KR20210121107A - 생물제제내 가시성 및/또는 현미경-가시성 입자의 특성규명 방법 - Google Patents

생물제제내 가시성 및/또는 현미경-가시성 입자의 특성규명 방법 Download PDF

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Abstract

샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 검출하고, 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 단리 및 포착하여 단백질의 존재를 확인하고, 질량 분광계를 사용하여 단백질을 특성규명함으로써 샘플에서 형성된 가시성 및/또는 현미경-가시성 입자내 하나 이상의 단백질의 특성규명 또는 정량화 방법.

Description

생물제제내 가시성 및/또는 현미경-가시성 입자의 특성규명 방법
분야
본 발명은 일반적으로 샘플에서 형성된 가시성 및/또는 현미경-가시성 입자내 하나 이상의 단백질의 특성규명 또는 정량화 방법에 관한 것이다.
배경
단백질 기재의 생물약제 제품은 암, 자가면역 질환, 감염 및 심장대사 장애의 치료를 위한 중요한 약물로서 부상되었고, 이들은 제약 산업에서 가장 빠르게 성장하는 생성물 부문 중 하나이다. 강건하고 안정한 바이오약품 제품은 바이오약품 산업에서의 성공적 전달에서 핵심 요소이다. 핵심 기준은 본질적으로 가시성 및/또는 현미경-가시성 입자가 없는 제형의 개발이다. 가시성 및/또는 현미경-가시성 입자는, 특히 그러한 단백질 기반된 바이오약품 제품에서, 수년간 바이오약품 산업 내에서 논쟁 및 조사의 촛점이었다. 합성 또는 생물학적 물질로 이루어지고 다양한 출처에서 기원하여, 입자는 환자에서 면역원성 효과의 잠재력을 높일 수 있고 약물 제품에서 상이한 효과를 가질 수 있다. 그래서, 약물 제품으로부터 이들을 감소 또는 제거하는데 돕기 위해 이들 입자의 기원, 조성, 및 결과를 조사하는 것이 중요할 수 있다.
가시성 및/또는 현미경-가시성 입자가 바이오약품 제품에서 발생하는 경우, 그들의 조성의 확인은 그들의 형성을 이해하고 완화하는데 결정적 단계이다. 하지만, 이들 입자가 작고, 깨지기 쉽고, 단리시키기 어려우며, 작은 질량의 물질만으로 구성되기 때문에 이것은 워크플로우 및 분석적 테스트를 결정하기에 도전하는 과제이다. 상기로부터 샘플에서 형성될 수 있는 그러한 가시성 및/또는 현미경-가시성 입자의 개선된 특성규명 방법을 위하여 필요가 존재한다는 것이 인식될 것이다.
개요
바이오약품 개발에서 핵심 기준은 가시성 및 현미경-가시성 입자가 없는 제형을 개발하는 것이다. 그러한 입자가 발생하는 경우, 그들의 확인 및 정량화는 바이오공정에서 중요한 단계일 수 있다.
본원에서 개시된 예시적 구현예는 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질(들)을 특성규명, 확인 및/또는 정량화 방법을 제공함으로써 상기 언급된 수요를 만족시킨다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법을 제공한다.
하나의 예시적 구현예에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법은 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 검출하는 단계, 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 단리 및 포착하여 단백질의 존재를 확인하는 단계, 및 질량 분광계를 사용하여 단백질을 특성규명하는 단계를 포함한다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법은 라만 분광법을 사용하여 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 존재를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법은 적어도 약 5 μm의 크기를 갖는 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법은 선천적 불순물을 포함하는 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법은 금-코팅된 폴리카보네이트 막에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 포착하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법은 약 5 μm의 기공 크기를 가진 금-코팅된 폴리카보네이트 막에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 포착하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법은 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자에서 단백질의 존재 확인 후 요소내 샘플을 용해시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법은 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자에서 단백질의 존재 확인 후 구아니딘 하이드로클로라이드내 샘플을 용해시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법은 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자에서 단백질의 존재 확인 후 8 M 요소 용액내 샘플을 용해시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법은 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자에서 단백질의 존재 확인 후 변성 조건 하에서 샘플을 소화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법은 관심의 단백질을 추가로 포함하는 샘플을 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법은 항체를 추가로 포함하는 샘플을 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법은 치료적 항체를 추가로 포함하는 샘플을 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법은 질량 분광계에 커플링된 액체 크로마토그래피 시스템을 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법은 질량 분광계에 커플링된 나노 액체 크로마토그래피 시스템을 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법은 탠덤 질량 분광계를 사용하여 단백질을 특성규명하는 단계를 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법은 숙주-세포 단백질인 단백질을 포함할 수 있다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 확인 방법을 제공한다.
하나의 예시적 구현예에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 확인 방법은 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 검출하는 단계, 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 단리 및 포착하여 단백질의 존재를 확인하는 단계, 및 질량 분광계를 사용하여 단백질을 특성규명하는 단계를 포함한다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 확인 방법은 라만 분광법을 사용하여 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 존재를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 확인 방법은 적어도 약 5 μm의 크기를 갖는 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 확인 방법은 선천적 불순물일 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 확인 방법은 금-코팅된 폴리카보네이트 막에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 포착하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 확인 방법은 약 5 μm의 기공 크기를 가진 금-코팅된 폴리카보네이트 막에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 포착하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 확인 방법은 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자에서 단백질의 존재 확인 후 요소내 샘플을 용해시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 확인 방법은 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자에서 단백질의 존재 확인 후 8 M 요소 용액내 샘플을 용해시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 확인 방법은 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자에서 단백질의 존재 확인 후 변성 조건 하에서 샘플을 소화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 확인 방법은 관심의 단백질을 추가로 포함하는 샘플을 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 확인 방법은 항체를 추가로 포함하는 샘플을 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법은 치료적 항체를 추가로 포함하는 샘플을 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 확인 방법은 질량 분광계에 커플링된 액체 크로마토그래피 시스템을 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 확인 방법은 질량 분광계에 커플링된 나노 액체 크로마토그래피 시스템을 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 확인 방법은 탠덤 질량 분광계를 사용하여 단백질을 특성규명하는 단계를 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 확인 방법은 숙주-세포 단백질인 단백질을 포함할 수 있다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 숙주 세포-단백질의 확인 방법을 제공한다.
하나의 예시적 구현예에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 숙주 세포-단백질의 확인 방법은 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 검출하는 단계, 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 단리 및 포착하여 단백질의 존재를 확인하는 단계, 및 질량 분광계를 사용하여 단백질을 특성규명시켜 단백질이 숙주 세포-단백질인지를 결정하는 단계를 포함한다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 숙주 세포-단백질의 확인은 라만 분광법을 사용하여 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 숙주-세포 단백질을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 숙주 세포-단백질의 확인은 적어도 약 5 μm의 크기를 갖는 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법은 선천적 불순물일 수 있는 숙주-세포 단백질을 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 숙주 세포-단백질의 확인 방법은 금-코팅된 폴리카보네이트 막에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 포착하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 숙주 세포-단백질의 확인 방법은 약 5 μm의 기공 크기를 가진 금-코팅된 폴리카보네이트 막에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 포착하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 숙주 세포-단백질의 확인 방법은 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자에서 숙주-세포 단백질의 존재 확인 후 요소내 샘플을 용해시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 숙주 세포-단백질의 확인 방법은 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자에서 숙주-세포 단백질의 존재 확인 후 8 M 요소 용액내 샘플을 용해시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 숙주 세포-단백질의 확인 방법은 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자에서 숙주-세포 단백질의 존재 확인 후 변성 조건 하에서 샘플을 소화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 숙주 세포-단백질의 확인 방법은 관심의 단백질을 추가로 포함하는 샘플을 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법은 항체를 추가로 포함하는 샘플을 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 숙주 세포-단백질의 확인 방법은 치료적 항체를 추가로 포함하는 샘플을 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 숙주 세포-단백질의 확인 방법은 질량 분광계에 커플링된 액체 크로마토그래피 시스템을 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 숙주 세포-단백질의 확인 방법은 질량 분광계에 커플링된 나노 액체 크로마토그래피 시스템을 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 숙주 세포-단백질의 확인 방법은 탠덤 질량 분광계를 사용하여 단백질을 특성규명하는 단계를 포함할 수 있다.
본 구현예의 일 양태에서, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 숙주 세포-단백질의 확인 방법은 숙주-세포 단백질인 단백질을 포함할 수 있다.
도 1은 (마이크론으로) 약물 제품에서 발견된 입자의 입자 크기의 범위를 도시한다.
도 2는 약물 제품에서 미립자 물질의 유형을 도시한다.
도 3은 단백질 응집체의 일반 기전의 도식적 도표를 도시한다.
도 4는 약물 제품에서 입자 형성의 잠재적 원인을 열거한다.
도 5는 2005-2017 년 동안 미립자 물질로 인한 FDA 약물 리콜의 그래프를 도시한다.
도 6은 2008년부터 2012년까지 FDA 무균 주사가능 약물 리콜에 대한 이유를 보여주는 차트를 도시한다.
도 7은 예시적 구현예에 따라 단백질 또는 숙주-세포 단백질의 특성규명을 위한 2개 워크플로우를 도시한다.
도 8은 일부 예시적 구현예에 따라 단백질 또는 숙주-세포 단백질의 특성규명을 위한 워크플로우를 도시한다.
도 9는 하나의 예시적 구현예에 따라 가시성 또는 현미경-가시성 입자의 포착 방법을 도시한다.
도 10은 하나의 예시적 구현예에 따라 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 평가하기 위해 만들어진 여과지 상의 절제를 도시한다.
도 11은 예시적 구현예에 따라 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 포착하는데 사용된 여과지의 컷트 영역에서 mAb1의 펩타이드 단편의 풍부도의 비교를 도시한다.
도 12는 예시적 구현예에 금-코팅된 폴리카보네이트 막에서 따라 가시성 또는 현미경-가시성 입자 포착의 방법을 도시한다.
도 13은 예시적 구현예에 따라 금-코팅된 폴리카보네이트 막에서 따라 단리되고 포착된 라만 분광법을 사용하여 분석된 입자의 암시야 조명을 도시한다.
도 14는 예시적 구현예 따라 분석된 상이한 롯트 (롯트 5-12)로부터 약물 용액에서 메탈로프로테이나제 억제제 1 (TIMP1)의 상대적 풍부도를 도시한다.
도 15는 예시적 구현예 따라 분석된 상이한 롯트 (롯트 5-12)로부터 약물 용액에서 C-C 모티프 케모카인 13 (CCL13)의 상대적 풍부도를 도시한다.
