗原決定基之多價雙特異性抗體在相同生物體體內之半衰期在統計上顯著較長(例如長50%、2倍或2倍以上)的半衰期，其中抗原結合特異性之方向在fab與scfv之間相反。
PBA可使細胞(例如癌細胞)中異調蛋白誘導之pAKT信號傳遞抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%。PBA可使細胞(例如癌細胞)中IGF-1誘導之pAKT信號傳遞抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%。PBA可使細胞(例如癌細胞)中胰島素誘導之pAKT信號傳遞抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%。PBA可使細胞(例如癌細胞)中IGF-2誘導之pAKT信號傳遞抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%。
PBA在活體內或活體外抑制腫瘤細胞中之mTOR活化(磷酸化)的程度可大於單特異性抗IGF-1R Ab# A或與PBA結合IGF-1R上之相同抗原決定基的單特異性抗IGF-1R Ab。PBA在活體內或活體外降低腫瘤細胞中之mTOR蛋 白含量的程度可大於單特異性抗IGF-1R Ab# A或與PBA結合IGF-1R上之相同抗原決定基的單特異性抗IGF-1R Ab。在某些實施例中，相對於單特異性抗IGF-1R Ab# A或相對於與PBA結合IGF-1R上之相同抗原決定基的單特異性抗IGF-1R Ab，PBA在活體內或活體外使腫瘤細胞中之mTOR活化或mTOR蛋白含量至少降低50%倍，或降至1/2倍、1/3倍、1/4倍或1/5倍或低於1/5倍。在某些實施例中，PBA在nu/nu小鼠中之人類異種移植物模型中比等莫耳量之抗IGF-1R IgG更有效抑制腫瘤生長。在一些實施例中，異種移植物模型包含人類DU145、BxPC-3、SK-ES-1或Caki-1細胞異種移植物。在另一實施例中，多價雙特異性抗體在nu/nu小鼠中之人類異種移植物模型中比等莫耳量之抗IGF-1R IgG與等莫耳量之抗ErbB3 IgG組合的組合更有效抑制腫瘤生長。
本文提供特異性結合IGF-1R或ErbB3之新穎單特異性抗體。該等抗體包括IgG抗體及scFv抗體。亦提供特異性結合人類IGF-1R及人類ErbB3之雙特異性抗體，例如多價雙特異性抗體(「PBA」)。此等蛋白質為經由IGF-1R及ErbB3中之任一者或兩者進行之腫瘤細胞增殖及信號轉導的有效抑制劑。該等蛋白質可用於治療細胞增殖性病症，例如癌症。
定義
為方便起見，說明書、實例及隨附申請專利範圍中所用之某些術語及短語的意義提供如下。
「藥劑」係指活性分子，例如治療性蛋白質，例如藥物。
「胺基酸取代」係指蛋白質中之一個特定胺基酸(「aa」)經另一aa置換。取代可為保守性取代，如下文所定義。
「抗ErbB3結合位點」係指特異性結合人類ErbB3之結合位點。
「抗IGF-1R結合位點」係指特異性結合人類IGF-1R之結合位點。
「抗原結合位點」係指包含抗體之VH及/或VL域或其至少一個CDR之結合位點。舉例而言，抗原結合位點可包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：僅VHCDR3或連同VHCDR2一起及視情況連同VHCDR1。在某些實施例中，抗原結合位點包含VH域及VL域，其可存在於同一多肽上或兩個不同多肽上，例如VH域存在於重鏈上且VL域存在於輕鏈上。
抗體之「抗原結合部分」係指保留特異性結合抗原(例如IGF-1R或ErbB3)之能力的抗體之一或多個片段。已證實抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段保留。術語抗體之「抗原結合部分」內涵蓋之結合片段之實例包括(i)Fab片段，一種由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii)F(ab’)2片段，一種由兩個藉由二硫橋鍵在鉸鏈區連接之Fab片段組成之二價片段；(iii)由VH及CH1域組 成之Fd片段；(iv)由抗體之單一臂之VL及VH域組成之Fv片段；(v)由VH域組成之dAb片段；及(vi)經分離之互補決定區(CDR)。此外，儘管VL及VH為Fv片段之兩個域，但VL及VH由單獨基因編碼，其可使用重組方法藉由使得能將其製成VL及VH區配對形成單價蛋白質之單一蛋白質鏈的合成連接子聯結，該單價蛋白質稱為單鏈Fv(scFv)，參見美國專利第5,892,019號。該等單鏈抗體亦意欲涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」內。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中VH及VL域表現於單一多肽鏈上，但使用過短以致不允許同一鏈上之兩個域之間發生配對的連接子，藉此迫使該等域與另一鏈之互補域配對並產生兩個抗原結合位點。
「結合親和力」係指結合相互作用之強度且包括實際結合親和力以及表觀結合親和力兩者。實際結合親和力為締合速率相對於解離速率之比率。表觀親和力可包括例如由多價相互作用產生之親合性。解離常數(Kd)通常為結合親和力之倒數，且可使用表面電漿子共振分析(例如，如在BIACORE 3000儀器(GE Healthcare)中，例如使用重組ErbB3作為分析物及抗ErbB3抗體作為配位體所測定)或細胞結合分析便利地量測，該等分析各自描述於美國專利第7,846,440號之實例3中。
「結合部分」、「結合域」或「結合位點」係指結合多肽或當如此說明時其重鏈或輕鏈中直接參與介導抗體與 目標分子(亦即抗原)之特異性結合的部分、區或位點。示範性結合域包括抗原結合位點、配位體之受體結合域、受體之配位體結合域或酶促域。在較佳實施例中，結合域包含抗原結合位點或由抗原結合位點組成(例如包含來自抗體之可變重(VH)鏈序列及可變輕(VL)鏈序列或六個CDR安置於替代框架區中(例如視情況包含一或多個aa取代之人類框架區)。在某些實施例中，結合位點可基本上僅由VH或VL鏈序列構成。結合位點可完全來自一種物種，例如其僅具有來源於一種物種之生殖系序列的序列。舉例而言，結合位點可為人類(亦即來自人類物種)、小鼠或大鼠。結合位點亦可經人類化，亦即CDR係來自一種物種且框架(FR)係來自另一物種。舉例而言，結合位點可具有來源於小鼠抗體之CDR及來自人類物種之FR。某些人類化結合位點在一或多個CDR中包含突變以使得CDR看起來更類似於供體抗體之CDR。某些人類化抗體亦可在一或多個FR中包含突變。一般而言，結合位點中之突變可增強結合位點與其目標抗原之結合的親和力，及/或其可使結合位點穩定，例如延長其半衰期。
「CDR」或「互補決定區」係指重鏈及輕鏈多肽兩者之可變區內發現之不連續抗原結合位點。此等特定區已由以下文獻描述：Kabat等人，J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)及Kabat等人，Sequences of protein of immunological interest.(1991)，及Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)及MacCallum等人，J.Mol.Biol. 262：732-745(1996)，其中定義包括當彼此比較時aa殘基之重疊及子集。闡述涵蓋如上文引用參考文獻各自所定義之CDR的aa殘基以供比較。如本文所用，且若無其他規定，則「CDR」如Kabat所定義。
「CH1域」係指位於VH域與鉸鏈之間的重鏈免疫球蛋白恆定域。其涵蓋EU位置118-215。CH1域可為天然存在之CH1域，或一或多個aa已經取代、添加或缺失之天然存在之CH1域，其限制條件為該CH1域具有所要生物 性質。所要生物活性相對於天然存在之序列可為天然生物活性、增強之生物活性或降低之生物活性。
「CH2域」係指位於鉸鏈與CH3域之間的重鏈免疫球蛋白恆定域。其涵蓋EU位置231-340。CH2域可為天然存在之CH2域，或一或多個aa已經取代、添加或缺失之天然存在之CH2域，其限制條件為該CH2域具有所要生物性質。所要生物活性相對於天然存在之序列可為天然生物活性、增強之生物活性或降低之生物活性。
「CH3域」係指位於CH2域之C端的重鏈免疫球蛋白恆定域且涵蓋來自CH2域之N端的約110個殘基，例如約位置341-446b(EU編號系統)。CH3域可為天然存在之CH3域，或一或多個胺基酸(「aa」)已經取代、添加或缺失之天然存在之CH3域，其限制條件為該CH3域具有所要生物性質。所要生物活性相對於天然存在之序列可為天然生物活性、增強之生物活性或降低之生物活性。CH3域可包含或可不包含C端離胺酸。
「CH4域」係指IgM及IgE抗體中位於CH3域之C端的重鏈免疫球蛋白恆定域。CH4域可為天然存在之CH4域，或一或多個aa已經取代、添加或缺失之天然存在之CH4域，其限制條件為該CH4域具有所要生物性質。所要生物活性相對於天然存在之序列可為天然生物活性、增強之生物活性或降低之生物活性。
「CL域」係指位於VH域之C端的重鏈免疫球蛋白恆定域。其涵蓋約Kabat位置107A-216。CL域可為天然存 在之CH1域，或一或多個aa已經取代、添加或缺失之天然存在之CL域，其限制條件為該CL域具有所要生物性質。所要生物活性相對於天然存在之序列可為天然生物活性、增強之生物活性或降低之生物活性。CL域可包含或可不包含C端離胺酸。
「保守性取代」或「保守性胺基酸取代」係指蛋白質或肽中之一或多個aa殘基經特定置換aa置換，對於各特定取代前aa殘基而言，該特定置換aa已知不可能改變該種特定aa殘基經該種特定置換aa取代之蛋白質或肽的構形或功能。該等保守性取代通常涉及一個aa經在電荷及/或大小方面與第一aa類似之另一aa置換，且包括異白胺酸(I)、纈胺酸(V)或白胺酸(L)中之任一者彼此置換、天冬胺酸(D)取代麩胺酸(E)及反之亦然；麩胺醯胺(Q)取代天冬醯胺(N)及反之亦然；及絲胺酸(S)取代酥胺酸(T)及反之亦然。此項技術中已知在特定序列或結構環境中保守之其他取代。舉例而言，甘胺酸(G)及丙胺酸(A)經常可彼此取代以產生保守性取代，丙胺酸與纈胺酸(V)亦可如此。相對疏水性之甲硫胺酸(M)經常可保守性取代白胺酸或異白胺酸或被白胺酸或異白胺酸保守性取代，且有時保守性取代纈胺酸或被纈胺酸保守性取代。離胺酸(K)及精胺酸(R)在aa殘基之重要特徵為其電荷且預期該兩種鹼性aa殘基之不同pK不重要之位置中經常可互換。該等取代之作用可使用取代計分矩陣(諸如PAM120、PAM-200及PAM-250)進行計算。其他此類保守性取代(例 如具有類似疏水性特徵之整個區(例如跨膜域)之取代)為熟知的。
免疫球蛋白輕鏈上之恆定區域可互換地稱為「CL」、「輕鏈恆定區域」、「CL區」或「CL域」。免疫球蛋白之重鏈上之恆定域(例如鉸鏈、CH1、CH2或CH3域)可互換地稱為「CH」、「重鏈恆定域」、「CH」區或「CH域」。免疫球蛋白輕鏈上之可變域可互換地稱為「VL」、「輕鏈可變域」、「VL區」或「VL域」。免疫球蛋白重鏈上之可變域可互換地稱為「VH」、「重鏈可變域」、「VH區」或「VH域」。
「域」係指重鏈或輕鏈多肽之區，例如獨立地折疊之球蛋白區或非球蛋白區(例如連接子域)，其可包含可由例如β-折疊片及/或鏈間二硫鍵穩定之肽環(例如1至4個肽環)。免疫球蛋白重鏈及輕鏈之恆定區及可變區通常折疊成域。詳言之，CH1、CH2、CH3、CH4、CL、VH及VL域中之每一者通常形成環結構。
「EC50」或「EC50」係指提供蛋白質對特定系統(諸如結合分析或信號轉導路徑)之最大作用之50%的分子(例如PBA)之濃度。
「ErbB3」及「HER3」係指如美國專利第5,480,968號中所述之ErbB3蛋白。人類ErbB3蛋白序列展示於第4圖及美國專利第5,480,968號之SEQ ID NO：4中，其中前19個aa對應於自成熟蛋白質裂解之前導序列。ErbB3為受體之ErbB家族之成員，該家族之其他成員包括 ErbB1(EGFR)、ErbB2(HER2/Neu)及ErbB4。雖然ErbB3本身缺乏酪胺酸激酶活性，但其本身在ErbB與另一ErbB家族受體(例如ErbB1、ErbB2及ErbB4，其為受體酪胺酸激酶)二聚化後磷酸化。ErbB家族之配位體包括異調蛋白(HRG)、乙胞素(BTC)、表皮生長因子(EGF)、乙醯肝素結合表皮生長因子(HB-EGF)、轉型生長因子α(TGF-α)、雙調蛋白(amphiregulin；AR)、上皮有絲分裂蛋白(epigen；EPG)及外調蛋白(epiregulin；EPR)。人類ErbB3之aa序列以Genbank寄存編號NP_001973.2(受體酪胺酸蛋白激酶erbB-3同功異型物1前驅體)提供且指定基因ID：2065。
「EU」指示重鏈恆定區中之aa位置(包括CH1、鉸鏈、CH2及CH3域中之aa位置)在本文中係根據EU指數編號系統進行編號(參見Kabat等人，「Sequences of Proteins of Immunological Interest」,U.S.Dept.Health and Human Services，第5版，1991)。
「Fab」係指抗體之抗原結合部分，其包含兩條鏈：包含VH域及CH1域之第一鏈及包含VL域及CL域之第二鏈。儘管Fab通常描述為經木瓜蛋白酶處理之抗體之N端片段且包含一部分鉸鏈區，但其在本文中亦用於表示重鏈不包含一部分鉸鏈之結合域。
「Fc區」係指單一免疫球蛋白重鏈中始於鉸鏈區中緊接木瓜蛋白酶裂解位點上游(亦即IgG中之殘基216，取重鏈恆定區之第一個殘基為114)且結束於抗體之C端的部分。因此，完整Fc區至少包含鉸鏈、CH2域及CH3域。 二聚化之兩個Fc區稱為「Fc」或「Fc二聚體」。Fc區可為天然存在之Fc區，或一或多個aa已經取代、添加或缺失之天然存在之Fc區，其限制條件為該Fc區具有所要生物性質。所要生物活性相對於天然存在之序列可為天然生物活性、增強之生物活性或降低之生物活性。
「框架區」或「FR」或「FR區」包括作為可變區之部分但不為CDR之部分的aa殘基(例如使用CDR之Kabat定義)。因此，可變區框架之長度在約100-120個aa之間但僅包括CDR以外之彼等aa。對於重鏈可變區之特定實例及如Kabat等人，1991，同上所定義之CDR，框架區1對應於可變區中涵蓋aa 1-30之域；框架區2對應於可變區中涵蓋aa 36-49之域；框架區3對應於可變區中涵蓋aa 66-94之域，且框架區4對應於可變區中自aa103至可變區末端之域。輕鏈之框架區類似地由各輕鏈可變區CDR分隔。類似地，使用Chothia等人或McCallum等人關於CDR之定義，框架區邊界如上所述由各別CDR末端分隔。在較佳實施例中，CDR如Kabat所定義。
「全長抗體」為包含一或多個重鏈及一或多個輕鏈之抗體。各重鏈由重鏈可變區(在本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區構成。重鏈恆定區由三個域CH1、CH2及CH3及視情況存在之第四域CH4構成。各輕鏈由輕鏈可變區(在本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區構成。輕鏈恆定區由一個 域CL構成。VH及VL區可進一步細分為具有高變性之區，稱為互補決定區(CDR)，其間插有較保守之區，稱為框架區(FR)。各VH及VL通常由三個CDR及四個FR構成，自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。免疫球蛋白可為任何類型類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)或子類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類。
「Gly-Ser連接子」或「Gly-Ser肽」係指由甘胺酸及絲胺酸殘基組成之肽。示範性Gly-Ser肽包含aa序列(GIy4Ser)n(SEQ ID NO：395)，其中n=1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或20以上。在某些實施例中，n為1與5之間的數值，n為6與10之間的數值，n為11與15之間的數值，n為16與20之間的數值，n為21與25之間的數值，或n為26與30之間的數值。
「重鏈免疫球蛋白恆定區」或「HC Ig恆定區」可包含CH1域及Fc區，該Fc區可包含鉸鏈、CH2域、CH3域及/或CH4域。輕鏈免疫球蛋白恆定區可包含CL域。
「鉸鏈」或「鉸鏈區」或「鉸鏈域」係指重鏈中位於CH1域與CH2域之間的可撓性部分。其長度為約25個aa，且分為「上鉸鏈」、「中鉸鏈」及「下鉸鏈」。鉸鏈可為天然存在之鉸鏈，或一或多個aa已經取代、添加或缺失之天然存在之鉸鏈，其限制條件為該鉸鏈具有所要生 物性質。所要生物活性相對於天然存在之序列可為天然生物活性、增強之生物活性或降低之生物活性。
「IC50」或「IC50」係指提供最大活性(例如對刺激物之反應或組成性活性)之50%抑制的分子(例如PBA)之濃度，亦即使活性降至最大活性與基線之間的半程程度之濃度。IC50值可使用例如Cheng-Prusoff方程轉化為絕對抑制常數(Ki)。在受結合劑(諸如本文提供之抗體或雙特異性結合蛋白)抑制之系統中，IC50可能與EC50不可區分。
「IGF-1R」或「IGF1R」係指胰島素樣生長因子1(IGF-1，先前稱為促生長因子C(somatomedin C))之受體。IGF-1R亦結合胰島素樣生長因子2(IGF-2)且由胰島素樣生長因子2(IGF-2)活化。IGF1-R為受體酪胺酸激酶，其在受IGF-1或IGF-2活化後自體磷酸化。人類IGF-1R前驅體之aa序列以Genbank寄存編號NP_000866提供且指定基因ID：3480。
「IgG-(scFv)2」表示由具有兩個各自由IgG重鏈及IgG輕鏈構成之N端Fab結合位點之IgG組成的四價PBA，其中各重鏈之C端連接於由VH域與VL域構成之結合位點的scFv。當免疫球蛋白恆定區為IgG1之恆定區時，PBA稱為「IgG1-(scFv)2」。示範性IgG1-(scFv)2 PBA為四個結合位點包含兩個基本上相同之抗IGF-1R結合位點及兩個基本上相同之抗ErbB3結合位點者。下文在實施方式中在子標題「包含IgG1恆定區之示範性IGF-1R+ErbB3 PBA」 下所述之38個四價PBA(亦參見第5A及5B圖)各自包含兩個聯結之基本上相同之次單元，各次單元包含彼此經二硫鍵鍵結之重鏈及輕鏈，例如M7-G1-M78(SEQ ID NO：284及SEQ ID NO：262)、P4-G1-M1.3(SEQ ID NO：226及SEQ ID NO：204)及P4-G1-C8(SEQ ID NO：222及SEQ ID NO：204)，為該等IgG1-(scFv)2蛋白之示範性實施例。當免疫球蛋白恆定區為IgG2之恆定區時，蛋白質稱為「IgG2-(scFv)2」。示範性「IgG2-(scFv)2蛋白為ELI-7。當免疫球蛋白恆定區部分來自IgG1且部分來自IgG之另一同型(例如IgG2)時，蛋白質稱為例如「IgG1/2-(scFv)2」。
「免疫球蛋白恆定區」或「Ig恆定區」係指免疫球蛋白(亦即抗體)中其可變域以外之部分。在某些實施例中，免疫球蛋白恆定區包含「重鏈免疫球蛋白恆定區」及「輕鏈免疫球蛋白恆定區」。
生物活性受結合蛋白「抑制」係指生物活性由結合蛋白介導之任何可再現之可偵測降低。在一些實施例中，抑制使生物活性產生統計顯著性降低，例如生物活性相對於在不存在結合蛋白下測得之生物活性降低約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。
在提及聚核苷酸、多肽或蛋白質時之「經分離之」意謂該聚核苷酸、多肽或蛋白質實質上自在自然界中與其或其類似物伴隨出現之聚核苷酸、多肽、蛋白質或其他大分子移除。儘管術語「經分離」不欲要求特定純度， 但通常蛋白質將為至少約75%純，更佳為至少約80%純，更佳為至少約85%純，更佳為至少約90%純，更佳為至少約95%純，且最佳為至少約99%純。
與免疫球蛋白aa序列位置之指定有關之「Kabat」指示輕鏈恆定區(例如CL域)中之胺基酸位置係根據Kabat指數編號系統(參見Kabat等人，1991.,op.cit.)進行編號。
「連接於」在上下文中係指胺基酸或核苷酸之直接或間接連接或聯結。「間接連接」係指經由包含例如一或多個aa或核苷酸之連接子或域介導之連接。「直接連接」或「直接地連接」當提及兩個多肽區段時係指在該兩個多肽區段之間存在共價鍵，例如兩個多肽區段連續聯結而無插入序列。
「連接子」係指將兩個域或區連接在一起之一或多個aa。連接子可為可撓性的以允許由連接子連接之域形成適當三維結構，由此允許其具有所需生物活性。連接scFv之VH及VL之連接子在本文中稱為「scFv連接子」。連接VH域之N端或CH3域之C端與第二VH域(例如scFv之VH域)的連接子稱為「連接型連接子(connecting linker)」。
「模組」係指PBA中在結構上及/或功能上不同之部分，諸如結合位點(例如scFv域或Fab域)及Ig恆定域。本文提供之模組可與其他模組以大量組合重排(藉由重組核酸或完全或部分重新合成新聚核苷酸對其編碼序列進行重組)以產生廣泛多種PBA，例如如本文所揭示。舉 例而言，「SF」模組係指結合位點「SF」，亦即至少包含SF VH及SF VL域之CDR。「C8」模組係指結合位點「C8」。
「PBA」係指多價雙特異性抗體，其為包含至少兩個不同結合部分或域且因此包含至少兩個不同結合位點(例如兩個不同抗體結合位點)之人工雜交蛋白質，其中複數個結合位點中之一或多者例如經由肽鍵彼此共價連接。本文所述之較佳PBA為抗IGF-1R+抗ErbB3 PBA，其為包含一或多個特異性結合IGF-1R蛋白(例如人類IGF-1R蛋白)之第一結合位點及一或多個特異性結合ErbB3蛋白(例如人類ErbB3蛋白)之第二結合位點的多價雙特異性抗體。抗IGF-1R+抗ErbB3 PBA之命名與抗IGF-1R及抗ErbB3結合位點在分子中之方向無關，而在PBA名稱包含兩個由斜線(/)分開之抗原時，斜線左邊之抗原位於斜線右邊抗原之胺基端。PBA可為二價結合蛋白、三價結合蛋白、四價結合蛋白或具有4個以上結合位點之結合蛋白。示範性PBA為四價雙特異性抗體，亦即具有4個結合位點但僅結合兩種不同抗原或抗原決定基之抗體。示範性雙特異性抗體為四價「抗IGF-1R/抗ErbB3」PBA及「抗ErbB3/抗IGF-1R」PBA。通常，四價PBA之N端結合位點為Fab且C端結合位點為scFv。
「一致性百分比」或「一致性%」係指兩個或兩個以上核酸或多肽序列或子序列在將該兩個序列對準以獲得最大對應性且比較時相同(100%一致)或具有指定百分比之相同核苷酸或aa殘基。為對準以獲得最大對應性，可將 空隙引入所比較之一個序列中。接著比較相應位置上之aa殘基或核苷酸並定量。當第一序列中之位置由與第二序列中相應位置相同之殘基佔據時，則該等序列在彼位置一致。兩個序列之間的一致性百分比為該等序列所共享之一致位置之數目的函數(例如，一致性%=一致位置之數目/位置總數(例如重疊位置)×100)。在某些實施例中，兩個序列具有相同長度。一個序列與另一序列之實測一致性%的測定可使用數學算法進行測定。用於兩個序列之該比較之數學算法的一非限制性實例併入作為GCG序列比對軟體套件之一部分的ALIGN程式(2.0版)中。當利用ALIGN程式例如用於比較aa序列時，可使用PAM120加權殘基表、空隙長度罰分12及空隙罰分4。用於序列分析之其他算法在此項技術中為熟知的並且許多可在線上獲得。
參考部分之(例如域之)「部分」或「片段」係指完整參考部分(例如域，例如天然存在之域)中佔參考部分尺寸之至少或至多10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的離散部分。
「scFv連接子」係指插入scFv之VL與VH域之間的肽或多肽域。scFv連接子較佳允許VL及VH域之定向呈抗原結合構形。在一個實施例中，scFv連接子包含僅包含甘胺酸及絲胺酸之肽或多肽連接子(「Gly-Ser連接子」)或由其組成。在某些實施例中，scFv連接子包含二硫鍵。
「scFv蛋白」係指由包含一個輕鏈可變域(VL)及一個 重鏈可變域(VH)之單一多肽組成的結合蛋白，其中各可變域係來源於相同或不同抗體。scFv蛋白通常包含插入VH域與VL域之間的scFv連接子。ScFv蛋白在此項技術中為已知的且描述於例如美國專利第5,892,019號中。
「相似性」或「相似性百分比」在兩個或兩個以上多肽序列之情況下係指兩個或兩個以上序列或子序列在比較及對準以獲得最大對應性時具有指定百分比之相同或保守性取代的aa殘基。舉例而言，當第一aa序列與第二aa序列中與第一序列中所含數目相同數目之aa進行比較或與藉由此項技術中所已知之電腦相似性程式對準之多肽之對準進行比較，與第二aa序列至少50%、60%、70%、75%、80%、90%或甚至95%一致或保守性取代時，第一aa序列可視為與第二aa序列相似。該等術語亦適用於兩個或兩個以上聚核苷酸序列。
當提及結合位點與其目標抗原決定基或結合位點組合與其目標抗原決定基之結合時，「特異性結合(Specific binding)」、「特異性地結合(specifically binds)」、「選擇性結合(selective binding)」及「選擇性地結合(selectively binds)」以及「特異性地結合(binds specifically)」、「選擇性地結合(binds selectively)」意謂結合位點展現與目標抗原決定基之免疫特異性結合。特異性結合抗原決定基之結合位點對目標抗原決定基展現顯著親和力，且通常因其並不對任何不相關抗原決定基展現顯著親和力且較佳不對任何不相關抗原決定基展現等於、大於對目標抗 原決定基之親和力或比對目標抗原決定基之親和力低兩個數量級以內的親和力而展現與其他抗原決定基之交叉反應性。「顯著」或較佳結合包括解離常數「Kd」為10-8、10-9 M、10-10、10-11、10-12 M、10-13 M或Kd值甚至更低之結合。應注意，較低Kd(解離常數)值指示較高結合親和力，因此10-7之Kd為比10-8之Kd高的Kd值，但指示比10-8之Kd低的結合親和力。值為約10-7 M且甚至低至約10-8 M之解離常數為適於治療性抗體之解離常數之高端。結合親和力可由解離常數之範圍指示，例如10-5至10-12 M、10-7至10-12 M、10-8至10-12 M或更佳(亦即，或較低值解離常數)。奈莫耳濃度(10-9 M)至皮莫耳濃度(10-12 M)範圍內或更低之解離常數通常最適用於治療性抗體。適合解離常數為50 nM或50 nM以下之Kd(亦即結合親和力為50 nM或50 nM以上，例如Kd為45 nM)，或40 nM、30 nM、20 nM、10 nM、1 nm、100 pM、10 pM或1 pM或1 pM以下之Kd。特異性或選擇性結合可根據用於測定該種結合之此項技術中公認之方式，包括例如根據史卡查分析及/或競爭結合分析進行測定。
多價雙特異性抗體
本文提供多價雙特異性抗體(「PBA」)，其可為經分離之單株抗體。示範性PBA包含至少一個抗IGF-1R結合位點及至少一個抗ErbB3結合位點或至少兩個抗IGF-1R結合位點及至少兩個抗ErbB3結合位點。在一較佳實施例中，抗IGF-1R結合位點特異性結合人類IGF-1R且抗ErbB3 結合位點特異性結合人類ErbB3。在某些實施例中，PBA包含兩個彼此締合形成單一蛋白質之重鏈-輕鏈對，其中各重鏈-輕鏈對包含抗IGF-1R結合位點及抗ErB3結合位點。在某些實施例中，第一重鏈-輕鏈對之抗IGF-1R結合位點及抗ErbB3結合位點經由免疫球蛋白恆定區連接，該免疫球蛋白恆定區與另一重鏈-輕鏈對之免疫球蛋白恆定區締合(例如藉由二硫鍵)形成例如單一IgG樣蛋白質。如本文所述之較佳PBA具有有利性質，諸如與其經分離之抗IGF-1R結合部分或其經分離之抗ErbB3結合部分相比相等地或更有效地抑制腫瘤細胞增殖及降低或穩定腫瘤生長之能力，且在某些實施例中，抑制腫瘤侵襲力及腫瘤轉移中任一者或兩者之能力。本文所述之示範性PBA與其經分離之抗IGF-1R結合部分或其經分離之抗ErbB3結合部分相比可相等地或更有效地抑制IGF-1R及ErbB3介導之信號轉導中的任一者或兩者，諸如IGF-1R、ErbB3及AKT磷酸化。示範性PBA將(i)使腫瘤細胞生長抑制例如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或90%以上；或(ii)使IGF-1r、ErbB3或Akt磷酸化抑制例如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或90%以上，例如與其經分離之抗IGF-1R結合部分或其經分離之抗ErbB3結合部分相比程度類似或更有效，或(i)與(ii)兩者。示範性PBA將(iii)為穩定的，例如在溶液中在4℃、室溫或37℃下1、2、3、4、5天或5天以上後至少80%為單體，或(iv)具有至少50℃、 55℃、65℃或65℃以上之Tm(例如，如DSF所測定)，或(iii)與(iv)兩者。本文所述之PBA可用於例如治療患有癌症之個體。
在某些實施例中，PBA之免疫球蛋白恆定區可包含IgG重鏈之恆定區，其可包含Fc區。免疫球蛋白恆定域可以重鏈-輕鏈對形式存在，其重鏈Fc區可包含與另一該重鏈-輕鏈對之CH3域締合(例如藉由二硫鍵)之CH3域。免疫球蛋白恆定區部分亦可包含CH2域、鉸鏈及/或CH1域。如本文進一步描述，PBA之CH1、鉸鏈、CH2或CH3域各自可為天然存在之(或野生型)域，或其可因一或多個aa取代(例如保守性取代)、添加或缺失而與天然存在之域不同，其限制條件為特定域保留其所要生物活性，諸如CH3及CL締合活性中之任一者或兩者。存在時，CH1、鉸鏈、CH2及CH3域之順序較佳如其在天然情況下所存在為N端至C端，亦即CH1、鉸鏈、CH2、CH3。該等域可彼此直接或間接聯結或連接。間接連接為經由具有一或多個aa之連接子介導之連接。在一個實施例中，各CH域直接連接於其相鄰域。因此，在一個實施例中，CH1域以其C端連接於鉸鏈域之N端，該鉸鏈域以其C端連接於CH2域之N端，該CH2域以其C端連接於CH3域之N端。
某些PBA包含至少兩個抗IGF-1R及至少兩個抗ErbB3結合位點，各自分別與IGF-1R或ErbB3特異性結合。該等結合位點可為任何類型之免疫球蛋白來源之結合位點 或模擬結合位點，其限制條件為各結合位點特異性結合其各別目標。舉例而言，結合位點可為Fab域、scFv或單域抗體之片段。PBA之抗IGF-1R及抗ErbB3結合位點可為相同類型之結合位點或為不同類型。舉例而言，抗IGF-1R結合位點可為Fab且抗ErbB3結合位點可為scFv。或者，抗IGF-1R結合位點可為scFv且抗ErbB3結合位點可為Fab。在另一實施例中，一個抗ErbB3結合位點為Fab且另一抗ErbB3結合位點為scFv；在另一實施例中，一個抗IGF-1R結合位點為Fab且另一抗IGF-1R結合位點為scFv。在一些實施例中，第一及第二Fab分別連接至免疫球蛋白恆定區域之N端及C端。在一些實施例中，第一及第二scFv分別連接至免疫球蛋白恆定區域之N端及C端。在一些實施例中，至少一個Fab域連接至免疫球蛋白恆定區之N端(例如呈Fab及恆定區之天然排列)且至少一個scFv連接至免疫球蛋白恆定區之C端。在一些實施例中，至少一個scFv連接至免疫球蛋白恆定區之N端且至少一個Fab連接至免疫球蛋白恆定區之C端。Fab及scFv及抗IGF-1R及抗ErbB3雙特異性抗體之示範性排列闡述於表4中。
在某些實施例中，PBA之免疫球蛋白恆定區包含連接至第一重鏈可變域(VH)域之CH1域。舉例而言，CH1域可以N端連接於第一VH域之C端。
在某些實施例中，PBA之免疫球蛋白恆定區包含連接至第二VH域之CH3。當提及本文提供之基於IgG(例如來源於IgG或包含IgG恆定區之至少一部分及IgG)之PBA的第一及第二結合位點時，「第一」結合位點係指位於免疫球蛋白恆定區部分之N端的結合位點，而「第二」結合位點為位於免疫球蛋白恆定區部分之C端的結合位點。舉例而言，CH3域可以其C端連接於第二VH域之N端。CH3域可以其C端連接於連接子之N端，該連接子以其C端連接於第二VH域之N端。該連接子可適用於提供恆定免疫球蛋白區與第二VH域之間的可撓性，以使得可獲得適當三維結構以允許蛋白質具有生物活性。
在某些實施例中，PBA包含兩個作為如抗體中通常所發現之抗原結合位點的結合位點(亦即其包含兩個Fab)。該等PBA通常包含兩條輕鏈，其中各輕鏈包含與兩條重鏈各自之VH域締合(例如藉由二硫鍵鍵結)以形成兩個結合位點之輕鏈可變(VL)域。VL域可連接於恆定輕鏈(CL)域且形成輕鏈Fab區。舉例而言，VL域可以其C端連接於CL域之N端。在第一與第二結合位點為Fab之實施例中，PBA具有兩條不同輕鏈，稱為第一及第二輕鏈，其中第一及第二輕鏈分別包含第一及第二VL域，且視情況分別包含第一及第二CL域，且分別與第一及第二VH域 且視情況與第一及第二CH1域締合(例如二聚化)。
在PBA包含一或多個scFv之實施例中，各scFv之VH域連接於scFv連接子，該scFv連接子連接於VL域，且VH域與VL域彼此締合形成抗原結合位點。在一個實施例中，VH域以其C端連接於scFv連接子之N端，該scFv連接子以其C端連接於VL域之N端。在一個scFv連接於免疫球蛋白恆定區之N端且一個scFv連接於其C端之實施例中，免疫球蛋白恆定區之N端連接於第一VH域，該第一VH域連接於第一scFv連接子，該第一scFv連接子連接於第一VL域，且該第一VH域與該第一VL域形成第一結合位點；且免疫球蛋白恆定區之C端連接於第二VH域，該第二VH域連接於第二scFv連接子，該第二scFv連接子連接於第二VL域，且該第二VH域與該第二VL域形成第二結合位點且兩個該等免疫球蛋白恆定區二聚化或以其他方式締合(例如藉由至少一個鍵，例如二硫鍵或范德華鍵)以形成單一四價蛋白質。
在較佳實施例中，免疫球蛋白恆定區為人類免疫球蛋白恆定區，亦即其基本上由獲自人類免疫球蛋白譜系之aa序列組成。免疫球蛋白恆定區可為任何免疫球蛋白同型、類別或子類之恆定區。在一個實施例中，免疫球蛋白恆定區為IgG恆定區，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區。在某些實施例中，恆定區為由至少兩種不同類別或子類或類型之免疫球蛋白構成之雜交體。舉例而言，免疫球蛋白恆定區可具有一個來自IgG1之域及一或多個 來自IgG4蛋白之其他域。如本文進一步描述，在某些實施例中，免疫球蛋白恆定區內之域(例如CH1、鉸鏈、CH2或CH3)可主要來自免疫球蛋白之一種同型，但可具有一或多個aa突變(例如取代、添加或缺失)，例如以提供歸屬於另一類型或類別之免疫球蛋白恆定區的突變型免疫球蛋白恆定區。
在某些實施例中，PBA具有IgG-(scFv)2結構。該等蛋白質包含具有兩個第一結合位點之IgG抗體，具有第二結合位點之scFv連接於該IgG抗體，例如連接於IgG蛋白之兩個C端中之每一者。示範性IgG-(scFv)2為IgG1-(scFv)2，其中IgG為IgG1。
在某些實施例中，PBA包含具有由scFv-Fc-scFv表示之結構的重鏈且該PBA可具有結構(scFv-Fc-scFv)2。Fc可為包含鉸鏈、CH2及CH3域之Fc區。在某些實施例中，該等蛋白質不包含CH1或CL域。
在一個實施例中，PBA包含兩個相同之形成IgG樣分子之重鏈-輕鏈對，其中各對包含一個為抗IGF-1R Fab之結合部分及另一為抗ErbB3 scFv之結合部分，且其中該兩個結合部分經由免疫球蛋白恆定區連接，該免疫球蛋白恆定區按N端至C端順序包含鉸鏈域、CH2域及CH3域。scFv可經由連接子連接於CH3域。在一示範性實施例中，PBA包含形成二聚體之兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈，其中各輕鏈與重鏈締合，且其中各重鏈包含：第一VH域，該第一VH域以其C端連接於CH1域之N端， 該CH1域以其C端連接於鉸鏈域之N端，該鉸鏈域以其C端連接於CH2域之N端，該CH2域以其C端連接於CH3域之N端，該CH3域以其C端連接於連接子之N端，該連接子以其C端連接於第二VH域之N端，該第二VH域以其C端連接於scFv連接子之N端，該scFv連接子以其C端連接於第二VL域之N端，該第二VL域與該第二VH域締合形成第二結合位點；且其中各輕鏈包含第一VL域，該第一VL域以其C端連接於CL域之N端，其中該VH域與該第一VL域形成第一結合位點。在一個實施例中，第一結合位點為抗IGF-1R結合位點且第二結合位點為抗ErbB3結合位點。在另一實施例中，第一結合位點為抗ErbB3結合位點且第二結合位點為抗IGF-1R結合位點。
在某些實施例中，PBA包含含有由SEQ ID NO：304中所述之一致序列組成之VHCDR3及視情況存在之分別由SEQ ID NO：302及303中所述之一致序列組成之VHCDR1及/或VHCDR2的IGF-1R結合位點(參見第1圖)。在某些實施例中，SEQ ID NO：304之最末(C端)X aa不為I。PBA亦可包含含有由SEQ ID NO：307中所述之一致序列組成之VLCDR3及視情況存在之分別由SEQ ID NO：305及306中所述之序列組成之VHCDR1及VHCDR2中任一者或兩者的抗IGF-1R結合位點(參見第2圖)。在某些實施例中，PBA包含含有分別由SEQ ID NO：302、303、304、305、306及307(或308)中所述之一致序列組成之VHCDR1、 VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3的抗IGF-1R結合位點。
在某些實施例中，PBA包含含有由SEQ ID NO：311中所述之一致序列組成之VHCDR3及視情況存在之分別由SEQ ID NO：309及310中所述之序列組成之VHCDR1及/或VHCDR2的抗ErbB3結合位點(參見第3圖)。PBA亦可包含含有由SEQ ID NO：314或315中所述之一致序列組成之VLCDR3及視情況存在之分別由SEQ ID NO：312及313中所述之序列組成之VHCDR1及/或VHCDR2的抗IGF-1R結合位點(參見第4圖)。在某些實施例中，PBA包含含有分別由SEQ ID NO：309、310、311、312、313及314(或315)中所述之序列組成之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3的抗IGF-1R結合位點。
SEQ ID NO：302-315之序列闡述如下：抗IGF-1R CDR
VHCDR1一致序列：GFX1FSX2YPMH(SEQ ID NO：302)
VHCDR2一致序列：ISX1X2GGATX3YADSVKG(SEQ ID NO：303)
VHCDR3一致序列：DFYX1X2LTGNAFDX3(SEQ ID NO：304)
VLCDR1序列：RASQGISSYLA(SEQ ID NO：305)
VLCDR2一致序列：AX1STX2QS(SEQ ID NO：306)
VLCDR3一致序列：QQYX1X2X3PLT(SEQ ID NO：307)及QQYWX1X2PLT(SEQ ID NO：308)
抗ErbB3 CDR
VHCDR1序列：GFTFDDYAMH(SEQ ID NO：309)
VHCDR2一致序列：ISWX1SGSX2GYADSVKG(SEQ ID NO：310)
VHCDR3一致序列：DLGX1X2QWX3X4GFDY(SEQ ID NO：311)
VLCDR1序列：QGDSLRSYYAS(SEQ ID NO：312)
VLCDR2序列：GKNNRPS(SEQ ID NO：313)
VLCDR3一致序列：X1SRDX2X3GX4X5WV(SEQ ID NO：314)及X1SRDX2PGX3X4WV(SEQ ID NO：315)
之後接有數字之各aa「X」為可變aa，其獨立地表示任何aa，諸如位於第1、2、3或4圖中相應位置之任何aa。SEQ ID NO：302之X1-X2、SEQ ID NO：303之X1-X2及SEQ ID NO：304之X1-X3之示範性胺基酸提供於第1圖中aa序列中的相應位置處。SEQ ID NO：306之X1-X2、SEQ ID NO：307之X1-X3及SEQ ID NO：308之X1-X2之示範性胺基酸提供於第2圖中aa序列中的相應位置處。SEQ ID NO：310之X1-X2及SEQ ID NO：311之X1-X4之示範性胺基酸提供於第3圖中aa序列中的相應位置處。SEQ ID NO：314之X1-X5或SEQ ID NO：315之X1-X4之示範性胺基酸提供於第4圖中aa序列中的相應位置處。
示範性PBA包含含有分別由SEQ ID NO：302、303、304、305、306及307(或308)中所述之序列組成之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3的抗IGF-1R結合位點及含有分別由SEQ ID NO：309、310、311、312、 313及314(或315)中所述之序列組成之VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3的抗ErbB3結合位點。
