ES2963079T3 - Detección de proteínas de células hospedadoras residuales en preparaciones de proteínas recombinantes - Google Patents

Abstract

Esta solicitud proporciona un método para usar aptámeros para determinar la presencia de HCP en una preparación de proteínas recombinantes, y proporciona métodos para preparar una pluralidad de aptámeros para usar en el método de detectar una pluralidad de HCP en una preparación de proteínas recombinantes. De acuerdo con la descripción, un método para determinar la presencia o ausencia de una pluralidad de HCP en una preparación de proteínas recombinantes comprende: proporcionar una preparación de proteínas recombinantes; proporcionar un conjunto final de aptámeros; combinar la preparación de proteínas recombinantes con el conjunto final de aptámeros; y determinar la presencia o ausencia de una pluralidad de HCP. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Detección de proteínas de células hospedadoras residuales en preparaciones de proteínas recombinantes

Campo

Esto está en el campo de proteínas recombinantes. Más específicamente, esto se refiere a métodos para determinar la presencia de proteínas residuales de células hospedadoras (HCP) en preparaciones de proteínas recombinantes.

Antecedentes de la invención

Las proteínas recombinantes se producen habitualmente en células hospedadoras. Las proteínas de célula hospedadora (HCP) son impurezas relacionadas con el proceso que surgen de las células hospedadoras durante el curso normal de la producción de proteínas recombinantes [Wang et al., HCPs in Biologics Development: Identification, Quantitation and Risk Assessment, Biotechnol. Bioeng. 103(3):446-458 (2009)]. En los biofármacos recombinantes, las HCP conllevan riesgos potenciales de seguridad clínica debido a la actividad de las propias HCP, o a la capacidad de la HCP para provocar una respuesta inmunitaria. De hecho, la demostración de la depuración y/o el control de las HCP presentes en un producto bioterapéutico es un requisito reglamentario [ICH Harmonised Tripartite Guideline Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products Q6B (1999)]. Por lo tanto, la caracterización, remoción, y/o depuración de HCP de productos biofarmacéuticos recombinantes a través del proceso de purificación son deseables antes de que el producto biofarmacéutico se pueda liberar para usarse en el tratamiento de seres humanos o animales.

Las HCP se detectan actualmente en preparaciones de proteínas recombinantes utilizando anticuerpos policlonales (pAb) en un formato de inmunoensayo. La producción de pAbs anti-HCP requiere mucho tiempo y es costosa, y existen importantes problemas de calidad y utilidad con los pAbs anti-HCP resultantes: 1) Debido a la inmunización de los animales, la producción de pAb anti-HCP tarda entre 9 y 12 meses a un costo significativo; 2) El reconocimiento de todas las HCP en una mezcla no es posible debido a la falta de inmunogenicidad de algunas de las HCP en los animales utilizados para generar la respuesta inmunitaria policlonal, o las bajas cantidades relativas de HCP individuales presentes en la mezcla de HCP utilizada para inmunizar a los animales.

Un pAb de HCP habitual reconoce aproximadamente 50-75% de HCP en una preparación de proteína recombinante. Con algunas estimaciones de 1,200 a 1,600 posibles HCP en una preparación antigénica, este enfoque potencialmente deja una gran cantidad de HCP indetectables por un pAb. Por lo tanto, un mejor reactivo de detección de HCP, uno que reconozca todos o casi todos las HCP potenciales, sería altamente deseable para dar un mejor significado cuantitativo a los resultados del inmunoensayo de<h>C<p>.

Los aptámeros se han generado previamente contra una diana individual (ya sea en forma purificada o como parte de una mezcla compleja). Al generar aptámeros a partir de una mezcla compleja, Fitter y James [Deconvolution of a Complex Target Using DNA Aptamers, J. Cell Biol., 280 (40): 34193-34201 (2005)] enseña una estrategia de procesamiento en serie. En esta estrategia, Fitter y James utilizan una estrategia de agotamiento de dianas para evitar la convergencia de aptámeros sólo a unas pocas dianas dentro de la mezcla. Específicamente, en una estrategia de procesamiento en serie, Fitter y James realizan rondas repetidas de examinación y después de cada ronda, utilizan los aptámeros generados en la ronda anterior para remover las dianas de la mezcla.

Fortis et al [J. Proteome Res. 5 (10): 2577-2585 2006)] se refiere a un enfoque para la detección e identificación de impurezas de proteínas utilizando bibliotecas combinatorias de ligandos en fase sólida. Cho et al [PNAS 110 (46) 18460 18465 (2013)] se refiere a la selección cuantitativa y caracterización paralela de aptámeros. WO 2004/094989 se refiere a métodos para determinar la presencia de proteínas de células hospedadoras en una muestra. US 2009/247421 se refiere a diversas bibliotecas químicas unidas a partículas pequeñas con propiedades paramagnéticas.

El método que se enseña aquí es inherentemente una estrategia paralela que no requiere ningún agotamiento de dianas. Específicamente, el método presentado en la presente utiliza secuenciación de próxima generación (NGS) para identificar aptámeros para la unión a todas las dianas en la mezcla en paralelo, y utiliza los arreglos de aptámeros para medir la unión real simultáneamente de todos los aptámeros a todas las dianas en la mezcla. Anteriormente no se consideraba posible realizar una tarea tan compleja. Específicamente, anteriormente no se percibía posible utilizar una estrategia paralela para identificar aptámeros que se unen a diferentes dianas y para desacoplar la identidad de los aptámeros y su capacidad para unirse a cada diana. El grupo de aptámeros obtenido aquí se puede utilizar para determinar la presencia de HCP en preparaciones de proteínas recombinantes.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La invención se define por las reivindicaciones anexas. Se refiere a un método para remover proteínas de la célula hospedadora (HCP) de una preparación de proteína recombinante. El método comprende: (i) proporcionar un grupo final de aptámeros; (ii) exponer la preparación de proteína recombinante al grupo final de aptámeros; (iii) permitir que el grupo final de aptámeros se una a HCP que forman complejos de aptámero:HCP; y (iv) separar los complejos de aptámero:HCP de la preparación de proteína recombinante. La preparación del grupo final de aptámeros comprende: (a) proporcionar una biblioteca de aptámeros potenciales; (b) seleccionar una pluralidad de aptámeros candidatos de una biblioteca de aptámeros potenciales determinando qué aptámeros muestran cierto grado de unión a HCP en una mezcla de HCP; (c) secuenciar la pluralidad de aptámeros candidatos, opcionalmente en donde la secuenciación es mediante secuenciación de próxima generación; y (d) identificar el grupo final de aptámeros con base en la afinidad de unión de los aptámeros candidatos a las HCP en una mezcla de HCP, en donde la afinidad de unión se determina específicamente al emplear un soporte sólido que muestra aptámeros candidatos.

SUMARIO DE LOS ASPECTOS GENERALES DE LA DIVULGACIÓN

Más allá del alcance de la invención, que se define por las reivindicaciones anexas, esta divulgación proporciona un marco más genérico con relación a métodos para determinar la presencia o ausencia de una pluralidad de HCP en una preparación de proteína recombinante, que comprende: proporcionar una preparación de proteína recombinante; proporcionar un grupo final de aptámeros; combinar la preparación de proteína recombinante con el grupo final de aptámeros; y determinar la presencia o ausencia de una pluralidad de HCP.

En algunos casos, la preparación de proteína recombinante es una preparación biofarmacéutica.

En un caso, determinar la presencia de una pluralidad de HCP comprende microarreglo, cromatografía, reacción en cadena de polimerasa, o ensayo inmunoabsorbente vinculado a enzimas. En otro caso, el grupo final de aptámeros se ha elegido por la capacidad de los aptámeros individuales para unirse a HCP.

Un caso abarca un método para preparar un grupo final de aptámeros para usarse en la detección o remoción de una pluralidad de HCP en una preparación de proteína recombinante, donde el método comprende: proporcionar una biblioteca de aptámeros potenciales; seleccionar una pluralidad de aptámeros candidatos de la biblioteca de aptámeros potenciales por la exposición de la biblioteca de aptámeros potenciales a una mezcla de HCP que comprende una pluralidad de HCP, y separar una pluralidad de aptámeros candidatos de la biblioteca de aptámeros potenciales por la capacidad de cada aptámero individual para unirse a una HCP; y determinar la identidad de una pluralidad de aptámeros que se unen a una pluralidad de HCP, en donde el método identifica un grupo final de aptámeros que se unen específicamente a HCP.

En un caso, la preparación de proteína recombinante es de una célula hospedadora que expresa transitoriamente la proteína recombinante. En otro caso, la preparación de proteína recombinante es de una célula hospedadora transformada de manera estable. En otro caso, el grupo de aptámeros candidatos es el grupo final de aptámeros. En un caso, el grupo de aptámeros candidatos se somete a una selección adicional antes de la selección del grupo final de aptámeros. En algunos casos, el grupo de aptámeros candidatos se somete a una o más rondas de selección para obtener un grupo final de aptámeros.

En un caso adicional, el método comprende determinar la identidad de un grupo final de aptámeros que se unen a HCP específicas. En un modo, determinar la identidad de un grupo final de aptámeros comprende secuenciar el grupo final de aptámeros. En otro aspecto, la secuenciación comprende secuenciar el grupo final de aptámeros en paralelo. En un caso, la secuenciación en paralelo se realiza utilizando un proceso de secuenciación de próxima generación.

En un caso adicional, el método comprende determinar la identidad de una pluralidad de HCP que se unen a los aptámeros. En un aspecto adicional, determinar la afinidad de unión de la pluralidad de aptámeros candidatos para las HCP en la preparación de proteína recombinante comprende: fijar los aptámeros candidatos a un soporte sólido, poner en contacto la preparación de proteína recombinante con los aptámeros candidatos unidos al soporte sólido, y determinar la afinidad de unión de las HCP en la preparación de proteína recombinante a los aptámeros candidatos o fijar las HCP de la preparación de proteína recombinante a un soporte sólido, poner en contacto los aptámeros candidatos con las HCP unidas al soporte sólido, y determinar la afinidad de unión de los aptámeros candidatos a las HCP en la preparación de proteína recombinante.

En un modo, los aptámeros candidatos se unen al soporte sólido como un arreglo. En otro aspecto, la afinidad de unión se determina en paralelo para los aptámeros candidatos a las HCP en la preparación de proteínas recombinantes usando el arreglo. En un caso, la preparación de proteína recombinante comprende una pluralidad de HCP de identidad desconocida. En otro caso, la preparación de proteína recombinante comprende una pluralidad de HCP de cantidad desconocida. En un modo, la preparación de proteína recombinante comprende diferentes cantidades de múltiples HCP. En otro modo, la biblioteca de aptámeros potenciales comprende al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 102, al menos aproximadamente 103, al menos aproximadamente 104, al menos aproximadamente 105, al menos aproximadamente 106, al menos aproximadamente 107, al menos aproximadamente 108, al menos aproximadamente 109, al menos aproximadamente 1010 o al menos aproximadamente 6 * 1014 aptámeros.

En un modo, seleccionar una pluralidad de aptámeros candidatos de la biblioteca de aptámeros potenciales comprende mostrar una biblioteca de aptámeros potenciales en un soporte sólido. En un modo, cada soporte sólido muestra múltiples copias del mismo aptámero. En un modo, cada soporte sólido muestra múltiples aptámeros. En otro aspecto, el soporte sólido y los aptámeros forman una partícula de aptámero. En un caso, el método comprende aislar los aptámeros con una capacidad para unirse a HCP. En un aspecto, la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) se utiliza para aislar aptámeros con una capacidad para unirse a HCP en la preparación de proteínas recombinantes. En otro aspecto, la selección de una pluralidad de aptámeros candidatos de una biblioteca de aptámeros potenciales comprende la selección microfluídica.

En un modo adicional, el soporte sólido utilizado para seleccionar aptámeros candidatos de la biblioteca de aptámeros potenciales son cuentas. En otro modo, las cuentas son cuentas magnéticas. En un caso, las HCP se unen al soporte sólido. En algunos casos, el soporte sólido al que se unen las HCP son cuentas. En otro caso, las cuentas están atrapadas en un dispositivo de separación micromagnética. En otro caso, se realizan múltiples rondas de selección para seleccionar una pluralidad de aptámeros candidatos de la biblioteca de aptámeros. En un caso adicional, las condiciones de selección en las múltiples rondas de selección son diferentes. En un caso diferente, las condiciones de selección en las múltiples rondas de selección son las mismas.

En un aspecto, se obtiene la secuencia de ácido nucleico de sólo el grupo final de aptámeros. En otro aspecto, se obtiene la secuencia de ácido nucleico de aptámeros en diferentes pasos en la selección. En un aspecto adicional, después de obtener la secuencia de ácido nucleico de los aptámeros en una biblioteca de aptámeros potenciales, un paso de discriminación adicional identifica aptámeros candidatos para un arreglo en la que los aptámeros candidatos se pueden unir para determinar la afinidad por las HCP. En un modo, el paso de discriminación adicional comprende al menos uno de análisis de número de veces de enriquecimiento, análisis de motivo de repetición, y análisis de número de copias.

En un modo, el arreglo se utiliza para determinar la afinidad de unión de al menos aproximadamente 10 aptámeros a HCP. En otro modo, el arreglo determina la afinidad de unión para al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 250, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 250, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 1000, al menos aproximadamente 2000, al menos aproximadamente 5000, al menos aproximadamente 10,000, al menos aproximadamente 20,000, al menos aproximadamente 105, al menos aproximadamente 106, al menos aproximadamente 107, al menos aproximadamente 108, al menos aproximadamente 109, al menos aproximadamente 1010, o al menos aproximadamente 6 * 1014 aptámeros para HCP. En otro modo, los aptámeros se unen a un soporte sólido usando un ligador. En otro modo, la afinidad de unión para los aptámeros a HCP se determina al medirKdo K<a>. En otro modo, los aptámeros se unen a HCP específicas con una K<d>de al menos aproximadamente 2 |<j>M.

