JP2023536366A - タンパク質組成物を製造するための方法 - Google Patents

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Abstract

Figure 2023536366000001
本発明は、概して、タンパク質組成物を調製するための手段及び方法の提供に関する。本発明は、（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、（ｉｉ）前記タンパク質を含む組成物を回収する工程、を含む方法を提供する。更に、本発明は、（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、（ｉｉ）タンパク質を含む組成物を回収する工程を含む、タンパク質製剤を調製するための方法に関し、タンパク質製剤を調製するための該方法は、タンパク質を含む組成物に、界面活性剤、好ましくは脂肪酸エステルを添加することを更に含む。更に、本発明は、本明細書に記載の方法によって得られるか若しくは得ることができるタンパク質組成物及び／又は本明細書に記載の方法によって得られるか若しくは得ることができるタンパク質製剤に関する。

Description

本発明は、概して、タンパク質組成物を調製するための手段及び方法の提供に関する。本発明は、
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含む、方法を提供する。
更に、本発明は、タンパク質製剤を調製するための方法であって、
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含み、
タンパク質製剤を調製するための方法が、該タンパク質を含む組成物に、界面活性剤、好ましくは脂肪酸エステルを添加することを更に含む、方法に関する。
更に、本発明は、本明細書に記載の方法によって得られるか若しくはそれによって得ることができるタンパク質組成物及び／又は本明細書に記載の方法によって得られるか若しくはそれによって得ることができるタンパク質製剤に関する。
組換え生物医薬タンパク質（例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、抗体断片（Ｆａｂ）、複合体、抗体由来タンパク質及び融合タンパク質）は、通常、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞株において高い発現率で発現される（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：７００－７０７（非特許文献１））。これらのタンパク質の精製中、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の量は、薬物の臨床的又は市販されている適用について患者の安全性を保証するために、排除又は少なくとも十分に低減される必要がある（Ｖａｎｄｅｒｌａａｎ（２０１８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．３４：８２８－８３７（非特許文献２））。加水分解活性を有するＨＣＰは、界面活性剤の分解をもたらし得る（Ｌａｂｒｅｎｚ（２０１４）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０３：２２６８－２２７７（非特許文献３））。酵素起源の界面活性剤分解は、バイオ医薬品産業内の複数のバイオ医薬品製剤で観察されており、タンパク質凝集の界面活性剤媒介防止の減少及び／又は界面活性剤分解生成物の蓄積に起因して可視粒子形成をもたらし得る（Ｌａｂｒｅｎｚ（２０１４）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０３：２２６８－２２７７（非特許文献３）；Ｃａｏ（２０１５）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０４：４３３－４４６（非特許文献４）；Ｌａｒｓｏｎ（２０２０）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０９：６３３－６３９（非特許文献５）；Ｇｒａｆ（２０２０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．１５２：３１８－３２６（非特許文献６））。粒子及び／又は凝集体の形成は、貯蔵寿命の制限をもたらす。
最近の研究は、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）（Ｃｈｉｕ（２０１７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１４：１００６－１０１５（非特許文献７））、リソソームホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）（Ｈａｌｌ（２０１６）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０５：１６３３－１６４２（非特許文献８））及び推定ホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＬ ２）（Ｄｉｘｉｔ（２０１６）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０５：１６５７－１６６６（非特許文献９））を含む、バイオ医薬製剤における界面活性剤分解の増加に起因するいくつかの加水分解酵素を明らかにした。最も注目すべきことに、下流プロセシングに沿ったこれらの酵素の持続性は、それらの除去困難及び／又はｍＡｂ会合特性を繰り返し強調して示されている（Ｖａｌｅｎｔｅ（２０１４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１２：１２３２－１２４２（非特許文献１０）；Ｌｅｖｙ（２０１４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１１：９０４－９１２（非特許文献１１）；Ｔｒａｎ（２０１６）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ １４３８：３１－３８（非特許文献１２））。
リパーゼ等の加水分解酵素を含む個々のＨＣＰの選択的除去は、あまり理解されていない。ポリソルベート２０又は８０等の界面活性剤の分解に由来する脂肪酸を含有する凝集体／可視粒子の大部分が、（長期）貯蔵中に増加していることが観察された（Ｌａｂｒｅｎｚ（２０１４）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０３：２２６８－２２７７（非特許文献３）；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ（２０１５）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １２：３８０５－３８１５（非特許文献１３））。これは、ポリソルベート分解を開始する汚染を排除するための戦略の開発の引き金となった。安定性研究並びにリパーゼ活性アッセイに基づいて、精製中の洗浄及び／又はインキュベーション工程の性能をＨＣＰ除去について評価し、ポリソルベートを含有するタンパク質製剤の（長期）貯蔵試験中に粒子が生成されるという残留リスクが残っていることが分かった。例えば、国際公開第２０１６／０５７７３９号（特許文献１）は、リパーゼを減少させるために疎水性相互作用媒体を使用した。しかしながら、当該方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィーが分子特性（疎水性）の違いに依存するという欠点を伴う。このアプローチの適合性は、タンパク質の特性に応じて異なり得る。更に、タンパク質の疎水性及び適用される緩衝液条件に応じて、タンパク質はＨＩＣ樹脂に結合するか、又は生成物の潜在的な収率損失をもたらし得る。
したがって、タンパク質組成物における加水分解活性を低下させるための手段及び方法が必要とされている。
本発明の根底にある技術的課題は、タンパク質組成物の安定性を高めた／より高い安定性を有するタンパク質組成物を調製するため、及び／又はタンパク質組成物における加水分解活性を低下させるための手段及び方法を提供することである。技術的課題は解決され、上記の必要性は、特許請求の範囲において特徴付けられ、本明細書で以下に提供される実施形態の提供によって対処される。
国際公開第２０１６／０５７７３９号
Ｄｕｒｏｃｈｅｒ（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：７００－７０７ Ｖａｎｄｅｒｌａａｎ（２０１８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．３４：８２８－８３７ Ｌａｂｒｅｎｚ（２０１４）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０３：２２６８－２２７７ Ｃａｏ（２０１５）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０４：４３３－４４６ Ｌａｒｓｏｎ（２０２０）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０９：６３３－６３９ Ｇｒａｆ（２０２０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．１５２：３１８－３２６ Ｃｈｉｕ（２０１７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１４：１００６－１０１５ Ｈａｌｌ（２０１６）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０５：１６３３－１６４２ Ｄｉｘｉｔ（２０１６）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０５：１６５７－１６６６ Ｖａｌｅｎｔｅ（２０１４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１２：１２３２－１２４２ Ｌｅｖｙ（２０１４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１１：９０４－９１２ Ｔｒａｎ（２０１６）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ １４３８：３１－３８ Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ（２０１５）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １２：３８０５－３８１５
本発明は、
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含む、方法に関する。
添付の実施例に示すように、驚くべきことに、予想外にも、加水分解酵素阻害剤は、官能性を失うことなく固体担体上に固定化され得ることが見出された（すなわち、固定化された阻害剤は、加水分解酵素への結合を保持する）。これにより、加水分解酵素をタンパク質組成物から確実に除去することができる。
実施例１は、固定化加水分解酵素阻害剤オルリスタットＢがリソソームリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）と相互作用する能力を保持することを実証する。抗体溶液を組換えＬＰＬＡ２でスパイクし、続いて磁気ビーズ上に固定化されたオルリスタットＢと共にインキュベートした。インキュベーション後、ビーズをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析に供したところ、ビーズに対するＬＰＬＡ２の高い親和性が示された（図２Ｂ）。更に、ビーズ上に固定化されたオルリスタットＢと共にインキュベートした抗体溶液は、オルリスタットＢを含まない対照ビーズと共にインキュベートした抗体溶液と比較して、加水分解活性の顕著な減少を示すことが示された（図２Ａ）。この結果は、固定化されたオルリスタットＢとのインキュベーションにより、ＬＰＬＡ２が抗体溶液から除去されることを更に確認する。したがって、必ずしも科学理論に束縛されるものではないが、ビーズに共有結合していてもＬＰＬＡ２と共有結合を形成することができるオルリスタットＢが想定される。
実施例２は、より高い濃度の抗体溶液についてこの結果を確認する（図３）。これは、加水分解酵素の除去及び加水分解活性の低下が、組成物中の広範囲のタンパク質濃度について達成され得ることを示す。
実施例３は、抗体組成物（抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＲＧ６０２６としても知られるグロフィタマブ））の混合モード陰イオン交換（ＭＭＡＥＸ）負荷溶液について、実際に残存加水分解酵素活性があることを示す。固体担体上に固定化されたオルリスタットＢが、出発タンパク質組成物と比較して、回収されたタンパク質組成物中の加水分解酵素活性を低下させることができることが実証されている（図４）。それぞれの対照（リンカーを有するビーズ及び固定化されていないオルリスタットＢ／リンカーを有しないビーズ）と比較して加水分解酵素活性の低下もあり、加水分解酵素活性の低下に対する加水分解酵素阻害剤オルリスタットＢの特異的効果を実証している。更に、実施例３は、２つの異なる連結方法、すなわちアミンとＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化エステルとの間の反応を使用する方法、又はストレプトアビジンとビオチンの親和性を使用する方法のいずれかによって固定化された場合、オルリスタットＢが加水分解酵素に特異的に結合する能力を保持することを示す。したがって、加水分解活性の低下は、特定の固定化方法及び／又は目的の様々なタンパク質とは無関係に達成することができる。
実施例４は、トラスツズマブコンディショニング後プロテインＡ溶出プール中の固定化オルリスタットによる残留加水分解酵素活性の除去／減少を更に確認する（図５）。更に、実施例４はまた、加水分解酵素阻害剤オルリスタットＡを使用して抗体溶液から加水分解酵素を除去することができること、すなわち、加水分解酵素阻害剤自体を様々な固体担体（それぞれＮＨＳ活性化セファロースビーズ及びストレプトアビジンセファロースビーズ）上に固定化し、それらの結合活性を保持することができ、これを有利に使用して加水分解活性を低下させることができることを示す。
実施例５は、更に別の加水分解酵素阻害剤（ビス－エノール－エステル）を用いて、加水分解酵素に対する特異的結合活性を保持しながら固体担体への固定化を達成できることを確認する（図６）。実施例５は、加水分解酵素が実際に阻害剤に特異的に結合し、ビーズ材料に非特異的に結合しないことを更に確認する。
要約すると、異なる固体担体上に固定化された異なる阻害剤を有するいくつかの異なる出発抗体組成物から加水分解酵素を除去することができることが本発明によって例示される。上記組成物はまた、様々な抗体濃度を有する。全体として、これは、本発明が多種多様な条件下で有利に実施され得ることを実証している。
加水分解酵素は、それらのそれぞれの基質（例えば、医薬組成物のようなタンパク質製剤で日常的に使用される界面活性剤等の脂肪酸エステル／脂質）を分解し、それによって、界面活性剤が媒介するタンパク質凝集の防止の減少に起因して、及び／又は界面活性剤分解生成物の蓄積に起因して、（可視）粒子形成をもたらすことが知られている。したがって、本明細書では、本発明による加水分解活性の低下が、タンパク質製剤のより少ない粒子（複数可）（形成）及び／又は改善された安定性／溶解性をもたらすことが予想される。
１つの既知の分子、いわゆるオルリスタットは、脂質の加水分解に関連する酵素の大部分を阻害することができ、その結果、同様の化学的特性を有する界面活性剤を阻害することができる（Ｊａｈｎ（２０２０），Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３７：１１８）。この分子は、リパーゼの天然基質を模倣することができ、したがって活性部位での共有結合エステル結合の形成を介してリパーゼを捕捉することができる（Ｆａｋｏ（２０１４）ＡＣＳ Ｃａｔａｌ．４：３４４４－３４５３）。しかしながら、ほとんどのリパーゼ阻害剤は非極性化合物であり、有機溶媒中で添加しなければならないので、タンパク質組成物にオルリスタット又は他の阻害剤を単純に補充することは不可能である。特に、オルリスタットは水に非常に不溶性である。更に、これらの化学物質は、薬物の適用中に患者において有害事象を誘発する可能性があり、薬物の質に影響を及ぼす可能性がある。特にオルリスタットは、例えばタンパク質組成物と一緒に静脈内適用された場合に毒性であり得る。更に、オルリスタットと酵素との間のエステル結合は、タンパク質組成物の貯蔵中に加水分解され（酸触媒又は塩基触媒され）得て、活性酵素を再遊離させる。
加水分解酵素阻害剤（例えばオルリスタット）が添加されたタンパク質組成物の貯蔵中（すなわち、阻害剤は固体担体上に固定化されていない）、加水分解酵素阻害剤（例えばオルリスタット）は、タンパク質組成物中のタンパク質の濃度が高いため、例えばタンパク質のセリン残基（例えば、抗体）と非特異的かつ共有結合的に反応し得る。当該非特異的反応は、標的（すなわち、製品の有効性の低下）に対するタンパク質（例えば、抗体）の結合親和性を低下させ得、及び／又はタンパク質（すなわち、製品品質の低下）の（増加した）凝集をもたらし得る。
対照的に、タンパク質組成物を本発明による固定化加水分解酵素阻害剤と短時間だけ接触させる場合、当該非特異的反応は起こりにくい。固定化加水分解酵素阻害剤が工程（ｉ）（「タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程」）の間にタンパク質組成物中の目的のタンパク質と反応するまれな場合には、目的のタンパク質も固体担体に固定化され、回収されたタンパク質組成物中には存在しない。したがって、本明細書に記載の本発明の方法を使用することによって、加水分解酵素阻害剤（例えばオルリスタット）をタンパク質組成物に添加するときに生じる上述の欠点を回避又は最小化することができる（すなわち、標的に対する結合親和性が低下した（すなわち、製品の有効性が低下した）タンパク質（複数可）（例えば、抗体／抗体）、及び／又はタンパク質（複数可）（例えば、抗体／抗体）タンパク質の凝集（の増加）（すなわち、製品品質の低下）の存在）。
本発明の更なる利点として、加水分解活性の低下を、タンパク質製剤中に加水分解酵素阻害剤自体の存在なしに、及び／又はそのような加水分解酵素阻害剤（すなわち、阻害剤が固体担体に固定化されずに組成物に添加された場合）を除去する必要なしに達成することができる。
加水分解酵素阻害剤は、加水分解酵素に共有結合し得る。加水分解酵素阻害剤が固定化された固体担体は、本明細書に記載の方法、特にその工程（ｉ）を実施するために数回／繰り返し使用され得る。これは、例えば、以下で更に説明するように、工程（ｉ）が繰り返し実行される場合に有用であり得る。したがって、出発組成物は、例えば加水分解酵素の最大結合容量に達するまで、繰り返し／続いて同じ固体担体に供することができる。しかしながら、好ましい態様では、材料、すなわち加水分解酵素阻害剤が固定化された固体担体は、単回使用／利用のためのものである。当該材料の単回使用／利用は、例えばＧＭＰ（適正製造基準）認定及び／又は市販の精製プロセス／プラットフォームである精製プロセス／プラットフォームにおいて好ましい場合がある。しかしながら、基礎研究及び／又は学術研究のために、当該材料を２回又は複数回利用することができることが想定される。本明細書で使用される場合、２回又は複数回の当該材料の利用は、（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程が、固体担体上に固定化された同一の加水分解酵素阻害剤を用いて２回又は複数回行われることを意味する。当業者は、どのような状況下で、固定化された加水分解酵素阻害剤を有する固体担体を２回又は複数回利用することができるか、例えば、最初の利用（すなわち、タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程）後に加水分解酵素阻害剤分子が加水分解酵素と定量的に反応しなかった場合、すなわち、固体担体上に第２の又はその後の利用において加水分解酵素と反応することができる加水分解酵素阻害剤分子が依然として存在する場合を十分に認識している。言い換えれば、全ての加水分解酵素阻害剤分子が最初の利用（すなわち、タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程）後に加水分解酵素を吸着（結合）していない場合、材料、すなわち固定化された加水分解酵素阻害剤を有する固体担体は、２回又は複数回使用／利用され得る。これは、２回目以降の利用においても加水分解酵素が加水分解酵素阻害剤に吸着することができることを意味する。言い換えれば、第２の利用又はその後の利用において加水分解酵素分子を吸着することができる「遊離」（未結合）加水分解酵素阻害剤分子が依然として存在する。
上述のように、疎水性相互作用クロマトグラフィーによるＨＣＰの除去は、タンパク質製剤中のタンパク質の特性に依存し得る。対照的に、加水分解酵素阻害剤は、本加水分解酵素に対して直接標的化され、したがって一般に、タンパク質製剤中のタンパク質によって影響されないままである。したがって、本発明は、タンパク質製剤／組成物から特定の不純物を除去するために特定のリガンドを使用する。
以下では、本発明をより詳細に説明する。
更なる実施形態では、本発明は、以下の項目に関する：
１．
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、前記加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含む、方法。
２．タンパク質を含む組成物を調製するためのものである、項目１に記載の方法。
３．前記タンパク質を含む前記組成物が、例えば、リパーゼ活性アッセイ（ポリソルベートのためのリパーゼ酵素アッセイ（ＬＥＡＰ）のアッセイ）及び／又は質量分析による脂肪酸（ＦＡＭＳ）アッセイによって決定される場合、前記出発組成物と比較して加水分解活性が低下している、及び／又は前記出発組成物と比較して加水分解酵素の含有量が低下している、項目１又は２に記載の方法。
４．前記出発組成物における加水分解活性を低下させるため、及び／又は前記出発組成物中の加水分解酵素の含有量を低下させるためのものである、項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
５．前記出発組成物が、加水分解酵素（複数可）を更に含む、及び／又は加水分解活性を更に有する、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
６．前記タンパク質組成物が、前記出発組成物から加水分解酵素を除去することによって、及び／又は前記出発組成物中の加水分解酵素の含有量を低下させることによって調製される、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
７．前記工程（ｉ）が、前記加水分解酵素を前記加水分解酵素阻害剤に吸着させる工程（ａ）を更に含む、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
８．タンパク質を含む前記組成物が、タンパク質を含む溶液である、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
９．前記溶液が水溶液である、項目８に記載の方法。
１０．前記溶液が緩衝溶液である、項目８又は９に記載の方法。
１１．前記加水分解酵素が、エステラーゼ（複数可）及び／又はアミダーゼ（複数可）である、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．前記エステラーゼ（複数可）が、カルボン酸エステル加水分解酵素（複数可）及び／又はチオエステラーゼ（複数可）である、項目１１に記載の方法。
１３．前記カルボン酸エステル加水分解酵素（複数可）がリパーゼ（複数可）である、項目１２に記載の方法。
１４．前記加水分解酵素（複数可）が、リポタンパク質リパーゼ、パルミトイルプロテインチオエステラーゼ、酸性セラミダーゼ、脂肪酸シンターゼのＣ末端ドメイン、推定ホスホリパーゼｂ様２、リソソーム酸リパーゼ、及びリソソームホスホリパーゼからなる群から選択される、項目１～１２のいずれか一項に記載の方法。
１５．前記固定化された阻害剤が、オルリスタット又はビス－エノール－エステルからなる群から選択される、項目１～１４のいずれか一項に記載の方法。
１６．前記固体担体が、セファロース、ポリスチレン、及びスマートポリマーからなる群から選択される、項目１～１５のいずれか一項に記載の方法。
１７．前記阻害剤が、アジド基とアルキン基との反応を介して固体担体上に固定化される、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
１８．前記阻害剤が、ビオチン基へのストレプトアビジン基の結合を介して固体担体上に固定化される、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
１９．前記阻害剤が、アミノ基とＮ－ヒドロキシスクシンイミド基との反応を介して固体担体上に固定化される、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
２０．前記阻害剤が、式（１）、（２）、（３）、若しくは（４）：
Figure 2023536366000002
Figure 2023536366000003
、好ましくは式（１）、（２）、若しくは（４）を含むか又はそれからなる化合物をアジドと反応させることによって得ることができる基である、項目１～１９のいずれか一項に記載の方法。
２１．前記工程が、以下の順序：工程（ｉ）及びそれに続く工程（ｉｉ）で行われる、項目１～２０のいずれか一項に記載の方法。
２２．工程（ｉ）の前及び／若しくは後、並びに／又は工程（ｉｉ）の前及び／若しくは後に、タンパク質調製及び／又は精製の工程を更に含む、項目１～２１のいずれか一項に記載の方法。
２３．工程（ｉ）が、アフィニティークロマトグラフィーの後、好ましくはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの後に行われる、項目１～２２のいずれか一項に記載の方法。
２４．前記タンパク質が抗体である、項目１～２３のいずれか一項に記載の方法。
２５．前記抗体がモノクローナル抗体である、項目２４に記載の方法。
２６．前記抗体が、ヒト抗体又はヒト化抗体である、項目２４又は２５に記載の方法。
２７．前記タンパク質が、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＩＬ１３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、抗ＶＥＧＦ－Ａ／ＡＮＧ２抗体、抗ＣＤ７９ｂ抗体、抗ＳＴ２抗体、抗Ｄ因子抗体、抗ＩＸ因子抗体、抗Ｘ因子抗体、抗ａベータ抗体、抗ｔａｕ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗ＣＥＡ／ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０／ＣＤ３抗体、抗ＦｃＲＨ５／ＣＤ３抗体、抗Ｈｅｒ２／ＣＤ３抗体、抗ＦＧＦＲ１／ＫＬＢ抗体、ＦＡＰ－４－１ ＢＢＬ融合タンパク質、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ融合タンパク質、オクレリズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、トシリズマブ、ファリシマブ、ポラツズマブ、ガンテネルマブ、シビサタマブ、クレネズマブ、モスネツズマブ、チラゴルマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、アテゾリズマブ、オビヌツズマブ、ランパリズマブ、レブリキズマブ、オマリズマブ、ラニビズマブ、エミシズマブ、セリクレルマブ、プラシネズマブ、グロフィタマブ、シムルカフスプアルファ、及びＲＧ７８２７である、項目１～２６のいずれか一項に記載の方法。
２８．タンパク質製剤を調製するための方法であって、項目１～２７のいずれか一項に記載の方法の工程を含み、前記組成物に、界面活性剤、好ましくは脂肪酸エステルを添加することを更に含む、方法。
２９．タンパク質製剤を調製するための方法であって、項目１～２７のいずれか一項に記載の方法によって得られるか又は得ることができる前記組成物に、界面活性剤、好ましくは脂肪酸エステルを添加することを更に含む、方法。
３０．前記タンパク質製剤が、可視粒子及び／又はサブビジブル粒子を（本質的に）含まない、項目２８又は２９に記載の方法。
３１．前記タンパク質製剤が、推奨される貯蔵条件下で少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間、少なくとも３６ヶ月間、又は少なくとも６０ヶ月間安定である、項目２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
３２．前記脂肪酸エステルが、ポリオキシエチレンソルビタン又はイソソルビド脂肪酸モノ－、ジ－若しくはトリ－エステルである、項目２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
３３．前記脂肪酸エステルがポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウレートである、項目２８～３２のいずれか一項に記載の方法。
３４．前記脂肪酸エステルが、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６１、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８１、ポリソルベート８５、若しくはポリソルベート１２０、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、項目２８～３２のいずれか一項に記載の方法。
３５．前記脂肪酸エステルが、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０である、項目２８～３２のいずれか一項に記載の方法。
３６．前記界面活性剤が、モノアシルグリセロール若しくはジアシルグリセロール、糖類－脂肪酸エステル、又はα－トコフェリルポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スクシネートである、項目２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
３７．前記脂肪酸エステルの分解が２４ヶ月以内に２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満である、項目２８～３６のいずれか一項に記載の方法。
３８．抗体濃度が、少なくとも１ｍｇ／ｍｌかつ最大２５０ｍｇ／ｍｌである、項目２６～３７のいずれか一項に記載の方法。
３９．緩衝剤、添加物、希釈剤、安定剤、及び／又は担体を、前記組成物に添加することを更に含む、項目２８～３８のいずれか一項に記載の方法。
４０．前記タンパク質製剤が医薬組成物である、項目２８～３９のいずれか一項に記載の方法。
４１．前記タンパク質を含む前記組成物及び／又は前記タンパク質製剤が、加水分解酵素阻害剤を本質的に含まない、項目１～４０のいずれか一項に記載の方法。
４２．項目１～２７のいずれか一項に記載の方法によって得られるか又は得ることができる、タンパク質組成物。
４３．項目２８～４１のいずれか一項に記載の方法によって得られるか又は得ることができる、タンパク質製剤。
４４．薬品として使用するための、又は医薬において使用するための、項目４３に記載のタンパク質製剤。
４５．タンパク質組成物及び／又はタンパク質製剤を調製するための、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤の使用。
４６．タンパク質組成物及び／又はタンパク質製剤における加水分解活性を除去又は低減するための、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤の使用。
４７．タンパク質組成物及び／又はタンパク質製剤中の不純物、特に宿主細胞タンパク質、好ましくは加水分解酵素（複数可）を、除去又は（その含有量を）低減するための、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤の使用。
４８．タンパク質組成物及び／又はタンパク質製剤中の可視粒子及び／若しくはサブビジブル粒子（の形成）並びに／又は界面活性剤分解物の発生／存在を阻害又は低減するための、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤の使用。
更に、本発明は以下の態様に関する：
１．方法であって、
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、前記加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含む、方法。
２．タンパク質を含む前記組成物が、前記出発組成物と比較して減少した加水分解活性を有する、項目１に記載の方法。
３．前記タンパク質組成物が、前記出発組成物から加水分解酵素を除去することによって調製される、項目１又は２に記載の方法。
４．前記加水分解酵素が、エステラーゼ（複数可）及び／又はアミダーゼ（複数可）であり、好ましくは、前記エステラーゼが、カルボン酸エステル加水分解酵素（複数可）及び／又はチオエステラーゼ（複数可）である、項目３に記載の方法。
５．前記エステラーゼがリパーゼ（複数可）である、項目４に記載の方法。
６．前記加水分解酵素（複数可）が、リポタンパク質リパーゼ、パルミトイルプロテインチオエステラーゼ、酸性セラミダーゼ、脂肪酸シンターゼ、推定ホスホリパーゼｂ様２、リソソーム酸リパーゼ、及びリソソームホスホリパーゼからなる群から選択される、項目３のいずれか一項に記載の方法。
７．前記固定化された阻害剤が、オルリスタット又はビス－エノール－エステルからなる群から選択される、項目１～６のいずれか一項に記載の方法。
８．前記阻害剤が、式（１）、（２）、（３）、若しくは（４）：
Figure 2023536366000004
Figure 2023536366000005
、好ましくは式（１）、（２）、若しくは（４）を含むか又はそれからなる化合物をアジドと反応させることによって得ることができる、項目１～７のいずれか一項に記載の方法。
９．工程（ｉ）の前及び／又は後に、タンパク質調製及び／又は精製の工程を更に含む、項目１～８のいずれか一項に記載の方法。
１０．工程（ｉ）が、アフィニティークロマトグラフィーの後、好ましくはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの後に行われる、項目１～９のいずれか一項に記載の方法。
１１．前記タンパク質が抗体である、項目１～１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．タンパク質製剤を調製するための方法であって、項目１～１１のいずれか一項に記載の方法の工程を含み、前記組成物に、界面活性剤、好ましくは脂肪酸エステルを添加することを更に含む、方法。
１３．前記タンパク質製剤が、可視粒子及び／又はサブビジブル粒子を（本質的に）含まない、項目１２に記載の方法。
１４．前記脂肪酸エステルが、ポリオキシエチレンソルビタン又はイソソルビド脂肪酸モノ－、ジ－若しくはトリ－エステルである、項目１２又は１３に記載の方法。
１５．項目１～１１のいずれか一項に記載の方法によって得られるか又は得ることができる、タンパク質組成物。
上述のように、本発明は、
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、前記加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含む、方法に関する。
本明細書で使用される場合、「タンパク質を含む出発組成物」という用語は、一般に、「目的のタンパク質」を含む組成物を指す。これに関連して、「タンパク質」という用語は「目的のタンパク質」を指す。「目的のタンパク質」は、典型的には、細胞培養／培養細胞から得られ、細胞培養／培養細胞から単離及び／又は精製されるタンパク質であり、例えば、商業、医薬、診断及び／又は治療目的及び／又は科学的研究のためのものである。「目的のタンパク質」という用語は、典型的には、目的の１つの特異的タンパク質、例えば抗原Ａに結合する特異的抗体を指す。しかしながら、「目的のタンパク質」という用語はまた、１つ以上の異なる「目的のタンパク質」、例えば２つ以上の異なる目的のタンパク質（例えば、抗原Ａに結合する１つの抗体及び抗原Ｂに結合する第２の抗体）を指すことができる。更に、以下で更に説明するように、「出発組成物」は、「目的のタンパク質」に加えて、１つ以上の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含み得る。
「タンパク質」という用語の意味は当技術分野で周知であり、したがって本発明に関連して使用される。特に、本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、本発明によれば、所与の長さのアミノ酸鎖を包含し、アミノ酸残基が共有結合性ペプチド結合によって連結されているタンパク質又はポリペプチドを意味する。典型的には、「タンパク質」は、少なくとも２０個の連続したアミノ酸、及び最大３５００個の連続したアミノ酸の長さを有する。タンパク質はモノマーであり得る。「タンパク質」という用語には、二量体、三量体、四量体等の多量体を形成するタンパク質も含まれ、このような多量体はホモ又はヘテロ多量体であり得る。したがって、本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、単量体タンパク質で構成されるそのような多量体（多量体タンパク質）であり得る。目的の例示的なタンパク質／タンパク質は、本明細書において以下に更に記載される。
本明細書で使用される場合、「タンパク質を含む出発組成物」（又は同様に、「タンパク質を含む初期組成物」）という用語は、具体的には、細胞培養物又は培養細胞からの抽出物であって、タンパク質（目的のタンパク質）を産生する当該細胞培養物若しくは培養細胞、又はタンパク質（目的のタンパク質）を産生するために使用される当該細胞培養物若しくは培養細胞を指すことを意味する。抽出物は、粗抽出物であってもよく、又は精製された抽出物であってもよい（精製された抽出物は、１つ以上の精製工程に供されている）。したがって、「タンパク質を含む出発組成物」は、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー又は陽イオン交換クロマトグラフィー）、限外濾過／ダイアフィルトレーション、ウイルス濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー／マルチモーダルクロマトグラフィー（例えば、混合モードイオン交換クロマトグラフィー）、並びにそれらの任意の組み合わせ等の１つ以上の従来の精製工程に既に供されていてもよい。