示範性PBA包含一或多個來自第1-4圖中提供之一或多個可變區的CDR。在某些實施例中，抗IGF-1R結合位點包含1、2或3個第1圖中所示之VH域之一的CDR及/或1、2或3個第2圖中所示之VL域之一的CDR。舉例而言，抗IGF-1R結合部分可包含來自SEQ ID NO：11之CDR1、CDR2及/或CDR3及/或來自SEQ ID NO：35之CDR1、CDR2及/或CDR3(16F之CDR)。在某些實施例中，抗IGF-1R結合部分包含第1及2圖中所示之CDR之組合，其限制條件為(亦即其中)(i)結合部分不為16F之結合部分，或(ii)抗IGF-1R結合實體之CDR中之1、2、3、4、5或6者不存在於16F之抗IGF-1R結合實體中，或(iii)抗IGF-1R結合實體之VH或VL域分別與16F中之相應VH或VL域不同。
示範性PBA包含含有包含第1圖中之序列(例如SEQ ID NO：8、9、10及11中之一者)中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列之VH域的抗IGF-1R結合實體(該等CDR之位置展示於第1圖中)。PBA亦可包含含有包含SEQ ID NO：32、33、34及35中之一者中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列之VL域的抗IGF-1R結合實體(該等CDR之位置展示於第2圖中)。在某些實施例中，PBA包含含有包含SEQ ID NO：8、9、10及11中之一者中所述之 VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列的VH域及包含SEQ ID NO：32、33、34及35中之一者中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列的VL域的抗IGF-1R結合實體。在特定實施例中，抗IGF-1R結合域包含含有SEQ ID No：8中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列的VH域及含有SEQ ID No：32中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列的VL域。在特定實施例中，抗IGF-1R結合域包含含有SEQ ID No：9中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列的VH域及含有SEQ ID No：33中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列的VL域。在特定實施例中，抗IGF-1R結合域包含含有SEQ ID No：10中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列的VH域及含有SEQ ID No：34中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列的VL域。在特定實施例中，抗IGF-1R結合域包含含有SEQ ID No：11中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列的VH域及含有SEQ ID No：35中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列的VL域。在特定實施例中，抗IGF-1R結合域包含含有SEQ ID No：8中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列的VH域及含有SEQ ID No：33中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列的VL域。在特定實施例中，抗IGF-1R結合域包含含有SEQ ID No：10中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列的VH域及含有SEQ ID No：32中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列的VL域。 在某些實施例中，抗ErbB3結合位點包含1、2或3個第3圖中所示之VH域之一的CDR及/或1、2或3個第4圖中所示之VL域之一的CDR。舉例而言，抗ErbB3結合部分可包含來自SEQ ID NO：143之CDR1、CDR2及/或CDR3及/或來自SEQ ID NO：175之CDR1、CDR2及/或CDR3(16F之CDR)。在某些實施例中，抗ErbB3結合部分包含第1及2圖中所示之CDR之組合，其限制條件為(亦即其中)(i)結合部分不為16F之結合部分，或(ii)抗抗ErbB3結合實體之CDR中之1、2、3、4、5或6者不存在於16F之抗ErbB3結合實體中，或(iii)抗IGF-1R結合實體之VH或VL域分別與16F中之相應VH或VL域不同。
示範性PBA包含含有包含第3圖中之序列(例如SEQ ID NO：134-143中之一者)中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列之VH域的抗ErbB3結合實體(該等CDR之位置展示於第3圖中)。PBA亦可包含含有包含SEQ ID NO：166-175中之一者中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列之VL域的抗ErbB3結合實體(該等CDR之位置提供於第4圖中)。在某些實施例中，PBA包含含有包含SEQ ID NO：134-143中之一者中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列的VH域及包含SEQ ID NO：166-175中之一者中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列的VL域的抗ErbB3結合實體。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：134中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列的VH域及含有 SEQ ID No：166中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列的VL域。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：135中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列的VH域及含有SEQ ID No：167中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列的VL域。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：136中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列的VH域及含有SEQ ID No：168中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列的VL域。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：137中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列的VH域及含有SEQ ID No：169中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列的VL域。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：138中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列的VH域及含有SEQ ID No：170中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列的VL域。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：139中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列的VH域及含有SEQ ID No：171中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列的VL域。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：140中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列的VH域及含有SEQ ID No：172中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列的VL域。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：141中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列的 VH域及含有SEQ ID No：173中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列的VL域。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：142中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列的VH域及含有SEQ ID No：174中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列的VL域。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：143中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列的VH域及含有SEQ ID No：175中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列的VL域。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：136中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列的VH域及含有SEQ ID No：169中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列的VL域。
結合位點亦可包含第1-4圖中所示之可變區之一或多個CDR，其中1、2或3個aa已經改變，例如取代、添加或缺失，其限制條件為該等結合位點仍能夠特異性結合其目標。
在某些實施例中，抗IGF-1R結合位點包含含有以下一致序列之VH域：
該一致序列藉由比對24個高親和力抗IGF-1R結合位點之VH序列而獲得。比對展示於第1圖中。
在某些實施例中，SEQ ID NO：1之aa X1-X11各自獨立地表示任何aa。在其他實施例中，SEQ ID NO：1之aa X1-X11各自獨立地表示在第1圖之任何序列中之彼等位置上所示之任何aa。在一個該實施例中，X1為T，X2為V，X3為S，X4為S，X5為S，X6為R，X7為A，X8為D，X9為I，X10為I，且X11為T(SF重鏈16F；SEQ ID NO：11)。示範性IGF-1R VH序列闡述為SEQ ID NO：8-31。
在某些實施例中，抗IGF-1R結合位點之VH域包含SEQ ID NO：1中所述之一致序列，其限制條件為(亦即其中)該序列不為SF重鏈16F之序列，例如有至少一個aa不同。在某些實施例中，抗IGF-1R結合位點之VH域包含SEQ ID NO：1中所述之一致序列，其限制條件為(亦即其中)X1不為T，X2不為V，X6不為R，X8不為D或X10不為I。
示範性抗IGF-1R VH序列闡述為SEQ ID NO：8-10及12-31。
在某些實施例中，抗IGF-1R結合位點包含含有以下一致序列之VL域：
該一致序列藉由比對約100個高親和力抗IGF-1R結合位點之VL序列而獲得。比對展示於第2圖中。
在某些實施例中，SEQ ID NO：2之胺基酸X1-X10各自獨立地表示任何aa。在其他實施例中，SEQ ID NO：2之aa X1-X10各自獨立地表示在第2圖之任何序列中之彼等位置上所示之任何aa。在一個該實施例中，X1為M，X2為T，X3為A，X4為L，X5為D，X6為F，X7為A，X8為F，X9為T，且X10為F(SF κ輕鏈16F；SEQ ID NO：35)。示範性IGF-1R VL序列闡述為SEQ ID NO：32-133。
在某些實施例中，抗IGF-1R結合位點之VL域包含SEQ ID NO：2中所述之一致序列，其限制條件為(亦即其中)該序列不為SF輕鏈16F之序列，例如有至少一個aa不同。在某些實施例中，抗IGF-1R結合位點之VL域包含SEQ ID NO：2中所述之一致序列，其限制條件為(亦即其中)X2不為T，X6不為F，或X8不為F。當X2不為T，X6不為F，及/或X8不為F時，X2可為L，X6可為F，及/或X8可為F，如以下一致序列中所述：
在某些實施例中，抗IGF-1R結合位點之VL域包含SEQ ID NO：3中所述之一致序列，其中SEQ ID NO：3之aa X1-X7各自獨立地表示任何aa。在其他實施例中，SEQ ID NO：3之aa X1-X7各自獨立地表示在第2圖之任何序列中之彼 等位置上所示之任何aa。示範性IGF-1R VL序列闡述為SEQ ID NO：32-34及36-133。
在某些實施例中，抗ErbB3結合位點包含含有以下一致序列之VH域：
該一致序列藉由比對32個高親和力抗IGF-1R結合位點之VH序列而獲得。比對展示於第3圖中。
在某些實施例中，SEQ ID NO：4之aa X1-X12各自獨立地表示任何aa。在其他實施例中，SEQ ID NO：4之aa X1-X12各自獨立地表示在第3圖之任何序列中之彼等位置上所示之任何aa。在一個該實施例中，X1為Q，X2為Q，X3為G，X4為A，X5為N，X6為I，X7為P，X8為V，X9為Y，X10為N，X11為V，且X12為E(C8重鏈16F；SEQ ID NO：143)。示範性ErbB3 VH序列闡述為SEQ ID NO：134-165。
在某些實施例中，抗ErbB3結合位點之VH域包含SEQ ID NO：4中所述之一致序列，其限制條件為(亦即其中)該序列不為C8重鏈16F之序列，例如有至少一個aa不同。在某些實施例中，抗ErbB3結合位點之VH域包含SEQ ID NO：4中所述之一致序列，其限制條件為(亦即其中)aa X7不為P，或X8不為V。當X7不為P及/或X8不為V時，X7可為A及/或X8可為L，如以下一致序列中所述：
在某些實施例中，抗ErbB3結合位點之VH域包含SEQ ID NO：5中所述之一致序列，其中SEQ ID NO：5之aa X1-X10各自獨立地表示任何aa。在其他實施例中，SEQ ID NO：5之aa X1-X10各自獨立地表示在第3圖之任何序列中之彼等位置上所示之任何aa。示範性ErbB3 VH序列闡述為SEQ ID NO：134-142及144-165。
在某些實施例中，抗ErbB3結合位點包含含有以下一致序列之VL域：
該一致序列藉由比對35個高親和力抗IGF-1R結合位點之VL序列而獲得。比對展示於第4圖中。
在某些實施例中，SEQ ID NO：6之aa X1-X9各自獨立地 表示任何aa。在其他實施例中，SEQ ID NO：6之aa X1-X10各自獨立地表示在第4圖之任何序列中之彼等位置上所示之任何aa。在一個實施例中，X1為Y，X2為T，X3為S，X4為N，X5為S，X6為S，X7為N，X8為H，且X9為L(C8 λ輕鏈16F；SEQ ID NO：175)。示範性ErbB3 VL序列闡述為SEQ ID NO：166-200。
在某些實施例中，抗ErbB3結合位點之VL域包含SEQ ID NO：6中所述之一致序列，其限制條件為(亦即其中)該序列不為C8 λ輕鏈16F之序列，例如有至少一個aa不同。在某些實施例中，抗ErbB3結合位點之VL域包含SEQ ID NO：6中所述之一致序列，其限制條件為(亦即其中)X6不為S。當X6不為S時，X6可為P，如以下一致序列中所述：
在某些實施例中，抗ErbB3結合位點之VL域包含SEQ ID NO：7中所述之一致序列，SEQ ID NO：7之aa X1-X8各自獨立地表示任何aa。在其他實施例中，SEQ ID NO：7之aa X1-X8各自獨立地表示在第4圖之任何序列中之彼等位置上所示之任何aa。示範性ErbB3 VL序列闡述為SEQ ID NO：166-174及176-200。
示範性抗IGF-1R VH域包括M57 VH域(SEQ ID NO：8)、M78 VH域(SEQ ID NO：9)、P4 VH域(SEQ ID NO：10)及SF VH域(SEQ ID NO：11)。示範性抗IGF-1R VL域包括M57 VL域(SEQ ID NO：32)、M78 VL域(SEQ ID NO：33)、P4 VL域(SEQ ID NO：34)及SF VL域(SEQ ID NO：35)。
示範性抗ErbB3 VH域包括B60 VH域(SEQ ID NO：134)、B72 VH域(SEQ ID NO：135)、M27 VH域(SEQ ID NO：136)、M7 VH域(SEQ ID NO：137)、P1 VH域(SEQ ID NO：138)、M27 VH域(SEQ ID NO：139)、B69 VH域(SEQ ID NO：140)、P6 VH域(SEQ ID NO：141)、M1.3 VH域(SEQ ID NO：142)及C8 VH域(SEQ ID NO：143)。示範性抗ErbB3 VL域包括B60 VL域(SEQ ID NO：166)、B72 VL域(SEQ ID NO：167)、M27 VL域(SEQ ID NO：168)、M7 VL域(SEQ ID NO：169)、P1 VL域(SEQ ID NO：170)、M27 VL域(SEQ ID NO：171)、B69 VL域(SEQ ID NO：172)、P6 VL域(SEQ ID NO：173)、M1.3 VL域(SEQ ID NO：174)及C8 VL域(SEQ ID NO：175)。
結合位點可包含具有相同模組名稱(例如「M57」、「M78」及「P4」)之VH及VL域，亦即其為其最初分離之結合位點之抗體之VH及VL域，或其可混合及匹配。舉例而言，抗IGF-1R結合部分可包含：(i)模組M57之VH域(SEQ ID NO：8)及模組M57之VL域(SEQ ID NO：32)；模組M78之VH域(SEQ ID NO：9)及模組M78之VL域(SEQ ID NO：33)；(iii)模組P4之VH域(SEQ ID NO：10)及模組P4之VL域(SEQ ID NO：34)；(iv)模組SF之VH域(SEQ ID NO：11)及模組SF之VL域(SEQ ID NO：35)。抗ErbB3結合部分可包含：(i)模組B60之VH域(SEQ ID NO：134)及模組B60之VL域(SEQ ID NO：166)；(ii)模組B72之VH域(SEQ ID NO：135)及模組B72之VL域(SEQ ID NO：167)；(iii)模組M27之VH域(SEQ ID NO：136)及模組M27之VL域(SEQ ID NO：168)；(iv)模組M7之VH域(SEQ ID NO：137)及模組M7之VL域(SEQ ID NO：169)；(v)模組P1之VH域(SEQ ID NO：138)及模組P1之VL域(SEQ ID NO：170)；(vi)模組M27之VH域(SEQ ID NO：139)及模組M27之VL域(SEQ ID NO：171)；(vii)模組B69之VH域(SEQ ID NO：140)及模組B69之VL域(SEQ ID NO：172)；(viii)模組P6之VH域(SEQ ID NO：141)及模組P6之VL域(SEQ ID NO：173)；(ix)模組M1.3之VH域(SEQ ID NO：142)及模組M1.3之VL域(SEQ ID NO：174)；及(x)模組C8之VH域(SEQ ID NO：143)及模組C8之VL域(SEQ ID NO：175)。
PBA之結合部分亦可包含混合及匹配之VH及VL域，亦即結合部分可包含來自一個模組之VH域及來自另一模組之VL域。舉例而言，抗IGF-1R結合部分可包含模組M57之VH域(SEQ ID NO：8)及模組M78之VL域(SEQ ID NO：33)或模組P4之VH域(SEQ ID NO：10)及模組M57之 VL域(SEQ ID NO：32)。抗ErbB3結合部分可包含模組M27之VH域(SEQ ID NO：136)及模組M7之VL域(SEQ ID NO：169；參見例如實例7)。以高親和力結合目標之混合鏈結合部分為較佳。
PBA亦可包含屬□本文所述之IGF-1R VH(SEQ ID NO：1)、IGF-1R VL(SEQ ID NO：2)、ErbB3 VH(SEQ ID NO：4)及ErbB3 VL(SEQ ID NO：6)一致序列中一種以上的aa序列，其限制條件為該PBA特異性結合IGF-1R及ErbB3。舉例而言，PBA可包含以下任一者：-包含SEQ ID NO：1之IGF-1R VH域及包含SEQ ID NO：2之IGF-1R VL域；-包含SEQ ID NO：1之IGF-1R VH域及包含SEQ ID NO：4之ErbB3 VH域；-包含SEQ ID NO：1之IGF-1R VH域及包含SEQ ID NO：6之ErbB3 VL域；-包含SEQ ID NO：1之IGF-1R VH域、包含SEQ ID NO：2之IGF-1R VL域及包含SEQ ID NO：4之ErbB3 VH域；-包含SEQ ID NO：1之IGF-1R VH域、包含SEQ ID NO：2之IGF-1R VL域及包含SEQ ID NO：6之ErbB3 VL域；-包含SEQ ID NO：1之IGF-1R VH域、包含SEQ ID NO：2之IGF-1R VL域、包含SEQ ID NO：4之ErbB3 VH域及包含SEQ ID NO：6之ErbB3 VL域；-包含SEQ ID NO：2之IGF-1R VL域及包含SEQ ID NO：4 之ErbB3 VH域；-包含SEQ ID NO：2之IGF-1R VL域及包含SEQ ID NO：6之ErbB3 VL域；-包含SEQ ID NO：2之IGF-1R VL域、包含SEQ ID NO：4之ErbB3 VH域及包含SEQ ID NO：6之ErbB3 VL域；或-包含SEQ ID NO：4之ErbB3 VH域及包含SEQ ID NO：6之ErbB3 VL域；其中可變aa獨立地為任何aa，或其中可變aa獨立地為第1-4圖中所示之該等一致序列各自之相應位置上所示的任何aa，其限制條件為該PBA特異性結合IGF-1R及ErbB3。
PBA亦可包含屬□本文所述之IGF-1R VH(SEQ ID NO：1)、IGF-1R VL(SEQ ID NO：2)、ErbB3 VH(SEQ ID NO：4)及ErbB3 VL(SEQ ID NO：6)一致序列中一種以上的aa序列，其限制條件為該PBA特異性結合IGF-1R及ErbB3，其限制條件為(亦即其中)該PBA不為16F。舉例而言，PBA亦可包含屬□本文所述之IGF-1R VH(SEQ ID NO：1)、IGF-1R VL(SEQ ID NO：3)、ErbB3 VH(SEQ ID NO：5)及ErbB3 VL(SEQ ID NO：7)一致序列中一種以上的aa序列，其限制條件為其特異性結合IGF-1R及ErbB3。舉例而言，PBA可包含：-包含SEQ ID NO：1之IGF-1R VH域及包含SEQ ID NO：3之IGF-1R VL域；-包含SEQ ID NO：1之IGF-1R VH域及包含SEQ ID NO：5 之ErbB3 VH域；-包含SEQ ID NO：1之IGF-1R VH域及包含SEQ ID NO：7之ErbB3 VL域；-包含SEQ ID NO：1之IGF-1R VH域、包含SEQ ID NO：3之IGF-1R VL域及包含SEQ ID NO：5之ErbB3 VH域；-包含SEQ ID NO：1之IGF-1R VH域、包含SEQ ID NO：3之IGF-1R VL域及包含SEQ ID NO：7之ErbB3 VL域；-包含SEQ ID NO：1之IGF-1R VH域、包含SEQ ID NO：3之IGF-1R VL域、包含SEQ ID NO：5之ErbB3 VH域及包含SEQ ID NO：7之ErbB3 VL域；-包含SEQ ID NO：3之IGF-1R VL域及包含SEQ ID NO：5之ErbB3 VH域；-包含SEQ ID NO：3之IGF-1R VL域及包含SEQ ID NO：7之ErbB3 VL域；-包含SEQ ID NO：3之IGF-1R VL域、包含SEQ ID NO：5之ErbB3 VH域及包含SEQ ID NO：7之ErbB3 VL域；或-包含SEQ ID NO：5之ErbB3 VH域及包含SEQ ID NO：7之ErbB3 VL域；其中可變aa獨立地為任何aa，或其中可變aa獨立地為第1-4圖中所示之該等一致序列各自之相應位置上所示的任何aa，其限制條件為該PBA特異性結合IGF-1R及ErbB3。
示範性PBA包含含有包含第1圖中之aa序列(例如SEQ ID NO：8、9、10及11中之一者中所述之aa序列)之VH域的抗IGF-1R結合實體。PBA亦可包含含有包含第2圖中之aa序列(例如SEQ ID NO：32、33、34及35中之一者中所述之aa序列)之VL域的抗IGF-1R結合實體。在某些實施例中，PBA包含含有包含SEQ ID NO：8、9、10及11中之一者中所述之aa序列的VH域及包含SEQ ID NO：32、33、34及35中之一者中所述之aa序列的VL域的抗IGF-1R結合實體。在特定實施例中，抗IGF-1R結合域包含含有SEQ ID No：8中所述之aa序列的VH域及含有SEQ ID No：32中所述之aa序列的VL域。在特定實施例中，抗IGF-1R結合域包含含有SEQ ID No：9中所述之aa序列的VH域及含有SEQ ID No：33中所述之aa序列的VL域。在特定實施例中，抗IGF-1R結合域包含含有SEQ ID No：10中所述之aa序列的VH域及含有SEQ ID No：34中所述之aa序列的VL域。在特定實施例中，抗IGF-1R結合域包含含有SEQ ID No：11中所述之aa序列的VH域及含有SEQ ID No：35中所述之aa序列的VL域。在特定實施例中，抗IGF-1R結合域包含含有SEQ ID No：8中所述之aa序列的VH域及含有SEQ ID No：33中所述之aa序列的VL域。在特定實施例中，抗IGF-1R結合域包含含有SEQ ID No：10中所述之aa序列的VH域及含有SEQ ID No：32中所述之aa序列的VL域。
示範性PBA包含含有包含SEQ ID NO：134-143中之一者中所述之aa序列之VH域的抗ErbB3結合實體。PBA亦 可包含含有包含SEQ ID NO：166-175中之一者中所述之aa序列之VL域的抗ErbB3結合實體。在某些實施例中，PBA包含含有包含SEQ ID NO：134-143中之一者中所述之aa序列的VH域及包含SEQ ID NO：166-175中之一者中所述之aa序列的VL域的抗ErbB3結合實體。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：134中所述之aa序列的VH域及含有SEQ ID No：166中所述之aa序列的VL域。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：135中所述之aa序列的VH域及含有SEQ ID No：167中所述之aa序列的VL域。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：136中所述之aa序列的VH域及含有SEQ ID No：168中所述之aa序列的VL域。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：137中所述之aa序列的VH域及含有SEQ ID No：169中所述之aa序列的VL域。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：138中所述之aa序列的VH域及含有SEQ ID No：170中所述之aa序列的VL域。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：139中所述之aa序列的VH域及含有SEQ ID No：171中所述之aa序列的VL域。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：140中所述之aa序列的VH域及含有SEQ ID No：172中所述之aa序列的VL域。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：141中所述之aa序列的VH域及含有SEQ ID No：173中所述之aa序列的VL域。在特 定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：142中所述之aa序列的VH域及含有SEQ ID No：174中所述之aa序列的VL域。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：143中所述之aa序列的VH域及含有SEQ ID No：175中所述之aa序列的VL域。在特定實施例中，抗ErbB3結合域包含含有SEQ ID No：136中所述之aa序列的VH域及含有SEQ ID No：169中所述之aa序列的VL域。
在一示範性實施例中，PBA包含含有免疫球蛋白恆定區之重鏈，該免疫球蛋白恆定區包含以下、基本上由以下組成或由以下組成：IgG1之CH1域、鉸鏈、CH2域及CH3域(稱為「IgG1恆定區」)。示範性PBA包含IgG1恆定區及以下aa序列中之一或多者：包含SEQ ID NO：1中所述之一致序列的IGF-1R VH域；包含SEQ ID NO：2中所述之一致序列的IGF-1R VL域；包含SEQ ID NO：4中所述之一致序列的ErbB3 VH域；及包含SEQ ID NO：6中所述之一致序列的ErbB3 VL域，且包含含有第5A、5B、7A及7B圖中所示之重鏈及輕鏈aa序列的PBA。
其他示範性PBA包含含有IgG1恆定區及以下aa序列中之一或多者的重鏈：包含SEQ ID NO：1中所述之一致序列的IGF-1R VH域；包含SEQ ID NO：3中所述之一致序列的IGF-1R VL域；包含SEQ ID NO：5中所述之一致序列的ErbB3 VH域；及包含SEQ ID NO：7中所述之一致序列的 ErbB3 VL域，且包含含有第5A及5B圖中所示之重鏈及輕鏈aa序列但排除16個重鏈及輕鏈的PBA。
包含本來以離胺酸或精胺酸結尾之羧基端的PBA之羧基端aa可能經羧肽酶修剪。為避免此現象，在該羧基端上添加一或多個aa可為有益的。舉例而言，當蛋白質本來在其羧基端上具有「VEIK」時，可向羧基端添加1、2、3、4、5個或5個以上胺基酸以防止離胺酸移除。在某些實施例中，該等額外aa可來源於CL域。因此，舉例而言，在PBA結束於以「VEIK」結尾之抗IGF-1R VL序列之情況下，可在羧基端上添加aa「RT」(參見例如P1-G1-P4；SEQ ID NO：268)。
抗IGF-1R/ErbB3 PBA可包含含有選自由以下重鏈融合物(雜交體)組成之群之aa序列的重鏈：SF-G1-C8(亦即16F；SEQ ID NO：210)；SF-G1-P1(SEQ ID NO：212)；SF-G1-M1.3(SEQ ID NO：214)；SF-G1-M27(SEQ ID NO：216)；SF-G1-P6(SEQ ID NO：218)；SF-G1-B69(SEQ ID NO：220)；P4-G1-C8(SEQ ID NO：222)；P4-G1-P1(SEQ ID NO：224)；P4-G1-M1.3(SEQ ID NO：226)；P4-G1-M27(SEQ ID NO：228)；P4-G1-P6(SEQ ID NO：230)；P4-G1-B69(SEQ ID NO：232)；M78-G1-C8(SEQ ID NO：234)；M78-G1-P1(SEQ ID NO：236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO：238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO：240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO：242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO：244)；M57-G1-C8(SEQ ID NO：246)；M57-G1-P1(SEQ ID NO：248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO：250)；M57-G1-M27(SEQ ID NO：252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO：254)及M57-G1-B69(SEQ ID NO：256)。抗IGF-1R/ErbB3 PBA可包含含有選自由以下κ輕鏈組成之群之aa序列的輕鏈：SF(SEQ ID NO：202)；P4(SEQ ID NO：204)；M78(SEQ ID NO：206)；及M57(SEQ ID NO：208)。
抗ErbB3/IGF-1R PBA可包含含有選自由以下重鏈融合物(雜交體)組成之群之aa序列的重鏈：P1-G1-P4(SEQ ID NO：268)；P1-G1-M57(SEQ ID NO：270)；P1-G1-M78(SEQ ID NO：272)；M27-G1-P4(SEQ ID NO：274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO：276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO：278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO：280)；M7-G1-M57(SEQ ID NO：282)；M7-G1-M78(SEQ ID NO：284)；B72-G1-P4(SEQ ID NO：286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO：288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO：290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO：292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO：294)；B60-G1-M78(SEQ ID NO：296)；B60-G2-M78(SEQ ID NO：355)及M7-G2-M78(SEQ ID NO：357)。抗ErbB3/IGF-1R PBA可包含含有選自由以下λ輕鏈組成之群之aa序列的輕鏈：P1(SEQ ID NO：258)、M27(SEQ ID NO：260)、M7(SEQ ID NO：262)、B72(SEQ ID NO：264)及B60(SEQ ID NO：266)。
重鏈可與包含與重鏈之VH域相同之模組之VL域的輕鏈配對。然而，重鏈及輕鏈亦可混合及匹配，其限制條件為結合位點保留與其目標之高親和力結合。
包含IgG1恆定區之示範性IGF-1R+ErbB3 PBA
38個包含IgG1恆定區之示範性IGF-1R+ErbB3 PBA之名稱在此處下表5中闡明，該等名稱各自之後接有(在括號中，按序)重鏈SEQ ID NO及輕鏈SEQ ID NO。該等IgG樣PBA包含兩條基本上相同之重鏈及兩條基本上相同之輕鏈。
在一示範性實施例中，PBA包含兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈，其中各重鏈之序列包含SEQ ID NO：210或300，基本上由SEQ ID NO：210或300組成或由SEQ ID NO：210或300組成，且其中各輕鏈之序列包含SEQ ID NO：202或298，基本上由SEQ ID NO：202或298組成或由SEQ ID NO：202或298組成。PBA亦可包含含有分別恰好或至多有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、50、100、200或300個aa與SEQ ID NO：202或298或者SEQ ID NO：210或300不同之aa序列的重鏈及/或輕鏈，其限制條件為該PBA具有所要生物特徵，如本文進一步描述。在一個實施例中，PBA包含因在CH3域末端添加離胺酸(K)，亦即產生序列…SLSLSPGKGGGGS….(SEQ ID NO：301)，而與SEQ ID NO：210或300不同之aa序列。PBA亦可包含因在CH3域中包含一或多個以下aa取代而與SEQ ID NO：210或300不同之aa序列：S239D、N297Q、S298A,T299A、T299C、T299K、A330L、I332E、E333A、K334A、E356D、M358L、N434A、N343K(EU編號；參見第7A圖)。
PBA亦可包含兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈，其中各重鏈及各輕鏈之序列包含第5A或5B圖中所示之序列，基本上由其組成或由其組成(亦即選自SEQ ID NO：202-296之任何偶數SEQ ID編號之序列)。PBA亦可包含含有分別恰好或至多有1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、15、20、25、30、50、100、200或300個aa與第5A或5B圖中之序列不同之aa序列的重鏈及/或輕鏈，其限制條件為該PBA具有所要生物特徵，如本文進一步描述。aa之差異可為aa缺失、添加或取代(例如保守性取代)。舉例而言，PBA可包含因在CH3域末端添加(或缺失)離胺酸及/或因在CH3域中包含一或多個以下aa取代而與第5A或5B圖中所述之aa序列不同的aa序列：S239D、N297Q、S298A,T299A、T299C、T299K、A330L、I332E、E333A、K334A、E356D、M358L、N434A、N343K(參見第7A圖)。一或多個aa差異可存在於兩個VH域中之一者或兩者中或兩個VL域中之一者或兩者中，例如一或多個CDR中或一或多個框架區(FR)中。一或多個aa差異亦可存在於一或多個免疫球蛋白恆定區域中，例如CH1域、CL域、鉸鏈、CH2域及/或CH3域中。可對免疫球蛋白恆定區進行例如以改變免疫球蛋白之一或多種特徵的特定aa變化在本文中進一步描述。胺基酸變化亦可存在於連接CH3域之C端與scFv之N端的連接子中及/或連接scFv之VH域之C端與scFv之VL域之N端的scFv連接子中。可對連接型連接子及scFv連接子進行之示範性修飾在本文中進一步描述。
亦可使用以下PBA：-包含重鏈及/或輕鏈之PBA，該重鏈及/或輕鏈包含與具有SEQ ID NO：210或300之重鏈域及/或具有 SEQ ID NO：202或298(16F之SEQ ID NO)之輕鏈域之aa序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的aa序列，其中該等PBA具有所要生物特徵；-為由兩個重鏈域及兩個輕鏈域組成之PBA之生物類似物或生物等效物的PBA，該兩個重鏈域各自由SEQ ID NO：210或300組成，該兩個輕鏈域各自由SEQ ID NO：202或298組成；-包含一或多個包含與SEQ ID NO：202、210、298或300中之相應域之aa序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之aa序列之域的PBA，該一或多個域為例如VH域、VL域、CDR域、FR域、CH1域、CL域、鉸鏈、CH2域、CH3域、連接子、scFv VH域、scFv連接子及scFv VL域；-包含重鏈域及/或輕鏈域之PBA，該重鏈域及/或輕鏈域包含與第5A或5B圖中所述之重鏈域及/或第5A或5B圖中所述之輕鏈域之aa序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的aa序列，其中該等PBA具有所要生物特徵；-為由兩個重鏈域及兩個輕鏈域組成之PBA之生物類似物或生物等效物的PBA，該兩個重鏈域各自包含第5A或5B圖中所述之aa序列，該兩個輕鏈域 各自包含第5A或5B圖中所述之aa序列；-包含一或多個包含與第5A或5B圖中所述之任一aa序列中之相應域之aa序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之aa序列之域的PBA，該一或多個域為例如VH域、VL域、CDR域、FR域、CH1域、CL域、鉸鏈、CH2域、CH3域、連接子域、scFv VH域、scFv連接子域及scFv VL域。
