TW202337899A - 透過proteominer改善序列變異分析 - Google Patents
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Abstract
本發明提供在含有高豐度蛋白質的樣品中鑑定宿主細胞蛋白質(HCP)雜質的方法和系統。HCP雜質可以使用已附接至固態載體上的交互作用肽配體來進行富集。HCP雜質可以從固態載體被溶析下來。可以對經分離的HCP雜質進行有限消化(limited digestion)，以生成經分離的HCP雜質的組分，其隨後可以使用質譜儀對其進行鑑定。本發明還提供了在含有高豐度蛋白質的樣品中鑑定序列變體(SV)肽或蛋白質的方法和系統。SV肽或蛋白可以使用已附接到固態載體上的交互作用肽配體進行富集。SV肽或蛋白可以從固態載體被溶析下來。可以對經分離的SV肽或蛋白進行完全或有限消化，以生成經分離的SV肽或蛋白的組分，隨後可以使用質譜儀對其進行鑑定。
Description
本申請請求於2022年1月10日提申的臨時專利申請號第63/297,822號、於2022年11月17日提申的美國臨時專利申請號第63/426,199號，以及於2022年12月16日提申的美國臨時專利申請號第64/433,106號的優先權以及權益，其內容以全文引用的方式併入本文。
本發明大體上是涉及用於在生物製藥產品中鑑定和定量低豐度宿主細胞蛋白質(host cell proteins，HCP)以監測和控制雜質的方法。本發明還有關用於在生物製藥產品中富集、鑑定和定量胺基酸序列變體(SV)蛋白的方法。
重組DNA技術已被廣泛用於在宿主細胞中生產生物製藥產品。生物製藥產品必須滿足非常高的純度標準。因此，在藥物開發、生產、儲存和處理的不同階段下，監測此類生物製藥產品中的任何雜質可能很重要。在進行臨床研究之前，殘留雜質應呈可接受的低含量。殘餘雜質對終端使用者也可能是生物製藥產品的一個問題。例如，宿主細胞蛋白質(HCP)可以存在於使用基於細胞的系統所開發的基於蛋白質的生物製藥中。需要在藥物產品中監測HCP的存在，超過某個閾值可能是不能接受的，這視產品和特定HCP而定。有時，即使微量的HCP也會引起免疫原性反應。
免疫分析已用於使用多株抗HCP抗體來監測HCP移除。免疫分析可以在高通量下提供總HCP含量的半定量，但它們可能無法有效快速定量個別HCP。最近出現了用於監測HCP移除的液相層析法-質譜法(LC-MS)。然而，於存在高濃度經純化抗體的情況下，HCP的巨大動態濃度範圍對於開發LC-MS方法來監測HCP移除來說可能是一個挑戰。特別是，定量極低含量(＜1 ppm)的個別HCP具有挑戰性。
應當理解，需要鑑定並定量HCP的方法和系統，以在原料藥或其他產品中監測和控制殘餘HCP，從而減輕安全性風險。
有鑑於對療效和安全性的潛在影響，因為重組治療性蛋白質中的意外胺基酸取代所造成的序列變體(SV)已經越來越受到監管機構和生物製藥產業的關注。在經過充分優化的生產系統中，由於諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株的哺乳動物表現系統中DNA複製和蛋白質生物合成過程的高保真度，此類序列變體在最終產品中通常以極低的含量存在。然而，如果所挑選的生產細胞株具有出乎意料的DNA突變或製程未經完全優化(例如，如果在生物反應器的細胞培養基中某些胺基酸耗盡)，SV含量可能會顯著升高。因此，設計和實施有效的監測與控制策略，以便在產品和製程開發的早期階段期間預防或最小化SV可能存在的風險是很重要的。然而，監管機構沒有完善的指南或整個行業並沒有共識來評估和管理SV風險。
生物製藥產業當前的目標是在治療性單株抗體(mAb)中個別胺基酸序列變異的普遍控制界限為0.1%，這似乎是個別胺基酸的自然序列變異上限。然而，目前還沒有一種靈敏、準確和精確的方法來偵測SV蛋白。例如，三個獨立實驗室消化NIST標準品mAb，使用常規流動帶電表面雜合(charge surface hybrid，CSH) LC管柱純化NIST mAb胰蛋白酶肽，並使用質譜法偵測SV NIST mAb胰蛋白酶肽(Zhang,
et al. 2020)。這三間實驗室各自在NIST單株抗體(mAb)中鑑定出21-23個序列變異，變異率介於0.01%到0.1%，但實驗室僅就12個序列變異達成一致。需要更為可再現和更為可靠的方法來偵測生物製藥療法中的完全SV蛋白陣列，特別是在個別胺基酸的0.1%序列變異作為雜質上限。
應當理解，需要方法和系統來鑑定並定量生物治療劑中的胺基酸序列變異，以確保藥物產品安全性、一致性與療效。
在複雜度相當高的樣品中因為蛋白質濃度的動態範圍廣泛，因此在生物製藥產品中鑑定HCP雜質具有挑戰性。特別是，樣品中至少存在一種高豐度蛋白質或肽(諸如治療性蛋白質)，會對樣品中極低豐度蛋白質的偵測、鑑定和定量造成技術障礙。本件申請案提供了在含有高豐度蛋白質的樣品中鑑定HCP雜質的方法，其包括一種富集方法以滿足在治療性藥物產品中富集低豐度HCP的需要。
本發明提供了在樣品中鑑定及/或定量HCP雜質的方法。在一些例示性實施例中，該方法包含：(a)使包括至少一種高豐度肽或蛋白質和至少一種HCP雜質的樣品與固態載體接觸，其中該固態載體附接至能夠與該至少一種HCP雜質交互作用的交互作用肽配體；(b)洗滌該固態載體以提供包含至少一種經富集HCP雜質的析出液；(c)使該析出液經過酶消化條件以產生該至少一種經富集HCP雜質的至少一種組分，其中該酶消化條件並未完全消化該析出液中的所有蛋白質；(d)使用質譜儀鑑定該至少一種經富集HCP雜質的該至少一種組分；以及(e)使用該至少一種組分的鑑定結果來鑑定該至少一種經富集HCP雜質。
在一個態樣中，洗滌步驟包括表面活性劑，其中該表面活性劑是相轉移表面活性劑、離子性表面活性劑、陰離子性表面活性劑、陽離子性表面活性劑或其組合。在一個特定態樣中，表面活性劑是去氧膽酸鈉、月桂基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉或其組合。在另一個態樣中，表面活性劑的濃度為約12 mM。在一個特定態樣中，表面活性劑包含約12 mM去氧膽酸鈉和約12 mM月桂基硫酸鈉。
在一個態樣中，至少一種高豐度肽或蛋白質的濃度比該至少一種HCP雜質的濃度高至少約1000倍、約10,000倍、約100,000倍或約1,000,000倍。在另一個態樣中，交互作用肽配體是組合式六肽配體的庫。在又另一個態樣中，至少一種高豐度肽或蛋白質是抗體、雙特異性抗體、抗體片段、抗體的Fab區、抗體-藥物結合物、融合蛋白、重組蛋白、蛋白質醫藥產品、生物製藥產品或藥物。
在一個態樣中，酶消化條件的酶是胰蛋白酶。在一個特定態樣中，酶消化條件包括酶與受質比例小於約1：200的胰蛋白酶。在另一個特定態樣中，酶消化條件包括酶與受質比例為約1：400、約1：1000、約1：2500或約1：10000的胰蛋白酶。在另一個態樣中，至少一種經富集HCP雜質在經過該酶消化條件之前並未經過變性。
在一個態樣中，質譜儀是電灑游離質譜儀、奈米電灑游離質譜儀或三重四極質譜儀，其中質譜儀耦合至液相層析系統。在另一個態樣中，質譜儀能夠進行LC-MS (液相層析法-質譜法)或LC-MRM-MS (液相層析法-多反應監測-質譜法)分析。
在一個態樣中，方法進一步包含使用該質譜儀對至少一種經富集HCP雜質進行定量，其中至少一種經富集HCP雜質的偵測極限為約0.003至0.006 ppm。
現有的類似偵測方法無法在同一個NIST mAb標準品中偵測相同的胺基酸序列變異陣列(Zhang,
et al. 2020)。一個可能的解釋可能是，異常的胺基酸取代可以發生在蛋白質序列中的任何胺基酸處，從而產生多種序列變異的陣列，從而逃避可靠的鑑定。因此，使用現有方法大體上不可能定量與SV蛋白以及特定SV蛋白或SV蛋白子集相關的風險。本件申請案提出一種方法，該方法可以在同一個NIST mAb標準品中鑑定出比先前多項研究多出大約4倍的序列變異。此外，本發明方法特別適用於可再現地鑑定可能影響到三維蛋白質結構的胺基酸序列變異。具體而言，本發明的ProteoMiner™ SV鑑定方法能最為有效地富集SV蛋白，其中具有物理特徵的胺基酸(像是麩胺酸的帶負電荷極性側鏈)取代了具有不同物理特徵的胺基酸(像是纈胺酸的非極性疏水性側鏈)。
本發明提供了用於在樣品中鑑定SV肽或蛋白的方法，其中SV肽或蛋白的至少一個胺基酸無意中不同於野生型肽或蛋白質。在一些實施例中，該方法包含：(a)使包括至少一種更為豐富的野生型肽或蛋白質和至少一種SV肽或蛋白的樣品與固態載體接觸，其中固態載體附接至能夠與至少一種SV肽或蛋白交互作用的交互作用肽配體；(b)洗滌固態載體以提供包含至少一種經富集SV肽或蛋白的第一析出液；(c)使第一析出液經過酶消化條件以產生至少一種經富集SV肽或蛋白的至少一種組分；(d)使具有至少一種經富集SV肽或蛋白的至少一種組分的第一析出液經過液相層析系統，以產生具有至少一種經富集SV肽或蛋白的至少一種組分的第二析出液；(e)使具有至少一種經富集SV肽或蛋白的至少一種組分的第二析出液經過質譜分析；(f)使用質譜儀鑑定至少一種經富集SV肽或蛋白的至少一種組分；以及(g)使用至少一種經富集SV肽或蛋白的至少一種組分的鑑定結果來鑑定樣品中的至少一種經富集SV肽或蛋白。
在一個態樣中，酶消化條件是直接消化。
在一個態樣中，液相層析系統包含奈米規模液相層析法(nanoLC)管柱或常規流動CSH管柱。
在一個態樣中，酶消化條件並未完全消化第一析出液中的所有蛋白質。
在一個態樣中，使用表面活性劑洗滌固態載體，其中表面活性劑是相轉移表面活性劑、離子性表面活性劑、陰離子性表面活性劑、陽離子性表面活性劑或其組合。
在一個態樣中，表面活性劑是去氧膽酸鈉、月桂基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉或其組合。
在一個態樣中，表面活性劑的濃度為約12 mM。
在一個態樣中，表面活性劑包含約12 mM去氧膽酸鈉和約12 mM月桂基硫酸鈉。
在一個態樣中，至少一種更為豐富的野生型肽或蛋白質的濃度比至少一種SV肽或蛋白的濃度高至少約1000倍、約10,000倍、約100,000倍或約1,000,000倍。
在一個態樣中，交互作用肽配體是組合式六肽配體的庫。
在一個態樣中，至少一種更為豐富的野生型肽或蛋白質和至少一種SV肽或蛋白是抗體、雙特異性抗體、抗體片段、抗體的Fab區、抗體-藥物結合物、融合蛋白、重組蛋白、蛋白質醫藥產品、生物製藥產品或藥物。
在一個態樣中，酶消化條件的酶是胰蛋白酶。
在一個態樣中，酶消化條件包括酶與受質比例小於約1：200的胰蛋白酶。
在一個態樣中，酶消化條件包括酶與受質比例為約1：400、約1：1000、約1：2500或約1：10000的胰蛋白酶。
在一個態樣中，至少一種經富集SV肽或蛋白在經酶消化條件之前未經變性。
在一個態樣中，質譜儀是電灑游離質譜儀、奈米電灑游離質譜儀或三重四極質譜儀，其中質譜儀耦合至液相層析系統。
在一個態樣中，質譜儀能夠進行LC-MS (液相層析法-質譜法)或LC-MRM-MS (液相層析法-多反應監測-質譜法)分析。
在一個態樣中，方法進一步包含使用質譜儀對至少一種經富集SV肽或蛋白進行定量，其中至少一種經富集SV肽或蛋白的偵測極限為約0.003至0.006 ppm。
本發明提供了用於在樣品中鑑定宿主細胞蛋白質(HCP)雜質的方法。在一些實施例中，該方法包含：(a)使包含至少一種高豐度肽或蛋白質與至少一種HCP雜質的樣品與固態載體接觸，其中該固態載體附接到能夠與該至少一種HCP雜質交互作用的交互作用肽配體；(b)洗滌該固態載體以提供包含至少一種經富集HCP雜質的析出液；(c)使該析出液經過酶消化條件以產生該至少一種經富集HCP雜質的至少一種組分，其中該酶消化條件並未完全消化該析出液中的所有蛋白質；(d)使用平行反應監測-質譜法鑑定該至少一種經富集HCP雜質的該至少一種組分；以及(e)使用該至少一種組分的鑑定結果來鑑定該至少一種經富集HCP雜質。
在一個態樣中，使用表面活性劑洗滌固態載體，其中表面活性劑是相轉移表面活性劑、離子性表面活性劑、陰離子性表面活性劑、陽離子性表面活性劑或其組合。
在另一個態樣中，表面活性劑是去氧膽酸鈉、月桂基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉或其組合。
在一個態樣中，表面活性劑的濃度為約12 mM。
在又另一個態樣中，表面活性劑包含約12 mM去氧膽酸鈉和約12 mM月桂基硫酸鈉。
在一個態樣中，至少一種高豐度肽或蛋白質的濃度比該至少一種HCP雜質的濃度高至少約1,000倍、約10,000倍、約100,000倍、約1,000,000倍、約10,000,000倍、約100,000,000倍或約1,000,000,000倍。
在一個態樣中，交互作用肽配體是組合式六肽配體的庫。
在一個態樣中，至少一種高豐度肽或蛋白質是抗體、雙特異性抗體、抗體片段、抗體的Fab區、抗體-藥物結合物、融合蛋白、重組蛋白、蛋白質醫藥產品或藥物。
在一個態樣中，該酶消化條件的酶是胰蛋白酶。
在另一個態樣中，酶消化條件包括酶與受質比例小於約1：200的胰蛋白酶。
在又另一個態樣中，酶消化條件包括酶與受質比例為約1：400、約1：1000、約1：2500或約1：10000的胰蛋白酶。
在一個態樣中，至少一種經富集HCP雜質在經過該酶消化條件之前未經變性。
在一個態樣中，質譜儀是電灑游離質譜儀、奈米電灑游離質譜儀或三重四極質譜儀，其中質譜儀耦合至液相層析系統。
在一個態樣中，樣品包括內部標準品。
在另一個態樣中，內部標準品經重同位素標記。
在又另一個態樣中，內部標準品是hPLBD2。
當結合以下說明和隨附圖式考慮時，將更為充分地理解和了解到本發明的這些和其他態樣。以下說明雖然指示各種實施例及其眾多具體細節，但是以說明而非限制的方式提供的。在本發明範疇內可以進行許多取代、修改、添加或重新排列。
為了製造生物製藥產品，獲得具有高純度的生物製藥產品是很重要的，因為殘餘HCP會損及產品安全性和穩定性。為了生產基於細胞的重組治療性抗體，免疫分析(諸如酶聯免疫吸附分析(ELISA))通常已被用於在開發過程期間使用多株抗HCP抗體監測HCP移除(清除)。ELISA可以高通量提供總HCP含量的半定量。然而，由於ELISA用多株抗HCP抗體被用來捕獲、偵測和定量總HCP，它們可能無法有效定量個別HCP。特別是，一些非免疫原性或弱免疫原性HCP可能無法使用ELISA被偵測到。
為了鑑定並定量HCP，已使用幾種互補方法來監測HCP，諸如一維/二維(1D/2D) PAGE或液相層析法(LC)耦合串聯質譜法(LC-MS/MS)。然而，於存在著高濃度經純化抗體的情況下，HCP的廣泛動態濃度範圍對於開發LC-MS方法來說，監測HCP雜質移除可能是一個重大挑戰。於存在著高濃度治療性抗體的情況下，由於動態濃度範圍廣泛，單質譜法(MS)缺乏偵測低豐度目標(諸如低ppm含量的HCP，治療性抗體可能比HCP雜質高出六個數量級以上)的能力。為了克服這個問題，一個策略是在MS分析之前藉由添加另一個分離維度(諸如2D-LC及/或離子遷移率)，結合數據依賴擷取或數據非依賴擷取來解析共析出肽，以便提高分離效率。
Huang等人(Huang
et al., A Novel Sample Preparation for Shotgun Proteomics Characterization of HCPs in Antibodies, Anal. Chem. 2017, May 16; 89 (10):5436‐5444)描述了一種使用胰蛋白酶消化的樣品製備方法，其在抗體樣品中對HCP雜質進行獵槍蛋白質體學特徵鑑定。Huang的樣品製備方法在HCP被消化時使抗體維持近乎完整。與傳統的胰蛋白酶消化樣品製備相比，Huang的方法可以將使用質譜法偵測HCP的動態範圍降低一到兩個數量級。正如HCP摻加實驗所證明，Huang的方法可以偵測到0.5 ppm的分子量大於60 kDa的HCP，諸如rPLBL2。例如，使用Huang的方法在RM 8670 (NISTmAb，NIST單株抗體標準品，在鼠類細胞株中表現，從National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, MD獲得)中偵測到六十種小鼠HCP雜質。