En un aspecto, el método genera al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 600, al menos aproximadamente 700, al menos aproximadamente 800, al menos aproximadamente 900, al menos aproximadamente 1000 o al menos aproximadamente 6 * 1014 aptámeros que se unen a HCP específicas. En un caso, los aptámeros se utilizan para determinar la presencia de HCP en una preparación de proteína recombinante. En otro caso, los aptámeros se utilizan para determinar la identidad de las HCP en una preparación de proteína recombinante. En un caso, los aptámeros se utilizan para determinar la cantidad de HCP en una preparación de proteína recombinante.

Otro modo abarca un método para determinar la identidad de al menos una HCP en una preparación de proteína recombinante que comprende: proporcionar al menos un aptámero preparado por los métodos de la presente; y determinar la identidad de al menos una HCP.

En un aspecto, el método emplea una pluralidad de aptámeros. En otro aspecto, la identidad de al menos una HCP se determina por espectrometría de masas.

Otro modo abarca un método para detectar la presencia de una pluralidad de HCP en una preparación de proteína recombinante que comprende: proporcionar un grupo final de aptámeros preparado por los métodos de la presente; y determinar si algunos de los aptámeros se unen a HCP específicas en la preparación de proteína recombinante.

Otro modo abarca un método para remover HCP de una preparación de proteína recombinante que comprende: proporcionar un grupo final de aptámeros preparados por los métodos en la presente; exponer la preparación de proteína recombinante que comprende HCP al grupo final de aptámeros, permitir que los aptámeros se unan a HCP; y separar los aptámeros de unión a HCP de la preparación de proteína recombinante. En un aspecto, el grupo final de aptámeros se fija a un soporte sólido. En un modo, el soporte sólido es una placa, resina de cromatografía, o una cuenta. En un aspecto, la cuenta es una cuenta magnética. En otro modo, cada uno de los aptámeros en el grupo final de aptámeros se fija individualmente a un soporte sólido. En otro aspecto, todos los aptámeros en el grupo final de aptámeros se fijan como una mezcla al soporte sólido.

La divulgación se puede entender más completamente a partir de la siguiente descripción detallada y las figuras anexas, que forman parte de esta solicitud.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 representa una gráfica de FACS que muestra la intensidad de fluorescencia para partículas de aptámero individuales unidas a HCP marcadas de manera fluorescente.

La figura 2 muestra dos imágenes de un microarreglo que contiene aptámeros obtenidas después de cinco rondas de visualización de partículas e incubadas con HCP marcados con Alexa FluorMR 647. Dentro de los bordes blancos de la figura 2<a>hay pocillos que contienen aptámeros individuales rodeados por pocillos vacíos; la figura 2B representa pocillos que contienen ADN de hebra individual (ADNmc) de secuencias aleatorias. La figura 3 muestra una gráfica de barras de la cuantificación del microarreglo en la figura 2A.

La figura 4 muestra una imagen de soluciones de sobrenadante eluido separadas usando una electroforesis en gel NuPAGEMR, y los polipéptidos visualizados al teñir el gel con tinción de gel de proteína SYPROMR Ruby.DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS

La tabla listada a continuación proporciona la secuencia de ácido nucleico, nombre o descripción, y número de identificador de secuencia (SEQ ID NO) de cebadores, ligadores, y aptámeros a los que se hace referencia en la presente. La tabla 1 contiene SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 398, y proporciona una lista de secuencias de cebadores y algunos de los aptámeros a los que se hace referencia en la presente descripción.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

I. Definiciones

En el contexto de esta divulgación, se debe utilizar una serie de términos.

En la presente divulgación, "HCP" se refiere a la proteína de célula hospedadora.

Como se usa en la presente, "mezcla de proteínas de célula hospedadora" y "mezcla de HCP" y "antígeno de HCP" se usan indistintamente y se refieren a una mezcla de HCP obtenida de una célula hospedadora nula, es decir, una célula hospedadora que no expresa una proteína recombinante.

Como se utiliza en la presente, una "preparación de proteína recombinante" se refiere a la preparación obtenida después de expresar una proteína recombinante en una célula hospedadora. La preparación de proteína recombinante puede ser una preparación de anticuerpo. La preparación de proteína recombinante puede ser una preparación biofarmacéutica. El término "aptámero" se refiere a una molécula de ácido oligonucleico o péptido que se une a una molécula diana específica. Los aptámeros de oligonucleótidos se pueden clasificar como aptámeros de ADN, ARN o ácido xenonucleico (XNA), y usualmente constan de hebras cortas de oligonucleótidos o XNA. Los aptámeros de péptidos constan de un dominio de péptido variable corto unido en ambos extremos a un andamiaje de proteínas.

El término "aptámeros potenciales" se refiere a una colección de aptámeros que se pueden proporcionar al comienzo de un método para identificar aptámeros que se van a utilizar para la detección de HCP. Los aptámeros potenciales se pueden generar aleatoriamente. Los aptámeros potenciales pueden ser una biblioteca de aptámeros potenciales.

Los "aptámeros candidatos" son aptámeros que han experimentado alguna selección para unirse a HCP y, por lo tanto, son un subconjunto de los aptámeros potenciales.

Se usan indistintamente en la presente "grupo final de aptámeros" y "grupo final de aptámeros" que se refieren a la colección de aptámeros preparados e identificados para usarse en el método para determinar la presencia de una pluralidad de HCP en una preparación de proteína recombinante. El grupo final de aptámeros puede ser un subconjunto de los aptámeros candidatos que se han sometido a una selección adicional o pueden ser los aptámeros candidatos. El grupo final de aptámeros es una pluralidad de aptámeros.

El término "pluralidad de aptámeros" se refiere en la presente solicitud a al menos aproximadamente al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 102, al menos aproximadamente 103, al menos aproximadamente 104, al menos aproximadamente 105, al menos aproximadamente 106, al menos aproximadamente 107, al menos aproximadamente 108, al menos aproximadamente 109, al menos aproximadamente 1010 o al menos aproximadamente 6 x 1014 aptámeros.

El término "aptámero anti-HCP" se refiere a un aptámero que se ha preparado por los métodos descritos en la presente y se une específicamente a una HCP.

El término "microfluidos" se refiere a un sistema en el que se manejarán pequeños volúmenes de fluido, con al menos una dimensión por debajo de aproximadamente 1000 |jm o por debajo de aproximadamente 500 |jm.

Como se usa en la presente, el término "aproximadamente" se refiere a un valor numérico, que incluye, por ejemplo, números enteros, fracciones y porcentajes, ya sea que se indique explícitamente o no. El término aproximadamente en general se refiere a un intervalo de valores numéricos (por ejemplo, /- 5-10% del intervalo mencionado) que un experto en la técnica consideraría equivalente al valor mencionado (por ejemplo, que tiene la misma función o resultado). En algunos casos, el término aproximadamente puede incluir valores numéricos que se redondean a la cifra significativa más cercana.

La cantidad de cada HCP se puede determinar por la concentración o cantidad de la proteína.

II. Producción de aptámeros para HCP

Los aptámeros se pueden utilizar para la detección de HCP. Debido a que la generación de aptámeros no depende del reconocimiento inmunitario, los métodos que usan aptámeros tienen el potencial de detectar una mayor cantidad de HCP que los métodos actuales.

En un caso, los aptámeros se pueden seleccionar para determinar la presencia de HCP en una preparación de proteína recombinante obtenida de cualquiera de los diferentes tipos de células conocidos (que incluyen, pero no se limitan a, mamíferos, bacterias, levaduras, insectos, o plantas).

La presente divulgación abarca una pluralidad de enfoques para producir una pluralidad de aptámeros que se unen a HCP específicas. En un caso, un método para preparar una pluralidad de aptámeros comprende los siguientes pasos. En primer lugar, se proporciona una biblioteca de aptámeros potenciales. En segundo lugar, los aptámeros candidatos se pueden seleccionar de la biblioteca de aptámeros potenciales determinando qué aptámeros candidatos muestran algún grado de unión a las HCP. En este método, los pasos identifican una pluralidad de aptámeros que se unen a HCP específicas. En un método, los aptámeros candidatos pueden ser el grupo final de aptámeros. En algunos casos, los aptámeros pueden usarse en un método de detección o un método de remoción de HCP.

En otro caso, el enfoque comprende los siguientes pasos. En primer lugar, se proporciona una biblioteca de aptámeros potenciales. En segundo lugar, los aptámeros candidatos se pueden seleccionar de la biblioteca de aptámeros potenciales determinando qué aptámeros muestran algún grado de unión a las HCP. En tercer lugar, el método puede comprender determinar la identidad de (i) una pluralidad de aptámeros que se unen a una HCP y/o (ii) una pluralidad de HCP que se unen a la pluralidad de aptámeros. En un caso, determinar la identidad de una pluralidad de aptámeros comprende secuenciar los aptámeros. En un caso, la secuenciación de los aptámeros se lleva a cabo en paralelo. En un caso, la secuenciación en paralelo se realiza a través de un proceso de secuenciación de próxima generación.

En un caso, el grupo de aptámeros candidatos se somete a una selección adicional antes de la preparación del grupo final de aptámeros. En otro caso, el enfoque comprende los siguientes pasos. En primer lugar, se proporciona una biblioteca de aptámeros potenciales. En segundo lugar, los aptámeros candidatos se pueden seleccionar de la biblioteca de aptámeros potenciales determinando qué aptámeros muestran al menos algún grado de unión a las HCP en una mezcla de HCP. En tercer lugar, se pueden secuenciar aquellos aptámeros candidatos que muestran cierto grado de unión a HCP en una mezcla de HCP. En algunos casos, la secuenciación se realiza en paralelo. En cuarto lugar, la afinidad de unión para una pluralidad de los aptámeros candidatos se puede determinar específicamente. En quinto lugar, se puede identificar un grupo final de aptámeros con base en la afinidad de unión de los aptámeros candidatos a las HCP en la mezcla de HCP, o la preparación de proteínas recombinantes. En un caso, la afinidad de unión se puede determinar específicamente al emplear un soporte sólido que muestra aptámeros candidatos. En un caso, el soporte sólido puede ser un arreglo. En un caso en el que el soporte sólido es un arreglo, la afinidad de unión por los aptámeros candidatos se puede determinar en paralelo.

En otro caso, el enfoque comprende los siguientes pasos. En primer lugar, se proporciona una biblioteca de aptámeros potenciales. En segundo lugar, los aptámeros candidatos se pueden seleccionar de la biblioteca al determinar qué aptámeros muestran algún grado de unión a las HCP en una mezcla de HCP o una preparación de proteínas recombinantes. En tercer lugar, se pueden secuenciar aquellos aptámeros candidatos que muestran cierto grado de unión a HCP. En algunos casos, la secuenciación se puede realizar en paralelo. En cuarto lugar, se puede proporcionar una matriz que muestre los aptámeros candidatos. En quinto lugar, la afinidad de unión por los aptámeros candidatos a las HCP en la mezcla de HCP o la preparación de proteínas recombinantes se puede determinar usando un enfoque basado en arreglo, y se pueden elegir aptámeros que muestran una unión de menos de 2 |jM de K<d>o menos de 1 |jM de K<d>a las HCP en la mezcla de HCP o la preparación de proteínas recombinantes. En sexto lugar, se puede identificar una pluralidad de aptámeros que se unen a<h>C<p>específicas en la mezcla de HCP o la preparación de proteína recombinante. En algunos casos, se puede utilizar mutagénesis u otras formas de evolución directa en la búsqueda para identificar aptámeros que se unen a HCP específicas.

El término "unión específica" se refiere a la interacción de una molécula de unión (aquí un aptámero) y su compañero de unión (aquí una HCP) donde la interacción depende de la presencia de una estructura particular en el compañero de unión. El aptámero se unirá o reconocerá preferentemente la<h>C<p>incluso cuando la HCP esté presente en una mezcla de otras moléculas (incluyendo otras HCP o la proteína recombinante producida por una línea celular del mismo tipo).

En un caso, las HCP generadas por una proteína recombinante específica se pueden identificar al determinar las HCP en una preparación de proteína recombinante; determinar las HCP en una preparación de proteína a partir de una línea celular del mismo tipo, pero que no expresa la proteína recombinante (línea celular nula); y restar las HCP en la preparación de proteína recombinante de las HCP en la línea celular nula.

Opcionalmente, el grupo final de aptámeros se puede utilizar para determinar la identidad de las HCP a las que se une cada aptámero. En algunos casos, la HCP identificada puede estar aislada.

La afinidad entre algunos o todos los aptámeros en el grupo final de aptámeros generado a través de una instancia descrita en la presente, y la HCP a la que cada aptámero se une más estrechamente (es decir, tiene laKdmás baja) se puede representar por una K<d>de aproximadamente 1x10-8 a aproximadamente 1x10-13 En otro caso, se puede representar por una K<d>de aproximadamente 1x10-9 a aproximadamente 1x10-12 o de aproximadamente 1x10-9 a aproximadamente 500 x 10-12 En una preparación de proteína recombinante hay aproximadamente 1200 HCP presentes en un intervalo de concentración de aproximadamente 1 a 100 ng/mL. Por lo tanto, para ver una señal con un escáner, los aptámeros deben tener una K<d>de aproximadamente 1x10-8 a aproximadamente 1 x 10-13. En otro caso, se puede representar por una K<d>de aproximadamente 1x10-9 a aproximadamente 1x10-12 o de aproximadamente 1x10-9 a aproximadamente 500 x 10-12.

En un caso, las HCP están presentes en diferentes cantidades en la mezcla de HCP o en la preparación de proteína recombinante. Algunas HCP pueden estar presentes en concentraciones muy altas y otras HCP pueden estar presentes en concentraciones muy bajas. Por ejemplo, las HCP pueden diferir en cantidad en al menos aproximadamente una relación de 1:10, al menos aproximadamente una relación de 1:100, o al menos aproximadamente una relación de 1: 1000. Una ventaja de los presentes métodos es que este enfoque de aptámeros se puede utilizar para preparar aptámeros o detectar HCP presentes en concentraciones tanto altas como bajas simultáneamente.