在PBA包含與本文所述之aa序列(諸如第5或6圖之aa)不同之aa序列的某些實施例中，PBA不為16F(亦即，不包含兩條由SEQ ID NO：210組成之重鏈及兩條由SEQ ID NO：202組成之輕鏈)。
在某些實施例中，PBA包含兩個彼此締合之重鏈-輕鏈對，其中各重鏈-輕鏈對包含抗IGF-1R結合位點及抗ErbB3結合位點，且其中該等重鏈-輕鏈對彼此不同。重鏈-輕鏈對可有一或多個aa不同(例如有恰好或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50個或直至100個aa不同)。舉例而言，第一重鏈-輕鏈對可包含重鏈恆定區且第二重鏈-輕鏈對可包含第二重鏈恆定區，其中第一及第二重鏈恆定區具有有利於其彼此締合之aa差異(例如「鈕孔(knobs and holes)」)。
在某些實施例中，多價蛋白質包含四個以上結合位點。舉例而言，六價結合蛋白可包含IgG-(scFv)2，亦即蛋白質包含兩個作為IgG之一部分之結合位點，一個scFv連 接於IgG之各CH3域之C端，且進一步包含例如經由連接子連接於IgG蛋白之N端或各scFv之C端的另一Fab或scFv。八價結合蛋白可包含與六價結合蛋白相同之結構，進一步包含兩個額外結合位點。
在某些實施例中，PBA可包含一個來源於此項技術中已知之結合蛋白或抗體之結合位點，諸如本文進一步所述者。舉例而言，PBA可包含一或多個來自選自由以下組成之群之抗IGF-1R抗體的CDR：CP-751,871；IMC-A12；抗IGF-1R Ab# A；BIIB-G11；及C06，其重鏈及輕鏈aa序列闡明於第37圖中。舉例而言，用於PBA中之抗IGF-1R結合位點可包含SEQ ID NO：321-335中任一者之VHCDR3及/或VLCDR3域及視情況存在之VHCDR1、VLCDR1、VHCDR2及/或VLCDR2。在某些實施例中，PBA包含含有1、2、3、4、5或6個包含因1、2或3個aa添加、缺失或取代而與SEQ ID NO：321-335中之一者中所述之相應CDR不同的aa序列之CDR的抗IGF-1R結合位點，其限制條件為該結合位點特異性結合其目標(抗原)。在某些實施例中，PBA包含含有1、2、3、4、5或6個包含與SEQ ID NO：321-335中之一者中所述之相應CDR至少70%、80%、90%或95%一致或類似的aa序列之CDR的抗IGF-1R結合位點。在某些實施例中，PBA包含含有SEQ ID NO：321-335中之任一者中所述之aa序列的VH及/或VL鏈。在其他實施例中，PBA包含含有因至多1、2、3、4、5、10、15、20、25或30個aa缺失、添加或取代而與 SEQ ID NO：321-335中之任一者不同或與SEQ ID NO：321-335中之序列至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之aa序列的VH及/或VL鏈，其限制條件為結合位點特異性結合其目標。在某些實施例中，PBA包含含有輕鏈及/或重鏈之結合位點，該重鏈及/或輕鏈包含SEQ ID NO：321-335中所述之aa序列或因至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100個aa缺失、添加或取代而與其不同或與SEQ ID NO：321-335中之序列至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之aa序列，其限制條件為該結合位點保留與其目標之特異性結合。舉例而言，PBA可包含來自選自由CP-751,871；IMC-A12；抗IGF-1R Ab# A；BIIB-G11；及C06組成之抗體群之抗體的(i)VH域及VL域；(ii)重鏈及輕鏈；或(iii)包含VH及VL鏈之scFv。該PBA可包含本文所述之抗ErbB3結合位點。
PBA可包含一或多個來自抗ErbB3抗體之CDR，該抗ErbB3抗體為例如抗ErbB3 Ab# A；H3(美國專利第7,332,580號)，MM Ab#3；MM Ab#14；MM Ab#17或MM Ab#19，其重鏈及輕鏈aa序列闡明於第38圖中。舉例而言，用於PBA中之抗ErbB3結合位點可包含SEQ ID NO：336-353中任一者之VHCDR3及/或VLCDR3域及視情況存在之VHCDR1、VLCDR1、VHCDR2及/或VLCDR2。在某些實施例中，PBA包含含有1、2、3、4、5或6個包含因1、2或3個aa添加、缺失或取代而與SEQ ID NO：336-353中之一者中所述之相應CDR不同的aa序列之CDR的抗ErbB3結合位點，其限制條件為該結合位點特異性結合其目標。在某些實施例中，PBA包含含有1、2、3、4、5或6個包含與SEQ ID NO：336-353中之一者中所述之相應CDR至少70%、80%、90%或95%一致或類似的aa序列之CDR的抗ErbB3結合位點。在某些實施例中，PBA包含含有SEQ ID NO：336-353中之任一者中所述之aa序列的VH及/或VL鏈。在其他實施例中，PBA包含含有因至多1、2、3、4、5、10、15、20、25或30個aa缺失、添加或取代而與SEQ ID NO：336-335中之任一者不同或與SEQ ID NO：336-335中之序列至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之aa序列的VH及/或VL鏈，其限制條件為結合位點保留與其目標之特異性結合。在某些實施例中，PBA包含含有輕鏈及/或重鏈之結合位點，該重鏈及/或輕鏈包含SEQ ID NO：336-353中所述之aa序列或因至多1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90或100個aa缺失、添加或取代而與其不同或與SEQ ID NO：336-353中之序列至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之aa序列，其限制條件為該結合位點特異性結合其目標。舉例而言，PBA可包含來自選自由抗ErbB3 Ab# A；H3(美國專利第7,332,585號)，MM Ab#3；MM Ab#14；MM Ab#17及MM Ab#19組成之抗體群之抗體的(i)VH域及VL域；(ii)重鏈及輕鏈；或(iii)包 含VH及VL鏈之scFv。可使用之其他抗ErbB3結合位點(或其部分，諸如CDR、V域或鏈)為來自以下抗ErbB3抗體者：1B4C3(目錄號sc-23865，Santa Cruz Biotechnology)及2D1D12(U3 Pharma AG)，兩者均描述於例如美國專利公開案第20040197332號中且由融合瘤細胞系DSM ACC 2527或DSM ACC 2517(寄存於DSMZ)產生，AV-203(WO 2011/136911中之SEQ ID NO：190(重鏈)及SEQ ID NO：206(輕鏈)，Aveo Pharmaceuticals)或8B8(由ATCC®融合瘤#HB-12070TM產生，且描述於WO 1997/035885中)，美國專利第7,846,440號中所述之抗體，單株抗體Mab 205.10.2(美國專利公開案第20110171222號中之SEQ ID NO：8(重鏈)及SEQ ID NO：10(輕鏈)，Roche Glycart)，美國專利公開案第20100310557號中所述之鼠類抗ErbB3抗體(Trellis Biosciences)或雙特異性抗ErbB3/抗EGFR抗體(例如SEQ ID NO：14(重鏈)及SEQ ID NO：13(輕鏈)，Genentech)。該等PBA可包含本文所述之抗IGF-1R結合位點。
PBA亦可包含與本文提供之結合部分結合人類IGF-1R或人類ErbB3上之相同抗原決定基的結合位點，例如，其可與具有如第5A及5B圖中所述之序列的結合部分競爭。本文涵蓋之結合部分亦可與本文所述之結合部分競爭與抗原之結合，例如，其可與具有如第5A及5B圖中所述之序列的結合部分競爭。包含與本文所述之結合部分競爭與目標抗原或抗原決定基之結合之結合部分的結 合蛋白可為在本文所述之結合部分之前或之後添加至ELISA中時能夠置換本文所述之結合部分的結合部分。
在某些實施例中，本文提供之PBA不包括PCT/US2010/052712中所述之PBA，在其他實施例中，本文提供之PBA不包括PCT/US2010/052712中所述之PBA的可變域。
示範性免疫球蛋白恆定區
在某些實施例中，PBA包含兩條重鏈，其中各自包含免疫球蛋白恆定區。多價結合域亦可包含兩條輕鏈，其中各輕鏈包含CL域。免疫球蛋白恆定區可來自人類Ig，例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，或來自一種以上免疫球蛋白同型。舉例而言，一個域可來自IgG1，且其他域可來自其他IgG同型。在某些實施例中，一個域之一部分係來自一種IgG同型且其他域係來自另一IgG同型。
可包含CH1域、鉸鏈、CH2域、CH3域及CH4域中之一或多者的重鏈免疫球蛋白恆定區可包含與特定IgG同型(例如IgG1)之天然存在或野生型恆定域中的重鏈免疫球蛋白恆定區或本文所述aa序列中一者之恆定區至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之aa序列或由其組成。CL域亦可包含與天然存在或野生型κ或λ輕鏈中之CL域或本文所述aa序列中一者中之CL域至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之aa序列或由其組成。
可包含CH1域、鉸鏈、CH2域、CH3域及CH4域中之一或多者的重鏈免疫球蛋白恆定區相對於特定IgG同型(例如IgG1)之天然存在或野生型恆定區中之相同重鏈免疫球蛋白恆定區或相對於本文(例如第5-7圖中)所述之重鏈免疫球蛋白恆定區可包含恰好或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50、50-100或100個以上aa取代、添加及/或缺失。CL域相對於天然存在或野生型κ或λ輕鏈中之CL域或本文所述之CL域可包含恰好或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50、50-100或100個以上aa取代、添加及/或缺失。
恆定區之各域(亦即CH1域、鉸鏈、CH2域、CH3域及CL域)相對於特定IgG同型(例如IgG1)之天然存在或野生型恆定域或本文所述之恆定域可包含一或多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10個以上)aa取代、添加及/或缺失。恆定區之各域(亦即CH1域、鉸鏈、CH2域、CH3域及CL域)可包含與特定IgG同型(例如IgG1)之天然存在或野生型恆定域中之相同域或本文所述之域至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的aa序列。
胺基酸取代、添加或缺失在空間上相對於彼此之定位可間隔至少1個aa位置或1個以上，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個aa位置或10個以上。在某些實 施例中，工程改造之aa在空間上之定位彼此隔開至少5、10、15、20或25個aa位置或25個以上之間隔。
在某些實施例中，PBA包含含有本文所述之aa序列的恆定區，例如Fc區或其域。在某些實施例中，PBA包含含有其中1個或1個以上aa已經缺失、添加或取代之本文所述aa序列或含有與本文所述序列至少約80%、90%、95%、97%、98%或99%一致之aa序列的恆定區，例如Fc區或其域。舉例而言，SEQ ID NO：300或第5及6圖中任何其他胺基酸序列之CH3域中的aa 356及358可經取代，例如E356D及M358L，以反映野生型IgG1 CH3序列。本文亦涵蓋表示任何單倍體型之任何恆定域變異體。
某些aa變化對恆定域之影響可如本文所進一步描述或如此項技術中所已知進行測定。
置換Fc部分中之aa殘基以改變抗體效應功能在此項技術中為已知的(美國專利第5,648,260號及第5,624,821號)。抗體之Fc部分介導若干重要效應功能，例如細胞激素誘導、ADCC、吞噬作用、補體依賴性細胞毒性(CDC)以及抗體及抗原-抗體複合物之半衰期/清除率。視治療目標而定，在一些情況下，此等效應功能對於治療性抗體為需要的，但在其他情況下可能不必要或甚至有害。
某些人類IgG同型(尤其IgG1及IgG3)分別經由與Fc γ R及補體Clq結合而介導ADCC及CDC。新生兒Fc受體(FcRn)為決定抗體之循環半衰期的關鍵組分。在另一實施例中，抗體之恆定區(例如抗體之Fc區)中的至少一個aa殘基經 置換，以使得抗體之效應功能改變。免疫球蛋白之兩個相同重鏈之二聚化由CH3域之二聚化介導且由鉸鏈區內的二硫鍵穩定化。
在一個實施例中，PBA保留以下屬性中之一或多者，且較佳保留全部：在人類中藉由與活化型Fc γ RI、Fc γ RIIa/c、Fc γ RIIIa及抑制性Fc γ RIIb受體相互作用而測定之抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)；由抗體結合於補體系統之組分而觸發之補體依賴性細胞毒性(CDC)；及經由新生兒Fc受體(FcRn)之主動再循環而介導之長半衰期。所有此等功能均可調節以使抗癌療法之有效性最佳化且較佳在PBA中得到保留。
可對免疫球蛋白恆定區進行某些aa修飾以降低或增加恆定域之天然生物活性，諸如上文所述者。因此，在某些實施例中，恆定免疫球蛋白區在位於Fc之「15埃接觸區」內之aa位置上包含aa取代、缺失或添加。15埃區包括位於全長野生型Fc部分之EU位置243至261、275至280、282-293、302至319、336至348、367、369、372至389、391、393、408及424-440的殘基。
在某些實施例中，結合蛋白(例如PBA、抗IgG-1R結合位點及抗ErbB3結合位點)在Fc域中包含改變域之一或多種抗原獨立性效應功能(例如包含該域之蛋白質的循環半衰期)的aa變化(例如aa取代、添加或缺失)。示範性抗體在與缺乏該等aa變化之抗體比較時展現與FcRn之 結合增加或減少，且因此分別具有增加或減少之血清半衰期。包含對FcRn之親和力提高之Fc變異體的抗體預期具有較長血清半衰期，而包含FcRn結合親和力降低之Fc變異體的抗體預期具有較短半衰期。在一個實施例中，FcRn結合改變之結合蛋白包含至少一個在Fc域之「FcRn結合環」內具有一或多個aa變化的Fc域。FcRn結合環由野生型全長Fc之aa殘基280-299(EU)構成。在其他實施例中，FcRn結合親和力改變之結合蛋白包含至少一個在15 Å FcRn「接觸區」內具有一或多個aa取代的Fc域。術語15 Å FcRn「接觸區」包括野生型全長Fc域之以下位置上的殘基：243-261、275-280、282-293、302-319、336-348、367、369、372-389、391、393、408、424、425-440(EU)。在某些實施例中，FcRn結合親和力改變之結合蛋白包含至少一個在對應於任一以下EU位置之aa位置上具有一或多個aa變化之Fc域(例如一個或兩個Fc部分)：256、277-281、283-288、303-309、313、338、342、376、381、384、385、387、434(例如N434A或N434K)及438。改變FcRn結合活性之示範性aa變化揭示於國際PCT公開案第WO05/047327號中。
在一些實施例中，結合蛋白包含含有例如與野生型Fc區相比時改變多肽之抗原依賴性效應功能(尤其ADCC或補體活化)之aa變化的Fc變異體。在示範性實施例中，該等抗體展現與Fc γ受體(例如CD16)之結合改變。該等受體展現與野生型多肽相比時與Fc γ R之結合增加或 減少，且因此分別介導增強或減弱之效應功能。對Fc γ R之親和力提高之Fc變異體預期增強效應功能，且該等蛋白質可在希望破壞目標分子之治療哺乳動物之方法中(例如在腫瘤療法中)具有適用應用，相反，Fc γ R結合親和力降低之Fc變異體預期減弱效應功能。在一個實施例中，結合蛋白包含至少一種與包含野生型Fc區之結合蛋白相比改變之選自由以下組成之群的抗原依賴性效應功能：調理作用、吞噬作用、補體依賴性細胞毒性、抗原依賴性細胞毒性(ADCC)或效應細胞調節。
在一個實施例中，結合蛋白展現與活化型Fc γ R(例如Fc γ RI、Fc γ RIIa或Fc γ RIIIa)之結合改變。在另一實施例中，結合蛋白展現對抑制性Fc γ R(例如Fc γ RIIb)之結合親和力改變。在其他實施例中，Fc γ R結合親和力增加(例如Fc γ RIIIa結合親和力增加)之結合蛋白包含至少一個在對應於一或多個以下位置之aa位置上具有aa變化之Fc域：239、268、298、332、334及378(EU)。在某些實施例中，Fc γ R結合親和力降低(例如Fc γ RI、Fc γ RII或Fc γ RIIIa結合親和力降低)之結合蛋白包含至少一個在對應於一或多個以下位置之aa位置上具有aa取代之Fc域：234、236、239、241、251、252、261、265、268、293、294、296、298、299、301、326、328、332、334、338、376、378及435(EU)。
在某些實施例中，補體結合親和力增加(例如C1q結合親和力增加)之結合蛋白包含在對應於一或多個以下位 置之aa位置上具有aa變化之Fc域：251、334、378及435(EU)。在某些實施例中，補體結合親和力降低(例如C1q結合親和力降低)之結合蛋白包含在對應於一或多個以下位置之aa位置上具有aa取代之Fc域：239、294、296、301、328、333及376(EU)。改變Fc γ R或補體結合活性之示範性aa變化揭示於國際PCT公開案第WO05/063815號中。在某些實施例中，結合蛋白可包含以下特定Fc區取代中之一或多者：S239D、S239E、M252T、H268D、H268E、I332D、I332E、N434A及N434K(EU)。
結合蛋白亦可包含改變結合蛋白之糖基化之aa取代。舉例而言，結合蛋白之免疫球蛋白恆定區可包含具有導致糖基化(例如N連接型或O連接型糖基化)減少之突變的Fc域或可包含改變之野生型Fc域之糖型式(例如低海藻糖或無海藻糖聚糖)。「工程改造之糖型式」係指共價連接於Fc區之碳水化合物組成，其中該碳水化合物組成在化學上不同於親本Fc區之碳水化合物組成。工程改造之糖型式可適用於多種目的，包括(但不限於)增強或減弱效應功能。工程改造之糖型式可由此項技術中已知之多種方法產生(US 6,602,684；美國專利公開案第2010-0255013號；美國專利公開案第20030003097號；WO 00/61739A1；WO 01/29246A1；WO 02/31140A1；WO 02/30954A1)；(PotelligentTM技術(Biowa,Inc.,Princeton,NJ)；及GlycoMAbTM糖基化工程改造技術(Glycart Biotechnology AG,Zurich,Switzerland)。許多此等技術係 基於藉由以下方式控制共價連接於Fc區之海藻糖基化及/或對分寡醣之含量：例如在經工程改造或以其他方式改造之各種生物體或細胞系(例如Lec-13 CHO細胞或大鼠融合瘤YB2/0細胞)中表現Fc多肽、調控糖基化路徑中所涉及之酶(例如FUT8[a1,6-海藻糖基轉移酶]及/或31-4-N-乙醯葡糖胺基轉移酶III[GnTIII])、或在表現了Fc多肽之後對碳水化合物進行修飾。
在示範性實施例中，aa變化(例如aa取代)產生通常在aa位置297(EU)上發現之N連接型聚糖之糖基化減少的Fc區。Fc區亦可在aa位置297(EU)包含低海藻糖或無海藻糖聚糖。在某些實施例中，結合蛋白在糖基化基元(例如含有aa序列NXT或NXS之N連接型糖基化基元)附近或之內具有aa取代。在一特定實施例中，結合蛋白在對應於Fc之297或299(EU)之aa位置上包含aa取代。減少或改變糖基化之示範性aa取代揭示於國際PCT公開案第WO05/018572號及美國專利公開案第20070111281號中。
在其他實施例中，結合蛋白包含至少一個具有一或多個位於溶劑暴露表面之工程改造半胱胺酸殘基或其類似物的Fc域。工程改造之半胱胺酸殘基或其類似物較佳不干擾結合蛋白之所要生物活性。舉例而言，可能需要改變不干擾Fc結合Fc受體(例如Fc γ RI、Fc γ RII或Fc γ RIII)或補體蛋白(例如C1q)或者觸發免疫效應功能(例如抗體 依賴性細胞毒性(ADCC)、吞噬作用或補體依賴性細胞毒性(CDCC))之能力。在某些實施例中，抗體包含含有至少一個實質上不含與第二半胱胺酸殘基之二硫鍵鍵結之工程改造游離半胱胺酸殘基或其類似物的Fc域。抗體可包含在CH3域中之一或多個以下位置上具有工程改造半胱胺酸殘基或其類似物的Fc域：349-371、390、392、394-423、441-446及446b(EU)。抗體可包含在任一以下位置上具有工程改造半胱胺酸殘基或其類似物的Fc變異體：350、355、359、360、361、389、413、415、418、422、441、443及EU位置446b。
亦可藉由自特定免疫球蛋白類別或子類選擇Fc或藉由組合來自特定免疫球蛋白類別或子類(例如IgG1、IgG2等)之特定區獲得所要效應功能。舉例而言，因為ADCC及CDC(分別經由IgG與Fc γ R及C1q之結合)係由位於鉸鏈及CH2域中之殘基介導，且因為IgG4基本上缺乏效應功能，所以可藉由組合IgG4之鉸鏈及CH2域與IgG1之CH3域來構建無效應Fc。包含IgG4鉸鏈之蛋白質中的Fab臂交換可藉由該鉸鏈中之取代S228P而減少。
亦可例如在CH3域中進行此項技術中稱為「鈕-孔(knobs-into-holes)」且描述於例如美國專利第7,183,076號中之變化對免疫球蛋白恆定區進行修飾。在此策略中，對兩條重鏈之Fc部分進行工程改造以得到一個突出之「鈕」及另一互補之「孔」，由此有利於該等重鏈之締合。
示範性連接子
可使用連接子來將兩個域或區連接在一起，例如可變域連接至恆定域、可變域連接至可變域及恆定域連接至恆定域。連接scFv之VH域與scFv之VL域的連接子稱為「scFv連接子」。連接scFv與恆定域(例如CH3域)之連接子稱為「連接型連接子」。
連接子較佳具有足夠長度以允許所連接之域或區適當折疊。舉例而言，連接子可為1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或至少90-100個aa長。
在某些實施例中，連接子為生物惰性的，例如通常不能誘發生物反應，例如免疫反應。
多肽連接子可包含Gly-Ser連接子或由其組成。「Gly-Ser連接子」係指由甘胺酸及絲胺酸殘基組成之肽。示範性Gly-Ser連接子包含具有式(Gly4Ser)n(SEQ ID NO：395)之aa序列，其中n為正整數(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。舉例而言，在某些實施例中，連接型連接子包含以下或由以下組成：(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：396)或(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：397)或(Gly4Ser)5(SEQ ID NO：398)。在某些實施例中，scFv連接子包含以下或由以下組成：(Gly4Ser)3或(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：397)或(Gly4Ser)5(SEQ ID NO：398)。除(Gly4Ser)n序列外，連接子亦可包含一或 多個位於(Gly4Ser)n序列之N端或C端之額外aa。舉例而言，scFv連接子可包含位於(Gly4Ser)n(SEQ ID NO：399)序列之N端的3個aa，例如AST(參見例如，在第7圖中所示之16F之重鏈序列中及如SEQ ID NO：300。在該序列中，scFv連接子由aa序列AST(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：400)組成。
PBA之示範性生物特徵
在某些實施例中，PBA在活體外抑制腫瘤細胞之生長。如實例3(C)及第16及17圖中所示，抗ErbB3/抗IGF-1R IgG2(scfv)2 PBA抑制2D培養物中兩種不同腫瘤細胞系之增殖，而任一單獨結合位點均不顯著抑制其增殖。因此，在某些實施例中，PBA在活體外比任一單獨結合位點更有效地抑制腫瘤細胞增殖(例如，如藉由對6天培養物，例如實例3(C)中所述之培養物之抑制百分比所量測)。PBA存在下之增殖相對於不存在PBA下細胞之增殖可抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或90%以上。
在某些實施例中，PBA在活體內抑制腫瘤細胞增殖。如實例3(D)及第18A至20B圖所示，抗ErbB3/抗IGF-1R IgG2(scfv)2 PBA抑制癌症小鼠模型中兩種不同腫瘤細胞系之增殖的程度比個別結合位點之抑製程度高。因此，在某些實施例中，PBA在活體內比任一單獨結合位點更 有效地抑制腫瘤細胞增殖(例如，如藉由比較實驗(例如實例3(D)中所述之實驗)結束時之腫瘤尺寸所量測)。PBA存在下之腫瘤生長相對於不存在PBA下之腫瘤生長可抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或90%以上。
「與任一單獨結合位點相比」係指與PBA之一個或另一結合位點相比較，此時該結合位點包含與PBA中結合位點之可變區相同之可變區且例如呈抗體形式，例如IgG1抗體(如例如實例中所示)。
在某些實施例中，PBA抑制經由IGF-1R及ErbB3中之任一者或兩者介導之信號轉導。如實例3(B)、4及5(C)中所示，各種PBA抑制經由IGF-1R及ErbB3進行信號轉導，如藉由對IGF-1R、ErbB3及AKT之磷酸化之抑制作用所量測。該等實例展示PBA抑制信號轉導之程度或範圍相對於先前技術抗IGF-1R抗體(抗IGF-1R Ab# A-SEQ ID NO：327(HC)及SEQ ID NO：328(LC))或抗ErbB3抗體(抗ErbB3 Ab# A-SEQ ID NO：336(HC)及337(LC))或其組合可類似或較高。在某些實施例中，pIGF-1R、pErbB3及pAKT中之任一者或其中兩者或三者之組合含量之降低百分比與抗IGF-1R Ab# A或抗ErbB3 Ab# A或其組合之含量降低百分比相比可類似(例如在1%、5%或10%以內)、較高(例如高10%、20%、30%、40%或50%)或較低(例如低10%、20%、30%、40%、50%)。在一些實施例中，實驗(例如， 如實例中所述)結束時磷酸化之抑制(例如抑制%)與先前技術抗IGF-1R或抗ErbB3抗體或其組合之磷酸化抑制相比可類似或較高或較低。在某些實施例中，當在例如實驗(例如，如實例中所述)結束時測定時，相對於不存在PBA下之磷酸化，PBA使IGF-1R、ErbB3及/或AKT之磷酸化抑制至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或99%以上。例如藉由IGF-1R及ErbB3磷酸化之抑制作用所量測，較佳PBA抑制IGF-1R及/或ErbB3信號轉導接近完全，例如至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%。
分別對a)配位體介導之ErbB3磷酸化及b)IGF-1或IGF-2介導之IGF-1R磷酸化的抑制作用可由PBA使a)由ErbB家族配位體(例如異調蛋白)誘導之ErbB3磷酸化、b)由IGF-1R配位體(亦即IGF-1或IGF-2)誘導之IGF-1R磷酸化或c)由IGF-1R配位體或ErbB3配位體誘導之AKT磷酸化之程度各自相對於不與PBA接觸之對照細胞中之磷酸化可再現地降低的能力來證明。表現ErbB3及/或IGF-1R之細胞可為天然存在之細胞或細胞系之細胞，或可藉由將編碼ErbB3及/或IGF-1R之核酸引入宿主細胞中來重組產生。在一個實施例中，PBA使ErbB家族配位體介導之ErbB3磷酸化抑制至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或99%以上， 如例如藉由蛋白質印跡接著如下文實例中所述用抗磷酸酪胺酸抗體進行探測所測定。在另一實施例中，PBA使IGF-1或IGF-2介導之IGF-1R磷酸化抑制至少約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或99%以上，如例如藉由蛋白質印跡接著如下文實例中所述用抗磷酸酪胺酸抗體進行探測所測定。
PBA可使細胞(例如癌細胞)中異調蛋白誘導之pAKT信號傳遞抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%。PBA可使細胞(例如癌細胞)中IGF-1誘導之pAKT信號傳遞抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%。PBA可使細胞(例如癌細胞)中胰島素誘導之pAKT信號傳遞抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%。PBA可使細胞(例如癌細胞)中IGF-2誘導之pAKT信號傳遞抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%。對pAKT信號傳遞之抑制可如本文(例如實例)所進一步描述進行測定。
PBA可使配位體誘導之IGF-1R磷酸化抑制至少70%或80%，使配位體誘導之ErbB3磷酸化抑制至少70%或80%， 且視情況使配位體誘導之AKT磷酸化抑制至少30%或40%。PBA亦可使配位體誘導之IGF-1R磷酸化抑制至少85%，使配位體誘導之ErbB3磷酸化抑制至少85%，且視情況使配位體誘導之AKT磷酸化抑制至少75%，在某些實施例中，PBA使配位體誘導之IGF-1R磷酸化抑制至少50%且使配位體誘導之ErbB3磷酸化抑制至少90%，且視情況使配位體誘導之AKT磷酸化抑制至少30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。
PBA亦可由其抑制IGF-1R、ErbB3及AKT中一或多者磷酸化之EC50(亦即獲得最大抑制之50%時PBA之濃度)定義，該等EC50可如本文進一步所述測定。舉例而言，本文揭示之PBA抑制IGF-1R磷酸化之EC50可為10-9 M、10-10 M或10-10 M以下。其抑制ErbB3磷酸化之EC50可為10-9 M、10-10 M或10-10 M以下。其抑制AKT磷酸化之EC50可為10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M或10-10 M以下。本文揭示之一些PBA使IGF-1R磷酸化抑制至少80%或85%之EC50為10-9 M、10-10 M或10-10 M以下；使ErbB3磷酸化抑制至少80%或85%之EC50為10-9 M、10-10 M或10-10 M以下；且視情況使AKT磷酸化抑制至少55%或65%或75%之EC50為10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M或10-10 M以下。在一些情況下，可用本文揭示之PBA獲得IGF-1R磷酸化及ErbB3磷酸化中任一者或兩者之基本上完全阻斷。
在一些實施例中，本文提供之PBA結合表現其目標(亦 即由PBA結合之抗原)中之一者或兩者之細胞的EC50為約0.02 nM或0.02 nM以下至約10 nM，或Kd為約10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M或10-12 M或10-12 M以下；各自如例如藉由使用表現該PBA之目標抗原中之一者或兩者之該等細胞的流動式細胞測量術所量測。在其他實施例中，本文提供之PBA結合其目標(例如人類IGF-1R及人類ErbB3中之任一者或兩者)的為Kd約10-6 M、10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M或10-12 M或10-12 M以下，如例如藉由或藉由使用BIAcore設備之表面電漿子共振所量測。舉例而言，本文提供之抗ErbB3/抗IGF-1R IgG2(scfv)2 PBA展示結合ADRr及MCF7細胞之Kd分別為2.5及2.1 nM(參見實例3A)。實例5(A)展示若干其他PBA結合BxPC-3細胞之EC50為約2-5 nM。實例5(B)展示若干PBA結合ErbB3之EC50為約0.2-0.4 nM。其他PBA結合BxPC-3細胞之EC50在0.02 nM(例如P4-G1-P6)至約1 nM或至約2 nM範圍內。
在某些實施例中，PBA結合抗原(例如ErbB3或IGF-1R)之解離常數(Kd)為50 nM或50 nM以下(亦即結合親和力至少高達由50 nM之Kd所指示之結合親和力)(例如Kd為40 nM或30 nM或20 nM或10 nM或1 nm，或100 pM或10 pM或1 pM或1 pM以下)。在一特定實施例中，PBA結合抗原(ErbB3或IGF-1R)之Kd為8 nM或更佳(例如7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、2 nM、1.5 nM、1.4 nM、1.3 nM、1nM、100 pM、10 pM或1 pM或0.1 pM或0.1 pM以下)。在其他實施例中，結合蛋白、結合部分或結合位點結合抗原(例如ErbB3或IGF-1R)之解離常數(Kd)低於約10-7 M，諸如低於約10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M或10-12 M或甚至更低，且結合該抗原之親和力比其對非特異性抗原(例如KLH、BSA或酪蛋白)之結合親和力至少高一個數量級(亦即Kd值為至多十分之一)。
PBA可抑制配位體與IGF-1R及/或ErbB3之結合。舉例而言，PBA可使配位體與IGF-1R及/或ErbB3之結合抑制至少70%、80%、90%、95%、97%、98%或99%，如例如在細胞上或活體外所量測。某些PBA抑制在該PBA之前或之後添加配位體時該配位體與IGF-1R及/或ErbB3結合之程度。
在某些實施例中，包含濃度為0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 mg/ml或15 mg/ml以上(或在任何該等兩個數值之間的濃度範圍)之PBA的溶液包含多於70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之呈未聚集形式之PBA(在本文中稱為單體)，如例如在如下文所述之穩定性測試後例如藉由尺寸排阻層析(SEC)所測定。單體之百分比可在溶液中在一種以下穩定性測試之後測定：a)在4℃下培育1、2、3、4、5或6天，或1、2、3週或3週以上；b)在室溫下培育1、2、3、4、5或6天，或1、2、3週或3週以上；c)在37℃ 下培育1、2、3、4、5或6天，或1、2、3週或3週以上；d)1、2、3、4或5個冷凍/解凍循環，及e)攪動，例如在室溫下在軌道式振盪器上輕緩攪動例如1、2、3、4、5個小時或5個小時以上。
在某些實施例中，PBA在37℃下在血清中培育1、2、3、4或5天後相對於其在第0天之穩定性展現至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之穩定性，其中蛋白質之穩定性藉由例如量測培育後其結合其一或多種目標抗原之能力來測定，如例如藉由ELISA所測定(參見例如實例7)。
在某些實施例中，PBA具有如例如藉由微差掃描螢光測定法(DSF)所測定至少50℃、55℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃之熔融溫度(Tm)，如實例中所述。
在某些實施例中，PBA有效抑制當配位體以高濃度或低濃度存在時經由IGF-1R及/或ErbB3進行之信號轉導。在某些實施例中，PBA抑制基本信號傳遞，例如抑制在配位體誘導不存在下細胞中存在之pAKT之含量。PBA亦可使細胞表面上之IGF-1R及/或ErbB3(例如磷酸化及/或非磷酸化受體)相對於未暴露於該PBA之細胞下調例如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或90%以上。PBA亦可使細胞中之胰島素信號傳遞相對於未暴露於該PBA之細胞抑制例如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或90%以上。
PBA在小鼠或人類血清中可具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天之穩定性。PBA當以每公斤小鼠5 mg或25 mg注射時，在石蟹獼猴中可具有至少10小時、20小時、30小時、40小時、45小時、50小時、60小時、70小時、80小時、90小時、100小時、110小時、115小時或115小時以上之半衰期。在某些實施例中，PBA在為小鼠或石蟹獼猴之生物體體內具有比另一結合相同抗原決定基之多價雙特異性抗體在相同生物體體內之半衰期在統計上顯著較長(例如長至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%(亦即2倍)、150%或200%)的半衰期，其中抗原結合特異性之方向在fab與scfv之間相反。
在某些實施例中，相對於與PBA結合IGF-1R上之相同抗原決定基之單特異性抗IGF-1R抗體，PBA使mTOR之蛋白質含量或磷酸化mTOR之含量抑制至或使mTOR活化降至或抑制至(亦即使pmTOR之含量降至)例如約50%、1/2倍、1/3倍、1/4倍、1/5倍或1/5倍以下。
PBA可具有本文所述之特徵中之兩種或兩種以上之組合。舉例而言，PBA可使配位體誘導之IGF-1R磷酸化抑制至少80%及使配位體誘導之ErbB3磷酸化抑制至少80%，並且亦展現一或多種以下特徵：(i)如藉由DSF所測定至少60℃或65℃之Tm；(ii)在PBS中在10 mg/mL下在室溫下5天後至少80%、90%或95%呈單體；(iii)及在血清中在37℃下培育5天後具有至少70%、80%或90% 之穩定性。在某些實施例中，PBA具有至少60℃之Tm及至少90%之血清穩定性。在其他實施例中，PBA(i)使腫瘤細胞之生長抑制例如至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或90%以上；(ii)使經由IGF-1R及/或ErbB3介導之信號轉導抑制例如至少70%、80%、90%或90%以上，(iii)為穩定的，例如在4℃、室溫或37℃下1、2、3、4、5天或5天以上後在溶液中至少80%為單體，及/或(iv)具有如藉由DSF所測定至少50℃、55℃、60℃、65℃或65℃以上之Tm；例如程度與結合實體單獨或一起相比類似或更有效或效力更高。
可使用標準分析來測定抗IGF-1R+抗ErbB3 PBA之生物活性及特徵。用於以下測試之示範性分析提供於本文之實例中：(a)用於測定結合位點與其目標之結合親和力或Kd的分析；(b)用於測定結合蛋白結合細胞之能力的分析；(c)用於藉由量測對IGF-1R、ErbB3或AKT磷酸化之抑制作用測定結合蛋白抑制信號轉導之能力的分析；(d)用於活體外測定PBA抑制抑制細胞增殖之能力的分析；(e)用於活體內測定PBA對腫瘤細胞之影響的分析；及(f)用於測定PBA之穩定性的分析。
單價及二價單特異性抗體
本文進一步提供單價及二價單特異性抗體，其為1)二價IgG抗體，其可藉由共表現至少一種編碼重鏈之核酸分子及至少一種可與編碼該重鏈之分子相同或不同的編 碼該抗體之輕鏈之核酸分子來製備，或2)單價單鏈Fv(scFv)抗體，其可藉由表現至少一種編碼該scFv之核酸分子來製備；各自如本文所述在適合表現系統中表現，該表現系統包括市售表現系統及此項技術中熟知之其他表現系統。該等抗體可為單株抗體。
抗IGF-1R抗體
本文提供特異性結合人類IGF-1R之抗IGF-1R抗體。在某些實施例中，IGF-1R結合蛋白包含重鏈及輕鏈，該重鏈及輕鏈彼此締合形成結合部分，例如抗體或其抗原結合域。本文提供之描述適用於抗IGF-1R抗體，但亦適用於PBA中包含之抗IGF-1R結合部分。反之，抗IGF-1R結合部分之描述適用於抗IGF-1R抗體或其抗原結合位點。