Doneanu等人(Doneanu
et al., Enhanced Detection of Low‐Abundance Host Cell Protein Impurities in High‐Purity Monoclonal Antibodies Down to 1 ppm Using Ion Mobility Mass Spectrometry Coupled with Multidimensional Liquid Chromatography, Anal. Chem. 2015 Oct 20; 87(20):10283‐10291)報導，使用液相層析法-質譜法(LC-MS)方法在抗體樣品中偵測到低至1 ppm的低豐度HCP雜質。Doneanu的方法包括使用新的表面經電荷修飾的C18固定相來緩解管柱飽和的挑戰，結合共溶析肽前體的行進波離子遷移率分離，以及藉由找出用於前體裂解的碰撞能與遷移率漂移時間的關聯性來提高低豐度HCP肽的裂解效率。使用2D-HPLC (2D-高效液相層析法)結合離子遷移率質譜法分析可以在10-50 ppm下鑑定出HCP雜質。但是，2D-LC或2D-HPLC的循環時間可能會很長。此外，這些方法對於低含量HCP分析(諸如低於10 ppm)可能不夠靈敏。鑑定HCP雜質的其他方法包括樣品製備以藉由移除樣品中的抗體而富集HCP，諸如使用親和力純化或有限消化來移除抗體。此外，使用多株抗體來捕獲HCP是另一種常用方法。
由於樣品的複雜度非常高，鑑定HCP雜質所需的分析技術遭遇到處理比分析物(例如HCP或HCP肽)多約100萬倍基質分子的挑戰。將HCP富集到與偵測兼容的程度是不容易的，因為HCP雜質通常以低含量存在，諸如蛋白質生物製藥中的1-100 ppm。在不知道HCP的特性和性質的情況下，開發一種通用的樣品製備程序以富集HCP (或HCP肽)或移除基質背景可能非常具有挑戰性(Doneanu
et al.)。
Chen等人(Chen
et al., Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner, Anal. Biochem. 2020 Dec. 1; 610:113972)描述了一種使用交互作用肽配體(特別是ProteoMiner™珠粒)來富集HCP的方法。本發明方法改善了先前所述HCP富集、鑑定和定量的ProteoMiner™方法。
本件申請案提供了一種使用交互作用肽配體(諸如組合式配體庫)來富集HCP的方法。在一些例示性實施例中，ProteoMiner™珠粒(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA)是一種固定在珠粒上的組合式六肽庫，被用於富集HCP。當結合肽配體的珠粒被施加到含有各種蛋白質種類的樣品時，各種蛋白質種類都可以結合至其交互作用肽配體。HCP主要藉由疏水力加上一些弱交互作用力(諸如離子性交互作用和氫鍵)結合至其交互作用肽配體。
由於過量存在，高豐度的蛋白質種類可以使其交互作用肽配體飽和，因為組合式配體庫中對應於各個蛋白質種類的交互作用肽配體的數量有限。於存在過量高豐度蛋白質的情況下，數量有限的對應交互作用肽配體很容易就飽和。無法結合至交互作用肽配體的過量高豐度蛋白質可以從珠粒上被洗下來。由於與高豐度蛋白質相比，樣品中低豐度蛋白質的數量相對較低，因此低豐度蛋白質可能不會使其對應的交互作用肽配體飽和。因此，與高豐度蛋白質相比，低豐度蛋白質可以被相對富集。進行富集過程後，可顯著降低蛋白質濃度的廣泛動態範圍，以便偵測到低豐度蛋白質。
使用有限消化可以進一步降低蛋白質濃度的廣泛動態範圍。降低消化酶與受質的比例，並對天然折疊蛋白質而不是變性蛋白質進行消化反應，導致樣品中的蛋白質消化不完全，在樣品中不成比例地減少對應於高豐度蛋白質的肽的存在，並因此降低了蛋白質濃度的動態範圍。
本件申請案的HCP富集方法可以透過減少高豐度蛋白的數量來富集並偵測中等豐度和低豐度蛋白質。本件申請案的HCP富集方法也滿足了在藥物產品或其他感興趣的樣品中富集低豐度HCP雜質的需要。
在一些例示性實施例中，用ProteoMiner™珠粒處理樣品來減少以高豐度存在的治療性蛋白質數量並富集低豐度HCP雜質。隨後對HCP經富集的樣品進行蛋白質體學分析。這個程序可以富集低豐度HCP雜質，同時降低治療性蛋白質的含量。它可以成功地降低HCP和蛋白質藥物之間的動態濃度範圍，從而可以偵測到低豐度HCP雜質。使用本件申請案的HCP富集方法，HCP雜質的偵測極限為約0.003至0.006 ppm。
在一些例示性實施例中，本發明提供了一種在樣品中鑑定及/或定量宿主細胞蛋白質(HCP)雜質的方法，其包含：使包括至少一種高豐度肽或蛋白質和至少一種HCP雜質的樣品與固態載體接觸，其中該固態載體附接至能夠與該至少一種HCP雜質交互作用的交互作用肽配體；洗滌固態載體以提供包含至少一種經富集HCP雜質的析出液；使析出液經過酶消化條件以產生至少一種經富集HCP雜質的至少一種組分，其中酶消化條件是不完全消化析出液中的所有蛋白質的有限消化；使用質譜儀鑑定及/或定量至少一種經富集HCP雜質的至少一種組分；以及使用至少一種組分的鑑定結果及/或定量結果來鑑定及/或定量至少一種經富集HCP雜質。
在一些例示性實施例中，相轉移表面活性劑(PTS) (諸如去氧膽酸鈉(SDC)和月桂基硫酸鈉(SLS))被用來從ProteoMiner™珠粒溶析HCP。SDC是一種離子性清潔劑，特別適用於破壞並解離蛋白質交互作用。離子性清潔劑具有帶電荷的親水性頭基，可能帶負電(陰離子性)或帶正電(陽離子性)。SLS是一種陰離子性表面活性劑。陰離子清潔劑(諸如SLS或十二烷基苯磺酸鈉)是磺化長鏈、醇或碳氫化合物的鈉鹽。
在一些例示性實施例中，用於從ProteoMiner™珠粒溶析HCP的溶析緩衝液包含離子性表面活性劑、陰離子性表面活性劑、陽離子性表面活性劑、相轉移表面活性劑或其組合。在一個態樣中，溶析緩衝液含有SDC、SLS或十二烷基苯磺酸鈉。在一個態樣中，溶析緩衝液包含含有12 mM SDC (去氧膽酸鈉)、12 mM SLS (月桂醯基肌胺酸鈉)、10 mM TCEP (叁(2-羧基乙基)膦，一種還原劑)和30 mM CAA (氯乙醯胺)的PTS緩衝液。
微量的特定HCP可能在藥物注射後引起免疫反應或毒性生物活性。生物製藥產品中存在著殘餘HCP對藥物安全性來說是一個問題，這會導致越來越需要開發方法和系統來鑑定和特徵鑑定生物製藥產品中的HCP雜質。在治療性蛋白質產品中鑑定和監測個別HCP以進行風險評估的需求尚未得到滿足。
本發明藉由提供鑑定和定量HCP的方法和系統來監測和控制原料藥中的殘餘HCP，以便降低安全風險而提供滿足上述需求。本文揭示的例示性實施例滿足上述要求和長期需求。
除了HCP之外，由意外胺基酸取代引起的序列變體(SV)是藥物開發和製造中所關注的另一個產品品質屬性。此類SV已被證明存在於天然和重組蛋白質中，咸信是由多種機制引起的，包括複製期間的DNA突變，以及蛋白質生物合成期間的轉錄和轉譯錯誤。
由於生物系統的高保真度(其進化以防止這種自發錯誤的發生)，因此SV通常在天然生物蛋白質中以非常低的含量(＜0.1%)存在。然而，在治療性蛋白質藥物開發期間，目標是提高蛋白質效價和製程生產力來滿足全球需求，並降低商品成本以擴大患者的可及性。這導致了所謂的強化型生物反應器製造系統的廣泛使用，這個系統被設計成在細胞培養過程期間使細胞密度和目標治療性蛋白質的特定生產力最大化。這種強化型生產系統可以對生產細胞株施加高於正常表現系統(machinery)的壓力。如果沒有完全優化，則蛋白質產品中可能會產生更高含量的SV。此外，為了進一步提高產品效價，細胞株開發通常會經過多輪挑選，同時增加選擇性壓力，以便找出最多產的細胞株。這個挑選過程可能會向細胞株引入DNA突變。如果篩選不當，可能會導致最終藥物產品中出現意想不到的高含量SV。
有鑑於這些關於SV升高可能如何影響藥物品質的擔憂，產業和監管機構都開始更為關注SV。在過去十年內，整個行業投入了大量努力和資源，以便能更充分地了解SV的成因及其在生物開發中的控制。由於這些集體努力，已經開發出多種控制策略，在其產物和製程開發期間更好地監控和緩解SV問題。一如預期，這些提議的策略強調了多分析、多層SV篩選方法的重要性，以指導從早期細胞株挑選到小規模細胞培養製程開發再到規模放大確認的製程開發。這些策略共同提供了一個有價值的全行業框架和高級指導，在SV控制方面實現建立一些通用最佳實施的目標。
然而，整個產業在許多重要方面仍缺乏清晰度和共識。例如，這些包括：1)多種SV相關分析技術的挑選和組合使用(例如，基於次世代定序的DNA或RNA定序、液相層析法(LC)-質譜法(MS)/MS，替代胺基酸分析)；2)考慮整體控制策略有效性和開發時間表，挑選在產品和製程開發期間實施SV監測與控制的階段和程度；3)適當評估SV風險對產品安全性與功效的影響；4)確定製程開發和最終藥物產品中合理的SV控制限度或可接受水平；以及5)在監管備案時回報SV數據。
為了填補其中一些知識空白，International Consortium for Innovation & Quality in Pharmaceutical Development. (Zhang,
et al. 2020)最近發布了一項關於在其生物開發時SV分析和控制的產業實務調查結果。在調查中，提出的最關鍵的問題之一是個別公司為其產品和製程開發所設定的行動限制(或控制目標)的SV含量。問題是，沒有一種可靠的方法可再現地偵測樣本中的同一組SV mAb。例如，先前一項研究評估了一種用於SV NIST mAb偵測的LC-MS方法的性能，因為它經充分特徵鑑定且兩個獨立實驗室進行了類似的分析。(Zhang,
et al. 2020)。儘管所有三間實驗室都能夠偵測和鑑定出0.01-0.1%範圍內的低含量SV，但三間實驗室所鑑定出的SV集並未完全彼此重疊。三個測試實驗室各自在NIST mAb中鑑定出數量相似(例如21-23)的SV，但所有三個測試實驗室只鑑定出其中的共同12個，這表明基於方法在偵測低含量SV方面有很大的方法上變異。
本件申請案提供了在使用或不使用交互作用肽配體(諸如組合式配體庫)進行富集的情況下，提高SV蛋白(尤其是mAb)偵測極限的方法。在一些例示性實施例中，ProteoMiner™珠粒(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) (一種固定在珠粒上的組合式六肽庫)被用於提高SV mAb的偵測極限(例如，可以偵測到SV mAb的分辨率)。在一些例示性實施例中，ProteoMiner™珠粒可以富集SV mAb，其中胺基酸取代影響到mAb蛋白質結構。當結合肽配體的珠粒被施加到含有不同蛋白質種類的樣品時，每種蛋白質種類都可以結合至其交互作用肽配體。SV蛋白主要藉由疏水力加上一些弱交互作用力(諸如離子性交互作用和氫鍵)結合至其交互作用肽配體。
高豐度非SV蛋白種類及其對應的低豐度SV蛋白種類可能結合相同的交互作用肽配體。低豐度SV蛋白種類對肽配體的親和力可能相當於對應非SV蛋白種類對相同肽配體的親和力。或者，低豐度SV蛋白種類對肽配體的親和力可能大於或小於對應非SV蛋白種類對相同肽配體的親和力。無法結合至交互作用肽配體的過量高豐度非SV蛋白可以從珠粒被洗下。因此，與高豐度非SV蛋白種類相比，低豐度SV蛋白種類的偵測極限可以被相對提高。在提高低豐度SV蛋白種類的偵測極限後，可以顯著降低蛋白質濃度的廣泛動態範圍，以允許偵測到低豐度SV蛋白。
使用有限消化可以進一步降低蛋白質濃度的廣泛動態範圍。降低消化酶與受質的比例，並對天然折疊蛋白質而不是變性蛋白質進行消化反應，導致樣品中的蛋白質消化不完全，在樣品中不成比例地減少對應於高豐度蛋白質的肽的存在，並因此降低了蛋白質濃度的動態範圍
使用nanoflow LC (nanoLC)可以進一步提高低豐度SV蛋白種類的偵測極限。NanoLC可以透過增加衍生自SV蛋白的SV肽產物離子的信號並允許形成更多的y離子來改善MS2譜圖。
本件申請案的強化型SV蛋白偵測方法可以透過減少高豐度非SV蛋白的數量來提高SV蛋白的偵測極限。本件申請案提高SV蛋白偵測極限的方法也可以滿足在治療性藥物產品中富集低豐度SV蛋白的需要。
在一些例示性實施例中，樣品用ProteoMiner™珠粒處理，以減少以高豐度存在的治療性蛋白質數量，並在有富集或沒有富集的情況下提高低豐度SV治療性蛋白質的偵測。隨後對樣本進行蛋白質體學分析。這個程序可以富集低豐度的SV治療性蛋白質，同時降低非SV治療性蛋白質的含量。它可以成功地降低SV和非SV蛋白藥物之間的動態濃度範圍，從而可以偵測到低豐度SV蛋白。本件申請案的強化型SV蛋白偵測方法可以偵測到在約0.003%蛋白質中發生的胺基酸取代。
在一些例示性實施例中，本發明提供了一種在樣品中鑑定序列變體(SV)肽或蛋白質的方法，其中SV肽或蛋白的至少一個胺基酸無意中不同於野生型肽或蛋白質，該方法包含：(a)使包括至少一種更為豐富的野生型肽或蛋白質和至少一種SV肽或蛋白的樣品與固態載體接觸，其中該固態載體附接至能夠與該至少一種SV肽或蛋白交互作用的交互作用肽配體；(b)洗滌該固態載體以提供包含至少一種經富集的SV肽或蛋白的第一析出液；(c)使該第一析出液經過酶消化條件以產生該至少一種經富集SV肽或蛋白的至少一種組分；(d)使具有該至少一種經富集SV肽或蛋白的該至少一種組分的該第一析出液經過液相層析系統，以產生具有該至少一種經富集SV肽或蛋白的該至少一種組分的第二析出液；(e)使具有該至少一種經富集SV肽或蛋白的該至少一種組分的該第二析出液進行質譜分析法；(f)使用質譜儀鑑定該至少一種經富集SV肽或蛋白的該至少一種組分；以及(g)使用該至少一種經富集SV肽或蛋白的該至少一種組分的鑑定結果來鑑定該樣品中的該至少一種經富集SV肽或蛋白。
在一些例示性實施例中，相轉移表面活性劑(PTS)用於從ProteoMiner™珠粒溶析SV蛋白。在一些例示性實施例中，從ProteoMiner™珠粒溶析SV蛋白的溶析緩衝液含有離子性表面活性劑、陰離子性表面活性劑、陽離子性表面活性劑、相轉移表面活性劑或其組合。在一個態樣中，溶析緩衝液含有SDC、SLS或十二烷基苯磺酸鈉。在一個態樣中，溶析緩衝液包含含有12 mM SDC (去氧膽酸鈉)、12 mM SLS (月桂醯基肌胺酸鈉)、10 mM TCEP (參(2-羧基乙基)膦，一種還原劑)和30 mM CAA(氯乙醯胺)的PTS緩衝液。
微量的特定SV蛋白可能在藥物注射後引起免疫反應或毒性生物活性。生物製藥產品中存在著殘餘SV蛋白對藥物安全性來說是一個問題，這會導致越來越需要開發方法和系統來鑑定和特徵鑑定生物製藥產品中的SV蛋白。在治療性蛋白質產品中鑑定和監測SV蛋白以進行SV存在風險評估的需求尚未得到滿足。
本發明是藉由提供方法和系統鑑定和定量SV蛋白來監測和控制原料藥中的SV蛋白以減輕安全性風險，從而提供滿足上述需求的方法和系統。本文揭示的例示性實施例滿足上述要求和長期需求。
除非另有說明，否則本文使用的所有技術和科學術語與本發明所屬技藝中具有通常知識者一般理解的含義相同。儘管在實施或測試時可以使用與本文描述的那些類似或等效的任何方法和材料，但是現將描述特定的方法和材料。