도 16은 예시적 구현예에 따라 표적화된 LC-MS/MS를 사용하여 고분자량 샘플에서 확인된 숙주-세포 단백질의 상대적 정량을 도시한다.
도 17은 예시적 구현예에 따라 금-필터에서 따라 가시성 또는 현미경-가시성 입자의 포착 방법을 도시한다.
도 18은 예시적 구현예에 따라 금-필터에서 가시성 또는 현미경-가시성 입자의 단리 방법을 도시한다.
도 19는 예시적 구현예에 따라 라만 분광법을 사용하여 가시성 또는 현미경-가시성 입자에서 단백질의 존재의 확증을 도시한다.
도 20은 예시적 구현예에 따라 특성규명된 입자에서 mAb1의 풍부도를 도시한다.
도 21은 예시적 구현예에 따라 실시된 현미경-가시성 입자를 포함하는 샘플의 어둡게 채워진 이미지를 도시한다.
도 22는 예시적 구현예에 따라 실시된 현미경-가시성 입자를 포함하는 샘플의 어둡게 채워진 이미지 및 라만 이미지를 도시한다.
도 23은 예시적 구현예에 따라 입자를 특성규명하는데 사용된 2개 필터에 대하여 경시적으로 Vmax 용량 및 탁도에서 감소의 그래프를 도시한다.
도 24는 예시적 구현예에 따라 실시된 여과지의 절제를 도시한다.
도 25는 예시적 구현예에 따라 실시된 mAb2를 포함하는 입자에 대하여 72 시간 동안 입자에서 mAb2의 중쇄 및 경쇄의 정상화된 풍부도의 그래프를 도시한다.
도 26은 예시적 구현예에 따라 실시된 mAb2를 포함하는 입자에 대하여 숙주 세포 단백질의 상대적 풍부도 대 시간의 평행 플롯을 도시한다.
도 27은 예시적 구현예에 따라 실시된 시간 T=0 시간에 입자에서 mAb2의 상대량에 대해 시간 T=0 시간에 입자에서 숙주-세포 단백질 대 시간 T=0 시간에 입자에서 숙주-세포 단백질의 풍부도의 비의 버블 플롯을 도시한다.
도 28은 예시적 구현예에 따라 실시된 시간 T=24 시간에 입자에서 mAb2의 상대량에 대해 시간 T=24 시간에 입자에서 숙주-세포 단백질 대 시간 T=0 시간에 입자에서 숙주-세포 단백질의 풍부도의 비의 버블 플롯을 도시한다.
도 29는 예시적 구현예에 따라 실시된 시간 T=48 시간에 입자에서 mAb2의 상대량에 대해 시간 T=48 시간에 입자에서 숙주-세포 단백질 대 시간 T=0 시간에 입자에서 숙주-세포 단백질의 풍부도의 비의 버블 플롯을 도시한다.
도 30은 예시적 구현예에 따라 실시된 시간 T=72 시간에 입자에서 mAb2의 상대량에 대해 시간 T=72 시간에 입자에서 숙주-세포 단백질 대 시간 T=0 시간에 입자에서 숙주-세포 단백질의 풍부도의 비의 버블 플롯을 도시한다.
상세한 설명
가시성 및 현미경-가시성 입자의 존재는 단백질을 포함하는 약물 제품의 제형화 동안 주요 쟁점이다. 이들 입자는 어느 한쪽 단백질성 또는 비-단백질성일 수 있고 제형의 안정성을 모니터링하기 위해 분석될 필요가 있다. 약물 제품에서 그러한 입자의 면역원성 잠재력에 대한 증가하는 염려는 이의 내용물을 특성규명하기 위한 강건한 방법 및/또는 워크플로우를 필요로 한다.
단백질을 포함하는 약물 제품의 제형 개발 동안 주요 문제는 그들의 제한된 안정성을 극복하는 것이다. 응집은 가장 심각한 분해 기전 중 하나이다. 응집체는 많은 양태 예컨대 크기, 가역성, 및 구조에서 다양할 수 있다. 예를 들어, 그들의 크기는 나노미터 범위의 직경부터 수백 마이크론의 큰 응집체까지 범위일 수 있고, 이는 인간 눈에 가시성이다 (도 1 참고). 응집체는, 예를 들어, 제품 품질에 영향을 미치는 포장 재료 또는 부형제에서 기원하는 단백질성 뿐만 아니라 비-단백질성 입자를 포함할 수 있고 그러므로 분석될 필요가 있다.
미국 약전에서 개시된 바와 같이, "주사세 중 가시적 미립자(Visible Particulates in Injections) <790>" 및 "치료적 단백질 주사액 중 현미경가시적 미립자(subvisible Particulate Matter in Therapeutic Protein Injections) <1787>"로 지정된 장은 약물 제품의 미립자 물질 함량에 관한 일반 지도를 제공하는데 돕는다. 약물 제품에서 존재할 수 있는 미립자 물질의 유형은 도 2에서 개괄된다.
도 2에서 도시된 바와 같이 약물 제품에서 선천적 미립자 물질은 응집된 단백질을 포함할 수 있다. 응집은 상이한 기전 및 경로의 상이한 유형으로 인해 형성될 수 있다 (도 3 참고). 이들 기전은 상호 배타적이지 않고 동일한 제품 내에서 나란히 발생할 수 있다 (John Philo & Tsutomu Arakawa, Mechanisms of Protein Aggregation, 10 CURRENT PHARMACEUTICAL BIOTECHNOLOGY 348-351 (2009)). 우월한 기전은 단백질 자체, 뿐만 아니라 다양한 기타 인자, 예컨대 제형, 불순물 또는 오염물의 존재, 그리고 상기 언급된 화학적 또는 물리적 응력에의 노출에 의존한다. 상이한 응집 기전 및 이에 의해 생성된 응집체의 구조적 차이가 그들의 잠재적 면역원성에 어떻게 영양을 미치는지는 현재 완전히 이해되지 않는다.
도 4에서 열거된, 약물 제품에서 입자 형성의 잠재적 원인 중 일부는 소위 열응력, 저장 시간 동안 분해, 약물 제품에서 부형제의 화학적 분해, 기계적 응력, 및 계면 응력 때문이다. 약물 제품에서 그러한 입자의 잠재적 결과는 제품을 불안전하게 제조 (모세 혈관 폐색, 면역원성, 또는 세포독성을 야기), 효능을 변경 (저- 또는 과- 효력을 야기 또는 신체에서 약물의 생체내분포 및 청소율을 변화), 약물의 약동학을 변경, 제품을 일관되지 않게 제조, 또는 바이오공정을 일관되지 않게 제조할 수 있다.
주사가능 약물의 FDA 리콜은 미립자 물질이 약물 리콜에 대한 주요 이유 중 하나인 것을 시사한다 (도 5 참고). 2008-2012년부터, 가시성 입자의 존재는 무균 주사가능 약물 중에서 리콜의 22%를 차지하였다 (도 6 참고).
규제 기관은 제품 특성규명 및 제어의 일부로서 가시성 및 현미경-가시성 입자 분석을 포함하기 위해 미립자 물질에 대하여 약물 제품 분석을 요구하고 위험 사정은 안전 및 효능에 관한 그들의 잠재적 영향을 사정하기 위해 포함되어야 한다. 분석은 또한 미립자 물질 및 안정성 평가를 형성하기 위해 성향의 사정에 대하여 다중 응력 조건을 관여시킨다. 그러한 분석 이후, 전략은 미립자 물질의 형성을 최소화하기 위해 이행되도록 요구된다. 가시성 입자의 경우, 미립자 물질 테스팅에 관한 미국 약전 (U.S.P.) 지도는 (i) 충전 공정에서 100% 육안 검사의 요구사항 (USP <1> 주사액), (ii) 100% 육안 검사에 대한 지도 (USP <790> 주사액 중 가시성 미립자), 및 (iii) 검사자 훈련, 샘플링 방법, 및 검사의 설명; 예방/검사 생활주기 강조 (USP <1790> 주사의 육안 검사)를 열거한다. 미국 약전 (U.S.P.)은 또한 현미경-가시성 입자에 대하여 미립자 물질 테스팅에 관한 지도, 예컨대, (i) 현미경-가시성 입자에 대한 한계 (≥ 10 μm 입자 ≤ 25 / ml; ≥ 25 μm 입자 ≤ 3 / ml) 및 입자 카운팅을 위하여, 2개 방법, 빛 차단 및 현미경의 권장 (USP <788> 주사내 미립자 물질), (ii) 생물학에 대한 특정 요구사항 및 단백질성 입자 카운팅을 위하여 현미경의 사용 중단 (USP <787> 치료적 단백질 주사액 중 현미경-가시성 미립자 물질), 및 (iii) 입자의 유형을 구별하는 방법; 단백질성 입자의 특성규명 강조 (USP <1787> 치료적 단백질 주사액 중 현미경-가시성 미립자 물질의 측정)를 열거한다. 마지막으로, 안과 용액내 미립자 물질의 경우, 미립자 물질 테스팅에 관한 미국 약전 (U.S.P.) 지도는 USP <789> 안과 용액내 미립자 물질 및 USP <1788> 주사 및 안과 용액내 미립자 물질의 결정 방법 장에서 지도를 제공한다.
단백질 제형 개발 및 평가 동안 주요 문제 중 하나는 잠재적 분해 산물, 특히 응집체 및 입자의 특성규명 및 정량화이다 (Linda Narhi, Jeremy Schmit & Deepak Sharma, Classification of protein aggregates, 101 JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES 493-498 (2012)).
계기 제조업체는 현미경-가시성 크기 범위에서 분석적 갭을 극복하기 위해 새로운 분석적 기법을 제공하기 위해 노력했지만, 그들의 결정적인 과학적 평가를 돕기 위한 워크플로우를 설정해야 하는 많은 요구가 있다.
기존 방법의 한계를 고려하여, 약물 제품에서 가시성 또는 현미경-가시성 입자의 확인 및 특성규명을 위한 효과적 및 효율적 방법은 개발되었다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 이제 특정 방법 및 물질을 기재한다. 언급된 모든 공개문헌은 본원에 참조로 포함된다.
용어 "a"는 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 하고; 용어 "약" 및 "대략"은 당업계의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같은 표준 변동을 허용하는 것으로 이해되어야 하고; 범위가 제공되는 경우, 종점이 포함된다.
