JP2023516950A - 薬物製剤中のポリソルベート分解を低減する方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、リパーゼの残留量が低減した組成物およびそのような組成物を作製する方法に関する。特に、肝カルボキシルエステラーゼＢ－１様タンパク質および肝カルボキシルエステラーゼ１様タンパク質などのある特定のリパーゼを組成物から枯渇させることによる組成物、およびそのような組成物を作製する方法に関する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年２月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／９８２，３４６号、２０２０年５月７日に出願された米国仮特許出願第６３／０２１，１８１号、および２０２０年９月１日に出願された米国仮特許出願第６３／０７３，１２５号の優先権を主張し、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

分野
本発明は、全体として、ある特定のリパーゼの量が低減した組成物、そのような組成物を作製する方法、およびそのようなリパーゼの存在によるポリソルベート分解を低減する方法に関する。具体的には、本発明は、全体として、肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ１様タンパク質および肝カルボキシルエステラーゼ－１様タンパク質の存在が低減した組成物、ならびに組成物を作製する方法に関する。

背景
医薬品の中で、タンパク質ベースの生物治療薬は、過去数年間にわたるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）による臨床試験の大幅な増加によって証明されるように、高いレベルの選択性、効力、および有効性を提供する薬物の重要な部類である。タンパク質ベースの生物治療薬を臨床にもたらすことは、発見、プロセスおよび製剤開発、分析的特徴決定、ならびに前臨床毒性学および薬理学を含む、様々な研究開発分野にわたって協調的な努力を必要とする複数年にわたる事業である場合がある。

臨床的および商業的に実行可能な生物治療薬についての重要な１つの側面は、製造プロセスおよび貯蔵寿命の点での医薬品の安定性である。これはしばしば、より高い固有の安定性を有する分子の同定、タンパク質工学、および製剤開発を含む、産物品質への影響を最小限に抑えた製造および保存に必要な異なる溶液条件および環境を通じて、タンパク質ベースの生物治療薬の物理的および化学的安定性を増加させるのに役立つ適切なステップを必要とする。タンパク質ベースの生物治療薬産物の物理的安定性を増強するために、ポリソルベートなどの界面活性剤がよく使用される。市販されているモノクローナル抗体治療薬の７０％超が、タンパク質ベースの生物治療薬に物理的安定性を付与するために、界面活性剤の一種である０．００１％～０．１％のポリソルベートを含む。ポリソルベートは、自動酸化および加水分解の影響を受けやすく、それは遊離脂肪酸およびその後の脂肪酸粒子の形成をもたらす。ポリソルベートは、凝集および吸着などの界面応力から保護することができるため、ポリソルベートの分解は、医薬品品質に悪影響を及ぼす可能性がある。いくらかのリパーゼの存在が製剤中のポリソルベートの分解の原因である可能性が高い場合がある。したがって、医薬品中のそのようなリパーゼを検出し、監視し、低減する必要がある。

リパーゼの直接的な分析は、産物をアッセイに十分なだけの多い量で単離することを必要とすることがあり、これは、望ましくなく、選択された場合においてのみ可能であった。したがって、試料中のポリソルベート分解を担うリパーゼを特徴決定するために必要なワークフローおよび分析試験を決定するのは困難な作業である。ポリソルベート分解を担うリパーゼの検出に加えて、医薬品は、そのようなリパーゼを除去または低減する精製方法によって得られなければならない。

製剤化された医薬品からリパーゼを枯渇させるための方法に対する必要性が存在することが認識されるであろう。

概要
保存中だけでなく、製造、輸送、取り扱い、および投与中にも、薬物製剤の安定性を維持することは、重要な課題である。医薬品の中でも、タンパク質生物治療薬はその成功および汎用性により人気を博している。タンパク質生物治療薬開発の主要な課題のうちの１つは、リパーゼの存在（宿主細胞タンパク質として存在）によって影響され得る産物中のタンパク質および賦形剤の限られた安定性を克服することである。薬物製剤へのその影響およびそのようなリパーゼの低減の評価は、薬物製剤の開発における重要なステップであり得、続いて、リパーゼの低減およびリパーゼの低減に起因する安定性の増加を有するように薬物製剤を調製する方法であり得る。

１つの例示的な実施形態において、本開示は、試料からリパーゼを枯渇させる方法を提供し、本方法は、リパーゼを含む試料をプローブと接触させることであって、該プローブが、リパーゼに結合して複合体を形成することが可能である、接触させることと、複合体を試料から分離して、それによって試料からリパーゼを枯渇させることと、を含む。一態様において、試料は、目的のタンパク質を含み得る。一態様において、試料は、ポリソルベート賦形剤を含み得る。特定の態様において、ポリソルベート賦形剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、またはそれらの組み合わせから選択され得る。さらに別の特定の態様において、ポリソルベート賦形剤は、ポリソルベート８０である。

一態様において、リパーゼは、肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ１様タンパク質である。別の態様において、リパーゼは、肝カルボキシルエステラーゼ－１様タンパク質である。

一態様において、リパーゼは、試料中のポリソルベートを分解することが可能である。したがって、本実施形態の方法は、試料のリパーゼを枯渇させることによって、ポリソルベートの分解を低減する。

一態様において、プローブは、固体支持体に連結することが可能であり得る。特定の態様において、固体支持体は、アガロースビーズまたは磁性ビーズであり得る。

一態様において、プローブは、リガンドを使用して固体支持体に結合させることができる。特定の態様において、リガンドは、インジケーター、ビオチン分子、修飾ビオチン分子、核、配列、エピトープタグ、電子不足分子、または電子豊富分子であり得る。

一態様において、方法は、複合体からリパーゼを回収することをさらに含み得る。

１つの例示的な実施形態において、本開示は、目的のタンパク質とリパーゼとを有する試料を精製する方法を提供し、本方法は、試料をプローブと接触させることであって、該プローブが、リパーゼに結合して複合体を形成することが可能である、接触させることと、複合体を試料から分離することと、を含む。一態様において、リパーゼは、肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ１様タンパク質である。別の態様において、リパーゼは、肝カルボキシルエステラーゼ－１様タンパク質である。

一態様において、試料は、ポリソルベート賦形剤を含む。特定の態様において、ポリソルベート賦形剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、またはそれらの組み合わせから選択され得る。さらに別の特定の態様において、ポリソルベート賦形剤は、ポリソルベート８０であり得る。

一態様において、プローブは、固体支持体に連結することが可能であり得る。特定の態様において、固体支持体は、アガロースビーズまたは磁性ビーズであり得る。

一態様において、プローブは、リガンドを使用して固体支持体に結合させることができる。特定の態様において、リガンドは、インジケーター、ビオチン分子、修飾ビオチン分子、核、配列、エピトープタグ、電子不足分子、または電子豊富分子であり得る。

１つの例示的な実施形態において、本開示は、試料中のポリソルベートの分解を減少させる方法を提供し、本方法は、リパーゼとポリソルベートとを含む試料をプローブと接触させることであって、該プローブが、リパーゼに結合して複合体を形成することが可能である、接触させることと、複合体を試料から分離して、それによって試料中のポリソルベートの分解を減少させることと、を含む。

一態様において、リパーゼは、肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ１様タンパク質である。別の態様において、リパーゼは、肝カルボキシルエステラーゼ－１様タンパク質である。

一態様において、試料は、目的のタンパク質を含み得る。一態様において、試料は、ポリソルベート賦形剤を含み得る。特定の態様において、ポリソルベート賦形剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、またはそれらの組み合わせから選択される。さらに別の特定の態様において、ポリソルベート賦形剤は、ポリソルベート８０である。

一態様において、プローブは、固体支持体に連結することが可能であり得る。特定の態様において、固体支持体は、アガロースビーズまたは磁性ビーズであり得る。

一態様において、プローブは、リガンドを使用して固体支持体に結合させることができる。特定の態様において、リガンドは、インジケーター、ビオチン分子、修飾ビオチン分子、核、配列、エピトープタグ、電子不足分子、または電子豊富分子であり得る。

１つの例示的な実施形態において、本開示は、哺乳類細胞から精製された目的のタンパク質と、肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ１様タンパク質の残留量とを含む組成物を提供する。一態様において、肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ１様タンパク質の残留量は、約５ｐｐｍ未満である。別の態様において、組成物は、界面活性剤をさらに含み得る。さらに別の態様において、界面活性剤は、親水性非イオン性界面活性剤であり得る。別の態様において、界面活性剤は、ソルビタン脂肪酸エステルであり得る。特定の態様において、界面活性剤は、ポリソルベートであり得る。別の特定の態様において、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．０１％ｗ／ｖ～約０．２％ｗ／ｖであり得る。さらなる特定の態様において、界面活性剤は、ポリソルベート８０であり得る。一態様において、哺乳類細胞は、ＣＨＯ細胞を含み得る。

一態様において、肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ１様タンパク質は、ポリソルベート８０の分解を引き起こし得る。

一態様において、組成物は、非経口製剤であり得る。

一態様において、目的のタンパク質は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、抗体断片、融合タンパク質、または抗体－薬物複合体であり得る。一態様において、目的のタンパク質の濃度は、約２０ｍｇ／ｍＬ～約４００ｍｇ／ｍＬであり得る。

一態様において、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。別の態様において、組成物は、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、アルギン酸緩衝液、およびアルギニン緩衝液からなる群から選択される緩衝液をさらに含み得る。一態様において、組成物は、張性改変剤をさらに含み得る。さらに別の態様において、組成物は、リン酸ナトリウムをさらに含み得る。

１つの例示的な実施形態において、本開示は、哺乳類細胞から精製された目的のタンパク質と、肝カルボキシルエステラーゼ－１様タンパク質の残留量とを含む組成物を提供する。一態様において、肝カルボキシルエステラーゼ－１様タンパク質の残留量は、約５ｐｐｍ未満である。別の態様において、組成物は、界面活性剤をさらに含み得る。さらに別の態様において、界面活性剤は、親水性非イオン性界面活性剤であり得る。別の態様において、界面活性剤は、ソルビタン脂肪酸エステルであり得る。特定の態様において、界面活性剤は、ポリソルベートであり得る。別の特定の態様において、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．０１％ｗ／ｖ～約０．２％ｗ／ｖであり得る。さらなる特定の態様において、界面活性剤は、ポリソルベート８０であり得る。一態様において、哺乳類細胞は、ＣＨＯ細胞を含み得る。

一態様において、肝カルボキシルエステラーゼ－１様タンパク質は、ポリソルベート８０の分解を引き起こし得る。

一態様において、組成物は、非経口製剤であり得る。

一態様において、目的のタンパク質は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、抗体断片、融合タンパク質、または抗体－薬物複合体であり得る。一態様において、目的のタンパク質の濃度は、約２０ｍｇ／ｍＬ～約４００ｍｇ／ｍＬであり得る。

一態様において、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。別の態様において、組成物は、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、アルギン酸緩衝液、およびアルギニン緩衝液からなる群から選択される緩衝液をさらに含み得る。一態様において、組成物は、張性改変剤をさらに含み得る。さらに別の態様において、組成物は、リン酸ナトリウムをさらに含み得る。

１つの例示的な実施形態において、本開示は、試料中のリパーゼを検出する方法を提供する。一態様において、リパーゼは、肝カルボキシルエステラーゼ－１様タンパク質または肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ１様タンパク質であり得る。一態様において、試料中のリパーゼを検出する方法は、試料をセリンヒドロラーゼプローブと接触させることを含み得る。一態様において、試料中のリパーゼを検出する方法は、試料をセリンヒドロラーゼプローブと接触させ、インキュベートして、リパーゼとセリンヒドロラーゼプローブとの複合体を形成することを含み得る。さらなる態様において、試料中のリパーゼを検出する方法は、リパーゼとセリンヒドロラーゼプローブとの複合体を形成していないセリンヒドロラーゼプローブを濾過することを含み得る。

一態様において、試料中のリパーゼを検出する方法は、磁性ビーズがリパーゼとセリンヒドロラーゼプローブとの複合体に結合するように、試料を、セリンヒドロラーゼプローブに結合する能力を有する磁性ビーズと接触させる接触させることをさらに含み得る。リパーゼとセリンヒドロラーゼプローブとの複合体に結合した磁性ビーズを試料からさらに除去し、緩衝液で洗浄してもよい。

別の態様において、方法は、リパーゼとセリンヒドロラーゼプローブとの複合体に結合している磁性ビーズを除去して、リパーゼが濃縮された溶液を形成することをさらに含み得る。

一態様において、方法は、加水分解剤を溶液に添加して、消化物を得ることをさらに含み得る。特定の態様において、加水分解剤は、トリプシンであり得る。一態様において、方法は、消化物を分析して、リパーゼを検出することをさらに含み得る。一態様において、消化物は、質量分析計を使用して分析され得る。特定の態様において、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。別の特定の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムに連結され得る。さらに別の特定の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィー－多重反応監視システムに連結され得る。

一態様において、方法は、タンパク質変性剤を溶液に添加することをさらに含み得る。特定の態様において、タンパク質変性剤は、尿素であり得る。一態様において、方法は、タンパク質還元剤を溶液に添加することをさらに含み得る。特定の態様において、タンパク質還元剤は、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）であり得る。一態様において、方法は、タンパク質アルキル化剤を溶液に添加することをさらに含み得る。特定の態様において、タンパク質アルキル化剤は、ヨードアセトアミドであり得る。