術語「一」應理解為表示「至少一」，而術語「約」和「大約」應理解為允許標準變化，如那些具有通常知識者所理解的，並且其中提供了範圍，包括端點在內。如本文所用，術語「包括(include、includes以及including)」意為非限制性的並且被理解為分別表示「包含(comprise、comprises以及comprising)」。
如本文所用，術語「蛋白質」或「感興趣的蛋白質」可包括具有共價連接的醯胺鍵的任何胺基酸聚合物。蛋白質包含一條或多條胺基酸聚合物鏈，在本領域中通常稱為「多肽」。「多肽」是指由胺基酸殘基、相關的天然存在的結構變體及其合成的非天然存在的類似物經由肽鍵連接所組成的聚合物。「合成肽或多肽」是指非天然存在的肽或多肽。可以合成合成肽或多肽，例如使用自動化多肽合成儀。各種固相肽合成方法是本技術領域具有通常知識者已知的。蛋白質可包含一或多個多肽以形成單一功能性生物分子。
如本文所用，術語「治療性蛋白質」包括用於研究或治療的任何蛋白質、重組蛋白、捕獲蛋白和其他嵌合受體Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗體、單株抗體、多株抗體、人類抗體和雙特異性抗體。
在另一個例示性態樣中，蛋白質可包括抗體片段、奈米抗體、重組抗體嵌合體、細胞介素、趨化介素、肽激素以及類似物。感興趣的蛋白質可包括任何生物治療性蛋白質、用於研究或治療的重組蛋白、捕獲蛋白和其他嵌合受體Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗體、單株抗體、多株抗體、人類抗體和雙特異性抗體。蛋白質可以使用基於重組細胞的生產系統來生產，諸如昆蟲桿狀病毒系統、酵母系統(例如畢赤酵母屬)以及哺乳動物系統(例如CHO細胞和CHO衍生物，像是CHO-K1細胞)。有關最近討論生物治療性蛋白質及其生產的評論，參見Ghaderi
et al., “Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non‐human sialylation” (Darius Ghaderi
et al., 28 BIOTECHNOLOGY AND GENETIC ENGINEERING REVIEWS 147-176 (2012)，其以全文引用的方式併入本文)。在一些例示性實施例中，蛋白質包含修飾、加合物和其他共價連接的部分。這些修飾、加合物和部分包括例如抗生物素蛋白、鏈黴親和素、生物素、聚醣(例如N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖、神經胺酸、N-乙醯基葡萄糖胺、岩藻糖、甘露糖和其他單醣)、PEG、多組胺酸、FLAGtag、麥芽糖結合蛋白(MBP)、幾丁質結合蛋白(CBP)、麩胱甘肽-S-轉移酶(GST) myc-表位、螢光標記和其他染料，以及類似物。蛋白質可以根據組成和溶解度進行分類，因此可以包括簡單的蛋白質，諸如球狀蛋白質和纖維狀蛋白質；結合型蛋白，諸如核蛋白、醣蛋白、黏蛋白、色蛋白、磷蛋白、金屬蛋白和脂蛋白；以及衍生蛋白，諸如初級衍生蛋白和次級衍生蛋白。
在一個態樣中，本發明方法中的至少一種高豐度肽或蛋白質是抗體、雙特異性抗體、抗體片段、抗體的Fab區、抗體-藥物結合物、融合蛋白，蛋白質醫藥產品或藥物。
如本文所用，術語「重組蛋白」是指由於重組表現載體上攜帶的基因轉錄和轉譯而產生的蛋白質，該重組表現載體已被引入合適的宿主細胞。在某些例示性實施例中，重組蛋白可以是抗體，例如嵌合抗體、人源化抗體或完全人類抗體。在某些例示性實施例中，重組蛋白可以是選自以下組成之群組的同型的抗體：IgG、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE。在某些例示性實施例中，抗體分子是全長抗體(例如IgG1)，或者抗體可以是片段(例如Fc片段或Fab片段)。
如本文所用，術語「抗體」包括免疫球蛋白分子及其多聚體(例如IgM)，免疫球蛋白分子包含四條多肽鏈，兩條重(H)鏈和兩條輕
(L)鏈藉由雙硫鍵相互連接。每條重鏈包含重鏈可變區(本文縮寫為HCVR或VH)和重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個結構域，CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(本文縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域(CL1)。VH和VL區可以進一步細分為高變區，稱為互補決定區(CDR)，散佈著更保守的區域(稱為框架區(FR))。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，從胺基端到羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在本發明的不同實施例中，抗大ET-1抗體(或其抗原結合部分)的FR可能與人類生殖系序列相同，也可能是經天然或人工修飾的。胺基酸共有序列可以根據兩個或更多個CDR的並排分析來定義。如本文所用，術語「抗體」還包括完全抗體分子的抗原結合片段。如本文所用，術語抗體的「抗原結合部分」、抗體的「抗原結合片段」以及類似術語包括特異地結合抗原以形成複合物的任何天然存在的、酶可獲得的、合成的或經基因改造的多肽或醣蛋白。例如，抗體的抗原結合片段可以使用任何合適的標準技術(諸如蛋白水解消化，或涉及操作與表現編碼抗體可變域和視情況恆定域的DNA的重組基因工程技術)從完整抗體分子衍生而來。這種DNA是已知的及/或很容易從例如商業來源、DNA庫(包括例如噬菌體抗體庫)獲得，或者可以被合成。DNA可以在化學上或透過使用分子生物學技術進行定序和操作，例如將一或多個可變域及/或恆定域排列成合適的構型，或引入密碼子、產生半胱胺酸殘基、修飾，添加或刪除胺基酸等。
如本文所用，「抗體片段」包括完整抗體的一部分，諸如例如抗體的抗原結合區或可變區。抗體片段的實例包括，但不限於Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv雙功能抗體、dAb片段、Fd'片段、Fd片段和經分離的互補決定區(CDR)區域，以及由抗體片段形成的三功能抗體、四功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子和多特異性抗體。Fv片段是免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區的組合，而ScFv蛋白是免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變區藉由肽連接子連接的重組單鏈多肽分子。在一些例示性實施例中，抗體片段包含足夠的親本抗體胺基酸序列，它是與親本抗體結合至相同抗原的片段；在一些例示性實施例中，片段以與親本抗體不相上下的親和力結合至抗原及/或與親本抗體競爭結合至抗原。可以藉由任何方式製造抗體片段。例如，抗體片段可以藉由完整抗體的破裂以酶或化學方式產生，及/或它可以從編碼部分抗體序列的基因重組產生。或者或另外，抗體片段可以全部或部分地以合成方式產生。抗體片段可視情況包含單鏈抗體片段。或者或另外，抗體片段可包含例如藉由雙硫鍵聯連接在一起的多條鏈。抗體片段可視情況包含多分子複合物。功能性抗體片段通常包含至少約50個胺基酸並且更通常包含至少約200個胺基酸。
術語「雙特異性抗體」(bsAb)包括能夠選擇性結合兩個或更多個表位的抗體。雙特異性抗體通常包含兩條不同的重鏈，其中每條重鏈特異地結合不同的表位，表位是在兩個不同的分子(例如抗原)上或在相同的分子(例如在相同的抗原)上。如果雙特異性抗體能夠選擇性結合兩個不同的表位(第一表位和第二表位)，則第一重鏈對第一表位的親和力通常比第一重鏈對第二表位的親和力低至少一個到兩個或三個或四個數量級，反之亦然。雙特異性抗體所辨識的表位可以在相同或不同的目標上(例如在相同或不同的蛋白質上)。例如，可以透過將辨識相同抗原的不同表位的重鏈予以組合來製得雙特異性抗體。例如，編碼辨識相同抗原的不同表位的重鏈可變序列的核酸序列可融合至編碼不同重鏈恆定區的核酸序列，並且此類序列可在表現免疫球蛋白輕鏈的細胞中表現。
典型的雙特異性抗體具有兩條重鏈，每條重鏈有三個重鏈CDR，然後是一個CH1域、鉸鏈、CH2域和CH3域；以及一條免疫球蛋白輕鏈，它們並未賦予抗原結合特異性，但可以與每條重鏈締合，或者可以與每條重鏈締合且可以結合重鏈抗原結合區所結合的一或多個表位，或者可以與每條重鏈結合且能夠使一或多條重鏈結合一或兩個表位。BsAb可分為兩大類，帶有Fc區(IgG樣)的和沒有Fc區的，後者通常小於包含Fc的IgG和IgG樣雙特異性分子。IgG-樣bsAb可以有不同的形式，諸如但不限於三功能抗體(triomab)、旋鈕入孔洞IgG (knobs into holes IgG，kih IgG)、crossMab、orth-Fab IgG、Dual-可變域Ig (DVD-Ig)、二合一或雙重作用Fab (DAF)、IgG單鏈Fv (IgG-scFv)或κλ體。非IgG樣的不同形式包括串聯scFv、雙功能抗體形式、單鏈雙功能抗體、串聯雙功能抗體(TandAb)、雙親和力重新定向分子(DART)、DART-Fc、奈米抗體或對接-鎖定方法產生的抗體(DNL) (Gaowei Fan, Zujian Wang & Mingju Hao, Bispecific antibodies and their applications, 8 JOURNAL OF HEMATOLOGY & ONCOLOGY 130；Dafne Müller & Roland E. Kontermann, Bispecific Antibodies, HANDBOOK OF THERAPEUTIC ANTIBODIES 265-310 (2014)，其以全文引用的方式併入本文)。生產bsAb的方法不限於基於兩種不同融合瘤細胞株進行體細胞融合的四融合瘤技術、涉及化學交聯劑的化學接合，以及採用重組DNA技術的遺傳方法。
如本文所用，術語「多特異性抗體」是指對至少兩種不同抗原具有結合特異性的抗體。雖然此類分子通常將僅結合兩個抗原(即雙特異性抗體，bsAb)，但本文揭示的系統和方法也可以處理具有額外特異性的抗體，例如三特異性抗體和KIH三特異性抗體。
如本文所用，術語「單株抗體」不限於透過融合瘤技術產生的抗體。單株抗體可以透過本技術領域中可用或已知的任何方式衍生自單一殖株，包括任何真核、原核或噬菌體殖株。可使用本技術領域中已知的廣泛多種技術製備可用於本發明的單株抗體，包括使用融合瘤、重組和噬菌體展示技術或其組合。
如本文所用，術語「宿主細胞蛋白質」(HCP)包括衍生自宿主細胞的蛋白質。宿主細胞蛋白質可以是一種與製程相關的雜質，其可能衍生自製程且可包括三大類：細胞基質衍生的、細胞培養衍生的和下游衍生的。細胞基質衍生的雜質包括但不限於衍生自宿主生物體的蛋白質和核酸(宿主細胞基因體、載體或總DNA)。細胞培養衍生的雜質包括，但不限於誘導劑、抗生素、血清和其他培養基組分。下游衍生的雜質包括，但不限於酶、化學和生化處理試劑(例如溴化氰、胍、氧化劑和還原劑)、無機鹽(例如重金屬、砷、非金屬離子)、溶劑、載劑、配體(例如單株抗體)和其他可滲出物(leachable)。在一些例示性實施例中，組成物中與製程相關的HCP雜質類型可能有至少兩種。
在一些例示性實施例中，樣品可包含至少一種高豐度蛋白質或肽和至少一種HCP。在一些例示性實施例中，至少一種高豐度蛋白質或肽的濃度可以比至少一種HCP的濃度高至少約1000倍、約10,000倍、約100,000倍或約1,000,000倍。表示相對濃度的另一種方式例如是呈百萬分之一(ppm)。應該理解的是，當在包括高豐度蛋白質或肽(諸如治療性蛋白質)的樣品中使用ppm來描述低豐度蛋白質或肽(諸如HCP)的濃度時，ppm是相對於高豐度蛋白質或肽的濃度所測得的。在一些例示性實施例中，至少一種HCP的濃度可以小於約1000 ppm、小於約100 ppm、小於約10 ppm或小於約1 ppm。
如本文所用，術語「序列變體蛋白」(SV蛋白)包括具有無意取代的胺基酸的任何蛋白。例如，如圖15中所示，SV蛋白內的無意胺基酸取代可能由編碼序列中的至少一個DNA突變、從DNA到mRNA的轉錄錯誤、從mRNA到蛋白質序列的轉譯錯誤或其組合所引起。正如文獻中所回顧的，由於DNA複製和蛋白質生物合成過程中的保真度有限，意外的胺基酸取代會以自發的方式自然發生在任何自然生物系統中。然而，在正常的生物系統中，這種自發錯誤發生的可能性預期極低，DNA複製期間的範圍為10
-11-10
-8，mRNA轉錄期間為10
-6- 10
-4，而蛋白質轉譯期間為10
-5‐ 10
-4。在像是大腸桿菌的原核系統中，相對於其天然形式，轉譯錯誤可能更高，高達10
-3或0.1%的SV。由於事件的自發性，這些由轉錄或轉譯錯誤引起的極低量SV通常是不可避免的，因此可以被視為蛋白質表現時的生物噪聲。優化不足的重組蛋白生產系統可能會增加SV蛋白，例如藉由包含稀有密碼子序列或作為胺基酸耗盡的結果。
在一些例示性實施例中，樣品可包含至少一種高豐度非SV蛋白或肽以及至少一種SV蛋白。在一些例示性實施例中，至少一種高豐度非SV蛋白或肽的濃度可能比至少一種SV蛋白的濃度高至少約1000倍、約10,000倍、約100,000倍或約1,000,000倍。表示相對濃度的另一種方式例如是呈百萬分之一(ppm)。應理解的是，當在包括高豐度非SV蛋白或肽(例如治療性蛋白質)的樣品中使用ppm來描述低豐度蛋白質或肽(例如SV蛋白)的濃度時，ppm是相對於高豐度非SV蛋白質或肽的濃度進行測量。在一些例示性實施例中，至少一種SV蛋白的濃度可以小於約1000 ppm (例如0.1%)、小於約100 ppm (例如0.01%)、小於約10 ppm (例如0.001%)，或小於約1 ppm (例如0.0001%)。
雖然本發明主要涉及HCP和SV，但應理解，本發明的方法和系統可用於在樣品中鑑定並定量任何低豐度肽或蛋白質。
如本文所用，「蛋白質製藥產品」或「生物製藥產品」包括在性質上可以是完全或部分生物學的活性成分。在一個態樣中，蛋白質製藥產品可包含肽、蛋白質、融合蛋白、抗體、抗原、疫苗、肽-藥物結合物、抗體-藥物結合物、蛋白質-藥物結合物、細胞、組織、或其組合。在另一個態樣中，蛋白質製藥產品可以包含肽、蛋白質、融合蛋白、抗體、抗原、疫苗、肽-藥物結合物、抗體-藥物結合物、蛋白質-藥物結合物、細胞、組織或其組合的重組、經改造、經修飾、經突變或經截短形式。
如本文所用，「樣品」可獲自生物製程的任何步驟，諸如細胞培養液(CCF)、收取的細胞培養液(HCCF)、下游處理中的任何步驟、原料藥(DS)或包含最終配製產品的藥物產品(DP)。在一些特定的例示性實施例中，樣品可以選自澄清、層析生產或過濾的下游製程的任何步驟。在一些特定的例示性實施例中，藥物產品可以選自在臨床、運輸、儲存或處理時製造的藥物產品。
如本文所用，術語「固態載體」可包括具有結合蛋白質或肽的能力的任何表面。固態載體的非限制性實例可以包括親和力樹脂、珠粒和經包覆的盤或微量盤。固態載體可以附接到能夠結合至蛋白質或肽的分子(包括親和力試劑、抗原結合分子或交互作用肽配體)。在一些例示性實施例中，固態載體包含附接至交互作用肽配體的珠粒。在一些例示性實施例中，固態載體包含ProteoMiner™珠粒。
在一些例示性實施例中，可以在LC-MS分析之前製備樣品。製備步驟可包括變性、烷基化、稀釋和消化。
如本文所用，術語「蛋白質烷基化劑」或「烷基化劑」是指用於將蛋白質中的某些游離胺基酸殘基烷基化的試劑。蛋白質烷基化劑的非限制性實例是碘乙醯胺(IOA/IAA)、氯乙醯胺(CAA)、丙烯醯胺(AA)、N-乙基馬來醯亞胺(NEM)、甲硫代磺酸甲酯(MMTS)和4-乙烯基吡啶或其組合。