일부 예시적 구현예에서, 본 개시내용은 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법을 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질"은 공유 연결된 아미드 결합을 갖는 임의의 아미노산 중합체를 포함한다. 단백질은, 당업계에서 일반적으로 "폴리펩티드"로서 공지된 하나 이상의 아미노산 중합체 사슬을 포함한다. "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산 잔기, 관련 자연 발생 구조적 변이형, 및 그의 합성 비-자연 발생 유사체로 구성된 중합체, 관련 자연 발생 구조적 변이형, 및 그의 합성 비-자연 발생 유사체를 지칭한다. "합성 펩티드 또는 폴리펩티드'는 비-자연 발생 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 합성 펩티드 또는 폴리펩티드는, 예를 들어, 자동화된 폴리펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 다양한 고체 상 펩티드 합성 방법이 당업계의 숙련자에게 공지되어 있다. 단백질은 단일 기능 생물분자를 형성하도록 다수의 또는 하나의 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 단백질은 생물요법 단백질, 연구 또는 요법에 사용되는 재조합 단백질, 트랩 단백질 및 다른 키메라 수용체 Fc-융합 단백질, 키메라 단백질, 항체, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간 항체, 및 이중특이적 항체 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 단백질은 항체 단편, 나노바디, 재조합 항체 키메라, 시토카인, 케모카인, 펩티드 호르몬 등을 포함할 수 있다. 단백질은 곤충 바쿨로바이러스 시스템, 이스트 시스템 (예: 피키아(Pichia) 종), 포유류 시스템 (예: CHO 세포 및 CHO 유도체, 예컨대 CHO-K1 세포) 등의 재조합 세포 기반 생성 시스템을 사용하여 생성될 수 있다. 생물요법 단백질 및 그의 생성을 논의하는 검토에 대하여, 하기 문헌을 참조한다: Ghaderi 등, "Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation", (BIOTECHNOL. GENET. ENG. REV. 147-175 (2012)). 일부 예시적 구현예에서, 단백질은 변형, 부가생성물, 및 다른 공유 연결 모이어티를 포함한다. 이들 변형, 부가생성물 및 모이어티는 예를 들어 아비딘, 스트렙타비딘, 비오틴, 글리칸 (예: N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 뉴라민산, N-아세틸글루코사민, 푸코스, 만노스, 및 다른 모노사카라이드), PEG, 폴리히스티딘, FLAGtag, 말토스 결합 단백질 (MBP), 키틴 결합 단백질 (CBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) myc-에피토프, 형광 라벨 및 다른 염료 등을 포함한다. 단백질은 조성 및 용해도에 기초하여 분류될 수 있고, 따라서 단순 단백질, 예컨대, 구상 단백질 및 섬유상 단백질; 컨쥬게이션된 단백질, 예컨대, 핵단백질, 당단백질, 점액단백질, 색소단백질, 인단백질, 메탈로단백질, 및 지방단백질; 및 유도 단백질, 예컨대, 1차 유도 단백질 및 2차 유도 단백질을 포함할 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 단백질은 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 항체 단편, 모노클로날 항체, 숙주-세포 단백질 또는 이들의 조합일 수 있다.
용어 "항체"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 디술피드 결합에 의해 상호-접속된 4개의 폴리펩티드 사슬, 2개의 중 (H)쇄 및 2개의 경 (L)쇄, 뿐만 아니라 이들의 다량체 (예: IgM)를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 HCVR 또는 VH로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 LCVR 또는 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 (C.sub.L1)을 포함한다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역 (FR)이라 불리는 보다 보존된 영역이 산재된, 상보성 결정 영역 (CDR)이라 불리는 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은, 아미노-말단으로부터 카르복시-말단까지 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 상이한 예시적 구현예에서, 항-빅(big)-ET-1 항체 (또는 그의 항원-결합 부분)의 FR은 인간 생식계열 서열과 동일할 수 있거나, 자연 또는 인공 변형될 수 있다. 아미노산 공통 서열은 2개 이상의 CDR의 사이드-바이-사이드(side-by-side) 분석에 기초하여 정의될 수 있다. 용어 "항체"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 전체 항체 분자의 항원-결합 단편을 또한 포함한다.
항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편" 등의 용어는, 본원에서 사용되는 바와 같이, 특이적으로 항원에 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연 발생, 효소적으로 수득가능한, 합성, 또는 유전적으로 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은, 예를 들어, 항체 가변 및 임의로 불변 도메인을 인코딩하는 DNA의 조종 및 발현을 포함한 재조합 유전적 조작 기술 또는 단백분해 소화 등의 임의의 적합한 표준 기술을 사용하여 전체 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고/거나 예를 들어 상업적 공급원, DNA 라이브러리 (예를 들어, 파지-항체 라이브러리 포함)로부터 쉽게 입수가능하거나, 또는 합성될 수 있다. DNA를 화학적으로 또는 분자 생물학 기술 사용에 의해 시퀀싱하고 조종하여 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 구성으로 배열하거나, 코돈을 도입, 시스테인 잔기를 창출, 아미노산을 변형, 부가 또는 삭제할 수 있고, 기타 등등이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "항체 단편"은, 예를 들어, 항체의 항원-결합 또는 가변 영역 등의 온전 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fc 단편, scFv 단편, Fv 단편, dsFv 디아바디, dAb 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 영역, 뿐만 아니라 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. Fv 단편은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 조합이고, ScFv 단백질은 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 접속된 재조합 단일쇄 폴리펩티드 분자이다. 항체 단편은 다양한 수단에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 온전 항체의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생성될 수 있고/거나 이는 부분적 항체 서열을 인코딩하는 유전자로부터 재조합 생성될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체 단편은 완전히 또는 부분적으로 합성적으로 생성될 수 있다. 항체 단편은 임의로 단일쇄 항체 단편을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체 단편은, 예를 들어, 디술피드 연결에 의해, 함께 연결된 다수의 사슬을 포함할 수 있다. 항체 단편은 임의로 다중-분자 복합체를 포함할 수 있다.
용어 "모노클로날 항체"는 본원에서 사용되는 바와 같이 하이브리도마 기술을 통해 생성된 항체로 제한되지 않는다. 모노클로날 항체는, 당업계에서 이용가능한 또는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해, 임의의 진핵, 원핵, 또는 파지 클론을 포함한 단일 클론으로부터 유래될 수 있다. 본 개시내용에서 유용한 모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합, 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이들의 조합의 사용을 포함한 당업계에 공지된 폭넓게 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "숙주-세포 단백질"은 숙주 세포에 의해 발현된 단백질을 포함하고 관심의 원하는 단백질에 관련 없을 수 있다. 숙주-세포 단백질은 제조 공정에서 유래될 수 있는 공정-관련된 불순물일 수 있고 3개 주요 카테고리: 세포 기질-유래, 세포 배양물-유래 및 다운스트림 유래를 포함할 수 있다. 세포 기질-유래 불순물은, 비제한적으로, 숙주 유기체 및 핵산 (숙주 세포 게놈성, 벡터, 또는 총 DNA)에서 유래된 단백질을 포함한다. 세포 배양물-유래 불순물은, 비제한적으로, 유도제, 항생제, 혈청, 및 기타 배지 성분을 포함한다. 다운스트림-유래 불순물은, 비제한적으로, 효소, 화학적 및 생화학적 가공 시약 (예를 들면, 시아노겐 브로마이드, 구아니딘, 산화 및 환원 제제), 무기 염 (예를 들면, 중금속, 비소, 비금속 이온), 용매, 담체, 리간드 (예를 들면, 단클론성 항체), 및 기타 침출물을 포함한다.
일부 예시적 구현예에서, 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자는 공정 관련된 불순물을 포함할 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자는 제품 관련된 불순물을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "제품-관련된 불순물" (예를 들면, 전구체, 특정 분해 산물)은 활동성, 효능, 및 안전성에 관하여 원하는 산물의 것과 비교가능한 속성을 갖지 않는 제조 및/또는 저장 동안 일어나는 분자성 변이형일 수 있다. 그러한 변이형은 변형(들)의 유형을 확인하기 위해 단리 및 특성규명에서 상당한 노력을 필요로 할 수 있다. 제품-관련된 불순물은 절단된 형태, 변형된 형태, 및 응집체를 포함할 수 있다. 절단된 형태는 펩타이드 결합의 절단을 촉매화하는 가수분해성 효소 또는 화학물질에 의해 형성된다. 변형된 형태는, 비제한적으로, 탈아미드화된, 이성질체화된, 미스매치된 S-S 결합된, 산화된, 또는 변경된 접합된 형태 (예를 들면, 글리코실화, 인산화)를 포함한다. 변형된 형태는 임의의 번역후 변형 형태를 또한 포함할 수 있다. 응집체는 원하는 산물의 이량체 및 더 높은 다중체를 포함한다. (Q6B Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products, ICH August 1999, U.S. Dept. of Health and Humans Services).
일부 예시적 구현예에서, 가시성 또는 현미경-가시성 입자는 단백질 응집체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단백질 응집체"는 크기, 가역성, 및 구조에서 다양할 수 있는 단백질 단량체의 조립물을 지칭한다. 단백질 응집체 형성의 기전의 일부는 도 4에서 개괄된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "제형"은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 비히클와 함께 제형화되는 활성 약학적 제제를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "활성 약학적 제제"는 약물 제품의 생물학적으로 활성 성분을 포함할 수 있다. 활성 약학적 제제는, 약리학적 활동성을 제공하거나 질병의 진단, 치유, 완화, 치료 또는 예방에 직접적인 효과를 갖기 위해, 또는 동물에서 생리적 기능을 복원, 수정 또는 변형시키는데 직접적인 효과를 갖기 위해, 약물 제품에서 사용된 임의의 서브스턴스나 서브스턴스들의 조합을 지칭할 수 있다. 활성 약학적 제제를 제조하는 비-제한 방법은 단편화 공정, 재조합 DNA, 천연 자원으로부터 단리 및 회수, 화학적 합성, 또는 이들의 조합을 사용하는 것을 포함할 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 제형은 단백질 제형일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단백질 제형"은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 비히클과 함께 제형화되는 치료적 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료적 단백질은 치료적 레지멘에서 투여에 적합한 단위 용량 양으로 존재한다.
일부 기타 구현예에서, 제형은, 비제한적으로 완충 제제, 벌크화 제제, 등장성 변형제, 계면활성제, 가용화 제제, 및 방부제를 포함하는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 기타 추가의 부형제는 기능에 기반하여 또한 선택될 수 있고 제형과의 호환성은, 예를 들어 본원에서 그들 전체가 참고로 편입된 LOYD V. ALLEN, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (19 ed. 1995), JOHN E HOOVER, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (1975), 및 LYOD ALLEN, ANSEL'S PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS (10 ed.)에서 찾아질 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 제형은 안정할 수 있다.
제형의 안정성은 활성 약학적 제제의 화학적 안정성, 물리적 안정성 또는 기능적 안정성을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형은 활성 약학적 제제의 안정성의 높은 수준을 전형적으로 나타낸다.
