KR20140135251A - 항종양 활성이 있는 신규 결합 분자 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양 세포에서 발현되는 항원의 두 개의 다른 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 분자에 관한 것으로, 상기 결합 분자는 다음을 포함한다: (a) 상기 종양 세포에서 발현되는 항원의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 (폴리)펩타이드로서, 상기 제 1 결합 (폴리)펩타이드는 Fyn SH3-유래 폴리펩타이드인 제 1 결합 (폴리)펩타이드; 및 (b) 상기 종양 세포에서 발현되는 항원의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 (폴리)펩타이드. 본 발명은 또한 본 발명의 결합 분자를 인코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포 또는 비-인간 숙주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 결합 분자를 제조하는 방법 및 약학적 및 진단용 조성물에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 또한 본 발명의 결합 분자, 핵산 분자, 벡터 또는 숙주 세포의 종양치료에 있어서의 용도에 관한 것이다.

Description

항종양 활성이 있는 신규 결합 분자{NOVEL BINDING MOLECULES WITH ANTITUMORAL ACTIVITY}
본 발명은 종양 세포에서 발현되는 항원의 두 개의 다른 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 분자에 관한 것으로, 상기 결합 분자는 다음을 포함한다: (a) 상기 종양 세포에서 발현되는 항원의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 (폴리)펩타이드로서, 상기 제 1 결합 (폴리)펩타이드는 Fyn SH3-유래 폴리펩타이드인 제 1 결합 (폴리)펩타이드; 및 (b) 종양 세포에서 발현되는 항원의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 (폴리)펩타이드. 본 발명은 또한, 본 발명의 결합 분자를 인코딩하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 숙주 세포 또는 비-인간 숙주(non-human host)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 결합 분자의 생산방법, 약학적 및 진단용 조성물에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 또한, 본 발명의 결합 분자, 핵산 분자, 벡터 또는 숙주 세포의 종양 치료에 있어서의 용도에 관한 것이다.
본 명세서에서, 특허 출원 및 제조사의 매뉴얼을 포함하는 다수의 문헌이 인용된다. 이들 문헌에서 개시하고 있는 내용은, 본 발명의 특허성과 관련 있는 것으로 고려되지는 않지만, 참조로써 온전히 본 발명에 포함된다. 더욱 상세하게는, 모든 참조 문헌은 각 문헌이 구체적이고 개별적으로 참조로써 포함되는 것으로 나타내는 범위에서 동일하게 참조로써 포함된다.
비-면역글로불린-유래 결합제 (총괄하여 스캐폴드(scaffolds)라 지칭; 예를 들어, Skerra (2000) J. Mol. Recognit. 13, 167-187 참조)의 진단 및 치료제로서의 사용이 제시되어왔다. 지난 10 내지 15 년 동안, 50건이 넘는 다른 단백질 스캐폴드가 제안되었고, 이 분야에서 가장 진보한 것은 다음과 같다 (Gebauer 및 Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255에서 요약된 것으로서): 어피바디(affibodies) (포도상구균 단백질 A의 Z-도메인), 쿠니츠 타입 도메인(Kunitz type domain), 애드넥틴(adnectins; 인간 피브로넥틴의 10th 도메인), 안티칼린(anticlains; 리포칼린 유래), DARPins (안키린 반복 단백질 유래), 아비머(avimers; 멀티머화된(multimerized) LDLR-A), 및 인간 Fyn SH3 도메인으로부터 유래된 Fynomers.
일반적으로, SH3 도메인은 세포 신호 전달에 관여하는 다양한 단백질에 존재한다 (Musacchio et al. (1994) Prog . Biophys . Mol . Biol . 61; 283-297). 이 도메인들은 단백질 내에서 고정된 자리를 차지하지 않고 독립적으로 발현 및 정제될 수 있다. 약 300 개의 인간 SH3 도메인을 포함하여 현재 1000 개가 넘는 도메인의 존재가 알려져 있다 (Musacchio (2003) Advances in Protein Chemistry . 61; 211-268). SH3 도메인 사이에 많은 서열 다양성이 있지만, 그들은 모두 보존된 폴드(conserved fold)를 공유한다: 두 개의 역-평행(anti-parallel) 베타-시트에 의하여 형성된 컴팩트 베타 베럴(compact beta barrel; Musacchio (2003) Advances in Protein Chemistry . 61; 211-268). 통상적으로, SH3 도메인은 PXXP 코어-결합 모티프를 함유하는 프롤린-풍부 펩타이드(proline-rich peptide)에 결합하나(Ren et al. (1993) Science 259; 1157-1161), SH3 결합 부위의 비전형적인 예가 또한 기술되어 있다 (Karkkainen et al. (2006) EMBO Rep . 7;186-191). 지금까지 밝혀진 대부분의 SH3 도메인은 총 길이가 대략 60 내지 65 개의 아미노산을 갖는 것으로 시퀀싱되어있으나, 이들 중 몇몇은 2차 구조의 주요 보존 요손들을 연결하는 루프로의 삽입으로 인하여 85 개 정도의 아미노산을 특징으로 할 수도 있다 (Koyama et al. (1993) Cell 72(6); 945-952). 다른 SH3 도메인의 얼라인먼트로 바람직한 구조 형성 및 고전적인 프롤린-풍부 모티프 인지에 역할을 하는 보존된 아미노산 잔기가 밝혀졌다 (Larson et al. (2000) Protein Science 9; 2170-2180).
전통적인 화학요법제로의 종양의 치료는 약물이 정상 세포와 비교하여 빠르게 분열하는 종양 세포를 우선적으로 죽일 것이라는 기대에 의존한다. 그러나, 종양 세포에 대한 선택성의 결여는, 골수, 위장관 및 모공과 같이 높은 증식률을 갖는 정상 조직에서 독성을 유발한다. 종양 환경의 낮은 혈액 관류, 불규칙한 혈관 구조 및 높은 간질 압력(high interstitial pressure) 때문에 화학요법제는 종양 덩어리에서 낮은 축적률을 보인다 (Bosslet et al (1998) Cancer Res 58:1195-1201). 더욱이, 다중약제 내성 단백질은 약물 흡수를 감소시킬 수도 있다(Ramachandran et al (1999) Mol Diagn 4:81-94). 그 결과, 우선적으로 종양 세포를 타겟으로 하는 치료제의 개발이 현대의 항-암 연구의 주요 쟁점으로 떠올랐다. 이러한 맥락에서, 정상 조직은 피하면서 종양성 병변(neoplastic lesions)에 생리활성 분자를 집중시키는, 종양 연관 항원에의 결합에 의한, 치료제의 종양 부위로의 표적화 운반이 항-암 연구의 새로운 연구주제로 떠올랐다(Pfaffen et al (2010) Exp Cell Res 316(5) 836-847). 예를 들어, 유방암 및 난소암에서 HER2 단백질의 상향조절이 관찰되며 이는 좋지 않은 예후와 연관성이 있다 (Slamon et al. (1987) Science, 235:177-182; Slamon et al. (1989) Science 244:707-712). 방광, 침샘, 자궁내막, 췌장, 갑상선, 신장, 폐, 상부 위장관 및 결장의 암종을 포함하여 여러 다른 종류의 종양에서 HER2의 과발현 (유전자 증폭에 의하여 종종 그러나 일률적이지 않은)이 또한 관찰된다(Scholl et al. (2001) Ann Oncol, 12 Suppl 1:S81-87; Ross JS (2011) Biomark Med 3:307-318; Fukushige et al. (1986) Mol 세포 Biol 3:955-958; Cohen et al. (1989) Oncogene 1:81-88; Weiner et al (1990) Cancer Res 50:421-425; Park et al (1989) Cancer Res 23:6605-6609; Zhau et al (1990) Mol. Carcinog. 5:254-257; Aasland et al. (1988) Br J Cancer 4:358-363; Seliger et al (2000) Int J Cancer 87(3):349-359). 또한, HER2는 유방암 조직에서는 저발현되나, 전립선암에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다(Minner et al. (2010) Clin Cancer Res 16(5):1553-1560).
과거에, 어피바디(affibodies) 및 DARPins과 같은 몇몇의 HER2 결합 단백질이 기술되었다(Wikman et al (2004) Protein Eng Des Sel 17(5): 455-462; Zahnd et al (2007) 369(4):1015-1028). 또한, Hudziak et al. 는 인간 유방 종양 세포주를 이용하는 것을 특징으로 하는 뮤린 항-HER2 항체 집단 (항체 4D5 및 2C4를 포함하는)의 생성을 기술한다 (Hudziak et al. (1989) Mol Cell Biol 9(3):1165-1172; see also U.S. Patent No. 5,677,171). 항체 노출 후 세포의 상대적인 세포 증식이 확인되었다. 저자는 항체 4D5가 가장 효율적으로 세포 증식을 억제함을 기술하였다. 1998년, 화학요법과 병용한 HER2-양성 전이성 유방암 (MBC)의 관리에 대하여, 인간화된 버전의 재조합 뮤린 항-HER2 항체 4D5(huMAb4D5-8, 트라스투주맙, Herceptin, see also U.S. Patent No. 5,821,337) 가 US FDA(Food and Drug Administration)에 의하여 승인되었다. 현재, 보조 요법뿐 아니라 단독 (제한된 환자군) 또는 내분비 요법 또는 화학요법과 병용하여, 전이성 HER2-양성 종양 환자의 제 1의 치료제로 트라스투주맙이 추천된다 (Awada et al. (2012) Cancer Treat Rev, 106(1):6-13). 그러나, 트라스투주맙으로 치료하는 동안 1차 (내재성) 또는 2차 (치료 중에 획득된) 내성이 종종 나타난다 (Tsang et al. (2012) Br J Cancer 106:6-13). 예를 들어, HER2-과발현 전이성 유방암에서 트라스투주맙 단독 요법에 대한 1차 내성의 발생비율은 66 89%이다. 또한, 트라스투주맙에-기반한 요법에 처음 반응을 보이는 대다수의 환자들은 1년 이내에 내성이 생긴다 (Nahta et al (2006) Nat Clin Pract Oncol 3(5):269-280). 트라스투주맙 요법에 대한 내성을 극복하기 위한 몇몇 전략이 문헌에 기술되어있다 (review Tsang et al. (2012) Br J Cancer 106:6-13; Awada et al. (2012) Cancer Treat Rev 106(1):6-13 참조).
내성을 극복하는 하나의 매력적인 방안은 HER2 결합제와 조합하는 것으로 대표된다. 이러한 맥락에서, 몇몇 그룹은, 인 비트로(in vitro) 및/또는 인 비보(in vivo)에서, 인간 종양 세포주의 성장을 억제하는 두 개의 항-HER2 항체의 조합이 하나의 항체만을 처리한 경우보다 치료효과가 좋음을 보여주었다(Yamashita-Kashima et al (2011) Clin Cancer Res 17(15):5060-5070; Scheuer et al. (2009) Cancer Res 69(24):9330-9336; Lee-Hoeflich et al (2008) Cancer Res 68(14):5878-5887; Kasprzyk et al (1992) Cancer Res 52:2771-2776; Ben-Kasus et al. (2009) Proc Natl Acad Sci U S A 106(9):3294-3299). 특히, 트라스투주맙을 퍼투주맙 (퍼투주맙은 Hudziak et al. (Hudziak et al. (1989) Mol 세포 Biol 9(3):1165-1172; U.S. Patent No. 5,677,171)에 기술된 것으로 마우스 항체 2C4의 인간화된 형태이다; Adams C.W. et al. (2006) Cancer Immunol Immunother, 55:717-727; WO2001/00245))과 조합한 전임상 연구에서 증가된 효능이 관찰되었고, 임상 2상 시험은 트라스투주맙 및 퍼투주맙의 공동-투여(co-administration)가, 이전에 트라스투주맙-기반 요법을 받는 동안 질병의 진행을 경험한 환자에서 항-종양 반응을 생성함을 보여주었다 (Baselga et al. (2010) J Clin Oncol 28:1138-1144). 트라스투주맙은 HER2 도메인 IV에 결합하는 반면에, 퍼투주맙은 멤브레인 근위인 HER2의 세포외 부분의 도메인 II에 결합한다. 그 결합 특이성에 기인하여, 퍼투주맙은 HER2가 다른 HER 수용체 (HER1, HER3 및 HER4와 같은)와 활성형 헤테로다이머를 형성하는 것을 방지하였다 (Agus et al (2002) Cancer Cell 2:127-137; Fendly et al (1990) Cancer Res 50(5):1550-1558).
최근의 임상 III상 시험은, 플라시보 + 트라스투주맙 + 도세탁셀과 비교하여, 퍼투주맙 + 트라스투주맙 + 도세탁셀의 조합을 HER2-양성 전이성 유방암 환자에서 제 1의 치료제로 사용하였을 때, 무-진행 생존율이 상당히 연장됨을 보여주었다 (Baselga et al (2012) N Engl J Med 366(2):109-119). 그러나, 독립적으로 측정된 무-진행 생존율의 중앙값은 6.1 개월만이 증가되었다 (대조군에서의 12.4 개월부터 퍼투주맙군에서의 18.5 개월). 더욱이, 두 개 또는 그 이상의 생물학적 화합물의 조합은 일반적으로 조절하게 되는 두 물질의 용량 및 임상적 절차를 더욱 어렵게 만든다. 또한, 약동학적 차이 및 조직 농도에 따른 차이는 두 개의 항체의 효능을 감소시킬 수 있다.
HER2 또는 EGFR (HER1)의 다른 에피토프를 타겟으로 하는 항체 조합의 향상된 치료 효능에 기반하여 (Perera et al. (2005) Clin. Cancer Res. 11:6390-6399), EGFR (WO2011/020033) 또는 HER2(oral presentation of Woisetschlger M., bispecific antibody Summit 2011, September 27, 2011, Boston, USA; slides number 5 & 15)의 다른 에피토프에 결합하는, 다중특이적 EGFR 및 HER2 타겟 단백질을 구축하기 위한 노력이 수행되었다.
WO 2011/020033에서, 피브로넥틴 도메인-기반 EGFR 결합 단백질이 분리되어, 항-EGFR 단클론 항체 225 (세툭시맙(cetuximab; Erbitux)으로도 알려진)의 중쇄 및/또는 경쇄의 C- 또는 N-말단에 융합되었다. EGFR 결합 피브로넥틴 도메인은 항체 225 보다 다른 에피토프를 인지하는 것으로 나타났다. 피브로넥틴-항체 융합 단백질의 일부는 항체 225 자체에 비하여 EGFR 클러스터링 및 하향조절을 더욱 효과적으로 유도하는 것으로 밝혀졌다.
Woisetschlger M. (oral presentation of Woisetschlger M., bispecific antibody Summit 2011, September 27, 2011, Boston, USA; slides number 5 & 15)의 발표에서, HER2의 두 개의 다른 에피토프에 결합하는, 이중특이적 트라스투주맙-기반 HER2-타겟 항체, 트라스투주맙-Her2-1이 기술되었다. 그러나, 수식되지 않은(unmodified) 트라스투주맙과 비교하여, 이중특이적 트라스투주맙-기반 항체의 활성 증가는 관찰되지 않았다.
따라서, 항종양-요법을 개선하기 위한 수많은 노력을 쏟았음에도 불구하고, 위에서 기술한 단점들을 극복하여 암 치료를 향상시키기 위한 새로운 치료 화합물을 찾을 필요성이 여전히 존재한다.
이러한 필요성이 청구항에서 특징되는 구체예의 제공에 의하여 다루어진다.
따라서, 본 발명은 종양 세포에서 발현되는 항원의 두 개의 다른 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 분자에 관한 것으로, 상기 결합 분자는 다음을 포함한다: (a) 상기 종양 세포에서 발현되는 항원의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 (폴리)펩타이드로서, 상기 제 1 결합 (폴리)펩타이드는 Fyn SH3-유래 폴리펩타이드인 제 1 결합 (폴리)펩타이드; 및 (b) 상기 종양 세포에서 발현되는 항원의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 (폴리)펩타이드.
용어 "항원의 두 개의 다른 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 분자"는 종양 세포에서 발현되는 하나의 항원에 대하여 두 개의 다른 결합 특이성을 갖는 결합 분자이다. 다시 말해, 본 발명의 결합 분자는 상기 하나의 항원 내에 있는 두 개의 구별되는 결합 부위 (즉, 에피토프)에 특이적으로 결합할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 이중특이적 결합 분자는 상기 두 개의 다른 에피토프에 동시에 결합할 수 있다.
본 발명에 따르면, 각 분자가 유사한 구조의 에피토프와 교차-반응(cross-react)하지 않거나 또는 본질적으(essentially)로 교차-반응하지 않을 때, 분자는 특이적으로 결합하는 것(본 명세서에서 또한 특이적으로 상호작용하는 것으로도 언급된)으로 여겨진다. 예를 들어, 통상적인 조건 하에서 상기 분자 집단의 관심있는 에피토프 및 많은 수의 다소 (구조적으로 및/또는 기능적으로) 밀접하게 관련되는 에피토프에 대한 결합을 측정함에 의하여, 연구 중인 분자 집단의 교차-반응성(Cross-reactivity)이 시험될 수도 있다. 관련 맥락에서, 오로지 관심있는 에피토프(예를 들어, 단백질 구조에서의 특이적인 모티프)에만 결합하고, 다른 어떤 에피토프에는 결합하지 않거나 또는 본질적으로 결합하지 않는 분자들은 관심있는 에피토프에 특이적인 것으로 여겨진다. 예를 들어, Harlow 및 Lane, Antibodies에서, 이에 상응하는 방법이 기술된다: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 또는, Harlow 및 Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999). 여기에서 사용된 것으로, 용어 "유사한 구조의 에피토프와 본질적으로 교차-반응하지 않는 분자"는 유사한 구조의 에피토프와 비교하여 타겟 항원에 대하여 적어도 5-배 높은 친화성, 더욱 바람직하게는 예를 들어, 적어도 50-배 높은 친화성과 같은, 적어도 10-배 높은 친화성, 더욱 바람직하게는, 예를 들어, 적어도 500-배 높은 친화성과 같은, 적어도 100-배 높은 친화성을 갖고 결합하는 분자이다. 매우 바람직하게는, 분자는 유사한 구조의 에피토프와 비교하여, 타겟 항원에 대하여 예를 들어, 적어도 10.000-배 높은 친화성과 같은, 적어도 1.000-배 높은 친화성 및 가장 바람직하게는 적어도 100.000-배 높은 친화성을 갖고 결합한다.
용어 "종양 세포에서 발현되는 항원"은 비-종양 세포에서 발현되지 않거나 또는 비-종양 세포와 비교하여 종양 세포에서 더욱 많이 발현되는 항원이다. 바람직하게는, 항원은 비-종양 세포에서보다 종양 세포에서 적어도 두 배 많은 양, 예를 들어, 적어도 10-배 많은 양과 같은, 더욱 바람직하게는 적어도 다섯 배 많은 양, 예를 들어, 적어도 1000-배 많은 양과 같은, 더욱 바람직하게는 적어도 100-배 많은 양 및 가장 바람직하게는 적어도 10.000-배 많은 양이 발현된다. 적합한 타겟 항원은 종양 세포에서 더욱 강하게 발현되는 어떠한 항원도 포함하고, 바람직하게는 항원은 후술하는 항원 중 하나이다.
본 발명에 따라 사용되는 것으로, 용어 "(폴리)펩타이드"는 단일 사슬 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 아미노산의 선형 분자 사슬을 말한다. 상기 용어는 30개에 달하는 아미노산으로 이루어진 펩타이드들의 그룹 및 30개가 넘는 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드들의 그룹 (여기에서, 단백질이라고도 하는)을 포함하는 분자들의 그룹이다.
추가로, 아미노산(들) 및/또는 펩타이드 결합(들)은 기능적 유사체에 의하여 대체되어 있는, (폴리)펩타이드의 펩티도미메틱(peptidomimetics) 또한 본 발명에 포함된다. 이와 같은 기능적 유사체는, 셀레노시스테인과 같은, 20 종의 유전자로-인코딩되는 아미노산 외에 알려진 모든 아미노산을 포함한다. 용어 (폴리)펩타이드는 또한 자연적으로 수식된 (폴리)펩타이드를 포함하며, 상기 수식은, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 인산화 및 당업계에서 알려진 유사 수식에 의하여 영향을 받는다.
본 발명에 따르면, 결합 분자는 (a) 및 (b)에서 정의된 두 개의 결합 (폴리)펩타이드를 포함한다.
상기 종양 세포에서 발현되는 항원의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 (폴리)펩타이드는 Fyn SH3-유래 폴리펩타이드이다. 예를 들어, 두 개, 세 개 또는 네 개의 제 1 결합 (폴리)펩타이드의 카피(copies)와 같은, 상기 제 1 결합 (폴리)펩타이드의 하나 또는 그 이상의 카피가 본 발명의 결합 분자에 존재할 수도 있음이 인지될 것이다.