如本文所用，「蛋白質變性」或「變性」可指分子的三維形狀從其天然狀態改變的一個過程。可以使用蛋白質變性劑進行蛋白質變性。蛋白質變性劑的非限制性實例包括加熱、高或低pH值、還原劑(像是DTT)或暴露於離散劑。幾種離散劑可用作蛋白質變性劑。離散溶質透過干擾由諸如氫鍵、凡得瓦力和疏水作用的非共價力媒介的分子內交互作用來增加系統的熵。離散劑的非限制性實例包括丁醇、乙醇、氯化胍、高氯酸鋰、乙酸鋰、氯化鎂、苯酚、丙醇、十二烷基硫酸鈉、硫脲、N-月桂醯基肌胺酸、脲及其鹽。
如本文所用，術語「消化」是指水解蛋白質的一或多個肽鍵。有幾種方法使用適當的水解劑對樣品中的蛋白質進行消化，例如酶消化或非酶消化。將蛋白質消化成組成肽可以產生「肽消化物」，可以使用肽圖分析法進一步分析。
如本文所用，術語「消化酶」是指可以進行蛋白質消化的大量不同試劑中的任何一種。可進行酶消化的水解劑的非限制性實例包括齋藤麴菌(Aspergillus Saitoi)的蛋白酶、彈性蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶XIII、胃蛋白酶、胰蛋白酶、Tryp-N、胰凝乳蛋白酶、麴黴蛋白酶I、LysN蛋白酶(Lys-N)、LysC內切蛋白酶(Lys-C)、內切蛋白酶Asp-N (Asp-N)、內切蛋白酶Arg-C (Arg-C)、內切蛋白酶Glu-C (Glu-C)或外膜蛋白T (OmpT)、化膿鏈球菌的免疫球蛋白降解酶(IdeS)、嗜熱菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈黴蛋白酶、V8蛋白酶或其生物活性片段或同源物，或其組合。有關討論蛋白質消化可用技術的最新評論，參見Switazar
et al., “Protein Digestion: An Overview of the Available Techniques and Recent Developments” (Linda Switzar, Martin Giera & Wilfried M. A. Niessen, 12 JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH 1067-1077 (2013))。
傳統方法使用消化酶，其條件和濃度足以在LC-MS分析之前完全消化樣品中的所有蛋白質。本發明出乎意料發現到，可以透過有限消化來增進低豐度蛋白質(諸如HCP)的鑑定和定量，這意味著在樣品中的蛋白質未被完全消化的條件下使用消化酶。在一些例示性實施例中，蛋白質在沒有預先變性的情況下進行消化，表示「自然消化」是對天然折疊的蛋白質進行的。在一些例示性實施例中，選定消化酶與受質的比例以確保有限消化。在一些例示性實施例中，消化酶與受質的比例小於約1：100、小於約1：200、小於約1：300、小於約1：400、小於約1：500、小於約1：600、小於約1：700、小於約1：800、小於約1：900、小於約1：1000、小於約1：2000、小於約1：3000、小於約1：4000、小於約1：5000、小於約1：6000、小於約1：7000、小於約1：8000、小於約1：9000、小於約1：10000、約1：400、約1：1000、約1：2500，或者約1：10000。
如本文所用，術語「蛋白質還原劑」或「還原劑」是指在蛋白質中用於還原雙硫橋的試劑。用於還原蛋白質的蛋白質還原劑的非限制性實例是二硫蘇糖醇(DTT)、β-巰基乙醇、埃爾曼試劑(Ellman’s reagent)、鹽酸羥胺、氰基硼氫化鈉、參(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP-HCl)或其組合。
如本文所用，術語「液相層析法」是指一種過程，其中液體攜帶的生物及/或化學混合物可以因為組分流過(或流入)靜止液相或固相時的差異分佈而被分離。液相層析法的非限制性實例包括逆相液相層析法、離子交換層析法、尺寸排阻層析法、親和力層析法、疏水交互作用層析法、親水交互作用層析法或混合模式層析法。在一些態樣中，可以對樣品或析出液進行任何一種上述層析法或其組合。
如本文所用，術語「質譜儀」包括能夠鑑定特定分子種類並測量其準確質量的裝置。術語旨在包括任何多肽或肽可在其中進行特徵鑑定的分子偵測器。質譜儀可包括三個主要部分：離子源、質量分析器和偵測器。離子源的作用是產生氣相離子。分析物原子、分子或簇可以轉移到氣相中並同時(如電灑游離)或透過單獨的過程被游離。離子源的選擇取決於應用。
質譜儀可以耦合到液相層析法-多反應監測系統。更普遍來說，質譜儀可能能夠藉由選擇反應監測(SRM)進行分析，包括連續反應監測(CRM)和平行反應監測(PRM)。
如本文所用，「多反應監測」或「MRM」是指一種基於質譜法的技術，其可以精確定量複合基質中的小分子、肽與蛋白質，具有高靈敏度、特異性和廣泛動態範圍(Paola Picotti & Ruedi Aebersold, Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions, 9 NATURE METHODS 555-566 (2012))。MRM通常可以使用三重四極質譜儀進行，其中在第一個四極中選擇對應於所選小分子/肽的前驅離子，並在第三個四極中選擇前驅離子的裂解離子進行監測(Yong Seok Choi et al., Targeted human cerebrospinal fluid proteomics for the validation of multiple Alzheimers disease biomarker candidates, 930 JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B 129-135 (2013))。
SRM/MRM/選定離子監測(SIM)是串聯質譜法中使用的一種方法，其中在串聯質譜儀的第一階段選擇特定質量的離子，並在第二個質譜儀階段選擇前驅離子裂解反應的離子產物進行偵測。可以執行MRM/SRM/SIM的三重四極質譜儀(TQMS)的實例包括但不限於QTRAP® 6500 System (Sciex)、QTRAP® 5500 System (Sciex)、Triple QTriple Quad 6500 System (Sciex)、Agilent 6400 Series Triple Quadrupole LC/MS系統以及Thermo Scientific™ TSQ™ Triple Quadrupole系統。
除了MRM之外，還可以透過平行反應監測(PRM)對肽的選擇進行定量。PRM是SRM的應用，使用高分辨率質譜儀在單個分析中平行偵測所有躍遷率。PRM提供高選擇性、高靈敏度和高通量來定量選定的肽(Q1)，從而定量蛋白質。可為每種蛋白質特異地選擇多種肽。PRM方法學可以使用質譜儀的四極來分離目標前驅離子，在碰撞池中裂解靶定的前驅離子，然後在Orbitrap質量分析器中偵測生成的產物離子。PRM可以使用四極飛行時間(QTOF)或混合四極軌道阱(QOrbitrap)質譜儀進行肽及/或蛋白質的鑑定。QTOF的實例包括但不限於TripleTOF® 6600 System (Sciex)、TripleTOF® 5600 System (Sciex)、X500R QTOF System (Sciex)、6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent)和Xevo G2-XS QT of Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry (Waters)。QObitrap的實例包括但不限於Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap 質譜儀(Thermo Scientific)和Orbitrap Fusion™ Tribrid™ (Thermo Scientific)。
PRM的非限制性優勢包括：消除大多數干擾；提供更高的準確度和阿莫耳級(attomole-level)的偵測和定量極限；利用光譜庫匹配能夠自信地確認肽屬性；由於不需要預先選擇目標躍遷，因此減少了分析開發時間；並利用光譜多工和進階信號處理來確保與UHPLC相容的數據擷取速度。
本件申請案的方法或系統中的質譜儀例如可以是電灑游離質譜儀、奈米電灑游離質譜儀或三重四極質譜儀，其中質譜儀可以耦合至液相層析系統，其中質譜儀能夠進行LC-MS (液相層析法-質譜法)或LC-PRM-MS (液相層析法-平行反應監測-質譜法)分析。在一些例示性實施例中，肽的鑑定是使用PRM-MS進行的。
在一些例示性實施例中，質譜儀可以是串聯質譜儀。如本文所用，術語「串聯質譜法」包括其中藉由使用質量選擇和質量分離的多個階段獲得有關樣品分子的結構資訊的技術。一個先決條件是樣品分子被轉化為氣相並被游離，以便在第一個質量選擇步驟之後以可預測和可控的方式形成碎片。MS/MS或MS2可以透過首先選擇和分離前驅離子(MS1)，然後將其碎裂以獲得有意義的資訊來執行。串聯MS已成功地與各種分析儀組合一起執行。為特定應用組合使用哪些分析儀取決於許多不同的因素，諸如靈敏度、選擇性和速度，還有尺寸、成本和可用性。串聯MS方法的兩個主要類型是空間串聯和時間串聯，但也有時間串聯分析儀與空間或與空間串聯分析儀耦合的混合方法。空間串聯質譜儀包含離子源、前驅離子活化裝置和至少兩個非捕獲質量分析器。可以設計特定的m/z分離功能，以便在儀器的一個部分中選擇離子、在中間區域解離，然後將產物離子傳輸到另一台分析儀進行m/z分離和數據擷取。在時間串聯中，離子源中產生的質譜儀離子可以在同一物理設備中被捕獲、分離、碎裂和m/z分離。
質譜儀所鑑定的肽可用作完整蛋白質及其轉譯後修飾的替代物代表。它們可用於藉由使實驗和理論MS/MS數據產生關連性來對蛋白質進行特徵鑑定，理論MS/MS數據是從蛋白質序列數據庫中可能的肽生成的。特徵鑑定包括但不限於對蛋白質片段的胺基酸進行定序、確定蛋白質定序、確定蛋白質從頭定序、定位轉譯後修飾或識別轉譯後修飾，或可比性分析或其組合。
在一些例示性態樣中，質譜儀可以根據奈米電灑或奈米噴灑來運作。如本文所用，術語「奈米電灑」或「奈米噴灑」是指在非常低的溶劑流速下進行電灑游離，通常為每分鐘數百奈升的樣品溶液或更低，通常不使用外部溶劑輸送。形成奈米電灑的電灑輸送裝置可以使用靜態奈米電灑發射器或動態奈米電灑發射器。靜態奈米電灑發射器在一段較長時間內對少量樣品(分析物)溶液體積進行連續分析。動態奈米電灑發射器使用毛細管柱和溶劑輸送系統在質譜儀分析之前對混合物進行層析分離。
如本文所用，術語「數據庫」是指樣品中可能存在的蛋白質序列的彙整集合，例如呈FASTA格式的檔案形式。相關的蛋白質序列可能衍生自正在研究中的物種的cDNA序列。可用於檢索相關蛋白質序列的公共數據庫包括由例如Uniprot或Swiss-prot提供支援的數據庫。可以使用本文中稱為「生物資訊學工具」的數據庫。生物資訊學工具能夠針對數據庫中的所有可能序列檢索未解釋的MS/MS譜圖，並提供已解釋(註釋)的MS/MS譜圖作為輸出。此類工具的非限制性例示包括Mascot (www.matrixscience.com)、Spectrum Mill (www.chem.agilent.com)、PLGS (www.waters.com)、PEAKS (www.bioinformaticssolutions.com)、Proteinpilot (download.appliedbiosystems.com/proteinpilot)、Phenyx (www.phenyx-ms.com)、Sorcerer (www.sagenresearch.com)、OMSSA (www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/)、X!Tandem (www.thegpm.org/TANDEM/)、Protein Prospector (prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm)、Byonic (www.proteinmetrics.com/products/byonic)或Sequest (fields.scripps.edu/sequest)。
應理解，本發明不限於任何上述蛋白質、治療性蛋白質、抗體、重組蛋白、宿主細胞蛋白質、序列變體蛋白質、蛋白質製藥產品、樣品、固態載體、蛋白質烷基化劑、蛋白質變性劑、蛋白質還原劑、消化酶、層析方法、質譜儀、數據庫、生物資訊學工具、pH範圍或值、溫度或濃度，以及任何蛋白質、治療性蛋白質、抗體、重組蛋白、宿主細胞蛋白質、序列變體蛋白質、蛋白質製藥產品、樣品、固態載體、蛋白質烷基化劑、蛋白質變性劑、蛋白質還原劑、消化酶、層析方法、質譜儀、數據庫、生物資訊學工具、pH值、溫度或濃度可以透過任何合適的方式來選定。
參考以下實例將更為充分地理解本發明。然而，它們不應被解釋為限制本發明的範疇。
實例 實例 1 至 3 的材料與方法 材料
ProteoMiner™ Protein Enrichment套組購自Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA)。ProteoMiner™技術是一種樣品製備工具，用於壓縮生物樣品中的蛋白質濃度動態範圍。一個大型組合式六肽配體庫被固定在珠粒上以捕獲各種蛋白質。ProteoMiner™離心管柱含有500 µl珠粒漿液(4%微珠，20% v/v乙醇水溶液)和20 µl沉降珠粒體積。套組的洗滌緩衝液含有50 mL PBS (磷酸鹽緩衝鹽水、150 mM NaCl、10 mN NaH2PO4，pH 7.4)。套組的溶析緩衝液含有凍乾脲CHAPS (8M脲，2% CHAPS；CHAPS清潔劑是3-((3-膽醯胺基丙基)二甲基氨基)-1-丙磺酸鹽)。套組的復水緩衝液含有5%乙酸。
LC-MS級層析溶劑購自Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)。單株抗體由Regeneron (Tarrytown, NY)生產。去氧膽酸鈉(SDC)、月桂醯基肌胺酸鈉(SLS)和氯乙醯胺(CAA)購自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。參-(2-羧基乙基)膦(TCEP)購自Thermo Fisher Scientific。RM 8670 (NISTmAb，NIST單株抗體標準品，在鼠類細胞株中表現)獲自National Institute of Standards and Technology (NIST, Gaithersburg, MD)。
使用 ProteoMiner™ Protein Enrichment Kit 進行蛋白質富集
ProteoMiner™ Protein Enrichment套組用於富集樣品中的蛋白質。五個實驗使用一個小規模的ProteoMiner™盒。用套組中提供的200 µL洗滌緩衝液洗滌ProteoMiner™珠粒兩次。用200 µL水重新懸浮珠粒，並將40 µL珠粒漿液轉移到試管中進行一項實驗。mAB DS或NISTmAb用水稀釋，然後使用25 mM pH 4.0乙酸鈉將溶液的pH值調節至pH 6。將樣品添加到ProteoMiner™珠粒漿液中，在室溫下旋轉培育兩小時。然後將樣品混合物裝入帶有玻璃料(frit)的管尖。藉由在1000 ×g下離心1分鐘去除上清液。隨後，藉由將100 µL洗滌緩衝液添加到管尖中來洗滌珠粒，然後在200 xg下離心一分鐘三次。最後，使用10 µL PTS緩衝液(12 mM SDC、12 mM SLS、10 mM TCEP和30 mM CAA)溶析經富集的蛋白質，繼而在200 xg下離心一分鐘三次。