本明細書で提供される方法は、実質的に任意の「タンパク質を含む組成物」（いかなる不純物も全く又は微量しか含まない高度に精製された組成物であっても）に使用することができるが、本明細書で使用される場合、「タンパク質を含む出発組成物」は、通常、当該タンパク質／目的のタンパク質を産生するために使用される細胞培養物／培養細胞からの少なくとも１つの不純物、すなわちタンパク質／目的のタンパク質が得られる／調製される細胞培養物／培養細胞からの少なくとも１つの不純物を含むことが理解される。不純物は、１つ以上の宿主細胞タンパク質、具体的には加水分解活性を有するタンパク質（加水分解酵素）であり得る。
例えば、タンパク質を含む出発組成物は、細胞培養物中で増殖して当該目的のタンパク質を産生する細胞をホモジナイズ溶液中でホモジナイズすることによって調製され得る。タンパク質を含む出発組成物は、細胞培養中にタンパク質が直接分泌される場合、細胞培養上清であってもよい。したがって、タンパク質を含む出発組成物は、回収細胞培養液（ＨＣＣＦ）であり得る。ＨＣＣＦは、細胞、細胞残屑及び／又は凝集体から（濾過によって）分離された組成物であり、例えば、ＨＣＣＦは、コンディショニング及び／又は濾過（例えば、細胞培養物から調製された組成物又は細胞培養上清の濾過によって）後に得られる。本明細書の出発組成物は、好ましくは、回収細胞培養液（ＨＣＣＦ）である。濾過後にＨＣＣＦとなる組成物は、プレ回収細胞培養液（ＰＨＣＣＦ）と称され得る。言い換えれば、コンディショニング及び／又は濾過の前の組成物（例えば、細胞培養物又は細胞培養上清から調製される）は、回収細胞培養液（ＰＨＣＣＦ）と称される。
タンパク質を含む出発組成物は、細胞培養物中で増殖して目的のタンパク質を産生する当該細胞をホモジナイズした直後に、加水分解酵素阻害剤と接触され得る。しかしながら、タンパク質を含む出発組成物が、タンパク質を含む当該組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる前に、１つ以上の精製工程に供されることも本明細書で想定される。そのような精製工程の非限定的な例を本明細書で以下に記載する。
本発明によれば、「タンパク質を含む出発組成物」は、「タンパク質を含む出発組成物」を加水分解酵素阻害剤と接触させることを含む（更なる）精製に供され、加水分解酵素阻害剤は固体担体上に固定化される（本方法の工程（ｉ））。
その工程の後、更なる工程が実施され（方法の工程（ｉｉ））、すなわち「タンパク質を含む組成物を回収する」、すなわち「タンパク質を含む組成物」が回収される。より簡単に言えば、更なる工程は「タンパク質の回収」である。これに関連して、「タンパク質」という用語は、上で定義した「目的のタンパク質」を指す。言い換えれば、出発組成物に含まれる目的のタンパク質はまた、回収された組成物中の目的のタンパク質であるか、又は回収された目的のタンパク質である。また、本明細書では、その組成物を「回収された組成物」と呼び、そのタンパク質を「回収されたタンパク質」と呼ぶ。
「タンパク質を含む出発組成物」を、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤と接触させることが理解される。言い換えれば、「タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該当該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程」という用語は、「出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、当該組成物がタンパク質を含み、当該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程」を意味する。
加水分解酵素阻害剤は、接触工程の前に、すなわち本方法の工程（ｉ）の前に固体担体上に固定化され得ることが想定される。言い換えれば、加水分解酵素阻害剤は、タンパク質を含む出発組成物と接触させる前に、固体担体上に固定化され得る（固体担体に付着され得る）。本明細書において、加水分解酵素阻害剤は、接触工程の前に固体担体上に固定化されることが理解される。言い換えれば、加水分解酵素阻害剤は、タンパク質を含む出発組成物と接触させる前に、固体担体上に固定化される（固体担体に付着され得る）。
したがって、本発明は、好ましい態様では、
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤と接触させる工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含む、方法に関する。
言い換えれば、本発明は、好ましい態様では、
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤は、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤である、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含む、方法に関する。
「タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる」ことによって、上記の不純物、例えば１つ以上の宿主細胞タンパク質（複数可）、具体的には、出発組成物中に存在する場合、加水分解活性を有するタンパク質（加水分解酵素）（複数可）が除去されるか、又は「タンパク質を含む出発組成物」と比較して「回収された組成物」中で少なくともその含有量が減少することが理解される。本明細書では、宿主細胞タンパク質、具体的には加水分解活性を有するタンパク質（加水分解酵素）（複数可）が出発組成物中に存在することが好ましい。
上述のように、「タンパク質を含む組成物を回収すること」という用語は、「タンパク質を回収すること」と同義に使用され得る。したがって、この方法は、タンパク質を含む組成物を調製すること（又は同様に得ること）を目的とする。これに関連して、「タンパク質を含む組成物」は、通常、本方法の工程（ｉｉ）に従って回収された組成物である。
したがって、本発明は、タンパク質を含む組成物を調製するための、又は得るための方法であって、
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、前記加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含む、方法を提供する。
したがって、「タンパク質を含む組成物」は、通常、工程（ｉ）及び（ｉｉ）（また任意に、上記で説明したように、工程（ｉ）及び（ｉｉ）の繰り返し）が実施される場合に調製又は得られる。しかしながら、この方法はまた、「タンパク質を含む組成物」を調製又は得るために、工程（ｉ）の前及び／又は工程（ｉｉ）の後及び／又は工程（ｉ）と（ｉｉ）の間に追加の工程（例えば、従来の精製）を含み得る。上記で説明したように、工程（ｉ）及び（ｉｉ）が繰り返される場合、同じ説明及び定義が適用される。
また、本明細書において上で論じられているように、本発明の方法の目的は、出発組成物における加水分解活性（存在する場合）を除去若しくは低減すること、及び／又は不純物（存在する場合）、特に宿主細胞タンパク質、好ましくは出発組成物中の加水分解酵素（複数可）の含有量を除去若しくは低減することである。したがって、一態様では、「タンパク質を含む組成物」は、出発組成物と比較して加水分解活性が低下しており、及び／又は出発組成物と比較して、不純物（存在する場合）、特に宿主細胞タンパク質、好ましくは加水分解酵素（複数可）の含有量が低下している。本明細書で説明されるように、工程（ｉ）及び（ｉｉ）が繰り返される場合、同じ説明及び定義が適用される。本明細書では、加水分解活性が出発組成物中に存在すること、及び／又は不純物が出発組成物中に存在すること、特に宿主細胞タンパク質、好ましくは加水分解酵素（複数可）が出発組成物中に存在することが好ましい。
したがって、一態様では、本発明は、
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、前記加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含む方法を提供し、
タンパク質を含む組成物（回収された組成物）は、出発組成物と比較して減少した加水分解活性を有し、
及び／又は、タンパク質を含む組成物（回収された組成物）は、出発組成物と比較して、不純物、特に宿主細胞タンパク質、好ましくは加水分解酵素（複数可）の含有量が減少している。
これに関連して、出発組成物が加水分解活性を有すること、及び／又は出発組成物が不純物、特に宿主細胞タンパク質、好ましくは（１又は複数の）加水分解酵素を有する／含むことが理解される。言い換えれば、上で定義した加水分解活性及び／又は不純物が、好ましくは出発組成物中に存在する。出発組成物中の上記で定義したような加水分解活性及び／又は不純物の存在は、当技術分野で公知のアッセイ及び／又は本明細書に開示及び提供されるアッセイによって決定することができる。加水分解活性を測定、決定又は定量するための非限定的な例は、リパーゼ活性を検出するアッセイ、又は言い換えれば、本明細書ではＬＥＡＰ（多塩基のためのリパーゼ酵素アッセイ）アッセイ（Ｊａｈｎ（２０２０）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３７：１１８）と呼ばれるリパーゼ活性アッセイ（例えば、Ｊａｈｎ ｅｔ ａｌ．によって記載される）、及び／又は質量分析による脂肪酸（ＦＡＭＳ）アッセイ（Ｈｏｎｅｍａｎｎ（２０１９）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ １１１６：１－８；Ｃｈｅｎｇ（２０１９）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０８：２８８０－２８８６）である。このようなアッセイを使用して、加水分解活性の低下を決定することもできる。
タンパク質の存在又は量を決定するために、免疫凝集、免疫沈降（例えば、免疫拡散、免疫電気泳動、免疫固定）、ウェスタンブロッティング技術（例えば、（ｉｎ ｓｉｔｕ）免疫組織化学、（ｉｎ ｓｉｔｕ）免疫細胞化学、アフィニティークロマトグラフィー、酵素イムノアッセイ）等の日常的な方法を本明細書で使用することができる。タンパク質を接触させるこれら及び他の適切な方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｖｏｌ．２，３ｒｄ ｅｄｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにも記載されている。定量は、上記の技術、特にウェスタンブロッティング技術を利用することによって行うことができる。一般に、当業者は、タンパク質の定量方法を知っている。溶液中の精製タンパク質の量は、物理的方法、例えば測光法によって決定することができる。混合物中の特定のタンパク質を定量する方法は、特異的結合、例えば抗体に依存する。抗体の特異性を利用する特異的検出及び定量方法は、例えば免疫組織化学（ｉｎ ｓｉｔｕ）を含む。ウェスタンブロッティングは、電気泳動によるタンパク質の混合物の分離と、抗体による特異的検出とを組み合わせる。電気泳動は、２Ｄ電気泳動等の多次元であってもよい。通常、ポリペプチドは、二次元電気泳動において、一次元に沿った見かけの分子量及び他の方向に沿った等電点によって分離される。
以下で更に説明するように、所与の組成物、例えば出発組成物が、上で定義したように加水分解活性を有し、及び／又は不純物を有し／含むことを決定するための間接的なパラメータは、（例えば、界面活性剤分解物の不溶分に起因する）可視粒子及び／若しくはサブビジブル粒子の発生／存在並びに／又はそれ自体の界面活性剤分解物の発生／存在である。同様に、（例えば、界面活性剤分解物の不溶分に起因する）可視粒子及び／若しくはサブビジブル粒子並びに／又は界面活性剤分解物自体の発生／存在の減少は、所与の組成（好ましくはタンパク質を含む組成物（回収された組成物））が出発組成物と比較して加水分解活性が低下している、及び／又は本明細書で定義される不純物の含有量が低下していることを決定するための間接的なパラメータである。
（例えば、（例えば、界面活性剤分解物の不溶分に起因する）可視粒子及び／若しくはサブビジブル粒子の発生／存在、並びに／又はそれ自体の界面活性剤分解物の発生／存在の）決定は、所与の組成物（例えば、出発組成物及び／又はタンパク質を含む組成物（回収された組成物））の貯蔵、例えば以下で更に説明されるような長期条件下での貯蔵を含み得る。例えば、所与の組成物が、開始時に（例えば、界面活性剤分解物の不溶分に起因する）可視粒子及び／若しくはサブビジブル粒子の発生／存在並びに／又は界面活性剤分解物等の発生／存在を示さないが、貯蔵後にそれを示す場合、開始時の所与の組成物が加水分解活性を有し、及び／又は上で定義した不純物を有する／含むことが示される。
これは、例えば、その組成物が阻害剤と接触していない場合、基準点として本明細書で使用される「出発組成物」における加水分解活性及び／又は不純物の存在を決定するために使用することができる。阻害剤（すなわち、タンパク質を含む組成物（回収された組成物））と接触させた「出発組成物」と比較することによって、接触させた組成物（すなわち、タンパク質を含む組成物（回収された組成物））が、基準出発組成物（したがって、「出発組成物」）と比較して、加水分解活性が低下しているかどうか、及び／又は本明細書で定義される不純物の含有量が低下しているかどうかを評価することができる。
「加水分解活性」という用語の意味は当技術分野で周知であり、それに応じて本発明の文脈で使用され、以下で更に詳細に説明される。
「加水分解酵素阻害剤」は、本明細書では最も広い意味で使用され、加水分解活性を有する別の分子を阻害する分子を指し得る。加水分解活性及び加水分解酵素の定義は、本明細書において以下に提供される。加水分解酵素の非限定的な例も本明細書において以下に提供される。加水分解酵素阻害剤は、酵素に結合することによって酵素を阻害し得る。加水分解酵素阻害剤は、酵素の活性部位に結合し得る。加水分解酵素阻害剤は、酵素と共有結合を形成し得る。対応する酵素と共有結合を形成し、本発明との関連で使用される加水分解酵素阻害剤の非限定的な例は、オルリスタット及びビス－エノール－エステルである。
以下は、本発明に従って提供され、使用される「加水分解酵素阻害剤」に関する。「加水分解酵素阻害剤」及び「加水分解酵素阻害剤」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
「加水分解酵素阻害剤」及び「加水分解酵素の阻害剤」という用語は、本発明との関連で、特に、加水分解酵素の生理学的活性を完全に又は部分的に防止又は低減することができる化合物を意味する。「アンタゴニスト」又は「阻害剤」という用語は、本明細書では互換的に使用される。本明細書では、「加水分解酵素阻害剤」が加水分解酵素の選択的阻害剤であることが想定される。
したがって、本発明との関連において、当該阻害剤は、例えば当該化合物／物質（すなわち、アンタゴニスト／阻害剤）が当該加水分解酵素に結合すると、該加水分解酵素の生理学的活性を防止、低減、阻害又は不活性化し得る。本明細書で使用される場合、「アンタゴニスト」という用語はまた、とりわけＭｕｔｓｃｈｌｅｒ，’’Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｗｉｒｋｕｎｇｅｎ’’（１９８６），Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｂＨ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙに記載されているように、競合アンタゴニスト、（可逆的）非競合アンタゴニスト又は不可逆的アンタゴニストを包含する。そのような阻害は、基質ターンオーバーを決定することによって測定することができる。
要約すると、本明細書に記載の加水分解酵素アンタゴニスト／阻害剤は、したがって、加水分解酵素活性の減少又は低下をもたらす。
本明細書では、加水分解酵素の拮抗薬は加水分解酵素を標的とし、具体的には加水分解酵素の活性部位（例えば触媒三残基）を標的とすることが想定され、好ましい。「標的化」という用語は、これに関連して、加水分解酵素（及びここでは特に加水分解酵素の活性部位）への（特異的）結合、及び／又は加水分解酵素の活性の阻害、特に加水分解活性の阻害を指す。
アンタゴニストは、小分子薬物（複数可）、又は（小）結合分子であり得る。
本明細書で使用される阻害剤は、小分子薬物（複数可）であり得る。「小分子薬物」及び「小分子化合物」という用語は、本明細書では互換的に使用される。（Ａ）本明細書で加水分解酵素の阻害剤として使用される小分子薬物は、（有機）低分子量（＜９００ダルトン）化合物を指すことができる。小分子は、生物学的プロセスを調節するのを助けることができ、通常、１０－９ｍ程度のサイズを有する。本明細書で使用されるアンタゴニストは、小分子（薬物）と同様に、例えば、化合物ライブラリー、例えばＥｎａｍｉｎｅ、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ又はＰｒｅｓｔｗｉｃｋ化学ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することができる。
阻害剤は、好ましくは加水分解酵素の選択的阻害剤である。
選択性は、所与の化合物濃度で酵素（又はタンパク質）が異なる程度に影響を受けるという生物学的事実を表す。酵素の場合、選択的阻害は、所与の濃度の化合物による好ましい阻害として定義することができる。言い換えれば、濃度がある場合、酵素（又はタンパク質）は別の酵素（又はタンパク質）よりも選択的に阻害され、その結果、第１の酵素（又はタンパク質）の阻害がもたらされるが、第２の酵素（又はタンパク質）は影響を受けないか、又は実質的に影響を受けない。異なる酵素に対する化合物の効果を比較するために、蛍光エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイ、Ｐｌｕｓアッセイ、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）アッセイ、サーモシフトアッセイ、生物学的読み出し（Ｃｘｃｌ１／ＣＸＣＬ８等のレポータータンパク質／酵素）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、又は化学プロテオミクス等の同様のアッセイ形式を使用することが重要である。例えば、ＥＬＩＳＡキットスキャンのような市販の検査キットが使用される。
本明細書で使用される阻害剤は、好ましくは加水分解酵素に対して選択的であり、すなわち化合物は加水分解酵素を選択的に阻害する。言い換えれば、加水分解酵素阻害剤／拮抗アンタゴニスト剤は、好ましくは選択的加水分解酵素阻害剤／アンタゴニストである。
本明細書で使用される場合、「選択的加水分解酵素阻害剤」という用語は、別のタンパク質又は酵素、特に別の酵素（すなわち、特に、加水分解酵素ではない別のタンパク質又は酵素）に対する実質的な阻害又は拮抗作用を示すことなく、加水分解酵素を阻害又はそれに対して拮抗作用を示す、本明細書で定義される加水分解酵素阻害剤（特に小分子薬物）を指す。
したがって、加水分解酵素に選択的な加水分解酵素阻害剤は、別のタンパク質又は酵素（すなわち、特に、加水分解酵素ではない別のタンパク質又は酵素）の阻害又は拮抗作用に関して、約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２０倍、５０倍超又は約１００倍超の加水分解酵素選択性を示す。加水分解酵素に選択的な加水分解酵素阻害剤は、タンパク質を含む組成物中の目的のタンパク質に対して約１０．０００倍を超える加水分解酵素選択性を示し得る。
例えば、汎加水分解酵素阻害剤（ｐａｎ－ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）（すなわち、実質的に任意の加水分解酵素を広く阻害する化合物）（例えばオルリスタット）を本発明との関連で使用することができる。汎加水分解酵素阻害剤は、本明細書で定義される選択的加水分解酵素阻害剤であり得る。例えば、オルリスタットは、他のタンパク質（すなわち、特に非加水分解酵素、特に非リパーゼと比較して、）と比較して、加水分解酵素、特にリパーゼに非常に優先的に結合するが、オルリスタットは異なるリパーゼと反応／阻害することができる。
「選択的加水分解酵素阻害剤」という用語は、異なる加水分解酵素（例えば、異なるリパーゼ）と反応／阻害することができるので、阻害剤が非常に特異的であることを必ずしも意味しない。非常に特異的な阻害剤は、他の全てのタンパク質を区別しながら、単一の酵素（単一の加水分解酵素）とのみ反応する。（高度に）特異的な加水分解酵素阻害剤（すなわち、阻害剤は、他の全てのタンパク質を区別しながら、単一の酵素（単一の加水分解酵素）とのみ反応／阻害する）の使用も本明細書で想定される。本明細書で定義される（高度に）特異的な加水分解酵素阻害剤は、本明細書で定義される選択的な加水分解酵素阻害剤であり得、逆もまた同様であることが本明細書で想定される。
更に、加水分解酵素阻害剤／アンタゴニストは、好ましくは強力な加水分解酵素阻害剤／アンタゴニストである。
「加水分解酵素に対する効力」は、ＩＣ５０値によって決定又は定義することもできる。例えば、加水分解酵素に対する加水分解酵素阻害剤のＩＣ５０値は低く、好ましくは０．２μＭ未満、より好ましくは０．１５μＭ、０．１４μＭ、０．１３μＭ、０．１２μＭ未満、又は更に低い。より好ましくは、ＩＣ５０値は、０．１μＭ、０．０９５μＭ、０．０９０μＭ、０．０８５μＭ、０．０８０μＭ、０．０７５μＭ、０．０７０μＭ、０．０６５μＭ、０．０６０μＭ、０．０５５μＭ、０．０５０μＭ、０．０４５μＭ、０．０４０μＭ、０．０３５μＭ、０．０３０μＭ未満、又は０．０２５μＭ未満であり、より低い値がより高い値よりも好ましい。更により好ましくは、ＩＣ５０値は、０．０２４μＭ、０．０２３μＭ、０．０２２μＭ、０．０２１μＭ、０．０２０μＭ、０．０１９μＭ、０．０１８μＭ、０．０１７μＭ、０．０１６μＭ、０．０１５μＭ、０．０１４μＭ、０．０１３μＭ、０．０１２μＭ又は０．０１１μＭ未満である。ＩＣ５０値は更に低くてもよく、例えば、０．０１０μＭ、０．００９μＭ、０．００８μＭ、０．００７μＭ、０．００６μＭ又は０．００５μＭ未満であってもよい。一般に、本明細書では、より低い値がより高い値よりも好ましい。
本発明による強力な加水分解酵素阻害剤は、加水分解酵素に関するＩＣ５０値の代わりに、又はそれに加えて、別のタンパク質又は酵素に関するＩＣ５０値によって定義することができる。
例えば、別のタンパク質又は酵素に関連する強力な加水分解酵素阻害剤のＩＣ５０値は高く、好ましくは０．００１μＭ、０．００２μＭ、０．００３μＭ、０．００４μＭ、０．００５μＭ、０．００６μＭ、０．００７μＭ、０．００８μＭ、０．００９μＭ又は０．０１０μＭより高い。より好ましくは、ＩＣ５０値は、０．０１１μＭ、０．０１２μＭ、０．０１３μＭ、０．０１４μＭ、０．０１５μＭ、０．０１６μＭ、０．０１７μＭ、０．０１８μＭ、０．０１９μＭ、０．０２０μＭ、０．０２１μＭ、０．０２２μＭ、０．０２３μＭ、又は０．０２４μＭよりも高い。更により好ましくは、ＩＣ５０値は、０．０２５μＭ、０．０３０μＭ、０．０３５μＭ、０．０４０μＭ、０．０４５μＭ、０．０５０μＭ、０．０５５μＭ、０．０６０μＭ、０．０６５μＭ、０．０７０μＭ、０．０７５μＭ、０．０８０μＭ、０．０８５μＭ、０．０９０μＭ、０．０９５μＭ、０．１μＭよりも高いか、又は更に高く、より高い値がより低い値よりも好ましい。更により好ましくは、ＩＣ５０値は、０．１２μＭ、０．１３μＭ、０．１４μＭ、０．１５μＭ、０．２μＭよりも高いか、又は更に高い。
本明細書では、好ましくは同じアッセイに従って決定される、加水分解酵素に対する別のタンパク質又は酵素のＩＣ５０値に対する、加水分解酵素に対する強力な加水分解酵素阻害剤のＩＣ５０値の比は、約１：１０以下であることが好ましい。１：１０以下の比は、加水分解酵素に対する阻害剤の効力も示す。より好ましいのは、１：１０、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０又は１：１００又は更に低い比である。
「加水分解酵素」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、加水分解活性を有する分子／化合物を指す。したがって、一般に、「加水分解酵素」は、化学結合を加水分解する酵素である。例えば、「加水分解酵素」は、誘導された遊離酸を最終生成物として有するカルボン酸由来エステル切断酵素である。あるいは、加水分解酵素は、加水分解酵素活性、すなわち、水分子を使用することによって共有結合を切断する酵素である。「加水分解酵素」の非限定的な例は、リパーゼ、エステラーゼ、チオエステラーゼ、ホスホリパーゼ又はセラミダーゼである。
「加水分解活性」は、当技術分野で知られているように本明細書で使用される場合、化学結合を加水分解する能力を指す。加水分解は、水分子が求核剤として作用する化学結合の切断を指す。好ましくは、加水分解活性を有する分子／化合物は、加水分解活性を有するタンパク質又はポリペプチドである。したがって、加水分解活性を有するタンパク質又はポリペプチドは、加水分解活性を有する酵素である。したがって、加水分解酵素は、好ましくは加水分解活性を有する酵素である。加水分解酵素は、エステラーゼ又はアミダーゼであり得る。
「エステラーゼ」という用語は当技術分野で周知であり、本発明と関連して、エステル結合の加水分解を触媒して酸及びアルコールを生成する酵素を指す。言い換えると、エステラーゼはエステル結合に作用し得る。エステラーゼは、アセチルエステラーゼ、ホスファターゼ、ヌクレアーゼ、チオエステラーゼ、及びカルボン酸エステル加水分解酵素を含む酵素の多様なカテゴリーである。好ましくは、本発明と関連して、加水分解酵素は、チオエステラーゼ又はカルボン酸エステル加水分解酵素である。チオエステラーゼは、チオエステルを加水分解してチオールと酸とにするために水分子を使用する。カルボン酸エステル加水分解酵素は、水分子を用いてカルボン酸エステルをアルコールとカルボン酸塩に加水分解する。最も好ましくは、加水分解酵素／エステラーゼ（カルボン酸エステル加水分解酵素等）はリパーゼである。リパーゼは、トリグリセリド、脂肪及び油を含む脂肪酸エステル／脂質の脂肪酸及びアルコール頭部基への加水分解を触媒する。
「アミダーゼ」という用語は当技術分野で周知であり、本発明と関連して、アミド結合の加水分解を触媒する酵素を指す。すなわち、アミド結合には、アミダーゼが作用し得る。
好ましくは、本発明による加水分解酵素（複数可）は、リポタンパク質リパーゼ（受託番号：Ｇ３Ｈ６Ｖ７）、パルミトイルプロテインチオエステラーゼ１（受託番号：Ｇ３ＨＮ８９）、酸性セラミダーゼ（受託番号：Ｇ３ＧＺＢ２）、脂肪酸シンターゼのＣ末端ドメイン（受託番号：Ｇ３ＧＸＤ７）、推定ホスホリパーゼｂ様２（受託番号：Ｇ３Ｉ６Ｔ１）、リソソーム酸リパーゼ（受託番号：Ｇ３ＨＱＹ６）及び／又はリソソームホスホリパーゼである。より好ましくは、本発明による（１つ以上の）加水分解酵素は、リポタンパク質リパーゼ、推定ホスホリパーゼｂ様２、及び／又はリソソームホスホリパーゼである。これは、組成物中の（可視）粒子の形成及び／又は組成物の安定性の低下に起因する、ポリソルベート等の界面活性剤に対するそれらの記述された加水分解活性のためである。最も好ましくは、本発明による加水分解酵素は、リソソームホスホリパーゼ、具体的にはリソソームホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）（受託番号：Ｇ３ＨＫＶ９）である。
これは、タンパク質を含む出発組成物から除去される（又はその含有量が減少する）加水分解酵素（複数可）が、リポタンパク質リパーゼ、パルミトイルプロテインチオエステラーゼ、酸性セラミダーゼ、脂肪酸シンターゼ（特にそのＣ末端ドメイン）、推定ホスホリパーゼｂ様２、リソソーム酸リパーゼ、及びリソソームホスホリパーゼからなる群から選択され得ることを意味する。したがって、加水分解酵素阻害剤に結合している加水分解酵素（複数可）は、リポタンパク質リパーゼ、パルミトイルプロテインチオエステラーゼ、酸性セラミダーゼ、脂肪酸シンターゼ、推定ホスホリパーゼｂ様２、リソソーム酸リパーゼ、及びリソソームホスホリパーゼからなる群から選択され得る。
「固体担体上に固定化された」という用語は、加水分解酵素阻害剤が固体担体に結合していることを意味する（「固体担体」及び「固相」という用語は本明細書では互換的に使用される）。言い換えると、加水分解酵素阻害剤は固体担体に結合している。固体担体の非限定的な例を以下に提供する。加水分解酵素阻害剤と固体担体との間の結合は、共有結合及び／又は非共有結合であり得る。好ましくは、結合は共有結合である。加水分解酵素阻害剤が固体担体上にどのように固定化され得るかの非限定的な例は、本明細書において以下及び添付の実施例に記載される。
「タンパク質を含む組成物を回収する」とは、タンパク質を含む組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させた後に回収することを意味する。したがって、「タンパク質を含む出発組成物」は、その組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる前のタンパク質を含む組成物である。「タンパク質を含む組成物」は、その組成物（ここでは「出発組成物」）を加水分解酵素阻害剤と接触させた後のタンパク質を含む組成物である（そして「タンパク質を含む組成物」は、タンパク質を含む回収された組成物である）。
例えば、工程（ｉ）及び（ｉｉ）を、以下のように実施することができる：
この方法は、固体担体（又は固相）を提供する工程であって、担体がそれに固定化された加水分解酵素阻害剤を含む工程と、出発組成物を加水分解酵素阻害剤と（又は阻害剤が固定化された固体担体と）接触させる工程とを含む第１の工程（ス工程（ｉ））を含むことができる。次いで、加水分解酵素は加水分解酵素阻害剤に結合するが、残りのタンパク質（又はその少なくとも大部分）、特に目的のタンパク質は阻害剤に結合せず、（例えばフロースルーから）収集することができる（又は加水分解酵素よりも低い程度に結合する）。
この方法は、－タンパク質を含む組成物を回収するために（工程（ｉｉ））－いくつかの洗浄工程を実施することを更に含むことができ、少なくとも１つの洗浄工程は、固体担体及び／又は阻害剤に結合した不純物（宿主細胞タンパク質、例えば加水分解酵素）を保持しながら、阻害剤／担体に結合した可能性がある目的のタンパク質の少なくとも一部を固体担体及び／又は阻害剤から分離することができる洗浄緩衝液を使用して実施される。任意に、本方法は、タンパク質が阻害剤／担体に結合した可能性がある場合に、固体担体及び／又は阻害剤に結合した不純物（宿主細胞タンパク質、例えば加水分解酵素）を保持しながら、固体担体及び／又は阻害剤から当該タンパク質（の少なくとも一部）を分離することができる溶出緩衝液を使用して目的のタンパク質を得ることを含み得る。
上で論じられるように、タンパク質を含む組成物は、タンパク質を含む出発組成物と比較して加水分解活性が低下していることが本明細書で想定される。
したがって、一態様では、本発明は、
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、前記加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含む方法に関し、タンパク質を含む組成物は、出発組成物と比較して減少した加水分解活性を有する。
したがって、本発明は、一態様では、タンパク質を含む組成物を調製するための、又は得るための方法であって、
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、前記加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含む方法に関し、タンパク質を含む組成物は、出発組成物と比較して減少した加水分解活性を有する。
タンパク質を含む組成物（回収された組成物）は、タンパク質を含む出発組成物と比較して加水分解活性が低下している可能性があり、その理由は、加水分解酵素（複数可）が、タンパク質を含む出発組成物から除去されている、及び／又は加水分解酵素（複数可）の含有量が、出発組成物において減少しているためである。
タンパク質を含む出発組成物と比較した加水分解活性の低下は、もちろん、出発組成物が加水分解活性を有することを意味する。同様に、タンパク質を含む出発組成物と比較した加水分解酵素（複数可）の含有量の減少は、もちろん、出発組成物が加水分解酵素（複数可）を含むことを意味する。
したがって、本明細書に記載の方法では、タンパク質を含む出発組成物は、加水分解活性を有し得、及び／又は１つ以上の加水分解酵素を含み得る。
したがって、本発明の方法は、タンパク質を含む出発組成物の加水分解活性を決定する工程及び／又はタンパク質を含む組成物（回収された組成物）の加水分解活性を決定する工程を含むことができる。両方の工程が実施される場合（すなわち、タンパク質を含む出発組成物及びタンパク質を含む組成物（回収された組成物）の両方の加水分解活性が決定される場合）、タンパク質を含む組成物（回収された組成物）が出発組成物と比較して減少した加水分解活性を有するかどうかを容易に決定することができる。
一態様では、タンパク質を含む出発組成物の加水分解活性を決定する工程（のみ）が実施される場合、及び出発組成物が加水分解活性を有しないと決定される場合、特許請求の範囲の工程（ｉ）（及び工程（ｉｉ））は実施されない。
一態様では、タンパク質を含む出発組成物の加水分解活性を決定する工程（のみ）が実施される場合、及び出発組成物が加水分解活性を有すると決定される場合、特許請求の範囲の工程（ｉ）（及び工程（ｉｉ））が実施される。
同じ説明が、タンパク質を含む出発組成物が１つ以上の加水分解酵素を含むという上記の態様に準用される。
加水分解酵素の存在の指標は、特に、加水分解酵素を含まないことが確認されている組成物／製剤と比較した場合、基質（例えばインタクト脂肪酸エステル、例えばポリソルベート）の（増加した）分解及び／又はタンパク質組成物／製剤中の遊離脂肪酸含有量の（同時の）増加である。そのような分解が判定された場合、この方法を実行する必要性が最初に示される。しかしながら、この方法は、一般に取り外し困難なＨＣＰに対する追加のクリアランス工程として使用することができる。
当業者は、加水分解活性をどのように測定、決定又は定量することができるかをよく知っている。
加水分解活性を測定、決定又は定量するための非限定的な例は、リパーゼ活性を検出するアッセイ、又は言い換えれば、本明細書ではＬＥＡＰ（多塩基のためのリパーゼ酵素アッセイ）アッセイ（Ｊａｈｎ（２０２０）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３７：１１８）とも呼ばれるリパーゼ活性アッセイ（例えば、Ｊａｈｎ ｅｔ ａｌ．によって記載される）、及び／又は質量分析による脂肪酸（ＦＡＭＳ）アッセイ（Ｈｏｎｅｍａｎｎ（２０１９）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ １１１６：１－８；Ｃｈｅｎｇ（２０１９）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０８：２８８０－２８８６）である。加水分解活性の測定、決定又は定量を可能にするアッセイの非限定的な例は、４－メチルウンベリフェロンカプリル酸（４－ＭＵＣＡ）の４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）への変換を測定するリパーゼ活性アッセイ（又は言い換えれば脂肪分解活性を検出するアッセイ）である。基質として４－ＭＵＣＡを使用するアッセイは、以下に記載されるように実施され得る。
加水分解活性を決定するタンパク質を含む１０μＬの組成物を、８０μＬの反応緩衝液（１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．２５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び０．１２５％（ｗ／ｖ）アラビアガム）及び１０μＬの４－ＭＵＣＡ基質（ＤＭＳＯ中１ｍＭ）と混合することができる。反応は、９６ウェルハーフエリアのポリスチレンプレート（蓋付き黒色透明平底、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）にセットアップされ得、蛍光シグナル（３５５ ｎｍで励起、４６０ ｎｍで発光）の増加は、４－ＭＵ産生速度を導出するために、例えばＩｎｆｉｎｉｔｅ ２００ Ｐｒｏプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において３７℃で２時間反応プレートをインキュベートすることによって１０分毎にモニターされ得る。タンパク質を含む組成物の４－ＭＵ産生速度は、タンパク質を含む出発組成物と比較され得る。
以下の段落は、ＦＡＭＳアッセイを実施するための例示的な試料調製及び分析手順を記載する。ＦＡＭＳアッセイは、ポリソルベート２０の加水分解による遊離脂肪酸の蓄積を定量することによってリパーゼ活性を測定する。
全ての試料（抗体溶液及び緩衝液対照）に、１％（ｗ／ｖ）超精製ポリソルベート２０（Ｃｒｏｄａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）及び０．２５ＭＬ－メチオニン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｒｔ．Ｎｏ．Ｍ５３０８）のストック溶液を補充して、試料当たり０．０４％（ｗ／ｖ）超精製ポリソルベート２０及び０．０１ＭＬ－メチオニンの最終濃度を得ることができる。各スパイク試料について、１９０μＬのアリコートを、試料のインキュベーションに使用することができる５つのキャップ付きガラスバイアル（ｔ０、ｔ１、ｔ２、ｔ３、ｔ４と呼ばれる）に移すことができる。ガラスバイアルｔ０は、分析までそれらの調製後直ちに－７０℃で凍結され得る。ガラスバイアルｔ１、ｔ２、ｔ３及びｔ４を２５℃で直立状態でインキュベートし、インキュベータ内で光から保護することができる。ガラスバイアルのインキュベーションは、次の５日から１４日間にわたって一度に１つずつ停止してもよく、その後、分析までガラスバイアルを－７０℃で凍結してもよい。
分析のために、凍結試料を１時間周囲温度にすることができる。安定同位体標識脂肪酸のストック溶液は、５０ ｍｇのそれぞれの脂肪酸、ラウリン酸２ｄ２３（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号第４５１４０１号）及びミリスチン酸１３Ｃ１４（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号第６０５６８９号）を５０ｍＬの８０％アセトン／２０％メタノールメタノールに溶解して、各調査脂肪酸について１μｇ／ｍＬの最終濃度を有する沈殿試薬を得ることによって調製することができる。試料溶液５０μＬを反応管中の沈殿試薬２００μＬに添加し、ボルテックスによって混合し、室温で１時間保持してタンパク質を沈殿させることができる。沈殿物を、２０℃、１５，０００×ｇで１５分間の遠心分離によってスピンダウンすることができる。１００μＬの上清を新しい反応管に移し、１００μＬの移動相Ａ（２０ｍＭ酢酸アンモニウム）と混合することができる。１５，０００×ｇを用いて２０℃で１５分間スピンダウンした後、５０～１００μＬの溶液をＬＣ－ＭＳバイアル（３００μｌの固定インサートバイアル（透明、ねじ蓋式）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号０３－ＦＩＳＶ）に移してもよい。
遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の分離は、Ｊｕｐｉｔｅｒ（登録商標）Ｃ４ ＲＰカラム（３００Å、２×５０ｍｍ、５μｍ）（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カタログ番号００Ｂ－４１６７－Ｂ０）を使用することにより、温度制御可能なオートサンプラー及びカラム区画を備えたＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓシステム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国マサチューセッツ州ミルフォード）で達成することができる。移動相Ａは２０ｍＭ酢酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号第７３５９４号）であり得、移動相Ｂは１００％メタノール（メルク、カタログ番号１．０６００７．２５００）であり得、これを以下の勾配を適用することによって０．４ｍＬ／分の流量で４分間実行し得る。初期条件：７０％移動相Ｂ、０．５分～３．４分：勾配は７０％から８５％移動相Ｂまで直線的に変化し得る；３．５～４．０分：７０％移動相Ｂ。オートサンプラーを２０℃に維持し、カラムコンパートメントを６０℃に維持することができる。注入量は８μＬに設定することができる。検出を、負イオンモードの外部バッキングポンプを備えた接続されたＱＤａ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ）で行うことができる。ＭＳ設定は、コーン電圧１５Ｖ、ソース温度１２０℃、キャピラリー電圧８００Ｖ、プローブ温度６００℃、質量範囲５０～１０００ｍ／ｚ及びサンプリング周波数２Ｈｚであり得る。全ての試料を三重反復で分析することができる。
データ評価は、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアバージョン４．１（ＳＣＮ７８１）（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国マサチューセッツ州ミルフォード）の一部としてＴａｒｇｅｔＬｙｎｘを用いて実行することができる。ラウリン及びミリスチンの含有量は、以下の式：
Figure 2023536366000006
を使用して、脂肪酸のピーク面積をそれぞれの内部標識標準と比較することによって決定することができ、式中、ＦＦＡのΣピーク面積及び内部標準のΣピーク面積は、それぞれ＋１／＋２又は－１／－２における単同位体ピーク及び同位体ピークの合計を指す。
脂肪酸放出速度を決定するために、各試料の遊離脂肪酸濃度をインキュベーション時間に対してプロットすることができ、分解速度を線形回帰の勾配から抽出することができる。
タンパク質を含む組成物の加水分解活性は、タンパク質を含む出発組成物と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％、例えば２０から最大８０％、好ましくは５０から最大８０％低下し得る。逆に、タンパク質を含む組成物の加水分解活性は、タンパク質を含む出発組成物と比較して、最大５％、最大１０％、最大２０％、最大３０％、最大４０％、最大５０％、最大６０％、最大７０％、最大８０％、最大９０％、最大９５％又は最大９９％、好ましくは最大２０％、より好ましくは最大５０％、更により好ましくは最大８０％低下し得る。組成物が本明細書で提供される方法による１つ以上の精製に供される場合、以下で更に説明するように、本明細書で定義される減少％は、好ましくは基準点としての（初期、最初）出発組成物、すなわち本明細書に記載の加水分解酵素阻害剤と接触していない出発組成物を指す。
もちろん、タンパク質を含む組成物における加水分解活性は、使用されるアッセイ（後者の場合、加水分解活性及び／又は加水分解酵素（複数可）は、本明細書の出発組成物から「除去された」、又はより正確には「完全に除去された」とみなされる）の検出限界未満のレベルまで低下することも想定される。
本発明はまた、タンパク質を含む組成物が出発組成物と比較して減少した加水分解活性を有し、加水分解活性が、例えば（例えば、Ｊａｈｎ ｅｔ ａｌ．によって記載されるように）本明細書に記載のアッセイ（例えば、本明細書ではＬＥＡＰアッセイ（Ｊａｈｎ（２０２０）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．３７：１１８）と呼ばれるリパーゼ活性アッセイ及び／又は質量分析による脂肪酸（ＦＡＭＳ）アッセイ）の１つによって決定され得る、タンパク質を含む組成物を調製又は得るための方法に関する。
同様に、組成物は、出発組成物と比較して減少した含量の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、例えば加水分解酵素を含み得る。例えば、ＨＣＰ含有量は、出発組成物と比較して、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％減少し得る。例えば、組成物は、好ましくは１００ｐｐｍ未満、より好ましくは１０ｐｐｍ未満、より好ましくは１ｐｐｍ未満、より好ましくは０．１ｐｐｍ未満、最も好ましくは０．０１ｐｐｍ未満のＨＣＰを含む。
本明細書に記載の方法は、タンパク質を含む出発組成物が、加水分解活性を測定又は定量するために使用されるアッセイにおいて検出可能な加水分解活性を示さない場合にも使用できることが理解されよう。科学理論に必ずしも束縛されるものではないが、タンパク質を含む組成物において使用されるアッセイの検出限界未満である加水分解活性も、タンパク質を含む組成物に悪影響を及ぼし得ることが想定される。当該悪影響は、タンパク質を含む組成物の長期保存中にのみ明らかになり得る。当該悪影響は、界面活性剤、例えば脂肪酸エステル、エステル又はチオエステルの分解であり得、本明細書でより詳細に説明される。
タンパク質を含む生成／回収された組成物は、加水分解活性を本質的に含まないことも本明細書で想定される。
したがって、本発明は、
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、前記加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含む方法に関し、該タンパク質を含む組成物は加水分解活性を本質的に含まない。
更に、本発明は、タンパク質を含む組成物を調製するための又は得るための方法であって、
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、前記加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含む方法に関し、該タンパク質を含む組成物は加水分解活性を本質的に含まない。
本明細書で使用される場合、「加水分解活性を本質的に含まない」とは、タンパク質を含む組成物における加水分解活性が、加水分解活性を測定又は定量するために使用されるアッセイの検出限界付近又はそれ未満であることを意味し得る。本明細書で使用される場合、「加水分解活性を本質的に含まない」はまた、タンパク質を含む組成物の加水分解活性が、タンパク質を含む出発組成物と比較して８０％、９０％、９５％又は９９％低下することを意味し得る。
本明細書で使用される場合、「本質的に加水分解活性を有しない」はまた、タンパク質を含む組成物が、例えば４℃～８℃で２４ヶ月間、例えば少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間、少なくとも３６ヶ月間、又は少なくとも６０ヶ月間、好ましくは本明細書に記載の標準的な長期条件下で保存された場合に、タンパク質を含む組成物中のエステル（複数可）の１０％未満が分解されることを意味し得る。組成物は、０．０１％（ｗ／ｖ）～２％（ｗ／ｖ）の範囲の本明細書に記載のタンパク質濃度、本明細書に記載の緩衝系、本明細書に記載の添加剤及び本明細書に記載の界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０）を含み得る。
分解は、ＥＬＳＤ／ＣＡＤ検出（Ｌｉｐｐｏｌｄ（２０１７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．１３２：２４－３４）又はいわゆる蛍光ミセルアッセイ（ＦＭＡ（Ｌｉｐｐｏｌｄ（２０１７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．１３２：２４－３４）に連結した混合モードＨＰＬＣによって残りの界面活性剤含有量を決定することによって監視することができる。また、ＦＡＭＳアッセイを使用して、主な分解産物（例えば、ＰＳ２０の場合はラウリン酸及びミリスチン酸、ＰＳ８０の場合はオレイン酸）を直接モニタリングすることができる（Ｈｏｎｅｍａｎｎ（２０１９）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ １１１６：１－８；Ｃｈｅｎｇ（２０１９）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０８：２８８０－２８８６）。
上記のアッセイの使用及び適合は、十分に当業者の技能の範囲内である。
本明細書に記載の方法は、加水分解活性を低下させるために、及び／又はタンパク質を含む出発組成物中の加水分解酵素の含有量を低下させるために使用され得ることが理解されよう。
したがって、本発明はまた、一態様では、
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、前記加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含む方法に関し、該方法は、出発組成物における加水分解活性を低下させるためのものである。
更に、本発明は、一態様では、タンパク質を含む組成物を調製するための、又は得るための方法であって、
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、前記加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含む方法に関し、該方法は、出発組成物における加水分解活性を低下させるためのものである。
加水分解活性及び／又は加水分解酵素の含有量をどのように減少させることができるか、及び対応する減少をどのように決定することができるかは、上記で詳細に記載されている。
したがって、本発明はまた、一態様では、タンパク質組成物から加水分解酵素を除去する及び／又はタンパク質組成物中の加水分解酵素の含有量を減少させる方法を提供する。
一般に、「タンパク質組成物」及び「タンパク質を含む組成物」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
言い換えれば、本発明は、一態様では、タンパク質を含む組成物が、タンパク質を含む出発組成物から加水分解酵素を除去することによって、及び／又は出発組成物中の加水分解酵素（複数可）の含有量を減少させることによって調製される方法に関する。したがって、本発明は、一態様では、タンパク質を含む組成物が、タンパク質を含む出発組成物から加水分解酵素を除去することによって調製される方法であって、
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、前記加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含む、方法。
したがって、本明細書に記載の方法では、タンパク質を含む出発組成物は、１つ以上の加水分解酵素を含み得る。
本明細書に記載の方法は、加水分解酵素を加水分解酵素阻害剤に吸着させる工程を更に含み得る。したがって、本発明は、一態様では、
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、前記加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含む方法に関し、当該工程（ｉ）は、加水分解酵素を加水分解酵素阻害剤に吸着させる工程（ａ）を更に含む。「吸着」は、本明細書では最も広い意味で使用され、加水分解酵素が加水分解酵素阻害剤と会合することを意味する。言い換えれば、加水分解酵素は、加水分解酵素阻害剤に結合する。加水分解酵素と加水分解酵素阻害剤とは、非共有結合を介して会合してもよいし、共有結合を介して会合してもよい。非共有結合の例は、水素架橋、イオン相互作用及び疎水性相互作用である。好ましくは、加水分解酵素と加水分解酵素阻害剤は共有結合を介して会合する。共有結合は、エステル、チオエステル又はホスホエステルであってもよい。
オルリスタットのβ－ラクトン部分は、加水分解酵素のセリンとエステル結合を形成することが想定される。
タンパク質を含む組成物（回収された組成物）は、タンパク質を含む溶液であり得ることが更に想定される。また、タンパク質を含む出発組成物は、タンパク質を含む溶液であり得る。
タンパク質を含む当該溶液は水溶液であり得る。
タンパク質を含む当該溶液は緩衝溶液であり得る。したがって、タンパク質を含む当該水溶液も緩衝溶液であり得る。
溶液を緩衝するための緩衝剤としてどの薬剤を使用できるかは、当技術分野で周知である。「緩衝液」という用語は、当技術分野で知られているように本明細書で使用され、溶液のｐＨを安定化する薬剤を指す。緩衝剤は、一般に、弱酸及びそのコンジュゲート塩基、又は弱塩基及びそのコンジュゲート酸を含む。当業者は、例えば特定のタンパク質の最適ｐＨをどのように決定することができるか、及び当該最適ｐＨを安定化するためにどの緩衝液を使用することができるかを知っている。緩衝剤として使用することができる薬剤の非限定的な例は、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、Ｐｉｐｅｓ、Ｍｏｐｓ、アセテート及びホスフェートである。
上記のように、方法は、タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させることを含み得る。加水分解酵素阻害剤並びに加水分解酵素阻害剤の非限定的な例を本明細書に記載する。更に、加水分解酵素阻害剤は、オルリスタット又はビス－エノール－エステル、ホスホネート、例えばα－アミノアルキルホスホネート又はパラ－ニトロフェニルホスホネート（例えば、メチル４－ニトロフェニルウンデカ－１０－エニルホスホネート）（Ｄｅｌｏｒｍｅ（２０１４）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ １０７：１２４－１３４）からなる群から選択され得る。
既に上述したように、加水分解酵素阻害剤は、固体担体に固定化／結合され得る。「固体担体」及び「固相」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
固体担体は樹脂であってもよく、カラムの形態、例えば市販の樹脂／カラムであってもよい。固相は、例えば樹脂であってもよく、典型的にはカラムの形態であり、それ自体市販されている。本発明による方法におけるカラムの使用は、容易にアップスケーラブルであるため好ましい。加水分解酵素阻害剤は加水分解酵素に共有結合するので、そのようなカラムは単回使用であり得る。したがって、カラムを再生する必要がない。固体担体に固定化された加水分解酵素阻害剤を含むそのようなカラムは、例えば、同等のプロセス工程で使用される疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）用のカラムよりも小さい体積を有することが想定される（ＨＩＣカラムは、典型的には約２０Ｌの体積を有する）。固体担体に固定化された加水分解酵素阻害剤を含むカラムの体積は、約２５０ｍｌ～最大約５ｌの間であってもよく、例えば、約２５０ｍｌ～約５Ｌ、約２５０ｍｌ～約４Ｌ、約２５０ｍｌ～約３Ｌ、約２５０ｍｌ～約２Ｌ、約２５０ｍｌ～約１．５Ｌ、約２５０ｍｌ～約１Ｌであってもよく、又は約５００ｍｌ～約５Ｌ、約５００ｍｌ～約４Ｌ、約５００ｍｌ～約３Ｌ、約５００ｍｌ～約２Ｌ、約５００ｍｌ～約１．５Ｌ、約５００ｍｌ～約１Ｌ、例えば、約５００ｍｌ、約１Ｌ、約１．５Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ又は約５Ｌであってもよい。好ましくは、固体担体に固定化された加水分解酵素阻害剤を含むカラムの体積は、約５００ｍｌ～約１．５Ｌ、より好ましくは約５００ｍｌ～約１Ｌである。最も好ましくは、固体担体に固定化された加水分解酵素阻害剤を含むカラムの体積は、約５００ｍｌ、約６００ｍｌ、約７００ｍｌ、約８００ｍｌ、約９００ｍｌ、約１Ｌ、約１．１Ｌ、約１．２Ｌ、約１．３Ｌ、約１．４Ｌ又は約１．５Ｌである。約５００ｍｌ又は約１Ｌの固体担体に固定化された加水分解酵素阻害剤を含むカラムの体積が特に好ましい。
しかしながら、固体担体がビーズの形態又は膜の形態であることも可能である。例えば、固体担体が当該阻害剤を含むビーズの形態である場合、この方法は、接触及び遠心分離、デカント及び溶解による回収の工程を実施することを含み得る。回収工程（洗浄工程を含み得る）中に磁気ビーズ及び磁気分離を使用することも可能である。当業者は、親和性精製のための異なるプロセスに精通しており、本発明による方法における使用のためにそのようなプロセスを容易に適合させることができる。
固体担体は、セファロース、ポリスチレン、無機金属及び／又は金属－ヘテロ原子粒子（例えば、Ｆｅ３Ｏ４、ＳｉＯ２又はＦｅＳ粒子）、金粒子、銀粒子、及びスマートポリマーからなる群から選択され得る。固体担体が磁気ビーズの形態であり、この方法を実施するときに磁気分離を使用することも可能である。当業者は、親和性精製と関連して一般的に使用される異なるプロセスに精通しており、本発明による方法で使用するためにそのようなプロセスを容易に適合させることができる。
当業者は、どのようにして加水分解酵素阻害剤を固体担体上に固定化することができるかをよく知っているが、非限定的な例を以下に提供する。一般に、加水分解酵素阻害剤は、官能基の結合及び／又は生体分子／リガンド結合を介して固体担体上に固定化することができる。
以下の説明、並びに加水分解酵素阻害剤に関する本明細書の上記の説明は、必要な変更を加えて、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤を調製するための方法、例えば、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤を含むデバイス（カラム等）を調製するための方法にも適用される。固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤を調製するための（又は固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤を含むデバイス（カラム等）を調製するための）そのような方法は、本発明の一態様と明確に考えられる。固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤（複数可）及び／又は固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤を含むデバイス（カラム等）も本発明の一態様である。逆に、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤を含むデバイス（カラム等）の調製に関する本明細書の説明及び定義、並びにそのようなデバイスは、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤及び／又はそれを調製するための方法にも準用される。加水分解酵素阻害剤が本発明による固体担体上に固定化されるべきである場合、本明細書で説明される加水分解酵素阻害剤の誘導体が使用されるべきであることが理解される。
加水分解酵素阻害剤は、アジド基とアルキン基との反応を介して固体担体上に固定化され得る。当該反応は、アジド－アルキンヒュスゲン環化付加反応であり得る。アルキン基は加水分解酵素阻害剤に結合していてもよく、アジド基は固体担体に結合していてもよい。しかしながら、アルキン基を固体担体に結合させ、アジド基を加水分解酵素阻害剤に結合させることも可能である。
したがって、アジド修飾磁性粒子（ポリスチレン系アジドビーズ；ＣＬＫ－１０３６－１、Ｊｅｎａ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に加水分解酵素阻害剤を固定化してもよい。アジド基及びアジド基という用語は、本明細書では互換的に使用される。
更に、加水分解酵素阻害剤は、ストレプトアビジン基とビオチン基との結合を介して固体担体上に固定化されてもよい。ストレプトアビジン基は加水分解酵素阻害剤に結合していてもよく、ビオチン基は固体担体に結合していてもよい。好ましくは、ストレプトアビジン基は固体担体に結合し、ビオチン基は加水分解酵素阻害剤に結合していてもよい。
更に、加水分解酵素阻害剤は、アミノ基とＮ－ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルとの反応を介して固体担体上に固定化され得る。アミノ基は加水分解酵素阻害剤に結合していてもよく、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルは固体担体に結合している。しかしながら、アミノ基を固体担体に結合させ、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルを加水分解酵素阻害剤に結合させることも可能である。当業者には明らかであるが、加水分解酵素阻害剤又は固体担体は、リンカーを介して上記の反応性基から分離され得ることに留意されたい。リンカーは、本明細書において以下に記載される。
当業者には明らかであるが、上記の固体担体上に加水分解酵素阻害剤を固定化する手段及び方法を組み合わせることができることに留意されたい。例えば、リンカーによって分離されたアジド基及びビオチン基を含む薬剤が、最初にクリックケミストリーを介してアルキン基を含む加水分解酵素阻害剤にカップリングされることが想定される。続いて、当該薬剤に連結された加水分解酵素阻害剤を、ストレプトアビジン基を含む固体担体上に固定化する。当業者は、どのリンカーが適切であり得るかを十分に認識している。そのようなリンカーは、複合体形成を促進し、及び／又は加水分解酵素阻害剤と固体担体との間に規定の距離を確立し得る。リンカーは、原則として、固体担体上の加水分解酵素阻害剤を所望の距離で共有結合させるのに適した任意の化学結合であり得る。当業者は、環境に対する結合の耐性及び意図される使用の条件に関して必要に応じてリンカーを選択することができる。リンカーは、例えば、ＰＥＧ又はバイオポリマー、例えばＤＮＡ／ＬＮＡ、ポリスガー（例えば、キトサン又は誘導体）、マレイミドアルカンリンカー、化学的に切断可能なリンカー（例えば、ヒドラジン／ジスルフィドリンカー）又は酵素的に切断可能なリンカー（例えばＶａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣリンカー）を含み得る。ＰＥＧリンカーは、ＰＥＧ３又はＰＥＧ４であり得る。好ましい実施形態では、ＰＥＧリンカーによって分離されたアジド基及びビオチン基を含む薬剤／リンカーは、アゾビオチン－ＰＥＧ３－アジド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；注文番号：９００８９１；ＣＡＳ １３３９２０２－３３－３）であり、アゾビオチン－アジドという名称で流通しているため、本明細書ではアゾビオチン－アジドとも呼ばれる。好ましい実施形態では、当該薬剤にカップリングされた加水分解酵素阻害剤は、ストレプトアビジンＭａｇセファロースビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；注文番号：１１７９１４５６）に固定化される。別の好ましい実施形態では、ＰＥＧリンカーによって分離されたアジド基及びビオチン基を含む薬剤は、ビオチン－ＰＥＧ４－アジド（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ；カタログ番号：ＢＰ－２２１１９；ＣＡＳ １３０９６４９－５７－７）である。好ましい実施形態では、当該薬剤にカップリングされた加水分解酵素阻害剤は、ストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能ビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；注文番号：１７５１１３０１）に固定化される。
更に、本明細書では、リンカーによって分離されたアジド基及びアミノ基を含む薬剤を、ＮＨＳ活性化エステルを含む固体担体に最初にカップリングさせることが想定される。続いて、アルキン基を含む加水分解酵素阻害剤を、固体担体上に固定化された当該薬剤にカップリングさせる。リンカーについての説明は上記で記載されている。好ましい実施形態では、リンカーによって分離されたアジド基及びアミノ基を含む薬剤は、アジド－ＰＥＧ４－アミン（Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ、ＢＰ－２１６１５；ＣＡＳ ９５１６７１－９２－４）である。好ましい実施形態では、上記薬剤にカップリングされた加水分解酵素阻害剤は、ＮＨＳ活性化セファロース（登録商標）４高速フロービーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；注文番号：１７０９０６０１）に固定化される。
以下は、本発明に従って使用することができる阻害剤に関する。
好ましくは、加水分解酵素阻害剤（固相に結合する前の形態）は、以下：
Figure 2023536366000007
から選択される（例えば、構造を有する）を含むか又はそれからなる化合物から選択され、
式中、（ＨＩ－１）において、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、それぞれ独立して、直鎖又は分岐鎖であってもよいＣ２～２４アルキルから選択され、任意に、Ｒ１、Ｒ２、又はＲ３の少なくとも１つの末端－ＣＨ２－ＣＨ３基は、－Ｃ≡ＣＨ基で置き換えられ、
（ＨＩ－２）において、
Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３は、それぞれ独立して、直鎖又は分岐鎖であってもよいＣ２～２４アルキルから選択され、任意に、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３の少なくとも１つの末端－ＣＨ２－ＣＨ３基は、－Ｃ≡ＣＨ基で置き換えられる。
加水分解酵素阻害剤は、固体担体上に存在する場合、好ましくは、以下：
Figure 2023536366000008
から選択される構造を含むか又はそれからなる化合物から選択され、
式中、（ＨＩＢ－１）において
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、それぞれ独立して、直鎖又は分岐鎖であってもよいＣ２～２４アルキルから選択され、Ｒ１、Ｒ２、又はＲ３（好ましくはＲ２）の一方の末端－ＣＨ３基は、－ＣＨ２－＊基で置き換えられ、－＊は、加水分解酵素阻害剤が固体担体に連結される位置を示し、
（ＨＩＢ－２）において、
Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３は、それぞれ独立して、直鎖又は分岐鎖であってもよいＣ２～２４アルキルから選択され、Ｒ１１、Ｒ１２、又はＲ１３（好ましくはＲ１１）の一方の末端－ＣＨ３基は、－ＣＨ２－＊基で置き換えられ、－＊は、加水分解酵素阻害剤が固体担体に連結される位置を示す。
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ１１の炭素原子数は、独立して、２～１５、好ましくは３～１４、より好ましくは４～１２、更により好ましくは５～１１から選択することができる。
Ｒ１２及びＲ１３の炭素原子の数は、独立して、５～２４、好ましくは８～１８、より好ましくは１０～１６、更により好ましくは１０～１２から選択され得る。
Ｒ３の炭素数は、２～１０、好ましくは２～８、より好ましくは３～６、更に好ましくは３～５から選択することができる。
Ｒ１及びＲ２のアルキル基は、好ましくは直鎖である。
Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３のアルキル基は好ましくは直鎖である。
Ｒ３のアルキル基は、分岐状であることが好ましい。
好ましくは、式（ＨＩＢ－１）は以下の構造（ＨＩＢ－１ａ）：
Figure 2023536366000009
を有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、上で定義された通りである。
（固相に結合する前の阻害剤の形態の）（ＨＩ－１）及び（ＨＩ－２）の上記の例、並びにそれらの任意のより具体的な例において、－Ｃ≡ＣＨ基以外の官能基、例えば、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、他のアルキン、アジド又はバイオポリマー（例えばストレプトアビジン及び／又はビオチン）が含まれてもよい。固体担体上に存在する加水分解酵素阻害剤は、例えば、阻害剤（固相に結合する前の形態）がアルキニル基を有し、加水分解酵素阻害剤が固相に結合する前に固体担体及び加水分解酵素阻害剤上に存在するアジドとの反応によって固相に（直接的又は間接的に）結合された場合、１，２，３－トリアゾールを介して、官能基から生じるリンカー基を介して固体担体に結合することを理解されたい。
好ましくは、加水分解酵素阻害剤（固相に結合する前の阻害剤の形態）は、アルキン基を含有し、以下：
Figure 2023536366000010
から選択される構造を有する化合物から選択される。
本明細書で提供される加水分解酵素阻害剤は、通常、加水分解酵素阻害剤自体に関連するが、固定化のためには、例えば阻害剤がアルキン基を含有するという点で、加水分解酵素阻害剤を修飾／適合させる必要があることが理解される。このように修飾／適合された加水分解酵素阻害剤は、本明細書では「加水分解酵素阻害剤の誘導体」とも呼ばれる。
修飾／適合された加水分解酵素阻害剤（加水分解酵素阻害剤誘導体）（固相に結合する前の阻害剤の形態）は、好ましくは、アルキン基を含有する加水分解酵素阻害剤であり、以下：
Figure 2023536366000011
から選択される構造を有する化合物から選択され、
式中、（ＨＩ－１）において、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、それぞれ独立して、直鎖又は分岐鎖であってもよいＣ２～２４－アルキルから選択され、Ｒ１、Ｒ２、又はＲ３の少なくとも１つの末端－ＣＨ２－ＣＨ３基は、－Ｃ≡ＣＨ基で置き換えられ、
（ＨＩ－２）において、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３は、それぞれ独立して、直鎖又は分岐鎖であってもよいＣ２～２４アルキルから選択され、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３の少なくとも１つの末端－ＣＨ２－ＣＨ３基は、－Ｃ≡ＣＨ基で置き換えられる。
そのような修飾／適合された加水分解酵素阻害剤（加水分解酵素阻害剤誘導体）もまた、本明細書において以下で更に説明及び定義される。
以下では、本発明と関連して使用され得る加水分解酵素阻害剤を示すマーカッシュ構造が提供される。
マーカッシュ：オルリスタット：
活性構造要素名：（エチルオキセタン－２－オン）：
Figure 2023536366000012
市販物質としてのオルリスタット：
Figure 2023536366000013
これは、本明細書では式（４）とも呼ばれる。
Ｒ１＝アルキル－アルキン；Ｒ２＝アルキル（オルリスタット誘導体１；オルリスタットＡ））：
Figure 2023536366000014
Ｒ１＝アルキル；Ｒ２＝アルキル－アルキン（オルリスタット誘導体２；オルリスタットＢ））：
Figure 2023536366000015
好ましい実施形態では、加水分解酵素阻害剤はオルリスタットである。好ましくは、オルリスタットは、アジド基とアルキン基との反応を介して固体担体上に固定化される。オルリスタットが固体担体上に固定化されるべきであるとき、オルリスタット誘導体が使用されるべきであることが理解される。好ましくは、オルリスタット誘導体はアルキン基を含む。オルリスタットは、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１０），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃｉ １３２，６５６－６６６にも開示されている。好ましくは、アルキン基を含むオルリスタット誘導体は、本明細書ではオルリスタットＡと命名される式（１）、及び本明細書ではオルリスタットＢと命名される式（２）からなる群から選択される。化合物（Ａ）、式（１）、オルリスタットＡ及びオルリスタット誘導体１という用語は、本明細書では互換的に使用される。化合物（Ｂ）、式（２）、オルリスタットＢ及びオルリスタット誘導体２という用語は、本明細書では互換的に使用される。
Figure 2023536366000016
別の好ましい実施形態では、加水分解酵素阻害剤はビス－エノール－エステルである。ビス－エノール－エステルは周知であり、とりわけ’’Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ Ｂｉｓ－ｅｎｏｌ Ａｃｅｔａｔｅｓ ａｓ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｅｓｔｅｒａｓｅｓ’’（Ｒｉｃｈｔｅｒ（２０１３）ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １８：２４３５－２４３８）に記載されている。
天然化合物を起源とするこの構造要素（ビス－エノール－エステル）は、以下の構造：
Figure 2023536366000017
を有する。（ｈｔｔｐｓ：／／ｒｏｅｍｐｐ．ｔｈｉｅｍｅ．ｄｅ／ｌｅｘｉｃｏｎ／ＲＤ－０３－００６９８、又は ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｏｍｐｏｕｎｄ／Ｃａｕｌｅｒｐｅｎｙｎｅを参照されたい）。この化合物は、ＣＡＳ番号７００００－２２－５でＣａｕｌｅｒｐｅｎｙｎｅとして知られており、そのＰｕｂＣｈｅｍ ＣＩＤは５３１１４３６である。
以下は、ビスエノールエステルに関する。
マーカッシュ：ビス－エノール－エステル：
Figure 2023536366000018
活性構造要素名：（１，３）－ブタ－１，３－ジエン－１，４－ジイルジ脂肪酸 Ｒ１＝Ｈ又はカップリング基［ＣＨ２－（ＣＨ２）ｎ－アルキン又はＤｉＧ／＜Ｄｉｇ＞／ビオチン－ストレプトアビジン、ＮＨＳ、ＳＨ、ＬＮＡ［ｎ＝１～１０］
Ｒ２＝－（ＣＨ２）ｘ－ＣＨ３［ｘ＝１－２０］
Ｒ３＝－（ＣＨ２）ｙ－ＣＨ３［ｙ＝１－２０］
好ましくは、ビス－エノール－エステルは、リンカー、例えばアルキン基を介して、例えばアジド基とアルキン基との反応を介して固体担体上に固定化される。ビス－エノール－エステルが固体担体上に固定化されるべきである場合、ビス－エノール－エステルの誘導体が使用されるべきであることが理解される。好ましくは、ビス－エノール－エステル誘導体はアルキン基を含む。好ましくは、アルキン基を含むビスエノールエステル誘導体は、式（３）：
Figure 2023536366000019
を含むか又はそれからなる。化合物（Ｃ）及び式（３）という用語は、本明細書では互換的に使用される。
当業者が理解するように、「固定化された阻害剤がオルリスタット又はビス－エノール－エステルからなる群から選択される」等の表現は、オルリスタット又はビス－エノール－エステルが適切なカップリング基を介して固体担体に連結されていることを示す。例えば、オルリスタット又はビス－エノール－エステルは、アルキン基を含有する修飾オルリスタット又はビス－エノール－エステルを、１つ以上のアジド基を有する固体担体と反応させることによって固定化され得る。この場合、固体担体上に存在するオルリスタット又はビス－エノール－エステルは、それによってオルリスタット又はビス－エノール－エステルが固体担体に連結されているそのアルキル基の１つに修飾を有することを理解されたい。例えば、固体担体のアジド基との「クリック」反応によって固体担体との結合を可能にするために、オルリスタットのＣＨ２－ＣＨ３基が－Ｃ≡ＣＨ基に修飾されている場合、オルリスタットのこの部分もまた、オルリスタットが固体担体に連結されている形態で修飾される（特に、－Ｃ≡ＣＨ基を表した部分は、－Ｃ≡ＣＨ基とアジド基との反応によって形成されるトリアゾールの一部になる）。
既に上で述べたように、本発明は更に、一態様では、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤を調製又は得るための方法、及び／又は固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤を含むデバイス（カラム等）を調製又は得るための方法に関する。したがって、そのような方法は、加水分解酵素阻害剤を固体担体上に固定化する工程を含む。本発明はまた、一態様では、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤及び／又は固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤を含むデバイス（カラム等）に関する。固体担体上に固定化された当該加水分解酵素阻害剤及び／又は当該デバイスは、その方法によって調製又は得ることができる。更に、本明細書中に開示される方法によって調製されるか、得られるか、若しくは得ることができる固定化された阻害剤及び／又は本明細書中に開示される方法によって調製されるか、得られるか、若しくは得ることができる固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤は、本発明に従って、例えば、
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、前記加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含む、方法において使用することができる。
好ましい態様では、阻害剤は、式（１）、（２）、（３）、若しくは（４）、好ましくは式（１）、（２）、若しくは（４）を含むか又はそれからなる化合物をアジドと反応させることによって得ることができる基である。
言い換えれば、本発明は、以下の項目１～４２に表される方法及び製品にも関する。
項目１．固体担体上に加水分解酵素阻害剤を固定化するための方法であって、
固体担体を提供する工程、
加水分解酵素阻害剤を提供する工程、
前記固体担体と、前記加水分解酵素阻害剤を含有する溶液とを接触させる工程、及び
前記加水分解酵素阻害剤を前記固体担体上に固定化することを可能にする工程
を含む、方法。
項目２．前記固体担体が、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）のようなポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレン、ポリエチレンオキシド、セルロース及びセルロース誘導体、例えば酢酸セルロース（ＣＡ）又は再生セルロース、架橋アガロースを含むアガロース、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、及び前述のもののブレンド若しくはコポリマー、又は親水化ポリマーとの、好ましくはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）若しくはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）とのブレンド若しくはコポリマーから選択される、項目１に記載の方法。