에피토프는 입체적(conformational) 또는 연속적(continuous) 에피토프일 수도 있다. 폴리펩타이드 항원에서, 입체적(또는 비연속적(discontinuous)) 에피토프는, 일차 서열에서는 분리되어 있으나, 폴리펩타이드가 천연의 3-차원적 구조로 접혀 에피토프를 구성하는 경우, 분자 표면상에서 서로 가까이 위치하는 두 개 또는 그 이상의 개별 아미노산 잔기의 존재에 의하여 특징된다 (Sela, (1969) Science 166, 1365 및 Laver, (1990) Cell 61, 553-6). 에피토프에 기여하는 두 개 또는 그 이상의 개별 아미노산 잔기는 항원의 분리된 섹션 또는 하나 또는 그 이상의 (폴리)펩타이드 사슬(들)에 존재한다. 대조적으로, 선형(linear) 또는 연속적 에피토프는 (폴리)펩타이드 사슬의 하나의 선형 부분에서 서로 인접하게 위치하는 두 개 또는 그 이상의 개별 아미노산 잔기로 이루어진다.
용어 "Fynomer"와 상호교환적으로 여기에서 사용되는 용어 "Fyn SH3-유래 폴리펩타이드"는, 인간 Fyn SH3 도메인으로부터 유래된, 비-면역글로불린-유래 결합 (폴리)펩타이드 (예를 들어, 위에서 기술된 소위 스캐폴드)를 말한다. Fyn SH3-유래 폴리펩타이드는 당업계에서 잘 알려져 있고, 예를 들어, Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204 또는 WO 2008/022759, Bertschinger et al (2007) Protein Eng Des Sel 20(2):57-68, Gebauer 및 Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255)에 기술되어 있다.
Fyn 키나아제 (Fyn SH3)의 SH3 도메인은 서열번호 164에 나타낸 바와 같이 서열 GVTLFVALYDYEARTEDDLSFHKGEKFQILNSSEGDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ의, 63개의 잔기, 즉, Semba et al. (1986) (Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 83(15): 5459-63) 및 Kawakami et al. (1986) (Mol Cell Biol. 6(12): 4195-201)에 의하여 보고된 서열의 83 내지 145번 아미노산을 포함한다. Fyn은 티로신 키나아제의 Src 패밀리의 59 kDa 구성원이다. 선택적 스플라이싱(alternative splicing) 결과, Fyn 단백질은 그들의 키나아제 도메인에 차이가 있는 두 개의 다른 이소폼(isoforms)으로 존재한다: 하나의 형태는 흉선세포, 비장세포(splenocytes) 및 몇몇 혈액림프 세포주(hematolymphoid cell lines)에서 발견되고, 두 번째 형태는 주로 뇌에 축적된다 (Cooke 및 Perlmutter (1989),New Biol. 1(1): 66-74). 세포내 단백질인 Fyn의 생물학적 기능은 다양하고 T 세포 수용체를 통한 신호전달, 뇌 기능 조절 및 부착에 의하여 매개된 신호전달을 포함한다 (Resh (1998) Int. J. Biochem. Cell Biol. 30(11): 1159-62). 다른 SH3 도메인과 같이, Fyn SH3은 두 개의 역평행 -시트로 구성되고, 다른 단백질과 상호작용하기 위한 두 개의 유연(flexible) 루프 (RT-Src 및 n-Src-루프)를 함유한다. 두 개의 유연 루프 (RT-Src 및 n-Src-루프라 칭하는)의 서열은, 각각, 밑줄 및 두 줄-밑줄로 표시하였다. Fyn SH3의 아미노산 서열은 인간, 마우스, 랫트 및 원숭이 (긴팔원숭이; gibbon) 사이에서 완전히 보존된다.
당업계에서 보여주는 바와 같이 (WO 2008/022759; Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204), Fyn SH3 도메인은 특히, 결합 단백질을 생산하기 위한 매력적인 스캐폴드, 즉, Fynomers이다. 그 이유는 Fynomers는 (i) 많은 양이, 용해 가능한 형태로, 박테리아에서, 발현될 수 있고, (ii) 용액에 보관 시 응집되지 않으며, (iii) 매우 안정하고 (Tm 70.5℃), (iv)시스테인 잔기가 결핍되어 있으며, (v) 마우스에서부터 인간에 이르기까지 온전히 보존되는 아미노산 서열을 특징으로 하는 인간으로부터 본래 유래됨으로써, 원치 않는 면역 반응을 감소시킬 수 있기 때문이다.
특정 타겟 항원에 대하여 특이적으로 결합하는 Fyn SH3-유래 폴리펩타이드의 유래는 당업계에 기술되어 있다. 예를 들어, 다른 Fyn SH3의 라이브러리는 상기 서열번호 164에 나타낸 서열을 변경하여 만들 수 있다. 바람직하게는, 변경은 (i) RT-루프를 나타내는 서열 또는 선택적으로 상기 서열에 인접한 두 개에 이르는 아미노산 위치에서 (즉, 위에서 나타낸 서열번호 164에서, 서열 DYEARTEDDL), 또는 (ii) Scr 루프 또는 선택적으로 상기 서열에 인접한 두 개에 이르는 임의의 아미노산 위치에서 (즉, 위에서 나타낸 서열번호 164에서 두 줄-밑줄로 표시한 서열 LNSSEG) 또는 (iii) 동시에 두 서열에서, 수행된다. 바람직하게는, 변경은 당업계에서 기술된 것으로 치환, 결실 또는 부가이다 (예를 들어, WO 2008/022759; Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204 참조). 아미노산 서열을 변경하는 수단 및 방법은 당업계에서 잘 알려져 있고, 예를 들어, Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204에서 기술된다.
그 후에, 이 Fyn SH3 라이브러리는 예를 들어, pHEN1와 같은, 파지미드(phagemid) 벡터로 클로닝될 수 있고 (Hoogenboom et al. Multi-subunit protein on surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains, Nucleic Acids Res, 19(15):4133-7, 1991), 상기 라이브러리는 그 후에 파지(phage) 상에 디스플레이되고 패닝(panning), 바람직하게는 예를 들어, 각 항원에 대하여 적어도 2회, 더욱 바람직하게는 적어도 3회의 패닝과 같은 반복된 횟수의 패닝을 거칠 수 있다. 그 뒤, 예를 들어, 단클론 파지-ELISA와 같은 확립된 기술에 의하여 결합 (폴리)펩타이드에 대한 스크리닝이 수행될 수 있다. 이와 같이 동정된(identified) 클론을 시퀀싱하여, 풍부한 서열(enriched sequence)을 밝힐 수도 있다. 이와 같이 확인된 결합 (폴리)펩타이드는 또한 예를 들어, 동정된 서열의 변경 및 반복된 파지 디스플레이 및 패닝 단계에 기반한 부가적인 라이브러리의 생성에 의한 것과 같은 추가의 성숙 단계를 거칠 수도 있다. 마지막으로, 결과물인 Fyn SH3-유래 폴리펩타이드의 교차-반응성 및 면역원성이 분석될 수도 있고, 타겟 항원에 특이적인 Fyn SH3-유래 폴리펩타이드가 선별될 수 있다.
이들 파지 디스플레이 스크리닝 및 결합 (폴리)펩타이드의 최적화 방법은 당업계에서 일반적으로 알려져 있다.
(b)에서 정의된 제 2 (폴리)펩타이드는 상기 종양 세포에서 발현되는 항원의 제 2 에피토프에 특이적으로 결합한다. 위에서 기술된 바와 같이, 이는 이 제 2 결합 (폴리)펩타이드에 의하여 동일한 항원이 결합되지만, 상기 항원 상의 다른 에피토프가 결합됨을 의미한다. 용어 "다른" 에피토프는 제 1 결합 (폴리)펩타이드에 특이적으로 결합하는 에피토프와 중첩되지 않는 에피토프를 말한다. 따라서, 본 발명에 따른 하나의 결합 (폴리)펩타이드의 결합은 제 2 (폴리)펩타이드의 결합을 차단하지 않고, 따라서 두 결합 (폴리)펩타이드들 모두 동시에 결합할 수 있다. 제 2 (폴리)펩타이드는, 예를 들어, 항체 또는 위에서 기술된 비-면역글로불린-유래 결합제 또는 스캐폴드, 바람직하게는 어피바디(affibodies) (포도상구균 단백질 A의 Z-도메인에 기반한), Kunitz 타입 도메인, 애드넥틴 (인간 피브로넥틴의 10th 도메인에 기반한), 안티칼린 (리포칼린 유래의), DARPins (안키린 반복 단백질 유래의), 아비머(avimers; 멀티머화된 LDLR-A 유래의)로 이루어진 군으로부터 선택되는 스캐폴드와 같은, 타겟 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 어떠한 (폴리)펩타이드일 수도 있다. 이 모든 스캐폴드는 당업계에 잘 알려져 있고 위에서 인용된 참고문헌에 기술되어 있다.
본 발명의 결합 분자에 포함되는 결합 (폴리)펩타이드는 단일 폴리펩타이드 사슬을 형성할 수도 있고 또는 본 발명의 결합 분자에서 서로 공유 결합 또는 비-공유 결합되어 있을 수도 있는 여러 개의 폴리펩타이드 사슬로 존재할 수도 있다. 결합 (폴리)펩타이드가 단일 폴리펩타이드 사슬을 형성하는 경우, 그들은 상기 분자 내에서, 예를 들어 (a)-(b) 또는 (b)-(a)와 같이, 어떠한 순서로도 정렬될 수 있다. 더욱 바람직하게는, (a) 및 (b)의 결합 (폴리)펩타이드는, 예를 들어, N-말단 에서 C-말단 방향으로 (a) 에서 (b) 순서로, 나열된 순서로 정렬된다. 결합 (폴리)펩타이드가 단일 폴리펩타이드 사슬을 형성하지 않는 경우, 그들은 여전히 서로 결합되어 선형 사슬을 형성할 수도 있다. 이러한 경우, 그들은 또한, 예를 들어 (a)-(b) 또는 (b)-(a) 와 같이, 선형 사슬 내에서 어떠한 순서로도 정렬될 수 있다. 더욱 바람직하게는, (a) 및 (b)의 결합 (폴리)펩타이드는 나열된 순서, 예를 들어, (a) 에서 (b) 순서로 정렬된다. 결합 (폴리)펩타이드는 머리-에서-꼬리 순서(head-to-tail order)로, 서로를 향하여 정렬될 수도 있다. 즉, 하나의 결합 (폴리)펩타이드는 그의 N-말단과 다른 결합 (폴리)펩타이드의 C-말단이 (공유적으로 또는 비-공유적으로) 결합될 수 있다. 그들은 또한 머리-에서-머리(head-to-head) 또는 꼬리-에서-꼬리(tail-to-tail) 순서로 정렬될 수도 있다. 즉, 하나의 결합 (폴리)펩타이드는 그의 N-말단과 다른 결합 (폴리)펩타이드의 N-말단이, 또는 그의 C-말단과 다른 결합 (폴리)펩타이드의 C-말단이 (공유적으로 또는 비-공유적으로) 커플링될 수 있다. 결합 (폴리)펩타이드는 또한 비-선형적으로 정렬될 수도 있음이 인지될 것이다. 또한 여기에서 기술된 모든 결합 분자는, 후술하는 바와 같이, 즉, 두 개의 결합 (폴리)펩타이드의 공유 또는 비-공유적 연계에 의한, 결합 분자의 형성 후에, 두 개의 결합 (폴리)펩타이드의 그들의 각 에피토프에 대한 결합 활성이 유지되거나 본질적으로 유지되어야 할 필요성이 있다는 것이 인지될 것이다. 결합 분자가 여러 가지 (폴리)펩타이드 사슬을 형성하는 경우 이들 사슬들은 서로 공유 결합됨이 바람직하다.
본 발명의 결합 분자는 업계에서 알려진 어떠한 (폴리)펩타이드 생산방법으로도 생산될 수 있다. 예를 들어, 아래에서 더욱 상세하게 기술되는 바와 같이, 본 발명의 결합 분자를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자는 적합한 숙주에서 발현될 수도 있고 이렇게 생성된 결합 분자는 그 후에 분리될 수 있다. 본 발명의 결합 분자를 생산하기 위한 대체적인 방법은 mRNA의 인 비트로 번역이다. 본 발명에 따라 사용하기에 적합한 무-세포 발현 시스템(cell-free expression systems) 은 래빗 망상적혈구 용해물, 밀 배아 추출물, 개 췌장 마이크로솜 멤브레인(canine pancreatic microsomal 멤브레인), E. coli S30 추출물, 및 TNT-시스템 (Promega)과 같은 커플링된 전사/번역 시스템(coupled transcription/translation system)을 포함한다. 이 시스템들은 코딩 영역(coding regions) 및 적절한 프로모터 성분을 함유하는 클로닝 벡터, DNA 단편, 또는 RNA 서열의 부가에 따라 재조합 (폴리)펩타이드를 발현한다.
재조합의 생성에 더하여, 본 발명의 결합 분자는 합성적으로, 예를 들어, 고체-상 기술을 이용한 직접 펩타이드 합성법에 의하여 생성될 수도 있다 (cf Stewart et al. (1969) Solid Phase Peptide Synthesis; Freeman Co, San Francisco; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154). 합성 단백질 합성은 매뉴얼적 방법 또는 자동화 방법을 이용하여 수행될 수도 있다. 자동화된 합성은 예를 들어, 제조자에 의하여 제공된 설명서에 따라 Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer, Foster City CA)를 이용하여 달성될 수도 있다. 다양한 단편들은 화학적으로 각각 합성될 수도 있고 화학적 방법을 이용하여 조합되어 전체 길이 분자를 생성할 수도 있다. 위에서 서술한 바와 같이, Houghton Proc. Natl. Acad. Sci. USA (82) (1985), 5131-5135에 의하여 기술된 고체상 절차와 같은 화학적 합성법이 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 결합 분자는, 예를 들어 재조합 및 합성적 생산을 조합하여, 반-합성적으로(semi-synthetically) 생성될 수도 있다.
본 발명에 따르면, 놀랍게도 Fyn SH3-유래 폴리펩타이드 및 동일한 항원이지만 상기 항원의 다른 에피토프에 대하여 결합 특이성을 갖는 제 2 결합 (폴리)펩타이드를 포함하는, 종양세포의 우수한 항증식 활성을 갖는 결합 분자가 확인되었다. 이 활성은 단일 특이적인 Fyn SH3-유래 폴리펩타이드 (Fc 융합 단백질로서 2가 포맷에서) 또는 제 2 (폴리)펩타이드 단독의 활성보다 높았고, 가장 놀라운 것은, 양 화합물을 조합한 경우보다도 높았다. 따라서, 본 발명의 결합 분자의 생성은 두 개의 각각의 결합 (폴리)펩타이드와 비교하여 개선된 효과를 이끌었다.
따라서, 본 발명은 결합 분자를 제공한다. 상기 결합 분자의, 표면에서 각 타겟 항원을 발현하는 종양 세포에의 결합은, 두 개의 단일-특이적 결합 단백질의 결합을 조합하여 얻어지는 종양 활성의 억제보다 더 높은 종양 활성의 향상된 억제를 이끌었고, 제 1 단일-특이적 결합 단백질은 (a) 의 Fyn SH3-유래 폴리펩타이드를 포함하거나 상기 폴리펩타이드로 이루어지고, 제 2 단일-특이적 결합 단백질은 (b)의 결합 (폴리)펩타이드를 포함하거나 상기 폴리펩타이드로 이루어진다. 바람직하게는, 종양 활성 억제의 향상은 시너지 효과, 즉, 두 개의 단일-특이적 결합 단백질을 조합하여 결합함에 의하여 얻어지는 종양 활성 억제의 상가 효과(additive effects)보다 높다.
본 발명의 결합 분자의 바람직한 구체예에서, 종양 세포에서 발현되는 항원은 HER2, HER1, HER3 및 HER4를 포함하는 다른 EGFR 패밀리 구성원, ALK, AXL, DDR, EPH, FGFR, EPH, FGFR, INSR, MET, MUSK, PDGFR, PTK7, RET, ROR, ROS, RYK, TIE, TRK, VEGFR, AATYK 패밀리, EpCAM, CD20, CD33, CD52 및 CD30을 포함하는 다른 수용체 티로신 키나아제 패밀리로 이루어진 군으로부터 선택된다.
HER2는 관련 기술에 따라 정의된 것으로, 1984년에 처음으로 기술된 인간 상피세포 성장 인자 수용체 타입 2 (HER2/neu 또는 ErbB-2라고도 함, 상기 참조), 185-kDa 수용체와 관련된다(Schlechter et al (1984) Nature 312:513-516). 인간 HER2 (서열번호 171)는 NCBI 레퍼런스: NP_004439 (2012년 2월 26일 공개) 에 의하여 표시되고, 당업계에, 예를 들어, Robinson et al. (2000) Oncogene 19:5548-5557 및 위에서 인용된 참조 문헌에 기술되어 있다. 수용체 티로신 키나아제 패밀리 (EGFR, ALK, AXL, DDR, EPH, FGFR, EPH, FGFR, INSR, MET, MUSK, PDGFR, PTK7, RET, ROR, ROS, RYK, TIE, TRK, VEGFR, AATYK)의 다른 타겟이 당업계에서 잘 알려져 있고, Robinson et al. (2000) Oncogene 19:5548-5557에서, NCBI 레퍼런스를 포함하여 기술되어 있다.
EpCAM은 관련 기술에 따라 정의된 것으로, 거의 모든 암종에서 발현되는 팬-상피성 분화 항원 (pan-epithelial differentiation antigen)인 상피 세포 부착 분자와 관련된다. 인간 EpCAM는 UniProtKB/Swiss-Prot 등록 번호: P16422.2 (2012년 2월 22일 공개)에 의하여 표시되고, 당업계에서, 예를 들어, Strnad et al. (1989) Cancer Res. 49(2):314-317에 기술되어 있다.
CD20은 관련 기술에 따라 정의된 것으로, B-림프구 항원 CD20과 관련된다. 인간 CD20은 NCBI 레퍼런스 서열: NP_690605.1 (2012년 1월 8일 공개)에 의하여 표시되고, 업계에, 예를 들어, Dawidowicz et al (2011) Clin Exp Rheumatol 29(5):839-842에 기술되어 있다.
CD33은 관련 기술에 따라 정의된 것으로, CD33 항원과 관련된다. 인간 CD33은 NCBI 참조 서열: NP_001763.3 (2011년 12월 18일 공개)에 의하여 표시되고, 당업계에, 예를 들어, Raponi et al. (2011) Leuk. Lymphoma 52(6):1098-1107에 기술되어 있다.
CD52는 관련 기술에 따라 정의된 것으로, CD52 항원 (CAMPATH-1 항원)과 관련된다. 인간 CD33은 GenBank 등록 번호: EAX07822.1 (2010년 2월 4일 공개)에 의하여 표시되고, 당업계에, 예를 들어, Venter et al (2001) Science 291(5507):1304-1351 에 기술되어 있다.
CD30은 관련 기술에 따라 정의된 것으로, CD30 항원과 관련된다. 인간 CD30은 GenBank 등록 번호: AAA51947.1 (1994년 11월 1일 공개) 에 의하여 표시되고, 당업계에, 예를 들어, Durkop, H et al. (1992) 세포 68(3):421-427 에 기술되어 있다.
본 발명의 이중-특이적 결합 분자의 바람직한 구체예에서, 항원은 HER2이다.
본 발명의 결합 분자의 다른 바람직한 구체예에서, 제 2 (폴리)펩타이드는 항체이다.
항체는 어떠한 종류의 항체, 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수도 있다. 용어 항체는 또한 전체 길이 또는 비-수식된 항체의 결합 특이성을 여전히 보유하는 항체 단편 또는 그들의 유도체를 포함한다. 본 발명의 항체는 또한 합성, 키메릭, 단일 사슬 및 인간화된 항체와 같은 예를 포함한다.
용어 항체 단편은 (i) Fab 단편, (ii) F(ab)2단편, (iii) Fd 단편 (VHC 및 CH1 도메인으로 이루어진), (iv) Fv 단편 및 (v) 특이적으로 결합하기에 충분한 프레임워크(framework)를 갖는 분리된 상보성 결정 영역(complementary determining region, CDR), 예를 들어, 가변 영역의 항원 결합 부분과 같은 단편과 관련된다.
본 발명의 맥락에서, 용어 항체 유도체는 화학적으로 수식된 항체 및 항체 단편으로 정의된다. 이는 scFv 단편, 단일 도메인 항체 등을 포함한다. 따라서, 항체 유도체는 때로 항체 분자 유래의 (폴리)펩타이드 및/또는 화학적/생화학적 또는 분자 생물학적 방법에 의하여 수식된 (폴리)펩타이드이다. 항체 단편 및 에피토프의 피팅(fitting)을 허용하는 맥락에서, 항체 단편의 그의 특이적 에피토프와의 특이적 상호작용을 위한 최소 요건은 부모 항체의 가변 중쇄 (VH)및/또는 가변 경쇄 (VL)의 하나 또는 그 이상의 CDRs의 존재이다. 이와 같은 맥락은 항체의 적합한 프레임워크의 사용에 의하여 제공될 수 있다. 당업계에서 알려진 것으로서, 항체 또는 항체 유도체의 맥락에서, 용어 프레임워크(framework)는 CDRs 사이에서 스페이서로 기능하고, 그들의 N-말단 및 C-말단을 연장하는 아미노산 서열로 정의되며, CDRs에 의한 항원 결합 부위의 형성을 허용하는 구조를 제공한다. 예를 들어, 분자 생물학적 방법에 의하여 결합 친화성을 향상시키기 위한 프레임워크 또는 CDR 서열의 수식은 예를 들어, 당업계에서 알려진 아미노산 결실(들), 삽입(들), 치환(들), 부가(들), 및/또는 재조합(들) 및/또는 어떠한 다른 수식(들) (예를 들어, 글리코실화 및 인산화와 같은, 번역후 및 화학적 수식)을 단독 또는 조합하여 이용함에 의하여, 당업계에서 알려진 전통적인 기술을 이용한 (폴리)펩타이드의 수식을 포함할 수도 있다. 면역글로불린 사슬의 아미노산 서열의 근간이 되는 DNA 서열에 이와 같은 수식을 도입하기 위한 방법은 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다; 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd edition 1989 및 3rd edition 2001; Gerhardt et al., Methods for General and Molecular Bacteriology, ASM Press, 1994; Lefkovits, Immunology Methods Manual: Comprehensive Sourcebook of Techniques, Academic Press, 1997; 또는 Golemis, Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002, 참조.