本発明のこれらおよび他の態様は、以下の説明および添付の図面と併せて考慮される場合、より良好に認識され、理解されるであろう。以下の説明は、その様々な実施形態および多数の特定の詳細を示しているが、例示のために与えられており、限定のためではない。多くの置換、修正、追加、または再配置は、本発明の範囲内で行われ得る。

ポリソルベート中の主要種の化学構造を示す。ポリソルベートは、主に、一般的なソルビタンＰＯＥ、イソソルビドＰＯＥまたはＰＯＥ頭基を共有する脂肪酸エステルで構成され、オレイン酸がＰＳ８０の主な脂肪酸である。右パネルＡは、オンライン２Ｄ－ＬＣ／ＭＳ分析による、ｍＡｂ製剤中のＰＳ８０のトータルイオンカレント（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。標識されたピークの同定は、（１）ＰＯＥ－ＰＯＥイソソルビド－ＰＯＥソルビタン、（２）ＰＯＥソルビタンモノリノレアート、（３）ＰＯＥソルビタンモノオレアート、（４）ＰＯＥイソソルビドモノオレアートおよびＰＯＥモノオレアート、（５）ＰＯＥソルビタンリノレアート／オレアートジエステル、（６）ＰＯＥソルビタンジ－オレアート、（７）ＰＯＥイソソルビドジ－オレアートおよびＰＯＥジ－オレアート、（８）解釈するには質量スペクトルが複雑すぎるため、可能性として、ＰＯＥイソソルビド／ＰＯＥリノレアート／オレアートジエステル、（９）トリオレアートとテトラオレアートとを混合したＰＯＥソルビタン、である。右パネルＢは、オンライン２Ｄ－ＬＣ／ＣＡＤ分析による、ｍＡｂ製剤中のＰＳ８０の分離および検出を示すＣＡＤクロマトグラムを示す。 例示的な実施形態による、ｐＨ６の１０ｍＭのヒスチジン中、５℃で０時間および３６時間インキュベートした５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－１中０．１％のＰＳ８０のクロマトグラムを示す。１１～１７．５分に溶出したピークは、ＰＯＥ、ＰＯＥイソソルビド、およびＰＯＥソルビタンであった。 インキュベーション時間に対してプロットした残存するＰＳ８０の割合のチャートを示し、元のｍＡｂ－１、０．１２５μＭ、０．５μＭ、および２μＭのＦＰプローブと混合したｍＡｂ－１を黒い実線と塗りつぶした円、赤い点線と塗りつぶした菱形、橙色の点線と塗りつぶし正方形、および青い点線と塗りつぶした三角形によって示す。 例示的な実施形態による、リパーゼ枯渇実験の概略図を示す。ストレプトアビジンダイナビーズ磁性ビーズをデスチオビオチン－ＦＰプローブと連結させ、リパーゼ枯渇に使用した。元のｍＡｂ－１、および素通り画分ｍＡｂ－１、ならびにプロセス対照ｍＡｂ－１を５℃で３６時間０．１％のＰＳ８０とともにインキュベートし、ＰＳ分解測定を施した。濃縮されたリパーゼに、消化、および質量分析を使用するＨＣＰ分析を施す。 元のｍＡｂ－１、プロセス対照ｍＡｂ－１、およびリパーゼを枯渇させたｍＡｂ－１中に残存するＰＳ８０の割合のチャートを示し、元のｍＡｂ－１、プロセス対照ｍＡｂ－１、およびリパーゼを枯渇させたｍＡｂ－１は、黒い実線と塗りつぶした菱形、青い点線と塗りつぶした正方形、および橙色の破線と塗りつぶした円によって示す。 図６Ａは、例示的な実施形態による、ｐＨ６の１０ｍＭのヒスチジン中、５℃で０時間、１．５時間、および８時間インキュベートした２０μｇ／ｍＬの市販ウサギ肝エステラーゼ中０．１％のＰＳ８０のクロマトグラムを示す。図６Ｂは、例示的な実施形態による、ｐＨ６の１０ｍＭのヒスチジン中、５℃で０時間、５時間、および１８時間インキュベートした１００μｇ／ｍＬの市販ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１中０．１％のＰＳ８０のクロマトグラムを示す。図６Ｃは、例示的な実施形態による、ｐＨ６の１０ｍＭのヒスチジン中、５℃で０時間、１８時間、および３６時間インキュベートした５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－１中０．１％のＰＳ８０のクロマトグラムを示す。 図６Ｄは、肝カルボキシルエステラーゼＢ－１様（Ａ０Ａ０６１Ｉ７Ｘ９）、肝カルボキシルエステラーゼ１様（Ａ０Ａ０６１ＦＥ２）、およびヒト肝カルボキシルエステラーゼ（ｈＣＥＳ－１）の配列アラインメントを示す。

詳細な説明
宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、すべての細胞由来タンパク質治療薬から除去されなければならない不純物の部類である。ＦＤＡは、ＨＣＰの最大許容レベルを指定していないが、最終医薬品中のＨＣＰ濃度は、バッチごとに制御され、再現可能でなければならない（ＦＤＡ，１９９９）。主要な安全性の懸念は、ＨＣＰがヒト患者に抗原性効果を引き起こし得る可能性に関する（Ｓａｔｉｓｈ Ｋｕｍａｒ Ｓｉｎｇｈ，Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｐｒｏｄｕｃｔ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｆａｃｔｏｒｓ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ａｎｄ １００ ＪＯＵＲＮＡＬＳ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ３５４－３８７（２０１１））。患者についての健康上の悪影響に加えて、酵素的に活性なＨＣＰは、処理中または長期保存中に産物品質に影響を与える可能性がある（Ｓｈａｒｏｎ Ｘ．Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｄ ｔｏ ｒｅｓｉｄｕａｌ ＣＨＯ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ，１０８ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ９７７－９８２（２０１０）、Ｆｌａｖｉｅ Ｒｏｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ｆｃ－ｆｕｓｉｏｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅａｓｅｓ：Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＣＨＯ ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ，１０４ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＢＩＯＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ １１３２－１１４１（２００９））。ＨＣＰは、最終的な医薬品への精製操作を介して持続するための最大のリスクを提示する可能性がある。長期保存中、産物分子の重要な品質属性を維持し、最終製品製剤中の賦形剤の分解を最小限に抑えなければならない。

市場にでているいくつかの薬物製剤は、タンパク質の安定性を改善し、医薬品を凝集および変性から保護することができる、生物医薬品タンパク質製剤において最も一般的に使用される非イオン性界面活性剤のうちの１つとしてポリソルベートを含む（Ｓｙｌｖｉａ Ｋｉｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈａｋｅｎ，Ｎｏｔ Ｓｔｉｒｒｅｄ：Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｔｒｅｓｓ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ａｎ ＩｇＧ１ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，９７ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ４３４７－４３６６（２００８）、Ａｒｉａｄｎａ Ｍａｒｔｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｏｎ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，１０６ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ １７２２－１７３５（２０１７））。ポリソルベート２０（ＰＳ２０）およびポリソルベート８０（ＰＳ８０）は、タンパク質の安定性を改善し、医薬品を凝集および変性から保護することができる、生物医薬品タンパク質製剤で最も一般的に使用される非イオン性界面活性剤である。医薬品中の典型的なポリソルベート濃度は、タンパク質の安定性に関する十分な成果を提供するために、約０．００１％～約０．１％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。

しかしながら、ポリソルベートは、分解を受けやすく、この分解は、製剤化された原薬における望ましくない微粒子形成を促進し得る。ポリソルベートは、自動酸化および加水分解の２つの主な経路で分解することが知られている。酸化は、不飽和脂肪酸エステル置換基の含有量が高いため、ＰＳ８０において起こる可能性が高いことが見出されたが、ＰＳ２０においては、酸化は、頻繁には観察されないポリオキシエチレン鎖中のエーテル結合上で起こると考えられた（Ｏｌｅｇ Ｖ．Ｂｏｒｉｓｏｖ，Ｊｕｎｙａｎ Ａ．Ｊｉ＆Ｙ．Ｊｏｈｎ Ｗａｎｇ，Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ Ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１０４ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ１００５－１０１８（２０１５）、Ａｎｔｈｏｎｙ Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅｓ，ａｎｄ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，１２ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＳ ３８０５－３８１５（２０１５）、Ｊｉａ Ｙａｏ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ Ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｅｓｔｅｒ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔｓ，２６ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ２３０３－２３１３（２００９））。さらに、ポリソルベートはまた、脂肪酸エステル結合を破断することによって加水分解を受ける可能性がある。ポリソルベートの分解を起源とする微粒子は、可視のまたは肉眼で見えないものさえも形成する可能性があり、それは患者における免疫原性の可能性を高める可能性があり、医薬品の品質に様々な影響を及ぼし得る。そのような可能性のある不純物の１つは、ポリソルベートを含む薬物製剤の製造、輸送、保存、取り扱い、または投与中に形成される脂肪酸粒子であり得る。脂肪酸粒子は、潜在的に有害な免疫原性の影響を引き起こし、貯蔵寿命に影響を及ぼす可能性がある。さらに、ポリソルベートの分解はまた、製剤中の界面活性剤の総量の低減も引き起こし、その製造、保存、取り扱い、および投与中の産物の安定性に影響を及ぼす可能性がある。

典型的には、ポリソルベート分解は、かなり長期間の保存後にのみ医薬品中で観察され得る。しかしながら、ＰＳ８０分解は、４℃で２４時間以内に１つのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の場合に観察されたが、明らかに高い濃度のリパーゼは検出されず、この原薬中にはあまり見られないリパーゼが存在することが示唆された。薬物製剤の安定性を維持するためには、そのようなリパーゼの濃度を検出および低減することが不可欠である。

推定ホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＤ２）は、ＰＳ２０の酵素加水分解を引き起こすことが提唱された最初の宿主細胞タンパク質であった（Ｎｉｔｉｎ Ｄｉｘｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｉｄｕａ ｌ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｓｕｌｆａｔａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，１０５ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ１６５７－１６６６（２０１６））。ブタ肝エステラーゼは、（ＰＳ２０ではなく）ポリソルベート８０の特異的加水分解を行うことができ、ｍＡｂ医薬品中で経時的にＰＳ８５の形成をもたらすことが報告された（Ｓｔｅｖｅｎ Ｒ．Ｌａｂｒｅｎｚ，Ｅｓｔｅｒ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０ ｉｎ ｍＡｂ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｉｎ Ｓｕｐｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｚｅｄ Ｒｉｓｋ Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ ｉｎ ｍＡｂ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，１０３ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ２２６８－２２７７（２０１４））。ＸＶ群リソソームホスホリパーゼＡ_２異性体Ｘ１（ＬＰＬＡ_２）は、１ｐｐｍ未満でＰＳ２０およびＰＳ８０を分解する能力を示した（Ｔｒｏｉｉ Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅｓ ２０ ａｎｄ ８０ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ Ｇｒｏｕｐ ＸＶ Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ ２ Ｉｓｏｍｅｒ Ｘ１ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，１０５ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ １６３３－１６４２（２０１６）およびＹｉｎｇ Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ Ｈｉｇｈ－Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｖｅｒｓｅｄ－Ｐｈａｓｅ Ｕｌｔｒａ Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０８ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ２８８０－２８８６（２０１９））。

最近、イモビード１５０上のｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｅｐａｃｉａリパーゼ（ＰＣＬ）、イモビード１５０上のｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ（ＣＡＬＢ）、イモビード１５０上のｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓリパーゼ（ＴＬＬ）、ウサギ肝エステラーゼ（ＲＬＥ）、Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａリパーゼＢ（ＣＡＬＢ）、およびブタ膵臓リパーゼＩＩ型（ＰＰＬ）を含む、ある範囲のカルボキシエステルを選択して、それぞれ、９９％のラウリュートおよび９８％のオレイン酸エステルを含む２つの特有のＰＳ２０およびＰＳ８０の加水分解を研究した。種々のカルボキシエステルは、特有の分解パターンを示し、分解パターンを使用して、ポリソルベートを加水分解する酵素を区別することができることを示した（Ａ．Ｃ．Ｍｃｓｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ ａｎｄ ８０ ｂｙ ａ Ｒａｎｇｅ ｏｆ Ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，７０ ＰＤＡ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ３３２－３４５（２０１６））。医薬品と共精製された宿主細胞タンパク質がポリソルベートに及ぼす影響を評価して、薬物製剤の安定性を確保することが不可欠であり得る。これには、宿主細胞タンパク質の同定およびポリソルベートを分解するその能力が必要となる可能性がある。ＨＣＰの存在は、概して、ＨＣＰの単離および同定を困難にするｐｐｍの範囲にあるため、宿主細胞タンパク質の同定は特に困難となる可能性がある。

本発明は、ポリソルベートを分解し得る宿主細胞タンパク質のレベルが低減した、ポリソルベートを含む改善された組成物、そのような宿主細胞タンパク質を検出するための方法、およびそのような宿主細胞タンパク質を枯渇させるための方法を開示する。

別段記載されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に説明されるものと類似のまたは同等の任意の方法および材料を実施または試験において使用することができるが、特定の方法および材料をこれから説明する。言及されたすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。

「１つの（ａ）」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきであり、「約」および「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように標準的な変動を可能にすると理解されるべきであり、範囲が提供される場合、エンドポイントが含まれる。