有關本發明的經優化ProteoMiner有限消化方法，減少了含有經富集蛋白質的收集析出液。減少的蛋白質以酶與受質的比例為1：400在28℃下消化過夜，以獲得含有肽混合物的溶液。然後將肽混合物進行還原、變性和烷基化。
使用10 µL 10% TFA酸化含有肽混合物的溶液以沉澱SDC和SLS。隨後，將含有肽混合物的溶液以14,000 rcf離心二十分鐘。接著使用GL-Tip GC脫鹽管尖對含有肽混合物的上清液進行脫鹽，並使用SpeedVac予以乾燥。
LC-MS/MS 分析
從ProteoMiner™有限消化富集獲得的脫鹽肽混合物被乾燥並重新懸浮在30 µL的0.1%甲酸(FA)溶液中。將5 μL含有肽混合物的溶液注入低流速液相層析系統，例如耦合至Q-Exactive HFX質譜儀(Thermo Fisher Scientific)的UltiMate™3000 RSLCnano系統(Thermo Fisher Scientific)。在25 cm C18 管柱(內徑0.075 mm，2.0 μm，100 Å，Thermo Fisher Scientific)上分離肽。流動相緩衝液含有具0.1% FA的超純水(緩衝液A)，而溶析緩衝液含有0.1% FA的80%乙腈(ACN) (緩衝液B)。使用2-25%緩衝液B的100分鐘線性梯度以300 nL/分鐘的流速溶析肽。質譜儀以數據相關模式運行。針對在120,000分辨率(自動增益控制(AGC)目標3e6，60 ms最大注射時間，m/z 375-1500)的各個完整MS掃描和在30,000分辨率的MS/MS事件(AGC目標1e5，60 ms最大注射時間，m/z 200-2000)，十個最強的離子進行高能碰撞解離(HCD)碎裂，標準化碰撞能量(NCE)為27%。MS蛋白質體學數據已經由JPOST儲存庫保存到ProteomeXchange Consortium，計畫登錄號為PXD016194。
實例 1. 消化方法的比較
將前述用於HCP鑑定的ProteoMiner™方法(Chen
et al.) (「直接消化方法」)與各種替代技術進行了比較，以在包含至少一種高豐度蛋白質或肽的樣品中優化宿主細胞蛋白質(HCP)和其他低豐度蛋白質的偵測結果。直接消化方法包括將包含至少一種高豐度蛋白質或肽的樣品與固態載體(諸如珠粒)接觸的步驟，其中交互作用肽配體已附接在固態載體上，而HCP雜質可以結合至交互作用肽配體(例如ProteoMiner™珠粒)；使用包含表面活性劑的溶液洗滌固態載體來富集HCP雜質並提供析出液；使析出液進行變性、烷基化與還原；使經變性、烷基化和還原的析出液進行酶消化反應以產生經富集HCP雜質的組分；使用質譜儀鑑定經富集HCP雜質的組分；以及使用已鑑定的組分來鑑定經富集的HCP雜質。
另一種方法是珠粒上的自然消化方法，其中HCP雜質在從固態載體溶析之前進行酶消化。另一種替代方法是「溶析溫和變性消化」或「有限消化」，其中HCP雜質被溶析；使用較低比例的消化酶與受質進行有限消化；進行還原、變性和烷基化；以及接著使用質譜儀進行分析。有限消化方法的例示性工作流程如圖1中所示。
根據這三種替代技術在單株抗體原料藥(mAb DS)樣品中鑑定HCP的能力，以及在mAb DS樣品中鑑定被摻入UPS2蛋白的能力，對這三種技術進行了比較。UPS2是一種市售的蛋白質體學標準品，包含48種人類蛋白質，濃度動態範圍廣泛，橫跨多個數量級。如表1和圖2中所示，ProteoMiner™有限消化是最靈敏的方法。
表1. 消化方法的比較結果
實例 2. 參數優化
| ProteoMiner + 消化法 | 宿主細胞蛋白質的數量 | 2.14‐16.58 ppm | 0.16‐1.5 ppm | 0.02‐0.14 ppm | UPS2的數量 0.02‐0.14 ppm |
| 直接消化 | 90 | 8/8 | 8/8 | 5/8 | 5 |
| 在珠粒上的自然消化 | 40 | 8/8 | 6/8 | 1/8 | 1 |
| 溶析有限消化 | 139 | 8/8 | 7/8 | 8/8 | 8 |
基於如實例1中所示有限消化ProteoMiner™方法對低豐度蛋白質鑑定的有效性，進一步優化此方法。此方法是在降低胰蛋白酶：消化受質的比例的情況下進行，並比較了HCP和UPS2蛋白鑑定結果的靈敏度。先前描述的方法使用比例為1：20的酶：受質。如表2和圖3中所示，發現到比例為1：400的酶：受質是最為有效的。
表2. 消化酶：受質比例的比較結果
| mAb：胰蛋白酶比例 | 宿主細胞蛋白質的數量 | 1.07‐8.29 ppm | 0.08‐0.75 ppm | 0.01‐0.07 ppm | UPS2的數量 0.01‐0.07 ppm |
| 1:20 | 78 | 8/8 | 8/8 | 3/8 | 3 |
| 1:400 | 118 | 8/8 | 7/8 | 5/8 | 5 |
| 1:1000 | 91 | 8/8 | 7/8 | 5/8 | 5 |
| 1:2500 | 92 | 8/8 | 7/8 | 4/8 | 4 |
| 1:10000 | 44 | 8/8 | 7/8 | 0/8 | 0 |
儘管不受理論所束縛，咸信更為有限的消化可能在樣品中導致高豐度蛋白質的消化不成比例地減少，進一步降低經消化肽的動態範圍並允許更有效地測量低豐度蛋白質。對蛋白質樣品進行自然消化而不變性，有助於更有限的消化，就像對蛋白質樣品進行較低比例的消化酶與受質的消化一樣(Huang
et al.)。
透過比較變性試劑的濃度範圍來進一步優化本發明的方法。如表3和圖4中所示，發現到12 mM的SLS/SDC濃度對HCP和UPS2蛋白鑑定最為有效。
表3. 變性劑濃度的比較結果
| SLS/SDC濃度 | 宿主細胞蛋白質的數量 | 1.07‐8.29 ppm | 0.08‐0.75 ppm | 0.01‐0.07 ppm | UPS2的數量 0.01‐0.07 ppm |
| 12 mM | 115 | 8/8 | 7/8 | 6/8 | 6 |
| 4 mM | 104 | 8/8 | 7/8 | 5/8 | 5 |
| 2.4 mM | 91 | 8/8 | 7/8 | 5/8 | 5 |
將這些經過優化的條件用於進一步的實驗。
實例 3. 用經優化的 ProteoMiner
™ 方法的案例研究
與前述ProteoMiner™方法相比，在將UPS2摻入mAb DS樣品中的情況下使用實例2中所述的經優化方法。如圖5中所示，與前述方法相比，本發明的經優化方法在鑑定低豐度UPS2蛋白方面具有更高的有效性。表1-3右側的UPS2列代表直接消化的UPS2標準品且未摻入mAb DS中，作為儀器偵測極限的對照品。
兩種方法都在1-4 ppm含量下鑑定出所有摻入蛋白質。在0.1-1 ppm含量下，前述的ProteoMiner™方法鑑定出8/8的摻入蛋白質，而經優化的ProteoMiner™有限消化方法鑑定出7/8。在0.01-0.07 ppm含量下，前述的ProteoMiner™方法鑑定出3/8的摻入蛋白質，而經優化的ProteoMiner™有限消化方法鑑定出8/8。在0.001-0.006 ppm含量下，前述的ProteoMiner™方法鑑定出0/8的摻入蛋白質，而經優化的ProteoMiner™有限消化方法鑑定出3/8。
在有和沒有摻入UPS2的情況下，使用mAb DS作為樣品，將本發明的經優化方法進一步與習知方法進行比較。所比較的習知方法包括免疫沉澱、過濾、單獨有限消化和前述ProteoMiner™方法。如圖6中所示，在沒有摻入UPS2的mAb DS中，本發明的經優化方法比任何其他方法都更為有效鑑定HCP。如圖7中所示，在摻入UPS2的mAb DS中，本發明的經優化方法比任何其他方法都更為有效鑑定UPS2蛋白。在圖7中，第一列代表要鑑定的UPS2蛋白總數量，第二列代表在0.1875 ppm下鑑定的UPS2蛋白數量，總共八個。本發明的經優化方法在這個濃度下鑑定到8/8個UPS2蛋白。
使用NIST mAb標準品作為樣品，將本發明的經優化方法進一步與前述方法進行比較。所比較的習知方法包括正常消化、自然消化、使用ProA珠粒的自然消化和場不對稱離子遷移率光譜法(FAIMS)、過濾和前述的ProteoMiner™方法。將使用本發明方法在NIST mAb樣品中鑑定的HCP數量與根據先前出版刊物使用習知方法鑑定的HCP數量進行比較。如圖8中所示，本發明的方法在NIST mAb樣品中於鑑定HCP方面比任何先前揭示的方法都更為有效。
實例 4 至 6 的材料與方法 材料
層析溶劑為LC-MS級，購自Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)。mAb和被摻入的CHO蛋白由Regeneron (Tarrytown, NY)生產。去氧膽酸鈉(SDC)、月桂醯基肌胺酸鈉(SLS)、碘乙醯胺、脲、10× Tris緩衝鹽水、乙酸銨、油酸和油酸-
13C
18(CAS編號287100-82-7)購自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)。超精製PS80是購自Croda (East Yorkshire, UK)。二硫蘇糖醇購自Thermo Fisher Scientific。人類棕櫚醯基蛋白硫酯酶1 (hPPT1)和人類LPL是購自Abcam。CHO LAL、CHO補體組分1r (C1r-A)、CHO酸性神經醯胺酶(ASAH1)、CHO β-2-微球蛋白、CHO羧肽酶、CHO組織蛋白酶D和CHO組織蛋白酶Z是由Regeneron Pharmaceuticals內部合成。
內部標準品以及標準品曲線製備
將八種重組蛋白(LAL、LPL、C1r-A、ASAH1、β-2-微球蛋白、羧肽酶、組織蛋白酶D和組織蛋白酶Z)溶解在水中作為原液，最終濃度為100 ng/µL。將原液進一步稀釋為1 ng/µL和10 ng/µL，並摻入抗體基質(mAb-1)中以製備具有以下濃度的標準曲線：0.05 ppm、0.1 ppm、0.5 ppm、1 ppm、2 ppm和5 ppm。QC蛋白是從單獨的重組蛋白混合物(7 ng/µL組織蛋白酶Z、17 ng/µL組織蛋白酶D、35 ng/µL LAL、87 ng/µL羧肽酶和175 ng/µL LPL)製備的，並摻入mAb-1以獲得0.2 ppm組織蛋白酶Z、0.5 ppm組織蛋白酶D、1 ppm LAL、2.5 ppm羧肽酶和5 ppm LPL。將經重同位素標記的假定類磷脂酶B2 (hPLBD2)稀釋至5 ng/µL，並以5 ppm摻入到每個樣品中。
以1 ng/µL和5 ng/µL的濃度製備兩種重組蛋白(LAL和hPPT1)的原液，並將其摻入抗體基質(mAb-2)中以製備具有以下濃度的標準曲線：0.1 ppm、0.5 ppm、1 ppm、2 ppm、5 ppm，10 ppm和20 ppm。經重同位素標記的hPLBD2被稀釋至5 ng/µL，並以5 ppm摻入到每個樣品中。使用相同的抗體基質測量mAb-18和mAb-19中的PPT-1與LAL。
使用 PMLD 方法製備樣品
首先透過ProteoMiner富集結合有限消化(PMLD)來富集宿主細胞蛋白質。ProteoMiner珠粒依序用洗滌緩衝液和水洗滌，然後懸浮在水中。將總共15 mg mAb在水中稀釋或濃縮至50 mg/mL，調節至pH 6並添加到ProteoMiner珠粒漿液中。每個樣品在室溫下旋轉培育2.5小時，然後裝入內部製造的帶有9.5 mm孔徑玻璃料的管尖上。接著清洗珠粒，並藉由添加10 µL溶析緩衝液(12 mM SDC和12 mM SLS)將經富集的蛋白質溶析三次。繼而藉由添加75 ng胰蛋白酶的經改良有限消化進一步製備收集的析出液，之後在28℃下消化過夜。消化後的樣品在90℃下還原20分鐘，並在室溫下烷基化又再20分鐘。用10% TFA將肽混合物酸化至pH 2-3，以在酸性溶液中沉澱mAb、SDC和SLS。然後將混合物以14,000 rcf離心10分鐘。收集含有肽的上清液並用GL-Tip GC脫鹽管尖脫鹽，乾燥且重新懸浮於0.1% FA中用於nano-LC-MS/MS分析。
非靶向 nanoLC-MS/MS 和靶向平行反應監測分析
將肽混合物注入與Orbitrap Exploris 480質譜儀(Thermo Fisher Scientific)耦合的UltiMate™ 3000 RSLCnano系統。將肽混合物裝到20 cm × 0.075 mm Acclaim PepMap 100 C18捕集管柱(Thermo Fisher Scientific)上進行脫鹽，然後在25 cm × 75 µm ID × 1.7 µm C18一體式管柱(CoAnn Technologies)上分離。使用2%至32%溶劑B (含0.1%甲酸的乙腈)的150分鐘線性梯度以300 nL/min的流速來分離肽。在數據相關模式下運行的Orbitrap Exploris 480質譜儀(Thermo Fisher Scientific)用於非靶向HCP偵測。對於靶向PRM偵測，每個樣品都在PRM下進行分析，隔離窗口為2 m/z。在所有實驗中，相對於m/z 200 (標準化AGC目標(%) 300、20 ms最大注射時間，m/z 380-1600)，以60,000分辨率進行完整質譜，然後以15,000分辨率進行定時PRM掃描(標準化AGC目標(%) 100，60 ms最大注射時間)。HCD與30% NCE一起使用。
數據分析
使用Byonic軟體(4.1.10版)針對UniProt Cricetulus Griseus (2020版)檢索質譜原始檔案，沒有冗餘條目。質量公差設為10 ppm，而碎片質量公差設為20 ppm。檢索標準包括半胱胺酸的靜態脲基甲基化(+ 57.0214 Da)和甲硫胺酸殘基的可變氧化修飾(+15.9949 Da)。數據庫檢索是用胰蛋白酶消化進行的，最多有兩個遺漏的裂解。當至少發現兩個獨特的肽時，肯定是鑑定出HCP。PRM數據在Skyline (版本 21.1)中手動管理。
mAb-3 利用 2DLC-CAD 的 PS80 降解分析
進行了PS80降解分析。將含有0.1% PS80的mAb-3在水中稀釋至0.004%，然後注入2D HPLC-CAD系統。PS80滯留在Oasis Max管柱(2.1 × 20 mm，30 mm)上，由Acquity BEH C4管柱(2.1 × 50 mm，1.7 mm)分離，並用Corona Ultra CAD偵測器偵測。
調配藥物產品中 PS80 的加速水解
在mAb-3至mAb-15中進行PS80加速水解。將內部標準品油酸-
13C
18加入mAb，達到最終濃度為1 µg/mL，同時向mAb中加入10% PS80原液，達到最終濃度為1% PS80。所有樣品均在37℃下培育3或5天，並在培育前後收集各樣品10 µL用於油酸定量。
mAb 中的油酸定量
在mAb-3穩定性樣品中，PS80降解所釋出的油酸是藉由LC-MRM進行定量。將90 µL含有1 µg/mL油酸-
13C
18的80% IPA/20% MeOH的萃取緩衝液添加到10 µL的每個mAb-3穩定性樣品中，混合並在室溫下培育1小時。然後透過在25℃下以14,000 rcf 離心30分鐘沉澱蛋白質，並將40 µL含有油酸的上清液轉移到96孔盤中進行LC-MRM分析。以類似的方式用LC-MRM在mAb-3至mAb-15中定量透過PS80加速水解所釋出的油酸，除了萃取緩衝液含有80% IPA/20% MeOH而沒有在培育前後將內部標準品油酸-
13C
18添加至mAb-3至mAb-15樣品。藉由使用配備有Agilent 1290 Infinity UHPLC (Agilent, Wilmington, DE)的Agilent 6495 QQQ質譜儀監測峰281.2/281.2和299.2/299.2對油酸和油酸-