단백질 제형의 면에서, 용어 "안정한"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 기재된 예시적 조건 하에서 저장 후 허용가능한 수준의 화학적 구조 또는 생물학적 기능을 보유할 수 있는 제형 내에서 단백질을 지칭한다. 제형은 그안에 들어있는 단백질이 한정된 시간 동안 저장 후 이의 화학적 구조 또는 생물학적 기능의 100%를 유지하지 않아도 안정할 수 있다. 특정 환경 하에서, 한정된 시간 동안 저장 후 단백질의 구조 또는 기능의 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99%의 유지는 "안정한" 것으로 간주될 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 지방산 입자는 크기가 적어도 5 μm일 수 있다. 추가로, 이들 지방산 입자는 그들의 크기에 따라 가시성 (> 100 μm), 현미경-가시성 (< 100 μm, 마이크론 (1-100 μm) 및 서브마이크론 (100 nm-1000 nm)으로 하위분할될 수 있음) 및 나노미터 입자 (< 100 nm)로서 분류될 수 있다 (Linda Narhi, Jeremy Schmit & Deepak Sharma, Classification of protein aggregates, 101 JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES 493-498 (2012)).
일부 예시적 구현예에서, 입자는 라만 분광법에 의해 단백질로서 검출될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "라만 분광법"은 라만 산란 방법에 기반된 분광 방법을 지칭한다. 라만 분광법은, 라만 스펙트럼의 데이터베이스와 비교에 의해 분석된 물질의 화학적 확인을 가능하게 하는 지문 영역 (2000 내지 400 cm-1)에서 대역의 존재 및 위치를 확인할 수 있는, 라만 스펙트럼을 제공할 수 있다 (C. V. Raman 및 K. S. Krishnan, A new type of secondary radiation, 121 NATURE 501-502 (1928); Zai-Qing Wen, Raman spectroscopy of protein pharmaceuticals, 96 JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES 2861-287 (2007)).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "크로마토그래피"는, 액체 또는 기체에 의해 운반되는 화학적 혼합물이, 이들이 고정 액체 또는 고체 상 주위에서 또는 위에서 유동함에 따라 화학적 엔티티(entity)의 차등 분포의 결과로 성분들로 분리될 수 있는 프로세스를 지칭한다. 크로마토그래피의 비제한적인 예는 전통적 역상 (RP), 이온 교환 (IEX) 및 정상 상 크로마토그래피 (NP)를 포함한다. 소수성 상호작용, 친수성 상호작용 및 이온성 상호작용이 각각 지배적 상호작용 모드인 RP, NP 및 IEX 크로마토그래피와 달리, 혼합-모드 크로마토그래피는 이들 상호작용 모드 중 2개 이상의 조합을 이용할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "질량 분광계"는 특정 분자 종을 동정하고 이들의 정확한 질량을 측정할 수 있는 장치를 포함한다. 용어는 폴리펩티드 또는 펩티드가 검출 및/또는 특성화를 위해 용리될 수 있는 임의의 분자 검출기를 포함하도록 의도된다. 질량 분광계는 3개의 주요 부분을 포함할 수 있다: 이온 공급원, 질량 분석기, 및 검출기. 이온 공급원의 역할은 기체 상 이온을 창출하는 것이다. 피분석물 원자, 분자, 또는 클러스터가 기체 상으로 전달되고 동시에 이온화될 수 있다 (전기분무 이온화에서와 같이). 이온 공급원의 선택은 응용에 따라 크게 달라진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "질량 분석기"는 종, 즉 원자, 분자, 또는 클러스터를 그들의 질량에 따라 분리할 수 있는 장치를 포함한다. 빠른 단백질 시퀀싱에 이용될 수 있는 질량 분석기의 비-제한적 예는 비행 시간 (TOF), 자기 / 전기 구획, 4극자 질량 필터 (Q), 4극자 이온 트랩 (QIT), 오비트랩, 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명 (FTICR), 및 또한 가속기 질량 분광측정 (AMS)의 기술이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "탠덤 질량 분광측정"은, 질량 선택 및 질량 분리의 다중 스테이지를 사용함으로써 샘플 분자에 대한 구조적 정보가 얻어지는 기술을 포함한다. 전제조건은, 샘플 분자가 기체 상으로 전달되고 온전하게 이온화될 수 있는 것, 또한 이들이 제1 질량 선택 단계 후 일부 예측가능하고 제어가능한 방식으로 결렬되도록 유도될 수 있는 것이다. 다중스테이지 MS/MS, 또는 MSn은, 의미있는 정보를 얻을 수 있거나 단편 이온 신호가 검출가능한 한, 먼저 전구체 이온 (MS2)을 선택 및 단리하고, 이를 단편화하고, 1차 단편 이온 (MS3)을 단리하고, 이를 단편화하고, 2차 단편 (MS4)을 단리하는 것 등에 의해 수행될 수 있다. 탠덤 MS는 폭넓게 다양한 분석기 조합으로 성공적으로 수행되었다. 특정 응용을 위해 조합할 분석기가 무엇인지는 많은 상이한 인자, 예컨대 감도, 선택성, 및 속도, 뿐만 아니라 크기, 비용, 및 이용가능성에 의해 결정될 수 있다. 탠덤 MS 방법의 두가지 주요 카테고리는 탠덤-인-스페이스(tandem-in-space) 및 탠덤-인-타임(tandem-in-time)이지만, 탠덤-인-타임 분석기가 탠덤-인-스페이스 분석기와 함께 또는 공간 내에서 커플링된 하이브리드가 또한 존재한다. 탠덤-인-스페이스 질량 분광계는 이온 공급원, 전구체 이온 활성화 기기, 및 적어도 2개 비-포획 질량 분석기를 포함한다. 특별 m/z 분리 기능은 계기의 한 섹션에서 이온이 선택되고, 중간 영역에서 해리되고 제품 이온이 그 다음 m/z 분리 및 데이터 획득을 위하여 또 다른 분석기로 전송되도록 설계될 수 있다. 탠덤-인-타임으로, 이온 공급원에서 생산된 질량 분광계 이온은 동일한 물리적 기기에서 포획, 단리, 단편화, 및 m/z 분리될 수 있다.
질량 분광계에 의해 확인된 펩타이드는 온전한 단백질의 대리 대표 및 그들의 번역후 변형으로서 사용될 수 있다. 이들은 실험적 및 이론적 MS/MS 데이터를 상관함으로써 단백질 특성규명에 사용될 수 있고, 후자는 단백질 서열 데이터베이스에서 가능한 펩타이드로부터 생성된다. 특성규명은, 비제한적으로, 단백질 단편의 아미노산 시컨싱, 단백질 시컨싱 결정, 단백질 드 노보 시컨싱 결정, 번역후 변형 위치결정, 또는 번역후 변형 확인, 또는 비교가능성 분석, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "데이터베이스"는 데이터베이스(들)에서 모든 가능한 서열에 대해 해석되지 않은 MS-MS 스펙트럼 검색의 가능성을 제공하는 생물정보학 도구를 지칭한다. 그러한 도구의 비-제한 예는 Mascot (http://www.matrixscience.com), Spectrum Mill (http://www.chem.agilent.com), PLGS (http://www.waters.com), PEAKS (http://www.bioinformaticssolutions.com), Proteinpilot (http://download.appliedbiosystems.com//proteinpilot), Phenyx (http://www.phenyx-ms.com), Sorcerer (http://www.sagenresearch.com), OMSSA (http://www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/), X!Tandem (http://www.thegpm.org/TANDEM/), Protein Prospector (http://www. http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm), Byonic (https://www.proteinmetrics.com/products/byonic) 또는 Sequest (http://fields.scripps.edu/sequest)이다.
예시적 구현예
본원에서 개시된 구현예는 샘플에서 단백질의 신속한 특성규명을 위한 조성, 방법, 및 시스템을 제공한다.
일부 예시적 구현예에서, 본 개시내용은, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 검출하는 단계, 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 단리 및 포착하여 단백질의 존재를 확인하는 단계, 및 질량 분광계를 사용하여 단백질을 특성규명하는 단계를 포함하는, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법을 제공한다.
일부 예시적 구현예에서, 본 개시내용은, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 검출하는 단계, 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 단리 및 포착하여 단백질의 존재를 확인하는 단계, 및 질량 분광계를 사용하여 단백질을 특성규명하는 단계를 포함하는, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 확인 방법을 제공한다.
일부 예시적 구현예에서, 본 개시내용은, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 검출하는 단계, 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 단리 및 포착하여 단백질의 존재를 확인하는 단계, 및 질량 분광계를 사용하여 단백질을 특성규명시켜 단백질이 숙주 세포-단백질인지를 결정하는 단계를 포함하는, 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 숙주 세포-단백질의 확인 방법을 제공한다.
일부 예시적 구현예에서, 라만 분광법은 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 존재를 확인하는데 사용될 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자는 적어도 약 2 μm의 크기를 가질 수 있다. 일 양태에서, 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자는 적어도 약 2 μm, 적어도 약 3 μm, 적어도 약 4 μm, 적어도 약 5 μm, 적어도 약 6 μm, 적어도 약 7 μm, 적어도 약 8 μm, 적어도 약 9 μm, 적어도 약 10 μm, 적어도 약 11 μm, 적어도 약 12 μm, 적어도 약 13 μm, 적어도 약 14 μm, 적어도 약 15 μm, 적어도 약 20 μm, 적어도 약 25 μm, 적어도 약 30 μm, 적어도 약 35 μm, 적어도 약 40 μm, 적어도 약 45 μm, 적어도 약 50 μm, 적어도 약 55 μm, 적어도 약 60 μm, 적어도 약 65 μm, 적어도 약 70μm, 적어도 약 7 μm, 적어도 약 80μm, 적어도 약 85 μm, 적어도 약 90 μm, 적어도 약 95 μm, 또는 적어도 약 100 μm의 크기를 가질 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 단백질은 선천적 불순물일 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자는 금-코팅된 폴리카보네이트 막에서 포착될 수 있다. 일부 예시적 구현예에서, 금-코팅된 폴리카보네이트 막은 약 5 μm의 기공 크기를 가질 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자는 여과지에서 포착될 수 있다. 일부 예시적 구현예에서, 여과지는 약 5 μm의 기공 크기를 가질 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 본 방법은 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 포착하는데 사용된 여과지 또는 금-코팅된 폴리카보네이트 막의 한 부분을 절제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 본 방법은 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자에서 단백질 또는 숙주-세포 단백질의 존재 확인 후 요소내 샘플을 용해시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 양태에서, 샘플은 8 M 요소 용액내 용해될 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 본 방법은 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자에서 단백질 또는 숙주-세포 단백질의 존재 확인 후 변성 조건 하에서 샘플을 변성시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 양태에서, 샘플은 적당한 온도에서 디티오트레이톨을 사용하여 변성될 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 본 방법은 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자에서 단백질 또는 숙주-세포 단백질의 존재 확인 후 변성 조건 하에서 샘플을 소화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 양태에서, 샘플은 가수분해 제제를 사용하여 소화될 수 있다. 효소적 소화를 실시할 수 있는 가수분해 제제의 비-제한 예는 트립신, 엔도프로테이나제 Arg-C, 엔도프로테이나제 Asp-N, 엔도프로테이나제 Glu-C, 외막 프로테아제 T (OmpT), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)의 면역글로불린-분해 효소(IdeS), 키모트립신, 펩신, 서몰리신, 파파인, 프로나제, 및 아스페르길루스 사이토이(Aspergillus Saitoi)로부터 프로테아제를 포함한다. 비-효소적 소화를 실시할 수 있는 가수분해 제제의 비-제한 예는 고온, 마이크로파, 초음파, 고압, 적외선, 용매 (비-제한 예는 에탄올 및 아세토니트릴임), 고정화된 효소 소화 (IMER), 자기 입자 고정화된 효소, 및 온-칩 고정화된 효소의 사용을 포함한다. 단백질 소화에 대하여 이용가능한 기법을 논의하는 최근 검토를 위하여 Switazar 등, "Protein Digestion: An Overview of the Available Techniques and Recent Developments" (J. Proteome Research 2013, 12, 1067-1077) 참고. 가수분해 제제의 하나 또는 조합은, 더 짧은 펩타이드의 예측가능한 집합을 생성하는, 서열-특이적 방식으로, 단백질 또는 폴리펩타이드에서 펩타이드 결합을 절단시킬 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 샘플은 관심의 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 일 양태에서, 관심의 단백질은 치료적 항체, 항체, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 융합 단백질, 또는 이들의 조합일 수 있다.