いくつかの例示的な実施形態において、本開示は、目的のタンパク質と、ポリソルベートと、リパーゼの残留量とを含む組成物を提供する。

本明細書で使用される場合、用語「組成物」は、１つ以上の薬学的に許容されるビヒクルとともに製剤化される活性薬剤を指す。

本明細書で使用される場合、「活性薬剤」という用語は、医薬品の生物学的に活性な成分を含み得る。活性薬剤は、薬理学的活性を提供すること、またはそうでなければ疾患の診断、治癒、緩和、治療、または予防に直接的な効果を有すること、または動物における生理学的機能の回復、矯正、または修正に直接的な効果を有することを目的とした、医薬品に使用される任意の物質または物質の組み合わせを指し得る。活性薬剤を調製するための非限定的な方法には、発酵プロセス、組換えＤＮＡ、天然資源からの単離および回収、化学合成、またはそれらの組み合わせを使用することを含み得る。

いくつかの例示的な実施形態において、製剤中の活性薬剤の量は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ～約６００ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。いくつかの特定の実施形態において、製剤中の活性薬剤の量は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ、約０．０２ｍｇ／ｍＬ、約０．０３ｍｇ／ｍＬ、約０．０４ｍｇ／ｍＬ、約０．０５ｍｇ／ｍＬ、約０．０６ｍｇ／ｍＬ、約０．０７ｍｇ／ｍＬ、約０．０８ｍｇ／ｍＬ、約０．０９ｍｇ／ｍＬ、約０．１ｍｇ／ｍＬ、約０．２ｍｇ／ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬ、約０．４ｍｇ／ｍＬ、約０．５ｍｇ／ｍＬ、約０．６ｍｇ／ｍＬ、約０．７ｍｇ／ｍＬ、約０．８ｍｇ／ｍＬ、約０．９ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、約７ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ、約９ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ、約４５ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約５５ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ、約６５ｍｇ／ｍＬ、約７０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約８５ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１１０ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約１９０ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ、約２２５ｍｇ／ｍＬ、約２５０ｍｇ／ｍＬ、約２７５ｍｇ／ｍＬ、約３００ｍｇ／ｍＬ、約３２５ｍｇ／ｍＬ、約３５０ｍｇ／ｍＬ、約３７５ｍｇ／ｍＬ、約４００ｍｇ／ｍＬ、約４２５ｍｇ／ｍＬ、約４５０ｍｇ／ｍＬ、約４７５ｍｇ／ｍＬ、約５００ｍｇ／ｍＬ、約５２５ｍｇ／ｍＬ、約５５０ｍｇ／ｍＬ、約５７５ｍｇ／ｍＬ、または約６００ｍｇ／ｍＬであり得る。

いくつかの例示的な実施形態において、組成物のｐＨは、約５．０超であり得る。１つの例示的な実施形態において、ｐＨは、約５．０超、約５．５超、約６超、約６．５超、約７超、約７．５超、約８超、または約８．５超であり得る。

いくつかの例示的な実施形態において、活性薬剤は、目的のタンパク質であり得る。

本明細書で使用される場合、「タンパク質」または「目的のタンパク質」という用語は、共有結合で連結されたアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含み得る。タンパク質は、概して「ポリペプチド」として当技術分野において既知である、１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。「ポリペプチド」は、アミノ酸残基、関連する天然に存在する構造変異体、およびペプチド結合を介して連結されたその合成の非天然に存在する類似体、関連する天然に存在する構造変異体、ならびにそれらの合成の非天然に存在する類似体からなるポリマーを指す。「合成のペプチドまたはポリペプチド」は、天然に存在しないペプチドまたはポリペプチドを指す。合成のペプチドまたはポリペプチドは、例えば、自動化ポリペプチド合成機を使用して合成され得る。様々な固相ペプチド合成方法が、当業者に既知である。タンパク質は、単一の機能的な生体分子を形成するために、１つまたは複数のポリペプチドを含み得る。タンパク質は、生物治療薬タンパク質、研究または治療において使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質および他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ならびに二重特異性抗体のうちのいずれかを含み得る。別の例示的な態様において、タンパク質は、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含み得る。タンパク質は、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えば、Ｐｉｃｈｉａ種）、哺乳類系（例えば、ＣＨＯ細胞、およびＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ誘導体）などの組換え細胞ベースの産生系を使用して産生され得る。生物治療薬タンパク質およびそれらの産生を考察する最近のレビューについては、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，”（Ｄａｒｉｕｓ Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，２８ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＧＥＮＥＴＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ ＲＥＶＩＥＷＳ１４７－１７６（２０１２））を参照されたい。いくつかの実施形態において、タンパク質は、修飾、付加物、および他の共有結合で連結された部分を含む。これらの修飾、付加物、および部分は、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン分子、修飾ビオチン分子、グリカン（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、マンノース、および他の単糖類）、ＰＥＧ、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ｍｙｃ－エピトープ、蛍光標識、および他の色素などを含む。タンパク質は、組成および溶解性に基づいて分類され得、したがって、球状タンパク質および線維状タンパク質などの単純タンパク質；ヌクレオタンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、およびリポタンパク質などのコンジュゲートタンパク質；ならびに一次由来タンパク質および二次由来タンパク質などの誘導タンパク質を含み得る。

いくつかの例示的な実施形態において、目的のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、融合タンパク質、およびそれらの組み合わせであり得る。

特定の態様において、目的のタンパク質は、アフリベルセプトであり得る（参照によりその教示全体が本明細書に組み込まれる、ＵＳ７，２７９，１５９を参照されたい）。

「抗体」という用語は、本発明で使用される場合、ジスルフィド結合によって相互接続された２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖の４本のポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶ_Ｈと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶ_Ｌと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（Ｃ_Ｌ１）を含む。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化され得、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が点在する。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４。本発明の異なる実施形態において、抗ｂｉｇ－ＥＴ－１抗体（もしくはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得るか、または天然にもしくは人工的に修飾され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義され得る。

「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、完全な抗体分子の抗原結合断片も含む。抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」および同様の用語は、本明細書で使用される場合、天然に存在する、酵素的に手得可能な、合成の、または遺伝子操作された、抗原に特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗体結合断片は、例えば、完全な抗体分子から、抗体可変ドメインおよび任意選択で定常ドメインをコードするＤＮＡの操作および発現に関連するタンパク質消化、または組換え遺伝子操作技術などの任意の好適切標準的技術を使用して、得ることができる。そのようなＤＮＡは既知であり、および／または例えば、市販の供給源、ＤＮＡライブラリー（例えばファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、または合成され得る。ＤＮＡは、例えば、１つ以上の可変および／もしくは定常ドメインを好適な構成へと配置するか、またはコドンを導入し、システイン残基を作成し、アミノ酸を修飾、付加、もしくは欠失などするために、化学的に、または分子生物学技術を使用することによって配列決定および操作され得る。

本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合領域または可変領域などの完全なままの抗体の一部分を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、および単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、ならびにトリアボディ、テトラボディ、線形抗体、単鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｖ断片は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ＳｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続された組換え単鎖ポリペプチド分子である。いくつかの例示的な実施形態において、抗体断片は、親抗体と同じ抗原に結合する断片である親抗体の十分なアミノ酸配列を含み、いくつかの例示的な実施形態において、断片は、親抗体と同等の親和性で抗原に結合し、および／または抗原への結合について親抗体と競合する。抗体断片は、任意の手段によって産生され得る。例えば、抗体断片は、完全なままの抗体の断片化によって酵素的または化学的に産生され得、かつ／またはそれは、部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に産生され得る。代替的または追加的に、抗体断片は、完全にまたは部分的に合成的に産生され得る。抗体断片は、任意選択で単鎖抗体断片を含み得る。代替的または追加的に、抗体断片は、例えば、ジスルフィド連結によって一緒に連結される複数の鎖を含み得る。抗体断片は、任意選択で多分子複合体を含み得る。機能的抗体断片は、典型的には、少なくとも約５０アミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも約２００アミノ酸を含む。

「二重特異性抗体」という語句は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することが可能な抗体を含む。二重特異性抗体は、概して、２つの異なる重鎖を含み、各重鎖は、２つの異なる分子（例えば、抗原）上または同じ分子上（例えば、同じ抗原上）のいずれかで異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第１のエピトープおよび第２のエピトープ）に選択的に結合することが可能である場合、第１の重鎖の第１のエピトープに対する親和性は、概して、第１の重鎖の第２のエピトープに対する親和性より少なくとも１～２、または３、または４桁低く、逆も同様である。二重特異性抗体によって認識されるエピトープは、同じまたは異なる標的上（例えば、同じまたは異なるタンパク質上）にあり得る。二重特異性抗体は、例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製され得る。例えば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合され得、そのような配列は、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞で発現し得る。

典型的な二重特異性抗体は、各々が３つの重鎖ＣＤＲを有する２つの重鎖、続いて、Ｃ_Ｈ１ドメイン、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２ドメイン、およびＣ_Ｈ３ドメイン、ならびに免疫グロブリン軽鎖を有し、その免疫グロブリン軽鎖は抗原結合特異性を付与しないが、各重鎖と会合可能であるか、または各重鎖と会合可能であり、かつ重鎖抗原結合領域によって結合されたエピトープのうちの１つ以上と会合可能であるか、または各重鎖と会合可能であり、かつ重鎖のうちの１つもしくは両方が１つもしくは両方のエピトープと結合可能である。ＢｓＡｂは、Ｆｃ領域を保有するもの（ＩｇＧ様）と、Ｆｃ領域を欠くものの２つの主要なクラスに分けることができ、後者は、通常、Ｆｃを含むＩｇＧおよびＩｇＧ様二重特異性分子よりも小さい。ＩｇＧ様ｂｓＡｂは、これらに限定されないが、トリオマブ、ノブイントゥホールＩｇＧ（ｋｉｈ ＩｇＧ）、クロスＭａｂ、ｏｒｔｈ－Ｆａｂ ＩｇＧ、二重可変ドメインＩｇ（ＤＶＤ－Ｉｇ）、ツーインワンもしくは二重作用Ｆａｂ（ＤＡＦ）、ＩｇＧ－単鎖Ｆｖ（ＩｇＧ－ｓｃＦｖ）、またはκλ－体などの異なる形式を有し得る。非ＩｇＧ様の異なる形式としては、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ形式、単鎖ダイアボディ、タンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ）、二重親和性再標的化分子（ＤＡＲＴ）、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ナノボディ、またはドックアンドロック（ＤＮＬ）法によって産生される抗体（Ｇａｏｗｅｉ Ｆａｎ，Ｚｕｊｉａｎ Ｗａｎｇ ＆ ｍｉｎｕｔｅｓ ｇｊｕ Ｈａｏ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，８ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＥＭＡＴＯＬＯＧＹ ＆ ＯＮＣＯＬＯＧＹ１３０、Ｄａｆｎｅ Ｍｕｌｌｅｒ ＆ Ｒｏｌａｎｄ Ｅ．Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ２６５－３１０（２０１４））が挙げられる。

ＢｓＡｂを産生する方法は、２つの異なるハイブリドーマ細胞株の体細胞融合に基づくクアドローマ技術、化学的架橋剤を含む化学的コンジュゲーション、および組換えＤＮＡ技術を利用する遺伝子アプローチであるが、これらに限定されない。ＢｓＡｂの例としては、以下の特許出願に開示されているものが挙げられ、これらは参照により本明細書に組み込まれる。２０１０年６月２５日に出願された米国特許出願第１２／８２３８３８号、２０１２年６月５日に出願された米国特許出願第１３／４８８６２８号、２０１３年９月１９日に出願された米国特許出願第１４／０３１０７５号、２０１５年７月２４日に出願された米国特許出願第１４／８０８１７１号、２０１７年９月２２日に出願された米国特許出願第１５／７１３５７４号、２０１７年９月２２日に出願された米国特許出願第１５／７１３５６９号、２０１６年１２月２１日に出願された米国特許出願第１５／３８６４５３号、２０１６年１２月２１日に出願された米国特許出願第１５／３８６４４３号、２０１６年７月２９日に出願された米国特許出願第１５／２２３４３号、および２０１７年１１月１５日に出願された米国特許出願第１５８１４０９５号。低レベルのホモ二量体不純物は、二重特異性抗体の製造中のいくつかのステップで存在し得る。そのようなホモ二量体不純物の検出は、通常の液体クロマトグラフィー法を使用して実施する場合、ホモ二量体不純物の存在量が少なく、これらの不純物が主な種と共溶出するため、インタクト質量分析を使用して実施する場合、困難である可能性がある。

本明細書で使用される場合、「多重特異性抗体」または「Ｍａｂ」とは、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する抗体を指す。そのような分子は通常、２つの抗原のみに結合するが（すなわち、二重特異性抗体、ＢｓＡｂ）、三重特異性抗体およびＫＩＨ三重特異性などの追加の特異性を有する抗体は、本明細書に開示される系および方法によって対処することができる。

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ハイブリドーマ技術を介して産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当技術分野において利用可能または既知の任意の手段によって、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一のクローンに由来し得る。本開示で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当技術分野において既知の多種多様な技術を使用して調製され得る。

いくつかの例示的な実施形態において、目的のタンパク質は、約４．５～約９．０の範囲のｐＩを有し得る。１つの例示的な特定の実施形態において、ｐＩは、約４．５、約５．０、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、または約９．０であり得る。