A. Proporcionar una biblioteca de aptámeros potenciales

Los aptámeros potenciales en una biblioteca pueden comprender ácidos nucleicos. En un caso, los aptámeros potenciales en una biblioteca pueden comprender ADN, o ARN, o XNA, o una combinación de estos. En un caso, los aptámeros potenciales en una biblioteca pueden comprender ADNmc. En un caso adicional, los aptámeros potenciales en la biblioteca comprenden secuencias de nucleótidos aleatorizadas. En un caso, los aptámeros potenciales también comprenden sitios de cebador de reacción en cadena de polimerasa (PCR). En un caso, el aptámero potencial comprende aproximadamente 100 nucleótidos. En un caso, el aptámero potencial comprende aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, o aproximadamente 130 nucleótidos. En un caso, el aptámero potencial comprende de aproximadamente 50 a aproximadamente 130 nucleótidos, de aproximadamente 60 a aproximadamente 120 nucleótidos, de aproximadamente 90 a aproximadamente 110 nucleótidos. En algunos casos, la biblioteca de aptámeros contiene aptámeros potenciales con la misma cantidad de nucleótidos. En otro caso, la biblioteca contiene aptámeros potenciales con diferentes números de nucleótidos. En un caso, diferentes cantidades de secuencias aleatorias en los aptámeros representan los diferentes números de nucleótidos en los aptámeros potenciales. En algunos casos, los aptámeros utilizados para identificar HCP en un lisado de CHO contienen 50 nucleótidos.

En un caso, el aptámero potencial comprende una secuencia aleatoria de aproximadamente 60 nucleótidos. En un caso, el aptámero potencial comprende una secuencia aleatoria de aproximadamente 30 a aproximadamente 100, de aproximadamente 40 a aproximadamente 90 nucleótidos, o de aproximadamente 50 a 70 nucleótidos. En un caso, el aptámero potencial comprende una secuencia aleatoria de aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, o aproximadamente 100 nucleótidos.

En otro caso, el aptámero potencial comprende sitios de cebador de PCR cada uno de aproximadamente 20 nucleótidos. En un caso, el aptámero potencial comprende sitios de cebador de PCR cada uno de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nucleótidos, o de aproximadamente 18 a aproximadamente 22 nucleótidos. En un caso, los sitios de cebador de PCR son cada uno de aproximadamente 15, aproximadamente 18, aproximadamente 19, aproximadamente 20, aproximadamente 21, aproximadamente 22, o aproximadamente 25 nucleótidos.

En un caso, el aptámero potencial comprende aproximadamente 60 nucleótidos en una secuencia aleatorizada flanqueada por sitios de cebador de PCR de aproximadamente 20 nucleótidos cada uno arreglado como sitio de cebador de 5'-secuencia aleatorizada-sitio de cebador de 3'. En un caso, los sitios de cebador de PCR pueden ser AGCAGCACAGAGGTCAGATG (expuestos en SEQ ID NO: 1) y CCTATGCGTGCTACCGTGAA (expuesta en SEQ ID NO: 2). También se pueden utilizar otros sitios de cebadores de PCR. Las bibliotecas de aptámeros y los cebadores se pueden sintetizar usando química de fosforamidita. Las bibliotecas y cebadores de aptámeros se pueden comprar al menos de Integrated DNA Technologies.

En un caso, la biblioteca de aptámeros potenciales comprende mostrar la biblioteca de aptámeros potenciales en un soporte. En un caso, cada soporte muestra múltiples copias del mismo aptámero. En una instancia, cada soporte muestra múltiples aptámeros.

En un caso, los aptámeros se pueden usar en su estado nativo (es decir, estado en fase de solución). En otro caso, los aptámeros se pueden formar en partículas de aptámero en una cuenta. En algunos casos, las partículas de aptámero están en una cuenta magnética. En un caso, las partículas de aptámero se pueden sintetizar usando reacción en cadena de polimerasa en emulsión (PCR). En un caso, las emulsiones de agua en aceite se pueden preparar con reactivos de PCR, de modo que cada gota contenga (en la mayoría de los casos) una plantilla de ADN y una cuenta (tal como, por ejemplo, una cuenta magnética) recubierta con cebador directo. La amplificación por PCR se puede realizar dentro de la gota, produciendo partículas que muestran múltiples copias del aptámero en su superficie. En un caso, la partícula puede mostrar aproximadamente 2.4 * 105 copias del aptámero [Wang et al., Particle Display: A Quantitative Screening Method for Generating High-Affinity Aptamers, Angew. Chem. 53(19): 4796 - 4801 (2014)]. Después de romper la emulsión y remover los reactivos de p Cr sin reaccionar, las cadenas de complemento de aptámero se pueden desnaturalizar y liberar por tratamiento con NaOH y se recolectan las partículas de aptámero. Si se empleó una cuenta magnética, las partículas de aptámero se pueden recolectar en pasos posteriores por separación magnética. En algunos casos, se puede usar una cuenta que no es magnética.

B. Selección de aptámeros candidatos de una biblioteca

Se puede utilizar una variedad de técnicas para seleccionar una pluralidad de aptámeros candidatos de una biblioteca. En un caso, se selecciona una pluralidad de aptámeros candidatos de la biblioteca al exponer la biblioteca a una pluralidad de proteínas hospedadoras y al separar una pluralidad de aptámeros candidatos de la biblioteca por su capacidad para unirse cada uno a al menos una de las HCP. En un caso, cualquier técnica utilizada para seleccionar aptámeros candidatos de una biblioteca y para unir aptámeros a una diana conocida se puede utilizar en esta porción del método. Por lo tanto, la descripción de métodos particulares para seleccionar aptámeros candidatos de una biblioteca no limita esta porción particular del método.

En un caso, cada uno de los aptámeros candidatos se selecciona por su unión de alta afinidad a sólo una HCP. En un caso, los aptámeros candidatos tendrán una K<d>de aproximadamente 2 |<j>M o menor para su HCP diana. En otro caso, el aptámero candidato tendrá una K<d>de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 25 nM o menor para su HCP diana. En un caso, cada uno de los aptámeros candidatos se clasifica por su afinidad por sólo una HCP. En un caso, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 102, al menos aproximadamente 103, al menos aproximadamente 104, aproximadamente 105, aproximadamente 106, aproximadamente 107, aproximadamente 108, aproximadamente 109, o aproximadamente 1010 aptámeros candidatos se identifican por este proceso. Se puede sintetizar una gran cantidad de secuencias diferentes en paralelo en un arreglo, escindirlas, y recolectarlas, lo que hace que la generación de mezclas de aptámeros sea un proceso muy simple.

En un caso, los aptámeros candidatos son el grupo final de aptámeros. En otro caso, los aptámeros candidatos se someten a una selección adicional antes de determinar la composición de un grupo final de aptámeros. Hay una variedad de métodos para seleccionar aptámeros candidatos de una biblioteca, y algunos se describen de la siguiente manera:

1. Plataforma de selección microfluídica

En un caso, los aptámeros se pueden generar a través de la evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial utilizando tecnología microfluídica. En un caso, la selección microfluídica comienza al inmovilizar HCP en la superficie de cuentas magnéticas que pueden ser de tamaño de micrones. Las cuentas recubiertas se pueden incubar con una biblioteca de ácidos nucleicos, como se analiza anteriormente.

Durante la incubación, los aptámeros que se unen a las HCP se unirán a las cuentas recubiertas con HCP. Las cuentas se pueden lavar y clasificar utilizando una variedad de modos. En un caso, las cuentas son magnéticas y están sujetas a un lavado continuo de alta rigurosidad a una velocidad de flujo de 50 mL/hora dentro de un dispositivo de separación micromagnética (MMS). Después de la separación, se pueden remover los imanes externos, eluir las cuentas que portan los aptámeros seleccionados, y amplificar los aptámeros. La amplificación de aptámeros se puede realizar por reacción en cadena de polimerasa (PCR) para obtener a Dn de doble hebra (ADNbc), que se puede desnaturalizar en ADNmc para usarse en rondas adicionales de selección.

En un caso, la relación molar entre el ADNmc de aptámero y la diana puede ser de al menos aproximadamente 1:1, aproximadamente 5:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 25:1, aproximadamente 50:1, aproximadamente 75:1, aproximadamente 100:1, aproximadamente 200:1, aproximadamente 500:1, con las relaciones más altas de ADNmc del aptámero con respecto a la diana incrementando la presión de selección en el proceso.

En algunos casos, también se puede adicionar un componente de selección negativa al unir otras moléculas a las cuentas para incrementar la especificidad de los aptámeros seleccionados. En un caso, se puede utilizar la proteína recombinante producida por la célula hospedadora. En un caso, cuando se utiliza un modo de selección negativa, la selección negativa se puede presentar antes de la selección positiva utilizando el grupo agotado. En otro caso, la selección negativa se puede presentar después de la selección positiva. La selección negativa permite la remoción de aptámeros potenciales en la biblioteca que se unirían a la proteína recombinante que se está produciendo por la célula hospedadora en cuestión.

En un caso, se pueden utilizar múltiples rondas de selección y comparar los datos entre ellas. Cuando se utilizan múltiples rondas de selección, las condiciones en cada ronda pueden ser las mismas o pueden diferir. Por ejemplo, se pueden utilizar múltiples rondas de selección y los aptámeros candidatos que aparecen en todas las rondas de selección se ven favorecidos en mayor medida en el proceso de selección general. Alternativamente, se pueden utilizar diferentes condiciones para equilibrar la rigurosidad del proceso con la cantidad de aptámeros seleccionados como aptámeros candidatos. Además, la selección microfluídica también se puede combinar con la selección de visualización de partículas, con diferentes técnicas utilizadas en diferentes rondas y aptámeros candidatos que son aquellos que se seleccionan a través de ambos procesos. En un caso, se utilizan de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 rondas de selección microfluídica y de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 rondas de visualización de partículas. En un caso, se utilizan al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5 o al menos aproximadamente 6 rondas totales de selección para determinar los aptámeros candidatos.

2. Método de visualización de partículas

Si la biblioteca de aptámeros se proporciona en partículas de aptámeros, en un caso, se puede utilizar un método de visualización de partículas. En este método, las partículas que muestran aptámeros se exponen a una pluralidad de HCP y se selecciona una pluralidad de partículas de aptámero candidatas por su capacidad para unirse cada una a sólo una de las HCP. En un caso, los aptámeros se clasifican por su afinidad por una HCP después de que se haya medido su afinidad.

En un caso, una pluralidad de HCP se marca con porciones fluorescentes. El análisis de FACS se puede utilizar para separar las partículas de aptámero con mayor afinidad por una de las HCP de las partículas de aptámero con menor afinidad por una de las HCP. En un caso, se puede aplicar un marcador fluorescente individual a la mezcla de HCP, marcando todas las proteínas en un paso individual con un marcador fluorescente individual, puesto que este método no requiere diferenciar cuál de las HCP se une.

La intensidad de fluorescencia de las proteínas capturadas por las partículas de aptámero es proporcional a la afinidad de unión del aptámero a su HCP diana. La correlación directa entre la fluorescencia y la afinidad de aptámero permite la identificación cuantitativa y la clasificación de los aptámeros candidatos con las mayores afinidades por las HCP.

Las marcas fluorescentes que se pueden usar en el análisis de FACS incluyen, pero no se limitan a, fluoróforos tal como 7-AAD, Alexa FluorMR 405, Alexa FluorMR 488, Alexa FluorMR 532, Alexa FluorMR 546, Alexa FluorMR 647, Alexa FluorMR 700, APC (aloficocianina), APC-Alexa FluorMR 750, APC-eFluorMR 780, Cy5, eFluorMR 450, eFluorMR 605NC, eFluorMR 625NC, eFluorMR 650NC, eFluorMR 660, FITC (isotiocianato de fluoresceína), Fluoresceína, Pacific BlueMR, Naranja del Pacífico, PE-Cianina 5, PE-Cianina 5.5, PE-Cianina 5.5, PE-Cianina 7, PE-eFluorMR 610, PerCP-Cianina 5.5, PerCP-eFluorMR 710, Yoduro de Propidio (PI), R-PE (R-Phicoeritrina), RPE, RPE-Alexa FluorMR 610, RPE-Alexa FluorMR, RPE-CyMR 5.5, RPE-CyMR 7, RPE-TexasMR, y TRICOLOR<mr>Las marcas fluorescentes también incluyen puntos cuánticos que también se pueden utilizar en el análisis de FACS en lugar de los fluoróforos tradicionales. Los puntos cuánticos incluyen, pero no se limitan a, nanocristal QdotMR 525, nanocristal QdotMR 565, nanocristal QdotMR 585, nanocristal QdotMR 605, nanocristal QdotMR 655, nanocristal QdotMR 705, nanocristal QdotMR 800 (todos de Life Technologies).

En un aspecto, las marcas fluorescentes se pueden unir a las HCP a través de una estrategia de biotina-estreptavidina. Las HCP se pueden biotinilar y la proteína fluorescente se puede conjugar a estreptavidina. En un modo, se puede utilizar el kit de biotinilación EZ-Link Micro NHS-PEOi (Pierce Biotechnology), que incluye un espaciador de polietilenglicol (PEG) para mejorar la solubilidad en agua. Las concentraciones de proteína se pueden ajustar a 0.5 mg/mL con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) antes de la biotinilación. Se puede utilizar un exceso molar de 50 veces de reactivo de biotina para marcar 50-100 |jg de proteína durante 30 minutos o más a temperatura ambiente, y se puede remover a biotina libre mediante la columna de centrifugación Zeba Desalt (Pierce Biotechnology). La concentración de proteína biotinilada se puede medir con base en la absorbancia a 280 nm utilizando, por ejemplo, un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific).