본 발명에 따른 항체는 에피토프와 특이적으로 결합/상호작용할 수 있다. 에피토프는 폴리펩타이드 구조 및 예를 들어, 폴리사카라이드와 같은 아미노산을 포함하지 않는 화합물일 수도 있다. 용어 "특이적으로 결합/상호작용하는"은 위에서 정의된 바와 같다.
바람직하게는, 항체는 단클론 항체이다. 더욱 바람직하게는, (단클론) 항체는 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM 클래스이다(또한 그의 서브타입 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4) 도 포함).
후술하는 바와 같이, 두 개의 결합 (폴리)펩타이드의 결합력이 유지되거나 또는 본질적으로 유지되는 한, 어느 가능한 위치에서, 제 1 결합 (폴리)펩타이드를 나타내는 Fyn SH3-유래 폴리펩타이드는 항체와 커플링될 수도 있음이 인지될 것이다. 예를 들어, 완전 항체가 쓰이는 경우, 제 1 결합 (폴리)펩타이드를 나타내는 Fyn SH3-유래 폴리펩타이드는 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N- 또는 C-말단에서 커플링될 수도 있다. 바람직하게는, Fyn SH3-유래 폴리펩타이드는 항체의 경쇄의 N-말단에 커플링된다.
본 발명의 결합 분자의 다른 바람직한 구체예에서, 제 1 및 제 2 결합 (폴리)펩타이드는 링커에 의하여 연결된다.
본 발명에 따라 사용되는 것으로서, 용어 링커는 일련의 아미노산 (즉, 펩타이드 링커) 및 본 발명의 결합 분자의 결합 (폴리)펩타이드와 분리되는 비-펩타이드 링커이다. 본 발명의 결합 분자가 단일 폴리펩타이드 사슬인 경우, 링커는 펩타이드 링커임이 인지될 것이다.
링커의 특성, 즉, 링커의 길이 및/또는 조성 (예를 들어, 아미노산 서열과 같은)이 개질되거나 또는 분자의 안정성 및/또는 용해성이 증강되어, 결합 분자 결과물의 유연성이 증강되고/거나 입체 장해의 감소에 의하여 타겟 항원에 대한 결합이 개선될 수도 있다. 링커의 길이 및 조성은 본 발명의 결합 분자의 각 결합 (폴리)펩타이드의 조성에 따라 달라진다. 통상의 기술자는 다른 링커들의 적합성을 시험하는 방법을 잘 알고 있다. 예를 들어, 결합 분자의 성질은 다른 타입의 링커를 사용할 때의 그의 결합 친화성을 분석함에 의하여 쉽게 시험될 수 있다. 게다가, 각 결합 (폴리)펩타이드 단독에 대한 각각의 측정이 수행되고, 결합 분자의 결합 친화성에 대하여 비교될 수도 있다. 결과 분자의 안정성은 당업계에서 알려진 방법에 의하여, 예를 들어, 여러 시간 동안, 37 ℃, 인간 혈청에서 인큐베이션한 후, 분자의 남아있는 결합력을 결정하는 ELISA법을 이용하여, 측정될 수 있다.
본 발명에 의하여 예상되는 펩타이드 링커는 아미노산으로 구성된 (폴리)펩타이드 링커이다. 바람직하게는, 링커는 1 내지 100 개의 아미노산 길이이다. 더욱 바람직하게는, 링커는 5 내지 50개의 아미노산 길이이고 매우 더욱 바람직하게는, 링커는 10 내지 20 개의 아미노산 길이이다. 가장 바람직하게는, 링커는 15개 아미노산 길이이다. 바람직한 구체예에서, 링커는, 예를 들어, 아미노산 알라닌 및 세린 또는 글리신 및 세린을 이용하는 유연한 링커이다. 바람직하게는, 링커 서열은 (Gly4Ser)1,(Gly4Ser)2,또는 (Gly4Ser)3이다. 가장 바람직하게는, 링커는 (Gly4Ser)3이다.
본 발명에 따라 사용되는 것으로서, 용어 "비-펩타이드 링커"는, 위에서 정의된 펩타이드 링커를 제외한, 두 개 또는 그 이상의 반응기를 갖는 연결기(linkage group) 이다. 예를 들어, 비-펩타이드 링커는, 본 발명의 분자의 결합 부분의 반응기, 예를 들어, 아미노 말단, 리신 잔기, 히스티딘 잔기 또는 시스테인 잔기에 각각 결합하는, 예를 들어, 양 말단에 반응기를 갖는, 폴리에틸렌 글리콜과 같은, 폴리머일 수도 있다. 폴리머의 반응기는 하이드록시기, 알데히드기, 프로피온 알데히드기, 부틸 알데히드기, 말레이미드기, 케톤기, 비닐 설폰기, 티올기, 히드라지드기, 카보닐디이미다졸(CDI)기, 니트로페닐 카보네이트(NPC)기, 트리실레이트기(trysylate group), 이소시아네이트기, 및 숙신이미드 유도체를 포함한다.
숙신이미드 유도체의 예는 숙신이미딜 프로피오네이트(SPA), 숙신이미딜 부탄산 (SBA), 숙신이미딜 카복시메틸레이트 (SCM), 숙신이미딜 숙신아미드 (SSA), 숙신이미딜 숙시네이트 (SS), 숙신이미딜 카보네이트, 및 N-하이드록시 숙신이미드 (NHS)를 포함한다. 비-펩타이드 폴리머 양 말단의 반응기는 동일할 수도 있고 다를 수도 있다. 예를 들어, 비-펩타이드 폴리머는 하나의 말단에 말레이미드기를, 다른 말단에 알데히드기를 가질 수도 있다. 바람직하게는, 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜이다.
가장 바람직하게는, 링커는 펩타이드 링커이다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 분자는 적어도 하나의 부가 (폴리)펩타이드를 추가로 포함한다.
이와 같은 부가 (폴리)펩타이드의 비-제한적인 예는, 본 발명의 결합 분자의 성능을 개선하기에 적합한 태그(tag) 또는 기능적 (폴리)펩타이드를 포함하는, 예를 들어, 약학적 및/또는 진단적 활성 성분이다.
약학적 및/또는 진단적 활성 성분은, 예를 들어, 사이토카인, 독성 화합물, 케모카인, 효소, 형광 염료 및 광감작제, 항-응고 인자(pro-coagulant factor), 바람직하게는 조직 인자, 방사성 핵종 또는 본 발명의 결합 분자의 혈청 반-감기를 조절하는 성분으로부터 선택될 수도 있다.
사이토카인의 비-제한적인 예는, 예를 들어, IL-2, IL-12, TNF-알파, IFN 알파, IFN 베타, IFN 감마, IL-10, IL-15, IL-24, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, LIF, CD80, B70, TNF 베타, LT-베타, CD-40 리간드, Fas-리간드, TGF-베타, IL-1알파 및 IL-1베타를 포함한다.
독성 화합물의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 칼리케아미신(calicheamicin), 메이탄시노이드(maytansinoid), 네오카지노스타틴(neocarzinostatin), 에스페라미신(esperamicin), 다이네미신(dynemicin), 케다시딘(kedarcidin), 마두로펩틴(maduropeptin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 아우리스타틴(auristatin), 리신-A-사슬(Ricin-A chain), 모데신(modeccin), 말단절단형 슈도모나스 엑소톡신 A(truncated Pseudomonas exotoxin A), 디프테리아 독소(diphtheria toxin) 및 재조합 겔로닌(gelonin)을 포함한다.
케모카인의 비-제한적인 예는, IL-8, GRO 알파, GRO 베타, GRO 감마, ENA-78, LDGF-PBP, GCP-2, PF4, Mig, IP-10, SDF-1알파/베타, BUNZO/STRC33, I-TAC, BLC/BCA-1, MIP-1알파, MIP-1 베타, MDC, TECK, TARC, RANTES, HCC-1, HCC-4, DC-CK1, MIP-3 알파, MIP-3 베타, MCP-1-5, 에오탁신(Eotaxin), 에오탁신-2, I-309, MPIF-1, 6Ckine, CTACK, MEC, 림포탁틴(Lymphotactin) 및 프랙탈킨(Fractalkine)을 포함한다.
형광 염료는 예를 들어, Alexa Fluor 또는 Cy 염료를 포함하고, 광감작제는 예를 들어 광독성 레드 형광 단백질 킬러레드(phototoxic red fluorescent protein KillerRed) 또는 헤마토포르피린(haematoporphyrin)을 포함한다.
효소의 비-제한적인 예는 전구-약물(pro-drug) 활성화를 위한 효소, 바람직하게는 카복시-펩티다제(carboxy-peptidases), 글루쿠로니다제(glucuronidases) 및 글루코시다제(glucosidases) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소를 포함한다.
방사성 핵종은, 예를 들어, 감마선-방출 동위원소군, 바람직하게는 99 mTc, 123I,111In; 바람직하게는 18F, 64Cu,68Ga,86Y,124I인 양전자 방사체군으로부터; 바람직하게는 131I, 90Y,177Lu,67Cu인 베타-방사체군으로부터; 또는, 바람직하게는 213Bi, 211At인 알파-방사체군으로부터 선택될 수도 있다.
혈청 반-감기를 조절하는 성분의 예는, 이에 제한되는 것은 아니나, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 항체의 Fc 도메인, 알부민-결합 단백질 및 구조적으로 무질서한 폴리펩타이드 서열(conformationally disordered polypeptide sequences)을 포함한다.
태그(tags)의 비-제한적인 예는 Strep-태그, His-태그, Myc-태그, TAP-태그 또는 Flag-태그를 포함한다. 기능적 부가 (폴리)펩타이드는, 예를 들어, 카파 분비 리더(kappa secretion leader)와 같은 분비 펩타이드 또는 N-글리코실화 자리 제공 펩타이드이다.
위에서 요약한 바와 같이, 몇몇의 부가 (폴리)펩타이드는 부가적인 약학적 또는 진단적 활성을 갖거나 또는 본 발명의 결합 분자의 안정성을 증강시킴에 따라, 그의 항종양 활성을 증강시킬 수도 있고, 다른 부가 (폴리)펩타이드는 이에 대신하여 결합 분자의 제조 및/또는 정제를 촉진시킬 수도 있다.
위에서 정의된 부가 (폴리)펩타이드를 본 발명의 결합 분자에 추가하는 방법은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 예를 들어, Sambrook, 2001, loc cit.에 기술되어 있다. 부가 (폴리)펩타이드는 본 발명의 결합 분자에 비-공유결합되거나 또는 공유 결합되어, 예를 들어, 그들은 결합 분자와 융합 단백질을 형성할 수도 있고, 예를 들어, 그들은 단일 폴리펩타이드 사슬을 형성할 수도 있음이 인지될 것이다. 이와 같은 융합 단백질은, 예를 들어 단일 핵산 분자에 의하여 인코딩될 수도 있다.
본 발명에는 또한, 임의적으로 위에서 정의된 부가 (폴리)펩타이드를 포함하여 본 발명의 결합 분자을 형성하는, 예를 들어, 다이머, 트리머, 테트라머 등과 같은, 멀티머(multimers)가 포함된다. 이와 같은 멀티머는 공유 또는 비-공유적 연계, 바람직하게는 공유 연계에 의하여 형성될 수도 있다. 바람직하게는, 멀티머는 위에서 정의된 링커, 바람직하게는 위에서 정의된 펩타이드 링커를 통하여 형성된다. 더욱 바람직하게는, 링커는 (Gly4Ser)1, (Gly4Ser)2 또는 (Gly4Ser)3이다. 가장 바람직하게는, 링커는 (Gly4Ser)3 이다.
본 발명의 결합 분자의 다른 바람직한 구체예에서, 제 1 결합 (폴리)펩타이드는 (i) 서열번호 1 내지 152의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 또는 (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열에 적어도 65%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진다.
이러한 구체예에서, 결합 (폴리)펩타이드가 나열된 아미노산 서열을 포함 (이루어지기 보다는)하는 경우, 부가 아미노산은 N-말단 또는 C-말단 또는 양자 모두에서 특이적인 서열을 연장한다. 바람직하게는, 50개 이하의 부가 아미노산이 N- 말단에 존재하고 50개 이하의 부가 아미노산이 C-말단에 존재한다. 더욱 바람직하게는, 30개 이하와 같은, 40개 이하, 더욱 바람직하게는, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하와 같은, 20개 이하 및 매우 바람직하게는 1개 이하의 부가 아미노산(들)이 독립적으로 N- 또는 C-말단의 한쪽 또는 양쪽에 존재한다. 부가 아미노산의 존재 하에서, 후술하는 바와 같이, 타겟 항원의 두 개의 다른 에피토프에 대한 결합 분자의 결합력이 유지되거나 또는 본질적으로 유지되는 것이 전제조건임이 인지될 것이다. 부가 서열은 예를 들어, 정제를 위하여 도입된 서열을 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 제 1 결합 (폴리)펩타이드는 (i) 또는 (ii)에서 나열된 아미노산 서열로 이루어진다. 더욱 바람직하게는, 제 1 결합 (폴리)펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진다.
본 발명에 따르면, 용어 % 서열 상동성은 전체 길이의 아미노산 서열 또는 핵산 (또는 그의 부분과 대비되는 전체)을 구성하는 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드와 비교한 것으로서, 두 개 또는 그 이상의 나란한 아미노산 또는 핵산 서열의 동일한 아미노산/뉴클레오티드의 수 (히트(hits))를 나타낸다. 다시 말해, 비교의 창에서, 또는 당업계에서 알려진 것으로 서열 비교 알고리즘을 이용하여 측정된 것으로서 지정된 영역에서, 최대 상응성을 위하여 (서브)서열을 비교 및 정렬하는 경우, 또는 매뉴얼적으로 정렬 및 육안으로 검사하는 경우, 얼라인먼트를 이용하여, 두 개 또는 그 이상의 서열 또는 서브-서열(sub-sequence)에 대하여, 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 동일한 퍼센트 (예를 들어, 65% 또는 80% 상동성)가 결정될 수도 있다. 본 발명에 따른 바람직한 (폴리)펩타이드는 적어도 약 15 내지 25개의 아미노산의 길이의 영역에서, 더욱 바람직하게는, 적어도 약 30 내지 50개의 아미노산의 길이의 영역에서, 상동성이 존재하는 것으로 나타나는 것이다. 본 발명에 따른 더욱 바람직한 (폴리)펩타이드는 구체적으로 여기에서 언급된 (폴리)펩타이드의 전체 길이에서 서열 상동성을 갖는 것이다. 당업계에서 통상의 기술자는, 예를 들어, NCBI BLAST 알고리즘(Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, 및 David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic acids Res. 25:3389-3402), CLUSTALW computer program (Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680) 또는 FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci., 1988, 85; 2444)에 기반한 것과 같은 알고리즘을 이용하여, 서열 사이에/중에서의 퍼센트 서열 상동성을 결정하는 방법을 알 것이다.
본 발명에 따르면, 바람직하게는 NCBI BLAST 알고리즘이 사용된다. 아미노산 서열에 대하여, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 W(word length), 및 10의 E(expectation)를 사용한다. 핵산 서열에 대한 BLASTN 프로그램은 디폴트로서 11의 W(word length), 10의 E(expectation), M=5, N=4, 및 양 스트랜드의 비교를 사용한다. BLOSUM62 스코어링 매트릭스(Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci., 1989, 89:10915) 는 50의 B(alignments), 10의 E(expectation), M=5, N=4, 및 양 스트랜드의 비교를 사용한다. 따라서, NCBI BLAST 프로그램으로 결정된 것으로, 적어도 80%의 서열 상동성을 갖는 모든 (폴리)펩타이드가 본 발명의 범주에 속한다.
본 발명의 구체예에 따르면, 적어도 65% 서열 상동성, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85% 및 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열 또한 포함된다. 매우 바람직하게는, 상동성은 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 및 가장 바람직하게는 적어도 99.5% 이다.
서열번호 1의 아미노산 서열에 적어도 65%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열은 바람직하게는 하기 식 1을 갖는다:
GVTLFVALYDYX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10LSFHKGEKFQILX11X12X13X14X15X16GX17WWX18ARSLTTGEX19GX20IPSX21YVAPVDSIQ (식 I)
상기에서 X1 내지 X7 및 X11 내지 X13 및 X17 내지 X21은 각각 G, V, T, L, F, A, Y, D, S, H, K, E, Q, I, W, R, M, P, N 및 C; 더욱 바람직하게는 G, V, T, L, F, A, Y, D, S, H, K, E, Q, I, W, R, M, P 및 N으로부터 독립적으로 선택되고;
상기에서 X8 내지 X10 및 X14 내지 X16은 각각 G, V, T, L, F, A, Y, D, S, H, K, E, Q, I, W, R, M, P, N 및 C; 더욱 바람직하게는 G, V, T, L, F, A, Y, D, S, H, K, E, Q, I, W, R, M, P 및 N으로부터 독립적으로 선택되거나;
또는 상기에서 하나 또는 그 이상의 X8 내지 X10 및 X14 내지 X16은 빈칸이다.
더욱 바람직하게는,
X1은 다음으로부터 선택된다: T, E, D, Q, Y, V, W, N, S, F 또는 K
X2는 다음으로부터 선택된다: S, A, R 또는 T
X3은 다음으로부터 선택된다: Y, R, H, T, N, V, W 또는 S
X4는 다음으로부터 선택된다: N, D, M, Y, R, P, E, L, H, T, G 또는 F
X5는 다음으로부터 선택된다: T, S, P, Q, R, K, G, Q, A, D, M, N, L, F, Y 또는 E
X6은 다음으로부터 선택된다: R, M, K, D, F, T, G, H, S, P, N, Q, Y, L, A 또는 P
X7은 다음으로부터 선택된다: D, G, V, L, H, N, R, F, S 또는 A
X8은 다음으로부터 선택된다: G, S, E, D, P, Y 또는 빈칸
X9는 다음으로부터 선택된다: Q, D, S, H 또는 빈칸
X10은 다음으로부터 선택된다: D, V 또는 빈칸
X11은 다음으로부터 선택된다: R, K, Q, N, S, G, W, M, H, L, F, E, T, P, A, D 또는 V
X12는 다음으로부터 선택된다: M, R, E, G, N, D, S, A, Q, F, P, K, Y, T, H, V, L 또는 W
X13은 다음으로부터 선택된다: E, W, P, R, K, S, V, N, D, H, G, T, Q, A, Y, L 또는 M
X14는 다음으로부터 선택된다: D, R, Q, S, A, N, P, I, H, T, Y, E, L, K, M, V, I, W 또는 빈칸
X15는 다음으로부터 선택된다: G, S, I, L, A, V, T, E, D, Q, R, P, K, M, H, Y 또는 빈칸
X16은 다음으로부터 선택된다: K, G, R, A, T, V, S, I, E, Q, P, D, N, H 또는 빈칸
X17은 다음으로부터 선택된다: V, D, T, I 또는 Y
X18은 다음으로부터 선택된다: E, A, R, T 또는 Q
X19는 다음으로부터 선택된다: T, I 또는 V
X20은 다음으로부터 선택된다: Y, L 또는 F
X21은 다음으로부터 선택된다: N 또는 S.
바람직한 구체예에서, 식 I에서 잔기 X는 다음으로부터 독립적으로 선택된다: X1 내지 X10은 TSYNTRD (즉, 상기에서 X8 내지 X10은 빈칸이다); X11 내지 X16은 RMED (즉, 상기에서 X14 내지 X16은 빈칸이다); X17은 V; X18은 E; X19는 T; X20은 Y 및/또는 X21은 N이다.
바람직하게는, 결합 (폴리)펩타이드는, 서열번호 1로 이루어진 결합 (폴리)펩타이드의 결합력을 유지하거나 또는 본질적으로 유지하는, 즉, 각 타겟 에피토프에 대한 결합의 세기가 유지되거나 또는 본질적으로 유지되는, 서열번호 1의 아미노산 서열에 적어도 65%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함거나 상기 서열로 이루어진다.