いくつかの例示的な実施形態において、組成物中の目的のタンパク質のタイプは、少なくとも２つであり得る。いくつかの特定の実施形態において、少なくとも２つの目的のタンパク質のうちの１つは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、抗体断片、融合タンパク質、または抗体－薬物複合体であり得る。いくつかの他の特定の実施形態において、少なくとも２つの目的のタンパク質のうちの１つの濃度は、約２０ｍｇ／ｍＬ～約４００ｍｇ／ｍＬであり得る。いくつかの例示的な実施形態において、組成物中の目的のタンパク質のタイプは、２つである。いくつかの例示的な実施形態において、組成物中の目的のタンパク質のタイプは、３つである。いくつかの例示的な実施形態において、組成物中の目的のタンパク質のタイプは、５つである。

いくつかの例示的な実施形態において、組成物中の２つ以上の目的のタンパク質は、トラップタンパク質、キメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、またはペプチドホルモンから選択され得る。

いくつかの例示的な実施形態において、組成物は、併用製剤であり得る。

いくつかの例示的な実施形態において、目的のタンパク質は、哺乳類細胞から精製され得る。哺乳類細胞は、ヒト起源または非ヒト起源のものであり得、初代上皮細胞（例えば、角化細胞、子宮頸部上皮細胞、気管支上皮細胞、気管上皮細胞、腎臓上皮細胞および網膜上皮細胞）、確立された細胞株およびそれらの株（例えば、２９３胎児腎臓細胞、ＢＨＫ細胞、ＨｅＬａ子宮頸部上皮細胞およびＰＥＲ－Ｃ６網膜細胞、ＭＤＢＫ（ＮＢＬ－１）細胞、９１１細胞、ＣＲＦＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢｅＷｏ細胞、Ｃｈａｎｇ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２細胞、ＨｅＬａ２２９細胞、ＨｅＬａＳ３細胞、Ｈｅｐ－２細胞、ＫＢ細胞、ＬＳＩ８０細胞、ＬＳ１７４Ｔ細胞、ＮＣＩ－Ｈ－５４８細胞、ＲＰＭＩ２６５０細胞、ＳＷ－１３細胞、Ｔ２４細胞、ＷＩ－２８ ＶＡ１３、２ＲＡ細胞、ＷＩＳＨ細胞、ＢＳ－Ｃ－Ｉ細胞、ＬＬＣ－ＭＫ２細胞、クローンＭ－３細胞、１－１０細胞、ＲＡＧ細胞、ＴＣＭＫ－１細胞、Ｙ－ｌ細胞、ＬＬＣ－ＰＫｉ細胞、ＰＫ（１５）細胞、ＧＨｉ細胞、ＧＨ３細胞、Ｌ２細胞、ＬＬＣ－ＲＣ２５６細胞、ＭＨｉＣｉ細胞、ＸＣ細胞、ＭＤＯＫ細胞、ＶＳＷ細胞、およびＴＨ－Ｉ、Ｂ１細胞、ＢＳＣ－１細胞、ＲＡｆ細胞、ＲＫ細胞、ＰＫ－１５細胞、またはそれらの誘導体）、任意の組織または器官由来の線維芽細胞（以下を含むがこれらに限定されない。心臓、肝臓、腎臓、結腸、腸、食道、胃、神経組織（脳、脊髄）、肺、血管組織（動脈、静脈、毛細血管）、リンパ組織（リンパ腺、咽頭扁桃腺、扁桃腺、骨髄、および血液）、脾臓、ならびに線維芽細胞および線維芽細胞様細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞、ＴＲＧ－２細胞、ＩＭＲ－３３細胞、Ｄｏｎ細胞、ＧＨＫ－２１細胞、シトルリン血症細胞、Ｄｅｍｐｓｅｙ細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５５１細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５１０細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２５細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５２９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３２細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５３９細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５４８細胞、Ｄｅｔｒｏｉｔ５７３細胞、ＨＥＬ２９９細胞、ＩＭＲ－９０細胞、ＭＲＣ－５細胞、ＷＩ－３８細胞、ＷＩ－２６細胞、Ｍｉｄｉ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＶ－１細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＣＯＳ－３細胞、ＣＯＳ－７細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＤＢＳ－ＦｒｈＬ－２細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｆ９細胞、ＳＶ－Ｔ２細胞、Ｍ－ＭＳＶ－ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｋ－ＢＡＬＢ細胞、ＢＬＯ－１１細胞、ＮＯＲ－１０細胞、Ｃ３Ｈ／ＩＯＴＩ／２細胞、ＨＳＤＭｉＣ３細胞、ＫＬＮ２０５細胞、ＭｃＣｏｙ細胞、マウスＬ細胞、２０７１株（マウスＬ）細胞、Ｌ－Ｍ株（マウスＬ）細胞、Ｌ－ＭＴＫ’（マウスＬ）細胞、ＮＣＴＣクローン２４７２および２５５５、ＳＣＣ－ＰＳＡ１細胞、Ｓｗｉｓｓ／３Ｔ３細胞、Ｉｎｄｉａｎ ｍｕｎｔｊａｃ細胞、ＳＩＲＣ細胞、Ｃｎ細胞、およびＪｅｎｓｅｎ細胞、Ｓｐ２／０、ＮＳ０、ＮＳ１細胞、またはそれらの派生物）を含み得る。

いくつかの例示的な実施形態において、組成物は安定であり得る。組成物の安定性は、活性薬剤の化学的安定性、物理的安定性、または機能的安定性を評価することを含み得る。本発明の製剤は、典型的には、活性薬剤の高いレベルの安定性を示す。

タンパク質製剤に関して、「安定である」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書で定義される例示的な条件下での保存後に許容可能な程度の化学構造または生物学的機能を保持することができる製剤内の目的のタンパク質を指す。製剤は、その中に含まれる目的のタンパク質が、規定された時間保存した後、その化学構造または生物学的機能の１００％を維持しない場合であっても、安定であり得る。ある特定の状況下では、規定された時間保存した後のタンパク質の構造または機能の約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の維持は、「安定である」とみなされ得る。

安定性は、とりわけ、規定された温度で規定された時間保存した後、製剤中に残存する天然タンパク質の割合を決定することによって測定され得る。天然タンパク質の割合は、とりわけ、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー［ＳＥ－ＨＰＬＣ］）によって決定され得、天然タンパク質は、非凝集および非分解を意味する。その語句が本明細書で使用される場合、「許容される程度の安定性」は、所与の温度で規定された時間保存した後、少なくとも９０％の天然形態のタンパク質が製剤中で検出され得ることを意味する。ある特定の実施形態において、規定された温度で規定された時間保存した後、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の天然形態のタンパク質が製剤中で検出され得る。安定性が測定されるまでの規定された時間は、少なくとも１４日間、少なくとも２８日間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間、またはそれ以上であり得る。

安定性は、とりわけ、規定された温度で規定された時間保存した後の製剤内の凝集体に形成されるタンパク質の割合を決定することによって測定され得、安定性は、形成される凝集体の割合に反比例する。この形態の安定性は、本明細書で「コロイド安定性」とも称される。凝集したタンパク質の割合は、とりわけ、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー［ＳＥ－ＨＰＬＣ］）によって決定され得る。その語句が本明細書で使用される場合、「許容できる程度の安定性」は、所与の温度で規定された時間保存した後、最大６％のタンパク質が、製剤中で検出される凝集形態にあることを意味する。ある特定の実施形態において、許容される程度の安定性は、所与の温度で規定された時間保存した後、最大約６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％のタンパク質が製剤中で凝集体で検出され得ることを意味する。安定性が測定されるまでの規定された時間量は、少なくとも約２週間、少なくとも２８日、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１１ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１８ヶ月、少なくとも２４ヶ月、またはそれ以上であり得る。安定性を評価する場合、医薬製剤が保存され得る温度は、約－８０℃～約４５℃の任意の温度、例えば、約－８０℃、約－３０℃、約－２０℃、約０℃、約４℃、約５℃、約２５℃、約３５℃、約３７℃、または約４５℃での保存であり得る。例えば、医薬製剤は、５℃で６ヶ月間の保存後、約３％未満、２％、１％、０．５％、または０．１％のタンパク質が凝集形態で検出される場合、安定であるとみなされ得る。医薬製剤はまた、約２５℃で６ヶ月間の保存後、約４％未満、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％のタンパク質が凝集形態で検出される場合、安定であるとみなされ得る。医薬製剤はまた、４５℃で２８日間の保存後、約６％未満、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％のタンパク質が凝集形態で検出される場合、安定であるとみなされ得る。医薬製剤はまた、－２０℃、－３０℃、または－８０℃で３ヶ月間の保存後、約３％未満、２％、１％、０．５％、または０．１％のタンパク質が凝集形態で検出される場合、安定であるとみなされ得る。

安定性はまた、とりわけ、規定された温度で規定された時間保存した後の製剤内の凝集体に形成されるタンパク質の割合を決定することによって測定され得、安定性は、形成される凝集体の割合に反比例する。この形態の安定性は、本明細書で「コロイド安定性」とも称される。凝集したタンパク質の割合は、とりわけ、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー［ＳＥ－ＨＰＬＣ］）によって決定され得る。その語句が本明細書で使用される場合、「許容できる程度の安定性」は、所与の温度で規定された時間保存した後、最大約６％のタンパク質が、製剤中で検出される凝集形態にあることを意味する。ある特定の実施形態において、許容される程度の安定性は、所与の温度で規定された時間保存した後、最大約６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％のタンパク質が製剤中で凝集体で検出され得ることを意味する。安定性が測定されるまでの規定された時間量は、少なくとも約２週間、少なくとも２８日、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１１ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１８ヶ月、少なくとも２４ヶ月、またはそれ以上であり得る。安定性を評価する場合、医薬製剤が保存され得る温度は、約－８０℃～約４５℃の任意の温度、例えば、約－８０℃、約－３０℃、約－２０℃、約０℃、約４°～８℃、約５℃、約２５℃、約３５℃、約３７℃、または約４５℃での保存であり得る。例えば、医薬製剤は、約５℃で６ヶ月間の保存後、約３％未満、２％、１％、０．５％、または０．１％のタンパク質が凝集形態で検出される場合、安定であるとみなされ得る。医薬製剤はまた、約２５℃で６ヶ月間の保存後、約４％未満、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％のタンパク質が凝集形態で検出される場合、安定であるとみなされ得る。医薬製剤はまた、４５℃で約２８日間の保存後、約６％未満、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％のタンパク質が凝集形態で検出される場合、安定であるとみなされ得る。医薬製剤はまた、約－２０℃、－３０℃、または－８０℃で３ヶ月間の保存後、約３％未満、２％、１％、０．５％、または０．１％のタンパク質が凝集形態で検出される場合、安定であるとみなされ得る。

安定性はまた、とりわけ、タンパク質の主な画分（「主な電荷形態」）中よりもイオン交換（「酸性形態」）中のより酸性の画分中で移行するタンパク質の割合を決定することによって測定され得、安定性は、酸性形態のタンパク質の画分に反比例する。理論に束縛されることを望まないが、タンパク質の脱アミド化は、タンパク質を、非アミド化タンパク質に対して、より負に荷電させ、したがってより酸性にする可能性がある（例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｎ．（２００２）“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ”ＰＮＡＳ，９９（８）：５２８３－５２８８を参照されたい）。「酸性化」タンパク質の割合は、とりわけ、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー［ＣＥＸ－ＨＰＬＣ］）によって決定され得る。その語句が本明細書で使用される場合、「許容できる程度の安定性」は、定義された温度で定義された時間保存した後、最大で４９％のタンパク質が、製剤中で検出されるより酸性形態にあることを意味する。特定の例示的な実施形態において、許容できる程度の安定性は、所与の温度で規定された時間保存した後、最大約４９％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．１％のタンパク質が製剤中で酸性形態で検出され得ることを意味する。安定性が測定されるまでの規定された時間量は、少なくとも約２週間、少なくとも２８日、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１１ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１８ヶ月、少なくとも２４ヶ月、またはそれ以上であり得る。

安定性を評価する場合、医薬製剤が保存され得る温度は、約－８０℃～約４５℃の任意の温度、例えば、約－８０℃、約－３０℃、約－２０℃、約０℃、約４°～８℃、約５℃、約２５℃、または約４５℃での保存であり得る。例えば、医薬製剤は、－８０℃、－３０℃、または－２０℃で３ヶ月間の保存後、約３０％未満、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％のタンパク質がより酸性の形態である場合、安定であるとみなされ得る。医薬製剤はまた、５℃で６ヶ月間の保存後、約３２％未満、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％のタンパク質がより酸性形態である場合、安定であるとみなされ得る。医薬製剤はまた、２５℃で６ヶ月間の保存後、約４３％未満、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％のタンパク質がより酸性形態である場合、安定であるとみなされ得る。医薬製剤はまた、４５℃で２８日間の保存後、約４９％未満、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％のタンパク質がより酸性形態である場合、安定であるとみなされ得る。

他の方法、例えば、熱安定性を決定するための示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）、機械的安定性を決定するための制御された撹拌、溶液濁度を決定するための約３５０ｎｍまたは約４０５ｎｍでの吸光度などを使用して、本発明の製剤の安定性を評価し得る。例えば、本発明の製剤は、約５℃～約２５℃で６ヶ月以上の保存後、製剤のＯＤ４０５の変化が、ゼロ時点での製剤のＯＤ４０５から約０．０５未満（例えば、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、またはそれ未満）である場合、安定であるとみなされ得る。タンパク質の標的に対する生理学的活性または結合親和性を測定することも、安定性を評価するために使用され得る。例えば、本発明の製剤は、例えば、５℃、２５℃、４５℃などで規定された時間（例えば、１～１２ヶ月）保存した後、製剤中に含まれるタンパク質が、該保存前のタンパク質の結合親和性の少なくとも９０％、９５％、またはそれ以上の親和性でその標的に結合する場合、安定であるとみなされ得る。結合親和性は、例えば、ＥＬＩＳＡまたはプラズモン共鳴により決定され得る。生物学的活性は、例えば、タンパク質を発現する細胞を、タンパク質を含む製剤と接触させるなど、タンパク質活性アッセイによって決定され得る。タンパク質のそのような細胞への結合は、例えば、ＦＡＣＳ分析などを介して直接測定され得る。代替的に、タンパク質の下流活性系は、タンパク質の存在下で測定され得、タンパク質の欠如下でのタンパク質の活性系と比較され得る。