項目３．前記固体担体を提供する前記工程が、前記固体担体を処理して、好ましくはヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、アルキン、アジド、並びにバイオポリマー（例えばストレプトアビジン及び／又はビオチン）から選択される官能基を導入する工程を含む、項目１又は２に記載の方法。
項目４．前記加水分解酵素阻害剤を提供する前記工程が、好ましくはストレプトアビジン－ビオチン相互作用を形成するために、又はエステル、アミド、イミン、ウレタン、尿素、β－アミノアルコール、及び１，２，３トリアゾールから選択される１つ以上の基を形成するために、前記加水分解酵素阻害剤を処理して前記固体担体の前記官能基と反応することができる官能基を導入する工程を含む、項目３に記載の方法。
項目５．前記加水分解酵素阻害剤を提供する前記工程が、前記加水分解酵素阻害剤を処理して、好ましくはヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、アルキン、アジド、並びにバイオポリマー（例えばストレプトアビジン及び／又はビオチン）から選択される官能基を導入する工程を含む、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
項目６．前記固体担体を提供する前記工程が、好ましくはストレプトアビジン－ビオチン相互作用を形成するために、又はエステル、アミド、イミン、ウレタン、尿素、β－アミノアルコール、及び１，２，３－トリアゾールから選択される１つ以上の基を形成するために、前記固体担体を処理して前記加水分解酵素阻害剤の前記官能基と反応することができる官能基を導入する工程を含む、項目５に記載の方法。
項目７．
固体担体を提供する工程、
前記固体担体をリンカーを含有する溶液と接触させて担体－リンカーを形成する工程、
加水分解酵素阻害剤を提供する工程、
前記担体－リンカーを、前記加水分解酵素阻害剤を含有する溶液と接触させる工程、及び
前記加水分解酵素阻害剤を前記担体－リンカー上に固定化することを可能にする工程
を含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
項目８．前記固体担体を提供する前記工程が、前記固体担体を処理して、好ましくはヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、アルキン、アジド、並びにバイオポリマー（例えばストレプトアビジン及び／又はビオチン）から選択される官能基を導入する工程を含む、項目７に記載の方法。
項目９．前記リンカーが、
前記固体担体の前記官能基と反応して、好ましくはストレプトアビジン－ビオチン相互作用を形成するか、又はエステル、アミド、イミン、ウレタン、尿素、β－アミノアルコール、及び１，２，３－トリアゾールから選択される１つ以上の基を形成することができる官能基
を含む、項目７又は８に記載の方法。
項目１０．前記加水分解酵素阻害剤を提供する前記工程が、前記加水分解酵素阻害剤を処理して、好ましくはヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、アルキン、アジド、並びにバイオポリマー（例えばストレプトアビジン及び／又はビオチン）から選択される官能基を導入する工程を含む、項目７～９のいずれか一項に記載の方法。
項目１１．前記リンカーが、
前記加水分解酵素阻害剤の前記官能基と反応して、好ましくはストレプトアビジン－ビオチン相互作用を形成するか、又はエステル、アミド、イミン、ウレタン、尿素、β－アミノアルコール、及び１，２，３トリアゾールから選択される１つ以上の基を形成することができる官能基
を更に含む、項目７～１０のいずれか一項に記載の方法。
項目１２．
固体担体を提供する工程、
加水分解酵素阻害剤を提供する工程、
前記加水分解酵素阻害剤をリンカーと接触させて加水分解酵素阻害剤－リンカーを形成する工程、
前記固体担体と、前記加水分解酵素阻害剤－リンカーを含有する溶液とを接触させる工程、及び
前記加水分解酵素阻害剤－リンカーを前記固体担体上に固定化することを可能にする工程
を含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
項目１３．前記固体担体を提供する前記工程が、前記固体担体を処理して、好ましくはヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、アルキン、アジド、並びにバイオポリマー（例えばストレプトアビジン及び／又はビオチン）から選択される官能基を導入する工程を含む、項目１２に記載の方法。
項目１４．前記リンカーが、
前記固体担体の前記官能基と反応して、好ましくはストレプトアビジン－ビオチン相互作用を形成するか、又はエステル、アミド、イミン、ウレタン、尿素、β－アミノアルコール、及び１，２，３－トリアゾールから選択される１つ以上の基を形成することができる官能基
を含む、項目１２又は１３に記載の方法。
項目１５．前記加水分解酵素阻害剤を提供する前記工程が、前記加水分解酵素阻害剤を処理して、好ましくはヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、アルキン、アジド、並びにバイオポリマー（例えばストレプトアビジン及び／又はビオチン）から選択される官能基を導入する工程を含む、項目１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
項目１６．前記リンカーが、
前記加水分解酵素阻害剤の前記官能基と反応して、好ましくはストレプトアビジン－ビオチン相互作用を形成するか、又はエステル、アミド、イミン、ウレタン、尿素、β－アミノアルコール、及び１，２，３トリアゾールから選択される１つ以上の基を形成することができる官能基
を更に含む、項目１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
項目１７．前記固体担体上の前記官能基がアミノ基、好ましくは第一級アミノ基を含む、項目１～１６のいずれか一項に記載の方法。
項目１８．前記固体担体上の前記アミノ基が、反応性プラズマ、好ましくはアンモニアを含むガス混合物から生成されたプラズマによる処理によって導入される、項目１７に記載の方法。
項目１９．前記リンカーが、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、アルキン、アジド、並びにバイオポリマー（例えばストレプトアビジン及び／又はビオチン）から選択される少なくとも２つの官能基を含有する化合物である、項目７～１８のいずれかに記載の方法。
項目２０．前記リンカーが、ポリオキシエチレン部分又はポリオキシプロピレン部分を更に含有し、好ましくは３～２０個（より好ましくは３～１０個、更に好ましくは３～５個）のオキシエチレン又はオキシプロピレン単位を含有し、前記少なくとも２つの官能基がそれに結合している、項目１９に記載の方法。
項目２１．前記リンカーが、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、アルキン、アジド、並びにバイオポリマー（例えばストレプトアビジン及び／又はビオチン）から選択される少なくとも２つの異なる官能基を含有する、項目７～２０のいずれかに記載の方法。
項目２２．前記リンカーが、１分子あたり、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、アルキン、アジド、ストレプトアビジン及びビオチンから選択される第１の官能基と、更に少なくとも２つの第２の官能基とを含有し、前記少なくとも２つの第２の官能基が好ましくは同じ種類であり、前記第１の官能基とは異なるヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、アルキン、アジド、並びにバイオポリマー（例えばストレプトアビジン及び／又はビオチン）から選択される、項目２１に記載の方法。
項目２３．前記固体担体が、架橋アガロース、好ましくはセファロース、より好ましくはＭａｇ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎビーズ又はＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅビーズである、項目１～２２のいずれか記載の方法。
項目２４．前記固体担体がストレプトアビジンを含む官能基を含有し、前記リンカーがビオチンを含む官能基を含有する、項目１～２３のいずれかに記載の方法。
項目２５．前記リンカーがアジド基を更に含有し、前記加水分解酵素阻害剤がアルキン基を含有する、項目２４に記載の方法。
項目２６．前記固体担体が、任意にＮＨＳ活性化されているカルボキシレートを含む官能基を含有し、前記リンカーが、アミンを含む官能基を含有する、項目１～２５のいずれかに記載の方法。
項目２７．前記リンカーがアジド基を更に含有し、前記加水分解酵素阻害剤がアルキン基を含有する、項目２６に記載の方法。
項目２８．前記リンカーが、ビオチン－ＰＥＧ３－アジド（ＣＡＳ８７５７７０－３４－６）、ビオチン－ＰＥＧ４－アジド（ＣＡＳ１３０９６４９－５７－７）、アゾ－ビオチン－アジド（ＣＡＳ１３３９２０２－３３－３）及びアジド－ＰＥＧ４－アミン（ＣＡＳ９５１６７１－９２－４）から選択される、項目１～２７のいずれかに記載の方法。
項目２９．前記加水分解酵素阻害剤が、アルキン基を含有し、かつ以下：
Figure 2023536366000020
から選択される構造を有する化合物から選択され、
式中、（ＨＩ－１）において、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、それぞれ独立して、直鎖又は分岐鎖であってもよいＣ２～２４アルキルから選択され、Ｒ１、Ｒ２、又はＲ３の少なくとも１つの末端－ＣＨ２－ＣＨ３基は、－Ｃ≡ＣＨ基で置き換えられ、
（ＨＩ－２）において、
Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３は、それぞれ独立して、直鎖又は分岐鎖であってもよいＣ２～２４アルキルから選択され、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３の少なくとも１つの末端－ＣＨ２－ＣＨ３基は、－Ｃ≡ＣＨ基で置き換えられる、項目１～２８のいずれか一項に記載の方法。
項目３０．Ｒ１、Ｒ２、及びＲ１１の炭素原子の数が、独立して、２～１５、好ましくは３～１４、より好ましくは４～１２、更により好ましくは５～１１から選択される、項目２９に記載の方法。
項目３１．Ｒ１２及びＲ１３の炭素原子の数が、独立して、５～２４、好ましくは８～１８、より好ましくは１０～１６、更により好ましくは１０～１２から選択される、項目２９又は３０に記載の方法。
項目３２．Ｒ３の炭素原子の数が、２～１０、好ましくは２～８、より好ましくは３～６、更により好ましくは３～５から選択される、項目２９～３１のいずれか一項に記載の方法。
項目３３．Ｒ１及びＲ２の前記アルキル基が直鎖である、項目２９～３２のいずれか一項に記載の方法。
項目３４．Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３の前記アルキル基が直鎖である、項目２９～３３のいずれか一項に記載の方法。
項目３５．Ｒ３の前記アルキル基が分岐鎖である、項目２９～３４のいずれか一項に記載の方法。
項目３６．式（ＨＩ－１）が、以下の構造（ＨＩ－１ａ）：
Figure 2023536366000021
を有し、式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、先行する項目に定義される通りである、項目２９～３５のいずれか一項に記載の方法。
項目３７．前記加水分解酵素阻害剤が、アルキン基を含有し、以下：
Figure 2023536366000022
Figure 2023536366000023
から選択される構造を有する化合物から選択される、項目１～３６のいずれか一項に記載の方法。
項目３８．項目１～３７のいずれか一項に記載の方法により得ることができる、固体担体上に固定化された、加水分解酵素阻害剤。
項目３９．項目３８に記載の固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤を含む、デバイス。
項目４０．少なくとも２つの開口部を有する管状デバイスである、項目３９に記載のデバイス。
項目４１．前記デバイスが、好ましくは金属、ポリマー、又はガラス製の容器で構成され、前記容器が、固体担体上に固定化された前記加水分解酵素阻害剤が収容される空洞を形成する、項目３９又は４０に記載のデバイス。
項目４２．固体担体上に固定化された前記加水分解酵素阻害剤で少なくとも部分的に満たされたカラムである、項目３９～４１のいずれか一項に記載のデバイス。
タンパク質を含む組成物を回収する前に、タンパク質を含む出発組成物を、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤と接触させることが好ましい。言い換えれば、タンパク質を含む組成物は、タンパク質を含む出発組成物を固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤と接触させた後に回収される。したがって、本明細書に記載の方法は、以下の順序で実行することができる：
工程（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
続いて、
工程（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程。
本明細書中に記載される方法の工程（ｉ）及び（ｉｉ）は、典型的には、その順序で行われるべきであり、すなわち、工程（ｉ）の後に工程（ｉｉ）が続く。工程（ｉ）と工程（ｉｉ）との間に更なる工程（更なる精製工程等）が存在し得るが、本明細書では、工程（ｉ）の直後に工程（ｉｉ）が続くこと、すなわち工程（ｉ）と工程（ｉｉ）との間に更なる工程が存在しないことが好ましい。
更に、本明細書では、工程（ｉ）及び（ｉｉ）（好ましくは、（ｉ）の後に（ｉｉ）が続く順序）を１回行うことができ、例えば、粗抽出物又は従来の方法（プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー等）によって精製された抽出物のようなタンパク質を含む出発組成物を、本方法の工程（ｉ）に供し、続いて工程（ｉｉ）によるタンパク質を含む組成物を回収することが想定され、好ましい。言い換えれば、本明細書では、工程（ｉ）は、本明細書に記載の方法で１回（単独で）／本方法を実施するときに実施されることが好ましい。本明細書で言及及び記載されるように、方法は、工程（ｉ）の前及び／又は工程（ｉ）と（ｉｉ）との間に精製及び／又は調製の追加の工程、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィー及び／又は混合モードクロマトグラフィーを含み得る。
しかしながら、工程（ｉ）及び（ｉｉ）（好ましくは、（ｉ）の後に（ｉｉ）が続く順序）を１回又は複数回、例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は１０回繰り返すことができることも想定される。例えば、工程（ｉ）及び（ｉｉ）が最初に行われた後、例えば、加水分解活性の特定の閾値を達成するために、及び／又は宿主細胞タンパク質（複数可）、特に加水分解酵素等の不純物を（更に）除去又は低減するために、タンパク質を含む回収された組成物における加水分解活性を（更に）低減することが望ましい場合がある。
これに関連して、本方法の工程（ｉｉ）で回収されたタンパク質を含む組成物を、加水分解酵素阻害剤と接触させ、加水分解酵素阻害剤を固体担体上に固定化する。
例えば、本方法は、それに応じて以下のように実行することができる（好ましくは順序（ｉ）、続いて（ｉｉ）、続いて（ｉｉｉ）、続いて（ｉｖ）（短順序（ｉ）～（ｉｖ）：
以下の工程を含む方法：
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、前記加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程；
（ｉｉｉ）（前の）工程（ｉｉ）で回収されたタンパク質を含む組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程；
（ｉｖ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程。
次いで、これを、上記のように、例えば以下のように、所望に応じて繰り返すことができる。
以下の工程を含む方法
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、前記加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程；
（ｉｉｉ）（前の）工程（ｉｉ）で回収されたタンパク質を含む組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程；
（ｉｖ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程；
（ｖ）（前の）工程（ｉｖ）で回収されたタンパク質を含む組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程；
（ｖｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程；
等。
工程を更に繰り返すため、本方法では、任意の所望の数の以下の工程を更に実行することができる：
（ｖｉｉ）前の工程で回収されたタンパク質を含む組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程；
（ｖｉｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程；
等。
当業者には明らかであるが、本明細書に記載の方法は、（従来の）タンパク質調製及び／又は精製の手段及び方法と組み合わせることができることが指摘される。
言い換えれば、タンパク質を含む出発組成物を固定化加水分解酵素阻害剤と接触させる工程及び組成物を回収する工程は、（従来の）タンパク質調製及び／又は精製の更なる工程と組み合わせることができる。したがって、好ましい態様では、本方法は、工程「（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程」の前に、（従来の）タンパク質調製及び／又は精製の１つ以上の工程を更に含み得る。
本方法は、工程「（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程」の後に、（従来の）タンパク質調製及び／又は精製の１つ以上工程を更に含み得る。
本方法は、工程（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程の前及び後に、（従来の）タンパク質調製及び／又は精製の１つ以上工程を更に含み得る。
（従来の）タンパク質調製及び／又は精製工程の非限定的な例は、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、好ましくは陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ））、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）及び（超）濾過、又は混合モードクロマトグラフィー（例えば、混合モードイオン交換クロマトグラフィー、好ましくは混合モード陰イオン交換クロマトグラフィー（ＭＭＡＥＸ））等のそれらの組み合わせである。アフィニティークロマトグラフィーは、好ましくはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーである。
これらの用語の意味並びにアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）等）及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）クロマトグラフィーを含むタンパク質調製及び／又は精製工程は、当技術分野で周知である。
混合モードクロマトグラフィーの利点は、溶質が２つ以上の相互作用モード又は機構を介して固定相と相互作用し、より高い選択性及び分離能（２０１６）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．１２８：７３－８８）をもたらすことである。混合モードクロマトグラフィー（又はマルチモーダルクロマトグラフィー）は、例えば以下の方法を含むことができる。
ＩＥＣ／ＨＩＣ
ＩＥＣ及びＨＩＣ条件は、生物学的活性を維持するのに適した生理学的条件に最も近いものであるため、それらの組み合わせは生物学的産物の分離に広く使用されている。ＩＥＣ／ＨＩＣ ＭＭＣは、溶質が静電相互作用及び疎水性相互作用の両方を介して固定相と相互作用するという理由で、分離能及び選択性が改善されている。
ＩＥＣ／ＲＰＬＣ
ＩＥＣ／ＲＰ ＭＭＣは、ＲＰＬＣとＩＥＣの利点を併せ持っている。例えば、ＷＡＸ／ＲＰは、単一のＷＡＸ又はＲＰＬＣと比較して、分離能が向上し、分離選択性の調整の自由度が向上している。
ＨＩＬＩＣ／ＲＰＬＣ
Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．は、移動相の有機相を調整することによってＲＰＬＣ又はＨＩＬＩＣ保持を示すことができるＨＩＬＩＣ／ＲＰ固定相を合成した（Ｌｉｕ ａｎｄ Ｐｏｈｌ（２００８）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ １１９１：８３－８９．）。
ＨＩＬＩＣ／ＩＥＣ
Ｍａｎｔ ｅｔ ａｌ．は、ＨＥＬＩＣ／ＣＥＸが、ペプチド分離のためのＲＰＬＣと比較して、独自の選択性、より強い分離能及びより広い範囲の用途を提供したことを報告した。（Ｍａｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ．８１６（１）：７９－８８）
ＳＥＣ／ＩＥＣ
タンパク質ＳＥＣにおける疎水性相互作用は低いイオン強度では比較的弱く、静電効果は保持に大きく寄与する可能性があり、これによりＳＥＣカラムを弱いイオン交換体として使用することが可能になる。
好ましくは、タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させることは、タンパク質を含む出発組成物が（単独で）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、及び任意に濾過に供された後に行われる。濾過を行う場合、好ましくは、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、続いて濾過（すなわち、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーとそれに続く濾過）の順序である。「（単独で）供された」とは、出発組成物が、所与の（従来の）タンパク質調製及び／又は精製工程、例えば、これに関連して、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、及び任意に濾過にのみ供されたことを意味し、すなわちこの方法は、工程（ｉ）の前に所与の（１つ又は複数の）精製方法以外の任意の他の精製方法を含まない。
本明細書では、タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させることは、タンパク質を含む出発組成物が（単独で）プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーに供され、任意に濾過に供された後、及び／又はタンパク質を含む出発組成物がイオン交換クロマトグラフィー又は混合モードイオン交換クロマトグラフィー、好ましくは陽イオン交換クロマトグラフィー又は混合モード陰イオン交換クロマトグラフィーに供された後に行われることが想定される。
したがって、好ましい態様では、本方法は、タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程（ｉ）の前に、アフィニティークロマトグラフィー（好ましくはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）及び任意に濾過を更に含み得、加水分解酵素阻害剤は固体担体上に固定化される。
本明細書で使用される場合、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、好ましくは、組成物のｐＨ値の減少及びその後の（初期ｐＨ値への）ｐＨ値の増加を含む。これは、ウイルス（組成物中に（潜在的に）存在する場合）を不活性化するのに役立つ。このようなプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーに供した組成物は、本明細書では「コンディショニング後プロテインＡ溶液プール」、「コンディショニング後プロテインＡ溶出プール」、「コンディショニング後プロテインＡ溶出液」、プロテインＡ溶出プール又はプロテインＡ溶出液とも呼ばれる。
更に、本明細書で使用される場合、濾過は、深層フィルターの使用を含むことができる。したがって、本明細書では深層濾過が好ましい。そのようなプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーに供し、続いて濾過した組成物を、本明細書では「混合モード陰イオン交換負荷溶液」とも呼ぶ（これは、溶液が、工程（ｉ）を実施した後、混合モードイオン交換クロマトグラフィー、特に混合モード陰イオン交換クロマトグラフィーに供されることを示す）。
上述のように、本方法は、工程「（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程」の後に、（従来の）タンパク質調製及び／又は精製の１つ以上工程を更に含み得る。好ましい態様では、本方法は、工程（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させた後、（少なくとも）イオン交換クロマトグラフィー及び／又は混合モードクロマトグラフィー（混合モードイオン交換クロマトグラフィー等）及び／又は好ましくは陽イオン交換クロマトグラフィーの疎水性相互作用クロマトグラフィー及び／又は混合モードクロマトグラフィー（混合モード陰イオン交換クロマトグラフィー等）及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の工程を更に含み得、加水分解酵素阻害剤は、固体担体上に（及び組成物の回収の前に）固定化される。
混合モードイオン交換クロマトグラフィーは、好ましくは、本明細書では混合モード陰イオン交換クロマトグラフィー（ＭＭＡＥＸ）である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように、目的のタンパク質を培養細胞から産生、精製、及び／又は分離するために使用される工程は、回収物清澄化プロセス（又は細胞培養物からインタクト細胞及び細胞残屑を除去する同様のプロセス）、限外濾過（ＵＦ）プロセス（又は産生されたタンパク質を濃縮する同様のプロセス）、ダイアフィルトレーション（ＤＦ）プロセス（又は前のプロセスから産生されたタンパク質を含む緩衝液を変更若しくは希釈する同様のプロセス）、ウイルス不活化工程（又はウイルス粒子を不活化若しくは除去する同様のプロセス）、アフィニティー捕捉プロセス（又は、産生されたタンパク質を捕捉し、それを残りの緩衝液／溶液成分から分離するクロマトグラフィー方法のいずれか）、製剤化プロセス、及びバルク充填プロセスからなる群から選択される工程の少なくとも１つを更に含む。一態様では、本明細書に開示されているように、タンパク質を培養細胞から製造、精製、及び／又は分離する工程は、少なくとも回収物清澄プロセス（又は細胞培養物から無傷の細胞及び細胞残屑を除去する同様のプロセス）、回収後の限外濾過（ＵＦ）プロセス（又は生産されたタンパク質を濃縮する同様のプロセス）、回収後の透析濾過（ＤＦ）プロセス（又は前のプロセスから生産されたタンパク質を含む緩衝液を変更若しくは希釈する同様のプロセス）、溶媒／界面活性剤のウイルス不活化プロセス（又はウイルス粒子を化学的に不活化する同様のプロセス）、中間体精製プロセス（例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）又は産生されたタンパク質を捕捉し、それを残りの緩衝液／溶液成分から分離するクロマトグラフィー法のいずれか１つ）、ＨＩＣ後のＵＦ／ＤＦプロセス（又は産生されたタンパク質を濃縮及び／又は緩衝交換する同様のプロセス）、ウイルス還元濾過プロセス（又はウイルス粒子その他の不純物若しくは汚染物を更に除去するための同様のプロセス）、混合モードクロマトグラフィー、（例えば、ＣＡＰＴＯ（登録商標）アガロースクロマトグラフィー、又は生成されたタンパク質を更に精製及び／又は濃縮する同様の方法）、製剤化プロセス及びバルク充填プロセスを含む。一態様では、本明細書で提供される方法の分離工程は、回収清澄化、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉、ＨＩＣクロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー及びそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを更に含む。
いくつかの態様では、本明細書に開示される培養細胞からタンパク質を精製するために使用される工程は、クロマトグラフィープロセスを含む。一実施形態では、クロマトグラフィープロセスは親和性捕捉プロセスである。クロマトグラフィープロセスは、少なくとも、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、プロテインＡクロマトグラフィー、又はＣＡＰＴＯ（登録商標）Ａｄｈｅｒｅ混合モードクロマトグラフィーを含み得る。
好ましい態様で上述したように、本明細書に記載の方法は、工程「（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程」の前及び／又は後に、（従来の）タンパク質調製及び／又は精製の１つ以上の工程を更に含み得る。したがって、本明細書に記載の方法は、プラットフォームプロセス（すなわち、抗体等の目的のタンパク質を精製するための方法／プロセス）とすることができる。
そのような方法／プロセスは、異なる精製原理（すなわち、異なるタンパク質調製及び／又は精製工程）を有するいくつかのカラムの使用を含み得る。
本明細書に記載の（タンパク質を含む組成物を調製するための）典型的なプロセス又は方法は、目的のタンパク質の（従来の）調製及び／又は精製、すなわち細胞培養物からタンパク質組成物を調製する少なくとも４つのその後の工程、続いて典型的には（少なくとも）３つの（従来の）クロマトグラフィー工程、任意に４つの（従来の）クロマトグラフィー工程を含む。
したがって：タンパク質組成物が細胞培養又は培養上清から調製された後（工程１）、方法／プロセスは、典型的には、３つの後続の（従来の）クロマトグラフィー工程（任意に４つの後続の工程）、例えば、通常、それぞれが異なる精製原理を採用する３つのカラム（任意に４つのカラム）を使用する（工程２～４、又は任意の工程５（カラム４）が含まれる場合、工程２～５）。
好ましくは、（タンパク質を含む組成物を調製するための）本明細書に記載の方法／プロセスは、工程「（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程」に加えて、３つ（任意に４つ）の異なる精製原理を有する（少なくとも）３つのカラム（任意に４つのカラム）の使用を含む。
図７は、目的のタンパク質の組成物の調製／目的のタンパク質の精製のための従来の概略的な方法／プロセスを示す。図７はまた、本発明の方法において工程「（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程」を使用することができる場所を示す。
最初に、細胞培養物（目的のタンパク質／タンパク質を産生する細胞）からの組成物を、例えば細胞をホモジナイズすることによって調製する。組成物は、細胞培養上清であってもよい。好ましくは、上記組成物は続いて精製され、例えば、組成物は次いで、細胞、細胞残屑及び／又は凝集体から（例えば濾過によって）分離された組成物である。したがって、（続いて精製される）組成物は、細胞、細胞残屑及び／又は凝集体から（濾過によって）分離された組成物であり、例えば、回収細胞培養液（Ｈａｒｖｅｓｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｌｕｉｄ）（ＨＣＣＦ）である。
第２に、上記組成物を、例えばタンパク質調製及び／又は精製の更なる工程（工程２）によって更に精製する。タンパク質調製及び／又は精製の更なる工程は、好ましくはアフィニティークロマトグラフィー（好ましくはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）である。したがって、アフィニティークロマトグラフィー（好ましくはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）が好ましくは第１のクロマトグラフィー工程である。例えば、上記組成物（例えば、回収細胞培養液（ＨＣＣＦ））をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーに供する。言い換えれば、プロセスは、アフィニティークロマトグラフィーカラム（プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム）の使用を含む。
第３に、次いで溶出液を第２のカラム（カラム２）／工程３）に供する。
第４に、次いで、第２のカラムの溶出液を第３のカラムに供する（カラム３／工程４）。
第５に、品質（例えば、目的のタンパク質の純度）が達成されないか、又は第４の工程の後（すなわち、３つのカラムの後（好ましくはそれぞれ異なる精製原理を使用する）、任意に第５の工程（例えば、第４の精製原理を有する第４のカラム）を使用することができる（カラム４／工程５）。当業者は、例えばコスト及び／又は複雑さの増加と品質の改善とのバランスをとる場合に、第５の工程が必要であるかどうか及び／又は有益であるかどうかを事例ごとに決定することができる。
したがって、工程３～５は、任意の順序で、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ））、混合モードクロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）であり得る。言い換えれば、カラム２～４は、任意の順序のイオン交換クロマトグラフィーカラム（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）カラム又は陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）カラム）、混合モードクロマトグラフィーカラム及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムであり得る、すなわち、プロセスは、任意の順序の上記のカラムのいずれかの使用を含む。
プラットフォームプロセス／精製プロセスの開発中、当業者は、使用されるカラムの工程／順序を決定することができる。
第６に、カラム３又は任意のカラム４（工程４及び任意に工程５）の後、溶出液をウイルス濾過に供し、次いで、第７に、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）に供する。第７の工程（ＵＦＤＦ）の後、タンパク質を含む組成物を回収することができる。
図７のスキームでは、回収細胞培養液（ＨＣＣＦ）をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーに供する。次いで、溶出液を第２のカラム（カラム２）に供する。次いで、第２カラムの溶出液を第３カラム（カラム３）に供する。品質（例えば、目的のタンパク質の純度）が第３の工程の後（すなわち、３つの異なる精製原理を有する３つのカラムの後）に達成されない場合、例えば、実際の必要性がある場合、第５の工程（例えば、第４の精製原理を有する第４のカラム）を使用することができる（図７のカラム４）。そうでなければ、第５の工程／第４のカラムは、通常、コスト、材料損失、及び複雑さの増加を回避するために使用されない。当業者は、第４の工程が必要であるか及び／又は有益であるかを事例ごとに決定することができる。
図７に示すカラム２、３及び４については、開発中に定義された配列がある。評価される精製原理は本明細書に記載されており、イオン交換クロマトグラフィー（例えばアニオン－カチオン交換クロマトグラフィー）、混合モードクロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィーであり得る。言い換えれば、プラットフォームプロセス／精製プロセスの開発中に、当業者は、使用されるカラムの順序を決定するであろう。互いに対する異なる精製原理（タンパク質調製及び／又は精製工程）の順序のいくつかの非限定的な例を本明細書で上に提供する。
カラム３又は任意のカラム４の後、溶出液をウイルス濾過に供し、次いで限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）に供する。
更に、当業者は、工程「（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程」をいつ実施するかを決定することができる（図７において、組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させることと呼ばれる）。
（タンパク質を含む組成物を調製するための）本発明の方法／プロセスは、工程「（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤（オルリスタット等）と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程」を含む（例えば、この工程は、加水分解酵素阻害剤クロマトグラフィー（加水分解酵素阻害剤クロマトグラフィー工程）である）。言い換えれば、この方法／プロセスは、加水分解酵素阻害剤（例えば、オルリスタット）カラムの使用を含む。
好ましくは、加水分解酵素阻害剤クロマトグラフィー／クロマトグラフィー工程は、アフィニティークロマトグラフィー（好ましくはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）の工程／工程２に続く。言い換えれば、このプロセスは、プロテインＡカラムに（直接）続く加水分解酵素阻害剤（例えば、オルリスタット）カラムの使用を含み得る。したがって、好ましくは、工程「（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程」は、アフィニティークロマトグラフィー（好ましくはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）の後に行われる。これは、以下の精製工程がタンパク質組成物からの阻害剤（オルリスタット等）の除去を確実にすることを確実にするためである。阻害剤は、例えば、マトリックス（すなわち、阻害剤が固定化された固体担体からの出血）の潜在的な出血のために、当該工程（ｉ）を実施した後に組成物中に存在し得る。