Fyn SH3-유래 폴리펩타이드 C12 (서열번호 1)는, 표면 플라즈몬 공명 (surface plasmon resonance; SPR)에 의하여 측정하는 경우, HER2상의 그의 특이적 에피토프에 대하여 7x 10-8M의 해리 상수를 갖는다. 이를 위하여, Fyn SH3-유래 폴리펩타이드는 예를 들어, BIAcore 센서 칩에 고정되어 있는 His-태그 특이적인 항체에 의하여 포획된다. 특이적인 에피토프를 함유하는 항원의 주입에 따라, 복합체의 형성이 모니터링되고 소프트웨어 BIAcore 평가 소프트웨어를 이용하여 피팅된 곡선에 의하여, 키네틱 결합 상수 (kon) 및 키네틱 해리 상수 (koff), 또는 해리 상수 (KD)가 얻어진다. 따라서, 서열번호 1의 아미노산 서열에 적어도 65%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진 결합 (폴리)펩타이드의 결합력은, 해리 상수가, 바람직하게는 동일한 조건 하에서, HER2-결합에 대하여 적어도 1x10-4M로 유지되는 경우, 예를 들어, 적어도 1x10-5M, 더욱 바람직하게는 적어도 적어도 1x10-6M 및 가장 바람직하게는 적어도 1x10-7M로 유지되는 경우 본질적으로 유지된다. 또한 본 발명에 따른 결합 (폴리)펩타이드는 서열번호 1로 이루어진 결합 (폴리)펩타이드와 비교하여, 증가된 결합력, 즉, 100% 활성을 초과하는 결합력을 갖는다. 예를 들어, 여기에서 예상되는 결합 (폴리)펩타이드는 적어도 1x10-8M,예를 들어, 적어도 1x10-9M, 더욱 바람직하게는 적어도 적어도 1x10-10M와 같은, 예를 들어, 적어도 1x10-11M과 같은, 매우 바람직하게는 적어도 적어도 1x10-12M 및 가장 바람직하게는 적어도 1x10-13M의 해리 상수를 갖는다. 결합력의 측정 방법은 당업계에서 잘 알려져 있고, 이에 제한되는 것은 아니나, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술 또는 ELISA를 포함한다.
덧붙이는 실시예에서 나타내는 바와 같이, Fyn SH3-유래 폴리펩타이드 C12 (서열번호 1) 및 제 2 결합 특이성을 포함하는 결합 분자는 종양 항원 HER2에 특이적으로 결합하고 제 2 (폴리)펩타이드로 개선된 억제 효과를 생성한다. 따라서, 본 발명의 결합 분자는 서열번호 1을 포함하거나 상기 서열로 이루어진 Fyn SH3-유래 폴리펩타이드를 포함하는 것이 바람직하다.
하기 실시예 14로부터 입증되는 것으로, Fyn SH3-유래 폴리펩타이드 C12 (서열번호 1)는 HER2의 도메인 I (서열번호 172) 내에 위치한 HER2의 에피토프에 결합한다. HER2 단백질의 관련 잔기는 알라닌 스캐닝 접근법을 이용하여 결정되었고, HER2의 도메인 I 의 아미노산 자리 T166, R188, P197, S202 및 R203이 Fyn SH3-유래 폴리펩타이드 C12 및 HER2 사이의 결합과 관련되어 있음이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 결합 분자의 다른 바람직한 구체예에서, 제 1 결합 (폴리)펩타이드는 HER2의 도메인 I (서열번호 172) 내의 에피토프, 및 바람직하게는 그의 아미노산 자리 T166, R188, P197, S202 및 R203을 포함하는 HER2의 도메인 I(서열번호 172) 내의 에피토프에 결합하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진다.
본 발명의 결합 분자의 다른 바람직한 구체예에서, 제 2 (폴리)펩타이드는 항체이며, 여기에서, (i) 상기 항체의 중쇄는 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어지고, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 155의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어지거나; (ii) 상기 항체의 중쇄는 서열번호 160을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어지고, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어지거나; (iii) 상기 항체의 중쇄는 서열번호 154의 아미노산 서열에 적어도 65%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어지고, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 155의 아미노산 서열에 적어도 65%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어지거나; 또는 (iv) 상기 항체의 중쇄는 서열번호 160의 아미노산 서열에 적어도 65%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어지고, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 163 아미노산 서열에 적어도 65%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 상기 서열로 이루어진다.
서열 번호 154, 155, 160 및 163의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 예시적인 핵산 분자는 각각, 서열 번호 165, 166, 168 및 169에 나타내었다.
본 발명의 구체예에 따르면, (iii) 및 (iv)에는, 또한 나열된 아미노산 서열에 적어도 65% 서열 상동성, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85% 및 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 서열이 포함된다. 매우 바람직하게는, 나열된 아미노산 서열에 대하여 상동성은 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99% 및 가장 바람직하게는 적어도 99.5%이다.
더욱 바람직하게는, (iii) 또는 (iv)에서 정의된 항체는, 오로지 항체의 가변 도메인에서만 서열 상동성의 변이가 나타나고, 변이 항체의 불변 영역은 (i) 및 (ii)에서 정의된 항체의 불변 영역과 각각 동일한, 항체이다. 여기에서 사용된 항-HER2 항체 1의 가변 도메인은 서열번호 154의 아미노산 1 내지 119 및 서열번호 155의 아미노산 1 내지 107에 위치하고, 여기에서 사용된 항-HER2 항체 2의 가변 도메인은 서열번호 160의 아미노산 1 내지 120 및 서열번호 163의 아미노산 1 내지 107에 위치한다. 매우 바람직하게는, 서열 상동성의 변이가 항체의 CDR 도메인에서만 단독적으로 일어나, 변이 항체의 남아있는 (비-CDR) 영역은 (i) 및 (ii)에서 정의된 항체의 남아있는 (비-CDR) 영역과, 각각, 일치한다. 여기에서 사용된 항-HER2 항체 1의 CDR 도메인은 서열번호 154의 31 내지 35 (CDR1), 50 내지 66 (CDR2) 및 99 내지 108 (CDR3) 아미노산 및 서열번호 155의 24 내지 34 (CDR1), 50 내지 56 (CDR2) 및 89 내지 97 (CDR3) 아미노산에 위치하고, 여기에서 사용된 항-HER2 항체 2의 CDR 도메인은 서열번호 160의 31 내지 35 (CDR1), 50 내지 66 (CDR2) 및 99 내지 109 (CDR3) 아미노산 및 서열번호 163의 24 내지 34 (CDR1), 50 내지 56 (CDR2) 및 89 내지 97 (CDR3) 아미노산에 위치한다.
예를 들어 용어 "포함하는" 및 서열 상동성의 바람직한 정도 및 이를 결정하는 방법과 관련된, 제 1 결합 (폴리)펩타이드에 대한 위에서 제공된 모든 정의는 또한 적절히 수정되어 본 발명의 결합 분자의 제 2 결합 (폴리)펩타이드에 준용된다.
더욱이, (iii)에서 정의된 제 2 (폴리)펩타이드는 바람직하게는 (i) 에서 정의된 결합 (폴리)펩타이드의 결합력을 유지하거나 또는 본질적으로 유지하고, (iv)에서 정의된 제 2 (폴리)펩타이드는 바람직하게는 (ii)에서 정의된 결합 (폴리)펩타이드의 결합력을 유지하거나 또는 본질적으로 유지한다. 위에서 정의된 바와 같이, (iii) 또는 (iv)의 결합 (폴리)펩타이드의 결합력은 적어도 그의 60%의 결합력이 유지되는 경우 본질적으로 유지된다. 바람직하게는, 적어도 그의 75% 또는 더욱 바람직하게는 적어도 80% 의 결합력이 유지된다. 더욱 바람직하게는 적어도 95%와 같은, 적어도 90%, 매우 바람직하게는, 적어도 99%와 같은, 적어도 98%, (i) 또는 (ii)에서 정의된 결합 (폴리)펩타이드의 결합력이 각각 유지된다. 가장 바람직하게는 결합력은 완전히, 즉, 100%까지, 유지된다. 본 발명에 따르면, 또한, (i) 또는 (ii)에서 정의된 결합 (폴리)펩타이드와 비교하여, 각각, 증가된 결합력을 갖는, 즉, 100% 초과의 활성을 갖는 결합 (폴리)펩타이드이다. 바람직하게는, 결합력은 결합 (폴리)펩타이드의 HER2에 대한 결합력이다. 결합력의 측정 방법은 위에서 기술하였다.
한 구체예에서, 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의하여 측정하는 경우, (i) 및 (ii)에서 정의된 항체는 HER2 상의 그의 특이적인 에피토프에 대하여 2x10-9M내지 2x10-10M사이의 해리 상수를 갖는다. 이 경우, 항체는 BIAcore 센서 칩에 고정된 인간 IgG-특이적 항체에 의하여 포획된다. 특이적인 에피토프를 함유하는 항원의 주입에 따라, 복합체의 형성은 모니터링되고 소프트웨어 BIAcore 평가 소프트웨어를 이용하여 피팅된 곡선에 의하여, 키네틱 결합 (kon)및 키네틱 해리 상수 (koff),또는 해리 상수 (KD)가 얻어진다. 따라서, (i) 또는 (ii)의 항체와 적어도 65% 서열 상동성을 갖는 항체의 결합력은, 해리 상수, 바람직하게는 동일한 조건 하에서 측정된 해리 상수가, HER2-결합에 대하여, 예를 들어, 적어도 1x10-6M, 더욱 바람직하게는 적어도 적어도 1x10-7M, 매우 바람직하게는 적어도 1x10-8M 및 가장 바람직하게는 적어도 1x10-9M과 같이, 적어도 1x10-5M로 유지되는 경우, 본질적으로 유지된다. 본 발명에 따른 항체는, 또한, (i) 또는 (ii)의 항체와 비교하여 증가된 결합력, 즉, 100% 초과의 활성을 갖는다. 예를 들어, 여기에서 예상되는 항체는, 예를 들어, 적어도 1x10-11M, 더욱 바람직하게는 적어도 적어도 1x10-12M 및 가장 바람직하게는 적어도 1x10-13M과 같은, 적어도 1x10-10M의 해리 상수를 갖는다.
바람직하게는, 제 2 (폴리)펩타이드는 중쇄가 서열번호 154의 아미노산 서열로 이루어지고, 항체의 경쇄가 서열번호 155의 아미노산 서열로 이루어지는 항체이다.
바람직하게는, 제 1 결합 (폴리)펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지고, 제 2 (폴리)펩타이드는 항체의 중쇄가 서열번호 154의 아미노산 서열로 이루어지고, 항체의 경쇄가 서열번호 155의 아미노산 서열로 이루어지는 항체이다. 더욱 바람직하게는, 서열번호 1의 C-말단은 상기 항체의 경쇄의 N-말단, 즉, 서열번호 155에 연결된다. 본 발명의 결합 분자의 매우 바람직한 구체예에서, 제 1 결합 (폴리)펩타이드는 (Gly4Ser)3링커를 통하여 제 2 (폴리)펩타이드에 연결된, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진다. 상기 제 2 (폴리)펩타이드는 항체이고, 상기 항체의 중쇄는 서열번호 154의 아미노산 서열 이루어지며, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 155의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 링커는 서열번호 1의 C-말단을 상기 항체의 경쇄의 N-말단, 즉, 서열번호 155와 연결된다. 서열번호 1의 융합 단백질, 링커 (Gly4Ser)3및 서열번호 155로 표시되는 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 159로 표시된다 (이 아미노산 서열을 인코딩하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 167로 표시된다). 제 2 (폴리)펩타이드로서, 예를 들어, 두 개의 경쇄 및 두 개의 중쇄를 포함하는 항체가 사용되고, 제 1 결합 (폴리)펩타이드는 상기 항체의 경쇄 또는 중쇄에 융합되어, 본 발명에 따르면 결과물인 결합 분자는, 상기 하나의 항체 및 상기 항체의 두 개의 (경 또는 중)쇄에 융합된, 두 개의 제 1 결합 (폴리)펩타이드 포함할 수도 있음이 인지될 것이다. 본 발명의 이와 같은 결합 분자의 예는 덧붙이는 실시예에 기술되고, 예를 들어, 하기 도 8에서 보여준다.
덧붙이는 실시예에서 보여주는 바와 같이, 위에서 정의된 결합 분자 (여기에서 또한 COVA208라고도 함)는 HER2-발현 종양에 대하여 우수한 항종양 활성을 제공한다. 제 1 단일-특이적 결합 단백질은 서열번호 153을 갖는 2가의 Fyn SH3-유래 폴리펩타이드이고 (즉, C12의 Fc-융합 (서열번호 1)), 제 2 단일-특이적 결합 단백질은 항-HER2 항체 1이며, 상기 항체의 중쇄는 서열번호 154의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 155의 아미노산 서열로 이루어지는, 두 개의 단일-특이적 결합 단백질의 결합을 조합하에 의하여 얻어지는 종양 활성의 억제보다, 본 발명의 결합 분자를 이용하여 관찰된 항종양 활성이 상당히 높았다.
본 발명은 또한 본 발명의 결합 분자를 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 여기에서 또한 "폴리뉴클레오티드 또는 "핵산 서열"로도 칭하는, 용어 핵산 분자는 30 개가 넘는 뉴클레오티드로 이루어진 선형 분자 사슬이다. 핵산 분자들은, 본 발명에 따르면, 예를 들어 cDNA와 같은 DNA 또는 게놈 DNA, 및 RNA, 예를 들어 mRNA를 포함한다. 예를 들어, DNA 또는 RNA의 합성 또는 반-합성 유도체 및 혼합된 폴리머와 같은, 당업계에 알려진 핵산 모방 분자(nucleic acid mimicking molecules)가 추가로 포함된다. 본 발명에 따른 이와 같은 핵산 모방 분자 또는 핵산 유도체는 포스포로티오에이트 핵산, 포스포라미데이트 핵산(phosphoramidate nucleic acid), 2-O-메톡시에틸 리보 핵산, 모폴리노 핵산(morpholino nucleic acid), 헥시톨 핵산 (HNA) 및 LNA (locked nucleic acid) (Braasch 및 Corey, Chem Biol 2001, 8: 1, 참조)를 포함한다. LNA는 2-산소 및 4-탄소 사이의 메틸렌 다리에 의하여 리보스 고리가 제약을 받는 RNA 유도체이다. 당업계에서 통상의 기술자에게 쉽게 인지되는 것으로서, 그들은 부가적인 비-자연적 또는 변이 뉴클레오티드 염기를 함유할 수도 있다.
본 발명의 결합 분자는 단일 핵산 분자 또는 예를 들어, 개별적인 결합 (폴리)펩타이드 또는 항체의 다른 사슬과 같은, 결합 분자의 부분을 인코딩하는 복수의 핵산 분자에 의하여 인코딩될 수도 있음이 인지될 것이다. 이 핵산 분자들의 발현에 따라, 그들은 예를 들어 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘 또는 소수성 상호작용과 같은 비-공유 결합을 통하여 또는 예를 들어 이황화 결합과 같은 공유 결합을 통하여, 본 발명의 결합 분자를 형성한다.
예를 들어, 결합 분자가, 예를 들어, 오로지 scFv 단편 또는 dAb을 포함하는 항체-단편에 결합된 Fyn SH3-유래 폴리펩타이드인 경우, 결합 분자는 단일 핵산 분자에 의하여 인코딩될 수도 있다. 덧붙이는 실시예에서 보여주는 바와 같이, 결합 분자가 전체-길이의 항체에 결합된 Fyn SH3-유래 폴리펩타이드를 포함하는 경우, 제 1 핵산 분자는 Fyn SH3-유래 폴리펩타이드 및 Fyn SH3-유래 폴리펩타이드에 결합된 항체의 사슬을 인코딩하고, 제 2 핵산 분자는 남아있는 항체의 사슬을 인코딩할 수도 있다. 이에 대신하여, 예를 들어, 인코딩 핵산 서열이 각 인코딩 서열에 대한 각각의 조절 요소들을 포함하는 벡터에 포함되는 경우, 단일 핵산 분자는 또한 이 분리된 폴리펩타이드 사슬들을 인코딩할 수도 있다. 몇몇 핵산 서열 (또는 후술하는 벡터)이 사용되어 본 발명의 결합 분자를 인코딩하는 경우, 그 결과 발현되는 폴리펩타이드는 본 발명의 결합 분자를 형성하기 위하여 접촉시킬 필요가 있을 수도 있음이 인지될 것이다.
본 발명에 따르면, 용어 "본 발명의 핵산 분자 "는, 그에 의하여 본 발명의 결합 분자의 모든 성분이 인코딩되는, 단일 핵산 분자 및 복수의 핵산 분자들을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
바람직하게는, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오 파지 또는 예를 들어, 유전 공학에서, 전통적으로 사용되는 다른 벡터이다.
본 발명의 핵산 분자는 몇몇 상업적으로 이용 가능한 벡터들에 삽입될 수도 있다. 비-제한적인 예는 pQE-12, pUC-시리즈, pBluescript (Stratagene), 발현 벡터의 pET-시리즈 (Novagen) 또는 pCRTOPO (Invitrogen), 람다 gt11, pJOE, pBBR1-MCS 시리즈, pJB861, pBSMuL, pBC2, pUCPKS, pTACT1 및 E-027 pCAG Kosak-Cherry (L45a) 벡터 시스템, pREP (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2neo, pBPV-1, pdBPVMMTneo, pRSVgpt, pRSVneo, pSV2-dhfr, pIZD35, Okayama-Berg cDNA 발현 벡터 pcDV1 (Pharmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen), pcDNA3.1, pSPORT1 (GIBCO BRL), pGEMHE (Promega), pLXIN, pSIR (Clontech), pIRES-EGFP (Clontech), 피크-10 (Edge Biosystems) pTriEx-Hygro (Novagen) 및 pCINeo (Promega)와 같은 포유류 세포에서 호환 발현 가능한 벡터와 같은, 원핵 플라스미드 벡터를 포함한다. 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에 적합한 플라스미드 벡터의 예는, 예를 들어, 플라스미드 pAO815, pPIC9K 및 pPIC3.5K (모두 Invitrogen)를 포함한다. 제노푸스 배아(Xenopus embryos), 제브라피시 베아(zebrafish embryos) 및 다양한 종류의 포유류 및 조류 세포에서 단백질 발현에 적합한 다른 벡터는 다목적 발현 벡터 pCS2+이다.
위에서 언급한 본 발명의 핵산 분자는 또한 벡터에 삽입되어, 다른 핵산 분자와 번역 융합(translational fusion)이 일어날 수도 있다. 다른 핵산 분자는, 예를 들어, 본 발명의 핵산 분자에 의하여 인코딩되는 결합 분자의 용해성을 증가시키고/시키거나 정제를 촉진시키는 단백질 또는 형광 이미지에 의하여 관찰하기 좋은 단백질을 인코딩한다. 이와 같은 벡터의 비-제한적인 예는 pET32, pET41, pET43을 포함한다. 벡터는 또한, 올바른 단백질 접힘을 촉진시킬 수 있는 하나 또는 그 이상의 샤페론을 인코딩하는, 부가적으로 발현가능한 폴리뉴클레오티드를 함유할 수도 있다. 적합한 박테리아 발현 숙주는, 예를 들어, TG1, BL21 (BL21(DE3와 같은), BL21(DE3)PlysS, BL21(DE3)RIL, BL21(DE3)PRARE) 또는 로제타(Rosetta) 유래 스트레인을 포함한다.
벡터 개조 기술에 대해서는, Sambrook 및 Russel, 2001을 참조한다. 일반적으로, 벡터는 하나 또는 그 이상의 복제 원점 (ori) 및 클로닝 또는 발현을 위한 내재 시스템, 예를 들어, 항생제 내성과 같은, 숙주 선별을 위한 하나 또는 그 이상의 마커, 및 하나 또는 그 이상의 발현 카세트를 함유할 수 있다. 적합한 복제 원점은, 예를 들어, Col E1, 바이러스 SV40 및 M 13 복제 원점을 포함한다.