いくつかの例示的な実施形態において、組成物は、疾患または障害の治療、予防、および／または改善のために使用され得る。本発明の医薬製剤の投与によって治療および／または予防され得る例示的な非限定的な疾患および障害は、感染症；呼吸器疾患；神経原性、神経障害性または侵害受容性の痛みに関連する任意の状態から生じる痛み；遺伝性障害；先天性障害；がん；疱疹；慢性特発性じん麻疹；強皮症；肥厚性瘢痕；ウィップル病；良性前立腺肥大症；軽度、中等度または重度の喘息などの肺障害；アレルギー反応；川崎病；鎌状赤血球症；チャーグ・ストラウス症候群；グレーブス病；子癇前症；シェーグレン症候群；自己免疫性リンパ増殖性症候群；自己免疫性溶血性貧血；バレット食道；自己免疫性ブドウ膜炎；結核；ネフローゼ；慢性関節リウマチを含む節炎；クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患；全身性エリテマトーデス；炎症性疾患；ＨＩＶ感染；ＡＩＤＳ；ＬＤＬアフェレーシス；ＰＣＳＫ９活性化変異による障害（機能変異の獲得、「ＧＯＦ」）；ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症（ｈｅＦＨ）による障害；原発性高コレステロール血症；脂質異常症；胆汁うっ滞性肝疾患；ネフローゼ症候群；甲状腺機能低下症；肥満；アテローム性動脈硬化症；心血管疾患；神経変性疾患；新生児発症多系炎症性障害（ＮＯＭ ＩＤ／ＣＩＮＣＡ）；ムックル・ウェルズ症候群（ＭＷＳ）；家族性寒冷自己炎症症候群（ＦＣＡＳ）；家族性地中海熱（ＦＭＦ）；腫瘍壊死因子受容体関連の周期的発熱症候群（ＴＲＡＰＳ）；全身型若年性特発性関節炎（スティル病）；１型および２型糖尿病；自己免疫疾患；運動ニューロン疾患；眼疾患；性感染症；結核；ＶＥＧＦアンタゴニストによって改善、阻害、もしくは軽減される疾患もしくは状態；ＰＤ－１阻害物質によって改善、阻害、もしくは軽減される疾患もしくは状態；インターロイキン抗体によって改善、阻害、もしくは軽減される疾患もしくは状態；ＮＧＦ抗体によって改善、阻害、もしくは軽減される疾患もしくは状態；ＰＣＳＫ９抗体によって改善、阻害、もしくは軽減される疾患もしくは状態；ＡＮＧＰＴＬ抗体によって改善、阻害、もしくは軽減される疾患もしくは状態；アクチビン抗体によって改善、阻害、もしくは軽減される疾患もしくは状態；ＧＤＦ抗体によって改善、阻害、もしくは軽減される疾患もしくは状態；Ｆｅｌ ｄ １抗体によって改善、阻害、もしくは軽減される疾患もしくは状態；ＣＤ抗体によって改善、阻害、もしくは軽減される疾患もしくは状態；Ｃ５抗体によって改善、阻害、もしくは軽減される疾患もしくは状態またはそれらの組み合わせを含む。

いくつかの例示的な実施形態において、組成物を、患者に投与し得る。投与は、当業者に許容される任意の経路を介し得る。非限定的な投与経路には、経口、局所、または非経口が含まれる。特定の非経口経路を介した投与は、針またはカテーテルを介して、滅菌シリンジまたは連続注入システムなどのいくつかの他の機械的デバイスによって推進されて、患者の体内に本発明の製剤を導入することを含み得る。本発明によって提供される組成物は、シリンジ、注射器、ポンプ、または非経口投与のための当技術分野において認識される任意の他のデバイスを使用して投与され得る。本発明の組成物はまた、肺または鼻腔内で吸収するためのエアロゾルとして投与され得る。組成物はまた、口腔内投与など、粘膜を介した吸収のために投与されてもよい。

本明細書で使用される場合、「ポリソルベート」は、撹拌、凍結融解プロセス、および空気／水界面などの様々な物理的ストレスから抗体を保護するために製剤開発において使用される一般的な賦形剤を指し（Ｅｍｉｌｙ Ｈａ，Ｗｅｉ Ｗａｎｇ ＆ Ｙ．Ｊｏｈｎ Ｗａｎｇ，Ｐｅｒｏｘｉｄｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，９１ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ２２５２－２２６４（２００２）、Ｂｒｕｃｅ Ａ．Ｋｅｒｗｉｎ，Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅｓ ２０ ａｎｄ ８０ Ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ Ｐａｔｈｗａｙｓ，９７ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ２９２４－２９３５（２００８）、Ｈａｎｎｓ－Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ Ｍａｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ａ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ａｎｄ ａ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｓｔｅｒｉｌｉｚｉｎｇ－Ｇｒａｄｅ Ｆｉｌｔｅｒｓ，９９ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２６２０－２６２７（２０１０））、ポリオキシエチレン－ソルビタンの脂肪酸エステルからなる非イオン性両親媒性界面活性剤を含み得る。エステルは、ポリオキシエチレンソルビタン頭基と、飽和モノラウラート側鎖（ポリソルベート２０、ＰＳ２０）または不飽和モノオレアート側鎖（ポリソルベート８０、ＰＳ８０）のいずれかとを含み得る。いくつかの例示的な実施形態において、ポリソルベートは、製剤中に０．００１％～２％（重量／容量）の範囲で存在し得る。ポリソルベートはまた、様々な脂肪酸鎖の混合物を含み得、例えば、ポリソルベート８０は、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸およびステアリン酸の脂肪酸を含み、モノオレアート画分は、多分散系混合物の約５８％を占める（Ｎｉｔｉｎ Ｄｉｘｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｓｕｌｆａｔａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，１０５ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ １６５７－１６６６（２０１６））。ポリソルベートの非限定的な例には、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、およびポリソルベート８０が含まれる。

ポリソルベートは、ｐＨおよび温度に依存して自動酸化を受けやすい可能性があり、さらに、ＵＶ光への曝露は、不安定性を産生する可能性もあり（Ｒａｖｕｒｉ Ｓ．ｋ．Ｋｉｓｈｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅｓ ２０ ａｎｄ ８０：Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ Ｔｈｅｒｍａｌ Ａｕｔｏｘｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ，１００ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ７２１－７３１（２０１１））、結果としてソルビタン頭基とともに溶液中の遊離脂肪酸をもたらす。ポリソルベートから生じる遊離脂肪酸は、６～２０個の炭素を有する任意の脂肪族脂肪酸を含み得る。遊離脂肪酸の非限定的な例としては、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、またはそれらの組み合わせが挙げられる。

いくつかの例示的な実施形態において、ポリソルベートは、遊離脂肪酸粒子を形成し得る。遊離脂肪酸粒子は、サイズが少なくとも５μｍであり得る。さらに、これらの脂肪酸粒子は、それらのサイズに従って、可視（＞１００μｍ）、肉眼で見えない（＜１００μｍ、これは、ミクロン（１～１００μｍ）およびサブミクロン（１００ｎｍ～１０００ｎｍ）に細分され得る）およびナノメートル粒子（＜１００ｎｍ）として分類され得る（Ｌｉｎｄａ Ｎａｒｈｉ，Ｊｅｒｅｍｙ Ｓｃｈｍｉｔ ＆ Ｄｅｅｐａｋ Ｓｈａｒｍａ，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ，１０１ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ４９３－４９８）。いくつかの例示的な実施形態において、脂肪酸粒子は、可視粒子であり得る。可視粒子は、目視検査によって決定され得る。いくつかの例示的な実施形態において、脂肪酸粒子は、肉眼で見えない粒子であり得る。肉眼で見えない粒子は、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ（ＵＳＰ）に従って、光遮断法によって監視され得る。

いくつかの例示的な実施形態において、組成物中のポリソルベートの濃度は、約０．００１％ｗ／ｖ、約０．００２％ｗ／ｖ、約０．００３％ｗ／ｖ、約０．００４％ｗ／ｖ、約０．００５％ｗ／ｖ、約０．００６％ｗ／ｖ、約０．００７％ｗ／ｖ、約０．００８％ｗ／ｖ、約０．００９％ｗ／ｖ、約０．０１％ｗ／ｖ、約０．０１１％ｗ／ｖ、約０．０１５％ｗ／ｖ、約０．０２％ｗ／ｖ、０．０２５％ｗ／ｖ、約０．０３％ｗ／ｖ、約０．０３５％ｗ／ｖ、約０．０４％ｗ／ｖ、約０．０４５％ｗ／ｖ、約０．０５％ｗ／ｖ、約０．０５５％ｗ／ｖ、約０．０６％ｗ／ｖ、約０．０６５％ｗ／ｖ、約０．０７％ｗ／ｖ、約０．０７５％ｗ／ｖ、約０．０８％ｗ／ｖ、約０．０８５％ｗ／ｖ、約０．０９％ｗ／ｖ、約０．０９５％ｗ／ｖ、約０．１％ｗ／ｖ、約０．１１％ｗ／ｖ、約０．１１５％ｗ／ｖ、約０．１２％ｗ／ｖ、約０．１２５％ｗ／ｖ、約０．１３％ｗ／ｖ、約０．１３５％ｗ／ｖ、約０．１４％ｗ／ｖ、約０．１４５％ｗ／ｖ、約０．１５％ｗ／ｖ、約０．１５５％ｗ／ｖ、約０．１６％ｗ／ｖ、約０．１６５％ｗ／ｖ、約０．１７％ｗ／ｖ、約０．１７５％ｗ／ｖ、約０．１８％ｗ／ｖ、約０．１８５％ｗ／ｖ、約０．１９％ｗ／ｖ、約０．１９５％ｗ／ｖ、または約０．２％ｗ／ｖであり得る。

いくつかの例示的な実施形態において、ポリソルベートは、組成物中に存在するリパーゼによって分解され得る。これらのリパーゼは、製造プロセスに由来し得るプロセス関連不純物であり得、細胞基質由来、細胞培養物由来、および下流由来の３つの主要なカテゴリーを含み得る。細胞基質由来不純物としては、宿主生物に由来するタンパク質および核酸（宿主細胞ゲノム、ベクター、または総ＤＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。細胞培養物由来の不純物は、誘導剤、抗生物質、血清、および他の培地成分を含むが、これらに限定されない。下流由来の不純物は、酵素、化学的および生化学的処理試薬（例えば、シアノゲン臭化物、グアニジン、酸化剤および還元剤）、無機塩（例えば、重金属、ヒ素、非金属イオン）、溶媒、担体、リガンド（例えば、モノクローナル抗体）、および他の浸出可能物を含むが、これらに限定されない。

一態様において、リパーゼは、セリンヒドロラーゼであり得る。特定の態様において、次いで、リパーゼは、カルボキシルエステラーゼＢ－１様タンパク質（Ａ０Ａ０６１Ｉ７Ｘ９）であり得る。別の特定の態様において、リパーゼは、肝カルボキシルエステラーゼ１様タンパク質（Ａ０Ａ０６１ＩＦＥ２）であり得る。さらに別の特定の態様において、リパーゼは、カルボキシルエステラーゼＢ－１様タンパク質および肝カルボキシルエステラーゼ１様タンパク質の両方であり得る。

いくつかの例示的な実施形態による検出する方法を使用することによって、分解に対するリパーゼの効果を同定した。

ある特定のタンパク質調製物中のポリソルベートを分解することができるリパーゼを同定したため、そのようなリパーゼレベルの特異的な、感受性の高い、定量的な決定および／または枯渇のための試薬、方法、およびキットを有すること、ならびに低レベルのリパーゼを含む組成物を調製する方法を開発することが非常に有利であり、望ましいであろう。

いくつかの例示的な実施形態において、本開示は、約５ｐｐｍ未満のカルボキシルエステラーゼＢ－１様タンパク質および／または肝カルボキシルエステラーゼ１様タンパク質を含む組成物を提供する。

いくつかの例示的な実施形態において、組成物中のカルボキシルエステラーゼＢ－１様タンパク質および／または肝カルボキシルエステラーゼ１様タンパク質の残留量は、約５ｐｐｍ未満であり得る。いくつかの特定の例示的な実施形態において、カルボキシルエステラーゼＢ－１様タンパク質および／または肝カルボキシルエステラーゼ１様タンパク質の残留量は、約０．０１ｐｐｍ未満、約０．０２ｐｐｍ、約０．０３ｐｐｍ、約０．０４ｐｐｍ、約０．０５ｐｐｍ、約０．０６ｐｐｍ、０．０７ｐｐｍ、０．０８ｐｐｍ、０．０９ｐｐｍ、約０．１ｐｐｍ、約０．２ｐｐｍ、約０．３ｐｐｍ、約０．４ｐｐｍ、約０．５ｐｐｍ、約０．６ｐｐｍ、０．７ｐｐｍ、０．８ｐｐｍ、０．９ｐｐｍ、約１ｐｐｍ、約２ｐｐｍ、約３ｐｐｍ、約４ｐｐｍ、または約５ｐｐｍである。