13C
18進行定量。在Skyline中進行峰積分，而油酸濃度是根據摻入油酸濃度圖相對於
所建立的校正曲線算出的。
透過 DS-1 至 DS-3 的完整質量分析進行 MY 剪切 (clipping) 測量
透過完整質量分析來鑑定和定量DS中胺基酸殘基甲硫胺酸和酪胺酸之間的剪切(MY剪切)。藉由將5 µg DS以0.25 µg/µL與4 µL的5×快速PNGase緩衝液(New England Biolabs)的混合物並在80℃下培育10分鐘來還原DS樣品。藉由將1 µL快速PNGase (New England Biolabs)添加到混合物中並在50℃下培育25分鐘來進行去醣基化。隨後，將2 µg的各個樣品注入LCMS系統，使用BioResolve RP mAb Polyphenyl管柱(2.7 µm, 2.1 mm × 50 mm)藉由逆相層析法分離，並用Waters G2S質譜儀進行偵測。MS數據在Waters的MassLynx軟體中進行分析。
實例 4. 透過 PMLC 非靶向 HCP 分析鑑定 HCP
使用ProteoMiner富集結合有限消化(PMLD)結合靶向PRM分析來定量低於ppm含量的HCP。與其他基於質譜法的定量方法相比，這種基於富集的靶向定量進一步將偵測提高到低至0.06 ppm，具有高準確度和高精確度。低偵測極限對於風險評估至關重要：發現0.13 ppm肝臟羧酯酶(CES)、2.48 ppm溶酶體酸性脂肪酶(LAL)、1.46 ppm棕櫚醯基蛋白硫酯酶1 (PPT-1)和0.5 ppm組織蛋白酶D對藥物產品穩定性具有負面影響，而發現0.5 ppm脂蛋白脂肪酶(LPL)、0.04 ppm CES、0.8 ppm LAL、0.49 ppm PPT-1和0.3 ppm組織蛋白酶D是安全的，使藥物產品保持2至3年的儲存期限。
不同PS降解酶(PSDE)的聚山梨醇酯(PS)降解能力通常是透過比較利用重組蛋白的摻入實驗中的活性來進行評估。然而，重組蛋白所觀察到的脂肪酶活性可能並不能代表內源性蛋白的活性。例如，從假定磷脂酶B樣2 (PLBD2)觀察到的PS降解可能是由於雜質而不是PLBD2本身。LPL是否可以降解PS仍然值得懷疑，因為低於1.5 ppm的重組CHO LPL和內源性LPL均未顯示任何脂肪酶活性。ProteoMiner富集加上有限消化(PMLD)加上靶向PRM分析，透過脂肪酶活性與DP中內源性PSDE濃度的相關性，提供了一種用於比較PSDE脂肪酶活性的定量方法。根據PSDE與脂肪酶活性之間的相關性，可以推斷出PS降解的主要原因。
利用PMLD對幾種內部mAb進行了HCP分析，以確定最適合PRM方法開發的基質。PMLD工作流程如圖9中所示。PMLD的偵測極限低至0.002 ppm。如圖10中所示，mAb-1被選作為標準曲線和QC的基質，因為它對八種摻入重組CHO蛋白標準品的干擾最小(≤ 10% LLOQ程度)。mAb-2被選作為PPT-1和LAL標準曲線的基質，因為它與mAb-18和mAb-19是相同的mAb，但不含PPT-1或LAL。mAb-3含有不等量的HCP，因此用於評估運行內再現性。mAb-4到mAb-16是具有不同脂肪酶活性程度的抗體，用於獲取脂肪酶或酯酶的生物學相關濃度。在mAb-3至mAb-10中導致PS80降解的脂肪酶是LAL。在mAb-11至mAb-17中導致PS80降解的酯酶是CES，在mAb-18和mAb-19中導致PS80降解的兩種脂肪酶是LAL和PPT-1。DS-1至DS-3是融合蛋白，用於評估組織蛋白酶D的生物學相關濃度。
實例 5. 用於 HCP 定量的 PMLD-PRM 方法開發
表4顯示了針對每個HCP挑選的用於靶向PRM定量的胰蛋白酶肽。挑選這些肽是因為它們顯示出高MS信號強度、沒有或很低的轉譯後修飾、沒有遺漏的裂解，並且對於每個CHO HCP都是獨一無二的。hPLBD2作為所有HCP定量的通用內部標準品。所選HCP肽的峰面積比(PAR)是藉由將hPLBD2肽的峰面積除以HCP肽峰面積而獲得的。PAR用於構建定量用校正曲線。每個單獨HCP使用PMLD方法的相對富集程度與同一mAb樣品中的hPLBD2不相上下，因為ProteoMiner是一種無偏差的富集方法。事實上，圖11A顯示在mAb-1中所有八種HCP的基於PRM的定量結果，範圍從0.05到5 ppm，遵循回歸係數(R
2)高於0.99的線性回歸方程式。這個發現表明，PMLD富集方法的動態範圍以及隨後的靶向PRM分析，適用於定量範圍低於ppm到低ppm含量的HCP。在mAb-2中對人類PPT-1和LAL進行了PMLD-PRM分析，範圍從0.1到20 ppm，以便測試PMLD-PRM分析是否可以應用於範圍更為廣泛的HCP。圖11B顯示對於人類PPT-1和LAL均觀察到線性回歸線，回歸係數(R
2)高於0.99。
表4. 各HCP以及hPLBD2在獵槍蛋白質體學分析中最常被鑑定出的HCP肽
| 宿主細胞蛋白質(HCP) | 用於PRM 分析的肽 |
| 脂蛋白脂肪酶(LPL) | GLGDVDQLVK |
| 補體組分1r (C1r-A) | SLSNGYLHYITTK |
| 酸性神經醯胺酶(ASAH1) | GQFESYLR |
| β-2-微球蛋白 | GILLDTSR |
| 羧肽酶 | EFSHITFLTIK |
| 溶酶體酸性脂肪酶(LAL) | VNVYTSHSPAGTSVQNLR |
| 組脂蛋白酶D | VSSLPSVTLK |
| 組織蛋白酶Z | GVNYASITR |
| 棕櫚醯基蛋白硫酯酶1 (PPT-1) | ETIPLQESTLYTEDR (CHO) ETIPLQETSLYTQDR (人類) |
| 假定類磷脂酶B2 (hPLBD2) | AFIPNGPSPGS R[+10] |
使用摻入mAb-1的五個QC標準品的混合物以三重複對PMLD-PRM方法的運行間再現性和定量準確性進行了評估。用不同濃度的五種HCP製備五種QC肽的混合物：0.2 ppm組織蛋白酶Z、0.5 ppm組織蛋白酶D、1 ppm LAL、2.5 ppm羧肽酶和5 ppm LPL。每個QC標準品的濃度是根據其在mAb-1中的豐度來選定的，將圖10中所示掃描，以及與藥物產品在生物學相關上的干擾降至最低。如表5中所示，五個HCP的QC肽的偵測準確性範圍為0.2 ppm至5 ppm，在理論值的85%至111%內，三重複的變化小於12%。定量結果基於從mAb-1中富集的各個HCP的肽，摻入各者的樣品以三重複進行分析。定量下限(LLOQ)範圍為0.06 ppm至0.66 ppm。
表5. 由五個HCP的摻入研究所證實的定量準確性
| 蛋白質名稱 | 摻入濃度 (ppm) | 測得濃度 (ppm) | % CV (N=3) | % 準確性 | 計算 LLOQ (ppm) |
| 組織蛋白酶Z | 0.2 | 0.17 | 11.8% | 15.0% | 0.06 |
| 組織蛋白酶D | 0.5 | 0.55 | 10.9% | 10.0% | 0.14 |
| LAL | 1 | 0.91 | 5.0% | 9.2% | 0.14 |
| 羧肽酶 | 2.5 | 2.58 | 8.5% | 3.2% | 0.66 |
| LPL | 5 | 5.36 | 4.5% | 7.2% | 0.43 |
使用mAb-3評估運行內再現性，其含有範圍從0.03 ppm到4.24 ppm的不等量HCP。mAb-3的三個生物複製品分別在不同三天內製備和分析，並對六個HCP進行了定量評估，結果如表6中所示。所有低於0.5 ppm的HCP的精確度均在25%以內，而高於0.5 ppm的HCP的精確度在20%以內。定量結果是根據從mAb-3中富集的各個HCP的肽，且每個樣品以三重複進行分析。
表6. mAb-3的六個HCP的測得濃度
實例 6. 選定 HCP 的生物學相關濃度
| 蛋白質名稱 | 測得濃度 (ppm) 運行- 1 | 測得濃度 (ppm) 運行 -2 | 測得濃度 (ppm) 運行 -3 | 平均測得濃度 (ppm) | CV % |
| C1r-A | 0.04 | 0.03 | 0.02 | 0.03 | 25.4% |
| 組織蛋白酶Z | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.03 | 0.9% |
| LPL | 0.15 | 0.21 | 0.23 | 0.20 | 19.8% |
| β-2-微球蛋白 | 0.30 | 0.35 | 0.38 | 0.34 | 11.9% |
| LAL | 1.20 | 1.54 | 1.10 | 1.28 | 17.8% |
| 組織蛋白酶D | 4.56 | 4.56 | 3.60 | 4.24 | 13.1% |
低於ppm含量的脂肪酶或酯酶會導致藥物產品在長期儲存期間發生PS降解。表6和圖12A顯示，在mAb-3中偵測到1.28 ppm LAL並導致20% PS80降解，而圖12B顯示在4至8℃下6個月內釋放了23 µg/mL油酸。圖12C顯示，使用PMLD準確定量範圍從mAb-3中的0.1 ppm到mAb-10中的3.5 ppm的LAL。PS80降解所釋放的油酸與LAL測得濃度之間的回歸係數(R
2)大於0.98。透過PMLD方法測定mAb-4中的LAL濃度為0.1 ppm。圖12C顯示，mAb-4中的0.1 ppm LAL在37℃下4天內沒有引起任何可見的PS80降解。因此，LAL的低偵測極限為0.1 ppm，有助於準確估算LAL對PS80降解的潛在負面影響，並可用於預測藥物產品的潛在儲存期限。在從mAb3到mAb10的所有八個樣品中偵測到濃度低於0.5 ppm的LPL。圖12C顯示，PS80降解與mAb-3至mAb-10中的LPL濃度不相關，R
2為0.19，因此表明LPL不會影響PS80。圖12C還證實，在37℃下，0.5 ppm LAL每天從PS80降解中釋放出1.45 µg/mL油酸。
CES是一種酯酶，當以低豐度存在時，可以降解PS80。例如，20 ppm CES會在4至8℃下於24小時內完全耗盡PS80物質的單酯。透過自然消化結合MRM進行定量，mAb-11中的CES濃度經測定為2.3 ppm。在mAb-12 (與mAb-11相同的mAb，但透過不同的純化步驟獲得)中，PMLD未偵測到CES，也未觀察到PS80降解。mAb-13由mAb-11和mAb-12按1：9比例混合配製而成；因此，測得mAb-13中的CES濃度為0.23 ppm。mAb-14由mAb-11和mAb-12按1：49比例混合配製而成，測得mAb-14中的CES濃度為0.046 ppm。mAb-12到mAb-17藉由PMLD富集，每個樣品中的CES絕對豐度計算為相對於mAb-13和mAb-14的相對豐度。圖13顯示，建立了每天增加的油酸濃度與CES濃度之間的相關性。據估算，在加速降解條件(37℃)下，即使是0.1 ppm CES 也會導致油酸每天增加5.4 µg/mL。
PPT-1和LAL被發現在mAb-18和mAb-19中是PS80降解的可能原因。與只有LAL而不是LPL的mAb-3相比，其為PS80降解的主因，PPT-1和LAL在降解PS80方面發揮作用。表4顯示，CHO PPT-1的定量是用肽ETIPLQESTLYTEDR進行的，而校正曲線是用人類PPT-1肽ETIPLQETSLYTQDR創建的，因為缺少重組CHO PPT-1。考慮到15個殘基中只有一個胺基酸殘基的差異，預期這兩種肽的游離效率不會有顯著差異。
表7顯示在mAb-18和mAb-19中PPT-1與LAL的定量結果，以及在37℃下培育後釋放油酸的測量結果；在mAb-18中偵測到1.8 ppm PPT-1和0.39 ppm LAL，從而導致每天分別增加8.57 µg/mL油酸，而在mAb-19中發現1.1 ppm PPT-1和0.34 ppm LAL，並導致在加速降解條件(37℃)下，油酸每天增加5.28 µg/mL。基於圖12中的mAb-3結果，發現到0.5 ppm LAL在37℃下每天會降解約1.45 µg/mL油酸。據估算，1 ppm PPT-1會導致每天增加大約4 µg/mL油酸。
表7. 在mAb-18和mAb-19中，每天PPT-1、LAL和油酸增加的定量結果
| PPT-1 (ppm) | LAL (ppm) | 油酸增加(每天µg/mL @ 37℃) | |
| mAb-18 | 1.80 | 0.39 | 8.57 |
| mAb-19 | 1.13 | 0.34 | 5.28 |
圖14顯示，在mAb-18於4至8℃下培育36個月後，觀察到71.6%的PS80降解。PS80降解61%後形成亞可見和可見顆粒。儘管顆粒形成可能因不同的蛋白質配方而異，但這個觀察結果被用來估算顆粒形成時間。使用mAb-18穩定性研究的結果，估算在加速降解條件(37℃)下每天釋放大約7.3 µg/mL油酸將導致61%的PS80降解，並隨後在36個月內形成顆粒。因此，透過長期穩定性研究，估算1.8 ppm PPT-1、0.14 ppm CES或2.5 ppm LAL可能會導致DP中形成顆粒。也根據每天每ppm酶的油酸增加量來比較不同PSDE之間的相對脂肪酶活性，針對LAL、CES和PPT-1計算為每天每ppm分別為2.9、54.7和4.1 µg/mL。因此，這三種酶對PS的降解能力排序為CES ＞ PPT-1 ＞ LAL。
脂肪酶和酯酶並不是唯一一類必須在低於ppm含量下進行定量的高風險HCP。圖15顯示，在原料藥DS-1、DS-2和DS-3的高穩定性研究期間，在45℃壓力條件下6個月內，組織蛋白酶D在胺基酸殘基甲硫胺酸和酪胺酸之間分別造成超過12%、4%和0.2%的剪切。PMLD-PRM定量分析用於確定DS-1、DS-2和DS-3中的組織蛋白酶D濃度分別為1.5 ppm、1.1 ppm和0.3 ppm組織蛋白酶D。結果表明，在低至1.1 ppm或更高的濃度下，組織蛋白酶D會裂解蛋白質，而在0.3 ppm下，它顯示出可忽略不計的蛋白質裂解。
實例 7. 使用 ProteoMiner™ 提高 SV NIST mAb 的偵測極限
如圖17中所示，本發明強化偵測SV蛋白的ProteoMiner™方法改進了Chen等人描述的HCP鑑定用ProteoMiner™方法，以鑑定SV NIST mAb內的序列變異。ProteoMiner™ SV富集方法包括以下步驟：使包含至少一種其胺基酸序列未被無意改變(例如，野生型或重組)的更為豐富蛋白質或肽的樣品與固態載體接觸(諸如珠粒)，其中交互作用肽配體附接在固態載體上，SV NIST mAb可結合至交互作用肽配體(例如ProteoMiner™珠粒)；使用包含表面活性劑的溶液洗滌固態載體以富集SV NIST mAb並提供析出液；使析出液進行變性、烷基化與還原；對經變性、烷基化和還原的析出液進行酶消化反應，以生成經富集的SV NIST mAb的組分(例如直接消化)；使用質譜儀鑑定經富集SV NIST mAb的組分；以及使用已鑑定出的組份來鑑定經富集SV NIST mAb中的胺基酸取代。
本發明用於強化偵測SV蛋白的ProteoMiner™方法、nanoLC或其組合能夠偵測SV NIST mAb內的胺基酸取代，包括丙胺酸到麩胺酸、脯胺酸、蘇胺酸或纈胺酸；半胱胺酸到甘胺酸、絲胺酸或酪胺酸；天冬胺酸到麩胺酸；麩胺酸到天冬胺酸或纈胺酸；苯丙胺酸到絲胺酸、酪胺酸或白胺酸或異白胺酸；甘胺酸到天冬胺酸、麩胺酸或絲胺酸；組胺酸到天冬醯胺酸、天冬胺酸或酪胺酸；異白胺酸到精胺酸；離胺酸到精胺酸；白胺酸到精胺酸；麩醯胺酸、苯丙胺酸或脯胺酸；甲硫胺酸到蘇胺酸，白胺酸或異白胺酸；脯胺酸到丙胺酸、組胺酸、白胺酸或絲胺酸；精胺酸到離胺酸；絲胺酸到天冬醯胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、蘇胺酸、白胺酸或異白胺酸；蘇胺酸到丙胺酸、天冬醯胺酸、異白胺酸或絲胺酸；纈胺酸到丙胺酸、麩醯胺酸、甲硫胺酸、白胺酸或異白胺酸；色胺酸到絲胺酸；以及酪胺酸到天冬胺酸、半胱胺酸或苯丙胺酸，如圖18A、圖18B，和圖18C中所示。以紅色強調的細胞顯示了SV肽中的胺基酸取代，這些肽是使用本發明用於強化偵測SV蛋白的ProteoMiner™方法、nanoLC或其組合進行富集的。