벡터에 삽입되는 코딩 서열은, 예를 들어, 표준 방법에 의하여 합성되거나, 또는 천연 소스로부터 분리될 수 있다. 코딩 서열의 전사 조절 성분 및/또는 다른 아미노산 인코딩 서열에 대한 라이게이션은 확립된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 이와 같은 조절 서열 은 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 이에 제한되는 것은 아니나, 전사를 개시하게 하는 조절 서열, IRES(internal ribosomal entry sites) (Owens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001), 1471-1476) 및 임의 선택적으로 전사를 종결 및 전사체를 안정화시키는 조절 성분을 포함한다. 전사를 개시하는 조절 성분의 비-제한적인 예는, 번역 개시 코돈, 예를 들어, SV40-인핸서와 같은 인핸서, 인슐레이터 및/또는 예를 들어 사이토메갈로 바이러스 (CMV) 프로모터, SV40-프로모터, RSV-프로모터 (라우스 사코마 바이러스(Rous sarcome virus), lacZ 프로모터, 닭 베타-액틴 프로모터, CAG-프로모터 (닭 베타-액틴 프로모터 및 사이토메갈로바이러스 즉시형(immediate-early) 인핸서의 조합), gai10 프로모터, 인간 신장 인자 1a-프로모터, AOX1 프로모터, GAL1 프로모터 CaM-키나아제 프로모터, lac, trp 또는 tac 프로모터, lacUV5 프로모터, AcMNPV(autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus) 폴리헤드럴 프로모터와 같은 프로모터, 또는 포유류 및 다른 동물 세포의 글로빈 인트론을 포함한다. lac 프로모터는, 락토오스 유사체 이소프로필티올 -b-D-갈락토시드("IPTG")를 이용하여 유도될 수 있는, 원핵 세포에서 유용한, 전형적인 유도성 프로모터이다. 전사를 종결시키는 조절 성분의 비-제한적인 예는 V40-poly-A 부위, tk-poly-A 부위 또는 SV40, lacZ 또는 본 발명의 핵산 서열의 다운스트림에 포함되는 AcMNPV 폴리헤드럴 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 부가 조절 성분은 번역 인핸서, Kozak 서열 및 공여자 측면에 있는 개재 서열(intervening sequence) 및 RNA 스플라이싱을 위한 수용자 자리, 분비 신호를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 또는, 사용되는 발현 시스템에 따라, 발현되는 폴리펩타이드를 세포 컴파트먼트에 전할 수 있는 신호 서열을 포함할 수도 있다. 당업계에서 신호 펩타이드로도 불리는, 예를 들어, N-말단 측면 서열 또는 리더 서열이 포함될 수도 있다. 통상의 기술자는 적합한 리더 서열을 지체 없이 선택할 수 있다. 리더 서열은, 발현된, 성숙한 구축물에서는 더 이상 필요하지않는, 바람직하게는 (경쇄, 중쇄를 포함하는) 어떠한 항체 사슬 또는 도메인의 발현을 위하여 쓰인다. 더욱이, 복제 원점과 같은 성분, 약물 내성 유전자, 조절자 (유도성 프로모터의 부분으로서)가 포함될 수도 있다.
본 발명에 따른 발현 벡터는 복제, 및 본 발명의 핵산 분자 및 그에 의하여 인코딩되는 결합 분자의 발현을 지시할 수 있다.
dhfr, gpt, 네오마이신, 히그로마이신과 같은 선택된 마커와의 공동-형질감염(co-transfection) 은 형질감염된 세포의 동정 및 분리를 가능하게 한다. 형질감염된 핵산은 또한 증폭되어, 많은 양의 인코딩된 결합분자를 발현할 수 있다. DHFR (디히드로엽산 환원효소) 마커는 관심있는 유전자의 수백 또는 심지어 수천의 카피를 수행하는 세포주를 개발하는 데 유용하다. 다른 유용한 선택 마커는 글루타민 합성효소(glutamine synthase; GS)이다 (Murphy et al. 1991; Bebbington et al. 1992). 이 마커들을 이용하여, 선택된 배지에서 세포가 증식되고 가장 높은 내성이 있는 세포가 선택된다. 발현 벡터는 바람직하게는 적어도 하나의 선택 가능한 마커를 포함할 것이다. 이와 같은 마커는, 진핵 세포 배양을 위하여, 디히드로엽산 환원효소, G418 또는 네오마이신 내성, 및 E. coli 및 다른 박테리아에서의 배양을 위하여 테트라사이클린, 카나마이신 또는 암피실린 내성 유전자를 포함한다.
위에서 기술된 것으로, 본 발명의 핵산 분자는 직접 도입 또는 전기천공법 (예를 들어 Multiporator (Eppendorf) 또는 Genepulser (BioRad)을 이용하여), PEI (Polysciences Inc. Warrington, Eppelheim), Ca2 +-매개 형질감염을 통하여, 또는 리포좀 (예를 들어: "리포펙타민 " (Invitrogen)), 비-리포좀성 화합물 (예를 들어: "Fugene" (Roche)), 리포좀, 파지 벡터 또는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스)를 통하여, 세포 내로 도입하기 위하여 디자인될 수도 있다. 부가적으로, 본 발명의 핵산 분자를 위한 진핵 세포 발현 시스템에서의 벡터로서, 바큘로바이러스 시스템 또는 백시니아 바이러스 또는 셈리키 포레스트바이러스에 기반한 시스템 또한 사용될 수 있다. 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노-수반 바이러스, 헤르페스 바이러스, 또는 소 파필로마 바이러스와 같은, 바이러스 유래 발현 벡터는, 핵산 분자 또는 벡터를 타겟 세포 집단으로 운반하는 데 사용될 수도 있다. 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 재조합 바이러스 벡터를 구축할 수도 있다; 예를 들어, Sambrook, 2001 및 Ausubel, 2001에 기술된 기술 참조.
본 발명의 결합 분자가 하나 초과의 핵산 분자에 의하여 인코딩되는 경우, 상기 복수의 핵산 분자는 하나 또는 복수의 벡터에 포함될 수도 있음이 인지될 것이다. 용어 "본 발명의 벡터"는, 본 발명의 결합 분자의 모든 성분을 코딩할 수 있는, 단일 벡터 및 복수의 벡터를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 벡터로 형질전환된 숙주 세포 또는 비-인간 숙주에 관한 것이다.
존재에 따라 상기 벡터에 의하여 인코딩되는 결합 분자의 발현을 매개하는, 상기 숙주 또는 숙주 세포는, 본 발명의 벡터를 숙주 또는 숙주 세포로 도입함에 의하여 생성될 수도 있다.
본 발명에 따르면, 숙주는 본 발명의 발현 벡터로 및/또는 형질감염된 트랜스제닉 비-인간 동물일 수도 있다. 바람직한 구체예에서, 트랜스제닉 동물은 포유류, 예를 들어, 햄스터, 암소(cow), 고양이, 돼지, 개 또는 말이다.
바람직한 구체예에서, 숙주는 세포 배양의 부분이 될 수도 있는 분리된 세포와 같은, 세포이다.
적합한 원핵 숙주 세포는 예를 들어, 대장균, 바실러스균, 스트렙토마이세스 및 살모넬라 티피뮤리움 속의 박테리아를 포함한다. 적합한 진핵 세포 숙주 세포는, 예를 들어, 진균 세포, 그 중에서도, 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 와 같은 효모 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 또는 초파리(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) Sf9 세포와 같은 곤충 세포 및 식물 세포 및 포유류 세포이다. 위에서-기술한 숙주 세포를 위한 적절한 배양 배지 및 조건은 당업계에 알려져 있다.
포유류 숙주 세포는, 이에 제한되는 것은 아니나, 인간 Hela, HEK293, H9 및 Jurkat 세포, 마우스 NIH3T3 및 C127 세포, COS 1, COS 7 및 CV1, quail QC1-3 세포, 마우스 L 세포, CHO 세포 (Chinese hamster ovary cell) 및 흑색세포종 세포 (Bowes melanoma cell) 를 포함한다. 이에 대신하여, 본 발명의 결합 분자는, 크로모좀으로 통합되는, 본 발명의 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 유전자 구축물을 함유하는 안정한 세포주에서, 발현될 수 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 상기 세포는 초대 세포(primary cell) 또는 초대 세포주(primary cell line)이다. 초대 세포는 유기체로부터 직접적으로 얻어지는 세포이다. 적합한 초대 세포는, 예를 들어, 마우스 배아 섬유아세포, 마우스 초대 간세포, 심근세포(cardiomyocytes) 및 신경 세포 및 마우스 근육 줄기 세포 (위성 세포; satellite cell) 및 그들 유래의 안정한, 불멸화된 세포주이다.

본 발명은 또한, 적합한 조건 하에서, 본 발명의 숙주 세포를 배양하고 상기 숙주 세포에 의하여 생성된 결합 분자를 분리하는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 결합 분자를 생산하는 방법에 관한 것이다.
원핵 또는 진핵 숙주를 배양하기에 적합한 조건은 당업계에서 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 박테리아 배양에 적합한 조건은, LB(Luria Bertani) 배지에서, 통기성 조건 하에서, 배양하는 것이다. 발현 산물의 수율 및 용해성을 증가시키기 위하여, 배지는 완충되거나 또는 양자를 증강시키거나 촉진하는 것으로 알려진 적합한 첨가제로 보충될 수 있다. E. coli 는 4 내지 약 37 ℃에서 배양될 수 있고, 정확한 온도 또는 일련의 온도는 과-발현되는 분자에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 통상의 기술자는 또한 이러한 조건들은 숙주의 니즈 및 발현되는 결합 분자의 요건에 따라 수정될 수도 있음을 알고 있다. 숙주 세포에 존재하는 벡터에서, 유도성 프로모터가 본 발명의 핵산 분자를 제어하는 경우, 적절한 유도제의 부가에 의하여 결합 분자의 발현이 유도될 수 있다. 적합한 발현 프로토콜 및 전략은 통상의 기술자에게 알려져 있다.
세포 타입 및 그의 특이적인 요건에 따라, 포유류 세포 배양은 예를 들어, 10% (v/v) FCS, 2mM L-글루타민 및 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 또는 DMEM 배지에서 수행될 수 있다. 세포는 물 포화 분위기에서(water saturated atmosphere), 5% CO2 , 37 ℃에서 유지될 수 있다.
곤충 세포 배양을 위한 적합한 배지는 예를 들어, TNM + 10% FCS 또는 SF900 배지이다. 곤충 세포는 보통 부착 또는 부유 배양으로, 27 ℃에서 자란다.
진핵 세포를 위한 적합한 발현 프로토콜은 통상의 기술자에게 잘-알려져 있고, 예를 들어, Sambrook, 2001, 인용 텍스트에서 검색될 수 있다.
생산된 결합 분자를 분리하는 방법은 당업계에서 잘-알려져 있고, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 (크기 배제 크로마토그래피), 친화 크로마토그래피, 고 성능 액체 크로마토그래피(high pressure liquid chromatography; HPLC), 역상 HPLC, 디스크 겔 전기영동 또는 면역침강과 같은 방법을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, Sambrook, 2001에서 인용된 텍스트, 참조.
본 발명은 또한 적어도 하나의 (i) 본 발명의 결합 분자, (ii) 본 발명의 핵산 분자; (iii) 본 발명의 벡터 또는 (iv) 본 발명의 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명에 따라 사용되는 것으로, 용어 조성물은 적어도 하나의 나열된 화합물은 포함하는 조성물이다. 그것은, 임의적으로, 본 발명의 화합물의 특성을 변경하여, 예를 들어, 안정화, 그들의 기능을 조절 및/또는 증강시킬 수 있는 분자를 추가로 포함할 수도 있다. 조성물은 고체 또는 액체 형태일 수도 있고, 그 중에서도, 분말(들), 정제(들) 또는 용액(들)의 형태일 수도 있다.
바람직한 구체예에서, 조성물은 임의적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물이다.
본 발명에 따르면, 용어 약학적 조성물은 환자, 바람직하게는 인간 환자에게 투여하기 위한 조성물이다. 본 발명의 약학적 조성물은 위에서 나열된 화합물을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은, 임의적으로 및 부가적으로, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수도 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 비-독성 고체, 반고체 또는 액체 필러, 희석제, 캡슐 소재 또는 어떠한 타입의 예비적 제형을 의미한다. 적합한 약학적 담체의 예는 당업계에서 잘 알려져 있고, 염화 나트륨 용액, 포스페이트로 완충된 염화 나트륨 용액, 물, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼, 다양한 타입의 습윤제, 살균 용액, 유기 용매 등을 포함한다. 바람직하게는 담체는 비경구 담체, 더욱 바람직하게는, 수령자의 혈액과 등장인 용액이다. 여기에서 사용된 것으로, 용어 비경구는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 주입을 포함하는 투여 방식이다. 담체는 적합하게 등장성 및 화학적 안정성을 증강시키는 물질과 같은 첨가제를 약간 함유한다. 이와 같은 물질은 투여용량 및 사용된 농도에서, 수령자에게 비-독성이고, 포스페이트, 시트레이트, 숙시네이트, 아세트산, 및 다른 유기산 또는 그의 염과 같은 버퍼; 아스코르브산과 같은 항산화제; 저분자량 (약 10개의 잔기 미만의) (폴리)펩타이드, 예를 들어, 폴리아르기닌 또는 트리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 추가의 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루탐산, 아스파르트산, 또는 아르기닌과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 셀룰로오스 또는 그의 유도체, 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 카운터이온; 및/또는 폴리소르베이트, 폴록사머, 또는 PEG와 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
이와 같은 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 전통적인 방법에 의하여 제형화될 수 있다. 일반적으로, 제형은 약학적 조성물의 성분을 액체 담체 또는 잘게 나누어진 고체 담체 또는 양자 모두와 균일하게 및 충실히 접촉함에 의하여 제조된다. 그리고 나서, 필요한 경우, 생산물은 목적한 제형으로 만들어진다.
이 약학적 조성물들은 대상체에게 적합한 용량으로 투여될 수 있다. 투여용량 요법은 주치의 및 임상적 인자에 의하여 결정될 것이다. 의학 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 어느 한 환자를 위한 투여용량은 환자의 크기, 체표면적, 나이, 투여될 특정 화합물, 성별, 시간 및 투여 경로, 일반적인 건강, 및 현재 투여중인 다른 약물을 포함하는, 많은 인자에 따라 달라진다. 주어진 상황에서 치료적 유효량은 반복 실험에 의하여 쉽게 결정될 것이고, 통상의 임상의 또는 의사의 기술 및 판단 범위 내이다. 약학적 조성물은 한번에 투여될 수도 있고 또는 지속되는 기간 동안 정기적으로 투여될 수도 있다. 일반적으로, 약학적 조성물의 투여는 일회 용량이 예를 들어 체중의 10㎍/kg 내지 체중의 2g/kg 범위 내여야 한다. 그러나, 더욱 바람직한 투여용량은 일회 용량으로 체중의 100㎍/kg 내지 1.5g/kg, 매우 바람직하게는 체중의 1mg/kg 내지 1g/kg, 및 매우 바람직하게는 체중의 5mg/kg 내지 500mg/kg 범위 내여야 한다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여는 다른 방식, 예를 들어, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 피내, 비강내 또는 기관지내 투여에 의하여 영향을 받을 수도 있다.
치료적 투여를 위하여 사용되는 약학적 조성물의 성분들은 살균되어야 한다. 살균은 살균 여과 멤브레인 (예를 들어, 0.2 마이크론 멤브레인)을 통한 여과에 의하여 쉽게 달성된다.
약학적 조성물의 성분은 보통, 유닛 또는 다중-용량 컨테이너, 예를 들어, 수용액 또는 재형성(reconstitution)을 위한 동결건조 제형으로서, 밀봉된 앰플 또는 바이알에서 보관될 것이다. 동결건조 제형의 예로, 10-ml 바이알이 5 ml의 살균-여과된 1% (w/v) 수용액으로 채워지고, 결과 혼합물이 동결건조된다. 주입 용액은 주사-용-정균수(bacteriostatic water)를 이용한 동결건조된 화합물(들)의 재형성에 의하여 제조된다. 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트화제, 및 비활성 기체 등과 같은, 보존제 및 다른 첨가제가 존재할 수도 있다. 약학적 조성물은 약학적 조성물의 의도된 용도에 따라 추가 물질을 포함할 수도 있다.
후술하는 바와 같이, 약학적 조성물은 특히 종양의 치료에 유용할 수도 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물은 진단용 조성물이다.
본 발명에 따르면, 용어 진단용 조성물은 개별적인 환자를 본 발명의 약학적 조성물에 대한 잠재적인 반응성 또는 그에 의한 치료 가능성에 대하여 진단하기 위한 조성물이다 본 발명의 진단용 조성물은 위에서 나열된 화합물은 포함한다. 진단용 조성물은 적절한 버퍼 (들) 등을 추가로 포함할 수도 있다. 진단용 조성물은 하나의 컨테이너 또는 복수의 컨테이너에 포장될 수도 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 결합 분자, 본 발명의 핵산 분자 또는 본 발명의 종양의 치료에 있어서의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 용어 "종양"은 세포의 제어되지 않는 분할로 특징되는 질병 또는 장애의 종류이고, 예를 들어, 고체 종양 및 비-고체 종양뿐 아니라 암성 종양 및 양성 종양과 같은, 모든 타입의 종양을 포함한다. 암성 종양은 추가로, 침입을 통한 가까운 조직으로의 직접적인 성장, 또는 전이에 의한 먼 거리로의 이식(종양 세포가 혈류 또는 림프계를 통하여 운반되는 경우)에 의한, 종양들의 확산 능력으로 특징된다.
바람직하게는, 종양은 유방암, 난소암, 방광암, 침샘암, 자궁내막암, 췌장암, 갑상선암, 신장암, 폐암, 상부 위장관암, 결장암, 대장암, 전립선암, 두부 및 경부의 편평-세포 암종, 자궁경부암, 글리오블라스토마, 악성 복수(malignant ascites), 림프종 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암성 종양이다.
여기에서 기술되는 모든 타입의 암은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고, 관련 업계 및 통상의 기술자의 공통되는 일반적 지식에 따라 정의된다.
도 1: HER2 과발현 BT-474 세포를 이용한 FACS 결합 실험.
(A) 항-HER2 항체 1 (항-HER2 mAb 1; 상기에서 중쇄는 서열번호 154의 아미노산 서열을 갖고, 경쇄는 서열번호 155의 아미노산 서열을 갖는다; 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 165 및 166에서 보여준다) 및 항-HER2 항체 2 (항-HER2 mAb 2; 상기에서 중쇄는 서열번호 160의 아미노산 서열을 갖고, 경쇄는 서열번호 163의 아미노산 서열을 갖는다; 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 168 및 169 에서 보여준다)의 에피토프의 전-차단 유무에 따른, Fyn SH3 유래 폴리펩타이드 C12 (서열번호 1) 및 G10 (서열번호 2)의 HER2에 대한 결합. PBS, 포스페이트로 완충된 식염수는 음성 대조군을 나타낸다.
(B) 항-HER2 항체 1 및 항-HER2 항체 2의 에피토프의 전-차단 유무에 따른, 비오티닐화된 항-HER2 항체 1 및 비오티닐화된 항-HER2 항체 2 (비오티닐화된 항체는 약어로 bt로 나타낸다)의 결합. PBS, 포스페이트로 완충된 식염수는 음성 대조군을 나타낸다.
도 2: HER2 과발현 위암 세포주 NCI-N87의 인 비트로 증식 어세이.
Fyn SH3-유래 폴리펩타이드 C12 (서열번호1)는 인간 IgG1의 Fc 부분과 융합되어, Fc-C12 (서열번호 153)라고 하는 단일 특이적인 2 가 단백질을 만들었다. 상응하는 항-HER2 항체 단독보다, 항-HER2 항체 1 (항-HER2 mAb 1) (도 2A에서 보여주는) 및 항-HER2 항체 2 (항-HER2 mAb 2) (도 2C에서 보여주는)와 Fynomer C12-Fc의 조합 혼합물은 NCI-N87 세포의 증식률을 더 효과적으로 감소시키지 않았다. 그러나, 상응하는 비수식된(unmodified) 항체의 활성보다, 결합 분자 COVA208 (서열번호 154 & 159) (도 2B에서 보여주는) 및 COVA210 (서열번호 160 & 161; 서열번호161을 인코딩하는 예시적인 핵산 분자는 서열번호 170에서 보여준다) (도 2D)의 항-증식 활성이 더 높았다. COVA 208은 항체 1(서열번호 154 및 155)의 경쇄의 N-말단과 C12 (서열번호1)의 융합으로 이루어지고 및 COVA210은 항체 2 (서열번호 160 및 163)의 경쇄의 N-말단과 C12 (서열번호1)의 융합으로 이루어진다, 또한, 도 8 참조.
도 3: 항-HER2 Fynomer-항체 융합의 항-증식 활성은 Fynomer의 상대적 경향 및 항체의 결합 부위에 따라 달라진다.
NCI-N87 위암 세포의 증식 세포 어세이에서, 다른 Fynomer-항체 융합 단백질의 항-증식 활성은 (A) 및 (B)로 변화를 보여주었고, COVA208은 이 세포주에서 가장 좋은 항-증식 효과를 보여주었다(도 3B). 퍼센트 생존력으로 주어진 최대 효과를 표에 나타내었다. COVA201 (서열 번호 156 및 155), COVA202 (서열 번호 154 및 157), COVA207 (서열 번호 158 및 155) 및 COVA208 (서열 번호 154 및 159)은 모두 Fyn SH3 유래 폴리펩타이드 C12 (서열번호 1) 및 항-HER2 항체 1 (항-HER2 mAb 1) (서열 번호 154 및 155)의 융합 단백질이다. COVA201은 C-말단 중쇄 융합으로 이루어지고, COV202는 C-말단 경쇄 융합을 나타내며, COVA 207은 N-말단 중쇄 융합으로 이루어지며, COVA208은 N-말단 경쇄 융합을 나타낸다, 또한, 도 8 참조.
도 4: HER2 과발현 유방암 세포주 BT-474의 세포 어세이에서, COVA208 (서열 번호 154 및 159) (항-HER2 항체 1 (항-HER2 mAb 1, 서열 번호 154 및 155)의 경쇄의 N-말단과 Fynomer C12의 융합)의 항-증식 활성이 결정되었다. 비수식된 항체와 비교하여, COVA208은 우수한 항-증식 활성을 나타내었다.