しかしながら、本明細書の他の箇所でも論じられているように、工程「（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程」は、カラム２又はカラム３の後に実行することができる（第５の工程が所定の位置にある場合）。
したがって、加水分解酵素阻害剤クロマトグラフィー／クロマトグラフィー工程は、工程３～５（工程３～５は、任意の順序のイオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ））、混合モードクロマトグラフィー、並びに疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）であり得る）のいずれか１つに続くことができる。言い換えれば、このプロセスは、イオン交換クロマトグラフィーカラム（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）カラム又は陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）カラム）、混合モードクロマトグラフィーカラム及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムを任意の順序で使用した（直）後の加水分解酵素阻害剤（例えば、オルリスタット）カラムの使用を含む。
一態様では、方法／プロセスは、混合モードクロマトグラフィーを含まない。
加水分解酵素阻害剤クロマトグラフィー／クロマトグラフィー工程は、通常、細胞培養物からタンパク質組成物を調製する最初の工程（例えば、ＨＣＣＦに従わない）の（直）後に続かない。言い換えれば、加水分解酵素阻害剤クロマトグラフィー／クロマトグラフィー工程は、通常、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）／工程１の前に行われない。これは、そのような初期タンパク質組成物（例えば、細胞培養物／細胞培養物の上清からのタンパク質組成物、好ましくはＨＣＣＦ）が、典型的には依然として高度の不純物、例えば細胞、細胞残屑及び／又は凝集体を含むためである。したがって、このプロセスは通常、細胞培養物からタンパク質組成物を調製する最初の工程の後に（直接）加水分解酵素阻害剤（例えばオルリスタット）カラムを使用することを含まず、及び／又は通常、アフィニティークロマトグラフィーカラム（例えばプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム）を使用する前に加水分解酵素阻害剤（例えばオルリスタット）カラムを使用することを含まない。
本明細書中に記載される方法において使用される工程の順序とは無関係に、精製された原薬（回収されたタンパク質を含む組成物）は、阻害剤（例えばオルリスタット）を含有してはならないか、又は、例えば、ＦＤＡ若しくはＥＭＡ等の当局によって承認された製剤の形態で、最小量（好ましくは検出不能な量）若しくは対象／患者への組成物（又は本明細書に記載のタンパク質製剤、例えば組成物を含む製剤）の投与を妨げない量のみを含有すべきであることは明らかである。言い換えれば、本方法は、回収されたタンパク質組成物及び／又は本明細書に記載のタンパク質製剤中に阻害剤が存在しないこと（又は上記の最小量のみ）を確実にする方法で使用される。
本明細書に記載の（タンパク質を含む組成物を調製するための）方法は、以下の順序の工程を含むことができる。
（１）細胞培養物（タンパク質／目的のタンパク質を産生する細胞）から組成物を調製する工程、又は細胞培養物から細胞培養上清を得る工程であって、好ましくは、調製された組成物又は上清の後続の精製、例えば、細胞、細胞残屑及び／又は凝集体からの（例えば濾過による）分離／除去（好ましくは、調製及び／又は精製された組成物は回収細胞培養液（ＨＣＣＦ）である）が続く工程；
（２）アフィニティークロマトグラフィー（好ましくはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）（工程（１）を行うことによって得られた（精製された）組成物に適用される）工程であって、
「（ｉ）タンパク質を含む出発組成物（例えば、ここで、アフィニティークロマトグラフィーを行うことによって得られる（精製された）組成物）を加水分解酵素阻害剤（オルリスタット等）と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程」（例えば、この工程は加水分解酵素阻害剤クロマトグラフィー（加水分解酵素阻害剤クロマトグラフィー工程）である）が続く工程；
（３）イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ））（工程（２）を行って得られた（精製された）組成物に適用される）工程；
（４）混合モードクロマトグラフィー（工程（３）を実施することによって得られる（精製された）組成物に適用される）工程；
任意に（５）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（工程（４）を行うことによって得られる（精製された）組成物に適用される）工程；
（６）ウイルス濾過（工程（４）（又は該当する場合は（５））を行うことによって得られた（精製された）組成物に適用される）工程；
（７）濾過（例えば、ＵＦＤＦ）工程（（６）を実施することによって得られた（精製された）組成物に適用される）；続いて（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程。
論じられるように、任意の順序で、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ））、混合モードクロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用することができる。
したがって、代替的には、上記の方法は、例えば、以下の順序の工程を含むことができる：
（３）混合モードクロマトグラフィー（工程（２）を実施することによって得られる（精製された）組成物に適用される）工程；
（４）イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ））（工程（３）を行って得られた（精製された）組成物に適用される）；
任意に（５）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（工程（４）を行うことによって得られる（精製された）組成物に適用される）工程。
更なる代替形態では、上記の方法は、例えば、以下の順序の工程を含むことができる：
（３）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（工程（２）を行うことによって得られる（精製された）組成物に適用される）；
（４）イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ））（工程（３）を行って得られた（精製された）組成物に適用される）；
任意に（５）混合モードクロマトグラフィー（工程（４）を実施することによって得られる（精製された）組成物に適用される）。
更なる代替形態では、上記の方法は、例えば、以下の順序の工程を含むことができる：
（３）イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ））（工程（２）を行って得られた（精製された）組成物に適用される）；
（４）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（工程（３）を行うことによって得られる（精製された）組成物に適用される）；
任意に（５）混合モードクロマトグラフィー（工程（４）を実施することによって得られる（精製された）組成物に適用される）。
本明細書の他の箇所で議論されるように、工程「（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程」は、好ましくはアフィニティークロマトグラフィーの後に行われる（上記工程（２）を参照されたい）。
同じく上記で論じられるように、工程「（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程」は、本明細書に記載される方法において、例えば上記工程（３）、（４）及び／又は（５）において、以下のアフィニティークロマトグラフィー（上記工程（２）を参照されたい）の代わりに（又は、更に以下のアフィニティークロマトグラフィーに加えて）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ））の後／それに続いて、又は更なる代わりとして、混合モードクロマトグラフィーの後／それに続いて、又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の後／それに続いて行うことができる。
本明細書で使用及び定義される場合、「出発組成物」という用語によれば、加水分解酵素阻害剤と接触させる上記（精製）組成物（複数可）のいずれかであって、加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される（工程（ｉ））組成物は、「出発組成物」であるか、又は「出発組成物」であり得る。例えば、アフィニティークロマトグラフィーを行うことによって得られる（精製された）組成物（上記工程（２）を参照されたい）は、「タンパク質を含む出発組成物」である。
同じ説明が、加水分解酵素阻害剤と接触させるための本明細書に記載の（精製された）組成物に準用され、該加水分解酵素阻害剤は、固体担体上に固定化される（工程（ｉ））。例えば、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ））を行うことによって得られる（精製された）組成物である。混合モードクロマトグラフィー及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、「タンパク質を含む出発組成物」である。
一般に、「タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる」という用語は、「出発組成物がタンパク質を含む」こと、及びこの組成物を加水分解酵素阻害剤（加水分解酵素阻害剤は固体担体上に固定化される）と接触させることを意味することが理解される。したがって、出発組成物はタンパク質を含み、加水分解酵素阻害剤を含まない。
以下は、目的のタンパク質を調製／産生するために使用することができる培養細胞／細胞培養物に関する。目的のタンパク質をコードする核酸は、外因性遺伝子として、好ましくは調節エレメントと共に、活性な内因性遺伝子として宿主細胞中に既に存在するか、又は内因性の非活性遺伝子として活性化されるように、そのような宿主細胞に導入することができる。対応する培養細胞は、目的のタンパク質をコードするベクター又は核酸分子で形質転換された又はベクター又は核酸分子を含む宿主細胞又は非ヒト宿主（細胞）であり得る。本発明による「本発明のベクターで形質転換された宿主細胞又は非ヒト宿主」という用語は、典型的には、ベクター又はタンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞又は非ヒト宿主に関することが理解されよう。ポリペプチドの発現のための宿主細胞は当技術分野で周知であり、原核細胞並びに真核細胞を含む。したがって、宿主は、細菌、哺乳動物細胞、藻類細胞、繊毛虫、酵母及び植物細胞からなる群から選択することができる。典型的な細菌としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（グルタミクム（ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ））、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（フルオレセンス（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ））、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、サルモネラバチルス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）又はバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等）、又はコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）等が挙げられる。本明細書において最も好ましい細菌宿主は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。本明細書で使用される例示的な繊毛虫は、テトラヒメナ、例えばテトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）である。
典型的な哺乳動物細胞としては、Ｈｅｌａ、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｈ９、Ｐｅｒ．Ｃ６細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＮＳ０細胞及びＣ１２７細胞、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞及びＣＶ１細胞、ウズラＱＣ１－３細胞、マウスＬ細胞、マウス肉腫細胞、ボーズメラノーマ細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。本発明による最も好ましい哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞である。また、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞が好ましい。
他の適切な真核生物宿主細胞は、例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クリベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母、又は例えばＤＴ４０細胞等のニワトリ細胞である。発現に適した昆虫細胞は、例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｋｃ、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９及びＳｆ２１又はトリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）Ｈｉ５細胞である。好ましい藻類細胞は、クラミドモナス・レインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）又はシネココッカス・エロンガツス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）細胞等である。例示的な植物は、フィスコミトレラ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）、例えば、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）である。
初代哺乳動物細胞又は細胞株も本発明の範囲内である。初代細胞は、生物から直接得られる細胞である。適切な初代細胞は、例えば、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス初代肝細胞、心筋細胞及び神経細胞、並びにマウス筋幹細胞（衛星細胞）、ヒト皮膚及び肺線維芽細胞、ヒト上皮細胞（鼻、気管、腎臓、胎盤、腸、気管支上皮細胞）、ヒト分泌細胞（唾液腺、皮脂腺及び汗腺から）、ヒト内分泌細胞（甲状腺細胞）、ヒト脂肪細胞、ヒト平滑筋細胞、ヒト骨格筋細胞、ヒト白血球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又は樹状細胞等）、及びそれらに由来する安定な不死化細胞株（例えば、ｈＴＥＲＴ又は癌遺伝子不死化細胞）である。上記の宿主細胞について適切な培養培地及び条件は、当技術分野で公知である。
宿主細胞は、例えば、結合分子等の目的のタンパク質を大量に産生するために使用され得る。
本発明に関連して有用な例示的な結合タンパク質／結合分子としては、抗体、抗体断片、例えばＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、（単一）ドメイン抗体、特にラクダ科動物、ラマ又はサメに由来するもの、抗体の単離された可変領域（ＶＬ及び／又はＶＨ領域）、特にヒト又は霊長類由来のもの、ＣＤＲ、免疫グロブリンドメイン、ＣＤＲ由来ペプチド模倣物、レクチン、フィブロネクチンドメイン、テネイシンドメイン、プロテインＡドメイン、ＳＨ３ドメイン、アンキリンリピートドメイン、及びリポカリン又は記載されるような様々な種類の足場由来結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
以下は、出発組成物中に存在してもよく、存在する場合、目的のタンパク質を含む組成物から除去される（又は含有量が減少する）宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）に関する。
ＨＣＰは、産生プロセスで使用される細胞又は生物によって産生又はコードされるタンパク質であり、意図された生成物とは無関係である。いくつかは成長、生存及び正常な細胞プロセシングに必要であるが、他のものは必須ではない場合がある。意図された生成物と同様に、ＨＣＰもまた、いくつかの翻訳後修飾によって宿主によって修飾され得る。有用性又はその欠如にかかわらず、ＨＣＰは一般に、最終原薬において望ましくない。少量（意図されるタンパク質１ミリグラム当たりのナノグラムとして表される百万分率）で一般的に存在するが、それらを除去するために多くの労力及びコストが産業によって費やされる。治療的使用のための生物学的産物の承認の前に、産物中の残留ＨＣＰのレベルを定量的に測定すべきである。したがって、ＨＣＰは、典型的には排除又は低減されなければならず、排除又は低減が実証されなければならない。組換え生物学的産物中の混入ＨＣＰの存在についてアッセイするための現在の分析方法としては、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫ブロット法及びＥＬＩＳＡが挙げられる。例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００２，１８，５５６－５６４）、プロテインＡクロマトグラフィー（Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００８，２４，１１１５１１２１）、又は塩耐性陰イオン交換リガンド（Ｒｉｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２００９，Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．６）を使用したＨＣＰ汚染の除去及び除去に関する多くの刊行物がある。
しかしながら、本明細書に示すように、ＨＣＰ含有量は、従来の精製方法では十分に除去されない。わずかな残留量であっても、長期間の貯蔵安定性の低下をもたらし得る。組成物中のＨＣＰの存在は、界面活性剤分解物の不溶物に起因する可視粒子及び／又はサブビジブル粒子の発生をもたらし得ることが想定される。当該粒子は、非経口調製物（ＥＰ２．９．１９、ＥＰ２．９．２０、ＵＳＰ＜７８７＞、ＵＳＰ＜７８８＞、ＵＳＰ＜７８９＞）の要件に反する可能性がある。更に、これらの粒子は、可溶性タンパク質よりも免疫原性が高い不溶性タンパク質凝集体を含み得る。したがって、目的のタンパク質を含む本明細書で提供される組成物／製剤は、低含有量のＨＣＰを含む組成物／製剤であり、及び／又は好ましくは、特に例えば２～８℃で少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間、少なくとも３６ヶ月間、又は少なくとも６０ヶ月間の貯蔵中に目に可視粒子形成を示さない。
可視粒子形成では、粒子（複数可）が、拡大ガラス等の拡大手段を任意に使用して、当業者によって肉眼で観察され得ることを意味する。規制の世界では、可視粒子状物質と目に不可視粒子状物質との間に違いがある。可視微粒子は、肉眼で検出することができる任意の微粒子として大まかに定義される。典型的には、可視物体は、０．０５ｍｍ以上の物体として定義される。本発明で使用される場合、「可視粒子」という用語は、０．０５ｍｍ以上、好ましくは０．１ｍｍ以上、より好ましくは０．２ｍｍ以上、より好ましくは０．５ｍｍ以上、最も好ましくは１ｍｍ以上の粒子を意味する。このような可視粒子を検出するように設計された機器を用いて可視粒子形成を検出することも可能である。本発明による組成物（方法によって得られる）と同様に、透明溶液中の微粒子の検査を自動化するための最も一般的なアプローチは、溶液を撹拌し、溶液を経時的に画像化することである。撮像システムは、一般に、マシンビジョンカメラ、照明（この場合はバックライト）、及び画像を分析するための視覚プロセッサからなる。画像が取得されると、画像間の差異について順次分析される。違いは、気泡及び微粒子等の溶液内を移動する物体として解釈することができる。より大きく、より高密度の微粒子の場合、微粒子が沈む間に上昇するため、分析から気泡を濾別することによって検出が達成される。
直径が約１ｍｍ未満の微粒子を見つけることが目標である場合、視野から気泡を除去するために、撹拌に対するより慎重なアプローチを使用しなければならない。これは、加速速度及び減速速度に注意しながら、紡糸によって溶液を撹拌することによって行うことができる。しかしながら、本発明の目的のため、粒子が上記で定義されたような直径を有する限り、「可視粒子」を定義するために検出方法は重要ではない。
本発明による方法は、好ましくは、目的のタンパク質含有量に対して１００ｐｐｍ未満、より好ましくは１０ｐｐｍ未満、より好ましくは１ｐｐｍ未満、より好ましくは０．１ｐｐｍ未満、最も好ましくは０．０１ｐｐｍ未満のＨＣＰを含む組成物／製剤をもたらす。例えば、組成物／製剤は、１００ｐｐｍ未満、より好ましくは５０ｐｐｍ未満、より好ましくは２０ｐｐｍ未満、より好ましくは１０ｐｐｍ未満、より好ましくは５ｐｐｍ未満、より好ましくは２ｐｐｍ未満、最も好ましくは１ｐｐｍ未満又はそれ未満の宿主細胞タンパク質（複数可）を含む。
本明細書に記載の方法は、目的の特定のタンパク質／タンパク質に限定されない。出発組成物中の目的のタンパク質／タンパク質は、任意の供給源に由来する任意のタンパク質であり得る。
具体的には、任意の治療用、診断用及び／又は医薬用タンパク質／目的のタンパク質、並びに科学研究において目的の任意のタンパク質が企図される。以下は、目的のタンパク質の非限定的な例である：
インターロイキン受容体アンタゴニスト、ＥＢＩ－００５又はアナキンラのようなインターロイキン－１受容体アンタゴニスト、レプチン、アセチルコリンエステラーゼ、活性化プロテインＣ（ドロトレコギン）、アクチビン受容体ＩＩＢアンタゴニスト、アデノシンデアミナーゼ、アガルシダーゼアルファ、エントリモド（ｅｎｔｏｌｉｍｏｄ）のようなトール様受容体５のアゴニスト、アルファ－１アンチトリプシン、アルファ－１プロティナーゼ阻害剤、アルファ－ガラクトシダーゼ、アルファ－ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチド、アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、アルテプラーゼ、アメジプラーゼ、アミリン、アミリン類縁体、ＡＮＦ－Ｒｈｏ、アンギオテンシン（１～７）、アンギオテンシンＩＩ、アンギオテンシン転換酵素２、抗上皮細胞接着分子単鎖抗体断片、抗トロンビンアルファ、抗トロンビンＩＩＩ、アポトーシス誘導性酵素ｍｉ－ＡＰＯ、アルギニンデイミナーゼ、カラスパルガーゼ（ｃａｌａｓｐａｒｇａｓｅ）、ペグアスパルガーゼ、クリサンタスパーゼのようなアスパラギナーゼ、ベロクトコグ（ｂｅｒｏｃｔｏｃｏｇ）アルファ又はオクトファクター（ｏｃｔｏｆａｃｔｏｒ）のようなＢドメイン欠損第ＶＩＩＩ因子、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）（Ｌｙｍｐｈｏｓｃａｎ）、ブセリパーゼ（ｂｕｃｅｌｉｐａｓｅ）アルファのような胆汁酸塩刺激性リパーゼ、パブリズマブ（ｐａｖｌｉｚｕｍａｂ）のような呼吸器多核体ウイルスに対する結合タンパク質、ＢＭＰ－２（ジボテルミンアルファ）又はＢＭＰ－６のような骨形態形成タンパク質、ブーガニン、ウシカルボキシヘモグロビン、ウシ成長ホルモン、Ｃ１－エステラーゼ阻害剤、Ｃ３細胞外酵素タンパク質、カルボキシヘモグロビン、ＣＤ１９アンタゴニスト、リツキサンのようなＣＤ２０アンタゴニスト、ＣＤ３受容体アンタゴニスト、ＣＤ４０アンタゴニスト、ダピロリズマブ（ｄａｐｉｒｏｌｉｚｕｍａｂ）又はＡｎｔｏｖａのようなＣＤ４０Ｌアンタゴニスト、セレブロシドスルファターゼ、ＶＧＸ－２１０のようなセトリン、コンドロイチンリアーゼ、ノナコグガンマ、コナコグベータ、アルブトレペノナコグアルファのような凝固第ＩＸ因子、エプタコグアルファ、マルゼプタコグアルファ（ｍａｒｚｅｐｔａｃｏｇ ａｌｆａ）、バトレプタコグアルファ、オレプタコグアルファ（ｏｒｅｐｔａｃｏｇ ａｌｆａ）のような凝固第ＶＩＩａ因子、スソクトコグアルファ（ｓｕｓｏｃｔｏｃｏｇ ａｌｆａ）、ダモクトコグアルファ、ツロクトコグアルファ、ルリオクトコグアルファ、エフモロクトコグアルファ、エフラロクトコグアルファ、シモクトコグアルファ（ｓｉｍｏｃｔｏｃｏｇ ａｌｆａ）のような凝固第ＶＩＩＩ因子、凝固第Ｘ因子、カトリデカコグのような凝固第ＸＩＩＩ因子、クロストリジウム・ヒストリチクム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）のコラゲナーゼ、補体因子Ｃ３阻害剤、補体受容体５ａアンタゴニスト、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、ＦＰＡ００８のようなＣＳＦ１受容体アンタゴニスト、ＣＳＦ１Ｒアンタゴニスト、イピリムマブのようなＣＴＬＡ－４アンタゴニスト、シアノビリン－Ｎ、ドルナーゼアルファのようなデオキシリボヌクレアーゼＩ、ＥＧＦＲ受容体アンタゴニスト、ボナパニターゼのようなヒトＩ型膵臓エラスターゼのようなエラスターゼ、エンドスタチン、エンカスチム（ｅｎｋａｓｔｉｍ）、上皮成長因子、エリスロポエチンアルファ、エリスロポエチンゼータ、ＦｃγＩＩＢ受容体アンタゴニスト、フィブリノゲナーゼ、ブリナーゼのような線維素溶解酵素、線維芽細胞成長因子１（ヒト酸性線維芽細胞成長因子）、線維芽細胞成長因子１８、線維芽細胞成長因子２（ヒト塩基性線維芽細胞成長因子）、線維芽細胞成長因子２１、ＦＰＡ１４４のような線維芽細胞成長因子受容体２アンタゴニスト、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド、フォリトロピンアルファ又はフォリトロピンベータのような卵胞刺激ホルモン、ヒト殺菌性／透過性増強タンパク質２１（オペバカン／ｒＢＰＩ２１）の断片、ゲロニン、グルカゴン受容体アゴニスト、アブシキシマブのような糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト、コンドリアーゼのようなグリコサミノグリカン分解酵素、ｇｐ１２０／ｇｐ１６０、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、転写因子Ｅ７（ベルパセプカルテスペン（ｖｅｒｐａｓｅｐ ｃａｌｔｅｓｐｅｎ））と融合されているミコバクテリウムＢＣＧに由来する熱ショックタンパク質ｈｓｐ６５、肝細胞成長因子、肝細胞成長因子受容体（ＨＧＦＲ）アンタゴニスト、ヘプシジンアンタゴニスト、ハーセプチンのようなＨｅｒ２／ｎｅｕ受容体アンタゴニスト、ヘテロ二量体１５：ＩＬ－１５Ｒａ（ｈｅｔＩＬ－１５）、ヒルジン、ｈｓｐ７０アンタゴニスト、ヒト酸性スフィンゴミエリナーゼ、コリオゴナドトロピンアルファのようなヒト絨毛性ゴナドトロピン、レベグルコシダーゼアルファ（ｒｅｖｅｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ ａｌｆａ）又はアルグルコシダーゼアルファのようなヒト酵素酸性α－グルコシダーゼ、ヒト成長ホルモン、ヒトケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ、ヒトミエリン塩基性タンパク質断片、ヒト骨形成タンパク質１、ヒト骨形成タンパク質－１、ヒト副甲状腺ホルモン、ヒトトロンボモジュリンアルファ、ｒＨｕＰＨ２０のようなヒアルロニダーゼ、ヒトヒアルロニダーゼＰＨ－２０（ボルヒアルロニダーゼアルファ（ｖｏｒｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ ａｌｆａ））、ヒアロシダーゼ、又はボブヒアルロニダーゼ（ｂｏｖｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ）のようなヒアルロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ベラグルセラーゼアルファ、又はタリグルセラーゼアルファのような加水分解性リソソームグルコセレブロシド特異的酵素、イズロネート－２－スルファターゼ、オマリズマブのようなＩｇＥアンタゴニスト、イロコイ（ｉＩｒｏｑｕｏｉｓ）ホメオボックスタンパク質２（ＩＲＸ－２）、インスリン、インスリン類縁体、インテグリンα４β１アンタゴニスト、インターフェロンタウ、インターフェロン－アルファ、インターフェロン－アルファアンタゴニスト、インターフェロン－アルファスーパーアゴニスト、インターフェロン－アルファ－ｎ３（Ａｌｆｅｒｏｎ Ｎ注射剤）、インターフェロン－ベータ、インターフェロン－ガンマ、インターフェロン－ラムダ、ＤＡＢ（３８９）ＩＬ－２のようなインターロイキン２融合タンパク質、オプレレブキン（ｏｐｒｅｌｅｖｋｉｎ）のようなインターロイキン－１１、インターロイキン－１２、インターロイキン－１７受容体アンタゴニスト、インターロイキン－１８結合タンパク質、インターロイキン－２、インターロイキン－２２、ピトラキンラのようなインターロイキン－４、インターロイキン－４ムテイン、インターロイキン－６受容体アンタゴニスト、インターロイキン－７、インターロイキン－２２受容体サブユニットアルファ（ＩＬ－２２ｒａ）アンタゴニスト、イリシン、島ネオゲネシス関連タンパク質、カリジノゲナーゼ、ラクトフェリン、ラクトフェリン断片、ラノテプラーゼ、ブルルリパーゼ（ｂｕｒｌｕｌｉｐａｓｅ）、リゾリパーゼ（ｒｉｚｏｌｉｐａｓｅ）、エパフィパーゼ（ｅｐａｆｉｐａｓｅ）、又はセベリパーゼアルファのようなリパーゼ酵素、黄体形成ホルモン、ルトロピンアルファ、リンパ球膨張分子（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、リソスタフィン、哺乳動物胃リパーゼ酵素（メリスペース（ｍｅｒｉｓｐａｃｅ））、ベルマナーゼアルファ（ｖｅｌｍａｎａｓｅ ａｌｆａ）のようなマンノシダーゼ、メラノコルチン－４受容体アゴニスト、ＭＥＰＥ由来２３アミノ酸ペプチド、メチオニルヒト幹細胞因子（アンセスチム）、マイクロプラスミン、エロスルファーゼアルファのようなＮ－アセチルガラクトサミン－６－スルファターゼ、Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、ナサルプラーゼベータ、神経成長因子、ニューレグリン－１、神経毒（例えば、クロストリジウム・ボツリヌス神経毒のようなクロストリジウム神経毒（例えば、クロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒セロタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、又はＧ、特にクロストリジウム・ボツリヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒セロタイプＡ等）のようなクロストリジウム神経毒）、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、オクリプラスミン、オルニトドロス・モウバタ（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ ｍｏｕｂａｔａ）補体阻害剤（ＯｍＣＩ／Ｃｏｖｅｒｓｉｎ）、オステオプロテゲリン、Ｐ１２８（ＳｔａｐｈＴＡＭＥ）、パミテプラーゼ、パラトルモン（ＰＴＨ）、ＰＤ－１アンタゴニスト、ＰＤＧＦアンタゴニスト、ペントラキシン－２タンパク質、ＨＹ１３３のようなファージリシン、バリアーゼ（ｖａｌｉａｓｅ）のようなフェニルアラニンアンモニアリアーゼ、組織非特異性アルカリホスファターゼ又はアスホターゼアルファのようなホスファターゼ、プラスミノーゲン、Ｖ１０１５３のようなプラスミノーゲン変異体、血小板由来成長因子－ＢＢ、ブタ成長ホルモン、プロヒビチン標的指向性ペプチド１、プロインスリン、プロテインＡ、ドロトレコグニン（ｄｒｏｔｒｅｃｏｇｎｉｎ）のようなプロテインＣ、ＦＰ－１０３９のようなタンパク結合線維芽細胞成長因子受容体リガンド、組換え組織因子経路阻害剤（チファコギン）、リラキシン、セレラキシンのようなリラキシン類縁体、レテプラーゼ、ｒｈＰＤＧＦ－ＢＢ、オンコナーゼ又はアンフィナーゼのようなリボヌクレアーゼ、センレボターゼ、コネスタットアルファのようなセリンプロテアーゼ阻害剤、スフェリカーゼ、シアリダーゼ、可溶性補体受容体１型、可溶性ＤＣＣ（結腸直腸癌において欠失）受容体、可溶性ＴＡＣＩ受容体（アタシセプト）、可溶性腫瘍壊死因子Ｉ受容体（ｓＴＮＦ－ＲＩ）、可溶性腫瘍壊死因子ＩＩ受容体（ｓＴＮＦ－ＲＩＩ）、可溶性ＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ－１、可溶性ヒトＦｃγＩＩＢ受容体、スタフィロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、スルファミダーゼ、Ｔ細胞受容体リガンド、テネクテプラーゼ、血小板新生刺激タンパク質（ＡＭＧ－５３１）、トロンボポエチン、トロンボスポンジン－１、甲状腺ホルモン、タルチレリンのような甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）類縁体、組織プラスミノーゲン活性化因子、パミテプラーゼのような組織型プラスミノーゲン活性化因子、トリペプチジルペプチダーゼＩ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦアルファ）、腫瘍壊死因子αアンタゴニスト、ラスブリカーゼ又はペガドリカーゼ（ｐｅｇａｄｒｉｃａｓｅ）のようなウリカーゼ、ウロジラチン、ウロフォリトロピン、ウロキナーゼ、ウテログロビン、ランビズマブ（ｒａｎｂｉｚｕｍａｂ）又はベバシズマブのようなＶＥＧＦアンタゴニスト、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト、マルチＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ ＤＡＲＰｉｎ又は融合タンパク質のようなＶＥＧＦ／ＰＤＧＦアンタゴニスト、ビスキュミン、ボニコグアルファ（ｖｏｎｉｃｏｇ ａｌｆａ）のようなフォンビルブラント因子。インターロイキン受容体アンタゴニスト、特にＥＢＩ－００５又はアナキンラのようなインターロイキン－１受容体アンタゴニスト、及びレプチン、特にヒトレプチン、又は変異ヒトレプチン（成熟ポリペプチド鎖の位置１００でトリプトファンからグルタミンへの置換を有するヒトレプチン変異体であるｈｕＬｅｐｔｉｎ（Ｗ１００Ｑ））、
好ましくは、目的のタンパク質／タンパク質は抗体である。したがって、本発明は、一態様では、
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、前記加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含む方法に関し、該タンパク質は抗体である。
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、様々な抗体構造を包含し、標的タンパク質に特異的又は選択的に結合することができる任意の分子であり得る。抗体は、抗体又はそのドメイン／断片を含み得るか、又はそれらであり得、ドメイン／断片は、全長抗体と実質的に同じ結合活性を示す。非限定的な例は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又は多重特異性抗体（例えば、好ましくは二重特異性抗体）である。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体又は二重特異性抗体である。本発明内の抗体はまた、キメラ抗体、組換え抗体、ヒト化抗体又は（完全）ヒト抗体であり得る。好ましくは、抗体はヒト化抗体又はヒト抗体である。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２が挙げられるが、これらに限定されない。
抗体はまた、多価分子、多重特異性分子（例えば、ダイアボディ）、融合分子、アプマー、アビマー、又は他の天然に存在する分子若しくは組換えにより作製された分子を含み得る。本発明において有用な例示的抗体は、抗体様分子を含む。抗体様分子は、標的分子（例えば、Ｇｉｌｌ（２００６）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：６５３－６５８；Ｎｙｇｒｅｎ（１９９７）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ７：４６３－４６９；Ｈｏｓｓｅ（２００６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １５：１４－２７を参照されたい）に結合することで機能を発揮し得る分子であり、例えば、ＤＡＲＰｉｎ（国際公開第２００２／０２０５６５号）、アフィボディ（国際公開第１９９５／００１９３７号）、アビマー（国際公開第２００４／０４４０１１号；国際公開第２００５／０４０２２９号）、アドネクチン（国際公開第２００２／０３２９２５号）、フィノマー（国際公開第２０１３／１３５５８８号）等が挙げられる。