En otro caso, la etiqueta fluorescente se puede unir a la HCP a través de cualquier reacción que fije el fluoróforo a la HCP. Por ejemplo, se puede utilizar un derivado químicamente reactivo de un fluoróforo para reaccionar con la HCP. Los ejemplos incluyen derivados de isotiocianato, ésteres de succinimidilo, fluoróforos activados por maleimida, etc.

3. Técnicas de combinación

Se puede utilizar cualquier técnica conocida en la técnica para seleccionar aptámeros de una biblioteca. En algunos casos, al menos una de las técnicas descritas en la presente se puede utilizar para seleccionar aptámeros de una biblioteca. En un caso, se pueden combinar múltiples rondas de una técnica individual y/o se pueden combinar múltiples técnicas en un proceso de múltiples pasos.

C. Determinación opcional de la identidad de una pluralidad de aptámeros que unen a las HCP

Una vez que se eligen los aptámeros candidatos que demuestran algún nivel de unión a las HCP en la mezcla de HCP o la preparación de proteínas recombinantes, se puede determinar la identidad de los aptámeros candidatos elegidos. En un caso, la identidad de los aptámeros se determina a través de un proceso de secuenciación paralelo, tal como un proceso de secuenciación de próxima generación.

1. Secuenciación de próxima generación

La secuenciación de próxima generación significa la determinación de secuencia usando métodos que determinan muchas (habitualmente miles a miles de millones) de secuencias de ácido nucleico de una manera intrínsecamente paralela, es decir, donde las plantillas de ADN se preparan para la secuenciación no una a la vez, sino en un proceso masivo, y donde muchas secuencias se leen preferentemente en paralelo, o alternativamente usando un proceso en serie de rendimiento ultra alto que en sí mismo se puede paralelizar. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, pirosecuenciación (por ejemplo, como la comercializada por 454 Life Sciences, Inc., Branford, CT); secuenciación por ligación (por ejemplo, como la comercializada en la tecnología SOLiDMR, Life Technology, Inc., Carlsbad, CA); secuenciación por síntesis usando nucleótidos modificados (como la comercializada en la tecnología TruSeqMR y HiSeqMR por Illumina, Inc., San Diego, CA, y PacBio RS por Pacific Biosciences of California, Inc., Menlo Park, CA), secuenciación por tecnologías de detección de iones (Ion Torrent, Inc., South San Francisco, CA); secuenciación de nanobolas de ADN (Complete Genomics, Inc., Mountain View, CA); tecnologías de secuenciación basadas en nanoporos (por ejemplo, como las desarrolladas por Oxford Nanopore Technologies, LTD, Oxford, Reino Unido), y métodos de secuenciación altamente paralelizados similares.

Estos métodos de secuenciación de próxima generación se pueden llevar a cabo, por ejemplo, utilizando un método de secuenciación de un paso o utilizando secuenciación de extremos emparejados. Los métodos de secuenciación de próxima generación incluyen, pero no se limitan a, métodos basados en hibridación, métodos de secuenciación por síntesis, métodos basados en ligación, secuenciación de nanoporos, así como otros métodos.

En un caso, la secuenciación se realiza en los aptámeros candidatos del proceso de selección. En otro caso, la secuenciación se realiza en múltiples grupos de aptámeros candidatos del proceso de selección.

En un caso, la PCR se puede utilizar para amplificar los aptámeros candidatos del proceso de selección antes de la secuenciación.

2. Pasos de discriminación adicionales opcionales utilizando información de secuencia

En un caso, un paso de discriminación adicional que utiliza información de un proceso de secuenciación identifica un grupo final de aptámeros. El grupo final de aptámeros se puede utilizar para la determinación de la afinidad de unión. Se pueden emplear técnicas para agrupar aptámeros o para enriquecer aptámeros que se pueden unir a HCP en menor concentración. De manera alternativa, se pueden emplear técnicas para diferenciar aptámeros que se unen con alta afinidad a su HCP diana de aptámeros con baja afinidad a su HCP diana por la comparación de grupos de aptámeros de diferentes rondas de examinación.

El análisis de motivos repetidos incluye evaluar las secuencias del grupo inicial de aptámeros candidatos para examinar la heterogeneidad de la población seleccionada y para identificar secuencias homólogas. Si al menos un motivo se muestra en su totalidad o en parte en múltiples aptámeros candidatos, puede significar que esos aptámeros se unen a la misma HCP o HCP relacionadas (tal como HCP con estructuras homólogas). Estos aptámeros se pueden agrupar y probar para determinar si se unen a la misma HCP o a una HCP relacionada. En un caso, el al menos un motivo mostrado en su totalidad o en parte en múltiples aptámeros candidatos se puede ubicar en la misma o similar posición (tal como dentro de 5, 10 o 15 nucleótidos) dentro del aptámero candidato. En otro caso, el al menos un motivo se puede ubicar en ubicaciones variables dentro del aptámero candidato.

En una instancia, el análisis del número de copias incluye un proceso en el que los aptámeros se pueden ordenar por rango con base en su número de copias y esta información se utiliza para evaluar los aptámeros. Por ejemplo, los aptámeros con un número de copias alto pueden unirse a HCP a una concentración más alta, y los aptámeros con un número de copias más bajo se pueden unir a HCP a una concentración más baja. Tener esta información ayuda al investigador a evaluar los aptámeros y seleccionar ya sea un grupo final de aptámeros o seleccionar aptámeros candidatos para la examinación adicional. En un caso, el análisis del número de copias se puede realizar en el grupo final de aptámeros. En otro caso, el análisis del número de copias se puede realizar en múltiples grupos de aptámeros candidatos durante la selección de un grupo final de aptámeros.

En un caso, el análisis de número de veces de enriquecimiento incluye determinar el número de copias de cada aptámero en cada uno de los múltiples grupos de aptámeros candidatos durante la selección de un grupo final de aptámeros y clasificar los aptámeros por la relación de los números de copias entre dos rondas de selección para cada aptámero. Es probable que aquellos aptámeros que se enriquecen durante la selección (es decir, aquellos que tienen un número de copias más alto para una ronda de selección posterior que para una ronda de selección anterior) sean aptámeros más significativos. Por ejemplo, puede haber aptámeros con un alto número de copias en múltiples grupos de selección, pero no demuestran ningún número de veces de enriquecimiento notable. En este caso, esos aptámeros podrían estar sobrerrepresentados como resultado de desviaciones durante la síntesis de la biblioteca o la PCR. Por ejemplo, si se obtuvieron tres grupos de selección, el número de copias para la ronda 3 se podría comparar al número de copias para la ronda 1 (ronda 3/ronda 1). Alternativamente, o en combinación, el número de copias de la ronda 3 se podría comparar al número de copias de la ronda 2 (ronda 3/ronda 2). Alternativamente, o en combinación con uno o ambos de los enfoques anteriores, el número de copias para la ronda 2 se podría comparar al número de copias para la ronda 1 (ronda 2/ronda 1). Conforme se obtiene una relación para cada aptámero, es probable que los aptámeros que demuestran un mayor número de veces de enriquecimiento sean más significativos.

D. Determinación opcional de la identidad de las HCP que se unen a los aptámeros

En un caso, se puede determinar la pluralidad de HCP que se unen a los aptámeros, tal como los aptámeros candidatos. La identidad de una HCP que se une a un aptámero (ya sea que la identidad del aptámero sea conocida o desconocida) se puede determinar utilizando cualquiera de los métodos descritos a continuación en la Sección II.G. La identidad de las HCP que se unen a los aptámeros candidatos se puede determinar como parte de la caracterización de un grupo final de aptámeros donde los aptámeros candidatos son el grupo final de aptámeros. La identidad de las HCP que se unen a los aptámeros candidatos se puede determinar como parte de un proceso de selección continuo donde se emplean pasos adicionales para seleccionar adicionalmente un grupo final diferente de aptámeros.

E. Determinación opcional de la afinidad de unión para los aptámeros candidatos a la preparación de HCP

Los enfoques se pueden utilizar opcionalmente para determinar la afinidad de unión para cada aptámero a una HCP en una mezcla de HCP o en una preparación de proteína recombinante. En cualquiera de los métodos para determinar la afinidad de unión, se pueden usar ya sea los aptámeros candidatos o aquellos aptámeros que se eligen después de una examinación adicional, tal como al menos uno de número de veces de enriquecimiento, motivo de repetición, y análisis de número de copias sin cambiar el nombre de los aptámeros como aptámeros candidatos. En un caso, la información de secuencia de los aptámeros candidatos se puede emplear en este proceso opcional.

En un aspecto, determinar la afinidad de unión de la pluralidad de aptámeros candidatos para HCP en una mezcla de HCP o una preparación de proteína recombinante comprende fijar los aptámeros candidatos a un soporte sólido, poner en contacto los aptámeros fijados con el soporte sólido con una mezcla de HCP o una preparación de proteína recombinante, y determinar la unión de HCP a aptámeros candidatos. En otro caso, el método comprende fijar la mezcla de HCP o la preparación de proteína recombinante a un soporte sólido, poner en contacto la mezcla de HCP o la preparación de proteína recombinante con aptámeros candidatos, y determinar la unión de los aptámeros candidatos a las HCP.

En un caso, se puede preparar un arreglo para determinar la afinidad de unión para aptámeros candidatos a HCP en la mezcla de HCP o preparación de proteína recombinante. En un caso, el método comprende determinar en paralelo la afinidad de unión para los aptámeros candidatos a las HCP en la mezcla de HCP o preparación de proteína recombinante usando el arreglo.

En un caso, la afinidad de unión por los aptámeros candidatos se determina al medir laKdo K<a>de los aptámeros candidatos para su HCP diana. En otro caso, los aptámeros se unen específicamente a la HCP con una K<d>de al menos 2 |<j>M. En un caso adicional, el método genera una pluralidad de aptámeros que se unen específicamente a su HCP diana. En un caso, el método genera al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 2o, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 40o, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 600, al menos aproximadamente 700, al menos aproximadamente 800, al menos aproximadamente 900, al menos aproximadamente 1000 o al menos aproximadamente 6 * 1014 aptámeros que se unen específicamente a las HCP.

1. Arreglo de chip de aptámero

Un chip de aptámero se puede preparar con al menos un arreglo con una pluralidad de características. En un caso, el arreglo se puede preparar al imprimir sustratos de oligonucleótidos de hebra individual modificados químicamente sobre la superficie reactiva de un chip de arreglo. En un caso, el chip de aptámero se puede obtener comercialmente de Agilent Technologies (Santa Clara, CA), MYcroarray, u otro proveedor. En un caso, el chip de aptámero puede contener más de un arreglo. En un caso, cada arreglo incorpora los aptámeros para los que se desean los datos de afinidad de unión. El arreglo puede incorporar opcionalmente polinucleótidos de control con secuencias aleatorias. En otro caso, cada aptámero se puede representar por dos, tres o más de tres copias para permitir la medición por duplicado, triplicado, etc.

Los aptámeros candidatos se pueden aplicar al arreglo con las regiones de unión al cebador directo e/o inverso de la biblioteca de aptámeros potenciales o sin las regiones de unión al cebador directo e/o inverso de la biblioteca de aptámeros potenciales. En un caso, las regiones de unión al cebador se pueden escindir debido a que el arreglo no puede o no acomoda de manera óptima los polinucleótidos que tienen la longitud de la porción aleatorizada del aptámero candidato más la porción de cebador. En otro caso, las regiones de unión a cebador se pueden escindir a fin de confirmar que los aptámeros retienen su función sin estas regiones.

Los ligadores se pueden utilizar para unir los aptámeros candidatos a la superficie de arreglo. En un caso, un ligador puede ser de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 nucleótidos, o de aproximadamente 30 a aproximadamente 45 nucleótidos. En un caso, el ligador puede ser de aproximadamente 40 nucleótidos. En un caso, se puede utilizar un ligador de poli-T para unir los aptámeros candidatos a la superficie de arreglo, tal como un ligador de poli-T de aproximadamente 40 nucleótidos. En otro caso, se puede utilizar un ligador poli-A para unir los aptámeros candidatos a la superficie de arreglo, tal como un ligador de poli-A de aproximadamente 40 nucleótidos. En otro caso, el ligador puede comprender un cebador inverso. En un caso, el ligador puede comprender tanto un cebador directo como un cebador inverso. Los ligadores para la unión a la superficie sólida pueden ser iguales o diferentes a los cebadores de PCR utilizados anteriormente. Por ejemplo, una estrategia de cebador inverso podría comprender Xw -CCTATGCGTGCTACCGTGAA (expuesto en la SEQ ID NO: 3), y una estrategia de cebador directo e inverso podría comprender AGGTCAGATG-Xw -CCTATGCGTG (expuesto en SEQ ID NO: 4), en donde X representa cualquier nucleótido e i es un número entero para representar el número de nucleótidos en el aptámero candidato. En los ejemplos a continuación, los aptámeros candidatos contienen 50 nucleótidos.

Una vez que se ha preparado el arreglo, se incuba con HCP marcadas de manera fluorescente. En un caso, el arreglo se divide en múltiples arreglos idénticos, que entonces se pueden incubar con la misma concentración de HCP marcada de manera fluorescente o diferentes concentraciones de HCP marcada de manera fluorescente. Si se utilizan diferentes concentraciones, esto permite que la señal fluorescente de cada característica de aptámero individual a cada concentración de HCP diferente construya una isoterma de unión, lo que permite la derivación de los valores de K<d>para cada secuencia simultáneamente.

Por ejemplo, el arreglo se puede incubar con aproximadamente 10, aproximadamente 25, aproximadamente 50, aproximadamente 75, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200 o aproximadamente 500 nM de HCP marcada o con aproximadamente 1 |<j>M de HCP marcada. En un caso, se puede usar HCP marcado con Alexa Fluor<MR>647. Después de lavar y secar, se puede usar un escáner de arreglo para medir la intensidad de fluorescencia de cada característica. Si cada secuencia se aplica al arreglo por triplicado, las señales se pueden promediar en el proceso de cálculo de los valores de K<d>.