實例 8. 使用 ProteoMiner™ 富集 SV NIST mAb
圖19A顯示SV NIST mAb內的胺基酸序列變異表，其使用本發明用於強化偵測SV蛋白的ProteoMiner™方法、nanoLC或其組合進行富集。經富集的SV NIST mAb中的胺基酸序列變異通常導致具有一組物理特徵的胺基酸取代成具有一組不同物理特徵的胺基酸。此類取代影響了SV NIST mAb的三維蛋白質結構，這些mAb是使用本發明用於強化偵測SV蛋白的ProteoMiner™方法、nanoLC或其組合進行富集。圖19B、圖19C和圖19D顯示了根據例示性實施例，在SV NIST mAb的三維蛋白質結構內使用本發明ProteoMiner™ SV鑑定方法所鑑定且富集的NIST mAb胺基酸序列變異的視圖。
例如，圖20A顯示SV NIST mAb內，在SV中的帶正電荷的組胺酸(其被帶負電荷的天冬胺酸或極性不帶電的天冬醯胺酸取代)，這些mAb是使用本發明用於強化偵測SV蛋白的ProteoMiner™方法、nanoLC或其組合進行富集。圖20B顯示了組胺酸、天冬胺酸和天冬醯胺酸的可能密碼子序列，且點突變(例如，一個突變的DNA)可以導致組胺酸密碼子被取代成天冬胺酸或天冬醯胺酸密碼子。圖20C顯示了根據例示性實施例，使用經過常規流動CSH LC或nanoLC管柱的NIST mAb直接消化物，或經過nanoLC管柱之經ProteoMiner™富集的NIST mAb消化物的析出液所鑑定的NIST mAb組胺酸到天冬醯胺酸或天冬胺酸序列變異。圖20C還顯示本發明用於強化偵測SV蛋白的ProteoMiner™方法富集了帶有組胺酸227、271或313取代成天冬胺酸或天冬醯胺酸或其組合的SV NIST mAb。
圖20D顯示了根據例示性實施例，在經過常規流動CSH LC管柱的NIST mAb直接消化物的析出液中，所偵測到的胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(下方)，以及經過nanoLC管柱的經ProteoMiner™富集NIST mAb消化物的析出液中，所偵測到的組胺酸到天冬醯胺酸SV胰蛋白酶肽產物離子的MS2圖譜(下方)。圖20E顯示了根據例示性實施例，經過常規流動CSH LC管柱的NIST mAb直接消化物的析出液中，所偵測到的胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(下方)，以及經過nanoLC管柱經ProteoMiner™富集NIST mAb消化物的析出液中，所偵測到的組胺酸到天冬胺酸SV胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(上方)。類似地，本發明用於強化偵測SV蛋白的ProteoMiner™方法可以富集帶有組胺酸到天冬醯胺酸或天冬胺酸序列變異的CHO IgG1 mAb。圖20F顯示本發明用於強化偵測SV蛋白的ProteoMiner™方法富集了帶有組胺酸432或436或其組合取代成天冬醯胺酸的CHO IgG1 mAb。圖20F還顯示本發明用於強化偵測SV蛋白的ProteoMiner™方法富集帶有組胺酸227、271、288、432或436或其組合取代成天冬胺酸的CHO IgG1 mAb。
實例 9. ProteoMiner™ 富集具有三維蛋白質結構遭受改變的 SV NIST mAb
未使用本發明用於強化偵測SV蛋白的ProteoMiner™方法富集的SV NIST mAb內的胺基酸序列變異通常導致具有一組物理特徵的胺基酸取代成具有同組物理特徵的胺基酸。這樣取代並不會影響SV NIST mAb的三維蛋白質結構，這些mAb未使用本發明用於強化偵測SV蛋白的ProteoMiner™方法、nanoLC或其組合進行富集。
例如，圖21A顯示了在SV NIST mAb內，SV中被極性不帶電天冬醯胺酸取代的極性不帶電絲胺酸，其未使用本發明用於強化偵測SV蛋白的ProteoMiner™方法、nanoLC或其組合進行富集。圖21B顯示了根據例示性實施例，使用經過常規流動CSH LC或nanoLC管柱的NIST mAb直接消化物的析出物或經過nanoLC管柱的ProteoMiner™析出液NIST mAb消化物所鑑定的NIST mAb絲胺酸到天冬醯胺酸序列變異。
實例 10. 與直接消化和常規流動 LC 或 nanoLC 相比 ， ProteoMiner™ 提高 偵測到的 SV 數量
如圖22A中所示，使用經過常規流動CSH LC或nanoLC管柱的NIST mAb直接消化物的析出液所鑑定的NIST mAb胺基酸序列變異的數量(SVA ＞ 0.01%)少於經過nanoLC管柱的ProteoMiner™析出液NIST mAb消化物。雖然本發明用於強化偵測SV蛋白的ProteoMiner™方法可以富集某些SV蛋白，但方法大體上會強化SV蛋白的偵測，即使沒有富集。此外，nanoLC增進了偵測SV蛋白的靈敏度。圖22B顯示根據例示性實施例，在經過常規流動CSH LC管柱的NIST mAb直接消化物的析出液中，所偵測到的胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(上方)，以及經過nanoLC管柱的經ProteoMiner™富集NIST mAb消化物的析出液中，所偵測到的甘胺酸到天冬胺酸SV胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(下方) (SVA低至0.004%)。
絲胺酸、甘胺酸和纈胺酸SV NIST mAb用於進一步評估本發明用於強化偵測SV蛋白的ProteoMiner™方法。圖22C顯示了根據例示性實施例，使用經過常規流動CSH LC或nanoLC管柱的NIST mAb直接消化物或經過nanoLC管柱的經ProteoMiner™富集的NIST mAb消化物的析出液所鑑定的NIST mAb絲胺酸、甘胺酸和纈胺酸序列變異的數量。圖22C顯示，與使用經過常規流動CSH LC管柱的直接消化物相比，使用經過nanoLC管柱的直接消化物或經過nanoLC管柱的ProteoMiner™析出液NIST mAb消化物可以偵測到約50%以上的SV。圖22D顯示了根據例示性實施例，由三間實驗室使用經過常規流動CSH LC管柱的NIST mAb直接消化物或經過nanoLC管柱的經ProteoMiner™富集NIST mAb消化物的析出液所鑑定的NIST mAb絲胺酸、甘胺酸或纈胺酸序列變異的數量。圖22D顯示使用本發明用於強化偵測SV蛋白的ProteoMiner™方法偵測到約85%的SV，而使用本發明用於強化偵測SV蛋白的ProteoMiner™方法、nanoLC或其組合偵測到約92.3%的SV。
圖22E顯示了根據例示性實施例，由三間實驗室使用經過常規流動CSH LC管柱的NIST mAb直接消化物或NIST mAb直接消化物，或經過nanoLC管柱的經ProteoMiner™富集的NIST mAb消化物的析出液所鑑定的NIST mAb丙胺酸到蘇胺酸、甘胺酸到天冬胺酸、絲胺酸到天冬醯胺酸、纈胺酸到白胺酸或異白胺酸、精胺酸到離胺酸，以及離胺酸到精胺酸序列變異。本發明用於強化偵測SV蛋白的ProteoMiner™方法或nanoLC偵測到17個SV NIST mAb中的15個，這17個SV NIST mAb是使NIST mAb直接消化物經過常規流動CSH LC管柱所偵測到的。此外，圖22E顯示，藉由使NIST mAb直接消化物經過常規流動CSH LC管柱所偵測到的17個SV NIST mAb中的一個顯示出比使用nanoLC更高的SV百分比，而其他顯示出類似的相對豐度。
實例 11. NanoLC 可能導致高估 SVA
圖23顯示根據例示性實施例，在經過nanoLC管柱的經消化ProteoMiner™ NIST mAb析出液的析出液中所偵測到的胰蛋白酶肽產物離子(例如，VVSVLTVLHQDWLNGK和TTPPVLDSDGSFEYSK)，和絲胺酸到天冬醯胺酸SV胰蛋白酶肽產物離子(例如，VVNVLTVLHQDWLNGK和TTPPVLDSDGSFEYNK)的MS2質譜中的不飽和(下方)和飽和(上方)峰。SV和非SV肽產物離子的MS2質譜中的飽和峰會掩蓋SV和非SV蛋白的相對豐度，導致高估了SVA的相對豐度。
實例 12. NanoLC 可以改進 MS2 譜圖
NanoLC可以透過增加信號來改進MS2譜圖。例如，圖24顯示使用質譜儀分析經過常規流動CSH LC管柱的NIST mAb直接消化物的析出液，在胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(掃描9602，z=3)中產生比半胱胺酸到絲胺酸SV胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(掃描9515，z=3)更大的峰。相反，根據例示性實施例，使用質譜儀分析經過nanoLC管柱的經消化ProteoMiner™ NIST mAb析出液在胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(掃描59496，z=3)中產生比半胱胺酸到絲胺酸SV胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(掃描59579，z=3)更小的峰。
NanoLC還可以透過生成y離子來改進MS2譜圖。例如，圖25顯示質譜儀使用經過常規流動CSH LC管柱的NIST mAb直接消化物的析出液，在絲胺酸到白胺酸或異白胺酸SV胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(掃描14203，z=4)中不產生y離子。相反，根據例示性實施例，質譜儀使用經過nanoLC管柱的經消化ProteoMiner™ NIST mAb析出液的析出液，在絲胺酸到白胺酸或異白胺酸SV胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(掃描75616，z=4)中產生y離子。
無
圖1說明根據例示性實施例，本發明方法的工作流程。
圖2顯示根據例示性實施例，藉由替代性ProteoMiner™有限消化方法所鑑定的HCP和UPS2蛋白的數量。
圖3顯示根據例示性實施例，在一定範圍的胰蛋白酶與受質比例下，藉由ProteoMiner™有限消化方法所鑑定的HCP和UPS2蛋白的數量。
圖4顯示根據例示性實施例，藉由ProteoMiner™有限消化方法所鑑定的HCP和UPS2蛋白的數量，其中SDC/SLS以2.4 mM至12 mM的範圍存在。
圖5顯示根據例示性實施例，藉由前述ProteoMiner™方法、經優化的有限消化方法和本發明的ProteoMiner™有限消化方法所鑑定的UPS2蛋白。
圖6顯示根據例示性實施例，與習知方法相比，藉由本發明經優化的ProteoMiner™有限消化方法所鑑定的HCP的數量。
圖7顯示根據例示性實施例，與習知方法相比，藉由本發明經優化的ProteoMiner™有限消化方法所鑑定的UPS2蛋白的數量。
圖8顯示根據例示性實施例，與先前揭示的方法相比，藉由本發明經優化的ProteoMiner™有限消化方法所鑑定的NIST單株抗體(mAb) HCP的數量。
圖9說明根據例示性實施例，用於強化偵測宿主細胞蛋白質的ProteoMiner™和超靈敏定量方法的樣品製備工作流程。
圖10A顯示根據例示性實施例，在mAb-1和具有以定量下限(LLOQ)含量被摻入對應重組標準品的mAb-1中，LPL的GLGDVDQLVK的靶向定量(PRM)比較結果。
圖10B顯示根據例示性實施例，在mAb-1和具有以定量下限(LLOQ)含量被摻入對應重組標準品的mAb-1中，羧肽酶的EFSHITFLTIK的靶向定量(PRM)比較結果。
圖10C顯示根據例示性實施例，在mAb-1和具有以定量下限(LLOQ)含量被摻入對應重組標準品的mAb-1中，LAL的VNVYTSHSPAGTSVQNLR的靶向定量(PRM)比較結果。
圖10D顯示根據例示性實施例，在mAb-1和具有以定量下限(LLOQ)含量被摻入對應重組標準品的mAb-1中，組織蛋白酶D的VSSLPSVTLK的靶向定量(PRM)比較結果。
圖10E顯示根據例示性實施例，在mAb-1和具有以定量下限(LLOQ)含量被摻入對應重組標準品的mAb-1中，組織蛋白酶Z的GVNYASITR的靶向定量(PRM)比較結果。
圖11A顯示根據例示性實施例，八種肽的標準曲線。根據為每個HCP挑選的峰面積除以來自PRM分析之hPLBD2肽的峰面積，算出峰面積比(PAR)。HCP被摻入mAb-1中。HCP和hPLBD2的肽列表如
表 4中所示。
圖11B顯示根據例示性實施例，為LAL和人類PPT-1挑選的兩種肽除以來自PRM分析之hPLBD2的肽的肽峰面積比(PAR)的標準曲線。將LAL和人類PPT-1摻入到mAb-2中。
圖12A顯示根據例示性實施例，基於LC-CAD測量值，在長達6個月的正常儲存條件(4℃至8℃)下，於mAb-3 (存在1.28 ppm LAL和0.2 ppm LPL)中觀察到的PS80降解曲線。
圖12B顯示根據例示性實施例，基於游離脂肪酸測量值，在正常儲存條件(4℃至8℃)下，於mAb-3 (存在1.28 ppm LAL和0.2 ppm LPL)中觀察到的油酸濃度增加。
圖12C顯示根據例示性實施例，在壓力條件(37℃)下，於mAb-3至mAb-10中每天油酸增加量與脂肪酶濃度(LAL和LPL)之間的相關性。
圖13顯示根據例示性實施例，在壓力條件(37℃)下，於mAb-12至mAb-17中每天油酸增加量與測得CES濃度之間的相關性。藉由比較CES與mAb-13和mAb-14的相對豐度來定量mAb-15至mAb-17中的CES濃度。
圖14顯示根據例示性實施例，mAb-18在儲存條件(4至8℃)下殘餘PS80%之間的相關性。
圖15A顯示根據例示性實施例，DS-1、DS-2和DS-3在長達6個月的壓力條件(45℃)下觀察到的MY截斷。
圖15B顯示根據例示性實施例，組織蛋白酶D在DS-1、DS-2和DS-3中的濃度。
圖16顯示根據例示性實施例，產生SV蛋白的潛在機制可能發生在複製、轉錄、轉譯或其組合期間。
圖17說明根據例示性實施例，本發明的強化SV蛋白偵測方法的工作流程。
圖18A顯示根據例示性實施例，使用本發明ProteoMiner™ SV鑑定方法加上nanoLC管柱或直接消化加上nanoLC管柱，在SV NIST mAb中所鑑定出的胺基酸取代表。
圖18B顯示根據例示性實施例，使用本發明ProteoMiner™ SV鑑定方法加上nanoLC管柱或直接消化加上nanoLC管柱，在SV NIST mAb中所鑑定出的胺基酸取代表。
圖18C顯示根據例示性實施例，使用本發明ProteoMiner™ SV鑑定方法加上nanoLC管柱或直接消化加上nanoLC管柱，在SV NIST mAb中所鑑定出的胺基酸取代表。
圖19A顯示根據例示性實施例，使用本發明ProteoMiner™ SV富集方法所鑑定的經富集SV NIST mAb肽的表格。
圖19B顯示根據例示性實施例，在SV NIST mAb的三維蛋白質結構內使用本發明ProteoMiner™ SV鑑定方法所富集的NIST mAb胺基酸序列變異的視圖。