本発明内の抗体の非限定的な例は、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＩＬ１３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、抗ＶＥＧＦ－Ａ／ＡＮＧ２抗体、抗ＣＤ７９ｂ抗体、抗ＳＴ２抗体、抗Ｄ因子抗体、抗ＩＸ因子抗体、抗Ｘ因子抗体、抗ａベータ抗体、抗ｔａｕ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗ＣＥＡ／ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０／ＣＤ３抗体、抗ＦｃＲＨ５／ＣＤ３抗体、抗Ｈｅｒ２／ＣＤ３抗体、抗ＦＧＦＲ１／ＫＬＢ抗体、ＦＡＰ－４－１ ＢＢＬ融合タンパク質、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ融合タンパク質、オクレリズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、トシリズマブ、ファリシマブ、ポラツズマブ、ガンテネルマブ、シビサタマブ、クレネズマブ、モスネツズマブ、チラゴルマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、アテゾリズマブ、オビヌツズマブ、ランパリズマブ、レブリキズマブ、オマリズマブ、ラニビズマブ、エミシズマブ、セリクレルマブ、プラシネズマブ、グロフィタマブ、シムルカフスプアルファ、及びＲＧ７８２７である。
本明細書において好ましいのは、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体（特に抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体、特にグロフィタマブ）、抗Ｈｅｒ２抗体（特にトラスツズマブ）、及び／又は抗ＩＬ６受容体抗体（特にトシリズマブ）である。
本明細書に記載の本発明の方法をトラスツズマブの精製に使用する場合、トラスツズマブ溶液をプロテインＡクロマトグラフィーに供した後に工程「（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程」を行うことが想定される。
グロフィタマブは、抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体であり、ＲＧ６０２６としても知られている。グロフィタマブのアミノ酸配列は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０６７７７６（国際公開第２０１６／０２０３０９号）に開示されている。本明細書に記載の本発明の方法をグロフィタマブの精製に使用する場合、工程「（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程」は、グロフィタマブ溶液を混合モード陰イオン交換クロマトグラフィー（ＭＭＡＥＸ）、すなわちコンディショニング後プロテインＡ溶出液に供する前に行うことが想定される。グロフィタマブ精製に関連して、ＭＭＡＥＸ負荷溶液という用語は、ＭＭＡＥＸクロマトグラフィーに供する前の抗体溶液を指す。
好ましい一態様では、目的のタンパク質はトシリズマブであり、阻害剤はオルリスタットＢであり、固体担体にカップリングするためのリンカーによって分離されたアジド基及びビオチン基を含む薬剤（リンカー）はアゾビオチンアジドであり、固体担体はストレプトアビジンＭａｇセファロース（ビーズ）（実施例１及び２を参照）である。
好ましい一態様では、目的のタンパク質はグロフィチマブであり、阻害剤はオルリスタットＢであり、固体担体にカップリングするためのアジド基及びビオチン基を含む薬剤（リンカー）はビオチン－ＰＥＧ４－アジドであり、固体担体はストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能ビーズ（実施例３を参照）である。
好ましい一態様では、目的のタンパク質はグロフィチマブであり、阻害剤はオルリスタットＢであり、固体担体にカップリングするためのアジド基及びアミノ基を含む薬剤（リンカー）はアジド－ＰＥＧ４－アミンであり、固体担体はＮＨＳ活性化セファロース（登録商標）４高速フロービーズ（実施例３を参照）である。
好ましい一態様では、目的のタンパク質はトラスツズマブであり、阻害剤はオルリスタットＡ又はオルリスタットＢであり、固体担体にカップリングするためのアジド基及びビオチン基を含む薬剤（リンカー）はビオチン－ＰＥＧ４－アジドであり、固体担体はストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能ビーズ（実施例４を参照）である。
好ましい一態様では、目的のタンパク質はトラスツズマブであり、阻害剤はオルリスタットＡ又はオルリスタットＢであり、固体担体にカップリングするためのアジド基及びアミノ基を含む薬剤（リンカー）はアジド－ＰＥＧ４－アミンであり、固体担体はＮＨＳ活性化セファロース（登録商標）４高速フロービーズ（実施例４を参照）である。
上記の薬剤／リンカーは、ビオチン－ＰＥＧ４－アジド（ＣＡＳ１３０９６４９－５７－７）、アゾ－ビオチン－アジド（ＣＡＳ１３３９２０２－３３－３）（アゾ－ビオチン－ＰＥＧ３－アジドとしても知られる）及びアジド－ＰＥＧ４－アミン（ＣＡＳ９５１６７１－９２－４）として知られている。
トシリズマブは抗ＩＬ６受容体抗体である。トシリズマブのＣＡＳ登録番号は３７５８２３－４１－９である。ＩＮＮトシリズマブは、ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．３，２００４に開示されている。
本明細書で使用される場合、「タンパク質」（目的のタンパク質）及び特に「抗体」という用語は、そのバイオシミラーを含む及び／又はそれに関する。したがって、本明細書で使用される場合、「タンパク質」（目的のタンパク質）及び特に「抗体」という用語は、それぞれ「タンパク質及び／又はそのバイオシミラー」（又は同様に「目的のタンパク質及び／又はそのバイオシミラー」）、「抗体及び／又はそのバイオシミラー」等を指すと理解することができる。
バイオシミラーは、既に承認されている別の生物学的薬品（「基準薬品」）に非常に類似した生物学的医薬製品（生物製剤としても知られている）である。本明細書で使用される場合、「基準薬品」はまた、特にその「基準タンパク質／基準目的タンパク質」が承認されている場合（ＥＭＡ、ＦＤＡ等の当局によって）、本明細書で定義される「基準タンパク質／基準目的タンパク質」を指す。
バイオシミラーは、全ての生物学的医薬品に適用される医薬品の品質、安全性及び有効性の同じ基準に従って承認されている。本明細書で使用される場合、「バイオシミラー」という用語は、一般に、本明細書で定義される基準タンパク質／目的タンパク質と同じ、すなわち同一の（又は実質的に同じ）アミノ酸配列を有するタンパク質／目的タンパク質を指す。「バイオシミラー」は、基準タンパク質／目的のタンパク質とは異なるグリコシル化又は他の特徴を有し得ることが理解される。
例示的な基準タンパク質／目的のタンパク質は本明細書に記載され、例えば、オクレリズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、トシリズマブ、ファリシマブ、ポラツズマブ、ガンテネルマブ、シビサタマブ、クレネズマブ、モスネツズマブ、チラゴルマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、アテゾリズマブ、オビヌツズマブ、ランパリズマブ、レブリキズマブ、オマリズマブラニビズマブ、エミシズマブ、セリクレルマブ、プラシネズマブ、グロフィタマブ、シムルカフスプアルファ、及びＲＧ７８２７である。本明細書において好ましいのは、トラスツズマブ、トシリズマブ及びグロフィタマブである。
基準タンパク質／目的のタンパク質のアミノ酸配列は、ＩＮＮ及び関連する刊行物を介して容易に同定可能である。
上記に従って、特定の基準タンパク質（基準目的タンパク質）が本明細書で言及される場合、特定の基準タンパク質（基準目的タンパク質）は、そのバイオシミラー（好ましくは、バイオシミラーは、基準目的タンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質である）を含み、それに関する。
例えば、「抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体」という用語は、「抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体及び／又はそのバイオシミラー」を指すことができる（好ましくは、バイオシミラーは、基準抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体と同じアミノ酸配列を有する抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３抗体である）。
例えば、「抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体」という用語は、「抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体及び／又はそのバイオシミラー」を指すことができる（好ましくは、バイオシミラーは、基準抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体と同じアミノ酸配列を有する抗ＣＤ２０／抗ＣＤ３二重特異性抗体である）。
例えば、「グロフィタマブ」という用語は、「グロフィタマブ及び／又はそのバイオシミラー」を指すことができる（好ましくは、バイオシミラーは、基準抗体グロフィタマブと同じアミノ酸配列を有する抗体である）。
例えば、「抗Ｈｅｒ２抗体」という用語は、「抗Ｈｅｒ２抗体及び／又はそのバイオシミラー」を指すことができる（好ましくは、バイオシミラーは、基準抗Ｈｅｒ２抗体と同じアミノ酸配列を有する抗Ｈｅｒ２抗体である）。
例えば、「トラスツズマブ」という用語は、「トラスツズマブ及び／又はそのバイオシミラー」（好ましくは、バイオシミラーは基準抗体トラスツズマブと同じアミノ酸配列を有する抗体である）を指すことができる。
例えば、「抗ＩＬ６受容体抗体」という用語は、「抗ＩＬ６受容体抗体及び／又はそのバイオシミラー」を指すことができる（好ましくは、バイオシミラーは、基準抗ＩＬ６受容体抗体と同じアミノ酸配列を有する抗ＩＬ６受容体抗体である）。
例えば、「トシリズマブ」という用語は、「トシリズマブ及び／又はそのバイオシミラー」（好ましくは、バイオシミラーは基準抗体トシリズマブと同じアミノ酸配列を有する抗体である）を指すことができる。
上記の説明は、必要な変更を加えて、本明細書中に開示される全ての目的のタンパク質／タンパク質、具体的には抗体に適用される。
本発明は更に、タンパク質製剤を調製するための方法に関する。タンパク質製剤を調製するための上記方法は、本明細書中上で記載されるような方法、及び更に、タンパク質を含む組成物への界面活性剤、好ましくは脂肪酸エステルの添加を含み得る。言い換えれば、タンパク質製剤を調製するための方法は、本明細書に記載の方法によって調製されたタンパク質を含む組成物に、界面活性剤、好ましくは脂肪酸エステルを補充することを含み得る。
本明細書で上記に示すように、提供される方法は、宿主細胞タンパク質、特に加水分解酵素等の不純物の含有量が低減された、及び／又は加水分解活性が低減されたタンパク質組成物を調製するために使用することができる。したがって、本発明に従って調製されたタンパク質組成物は、タンパク質製剤を調製するために有利に使用することができ、後者は、例えば、界面活性剤のような、そのような宿主細胞タンパク質の基質がタンパク質製剤中に存在する場合でも、改善された（物理的）安定性を示す。好ましくは、粒子形成の減少、好ましくは目に可視粒子形成が結果的に長期貯蔵中に起こらない。
したがって、本発明は、一態様では、タンパク質製剤を調製するための方法であって、本明細書に上記の方法の工程を含み、タンパク質製剤を調製するための方法が、タンパク質を含む組成物に、界面活性剤、好ましくは脂肪酸エステルを添加することを更に含む、方法に関する。
一実施形態では、タンパク質製剤を調製するための方法は、
（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、前記加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
（ｉｉ）該タンパク質を含む組成物を回収する工程
を含み、
該タンパク質を含む組成物に、界面活性剤、好ましくは脂肪酸エステルを更に添加する工程を含む。
本発明は更に、一態様では、タンパク質製剤を調製するための方法に関し、タンパク質製剤を調製する方法は、本明細書に上記の方法によって得られるか又はそれによって得ることができるタンパク質を含む組成物に、界面活性剤、好ましくは脂肪酸エステルを添加することを更に含む。
界面活性剤は、共溶媒及び安定剤として有用である。それらは、親水性表面及び親油性表面の両方と会合して、タンパク質のような成分の分散及び構造安定性を維持することによって機能する。界面活性剤は、主に、気液界面及び固液界面の剪断等の機械応力に対するタンパク質安定性を高めるために、タンパク質製剤に添加される。本明細書で使用される場合、「界面活性剤」という用語は、特に本明細書で説明及び定義される「脂肪酸エステル」を指す。
界面活性剤が分解されると、界面活性剤分解生成物は可視粒子又はサブビジブル粒子を形成し得る。また、タンパク質製剤中の界面活性剤濃度が低下すると、タンパク質は、場合によっては溶液中で構造的に不安定になり、最終的に可視粒子又はサブビジブル粒子になる多量体凝集体を形成し得ることも想定される。
「脂肪酸エステル」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、エステル結合を介して頭部基に連結された脂肪酸鎖を含有する任意の有機化合物を指す。エステル結合は、ヒドロキシル基（例えば、アルコール又はカルボン酸）がアルコキシ基に置き換えられた場合に形成される。通常、エステルはカルボン酸及びアルコールから誘導される。アルコール基は、一般に頭部基と呼ばれる。アルコールは、グリセロール、ソルビトール、ソルビタン、イソソルビド等であってもよい。ポリソルベートの場合、エステル化は、カルボン酸と、例えばソルビトールに結合したポリオキシエチレン繰り返し単位の末端ヒドロキシル基との間で起こる。
「脂肪酸」又は「脂肪酸鎖」という用語は、脂肪族尾部を有するカルボン酸を意味する。脂肪族尾部は、単に、炭素及び水素、場合によっては酸素、硫黄、窒素及び／又は塩素置換を含む炭化水素鎖である。
脂肪族尾部は、（飽和脂肪酸の場合のように）飽和していてもよく、これは、全ての炭素－炭素結合が単結合（すなわち、アルカン）であることを意味する。脂肪族尾部は、（不飽和脂肪酸の場合のように）不飽和であってもよく、１つ以上の炭素－炭素結合が二重結合（アルケン）又は三重結合（アルキン）である。
脂肪酸は、一般に、脂肪族尾部に６個未満の炭素を有する短鎖脂肪酸、６～１２個の炭素を有する中鎖脂肪酸、１３～２１個の炭素を有する長鎖脂肪酸、及び２２個以上の炭素の脂肪族尾部を有する超長鎖脂肪酸と呼ばれる。上述のように、脂肪酸はまた、剛性及び融点と相関する飽和度に従って分類される。一般的な脂肪酸としては、カプリル酸（８個の炭素：０個の二重結合；８：０）、カプリン酸（１０：０）、ラウリン酸（１２：０）、ミリスチン酸（１４：０）、ミリストレイン酸（１４：１）、パルミチン酸（１６：０）、パルミトレイン酸（１６：１）、サピエン酸（１６：１）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１）、エライジン酸（１８：１）、バクセン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）、リネラジック酸（１８：２）、アルファ－リノレン酸（１８：３）、アラキジン酸（２０：０）、アラキドン酸（２０：４）、エイコサペンタエン酸（２０：５）、ベヘン酸（２２：０）、エルカ酸（２２：１）、ドコサヘキサエン酸（２２：６）、リグノセリン酸（２４：０）、及びセロチン酸（２６：０）が挙げられる。
好ましくは、脂肪酸エステルは、ポリオキシエチレンソルビタン又はイソソルビド脂肪酸モノ－、ジ－又はトリエステルである。好ましい実施形態では、本発明内の脂肪酸エステルは、ポリオキシエチレン（４）ソルビタンのモノエステル、ポリオキシエチレン（５）ソルビタンのモノエステル又はポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのモノエステルである。
ポリオキシエチレン（４）ソルビタン、ポリオキシエチレン（５）ソルビタン又はポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのモノエステルは、好ましくは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６１、ポリソルベート８０、ポリソルベート８１、ポリソルベート１２０及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。ポリソルベート２０は、大部分がポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのモノラウレートエステルを含む。ポリソルベート４０は、大部分がポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのモノパルミチン酸エステルを含む。ポリソルベート６０は、大部分がポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのモノステアリン酸エステルを含む。ポリソルベート６１は、大部分がポリオキシエチレン（４）ソルビタンのモノステアリン酸エステルを含む。ポリソルベート８０は、大部分がポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのモノオレイン酸エステルを含む。ポリソルベート８１は、大部分がポリオキシエチレン（５）ソルビタンのモノオレイン酸エステルを含む。ポリソルベート１２０は、大部分がポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのモノステアリン酸エステルを含む。
別の好ましい実施形態では、脂肪酸エステルがポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのモノエステルである。好ましくは、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのモノエステルは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、ポリソルベート１２０及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。より好ましくは、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのモノエステルは、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。最も好ましくは、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのモノエステルは、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
別の好ましい実施形態では、本発明内の脂肪酸エステルは、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのトリエステルである。好ましくは、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのトリエステルは、ポリソルベート６５、ポリソルベート８５及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。ポリソルベート６５は、大部分がポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのリステアリン酸エステルを含む。ポリソルベート８５は、大部分がポリオキシエチレン（２０）ソルビタンのトリオレイン酸エステルを含む。
別の好ましい実施形態では、本発明内の脂肪酸エステルはモノ－又はジアシルグリセロール、サッカライド－脂肪酸エステル、又はα－トコフェリルＰＥＧスクシネート（ＴＰＧＳ）である。本明細書で言及される全ての界面活性剤を組み合わせることができることは明らかである。
上述のように、界面活性剤の分解は、脂肪酸エステルの加水分解であり得る。加水分解による界面活性剤の損失は、タンパク質の凝集をもたらすことができ、可視粒子の形成及び／又はサブビジブル粒子形成をもたらし得る。また、界面活性剤自体の分解生成物は、可視粒子及び／又はサブビジブル粒子の形成をもたらし得る。本明細書で想定され、上に記載されるように、本発明の方法は、タンパク質を含む組成物における加水分解活性を低下させ得る。したがって、タンパク質を含む組成物から調製された製剤は、加水分解活性が低下している可能性があるか、又は加水分解活性を本質的に含まないことも想定される。当業者は、調製された製剤における加水分解活性の低下又は加水分解活性がないことにより、調製された製剤中の可視粒子及び／又はサブビジブル粒子の量が減少することを認識するであろう。調製された製剤は、可視粒子及び／又はサブビジブル粒子を含まないか、又は本質的に含まないことも可能である。調製された製剤は、貯蔵時に可視粒子及び／又はサブビジブル粒子を含まないか、又は本質的に含まないことが特に重要である。対応する定義は、上記で既に提供されている。これらの定義及び説明は、ここでは必要な変更を加えて適用される。
したがって、本発明は、一態様では、本明細書に記載のタンパク質製剤を調製するための方法に関し、タンパク質製剤は、特に貯蔵時に、可視粒子及び／又はサブビジブル粒子を（本質的に）含まない。
可視粒子及びサブビジブル粒子は、分析方法によって特徴付けられ（方法のリストについては表Ａを参照されたい）、対応する規制（ＥＰ２．９．１９、ＥＰ２．９．２０、ＵＳＰ＜７８７＞、ＵＳＰ＜７８８＞、ＵＳＰ＜７８９＞）内の要件に従って分類される。粒子の定量化及び化学的同定は、粒子リスク評価を知らせるために使用される。目視検査による可視粒子の検出は確率的であり、粒径、形態、色、密度、反射率、周囲の配合物の特性、測定条件、及び人間の性能に依存する。公開された研究は、１５０μｍが、ＵＳＰ＜１７９０＞（２０１１）ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈ．１２：２１５－２２１）で論じられているように、人間の検査員によって７０％を超える確率で検出される（方法を較正するために使用される）球形ポリスチレン粒子標準のサイズであることを示している。
サブビジブル粒子はまた、１０μｍ以上及び２５μｍ以上の粒子（及び眼科用溶液については５０μｍ以上）について薬局方及び製品仕様の限界に従って評価される。２μｍ以上及び５μｍ以上の粒子集団も通常、特に製品開発中に監視される。現在利用可能な技術（例えば、ＨＩＡＣ）に基づくサブビジブル粒子の検出の上限は１００μｍである。
米国薬局方（ＵＳＰ）（ＵＳＰ＜７８８＞）と一致して、「可視グレーゾーン」は、可視検査による粒子検出の確率が１５０μｍでの７０％未満からサブビジブル粒子検出能力の上端である５０μｍ付近で０まで低下する、可視検査の下端のサイズ範囲を指す。
粒子の許容量は、１０個の容器あたり７個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、２個未満、又は１個未満であってもよい。
当業者は、粒子に関する追加情報（例えば、欧州薬局方（ＥＰ）２．９．１９、ＥＰ２．９．２０、ＵＳＰ＜７８７＞、ＵＳＰ＜７８８＞、ＵＳＰ＜７８９＞、Ｍａｔｈｏｎｅｔ（２０１６）ＰＤＡ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ．７０：３９２－４０８，Ｒｅｃｈ（２０２０）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１０９：１７２５－１７３５）を受け取る方法をよく知っている。
Figure 2023536366000024
 表Ａ：粒子の検出／特性評価の方法
既に上述したように、当局は、医薬製剤の可視粒子及び／又はサブビジブル粒子の数に制限を与える。その結果、医薬製剤は、可視粒子及び／又はサブビジブル粒子の形成のために、一定時間後にはもはや使用することができない。
可視粒子及び／又はサブビジブル粒子の形成が減少したタンパク質製剤は、安定性が増加しているか、又はより安定であることが本明細書で想定される。言い換えれば、可視粒子及び／又はサブビジブル粒子の形成が減少したタンパク質製剤は、貯蔵寿命が増加する。
したがって、加水分解活性が低下したタンパク質製剤は、安定性の増加、貯蔵寿命の増加、又はより長い安定性を有し得る。
したがって、本発明は、一態様では、タンパク質製剤を調製するための方法であって、本明細書に記載の方法の工程を含み、タンパク質製剤を調製するための方法が、タンパク質を含む組成物に、界面活性剤、好ましくは脂肪酸エステルを添加することを更に含む、方法に関し、該タンパク質製剤は、安定性の増加、貯蔵寿命の増加、及び／又は（より長い）安定性、特に貯蔵安定性を有する。
医薬品（例えば、本明細書で定義されるタンパク質製剤）の長期安定性データは、貯蔵寿命を通して適切な安定性を確認するために生成されなければならない。バイオテクノロジー医薬品については、典型的には３つの標準的な長期条件が考慮される。長期条件は推奨保存条件とも名付けられる。これは、提案されたラベル保存条件を表す。
標準的な長期条件は、以下を含むことができる：
（ｉ）最低６ヶ月の期間（ＩＣＨ Ｑ５Ｃによる）、冷凍庫（－２０℃）（ＩＣＨ Ｑ１Ａによる）での貯蔵、
（ｉｉ）最低６ヶ月の期間（ＩＣＨ Ｑ５Ｃによる）、冷蔵庫（５℃（ＩＣＨ Ｑ１Ａによる）、すなわち医薬品の推奨保存条件）での貯蔵、
（ｉｉｉ）最低６ヶ月の期間（ＩＣＨ Ｑ５Ｃによる）、室温（２５℃）（ＩＣＨ Ｑ１Ａによる）での貯蔵。
標準的な長期条件（「標準的な長期保存条件」又は「推奨保存条件」とも呼ばれる）は、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間、少なくとも３６ヶ月間、又は少なくとも６０ヶ月間の保存を含み得る。
したがって、医薬品（例えば、本明細書で定義されるタンパク質製剤）の安定性は、そのような「標準的な長期条件下」で試験及び／又は確認することができる。
実際には、市販品の承認には少なくとも１８ヶ月の貯蔵寿命（すなわち、安定性）が必要であることが理解される。したがって、本明細書で使用される標準的な長期条件（「標準的な長期保存条件」又は「推奨保存条件」とも呼ばれる）は、好ましくは少なくとも１８ヶ月間の保存を含む。しかしながら、実際の目的では、データをより長い保存時間に外挿することができるため、少なくとも６ヶ月間の長期安定性試験で十分であり得る。
「少なくともＸヶ月」という用語は、特定の期間、すなわち「Ｘヶ月」を指すことができることが理解される。例えば、「少なくとも６ヶ月間（の貯蔵）」という用語は、「６ヶ月間（の貯蔵）」等を指すことができる。
重要な品質属性は、適切な分析方法論を適用して定期的に評価されるべきである。
本明細書中上に記載されるように、本発明の方法の工程（ｉ）は、タンパク質を含む組成物における加水分解活性を低下させることが想定される。
したがって、本発明は、一態様では、本明細書に記載のタンパク質製剤を調製するための方法に関し、タンパク質製剤は、該方法の工程（ｉ）に供されないタンパク質製剤と比較して、安定性の増加、貯蔵寿命の増加、又はより長い安定性を有する。
本発明は更に、タンパク質製剤を４℃で最大１８ヶ月間、最大２４ヶ月間、最大３６ヶ月間又は最大６０ヶ月間貯蔵することができ、特に製剤が（より）安定であり、特に（より）貯蔵安定性である、本明細書に記載のタンパク質製剤を調製するための方法に関する。
例えば、製剤は、安定性試験中、好ましくは本明細書に記載の標準的な長期条件下、例えば２～８℃、好ましくは約５℃で、少なくとも２ヶ月間、より好ましくは少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間、少なくとも３６ヶ月間、又は少なくとも６０ヶ月間、実質的な可視粒子形成を示さない。
実質的な可視粒子形成がないとは、２０個未満の可視粒子が１ｍＬの製剤中で形成されることを意味する。好ましくは、製剤の貯蔵について指定された条件での安定性試験中に、製剤１ｍＬ当たり１５個以下、より好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下、最も好ましくは１個未満の粒子が形成される。
上述のように、本明細書で使用される場合、「可視粒子」とは、直径５０μｍ以上、好ましくは１００μｍ以上、より好ましくは５００μｍ以上、最も好ましくは１ｍｍ以上の粒子を意味する。粒子は、任意に拡大手段を使用して肉眼で観察するか、又は前述のように、例えばフィルムカメラ及びフィルム材料を分析するための適切な手段等の自動化されたプロセスによって観察することができる。
上記のように、調製されたタンパク質製剤における加水分解活性が低下することが想定される。その結果、脂肪酸エステルの分解も、調製されたタンパク質製剤において低減され得る。
したがって、本発明は、脂肪酸エステルの分解が、例えば、初期製剤（貯蔵開始前の製剤）と比較して、好ましくは２４ヶ月以内に２０％未満、１５％未満、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満又は１％未満である、本明細書に記載のタンパク質製剤を調製するための方法に関する。これは、安定性試験中（好ましくは本明細書に記載の標準的な長期条件下）に決定することができる。
好ましくは、脂肪酸エステルの分解は、例えば、初期製剤（貯蔵開始前の製剤）と比較して、２４ヶ月以内に１０％未満である。これは、安定性試験中（好ましくは本明細書に記載の標準的な長期条件下）に決定することができる。
上述のように、タンパク質を含む組成物中のタンパク質は、好ましくは抗体である。したがって、本明細書では、本発明内のタンパク質製剤中のタンパク質が抗体であることも想定される。製剤中の抗体の濃度は、１ｍｇ／ｍｌ未満又は２５０ｍｇ／ｍｌ超であり得る。通常、抗体の濃度は１ｍｇ／ｍｌ～２５０ｍｇ／ｍｌである。
したがって、本発明は、タンパク質が抗体であり、抗体濃度が少なくとも１ｍｇ／ｍｌ～最大２５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも５ｍｇ／ｍｌ～最大２００ｍｇ／ｍｌである、タンパク質製剤を調製するための方法に関する。
例えば、抗体濃度は、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１１０ｍｇ／ｍｌ、１２０ｍｇ／ｍｌ、１３０ｍｇ／ｍｌ、１４０ｍｇ／ｍｌ、１５０ｍｇ／ｍｌ、１６０ｍｇ／ｍｌ、１７０ｍｇ／ｍｌ、１８０ｍｇ／ｍｌ、１９０ｍｇ／ｍｌ又は２００ｍｇ／ｍｌであり得る。
当業者には明らかであるが、界面活性剤に加えて、タンパク質を含む組成物に追加の物質を添加してもよいことに留意されたい。そのような物質は、緩衝剤、添加物、希釈剤、安定剤、担体及びそれらの組み合わせであり得る。
したがって、本発明は、タンパク質を含む組成物に、緩衝剤、添加物、希釈剤、安定剤、及び／又は担体を添加することを更に含む、本明細書に記載のタンパク質製剤を調製するための方法に関する。
適切な緩衝剤、添加物、希釈剤、安定剤、及び担体の例は、当技術分野で周知である。適切な緩衝液、添加物、希釈剤、安定剤、及び担体は、タンパク質製剤中のタンパク質が当該緩衝液、賦形剤、希釈剤、安定剤、及び担体と接触してその生物学的活性を保持する限り、任意の材料を含み得る。
緩衝剤の非限定的な例は、本明細書において上に提供されている。他の物質の非限定的な例は、トレハロース、スクロース、ソルビトール、塩化ナトリウム、塩化カリウム及び塩化カルシウム、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール、ヒト血清アルブミン、レシチン、デキストラン、エチレンオキシド－プロピレンオキシドコポリマー、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエチレングリコール、Ｎ－アセチルシステイン、Ｎ－アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ－アスコルビン酸及びその塩、Ｌ－パルミチン酸アスコルビル、Ｌ－ステアリン酸アスコルビル、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル及び没食子酸プロピル、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム及びメタリン酸ナトリウムである。
調製されたタンパク質製剤は、医薬組成物（又は言い換えれば医薬製剤）であり得ることは明らかである。
したがって、本発明は、タンパク質製剤が医薬組成物である、本明細書に記載のタンパク質製剤を調製するための方法に関する。
本明細書に記載の医薬組成物の投与は、種々の方法、例えば、非経口、皮下、静脈内、動脈内、腹腔内、局所、気管支内、肺内及び鼻腔内投与、並びに局所処置のために所望される場合、病巣内投与によって行われ得る。本明細書中に記載される医薬組成物はまた、例えば、具体的に影響を受ける器官のような外部又は内部の標的部位への生物学的送達によって、標的部位に直接投与され得る。
タンパク質製剤は、例えばｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｅｘ ｖｉｖｏ診断方法のための診断組成物であり得ることも本明細書で想定される。
本発明の利点は、加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化され、タンパク質及びそれに由来するタンパク質製剤を含む組成物を汚染しないことである。
したがって、本発明は、タンパク質を含む組成物及び／又はタンパク質製剤に関し、タンパク質を含む組成物及び／又はタンパク質製剤は、加水分解酵素阻害剤を本質的に含まない（例えば、加水分解酵素阻害剤は、タンパク質及び／又はタンパク質製剤を含む組成物中に存在せず（又はそれらの存在は検出できない）、又は加水分解酵素阻害剤は、微量でのみ存在する）。
本発明は更に、本明細書に記載の方法によって得られるか又はそれによって得ることができるタンパク質を含む組成物に関する。
したがって、本発明はまた、本明細書に記載のタンパク質製剤を調製するための方法によって得られるか又はそれによって得ることができるタンパク質製剤に関する。
本明細書では、本発明のタンパク質製剤が医薬として使用されることも想定される。換言すれば、本発明のタンパク質製剤は、医薬として使用されるか、又は薬品に使用されることが想定される。
したがって、本発明は更に、本明細書に記載のタンパク質製剤を調製するための方法によって得られるか又はそれによって得ることができるタンパク質製剤であって、医薬として使用するためのタンパク質製剤に関する。したがって、本発明は更に、本明細書に記載のタンパク質製剤を調製するための方法によって得られるか又はそれによって得ることができるタンパク質製剤であって、薬品に使用するためのタンパク質製剤に関する。加えて、本発明は更に、本明細書に記載のタンパク質製剤を調製するための方法によって得られるか又はそれによって得ることができるタンパク質製剤であって、疾患の処置において使用するためのタンパク質製剤に関する。本発明はまた、本明細書に記載のタンパク質製剤を調製するための方法によって得られるか又はそれによって得ることができるタンパク質製剤であって、疾患を処置するための医薬の調製に使用するためのものであるか、又は診断組成物の調製に使用するためのものであるタンパク質製剤に関する。
更に、本発明は、本明細書に記載のタンパク質製剤を調製するための方法によって得られるか又はそれによって得ることができるタンパク質製剤を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患の処置方法に関する。
固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤は、タンパク質及び／又はタンパク質製剤を含む組成物を調製するために使用できることは明らかである。
したがって、一態様では、本発明は、タンパク質を含む組成物を調製するための固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤の使用に関する。したがって、一態様では、本発明はまた、タンパク質製剤を調製するための固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤の使用に関する。一態様では、本発明はまた、タンパク質組成物及び／又はタンパク質製剤を調製するための固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤の使用に関する。一態様では、本発明はまた、タンパク質組成物及び／又はタンパク質製剤における加水分解活性を除去又は低減するための、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤の使用に関する。一態様では、本発明はまた、タンパク質組成物及び／又はタンパク質製剤中の不純物、特に宿主細胞タンパク質、好ましくは加水分解酵素（複数可）を、除去又は（その含有量を）低減するための、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤の使用に関する。一態様では、本発明はまた、タンパク質組成物及び／又はタンパク質製剤中の可視粒子及び／若しくはサブビジブル粒子（の形成）並びに／又は界面活性剤分解物の発生／存在を阻害又は低減するための、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤の使用に関する。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語又はそれらの文法上の変形は、記載された特徴、整数、工程又は構成要素を特定するものとして解釈されるべきであるが、１つ以上の追加の特徴、整数、工程、構成要素又はそれらの群の追加を排除するものではない。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」／「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」／「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語を包含する。したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」／「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」／「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語が本明細書で使用される場合はいつでも、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」又は好ましくは「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」に置き換えることができる。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」／「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」／「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、任意の更なる成分（又は同様に、特徴、整数、工程等）が存在し得ることを意味する。
「からなる」という用語は、更なる成分（又は同様に、特徴、整数、工程等）が存在し得ないことを意味する。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語又はその文法上の変形は、記載された特徴、整数、工程又は構成要素を特定するものと解釈されるべきであるが、１つ以上の追加の特徴、整数、工程、構成要素又はそれらの群の追加を排除するものではなく、追加の特徴、整数、工程、構成要素又はそれらの群が、特許請求される製品、組成物、デバイス又は方法等の基本的で新規な特徴を実質的に変更しない場合に限られる。