いくつかの例示的な実施形態において、本開示は、約５ｐｐｍ未満のカルボキシルエステラーゼＢ－１様タンパク質および／または肝カルボキシルエステラーゼ１様タンパク質を含む目的のタンパク質を有する組成物を調製する様々な方法を提供する。

本開示はまた、約５ｐｐｍ未満のカルボキシルエステラーゼＢ－１様タンパク質および／または肝カルボキシルエステラーゼ１様タンパク質を含む目的のタンパク質を有する組成物を調製する方法を提供し、本方法は、目的のタンパク質とリパーゼとを含む試料を形成することと、試料をプローブと接触させることであって、該プローブが、リパーゼに結合して複合体を形成することが可能である、接触させることと、複合体を試料から分離することと、を含む。

いくつかの例示的な実施形態において、試料は、培養された細胞培養液（ＣＣＦ）、採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）、プロセス性能認定（ＰＰＱ）、下流処理における任意のステップ、薬物溶液（ＤＳ）、または最終的に製剤化された産物を含む医薬品（ＤＰ）などのバイオプロセスの任意のステップから得ることができる。いくつかの他の特定の例示的な実施形態において、試料は、浄化、クロマトグラフィー精製、ウイルス不活性化、または濾過の下流プロセスの任意のステップから選択され得る。いくつかの特定の例示的な実施形態において、医薬品は、診療所、輸送、保存、または取り扱いにおける製造された医薬品から選択され得る。いくつかの他の特定の例示的な実施形態において、医薬品は、ポリソルベートを含み得る。

いくつかの例示的な実施形態において、約５ｐｐｍ未満のカルボキシルエステラーゼＢ－１様タンパク質および／または肝カルボキシルエステラーゼ１様タンパク質を含む目的のタンパク質を有する組成物を調製する方法はまた、さらなるクロマトグラフィーステップを含み得る。

いくつかの例示的な実施形態において、約５ｐｐｍ未満のカルボキシルエステラーゼＢ－１様タンパク質および／または肝カルボキシルエステラーゼ１様タンパク質を含む目的のタンパク質を有する組成物を調製する方法は、試料、クロマトグラフィーステップのうちの１つ以上からの溶出液、および／またはクロマトグラフィーステップのうちの１つ以上からの素通り画分のうちの１つまたはすべてを濾過することをさらに含み得る。

本明細書で使用される場合、「ウイルス濾過」には、Ａｓａｈｉ Ｋａｓｅｉ ＰｈａｒｍａからのＰｌａｎｏｖａ ２０Ｎ（商標）、５０ＮまたはＢｉｏＥｘ、ＥＭＤ ＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＶｉｒｅｓｏｌｖｅ（商標）フィルター、ＳａｒｔｏｒｉｕｓからのＶｉｒｏＳａｒｔ ＣＰＶ、またはＰａｌｌ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＵｌｔｉｐｏｒ ＤＶ２０またはＤＶ５０（商標）フィルターを含むが、これらに限定されない好適なフィルターを使用した濾過を含み得る。当業者には、所望の濾過性能を得るために好適なフィルターを選択することが明らかであろう。

いくつかの例示的な実施形態において、約５ｐｐｍ未満のカルボキシルエステラーゼＢ－１様タンパク質および／または肝カルボキシルエステラーゼ１様タンパク質を含む目的のタンパク質を有する組成物を調製する方法は、試料、クロマトグラフィーステップのうちの１つ以上からの溶出液、および／またはクロマトグラフィーステップのうちの１つ以上からの素通り画分のうちの１つまたはすべてに、ＵＦ／ＤＦを実施することをさらに含み得る。

本明細書で使用される場合、「限外濾過」または「ＵＦ」という用語は、静水圧を使用して水を半透過性膜に通過させる逆浸透と同様の膜濾過プロセスを含み得る。限外濾過は、ＬＥＯＳ Ｊ．ＺＥＭＡＮ ＆ ＡＮＤＲＥＷ Ｌ．ＺＹＤＮＥＹ，ＭＩＣＲＯＦＩＬＴＲＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＬＴＲＡＦＩＬＴＲＡＴＩＯＮ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ（１９９６）に詳細に説明されている。０．１μｍより小さい孔径のフィルターを、限外濾過に使用し得る。このような小さい孔径を有するフィルターを採用することによって、抗体がフィルターの後ろに保持されながら、フィルターを通過する試料緩衝液の透過を介して試料の容積を低減させ得る。

本明細書で使用される場合、「透析濾過」または「ＤＦ」は、塩、糖、および非水溶媒を除去および交換するため、結合種から遊離を分離するため、低分子量材料を除去するため、ならびに／またはイオンおよび／もしくはｐＨ環境の急速な変化を引き起こすために限外濾過装置を使用する方法を含み得る。微細溶質は、限外濾過されている溶液に、限外濾過速度とほぼ等しい速度で溶媒を添加することによって最も効率的に除去される。これは、溶液から一定体積で微細種を洗浄し、保持された抗体を効果的に製造する。本発明のある特定の実施形態において、任意選択でさらなるクロマトグラフィーまたは他の精製ステップの前に、本発明に関連して使用される様々な緩衝液を交換するために、ならびに抗体調製物から不純物を除去するために、透析濾過ステップが採用され得る。

いくつかの例示的な実施形態において、プローブは、固体支持体上に連結することが可能であり得る。固体支持体は、周知の支持体、または現在広く使用されているかもしくは固定化、分離などのために提案されているマトリックスのうちのいずれかであり得る。これらは、粒子、シート、ゲル、フィルター、膜、繊維、キャピラリー、または微量滴定ストリップ、チューブ、プレート、もしくはウェルなどの形態を取り得る。好都合に、支持体は、ガラス、シリカ、ラテックス、またはポリマー材料から作製され得る。微粒子物質、例えばビーズは、それらのより高い結合能力によって、特にポリマービーズが概して好ましい。本発明に従って使用される微粒子固体支持体は、球状ビーズを含むであろう。本発明の方法での使用に好適な非磁性ポリマービーズは、Ｄｙｎｏ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ＡＳ（Ｌｉｌｌｅｓｔｒｏｍ，Ｎｏｒｗａｙ）から、ならびにＱｉａｇｅｎ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ ａｎｄ Ｓｅｒｏｔｅｃから入手可能である。

しかしながら、操作および分離を補助するために、磁性ビーズが好ましい。本明細書で使用される場合、「磁性」という用語は、支持体が磁場に配置されると、磁気モーメントを得ることが可能であり、したがって、その磁場の作用下で置き換え可能であることを意味する。換言すれば、核酸結合ステップに続いて迅速、単純、かつ効率的に粒子を分離する方式を提供する、核酸を分解し得る剪断力を生成する遠心分離などの従来の技術よりもはるかに過酷ではない方法である磁性凝集によって、磁性粒子を含む支持体は容易に除去することができる。したがって、本発明の方法を使用して、プローブとリパーゼとの間で形成された複合体は、例えば、永久磁石を使用して、磁場を印加することによって除去することができる。通常、試料混合物を含む容器の側面に磁石を適用して、粒子を容器の壁に凝集させ、試料の残留物を注ぎ出すのに、磁場の印加は十分である。いくつかの特定の態様において、反応中の粒子の磁気凝集および塊化を回避し、したがって均一性および核酸抽出を確実にすることができるため、超常磁性粒子、例えば、ＳｉｎｔｅｆによってＥＰ－Ａ－１０６８７３に記載されているものが使用され得る。Ｄｙｎａｌ ＡＳ（Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）によってＤＹＮＡＢＥＡＤＳとして販売されている周知の磁性粒子は、本発明での使用に特に適している。さらに、ビーズまたは他の支持体は、異なるタイプの官能化表面、例えば、正に帯電しているか、または疎水性を有するように調製されていてもよい。弱く正に帯電した表面、および強く正に帯電した表面、弱く負に帯電した中性表面、ならびに例えばポリウレタンコーティングされた疎水性表面が良好に機能することが示されている。

いくつかの例示的な実施形態において、プローブは、リガンドを使用して固体支持体上に連結することが可能であり得る。非限定的な例としては、インジケーター、ビオチン分子、修飾ビオチン分子、修飾ビオチン分子、修飾ビオチン分子、核、タンパク質配列、エピトープタグ、電子不足分子、または電子豊富分子が挙げられ得る。リガンドの特定の例としては、ビオチン分子、またはデイミノビオチン分子、デスチオビオチン分子などの修飾されたビオチン分子、１，２－ジヒドロキシエタン、１，２－ジヒドロキシシクロヘキサンなどの隣接ジオール、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、グルタチオン、２，４－ジントロベンゼン（ｄｉｎｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅ）、フェニルアルソン酸（ｐｈｅｎｙｌａｒｓｅｎａｔｅ）、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ポリペプチドノペプチド、金属キレート、糖類、ローダミンもしくはフルオレセイン、または抗体を生成することができる任意のハプテンが挙げられ得るが、これらに限定されない。リガンドおよびそれらの捕捉試薬の例としては、例えば、ストレパビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）－アガロース、オリゴマー－アビジン－アガロース、またはモノマー－アビジン－アガロースの形態で使用され得る、アビジン／ストレプトアビジンファミリーのタンパク質に結合するデイミノビオチン分子、修飾ビオチン分子を含むデチオビオチンまたは構造修飾ビオチン系試薬；任意の１，２－ジオール、例えば、１，２－ジヒドロキシエタン（ＨＯ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＯＨ）、および環式アルカンのもの、例えば、アルキルまたはアリール基を介してアガロースなどの固体支持材料に結合し得るフェニル－Ｂ（ＯＨ）_２またはヘキシル－Ｂ（Ｏエチル）_２などの、アルキルまたはアリールボロン酸またはボロン酸エステルに結合する１，２－ジヒドロキシシクロヘキサンを含む、他の１，２－ジヒドロキシアルカン；マルトース結合タンパク質に結合するマルトース（ならびに上で考察された特性を有する任意の他の糖／糖結合タンパク質対、またはより一般には任意のリガンド／リガンド結合タンパク質対）；例えばジニトロフェニル基が抗ジニトロフェニル－ｌｇＧに結合するであろう、ハプテンを認識する抗ハプテン抗体にハプテンが結合する任意の抗体では、ジニトロフェニル基などのハプテン；遷移金属捕捉試薬が、ニトリロ三酢酸キレート化Ｎｉ（ＩＩ）またはイミノ二酢酸キレート化Ｎｉ（ＩＩ）などの樹脂結合キレート化遷移金属の形態で使用され得る、例えばオリゴマーヒスチジンがＮｉ（ＩＩ）に結合するであろう、遷移金属に結合するリガンド；グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼに結合するグルタチオンが挙げられるが、これらに限定されない。

本開示はまた、試料をセリンヒドロラーゼプローブと接触させることによって、試料中の肝カルボキシルエステラーゼ－１様タンパク質または肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ１様タンパク質を検出する方法を提供する。一態様において、試料中のリパーゼを検出する方法は、試料をセリンヒドロラーゼプローブと接触させ、インキュベートして、リパーゼとセリンヒドロラーゼプローブとの複合体を形成することを含み得る。さらなる態様において、試料中のリパーゼを検出する方法は、リパーゼとセリンヒドロラーゼプローブとの複合体を形成していないセリンヒドロラーゼプローブを濾過することを含み得る。

いくつかの例示的な実施形態において、試料中のリパーゼを検出する方法は、磁性ビーズがリパーゼとセリンヒドロラーゼプローブとの複合体に結合するように、試料を、セリンヒドロラーゼプローブに結合する能力を有する磁性ビーズと接触させる接触させることをさらに含み得る。

いくつかの特定の例示的な実施形態において、リパーゼとセリンヒドロラーゼプローブとの複合体に結合した磁性ビーズは、試料からさらに除去され、緩衝液で洗浄され得る。

いくつかの例示的な実施形態において、試料中のリパーゼを検出する方法は、リパーゼとセリンヒドロラーゼプローブとの複合体に結合している磁性ビーズを除去して、リパーゼが濃縮された溶液を形成することをさらに含み得る。

いくつかの例示的な実施形態において、試料中のリパーゼを検出する方法は、加水分解剤を溶液に添加して、消化物を得ることをさらに含み得る。

本明細書で使用される場合、用語「加水分解剤」は、タンパク質の消化を実施し得る多数の種々の薬剤のうちの任意の１つまたは組み合わせを指す。酵素消化を実施し得る加水分解剤の非限定的な例としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓａｉｔｏｉ由来のプロテアーゼ、エラスターゼ、サブチリシン、プロテアーゼＸＩＩＩ、ペプシン、トリプシン、Ｔｒｙｐ－Ｎ、キモトリプシン、アスペルギロペプシンＩ、ＬｙｓＮプロテアーゼ（Ｌｙｓ－Ｎ）、ＬｙｓＣエンドプロテアーゼ（Ｌｙｓ－Ｃ）、エンドプロテアーゼＡｓｐ－Ｎ（Ａｓｐ－Ｎ）、エンドプロテアーゼＡｒｇ－Ｃ（Ａｒｇ－Ｃ）、エンドプロテアーゼＧｌｕ－Ｃ（Ｇｌｕ－Ｃ）または外膜タンパク質Ｔ（ＯｍｐＴ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、またはそれらの生物学的に活性な断片、もしくはそれらのホモログ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。非酵素消化を実施し得る加水分解剤の非限定的な例としては、高温、マイクロ波、超音波、高圧、赤外線、溶媒（非限定的な例は、エタノールおよびアセトニトリル）、固定化酵素消化（ＩＭＥＲ）、磁性粒子固定化酵素、およびオンチップ固定化酵素の使用が挙げられる。タンパク質消化のための利用可能な技術を考察する最近のレビューについては、Ｓｗｉｔａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ”（Ｌｉｎｄａ Ｓｗｉｔｚａｒ，Ｍａｒｔｉｎ Ｇｉｅｒａ ＆ Ｗｉｌｆｒｉｅｄ Ｍ．Ａ．Ｎｉｅｓｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，１２ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＲＯＴＥＯＭＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ １０６７－１０７７（２０１３））を参照されたい。加水分解剤の１つまたは組み合わせは、タンパク質またはポリペプチドにおいて、配列特異的な様式でペプチド結合を切断し、より短いペプチドの予測可能な収集物を生成し得る。