在某些實施例中，抗IGF-1R結合蛋白包含1、2、3、4、5或6個選自由以下組成之群之CDR：SEQ ID NO：302中所述之一致序列中所涵蓋之VHCDR1 aa序列、SEQ ID NO：303中所述之一致序列中所涵蓋之VHCDR2 aa序列、SEQ ID NO：304中所述之一致序列中所涵蓋之VHCDR3 aa序列、SEQ ID NO：305中所述之一致序列中所涵蓋之VLCDR1 aa序列、SEQ ID NO：306中所述之一致序列中所涵蓋之VLCDR2 aa序列及SEQ ID NO：307(或308)中所述之一致序列中所涵蓋之VLCDR3 aa序列。舉例而言，抗 IGF-1R結合蛋白可包含1、2、3、4、5或6個選自由以下組成之群之CDR：第1圖中所示aa序列中之一者(例如SEQ ID NO：8-31中之任一者)中的VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列，及第2圖中所示aa序列中之一者(例如SEQ ID NO：32-133中之一者)中的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列。在一特定實施例中，抗IGF-1R結合蛋白包含含有1、2或3、4、5或6個選自由以下組成之群之CDR的VH域：SEQ ID NO：11中所述之VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3 aa序列及SEQ ID NO：35中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列(16F之CDR)。在某些實施例中，抗IGF-1R結合蛋白包含含有1、2、3、4、5或6個選自由以下組成之群之CDR的VH域：第1圖中之序列(例如SEQ ID NO：8-10及12-31)中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列，及第2圖中之序列(例如SEQ ID NO：32-34及36-133)中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列。
在某些實施例中，抗IGF-1R結合蛋白包含含有由SEQ ID NO：1中所述之一致序列所涵蓋之aa序列的VH域及/或含有由SEQ ID NO：2中所述之一致序列所涵蓋之aa序列的VL域。示範性VH aa序列為第1圖中所示之序列，例如SEQ ID NO：8-31。示範性VL aa序列為第2圖中所示之序列，例如SEQ ID NO：32-133。在一個實施例中，抗 IGF-1R結合蛋白包含含有SEQ ID NO：11之VH aa序列及/或含有SEQ ID NO：35之VL aa序列(16F之可變域)。
在某些實施例中，抗IGF-1R結合蛋白包含含有由SEQ ID NO：1中所述之一致序列所涵蓋之aa序列的VH域及/或含有由SEQ ID NO：3中所述之一致序列所涵蓋之aa序列的VL域。示範性VH aa序列為如SEQ ID NO：8-10及12-31所述之序列。示範性VL aa序列為如SEQ ID NO：32-34及36-133所述之序列。
本文亦提供特異性結合IGF-1R之抗IGF-1R抗體，其中VH域包含與第1圖中所示之VH aa序列(例如SEQ ID NO：8-31)之aa序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的aa序列，及/或其中VL域包含與第2圖中所示之VL aa序列(例如SEQ ID NO：32-133)之aa序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的aa序列。在某些實施例中，排除SEQ ID NO：11中所述之VH序列及/或SEQ ID NO：35中所述之VL序列。
本文亦提供特異性結合IGF-1R之抗IGF-1R抗體，其中VH域包含因1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或因1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50或50-100個aa取代、添加或缺失而與第1圖中所示之aa序列(例如SEQ ID NO：8-31)不同的aa序 列，且VL域包含因1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或因1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50或50-100個aa之aa取代、添加或缺失而與第2圖中所示之aa序列(例如SEQ ID NO：32-133)不同的aa序列。在某些實施例中，排除SEQ ID NO：11中所述之VH序列及/或SEQ ID NO：35中所述之VL序列。
抗IGF-1R抗體可具有抗體(例如全長抗體)或其抗原結合片段之結構。舉例而言，抗IGF-1R結合蛋白可包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈按N端至C端順序包含：VH域、CH1域、鉸鏈、CH2域、CH3域及視情況存在之CH4域，且其中該輕鏈按N端至C端順序包含：VL域及CL域。恆定域較佳為人類的且可來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其組合。恆定域可為天然存在之序列或突變型序列，其中已對天然存在之序列進行一或多個aa取代、添加或缺失。
抗IGF-1R結合蛋白可包含含有選自由以下組成之群之aa序列的重鏈：SF重鏈(SEQ ID NO：358)；P4重鏈(SEQ ID NO：359)；M78重鏈(SEQ ID NO：360)及M57重鏈(SEQ ID NO：361)(第6A圖)。抗IGF-1R結合蛋白亦可包含含有選自由以下組成之群之aa序列的輕鏈：SF κ輕鏈(SEQ ID NO：202)；P4 κ輕鏈(SEQ ID NO：204)；M78 κ輕鏈(SEQ ID NO：206)；及M57 κ輕鏈(SEQ ID NO：208)(第5A圖)。抗 IGF-1R結合蛋白可包含含有選自由以下組成之群之aa序列的重鏈：SF重鏈(SEQ ID NO：358)；P4重鏈(SEQ ID NO：359)；M78重鏈(SEQ ID NO：360)及M57重鏈(SEQ ID NO：361)，及含有選自由以下組成之群之aa序列的輕鏈：SF κ輕鏈(SEQ ID NO：202)；P4 κ輕鏈(SEQ ID NO：204)；M78 κ輕鏈(SEQ ID NO：206)；及M57 κ輕鏈(SEQ ID NO：208)。在特定實施例中，IGF-1R抗體包含具有名稱相同之aa序列的重鏈及輕鏈，例如SF重鏈與SF輕鏈、P4重鏈與P4輕鏈、M78重鏈與M78輕鏈及M57重鏈與M57輕鏈。然而，重鏈及輕鏈亦可混合及匹配。舉例而言，M57重鏈可與M7輕鏈配對，且P4重鏈可與M57輕鏈配對。
特別提供抗IGF-1R IgG抗體SF(重鏈SEQ ID NO：358，κ輕鏈SEQ ID NO：202)；P4(重鏈SEQ ID NO：359，κ輕鏈SEQ ID NO：204)；M78(重鏈SEQ ID NO：360，κ輕鏈SEQ ID NO：206)及M57(重鏈SEQ ID NO：361，κ輕鏈SEQ ID NO：208)；所有均為IgG1同型。
在某些實施例中，抗IGF-1R結合蛋白包含含有與SEQ ID NO：358、359、360及361中所述之aa序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之aa序列的重鏈及/或含有與SEQ ID NO：202、204、206及208中所述之aa序列至少70%、75%、80%、85%、90%、 95%、97%、98%或99%一致之aa序列的輕鏈。
在其他實施例中，IGF-1R結合蛋白包含含有因1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或因1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50或50-100個aa取代、添加或缺失而與SEQ ID NO：358、359、360及361中所述之aa序列不同之aa序列的重鏈及/或含有因1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或因1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50或50-100個aa取代、添加或缺失而與選自由SEQ ID NO：202、204、206及208組成之群之aa序列不同之aa序列的輕鏈。
抗ErbB3抗體之生物活性及特徵可利用分析(例如本文關於PBA所述之分析)來測定。抗ErbB3蛋白可配位體抑制ErbB3之磷酸化、腫瘤細胞之增殖及/或活體內抑制腫瘤生長。
抗IGF-1R結合部分可包含或連接於1、2、3、4個或4個以上可呈Fab、scFv形式或其他結合位點形式之其他結合位點。舉例而言，抗IGF-1R結合蛋白可包含抗ErbB3結合位點，例如抗ErbB3 scFv。
抗ErbB3抗體
本文亦提供特異性結合人類ErbB3之抗ErbB3抗體。在某些實施例中，ErbB3結合蛋白包含重鏈及輕鏈，該重 鏈及輕鏈彼此締合且形成結合蛋白，例如抗體或其抗原結合域。下文提供之描述適用於抗ErbB3抗體，但亦適用於PBA中包含之抗ErbB3結合位點。反之，抗ErbB3結合位點之描述適用於抗ErbB3抗體或其抗原結合位點。
在某些實施例中，抗ErbB3結合蛋白包含1、2、3、4、5或6個選自由以下組成之群之CDR：SEQ ID NO：309中所述之VHCDR1 aa序列、SEQ ID NO：310中所述之一致序列中所涵蓋之VHCDR2 aa序列、SEQ ID NO：311中所述之一致序列中所涵蓋之VHCDR3 aa序列、SEQ ID NO：312中所述之VLCDR1 aa序列、SEQ ID NO：313中所述之VLCDR2 aa序列及SEQ ID NO：314(或315)中所述之一致序列中所涵蓋之VLCDR3 aa序列。舉例而言，抗ErbB3結合蛋白可包含1、2、3、4、5或6個選自由以下組成之群之CDR：第3圖中之序列(例如SEQ ID NO：134-165中之任一者)中所述之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列，及第4圖中之序列(例如SEQ ID NO：166-200)中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列。在一特定實施例中，抗ErbB3結合蛋白包含含有1、2或3、4、5或6個選自由以下組成之群之CDR的VH域：SEQ ID NO：143中所述之VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3 aa序列及SEQ ID NO：175中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列(16F之CDR)。在某些實施例中，抗ErbB3結合蛋白包含含有1、2、3、4、5或6個選自由以下組成之群之CDR的VH域：第3圖中 所述之VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3 aa序列序列(例如SEQ ID NO：134-142及144-165中之任一者)，及第4圖中所述之VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列(例如SEQ ID NO：166-174及176-200中之任一者)。
在某些實施例中，抗ErbB3結合蛋白包含含有由SEQ ID NO：4中所述之一致序列所涵蓋之aa序列的VH域及/或含有由SEQ ID NO：6中所述之一致序列所涵蓋之aa序列的VL域。示範性VH aa序列為第3圖中所示之序列，例如SEQ ID NO：134-165。示範性VL aa序列為表4中所示之序列，例如SEQ ID NO：166-200。在一個實施例中，抗ErbB3結合蛋白包含含有SEQ ID NO：143之VH aa序列及/或含有SEQ ID NO：175之VL aa序列(16F之可變域)。
在某些實施例中，抗ErbB3結合蛋白包含含有由SEQ ID NO：5中所述之一致序列所涵蓋之aa序列的VH域及/或含有由SEQ ID NO：7中所述之一致序列所涵蓋之aa序列的VL域。示範性VH aa序列為如SEQ ID NO：134-142及145-165所述之序列。示範性VL aa序列為如SEQ ID NO：166-174及176-200所述之序列。
本文亦提供特異性結合ErbB3之抗ErbB3抗體，其中VH域包含與第3圖中所示之VH aa序列(例如SEQ ID NO：134-165)之aa序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的aa序列，及/或其中VL域 包含與第4圖中所示之VL aa序列(例如SEQ ID NO：166-200)之aa序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的aa序列。在某些實施例中，排除SEQ ID NO：143中所述之VH序列及/或SEQ ID NO：175中所述之VL序列。
本文亦提供特異性結合ErbB3之抗ErbB3抗體，其中VH域包含因1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或少於1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50或50-100個aa取代、添加或缺失而與第3圖中所示之aa序列(例如SEQ ID NO：134-165)不同的aa序列，且VL域包含因1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或少於1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50或50-100個aa取代、添加或缺失而與第4圖中所示之aa序列(例如SEQ ID NO：166-200)不同的aa序列。在某些實施例中，排除SEQ ID NO：143中所述之VH序列及/或SEQ ID NO：175中所述之VL序列。
抗ErbB3抗體可具有抗體(例如完全抗體(全長抗體))或其抗原結合片段之結構。舉例而言，抗ErbB3結合蛋白可包含重鏈及輕鏈，其中該重鏈按N端至C端順序包含：VH域、CH1域、鉸鏈、CH2域、CH3域及視情況存在之CH4域，且其中該輕鏈按N端至C端順序包含：VL域及CL域。恆定域較佳為人類的且可來自IgG1、IgG2、IgG3、 IgG4或其組合。恆定域可為天然存在之序列或突變型序列，其中已對天然存在之序列進行一或多個aa取代、添加或缺失。
抗ErbB3結合蛋白可包含含有選自由以下組成之群之aa序列的重鏈：P1重鏈(SEQ ID NO：362)；M27重鏈(SEQ ID NO：363)；M7重鏈(SEQ ID NO：364)；B72重鏈(SEQ ID NO：365)及B60重鏈(SEQ ID NO：366)(第5B圖)。抗ErbB3結合蛋白亦可包含含有選自由以下組成之群之aa序列的輕鏈：P1 λ輕鏈(SEQ ID NO：258)；M27 λ輕鏈(SEQ ID NO：260)；M7 λ輕鏈(SEQ ID NO：262)；B72 λ輕鏈(SEQ ID NO：264)及B60 λ輕鏈(SEQ ID NO：266)(第5B圖)。抗ErbB3結合蛋白可包含含有選自由以下組成之群之aa序列的重鏈：P1重鏈(SEQ ID NO：362)；M27重鏈(SEQ ID NO：363)；M7重鏈(SEQ ID NO：364)；B72重鏈(SEQ ID NO：365)及B60重鏈(SEQ ID NO：366)，及含有選自由以下組成之群之aa序列的輕鏈：P1 λ輕鏈(SEQ ID NO：258)；M27 λ輕鏈(SEQ ID NO：260)；M7 λ輕鏈(SEQ ID NO：262)；B72 λ輕鏈(SEQ ID NO：264)及B60 λ輕鏈(SEQ ID NO：266)。在特定實施例中，IGF-1R抗體包含具有名稱相同之aa序列的重鏈及輕鏈，例如P1重鏈與P1輕鏈、M27重鏈與M27輕鏈、M7重鏈與M7輕鏈、B72重鏈與B72輕鏈及B60重鏈與B60輕鏈。然而，重鏈及輕鏈亦可混合及匹配。舉例而言，M57重鏈可與M7輕鏈配對，且P4重鏈可與M57 輕鏈配對。
亦提供抗ErbB3抗體P1(重鏈SEQ ID NO：362，λ輕鏈SEQ ID NO：258)；M27(重鏈SEQ ID NO：363，λ輕鏈SEQ ID NO：260)；M7(重鏈SEQ ID NO：364，λ輕鏈SEQ ID NO：262)；B72(重鏈SEQ ID NO：365，λ輕鏈SEQ ID NO：264)；及B60(重鏈SEQ ID NO：366，λ輕鏈SEQ ID NO：266)；所有均為IgG1同型。
在某些實施例中，抗ErbB3結合蛋白包含含有與SEQ ID NO：362、363、364、365及366中所述之aa序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之aa序列的重鏈及/或含有與SEQ ID NO：258、260、262、264及266中所述之aa序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之aa序列的輕鏈。
在其他實施例中，ErbB3結合蛋白包含含有因1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或因1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50或50-100個aa取代、添加或缺失而與SEQ ID NO：362、363、364、365及366中所述之aa序列不同之aa序列的重鏈及/或含有因1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或因1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50或50-100個aa取代、添加或缺失而與選自由SEQ ID NO：258、260、262、264及266組成之群之aa序列不同 之aa序列的輕鏈。
抗ErbB3抗體之生物活性及特徵可利用分析(例如本文關於PBA所述之分析)來測定。抗ErbB3蛋白可配位體抑制ErbB3之磷酸化、腫瘤細胞之增殖及/或活體內抑制腫瘤生長。抗ErbB3結合部分可包含或連接於1、2、3、4個或4個以上可呈Fab、scFv形式或其他結合位點形式之其他結合位點。舉例而言，抗ErbB3結合蛋白可包含抗IGF-1R結合位點，例如抗IGF-1R scFv。
scFv抗體
亦提供scFv，例如經分離之單株scFv。示範性scFv為抗IGF-1R scFv及抗ErbB3 scFv。示範性scFv為包含由scFv連接子連接在一起之VH域及VL域的多肽。scFv之VH及VL鏈由插入VH與VL鏈之間的scFv連接子聯結在一起。scFv連接子可由10-30 aa(諸如15至20 aa)之連續aa序列組成。示範性scFv連接子為Gly-Ser連接子(SEQ ID NO：399)，其可為(Gly4Ser)n(SEQ ID NO：401)，其中n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。較佳scFv連接子包含(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：396)或(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：397)。其他較佳scFv連接子包含1-5 aa附加於(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：396)或(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：397)，例如AST，且可包含以下aa序列：AST(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：400)或AST(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：402)。
抗IGF-1R scFv抗體可包含含有一組三個包含VHCDR1、 VHCDR2及VHCDR3之VHCDR的VH域，及含有一組三個包含VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3之VLCDR的VL域，該等CDR分別包含SEQ ID NO：302、303或304、305、306或307(或308)中所述之aa序列，且其中各CDR進一步包含胺基端及羧基端，其中各組CDR之CDR在可變域中按CDR1、CDR2及CDR3之線性胺基至羧基順序排列，且其中SEQ ID NO：302、304、305、306、307(或308)中之X aa表示可為位於第1圖(VH)及第2圖(VL)中相應位置中之任何aa的可變aa。抗IGF-1R scFv可包含由第1圖中VH aa序列之群中所示之aa序列組成(例如由SEQ ID NO：8-31組成)之VH域的VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3，及/或由第2圖中VL aa序列之群中所示之aa序列組成(例如由SEQ ID NO：32-133組成)之VL域的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3。在某些實施例中，抗IGF-1R scFv不包含16F之全部六個CDR或不包含16F之VH域及/或16F之VL域。舉例而言，scFv包含有至少一個aa與16F中之序列不同的VH及VL aa序列。
抗IGF-1R scFv抗體可包含含有SEQ ID NO：1中所述之aa序列的VH域及/或含有SEQ ID NO：2(或3)中所述之aa序列的VL域，其中SEQ ID NO：1、2及3中之X aa為可為第1圖(VH域)及第2圖(VL域)中相應位置上之任何aa的可變aa。抗IGF-1R scFv抗體可包含含有第1圖中所示(例如選自由SEQ ID NO：8-31組成之群)之aa序列的VH域及/或含有第2圖中所示(例如選自由SEQ ID NO：32-133 組成之群)之aa序列的VL域。
示範性抗IGF-1R scFv包含由以下組成或至少包含以下之VH域：具有選自由SEQ ID NO：8、9、10及11組成之VH aa序列群之aa序列的VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列(此等CDR之位置展示於第1圖中)。抗IGF-1R scFv亦可包含由以下組成或至少包含以下之VL域：具有選自由SEQ ID NO：32、33、34及35組成之VL aa序列群之aa序列的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列(此等CDR之位置展示於第2圖中)。在某些實施例中，抗IGF-1R scFv包含由以下組成或至少包含以下之VH域：具有選自由SEQ ID NO：8、9、10及11組成之VH aa序列群之aa序列的VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列，及由以下組成或至少包含以下之VL域：具有選自由SEQ ID NO：32、33、34及35組成之VL aa序列群之aa序列的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列。在特定實施例中，抗IGF-1R scFv包含VH域，該VH域包含由以下組成或至少包含以下之VH域：SEQ ID No：8之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列；及由以下組成或至少包含以下之VL域：具有由SEQ ID No：32組成之aa序列的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列(M57模組)。在特定實施例中，抗IGF-1R scFv包含VH域，該VH域包含由以下組成或至少包含以下之VH域：SEQ ID No：9之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列；及由以下組成或至少包含以下之VL域：具有由SEQ ID No：33組成之aa序列的VLCDR1、VLCDR2及 VLCDR3 aa序列(模組M78)。在特定實施例中，抗IGF-1R scFv包含VH域，該VH域包含由以下組成或至少包含以下之VH域：SEQ ID No：10之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列；及由以下組成或至少包含以下之VL域：具有由SEQ ID No：34組成之aa序列的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列(模組P4)。在特定實施例中，抗IGF-1R scFv包含VH域，該VH域包含由以下組成或至少包含以下之VH域：SEQ ID No：8之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列；及由以下組成或至少包含以下之VL域：具有由SEQ ID No：33組成之aa序列的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列(模組M57/M78)。在特定實施例中，抗IGF-1R scFv包含VH域，該VH域包含由以下組成或至少包含以下之VH域：SEQ ID No：10之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列；及由以下組成或至少包含以下之VL域：具有由SEQ ID No：32組成之aa序列的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列(模組P4/M57)。
抗ErbB3 scFv抗體可包含含有一組三個包含VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3之VHCDR的VH域，及含有一組三個包含VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3之VLCDR的VL域，該等CDR分別包含SEQ ID NO：309、310或311、312、313或314(或315)中所述之aa序列，且其中各CDR進一步包含胺基端及羧基端，其中各組CDR之CDR在可變域中按CDR1、CDR2及CDR3之線性胺基至羧基順序排列，且其中SEQ ID NO：309、310或311、312、313或314(或315) 中之X aa表示可為位於第1圖(VH)及第2圖(VL)中相應位置中之任何aa的可變aa。抗ErbB3 scFv可包含由第3圖中VH aa序列之群中所示之aa序列組成(例如由SEQ ID NO：134-165組成)之VH域的VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3，及/或由第4圖中VL aa序列之群中所示之aa序列組成(例如由SEQ ID NO：166-200組成)之VL域的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3。在某些實施例中，抗ErbB3 scFv不包含16F之全部六個CDR或不包含16F之VH域及/或16F之VL域。舉例而言，scFv包含有至少一個aa與16F中之序列不同的VH及VL aa序列。
抗ErbB3 scFv抗體可包含含有SEQ ID NO：4(或5)中所述之aa序列的VH域及/或含有SEQ ID NO：6(或7)中所述之aa序列的VL域，其中SEQ ID NO：4、5、6及7中之X aa為可為第3圖(VH域)及第4圖(VL域)中相應位置上之任何aa的可變aa。抗ErbB3 scFv抗體可包含含有第3圖中(例如選自由SEQ ID NO：134-165組成之群)之aa序列的VH域及/或含有第4圖中(例如選自由SEQ ID NO：166-200組成之群)之aa序列的VL域。
示範性抗ErbB3 scFv包含由以下組成或至少包含以下之VH域：具有選自由SEQ ID NO：134-143組成之VH aa序列群之aa序列的VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列(此等CDR之位置展示於第3圖中)。抗ErbB3 scFv亦可包含由以下組成或至少包含以下之VL域：具有選自由 SEQ ID NO：166-175組成之VL aa序列群之aa序列的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列(此等CDR之位置展示於第4圖中)。在某些實施例中，抗ErbB3 scFv包含由以下組成或至少包含以下之VH域：具有選自由SEQ ID NO：134-143組成之VH aa序列群之aa序列的VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列，及由以下組成或至少包含以下之VL域：具有選自由SEQ ID NO：166-175組成之VL aa序列群之aa序列的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列。在特定實施例中，抗ErbB3 scFv包含VH域，該VH域包含由以下組成或至少包含以下之VH域：SEQ ID No：134之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列；及由以下組成或至少包含以下之VL域：具有由SEQ ID No：166組成之aa序列的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列(模組B60)。在特定實施例中，抗ErbB3 scFv包含VH域，該VH域包含由以下組成或至少包含以下之VH域：SEQ ID No：135之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列；及由以下組成或至少包含以下之VL域：具有由SEQ ID No：167組成之aa序列的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列(B72)。在特定實施例中，抗ErbB3 scFv包含VH域，該VH域包含由以下組成或至少包含以下之VH域：SEQ ID No：136之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列；及由以下組成或至少包含以下之VL域：具有由SEQ ID No：168組成之aa序列的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列(模組M27)。在特定實施例中，抗ErbB3 scFv包含VH域，該VH域包 含由以下組成或至少包含以下之VH域：SEQ ID No：137之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列；及由以下組成或至少包含以下之VL域：具有由SEQ ID No：169組成之aa序列的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列(M7模組)。在特定實施例中，抗ErbB3 scFv包含VH域，該VH域包含由以下組成或至少包含以下之VH域：SEQ ID No：138之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列；及由以下組成或至少包含以下之VL域：具有由SEQ ID No：170組成之aa序列的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列(P1模組)。在特定實施例中，抗ErbB3 scFv包含VH域，該VH域包含由以下組成或至少包含以下之VH域：SEQ ID No：139之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列；及由以下組成或至少包含以下之VL域：具有由SEQ ID No：171組成之aa序列的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列(M27模組)。在特定實施例中，抗ErbB3 scFv包含VH域，該VH域包含由以下組成或至少包含以下之VH域：SEQ ID No：140之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列；及由以下組成或至少包含以下之VL域：具有由SEQ ID No：172組成之aa序列的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列(B69模組)。在特定實施例中，抗ErbB3 scFv包含VH域，該VH域包含由以下組成或至少包含以下之VH域：SEQ ID No：141之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列；及由以下組成或至少包含以下之VL域：具有由SEQ ID No：173組成之aa序列的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列(P6模組)。 在特定實施例中，抗ErbB3 scFv包含VH域，該VH域包含由以下組成或至少包含以下之VH域：SEQ ID No：142之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列；及由以下組成或至少包含以下之VL域：具有由SEQ ID No：174組成之aa序列的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列(M1.3模組)。在特定實施例中，抗ErbB3 scFv包含VH域，該VH域包含由以下組成或至少包含以下之VH域：SEQ ID No：143之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列；及由以下組成或至少包含以下之VL域：具有由SEQ ID No：175組成之aa序列的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列(C8模組)。在特定實施例中，抗ErbB3 scFv包含VH域，該VH域包含由以下組成或至少包含以下之VH域：SEQ ID No：136之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3 aa序列；及由以下組成或至少包含以下之VL域：具有由SEQ ID No：169組成之aa序列的VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3 aa序列(M27/M7模組)。
示範性scFv為抗IGF-1R scFv抗體P4(SEQ ID NO：367)、M57(SEQ ID NO：368)、M78(SEQ ID NO：369)及M76(SEQ ID NO：382)；以及抗ErbB3 scFv抗體C8(SEQ ID NO：370)、P1(SEQ ID NO：371)、M1.3(SEQ ID NO：372)、M27(SEQ ID NO：373)、P6(SEQ ID NO：374)、B69(SEQ ID NO：375)及P6L(SEQ ID NO：383)。
scFv亦可包含因一或多個aa添加、缺失或取代而分別與本文所述之CDR、可變域或全長scFv不同，同時仍保 留其結合性質之CDR、可變域或其全長aa。舉例而言，CDR可有1或2個aa與本文提供之CDR序列不同；可變域可有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個aa與本文提供之可變域序列不同；且scFv可有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50個aa分別與本文提供之scFv不同。scFv亦可包含與本文提供之CDR、可變域或全長scFv序列至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致之CDR、可變域或其全長aa序列。在一個實施例中，scFv包含與選自由SEQ ID NO：367、368、369、370、372、373、374及375組成之scFv序列之群之aa序列至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的aa序列。
在某些實施例中，scFv在VL域之胺基端或羧基端上包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸。舉例而言，若相關scFv之羧基端為可由酶(諸如羧肽酶)修剪掉之aa(例如離胺酸或精胺酸)，則可添加一或多個aa以防止aa被修剪。舉例而言，可將來自CL域之aa「RT」添加至抗IGF-1R scFv中之羧基端「VEIK」，如例如SEQ ID NO：367-369中所示。
核酸、表現載體及宿主細胞
本文提供編碼本文所述之多肽的核酸，例如DNA或RNA。本文提供之示範性核苷酸序列為編碼第1-7圖中所 示之aa序列的核苷酸序列，諸如附錄中所示之核苷酸序列，或其部分，諸如編碼1、2、3、4或5個域之部分。亦涵蓋與編碼本文所述之aa序列之核苷酸序列(例如本文所述之核苷酸序列)至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致的核苷酸序列。該等核苷酸序列可編碼本文所述之蛋白質或可編碼與本文所述之蛋白質或其部分(例如域)至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%一致或類似之蛋白質，諸如第1-7圖中任一者所示之aa序列。
編碼具有前導序列之16F之重鏈(aa序列SEQ ID NO：300)的核苷酸序列闡述為SEQ ID NO：299。編碼具有前導序列之16F之輕鏈(aa序列SEQ ID NO：298)的核苷酸序列闡述為SEQ ID NO：297。
在某些實施例中，核酸編碼包含前導序列(或信號肽)之抗體之重鏈及/或輕鏈。示範性前導序列為第7圖中關於16F所示之前導序列。因此，本文亦提供連接於前導序列(諸如第7圖中所示者)之抗體(例如第5及6圖中所示者)，及編碼該等抗體之核酸。
在某些實施例中，核酸連接於增強或啟動核苷酸序列在細胞中之表現以產生蛋白質的序列。該等核酸可涵蓋於載體(例如表現載體)中。為表現作為跨膜蛋白之蛋白質，較佳亦包括信號序列，例如第7A圖中所示之信號序 列，該信號序列常刪除以形成成熟蛋白質。
本文亦涵蓋包含本文提供之核酸或載體之細胞，例如宿主細胞。
本文所述之抗體可藉由重組方式產生。用於重組產生之方法在現有技術狀態中廣泛已知且包含在原核及真核細胞進行蛋白質表現，並隨後分離抗體且通常純化至醫藥學上可接受之純度。為在宿主細胞中表現抗體，藉由標準方法將編碼各別多肽(例如輕鏈及重鏈)之核酸插入表現載體中。在適當原核或真核宿主細胞(如CHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母或大腸桿菌(E.coli)細胞)中進行表現，且自細胞(溶解後之上清液或細胞)回收結合蛋白。用於重組產生抗體之一般方法在此項技術中為熟知的。
抗體可藉由習知免疫球蛋白純化程序，諸如蛋白質A-瓊脂糖、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析自培養基分離。編碼抗體之DNA及RNA易於使用習知程序分離及定序。融合瘤細胞可用作該DNA及RNA之來源。分離後，可將DNA插入表現載體中，接著將該等表現載體轉染至不以其他方式產生免疫球蛋白之宿主細胞(諸如HEK 293細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞)中，以在宿主細胞中獲得重組抗體之合成。
可藉由將適當核苷酸變化引入抗體DNA中或藉由核苷酸合成來製備抗體之胺基酸序列變異體(例如突變體)。
「宿主細胞」表示可工程改造以產生本文所述之抗體 的任何種類之細胞系統。在一個實施例中，使用HEK293細胞及CHO細胞作為宿主細胞，在另一實施例中使用CHO或NSO細胞。
適於原核生物之控制序列例如包括啟動子，視情況包括操縱子序列，及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、強化子及聚腺苷酸化信號。
當核酸與另一核酸序列處於功能性關係中時，該核酸為「可操作地連接」的。舉例而言，序列前體或分泌前導序列之DNA在其表現為參與多肽之分泌中之蛋白質前體的情況下可操作地連接於該多肽之DNA；啟動子或強化子在其影響編碼序列之轉錄的情況下可操作地連接於該編碼序列；或核糖體結合位點在其位置促進轉譯之情況下可操作地連接於編碼序列。一般而言，「可操作地連接」意謂所連接之DNA序列為毗連的，且在分泌前導序列之情況下為毗連的且處於閱讀框中。然而，強化子不必為毗連的。連接藉由在適宜限制性位點進行連接來實現。若該等位點不存在，則根據習知實踐使用合成寡核苷酸接頭或連接子。
可藉由標準技術進行抗體之純化以消除細胞組分或其他污染物，例如其他細胞核酸或蛋白質，該等標準技術包括鹼性/SDS處理、CsCl分層、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中熟知之其他技術。不同方法已充分確立且廣泛用於蛋白質純化，諸如利用微生物蛋白質之親和層析(例如蛋白質A或蛋白質G親和層析)、離子交換 層析(例如陽離子交換(羧甲基樹脂)、陰離子交換(胺基乙基樹脂)及混合模式層析)、親硫吸附(例如利用β-巰基乙醇及其他SH配位體)、疏水性相互作用或芳族吸附層析(例如利用苯基-瓊脂糖凝膠、親氮雜芳烴樹脂或間胺基苯基硼酸)、金屬螯合親和層析(例如利用Ni(II)及Cu(II)親和材料)、尺寸排阻層析及電泳方法(諸如凝膠電泳、毛細管電泳)。