도 5: NCI-N87 위암 이종이식 마우스 모델의 동물 시험을 나타낸다. NCI-N87 위암 세포를 CD1 누드 마우스에 피하로 접종하였다 (처리군당 n=6). 종양의 크기가 약 140 mm3에 달하였을 때, COVA208 (서열 번호 154 및 159), 항-HER2 항체 1 (항-HER2 mAb 1 (서열 번호 154 및 155)) 또는 플라시보 (PBS)를 30 mg/kg의 부하 용량(loading dose) 으로, 동물에 처리하였다. 4주 동안 i.p. 주사 (15 mg/kg) (화살표로 표시되는)로 처리를 계속하고, 캘리퍼로 종양의 크기를 측정하였다. 단일 특이적인 항-HER2 항체 1 또는 플라시보 (PBS)보다, COVA208이 종양 성장을 상당히 많이 억제하는 것으로 밝혀졌다. 6 마리 마우스의 평균 종양 크기는 (처리를 시작한 0일 째와 비교하여) 평균 표준오차 (SEM)로 보여준다.
도 6: C57Bl/6 마우스로의 단일 i.v. 주사 후에, 다른 시-점에서, COVA208 (서열 번호 154 및 159) 및 항-HER2 항체 1 (항-HER2 mAb 1 (서열 번호 154 및 155))의 혈청 농도. 여섯 개의 마지막 시-점을 이용하여 247 시간(COVA208) 및 187 시간(항-HER2 항체 1)의 말단 반-감기(terminal half-lives)를 계산하였다. 시간에 대한 평균 혈청 농도를 도시하고, 에러 바는 표준편차 (SD)를 나타낸다.
도 7: COVA208 (서열 번호 154 및 159) 및 항-HER2 항체 1 (항-HER2 mAb 1 (서열번호 154 및 155))의 SDS PAGE (상단) 및 정제 후 및 4℃에서 1 및 2개월 보관 후의, COVA208의 크기 배제 크로마토그램(하단). 분명히, COVA208는 어떠한 응집도 형성하지 않았다.
도 8: 항원의 두 개의 다른 에피토프에 결합하는 결합 분자의 다른 포맷의 도식적 개요. COVA201 (서열번호 156 & 155), COVA202 (서열번호 154 & 157), COVA207 (서열번호 158 & 155) 및 COVA208 (서열번호 154 & 159) 는 모두 Fyn SH3 유래 폴리펩타이드 C12 (서열번호 1) 및 항-HER2 항체 1 (항-HER2 mAb 1) (서열번호 154 및 155)의 융합 단백질이다. COVA201은 C-말단 중쇄 융합으로 이루어지고, COV202는 C-말단 경쇄 융합을 나타내며, COVA 207은 N-말단 중쇄 융합으로 이루어지며, COVA208은 N-말단 경쇄 융합을 나타낸다. COVA210 (서열번호 160 & 161)은 항체 2 (서열번호 160 및 163) 의 경쇄의 N-말단과 C12 (서열번호1)의 융합으로 이루어진다.
도 9: HER2 발현 세포주의 인 비트로 증식 어세이. 항-HER2 항체 1 (항-HER2 mAb 1 (서열 번호 154 및 155))보다, COVA208 (서열 번호 154 및 159)은 더욱 효과적으로 OE19 (도 9A) 및 Calu-3 세포 (도 9B)의 세포 성장을 억제하였다. 도 9C는 10개의 다른 세포주에서 수행한 인 비트로 증식 어세이의 결과를, 각각에 대하여 최대 억제 수준을 도시하여 요약한 것이다. COVA208 및 항-HER2 항체 1에 대한 상응하는 데이터는 연결되어 두 개의 화합물 사이의 비교를 용이하게 한다.
10개 모두의 세포주에서, 항-HER2 항체 1과 비교하여, COVA208은 세포 성장의 개선된 억제를 보여준다.
도 10: COVA208 (서열 번호 154 및 159)은, 카스파제-3/7 활성 (도 10A) 및 TUNEL 염색 (도 10B)에 의하여 확인되는 세포예정사를 유도할 수 있다. 항-HER2 항체 1 (항-HER2 mAb 1 (서열 번호 154 및 155))는 카스파제-3/7 활성 및 TUNEL-양성 세포의 분율을 증가시키지 않았고, 이는 COVA208만이 세포예정사를 유도하는 능력이 있음을 가리킨다. 스타우로스포린이 양성 대조군으로 사용되었다. 도 10A 에서 에러 바는 3회 반복의 표준편차를 나타낸다.
도 11: COVA208 (서열 번호 154 및 159)은 MCF-7 세포에서 HER2 신호전달의 리간드-의존적 활성화 (왼쪽 패널) 및 NCI-N87 세포에서 HER2 신호전달의 리간드-비의존적 활성화 (오른쪽 패널)를 억제한다. 항-HER2 항체 1 (항-HER2 mAb 1 (서열 번호 154 및 155))는 오로지 MCF-7 세포에서만 신호전달을 억제하고, 항-HER2 항체 2 (항-HER2 mAb 2 (서열 번호 160 및 163))는 오로지 NCI-N87 세포에서만 활성화된다. 빈쿨린은 로딩 대조군으로 제공되었다.
도 12: COVA208은 NCI-N87 세포에 의하여 내재화된다. Imaris 소프트웨어로 분석된 공초점 레이저 스캐닝 이미지로부터 확인된 것으로, 표면 염색 다음 5 시간인큐베이션 후, 52%의 COVA208 (서열 번호 154 및 159)이 사이토졸 내에서 둥근 점으로 확인되었다. 항-HER2 항체 1 (항-HER2 mAb 1 (서열 번호 154 및 155)) 염색은 주로 멤브레인-결합으로 남아있고, 오직 9%의 염색만이 사이토졸의 둥근 점에 위치하였다.
도 13: KPL-4 유방암 이종이식 마우스 모델의 동물 시험을 나타낸다. SCID 베이지 마우스에 KPL-4 유방암 세포를 피하로 접종하였다(처리군당 n=8). 종양 크기가 약 70 mm3에 달하였을 때, COVA208 (서열 번호 154 및 159), 항-HER2 항체 1 (항-HER2 mAb 1 (서열 번호 154 및 155)) 또는 플라시보 (PBS)를 30 mg/kg의 부하 용량으로, 동물에 처리하였다. 4주 동안 i.p. 주사 (15 mg/kg) (화살표로 표시되는)로 처리를 계속하고, 캘리퍼로 종양의 크기를 측정하였다. 단일 특이적인 항-HER2 항체 1 또는 플라시보 (PBS)보다, COVA208 이 종양 성장을 상당히 많이 억제하는 것으로 밝혀졌다. 8 마리 마우스의 평균 종양 크기는 평균 표준오차 (SEM)로 보여준다.
실시예들은 본 발명을 설명한다:
실시예 1 : Fyn SH3 유래 폴리펩타이드는 HER2 에 결합한다.
방법
1) 재조합 HER2 단백질의 파지 ELISA
Grabulovski et al. (Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204)에서 Fyn SH3 라이브러리에 대하여 기술된 바와 같이, 서열 번호 9 내지 121의 아미노산을 인코딩하는 DNA를 파지미드 벡터 pHEN1로 클로닝하였다. 표준 프로토콜 (Viti, F. et al. (2000) Methods Enzymol. 326, 480-505)에 따라 파지 생성을 수행하였다. 파지를 함유하는 단클론 박테리아 상청액을 ELISA에 이용하였다: 전체-길이 단백질의 23-652 아미노산을 포함하는 HER2의 비오티닐화된 세포외 도메인 (인간 Fc1에 융합된 것으로, Bender Medsystems, 또는 R&D로부터 구입; 비오티닐화는 제조자의 설명서에 따라 sulfo-NHS-LC-biotin (Pierce)로 수행되었다)을 스트렙타비딘-코팅 웰(Streptawells, High Bind, Roche)에 고정하고, PBS 중의 2% 우유 (Rapilait, Migros, Switzerland)로 블로킹한 후, PBS 중의 10% 우유 20㎕ 및 파지 상청액 80㎕를 적용하였다. 1 시간 인큐베이션 후, 결합되지 않은 파지를 세척하여 제거하고, 항-M13-HRP 항체 컨쥬게이트 (GE Healthcare)로 결합된 파지를 검출하였다. BM 블루 POD 기질 (Roche) 을 가하여, 퍼옥시다제 활성을 검출하고, 1 M H2SO4를 가하여 반응을 종결시켰다. 스트렙타비딘 (Strepta웰s, High Bind, Roche) 및 인간 IgG (Sigma)에 대한 교차 반응성의 부재를 위하여, 파지 ELISA에 의하여 파지 ELISA 양성 클론을 시험하였다.
DNA 시퀀싱에 의하여, 특이적인 결합제의 DNA 서열을 검증하였다.
2) HER2 과발현 SKOV-3 세포에서의 FACS 실험
Grabulovski et al. (Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204)에 기술된 바와 같이, 서열 번호 1 내지 8 및 서열 번호 122-152의 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA를 박테리아 발현 벡터 pQE12로 서브클로닝하여, 결과 구축물이 C-말단에 myc-헥사히스티딘 태그 (서열번호 162)를 갖도록 하였다. E. coli 박테리아의 사이토졸에서 폴리펩타이드를 발현시키고, 원래의 배양물 ml 당 1.8 ml의 맑은 용해물을 제조하였다. 폴리펩타이드를 함유하는 100㎕ 맑은 용해물을, PBS/1% FCS/0.2 % 나트륨 아지드 중에 1.25 x 105 SKOV-3세포를 함유하는 100㎕의 세포 서스펜션과 혼합하였다. 얼음 중에서, 60 분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 세척하고, 10 g/ml 항-myc 마우스 항체 9E10 (Roche), 뒤이어, 항-마우스 IgG Alexa488 컨쥬게이트 (Invitrogen)에 의하여, 결합된 서열을 검출하였다. FACS 분석기에서, 염색된 세포를 분석하였다. DNA 시퀀싱에 의하여, 특이적 결합제의 DNA 서열을 검증하였다.
결과:
Fyn SH3 유래 HER2 결합제의 아미노산 서열은 첨부된 서열 목록에서의 서열 번호 1 내지 152로 표시된다.
실시예 2 : Fyn SH3 유래 폴리펩타이드는 항- HER2 항체와 비교하여 HER2 의 다른 에피토프에 결합한다
방법:
Grabulovski et al. (Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204)에 기술된 바와 같이, FynSH3-유래 클론 C12 (서열번호 1) 및 G10 (서열번호 2)을 인코딩하는 DNA 서열을 박테리아 발현 벡터 pQE12로 서브클로닝하여, 결과 구축물이 C-말단에 myc-헥사히스티딘 태그(서열번호 162)를 갖도록 하고, 헥사히스티딘 태그로 두 개의 구축물을 발현 및 정제하였다.
항-HER2 항체 1의 중쇄 및 경쇄 (서열번호 154 및 서열번호 155) 및 항-HER2 항체 2 (서열번호 160 및 서열번호 163)를 CHO 세포에서 일시적으로 공동-발현시켰다. MabSelect SuRe 컬럼 (GE healthcare)에서, 친화 크로마토그래피에 의하여, 배양 상청액으로부터 항체를 정제하였다.
얼음 중에서, 60 분 동안, 105BT-474세포 (ATCC)를 과량의 1 M 항-HER2 항체 1, 항-HER2 항체 2, 또는 PBS로 전-인큐베이트(pre-incubated) 하였다. 그 후에, 블로킹 항체를 세척하여 제거하지 않고, 300 nM C12 또는 G10 + 20 nM 마우스 항-myc 항체 9E10 (Roche)를 세포에 가하였다. 45 분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 세척하고, 항-마우스 IgG Alexa488 컨쥬게이트로 결합된 C12/9E10- 및 G10/9E10 복합체를 검출하였다. FACS에 의하여 세포를 분석하였다. 비-블로킹된 세포에의 결합에 대하여, C12 및 G10의 항-HER2 항체 1 또는 항-HER2 항체 2-블로킹된(blocked) 세포 표면에의 결합을 비교하였다. 항-HER2 항체 1 및 2에 의한 에피토프 차단의 효능을 분석하기 위하여, 25 nM 비오티닐화된 항체 (제조자의 설명서에 따라 sulfo-NHS-LC-biotin (Pierce)로 비오티닐화를 수행하였다)를 전-블로킹된 세포(pre-blocked cell)에 가하고, 스트렙타비딘-알로피코시아닌 컨쥬게이트로 검출하였다.
결과:
실험의 결과를 도 1에서 보여준다. 항체들 중 하나로의 전블로킹은 상응하는 비오티닐화된 항체의 결합을 급격하게 감소시켰고, 이는 전블로킹 단계가 효과적으로 및 특이적으로 두 개의 다른 항체의 에피토프를 차단함을 가리킨다(도 1B).
C12 및 G10의 결합은 항-HER2 항체 1 및 항-HER2 항체 2로의 전블로킹에 의하여 영향을 받지 않았고, 이는 이들 클론은 항-HER2 항체 1 및 항-HER2 항체 2의 다른 에피토프에 결합함을 가리킨다 (도 1A).
실시예 3 : 본 발명의 결합 분자는 각 결합 단백질의 조합보다 더욱 강한 항증식 효과를 갖는다
글리신-세린 (Gly4Ser)3링커를 통한 C12의 항-HER2 항체 1 (결과적으로 COVA208이라 명명된 단백질이 되는) 또는 항-HER2 항체 2 (COVA210라 명명)의 경쇄의 N-말단과의 융합에 의하여, 두 개의 다른 결합 특이성이 있는 HER2 타겟 분자를 만들었다.
방법:
항-HER2 항체 1 (서열번호 154 및 서열번호155), 항-HER2 항체 2 (서열번호 160 및 서열번호 163), COVA208 (서열번호 154 및 서열번호159) 및 COVA210 (서열번호 160, 서열번호 161)을 CHO 세포에서 일시적으로 공동-발현시키고, MabSelect SuRe 컬럼 (GE healthcare)에서 친화 크로마토그래피에 의하여 배양 상청액으로부터 정제하였다. (Gly4Ser)3를 통하여 인간 Fc1의 C-말단에 융합하여, 클론 C12의 2 가의 단일 특이적 포맷을 만들어, Fc-C12 (서열번호 153)를 만들었다. 항-HER2 항체 1, 항-HER2 항체 2, COVA208 및 COVA210에 대하여 위에서 기술한 바와 같이, 단백질을 발현 및 정제하였다.
인 비트로, NCI-N87 종양 세포주 (ATCC로부터 구입)에서, HER2 타겟 구축물의 성장 억제 효과를 조사하였다. 이 인간 HER2 과발현 위 세포주를 10 % FBS (Gibco; 45 분 동안, 56℃에서 열 불활성화된)로 보충된 RPMI1640 (Gibco)에서 성장시켰다. 웰 당 100㎕ 성장 배지에서, 7000 세포를 96-웰 플레이트에 씨딩하였다. 24 시간 동안 37℃ / 5% CO2에서 인큐베이션한 후, 20㎕의 항-HER2 구축물 Fc-C12, COVA208, COVA210, 항-HER2 항체 1 또는 항-HER2 항체 2, 또는 이들을 조합하여 가하였다. 각 조건을 세번 반복하여 수행하였고, 시약은 300 nM 및 0.015 nM 사이의 농도로 3-배 연속 희석하여 가하였다. 조합을 위하여, 각 시약을 지정된 농도로 사용하였다 (예를 들어, 300 nM Fc-C12 + 300 nM 항-HER2 항체 1). 5 일 후, XTT (Roche)로 처리된 배양물의 생존력을 분석하였다. 대사 활성 세포(metabolically active cells)에 의하여 XTT 시약은 450 nm 파장에서 빛을 흡수하는 유색의 포르마잔 산물로 전환된다. 흡광도는 살아있는 세포 수와 직접적으로 연관된다. 하기 식에 따라 PBS 처리 세포와 비교한 % 생존력을 계산하였다:
평균 % 생존력을 log10(농도)에 대하여 도시하고, 세 개의 파라미터 방정식을 이용하여, 소프트웨어 Prism 으로, 비선형 회귀분석에 의하여 결과인 용량-반응 곡선을 분석하였다:
결과:
Fyn SH3 유래 결합제 C12의 인간 Fc1, Fc-C12의 C-말단과의 융합은, 세포 생존력에 대하여 어떠한 효과도 갖지 않았다 (도 2A 및 2C). 항-HER2 항체 1 또는 항-HER2 항체 2와 조합하여 가한 경우, Fc-C12는 이들 두 항체의 활성을 유의하게 증가시키거나 또는 감소시키지 않았다 (도 2A 및 2C). 그러나, 클론 C12를 항-HER2 항체 1 (COVA208) 또는 항-HER2 항체 2 (COVA210)의 경쇄의 N-말단과 융합하여 하나의 항원에 대하여 두 개의 다른 특이성이 있는 분자를 생성한 경우, 비수식된 상응하는 항체의 항증식 효과를 증가시켰다(도 2B 및 2D).
요약하면, 이 결과들은 분자 COVA208 및 COVA210은 각 단일 특이적인 결합 단백질의 조합보다 우수함을 보여준다.
실시예 4 : 항- HER2 Fynomer -항체 융합의 항-증식 활성은 Fynomer 의 상대적인 경향 및 항체의 결합 부위의 따라 다르다
Fyn SH3-유래 서열이 항체에 결합하는 융합 부위의 영향을 조사하기 위하여, 몇몇 다른 C12 항체 융합의 NCI-N87 종양 세포의 성장 억제 능력에 대하여 시험하였다.
방법:
COVA201 (서열번호156; 서열번호155), COVA202 (서열번호154; 서열번호157), COVA207 (서열번호158; 서열번호155) 및 COVA208 (서열번호154; 서열번호159)은 모두 클론 C12가 중쇄의 C-말단 (COVA201), 경쇄의 C-말단 (COVA202), 중쇄의 N-말단 (COVA207) 및 경쇄의 N-말단(COVA208) 중 하나에 유합되어 있는 C12-항-HER2 항체 1 융합이다. 실시예 3에서 COVA208에 대하여 기술한 바와 같이, 발현 및 정제를 수행하였다. 실시예 3에서 기술한 바와 같이, NCI-N87 세포에서 세포 성장 억제 어세이를 수행하였다.
결과:
다른 C12-항-HER2 항체 1 포맷은 다른 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다(도 3A 및 3B). COVA208이 종양 세포 성장 억제에 가장 효과적이었고, 상대적인 생존력을 37%로 감소시켰다. COVA207 및 COVA201은 중간 활성을 보였고 (생존력: 각각 52% 및 61%), COVA202은 가장 적은 활성을 보여, 생존력을 67%로 감소시켰으나, 그래도 항-HER2 항체 1(81 82 % 생존력) 보다는 우수하였다.
이 결과들은 Fyn SH3-유래 서열 및 항체의 한 쌍의 융합은 다른 활성을 가지며, 융합 부위에 따라 달라지고, C12의 항-HER2 항체 1에 대한 N-말단 경쇄 융합 (=COVA208)이 가장 강력한 항-증식 효능이 있음을 보여준다.
실시예 5 : COVA208 은 항- HER2 항체 1보다 높은 효능으로 BT -474 세포의 성장을 억제한다
방법:
인간 유방 종양 세포주 BT-474 (ATCC로부터 구입)에서, COVA208 (서열 번호 154 및 159)의 종양 세포 성장 억제를 항-HER2 항체 1 (서열번호 154 및 155)과 비교하였다. HER2 과발현 세포주는 HER2 타겟 시약의 활성을 연구하기에 특성화된 가장 좋은 모델의 하나이다. BT-474 세포를 10% 열-불활성화된 FBS (Gibco) 및 10 g/ml 인간 재조합 인슐린으로 보충된 DMEM/F12 배지 (Gibco)에서 성장시켰다. 실시예 3에서 NCI-N87 세포에 대하여 기술한 바와 같이, 어세이를 수행하였다.
결과:
COVA208은 항-HER2 항체 1보다 더 좋은 항증식 활성을 보였다(도 4).
실시예 6 : 인 비보에서, COVA208 은 항- HER2 항체 1보다 NCI - N87 종양 성장을 더욱 효과적으로 억제한다
인 비보에서, 항-HER2 항체 1과 비교하여 COVA208의 종양 성장 억제에 대하여 조사하였다.
방법:
5 x 106인간 위 종양 세포 (ATCC; CRL-5822)를 s.c.로 무흉선 CD-1 누드 마우스 (Charles River)에 이식하였다. 일주일에 세번, 종양 치수 및 체중을 기록하였다. 식 크기 = (넓이) 2 x길이 x /6에 따라, 종양 크기를 계산하였다. 종양 접종 42 일 후, 평균 종양 크기가 약 140 mm3에 달하였을 때, 마우스를 무작위로 각 6 마리 마우스를 포함하는 세 개의 처리군으로 나누고, 처리를 시작하였다. 일주일에 한번씩, 4주 동안, COVA208 (서열 번호 154 및 159) 및 항-HER2 항체 1 (서열 번호 154 및 155)을 i.p.로 투여하였다 (총 네 번 주사). 최초 (부하) 용량은 30 mg/kg이고, 이후의 (유지) 용량은 15 mg/kg이었다. 대조군 마우스는 PBS를 주사하였다.