En un caso, se puede suponer una isoterma de unión Langmuiriana y se puede utilizar la siguiente ecuación: Y=B<max>x X/(K<d>) X), donde Y es la intensidad de fluorescencia neta en cada concentración, X es la concentración de HCP marcada con fluorescencia y B<max>es la intensidad de fluorescencia neta en la saturación. En un caso, se descarta cualquier secuencia de aptámeros con un B<max>que sea menor que el doble del fondo.

En un modo, la matriz determina la afinidad de unión específica para al menos 50 aptámeros candidatos a sus HCP diana. En otro modo, el arreglo determina la afinidad de unión para al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 150, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 250, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 1000, al menos aproximadamente 2000, al menos aproximadamente 5000, al menos aproximadamente 10,000, al menos aproximadamente 20,000, al menos aproximadamente 50,000 o al menos aproximadamente 100,000 aptámeros candidatos a sus HCP diana.

2. Ensayo de unión de fluorescencia basado en cuentas

La afinidad de unión por aptámeros candidatos a HCP específicas en una mezcla de HCP o una preparación de proteína recombinante también se puede evaluar utilizando un ensayo de unión de fluorescencia basado en cuentas. En un modo, se pueden incubar diferentes aptámeros en forma de partículas de aptámero, cada una de las cuales muestra un aptámero con una secuencia única, con una mezcla de HCP o una preparación de proteína recombinante. Opcionalmente, se puede utilizar una partícula de presentación de cebador directo no de unión como control negativo en cada medición. Esto puede proporcionar las afinidades de unión relativas de los aptámeros candidatos seleccionados.

El K<d>de cada aptámero candidato también se puede determinar usando un ensayo de unión de fluorescencia basado en cuentas. En un caso, las reacciones pueden tener lugar en agente amortiguador de PBSMCT (HyClone DPBS, número de catálogo SH30264.01) complementado con Tween-20 al 0.01% y MgCb a 1 mM o 1.5 mM. Se puede adicionar el volumen de agente amortiguador apropiado a cada tubo de 1.5 mL tal que el volumen de reacción final sea de 100 j L. Se puede adicionar HCP biotinilada (bHCP) a cada tubo en concentraciones que varían de 0.5 nM a 500 nM en la presencia de 0.2 mg/mL (concentración final) de ADN de esperma de salmón (Invitrogen). También se puede utilizar un control negativo sin bHCP con cada aptámero.

Los aptámeros de ADNmc (Integrated DNA Technologies) se pueden modificar con amino en el extremo de 5' y conjugar a cuentas de COOH de 1 jm (Invitrogen). Antes de comenzar el experimento, las cuentas se pueden diluir 1:500 en agente amortiguador de PBSMCT. Se puede adicionar un microlitro de la dilución 1:500 a cada tubo que contiene agente amortiguador y bHCP. Cada tubo se puede someter a vórtice durante 3 segundos y entonces colocarse en un rotador durante 1 hora a temperatura ambiente.

Después de la incubación de una hora, los tubos se pueden centrifugar brevemente, se puede usar una rejilla magnética para separar las cuentas del sobrenadante y se pueden adicionar 100<j>L de una dilución de 1:1000 de la solución madre de una solución de estreptavidina ficoeritrina de calidad superior (SA-PE, Life Technologies) a cada tubo. Después de someter a vórtice durante 3 segundos, los tubos se pueden incubar en un rotador a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Después de la incubación de 15 minutos con SA-PE, los tubos se pueden centrifugar brevemente y colocar en una rejilla magnética durante 1 minuto. El sobrenadante se puede remover y las cuentas se pueden volver a suspender en 100 |jL de agente amortiguador de PBSMCT. Los tubos que contienen las soluciones de 100 j L se pueden colocar en hielo en tanto que se transportan para realizar mediciones con un citómetro de flujo Accuri C6 (Becton Dickinson).

La mediana de valores de fluorescencia FL-2 restada de fondo se pueden graficar en función de la concentración de HCP biotinilada. Los datos se pueden ajustar con una ecuación de regresión no lineal utilizando un modelo de unión específico de un sitio de GraphPad. Por lo tanto, se puede determinar una constante de unión de disociación de equilibrio (K<d>) para cada aptámero.

F. Abordar opcionalmente los grandes excesos de proteína recombinante

El arreglo de aptámeros también se puede utilizar para examinar aptámeros que se unen a HCP específicamente, incluso en la presencia de grandes cantidades en exceso de proteínas recombinantes (tal como un anticuerpo recombinante, por ejemplo, IgG). Al marcar con fluoróforo las HCP con un color y la proteína recombinante con otro, será posible identificar secuencias que posean afinidad por la diana de HCP y no por la IgG recombinante, con base en el nivel y la longitud de onda de fluorescencia emitida desde una característica determinada.

Una vez que se han identificado las secuencias de aptámeros en el arreglo, estas secuencias individuales se pueden sintetizar y analizar utilizando ensayos basados en cuentas o placas para confirmar que se unen a las HCP. Este paso opcional aborda además la especificidad de los presentes métodos.

Esta técnica opcional se puede usar sola o en combinación con el proceso de selección negativa descrito anteriormente, donde los aptámeros potenciales que se unen a la proteína recombinante se remueven de la biblioteca de aptámeros antes de la selección de los aptámeros candidatos.

G. Determinación de la presencia y/o identidad de la HCP al que se unen uno o más aptámeros

Los métodos también pueden incluir determinar la identidad de la HCP al que se unen uno o más aptámeros.

Se puede utilizar una variedad de técnicas para identificar la HCP específica a la que se une un aptámero (ya sea que la secuencia del aptámero sea conocida o desconocida). Estas técnicas pueden incluir espectrometría de masas de proteínas, ionización por electropulverización (ESI), desorción/ionización de láser asistida por matriz (MALDI). Alternativamente, las proteínas se pueden digerir enzimáticamente en péptidos más pequeños por el uso de una proteasa (tal como tripsina), introducirse en el espectrómetro de masas, e identificarse por huella dactilar de masas de péptidos o espectrometría de masas en tándem.

Otras técnicas útiles en la identificación de la HCP específica a la que se une un aptámero incluyen transferencia Western, inmunoensayo, enfoque isoeléctrico, electroforesis capilar, electroforesis basada en microchip, espectroscopía Raman, RMN de protones, y determinación de una estructura cristalina a través de cristalografía de rayos X, entre otras.

MI. Métodos de detección de HCP utilizando aptámeros

En un caso, un método para determinar la presencia de una pluralidad de HCP en una preparación de proteína recombinante comprende proporcionar una preparación de proteína recombinante, proporcionar un grupo final de aptámeros, combinar la preparación de proteína recombinante con el grupo final de aptámeros; y determinar la presencia de una pluralidad de HCP. En un caso, determinar la presencia de una pluralidad de HCP comprende microarreglo, cromatografía, reacción en cadena de polimerasa, o ensayo inmunoabsorbente vinculado a enzimas. En un caso, el grupo final de aptámeros se elige por la capacidad de cada aptámero para unirse a una HCP. En otro caso, el grupo final de aptámeros se elige por la capacidad de cada aptámero para unirse a su HCP diana utilizando los métodos descritos en la sección I anterior.

En un caso, un método para determinar la identidad de al menos una HCP en una preparación de proteína recombinante comprende proporcionar al menos un aptámero preparado por cualquiera de los métodos analizados en la sección I anterior; y determinar la identidad de al menos una HCP como se analiza en la sección II.G. En un caso, el método emplea una pluralidad de aptámeros. En un caso, el método determina la presencia y/o la identidad de una pluralidad de HCP.

En un caso, la concentración de HCP en una mezcla de HCP o una preparación de proteína recombinante se puede determinar usando los métodos descritos en la presente.

A. Plataformas de ensayo

Los aptámeros se pueden usar en una variedad de plataformas de ensayo para detectar HCP, que incluyen, pero no se limitan a, detección basada en arreglo (tal como un microarreglo que permitiría la detección de una gran cantidad de HCP al mismo tiempo), ELISA y métodos de tipo ELISA (tal como ALPHAlisa), resonancia de plasmón superficial, métodos de inmunoafinidad que incluyen, pero no se limitan a, inmunoprecipitación, transferencia, cromatografía de afinidad, plataformas microfluídicas (tal como Gyros) y tecnologías analíticas de procesos.

B. Eficacia

Se espera que los métodos de detección de HCP que utilizan aptámeros detecten a la HCP más exactamente. En un caso, los métodos de detección de HCP son capaces de identificar al menos aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, aproximadamente 99.5%, o aproximadamente 99.9% de la HCP en una preparación de proteína recombinante. En otro caso, los métodos de detección pueden identificar aproximadamente el 100% de la HCP en la preparación de proteína recombinante.

En un caso, se puede preparar un conjunto de aptámeros y unirse a soportes sólidos para preparar un grupo de partículas de aptámero. Se permite que una mezcla de HCP se ponga en contacto con el grupo de partículas de aptámero. Se pueden recolectar las HCP que no están unidos al grupo de partículas de aptámero, denominados fracción de HCP no unida. Las HCP que se unen al grupo de partículas de aptámero, denominados fracción de HCP unida, se pueden recolectar después de la interrupción de la interfaz de grupo de partículas de HCP/aptámero. La fracción de HCP no unida se puede comparar a la fracción de HCP unida usando técnicas tal como una electroforesis en gel bidimensional, transferencia Western, y/o espectrometría de masas.

IV. Métodos de remoción de HCP

Una vez que se ha identificado una HCP en la preparación de proteína recombinante, se puede utilizar una variedad de modos para remover la HCP de la preparación. En un caso, el método para remover la HCP de una preparación de proteína recombinante comprende proporcionar una pluralidad de aptámeros; exponer la preparación de proteína recombinante a la pluralidad de aptámeros; permitir que los aptámeros se unan a las HCP; y separar los aptámeros unidos a las HCP de la preparación de proteína recombinante. En un caso, la pluralidad de aptámeros utilizados en el método se fija a un soporte sólido. En un caso, el soporte sólido es una placa, resina de cromatografía, o una cuenta (que incluye una cuenta magnética).

En un caso, al menos un aptámero, tal como uno producido de acuerdo con los métodos descritos en la presente, se puede utilizar para remover HCP del producto de proteína recombinante. El aptámero se puede fijar a un soporte sólido, tal como una resina o cuenta porosa (que incluye cuenta magnética), el producto de proteína recombinante se aplica y se deja incubar, y el producto de proteína recombinante se separa del complejo de soporte sólido-aptámero-HCP. Por ejemplo, en un caso, se puede usar al menos una columna de afinidad con al menos un aptámero para remover HCP.

En un caso, cada aptámero individual de una pluralidad de aptámeros se fija a una superficie sólida tal que cada superficie sólida tenga una preparación homogénea de aptámeros fijados a ella. En otro caso, la pluralidad de aptámeros se aplica como una mezcla a una superficie sólida tal que cada superficie sólida tenga una mezcla heterogénea de aptámeros fijados a ella.

Los casos alternativos también pueden proceder sin usar los aptámeros, tal como, por ejemplo, usando técnicas de supresión génica o ARNip para eliminar o reducir la expresión de la HCP que se desea eliminar o reducir de la preparación de proteína recombinante una vez que se ha identificado específicamente como se describe en la sección II.G anterior. Una unión de HCP a un aptámero se puede aislar usando métodos conocidos en la técnica, y se pueden crear aptámeros o anticuerpos adicionales para unirse al mismo para un proceso de remoción potencialmente de mayor afinidad, si se desea. Cualquiera de estos aptámeros o anticuerpos se pueden utilizar en los métodos de remoción como se describen anteriormente.

Ahora se hará referencia en detalle a los presentes ejemplos, cuyos ejemplos se ilustran en las figuras anexas.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Descripción general del enfoque

Se utilizó un flujo de trabajo de generación de aptámeros paralelo, que comprende seleccionar una pluralidad de aptámeros candidatos de una biblioteca de aptámeros potenciales por su capacidad para unirse a un HCP individual en una mezcla de HCP; secuenciar los aptámeros candidatos en paralelo; y determinar en paralelo la afinidad de unión relativa de los aptámeros candidatos a su HCP diana en la mezcla de HCP para seleccionar los aptámeros candidatos. La identidad de la HCP a la que se une un aptámero se puede identificar por la unión de aptámeros individuales en cuentas para preparar partículas de aptámero e incubar las partículas de aptámero en la presencia de una mezcla de HCP durante una cantidad de tiempo adecuada. Después de lavar las partículas de aptámero que no se unieron a HCP, las partículas de aptámero unidas se eluyen y la HCP se identifica por espectrometría de masas.

Los microfluidos se puede utilizar como un método de selección de aptámeros para aislar rápidamente aptámeros que tienen alta afinidad contra dianas de HCP que se unen a cuentas magnéticas. Las cuentas recubiertas con el diana se incuban con una biblioteca de ADNmc que consta de secuencias aleatorizadas que comprenden el grupo potencial de aptámeros. Algunos de los aptámeros se unirán específicamente a las HCP, y se utiliza un dispositivo microfluídico para capturar las cuentas magnéticas y lavar eficientemente cualquier aptámero no unido a las HCP. Las cuentas magnéticas que llevan los aptámeros unidos a HCP se eluyen del dispositivo microfluídico. El resultado final es un grupo de aptámeros candidatos.

La selección de visualización de partículas es un poderoso método de selección de aptámeros que aprovecha la visualización de partículas (PD), la PCR en emulsión, y la clasificación de partículas basada en fluorescencia para aislar aptámeros con alta afinidad por HCP específicas de la biblioteca de aptámeros potenciales. Una ventaja de la selección de visualización de partículas radica en el poder de PD: cada cuenta (partícula) se recubre con múltiples copias de un aptámero de una secuencia específica, lo que simplifica la identificación de aptámeros (por ejemplo, mediante la secuenciación de ADN).