使用本文提供之抗體之方法
本文提供使用本文所述之抗體，例如抗IGF-1R+抗ErbB3 PBA、抗IGF-1R抗體及抗ErbB3抗體用於治療性應用之方法。本文揭示之抗體可用於治療與ErbB3及/或IGF-1R依賴性信號傳遞相關之疾病或病症，包括多種癌症。
在一個實施例中，提供用於抑制表現IGF-1R及ErbB3之腫瘤細胞之增殖的方法，其包含使腫瘤細胞與抗IGF-1R+抗ErbB3雙特異性(視情況為多價)抗體接觸，以使得腫瘤細胞之增殖受到抑制、減緩或停止，或使得腫瘤細胞死亡。
本文提供用於治療與ErbB3及/或IGF-1R依賴性信號傳遞相關之疾病或病症之方法，其藉由向患者投與有效治療該疾病或病症之量的本文揭示之抗體來進行。適合疾病或病症包括例如多種癌症，包括(但不限於)乳癌及下文所述之癌症。在一個實施例中，用於治療患有增生性疾 病(諸如癌症)之個體的方法包含向有需要之個體投與治療有效量之一或多種本文所述之抗體，諸如抗IGF-1R+抗ErbB3雙特異性抗體。
亦提供用於治療患者之表現IGF-1R及ErbB3之腫瘤的方法(或雙特異性抗體，例如在用於治療該腫瘤之藥物中)，該方法包含投與有效量之如本文所述之抗體(例如有效使腫瘤生長減緩或停止，或使腫瘤收縮，或使腫瘤侵襲或腫瘤轉移減緩或停止)。可治療任何表現IGF-1R及ErbB3之腫瘤，包括以下癌症之腫瘤：肺癌、肉瘤、結腸直腸癌、胰臟癌、前列線癌、腎細胞癌、頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)、黑素瘤及乳癌。該等腫瘤之特定實例包括：非小細胞肺癌、尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、他莫昔芬(tamoxifen)抗性雌激素受體陽性乳癌、曲妥珠單抗抗性或拉帕替尼(lapatinib)抗性HER2陽性轉移性乳癌、吉非替尼(gefitinib)抗性或埃羅替尼(erlotinib)抗性肺癌、西妥昔單抗抗性或盤尼圖單抗抗性結腸直腸癌、西妥昔單抗抗性頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)及埃羅替尼抗性胰臟癌。
亦提供包含一或多種本文揭示之抗體的套組。該等套組可包括指示套組內含物之預定用途且視情況包括使用該套組治療與ErbB3及/或IGF-1R依賴性信號傳遞相關之疾病或病症(例如治療腫瘤)之說明的標簽。術語標簽包括於套組上或與套組一起供應或以其他方式伴隨套組之任何書面、銷售材料或記錄材料。
本文提供之治療腫瘤之方法可進一步包含投與第二抗 癌劑與該抗體之組合。因此涵蓋新穎醫藥組合物，其包含本文揭示之抗體，連同第二抗癌劑(通常為生物藥劑)一起，連同至少一種醫藥學上可接受之載劑或賦形劑一起。
醫藥組合物
在另一態樣中，提供用於治療患者之腫瘤的組合物(例如醫藥組合物)以及使用各該組合物治療患者之腫瘤的方法。本文提供之組合物含有與醫藥學上可接受之載劑調配於一起的一或多種本文揭示之抗體。如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑、及其生理上相容之類似物。較佳地，載劑適於靜脈內、肌肉內、皮下、非經腸、脊柱或表皮投藥(例如藉由注射或輸注)。視投藥途徑而定，抗體可包覆於物質中以保護其免遭酸或其他可能不活化蛋白質之自然條件作用。
醫藥組合物可單獨投與或與療法組合(亦即與其他藥劑)投與。舉例而言，組合療法可包括本發明之抗體與至少一種其他治療劑，諸如抗癌劑。醫藥組合物亦可與另一抗癌治療模態(諸如放射療法及/或手術)結合投與。
本發明之組合物可藉由此項技術中已知之多種方法投與。如熟習此項技術者所瞭解，投藥之途徑及/或模式將視所要結果而變。
為藉由某些投藥途徑投與本文提供之組合物，可能有必要或需要將抗體用防止其不活化之物質塗佈或將抗體與防止其不活化之物質共投與。舉例而言，抗體可於適當載劑中(例如於脂質體或稀釋劑中)投與患者。醫藥學上可接受之稀釋劑包括生理食鹽水及水性緩衝溶液。脂質體包括水包油包水CGF乳液以及習知脂質體。
醫藥學上可接受之載劑包括無菌水性溶液或分散液以及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。該等介質及藥劑用於醫藥活性物質之用途在此項技術中為已知的。除非任何賦形劑、稀釋劑或藥劑與活性化合物不相容，否則涵蓋其在本文提供之醫藥組合物中之使用。亦可將補充性活性化合物(例如其他抗癌劑)併入組合物中。
治療性組合物通常必須無菌且在製造及儲存條件下穩定。組合物可調配為溶液、微乳液、脂質體或適於高藥物濃度之其他有序結構。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物的溶劑或分散介質。生理食鹽水溶液及水性右旋糖及甘油溶液可用作液體載劑，尤其用於可注射溶液。必要時，組合物亦可含有少量濕潤劑或溶解度增強劑、穩定劑、防腐劑或pH值緩衝劑。在許多情況下，在組合物中包括等張劑(例如氯化鈉)、糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇、甘油、丙二醇及液體聚乙二醇)為適用的。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包 括延遲吸收之藥劑(例如單硬酯酸鹽及明膠)來達成。
實例
以下實例不應視為限制本發明之範疇。
材料及方法
在實例通篇中，除非另外說明，否則使用以下材料及方法。一般而言，除非另外指示，否則本發明技術之實施採用化學、分子生物學、重組DNA技術、免疫學(尤其例如抗體技術)、藥理學、製藥學之習知技術以及多肽製備中之標準技術。
配位體
如此等實例及圖式中所用，「HRG」係指稱為異調蛋白1 β 1之異調蛋白同功異型物(有時稱為HRG1-B、HRG-β 1、神經調節蛋白1(neuregulin 1)、NRG1、神經調節蛋白1 β 1、NRG1-b1或HRG ECD)，例如R&D Systems,377-HB-050/CF。如此等實例及圖式中所用，IGF-1係指胰島素樣生長因子1，例如R&D Systems,291-GI-050/CF。
細胞系
下文所述之實例中所用之所有人類細胞系可如所述自美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC,Manassas,VA)或美國國家癌症研究院(US National Cancer Institute；NCI)，例如自癌症治療及診斷學分部(Division of Cancer Treatment and Diagnostics；DCTD)獲得。
˙MCF7-ATCC®目錄號HTB-22TM
˙ADRr-NCI(登記為NCI/ADR-RES)
˙BxPC-3-ATCC®目錄號CRL-1687TM
˙DU145-ATCC®目錄號HTB-81TM
˙Caki-1-ATCC®目錄號HTB-46TM
˙SK-ES-1-ATCC®目錄號HTB-86TM
使用小鼠抗人類IGF-1R單株抗體mAb391(IgG1，R&D Systems MAB391)作為抗IGF-1R IgG抗體對照。
實例1：靶向多種信號傳遞路徑之抗體治療劑的合理工程改造
ErbB路徑因ErbB受體在特定癌症類型中之高度表現而長期受到癌症研究關注：HER2/ErbB2為在一些乳癌中擴增之基因，且EGFR/ErbB1在結腸癌及NSCLC中高度表現。對於該路徑之兩個成員EGFR/ErbB1及HER2/ErbB2，已批准單株抗體藥劑(例如西妥昔單抗及曲妥珠單抗)及小分子酪胺酸激酶抑制劑(例如埃羅替尼、拉帕替尼)。此等治療劑干擾細胞外刺激物活化下游細胞內信號傳遞網路之能力；然而，鑒於ErbB信號傳遞網路十分複雜(第9A圖)，因此難以確定何者代表最佳治療策略。除EGFR/ErbB1及HER2/ErbB2(缺乏配位體結合活性)外，ErbB路徑亦存在兩個其他成員-ErbB3(激酶死亡(kinase-dead))及ErbB4。所有四種受體在配位體活化後均可不同程度地 彼此二聚化，促成細胞內信號傳輸所需要之必需步驟。二聚化後，受體可內化且以取決於二聚體類型以及下游信號傳遞路徑(諸如PI3K路徑)之活化狀態之速率再循環。
ErbB網路之複雜性與量測關鍵組分之豐度及活化狀態之能力組合使得該網路適合進行計算模擬。藉由使用計算模擬，多種生物現象可得到充分描述，諸如受體轉運之二聚化依賴性、信號擴增經由反饋環路之控制及信號傳播之配位體依賴性。舉例而言，為確定抑制ErbB路徑之最佳策略，建立網路模型來描述PI3K/AKT路徑回應於配位體乙胞素及異調蛋白之活化，該等配位體分別選擇性活化EGFR/ErbB1或ErbB3異二聚體。該機械模型表示以下過程：配位體結合；受體二聚化；受體轉運及信號傳播，以及由質量作用動力學定義之一系列反應。為作出可靠預測，須首先使用捕捉關鍵動態事件，特定言之ErbB受體及PI3K/AKT路徑之活化的時間及劑量依賴性實驗對機械模型進行訓練。藉由敏感性分析鑒別具有最大影響之網路組分，在該敏感性分析中精細干擾網路之各組分且評定對下游輸出之相對貢獻(第9B圖)。
使用該等方法，產生ErbB網路之計算模型，其鑒別出激酶死亡ErbB3為PI3K/AKT路徑之最強活化因子。實際上，儘管在異調蛋白或乙胞素存在下ErbB3之表現量低， 但ErbB3仍提供對模型中PI3K/AKT路徑活化之最強貢獻。值得注意的是，此電腦(in silico)觀測甚至適用於表現相對少量ErbB3及量高達10倍之EGFR/ErbB1或HER2/ErbB2的細胞系。
除鑒別最佳目標外，機械模擬亦可用於確定最佳治療設計特徵。在靶向激酶死亡ErbB3之情況下，治療性單株抗體之最佳化模擬利用若干設計特徵，諸如與ErbB3之結合、阻止異調蛋白結合及阻斷二聚化，其中特別關注阻斷配位體誘導之EGFR/ErbB3二聚化。模擬用於經由模擬一定解離速率常數範圍內之抑制劑確定達成AKT磷酸化之最大抑制所需的親和力。根據此模擬，預測1奈莫耳濃度之親和力足以達成最大抑制劑效力，而更高親和力抑制劑僅顯示有限提高(第9C圖)。
雙特異性藥劑與生物系統相互作用之複雜性增加產生甚至更大的利用機械模擬來指導工程改造努力的機會。所有雙特異性蛋白質以與對各目標之親和力、親合性增強之交聯能力及各目標之相對豐度相關的方式結合其目標。設計針對有效抑制最佳化之雙特異性劑亦需要關於競爭性配位體及二聚化搭配物(若其存在)之親和力以及活化共同下游信號傳遞級聯中各目標之相對強度及後續細胞生長及存活機制的知識。合意表觀Kd可經由多輪親和力及親合性改良達成，且模擬模型可指導工程改造努 力朝向最適合分子格式及流線最佳化途徑發展。模擬可用於探究雙特異性蛋白質構想用於轉換目標親和力、親合性及目標表現量之效能。
旨在以針對各目標之單一結合部分抑制兩種細胞表面生長因子受體(IGF-1R、ERBB3)的雙特異性抗體
所有雙特異性蛋白質以與對各目標之親和力、親合性增強之交聯能力及各目標之相對豐度相關的方式結合其目標；雙特異性劑與生物系統相互作用之複雜性增加產生甚至更大的利用機械模擬來指導工程改造努力的機會。設計針對有效抑制最佳化之雙特異性劑亦需要關於競爭性配位體及二聚化搭配物(若其存在)之親和力以及活化共同下游信號傳遞級聯中各目標之相對強度及後續細胞生長及存活機制的知識。合意表觀Kd可經由多輪親和力及親合性改良達成，且模擬模型可指導工程改造努力朝向最適合分子格式及流線最佳化途徑發展。模擬可用於探究雙特異性蛋白質構想用於轉換目標親和力、親合性及目標表現量之效能。
在該系統中模擬旨在以針對各目標之單一結合部分抑制兩種細胞表面生長因子受體(IGF-1R及ErbB3)之雙特異性抗體的劑量反應行為揭示當ErbB3表現較高時IGF-1R受到更有效抑制，且當ErbB3表現較低時抑制效力較低(第10A圖)。因此，雙特異性抗體抑制IGF-1R之能力取 決於其有效結合。此現象對目標之相對表現及雙特異性抗體針對目標之相對親和力具特異性：IGF-1R之表現對ErbB3抑制影響較小，因為雙特異性抗體模擬成結合ErbB3之親和力比IGF-1R高(第10B圖)。對於雙特異性抑制劑，此受體含量依賴性行為可嚴重限制總體功效，如對兩種路徑所共有之下游細胞內讀數AKT的模擬影響所示：預測當ErbB3表現不足時對pAKT之抑制作用不佳，因為IGF-1R未受到充分抑制(第10C圖)。此模型系統之模擬揭示針對各目標之雙特異性抑制劑的效能可高度取決於兩種目標之相對表現；該資訊可用於治療性設計。
受體含量依賴性對雙特異性劑效力之影響可經由模擬多種假定癌細胞來廣泛研究，其中各目標之表現量在臨床上相關之範圍內變化且計算各目標及下游讀數之IC50並在反應表面上繪圖。IC50反應表面之形狀取決於潛在路徑相互作用。ErbB3為下游信號傳遞之較強活化因子，且界定雙特異性抑制劑將最有效之區域。模擬具有針對各目標之單一結合部分的雙特異性劑揭示對下游目標之最有效抑制作用集中於具有相等目標表現之區域。實際上，當任一目標過度表現少至5倍時，IC50值可增加多達100倍，效力產生實質性損失。
將腫瘤細胞系或臨床樣品中之實際目標含量定位於IC50反應表面上可用於藉由揭示最有效抑制作用區域是 否與相關患者群體重疊來指導治療性改良努力。可首先經由模擬研究變換所預測最佳效力之區域以治療不同或更廣泛患者群體的策略。IgG樣雙特異性抗體具有兩個針對各目標之結合部分且因此除交叉目標親合性外亦展現相同目標親合性，從而提高對各目標之有效結合親和力。模擬具有等於二價雙特異性蛋白質之單價結合親和力的IgG樣雙特異性抗體展示此格式關於效能對交叉目標親合性之依賴性較低：最佳效力之區域比單價雙特異性廣。因此，若目的在於治療更廣患者群體，則模型預測將可使用IgG樣雙特異性設計。
在改良最佳效力區域時對抗體功能進行親和力成熟之效益亦可經由模擬來檢驗。模擬非最佳四價雙特異性劑在受體空間範圍內之下游目標抑制鑒別出不良抑制之區域，尤其在IGF-1R表現較高時。經由降低解離速率使雙特異性劑針對IGF-1R之單價結合親和力增加至10倍預測親和力成熟將達成之提高。在IGF-1R表現較高及ErbB3表現較高之兩種情況下下游目標均受到顯著更有效地抑制，表明針對一個目標之親和力成熟經由交叉目標親合性增強針對第二目標之效力。
將該等考慮因素設定為概念驗證IgG樣雙特異性治療性蛋白質之最佳化方案之準則，該等治療性蛋白質顯示有效抑制生長因子誘導之信號傳遞及在異種移植物模型 中抑制腫瘤，從而確認該設計準則。此蛋白質包含針對IGF-1R之IgG抗體框架及針對ErbB3之兩個C端融合scFv模組，但不適於下游開發，因為其含有不具有足夠固有穩定性之不穩定scFv模組。此現象已充分瞭解且已描述使用多種技術針對穩定性對scFv模組進行工程改造，該等技術包括連接子最佳化、二硫鍵工程改造、靶向突變誘發、共變異分析、穩定框架上之環移植、結構指導之設計、聚焦設計及噬菌體呈現。
為將scFv模組親和力及穩定性之最佳化組合於單個方案內，使用結構指導之設計、酵母表面呈現及微小規模生物物理學表徵之組合。設計結構指導之scFv變異體，其中引入穩定性增強突變，對賦予潛在CMC不利作用之基元進行突變，移除或置換非典型框架aa，且在CDR之低多樣性部分中引入變異。因為酵母細胞具有真核生物轉譯後修飾及多肽輸出機構，因此監測表面表現量，該表現量據報導預測熱穩定性及可溶性分泌效率。除熱激發外，亦開發「燒煮結合(cook-and-bind)」方案。在此實驗中，不穩定scFv模組伸展，而穩定的高親和力蛋白質保持結合於抗原且因此增濃(第11A圖)。分離個別純系後，對融合於酵母表面之scFv進行激發且基於藉由流動式細胞測量術量測之殘餘親和力選擇純系。酵母表面上展示Kd提高10倍之熱穩定性scFv模組產生為可溶性蛋 白質且選擇顯示抗原結合改良、抑制生長因子信號傳遞及可接受之穩定性的蛋白質。使此等最佳化scFv模組以C端融合於IGF-R1抗體。在短暫表現系統中表現所得IgG樣蛋白質，使用蛋白質A層析進行純化，且使用生物物理學、生物活性及細胞信號傳遞分析進行概況分析。在多種適用生物物理學技術中，發現微差掃描螢光及熱不活化分析在1至5微克規模下提供最多資訊。由微差掃描螢光概況分析及熱不活化分析構成之微小規模篩分允許選擇具有提高之血清及聚集穩定性之雙特異性劑。微差掃描螢光概況分析及熱不活化分析得到關於穩定性最低蛋白質域之伸展速率及聚集速率的互補資訊。此等資料定性預測IgG樣雙特異性抗體之血清及聚集穩定性(第12圖)。具有穩固敏感性微小規模分析之重要性難以高估，因為其直接轉變成在單個設計方案內審查較大數量之不同候選物的能力。使用正常規模分析：與表現兩種目標之BxPC-3細胞之結合來確認經工程改造之IgG樣雙特異性蛋白質的改良之效力及穩定性(第13圖)。此表明，特徵在於對多功能性蛋白質之模組進行平行聚焦工程改造，接著進行高流通量製備及表徵的方法通常適用於在一個治療性設計循環之情形中提高目標雙特異性抗體樣蛋白質之效力及可製造性。
實例2：IgG四價雙特異性蛋白質之製備、表現及純化
基本上如下製備用於實例3中所述之實驗中的三種抗ErbB3-抗IGF-1R IgG2四價雙特異性蛋白質(「ELI-7」、「ILE-10」及「ILE-12」)及其他對照蛋白質。ELI-7、ILE-10及ILE-12具有結構IgG2(scFv)2。
ELI-7為包含抗ErbB3 IgG2抗體之抗ErbB3/抗IGF-1R IgG2四價雙特異性蛋白質，其中抗IGF-1R scFv連接於IgG2蛋白質之重鏈之各C端。
ELI-10及ILE-12為包含抗IGF-1R IgG2抗體之抗IGF-1R/抗ErbB3 IgG2四價雙特異性蛋白質，其中抗ErbB3 scFv連接於IgG2蛋白質之重鏈之各C端。
ELI-7、ILE-10及ILE-12之結構及關係闡明於表6中。簡言之，其均包含相同抗IGF-1R VH序列(「模組5-7」)。ILE-10與ILE-12僅在ErbB3 scFv之序列上不同。ILE-10與ELI-7包含相同抗IGF-1R及抗ErbB3 VH序列，且不同之處在於ILE-10具有IGF-1R Fab及ErbB3 scFv(「ILE」)且ELI-7具有相反組態(「ELI」)。對照抗體為單特異性且各自包含與雙特異性抗體中所存在之結合位點同源的結合位點。
本文實例2-3之許多揭示內容(包括ELI-7、ILE-10及ILE-12)可見於PCT申請案PCT/US2010/052712中。
各蛋白質之輕鏈及重鏈的aa序列如下：ELI-7之重鏈：SEQ ID NO：316。ELI-7之輕鏈：SEQ ID NO：317。ILE-10之重鏈：SEQ ID NO：318。ILE-12之重鏈：SEQ ID NO：319。ILE-10及IL-12之輕鏈：SEQ ID NO：320。
使用標準重組DNA技術將編碼該等蛋白質(稱為「融合蛋白」)之核酸作為單一蛋白質選殖至表現質體中。所用表現載體為pMP 10K(SELEXIS)。將表現質體線性化，使用QIAquick®純化套組(QIAGEN)純化，且使用LipofectamineTM LTX(Invitrogen)共轉染至CHO細胞中。轉染之細胞在無選擇壓力下利用含有10% FBS之F12Hams培養基恢復2天，接著在選擇壓力下恢復4天。4天後，在選擇壓力下將其更換至含有麩胺醯胺之無血清培養基(Hyclone)中。一週後，檢查細胞之表現且放大至所要體積。使用三個層析步驟之組合純化所有蛋白質：蛋白質A親和層析、陽離子交換層析及陰離子交換層析。各自根據製造商之說明進行。蛋白質A親和層析步驟用於將融合蛋白自收集之細胞培養物流體(HCCF)中選擇性地且有效地結合出來。此步驟在單一步驟中以高產率及高流 通量移除>95%之產物雜質。此步驟後融合蛋白之所要分子形式之部分在百分之60至98範圍內。使用來自GE之MABSELECT作為蛋白質A親和樹脂。在第二層析步驟中使用來自GE之SPFF(磺丙基速流(sulphopropyl fast flow))(一種基於瓊脂糖之樹脂)作為陽離子交換樹脂。此步驟後融合蛋白之所要分子形式之部分在百分之90至99範圍內。在第三及最終層析步驟中使用來自GE之QSFF(四級胺瓊脂糖凝膠速流(Quaternary-amine sepharose fast flow))(一種基於瓊脂糖之陰離子交換樹脂)。將經純化之物質濃縮且透析至PBS中。此步驟後融合蛋白之最終產率在20 mg-100 mg/L之範圍內。
實例3：抗ErbB3+抗IGF-1R IgG四價雙特異性蛋白質之結合及生物活性
此實例展示抗IGF-1R+抗ErbB3 IgG四價雙特異性蛋白質(ELI-7)以高親和力結合IGF-1R及ErbB3(亦如對於兩種類似蛋白質ILE-10及ILE-12所示)，有效抑制1)自IGF-1R及ErbB3受體開始之信號轉導，2)AKT磷酸化，及3)活體外及活體內之腫瘤細胞增殖。基本上如下獲得結果。
A)ELI-7、ILE-10及ILE-12與IGF-1R及ErbB3之結合
將1×105個MCF7細胞或1×105個ADRr細胞在室溫下與2 μM之ELI-7、ILE-10及ILE-12(兩種抗ErB3抗體及一種抗IGF-1R抗體)各自一起培育2小時，接著進行12次 後續3倍稀釋。接著使用山羊抗HSA-Alexa647結合之抗體作為偵測抗體，將細胞在冰上培育40分鐘。藉由FACS評定抗體對MCF7及ADRr細胞之細胞結合解離常數(結合親和力之量度)且測定各蛋白質之表觀解離常數。獲得以下結果(亦參見第14A及14B圖)。
結果展示IgG雙特異性劑(亦即ELI-7、ILE-10、ILE-12)結合於兩種細胞類型，在一些情況下在低濃度下具有較強結合，表明有效結合及能夠結合各受體。IgG雙特異性劑對於等效單株抗體組分具有類似Kd。
B)ELI-7及ILE-7對IGF-1R、ErbB3及Akt之信號抑制作用
ELI-7及ILE-7拮抗IGF-1R及ErbB3以及抑制下游組分IGF-1R、ErbB3及Akt活化(磷酸化)之能力；檢查磷酸化。將3.5×104個BxpC-3細胞與0.3 μM之抗體一起預培育1小時，接著進行9次後續3倍稀釋以得到10點曲線。細胞用80 ng/ml之IGF-1及20 ng/ml之異調蛋白處理15 分鐘。藉由ELISA(R & D Systems；目錄號DYC1770)量測產生磷酸化IGF-1R(pIGF-1R)之IGF-1R磷酸化，以評估藥劑抑制pIGF-1R形成之能力。藉由ELISA(R & D Systems；目錄號DYC1769)ErbB3之磷酸化，以評估藥劑抑制pErbB3形成之能力。使用以下抗體藉由ELISA量測AKT之磷酸化：抗AKT，純系SKB1(Millipore，目錄號05-591)；生物素化抗磷酸化AKT(Ser473特異性；Cell Signaling Technology目錄號5102)。ILE-7為具有與ELI-7相同之結合位點的三價蛋白質且描述於PCT/US2010/052712中。第15A-15C圖展示基本上如上文關於ILE-7及ELI-7所述獲得之結果。所獲得之結果亦概述於下表中。
結果表明ELI-7抑制ErbB3、IGF-1R及Akt之磷酸化，即使在用IGF-1及HRG同時刺激時亦如此。
C)在二維培養物中ELI-7之細胞生長抑制作用
使用CTG分析活體外檢查ELI-7對腫瘤細胞增殖之作 用，該分析為基於螢光之分析，其量測所存在之細胞ATP之量(Promega；目錄號PR-G7572)，如相對光單位(RLU)所指示。將每孔500個細胞之DU145細胞在具有80 ng/ml IGF-1及20 ng/ml HRG且含有始於2 μM之3倍抑制劑稀釋液的培養基中培育6天。對照由在無生長因子或抗體存在下培育之DU145細胞組成。
基本上如上文所述獲得之結果表明，ELI-7抑制DU145細胞之生長(Ki=12 nM，參見第16圖)，而IGF-1R或ErbB3之抑制劑對細胞生長無影響。
對另一細胞系進行類似實驗。每孔2000個BxPC-3細胞在含有始於1 μM之3倍抑制劑稀釋液的培養基中培育6天。對照由來自人類骨髓瘤漿之IgG2 κ(Sigma Aldrich目錄號I5405)組成。
基本上如上文所述獲得之結果表明，ELI-7使BxPC-3生長抑制46%(p<0.001，學生T測試(Student's T-test))(第17圖)。
D)癌症之人類異種移植物小鼠模型中雙特異性蛋白質之腫瘤生長抑制作用
本實例展示ELI-7在癌症之小鼠模型中在兩個不同模型中抑制腫瘤生長。
首先計算各雙特異性蛋白質在小鼠體內之藥物動力學性質。將600 μg ELI-7或500 μg各連接HSA之三價對照 蛋白質(ILE-3、ILE-7及ILE-9；描述於PCT/US2010/052712中)經由尾靜脈注射至各小鼠體內(每個抑制劑及時間點4只小鼠)。此後在不同時間點抽取血液(首先處死小鼠且接著藉由心臟穿刺抽取血液)。ELI-7之時間點為：0.5、4、24、72、120、168及240小時。三價對照蛋白質之時間點為：0.5、4、8、24、28、72及120小時。對於ELI-7，使用抗人類IgG ELISA套組(BethyI labs目錄號E80-104)根據製造商之說明量測血液濃度。對於三價蛋白質，使用特異性偵測IGF-1R及ErbB3結合之ELISA套組量測血液中之濃度，將盤用經His標簽標記之人類IGF-1R塗佈，與三價蛋白質或ELI-7一起培育，接著用人類ErbB3-Fc(R&D Systems)及抗Fc-HRP偵測試劑進行偵測。使用單隔室模型計算各蛋白質之藥物動力學性質(半衰期及Cmax)。獲得以下結果：
模擬藥物特異性半衰期導致預測以下劑量將產生相等暴露量(或在ILE-7之情況下50%相當暴露量)：
接著藉由向各小鼠側腹之皮下空間中注射5×106個BxPC-3細胞(懸浮於PBS與減去生長因子之基質膠之1：1混合物中；BD Biosciences目錄號354230)來評定ELI-7對小鼠模型中人類胰臟癌異種移植腫瘤生長之影響。允許腫瘤發展7-10天(直至其達到約100-200 mm3之體積)，且接著量測各小鼠之腫瘤尺寸(π/6×長度×寬度2，其中寬度為最小量測值)。接著對小鼠進行尺寸匹配且隨後隨機分配至治療組中。接著每3天注射ELI-7、三價對照蛋白質(ILE-7)、抗ErbB3抗體、抗IGF-1R抗體或PBS對照直至研究完成。
結果(第18及19圖)顯示與對照相比，ELI-7顯著抑制 BxPC-3腫瘤之異種移植腫瘤生長：經ELI-7治療之腫瘤與PBS對照相比最終腫瘤體積小77%(p值藉由學生T測試測定)。第0天係指給藥第一天。
藉由向各小鼠側腹之皮下空間中注射5×106個DU145細胞(懸浮於PBS與減去生長因子之基質膠之1：1混合物中；BD Biosciences目錄號354230)來評定ELI-7對小鼠模型中人類前列腺癌異種移植腫瘤生長之影響。允許腫瘤發展7-10天(直至各自達到約100-200 mm3之體積)，且接著量測各小鼠之腫瘤尺寸(π/6×長度×寬度2，其中寬度為最小量測值)。接著對小鼠進行腫瘤尺寸匹配且隨後隨機分配至治療組中。接著每3天注射ELI-7、三價對照蛋白質(ILE-7)、抗ErbB3抗體、抗IGF-1R抗體或PBS對照直至研究完成。
結果(第20A及20B圖)顯示ELI-7顯著抑制DU145細胞之異種移植腫瘤生長，而對照抗IGF-1R及抗ErbB3抗體不能：經ELI-7治療之腫瘤與PBS對照相比最終腫瘤體積小50%(p值藉由學生T測試測定)。第0天係指給藥第一天。
E)ELI-7在寬泛的ErbB3及IGF-1R受體含量範圍內抑制信號傳遞
為確定ELI-7是否可在寬泛的ErbB3及IGF-1R受體含量範圍內抑制下游信號傳遞，進行以下實驗： 藉由使用pLKO.1 PURO載體(Sigma)在BxPC-3細胞中進行shRNA介導之IGF-1R或ErbB3基因表現阻斷(knockdown)來改變BxPC-3細胞受體含量。shRNA序列提供於PCT/US2010/052712中。接著藉由定量FACS量測ErbB3及IGF-1R含量且自所得分佈計算平均受體含量(參見表11之相對表現量)。為確定ELI-7之效力，對細胞進行血清饑餓且用ELI-7在37℃下預處理1小時，接著用20 ng/ml HRG+80 ng/ml IGF1刺激15分鐘。藉由針對pAKT之ELISA評定信號抑制。
結果指示ELI-7對於具有改變之受體含量的BxPC-3細胞系具有類似效力，如藉由其IC50值及重疊信賴區間所指示(參見表11)，表明ELI-7具有針對一系列受體概況之寬泛活性(第21圖)。
實例4：相對於ELI-7具有增強之活性之抗IGF-1R/抗ErbB3四價雙特異性蛋白質(16F)的生物活性
進一步改良實例2及3中所述之概念驗證蛋白質(ELI-7)以增加其對IGF-1R及ErbB3之結合親和力、生物活性、穩定性及溶解度；如實例1中所述。進行以下改變：(i)將方向由抗ErbB3作為IgG組分轉換為抗IGF-1R作為IgG組分；(ii)使用結合不同抗原決定基之抗ErbB3結合部分；(iii)對其CDR3 VH區進行親和力成熟；(iv)對抗IGF-1R IgG組分進行突變以使其穩定(穩定化突變)；及(v)將其骨架由IgG2轉換為IgG1。所得蛋白質為16F，其aa序列闡明於第7圖中。
如實例3中所述，量測作為IGF-1R磷酸化抑制作用之函數，16F相對於ELI-7之抗IGF-1R效力之增加。基本上如上文所述獲得之結果(第22圖)指示經再工程改造之蛋白質為IGF-1R信號轉導之顯著更有效抑制劑。
基本上如實例3所述量測16F、ELI-7及抗IGF-1R Ab# A(加尼圖單抗；SEQ ID 327+SEQ ID 328)與抗ErbB3 Ab# A(SEQ ID 336+SEQ ID 337)之組合經由ErbB3及經由抑制AKT磷酸化抑制信號轉導之效力。此等量測在BxPC-3細胞中在HRG及IGF1存在下進行。基本上如上文所述獲得之結果(表12)指示與ELI-7相比，16F在抑制信號轉導方面具有改良之功效，該功效與臨床級抑制劑抗IGF-1R Ab# A+抗ErbB3 Ab# A之組合的功效相當。
如實例1所述，亦顯示經再工程改造之雙特異性劑(亦即16F)之熱穩定性及血清穩定性比ELI-7高。此外，16F之聚集傾向較低：(i)16F在19 mg/ml下在PBS中在4℃下穩定，在33天內僅有約2%聚集；(ii)3次冷凍解凍循環後未觀測到單體%發生顯著變化；(iii)在4℃下振盪一天後未觀測到單體%發生顯著變化；及(iv)在37℃下培育6天時未觀測到單體%發生顯著變化。
由下文所述之其他比較實驗得到之結果亦顯示16F在抑制信號轉導方面至少與市售抗IGF-1R與抗ErbB3之組合一樣有效。
在第一組實驗中，在兩個不同細胞系(BxPC-3及DU 145)中比較在抑制IGF-1R、ErbB3或AKT磷酸化方面16F(SF-G1-C8)與抗IGF-1R Ab#B(西妥木單抗；SEQ ID 324+SEQ ID 325)、抗ErbB3 Ab# A(SEQ ID 336+SEQ ID 337)或抗IGF-1R Ab#B+抗ErbB3 Ab# A之有效性。
BxPC-3及DU145細胞維持於補充有10%胎牛血清、青黴素/鏈黴素及L-麩胺醯胺之RPMI-1640培養基中。對於信號傳遞實驗，將3.5×104個細胞於完全培養基中接種於96孔組織培養盤中。第二天，將完全培養基置換為無血清培養基且細胞在37℃下培育隔夜。細胞用指定劑量之抗體預處理1小時，並接著用100 ng/ml IGF-1(Calbiochem)及30 ng/ml HRG(R&D Systems)刺激15分鐘。將細胞用PBS洗滌並在補充有蛋白酶及磷酸酶抑制劑之MPer緩衝液中溶解。
根據製造商之方案(R&D Systems)進行磷酸化IGF-1R(pIGF-1R)及磷酸化ErbB3(pErbB3)之ELISA。用以下試劑進行磷酸化AKT(pAKT)之ELISA：抗AKT捕捉抗體(Millipore)、抗pAKT(Ser473)偵測抗體(Cell Signaling)及抗生蛋白鏈菌素-HRP(R&D Systems)。添加SUPERSIGNAL ELISA PICO化學發光受質(Pierce)並在PerkinElmer EnVision®盤讀取器上讀取各盤。將發光值繪圖且使用Graphpad Prism 5軟體計算IC50值。
基本上如上文所述獲得且展示於第23圖(BxPC-3細胞)及第24圖(DU145細胞)及表13中之結果指示與抗IGF-1R Ab# B與抗ErbB3 Ab# A之組合相比，16F顯示顯著更有效抑制經由pErbB3及pAKT之雙重路徑信號傳遞。
表13：第23圖中呈示之抑制劑處理之IC50值。
在第二組實驗中，在BxPC-3細胞中比較在抑制IGF-1R、ErbB3或AKT磷酸化方面16F(SF-G1-C8)與抗IGF-1R抗體抗IGF-1R Ab# A、抗ErB3抗體抗ErbB3 Ab# A或後兩種抗體之組合的有效性。
基本上如上文所述獲得且展示於第24圖及表14中之結果指示與抗IGF-1R Ab# A與抗ErbB3 Ab# A之組合相比，16F顯著更有效抑制經由pErbB3及pIGF-1R之雙重路徑信號傳遞。
實例5：包含SF模組之其他抗IGF-1R/抗ErbB3 IgG四價雙特異性抗體之結合及生物活性
構建其他抗IGF-1R+抗ErbB3 IgG四價雙特異性抗體。基本上如第8圖中所示藉由組合三個模組來組裝此等各PBA。各PBA包含一對重鏈融合多肽(各自包含該三個模組各自之至少一部分)，該重鏈對之各成員彼此結合且各自進一步結合於一對輕鏈中之一者。組裝成各PBA之三個模組為：1.包含兩條(基本上相同之)輕鏈及兩條重鏈之N端的N端(胺基端)Fab可變域模組；2. scFv模組；及3.插入N端Fab可變域模組與scFv模組之間的HC IgG恆定區模組。
作為融合多肽之重鏈包含N端Fab模組之重鏈部分、IgG恆定區模組及C端scFv模組。
新的抗IGF-1R+抗ErbB3抗體由表15中所述之抗IGF-1R及抗ErbB3部分組裝成按不同方向排列之模組的組合構成。對於表15及16中之每一者，所建立之各PBA包含含有一對基本上相同之重鏈多肽的融合蛋白，該等重鏈多肽各自包含按N端至C端(胺基至羧基)順序左欄中命名之 具有IgG1恆定區(G1)之各Fab模組與同一表之右欄中命名之任一scFv模組的組合。該等其他PBA之重鏈及輕鏈之aa序列闡明於第5A圖(抗IGF-1R+抗ErbB3)及第5B圖(抗ErbB3及抗IGF-1R)中。
本實例展示包含N端「SF」模組之抗體結合BxPC-3細胞，結合ErbB3，抑制IGF-1R、ErbB3及AKT磷酸化，且為穩定的。利用其他蛋白質獲得之結果闡述於實例6中。
A)BxPC-3細胞結合資料
基本上如下量測SF-G1-P1、SF-G1-P6、SF-G1-M27、SF-G1-B69、SF-G1-M1.3及SF-G1-C8(16F)與BxPC-3之結合。
BxPC-3細胞維持於補充有10%胎牛血清、青黴素/鏈黴素及L-麩胺醯胺之RPMI-1640培養基中。移除培養基且用PBS洗滌BxPC-3細胞。添加胰蛋白酶直至細胞自培養盤脫離，並接著用培養基+10%血清中和。短暫離心細胞且再懸浮於FACS緩衝液(1×PBS+2%血清+0.1%疊氮化物)中。藉由上下抽吸及推擠細胞穿過細胞過濾器使聚集物拆散成單細胞。短暫離心細胞且以2×106個細胞/毫升之密度再懸浮於FACS緩衝液中。在96孔錐形底盤中，每孔等分50 μl細胞懸浮液以得到105個細胞/孔。
將抗體在FACS緩衝液中稀釋至1 μM，且進行10次3倍稀釋，其中最後之孔僅由FACS緩衝液組成(無一次抗體)。將50 μl抗體添加至50 μl細胞中以使得第一孔中之最高最終抗體濃度為500 nM。在輕緩攪拌下將細胞與抗體在室溫下培育2小時。將盤在1,500 RPM下旋轉5分鐘，且移除上清液。離心塊在FACS緩衝液中洗滌三次。最後一次洗滌後，移除FACS緩衝液，且添加50 μl在FACS緩衝液中按1：100稀釋之抗Fc-DyLight 649二次抗 體(Abcam)。將細胞在冷室中在黑暗中在輕緩攪拌下培育1小時，再洗滌三次且再懸浮於100 μl固定緩衝液(含1%三聚甲醛、2% FBS之PBS)中。將樣品轉移至96孔U形底FACS盤(Becton Dickinson)中且在4度下保持在黑暗中直至使用。使用FACSCalibur(Becton Dickinson)讀取樣品且使用FlowJo確定中值螢光強度(MFI)。利用GraphPad PRISM使用對數(促效劑)相對於反應(三參數)非線性回歸曲線擬合進行分析。
結果(第25圖及表17中)指示該等雙特異性抗體顯示與BxPC-3細胞之強結合。
B)ErbB3結合資料
基本上如下量測SF-G1-P1、SF-G1-P6、SF-G1-M27、SF-G1-B69、SF-G1-M1.3及SF-G1-C8(16F)與重組ErbB3之結合。
將96孔 REACTI-BIND盤(Pierce)用50 μl ErbB3-His(具有C端六聚組胺酸標簽之ErbB3-於PBS中2 μg/ml)(如SEQ ID NO：403中所揭示之「六聚組胺酸」)塗佈且在4℃下培育隔夜。第二天，將盤用PBS+0.05% Tween-20(PBS-T)洗滌且在室溫下用100 μl無蛋白質阻斷緩衝液(Pierce)阻斷1小時。將盤用PBS-T洗滌且添加50 μl各雙特異性抗體重複兩份。濃度始於500 nM(於PBS-T中)且包括十份另外之兩倍稀釋液及一份空白(僅PBS-T)。將盤在室溫下培育兩小時且接著用PBS-T洗滌。添加50 μl於PBS-T中按1：40,000稀釋之抗Fc-HRP(Jackson Labs)，且將盤在黑暗中在室溫下培育1小時。盤再次用PBS-T洗滌且添加100 μl TMB受質(Thermo Scientific，以1：1混合之TMB與過氧化物溶液)。將盤在室溫下培育5-15分鐘直至出現藍色，且用100 μl停止溶液(Cell Signaling Technology)使反應停止。在PerkinElmer Envision盤讀取器上讀取450 nm下之吸光度，且利用GraphPad PRISM使用對數(促效劑)相對於反應(三參數)非線性回歸曲線擬合產生結合曲線。
結果(第26圖及表18)指示該等雙特異性抗體顯示與重組ErbB3蛋白之強結合。
C)對信號轉導之抑制作用
基本上如下量測SF-G1-P1、SF-G1-P6、SF-G1-M27、SF-G1-B69、SF-G1-M1.3及SF-G1-C8(16F)對信號轉導之抑制作用。
BxPC-3細胞維持於補充有10%胎牛血清、青黴素/鏈黴素及L-麩胺醯胺之RPMI-1640培養基中。將3.5×104個細胞於完全培養基中接種於96孔組織培養盤中。第二天，將完全培養基置換為無血清培養基且細胞在37℃下培育隔夜。細胞用指定劑量之藥物預處理1小時，並接著用100 ng/ml IGF1(Calbiochem)及30 ng/ml HRG(R&D Systems)刺激15分鐘。將細胞用PBS洗滌並在補充有蛋白酶及磷酸酶抑制劑之MPer緩衝液(「哺乳動物蛋白質 萃取試劑」Pierce Thermo Scientific)中溶解。
如上文實例4中所述進行磷酸化IGF1R(pIGF1R)、磷酸化ErbB3(pErbB3)及磷酸化AKT(pAKT)之ELISA。將相對發光單位(RLU)繪圖且使用Graphpad Prism5軟體計算IC50值。
結果(第27圖及表19)指示該等雙特異性蛋白質強烈抑制雙重路徑信號傳遞。
D)雙特異性蛋白質之穩定性
已進行各種穩定性研究且其顯示SF-G1-P1、SF-G1-P6、SF-G1-M27、SF-G1-B69、SF-G1-M1.3在血清中為穩定的，具熱穩定性且在低pH值下為穩定的。
為測定血清穩定性，將蛋白質在小鼠血清(Sigma)中以2.5 μM之最終濃度在37℃下培育0小時或72小時。接著使用上文所述之比色ELISA結合分析分析樣品，且用GraphPad Prism產生結合曲線。針對0小時各曲線之拐 點將吸光度值校正以確定血清中37℃下72小時後保留之結合百分比。
基本上如上文所述獲得之結果(第28圖)指示所測試之各PBA在72小時後具有至少70%之(經校正)血清穩定性。某些PBA具有約100%之穩定性。
為測定熱穩定性，使用在上文所述之ELISA結合實驗中產生之結合曲線計算各PBA之EC90值。各PBA於PBS中製備為其EC90值之5倍且以每孔50 μl轉移至PCR盤(Bio-Rad)中。短暫離心各盤且置於ICYCLER IQ梯度PCR機(Biorad)中以歷時1小時將抗體自47℃加熱至72℃。各抗體之等份試樣亦在25℃及37℃下保持1小時。接著將各盤在2,000 RPM下離心5分鐘且將上清液在PBS-T中稀釋五倍至其EC90濃度。接著使用上文所述之比色ELISA結合分析分析樣品，且針對25℃校正吸光度。用GraphPad Prism產生結合曲線以確定T50值。
基本上如上所述獲得之結果(表20)指示T50值在46.7℃至62.6℃間變化。
藉由微差掃描螢光測定法(DSF)測定PBA伸展時之溫度。在IQ5即時偵測系統(Bio-Rad)中進行DSF分析。將20 μl之15 μM雙特異性抗體、1×Sypro Orange(Invitrogen Life Technologies)及1×PBS之溶液添加至96孔盤之孔中。以1℃/min之加熱速率將盤自20℃加熱至90℃。將資料轉移至GraphPad Prism進行分析。
基本上如上所述獲得之結果(表21)指示蛋白質在不同溫度下伸展。
表21：如藉由DSF所測定，各雙特異性抗體之Tm值
為測定pH3穩定性，將SF-G1-C8儲備溶液稀釋至0.1 M乙酸(pH 3.0)中且培育1小時。接著用1M Tris鹼中和溶液，以PBS透析且濃縮。針對蛋白質A純化後即刻中和之SF-G1-C8之樣品藉由SEC(尺寸排阻層析)及比色ELISA測試透析物。使用Agilent 1100系列HPLC系統進行SEC。將50 μg SF-G1-C8注射至TSK Super SW3000凝膠管柱(Tosoh Bioociences,P/N 18675)上。使用PBS作為操作及平衡緩衝液，流動速率為0.35 ml/min。如上所述，用重組IGF1R-His或ErbB3-His塗佈盤來執行ELISA。