하나의 예시적 구현예에서, 단백질 또는 숙주-세포 단백질은 관심의 단백질의 번역후 변형일 수 있다. 다양한 번역후 변형은, 비제한적으로, 절단, N-말단 확장, 단백질 분해, N-말단의 아실화, 비오틴화 (비오틴으로 라이신 잔기의 아실화), C-말단의 아미드화, 글리코실화, 요오드화, 보결분자단의 공유 부착, 아세틸화 (일반적으로 단백질의 N-말단에, 아세틸기의 첨가), 알킬화 (일반적으로 라이신 또는 아르기닌 잔기에 알킬기 (예를 들면 메틸, 에틸, 프로필)의 첨가), 메틸화, 아데닐화, ADP-리보실화, 폴리펩타이드 쇄 내에서, 또는 사이에서 공유 가교, 설포닐화, 프레닐화, 비타민 C 의존성 변형 (프롤린 및 라이신 하이드록실화 그리고 카르복시 말단 아미드화), 비타민 K가 γ-카복시글루타메이트 (glu 잔기)의 형성을 초래하는 글루탐산 잔기의 카복시화에서 공통인자인 비타민 K 의존성 변형, 글루타밀화 (글루탐산 잔기의 공유 연결), 글리실화 (글리신 잔기 공유 연결), 글리코실화 (당단백질을 초래하는, 어느 한쪽 아스파라긴, 하이드록시라이신, 세린, 또는 트레오닌에 글리코실기의 첨가), 이소프레닐화 (이소프레노이드기 예컨대 파르네솔 및 게라닐게라니올의 첨가), 리포일화 (리포에이트 기능성의 부착), 포스포판테테이닐화 (지방산, 폴리케티드, 비-리보솜 펩타이드 및 류신 생합성 처럼, 조효소 A로부터 4'-포스포판테테이닐 모이어티의 첨가), 인산화 (일반적으로 세린, 티로신, 트레오닌 또는 히스티딘에, 인산염 기의 첨가), 및 황산화 (일반적으로 티로신 잔기에, 황산염 기의 첨가)를 포함한다. 아미노산의 화학적 성질을 변화시키는 번역후 변형은, 비제한적으로, 시트룰린화 (탈이미드화에 의한 아르기닌의 시트룰린으로의 전환), 및 탈아미드화 (글루타민의 글루탐산으로의 또는 아스파라긴의 아스파르트산으로의 전환)를 포함한다. 구조적 변화를 관여시키는 번역후 변형은, 비제한적으로, 디설파이드 브릿지의 형성 (2개 시스테인 아미노산의 공유 연결) 및 단백질분해 절단 (펩타이드 결합에서 단백질의 절단)을 포함한다. 특정 번역후 변형은 기타 단백질 또는 펩타이드의 첨가, 예컨대 ISG화 (ISG15 단백질 (인터페론-자극 유전자)에 공유 연결), SUMO화 (SUMO 단백질 (작은 유비퀴틴-관련된 변형제)에 공유 연결) 및 유비퀴틴화 (단백질 유비퀴틴에 공유 연결)을 포함한다. UniProt에 의해 큐레이팅된 PTM의 더욱 상세된 제어 어휘에 대하여 http://www.uniprot.org/docs/ptmlist 참고.
또 다른 예시적 구현예에서, 샘플은 바이오공정의 임의의 단계, 예컨대, 배양 세포 배양물 유체 (CCF), 수확된 세포 배양물 유체 (HCCF), 공정 성능 자격 (PPQ), 다운스트림 프로세싱에서 임의의 단계, 약물 용액 (DS), 또는 최종 제형화된 제품을 포함하는 약물 제품 (DP)으로부터 수득될 수 있다. 일부 기타 특정한 예시적 구현예에서, 샘플은 정화, 크로마토그래피 정제, 바이러스성 불활성화, 또는 여과의 다운스트림 공정의 임의의 단계로부터 선택될 수 있다. 일 양태에서, 약물 제품은 클리닉, 선적, 저장, 또는 취급에서 제조된 약물 제품으로부터 선택될 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 질량 분광계는 액체 크로마토그래피에 커플링될 수 있다. 일 양태에서, 질량 분광계는 나노 액체 크로마토그래피에 커플링될 수 있다. 일부 예시적 구현예에서, 액체 크로마토그래피에서 단백질을 용리하는데 사용된 이동상은 질량 분광계와 호환성일 수 있는 이동상일 수 있다. 일 양태에서, 이동상은 아세트산 암모늄, 중탄산 암모늄, 또는 포름산 암모늄, 또는 이들의 조합일 수 있다.
또 다른 예시적 구현예에서, 질량 분광계는 나노분무를 포함할 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 질량 분광계는 단백질을 특성규명하기 위한 탠덤 질량 분광계일 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 단백질 또는 숙주-세포 단백질은 치료적 항체, 항체, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 융합 단백질, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일 양태에서, 항체 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, dsFv 디아바디, dAb 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 영역, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함할 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 단백질 또는 숙주-세포 단백질은 항체의 소화 산물일 수 있다. 소화 산물은 가수분해 제제에 의해 형성될 수 있다. 소화 산물은 제품-관련된 불순물일 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 단백질 또는 숙주-세포 단백질은 약 4.5 내지 약 9.0 범위에서 pI를 가질 수 있다. 하나의 예시적 특정한 구현예에서, 단백질은 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 약 8.0, 약 8.1 약 8.2, 약 8.3, 약 8.4, 약 8.5, 약 8.6, 약 8.7, 약 8.8, 약 8.9, 또는 약 9.0의 pI를 가질 수 있다.
하나의 예시적 구현예에서, 샘플에서 가시성 또는 현미경-가시성 입자의 수는 적어도 2개일 수 있다.
하나의 예시적 구현예에서, 가시성 또는 현미경-가시성 입자에서 단백질 또는 숙주-세포 단백질의 유형은 적어도 2개일 수 있다.
본 방법이 전술한 단백질, 불순물, 컬럼 중 어느 하나에 제한되지 않는다는 것 그리고 확인 또는 정량화 방법이 임의의 적당한 수단에 의해 실행될 수 있다는 것이 이해된다.
일부 예시적 구현예에서, 본 개시내용은 입자 검사 (100), 입자 단리 (110), 입자 포착 (120), 및 크로마토그래피 컬럼 (130)에 커플링된 질량 분광계 (140)를 포함하는 워크플로우를 제공한다 (도 7 참고).
일부 예시적 구현예에서, 워크플로우는 단백질의 존재를 확인할 수 있는 라만 분광법 (150)을 추가로 포함할 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 입자 검사 (100)는 육안 검사, 광 차단, 또는 마이크로 유동 영상에 의해 수행될 수 있다. 하나의 예시적 구현예에서, 입자 검사는 육안 검사, FTIR 분광법, 라만 분광법, 또는 마이크로 유동 영상 (MFI)에 의해 수행될 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 입자 단리 (110) 및 입자 포착 (120)은 여과 기기를 사용하여 실시될 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 크로마토그래피 컬럼 (130)은 이동상으로 세정될 수 있다. 하나의 예시적 구현예에서, 이동상은 아세트산 암모늄, 중탄산 암모늄, 또는 포름산 암모늄, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 질량 분광계 (140)는 나노분무를 포함할 수 있다.
일부 예시적 구현예에서, 질량 분광계 (140)는 탠덤 질량 분광계일 수 있다. 하나의 예시적 구현예에서, 질량 분광계 (140)는 탠덤 인 스페이스 질량 분광계일 수 있다. 하나의 예시적 구현예에서, 질량 분광계 (140)는 탠덤 인 타임 질량 분광계일 수 있다.
워크플로우의 예시적 구현예 도 8에서 표시되었다.
시스템이 전술한 단백질, 숙주-세포 단백질, 분광법 방법, 또는 크로마토그래피 컬럼 중 어느 하나에 제한되지 않는다는 것이 이해된다.
숫자 및/또는 문자를 사용한 본원에서 제공되는 바와 같은 방법 단계의 연이은 라벨링은 방법 또는 그의 임의의 구현예를 특정 지시된 순서로 제한하도록 의도되지 않는다.
특허, 특허 출원, 공개 특허 출원, 수탁 번호, 기술 논문 및 학술 논문을 포함한 다양한 공개문헌이 명세서 전반에 걸쳐 인용된다. 이들 인용 참조 문헌 각각은 본원에서 모든 목적상 그 전문이 참조로 포함된다.
본 개시내용은 하기 실시예를 참조함으로써 보다 완전히 이해될 것이며, 이들 실시예는 본 개시내용을 보다 상세히 설명하기 위해 제공된다. 이들은 예시하도록 의도된 것이며 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되어선 안된다.
실시예
실시예 1.