Ejemplo 2. Selección de una pluralidad de aptámeros candidatos

Se aisló un grupo de aptámeros candidatos que se unieron específicamente a HCP por el uso de microfluidos para enriquecer una biblioteca de aptámeros potencial para aptámeros que se unen a HCP. Se realizó una ronda individual de enriquecimiento de aptámeros antes de iniciar la examinación de visualización de partículas a fin de disminuir la diversidad del grupo inicial de partículas de aptámeros a una cantidad de partículas de aptámeros que se podrían clasificar por FACS. Para realizar este enriquecimiento, primero se conjugó covalentemente una mezcla de HCP a cuentas activadas con N-hidroxisuccinimida (NHS) (Pierce Biotechnologies, Rockford, IL). La conjugación exitosa de las HCP a las cuentas se verificó utilizando un kit de cuantificación de proteínas NanoOrangeMR (Molecular ProbesMR, Eugene, OR). Los aptámeros potenciales se desnaturalizaron, se mezclaron con las cuentas recubiertas con HCP y, después lavar los aptámeros no unidos, los aptámeros unidos se eluyeron de las HCP al calentar las cuentas recubiertas con HCP en 50 |jL de agua durante 5 minutos a 95 °C. Este grupo de aptámeros anti-HCP de microfluidos se utilizó como punto inicial para la visualización de partículas.

A) HCP de CHO

Se cultivó una línea de células hospedadoras CHO nulas utilizando condiciones de biorreactor estándar en la escala de 50 L y se recolectó por centrifugación continua. La recolección resultante se diafiltró en PBS, se alicuotó y se almacenó a -80 °C hasta que se necesitó. Se preparó una mezcla de HCP a partir de esta recolección de células.

B) cuentas recubiertas con HCP que se van a utilizar en la examinación microfluídica

Las cuentas acopladas a HCP se prepararon de acuerdo con las instrucciones para las cuentas magnéticas activadas por Pierce NHS (Thermo Scientific cat # 88826; Thermo Scientific, Rockford, IL) con varias modificaciones. En resumen, se utilizó un exceso de tres veces de HCP sobre la capacidad de unión a cuentas para obtener una concentración final de 150 jg de HCP/mg de cuenta. Las cuentas se lavaron una vez con HCl 1 mM enfriado con hielo, se combinaron con HCP en PBS, y se incubaron a 4 °C durante cuatro horas con rotación de extremo a extremo. Las cuentas se lavaron dos veces con glicina 0.1 M, se incubaron con etanolamina 3 M durante dos horas a temperatura ambiente y se lavaron una vez con H2O nanopuro. Después de tres lavados en agente amortiguador de almacenamiento (Tris 10 mM con Tween-20 al 0.01%), las cuentas se reconstituyeron en amortiguador de almacenamiento a la concentración original de 10 mg/mL y se almacenaron a 4 °C.

C) Ronda individual de enriquecimiento de aptámeros

Una ronda individual de enriquecimiento de aptámeros procedió como sigue. Se calentó un nmol (6 * 1014) de una biblioteca de ADNmc a 95 °C durante 5 minutos, se enfrió a 4 °C durante 5 minutos, y entonces se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Esta biblioteca de ADNmc se incubó con una concentración final de 3 jM de la proteína HCP unida a las cuentas magnéticas durante dos horas para permitir que los aptámeros se unieran a sus dianas de proteínas. Después de dos horas, las cuentas se lavaron 3 veces en agente amortiguador de PBSMCT (solución salina amortiguada con fosfato 1x, MgCh 1.5 mM y CaCh 1 mM, Tween 20 al 0.01%) (Hyclone; Logan, UT). El ADNmc (aptámeros) se eluyó de la diana proteica al calentar las cuentas en 50 jL de agua durante 5 minutos a 95 °C. Los aptámeros obtenidos aquí se amplificaron por PCR en preparación de la siguiente ronda.

Ejemplo 3. Selección de una pluralidad de aptámeros candidatos

Se utilizó visualización de partículas para seleccionar aptámeros específicos que se unieron a HCP específicas. El grupo de aptámeros candidatos anti-HCP de microfluidos se mezcló con cuentas tal que, estadísticamente, sólo un aptámero de una secuencia individual se unió por cuenta. El diana es tener sólo el 20% de las cuentas recubiertas con aptámeros. Conforme el porcentaje de cuentas recubiertas comienza a ser más alto que esto, las cuentas comienzan a tener más de una secuencia en cada gota. Se utilizó PCR en emulsión para expandir el número de aptámeros por cuenta. En total, había ~ 107 cuentas recubiertas con aptámero, con cada cuenta recubierta homogéneamente con múltiples aptámeros de una secuencia individual. Estas cuentas recubiertas con aptámero se incubaron con HCP marcadas con Alexa-64720 nM en la presencia de ADN de esperma de salmón, que se añade para reducir la unión no específica, y entonces se clasificaron por FACS. Las cuentas con una gran cantidad de señal de Alexa-647 unida se recolectaron y entonces se sometieron a secuenciación de ADN de alto rendimiento.

Específicamente, después de la elución de los aptámeros de ADNmc de las cuentas, el ADN se amplificó y purificó (Qiagen) que proporciona ADNmc libre de cebadores. Este ADNbc se usó entonces para realizar PCR en emulsión con cuentas recubiertas con cebador directo de 1 |jm de diámetro a fin de producir partículas candidatas de aptámero monoclonales. Se realizaron ensayos de unión basados en citometría de flujo con diversas concentraciones de HCP biotinilada (bHCP) con las partículas de aptámero monoclonal a fin de determinar las condiciones apropiadas para la clasificación. Una vez que se determinaron las condiciones adecuadas, las partículas que contenían aptámero se clasificaron utilizando un instrumento de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).

A) Partículas recubiertas de aptámero utilizadas en la visualización de partículas

Las partículas de aptámero se generaron mediante PCR en emulsión [Dressman et al., Transforming Single DNA Molecules Into Fluorescent Magnetic Particles for Detection and Enumeration of Genetic Variations, Proc NatAcad Sci 100(15) 8817-8822 (2003)]. La extensión de ADN se realizó en cuentas de cebador directo que se habían sintetizado de acuerdo con el protocolo para recubrir partículas magnéticas de ácido carboxílico DynabeadsMR MyOneMR (InvitrogenMR Life Technologies cat #65011) con ADNmc modificado con amina. En resumen, se lavaron 500 jL de partículas magnéticas de ácido carboxílico MyOneMR de 1 jm (107/jL ; Life Technologies) una vez con 500 jL de NaOH 0.001 N y tres veces con 1 mL de agua libre de nucleasa, seguido por resuspensión en 150 jL de mezcla de reacción que contenía NaCl 200 mM, FP modificado con 5'-amino (5' -amino-PEG18-AGC AGC ACA GAG GTC AGA TG-3') 0.2 mM, cloruro de imidazol 1 mM, dimetilsulfóxido (DMSO) al 50% v/v y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (<e>D<c>) 250 mM (Pierce Biotechnology). La modificación de grupo amino permite el acoplamiento covalente, manteniendo los FP unidos a las partículas durante el ciclo térmico, con PEG18 y el extremo de 5' que sirve como un espaciador. Las partículas se mezclaron bien con reactivos, se sometieron a vórtice, se sometieron a tratamiento con ultrasonido, y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente en un rotador. Después de acoplar el cebador directo (FP), las superficies de las cuentas se pasivaron con moléculas de PEG12 para impedir la unión no específica de las HCP diana. Los grupos carboxilo restantes en las partículas se convirtieron en NHS-ésteres reactivos con amino en la presencia de EDC 250 mM y N-hidroxisuccinimida (NHS) 100 mM en agente amortiguador de ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (mes) (100 mM, pH 4.7; Pierce Biotechnology) durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido por conjugación con amino-PEG12 20 mM (Pierce Biotechnology) en agente amortiguador de MES durante una hora. Las partículas se lavaron cuatro veces con 500 jL de agente amortiguador de TE (Tris 10 mM, pH 8.0, EDTA 0.1 mM), se suspendieron en 500 jL de agente amortiguador de TE y se almacenaron a 4 °C.

La PCR en emulsión se preparó con una fase acuosa de 1 * GoTaqMR PCR Master Mix (Promega, Madison, WI), MgCh 25 mM, 3.5 mM de cada dNTP (Promega), FP 40 nM, cebador inverso (RP) 3 jM , 0,25 U /jL de GoTaqMR Hot Start Polymerase (Promega), ADN molde 1 pM y 3*108 partículas recubiertas con FP en un volumen total de 1 mL; y una fase oleosa (preparada fresca cada día) de Span 80 al 4.5%, Tween 80 al 0.40% y Triton X-100 al 0.05% en aceite mineral, todos adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Las emulsiones de agua en aceite se prepararon al adicionar 1 mL de la fase acuosa a 7 mL de fase oleosa en un tubo DT-20 (IKA) bloqueado en el dispositivo Ultra-TurraxMR (IKA; Wilmington, DE). Esta adición se realizó gota a gota durante 30 segundos en tanto que la mezcla se agitaba a 900 rpm en el Ultra-TurraxMR Después de adicionar la fase acuosa, el contenido se mezcló durante 5 minutos. Las emulsiones se distribuyeron en alícuotas de 100 jL en ~80 pocillos de una placa de PCR de 96 pocillos. Después de 40 ciclos de PCR, las emulsiones se recolectaron en una bandeja de recolección de emulsiones (Life Technologies) por centrifugación a 30 * g durante 2 minutos. Las emulsiones se rompieron al adicionar 10 mL de 2-butanol a la bandeja y al transferir la muestra recolectada a un tubo de 50 mL. Después de someterse a vórtice durante 30 segundos, las partículas se granularon por centrifugación a 3,500 * g durante 5 minutos. Después de retirar cuidadosamente la fase oleosa, las partículas se resuspendieron en 600 jL de agente amortiguador de ruptura de emulsión (EB) (NaCl 100 mM, Triton X-100 al 1%, Tris-HCl 10 mM, pH 7.5 y EDTA 1 mM) y entonces se transfirieron a un nuevo tubo de 1.5 mL. Después de someterse en vórtice durante 30 segundos y de la centrifugación durante 90 segundos a 15,000 * g, se removió el sobrenadante. Las partículas se lavaron tres veces con agente amortiguador de TE pH 8.0 usando separación magnética y entonces se volvieron a suspender en 300 jL de TE.

B) Controles negativos

Se utilizaron dos muestras de control negativo para ayudar a establecer compuertas para la clasificación basada en FACS. Las partículas recubiertas con aptámero se incubaron sin bHCP, se lavaron y entonces se incubaron con un conjugado de estreptavidina-Alexa FluorMR647 (SA-647) a una dilución de 1:500 a partir de una concentración madre de 37 jM para determinar si los aptámeros tenían afinidad por el marcador fluorescente utilizado en el experimento. Se realizó un segundo experimento de control negativo con cuentas recubiertas con cebador directo y bHCP a la concentración diana utilizada para la clasificación. Después de la incubación y el lavado, las cuentas se incubaron nuevamente con SA-647. Este control se utilizó para determinar el grado en que los cebadores directos se unían a la bHCP diana.

Después de establecer las compuertas con base en los experimentos de control negativo, el grupo de aptámeros anti-HCP de microfluidos en cuentas se incubó con bHCP a una concentración de 20 nM durante 1.5 horas. Las cuentas se lavaron una vez con agente amortiguador de PBSMCT. Después de este paso de lavado, las cuentas se incubaron con SA-647 durante 15 minutos. Después de la incubación SA-647, las cuentas se lavaron nuevamente, y se volvieron a colocar en agente amortiguador de PBSMCT. Usando un instrumento BD FACS Aria II (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), las partículas con niveles de fluorescencia significativamente más altos que los niveles de fondo se clasificaron en un tubo de recolección. Las partículas se clasificaron a una velocidad de aproximadamente 2000 eventos/segundo durante un total de tres horas. Después de la clasificación, las partículas se amplificaron directamente con una reacción de PCR piloto para determinar un número de ciclo óptimo para la amplificación de todas las partículas que se recolectaron. Los productos de ADNbc resultantes de esta amplificación a escala completa se purificaron utilizando un kit Qiagen MinElute (Germantown, MD).

La figura 1 proporciona una gráfica de FACS para la generación inicial de UniQ-PASS de un grupo de aptámeros anti-HCP, que muestra el área de dispersión lateral versus la intensidad de fluorescencia de área Alexa FluorMR 647 para partículas de 1 |jm utilizadas en el experimento. Los datos muestran los resultados de partículas recubiertas con aptámero incubadas con HCP biotinilada 20 nM, seguido por marcado con Alexa FluorMR 647. Las partículas en la compuerta de FACS P6 se recolectaron y representaron aproximadamente el 1.1% de toda la población evaluada. Por el contrario, los experimentos de control negativo que no usaron HCP y usaron cuentas recubiertas con cebador directo más bHCP 20 nM mostraron 0.0% y 0.2% de todos los eventos, respectivamente, en la compuerta P6 de alta fluorescencia.

Ejemplo 4. Secuenciación de la pluralidad de aptámeros candidatos en paralelo

Los aptámeros candidatos se indexaron con el kit de preparación de muestra TruSeq ChIP de Illumina (IP-202-1012; Illumina, San Diego, CA). Las muestras se cuantificaron con el fluorómetro Life Technologies QubitMR (Q32857) y se secuenciaron en HiSeq 2500 de Illumina con trece muestras de TruSeq indexadas por carril. Se adicionaron ocho muestras preparadas de TruSeq RNA-Seq al mismo grupo que las 5 muestras de aptámeros de ADN únicamente para incrementar la diversidad total en la corrida. Estas muestras agrupadas se ejecutaron en ambos carriles de una ejecución rápida de lectura individual de 90 pb.