결과:
항-HER2 항체 1 처리는 오로지 약한 종양 성장 억제를 야기하였다(도 5). COVA208 은 항-HER2 항체 1과 비교하여, 처리기간 동안 개선된 종양 성장 제어를 보였다. 32일에, COVA208 처리 마우스의 종양은 처리를 시작한(d = 0) 최초 종양 크기와 비교하여 크기가 8 % 감소하였고, 항-HER2 항체 1-처리 마우스는 88%의 크기 증가를 보였다.
이 결과는 인 비보에서, 항-HER2 항체 1과 비교하여 COVA208가 매우 우수한 효능을 보임을 설명한다.
실시예 7 : 인 비보에서, COVA208 은 항체-유사 PK 프로파일을 나타낸다
방법:
C57BL/6 마우스 (Charles River)에서, COVA208의 약물동력학적 프로파일을 조사하였고, 항-HER2 항체 1와 비교하였다. 세 마리 C57BL/6 마우스에 i.v.로 200 g COVA208 (서열 번호 154 및 159) 또는 항-HER2 항체 1 (서열 번호 154 및 155)를 주사하였다. 10 분, 6, 24, 48, 96, 120, 144 및 168 시간 후, EDTA 코팅된 마이크로베트(마이크로vettes) (Sarstedt)로 혈액을 수집하고, 9300 g에서 10 분 동안 원심분리한 후, ELISA에 의하여 COVA208 또는 항-HER2 항체 1의 혈청 수준을 측정하였다. 블랙 맥시소프 마이크로타이터 플레이트(Black maxisorp microtiter plates; Nunc)를 50 nM HER2 ECD (Bender MedSystems)로 코팅하였다. PBS 중의 4 % 우유 (Rapilait, Migros, Switzerland)로 블로킹한 후, 40㎕의 PBS 및 적절하게 희석한 10㎕의 혈청을 적용하였다. 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 웰을 PBS로 세척하고, 단백질 A-HRP 컨쥬게이트 (Sigma)로 결합된 COVA208 또는 항-HER2 항체 1을 검출하였다. QuantaRed 형광 기질 (Pierce)로 어세이를 현상하였고, 544 nm (여기) 및 590 nm (방출)에서 5 내지 10분 후에 형광 강도를 측정하였다. COVA208 및 항-HER2 항체 1 (각각 333 - 0.5 ng/ml로 희석)의 표준 곡선을 이용하여 COVA208 및 항-HER2 항체 1의 혈청 수준을 결정하였다. 다른 시점에서, 혈청에서 측정된 COVA208 및 항-HER2 항체 1의 농도 및 제거 단계(elimination phase) (세미-로그 규모로 도시)의 결과 기울기 k로부터, 식 t1 /2=ln2/-k를 이용하여 반-감기를 계산하였다.
결과:
도 6에서 보여주는 바와 같이, 제거 단계 (베타 단계, 24h - 168h의 시점)로부터 결정된 COVA208 및 항-HER2 항체 1의 반-감기는 매우 유사하였다 (각각, 247 및 187 h). 이 데이터는 COVA208이 약물-유사 인 비보 PK 성질을 가짐을 설명한다.

실시예 8 : COVA208 은 안정하고 응집되지 않는다
SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피에 의하여 COVA208의 온전성 및 안정성을 측정하였다.
방법
SDS-PAGE에 의하여 정제된 COVA208 (서열 번호 154 및 159) 및 항-HER2 항체 1 (서열 번호 154 및 155)을 분석하였다. 분자량 마커 (RPN800e; GE healthcare)와 함께, 1x MOPS 러닝 버퍼 (Invitrogen)에서 4-12% Bis/Tris Novex 겔상에, 환원된 또는 비환원된 이황화 결합이 있는 4 g 단백질을 로딩하였다. 쿠마씨 염색에 의하여 단백질 밴드를 시각화하였다.
정제하고, 4℃, PBS에서, 1 또는 2개월 동안 단백질을 보관한 후, 즉시 COVA208의 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 프로파일을 측정하였다. 1.75 mg/mL의 농도에서, 100㎕ COVA208을 0.5 ml/min의 유속으로, PBS (GE healthcare)에서, Superdex 200 10/300 GL 컬럼에 로딩하고, OD280 를 읽음으로써 컬럼으로부터의 용출을 모니터링하였다.
결과:
COVA208의 SDS-PAGE 및 SEC 프로파일 결과를 도 7에서 보여준다. COVA208은 SDS-PAGE상에 예상되는 분자량에서 명확하게 분명한 밴드를 나타내었다(상단). 특히 흥미로운 것은 COVA208(MW 약 30 kDa)에서 검출가능한 천연 경쇄가 없었다는 것이고, 이는 항체 경쇄로부터 Fyn SH3-유래 클론 C12가 분해되지 않았음을 가리킨다.
COVA208은 13.1 ml의 머무름 용량으로, SEC 컬럼에서 형성된 하나의 주요 피크에서 용출되었다 (하단). 항-HER2 항체 1은 13.2 ml에서 용출되었다. 가장 중요한 것은, COVA208 단백질 제제에서는, 약 8 ml에서 용출될 수 있는 응집이 검출되지 않았다는 것이다.
4℃에서 2 개월 동안 COVA208의 SEC 프로파일은 변하지 않았다. 용출 피크는 좁게 남아있고, 대칭적이며, 동일한 머무름 용량에서 나타났다. 1 및 2 개월 보관 후, 단백질 제제는 응집 없이 남아있었다. 이는 4℃에서, 연장된 기간 동안, COVA208이 안정하게 남아있음을 가리킨다. 요약하면, 이 결과들은 COVA208가 안정하고, 최적의 생물물리학적 성질을 갖는 단분산성 분자임을 뒷받침한다.
실시예 9 : HER2 -발현 종양 세포주 10개의 패널에 대하여, COVA208 은, 항- HER2 항체 1와 비교하여 우수한 성장 억제 활성을 갖는다
다른 HER2 양성 세포주에서, COVA208 (서열 번호 154 및 159) 의 항-증식 활성을 항-HER2 항체 1 (서열 번호 154 및 155)과 비교하였다. 실시예 3에서 기술한 바와 같이, 필수적으로 XTT 어세이를 수행하였다. 이 실험에서 사용된 세포주 및 실험 조건을 표 1에 나타내었다. 실시예 3에서 기술한 바와 같이, 세 개의 파라미터 방정식에 대하여 용량-반응 곡선을 피팅하고, 다음 식으로 최대 성장 억제를 계산하였다:
최대 수준 억제 (%) = 100% - 바텀 ( bottom )
가변적인 바텀(bottom)은 다음 식을 이용한 용량-반응 곡선의 비선형 회귀로부터 유래:
Figure pct00001

이 어세이의 결과를 도 9에서 보여준다. 도 9A 및 9B는 OE19 및 Calu-3 세포주, 각각에서 얻은 용량-반응 곡선을 보여준다. 도 9C는, 도 2 및 4에서 보여주는 NCI-N87 및 BT-474 세포주에서의 결과를 포함하여, COVA208 및 항-HER2 항체 1로 각 세포주에서 얻은 최대 성장 억제를 나타낸다. COVA208은 항-HER2 항체 1과 비교하여 10개의 세포주 모두에서 개선된 항-증식 활성을 보여준다.
실시예 10 : NCI - N87 위암 세포에서, COVA208 은 세포예정사를 유도한다
카스파제 3/7 효소 활성의 분석 및 TUNEL 염색에 의한 DNA 단편 검출에 의하여, NCI-N87 세포에서, COVA208의 세포예정사 유도 능력을 조사하였다.
방법
카스파제 3/7 어세이: 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 45000 NCI-N87 세포를 씨딩하였다. 하루 후, 100 nM 항-HER2 항체 1 (서열 번호 154 및 155), COVA208 (서열 번호 154 및 159) 또는 PBS를 세포에 가하였다(세번 반복). 양성 대조군으로, 1 M 스타우로스포린을 가하였다. 2일 인큐베이션한 후, 형광 Apo-ONE 균질의 카스파제-3/7 키트 (Pierce)를 이용하여, 카스파제-3 및 카스파제-7의 활성을 측정하였다.
실시예 3에서 기술한 바와 같이, 레플리카 플레이트에서 동시에, XTT에 의하여 처리된 배양물의 생존력을 분석하고, PBS 처리 샘플에 대한 % 생존력을 계산하였다.
카스파제 3/7 활성을 % 생존력으로 나누어, 노멀라이즈된 카스파제 3/7 활성을 얻었다.
TUNEL 어세이: 2 mL 중의 0.8 x 106 개의 NCI-N87세포를 6-웰 플레이트에 분포하였다. 다음날, 300 nM 항-HER2 항체 1 (서열 번호 154 및 155), COVA208 (서열 번호 154 및 159) 또는 PBS를 세포에 가하였다. 양성 대조군으로, 1 M 스타우로스포린을 가하였다. APO-DIRECT 키트 (Phoenix flow systems)를 이용하여, 3 일 인큐베이션한 후, 세포를 떼어내고, 포르말린-고정하며, 70% 매우 차가운 에탄올 및 플루오레세인-데옥시우리딘 트리포스페이트 (FITC-dUTP)로 표지된 3-하이드록시 DNA 말단에 투과시켰다. FACS에 의하여 표지된 세포를 분석하고, FITC-dUTP 양성 세포 집단을 수집함에 의하여, % TUNEL-양성 세포를 결정하였다.
결과
카스파제 3/7 어세이의 결과를 도 10A에서 보여준다. COVA208은 카스파제 3/7 활성을 증가시켰고, 이는 NCI-N87 세포에서 COVA208가 세포예정사를 유도함을 가리킨다. 항-HER2 항체 1은 카스파제 3/7 활성을 유도하지 않았다.
TUNEL 어세이의 결과를 도 10B에서 보여준다. 다수의 세포에서, COVA208은, 세포예정사를 유도하는 또 다른 뒷받침이 되는 DNA 단편화를 유도하나, 항-HER2 항체 1은 그렇지 않았다.
실시예 11 : COVA208 은 리간드 -의존적 및 리간드 - 비의존적 HER2 -매개 신호전달을 억제한다
HER2 다운스트림 신호전달의 활성화는 HER3의 인산화를 이끌고, 결과적으로 PI3K-Akt-mTOR 경로를 활성화, 또는 MAPK/Erk 경로를 활성화한다. HER2를 충분히 높은 표면 밀도로 제시하는 종양 세포주에서, HER3 리간드의 부재 하에서 (리간드-비의존적 신호전달), 이 다운스트림 경로들은 본질적으로 활성화된다. HER2 다운스트림 신호전달의 리간드-비의존적 활성화에 더하여, 다운스트림 경로는 또한 HER2-HER3 헤테로다이머 형성을 촉진하는 (리간드-의존적 신호전달) HER3 리간드에 의하여 활성화될 수 있다.
COVA208의 HER2 다운스트림 신호전달에 대한 효과를 조사하기 위하여, HER2-과발현 NCI-N87 세포를 COVA208 (서열 번호 154 및 159), 항-HER2 항체 1 (서열 번호 154 및 155), 항-HER2 항체 2 (서열 번호 160 및 163), 또는 PBS로 처리하고, 면역블로팅에 의하여 세포 용해물을 인-단백질에 대하여 분석하였다.
HER3 리간드 헤레굴린-1의 부가 후에만 HER2 다운스트림 인산화가 촉발되는 HER2 저-발현 MCF-7 세포에서 어세이를 또한 수행하였다.
방법
웰 당 3 mL, 1 x 106개의 세포, 완전 배지에서, 6-웰 배양 디쉬에 NCI-N87 세포 (ATCC; CRL-5822)를 분포하였다. 37℃ / 5% CO2에서 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, 40 g/mL 항-HER2 시약을 가하고, 72 시간 동안 37℃ / 5% CO2에서, 세포를 인큐베이션하였다. 그 후에 1% Triton-X, 프로테아제 억제제 및 포스파타제 억제제 칵테일 (Roche Applied Sciences)을 함유하는 세포 용해 버퍼에서, 얼음 중에서 세포를 용해하였다.
MEM (Gibco) + 10 % FBS (Gibco)에서 MCF-7 세포 (ATCC; HTB-22) 를 배양하였다. 웰 당 3 mL, 0.5 x 106세포, 6-웰 배양 디쉬에 세포를 분포하였다. 37℃ / 5% CO2에서, 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, 3 시간 동안 무혈청 배지에서 세포를 굶겼다. 그리고 나서, 37℃ / 5% CO2에서 세포를 유지하면서, 1 시간 동안, 40 g/mL 항-HER2 시약을 가하였다. 45 분 후, 2 nM 인간 재조합 헤레굴린-1 (R&D 시스템)을 15 분 동안 가하였다. 그 후에 1% Triton-X, 프로테아제 억제제 및 포스파타제 억제제 칵테일 (Roche Applied Sciences)을 함유하는 세포 용해 버퍼에서, 얼음 중에서 세포를 용해하였다.
4℃에서 10 분 동안 16000 xg에서 원심분리하여, 총 세포 용해물을 맑게하고, Bradford 어세이 (Bio-Rad)에 의하여 맑은 용해물에서 단백질 농도를 측정하였다. Novex4-12%Bis-Tris겔 (Invitrogen)에서 10 g의 단백질을 분리하고, PVDF 멤브레인으로 옮겼다.
pHER3Y1289(Millipore),pAktS473(CST)또는 pErk1/2T202 / Y204(CST)에 대한 항체, 그 뒤에 2차 HRP-컨쥬게이트 항체 (Jackson Immuno Research)로, PVDF 멤브레인에서 인-단백질을 검출하였다. 빈쿨린-특이적 항체 (Millipore)로 빈쿨린을 검출하고, 로딩 대조군으로 사용하였다. ECD 프라임 화학발광 HRP 기질 (GE healthcare)로 면역블롯을 수행하고, X-선 필름에 노출시켰다.
결과:
이 실험의 결과를 도 11에서 보여준다. HER2 다운스트림 신호전달의 활성화에 HER3 리간드가 요구되는 MCF-7 세포에서, COVA208 및 항-HER2 항체 1 모두는 HER3, Akt 및 Erk1/2의 인산화를 동등하게 억제하였는데, 이는 COVA208가 그의 부모 항체의 활성을 유지함을 가리킨다. 이와 대조적으로, 항-HER2 항체 2는 HER3, Akt 또는 Erk1/2의 리간드-유도 인산화를 차단하지 않았다.
NCI-N87 세포에서, HER2 다운스트림 신호전달 단백질의 HER3 리간드 비의존적 인산화가 일어나는 경우, COVA208은 HER3, Akt 또는 Erk1/2의 인산화를 효율적으로 차단하였으나, 항-HER2 항체 1은 인산화를 차단하지 않았다. 이러한 조건에서, 항-HER2 항체 2 또한 HER2 신호전달을 효율적으로 차단할 수 있었다. 이 결과들은, 항-HER2 항체 1 및 2가 하나는 차단하지만 다른 하나는 차단하지 않는 것에 비하여, COVA208은 리간드-의존적 및 리간드-비의존적 HER2 다운스트림 신호전달 현상을 차단함을 가리킨다.
실시예 12 : COVA208 은 NCI - N87 세포에 의하여 내재화된다
인 비트로에서, COVA208이 HER2 수용체의 내재화를 촉진하는지 조사하기 위하여, NCI-N87 세포를 COVA208 (서열 번호 154 및 159) 의 존재 하에서 또는 항-HER2 항체 1 (서열 번호 154 및 155)와 함께 배양하고, 세포를 고정 및 투과시키고, 형광 2차 항체를 사용하여 항-HER2 시약을 검출하였다. 현미경 이미징을 이용하여 형광 신호의 세포내(sub-cellular) 분포를 측정하였다.
방법
Lab-Tek II CC2 챔버 슬라이드 웰에서 자란 NCI-N87 세포를, 100 nM COVA208 또는 항-HER2 항체 1로, 1 시간 동안, 얼음 중에서 표면 표지하였다. 비결합된 항-HER2 시약을 세척하였다. 양성 대조군으로, HER2의 신속한 내재화를 일으키는 1 M 겔다마이신 (Hsp90 억제제)을 몇몇 웰에 가하였다. 0 시간 또는 5 시간 동안 세포를 37℃ / 5% CO2 로 옮겨 내재화시키고 나서, 포르말린으로 고정하고 사포닌으로 투과시켰다. Alexa488-표지된 항-인간 IgG 항체 (Invitrogen)를 이용하여 투과된 세포상의 항-HER2 시약을 검출하고, Hoechst 33342 염료로 핵을 염색하였다. Leica TCS SP2-AOBS 레이저 스캐닝 공초점 현미경에서 염색된 세포를 분석하였다. 광학 섹션 (z-stacks, d = 0.2 m)을 수집하고, 세 개의 영역을 분석하였다. 점(dots) 내에 존재하는 항-HER2 시약의 퍼센트를 나타내는, 검출된 스페로이드 점(spheroid dots)에 대한 Imaris의 표면 툴을 이용하여, 뚜렷한 점에 위치하는 항-HER2 시약의 양을 소프트웨어 Imaris 7.4.0 (Bitplane)로 정량하였다:
점에서의 % 항- HER2 시약(% anti - HER2 agents ) = (점의 크기( volume of dots) / 총 항- HER2 염색의 크기( volume of total anti - HER2 staining )) x 100
결과
표면 표지를 하고 37℃에서 인큐베이션하기 전, COVA208 및 항-HER2 항체 1은 세포 멤브레인에 위치하였다. 37℃ 에서 5 시간 인큐베이션한 후에는, COVA208은 세포 멤브레인은 오로지 매우 약하게 염색된 반면, 사이토졸 내의 뚜렷한 점으로 나타나는 부분에 존재하였다. 이와 대조적으로, 항-HER2 항체 1은 37℃에서 5 시간 동안 인큐베이션한 후에도, 세포 멤브레인에 국한되었고, 사이토졸에서는 오로지 매우 적은 점만이 검출되었다. 겔다마이신과 함께 공동-인큐베이션한 경우, 항-HER2 항체 1은 또한 점(dots)에서 확인되었고, 세포 멤브레인은 상기 항체에 대하여 음성이었다. 이 결과들은, 항-HER2 항체 1과는 달리, COVA208은 NCI-N87 세포로 신속하게 내재화됨을 가리킨다.
점으로 나타나는 % 염색의 정량 결과를 도 12에서 보여준다. 대다수의 COVA208은 점에 국한되고, 항-HER2 항체 1의 적은 분율 만이 점에서 확인되었다.
실시예 13 : 인 비보에서 , COVA208 은 항- HER2 항체 1보다 더욱 효율적으로 KPL-4 유방 종양 성장을 억제한다
인 비보, KPL-4 유방 종양에서, 항-HER2 항체 1과 비교하여 COVA208의 성장 억제에 대하여 조사하였다.
방법:
3 x 106인간 KPL-4 유방 종양 세포 (Kurebayashi et al. (1999) Br . J. Cancer. 79; 707-717)를 암컷 SCID 베이지 마우스 (Charles River) 유방의 지방 패드에 이식하였다. 일주일에 세 번, 종양 치수 및 체중을 기록하였다. 식 크기 = (넓이) 2 x 길이 x π/6에 따라, 종양 크기를 계산하였다. 평균 종양 크기가 70 mm3 에 달하였을 때, 마우스를 무작위로 각 군당 8 마리 마우스를 포함하는 세 개의 처리군으로 나누고, 처리를 시작하였다. 일주일에 한번, 4주 동안(총 다섯 번 주사), COVA208 (서열 번호 154 및 159), 항-HER2 항체 1 (서열 번호 154 및 155) 또는 PBS를 i.p.로 투여하였다. 최초(부하; loading) 용량은 30 mg/kg이고, 이후의 (유지) 용량은 15 mg/kg이었다.
결과:
항-HER2 항체 1 처리는 매우 약한 종양 성장 억제만을 이끌었다 (도 13). COVA208은 상당히 개선된 종양 성장 제어를 보여주었다. 이 결과는 인 비보에서, 항-HER2 항체 1과 비교하여, COVA208이 상당히 우수한 효능을 보임을 뒷받침한다.
실시예 14 : Fyn SH3 -유래 폴리펩타이드 C12 에 의하여 결합된 HER2 에피토프 의 평가
Integral Molecular Inc. (Philadelphia, USA)에서 수행되고, 알라닌 스캐닝 돌연변이 접근법에 의하여 HER2의 Fyn SH3-유래 클론 C12 (서열번호 1)에 의하여 결합된 에피토프를 동정하였다. Paes et al (2009) J Am Chem Soc 131(20): 6952-6954에 기술된 바와 같이, 샷건 돌연변이 유발 돌연변이 라이브러리를 생성하였다. 요약하면, C-말단 V5His 에피토프 태그로, 전체-길이 인간 HER2를 인코딩하는 진핵 세포 발현 플라스미드를 구축하였다. PCR-기반 돌연변이 유발을 이용하여, 부모의 cDNA 구축물을 주형으로 하여, 알라닌 스캐닝 돌연변이를 세포외 도메인 HER2 (아미노산 23 652 서열번호 1의 71)의 세포외 도메인으로 도입하였다. 부모의 구축물에서 알라닌인 잔기가 메티오닌으로 변이되었다. HEK-293T 세포에서 변이된 구축물 및 부모의 HER2 대조군 구축물을 발현하였다. 24 시간 형질감염-후(post-transfection), PBS에서 세포를 세척하고, 4% 파라포름알데히드에 고정시켰다. 1 시간 동안, Ca2 +/Mg2 + (PBS++) 및 10% 평균 염소 혈청(Normal Goat Serum; NGS) 및 PBS에서, 세포를 대조군 항-HER2 단클론 항체 (MAB1129, R&D 시스템) 또는 Fyn SH3-유래 클론 C12 (N-말단 Fc 융합으로 발현되는 것으로서)와 인큐베이션하였다. PBS에서 두 번 세척한 후, 1 시간 동안, PBS++ 및 NGS에서, 세포를 염소 항-인간 Alexa Fluor 488-컨쥬게이트 2차 항체 (Jackson, West Grove, PA) 와 인큐베이션하고, PBS에서 2 번 세척하였다. Intellicyt HTFC 스크리닝 시스템을 이용한 유세포 분석에 의하여 마이크로플레이트를 측정하고, Forecyt 소프트웨어 (Intellicyt Corporation, Albuquerque, NM)를 이용하여 정량하였다.