したがって、「から本質的になる」という用語は、特定の更なる成分（又は同様に、特徴、整数、工程等）、すなわち製品、組成物、デバイス又は方法の本質的な特性に実質的に影響を及ぼさない成分が存在し得ることを意味する。換言すれば、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」という用語（これは、「実質的に含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」という用語と本明細書では交換可能に使用され得る）は、製品、組成物、デバイス又は方法の本質的な特徴が他の成分の存在によって実質的に影響されない限り、必須成分（又は同様に、特徴、整数、工程等）に加えて、製品、組成物、デバイス又は方法中の他の成分の存在を可能にする。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は±１０％を指す。
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。
本発明は、添付の非限定的な図面及び実施例によって説明される。
固定化に使用される加水分解酵素阻害剤の化学構造。(Ａ）実施例４で使用されるアルキン置換オルリスタット変異体１「オルリスタットＡ」（式（１）又は同様に化合物Ａ）。 固定化に使用される加水分解酵素阻害剤の化学構造。(Ｂ）実施例１～４で使用されるアルキン置換オルリスタット変異体２「オルリスタットＢ」（式（２）又は同様に化合物Ｂ）。 固定化に使用される加水分解酵素阻害剤の化学構造。(Ｃ）実施例５で使用される「ビス－エノール－エステル」試薬（式（３）又は同様に化合物Ｃ）。 ストレプトアビジンＭａｇセファロースビーズ上に固定化されたオルリスタットＢを使用した、トシリズマブ溶液からの組換えＬＰＬＡ２の除去。オルリスタットＢ：Ｍａｇ－セファロース－ストレプトアビジン＋アゾ－ビオチン－アジド（アゾ－ビオチン－ＰＥＧ３－アジド）＋アルキン－オルリスタットＢ；ビーズ対照：Ｍａｇ－セファロース－ストレプトアビジン＋アゾ－ビオチン－アジド；５ｍｇ／ｍＬトシリズマブ＋５０ｐｐｍ ｒｅｃ．ＬＰＬＡ２（＝２５０ｎｇ／ｍＬ ＬＰＬＡ２）におけるフィッシング。(Ａ）コンジュゲートビーズとのインキュベーション後のＬＰＬＡ２スパイクトシリズマブ上清のリパーゼ活性アッセイ。５ｎｇ／ｍＬの等価ＬＰＬＡ２について活性を示す。(Ｂ）オンビーズ消化した試料からのＬＰＬＡ２ ＬＣ ＭＳ／ＭＳ分析のスペクトルカウント。 １００ｍｇ／ｍＬトシリズマブ＋５０ｐｐｍ ｒｅｃ．ＬＰＬＡ２（＝５μｇ／ｍＬ ＬＰＬＡ２）におけるコンジュゲートビーズによるフィッシング後のトシリズマブ溶液のリパーゼ活性アッセイ。５ｎｇ／ｍＬの等価ＬＰＬＡ２について活性を示す。オルリスタットＢ：Ｍａｇ－セファロース－ストレプトアビジン＋アゾ－ビオチン－アジド＋アルキン－オルリスタットＢ；リンカー対照：Ｍａｇ－セファロース－ストレプトアビジン＋アゾ－ビオチン－アジド；ｍＡｂ＋ＬＰＬＡ２：１００ｇ／ｌトシリズマブ＋５０ｐｐｍ ｒｅｃ．ＬＰＬＡ２（＝５μｇ／ｍＬ ＬＰＬＡ２）；ｍＡｂ１００ｇ／Ｌトシリズマブ。 グロフィタマブＭＭＡＥＸ負荷溶液のリパーゼ活性アッセイ。所与の活性を１００μｇのタンパク質に対して正規化する。各バーは、１つの技術的なフィッシング複製物を表す。グロフィタマブＭＭＡＥＸ負荷溶液におけるフィッシング実験のためのビーズ組成物は以下の通りであった：ＮＨＳ活性化セファロース。「オルリスタットＢを含むＮＨＳ」：ＮＨＳ活性化セファロースビーズ＋アジド－ＰＥＧ４－アミン＋アルキン－オルリスタットＢ；「オルリスタットＢを含まないＮＨＳ」：ＮＨＳ活性化セファロースビーズ＋アジド－ＰＥＧ４－アミン＋ビオチン－ＰＥＧ４－アルキン；「ＮＨＳ」：ＮＨＳ活性化セファロースビーズ。ストレプトアビジンセファロースビーズ。「オルリスタットＢを含まないＳｅｐｈ－ＳＡ」：ストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能ビーズ＋ビオチン－ＰＥＧ４－アジド＋アルキン－オルリスタットＢ；「オルリスタットＢを含まないＳｅｐｈ－ＳＡ」：ストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能ビーズ＋ビオチン－ＰＥＧ４－アジド＋ビオチン－ＰＥＧ４－アルキン；「Ｓｅｐｈ－ＳＡ」：ストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能ビーズ。「グロフィタマブ対照」は、出発タンパク質組成物の活性を指す。利用可能なビーズ材料は、「ＮＨＳ」、「オルリスタットＢを含むＳＡ」及び「ＳＡ」について２回のフィッシング実験を行うのに十分であったため、３回の測定は欠けている。 トラスツズマブのコンディショニング後プロテインＡ溶出プール試料のリパーゼ活性アッセイ。ロードのみ、ビーズなし。所与の活性を１００μｇのタンパク質に対して正規化する。トラスツズマブのコンディショニング後プロテインＡ溶出プールにおける実験のためのビーズ組成物は以下の通りであった：オルリスタットＡを含むＳｅｐｈ－ＮＨＳ：ＮＨＳ活性化セファロースビーズ＋アジド－ＰＥＧ４－アミン＋アルキン－オルリスタットＡ；オルリスタットＢを含むＳｅｐｈ－ＮＨＳ：ＮＨＳ活性化セファロースビーズ＋アジド－ＰＥＧ４－アミン＋アルキン－オルリスタットＢ；オルリスタットを含まないＳｅｐｈ－ＮＨＳ：：ＮＨＳ活性化セファロースビーズ＋アジド－ＰＥＧ４－アミン＋ビオチン－ＰＥＧ４－アルキン；オルリスタットＡを含むＳｅｐｈ－ＳＡ：ストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能ビーズ＋ビオチン－ＰＥＧ４－アジド＋アルキン－オルリスタットＡ；オルリスタットＢを含むＳｅｐｈ－ＳＡ：ストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能ビーズ＋ビオチン－ＰＥＧ４－アジド＋アルキン－オルリスタットＢ；オルリスタットを含まないＳｅｐｈ－ＳＡ：ストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能ビーズ＋ビオチン－ＰＥＧ４－アジド＋ビオチン－ＰＥＧ４－アルキン；トラスツズマブ対照は、出発タンパク質組成物の活性を指す。 ビス－エノールエステル官能化ビーズに結合したリパーゼＣａｌＢ２のペプチドピーク強度。共有結合したリパーゼＣａｌＢ２（ビーズ表面露出アルキン基とのクリック反応後のビス－エノール－エステル部分（化合物Ｃ（又は同様に式（３））によって支持された洗浄工程後の官能化ビーズ上の２つのペプチド（ペプチドＣａｌＢ２リパーゼ１：ＬＭＡＦＡＰＤＹＫ及びＣａｌＢ２リパーゼ２：ＰＦＡＶＧＫ）に基づく））のピーク強度（右）正規化レベルでのＬＣ－ＭＳベースの読み出しを示す。ｍＡｂ吸着、消化及びＬＣ－ＭＳ実験（左右）のための対照ペプチドとして非共有結合的に吸着されたｍＡｂ（ペプチドＭａｂ：ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ）。図６左は、図６右に示す官能化ビーズと同じ試料処理工程を使用した非官能化ビーズを示す。非官能化ビーズは、ビス－エノール－エステル部分を欠いており、したがって、その表面に残留アルキン部分のみを有する。非共有結合的に吸着されたｍＡｂペプチドは、ワークフロー全体における信頼性を提供する。欠損したリパーゼペプチドは、非共有結合したリパーゼを除去する洗浄プロトコルの能力を示す。 タンパク質を含む組成物を調製するための概略的なプロセス。図７は、本発明によるタンパク質（目的のタンパク質）を含む組成物を調製するための例示的なプロセス又は方法を示す。典型的なプロセス又は方法は、目的のタンパク質の（従来の）調製及び／又は精製、すなわち細胞培養物からタンパク質組成物を調製する少なくとも４つのその後の工程、続いて典型的には（少なくとも）３つの（従来の）クロマトグラフィー工程、任意に４つの（従来の）クロマトグラフィー工程を含む。したがって：タンパク質組成物が細胞培養又は培養上清から調製された後（工程１）、プロセスは、典型的には３つの後続の（従来の）クロマトグラフィー工程を含み、例えば通常、それぞれが異なる精製原理を採用する３つのカラム（任意に４つのカラム）を使用する（工程２～４、又は任意の工程５（カラム４）が含まれる場合、工程２～５）。最初に、細胞培養物（目的のタンパク質／タンパク質を産生する細胞）からの組成物を、例えば細胞をホモジナイズすることによって調製する。組成物は、細胞培養上清であってもよい。好ましくは、上記組成物は続いて精製され、例えば、組成物は次いで、細胞、細胞残屑及び／又は凝集体から（例えば濾過によって）分離された組成物である。したがって、（続いて精製される）組成物は、細胞、細胞残屑及び／又は凝集体から（濾過によって）分離された組成物であり、例えば、回収細胞培養液（Ｈａｒｖｅｓｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆｌｕｉｄ）（ＨＣＣＦ）である。第２に、上記組成物を、例えばタンパク質調製及び／又は精製の更なる工程（工程２）によって更に精製する。タンパク質調製及び／又は精製の更なる工程は、好ましくはアフィニティークロマトグラフィー（好ましくはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）である。したがって、アフィニティークロマトグラフィー（好ましくはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）が好ましくは第１のクロマトグラフィー工程である。例えば、上記組成物（例えば、回収細胞培養液（ＨＣＣＦ））をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーに供する。言い換えれば、プロセスは、アフィニティークロマトグラフィーカラム（プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム）の使用を含む。第３に、次いで溶出液を第２のカラム（カラム２）／工程３）に供する。第４に、次いで、第２のカラムの溶出液を第３のカラムに供する（カラム３／工程４）。第５に、品質（例えば、目的のタンパク質の純度）が達成されないか、又は第４の工程の後（すなわち、３つのカラムの後（好ましくはそれぞれ異なる精製原理を使用する）、任意に第５の工程（例えば、第４の精製原理を有する第４のカラム）を使用することができる（カラム４／工程５）。当業者は、例えばコスト及び／又は複雑さの増加と品質の改善とのバランスをとる場合に、第５の工程が必要であるかどうか及び／又は有益であるかどうかを事例ごとに決定することができる。したがって、工程３～５は、任意の順序で、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）又は陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ））、混合モードクロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）であり得る。言い換えれば、カラム２～４は、任意の順序のイオン交換クロマトグラフィーカラム（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）カラム又は陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）カラム）、混合モードクロマトグラフィーカラム及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムであり得る、すなわち、プロセスは、任意の順序の上記のカラムのいずれかの使用を含む。精製プロセスの開発中、当業者は、使用されるカラムの工程／順序を決定することができる。第６に、カラム３又は任意のカラム４（工程４及び任意に工程５）の後、溶出液をウイルス濾過に供し、次いで、第７に、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）に供する。このプロセスは、工程「（ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤（オルリスタット等）と接触させる工程であって、該加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程」を含む（例えば、この工程は、加水分解酵素阻害剤クロマトグラフィー（加水分解酵素阻害剤クロマトグラフィー工程）である）。言い換えれば、このプロセスは、加水分解酵素阻害剤（例えば、オルリスタット）カラムの使用を含む。好ましくは、加水分解酵素阻害剤クロマトグラフィー／クロマトグラフィー工程は、アフィニティークロマトグラフィー（好ましくはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）の工程／工程２に続く。言い換えれば、このプロセスは、プロテインＡカラムに（直接）続く加水分解酵素阻害剤（例えば、オルリスタット）カラムの使用を含む。あるいは、加水分解酵素阻害剤クロマトグラフィー／クロマトグラフィー工程は、工程３～５（工程３～５は、任意の順序のイオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）又は陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ））、混合モードクロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）であり得る）のいずれか１つに続く。言い換えれば、このプロセスは、イオン交換クロマトグラフィーカラム（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）カラム又は陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）カラム）、混合モードクロマトグラフィーカラム及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムを任意の順序で使用した（直）後の加水分解酵素阻害剤（例えば、オルリスタット）カラムの使用を含む。加水分解酵素阻害剤クロマトグラフィー／クロマトグラフィー工程は、通常、細胞培養物からタンパク質組成物を調製する最初の工程（例えば、ＨＣＣＦに従わない）の（直）後に続かない。言い換えれば、加水分解酵素阻害剤クロマトグラフィー／クロマトグラフィー工程は、通常、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）／工程２の前に行われない。これは、そのような初期タンパク質組成物（例えば、細胞培養物／細胞培養物の上清からのタンパク質組成物、好ましくはＨＣＣＦ）が、典型的には依然として高度の不純物、例えば細胞、細胞残屑及び／又は凝集体を含むためである。したがって、このプロセスは通常、細胞培養物からタンパク質組成物を調製する最初の工程の後に（直接）加水分解酵素阻害剤（例えばオルリスタット）カラムを使用することを含まず、及び／又は通常、アフィニティークロマトグラフィーカラム（例えばプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム）を使用する前に加水分解酵素阻害剤（例えばオルリスタット）カラムを使用することを含まない。
実施例は、本発明を例示する。
実施例１：ストレプトアビジンＭａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズに固定化したオルリスタットＢを用いた加水分解活性の低下及びｒｅｃ．ＬＰＬＡ２スパイクトシリズマブ溶液（５ｍｇ／ｍＬ）からのＬＰＬＡ２の除去
以下の実験は、ストレプトアビジン磁気セファロースビーズ上に固定化されたオルリスタットＢ（式（２）又は化合物（Ｂ））（図１Ｂを参照されたい）を使用したトシリズマブ溶液からの組換えリソソームホスホリパーゼＡ２（ＬＰＬＡ２）の除去を実証する。
官能化ビーズを、クリックケミストリーあたりのオルリスタットＢ（ＡＳＭ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＧｍｂＨ）とアゾビオチン－アジド（アゾビオチン－ＰＥＧ３－アジド）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ；注文番号：９００８９１；ＣＡＳ １３３９２０２－３３－３）とのコンジュゲーション、及びストレプトアビジンに結合したビオチン基のストレプトアビジンに対する高い親和性を活用するストレプトアビジンＭａｇセファロースビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したその後のカップリング工程を含む２段階手順によって調製した。
クリック反応（試料／対照）を、表１に示す順序に従って反応管内で試薬を混合することによって行った。
Figure 2023536366000025
 表１：実施例１の銅触媒クリック反応組成物
オルリスタット又は対照ビーズ用のＤＭＳＯのみのいずれかを含む両方の反応混合物を、ローラーミキサー上で室温で２時間インキュベートし、溶媒を真空遠心機（４５℃、２時間）を使用して蒸発させた。ペレットを２００μＬのＤＭＳＯに溶解し、更なる使用まで４℃で保存した。
ストレプトアビジンＭａｇセファロースビーズとのコンジュゲーションのため、１ｍＬの１０％培地スラリーを１ｍＬの１×ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。洗浄後、１ｍＬの１０％培地スラリーを、上記の１００μＬのクリック反応生成物（試料／対照、それぞれ２連）と混合し、ローラーミキサーで１時間インキュベートした。コンジュゲートビーズを１ｍＬの１×ＰＢＳで５回洗浄し、更なる使用まで４℃で保存した。
トシリズマブを、最終抗体濃度５ｍｇ／ｍＬ及びＬＰＬＡ２濃度５０ｐｐｍ（２５０ｎｇ／ｍＬ）を得るため、ｒｅｃ．ＬＰＬＡ２でスパイクした（表２）。
Figure 2023536366000026
 表２：５０ｐｐｍのＬＰＬＡ２を５ｍｇ／ｍｌのトシリズマブ溶液においてスパイクした
フィッシング反応ごとに、５００μＬのＬＰＬＡ２スパイクトシリズマブを、９００ｒｐｍでＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ（登録商標）において３７℃で４時間、２００μＬのコンジュゲートビーズ（試料／対照）とインキュベートした。インキュベーション後、上清（試料／対照）をリパーゼ活性アッセイ（下記の「リパーゼ活性アッセイ」を参照されたい）によって評価し、オンビーズ消化及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために処理したコンジュゲートビーズ（試料／対照）を評価した（下記の「オンビーズ消化及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ」を参照されたい）。
リパーゼ活性アッセイ
この段落は、実施例１、２、３及び４で行われたリパーゼ活性アッセイを記載する。リパーゼ活性アッセイは、基質エステル結合の切断による非蛍光基質（４－ＭＵＣＡ、Ｃｈｅｍ Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔ’ｌ Ｉｎｃ）の蛍光生成物（４－ＭＵ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）への変換をモニターすることによってリパーゼ活性を測定した。アッセイ反応混合物は、８０μＬの反応緩衝液（１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．２５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００及び０．１２５％（ｗ／ｖ）アラビアガム）、１０μＬの４－ＭＵＣＡ基質（ＤＭＳＯ中１ｍＭ）、及び１０μＬのタンパク質試料を含んでいた。対応する実施例で使用した試料濃度及び対応する緩衝液を表３に列挙する。
Figure 2023536366000027
 表３：リパーゼ活性アッセイで使用される抗体溶液の試料濃度及び対応する緩衝液の要約
＊トラスツズマブコンディショニング後プロテインＡ溶出プールを、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍｌ遠心フィルターユニット（１０，０００Ｄａカットオフ、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用することによって１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０に再緩衝化した。
＊＊タンパク質溶液をビーズと共にインキュベートした後、各試料の試料濃度を再度測定した。これを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）Ｏｎｅ Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を使用して２連で行った。
各反応を９６ウェル半面積ポリスチレンプレート（蓋付き黒色透明平底、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）に技術的三連でセットアップし、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において反応プレートを３７℃で２時間インキュベートすることによって蛍光シグナル（３５５ｎｍで励起、４６０ｎｍで発光）の増加を１０分ごとにモニターした。ＭＵ生成速度を、蛍光時間経過（０．５時間～２時間）の傾きから求め、反応の生の速度（ｋｒａｗ［ＲＦＵ／ｈ］）を表す。
酵素ブランク反応を更に設定して、緩衝マトリックスによって引き起こされる基質の非酵素的切断を測定した。１０μＬのタンパク質試料を、反応混合物中の１０μＬの試料緩衝液（表３）に置き換えた。自己開裂速度（ｋ自己開裂［ＲＦＵ／ｈ］）を、蛍光の時間経過（０．５時間～２時間）の傾きから求めた。蛍光シグナル（ＲＦＵ）をμＭのＭＵに変換するために、標準的なＭＵ ３連をプレートごとに添加した。１０μＬのＭＵ（ＤＭＳＯ中１００μＭ）に、１０μＬの試料緩衝液（表３）及び８０μＬの反応緩衝液を補充した。変換係数ａ［ＲＦＵ／μＭ］は、蛍光シグナル（０．５時間～２時間）を平均し、ウェル中に存在するＭＵの最終濃度で割ることによって計算した。
試料の反応速度（ｋｒａｗ［ＲＦＵ／ｈ］）から酵素ブランクの反応速度（ｋ自己開裂［ＲＦＵ／ｈ］）を差し引き、項を変換係数ａ［ＲＦＵ／μＭ］で割ることによって蛍光シグナルをμＭ ＭＵ／ｈに変換することにより、［μＭ ＭＵ／ｈ］で示される試料のリパーゼ活性を決定した。活性は、ウェルあたりに適用したリパーゼ濃度（表３の行１及び２）又は１００μｇの抗体に対して正規化した活性（表３の行３及び４）のいずれかを報告した（図２Ａの説明も参照されたい）。
オンビーズ消化及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ
オンビーズ消化のため、コンジュゲートビーズ（試料、対照）を１ｍＬの１×ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で３回、１ｍＬの１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳで３回、１ｍＬの変性緩衝液（４００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、８Ｍ ＧｄｍＣｌ、ｐＨ８．５）で３回、１ｍＬの１×ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４）で５回連続して洗浄した。上清を捨て、ビーズを３００μＬの変性緩衝液（４００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、８Ｍ ＧｄｍＣｌ、ｐＨ８．５）及び１０μＬのＤＴＴ溶液（ＰＷＡ中０．１ｇ ＤＴＴ／ｍＬ）中、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ（登録商標）内、５０℃、９００ｒｐｍで６０分間インキュベートした。インキュベーション後、ヨード酢酸溶液１０μＬ（ＰＷＡ中０．３３ｇ／ｍＬ）を添加し、室温で暗所で３０分間インキュベートした。ビーズを１ｍＬの消化緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で洗浄し、上清を除去した。２５０μＬの消化緩衝液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．０）及び５μＬの０．２５ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液（１００μｌの１０ｍＭ ＨＣｌ中の２５μｇの凍結乾燥トリプシン）を添加した後、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ（登録商標）において９００ｒｐｍで５０℃で１８時間、オンビーズ消化を行った。上清を新しい反応管に移し、トリプシンを２５μＬのギ酸溶液（ＰＷＡ中１０％）を添加することによって不活性化し、試料を分析まで４℃で保存した。
ペプチドを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｖａｎｑｕｉｓｈ－Ｈ ＵＨＰＬＣシステムを使用してＣＳＨ１３０ Ｃ１８（１．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ）カラム（Ｗａｔｅｒｓ）で６０℃で分離した。１００μＬの試料を３００μＬ／分の流速で注入した。移動相Ａは水中０．１％ギ酸からなり、移動相Ｂはアセトニトリル中０．１％ギ酸からなった。６５分間の勾配は、４５分間で０％～４０％Ｂの線形増加で開始し、続いて９５％Ｂで５分間カラム洗浄し、１％Ｂで１０分間カラムを再平衡化した。更に、結果のキャリーオーバ及び歪みを防止するために、各試料の前の溶離液Ａラン（６５分勾配）及び１０％メタノールによる３０分洗浄勾配を実施した。ＵＨＰＬＣシステムを、ＤｕｏＳｐｒａｙ Ｉｏｎ Ｓｏｕｒｃｅを備えたＴｒｉｐｌｅＴＯＦ ６６００質量分析計（Ｓｃｉｅｘ）と連結した。タンデム質量分析を、以下の設定でデータ依存型取得（ＤＤＡ）を使用して行った：上位２０個の最も豊富なイオンを、２００～２０００ｍ／ｚの質量範囲にわたって全てのＭＳサーベイスキャン（２５０ｍｓ）から選択した。ＭＳ／ＭＳスキャン（６９ｍｓ）を、＋２～＋５の電荷状態を含む１００～１６００ｍ／ｚ（高感度モード）の質量範囲内で取得した。ＭＳ／ＭＳ選択のため、動的排除を６秒間、前駆イオン閾値を１５０カウント／秒に設定した。
ＭＳ／ＭＳデータを、ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔソフトウェア（Ｓｃｉｅｘ、バージョン５．０）を使用して、Ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇからの全てのＣＨＯタンパク質を含有する３５，８６２個のタンパク質配列（Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ及びＴｒＥＭＢＬ注釈が含まれる）、医薬品配列及びヒトケラチン不純物を含むカスタマイズされたＣＨＯデータベースに対して検索した。陽性タンパク質同定のための許容基準は、１％未満の偽発見率で設定され、少なくとも２つの特有なペプチドは９５％の信頼度であった。
結論
５０ｐｐｍのｒｅｃ．ＬＰＬＡ２でスパイクした５ｇ／ｌのトシリズマブ溶液を固定化されたオルリスタットＢとインキュベートすると、リパーゼ活性アッセイ（図２Ａ）によって示されるように、オルリスタットＢを含まないそれぞれの対照（ストレプトアビジンＭａｇセファロースビーズにカップリングされたアゾ－ビオチン－アジド）と比較して、上清における加水分解活性を有意に低下させた。これらの結果と一致して、ｒｅｃ．ＬＰＬＡ２は、単独でオルリスタットＢ官能化ビーズ上でのオンビーズ消化及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって同定することができたが、対照ビーズについては同定することができず、ＬＰＬＡ２上でのオルリスタットＢの共有結合、したがって抗体溶液からのその除去を示している（図２Ｂ）。
実施例２：ストレプトアビジンＭａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズに固定化したオルリスタットＢ（式（２）又は化合物Ｂ）を用いた加水分解活性の低下及びｒｅｃ．ＬＰＬＡ２スパイクトシリズマブ溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）からのＬＰＬＡ２の除去
この実験は、実施例１に記載のアプローチが、同じ比率のスパイクされたｒｅｃ．ＬＰＬＡ２（すなわち、５０ｐｐｍ、５μｇ／ｍＬ）で高タンパク質濃度（すなわち、１００ｍｇ／ｍＬのトシリズマブ）を含有する抗体溶液にも適用可能であることを実証する。
この目的のため、実施例１に記載のように官能化ビーズを調製した。
トシリズマブを最終抗体濃度１００ｍｇ／ｍＬ及びＬＰＬＡ２濃度５０ｐｐｍ（５μｇ／ｍＬ）を得るためのｒｅｃ．ＬＰＬＡ２でスパイクした（表４）。
Figure 2023536366000028
 表４：１００ｍｇ／ｍｌトシリズマブ溶液中の５０ｐｐｍのＬＰＬＡ２スパイク。
２５０μＬのＬＰＬＡ２スパイクトシリズマブを、９００ｒｐｍでＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ（登録商標）において３７℃で４時間、１００μＬのコンジュゲートビーズ（試料／対照）とインキュベートした。インキュベーション後、上清（試料／対照）をリパーゼ活性アッセイによって評価した（実施例１を参照されたい）。
結論：
実験１の結果と一致して、５０ｐｐｍのｒｅｃ．ＬＰＬＡ２でスパイクした１００ｇ／ｌのトシリズマブ溶液を固定化されたオルリスタットＢとインキュベートすると、リパーゼ活性アッセイ（図３Ａ）によって示されるように、オルリスタットＢを含まないそれぞれの対照（ストレプトアビジンＭａｇセファロースビーズにカップリングされたアゾ－ビオチン－アジド）と比較して、上清における加水分解活性を有意に低下させた。対照試料（ストレプトアビジンＭａｇセファロースビーズにカップリングされたアゾ－ビオチン－アジド）は、ｒｅｃ．ＬＰＬＡ２でスパイクした抗体溶液（ストレプトアビジンＭａｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズとのインキュベーション工程を含まない）と同等の加水分解活性を示すことから、この効果はオルリスタットＢの固定化に起因し得る。
実施例３：ストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能ビーズ又はＮＨＳ活性化セファロースビーズ上に固定化されたオルリスタットＢを使用したグロフィタマブのインプロセスプールからの加水分解活性の低下
この実験は、グロフィタマブのインプロセスプール（すなわち、ＭＭＡＥＸ負荷溶液）における加水分解活性が、ＮＨＳ活性化セファロース（登録商標）４高速フロービーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又はストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能ビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のいずれかに固定化されたオルリスタットＢ（式（２）又は化合物Ｂ）とインキュベートした場合に低下したことを示す。
ＮＨＳ活性化セファロース（登録商標）４高速フロービーズ上に固定化されたオルリスタットＢの調製）
官能化セファロース（登録商標）４高速フロービーズを、アミン反応性ＮＨＳ活性化ビーズ上へのリンカーアジド－ＰＥＧ４－アミン（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ、ＢＰ－２１６１５；ＣＡＳ ９５１６７１－９２－４）のカップリング、続いて、クリックケミストリーごとにそのアルキン基をビーズ結合リンカーのアジド基とコンジュゲートさせることによるオルリスタットＢの固定化を含む２段階手順によって調製した。
リンカーアジド－ＰＥＧ４－アミンをＮＨＳ活性化ビーズにカップリングさせるために、以下の工程を行った：１００μＬのアジド－ＰＥＧ４－アミンを１９００μＬのカップリング緩衝液（０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）で希釈して、２０００μＬの総体積を得た。ＮＨＳ活性化セファロース（登録商標）４高速フロービーズ６００μＬをＰｏｌｙ－Ｐｒｅｐクロマトグラフィーカラム（ＢｉｏＲａｄ）に充填し、使用直前に氷冷１ｍＭ ＨＣｌ（ＰＷＡ中）溶液１０ＣＶで洗浄した。調製したアジド－ＰＥＧ４－アミン溶液３００μＬを洗浄したビーズに添加し、ローラーミキサー上で室温で４時間インキュベートした。未反応ＮＨＳエステルのブロッキング及び洗浄のため、カップリング緩衝液（０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）、洗浄緩衝液Ａ（０．１Ｍ酢酸Ｎａ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）、洗浄緩衝液Ｂ（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ８．０）及び１×ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）を指定の順序及び体積で添加した：
(ａ） ３×２ＣＶブロッキング緩衝液
(ｂ） ３×２ＣＶ洗浄緩衝液Ａ
(ｃ） ３×２ＣＶブロッキング緩衝液
(ｄ） ブロッキング緩衝液中に３０分間放置
(ｅ） ３×２ＣＶ洗浄緩衝液Ａ
(ｆ） ３×２ＣＶ洗浄緩衝液Ｂ
(ｇ） ３×２ＣＶ洗浄緩衝液Ａ
(ｈ） ３×２ＣＶ洗浄緩衝液Ｂ
(ｉ） ３×２ＣＶ洗浄緩衝液Ａ
(ｊ） ３×２ＣＶ洗浄緩衝液Ｂ
(ｋ） ５ｘ２ＣＶ １ｘＰＢＳ
クリックケミストリーによってリンカーのビーズ結合アジド基上にオルリスタットＢをコンジュゲート化するために、以下の工程を行った：
上記のようにして得られた５００μＬの排出されたアジド官能化ビーズを５００μＬの１×ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）と混合し、均質化した。得られたビーズスラリー４００μＬを新しいＰｏｌｙ－Ｐｒｅｐクロマトグラフィーカラム（ＢｉｏＲａｄ）に充填した。ビーズ床を沈降させた後、上清を廃棄した。オルリスタットＢ（オルリスタットＢを含むＮＨＳセファロースと呼ばれる）又はビオチン－ＰＥＧ４－アルキン（オルリスタットＢを含まないＮＨＳセファロースと呼ばれる）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をコンジュゲートするため、以下の試薬を、示された順序及び体積で充填されたＰｏｌｙ－Ｐｒｅｐクロマトグラフィーカラムに添加した（表５）：
Figure 2023536366000029
 表５：実施例３におけるアジド官能化ビーズの官能化のための銅触媒クリック反応組成物
両方の反応混合物（試料／対照）をローラーミキサー上で室温で２時間インキュベートし、１０ＣＶの１×ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で洗浄した。調製した樹脂を含有するカラムを、更に使用するまで４℃で保存した。
ストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能ビーズに固定化されたオルリスタットＢ
オルリスタットＢで官能化されたストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能ビーズの調製のため、オルリスタットＢとビオチン－ＰＥＧ４－アジド（ＢｒｏａｄＰｈａｒｍ；ＣＡＳ １３０９６４９－５７－７）との間のクリック反応を、指定の順序及び体積に従って反応管内で以下の試薬を混合することによって行った（表６）：
Figure 2023536366000030
 表６：実施例３のストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能ビーズの官能化のための銅触媒クリック反応組成
両方の反応混合物をローラーミキサー上で室温で２時間インキュベートし、揮発性溶媒を真空遠心分離機（４５℃、２時間）を使用して蒸発させ、更に使用するまで４℃で保存した。
ストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能ビーズでのコンジュゲーションのため、１ｍＬの培地スラリーを結合緩衝液（２０ｍＭ ＮａＰＯ４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で１０回洗浄し、Ｐｏｌｙ－Ｐｒｅｐクロマトグラフィーカラム（ＢｉｏＲａｄ）に充填し、５ＣＶの結合緩衝液（２０ｍＭ ＮａＰＯ４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で平衡化した。５００μＬの結合緩衝液（２０ｍＭ ＮａＰＯ４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を２００μＬのコンジュゲート化ビオチン－オルリスタット（オルリスタットＢを含むＳｅｐｈ－ＳＡと呼ばれる）／ビオチン－ビオチン（オルリスタットＢを含まないＳｅｐｈ－ＳＡと呼ばれる）と混合し、全混合物を平衡化ビーズに添加した。ローリングミキサー上でＲＴで３０分間インキュベートした後、ビーズを１０ＣＶの結合緩衝液（２０ｍＭ ＮａＰＯ４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）及び１０ＣＶの１×ＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で連続的に洗浄した。コンジュゲートビーズ（オルリスタットＢを含むＳｅｐｈ－ＳＡ及びオルリスタットＢを含まないＳｅｐｈ－ＳＡ）を更なる使用まで４℃で保存した。
抗体グロフィタマブのＭＭＡＥＸ負荷溶液とのコンジュゲートビーズのインキュベーション
１００μＬの官能化ビーズスラリー（オルリスタットＢを含むＮＨＳセガサターン、オルリスタットＢを含まないＮＨＳセファロース、オルリスタットＢを含むＳｅｐｈ－ＳＡ及びオルリスタットＢを含まないＳｅｐｈ－ＳＡ）、並びにプレーンビーズスラリー（ＮＨＳ活性化セファロースビーズ及びストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能）を反応管に移し、５０μＬの上清を廃棄した。４５０μＬのグロフィタマブ（ｃ＝７、３ｍｇ／ｍｌ）のＭＭＡＥＸ負荷溶液を添加し、混合物をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ中８５０ｒｐｍで２５℃でインキュベートした。試料を１０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、実施例１に記載のように上清をリパーゼ活性について評価した。
結論：