1.1 입자의 검출
mAb1 제형을 포함하는 공정 성능 자격 (PPQ) 롯트 (롯트 번호 1)에서 바이알의 평가에서, PPQ 롯트의 약 264개 바이알 (~4.5%)은 가시성 입자를 가졌다. PPQ 롯트에 대하여 허용가능한 한계가 0.7%이므로, 롯트는 거부되었다.
PPQ 롯트는 폴리소르베이트 수준의 존재에 대하여 평가되었고, 이는 정상인 것으로 밝혀졌다.
PPQ 롯트로부터 입자 (입자 1)는 회색 필터에서 포착되었다 (도 9 참고).
1.2 입자의 단리
여과지 상에서 절제를 실시하였다: (a) 컷트 영역 1 - 입자 1이 부하된 4 mm X 4 mm 영역, (b) 컷트 영역 2 - 단백질 용액이 부하된 4 mm X 4 mm 영역, 및 (c) 컷트 아레 3 - 단백질이 부하되지 않은 4 mm X 4 mm 영역 (도 10 참고). 컷트 영역/샘플은 8 M 요소내 용해되었다.
샘플은 30 분 동안 50 ℃에서 8 M 요소 및 5 mM 디티오트레이톨 (DTT)로 인큐베이션되었고, 이어서 30 분 동안 실온에서 10 mM 인돌-3-아세트산 (IAA)으로 인큐베이션되었다. 인큐베이트 샘플은 변성 조건 하에서 1 시간 동안 1 μg의 rLysC로 소화되었고, 이어서 Tris-HCl로 희석되었다. 이러한 혼합물에, 1 μg의 트립신은 첨가되었고 소화는 3 시간 동안 계속되었다. 소화 혼합물은 그 다음 20% 포름산 (FA)으로 산성화되었고, 이어서 나노LC-MS/MS 분석되었다.
1.3 펩타이드 분석
입자 1의 조성을 알아내기 위해, Thermo QExactive HF 질량 분광계에 커플링된 나노LC-MS/MS Thermo EASY-nLC를 사용하여 입자 1의 펩타이드 분석을 실시하였다. 존재하는 단백질의 정체, Sequest 모드를 사용하는 Proteome Discoverer v. 1.4 소프트웨어는 CHO 단백질 서열 데이터베이스에 대한 질량 스펙트럼 데이터를 검색함으로써 사용되었다. 펩타이드 품질 점수는 검색 알고리즘이 샘플에서 펩타이드를 부정확하게 포함하였던 확률을 계산하는 Proteome Discoverer 내에서 Peptide Validator 노드를 사용하여 디코이 데이터베이스에 대해 처리함으로써 도출되었다. 위발견률 (FDR), 또는 위양성률은 펩타이드 확인 검색에 의해 발견된 모든 확인 중에서 위 양성 발견의 수를 추정하는 통계적 값이다. 5% 미만 FDR로 사정된 펩타이드 (중간 및 고 신뢰도 펩타이드)는 보유되었고, 1% 미만 FDR (고 신뢰도) 역치로 사정된 것들은 고 신뢰도로 주목하였다. 단백질당 최소 2개 중간 또는 고 신뢰도 (통과) 펩타이드는 각 HCP를 양성으로 확인하기 위해 요구되었다. 단 하나의 고 신뢰도 펩타이드에 의해 확인된 그들 단백질에 대한 펩타이드의 MS/MS 스펙트럼은 3개 이상의 연속적 b- 및 y-이온 및 적은 수의 풍부한 외부 이온의 적용범위를 수동으로 조사하여 그들의 수용을 결정하였다.
모든 샘플은 mAb1의 풍부도에 대하여 분석되었다. (입자 1을 포함하는) 컷트 영역 1은 mAb1 단백질의 높은 풍부도를 보여주었고, 이어서 컷트 영역 2 (입자 1 없는 단백질 용액)에서 mAb1의 일부 존재를 보여주었으며, 컷트 영역 3은 mAb1 단백질의 최저치/부재를 보여주었다 (도 11 참고).
mAb1 - TIMP1 이외의 숙주-세포 단백질은 입자 1에서 존재하는 것으로 밝혀졌다 (표 1). 하지만, TIMP1은 입자에서 풍부하였다는 것을 나타내는 입자 1 없는 단백질 용액에서 존재하지 않았다.
Figure pct00001
실시예 2.
4개 추가의 입자 (입자 2-5)는 mAb1로부터 제형을 함유하는 PPQ 롯트 (롯트 번호 1)에서 확인되었다. 이들 입자를 포착하여 분석하였다.
2.1 입자의 단리
각 검출된 입자는 도 12에서 도시된 바와 같이 40/20nm 코팅 및 5 μM의 기공 크기를 가진 개별 Rap ID 금-코팅된 폴리카보네이트 막에 배치되었다.
막 위에서 절제를 실시하여, 실시예 1에서 실례된 바와 같이, 단백질 용액으로부터 입자를 단리시켰다.
2.2 라만 분석
라만 분광법은 입자의 구성물질을 확인하는데 이용되었다. 이러한 방법은 비탄성 광 산란을 사용하여 독특한 에너지 스펙트럼을 각 분자에 생성하고, 그 다음 다양한 화학적 구조의 지문을 함유하는 참조 라이브러리와 비교된다. 라만 분석은 모두 4개 입자 (입자 2, 3, 4 및 5)가 단백질을 포함하였다는 것을 확증하였다. 암시야 조명은 영역을 둘러싸는 입자가 단백질 신호가 없거나 매우 적다는 것을 보여주었고, 이는 필터로부터 컷팅 입자가 MS 분석을 위하여 오염을 유도하지 않았다는 것을 보장한다 (도 13 참고).
2.3 펩타이드 분석
입자의 조성을 알아내기 위해, 실시예 1에서 실례된 바와 같이 나노LC-MS/MS를 이용하여 입자의 펩타이드 분석을 실행하였다. 표 2는, 약물 용액 롯트 (DS)와 함께, 입자 1 내지 5에서 확인된 숙주-세포 단백질을 열거하고, 이들 모두는 mAb1을 포함한다. 숙주-세포 단백질은 일반 나노LC-MS/MS를 사용하여 스크리닝되었고 표적화된 나노LC-MS/MS를 사용하여 확증되었다. 입자 3 및 4는 크기가 더 작고 그 입자 1 및 입자 5 약 10-50 배 더 적은 단백질 양을 가졌고, 이는 아마 확인중인 더 적은 숙주-세포 단백질의 결과를 설명한다.
Figure pct00002
연구는 입자 단리 거부된 mAb1 롯트 번호 1에서 숙주-세포 단백질의 존재를 확증하였다.
실시예 3
가시성 입자가 mAb1 제형을 포함하는 기타 롯트에서 숙주-세포 단백질로 농축되었는지를 연구하기 위해, mAb1 제형을 포함하는 임상 롯트 (롯트 번호 2) 그리고 mAb1 제형 롯트를 포함하는 2개 기타 PPQ 롯트 (롯트 번호 3 및 4)에서 입자를 평가하였다.
입자의 단리, 라만 분석 및 펩타이드 분석은 실시예 2에서 실례된 바와 같이 수행되었다.
표 3은 롯트 번호 1 (PPQ 롯트), 롯트 번호 2 (임상 롯트), 롯트 번호 3 (PPQ 롯트), 및 롯트 번호 4 (PPQ 롯트)로부터 입자에서 확인된 숙주-세포 단백질을 열거한다. 숙주-세포 단백질은 일반 나노LC-MS/MS를 사용하여 스크리닝되었고 표적화된 나노LC-MS/MS를 사용하여 확증되었다. 일부 숙주-세포 단백질은 초기 스크리닝에서 확인되지 않았지만 확증적 검정을 사용하여 확인되었다. 롯트 번호 2 (임상 롯트)에서 입자는 크기가 더 작았고 롯트 번호 4 (PPQ 롯트)로부터 입자보다 약 15-30 배 더 적은 단백질 양을 가졌고, 이는 아마 확인중인 더 적은 숙주-세포 단백질의 결과를 설명한다. 이들 롯트 2-4로부터 입자에서 존재하는 것으로 확인된 숙주-세포 단백질을 비교하는 것은 롯트 번호 1로부터 단리된 가시성 입자에서 확인된 단백질이 비교가능하다는 것을 시사한다.
Figure pct00003
실시예 4
PPQ 롯트를 구성할 수 있는 mAb1의 약물 용액이 숙주-세포 단백질로 농축되는 지를 연구하기 위해, 약물 용액 롯트 (롯트 번호 5-12)는 평가되었다.
4.1 PLBD2 수준
약물 용액은, CUSABIO로부터 카탈로그 CSB-EL018125Ha인, 햄스터 추정 포스포리파제 B-유사 2 (PLBD2) ELISA 키트를 사용하는 LC-MS MRM 방법을 사용하여 PLBD2에 대하여 테스트되었다. 이러한 키트는 햄스터 추정 포스포리파제 B-유사 (PLBD2) 농도의 정량적 결정을 제공하는 것으로 주장한다. 0.12-8 ng/ml의 범위에 걸쳐서 키트에서 포함된 햄스터 PLBL2 표준의 검출을 보여주는 표준 곡선은 생성되었다. 롯트 번호 5-12로부터 약물 용액은 정량의 하한 미만 PLBD2 수준 (1 ppm 즉, 1 mg mAb1내 1 ng의 PLBD)를 입증하였다
그래서, 상기 롯트의 모두에서 약물 용액은 비정상 PLBD2 수준의 부재를 보여주었다.
4.2 직접 펩타이드 맵핑을 사용하는 HCP 프로파일링
약물 용액의 조성을 알아내기 위해, 펩타이드 분석은 실시예 1에서 실례된 바와 같이 나노LC-MS/MS를 사용하여 실시되었다. 숙주-세포 단백질은 일반 나노LC-MS/MS를 사용하여 스크리닝되었고 표적화된 나노LC-MS/MS를 사용하여 확증되었다. 숙주-세포 단백질은 테스트된 롯트 (롯트 번호 5-12)의 어느 것에서도 확인되지 않았다 (표 4). TIMP1 및 CCL13은 모든 롯트의 초기 스크리닝에서 확인되지 않았지만 더욱 민감한 확증적 검정을 사용하여 모든 롯트에서 존재하는 것으로 밝혀졌다. 롯트 5-12로부터 약물 용액에서 숙주 세포 단백질 TIMP1 및 CCL13의 상대적 풍부도는 롯트 번호 5에서 상대적 풍부도로 정상화된 경우 플롯팅되었다 (도 14 및 15 참고).