Fyn SH3-유래 폴리펩타이드 C12 (서열번호 1)가 HER2 (서열번호 172)의 도메인 I 내에 위치하는 HER2의 에피토프에 결합함이 밝혀졌다. 더욱 상세하게는, 대조군 항체 MAB1129의 결합을 유지하면서, Fyn SH3-유래 폴리펩타이드 C12 (서열번호 1)를 포함하는 결합 분자의 결합을 현저하게 감소시키는 다섯 개의 알라닌 스캐닝 돌연변이를 동정하였다. 이 돌연변이들은 서열번호 172의 서열과 비교하여 T166A, R188A, P197A, S202A 및 R203A를 포함하였다. 다시 말해, Fyn SH3-유래 폴리펩타이드 C12 및 HER2 사이의 결합에 있어서, 적어도 HER2의 도메인 I의 아미노산 자리 T166, R188, P197, S202 및 R203가 연관된다.
표 1: 도 9에서 기술된 인 비트로 증식 어세이에서 사용된 HER2 발현 세포주 및 인 비트로 증식 어세이에 적용된 조건.
Figure pct00002
SEQUENCE LISTING <110> Covagen AG <120> Novel binding molecules with antitumoral activity <130> U1261 PCT <150> EP 12 15 9938.5 <151> 2012-03-16 <160> 172 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fynomer #1 C12 <400> 1 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Thr Ser Tyr Asn Thr 1 5 10 15 Arg Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Arg Met 20 25 30 Glu Asp Gly Val Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu Thr 35 40 45 Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln 50 55 60 <210> 2 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fynomer #1 G10 <400> 2 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Asp Ser 1 5 10 15 Met Gly Gly Gln Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu Lys Arg Trp Arg Gly Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr 35 40 45 Thr Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp 50 55 60 Ser Ile Gln 65 <210> 3 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fynomer #3 <400> 3 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Asp Ser 1 5 10 15 Met Gly Gly Gln Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu Thr Arg Trp Ala Gln Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr 35 40 45 Thr Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp 50 55 60 Ser Ile Gln 65 <210> 4 <211> 64 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fynomer #4 <400> 4 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Gln Ala Tyr Gly Met 1 5 10 15 Tyr Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Ser Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Gly Tyr Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu 35 40 45 Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln 50 55 60 <210> 5 <211> 66 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fynomer #5 <400> 5 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Glu Phe 1 5 10 15 Met Gly Gly Gln Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu Thr Met Trp Lys Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr 35 40 45 Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser 50 55 60 Ile Gln 65 <210> 6 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fynomer #6 <400> 6 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Pro Tyr 1 5 10 15 Leu Gly Gly Gln Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile 20 25 30 Leu His Ala Ser Met Leu Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr 35 40 45 Thr Gly Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp 50 55 60 Ser Ile Gln 65 <210> 7 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fynomer #7 <400> 7 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln 1 5 10 15 His Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Gly Asp 20 25 30 Asn Ile Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu Thr 35 40 45 Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln 50 55 60 <210> 8 <211> 67 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fynomer #8 <400> 8 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr 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Fynomer #29 <400> 29 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Tyr Ser Val His Pro 1 5 10 15 Gly Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Ser Asn 20 25 30 Tyr Gln Val Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu 35 40 45 Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln 50 55 60 <210> 30 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fynomer #30 <400> 30 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Tyr Ser Tyr Asn Ser 1 5 10 15 Arg Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Ala Gln 20 25 30 His Asp Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu Thr 35 40 45 Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln 50 55 60 <210> 31 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fynomer #31 <400> 31 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Thr Ser Tyr Asn Met 1 5 10 15 Arg Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Gly Arg 20 25 30 Gly Pro Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu Thr 35 40 45 Gly 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sequence <220> <223> Fynomer #84 <400> 84 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Thr Ser Tyr Asn Thr 1 5 10 15 Gln Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Asp Ser 20 25 30 Glu Thr Gly Lys Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly 35 40 45 Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile 50 55 60 Gln 65 <210> 85 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fynomer #85 <400> 85 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln 1 5 10 15 Arg Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Arg Lys 20 25 30 Pro Lys Tyr Asn Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly 35 40 45 Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile 50 55 60 Gln 65 <210> 86 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fynomer #86 <400> 86 Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln 1 5 10 15 Arg Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Ser Glu 20 25 30 Pro Leu Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg 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agaggaaatg 1080 accaaaaacc aggtgtccct gacatgcctg gtcaaaggct tctacccttc tgacattgct 1140 gtggagtggg agtcaaatgg acagcctgag aacaactaca aaacaacccc ccctgtgctg 1200 gattctgatg gctctttctt tctgtactcc aaactgactg tggacaagtc tagatggcag 1260 caggggaatg tcttttcttg ctctgtcatg catgaggctc tgcataacca ctacactcag 1320 aaatccctgt ctctgtctcc tggcaaatga tagtaaaagc tt 1362 <210> 166 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Anti-HER2 antibody 1 (light chain) (coding for amino acids shown in SEQ ID NO:155) <400> 166 gatatccaga tgacccagag ccctagtagt ctgagcgcaa gcgtcgggga ccgtgtgacc 60 attacctgta aagcaagcca ggatgtgtct atcggtgtgg catggtatca gcagaagccc 120 ggcaaagccc ctaagctgct gatctactct gctagttaca gatatactgg agtcccaagt 180 cggttctcag gctccggaag cgggaccgac tttaccctga caatctcctc cctgcaaccc 240 gaggatttcg ccacatacta ttgccagcag tactacatct atccttatac attcgggcag 300 gggacaaaag tggaaatcaa acggactgtg gcggcgcctt ctgtgttcat tttcccccca 360 tctgatgaac agctgaaatc tggcactgct tctgtggtct gtctgctgaa caacttctac 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ctgacaatct cctccctgca acccgaggat 480 ttcgccacat actattgcca gcagtactac atctatcctt atacattcgg gcaggggaca 540 aaagtggaaa tcaaacggac tgtggcggcg ccttctgtgt tcattttccc cccatctgat 600 gaacagctga aatctggcac tgcttctgtg gtctgtctgc tgaacaactt ctaccctaga 660 gaggccaaag tccagtggaa agtggacaat gctctgcaga gtgggaattc ccaggaatct 720 gtcactgagc aggactctaa ggatagcaca tactccctgt cctctactct gacactgagc 780 aaggctgatt acgagaaaca caaagtgtac gcctgtgaag tcacacatca ggggctgtct 840 agtcctgtga ccaaatcctt caatagggga gagtgctgat agtaaaagct t 891 <210> 168 <211> 1365 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Anti-HER2 antibody 2 (heavy chain) (coding for amino acids shown in SEQ ID NO: 160) <400> 168 gaagtccagc tggtcgaatc tggtggtggc ctggtccagc ctggtggatc actgagactg 60 tcctgtgctg cttctggttt caacatcaag gacacctaca tccattgggt cagacaggca 120 cctggcaagg gactggaatg ggtcgcccga atctacccta caaacggcta cactcgctac 180 gccgactccg tcaagggacg ctttaccatc tccgccgaca cctctaaaaa caccgcctac 240 ctgcagatga atagtctgag ggccgaggat 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gcttctaccc ttctgacatt 1140 gctgtggagt gggagtcaaa tggacagcct gagaacaact acaaaacaac cccccctgtg 1200 ctggattctg atggctcttt ctttctgtac tccaaactga ctgtggacaa gtctagatgg 1260 cagcagggga atgtcttttc ttgctctgtc atgcatgagg ctctgcataa ccactacact 1320 cagaaatccc tgtctctgtc tcctggcaaa tgatagtaaa agctt 1365 <210> 169 <211> 657 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Anti-HER2 antibody 2 (light chain) (coding for amino acids shown in SEQ ID NO: 163) <400> 169 gacatccaga tgacacagtc tccctcttcc ctgtccgctt ctgtgggcga tcgagtgaca 60 atcacctgta gggctagtca ggatgtgaat actgctgttg cttggtacca gcagaaacca 120 ggaaaagccc ctaaactgct gatctactct gcctcattcc tgtactctgg ggtgccttct 180 cgattcagtg gttctagatc tggcaccgat ttcacactga ccatttcttc actgcaacct 240 gaggattttg ccacctacta ctgtcagcag cactacacaa cacctcccac atttggccag 300 ggcacaaaag tggagatcaa acggaccgtg gcggcgcctt ctgtgttcat tttcccccca 360 tctgatgaac agctgaaatc tggcactgct tctgtggtct gtctgctgaa caacttctac 420 cctagagagg ccaaagtcca gtggaaagtg gacaatgctc tgcagagtgg 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acaacacctc ccacatttgg ccagggcaca 540 aaagtggaga tcaaacggac cgtggcggcg ccttctgtgt tcattttccc cccatctgat 600 gaacagctga aatctggcac tgcttctgtg gtctgtctgc tgaacaactt ctaccctaga 660 gaggccaaag tccagtggaa agtggacaat gctctgcaga gtgggaattc ccaggaatct 720 gtcactgagc aggactctaa ggatagcaca tactccctgt cctctactct gacactgagc 780 aaggctgatt acgagaaaca caaagtgtac gcctgtgaag tcacacatca ggggctgtct 840 agtcctgtga ccaaatcctt caatagggga gagtgctgat agtaaaagct t 891 <210> 171 <211> 1255 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 171 Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys 20 25 30 Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His 35 40 45 Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr 50 55 60 Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val 65 70 75 80 Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu 85 90 95 Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe 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Claims (15)

  1. (a) 종양 세포에서 발현되는 항원의 제 1 에피토프에 특이적으로 결합하는 제 1 결합 (폴리)펩타이드; 및
    (b) 종양 세포에서 발현되는 항원의 제2에피토프에 특이적으로 결합하는 제 2 결합 (폴리)펩타이드를 포함하며,
    상기 제 1 결합 (폴리)펩타이드는 Fyn SH3-유래 폴리펩타이드인 제 1 결합 (폴리)펩타이드인, 종양 세포에서 발현되는 항원의 두 개의 다른 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 종양 세포에서 발현되는 항원은 HER2, HER1, HER3, HER4, 인슐린 수용체, PDGF, FGF, VEGF, HGF, Trk, Eph, AXL, LTK, TIE, ROR, RET, KLG, RYK, MuSK 패밀리, EpCAM, CD20, CD33, CD52 및 CD30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제 2 결합 (폴리)펩타이드는 항체인 결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 및 제 2 결합 (폴리)펩타이드는 링커에 의하여 연결되어 있는 결합 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 펩타이드-링커인 결합 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 부가 (폴리)펩타이드를 더 포함하는 결합 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 결합 (폴리)펩타이드는
    (i) 서열번호 1 내지 152 로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열; 또는
    (ii) 서열번호 1의 아미노산 서열에 적어도 65%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어진 것인 결합 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 (폴리)펩타이드는 항체이고,
    (i) 상기 항체의 중쇄는 서열번호 154의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지고, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 155의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지거나;
    (ii) 상기 항체의 중쇄는 서열번호 160의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지고, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 163의 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지거나;
    (iii) 상기 항체의 중쇄는 서열번호 154의 아미노산 서열에 적어도 65%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지며, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 155의 아미노산 서열에 적어도 65%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지거나; 또는
    (iv) 상기 항체의 중쇄는 서열번호 160의 아미노산 서열에 적어도 65%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지고, 상기 항체의 경쇄는 서열번호 163의 아미노산 서열에 적어도 65%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지는 것인 결합 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 결합 분자를 인코딩하는 핵산 분자.
  10. 제9항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  11. 제12항의 벡터로 형질전환된 숙주 세포 또는 비-인간 숙주.
  12. 적합한 조건 하에서 제11항의 숙주 세포를 배양하고 생산된 결합 분자를 분리하는 것을 포함하는 종양 세포에서 발현되는 항원의 두 개의 다른 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 분자의 생산방법.
  13. (i) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 결합 분자;
    (ji) 제9항의 핵산 분자;
    (iii) 제10항의 벡터; 또는
    (iv) 제11항의 숙주 세포
    중 적어도 하나를 포함하는 조성물.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 결합 분자 또는 제9항의 핵산 분자 또는 제10항의 벡터 또는 제11항의 숙주 세포의 종양 치료에 있어서의 용도.
  15. 제14항에 있어서, 상기 종양은 유방암, 난소암, 방광암, 침샘암, 자궁내막암, 췌장암, 갑상선암, 신장암, 폐암, 상부 위장관암(cancer concerning upper 위장관), 결장암, 대장암, 전립선암, 두부 및 경부의 편평-세포 암종, 자궁경부암, 글리오블라스토마, 악성 복수(malignant ascites), 림프종 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 결합 분자, 또는 핵산 분자 또는 벡터의 용도.
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Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9956276B2 (en) 2012-01-19 2018-05-01 Duke University Vaccines against antigens involved in therapy resistance and methods of using same
EP2752426A1 (en) 2013-01-03 2014-07-09 Covagen AG Human serum albumin binding compounds and fusion proteins thereof
CA2931356A1 (en) 2013-11-27 2015-06-04 Zymeworks Inc. Bispecific antigen-binding constructs targeting her2
US10487140B2 (en) 2014-01-14 2019-11-26 Integrated Biotherapeutics, Inc. Targeting immunological functions to the site of bacterial infections using cell wall targeting domains of bacteriolysins
JP2017507950A (ja) 2014-02-27 2017-03-23 リセラ・コーポレイションＬｙｃｅｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ レチノイン酸受容体関連オーファン受容体ガンマのアゴニストを使用する養子細胞療法及び関連治療方法
HUE055424T2 (hu) * 2014-03-17 2021-11-29 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Antitest-fynomer konjugátumok
JP6728061B2 (ja) 2014-05-05 2020-07-22 リセラ・コーポレイションＬｙｃｅｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＲＯＲγアゴニストとして用いるテトラヒドロキノリンスルホンアミド及び関連化合物ならびに疾患の治療
WO2015171558A2 (en) 2014-05-05 2015-11-12 Lycera Corporation BENZENESULFONAMIDO AND RELATED COMPOUNDS FOR USE AS AGONISTS OF RORγ AND THE TREATEMENT OF DISEASE
US20170196953A1 (en) 2014-07-07 2017-07-13 Duke University VACCINES AGAINST AN ONCOGENIC ISOFORM OF HER2 (ErbB2) AND METHODS OF USING THE SAME
WO2016007504A1 (en) 2014-07-07 2016-01-14 Duke University Vaccines against an oncogenic isoform of esr1 and methods of using the same
EP3292119A4 (en) 2015-05-05 2018-10-03 Lycera Corporation DIHYDRO-2H-BENZO[b][1,4]OXAZINE SULFONAMIDE AND RELATED COMPOUNDS FOR USE AS AGONISTS OF RORy AND THE TREATMENT OF DISEASE
US10611740B2 (en) 2015-06-11 2020-04-07 Lycera Corporation Aryl dihydro-2H-benzo[b][1,4]oxazine sulfonamide and related compounds for use as agonists of RORγ and the treatment of disease
FI126633B (en) 2015-07-10 2017-03-15 Next Biomed Therapies Oy Method of Preparation of a Library comprising Recombinant Derivatives of the SH3 Domain of Nephrocystin (NPHP1)
US11253580B2 (en) 2016-01-07 2022-02-22 Duke University Cancer vaccines and methods of delivery
US10487143B2 (en) 2016-10-05 2019-11-26 Duke University Vaccines against HER3 antigens and methods of using the same
US11224665B2 (en) 2016-10-05 2022-01-18 Duke University Mitochondrial antiviral signaling (MAVS) protein compositions and methods of using the same
EP4015532A1 (en) 2016-11-21 2022-06-22 cureab GmbH Anti-gp73 antibodies and immunoconjugates
US10722589B2 (en) 2017-04-03 2020-07-28 Covagen Ag FGFR3 binding molecules
US20190153096A1 (en) 2017-10-02 2019-05-23 Covagen Ag Cd3/cd33 bispecific binding molecules
US20190100587A1 (en) 2017-10-02 2019-04-04 Covagen Ag IgG1 Fc MUTANTS WITH ABLATED EFFECTOR FUNCTIONS
WO2019134981A1 (en) 2018-01-05 2019-07-11 Ac Immune Sa Misfolded tdp-43 binding molecules
JP7350756B2 (ja) 2018-02-14 2023-09-26 アバ セラピューティクス アーゲー 抗ヒトｐｄ－ｌ２抗体
RU2018111298A (ru) * 2018-03-29 2019-10-01 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Биспецифическое антитело, которое специфично связывается с IV и II cубдоменами внеклеточного домена HER2 человека
CA3133909A1 (en) 2019-04-18 2020-10-22 Elpida TSIKA Novel molecules for therapy and diagnosis
AU2020278907A1 (en) 2019-05-23 2022-01-20 Ac Immune Sa Anti-TDP-43 binding molecules and uses thereof
EP3986465A1 (en) 2019-06-18 2022-04-27 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften E. V. Site-specific, kinetically inert conjugation of labels and/or carriers to target molecules such as his-tagged proteins via metal complex reagents
WO2021099484A1 (en) 2019-11-20 2021-05-27 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Archaeal peptide recombinase – a novel peptide ligating enzyme
CA3164226A1 (en) 2019-12-11 2021-06-17 Cilag Gmbh International Multispecific binding molecules comprising ltbr and edb binding domains and uses thereof
JP2023536366A (ja) 2020-08-07 2023-08-24 エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー タンパク質組成物を製造するための方法
WO2022034228A1 (en) 2020-08-14 2022-02-17 Ac Immune Sa Humanized anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof
WO2022043517A2 (en) 2020-08-27 2022-03-03 Cureab Gmbh Anti-golph2 antibodies for macrophage and dendritic cell differentiation
EP4229082A1 (en) 2020-10-16 2023-08-23 AC Immune SA Antibodies binding to alpha-synuclein for therapy and diagnosis
EP4405396A2 (en) 2021-09-20 2024-07-31 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2023088959A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Ac Immune Sa Novel molecules for therapy and diagnosis
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
AR128540A1 (es) 2022-02-16 2024-05-22 Ac Immune Sa Moléculas de unión anti-tdp-43 humanizadas y usos de las mismas
WO2023194565A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules
WO2023220695A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2024184494A1 (en) 2023-03-08 2024-09-12 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6184205B1 (en) 1994-07-22 2001-02-06 University Of North Carolina At Chapel Hill GRB2 SH3 binding peptides and methods of isolating and using same
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
US7332585B2 (en) * 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The California University Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
GT200500155A (es) * 2004-06-16 2006-05-15 Terapia del càncer resistente al platino
SI1771482T1 (sl) * 2004-07-22 2014-12-31 Genentech, Inc. Sestavek HER2 protitelesa
CA2577405A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Genentech, Inc. Anti-fc-gamma riib receptor antibody and uses therefor
US9513296B2 (en) 2006-08-21 2016-12-06 Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich Specific and high affinity binding proteins comprising modified SH3 domains of Fyn kinase
EP1892248A1 (en) * 2006-08-21 2008-02-27 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Specific and high affinity binding proteins comprising modified SH3 domains of FYN kinase
EP2069401A4 (en) 2007-07-31 2011-02-23 Medimmune Llc MULTISPECIENT EPITOP BINDING PROTEINS AND THEIR USE
US8937161B2 (en) * 2007-10-19 2015-01-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-TENB2 antibodies and antibody drug conjugates
US20120270797A1 (en) * 2009-08-13 2012-10-25 Massachusetts Institute Of Technology Engineered proteins including mutant fibronectin domains
US9376477B2 (en) * 2009-08-27 2016-06-28 Covagen Ag IL-17 binding compounds and medical uses thereof
CN107337734A (zh) * 2009-12-04 2017-11-10 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 多特异性抗体、抗体类似物、组合物和方法
BR112012014194A2 (pt) 2009-12-14 2017-01-10 Scil Proteins Gmbh um método para identificar proteínas ubiquitinas modificadas hetero-multiméricas com capacidade de ligação a ligandos
CN107253992B (zh) * 2010-05-27 2022-03-11 根马布股份公司 针对her2的单克隆抗体
US20120100166A1 (en) * 2010-07-15 2012-04-26 Zyngenia, Inc. Ang-2 Binding Complexes and Uses Thereof

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CN104284675A (zh) 2015-01-14

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