図４のそれぞれの対照ビーズ（すなわち、オルリスタットＢ及び非コンジュゲートビーズを含まないコンジュゲートビーズ）及び出発タンパク質組成物と比較して、これらのビーズの平均変換率の低下によってわかるように、グロフィタマブ（ＭＭＡＥＸ負荷溶液）とオルリスタットＢ官能化ビーズとのインキュベーションは、加水分解活性の有意な低下をもたらした。これらのデータは、かなりのレベルの加水分解活性を特徴とする抗体溶液のインプロセスプールから加水分解活性酵素を除去する固定化オルリスタットＢの能力を示している。更に、固定化されたオルリスタットＢの有益な効果は、ＮＨＳ活性化セファロース（登録商標）高速フロービーズ（上記のＮＨＳ及びクリックケミストリーによるカップリング）及びストレプトアビジンセファロース（登録商標）４高性能ビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（クリックケミストリーによるカップリング及び上記のビオチンとストレプトアビジンとの間の高い親和性を活用）の両方について実証することができたが、これは、図４の平均変換率によって示されるように、両方のアプローチがそれぞれの対照（すなわち、オルリスタットＢを含まないコンジュゲートビーズ、非コンジュゲートビーズ及び出発タンパク質組成物）と比較して加水分解活性の有意な減少をもたらしたためである。
実施例４：ストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能ビーズ又はＮＨＳ活性化セファロースビーズ上に固定化されたオルリスタットＡ又はオルリスタットＢを使用したトラスツズマブのインプロセスプールからの加水分解活性の低下
この実験は、ＮＨＳ活性化セファロース（登録商標）４高速フロービーズ又はストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能ビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のビーズのいずれかに固定化されたオルリスタットＡ（式（１）又は化合物Ａ）又はオルリスタットＢ（式（２）又は化合物Ｂ）のいずれかを使用することによって、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）インプロセスプール（すなわち、プロテインＡ溶出プール）における加水分解活性が低下したことを実証している。
官能化ビーズ（ＮＨＳ活性化セファロース（登録商標）４高速フロー及びストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能ビーズ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））を、実施例３に記載のように（オルリスタットＢをオルリスタットＡで置換することによって）オルリスタットＢ及びオルリスタットＡの両方について調製した。
１００μＬのオルリスタットＡ／Ｂ官能化ビーズ／対応する対照ビーズ（ＮＨＳ活性化セファロース（登録商標）４高速フロービーズ及びストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能ビーズの両方について、上記のように処理した）を反応管に移し、５０μＬの上清を廃棄した。４５０μＬのハーセプチンのプロテインＡ溶出プール（７ｇ／ｌ）を添加し、混合物をサーモミキサー８５０ｒｐｍで２５℃でインキュベートした。試料を１０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、実施例１に記載されているように、上清並びに出発タンパク質組成をリパーゼ活性アッセイによって評価した。
結論：
ＮＨＳ活性化セファロース４高速フロービーズ又はストレプトアビジンセファロース（登録商標）高性能ビーズのいずれかに固定化されたオルリスタットＡ及びオルリスタットＢの両方とのインキュベーション後のハーセプチンのプロテインＡ溶出プールでは、図５の平均変換率によって示されるように、それぞれの対照及び出発タンパク質組成物（官能化ビーズとのインキュベーション工程を含まない）と比較して、加水分解活性の有意な減少を達成することができ、固定化加水分解酵素阻害剤（すなわち、オルリスタットＡ及びＢ）が既に精製された抗体溶液（すなわち、トラスツズマブのインプロセスプール）から加水分解活性酵素を除去する能力を示している。
実施例５：固体支持体に結合したリパーゼのビス－エノール－エステルコンストラクトのプロテオミクス評価
この実験は、アジド修飾磁性粒子に共有結合により連結されたビス－エノール－エステル（式（３）又は化合物Ｃ）が（クリック反応化学を介して）、リパーゼ（モデルリパーゼ：ＣａｌＢ２）に共有結合的に及び選択的に結合し、抗体溶液からそれぞれのリパーゼを除去する能力を実証する。官能化ビーズがリパーゼに結合する能力を、対照としての非官能化ビーズと比較した。
試験試料：ＬＣ－ＭＳベースのプロテオミクスワークフローのための対照タンパク質としてのハーセプチン（ｍＡｂ；リン酸Ｎａ緩衝液中０．２μｇ／μｌ）を、標的としてのリパーゼＣａｌＢ２（ＣａｌＢ２；約１：１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の比でリン酸Ｎａ緩衝液中０．２μｇ／μｌ）と混合した。上記の試料を、クリック反応及び精製によって作製した６０μｇのアジド修飾磁性粒子（６０μｌの１μｇ／μｌ水溶液を調製した）（ポリスチレン系アジドビーズ；ＣＬＫ－１０３６－１、Ｊｅｎａ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に共有結合により連結された化合物Ｃ（ビス－エノール－エステル）で対処した（プロトコル実験例１及びＪｅｎａ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅクリックプロトコルについて記載された一般的手順を参照されたい）。対照として、非官能化アジド修飾ビーズ（ポリスチレン系アジドビーズ；ＣＬＫ－１０３６－１、Ｊｅｎａ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は、カップリング工程が化合物Ｃの溶媒のみで行われたことを除いて、化合物Ｃカップリングビーズと同じ方法で処理されている。
ＣａｌＢ２及びｍＡｂ混合物のインキュベーションは、６０μｇ（６０μｌの１μｇ／μｌ溶液）のそれぞれの官能化又は非官能化ビーズを５０μｌのＣａｌＢ２（０．２μｇ／μｌ）及び５０μｌのｍＡｂ（０．２μｇ／μｌ）と混合することによって行った。試料を４０℃で一晩、１０００ｒｐｍでボルテックスした。インキュベーション後、官能化ビーズ並びに非官能化ビーズを、磁気分離及び低結合ディスポーザブルを使用して以下のプロトコルに従って洗浄した：
１回目の洗浄：６０μｇのビーズを２００μｌのＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、続いて乾燥工程を行った。
２回目の洗浄：１回目の工程からの乾燥したビーズを、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００を含有するＰＢＳ緩衝液（９９９０μｌのＰＢＳで希釈した１０μｌのＴｒｉｔｏｎ－Ｘ １００）で３回洗浄し、続いて室温で風乾した。
３回目の洗浄：工程２からのビーズを２００μｌの水で２回洗浄し、続いて室温工程で風乾させる。
４回目の洗浄：工程３からのビーズを２００μｌ（７０％アセトニトリル／３０％水及び０．１％ギ酸（ｖ／ｖ／ｖ）で洗浄する。
５回目の洗浄：工程４からのビーズを最終的に２００μｌの水で洗浄した。
標的ＬＣ－ＭＳ分析のため、洗浄したビーズを５μｌのＩＡＭ溶液（５５ｍＭ：９８．３μｌのＭｉｌｌｉＱ－水中１ｍｇ／ｍｌ）でカルバミドメチル化し、５μｌのＤＴＴ（水中１０ｍＭ）溶液で３０分間還元した。
上記の工程の後、５０μｌの変性緩衝液／消化緩衝液（トリプシン希釈液（５０ｍＭ ＡｃＯＨ）、１０μｌ氷ＡｃＯＨ（３４７０μＬのＭｉｌｌｉＱ－水で希釈、４℃）を添加し、続いて２０μｇのトリプシンを元の管において４０μｌのトリプシン希釈液（５０ｍＭ ＡｃＯＨ）に溶解することによって、それぞれのビーズ上のタンパク質の変性を行った。５μｌのトリプシン溶液、１μｌのＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆ及び１μｌの（Ｎ／Ｏ－）脱グリコシル化ＭＩＸ ＩＩを試料ミックスに添加し、引き続いて混合及びインキュベーションした：（１０００ｒｐｍ、３７℃の熱シェーカー内、３７℃で１６～２０時間）。ビーズ上清分離を、短時間の遠心分離とそれに続く磁気分離によって行った。
２μｌのＦＡ溶液を試料消化物に添加することによって消化を停止させ、続いてインキュベーション工程（８００ｒｐｍの熱シェーカー内、３７℃で１．５～２時間（ＰＰＳの加水分解のため））を行った。分析までの（元の試料で）－８０℃での消化試料の保存
標的ＬＣ－ＭＳ分析は、緩衝液としてＴＦＡ（０．０５％ｖ（ｖ））を用いて水／アセトニトリル勾配を使用して行った。分離カラムは、ＰｅｐＳｗｉｆｔ Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ キャピラリカラム、２００μｍ×５ｃｍ、Ｐ／Ｎ：１６１４０９であった。質量分析計として、Ｔｈｅｒｍｏ ＬＴＱ ＦＴシステムを用いた。定量分析のための更なる実験計画は、一般的な実験的標的ＬＣ－ＭＳ手順に従った。１μｌの消化した試料を分析カラムに注入することによって、ビーズに結合したタンパク質をＬＣ－ＭＳシステムに適用した。
以下のペプチド及びそれぞれの質量を、標的化質量分析読み出しから生じる絶対ピーク強度（正規化レベル（ＮＬ）としてのピーク強度）の評価に使用した：
ペプチドＣａｌＢ２リパーゼ１：ＬＭＡＦＡＰＤＹＫ、電荷ｚ＝２；質量／電荷：５２８．２７Ｄａ
ペプチドＣａｌＢ２リパーゼ２：ＰＦＡＶＧＫ、電荷ｚ＝２；質量／電荷：３０９．６８Ｄａ
ペプチドｍＡｂ：ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ、電荷ｚ＝３；質量／電荷：５５９．９４Ｄａ
ｍＡｂペプチド及びリパーゼペプチドのそれぞれの標的ＬＣ－ＭＳシグナルをそれぞれのシグナル強度で使用して、図６を生成した。
質量分析結果の分析は、強いシグナルカウントで消化後にリパーゼＣａｌＢ２の両方の選択的ペプチドを見出すことができることを示した。
したがって、この実験は、モデルリパーゼＣａｌＢ２が、広範な洗浄工程に供した場合でも、ビス－エノールエステルで官能化されたビーズに結合することを明確に実証している（図６）。非官能化対照ビーズ上にリパーゼが検出されなかったため、この相互作用は明らかに特異的であった。
ｍＡｂは非常に沈殿しやすく、非共有結合的にビーズに吸着される。ｍＡｂペプチドは、官能化ビーズ及び対照ビーズの両方についての機能的ＬＣ－ＭＳベースのプロテオミクスワークフローを検証する官能化ビーズ及び対照ビーズで検出された。
本明細書に引用される全ての参考文献は、参照により完全に組み込まれる。ここで本発明を十分に説明してきたが、本発明又はその任意の実施形態の趣旨又は範囲に影響を及ぼすことなく、条件、パラメータ等の広範かつ同等の範囲内で本発明を実施することができることが当業者には理解されよう。

Claims (90)

  1. （ｉ）タンパク質を含む出発組成物を加水分解酵素阻害剤と接触させる工程であって、前記加水分解酵素阻害剤が固体担体上に固定化される、工程、
    （ｉｉ）前記タンパク質を含む組成物を回収する工程
    を含む、方法。
  2. タンパク質を含む組成物を調製するためのものである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記タンパク質を含む前記組成物が、例えば、リパーゼ活性アッセイ（ポリソルベートのためのリパーゼ酵素アッセイ（ＬＥＡＰ）のアッセイ）及び／又は質量分析による脂肪酸（ＦＡＭＳ）アッセイによって決定される場合、前記出発組成物と比較して加水分解活性が低下している、及び／又は前記出発組成物と比較して加水分解酵素の含有量が低下している、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記出発組成物における加水分解活性を低下させるため、及び／又は前記出発組成物中の加水分解酵素の前記含有量を低下させるためのものである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記出発組成物が、加水分解酵素（複数可）を更に含む、及び／又は加水分解活性を更に有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記タンパク質組成物が、前記出発組成物から加水分解酵素を除去することによって、及び／又は前記出発組成物中の加水分解酵素の前記含有量を低下させることによって調製される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記工程（ｉ）が、前記加水分解酵素を前記加水分解酵素阻害剤に吸着させる工程（ａ）を更に含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. タンパク質を含む前記組成物が、タンパク質を含む溶液である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記溶液が水溶液である、請求項８に記載の方法。
  10. 前記溶液が緩衝溶液である、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 前記加水分解酵素が、エステラーゼ（複数可）及び／又はアミダーゼ（複数可）である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記エステラーゼ（複数可）が、カルボン酸エステル加水分解酵素（複数可）及び／又はチオエステラーゼ（複数可）である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記カルボン酸エステル加水分解酵素（複数可）がリパーゼ（複数可）である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記加水分解酵素（複数可）が、リポタンパク質リパーゼ、パルミトイルプロテインチオエステラーゼ、酸性セラミダーゼ、脂肪酸シンターゼのＣ末端ドメイン、推定ホスホリパーゼｂ様２、リソソーム酸リパーゼ、及びリソソームホスホリパーゼからなる群から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記固定化された阻害剤が、オルリスタット又はビス－エノール－エステルからなる群から選択される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記固体担体が、セファロース、ポリスチレン、及びスマートポリマーからなる群から選択される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記阻害剤が、アジド基とアルキン基との反応を介して固体担体上に固定化される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記阻害剤が、ビオチン基へのストレプトアビジン基の結合を介して固体担体上に固定化される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記阻害剤が、アミノ基とＮ－ヒドロキシスクシンイミド基との反応を介して固体担体上に固定化される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記阻害剤が、式（１）、（２）、（３）、若しくは（４）：
    Figure 2023536366000031
    Figure 2023536366000032
    、好ましくは式（１）、（２）、若しくは（４）を含むか又はそれからなる化合物をアジドと反応させることによって得ることができる基である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記工程が、以下の順序：工程（ｉ）及びそれに続く工程（ｉｉ）で行われる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 工程（ｉ）の前及び／若しくは後、並びに／又は工程（ｉｉ）の前及び／若しくは後に、タンパク質調製及び／又は精製の工程を更に含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 工程（ｉ）が、アフィニティークロマトグラフィーの後、好ましくはプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの後に行われる、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記タンパク質が抗体である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記抗体が、ヒト抗体又はヒト化抗体である、請求項２４又は２５に記載の方法。
  27. 前記タンパク質が、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＩＬ１３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＶＥＧＦ－Ａ抗体、抗ＶＥＧＦ－Ａ／ＡＮＧ２抗体、抗ＣＤ７９ｂ抗体、抗ＳＴ２抗体、抗Ｄ因子抗体、抗ＩＸ因子抗体、抗Ｘ因子抗体、抗ａベータ抗体、抗ｔａｕ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗ＣＥＡ／ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０／ＣＤ３抗体、抗ＦｃＲＨ５／ＣＤ３抗体、抗Ｈｅｒ２／ＣＤ３抗体、抗ＦＧＦＲ１／ＫＬＢ抗体、ＦＡＰ－４－１ ＢＢＬ融合タンパク質、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ融合タンパク質、オクレリズマブ、ペルツズマブ、トラスツズマブ、トシリズマブ、ファリシマブ、ポラツズマブ、ガンテネルマブ、シビサタマブ、クレネズマブ、モスネツズマブ、チラゴルマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、アテゾリズマブ、オビヌツズマブ、ランパリズマブ、レブリキズマブ、オマリズマブ、ラニビズマブ、エミシズマブ、セリクレルマブ、プラシネズマブ、グロフィタマブ、シムルカフスプアルファ、及びＲＧ７８２７である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. タンパク質製剤を調製するための方法であって、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法の工程を含み、前記組成物に、界面活性剤、好ましくは脂肪酸エステルを添加することを更に含む、方法。
  29. タンパク質製剤を調製するための方法であって、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法によって得られるか又は得ることができる前記組成物に、界面活性剤、好ましくは脂肪酸エステルを添加することを更に含む、方法。
  30. 前記タンパク質製剤が可視粒子及び／又はサブビジブル粒子を（本質的に）含まない、請求項２８又は２９に記載の方法。
  31. 前記タンパク質製剤が、推奨される貯蔵条件下で少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間、少なくとも３６ヶ月間、又は少なくとも６０ヶ月間安定である、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記脂肪酸エステルがポリオキシエチレンソルビタン又はイソソルビド脂肪酸モノ－、ジ－、若しくはトリ－エステルである、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記脂肪酸エステルがポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウレートである、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記脂肪酸エステルが、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６１、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８１、ポリソルベート８５、若しくはポリソルベート１２０、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記脂肪酸エステルがポリソルベート２０又はポリソルベート８０である、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記界面活性剤が、モノアシルグリセロール若しくはジアシルグリセロール、糖類－脂肪酸エステル、又はα－トコフェリルポリエチレングリコール（ＰＥＧ）スクシネートである、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記脂肪酸エステルの分解が２４ヶ月以内に２０％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満である、請求項２８～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記抗体濃度が、少なくとも１ｍｇ／ｍｌかつ最大２５０ｍｇ／ｍｌである、請求項２６～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 緩衝剤、添加物、希釈剤、安定剤、及び／又は担体を、前記組成物に添加することを更に含む、請求項２８～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記タンパク質製剤が医薬組成物である、請求項２８～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記タンパク質を含む前記組成物及び／又は前記タンパク質製剤が、加水分解酵素阻害剤を本質的に含まない、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法によって得られるか又は得ることができる、タンパク質組成物。
  43. 請求項２８～４１のいずれか一項に記載の方法によって得られるか又は得ることができる、タンパク質製剤。
  44. 薬品として使用するための、又は医薬において使用するための、請求項４３に記載のタンパク質製剤。
  45. タンパク質組成物及び／又はタンパク質製剤を調製するための、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤の使用。
  46. タンパク質組成物及び／又はタンパク質製剤における加水分解活性を除去又は低減するための、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤の使用。
  47. タンパク質組成物及び／又はタンパク質製剤中の不純物、特に宿主細胞タンパク質、好ましくは加水分解酵素（複数可）を、除去又は（その含有量を）低減するための、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤の使用。
  48. タンパク質組成物及び／又はタンパク質製剤中の可視粒子及び／又はサブビジブル粒子（の形成）及び／又は界面活性剤分解物の発生／存在を阻害又は低減するための、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤の使用。
  49. 固体担体上に加水分解酵素阻害剤を固定化するための方法であって、
    固体担体を提供する工程、
    加水分解酵素阻害剤を提供する工程、
    前記固体担体と、前記加水分解酵素阻害剤を含有する溶液とを接触させる工程、及び
    前記加水分解酵素阻害剤を前記固体担体上に固定化することを可能にする工程
    を含む、方法。
  50. 前記固体担体が、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）のようなポリ（メタ）アクリレート、ポリスチレン、ポリエチレンオキシド、セルロース及びセルロース誘導体、例えば酢酸セルロース（ＣＡ）又は再生セルロース、架橋アガロースを含むアガロース、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、並びに前述のもののブレンド若しくはコポリマー、又は親水化ポリマーとの、好ましくはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）若しくはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）とのブレンド若しくはコポリマーから選択される、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記固体担体を提供する前記工程が、前記固体担体を処理して、好ましくはヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、アルキン、アジド、並びにバイオポリマー（例えばストレプトアビジン及び／又はビオチン）から選択される官能基を導入する工程を含む、請求項４９又は５０に記載の方法。
  52. 前記加水分解酵素阻害剤を提供する前記工程が、好ましくはストレプトアビジン－ビオチン相互作用を形成するために、又はエステル、アミド、イミン、ウレタン、尿素、β－アミノアルコール、及び１，２，３トリアゾールから選択される１つ以上の基を形成するために、前記加水分解酵素阻害剤を処理して前記固体担体の前記官能基と反応することができる官能基を導入する工程を含む、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記加水分解酵素阻害剤を提供する前記工程が、前記加水分解酵素阻害剤を処理して、好ましくはヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、アルキン、アジド、並びにバイオポリマー（例えばストレプトアビジン及び／又はビオチン）から選択される官能基を導入する工程を含む、請求項４９～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記固体担体を提供する前記工程が、好ましくはストレプトアビジン－ビオチン相互作用を形成するために、又はエステル、アミド、イミン、ウレタン、尿素、β－アミノアルコール、及び１，２，３－トリアゾールから選択される１つ以上の基を形成するために、前記固体担体を処理して前記加水分解酵素阻害剤の前記官能基と反応することができる官能基を導入する工程を含む、請求項５３に記載の方法。
  55. 固体担体を提供する工程、
    前記固体担体をリンカーを含有する溶液と接触させて担体－リンカーを形成する工程、
    加水分解酵素阻害剤を提供する工程、
    前記担体－リンカーを、前記加水分解酵素阻害剤を含有する溶液と接触させる工程、及び
    前記加水分解酵素阻害剤を前記担体－リンカー上に固定化することを可能にする工程
    を含む、請求項４９～５３のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記固体担体を提供する前記工程が、前記固体担体を処理して、好ましくはヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、アルキン、アジド、並びにバイオポリマー（例えばストレプトアビジン及び／又はビオチン）から選択される官能基を導入する工程を含む、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記リンカーが、
    前記固体担体の前記官能基と反応して、好ましくはストレプトアビジン－ビオチン相互作用を形成するか、又はエステル、アミド、イミン、ウレタン、尿素、β－アミノアルコール、及び１，２，３－トリアゾールから選択される１つ以上の基を形成することができる官能基
    を含む、請求項５５又は５６に記載の方法。
  58. 前記加水分解酵素阻害剤を提供する前記工程が、前記加水分解酵素阻害剤を処理して、好ましくはヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、アルキン、アジド、並びにバイオポリマー（例えばストレプトアビジン及び／又はビオチン）から選択される官能基を導入する工程を含む、請求項５５～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記リンカーが、
    前記加水分解酵素阻害剤の前記官能基と反応して、好ましくはストレプトアビジン－ビオチン相互作用を形成するか、又はエステル、アミド、イミン、ウレタン、尿素、β－アミノアルコール、及び１，２，３トリアゾールから選択される１つ以上の基を形成することができる官能基
    を更に含む、請求項５５～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 固体担体を提供する工程、
    加水分解酵素阻害剤を提供する工程、
    前記加水分解酵素阻害剤をリンカーと接触させて加水分解酵素阻害剤－リンカーを形成する工程、
    前記固体担体と、前記加水分解酵素阻害剤－リンカーを含有する溶液とを接触させる工程、及び
    前記加水分解酵素阻害剤－リンカーを前記固体担体上に固定化することを可能にする工程
    を含む、請求項４９～５９のいずれか一項に記載の方法。
  61. 前記固体担体を提供する前記工程が、前記固体担体を処理して、好ましくはヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、アルキン、アジド、並びにバイオポリマー（例えばストレプトアビジン及び／又はビオチン）から選択される官能基を導入する工程を含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記リンカーが、
    前記固体担体の前記官能基と反応して、好ましくはストレプトアビジン－ビオチン相互作用を形成するか、又はエステル、アミド、イミン、ウレタン、尿素、β－アミノアルコール、及び１，２，３－トリアゾールから選択される１つ以上の基を形成することができる官能基
    を含む、請求項６０又は６１に記載の方法。
  63. 前記加水分解酵素阻害剤を提供する前記工程が、前記加水分解酵素阻害剤を処理して、好ましくはヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、アルキン、アジド、並びにバイオポリマー（例えばストレプトアビジン及び／又はビオチン）から選択される官能基を導入する工程を含む、請求項６０～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記リンカーが、
    前記加水分解酵素阻害剤の前記官能基と反応して、好ましくはストレプトアビジン－ビオチン相互作用を形成するか、又はエステル、アミド、イミン、ウレタン、尿素、β－アミノアルコール、及び１，２，３トリアゾールから選択される１つ以上の基を形成することができる官能基
    を更に含む、請求項６０～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記固体担体上の前記官能基が、アミノ基、好ましくは第一級アミノ基を含む、請求項４９～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記固体担体上の前記アミノ基が、反応性プラズマ、好ましくはアンモニアを含むガス混合物から生成されたプラズマによる処理によって導入される、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記リンカーが、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、アルキン、アジド、並びにバイオポリマー（例えばストレプトアビジン及び／又はビオチン）から選択される少なくとも２つの官能基を含有する化合物である、請求項５５～６６のいずれかに記載の方法。
  68. 前記リンカーが、ポリオキシエチレン部分又はポリオキシプロピレン部分を更に含有し、好ましくは３～２０個（より好ましくは３～１０個、更に好ましくは３～５個）のオキシエチレン又はオキシプロピレン単位を含有し、前記少なくとも２つの官能基がそれに結合している、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記リンカーが、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、アルキン、アジド、並びにバイオポリマー（例えばストレプトアビジン及び／又はビオチン）から選択される少なくとも２つの異なる官能基を含有する、請求項５５～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記リンカーが、１分子あたり、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、アルキン、アジド、ストレプトアビジン、及びビオチンから選択される第１の官能基と、更に少なくとも２つの第２の官能基とを含有し、前記少なくとも２つの第２の官能基が好ましくは同じ種類であり、前記第１の官能基とは異なるヒドロキシル基、カルボキシレート基、ケトン、アルデヒド、イソシアネート、エポキシド、ヒドロキシル基、カルボキシレート基、アミン、アルキン、アジド、並びにバイオポリマー（例えばストレプトアビジン及び／又はビオチン）から選択される、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記固体担体が、架橋アガロース、好ましくはセファロース、より好ましくはＭａｇ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ビーズ）又はＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（ビーズ）である、請求項４９～７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記固体担体がストレプトアビジンを含む官能基を含有し、前記リンカーがビオチンを含む官能基を含有する、請求項４９～７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記リンカーがアジド基を更に含有し、前記加水分解酵素阻害剤がアルキン基を含有する、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記固体担体が、任意にＮＨＳ活性化されているカルボキシレートを含む官能基を含有し、前記リンカーが、アミンを含む官能基を含有する、請求項４９～７３のいずれかに記載の方法。
  75. 前記リンカーがアジド基を更に含有し、前記加水分解酵素阻害剤がアルキン基を含有する、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記リンカーが、ビオチン－ＰＥＧ３－アジド（ＣＡＳ８７５７７０－３４－６）、ビオチン－ＰＥＧ４－アジド（ＣＡＳ１３０９６４９－５７－７）、アゾ－ビオチン－アジド（ＣＡＳ１３３９２０２－３３－３）、及びアジド－ＰＥＧ４－アミン（ＣＡＳ９５１６７１－９２－４）から選択される、請求項４９～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記加水分解酵素阻害剤が、アルキン基を含有し、かつ以下：
    Figure 2023536366000033
    から選択される構造を有する化合物から選択され、
    式中、（ＨＩ－１）において、
    Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、それぞれ独立して、直鎖又は分岐鎖であってもよいＣ２～２４アルキルから選択され、Ｒ１、Ｒ２、又はＲ３の少なくとも１つの末端－ＣＨ２－ＣＨ３基は、－Ｃ≡ＣＨ基で置き換えられ、
    （ＨＩ－２）において、
    Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３は、それぞれ独立して、直鎖又は分岐鎖であってもよいＣ２～２４アルキルから選択され、Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３の少なくとも１つの末端－ＣＨ２－ＣＨ３基は、－Ｃ≡ＣＨ基で置き換えられる、
    請求項４９～７６のいずれか一項に記載の方法。
  78. Ｒ１、Ｒ２、及びＲ１１の炭素原子の数が、独立して、２～１５、好ましくは３～１４、より好ましくは４～１２、更により好ましくは５～１１から選択される、請求項７７に記載の方法。
  79. Ｒ１２及びＲ１３の炭素原子の数が、独立して、５～２４、好ましくは８～１８、より好ましくは１０～１６、更により好ましくは１０～１２から選択される、請求項７７又は７８に記載の方法。
  80. Ｒ３の炭素原子の数が、２～１０、好ましくは２～８、より好ましくは３～６、更により好ましくは３～５から選択される、請求項７７～７９のいずれか一項に記載の方法。
  81. Ｒ１及びＲ２の前記アルキル基が直鎖である、請求項７７～８０のいずれか一項に記載の方法。
  82. Ｒ１１、Ｒ１２、及びＲ１３の前記アルキル基が直鎖である、請求項７７～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. Ｒ３の前記アルキル基が分岐鎖である、請求項７７～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 式（ＨＩ－１）が、以下の構造（ＨＩ－１ａ）：
    Figure 2023536366000034
    を有し、
    式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、請求項７７、７８、８０、８１、及び８３のいずれか一項に定義される通りである、
    請求項７７～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記加水分解酵素阻害剤が、アルキン基を含有し、以下：
    Figure 2023536366000035
    から選択される構造を有する化合物から選択される、請求項４９～８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 請求項４９～８５のいずれか一項に記載の方法により得ることができる、固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤。
  87. 請求項８６に記載の固体担体上に固定化された加水分解酵素阻害剤を含む、デバイス。
  88. 少なくとも２つの開口部を有する管状デバイスである、請求項８７に記載のデバイス。
  89. 前記デバイスが、好ましくは金属、ポリマー、又はガラス製の容器で構成され、前記容器が、固体担体上に固定化された前記加水分解酵素阻害剤が収容される空洞を形成する、請求項８７又は８８に記載のデバイス。
  90. 固体担体上に固定化された前記加水分解酵素阻害剤で少なくとも部分的に満たされたカラムである、請求項８７～８９のいずれか一項に記載のデバイス。
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