加水分解剤対リパーゼの比および消化に必要な時間は、リパーゼの消化を得るために適切に選択され得る。酵素対基質比が不適切に高い場合、対応して消化速度が高いことで、ペプチドが質量分析計によって分析されるのに十分な時間が得られず、配列カバレッジが損なわれる。一方、低いＥ／Ｓ比は、長い消化を必要とし、したがって、データ取得時間が長くなる。酵素対基質比は、約１：０．５～約１：２００の範囲であり得る。本明細書で使用される場合、用語「消化」は、タンパク質の１つ以上のペプチド結合の加水分解を指す。適切な加水分解剤、例えば、酵素消化または非酵素消化を使用して、試料中のタンパク質の消化を実施するためのいくつかのアプローチがある。

いくつかの例示的な実施形態において、試料中のリパーゼを検出する方法は、タンパク質変性剤を溶液に添加することをさらに含み得る。

本明細書で使用される場合、「タンパク質変性」は、ペプチド結合の破裂がなく、分子の三次元形状をその天然の状態から変化させるプロセスを指し得る。タンパク質変性は、タンパク質変性剤を使用して実施し得る。タンパク質変性剤の非限定的な例としては、熱、高または低ｐＨ、またはカオトロピック剤への曝露が挙げられる。いくつかのカオトロピック剤をタンパク質変性剤として使用し得る。カオトロピック溶質は、水素結合、ファンデルワールス力、および疎水性効果などの非共有結合力によって媒介される分子内相互作用を妨げることによって、系のエントロピーを増加させる。カオトロピック剤の非限定的な例には、ブタノール、エタノール、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、Ｎ－ラウロイルサルコシン、尿素、およびそれらの塩が挙げられる。特定の態様において、タンパク質変性剤は、尿素であり得る。

いくつかの例示的な実施形態において、試料中のリパーゼを検出する方法は、タンパク質変性剤または還元剤を溶液に添加することをさらに含み得る。

本明細書で使用される場合、「タンパク質還元剤」という用語は、タンパク質中のジスルフィド架橋の還元のために使用される薬剤を指す。タンパク質を還元するために使用されるタンパク質還元剤の非限定的な例は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β－メルカプトエタノール、エルマン試薬、ヒドロキシルアミン塩酸塩、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）、またはそれらの組み合わせである。一態様において、タンパク質還元剤は、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）であり得る。

いくつかの例示的な実施形態において、試料中のリパーゼを検出する方法は、タンパク質アルキル化剤を溶液に添加することをさらに含み得る。

本明細書で使用される場合、「タンパク質アルキル化剤」という用語は、タンパク質中の特定の遊離アミノ酸残基のアルキル化のために使用される薬剤を指す。タンパク質アルキル化剤の非限定的な例は、ヨードアセトアミド（ＩＯＡ）、クロロアセトアミド（ＣＡＡ）、アクリルアミド（ＡＡ）、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）、メタンチオスルホン酸メチル（ＭＭＴＳ）、および４－ビニルピリジン、またはこれらの組み合わせである。

いくつかの例示的な実施形態において、試料中のリパーゼを検出する方法は、消化物を分析して、リパーゼを検出することをさらに含み得る。一態様において、消化物は、質量分析計を使用して分析され得る。特定の態様において、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。別の特定の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムに連結され得る。さらに別の特定の態様において、質量分析計は、液体クロマトグラフィー－多重反応監視システムに連結され得る。

本明細書で使用される場合、「質量分析計」という用語は、特定の分子種を同定し、それらの正確な質量を測定することが可能なデバイスを含む。この用語は、検出および／または特徴決定のためにポリペプチドまたはペプチドが溶出され得る任意の分子検出器を含むことを意味する。質量分析計は、イオン源、質量分析器、および検出器の３つの主要な部分を含み得る。イオン源の役割は、気相イオンを作成することである。分析物の原子、分子、またはクラスターを気相に移動させ、同時に（エレクトロスプレーイオン化のように）または別々のプロセスを介してイオン化し得る。イオン源の選択は、用途に大きく依存する。

本明細書で使用される場合、用語「タンデム質量分析」は、質量選択および質量分離の複数の段階を使用することによって、試料分子の構造情報が得られる技術を含む。前提条件は、試料分子を気相に移動させ、完全なままイオン化し得ること、ならびにそれらを、第１の質量選択ステップの後、何らかの予測可能で制御可能な方式で崩壊するように誘導し得ることである。多段階ＭＳ／ＭＳ、またはＭＳ^ｎは、まず、前駆体イオン（ＭＳ^２）を選択して単離し、断片化し、一次断片イオン（ＭＳ^３）を単離し、断片化し、二次断片（ＭＳ^４）を単離し、意味のある情報を得ることができるか、または断片化イオン信号が検出可能である限り、実施することができる。タンデムＭＳは多種多様な分析器の組み合わせで成功裏に実施されている。特定の用途のためにどの分析器を組み合わせるかは、感度、選択性、および速度だけでなく、サイズ、コスト、および可用性などの多くの異なる要因によって決定され得る。タンデムＭＳ方法の２つの主要なカテゴリーは、タンデムインスペースおよびタンデムインタイムであるが、タンデムインタイム分析器が空間内で、またはタンデムインスペース分析器と連結されるハイブリッドも存在する。タンデムインスペース質量分析計は、イオン源、前駆体イオン活性化デバイス、および少なくとも２つの非捕獲質量分析器を含む。特定のｍ／ｚ分離機能は、機器の１つのセクションにおいてイオンが選択され、中間領域において解離され、次いで産物イオンがｍ／ｚ分離およびデータ取得のために別の分析器に伝達されるように設計され得る。タンデムインタイムにおいては、イオン源において産生された質量分析イオンは、同じ物理デバイスにおいて捕獲、単離、断片化、およびｍ／ｚ分離され得る。

質量分析計によって同定されたペプチドは、完全なままのタンパク質およびそれらの翻訳後修飾の代理の代表物として使用され得る。実験および理論的なＭＳ／ＭＳデータを相関させることによってそれらをタンパク質の特徴決定に使用し得、後者は、タンパク質配列データベースにおける可能性のあるペプチドから生成される。特徴決定には、タンパク質断片のアミノ酸の配列決定、タンパク質配列決定、タンパク質デノボ配列決定、翻訳後修飾の位置特定、または翻訳後修飾の同定、または比較可能性分析、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「データベース」という用語は、データベースにおけるすべての可能性のある配列に対して解釈されていないＭＳ－ＭＳスペクトルを検索する可能性を提供するバイオインフォマティクスツールを指す。そのようなツールの非限定的な例は、Ｍａｓｃｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）、ＰＬＧＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗａｔｅｒｓ．ｃｏｍ）、ＰＥＡＫＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｗｎｌｏａｄ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／／ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ）、Ｐｈｅｎｙｘ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｅｎｙｘ－ｍｓ．ｃｏｍ）、Ｓｏｒｃｅｒｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｇｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）、ＯＭＳＳＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｓｓａ／）、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ／ＴＡＮＤＥＭ／）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ／ｍｓｈｏｍｅ．ｈｔｍ）、Ｂｙｏｎｉｃ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔｒｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｙｏｎｉｃ）またはＳｅｑｕｅｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｆｉｅｌｄｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｓｔ）である。

いくつかの例示的な実施形態において、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムに連結され得る。

本明細書で使用される場合、「クロマトグラフィー」という用語は、液体または気体によって担持される化学混合物が、固定した液体または固相の周囲または上を流れるとき化学的存在物の差分分布の結果として成分に分離され得るプロセスを指す。クロマトグラフィーの非限定的な例としては、従来の逆相（ＲＰ）、イオン交換（ＩＥＸ）および順相クロマトグラフィー（ＮＰ）が挙げられる。疎水性相互作用、親水性相互作用、およびイオン性相互作用がそれぞれ優勢な相互作用モードであるＲＰ、ＮＰ、およびＩＥＸクロマトグラフィーとは異なり、混合モードクロマトグラフィーは、これらの相互作用モードのうちの２つ以上の組み合わせを採用し得る。迅速分離液体クロマトグラフィー（ｒａｐｉｄ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＲＲＬＣ）、超高性能液体クロマトグラフィー（ｕｌｔｒａ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＵＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ｕｌｔｒａ－ｆａｓｔ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＵＦＬＣ）およびナノ液体クロマトグラフィー（ｎＬＣ）などのいくつかのタイプの液体クロマトグラフィーを、質量分析計とともに使用することができる。クロマトグラフィーの方法および原理のさらなる詳細については、Ｃｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（ＣＯＬＩＮ Ｆ．ＰＯＯＬＥ ＥＴ ＡＬ．，ＬＩＱＵＩＤ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬＳ ＡＮＤ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＡＴＩＯＮ（２０１７））を参照されたい。

いくつかの例示的な実施形態において、質量分析計は、ナノ液体クロマトグラフィーに連結し得る。いくつかの例示的な実施形態において、液体クロマトグラフィーにおいてタンパク質を溶出するために使用される移動相は、質量分析計と適合性であり得る移動相であり得る。いくつかの特定の例示的な実施形態において、移動相は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、もしくはギ酸アンモニウム、またはそれらの組み合わせであり得る。

いくつかの例示的な実施形態において、質量分析計は、液体クロマトグラフィー－多重反応監視システムに連結され得る。

本明細書で使用される場合、「複数反応監視」または「ＭＲＭ」は、高感度、特異度および幅広いダイナミックレンジを有する複合マトリックス内の低分子、ペプチド、およびタンパク質を正確に定量化することができる質量分析ベースの技術を指す（Ｐａｏｌａ Ｐｉｃｏｔｔｉ ＆ Ｒｕｅｄｉ Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ：ｗｏｒｋｆｌｏｗｓ，ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ｐｉｔｆａｌｌｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ，９ ＮＡＴＵＲＥ ＭＥＴＨＯＤＳ ５５５－５６６（２０１２））。ＭＲＭは、典型的には、選択された低分子／ペプチドに対応する前駆体イオンが第１の四重極で選択され、前駆体イオンの断片イオンが第３の四重極で監視するために選択される、三重四重極質量分析計で実施され得る（Ｙｏｎｇ Ｓｅｏｋ Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ ｆｌｕｉｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ，９３０ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ Ｂ １２９－１３５（２０１３））。

いくつかの例示的な実施形態において、質量分析計は、液体クロマトグラフィー－選択された反応監視システムに連結され得る。

本発明は、任意の好適な手段によって選択され得る、前述のクロマトグラフィー樹脂、賦形剤、濾過方法、加水分解剤、タンパク質変性剤、タンパク質アルキル化剤、同定に使用される機器、および任意のクロマトグラフィー樹脂、賦形剤、濾過方法、加水分解剤、タンパク質変性剤、タンパク質アルキル化剤、同定に使用される機器のうちのいずれかに限定されないことを理解される。

特許、特許出願、公開特許出願、受託番号、技術論文、および学術論文を含む、様々な刊行物が、本明細書全体を通して引用される。これらの引用された文献の各々は、参照によりその全体がすべての目的のために本明細書に組み込まれる。

本発明は、以下の実施例を参照することによって、より完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

材料
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ＡｃｔｉｖＸデスチオビオチン－ＦＰセリンヒドロラーゼプローブ、ギ酸、アセトニトリル、ジオチオスレイトール（ＤＴＴ）、および１ステップウルトラＴＭＤブロッティング溶液は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。酢酸、１０倍Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および尿素は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ＥＤＴＡおよび０．００５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ－２０を含むＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ－ＥＰ）は、ＧＥ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。モノクローナル抗体原薬は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｃ．で作製された。ポリソルベート８０は、Ｃｒｏｄａ（Ｅａｓｔ Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から購入した。ウサギｒＬＥは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ヒトＣＥＳ－１は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＵＫ）から購入した。配列決定グレードの改変トリプシンは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した。Ｏａｓｉｓ Ｍａｘカラム（２．１×２０ｍｍ、３０μｍ）およびＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ）は、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した。Ａｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ１００ Ｃ１８分析カラム（０．０７５×２５０ｍｍ、３μｍ）およびＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ１００ Ｃ１８トラップカラム（０．０７５×２０ｍｍ、３μｍ）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。ＤＰＢＳ（１０倍）は、Ｇｉｂｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入し、Ｔｗｅｅｎ２０はＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）から購入した。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を有するＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。