Se realizó una secuenciación de alto rendimiento, generando aproximadamente 7 millones de lecturas para cada grupo. De los 7 millones de lecturas, aproximadamente 1 millón de las lecturas eran secuencias únicas, y el 10% de todas las secuencias únicas estaban presentes en 10 copias o más.

Ejemplo 5. Preparación del microarreglo y determinación de la afinidad de unión de los aptámeros candidatos a la preparación de HCP

Las secuencias obtenidas de la clonación y la secuenciación de Sanger se colocaron en un microarreglo utilizando síntesisin situ.Se sintetizaron aproximadamente 15,000 secuencias (incluyendo las secuencias de control) en un portaobjetos individual en ubicaciones conocidas. Se llevó a cabo un ensayo de unión con HCP marcadas con fluoróforo (bHCP) en el portaobjetos. El portaobjetos se bloqueó con albúmina de suero bovino acetilada al 0.5% (BSA) en agente amortiguador de PBSMCT durante 3.5 horas y entonces se lavó. El portaobjetos se incubó con agente amortiguador de PBSMCT que contenía bHCP 50 nM y 0.1 jg / jL de ADN de esperma de salmón durante 3 horas a temperatura ambiente, y se lavó de nuevo. Entonces, el portaobjetos se marcó con un conjugado de fluoróforo de estreptavidina-Alexa FluorMR 647 a una concentración de 15 nM durante 15 minutos. Después del lavado del portaobjetos con agente amortiguador de PBSMCT, todo el portaobjetos se escaneó con un escáner de microarreglo GenePixMR 4400B (Molecular Devices; Sunnyvale, CA). Las características con alta intensidad de fluorescencia indicaron la unión de la HCP (proteína diana) a un aptámero. Cada secuencia de aptámeros se representó cinco veces en el arreglo (cada aptámero se representó con cinco características) para garantizar que los eventos de unión fueran significativos.

Para determinar la unión específica de las HCP a aptámeros individuales, se secuenciaron 68 aptámeros anti-HCP que se generaron a partir de cinco rondas de presentación de partículas y se colocaron en el arreglo. La secuencia de nucleótidos de estos 68 aptámeros se expone en SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO: 73 de la Tabla 1, a continuación. Los aptámeros de 50 nucleótidos se sintetizaronin situ,cinco veces cada uno, en un portaobjetos de microarreglo. En una sección diferente del mismo portaobjetos, se sintetizaronin situ5000 oligonucleótidos de ADNmc de 50 nucleótidos aleatorios en el portaobjetos. El portaobjetos se incubó con bHCP 50 nM en agente amortiguador con 0.1 jg / jL de ADN de esperma de salmón durante tres horas. Después de marcar con un conjugado de estreptavidina-fluoróforo Alexa FluorMR 647 a una concentración de 15 nM durante 15 minutos, el portaobjetos se lavó tres veces con PBS y el portaobjetos se formó en imagen. Como se ve en la figura 2, la unión a proteínas fue evidente en los puntos que contenían aptámeros candidatos (figura 2A, dentro de los límites blancos), pero la unión no fue evidente en los puntos compuestos por ADNmc aleatorio (figura 2B).

Se cuantificó la intensidad de fluorescencia de todos los puntos en el portaobjetos. La intensidad de fluorescencia de los aptámeros individuales se promedió, la fluorescencia de fondo se restó, y las intensidades de fluorescencia resultantes se graficaron como una gráfica de barras y se muestran en la figura 3. Esta figura muestra que varios de los aptámeros generaron una señal de alta intensidad de fluorescencia, lo que refleja su capacidad para unirse a HCP.

Ejemplo 6. Identificación de las HCP que se unen a aptámeros individuales usando precipitación por afinidad

Las HCP específicas unidas por aptámeros que muestran intensidad de fluorescencia positiva en la figura 3 se determinaron utilizando precipitación por afinidad. Las precipitaciones de afinidad de aptámero se realizaron para 43 aptámeros que tienen diferentes secuencias como se lista en la tabla 1, a continuación. Los aptámeros individuales de 50 nucleótidos (50-meros) y una biblioteca de oligonucleótidos aleatorios de 50-meros se sintetizaron por Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) con una biotina de 3' y un espaciador interno de 18-meros.

La biblioteca de oligonucleótidos aleatorios modificados con biotina de 3' sirve como control negativo para las reacciones de precipitación por afinidad. Los aptámeros y oligonucleótidos se suministran liofilizados a partir del fabricante. Por lo tanto, cada aptámero de biotina de 3' u oligonucleótidos aleatorios de biotina de 3' se disolvió a una concentración final de 2.5 |<j>M en agua UltraPure antes del uso.

Las cuentas recubiertas con estreptavidina (Dynabeads MyOne Streptavidin C1; Invitrogen de Life Technologies, Grand Island, NY) se lavaron usando agente amortiguador de unión y lavado (BW) 1X (Tris-HCl 5 mM [pH 7.4], EDTA 0.5 mM, NaCl 1 M, Tween-20 al 0.005%). Las cuentas de estreptavidina se volvieron a suspender de acuerdo con las instrucciones del fabricante en agente amortiguador 2X BW (Tris-Hcl 10 mM [pH 7.4], EDTA 1 mM, NaCl 2 M, Tween-20 al 0.01%) antes de la conjugación con aptámeros de biotina de 3' u oligonucleótidos aleatorios de biotina de 3'. Se incubaron volúmenes iguales de cuentas y aptámero de biotina de 3' o solución de oligonucleótido aleatorio de biotina de 3' a temperatura ambiente con rotación de extremo a extremo durante 15 minutos. Después de la incubación, las cuentas se lavaron dos veces con 1 mL de agente amortiguador BW 1X y una vez con PBSMCT (solución salina amortiguada con fosfato [pH 7.4], cloruro de magnesio 2.5 mM, cloruro de calcio 1 mM, Tween-20 al 0.01%) que contenía 0.1 mg/mL de ADN de esperma de salmón (Invitrogen).

Para las reacciones de precipitación por afinidad, se incubaron 1 mg de aptámero de biotina de 3' o cuentas de estreptavidina recubiertas con oligonucleótido de biotina de 3' con 0.5 mg de HCP y 1 mg de ADN de esperma de salmón en un volumen total de 10 mL de PBSMCT. La mezcla se incubó durante 3-5 horas a temperatura ambiente con rotación de extremo a extremo. Después de la incubación, la solución sobrenadante se retiró y las cuentas de estreptavidina recubiertas con el aptámero de biotina de 3' o la biblioteca de oligonucleótidos de biotina de 3' se lavaron dos veces con 1 mL de PBSMCT que contenía 0.1 mg/mL de ADN de esperma de salmón, seguido por un lavado con PBSMCT. Las HCP unidas se eluyeron del aptámero de biotina de 3' o cuentas de estreptavidina recubiertas con oligonucleótido de biotina de 3' en 45<j>L de agente amortiguador de elución (1.5X amortiguador de muestra NuPAGEMR [Novex by Life Technologies], 20% de glicerol, 50 mM de ditiotreitol [DTT]) a 97 °C durante 10 minutos. Las soluciones de sobrenadante de elución se cargaron en un gel de SDS-PAGE al 4-12% NuPAGEMR (Novex) con agente amortiguador de funcionamiento de MOPS (Novex) y se procesaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El gel se tiñó con tinción de gel de proteína SYPROM<r>Ruby (Molecular Probes, Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se analizó utilizando un Typhoon Trio Variable Mode Imager (GE Healthcare) utilizando un filtro de emisión de 610 nm y longitudes de onda de excitación de 488 nm y 532 nm.

La imagen de un gel nuPAGEMR representativo que muestra los resultados obtenidos después de la precipitación por afinidad utilizando dos aptámeros se muestra en la figura 4. Carril 1: marcadores de peso molecular (Mark12, número de catálogo de Invitrogen LC5677), con bandas de proteína de 30 kDa y 21 kDa indicadas; Carril 2: solución sobrenadante de la reacción de precipitación por afinidad para el aptámero R5-31; Carril 3: solución sobrenadante de la reacción de precipitación por afinidad para el aptámero R5-150; Carril 4: solución sobrenadante de la reacción de precipitación por afinidad de la biblioteca de oligonucleótidos aleatorios. La flecha de la derecha indica la banda de proteínas que corresponde a la estreptavidina (PM = 17 kDa) en los carriles 2, 3 y 4. Los carriles 2 y 3 muestran la presencia de bandas de proteínas que no están presentes en el carril 4, lo que indica que las HCP específicas y distintas están unidas por los aptámeros R5-31 y R5-150. Las precipitaciones por afinidad se llevaron a cabo con al menos 70 aptámeros, con resultados similares.

Las bandas de proteínas de los geles de SDS-PAGE se identificaron usando digestión con tripsina en gel seguida de cromatografía líquida seguida por espectrometría de masas (LC-MS/MS). La mitad de cada muestra presentada se separó ~ 1.5 cm en un minigel Bis-Tris Novex al 10% (Invitrogen) utilizando el sistema de agente amortiguador de MES (descrito anteriormente). El gel se tiñó con Coomassie y cada carril se escindió en diez segmentos de igual tamaño. Las piezas de gel se procesaron utilizando un robot (ProGest, DigiLab) con el siguiente protocolo:

• Lavado con bicarbonato de amonio 25 mM seguido por acetonitrilo

• Reducido con DTT 10 mM a 60 °C seguido de alquilación con yodoacetamida 50 mM a TA

• Digerido con tripsina (Promega) a 37 °C durante 4 h

Se extinguió con ácido fórmico y el sobrenadante se analizó directamente sin procesamiento adicional.

Los digeridos de gel se analizaron por nano LC/MS/MS con un sistema de HPLC Waters NanoAcquity conectado a un ThermoFisher Q Exactive. Los péptidos se cargaron en una columna de captura y se eluyeron sobre una columna analítica de 75 |jm a 350 nL/min; ambas columnas se empaquetaron con resina Júpiter Proteo (Phenomenex; Torrance, CA). El espectrómetro de masas se operó en modo dependiente de datos, con MS y MS/MS realizadas en el Orbitrap a una resolución de 70,000 FWHM y 17,500 FWHM, respectivamente. Los quince iones más abundantes se seleccionaron para MS/MS. Los datos se buscaron utilizando una copia local de Mascot con los siguientes parámetros: Enzima: Tripsina; Base de datos: Uniprot CHO (hacia adelante y hacia atrás anexado con contaminantes comunes); Modificación fija: Carbamidometilo (C); Modificaciones variables: Oxidación (M), Acetilo (Proteína N-término), Pyro-Glu (N-término Q), Desamidación (NQ); Valores de masa: Monoisotópico; Tolerancia de masa de péptidos: 10 ppm; Tolerancia de masa de fragmento: 0.02 Da

El conteo espectral se utiliza en espectrometría de masas como una medida de la abundancia relativa. Las identidades de las HCP unidas por los aptámeros R5-31 y R5-150 se listan en la tabla 2 (a continuación). Sólo se incluyeron las HCP con un conteo espectral de > 50, puesto que se aseguró que estas HCP tenían una abundancia relativamente alta. En general, el aptámero R5-31 se unió a das HCP en tanto que el aptámero R5-150 se unió a 8 HCP (tabla 2). Los valores teóricos del punto isoeléctrico (pl) y los pesos moleculares (MW) para las diez HCP muestran una amplia distribución, lo que indica que los aptámeros no se unen a un tipo específico de HCP (por ejemplo, sólo HCP con alto pl; sólo HCP menores que un cierto MW).

Tabla 2

Ejemplo 7. Determinación de la distribución de HCP unidas por un grupo seleccionado de aptámeros anti-HCP usando cromatografía de afinidad y electroforesis en gel bidimensional (2DGE)

Los aptámeros individuales de 50-meros u oligonucleótidos aleatorios de 50-meros se sintetizaron por Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) con un extremo amino de 3' y un espaciador interno de 18-meros. La biblioteca de oligonucleótidos aleatorios modificados con biotina de 3' sirve como control negativo para las reacciones de cromatografía de afinidad. Aproximadamente 1 jm ol (15 mg) de un grupo de 22 aptámeros modificados con amino de 3' o una biblioteca de oligonucleótidos aleatorios modificados con amino de 3' se disolvió en 2 mL de agente amortiguador de acoplamiento (bicarbonato de sodio 0.2 M, cloruro de sodio 0.5 M, pH 8.3). Estos aptámeros se eligieron con base en el número relativo y la intensidad de las HCP resultantes de la precipitación por afinidad seguida de SDS-PAGE (similar a los resultados mostrados en los Carriles 2 y 3 de la figura 4). Los aptámeros seleccionados para esta columna se indican en la tabla 1 (XXX anterior).

Dos columnas de HP Sepharose (GE) activadas por HiT rap NHS de 1 ml preempaquetadas se conjugaron con la biblioteca de oligonucleótidos aleatorios o los aptámeros agrupados de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, se removió la tapa superior de la columna y se adicionó 1 gota de HCl 1 mM frío a la entrada de columna. Entonces se conectó una jeringa que contenía HCl 1 mM a la entrada de columna. Se removió la tapa inferior de la columna y se conectó una segunda jeringa a la salida de columna. A una velocidad de flujo manual de menos de 1 ml/min (1 gota/2 s), la columna se lavó con 6 ml de HCl 1 mM. Inmediatamente después del lavado con HCl, el ligando (ya sea los 22 aptámeros agrupados o la biblioteca) se cargó en la columna. Después de aproximadamente 2 minutos, el flujo de la columna se pasó de nuevo a través de la columna para maximizar la exposición a la resina. Esto se repitió durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las columnas se lavaron con alícuotas alternas de 2 mL de agente amortiguador A (etanolamina 0.5 M, NaCI 0.5 M, pH 8.3) y agente amortiguador B (acetato de sodio 0.1 M, NaCI 0.5 M, pH 4) de acuerdo con el siguiente patrón: 3 * 2 mL de agente amortiguador A, seguido por 3 * 2 mL de agente amortiguador B, seguido por 3 * 2 mL de agente amortiguador A, seguido por permitir que la columna se equilibre durante aproximadamente 30 minutos con agente amortiguador A, seguido por 3 * 2 mL de agente amortiguador B, seguido por 3 * 2 mL de agente amortiguador A, seguido por 3 * 2 mL de agente amortiguador B. Entonces, cada columna se equilibró con PBSMCT y se almacenó a 5 °C hasta su uso.