8개 롯트 중에서, 롯트 번호 9 및 롯트 번호 11은 PPQ 롯트 1 및 3, 각각을 제조하는데 사용된 약물 용액을 포함하였다. 이들이 사용되는 PPQ 롯트와 비교된 롯트 번호 9 및 11의 약물 용액에서 숙주 세포 단백질은 기타 약물 서브스턴스 롯트와 비교된 입자를 생성하였던 롯트에서 관찰된 숙주 세포 단백질의 수준이 평가되지 않았다는 것을 시사한다.
Figure pct00004
4.3 항-HCP 면역정제 (IP) 농축 이어서 펩타이드 맵핑을 사용하는 HCP 프로파일링
약물 용액 롯트에서 존재하는 숙주 세포 단백질을 추가로 평가하기 위해, 더욱 민감한 항-HCP 면역정제가 실시되었다. 비오틴화된 항-HCP 항체의 풀은 치료적 단백질 및 기타 성분을 제거함으로써 접이식 및 농축된 HCP에 사용되었다. 농축 이후, HCP는 그 다음 효소에 의해 소화되었고 HCP 확인 및 정량화를 위하여 나노LC-MS에서 주사되었다. 농축은 우리가 HCP를 더욱 민감하게 확인 및 정량화하게 만든다.
표 5는 항-HCP 면역정제 농축을 사용하여 HCP 프로파일링을 수행함으로써 확인된 숙주 세포 단백질을 열거한다.
Figure pct00005
롯트 번호 1 (PPQ 롯트, 표 5) 내지 롯트 번호 9 (롯트 번호 1을 제조하는데 사용된 약물 용액 롯트, 표 3)에서 확인된 숙주 세포 단백질을 비교하여, 독특한 숙주 세포 단백질이 롯트 번호 1과 연관되지 않음이 결론지어질 수 있다. 이것은 PPQ 롯트에서 숙주 세포 단백질 프로파일이 약물 용액 롯트에서 숙주 세포 단백질 프로파일과 비슷하였다는 것을 시사한다.
실시예 5.
숙주-세포 단백질은 응집체 형성의 결과로서 농축될 수 있었다. 이것은 아래 표 6에서 나타난 바와 같이 mAb1의 고분자량 종으로 농축된 롯트와 약물 용액 롯트 (롯트 번호 6)에서 숙주-세포 단백질을 비교함으로써 연구되었다.
Figure pct00006
롯트 13-15에 대하여 입자의 단리 및 라만 분석은 실시예 2에서 실례된 바와 같이 수행되었다.
5.1 직접 펩타이드 맵핑을 사용하여 확인된 숙주 세포 단백질
샘플은 SpeedVac를 사용하여 건조되었고, 그 다음 8M 요소 및 10mM TCEP-HCl에 의해 용해되었고, 30 분 동안 50 ℃에서 변성되었고, 이어서 30 분 동안 실온에서 10 mM 인돌-3-아세트산 (IAA)으로 인큐베이션되었다. 인큐베이트 샘플은 변성 조건 하에서 1 시간 동안 1 μg의 rLysC로 소화되었고, 이어서 Tris-HCl로 희석되었다. 이러한 혼합물에, 1 μg의 트립신은 첨가되었고 소화는 3 시간 동안 계속되었다. 소화 혼합물은 그 다음 20% 포름산 (FA)으로 산성화되었고 이어서 나노LC-MS/MS 분석되었다. 6개 숙주 세포 단백질은 약물 용액 롯트가 아닌, 농축된 HMW mAb1 종을 가진 롯트에서 확인되었다 (표 7).
Figure pct00007
5.2 표적화된 LC-MS/MS를 사용하는 숙주 세포 단백질의 상대 정량
상기 단계 5.1로부터 확인된 펩타이드/단백질은 질량 분광계가 단편에 이들 특이적 펩타이드를 찾아서 HCP를 추가로 확증 및 정량화하기 위해 확인된 펩타이드의 질량 리스트를 창출하는데 사용되었다. 그렇게 하여서, 검출 민감성은 표적화된 스크리닝으로 인해 증가되었다. 7개 숙주 세포 단백질은 농축된 HMW mAb1 종을 가진 롯트 (롯트 번호 13-15)에서 확인되었다. 농축된 HMW mAb1 종을 가진 롯트에서 확인된 숙주 세포 단백질의 양은 약물 용액 롯트 (롯트 번호 6)에서 숙주 세포 단백질의 양보다 약 2-60 배 더 높았다. 도 16은 농축된 HMW mAb1 종을 가진 롯트에서 숙주 세포 단백질의 상대 정량의 차트를 도시한다.
5.3 항-HCP IP 농축 이어서 펩타이드 맵핑을 사용하여 확인된 숙주 세포 단백질
비오틴화된 항-HCP 항체의 풀은 치료적 단백질 및 기타 성분을 제거함으로써 접이식 및 농축된 HCP에 사용되었다. 농축 이후, HCP는 그 다음 효소에 의해 소화되었고 HCP 확인 및 정량화를 위하여 나노LC-MS에서 주사되었다. 31개 숙주 세포 단백질은 농축된 HMW mAb1 종을 가진 롯트 (롯트 번호 13-15)에서 확인되었다. 31개 숙주 세포 단백질 중에서, 약물 용액 롯트만이 2개 숙주 세포 단백질의 존재를 보여주었다 (표 8).
Figure pct00008
Figure pct00009
상기 결과는 mAb1 약물 용액 롯트보다 HMW mAb1 종을 가진 롯트에서 숙주 세포 단백질의 더 많은 양 및 농축을 보여주었다. 이것은 숙주 세포 단백질이 농축된 HMW mAb1 종인 것을 시사한다.
실시예 6.
mAb1을 포함하는 약물 제품은, mAb1의 약물 용액, mAb1의 HMW 종을 포함하는 롯트 및 mAb1의 PPQ 롯트 테스팅 이외에, 가시성 입자 및 숙주 세포 단백질의 존재에 대하여 또한 테스트되었다.
6.1 입자의 검출
mAb1을 함유하는 - 약물 제품을 포함하는 2개 바이알 (바이알 #1 및 바이알 #2)은 입자(들)의 존재를 검출하기 위해 수동으로 검사되었다.
6.2 입자의 단리
바이알의 각각에 대하여, 검출된 입자는 도 17에서 도시된 바와 같이 40/20nm 코팅 및 5 μM의 기공 크기를 가진 개별 (Rap ID) 금-코팅된 폴리카보네이트 막에서 배치되었다.
절제는 막에서 실시되었다: (a) 입자 샘플 - 입자(들)을 가진 3 mm 직경 원형 영역은 절제되었고 (b) 음성 대조군 - 입자가 없는 3 mm 직경 원형 영역은 절제되었다 (도 18). 입자 샘플 및 음성 샘플은 8 M 요소에서 용해되었다. 3개 입자 샘플 및 2개 음성 대조군은 표 9에서 나타난 바와 같이 2개 바이알에 대하여 막으로부터 단리되었다.
Figure pct00010
6.3 라만 분석
라만 분광법은 실시예 2에서 실례된 바와 같이 입자에서 수행되었다. 표 9에서 인용된 바와 같이 입자 1 중 하나의 라만 스펙트럼은 입자가 단백질성이라는 것을 확증하였다 (도 19 참고). 도 19에서 보여진 바와 같이 녹색 흔적은 단백질 참조 스펙트럼이고 도 19에서 보여진 바와 같이 적색 흔적은 입자 샘플 스펙트럼이다.
6.4 펩타이드 분석
펩타이드 분석은 실시예 2에서 실례된 바와 같이 입자에서 수행되었다.
모든 입자 샘플 및 음성 샘플은 mAb1의 풍부도에 대하여 분석되었다. 입자 샘플은 mAb1 단백질의 높은 풍부도를 보여주었고 음성 샘플은 mAb1 단백질의 부재를 보여주었다 (도 20 참고). 풍부도 피크는 mAb1에서 최상위 2개 가장 풍부한 펩타이드의 평균화된 피크 영역에 기반하여 추정되었다.
펩타이드 분석으로부터 수득된 mAb1 이외의 단백질은 표 10에서 나타난다. 입자 샘플 및 음성 샘플에서 mAb1 풍부도는 1E6로 정상화되어 표 10에서 ppm으로 기타 단백질을 비교적 정량화하였다. 표 10에서 용어 ND는 단백질이 검출되지 않았음을 나타내는 것이다.
Figure pct00011
입자 샘플 및 음성 샘플에서 단백질의 존재는 표 11에서 나타난다.
Figure pct00012
펩타이드 분석은 mAb1을 함유하는 약물 제품으로부터 단리된 입자에서 숙주-세포 단백질의 존재를 나타냈다.
실시예 7.
현미경-가시성 입자의 검출은 mAb1을 포함하는 제형화된 약물 물질 (FDS)을 사용하여 또한 수행되었다.
현미경-가시성 입자를 단리시키기 위해, 1.5 ml의 FDS 용액은 40/20nm 코팅 및 5 μM의 기공 크기를 가진 금-코팅된 폴리카보네이트 막에서 피펫팅되었다. 이것은 그 다음 밀리-Q 수로 세정되었다. 입자 없는 음성 대조군은 0.2 μM 필터 (Millipore)에서 1.5 ml의 FDS 용액을 초기에 피펫팅함으로써 비교를 위하여 설정되었고 관류는 수집되었다. 관류는 그 다음 40/20nm 코팅 및 5 μM의 기공 크기를 가진 금-코팅된 폴리카보네이트 막에서 피펫팅되었고 밀리-Q 수로 세정되었다.
라만 분석 및 펩타이드 분석은 실시예 2에서 기재된 바와 같이 수행되었다. 단백질을 포함하는 입자는 라만 분광법을 사용하여 확인되었다. 인용된 방법에 의해 확인된 단백질을 포함하는 입자의 어둡게 채워진 이미지는 도 21에서 도시된다. 현미경-가시성 입자의 펩타이드 분석은 mAb1과 함께 메탈로프로테이나제 억제제 1 - 숙주 세포 단백질의 존재를 입증하였고, 반면에 입자 없는 음성 대조군은 mAb1의 존재만을 보여주었다. 입자 없는 음성 대조군에서 숙주 단백질 메탈로프로테이나제 억제제 1의 부재는 숙주 세포 단백질이 현미경-가시성 입자에서만 농축되었다는 것을 시사한다 (표 12).
Figure pct00013
실시예 8.
바이오공정에서 숙주 세포 단백질의 존재를 평가하기 위해, mAb2에 대하여 전임상 제조 및 공정 개발 (PMPD)로부터 수확된 세포 배양물 유체 (HCCF)는 테스트되었다. mAb2에 대한 HCCF는 멸균 여과 후 그리고 냉동-해동 주기에서 입자의 존재를 보여주었다. 산업적 작동 및 제품 공급 (IOPS)에서 HCCF 멸균화 여과 단계 동안, 높은 배압은 경험이었고, 일부 비-가용성 물질이 필터를 막고 있음을 나타냈다.