基本上如上所述獲得之結果指示SF-G1-C8在低pH值培育(pH 3)1小時後為穩定的，與IGF1R及ErbB3-His之結合實質上未受影響。
為測定SF-G1-C8在4℃下長時間之穩定性，將SF-G1-C8(19 mg/ml)於PBS中在4℃下培育1、6或33天且進行SEC。如上所述藉由SEC測定單體百分比。結果 指示SF-G1-C8在4℃下33天後顯示98%之穩定性。
實例6：其他抗IGF-1R/ErbB3及抗ErbB3/IGF-1R PBA之表徵
A)與BxPC-3細胞之結合
如下測定PBA與BxPC-3細胞之結合。BxPC-3細胞維持於補充有10%胎牛血清、青黴素/鏈黴素及L-麩胺醯胺之RPMI-1640培養基中。移除培養基且用PBS洗滌BxPC-3細胞。添加胰蛋白酶直至細胞自培養盤脫離，並接著用培養基+10%血清中和。短暫離心細胞且再懸浮於FACS緩衝液(1×PBS+2%血清+0.1%疊氮化物)中。藉由上下抽吸及推擠細胞穿過細胞過濾器使聚集物拆散成單細胞。短暫離心細胞且以1×106個細胞/毫升之密度再懸浮於FACS緩衝液中。在96孔錐形底盤中，每孔等分50 μl細胞懸浮液以得到5×104個細胞/孔。
將PBA在FACS緩衝液中稀釋至2 μM，且進行10次3倍稀釋，其中最後之孔僅由FACS緩衝液組成(無一次抗體)。將50 μl連續稀釋之抗體添加至50 μl細胞中以使得第一孔中之最高最終抗體濃度為1 μM。在輕緩攪拌下將細胞與抗體在室溫下培育2小時。將盤在1,500 RPM下旋轉5分鐘，且移除上清液。離心塊在FACS緩衝液中洗滌三次。最後一次洗滌後，移除FACS緩衝液，且添加50 μl在FACS緩衝液中按1：100稀釋之抗Fc-DyLight 649 二次抗體(Abcam)。將細胞在冷室中在黑暗中在輕緩攪拌下培育1小時，再洗滌三次且再懸浮於100 μl固定緩衝液(含1%三聚甲醛、2% FBS之PBS)中。將樣品轉移至96孔U形底FACS盤(Becton Dickinson)中且在4度下保持在黑暗中直至使用。使用FACS Calibur(Becton Dickinson)讀取樣品且使用FlowJo確定中值螢光強度(MFI)。使用單位點-總結合(One Site-Total Binding)利用GraphPad PRISM來確定EC50值。基本上如上所述獲得且展示於第29(A-C)圖及下表22中之結果指示該等PBA顯示與BxPC-3細胞之強結合。第29(D)圖及下表22顯示使用單位點-總結合曲線擬合分析之結合資料。
B)對細胞信號傳遞之抑制作用
基本上如下測定PBA對細胞信號傳遞之抑制作用。BxPC-3細胞維持於補充有10%胎牛血清、青黴素/鏈黴素及L-麩胺醯胺之RPMI-1640培養基中。將3.5×104個細胞於完全培養基中接種於96孔組織培養盤中。第二天，將完全培養基置換為無血清培養基且細胞在37℃下培育隔夜。細胞用指定劑量之藥物預處理1小時，並接著用100 ng/ml IGF1(Calbiochem)及30 ng/ml HRG(R&D Systems)刺激15分鐘。將細胞用PBS洗滌並在補充有蛋白酶及磷酸酶抑制劑之MPer緩衝液中溶解。
如上文實例4中所述進行磷酸化IGF1R(pIGF1R)、磷酸化ErbB3(pErbB3)及磷酸化AKT(pAKT)之ELISA。
使用ILE-10(14F或14f)及ELI-7(5F或5f)(兩者均於上文描述)作為參考蛋白質。
基本上如上所述獲得且展示於第30圖pIGF-1R)、第31 圖(pErbB3)及第32圖(pAKT)以及下表23中之結果指示該等PBA顯示對雙重路徑信號傳遞之強抑制作用。
在另一組實驗中，將PBA對配位體誘導之信號轉導的抑製程度與用先前技術抗IGF-1R(抗ErbB3 Ab# A-SEQ ID NO：336(HC)及337(LC))及先前技術抗ErbB3(抗IGF-1R Ab# A-SEQ ID NO：327(HC)及SEQ ID NO：328(LC))抗獲得之抑制程度進行比較。基本上如本實例中緊接之上文所述進行實驗。
結果(第33、34及35圖以及表24)指示該等PBA顯示相對於抗IGF-1R Ab# A與抗ErbB3 Ab# A之組合，對雙重路徑信號傳遞之抑製程度特別高。
C)雙特異性蛋白質之穩定性
基本上如上文實例5D中所述進行各種穩定性研究，且其結果顯示所測試之PBA在血清中為穩定的且具有熱穩定性。
血清穩定性結果(第36圖)指示該等PBA顯示血清穩定性存在一些差異。最低穩定性為約65%且最高穩定性為約100%。具有約1(或1以上)之數值之PBA視為具有約100%穩定性。
熔融溫度結果闡明於表25中。該等結果指示該等PBA在不同溫度下伸展。
SEC穩定性結果展示於表26中，且指示該等PBA大部分為單體。
實例8：其他高親和力抗IGF-1R及抗ErbB3結合域之鑒別
經由噬菌體篩選分離許多更多高親和力抗IGF-1R及抗ErbB3結合域。此等蛋白質之重鏈及輕鏈之序列闡明於第1-4圖中之16F序列下方。抗IGF-1R結合位點之序列始於「5-7」且抗ErbB3結合位點之序列始於「E3B」。
實例9：抗EGF1R+抗ErbB3 BPA對雙重IGF1及HRG刺激之信號傳遞的有效抑制
此實例展示抗EGF1R+抗ErbB3 PBA為DU145及BxPC-3細胞中雙重IGF1及HRG刺激之信號轉導的有效抑制劑。
基本上如下獲得結果。將35,000個BxPC-3細胞於10%血清中在37℃下接種隔夜。第二天，使細胞在含有0.5%血清之培養基中饑餓處理且在37℃下培育隔夜。將細胞用指定濃度之Ab預處理一小時並接著用30 ng/ml HRG1b1-ECD+100 ng/ml IGF1刺激15分鐘。在本實例中且在實例10-13及21中，對照抗IGF1R及抗ErbB3 mAb 分別為抗IGF-1R Ab# A及抗ErbB3 Ab# A。將細胞在M-Per緩衝液(+蛋白酶/磷酸酶抑制劑)中溶解且進行關於pAKT之ELISA。對於pAKT ELISA分析，將盤用抗AKT(Millipore)塗佈，用PBS+2%BSA阻斷，與溶解產物及標準物一起培育，且用生物素化抗pAKT(Ser473)及抗生蛋白鏈菌素偵測。添加ELISA pico化學發光受質且在Perkin-Elmer Envision盤讀取器上讀取各盤。在Graphpad Prism中產生所有IC50曲線及計算值。
結果(第39圖)指示如藉由量測磷酸化AKT(pAKT)所測定，PBA M7-G1-M78、P4-G1-M1.3、P4-G1-C8及SF-G1-C8在DU145及BxPC-3細胞中均有效抑制由IGF-1及HRG誘導之信號轉導。
實例10：抗EGF1R+抗ErbB3 BPA效力在寬泛的受體概況範圍內維持
此實例展示抗EGF1R+抗ErbB3 PBA為具有各種含量之IGF1R或ErbB3之細胞中雙重IGF1及HRG刺激之信號轉導的有效抑制劑。
基本上如下獲得結果。將BxPC-3細胞用表現對照髮夾之慢病毒或用對IGF1R或ErbB3具特異性之shRNA(Sigma)(其使該等蛋白質之表現降低約50%)感染。藉由FACS及蛋白質印跡分析確認阻斷基因表現。接種細胞且如實例9中所述進行處理。如實例9中所述測 定pAKT之含量。
結果(第40圖及表27)指示如藉由量測磷酸化AKT(pAKT)所測定，PBA M7-G1-M78、P4-G1-M1.3、P4-G1-C8及SF-G1-C8在具有高或較低含量(含量降低50%)之IGF1R或ErbB3的BxPC-3細胞中均有效抑制由IGF-1及HRG誘導之信號轉導。
BPA在表27指定具有「G1」。舉例而言，「M7-M78」係指「M7-G1-M78」。
實例11：抗EGF1R+抗ErbB3 PBA為低劑量或高劑量IGF1或HRG誘導之信號傳遞的有效抑制劑
此實例展示抗EGF1R+抗ErbB3 PBA為回應於高或低配 位體(IGF1或HRG)濃度之雙重IGF1及HRG刺激之信號轉導的有效抑制劑。
基本上如下獲得結果。將35,000個BxPC-3細胞於10%血清中在37℃下接種隔夜。第二天，使細胞在含有0.5%血清之培養基中饑餓處理且在37℃下培育隔夜。細胞用指定濃度之PBA預處理一小時且接著用低(40 ng/ml)或高(400 ng/ml)IGF1，或低(20 ng/ml)或高(200 ng/ml)HRG1b1-ECD刺激15分鐘。pErbB3、pIGF1R及tIGF1R之ELISA係來自商業來源(R & D Systems)。對於pAKT ELISA分析，將盤用抗AKT(Millipore)塗佈，用PBS+2%BSA阻斷，與溶解產物及標準物一起培育，且用生物素化抗pAKT(Ser473)及抗生蛋白鏈菌素偵測。添加ELISA pico化學發光受質且在Perkin-Elmer Envision盤讀取器上讀取各盤。在Graphpad Prism中產生所有IC50曲線及計算值。
結果(第41、42圖及表28)指示如藉由量測pAKT(pAKT)、pIGF-1R及pErbB3含量所測定，PBA M7-G1-M78、P4-G1-M1.3、P4-G1-C8及SF-G1-C8在BxPC-3細胞中有效抑制由較高或較低含量之IGF-1及HRG誘導之信號轉導。
實例12：抗EGF1R+抗ErbB3 PBA抑制基本信號傳遞
此實例展示抗EGF1R+抗ErbB3 PBA抑制信號轉導之基本程度。
基本上如下獲得結果。將35,000個BxPC-3細胞於10%血清中在37℃下接種隔夜。第二天，使細胞在含有0.5%血清之培養基中饑餓處理且在37℃下培育隔夜。細胞在存在指定濃度之Ab但不存在配位體刺激之情況下預處理15分鐘或24小時。將細胞在M-Per緩衝液(+蛋白酶/磷酸酶抑制劑)中溶解且進行關於pAKT之ELISA，如實例9中所述。
結果(第43圖)指示PBA M7-G1-M78、P4-G1-M1.3及P4-G1-C8抑制pAKT之基本含量。
實例13：抗EGF1R+抗ErbB3 PBA有效下調IGF1R
此實例展示抗EGF1R+抗ErbB3 PBA下調IGF1R。
基本上如下獲得結果。將35,000個BxPC-3細胞於10%血清中在37℃下接種隔夜。第二天，使細胞在含有0.5%血清之培養基中饑餓處理且在37℃下培育隔夜。接著將細胞在含有0.5%血清及指定濃度之抗體(始於5E-07M之高劑量，隨後為3倍稀釋液)之培養基中培育24小時。使細胞溶解且藉由ELISA使用來自R&D Systems之市售套組量測總IGF1R。自Prism使用下式計算下調百分比：100＊(擬合最大值-觀測最小值)/(擬合最大值-無刺激)。
結果(第44圖及表29)指示PBA M7-G1-M78、P4-G1-M1.3及P4-G1-C8使A549及BxPC-3細胞中之IGF1R含量降低。
實例14：抗EGF1R+抗ErbB3 BPA抑制IGF1及IGF2介導之信號傳遞
此實例展示抗EGF1R+抗ErbB3 BPA抑制由IGF1及IGF2誘導之信號傳遞。
基本上如下獲得結果。在12孔培養盤中於10%血清中每孔接種500,000個DU145及Mia PaCa-2細胞隔夜。第2天使細胞血清饑餓隔夜。第3天進行抗體預培育1小時(250 nM P4-G1-M1.3或P4-G1-C8)且添加生長因子(100 ng/ml之IGF1或IGF2)，15分鐘後溶解。將所有細胞用PBS洗滌並在100 μl補充有蛋白酶及磷酸酶抑制劑之MPer緩衝液中溶解。在4-12% Bis-Tris凝膠上操作樣品前，添加含有b-巰基乙醇(b-ME)之加載緩衝液且將溶解產物在95℃下煮沸5分鐘。凝膠在150恆定電壓下電泳約90分鐘且使用iBlot(Invitrogen)轉移系統8分鐘轉移程式轉移至硝化纖維素膜上。將膜於Odyssey阻斷緩衝液(Licor Biosciences)中在室溫下阻斷1小時，且接著與一次抗體一起在4℃下於含5% BSA之TBS-T中培育隔夜。所用抗體為pAkt、pIGF1R、β肌動蛋白(全部來自Cell Signaling Technologies)。B-肌動蛋白以1：5,000使用，磷酸化Akt以1：2,000使用，且所有其他抗體以1：1,000使用。第二天，將膜用TBS-T洗滌3次每次5分鐘，且接著與在含5%牛奶之TBS-T中以1：15,000稀釋之抗兔IgG-DyLight800(Cell Signaling)在室溫下一起培育1小時。接著將膜用TBS-T洗滌3次每次5分鐘，且使用Licor Odyssey系統(Licor Biosciences)進行掃描。計算積分強度 且針對β-肌動蛋白含量進行校正。
結果(第45圖)展示BPA P4-G1-M1.3及P4-G1-C8抑制由IGF1或IGF2誘導之AKT磷酸化。
實例15：抗EGF1R+抗ErbB3 BPA部分抑制胰島素信號傳遞
此實例展示抗EGF1R+抗ErbB3 BPA部分抑制DU145細胞中之胰島素信號傳遞。
基本上如下獲得結果。在12孔培養盤中於10%血清中每孔接種500,000個DU145細胞隔夜。第2天使細胞血清饑餓隔夜。第3天進行Ab預培育1小時(500 nM P4-G1-M1.3)且添加生長因子(100 ng/ml之IGF1或5 μg/ml之胰島素)，15分鐘後溶解。如實例14中所述製備溶解產物及蛋白質印跡。
結果(第46圖)指示BPA P4-G1-M1.3部分抑制由胰島素誘導之信號轉導，如藉由pAKT含量所量測。
實例16：抗EGF1R+抗ErbB3 BPA下調ErbB3及IGF1R之總受體含量
此實例展示抗EGF1R+抗ErbB3 BPA下調由IGF1及HRG誘導或未誘導之細胞上之ErbB3及IGF1R含量。
基本上如下獲得結果。在12孔培養盤中於10%血清中每孔接種500,000個BxPC-3細胞隔夜。第2天使細胞血清饑餓隔夜。第3天進行抗體預培育6小時(250 nM M7-G1-M78或P4-G1-C8)。亦向一半樣品中添加生長因子(100 ng/ml之IGF1及30 ng/ml之HRG)，15分鐘後溶解。如實例14中所述製備溶解產物及蛋白質印跡。IGF1R、ErbB3及pErbB3亦來自Cell Signaling Technologies。
結果(第47圖)指示BPA M7-G1-M78及P4-G1-C8使ErbB3及IGF1R之總含量(磷酸化及非磷酸化)降低。
實例17：抗EGF1R+抗ErbB3 BPA在人類、小鼠及猴血清中顯示穩定性
此實例展示抗EGF1R+抗ErbB3 BPA在人類、小鼠及猴血清中為穩定的。
基本上如下獲得結果。將PBA在彙集之人類血清(Innovative Research)、小鼠血清(Sigma)或石蟹獼猴血清(innovative Research)中以2.5 μM之最終濃度在37℃下培育0天或5天。接著使用比色ELISA結合分析對樣品進行分析。將96孔Reacti-bind盤(Pierce,Fisher目錄號PI-15041)用50 μl對應於抗體scFv之蛋白質(於PBS中2 μg/ml之ErbB3-His或IGF1R-His(R&D Systems，目錄號分別為348-RB及305-GR))塗佈且在4℃下培育隔夜。第二天，將盤用PBS+0.05% Tween-20(PBS-T)洗滌且在室溫下用100 μl無蛋白質阻斷緩衝液(Pierce)阻斷1小時。將盤用PBS-T洗滌且添加50 μl各BPA重複兩份。濃度始於於PBS-T中500 nM(2.5 μM bsAb於血清中1：5稀釋)且包括 十份另外之兩倍稀釋液(於PBS-T+20%血清中)及一份空白(僅PBS-T+血清)。將盤在室溫下培育兩小時且接著用PBS-T洗滌。添加50 μl於PBS-T中按1：40,000稀釋之抗Fc-HRP(Jackson Labs)，且將盤在黑暗中在室溫下培育1小時。盤再次用PBS-T洗滌且添加100 μl TMB受質(Thermo Scientific，以1：1混合之TMB與過氧化物溶液)。將盤在室溫下培育5-15分鐘直至出現藍色，且用100 μl停止溶液(Cell Signaling Technology)使反應停止。在PerkinElmer Envision盤讀取器上讀取450 nm下之吸光度且用GraphPad Prism產生結合曲線。
結果(第48圖)展示BPA M7-G1-M78、P4-G1-M1.3及P4-G1-C8在小鼠及獼猴血清中穩定至少5天且P4-G1-M1.3在人類血清中穩定至少6天。
實例18：抗EGF1R+抗ErbB3 BPA與人類、小鼠、大鼠及猴IGF1R及ErbB3顯示交叉反應性
此實例展示抗EGF1R+抗ErbB3 BPA可與人類、小鼠、大鼠及猴IGF1R及ErbB3交叉反應。
基本上如下獲得結果。將96孔Reacti-bind®盤(Pierce,Fisher目錄號PI-15041)用50 μl於PBS中2 μg/ml之物種特異性ErbB3-His或IGF-1R-His(R&D Systems，目錄號分別為348-RB及305-GR)塗佈且在4℃下培育隔夜。第二天，將盤用PBS+0.05% Tween-20(PBS-T)洗滌且在室溫下 用100 μl無蛋白質阻斷緩衝液(Pierce)阻斷1小時。將盤用PBS-T洗滌且添加50 μl各PBA重複兩份。濃度始於500 nM(於PBS-T中)且包括十份另外之兩倍稀釋液及一份空白(僅PBS-T)。將盤在室溫下培育兩小時且接著用PBS-T洗滌。添加50 μl於PBS-T中按1：40,000稀釋之抗Fc-HRP(Jackson Labs)，且將盤在黑暗中在室溫下培育1小時。盤再次用PBS-T洗滌且添加100 μl TMB受質(Thermo Scientific，以1：1混合之TMB與過氧化物溶液)。將盤在室溫下培育5-15分鐘直至出現藍色，且用100 μl停止溶液(Cell Signaling Technology)使反應停止。在PerkinElmer Envision盤讀取器上讀取450 nm下之吸光度且使用GraphPad Prism產生結合曲線。
結果(第49圖)展示BPA P4-G1-C8、P4-G1-M1.3及M7-G1-M78有效結合人類、小鼠、大鼠及猴IGF1R及ErbB3。
實例19：抗EGF1R+抗ErbB3 BPA阻斷IGF1及IGF2與其受體IGF1R之結合
此實例展示抗EGF1R+抗ErbB3 BPA阻斷IGF1與IGF2兩者與之IGF1R結合。
基本上如下獲得結果。將ELISA盤用IGF1R-His塗佈且如實例18中所述阻斷。阻斷步驟後，洗滌各盤且與IGF1(100 ng/ml)或IGF2(100 ng/ml)(EMD Chemicals)一起 在室溫下培育1小時。將盤用PBS-T洗滌且添加100 μl各Ab重複兩份。濃度始於500 nM(於PBS-T中)且包括十份另外之兩倍稀釋液及一份空白(僅PBS-T)。將盤在室溫下培育1小時且接著用PBS-T洗滌。添加50 μl在PBS-T中以1：1,000稀釋之兔抗人類IGF1(Thermo Scientific)或兔抗人類IGF2(Abcam)在室溫下1小時。再次洗滌各盤且在PBS-T於中以1：1,000稀釋之抗兔HRP(Cell Signaling)中在室溫下培育1小時。如上文所述將各盤顯色、讀取及分析。
結果(第50圖)指示P4-G1-M1.3抑制IGF1與IGF2兩者與IGF1R之結合。
實例20：抗EGF1R+抗ErbB3 BPA在小鼠體內顯示劑量依賴性且不同之半衰期且在石蟹獼猴體內顯示長半衰期
此實例提供抗EGF1R+抗ErbB3 BPA在小鼠及石蟹獼猴體內之藥物動力學性質。
基本上如下獲得結果。給藥及樣品收集：藉由靜脈內快速注射向小鼠給予每只小鼠100 μg或每只小鼠500 μg之P4-G1-M1.3或M7-G1-M78，且在0.25、1、4、8、24、48、72、96及168小時時取血。每個時間點對四隻小鼠放血。對石蟹獼猴(WIL Research Laboratories)靜脈內輸注P4-C8及P4-M1.3。各組中之兩隻猴給予5 mg/kg或25 mg/kg且在0.08、1、4、8、24、48、72、96及168小時時放血。ELISA結合分析及模擬分析：將Reacti-bind® 96孔盤(Pierce,Fisher目錄號PI-15041)用50 μl於PBS中2 μg/ml之IGF1R(無標簽)塗佈且在4℃下培育隔夜。將盤用PBS-0.05% Tween-20(PBS-T)洗滌且在室溫下用100 μl之Pierce無蛋白質阻斷緩衝液阻斷1小時。再次用PBS-T洗滌各盤。將100 μl樣品及標準物添加至盤中且在室溫下培育2小時。對於標準曲線，將抗體於PBS-T中稀釋至12 μg/ml，接著為10次另外之3倍稀釋，最後之孔為空白。將血清樣品於PBS-T中以1：50稀釋，附加10次另外之3倍稀釋，且最後之孔為空白。將盤用PBS-T洗滌且添加100 μl於PBS-T中1 μg/ml之ErbB3-His在室溫下1小時。洗滌各盤且添加100 μl於PBS-T中以1：10,000稀釋之抗His-HRP(Abcam)且在室溫下培育(覆蓋)1小時。盤再次用PBS-T洗滌且添加100 μl TMB受質(Thermo Scientific，以1：1混合之TMB與過氧化物溶液)。將盤在室溫下培育5-15分鐘直至出現藍色，且用100 μl停止溶液(Cell Signaling Technology)使反應停止。在PerkinElmer Envision盤讀取器上讀取450 nm下之吸光度，且使用MATLAB(Mathworks-www.mathworks.com)及WinNonLin(Pharsight-www.pharsight.com)根據標準方案進行資料分析。
小鼠中之結果(表30)指示BPA M7-G1-M78及P4-G1-M1.3在小鼠體內具有平均3.33至41.90小時範圍內之半衰期，視BPA及投與小鼠之BPA之濃度而定。石 蟹獼猴中之結果(表31)指示P4-G1-C8及P4-G1-M1.3之半衰期在5 mg/kg時分別為51及61小時，且在25 mg/kgPBA時分別為115及78小時。因此，具有方向抗IGF1R-抗ErbB3之PBA(亦即其中抗IGF1R部分為全長Ab且抗ErbB3部分由兩個scFv構成)比具有相反構形之PBA(亦即其中抗ErbB3為全長Ab且抗IGF1R部分由兩個scFv構成)更穩定。
實例21：P4-G1-M1.3顯示在活體外隨時抑制配位體誘導之受體活化及Akt/mTOR/ERK信號傳遞。
此實例展示P4-G1-M1.3隨時抑制BxPC-3培養細胞中 配位體誘導之IGF-1R及ErbB3以及下游蛋白質Akt、Erk、mTOR及S6之磷酸化。
方法
BxPC-3細胞維持於補充有10%胎牛血清、青黴素/鏈黴素及L-麩胺醯胺之RPMI-1640培養基中。將3.5×104個細胞於完全培養基中接種於96孔組織培養盤中。第二天，將完全培養基置換為無血清培養基且細胞在37℃下培育隔夜。將細胞用1 μM P4-G1-M1.3預處理1小時且保持於無抑制劑之無血清培養基中，且接著將所有細胞用100 ng/ml IGF1(Calbiochem)及70 ng/ml HRG(R&D Systems)刺激5、15、30、60或120分鐘。將細胞用PBS洗滌並在補充有蛋白酶及磷酸酶抑制劑之MPer緩衝液中溶解。
如上文實例4中所述進行磷酸化IGF1R(pIGF1R)、磷酸化ErbB3(pErbB3)及磷酸化AKT(pAKT)之ELISA。根據製造商之說明進行磷酸化ERK(pERK，Cell Signaling Technology目錄號7246)、磷酸化S6(pS6，R&D Systems目錄號DYC3918)及磷酸化mTOR(pmTOR，R&D Systems目錄號DYC1665)之ELISA。各磷酸化蛋白質之所得濃度針對使用BCA方法測得之總蛋白質含量進行校正。
結果(第51圖)指示P4-G1-M1.3能夠在IGF-1及HRG存在下顯著阻斷配位體誘導之磷酸化IGF-1R(51A)、磷酸化ErbB3(51B)、磷酸化Akt(51C)、磷酸化ERK(p44/p42； 51D)、磷酸化mTOR(Ser2448，51E)及磷酸化S6(Ser235/236；51F)產生。
實例22：抗EGF1 R +抗ErbB3 PBA阻斷由IGF1R-胰島素受體異二聚體介導之信號傳遞
此實例展示由抗EGF1R+抗ErbB3 PBA對胰島素及IGF2信號傳遞之抑制作用係由IGF1R-胰島素受體異二聚體介導。
基本上如下獲得結果。在12孔培養盤中於10%血清中每孔接種500,000個BxPC-3及A673細胞隔夜。第2天使細胞血清饑餓隔夜。第3天進行抗體預培育1小時(500 nM P4-G1-M1.3)且添加生長因子(100 ng/ml之IGF1、IGF2或5 μg/ml之胰島素)，15分鐘後溶解。
結果(第52圖)指示P4-G1-M1.3能夠在表現高含量胰島素受體(IR)之A673細胞中顯著阻斷IGF2及胰島素信號傳遞。此抑製程度未見於表現低IR含量之BxPC-3細胞中。
實例23：PBA P4-G1-M1.3顯示優於抗IGF-1R mAb的降低mTOR活化及mTOR蛋白含量之作用
此實例展示在研究結束BxPC-3腫瘤中，P4-G1-M1.3顯示優於抗IGF-1R mAb的控制mTOR活化之作用。
基本上如下進行來自BxPC-3異種移植物研究之腫瘤的概況分析。製備具有人類腫瘤細胞系異種移植物之小鼠且基本上如上文實例3D中所述投與各種處理。自PBS 對照組收集五個研究結束腫瘤，基本上如下製備P4-G1-M1.3之最高劑量組(每只小鼠500 μg，q3d)及抗IGF1R Ab# A(加尼圖單抗；SEQ ID 327+SEQ ID 328)之最高劑量組(每只小鼠368 μg，q3d)。藉由組織粉碎及於TER1緩衝液(Invitrogen)中溶解產生溶解產物。藉由BCA方法定量總蛋白質，且將相等總蛋白質在4-12% SDS-PAGE凝膠上電泳。使用標準方法將凝膠轉移至硝化纖維素上。使用以下進行蛋白質印跡：抗mTOR及抗磷酸化mTOR(Ser2448)一次抗體(所有均來自Cell Signaling Technology)。所用二次抗體為抗兔IgG-DyeLight800(Cell Signaling Technology)。使用Li-Cor Odyssey系統使印跡顯色。藉由將目標條帶之強度除以其相關β-肌動蛋白對照條帶來進行針對β-肌動蛋白之校正。
結果(第53A及53B圖以及表32)指示來自經PBA P4-G1-M1.3處理之小鼠之腫瘤中的mTOR及磷酸化mTOR(Ser2448)含量顯著低於經抗IGF-1R Ab# A處理之小鼠。
實例24：P4-G1-M1.3在Caki-1及BxPC-3異種移植物模型中下調受體且抑制PI3K/Akt/mTOR信號傳遞
此實例展示在Caki-1人類腎透明細胞癌及BxPC-3人類胰臟腺癌異種移植物模型之研究結束腫瘤中，P4-G1-M1.3下調受體且抑制PI3K/Akt/mTOR信號傳遞。
基本上如下進行來自Caki-1異種移植物研究之腫瘤的概況分析。製備具有人類腫瘤細胞系異種移植物之小鼠且基本上如上文實例3D中所述投與各種處理。對於Caki-1異種移植物研究，建立3個組，各自含有5只小鼠。該等組包括對照組、P4-G1-M1.3組(600 μg)及抗IGF-1R Ab# A組(291 μg劑量1，320 μg劑量2)。抗體以三日時間間隔腹膜內給予兩次。依維莫司每日經口給予一次。第二次抗體劑量24小時後收集腫瘤。
基本上如實例23中所述進行來自BxPC-3異種移植物 研究之腫瘤的概況分析。
最初對腫瘤稱重且在CryoPrep組織粉碎機(CP-02型，Covaris)中進行粉碎。將含有蛋白酶及磷酸酶抑制劑之組織萃取試劑1(TER1，Life TechnologiesTM)以每100 mg組織1 ml TER1之比率添加至腫瘤中。樣品在冰上培育30分鐘以使組織溶解且根據製造商之方案推擠穿過QlAshredderTM管柱(Qiagen)。根據製造商之方案進行BCA分析(Pierce)以測定蛋白質濃度。
藉由蛋白質印跡分析樣品。添加含有β-巰基乙醇(β-ME)之加載緩衝液且將溶解產物在95℃下煮沸5分鐘。在18孔凝膠(BioRad)之各孔上電泳約40 μg蛋白質及兩份梯形標記(Invitrogen)。凝膠在150恆定電壓下電泳約90分鐘且使用iBlot®(Invitrogen)轉移系統8分鐘轉移程式轉移至硝化纖維素膜上。將膜於Odyssey®阻斷緩衝液(Licor® Biosciences)中在室溫下阻斷1小時，且接著與一次抗體一起在4℃下於含5% BSA之TBS-T中培育隔夜。所有抗體均購自Cell Signaling且以推薦稀釋度使用。第二天，將膜用TBS-T洗滌3次每次5分鐘，且接著與在含5%牛奶之TBS-T中以1：10,000-15,000稀釋之抗兔IgG-DyLight® 800(Cell Signaling)或抗兔IRDye® 800(Licor® Biosciences)在室溫下一起培育1小時。接著將膜用TBS-T洗滌3次每次5分鐘，且使用Licor® Odyssey®系統(Licor® Biosciences)進行掃描。使用Image Studio 2.0定量條帶強度且針對β-肌動蛋白含量進行校正。在Caki-1異種移植物中，將對照腫瘤與經P4-G1-M1.3、抗IGF-1R Ab#A+抗ErbB3 Ab# A或依維莫司處理之腫瘤進行比較。
Caki-1概況分析研究之結果(第54A-F圖)指示IGF-1R、胰島素受體、ErbB3、EGFR、pAKT(Ser473或Thr308)、pFox01(Thr24)/Fox03a(Thr32)及磷酸化mTOR(Ser2448或Ser2481)之含量均與對照小鼠中之含量類似，或在來自經P4-G1-M1.3處理之小鼠的腫瘤中比經抗IGF-1R Ab# A+抗ErbB3 Ab# A組合或mTOR抑制劑依維莫司處理之小鼠低。
BxPC-3概況分析研究之結果(第55A-C圖)指示IGF-1R、ErbB3、pEGFR、pmTOR(S2448)及pS6(S235/236)均在來自經P4-G1-M1.3處理之小鼠的腫瘤中比經抗IGF-1R Ab#A或僅PBS處理之小鼠低。
實例25：P4-G1-M1.3阻斷IGF-1及IGF-2與受體之結合
此實例藉由ELISA分析之方式展示P4-G1-M1.3有效阻斷IGF-1及IGF-2與IGF-1R之結合。
將96孔 Reacti-bind®盤(Pierce)用50 μl IGF-1R-His(R&D Systems目錄號305-GR；於PBS中2 μg/ml)塗佈且在4℃下培育隔夜。第二天，將盤用PBS+0.05% Tween-20(PBS-T) 洗滌且在室溫下用100 μl無蛋白質阻斷緩衝液(Pierce)阻斷1小時。將盤用PBS-T洗滌且添加100 μl P4-G1-M1.3，重複兩份。抗體濃度始於500 nM(於PBS-T中)且包括十份另外之兩倍稀釋液及一份空白(僅PBS-T)。將盤在室溫下培育兩小時且接著用PBS-T洗滌。以100 ng/ml添加100 μl IGF-1或IGF-2(EMD Chemicals)且在室溫下培育一小時。洗滌後，添加100 μl兔抗IGF-1或兔抗IGF-2(均為Abcam，5 μg/ml)至盤中且在室溫下培育一小時。接著洗滌盤且與100 μl抗兔HRP(Cell Signaling)一起在室溫下培育1小時，再次洗滌且添加100 μl TMB受質(Cell Signaling)。將盤在室溫下培育5-15分鐘直至出現藍色，且用100 μl停止溶液(Cell Signaling Technology)使反應停止。在PerkinElmer Envision盤讀取器上讀取450 nm下之吸光度且使用GraphPad Prism®產生結合曲線。
ELISA分析之結果(第56圖)展示P4-G1-M1.3以劑量依賴性方式阻斷IGF-1與IGF-2兩者與IGF-1R之結合。
實例26：DU145、BxPC-3、SK-ES-1及Caki-1腫瘤異種移植物模型中之P4-G1-M1.3及P4-G1-C8
對於以下各研究A-D，將細胞用PBS：減去生長因子之基質膠1：1再懸浮且皮下注射至Nu/Nu小鼠體內。允許腫瘤發展8天。抗體以每只小鼠指定劑量每3天一次(q3d)腹膜內注射。每週兩次藉由卡尺手動量測腫瘤長度及寬 度，且使用下式計算腫瘤體積：π/6(L x W2)。研究之各組含有10只動物。
A. P4-G1-C8及P4-G1-M1.3在活體內抑制DU145前列腺癌細胞之腫瘤生長。
對於此DU145異種移植物研究，製備8×106個DU145細胞且如上所述使用。
結果(第57A圖)展示P4-G1-C8與P4-G1-M.3均在活體內抑制前列腺癌細胞之生長。
B. P4-G1-C8及P4-G1-M1.3比抗IGF-1RIgG更好地在活體內抑制BxPC-3胰臟癌細胞之腫瘤生長。
對於此異種移植物研究，製備5×106個BxPC-3細胞且如上所述使用。
結果(第57B圖)展示P4-G1-C8及P4-G1-M1.3在活體內抑制BxPC-3胰臟癌細胞之腫瘤生長且在抑制腫瘤細胞生長方面均優於抗IGF-1R Ab# A。
C. P4-G1-M1.3在活體內抑制SK-ES-1尤文氏肉瘤癌細胞之腫瘤生長
對於此異種移植物研究，製備10×106個SK-ES-1細胞且如上所述使用。
結果(第57C圖)展示P4-G1-M1.3以劑量依賴性方式抑制腫瘤細胞生長。
D. P4-G1-M1.3在活體內抑制Caki-1腎細胞癌之癌細胞 的生長且顯示抑制優於抗IGF-1R IgG與抗ErbB3 IgG之組合。
對於此研究，製備8×106個Caki-1細胞且如上所述使用。
結果(第57D圖)展示P4-G1-M1.3以劑量依賴性方式抑制腫瘤細胞生長且在抑制腫瘤細胞生長方面比抗IGF-1R Ab# A(加尼圖單抗；SEQ ID 327+SEQ iD 328)與抗ErbB3 Ab# A(SEQ ID 336+SEQ ID 337)抗體之組合更有效，其中此等抗體以相等暴露量或以等莫耳濃度劑量給予。
實例27： 用於設計小鼠中之PD/功效研究的PK資料之計算分析
此實例描述用於擬合數學模擬與實驗資料以估算M1.3-G1-P4之藥物動力學(PK)參數的計算方法。
擬合數學模擬與PK資料
經由實施靜脈內(IV)快速注射目標介導之藥物配置(TMDD)模型來推斷M1.3-G1-P4之PK參數。IV TMDD為結構化為一組4個相關微分方程之2隔室PK模型，如下：
在方程1A-1D中，Dc及Dp為中心及周邊隔室中藥物 之濃度，Vc及Vp為中心及周邊隔室之體積，而R及D：R表示中心隔室中游離目標受體及藥物-受體複合物之濃度。此外，C ld 、C l 、k in 、k out 、k on 、k off 及k el 分別表示轉運穿過隔室之速率常數、藥物自中心隔室之清除率、受體合成、受體降解、藥物-受體締合、藥物-受體解離及藥物-受體自中心隔室之清除率。IV TMDD模型描述當相關藥物直接注射於中心隔室(血液)中時，中心隔室中藥物與目標受體結合及藥物清除之動態過程以及藥物自中心隔室轉運至周邊隔室之過程。擬合TMDD模型與自小鼠血液獲得之實驗資料使得能夠估算M1.3-G1-P4之PK性質。
第58圖展示TMDD模型與實驗資料之擬合(實線=靜脈內給予每只小鼠500 μg劑量之擬合，點線=靜脈內給予每只小鼠100 μg劑量之擬合)。M1.3-G1-P4 PK參數列於下表24中。
等效物
熟習此項技術者將認識到，或能夠僅使用常規實驗即可確認及實施本文所述特定實施例之許多等效物。該等等效物意欲由以下申請專利範圍涵蓋。附屬請求項中揭示之實施例之任何組合預期在本發明之範疇內。
本申請案含有序列表，該序列表已經由EFS-Web以ASCII格式提交且藉此以引用之方式整體併入。創建於2012年四月5日之該ASCII複本命名為1141PC01.txt且大小為950,611位元組。
以引用之方式併入
本文提及之每一美國及外國專利及申請中之專利申請案及公開案各自之揭示內容明確以引用之方式整體併入本文中。
<110> MERRIMACK PHARMACEUTICALS
<120> 單特異性及雙特異性抗IGF-1R及抗ERBB3抗體
<130> 526420 MMV-003PC
<140> 新申請案
<141> 與本文同時
<150> 61/619,244
<151> 2012-04-02
<150> 61/558,192
<151> 2011-11-10
<150> 61/539,297
<151> 2011-11-10
<150> 61/477,089
<151> 2011-04-19
<160> 429
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成一致序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (28)..(28)
<223> Phe,Asp,Asn,Thr,Leu,Val,Met,Glu,Arg,Ser,Ala,Trp或Pro
<220>
<221> MOD_RES
<222> (31)..(31)
<223> Lys,Ser,Arg,Val,His,Glu,Ile,Asn,Asp,Ala或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (49)..(49)
<223> Ser或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (53)..(53)
<223> Ser,Gly,Ala或Pro
<220>
<221> MOD_RES
<222> (54)..(54)
<223> Asp,Ser,Trp,Gly或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (59)..(59)
<223> Val,Pro,Arg,Ile或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (88)..(88)
<223> Ala或Pro
<220>
<221> MOD_RES
<222> (102)..(102)
<223> Thr,Gln,Asp,Tyr,Asn,Arg,Trp,Phe,His,Met或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (103)..(103)
<223> Trp,Ile,Met或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (111)..(111)
<223> Ser,Met,Tyr,Ile,Lys,Glu,Val,Ala,Arg,Thr或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (117)..(117)
<223> Ser或Thr
<220>
<223> 參見所提交說明書中關於取代及較佳實施例之詳細描述
<400> 1
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成一致序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Leu或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (15)..(15)
<223> Leu或Thr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (51)..(51)
<223> Arg,Ser,Lys,Ala,Gly,Gln,Thr,Asn,Pro或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (54)..(54)
<223> Arg,Leu,Cys,Thr,Pro,Gly,Ser,Lys,Glu,Gln,His Ala,Tyr,Ile
<220>
<221> MOD_RES
<222> (70)..(70)
<223> Glu或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (83)..(83)
<223> Ser或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (84)..(84)
<223> Ala或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (92)..(92)
<223> Trp或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (93)..(93)
<223> Thr,Ala,Arg,Met,Phe,Ser,Asn,Trp,Gln,Leu或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (94)..(94)
<223> Trp或Phe
<220>
<223> 參見所提交說明書中關於取代及較佳實施例之詳細描述
<400> 2
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成一致序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Leu或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (51)..(51)
<223> Arg,Ser,Lys,Ala,Gly,Gln,Thr,Asn,Pro或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (54)..(54)