圖19C顯示根據例示性實施例，在SV NIST mAb的三維蛋白質結構內使用本發明ProteoMiner™ SV鑑定方法所富集的NIST mAb胺基酸序列變異的替代視圖。
圖19D顯示根據例示性實施例，在SV NIST mAb的三維蛋白質結構內使用本發明ProteoMiner™ SV鑑定方法所鑑定的SV NIST mAb胺基酸序列變異的另一個替代視圖。
圖20A顯示根據例示性實施例，掌管組胺酸到天冬醯胺酸或天冬胺酸序列變異的組胺酸(例如，帶正電側鏈)、天冬醯胺酸(例如，極性不帶電側鏈)和天冬胺酸(例如，帶負電側鏈)的不同性質，其影響到透過本發明ProteoMiner™ SV鑑定方法所富集的SV mAb蛋白質結構。
圖20B顯示了根據例示性實施例，可在藉由本發明ProteoMiner™ SV鑑定方法所富集的SV mAb中造成組胺酸到天冬醯胺酸或天冬胺酸序列變異的密碼子序列變異。
圖20C顯示根據例示性實施例，使用經過常規流動CSH LC或nanoLC管柱的NIST mAb直接消化物或經過nanoLC管柱的經ProteoMiner™富集的NIST mAb消化物的析出液，所鑑定出的NIST mAb組胺酸到天冬醯胺酸或天冬胺酸序列變異。
圖20D顯示根據例示性實施例，在經過常規流動CSH LC管柱的NIST mAb直接消化物的析出液中，所偵測到的胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(下方)，以及在經過nanoLC管柱的經ProteoMiner™富集的NIST mAb消化物的析出液中，所偵測到的組胺酸到天冬醯胺酸SV胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(上方)。
圖20E顯示根據例示性實施例，在經過常規流動CSH LC管柱的NIST mAb直接消化物的析出液中，所偵測到的胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(下方)，以及在經過nanoLC 管柱的經ProteoMiner™富集的NIST mAb消化物的析出液中，所偵測到的組胺酸到天冬胺酸SV胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(上方)。
圖20F顯示根據例示性實施例，使用經過常規流動CSH LC管柱的CHO IgG1直接消化物，或經過nanoLC管柱的經ProteoMiner™富集的CHO IgG1 mAb消化物的析出液，所鑑定出的CHO IgG1 mAb組胺酸到天冬醯胺酸或天冬胺酸序列變異。
圖21A顯示根據例示性實施例，絲胺酸(例如，極性不帶電側鏈)和天冬醯胺酸(例如，極性不帶電側鏈)的相似性質，其防止絲胺酸到天冬醯胺酸序列變異影響到未藉由本發明ProteoMiner™ SV鑑定方法富集的SV mAb蛋白質結構。
圖21B顯示根據例示性實施例，使用經過常規流動CSH LC或nanoLC管柱的NIST mAb直接消化物的析出液，或經過nanoLC管柱的經消化ProteoMiner™ NIST mAb析出液，所鑑定出的NIST mAb絲胺酸到天冬醯胺酸序列變異。
圖22A顯示根據例示性實施例，使用經過常規流動CSH LC或nanoLC管柱的NIST mAb直接消化物的析出液，或經過nanoLC管柱的經消化ProteoMiner™ NIST mAb析出液，所鑑定出的NIST mAb胺基酸序列變異數量(SVA ＞ 0.01%)。
圖22B顯示根據例示性實施例，在經過常規流動CSH LC管柱的NIST mAb直接消化物的析出液中，所偵測到的胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(下方)，以及在經過nanoLC管柱的經消化ProteoMiner™ NIST mAb的析出液中所偵測到的甘胺酸到天冬胺酸SV胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(上方) (SVA低至0.004%)。
圖22C顯示根據例示性實施例，使用經過常規流動CSH LC或nanoLC管柱的NIST mAb直接消化物的析出液，或經過nanoLC管柱的經消化ProteoMiner™ NIST mAb析出液，所鑑定出的NIST mAb絲胺酸、甘胺酸或纈胺酸序列變異數量。
圖22D顯示根據例示性實施例，由三間實驗室使用經過常規流動CSH LC管柱的NIST mAb直接消化物，或經過nanoLC管柱的經消化ProteoMiner™ NIST mAb析出液所鑑定出的NIST mAb絲胺酸、甘胺酸或纈胺酸序列變異數量。
圖22E顯示根據例示性實施例，由三間實驗室使用經過常規流動CSH LC管柱或nanoLC管柱的NIST mAb直接消化物，或經過nanoLC管柱的經消化ProteoMiner™ NIST mAb析出液所鑑定出的NIST mAb丙胺酸到蘇胺酸、甘胺酸到天冬胺酸、絲胺酸到天冬醯胺酸、纈胺酸到白胺酸或異白胺酸、精胺酸到離胺酸，以及離胺酸到精胺酸序列變異。
圖23顯示根據例示性實施例，在經過nanoLC管柱的經消化ProteoMiner™ NIST mAb的析出液中，所偵測到的胰蛋白酶肽產物離子(例如，VVSVLTVLHQDWLNGK和TTPPVLDSDGSFEYSK)，和絲胺酸到天冬醯胺酸SV胰蛋白酶肽產物離子(例如，VVNVLTVLHQDWLNGK和TTPPVLDSDGSFEYNK)的MS2質譜中的不飽和(下方)峰和飽和(上方)峰。
圖24顯示根據例示性實施例，使用質譜儀分析經過常規流動CSH LC管柱的NIST mAb直接消化物的析出液，在胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(掃描9602，z=3)中產生比半胱胺酸到絲胺酸SV胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(掃描9515，z=3)更大的峰，而使用質譜儀分析經過nanoLC管柱的經ProteoMiner™富集的NIST mAb消化物的析出液，在胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(掃描59496，z=3)中產生比半胱胺酸到絲胺酸SV胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(掃描59579，z=3)更小的峰。
圖25顯示根據例示性實施例，質譜儀使用經過常規流動CSH LC管柱的NIST mAb直接消化物的析出液，在絲胺酸到白胺酸或異白胺酸SV胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(掃描14203，z=4)中不產生y離子，而質譜儀使用經過nanoLC管柱的經消化ProteoMiner™ NIST mAb的析出液，在絲胺酸到白胺酸或異白胺酸SV胰蛋白酶肽產物離子的MS2質譜(掃描75616，z=4)中產生y離子。
無
Claims (49)
- 一種在樣品中鑑定宿主細胞蛋白質(host cell protein, HCP)雜質的方法，包含： (a)使包括至少一種高豐度肽或蛋白質和至少一種HCP雜質的樣品與固態載體接觸，其中該固態載體附接至能夠與該至少一種HCP雜質交互作用的交互作用肽配體； (b)洗滌該固態載體以提供包含至少一種經富集HCP雜質的析出液； (c)使該析出液經過酶消化條件以產生該至少一種經富集HCP雜質的至少一種組分，其中該酶消化條件並未完全消化該析出液中的所有蛋白質； (d)使用質譜儀鑑定該至少一種經富集HCP雜質的該至少一種組分；以及 (e)使用該至少一種組分的鑑定結果來鑑定該至少一種經富集HCP雜質。
- 如請求項1之方法，其中使用表面活性劑洗滌該固態載體，其中該表面活性劑是相轉移表面活性劑、離子性表面活性劑、陰離子性表面活性劑、陽離子性表面活性劑或其組合。
- 如請求項2之方法，其中該表面活性劑是去氧膽酸鈉、月桂基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉或其組合。
- 如請求項1之方法，其中該表面活性劑的濃度為約12 mM。
- 如請求項3之方法，其中該表面活性劑包含約12 mM去氧膽酸鈉和約12 mM月桂基硫酸鈉。
- 如請求項1之方法，其中該至少一種高豐度肽或蛋白質的濃度比該至少一種HCP雜質的濃度高至少約1000倍、約10,000倍、約100,000倍或約1,000,000倍。
- 如請求項1之方法，其中該交互作用肽配體是組合式六肽配體的庫。
- 如請求項1之方法，其中該至少一種高豐度肽或蛋白質是抗體、雙特異性抗體、抗體片段、抗體的Fab區、抗體-藥物結合物、融合蛋白、重組蛋白、蛋白質醫藥產品或藥物。
- 如請求項1之方法，其中該酶消化條件的酶是胰蛋白酶。
- 如請求項9之方法，其中該酶消化條件包括酶與受質比例小於約1：200的胰蛋白酶。
- 如請求項10之方法，其中該酶消化條件包括酶與受質比例為約1：400、約1：1000、約1：2500或約1：10000的胰蛋白酶。
- 如請求項1之方法，其中該至少一種經富集HCP雜質在經過該酶消化條件之前並未經過變性。
- 如請求項1之方法，其中該質譜儀是電灑游離質譜儀、奈米電灑游離質譜儀或三重四極質譜儀，其中該質譜儀耦合至液相層析系統。
- 如請求項1之方法，其中該質譜儀能夠進行LC-MS (液相層析法-質譜法)或LC-MRM-MS (液相層析法-多反應監測-質譜法)分析。
- 如請求項1至14中任一項之方法，其進一步包含使用該質譜儀對該至少一種經富集HCP雜質進行定量，其中該至少一種經富集HCP雜質的偵測極限為約0.003至0.006 ppm。
- 一種用於在樣品中鑑定序列變體(sequence variant，SV)肽或蛋白的方法，其中SV肽或蛋白的至少一個胺基酸無意中不同於野生型肽或蛋白質，該方法包含： (a)使包括至少一種野生型肽或蛋白質和至少一種SV肽或蛋白的樣品與固態載體接觸，其中該固態載體附接至能夠與該至少一種SV肽或蛋白交互作用的交互作用肽配體； (b)洗滌該固態載體以提供包含至少一種經富集SV肽或蛋白的第一析出液； (c)使該第一析出液經過酶消化條件以產生該至少一種經富集SV肽或蛋白的至少一種組分； (d)使具有該至少一種經富集SV肽或蛋白的該至少一種組分的該第一析出液經過液相層析系統，以產生第二析出液； (e)使該第二析出液經過質譜法； (f)使用質譜儀鑑定該至少一種經富集SV肽或蛋白的該至少一種組分；以及 (g)使用該至少一種組分的鑑定結果來鑑定該樣品中的該至少一種經富集SV肽或蛋白。
- 如請求項16之方法，其中該酶消化條件是直接消化。
- 如請求項17之方法，其中該液相層析系統包含奈米規模液相層析法(nanoLC)管柱或常規流動帶電表面雜合(charged surface hybrid，CSH)管柱。
- 如請求項18之方法，其中該酶消化條件並未完全消化該第一析出液中的所有蛋白質。
- 如請求項19之方法，其中使用表面活性劑洗滌該固態載體，其中該表面活性劑是相轉移表面活性劑、離子性表面活性劑、陰離子性表面活性劑、陽離子性表面活性劑或其組合。
- 如請求項20之方法，其中該表面活性劑是去氧膽酸鈉、月桂基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉或其組合。
- 如請求項19之方法，其中該表面活性劑的濃度為約12 mM。
- 如請求項20之方法，其中該表面活性劑包含約12 mM去氧膽酸鈉和約12 mM月桂基硫酸鈉。
- 如請求項19之方法，其中該至少一種更為豐富的野生型肽或蛋白質的濃度比至少一種SV肽或蛋白的濃度高至少約1000倍、約10,000倍、約100,000倍或約1,000,000倍或蛋白質。
- 如請求項19之方法，其中該交互作用肽配體是組合式六肽配體的庫。
- 如請求項19之方法，其中該至少一種更為豐富的野生型肽或蛋白質和該至少一種SV肽或蛋白是抗體、雙特異性抗體、抗體片段、抗體的Fab區、抗體-藥物結合物、融合蛋白、重組蛋白、蛋白質醫藥產品或藥物。
- 如請求項19之方法，其中該酶消化條件的酶是胰蛋白酶。
- 如請求項27之方法，其中該酶消化條件包括酶與受質比例小於約1：200的胰蛋白酶。
- 如請求項28之方法，其中該酶消化條件包括酶與受質比例為約1：400、約1：1000、約1：2500或約1：10000的胰蛋白酶。
- 如請求項19之方法，其中該至少一種經富集SV肽或蛋白在經該酶消化條件之前未經變性。
- 如請求項19之方法，其中該質譜儀是電灑游離質譜儀、奈米電灑游離質譜儀或三重四極質譜儀，其中該質譜儀耦合至該液相層析系統。
- 如請求項19之方法，其中該質譜儀能夠進行LC-MS (液相層析法-質譜法)或LC-MRM-MS (液相層析法-多反應監測-質譜法)分析。
- 如請求項19至32中任一項之方法，其進一步包含使用該質譜儀對該至少一種經富集SV肽或蛋白進行定量，其中該至少一種經富集SV肽或蛋白的偵測極限為約0.003至0.006 ppm。
- 一種用於在樣品中鑑定宿主細胞蛋白質(HCP)雜質的方法，包含： (a)使包含至少一種高豐度肽或蛋白質與至少一種HCP雜質的樣品與固態載體接觸，其中該固態載體附接到能夠與該至少一種HCP雜質交互作用的交互作用肽配體； (b)洗滌該固態載體以提供包含至少一種經富集HCP雜質的析出液； (c)使該析出液經過酶消化條件以產生該至少一種經富集HCP雜質的至少一種組分，其中該酶消化條件並未完全消化該析出液中的所有蛋白質； (d)使用平行反應監測-質譜法鑑定該至少一種經富集HCP雜質的該至少一種組分；以及 (e)使用該至少一種組分的鑑定結果來鑑定該至少一種經富集HCP雜質。
- 如請求項34之方法，其中使用表面活性劑洗滌該固態載體，其中該表面活性劑是相轉移表面活性劑、離子性表面活性劑、陰離子性表面活性劑、陽離子性表面活性劑或其組合。
- 如請求項35之方法，其中該表面活性劑是去氧膽酸鈉、月桂基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉或其組合。
- 如請求項34之方法，其中該表面活性劑的濃度為約12 mM。
- 如請求項36之方法，其中該表面活性劑包含約12 mM去氧膽酸鈉和約12 mM月桂基硫酸鈉。
- 如請求項34之方法，其中該至少一種高豐度肽或蛋白質的濃度比該至少一種HCP雜質的濃度高至少約1,000倍、約10,000倍、約100,000倍、約1,000,000倍、約10,000,000倍、約100,000,000倍或約1,000,000,000倍。
- 如請求項34之方法，其中該交互作用肽配體是組合式六肽配體的庫。
- 如請求項34之方法，其中該至少一種高豐度肽或蛋白質是抗體、雙特異性抗體、抗體片段、抗體的Fab區、抗體-藥物結合物、融合蛋白、重組蛋白、蛋白質醫藥產品或藥物。
- 如請求項34之方法，其中該酶消化條件的酶是胰蛋白酶。
- 如請求項42之方法，其中該酶消化條件包括酶與受質比例小於約1：200的胰蛋白酶。
- 如請求項43之方法，其中該酶消化條件包括酶與受質比例為約1：400、約1：1000、約1：2500或約1：10000的胰蛋白酶。
- 如請求項34之方法，其中該至少一種經富集HCP雜質在經過該酶消化條件之前未經變性。
- 如請求項34之方法，其中該質譜儀是電灑游離質譜儀、奈米電灑游離質譜儀或三重四極質譜儀，其中該質譜儀耦合至液相層析系統。
- 如請求項34之方法，其中該樣品包括內部標準品。
- 如請求項47之方法，其中該內部標準品經重同位素標記。
- 如請求項48之方法，其中該內部標準品是hPLBD2。
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