입자의 단리, 라만 분석 및 펩타이드 분석은 실시예 2에서 실례된 바와 같이 수행되었다. 도 22는 입자의 어둡게 채워진 이미지 및 라만 이미지를 도시한다. mAb2 이외에, 743개 숙주 세포 단백질은 입자 중 하나에서 확인되었다. (서열 적용범위에 기반된) 최상위 10개 HCP는 L-락테이트 데하이드로게나제 (UniProt Accession: Q06BU8), 액틴, 세포질 (UniProt Accession: G3GVD0), 트랜스케톨라제 (UniProt Accession: G3GUU5), Rab GDP 해리 억제제 베타 (UniProt Accession: G3GR73), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제 (UniProt Accession: P17244), V-유형 양성자 ATPase 촉매적 아단위 A (UniProt Accession: G3H066), 트랜스젤린 (UniProt Accession: G3H7Z2), 글루타티온 S-트랜스퍼라제 뮤 5 (UniProt Accession: G3ILF1), 클로라이드 세포내 채널 단백질 4 (UniProt Accession: G3HMU4), 및 류코트리엔 A-4 가수분해효소 (UniProt Accession: G3HBI9)이었다.
실시예 9.
바이오공정에서 상이한 단계에 숙주 세포 단백질로 구성된 입자는 필터 용량에서 감소를 초래할 수 있다. 바이오공정에서 숙주 세포 단백질의 존재를 사정하기 위해, mAb3/mAb2 바이오공정을 위한 세포 배양물 유체 (CCF)는 테스트되었다.
9.1 필터 용량 사정
PMPD 및 IOPS 공정은 다양한 프로그램으로부터 소수의 롯트에서 비정상적으로 낮은 CCF 여과 처리량을 나타냈다. mAb3/mAb2 롯트 중 하나의 경우, 수확 풀 필터 용량은 실온에서 0, 24, 48, 및 72 시간 동안 인큐베이션된 후 사정되었다. 필터 용량 사정은 상기 언급된 시점에 CCF 필터 풀에서 Vmax 방법을 사용하여 수행되었다 (Vmax™Constant Pressure Test Protocol, Merck Millipore). Vmax™ 테스트에서, 시간 그리고 그 시간까지 수집된 시간 부피는 규칙적 간격에 기록되었다. 데이터는 그 다음 시간/부피 대 시간으로서 플롯팅되었다.
2개 유형의 필터 - Sartopore®2 (0.45 μm 및 0.2 μm, 각각을 가진 2개 층의 필터) 및 LifeASSURE™(0.65 μm 및 0.2 μm, 각각을 가진 2개 층의 필터))는 사정에 사용되었다. Vmax 용량 (L/m2) 대 시간으로 시간의 플롯 (도 23 참고)은 경시적으로 Vmax™에서의 감소를 보여주어서, 경시적으로 응집 또는 입자 형성을 나타냈다. 시간에서의 증가는 탁도에서의 증가를 또한 보여주었다. 탁도에서의 이러한 증가 그리고 필터 용량에서의 감소는 필터를 막고 있는 경시적으로 숙주 세포 단백질 또는 약물 용액의 침전 때문일 수 있다.
9.2 단백질 풍부도 정량
탁도에서의 증가 및 필터 용량에서의 감소의 원인을 찾기 위해, mAb2에 대한 CCF (pI: ~6.3)는 pH 5.60-6.10에서 0, 24, 48 및 72 시간 동안 사전-여과 인큐베이션되었다. 각 시점에 인큐베이션된 CCF 유체는 LifeASSURE™ 필터 (0.65 μm 및 0.2 μm, 각각을 가진 2개 층의 필터)를 사용하여 여과되었다.
어떤 단백질이 경시적으로 침전하였는지를 평가하기 위해, 필터는 절개되었고 4 mm 디스크는 분석되었다 (도 24 참고). 컷트 필터는 8M 요소 및 10mM TCEP-HCl에 침지되었고 30 분 동안 50 ℃에서 인큐베이션되어 컷트 필터에서 단백질을 용해, 변성, 및 감소시켰다. 샘플은 그 다음 30 분 동안 실온에서 10 mM 인돌-3-아세트산 (IAA)으로 인큐베이션되었다. 인큐베이트 샘플은 변성 조건 하에서 1 시간 동안 1 μg의 rLysC로 소화되었고, 이어서 Tris-HCl로 희석되었다. 이러한 혼합물에, 1 μg의 트립신은 첨가되었고 소화는 3 시간 동안 계속되었다. 소화 혼합물은 그 다음 20% 포름산 (FA)으로 산성화되었고 이어서 나노LC-MS/MS 분석되었다. 단백질 풍부도는 특정한 단백질에 할당하였던 최상위 3개 펩타이드 이온의 질량 분광계 신호 풍부도의 평균에 기반되었다.
총 2366개의 정량화가능 단백질은 mAb2의 CCF에서 확인되었다. 확인된 단백질로부터, 1880개 단백질은 추가 분석을 위하여 인큐베이션되었다 (486개 단백질은 이들이 단백질당 2개 미만 독특한 펩타이드를 보여주었기 때문에 배제되었다). 가장 풍부한 단백질은 mAb2이었다. 필터에서 mAb2에 대한 풍부도는 경시적으로 변화하지 않았다 (도 25 및 표 13 참고).
Figure pct00014
mAb2 LC의 평균 풍부도는 1E6으로 설정되었고 기타 단백질의 풍부도는 mAb2 LC의 평균 풍부도에 대해 정상화되었던 HCP 펩타이드 질량 분광계 피크 영역을 사용하여 계산되었다. (표 14에서 열거된) 최상위 50개 가장 풍부한 단백질은 이들이 필터를 더욱 막을 것 같으므로 면밀히 시험되었다.
Figure pct00015
Figure pct00016
mAb2의 상대적 풍부도 대 시간의 평행 플롯은 매우 풍부한 HCP의 일부가 경시적으로 증가하였음을 나타냈다 (도 26 참고).
상이한 시점에 인큐베이션된 CCF 필터에서 침전된 HCP의 양을 이해하기 위해, 시간 T에서 HCP의 풍부도/T0에서 HCP의 풍부도의 비 대 시간 T에서 mAb2 LC의 상대량 (ppm)의 버블 플롯은 도 27 (T = 0 시간), 도 28 (T = 24 시간), 도 29 (T = 48 시간), 및 도 30 (T = 72 시간)에서 도시된다. 도 28에서 보여진 바와 같이, 소수의 HCP (예를 들어 보체 C1q 종양 괴사, 신장 인자 1-베타, 78 kDa 글루코스-조절된 단백질 및 신장 인자 1-델타-유사 아이소폼 1)는 필터 용량에서 완화된 감소에 상관관계가 있었던 2-배 이상 증가하였다. 48 시간 후, 많은 HCP는 필터 용량에서 비슷하게 상당한 감소와 상관관계가 있는 2-배 이상 증가하였다 (도 29 참고). 72 시간에, 거의 모든 최상위 50개 HCP에 대하여 72 시간에서 풍부도는 0 시간에서 그들의 풍부도와 비교하여 2-배 이상 증가하였다 (도 30 참고). 9개 단백질 형태의 경우 최상위 50개 HCP는 0 시간에서 그들의 풍부도와 비교하여 5-배 이상 증가하였다 (표 14).
최상위 HCP 중에서, 피브로넥틴은 72 시간에서 4.6-배 증가를 보여주었고 가장 높은 분자량을 가졌고 감소된 필터 용량의 원인일 가능성이 가장 높았다.
현미경-가시성 또는 가시성 입자는 감소된 필터 용량을 초래할 수 있고 현미경-가시성 또는 가시성 입자의 형성에 대한 근본 원인 또는 필터 용량에서 감소에 대한 근본 원인을 찾는 것은 약물 제품 또는 바이오공정에 필수적일 수 있다. 일단 원인이 확인되었다면, 그것을 피하기 위한 단계는 실시될 수 있다. 본원에서 기재된 방법은 가시성 및 현미경-가시성 입자의 형성의 근본 원인의 확인을 용이하게 할 수 있다.

Claims (20)

  1. 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 단백질의 특성규명 방법으로서,
    상기 샘플에서 상기 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 검출하는 단계;
    상기 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 단리 및 포착하여 단백질의 존재를 확인하는 단계; 및
    질량 분광계를 사용하여 상기 단백질을 특성규명하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자가 라만 분광법을 사용하여 확인되는, 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자가 적어도 약 100 μm의 크기를 갖는, 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자가 선천적 불순물인, 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 금-코팅된 폴리카보네이트 막에서 상기 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 포착하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 금-코팅된 폴리카보네이트 막의 상기 기공 크기가 약 5 μm인, 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 라만 분광법 분석 수행 후 요소내 상기 샘플을 용해시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 요소의 농도가 약 8 M인, 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 라만 분광법 분석 수행 후 변성 조건 하에서 상기 샘플을 소화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 샘플이 관심의 단백질을 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 관심의 상기 단백질이 항체인, 방법.
  12. 제 9 항에 있어서, 관심의 상기 단백질이 치료적 항체인, 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 질량 분광계가 액체 크로마토그래피 시스템에 커플링되는, 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 액체 크로마토그래피 시스템이 나노 액체 크로마토그래피 시스템인, 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 질량 분광계가 탠덤 질량 분광계인, 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질이 숙주-세포 단백질인, 방법.
  17. 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 적어도 하나의 단백질의 정량화 방법으로서,
    상기 샘플에서 상기 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 검출하는 단계;
    상기 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 단리 및 포착하여 상기 적어도 하나의 단백질의 존재를 확인하는 단계; 및
    질량 분광계를 사용하여 상기 적어도 하나의 단백질을 확인하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 단백질이 숙주-세포 단백질인, 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자가 단백질의 응집체인, 방법.
  20. 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자내 숙주 세포-단백질의 특성규명 방법으로서,
    상기 샘플에서 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 검출하는 단계;
    상기 적어도 하나의 가시성 또는 현미경-가시성 입자를 단리 및 포착하여 단백질의 존재를 확인하는 단계; 및
    질량 분광계를 사용하여 상기 단백질을 특성규명시켜 상기 단백질이 상기 숙주 세포-단백질인지를 결정하는 단계
    를 포함하는, 방법.
KR1020217026589A 2019-01-30 2020-01-29 생물제제내 가시성 및/또는 현미경-가시성 입자의 특성규명 방법 KR20210121107A (ko)

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