<223> Arg,Leu,Cys,Thr,Pro,Gly,Ser,Lys,Glu,Gln,His Ala,Tyr,Ile
<220>
<221> MOD_RES
<222> (70)..(70)
<223> Glu或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (84)..(84)
<223> Ala或gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (93)..(93)
<223> Thr,Ala,Arg,Met,Phe,Ser,Asn,Trp,Gln,Leu或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (94)..(94)
<223> Trp或Phe
<220>
<223> 參見所提交說明書中關於取代及較佳實施例之詳細描述
<400> 3
<210> 4
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成一致序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Glu或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Glu或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Arg或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (49)..(49)
<223> Ser或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (54)..(54)
<223> Asp或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (58)..(58)
<223> Val,Arg,Thr,Ile,Met,Ser,Asn或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (88)..(88)
<223> Ala或Pro
<220>
<221> MOD_RES
<222> (93)..(93)
<223> Leu或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (102)..(102)
<223> Ala,Phe或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (103)..(103)
<223> Tyr,Asn,Lys,Phe,Met或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (106)..(106)
<223> Glu,Val,Trp,Leu,Gln或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (107)..(107)
<223> Glu或Asp
<220>
<223> 參見所提交說明書中關於取代及較佳實施例之詳細描述
<400> 4
<210> 5
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成一致序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Glu或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Glu或Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> Arg或Gly
<220>
<221> MOD_RES
<222> (49)..(49)
<223> Ser或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (54)..(54)
<223> Asp或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (58)..(58)
<223> Val,Arg,Thr,Ile,Met,Ser,Asn或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (102)..(102)
<223> Ala,Phe或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (103)..(103)
<223> Tyr,Asn,Lys,Phe,Met或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (106)..(106)
<223> Glu,Val,Trp,Leu,Gln或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (107)..(107)
<223> Glu或Asp
<220>
<223> 參見所提交說明書中關於取代及較佳實施例之詳細描述
<400> 5
<210> 6
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成一致序列
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<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
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<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
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<223> Ser或Thr
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Asn,Glu或Met
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Trp,Val,Thr,Ser,His,Tyr,Asn或Ala
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Ser或Pro
<220>
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<220>
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<223> Leu或Ile
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<223> 參見所提交說明書中關於取代及較佳實施例之詳細描述
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成一致序列
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<221> MOD_RES
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<221> MOD_RES
<222> (96)..(96)
<223> Gln,Lys,His,Ser,Val,Arg,Thr或Asn
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<221> MOD_RES
<222> (108)..(108)
<223> Leu或Ile
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<223> 參見所提交說明書中關於取代及較佳實施例之詳細描述
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<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 97
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 98
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 100
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 101
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<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<400> 258
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
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<220>
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<220>
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<400> 262
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
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<220>
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 270
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 272
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 274
<210> 275
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 275
<210> 276
<211> 720
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 276
<210> 277
<211> 2166
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 277
<210> 278
<211> 720
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 278
<210> 279
<211> 2166
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 279
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 280
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 282
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 283
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 284
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 285
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 286
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 287
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 288
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 289
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 290
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 291
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<211> 720
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 292
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 293
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<211> 720
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 294
<210> 295
<211> 2166
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 295
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 296
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<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 297
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<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 298
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<211> 2217
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 299
<210> 300
<211> 739
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 300
<210> 301
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 301
<210> 302
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Phe,Asp,Asn,Thr,Leu,Val,Met,Glu,Arg,Ser,Ala,Trp或Pro
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Lys,Ser,Arg,Val,His,Glu,11e,Asn,Asp,Ala或Thr
<400> 302
<210> 303
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Ser,Gly,Ala或Pro
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Asp,Ser,Trp,Gly或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Val,Pro,Arg,Ile或Ala
<400> 303
<210> 304
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Thr,Gln,Asp,Tyr,Asn,Arg,Trp,Phe,His,Met或Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Trp,Ile,Met或Leu
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> Ser,Met,Tyr,Ile,Lys,Glu,Val,Ala,Arg,Thr或Asn
<400> 304
<210> 305
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 305
<210> 306
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> Arg,Ser,Lys,Ala,Gly,Gln,Thr,Asn,Pro或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Arg,Leu,Cys,Thr,Pro,Gly,Ser,Lys,Glu,Gln,His
Ala,Tyr,Ile
<400> 306
<210> 307
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Trp或Phe
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Thr,Ala,Arg,Met,Phe,Ser,Asn,Trp,Gln,Leu或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Trp或Phe
<400> 307
<210> 308
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Thr,Ala,Arg,Met,Phe,Ser,Asn,Trp,Gln,Leu或Val
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Trp或Phe
<400> 308
<210> 309
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 309
<210> 310
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Asp或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Val,Arg,Thr,Ile,Met,Ser,Asn或Leu
<400> 310
<210> 311
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> Ala,Phe或Tyr
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Tyr,Asn,Lys,Phe,Met或Ser
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Glu,Val,Trp,Leu,Gln或Asn
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Glu或Asp
<400> 311
<210> 312
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 312
<210> 313
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 313
<210> 314
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Asn,Glu或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Trp,Val,Thr,Ser,His,Tyr,Asn或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Ser或Pro
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Asn或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Gln,Lys,His,Ser,Val,Arg,Thr或Asn
<400> 314
<210> 315
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Asn,Glu或Met
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> Trp,Val,Thr,Ser,His,Tyr,Asn或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Asn或Asp
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> Gln,Lys,His,Ser,Val,Arg,Thr或Asn
<400> 315
<210> 316
<211> 708
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 316
<210> 317
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 317
<210> 318
<211> 712
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 318
<210> 319
<211> 711
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 319
<210> 320
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 320
<210> 321
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 321
<210> 322
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 322
<210> 323
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 323
<210> 324
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 324
<210> 325
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 325
<210> 326
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 326
<210> 327
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 327
<210> 328
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 328
<210> 329
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 329
<210> 330
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 330
<210> 331
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 331
<210> 332
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 332
<210> 333
<211> 218
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 333
<210> 334
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 334
<210> 335
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 335
<210> 336
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 336
<210> 337
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 337
<210> 338
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 338
<210> 339
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 339
<210> 340
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 340
<210> 341
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 341
<210> 342
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 342
<210> 343
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 343
<210> 344
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 344
<210> 345
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 345
<210> 346
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 346
<210> 347
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 347
<210> 348
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 348
<210> 349
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 349
<210> 350
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 350
<210> 351
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 351
<210> 352
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 352
<210> 353
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 353
<210> 354
<211> 2154
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 354
<210> 355
<211> 716
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 355
<210> 356
<211> 2154
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 356
<210> 357
<211> 716
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 357
<210> 358
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 358
<210> 359
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 359
<210> 360
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 360
<210> 361
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 361
<210> 362
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 362
<210> 363
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 363
<210> 364
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 364
<210> 365
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 365
<210> 366
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 366
<210> 367
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 367
<210> 368
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 368
<210> 369
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 369
<210> 370
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 370
<210> 371
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 371
<210> 372
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 372
<210> 373
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 373
<210> 374
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 374
<210> 375
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 375
<210> 376
<211> 720
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 376
<210> 377
<211> 720
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 377
<210> 378
<211> 720
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 378
<210> 379
<211> 720
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 379
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 380
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 381
<210> 382
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 382
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<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 384
<210> 385
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 385
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 386
<210> 387
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 387
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<211> 720
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 389
<210> 390
<211> 720
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 390
<210> 391
<211> 720
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 391
<210> 392
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 392
<210> 393
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 393
<210> 394
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 394
<210> 395
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(100)
<223> 此序列可涵蓋1-20個「Gly Gly Gly Gly Ser」重複單元
<400> 395
<210> 396
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 396
<210> 397
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 397
<210> 398
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 398
<210> 399
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 399
<210> 400
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 400
<210> 401
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> 此序列可涵蓋1-10個「Gly Gly Gly Gly Ser」
重複單元
<400> 401
<210> 402
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 402
<210> 403
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成6×His標簽
<400> 403
<210> 404
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 404
<210> 405
<211> 734
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 405
<210> 406
<211> 734
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 406
<210> 407
<211> 739
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 407
<210> 408
<211> 739
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 408
<210> 409
<211> 2231
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 409
<210> 410
<211> 739
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 410
<210> 411
<211> 2231
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 429
第1A-B圖：示範性IGF-1R VH序列(SEQ ID NO：8-31及384-385，自上至下連續編號)與其所來源之一致序列(SEQ ID NO：1)的比對。CDR加有底線且CDR之SEQ ID NO作為方括號中之編號(例如「[S.302]」)提供於CDR上方。
第2A-E圖：示範性IGF-1R VL序列(SEQ ID NO：32-133 及386-387，自上至下連續編號)與其所來源之兩個一致序列(SEQ ID NO：2及3)的比對。SEQ ID NO：2包括16F之VL域，而SEQ ID NO：3不包括。CDR加有底線且CDR之SEQ ID NO作為方括號中之編號提供於CDR上方。
第3A-B圖：示範性ErbB3 VH序列(SEQ ID NO：134-165及388，自上至下連續編號)與其所來源之兩個一致序列(SEQ ID NO：4及5)的比對。SEQ ID NO：4包括16F之VH域，而SEQ ID NO：5不包括。CDR加有底線且CDR之SEQ ID NO作為方括號中之編號提供於CDR上方。
第4A-B圖：示範性ErbB3 VL序列(SEQ ID NO：166-200，自上至下連續編號)與其所來源之兩個一致序列(SEQ ID NO：6及7)的比對。SEQ ID NO：6包括16F之VL域，而SEQ ID NO：7不包括。CDR加有底線且CDR之SEQ ID NO作為括號中之編號提供於CDR上方。
第5圖：示範性抗IGF-1R-IgG1-抗ErbB3(第5A圖)及抗ErbB3-IgG1-抗-IGF-1R(第5B圖)多價雙特異性抗體之輕鏈及重鏈之胺基酸序列。
第5A圖展示以下抗IGF-1R-IgG1-抗ErbB3雜交重鏈之aa序列：SF-G1-C8(亦即16F-SEQ ID NO：210)；SF-G1-P1(SEQ ID NO：212)；SF-G1-M1.3(SEQ ID NO：214)；SF-G1-M27(SEQ ID NO：216)；SF-G1-P6(SEQ ID NO：218)；SF-G1-B69(SEQ ID NO：220)；P4-G1-C8(SEQ ID NO：222)； P4-G1-P1(SEQ ID NO：224)；P4-G1-M1.3(SEQ ID NO：226)；P4-G1-M27(SEQ ID NO：228)；P4-G1-P6(SEQ ID NO：230)；P4-G1-B69(SEQ ID NO：232)；M78-G1-C8(SEQ ID NO：234)；M78-G1-P1(SEQ ID NO：236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO：238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO：240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO：242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO：244)；M57-G1-C8(SEQ ID NO：246)；M57-G1-P1(SEQ ID NO：248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO：250)；M57-G1-M27(5EQ ID NO：252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO：254)及M57-G1-B69(SEQ ID NO：256)。
第5B圖展示以下抗ErbB3-IgG1-抗IGF-1R雜交重鏈之aa序列：P1-G1-P4(SEQ ID NO：268)；P1-G1-M57(SEQ ID NO：270)；P1-G1-M78(SEQ ID NO：272)；M27-G1-P4(SEQ ID NO：274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO：276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO：278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO：280)；M7-G1-M57(SEQ ID NO：282)；M7-G1-M78(SEQ ID NO：284)；B72-G1-P4(SEQ ID NO：286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO：288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO：290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO：292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO：294)；B60-G1-M78(SEQ ID NO：296)；B60-G2-M78(SEQ ID NO：355)及M7-G2-M78(SEQ ID NO：357)。