La cromatografía se realizó en un instrumento AKTA Avant 125 FPLC. La columna se preequilibró con PBSMCT 0.1 mg/mL de ADN de esperma de salmón antes de la carga. Las HCP se diluyeron a 0.05 mg/mL en PBSMCT ADN de esperma de salmón y se cargaron 45 mL de la mezcla de HCP diluida en la columna a una velocidad de flujo de 1 mL/min. La columna se lavó con 10 volúmenes de columna (~ 10 mL) de PBSMCT ADN de esperma de salmón. Las HCP unidas se eluyeron en 5 volúmenes de columna (~ 5 mL) PBSMCT NaCl 2M; el eluato se recolectó y se guardó para el procesamiento de muestra adicional. Después de la elución, la columna se equilibró con PBSMCT y se almacenó hasta el uso posterior. Este procedimiento idéntico se realizó tanto en la columna conjugada con aptámero agrupada de 22 como en la columna conjugada con biblioteca de oligonucleótidos aleatorios.

Las muestras eluidas se prepararon para el análisis por electroforesis en gel bidimensional (2DGE). Las muestras de proteína se intercambiaron con agente amortiguador en el agente amortiguador de lisis celular 2-D (Tris-HCl 30 mM, pH 8.8, urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS al 4%). Las muestras se prueban en pares, con cada muestra del par marcada con un CyDye diferente (GE Healthcare Life Sciences): CyDye-3 (Cy3) o CyDye-5 (Cy5). Cada muestra se mezcló con 1.0 |jL de CyDye y se mantuvo en la oscuridad en hielo durante 30 minutos. La reacción de marcado se detuvo por la adición de 1.0<j>L de lisina 10 mM a cada muestra, y la incubación en la oscuridad en hielo durante 15 minutos. Las muestras marcadas con Cy3 y Cy5 se mezclaron entre sí. Se adicionaron el agente amortiguador de muestra 2X 2-D (urea 8 M, CHAPS al 4%, DTT 20 mg/ml, Pharmalytes al 2%, cantidad traza de azul de bromofenol), 100<j>L de solución DeStreak y agente amortiguador de rehidratación (urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS al 4%, DTT 20 mg/ml, Pharmalytes al 1%, cantidad traza de azul de bromofenol) a la mezcla de marcado para obtener el volumen total de 250 j L para la tira de gradiente de pH inmovilizado de 13 cm (tira de IPG). Cada muestra se mezcló bien y entonces se centrifugó antes de cargarse en el retenedor de tira de IPG.

2DGE funciona al separar las proteínas primero con base en su pl y entonces por masa. El enfoque isoeléctrico (IEF; gradiente lineal de pH 3-10), que separa las proteínas por pl, se ejecutó en un sistema de enfoque isoeléctrico (IEF) Ettan (GE Healthcare) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (GE Healthcare). Después de la finalización de IEF, las tiras de IPG se incubaron en el agente amortiguador de equilibrio 1 recién preparado (Tris-HCl 50 mM, pH 8,8, urea 6 M, glicerol al 30%, SDS al 2%, 10 mg/ml de DTT, cantidad traza de azul de bromofenol) durante 15 minutos con agitación suave. Las tiras se enjuagaron en el agente amortiguador de equilibrio 2 recién preparado (Tris-HCl 50 mM, pH 8,8, urea 6 M, glicerol al 30%, SDS al 2%, 45 mg/ml de yodoacetamida, cantidad traza de azul de bromofenol) durante 10 minutos con agitación suave. Cada tira de IPG se enjuagó en agente amortiguador de ejecución de gel de SDS antes de transferirse a geles individuales de SDS-PAGE al 12%. SDS-PAGE se ejecutó a 15 °C y voltaje constante hasta que el frente de tinte se agotó de la parte inferior del gel. Los geles se escanearon inmediatamente después de la SDS-PAGE utilizando un generador de imágenes de modo variable Typhoon Trio (GE Healthcare). Las imágenes escaneadas entonces se analizaron con el software Image Quant (versión 6.0, GE Healthcare). Se utilizó el software DeCyder (versión 6.5, GE Healthcare) para el análisis de conteo de punto.

Cuando ambas columnas se cargaron con un total de 2.5 mg de HCP, el eluato de la columna conjugada con aptámero agrupada en 22 contenía 243 puntos de proteína distintos según lo determinado por el software DeCyder del gel bidimensional, en tanto que el eluato de la columna conjugada con la biblioteca de oligonucleótidos aleatorios contenía 20 puntos distintos. Esto indica que la columna conjugada con aptámero agrupada en 22 se une a HCP específicas, en tanto que la columna conjugada con la biblioteca de oligonucleótidos aleatorios no exhibe una unión significativa a HCP.

Ejemplo 8. Determinación del porcentaje de reconocimiento de HCP (o "cobertura") de aptámeros anti-HCP seleccionados usando cromatografía de afinidad y electroforesis en gel bidimensional (2DGE)

Se sintetizaron trescientos veinticuatro (324) aptámeros de 50-mero individuales por Integrated DNA Technologies con un extremo amino de 3' y un espaciador interno de 18-mero. Se disolvieron aproximadamente 12 jm ol de un grupo de 324 aptámeros modificados con amino de 3' en 2 mL de agente amortiguador de acoplamiento. Estos 324 aptámeros se eligieron con base en tener la intensidad de fluorescencia relativa más fuerte para la unión a HCP que resulta de un análisis de microarreglo de 6000 aptámeros candidatos (determinado a partir de un análisis de microarreglos realizado de manera similar a como se describe en el ejemplo 5). Los aptámeros seleccionados para esta evaluación cromatográfica se indican en la tabla 1, a continuación, y sus secuencias de nucleótidos se exponen en las SEQ ID NO 74 -398.

Una columna de HP Sepharose activada por NHS HiTrap de 5 mL preempaquetada se conjugó con 324 aptámeros anti-HCP modificados en 3' de una manera similar a la descrita en el ejemplo 7. En resumen, se removió la tapa superior de la columna y se adicionó 1 gota de HCl 1 mM frío a la entrada de columna. Entonces se conectó una jeringa que contenía HCl 1 mM a la entrada de columna. Se removió la tapa inferior de la columna y se conectó una segunda jeringa a la salida de columna. A una velocidad de flujo manual de menos de 5 ml/min, la columna se lavó con 30 ml de HCl 1 mM. Inmediatamente después del lavado con HCl, el ligando (mezcla equimolar de 324 aptámeros modificados con amino de 3') se cargó en la columna. Después de aproximadamente 2 minutos, el flujo de la columna se pasó de nuevo a través de la columna para maximizar la exposición a la resina. Esto se repitió durante 30 minutos a temperatura ambiente. La columna se lavó con alícuotas alternas de 10 mL de agente amortiguador A y agente amortiguador B de acuerdo con el siguiente patrón: 3 * 10 mL de agente amortiguador A, seguido por 3 * 10 mL de agente amortiguador B, seguido por 3 x 10 mL de agente amortiguador A, seguido por permitir que la columna se equilibre durante aproximadamente 30 minutos con agente amortiguador A, seguido por 3 * 10 mL de agente amortiguador B, seguido por 3 * 2 mL de agente amortiguador A, seguido por 3 * 10 mL de agente amortiguador B. Entonces, la columna se equilibró con PBSMCT y se almacenó a 5 °C hasta su uso.

La cromatografía se realizó en un instrumento AKTA Avant 125 FPLC de una manera similar a la descrita en el ejemplo 7. La columna se preequilibró con PBSMCT 0.1 mg/mL de ADN de esperma de salmón antes de la carga. Las HCP se diluyeron a 2.5 mg/mL en PBSMCT ADN de esperma de salmón y se cargaron 95 mL de la mezcla de HCP diluida en la columna a una velocidad de flujo de 5 mL/min. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna (~ 25 mL) de PBSMCT ADN de esperma de salmón. Las HCP unidas se eluyeron en 5 volúmenes de columna (~ 5 mL) PBSMCT NaCl 2M; el eluato se recolectó y se guardó para el procesamiento de muestra adicional. Después de la elución, la columna se equilibró con PBSMCT y se almacenó hasta el uso posterior.

La muestra eluida y una muestra de la carga de HCP (mezcla de HCP antes de la cromatografía) se prepararon para el análisis por 2DGE de una manera similar a como se describe en el ejemplo 7. Las muestras de proteína se intercambiaron con agente amortiguador en agente amortiguador de lisis celular 2-D. Cada muestra se mezcló con 1.0 |<j>L de Cy3 o Cy5 y se mantuvo en la oscuridad en hielo durante 30 minutos. La reacción de marcado se detuvo por la adición de 1.0 j L de lisina 10 mM a cada muestra, y la incubación en la oscuridad en hielo durante 15 minutos. Las muestras marcadas con Cy3 y Cy5 se mezclaron entre sí. Se adicionaron el agente amortiguador de muestra 2X 2-D, 100 j L de solución DeStreak y amortiguador de rehidratación a la mezcla de etiquetado para obtener el volumen total de 250<j>L para la tira de IPG de 13 cm. Cada muestra se mezcló bien y entonces se centrifugó antes de cargarse en el retenedor de tira de IPG.

Después de la finalización de IEF, las tiras de IPG se incubaron en el agente amortiguador de equilibrado-1 recién preparado durante 15 minutos con agitación suave. Las tiras se enjuagaron en el agente amortiguador de equilibrado 2 recién preparado durante 10 minutos con agitación suave. Cada tira de IPG se enjuagó en agente amortiguador de ejecución de gel de SDS antes de transferirse a geles individuales de SDS-PAGE al 12%. SDS-PAGE se ejecutó a 15 °C y voltaje constante hasta que el frente de tinte se agotó de la parte inferior del gel. Los geles se escanearon inmediatamente después de la SDS-PAGE utilizando un generador de imágenes de modo variable Typhoon Trio. Las imágenes escaneadas se analizaron con el software Image Quant. Se utilizó el software DeCyder para el análisis del conteo de puntos.

El eluato de la columna conjugada con 324 aptámeros, cuando se cargó con un total de 250 mg de HCP, contenía 1627 puntos de proteína distintas como se determina por 2DGE, en tanto que la muestra de carga de HCP (entrada) contenía 2052 puntos de proteína distintas. El porcentaje de cobertura, o el número de puntos unidos por la columna conjugada con aptámero 324, fue del 79.3%. Por lo tanto, los 324 aptámeros, seleccionados específicamente por su capacidad para unirse a las HCP, se unieron a aproximadamente el 80% del total de HCP presentes.

Tabla 1

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un método para remover proteínas de la célula hospedadora (HCP) de una preparación de proteína recombinante que comprende:

proporcionar un grupo final de aptámeros;

exponer la preparación de proteína recombinante al grupo final de aptámeros;

permitir que el grupo final de aptámeros se una a HCP que forman complejos de aptámero:HCP;

y separar los complejos de aptámero:HCP de la preparación de proteína recombinante,

en donde la preparación del grupo final de aptámeros comprende los siguientes pasos:

a. proporcionar una biblioteca de aptámeros potenciales;

b. seleccionar una pluralidad de aptámeros candidatos de una biblioteca de aptámeros potenciales al determinar qué aptámeros muestran cierto grado de unión a HCP en una mezcla de HCP;

c. secuenciar la pluralidad de aptámeros candidatos; y

d. identificar el grupo final de aptámeros con base en la afinidad de unión de los aptámeros candidatos a las HCP en una mezcla de HCP, en donde la afinidad de unión se determina específicamente al emplear un soporte sólido que muestra aptámeros candidatos.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la secuenciación es por secuenciación de próxima generación.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el soporte sólido es un arreglo.

4. El método de la reivindicación 3, en donde la afinidad de unión de los aptámeros candidatos se determina en paralelo.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la mezcla de HCP comprende una pluralidad de HCP de identidad desconocida, o una pluralidad de HCP de cantidad desconocida, o diferentes cantidades de una pluralidad de HCP.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la biblioteca de aptámeros potenciales comprende al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 102, al menos aproximadamente 103, al menos aproximadamente 104, al menos aproximadamente 105, al menos aproximadamente 106, al menos aproximadamente 107, al menos aproximadamente 108, al menos aproximadamente 109, al menos aproximadamente 1010 o al menos aproximadamente 6 * 1014 aptámeros.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde seleccionar una pluralidad de aptámeros candidatos de la biblioteca de aptámeros potenciales comprende mostrar una biblioteca de aptámeros potenciales en un soporte sólido,

opcionalmente, en donde cada unidad del soporte sólido muestra múltiples copias del mismo aptámero, opcionalmente en donde el soporte sólido y los aptámeros forman partículas de aptámero,

opcionalmente en donde la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) se utiliza para aislar partículas de aptámero con una capacidad para unirse a una de las HCP en la mezcla de HCP.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde seleccionar una pluralidad de aptámeros candidatos de la biblioteca de aptámeros potenciales comprende selección microfluídica.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la afinidad de unión por los aptámeros candidatos a las HCP diana se determina al medir K<d>o K<a>.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método genera al menos aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 200, aproximadamente 300, aproximadamente 400, aproximadamente 500, aproximadamente 600, aproximadamente 700, aproximadamente 800, aproximadamente 900, aproximadamente 1000 o aproximadamente 6 * 1014 aptámeros que se unen específicamente a sus HCP diana.