第5A及5B圖之此等雜交重鏈各自包含三個命名模組且各自根據其模組組成(參見如8)進行命名，其中左邊第一個名稱為胺基端模組，中間第二個名稱為中間模組(如 所示，在序列提供於第5A及5B圖中之多價雙特異性抗體中，始終為G1或G2)且右邊第三個名稱為羧基端模組。各第一胺基端模組包含自左至右包含各自由點狀底線所指示之VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3的重鏈可變區。各第二中間模組命名為G1或G2且包含IgG1恆定區，且不形成多價雙特異性抗體中之抗原結合位點。G1或G2模組序列之鉸鏈、CH2及CH3部分加有單底線。CH1部分始於ASTK(SEQ ID NO：392)。連接G1模組與第三模組之Gly-Ser連接子序列加有雙底線。各第三羧基端模組出現在此Gly-Ser連接子序列之右側且包含scFv，該scFv包含自左至右包含VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3(各自加有點狀底線)之重鏈可變區、Gly-Ser scFv連接子(加有雙波狀底線)及包含VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3(各自加有點狀底線)之輕鏈可變區。
各胺基端或羧基端重鏈模組之結合特異性與第5A或5B圖之相應命名輕鏈相同。
第5A圖展示以下成熟抗IGF-R1 κ輕鏈之胺基酸(「aa」)序列：SF(SEQ ID NO：202)、P4(SEQ ID NO：204)、M78(SEQ ID NO：206)及M57(SEQ ID NO：208)。
第5B圖展示以下成熟抗ErbB3 λ輕鏈之aa序列：P1(SEQ ID NO：258)、M27(SEQ ID NO：260)、M7(SEQ ID NO：262)、B72(SEQ ID NO：264)及B60(SEQ ID NO：266)。
第5A及5B圖之各輕鏈自左至右包含VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3(各自加點狀底線)。CL域在抗IGF-1R VL域中始於「RTVAA」(SEQ ID NO：393)且在抗ErbB3 VL域中始於「QPKAA」(SEQ ID NO：394)。
為形成包含第5A及5B圖之重鏈及輕鏈之完整多價雙特異性抗體，將各重鏈與共享重鏈之胺基端模組之名稱的輕鏈共表現。所得各多價雙特異性抗體採取IgG抗體之形式(其如同原生IgG抗體，包含兩個基本上相同之抗原結合位點)，具有scFv附接於IgG之兩條重鏈各自之羧基端。
第6圖：示範性6A)抗IGF-1R IgG1抗體及6B)抗ErbB3 IgG1抗體之胺基酸序列；及6C)抗IGF-1R scFv及6D)抗ErbB3 scFv之aa序列。
第7圖：SF-G1-C8(16F)之7A)重鏈及7B)輕鏈之胺基酸序列，各自具有在成熟抗體中不存在之前導序列。重鏈aa序列(SEQ ID NO：300)為具有附加N端前導序列之SF-G1-C8(SEQ ID NO：210)之重鏈aa序列。輕鏈aa序列(SEQ ID NO：298)為具有附加N端前導序列之SF κ輕鏈(SEQ ID NO：202)之輕鏈aa序列。前導序列以粗體加底線顯示；加有點狀底線之序列為如上所示之CDR；連接子(鉸鏈、連接型連接子及scFv連接子)在其粗體序列上方說明，且個別CH3 aa殘基E356及M358以黑體顯示(其為 可如下取代為E356D及M358L之aa)。第7A圖中之CH1、CH2、CH3、VH及VL域及第7B圖中之CL域的身份在各域之上方說明，各自之起點由直角箭頭指示。
第8圖：展示得到Ig樣四價雙特異性抗體之模組的示意圖。結合域(「N端模組」及「C端模組」)所來源之抗體標記為單株抗體1及單株抗體2。圖及模組在本質上為概念性的；聯結在一起以製備該種雙特異性抗體之實際DNA片段可能與模組之限制不一致，但最終結果基本上如所示。此外，單株抗體1及單株抗體2可能不呈所示之IgG格式，例如任一者或兩者可為scFv。若使用scFv作為N端模組之來源，則藉由移除編碼scFv連接子之DNA序列以產生分別由重鏈及輕鏈多肽鏈包含之VH及VL區來將其由scFv格式轉變為Fv格式。
第9圖：模擬ErbB網路以預測最佳ErbB3治療劑之設計。
9A)圖解描繪ErbB網路之複雜性：配位體結合、受體二聚化、受體運輸及細胞內信號傳遞各自表述於基於質量-作用之動力學模型中。9B)使用ErbB網路中各蛋白質之模擬擾動來鑒別在異調蛋白或乙胞素(betaceIIulin)刺激下下游信號磷酸化Akt對各蛋白質之敏感性。9C)經由解離速率之變化檢查Akt對抗ErbB3抗體之劑量反應性的多種親和力結合常數。各圖自上至下所列Kd之順序對 應於各圖中自左至右曲線之順序。
第10圖：預測雙特異性抗體共抑制兩條路徑之能力取決於相對受體含量。計算模擬表現三種不同莫耳比之各受體：另一受體之細胞中計算模擬之雙特異性抗體對A)IGF-1R、B)ErbB3及C)共有下游信號傳遞路徑成分Akt(Akt激酶)之活性程度的影響。各圖中之三條曲線可由其右手末端各自與圖邊框相交之相對位置加以鑒別。
最左邊x軸/最下邊y軸交線=IGF-1R為ErbB3 10倍多之模擬，中間交線=等量IGF-1R與ErbB3之模擬，最右邊x軸/最上邊y軸交線=ErbB3為IGF-1R 10倍多之模擬。歸因於雙特異性劑對IGF-1R之親和力較低，因此當ErbB3含量降低時IGF-1R抑制之效力降低，表明親合性之作用。未能有效抑制IGF-1R導致抑制pAkt之能力降低(右)。因雙特異性劑對ErbB3之親和力較強，因此抑制ErbB3之能力不受IGF-1R含量影響。
第11圖：藉由共價酵母呈現對scFv親和力及穩定性進行同時最佳化。
11A)藉由螢光活化細胞分選量測之熱激發後分離之酵母呈現scFv模組對可溶性GFR2(ErbB3)-Fc之親和力。11B)對共價連接於酵母表面之最佳化scFv模組進行之熱激發證實其較高熱穩定性。藉由螢光活化細胞分選量測65℃下熱逆境5分鐘後殘留之對ErbB3-Fc之殘餘結合活性。 MFI=平均螢光強度。
第12圖：可使用微差掃描螢光來估算血清穩定性。
12A)藉由微差掃描螢光測定法獲得之微觀穩定性量測值。12B)根據在37℃下在小鼠血清中培育前(100%)及3天後之結合活性百分比量測之宏觀穩定性。概念驗證雙特異性蛋白質在微觀(A)與宏觀(B)性質兩方面均顯示與穩定化類似物相比較低之穩定性。
第13圖：最佳化雙特異性抗體顯示與概念驗證雙特異性抗體相比較強之細胞結合。與表現IGF-1R與ErbB3兩者之BxPC-3細胞的結合藉由螢光活化細胞分選進行量測。
第14圖：與ADRr及MCF7細胞之結合。14A)與ADRr細胞之結合。如此圖及以下第14B、18、19、20A及20B圖中所用，「模組2-21之IgG」係指具有與ILE-12中相同之抗ErbB3可變區的抗ErbB3抗體。「模組2-3之IgG」係指具有與ELI-7及ILE-10中相同之抗ErbB3可變區的抗ErbB3抗體。「模組5-7之IgG」係指具有與ELI-7、ILE-10及ILE-12中相同之抗IGF-1R可變區的抗IGF-1R抗體。14B)與MC7細胞之結合。
第15圖：ILE-7及ELI-7對pAKT之抑制。
第16圖：ELI-7對DU145細胞生長之影響(藉由CTG分析量測)。RLU=相對發光單位。
第17圖：藉由CTG分析量測之ELI-7對BxPC-3細胞生長之抑制。
第18圖：異種移植腫瘤生長曲線。IgG抗體之描述提供於圖14A之圖例中。
第19圖：第41天時之BxPC-3最終異種移植腫瘤體積。
第20圖：異種移植腫瘤生長速率及尺寸。20A)DU145腫瘤生長曲線。20B)第36天時之DU145腫瘤體積。
第21圖：多價雙特異性抗體在寬泛的ErbB3及IGF-1R受體含量範圍內抑制信號傳遞。ELI-7顯示在經修飾以含有寬泛範圍之IGF1R及ErbB3受體含量的BxPC-3細胞系中抑制pAkt。「BxPC-3對照」係指具有不變IGF-1R及ErbB3含量之BxPC-3細胞。「BxPC-3-IGF1R-Mod1」係指IGF-1R含量降低37%之BxPC-3細胞。「BxPC-3-ErbB3-Mod1」係指ErbB3含量降低48%之BxPC-3細胞。
「BxPC-3-ErbB3-Mod2」係指ErbB3含量降低88%之BxPC-3細胞。
第22圖：在BcPC3細胞中由16F(SF-G1-C8)「再工程改造雙特異性劑」及ELI-7「原始雙特異性劑」所致之pIGF-1R含量降低。
第23圖：BxPC-3細胞中16F(SF-G1-C8)、抗IGF-1R Ab#B(西妥木單抗(cixutumumab)；SEQ ID 324+SEQ ID 325)、抗ErbB3 Ab# A(SEQ ID 336+SEQ ID 337)或抗IGF-1R Ab#B+抗ErbB3 Ab# A對23A)IGF1R、23B)ErbB3及23C)AKT之磷酸化的抑制，及DU145細胞中16F(SF-G1-C8)、抗IGF-1R Ab#B(西妥木單抗；SEQ ID 324+SEQ ID 325)、抗ErbB3 Ab# A(SEQ ID 336+SEQ ID 337)或抗IGF-1R Ab#B+抗ErbB3 Ab# A對23D)IGF1R、23E)ErbB3及23F)AKT之磷酸化的抑制。
第24圖：24A)16F(SF-G1-C8)與24B)抗IGF-1R Ab# A(加尼圖單抗(ganitumab)；SEQ ID 327+SEQ ID 328)、抗ErbB3 Ab# A(SEQ ID 336+SEQ ID 337)及抗IGF-1R Ab# A+抗ErbB3 Ab# A之信號傳遞抑制的比較。在24A與24B各圖中，IGF1R磷酸化之抑制展示於上圖中，ErbB3磷酸化之抑制展示於中圖中，且AKT磷酸化之抑制展示於下圖中；所有均在BxPC-3細胞中。
第25圖：雙特異性抗體顯示與BxPC-3細胞強結合。如藉由FACS所量測，在將指定抗體與BxPC-3細胞一起培育後產生結合曲線。
第26圖：雙特異性抗體顯示與重組ErbB3蛋白強結合，指定抗體在經ErbB3-His塗佈之盤中培育且藉由ELISA量測結合抗體含量後產生結合曲線。
第27圖：雙特異性抗體顯示對雙重路徑信號傳遞之強抑制。pIGF1R、pErbB3及pAKT產生之BxPC-3信號抑制如所示。
第28圖：指定雙特異性抗體在血清中在37℃下72小時之穩定性百分比。
第29圖：A-D展示如FACS所量測，各種雙特異性抗體(如所示)與BxPC-3細胞之結合。在29A)中，M27/M7-IgG-P4、M27/M7-IgG-M57及M27/M7-IgG-M78雙特異性抗體之N端模組含有M27重鏈及M7輕鏈。
第30圖：A-E展示如根據pIGF1R含量之變化所量測，各種雙特異性抗體(如所示)之BxPC-3信號抑制資料。
第31圖：A-F展示如根據pErbB3含量之變化所量測，各種雙特異性抗體(如所示)之BxPC-3信號抑制資料。
第32圖：A-E展示如根據pAKT含量之變化所量測，各種雙特異性抗體(如所示)之BxPC-3信號抑制資料。
第33圖：A-D展示如根據pIGF1R含量之變化所量測，各種雙特異性抗體(如所示)與抗ErbB3 Ab# A(SEQ ID 336+SEQ ID 337)及抗IGF-1R Ab# A(加尼圖單抗；SEQ ID 327+SEQ ID 328)之組合的BxPC-3信號抑制資料的比較。
第34圖：A-D展示如根據pErbB3含量之變化所量測，各種雙特異性抗體(如所示)與抗ErbB3 Ab# A(SEQ ID 336+SEQ ID 337)及抗IGF-1R Ab# A(加尼圖單抗；SEQ ID 327+SEQ ID 328)之組合的BxPC-3信號抑制資料的比較。
第35圖：A-D展示如根據pAKT含量之變化所量測，各種雙特異性抗體與抗ErbB3 Ab# A(SEQ ID 336+SEQ ID 337)及抗IGF-1R Ab# A(加尼圖單抗；SEQ ID 327+SEQ ID 328)之組合的BxPC-3信號抑制資料的比較。
第36圖：A-B展示各種雙特異性抗體(如所示)在小鼠血清中在37℃下5天之經校正穩定性。
第37圖：根據本文之揭示內容可併入多價雙特異性抗體中之抗IGF-1R抗體之重鏈、輕鏈及scFv的公開aa序列。
第38圖：根據本文之揭示內容併入多價雙特異性抗體中之抗ErbB3抗體之重鏈、輕鏈及scFv的公開aa序列。
第39圖：A-B展示在DU145細胞中由PBA A)M7-G1-M78(「M7-M78」)、P4-G1-M1.3(「P4-M1.3」)、P4-G1-C8(「P4-C8」)及B)SF-G1-C8(「SF-C8」)與不存在PBA(「IGF1+HRG」)；不存在誘導劑及PBA(「無Tx」)；僅有抗EGF1R mAB；僅有抗ErbB3 mAb；及抗IGF-1R+抗ErbB3之組合的情況下對IGF1及異調蛋白(HRG)信號轉導之抑制的比較，如根據對AKT磷酸化之抑制所量測。C-D展示與A-B中類似，但在BxPC-3細胞中獲得之抑制資料。此圖及第40-44及51圖中之抗IGF1R及抗ErbB3 mAb分別為抗IGF-1R Ab# A(加尼圖單抗；SEQ ID 327+SEQ ID 328)及抗ErbB3 Ab# A(SEQ ID 336+SEQ ID 337)。
第40圖：A-C展示如藉由對AKT磷酸化之抑制所量測，PBA M7-G1-M78、P4-M1.3、P4-C8及SF-C8在具有A-D) 野生型含量之IGF-1R及ErbB3；B-E)含量降低約50%之IGF-1R；或C-F)含量降低約50%之ErbB3的BxPC-3細胞中對IGF1及異調蛋白(HRG)誘導之信號轉導的抑制。
第41圖：A-D展示如根據AKT磷酸化之抑制所量測，BxPC-3細胞中PBA M7-G1-M78、P4-M1.3、P4-C8及SF-C8對由A-B)40 ng/ml IGF1或C-D)400 ng/ml IGF1誘導之信號轉導的抑制。
第42圖：A-D展示如根據AKT磷酸化之抑制所量測，BxPC-3細胞中PBA M7-G1-M78、P4-M1.3、P4-C8及SF-C8對由A-B)20 ng/ml IGF1或C-D)200 ng/ml異調蛋白(HRG)誘導之信號轉導的抑制。
第43圖：A-B展示A)與PBA M7-G1-M78、P4-M1.3、P4-C8及SF-C8一起培育15分鐘後；或B)與PBA一起培育2小時後A549細胞中基本信號傳遞之抑制。C-D展示C)與PBA M7-G1-M78、P4-M1.3、P4-C8及SF-C8一起培育15分鐘後；或D)與PBA一起培育2小時後BsPC-3細胞中基本信號傳遞之抑制。所有信號傳遞均藉由量測pAKT含量來測定。
第44圖：A-B展示用P4-G1-C3或P4-G1-M1.3處理24小時後A)A549細胞及B)BxPC-3細胞中之總IGF1R含量。
第45圖：展示血清剝奪(「剝奪」)或僅用IGF1或IGF2處理或在PBA P4-M1.3或P4-C8存在下用IGF1或IGF2處 理之DU145或MIA PaCa-2(高IR)細胞中pIGF1R、pAKt及B-肌動蛋白之蛋白質含量的蛋白質印跡。
第46圖：展示血清剝奪(「剝奪」)或用IGF1處理；在P4-M1.3存在下用IGF1處理；用胰島素處理或在P4-M1.3存在下用胰島素處理之DU145細胞中pIGF1R、pAKt及B-肌動蛋白之蛋白質含量的蛋白質印跡。
第47圖：展示在不存在配位體下(泳道1-3)或在存在IGF1及異調蛋白(HRG)下(泳道4-6)及在不存在PBA下或在存在PBA M7-78或P4-C8下培育之BxPC-3細胞中IGF1R、pIGF1R、ErbB3、pErbB3、pAkt及B-肌動蛋白之蛋白質含量的蛋白質印跡。
第48圖：A-F展示小鼠或石蟹獼猴血清中培育0或5天後所存在之A-B)M7-G1-M78；C-D)P4-G1-M1.3；E-F)P4-G1-C8之量。G-H展示在塗有IGF-1R(G)或ErbB3(H)之盤中人類血清中0或6天後所存在之P4G1-M1.3之量。
第49圖：A-F展示PBA P4-C8(A、D)、P4-M1.3(B、E)及M7-M78(C、F)與A-C)人類、小鼠、大鼠及石蟹獼猴ErbB3以及D-F)人類、小鼠、大鼠及石蟹獼猴EGF-1R之結合的程度。未提供M7-M78與大鼠及石蟹獼猴IGF-1R之結合。
第50圖：A-B展示使A)IGF1及B)IGF2自與盤結合之IGF-1R脫離所必需之PBA P4-G1-M1.3的濃度。
第51圖：A-F展示在活體外在經IGF-1+HRG或 IGF-1+HRG+P4-G1-M1.3處理之BxPC-3細胞中隨時間每毫克總蛋白質中磷酸化IGF-1R(A)、磷酸化ErbB3(B)、磷酸化Akt(C)、磷酸化ERK(p44/p42；D)、磷酸化mTOR(Ser2448,E)及磷酸化S6(Ser235/236；5F)之ng數。
第52圖：在用血清、IGF1、IGF1與P4M1.3(P4-G1-M1.3)、IGF2、IGF2與P4M1.3(P4-G1-M1.3)、胰島素及胰島素與P4M1.3(P4-G1-M1.3)處理之BxPC-3及A673細胞中pIGF1R、pAKT及B肌動蛋白之含量。
第53圖：A-B展示在注射了PBS、P4-G1-M1.3或抗IGF-1R Ab# A之一的小鼠之研究結束BxPC-3腫瘤中mTOR(A)及磷酸化mTOR(「pmTOR」)之含量。
第54圖：A-F展示在注射了PBS、P4-G1-M1.3、抗IGF-1RAb# A+抗ErbB3 IgG及mTOR抑制劑依維莫司(everolimus)之一的小鼠之研究結束Caki-1腫瘤中，IGF-1R及胰島素受體A)、ErbB3及EGFR(B)、在殘基S473上磷酸化之AKT(「pAKT S473」)及T308(「pAKT T308」)(C)、磷酸化Fox01及Fox03a(D，「磷酸化Fox01(Thr24)/Fox03a(Thr32)」)、在殘基S2448及S2481上磷酸化之mTOR(E)以及在殘基S235/236及S240/244上磷酸化之S6(F，「pS6 S235/236」及「pS6 S240/244」)的含量。
第55圖：A-C展示在注射了PBS、P4-G1-M1.3或抗IGF-1R Ab# A之一的小鼠之研究結束BxPC-3腫瘤中，IGF-1R及ErbB3(A)、磷酸化EGFR(B，「pEGFR」)以及磷酸化mTOR(「pmTOR S2448」)及磷酸化S6(「pS6 S235/236」)(C)的含量。
第56圖展示在盤經IGF-1R-His塗佈且向各孔中添加了P4-G1-M1.3之連續稀釋液的ELISA分析中IGF-1(「IGF1」，左圖)及IGF-2(「IGF2」，右圖)之含量。
第57圖：A-D展示在DU145(A)、BxPC-3(B)、SK-ES-1(C)及Caki-1(D)異種移植物模型中隨時間之平均腫瘤體積。向小鼠注射以下之一：PBS、500 μg P4-G1-M1.3、100 μg P4-G1-M1.3、500 μg P4-G1-C8或100 μg P4-G1-C8(A)；PBS、500 μg P4-G1-M1.3、300 μg P4-G1-M1.3、100 μg P4-G1-M1.3、500 μg P4-G1-C8、300 μg P4-G1-C8、100 μg P4-G1-C8、375 μg抗IGF-1R Ab# A(加尼圖單抗；SEQ ID 327+SEQ ID 328)、225 μg抗IGF-1R Ab# A(加尼圖單抗；SEQ ID 327+SEQ ID 328)或75 μg抗IGF-1R Ab# A(加尼圖單抗；SEQ ID 327+SEQ ID 328)(B)；PBS、500 μg P4-G1-M1.3、300 μg P4-G1-M1.3或100 μg P4-G1-M1.3(C)；或PBS、500 μg P4-G1-M1.3、300 μg P4-G1-M1.3、100 μg P4-G1-M1.3、以等暴露量給藥之抗IGF-1R+抗ErbB3或以等莫耳量給藥之抗IGF-1R+抗 ErbB3(D)。
第58圖展示目標介導之藥物處置模型與由來自注射了M1.3-G1-P4之小鼠之小鼠血液獲得之實驗資料的擬合。實線為給予500 μg劑量之小鼠的擬合，而點線為給予100 μg劑量之小鼠的擬合。
序列簡單描述：本文提及及序列表中所列之胺基酸(「aa」)序列說明如下。
SEQ ID NO：1為來源於示範性IGF-1R VH序列之aa一致序列。
SEQ ID NO：2為來源於示範性IGF-1R VL序列之aa一致序列。
SEQ ID NO：3為來源於示範性IGF-1R VL序列之aa一致序列，該等示範性IGF-1R VL序列不包括16F之IGF-1R結合位點之VL序列。
SEQ ID NO：4為來源於示範性ErbB3 VH序列之aa一致序列。
SEQ ID NO：5為來源於示範性ErbB3 VH序列之aa一致序列，該等示範性ErbB3 VH序列不包括16F之ErbB3結合位點之VH序列。
SEQ ID NO：6為來源於示範性ErbB3 VL序列之aa一致序列。
SEQ ID NO：7為來源於示範性ErbB3 VL序列之aa一致序列，該等示範性ErbB3 VL序列不包括16F之ErbB3結合位點之VL序列。
SEQ ID NO：8-31為第1圖中所示之IGF-1R VH aa序列。
SEQ ID NO：32-133為第2圖中所示之IGF-1R VL aa序列。
SEQ ID NO：134-165為第3圖中所示之ErbB3 VH aa序列。
SEQ ID NO：166-200為第4圖中所示之ErbB3 VL aa序列。
SEQ ID NO：201-256為第5A圖中提供之抗IGF-1R/抗ErbB3 IgG1(scFv)2之成熟輕鏈及重鏈的核苷酸序列(奇數編號)及aa序列(偶數編號)，其序列ID編號如下。κ輕鏈：SF(SEQ ID NO：201及202)；P4(SEQ ID NO：203及204)；M78(SEQ ID NO：205及206)；及M57(SEQ ID NO：207及208)。重鏈scFv融合物(雜交體)：SF-G1-C8(亦即16F；SEQ ID NO：209及210)；SF-G1-P1(SEQ ID NO：211及212)；SF-G1-M1.3(SEQ ID NO：213及214)；SF-G1-M27(SEQ ID NO：215及216)；SF-G1-P6(SEQ ID NO：217及218)；SF-G1-B69(SEQ ID NO：219及220)；P4-G1-C8(SEQ ID NO：221及222)；P4-G1-P1(SEQ ID NO：223及224)；P4-G1-M1.3(SEQ ID NO：225及226)；P4-G1-M27(SEQ ID NO：227及228)；P4-G1-P6(SEQ ID NO：229及230)；P4-G1-B69(SEQ ID NO：231及232)；M78-G1-C8(SEQ ID NO：233及234)；M78-G1-P1(SEQ ID NO：235及236)；M78-G1-M1.3(SEQ ID NO：237及238)；M78-G1-M27(SEQ ID NO：239及240)；M78-G1-P6(SEQ ID NO：241及242)；M78-G1-B69(SEQ ID NO：243及244)；M57-G1-C8(SEQ ID NO：245及246)；M57-G1-P1(SEQ ID NO：247及248)；M57-G1-M1.3(SEQ ID NO：249及250)；M57-G1-M27(SEQ ID NO：251及252)；M57-G1-P6(SEQ ID NO：253及254)及M57-G1-B69(SEQ ID NO：255及256)。
SEQ ID NO：257-296為第5B圖中提供之抗ErbB3/抗IGF-1R IgG1(scFv)2之成熟輕鏈及重鏈的核苷酸序列(奇數編號)及aa序列(偶數編號)，其序列ID編號如下。λ輕鏈：P1(SEQ ID NO：257及258)；M27(SEQ ID NO：259及260)；M7(SEQ ID NO：261及262)；B72(SEQ ID NO：263及264)；及B60(SEQ ID NO：265及266)。重鏈scFv融合物(雜交體)：P1-G1-P4(SEQ ID NO：267及268)；P1-G1-M57(SEQ ID NO：269及270)；P1-G1-M78(SEQ ID NO：271及272)；M27-G1-P4(SEQ ID NO：273及274)；M27-G1-M57(SEQ ID NO：275及276)；M27-G1-M78(SEQ ID NO：277及278)；M7-G1-P4(SEQ ID NO：279及280)；M7-G1-M57(SEQ ID NO：281及282)；M7-G1-M78(SEQ ID NO：283及284)； B72-G1-P4(SEQ ID NO：285及286)；B72-G1-M57(SEQ ID NO：287及288)；B72-G1-M78(SEQ ID NO：289及290)；B60-G1-P4(SEQ ID NO：291及292)；B60-G1-M57(SEQ ID NO：293及294)；及B60-G1-M78(SEQ ID NO：295及296)。
SEQ ID NO：297及298為如第7B圖中所示具有信號序列之16F之輕鏈的核苷酸及aa序列。
SEQ ID NO：299及300為如第7A圖中所示具有信號序列之16F之重鏈的核苷酸及aa序列。
SEQ ID NO：301為示範性重鏈域之一部分，其中在CH3域之C端與連接子之N端之間插入離胺酸SLSLSPGKGGGGS(SEQ ID NO：301-附加離胺酸加有底線)。
SEQ ID NO：302-304分別為抗IGF-1R VHCDR1、VHCDR2及VHCDR3域之一致序列，其為SEQ ID NO：1中所示及第1圖中所示之VH一致序列的CDR序列。
SEQ ID NO：305-307分別為抗IGF-1R VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3之一致序列，其為SEQ ID NO：2中所示及第2圖中所示之VL一致序列的CDR序列。
SEQ ID NO：308為抗IGF-1R VLCDR3之一致序列，其為SEQ ID NO：3中所示及第2圖中所示之VL一致序列的CDR3序列。
SEQ ID NO：209-311分別為抗ErbB3 VHCDR1、VHCDR2 及VHCDR3域之一致序列，其為SEQ ID NO：4中所示及第3圖中所示之VH一致序列的CDR序列。
SEQ ID NO：312-314分別為抗ErbB3 VLCDR1、VLCDR2及VLCDR3域之一致序列，其為SEQ ID NO：6中所示及第4圖中所示之VL一致序列的CDR序列。
SEQ ID NO：315為抗ErbB3 VLCDR3之一致序列，其為SEQ ID NO：7中所示及第4圖中所示之VL一致序列的CDR3序列。
SEQ ID NO：316為抗ErbB3/抗IGF-1R IgG2四價雙特異性蛋白ELI-7之重鏈的aa序列。
SEQ ID NO：317為抗ErbB3/抗IGF-1R IgG2四價雙特異性蛋白ELI-7之輕鏈的aa序列。
SEQ ID NO：318為抗IGF-1R/抗ErbB3四價雙特異性蛋白ILE-10之重鏈的aa序列。
SEQ ID NO：319為抗IGF-1R/抗ErbB3四價雙特異性蛋白ILE-12之重鏈的aa序列。
SEQ ID NO：320為抗IGF-1R/抗ErbB3四價雙特異性蛋白ILE-10及ILE-12之輕鏈的aa序列。
SEQ ID NO：321-335為表1中所示之抗IGF-1R抗體之Fab重鏈(Fab HC)、Fab輕鏈(Fab LC)及scFv的aa序列，該等序列列於第37圖中。
表1-抗IGF-1R抗體
SEQ ID NO：336-353為表2中所示之抗ErbB3抗體之Fab重鏈(Fab HC)、Fab輕鏈(Fab LC)及scFv的aa序列，該等序列列於第38圖中。
SEQ ID NO：354及355為第5B圖中所示之B60-IgG2-M78多價雙特異性抗體之核苷酸及aa序列。
SEQ ID NO：356及357為第5B圖中所示之M7-IgG2-M78多價雙特異性抗體之核苷酸及aa序列。
SEQ ID NO：358-360為第6A圖中所示之SF、P4、M78及M57抗IGF-1R IgG1單株抗體重鏈之aa序列。
SEQ ID NO：362-366為第6B圖中所示之P1、M27、M7、B72及B60抗ErbB3 IgG1單株抗體重鏈之aa序列。
SEQ ID NO：367-369為第6C圖中所示之P4、M57及M78抗IGF-1R scFv單株抗體之aa序列。
SEQ ID NO：370-375為第6D圖中所示之C8、P1、M1.3、M27、P6及B69抗ErbB3 scFv單株抗體之aa序列。
SEQ ID NO：376-379分別為重鏈P4M-G1-M1.3、P4M-G1-C8、P33M-G1-M1.3及P33M-G1-C8之aa序列。
SEQ ID NO：380及381分別為P33M κ輕鏈及P4M κ輕鏈之aa序列。
SEQ ID NO：382及383分別為抗IGF-1R scFv M76及抗ErbB3 scFv P6L之aa序列。結合位點M76之VH及VL域分別由SEQ ID NO：31及133中所示之aa序列組成。
SEQ ID NO：384及385分別為抗IGF-1R結合位點模組P4M及P33M之VH域之aa序列。
SEQ ID NO：386及387分別為抗IGF-1R結合位點模組P4M及P33M之VL域之aa序列。
SEQ ID NO：388為抗ErbB3結合位點模組P6L之VH域之aa。VL域由SEQ ID NO：173中所示之aa序列組成。
SEQ ID NO：389及390分別為抗IGF-1R重鏈P4M-G1-P6L及P33M-G1-P6L之aa序列。
SEQ ID NO：391為抗ErbB3重鏈P1-G1-M76之aa序列。
SEQ ID NO：392為第5A及5B圖之雜交重鏈之CH1部分開始之aa序列。
SEQ ID NO：393及394分別為第5A及5B圖之輕鏈之抗IGF-1R及ErbB3 VL域中CL域開始之aa序列。
SEQ ID NO：395-400為示範性Gly-Ser多肽連接子之aa序列。

Claims (38)

  1. 一種結合至IGF-1R之抗體，其包含含有SEQ ID NO：226之胺基酸26-35的重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：226之胺基酸51-66的重鏈CDR2、含有SEQ ID NO：226之胺基酸99-111的重鏈CDR3；以及含有SEQ ID NO：204之胺基酸24-34的輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：204之胺基酸50-56的輕鏈CDR2以及含有SEQ ID NO：204之胺基酸89-97的輕鏈CDR3。
  2. 一種結合至IGF-1R之抗體，其包含含有與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列至少90%相同的重鏈可變區以及與SEQ ID NO：34所示之胺基酸序列至少90%相同的輕鏈可變區。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體包含含有SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列的重鏈可變區以及含有SEQ ID NO：34所示之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體為單株抗體或其片段。
  5. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體為雙特異性抗體。
  6. 如申請專利範圍第5項之抗體，其中該抗體進一步包含ErbB3結合位點。
  7. 如申請專利範圍第6項之抗體，其該ErbB3結合位點包含重鏈及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含含有SEQ ID NO：226之胺基酸492-501的CDR1、含有SEQ ID NO：226之胺基酸517-532的CDR2以及含有SEQ ID NO：226之胺基酸565-577的CDR3，且該輕鏈可變區包含含有SEQ ID NO：226之胺基酸634-644的CDR1、含有SEQ ID NO：226之胺基酸660-666的CDR2以及含有SEQ ID NO：226之胺基酸699-709的CDR3。
  8. 如申請專利範圍第6項之抗體，其中該ErbB3結合位點包含含有與SEQ ID NO：142所示之胺基酸序列至少90%相同的重鏈可變區以及含有與SEQ ID NO：174所示之胺基酸序列至少90%相同的輕鏈可變區。
  9. 如申請專利範圍第7項之抗體，其中該ErbB3結合位點包含含有SEQ ID NO：142所示之胺基酸序列的重鏈可變區以及含有SEQ ID NO：174所示之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  10. 一種結合至ErbB3之抗體，其包含含有SEQ ID NO：226之胺基酸492-501的重鏈CDR1、含有SEQ ID NO：226之胺基酸517-532的重鏈CDR2以及含有SEQ ID NO：226之胺基酸565-577的重鏈CDR3；以及含有SEQ ID NO：226之胺基酸634-644的輕鏈CDR1、含有SEQ ID NO：226之胺基酸660-666的輕鏈CDR2以及含有SEQ ID NO：226之胺基酸699-709的輕鏈CDR3。
  11. 一種結合至ErbB3之抗體，其包含與SEQ ID NO：142所示之胺基酸序列至少90%相同的重鏈可變區以及與SEQ ID NO：174所示之胺基酸序列至少90%相同的輕鏈可變區。
  12. 如申請專利範圍第10或11項之抗體，其中該抗體包含含有SEQ ID NO：142所示之胺基酸序列的重鏈可變區以及含有SEQ ID NO：174所示之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  13. 如申請專利範圍第10或11項之抗體，其中該抗體為單株抗體或其片段。
  14. 如申請專利範圍第10或11項之抗體，其中該抗體為雙特異性抗體。
  15. 如申請專利範圍第14項之抗體，其中該抗體進一步包含IGF-1R結合位點。
  16. 如申請專利範圍第15項之抗體，其中該IGF-1R結合位點包含重鏈及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含含有SEQ ID NO：226之胺基酸26-35的CDR1、含有SEQ ID NO：226之胺基酸51-66的CDR2、含有SEQ ID NO：226之胺基酸99-111的CDR3，且該輕鏈可變區包含含有SEQ ID NO：204之胺基酸24-34的CDR1、含有SEQ ID NO：204之胺基酸50-56的CDR2以及含有SEQ ID NO：204之胺基酸89-97的CDR3。
  17. 如申請專利範圍第15項之抗體，其中該IGF-1R結合位點包含與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列至少90%相同的重鏈可變區，及/或與SEQ ID NO：34所示之胺基酸序列至少90%相同的輕鏈可變區。
  18. 如申請專利範圍第16項之抗體，其中該IGF-1R結合位點包含含有SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列的重鏈可變區，以及含有SEQ ID NO：34所示之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  19. 一種結合至IGF-1R及ErbB3之雙特異性抗體，其包含：a)包含重鏈及輕鏈可變區之IGF-1R結合位點，其中該重鏈可變區包含含有SEQ ID NO：226之胺基酸26-35的CDR1、含有SEQ ID NO：226之胺基酸51-66的CDR2、含有SEQ ID NO：226之胺基酸99-111的CDR3，且該輕鏈可變區包含含有SEQ ID NO：204之胺基酸24-34的CDR1、含有SEQ ID NO：204之胺基酸50-56的CDR2、含有SEQ ID NO：204之胺基酸89-97的CDR3；及b)包含重鏈及輕鏈可變區之ErbB3結合位點，其中該重鏈可變區包含含有SEQ ID NO：226之胺基酸492-501的CDR1、含有SEQ ID NO：226之胺基酸517-532的CDR2、含有SEQ ID NO：226之胺基酸565-577的CDR3，且該輕鏈可變區包含含有SEQ ID NO：226之胺基酸634-644的CDR1、含有SEQ ID NO：226之胺基酸660-666的CDR2、含有SEQ ID NO：226之胺基酸699-709的CDR3。
  20. 一種結合至IGF-1R及ErbB3之雙特異性抗體，其包含：a)包含重鏈及輕鏈可變區之IGF-1R結合位點，其中該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列至少90%相同之胺基酸序列，且該輕鏈可變域包含與SEQ ID NO：34所示之胺基酸序列至少90%相同之胺基酸序列；且b)包含重鏈及輕鏈可變區之ErbB3結合位點，其中該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：142所示之胺基酸序列至少90%相同之胺基酸序列，且該輕鏈可變域包含與SEQ ID NO：174所示之胺基酸序列至少90%相同之胺基酸序列。
  21. 如申請專利範圍第19或20項之雙特異性抗體，其中：a)該IGF-1R結合位點之重鏈可變區包含SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：34所示之胺基酸序列；且b)該ErbB3結合位點之重鏈可變區包含SEQ ID NO：142所示之胺基酸序列，且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：174所示之胺基酸序列。
  22. 如申請專利範圍第19或20項之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體包含C端scFv。
  23. 如申請專利範圍第22項之雙特異性抗體，其中該ErbB3結合位點為C端scFv。
  24. 如申請專利範圍第22項之雙特異性抗體，其中該IGF-1R結合位點為C端scFv。
  25. 一種結合至IGF-1R及ErbB3之雙特異性抗體，其具有兩對多肽鏈，該兩對中之各對包含藉由至少一個重鏈-輕鏈鍵聯結於輕鏈之重鏈，其中各輕鏈包含具有與SEQ ID NO：204所示之胺基酸序列至少90%相同之胺基酸序列且各重鏈包含具有與SEQ ID NO：226所示之胺基酸序列至少90%相同之胺基酸序列。
  26. 如申請專利範圍第25項之雙特異性抗體，其中各輕鏈包含如SEQ ID NO：204所示之胺基酸序列且各重鏈包含如SEQ ID NO：226所示之胺基酸序列。
  27. 如申請專利範圍第25或26項之雙特異性抗體，其中至少一個鍵中之至少一者為二硫鍵。
  28. 如申請專利範圍第19、20、25及26項中任一項之雙特異性抗體，其中該雙特異性抗體含有兩個IGF-1R結合位點及兩個ErbB3結合位點。
  29. 如申請專利範圍第1、2、10及11項中任一項之抗體，其中該抗體為IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY抗體。
  30. 如申請專利範圍第29項之抗體，其中該抗體為IgG抗體。
  31. 如申請專利範圍第30項之抗體，其中該抗體為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。
  32. 一種組合物，其包含如申請專利範圍第1至31項中任一項之抗體或雙特異性抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  33. 如申請專利範圍第32項之組合物，其中該醫藥學上可接受之載劑適用於注射或輸注。
  34. 一種核酸分子，其編碼如申請專利範圍第1至31項中任一項之抗體或雙特異性抗體。
  35. 一種載體，其包含如申請專利範圍第34項之核酸分子。
  36. 一種經分離之細胞，其包含如申請專利範圍第35項之載體。
  37. 一種套組，其包含如申請專利範圍第1至31項中任一項之抗體或雙特異性抗體。
  38. 一種如申請專利範圍第1至31項中任一項之抗體或雙特異性抗體的用途，其係用於製備治療癌症之醫藥品。
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