ポリソルベート分解を分析するための二次元液体クロマトグラフィー－荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）／質量分析（ＭＳ）方法
ＣＨＯ細胞を含まない培地または製剤化された抗体中のＰＳ２０およびＰＳ８０の分解は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｙｉ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｕｌｔｒａｈｉｇｈ－Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｃｈａｒｇｅｄ Ａｅｒｏｓｏｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，８６ ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ５１５０－５１５７（２０１４））によって以前に説明されている二次元ＨＰＬＣ－ＣＡＤ／ＭＳ方法によって分析した。まず、９９％の溶媒Ａ（水中０．１％のギ酸）および１％の溶媒Ｂ（アセトニトリル中０．１％のギ酸）で予め平衡化したＯａｓｉｓ ＭＡＸカラム（２．１×２０ｍｍ、３０μｍ）を使用して、ポリソルベートを製剤化されたｍＡｂから分離した。試料注入後、平衡化勾配を１分間保持し、続いて溶媒Ｂを４分で１５％に直線的に増加させて、ポリソルベートをｍＡｂから分離した。次いで、溶出したポリソルベートを、逆相クロマトグラフィーに基づく分離のために、スイッチバルブを使用してＡｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ４カラム（２．１×５０ｍｍ、１．７μｍ）に迂回させた。分離開始時に、溶媒Ｂを１．５分で２０％に急速に増加させ、次いで４５分で９９％に徐々に増加させ、５分間保持し、続いて５分間１％のＢの平衡化ステップを行った。流量を０．１ｍＬ／分、カラム温度を４０℃に維持した。

２Ｄ－ＬＣシステムは、Ｔｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００を用いて設定し、Ｃｏｒｏｎａ Ｕｌｔｒａ ＣＡＤ検出器と連結させ、定量化のために７５ｐｓｉの窒素圧力で操作した。Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ７は、システム制御およびデータ分析に使用された。ＥＳＩ源を備えたＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓを、特徴決定のみのために２Ｄ－ＬＣシステムと連結させた。機器を、３．８ｋＶのキャピラリー電圧、３５０℃のキャピラリー温度、４０℃のシース流量、および１０の補助流量で、正のモードで操作した。フルスキャンスペクトルを、１５０～２０００のｍ／ｚ範囲にわたって収集した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェアを使用して、ＭＳデータを収集および分析した。

各エステルのピーク面積をＣＡＤクロマトグラムから得、分解されていないＰＳ８０を考慮して加算した。分解後のＰＳ８０の残存割合は、２５分～３０分の各時点での溶出モノエステルのピーク面積の合計を、ゼロ時点でのピーク面積の合計と比較することによって算出した。異なる水準のエステルまたは総エステルの相対割合も同様に算出され得る。

ヒトＣＥＳ－１、ウサギＬＥＳ、および製剤化された抗体を用いたＰＳ８０分解アッセイ
ＰＳ８０に対するヒトＣＥＳ－１およびウサギＬＥＳの影響を、２μＬの０．１ｍｇ／ｍＬのヒトＣＥＳ－１または０．０２ｍｇ／ｍＬのウサギＬＥＳを、１６μＬの１０ｍＭのｐＨ６．０のヒスチジン緩衝液中１％の２μＬのＰＳ８０と混合し、続いて４℃でそれぞれ、１．５、８、および１８時間インキュベーションすることによって調べた。各溶液の１つのアリコート（３μＬ）を、ｐＨ６．０の７２μＬの１０ｍＭのヒスチジンを添加することによって２５倍希釈し、その後ＬＣ－ＣＡＤ分析を行った。

製剤化されたｍＡｂ中のＰＳ８０の加水分解を、１８μＬの５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ（ｐＨ６．０の１０ｍＭのヒスチジンへ緩衝液交換）を２μＬの１％のＰＳ８０と混合し、次いで５℃で１８、２４、および３６時間インキュベートすることによって調べた。各溶液の１つのアリコート（３μＬ）を、ｐＨ６の１０ｍＭのヒスチジンによって２５倍希釈し、その後ＬＣ－ＣＡＤ分析を行った。

ＣＨＯ由来抗体からのリパーゼの阻害
ＡｃｔｉｖＸデスチオビオチン－ＦＰセリンヒドロラーゼプローブを、ストック溶液としてＤＭＳＯ中で０．１ｍＭまで希釈した。等分した１．２５μＬ、５μＬ、および２０μＬのプローブストック溶液を各々、１ｍＬの最終体積で１倍のＰＢＳ中５ｍｇのｍＡｂと混合し、続いて室温で１時間穏やかに回転させた。次いで、各混合物をｐＨ６．０の１０ｍＭのヒスチジン中で緩衝液交換して遊離プローブを除去し、ｍＡｂ濃度を５０ｍｇ／ｍＬに調整した。緩衝液交換した各試料を０．１％のＰＳ８０とともに５℃でインキュベートし、続いてＬＣ－ＣＡＤ ＰＳ８０分解アッセイを行った。

ＣＨＯ由来抗体からのリパーゼの枯渇
固定したＡｃｔｉｖＸデスチオビオチン－ＦＰセリンヒドロラーゼプローブを使用することによって、リパーゼ枯渇実験を実施した。プローブを固定するために、まず、室温で２時間穏やかに回転させることによって、３５μＬのＡｃｔｉｖＸ デスチオビオチン－ＦＰセリンヒドロラーゼプローブ（ＤＭＳＯ中０．１ｍＭのストック溶液）を１倍のＰＢＳ中１ｍＬの最終体積まで２ｍｇのストレプトアビジンダイナビーズと連結させた。プロセス対照試料を、３５μＬのＤＭＳＯを１倍で１ｍＬの最終体積まで２ｍｇのストレプトアビジンダイナビーズと混合し、室温で２時間穏やかに回転させることによって調製した。ビーズを、１倍のＰＢＳによって３回洗浄し、次いで、８００μＬの１倍のＰＢＳ中に再懸濁させた。次いで、５ｍｇのｍＡｂ試料をＦＰプローブに連結させたストレプトアビジンダイナビーズに添加し、穏やかに回転させながら室温で１時間インキュベートした。上清をｐＨ６．０の１０ｍＭのヒスチジン中で緩衝液交換し、ｍＡｂ濃度を５０ｍｇ／ｍＬに調整した。次いで、緩衝液交換した上清試料を０．１％のＰＳ８０とともに５℃でインキュベートし、続いてＬＣ－ＣＡＤ ＰＳ８０分解アッセイを行った。

ＡＢＰＰを用いるＣＨＯ由来抗体中の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の検出
ＡｃｔｉｖＸデスチオビオチン－ＦＰセリンヒドロラーゼプローブを、ストック溶液としてＤＭＳＯ中で０．１ｍＭまで希釈した。まず、等分した２０μＬのプローブストック溶液を、１ｍＬの最終体積まで１倍のＰＢＳ中５ｍｇのｍＡｂと混合し、続いて室温で１時間穏やかに回転させた。濾過によって遊離プローブを除去し、タンパク質をＰＢＳ中５Ｍの尿素によって回収した。２ｍｇのストレプトアビジンダイナビーズを溶液に添加し、室温で穏やかに回転させることによって２時間インキュベートした。上清を除去した後、ダイナビーズを磁石によって収集し、ＰＢＳ中５Ｍの尿素によって洗浄し、次いで、５ｍＭのＴＣＥＰを含む５Ｍの尿素／５０ｍＭのトリス溶液中に再懸濁させた。タンパク質を、５５℃で３０分間変性および還元し、次いで、暗所で３０分間、１０ｍＭのヨードアセトアミドとともにインキュベーションした。アルキル化タンパク質を５倍希釈し、１μｇのトリプシンを用いて３７℃で一晩消化した。ダイナビーズを磁石によって除去し、ペプチド混合物を含む上清を、５μＬの１０％のＦＡによって酸性にし、ＧＬ－Ｔｉｐ（商標）ＳＤＢ脱塩チップ（ＧＬ ｓｃｉｅｎｃｅ、日本）を使用して脱塩し、４０μＬの０．１％のＦＡ中に再懸濁させた。Ｎａｎｏ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために１５μＬをＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、残りを－８０℃で保存した。まず、ｍＡｂ試料を８０℃で５分間加熱して、すべてのタンパク質を変性させて、宿主細胞タンパク質がＡｃｔｉｖＸデスチオビオチン－ＦＰセリンヒドロラーゼプローブに結合するのを防止することによって、陰性対照を実施した。

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
ペプチド混合物を、４０μＬの０．１％のギ酸（ＦＡ）中に溶解させ、まず、脱塩のために２０ｃｍ×０．０７５ｍｍのＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ１００ Ｃ１８トラップカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に１０μＬを充填し、その後、ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ ｎａｎｏＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内の２５０ｍｍ×０．０７５ｍｍのＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ１００ Ｃ１８分析カラム上で分離した。移動相Ａは、超純水中０．１％のＦＡで作製し、移動相Ｂは、８０％のＡＣＮ中０．１％のＦＡで作製した。ペプチドを、３００ｎＬ／分の流量の、緩衝液Ｂの２％～３２％の１５０分直線勾配で分離した。ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ ｎａｎｏＬＣは、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦＸ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と連結させた。各フルＭＳスキャン（分解能１２０，０００でｍ／ｚ３７５－１５００）では正規化衝突エネルギー（ＮＣＥ）２７％、ＡＧＣ３ｅ６、最大注入時間６０ｍｓ、およびＭＳ／ＭＳイベント（分解能３０，０００でｍ／ｚ２００－２０００）ではＡＧＣ１ｅ５、最大注入時間６０ｍｓの高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）断片化を１０個の最も強いイオンに施したデータ依存モードで、質量分析計を操作した。

ｍＡｂ－１直接消化
１００μｇのｍＡｂ－１を高速真空で乾燥させ、次いで、１０ｍＭのＤＴＴを含む２０μＬの８Ｍの尿素で再構成した。５５℃で３０分間タンパク質を変性および還元し、次いで、暗所で３０分間、６μｌの５０ｍｇ／ｍＬのヨードアセトアミドとともにインキュベートした。１００μＬの０．１μｇ／μＬのトリプシンを用いて、アルキル化タンパク質を３７℃で一晩消化した。ペプチド混合物を、５μＬの１０％のＴＦＡによって酸性にした。試料を０．４μｇ／μＬまで希釈し、２μＬをＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のためにカラムに注入した。

ｍＡｂ－１中のＣＥＳ－Ｂ１ＬおよびＣＥＳ－１ＬのＰＲＭ分析
試料の直接消化物（０．８μｇ）を、脱塩のために２０ｃｍ×０．０７５ｍｍのＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ１００ Ｃ１８トラップカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に充填し、その後、ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ ｎａｎｏＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内の２５０ｍｍ×０．０７５ｍｍのＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ１００ Ｃ１８分析カラム上で分離した。カラムを、３００ｎＬ／分の流量で、９８％の移動相Ａ（水中０．１％のギ酸で作製）および２％の移動相Ｂ（８０％のＡＣＮ中０．１％のギ酸で作製）で予め平衡化した。試料注入後、２％～３７％の移動相Ｂの直線勾配を１００分かけて適用して、ペプチドを分離した。ＣＥＳ－１Ｌからの３つのペプチドＬＮＶＱＧＤＴＫ［ｍ／ｚ４３７．７３５１^２＋］、ＡＩＳＥＳＧＶＩＬＶＰＧＬＦＴＫ［ｍ／ｚ８１５．９７４４^２＋］、およびＥＮＨＡＦＶＰＴＶＬＤＧＶＬＬＰＫ［ｍ／ｚ９２５．０１４５^２＋］、ＣＥＳ－Ｂ１Ｌからの３つのペプチドＡＰＥＥＩＬＡＥＫ［ｍ／ｚ５００．２７１５^２＋］、ＤＧＡＳＥＥＥＴＮＬＳＫ［ｍ／ｚ６４０．２８６１^２＋］、およびＩＲＤＧＶＬＤＩＬＧＤＬＴＦＧＩＰＳＶＩＶＳＲ［ｍ／ｚ８１９．１３５５^３＋］、ならびにｍＡｂ－１からの３つのペプチドＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ［６４４．３２９３^２＋］、ＬＬＩＹＤＡＳＮＲＰＴＧＩＰＡＲ［５８６．３２８３^３＋］、およびＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ［７１２．３５８５^２＋］を標的とする並列反応モニタリング（ＰＲＭ）によって、質量分析データを取得した。すべての実験において、ｍ／ｚ２００に対する１２０，０００分解能（ＡＧＣ標的１ｅ６、最大注入時間６０ｍｓ、ｍ／ｚ３５０－２０００）での質量フルスペクトルに続いて、３０，０００分解能（ＡＧＣ標的１ｅ５、最大注入時間１００ｍｓ）での時間を調節したＰＲＭスキャンを行った。ＭＳ／ＭＳ分析では、２７ｅＶの正規化衝突エネルギーおよび２ｍ／ｚの単離枠でのより高いエネルギー衝突解離（ＨＣＤ）を使用した。

実施例１．２Ｄ－ＬＣ－ＣＡＤ／ＭＳによって検出されたｍＡｂ製剤中のポリソルベート
製剤化されたｍＡｂ中のポリソルベートを、Ｙｉ Ｌｉ ｅｔ ａｌ、上記、およびＯｌｅｇ Ｖ．Ｂｏｒｉｓｏｖ ｅｔ ａｌ．によってわずかに修正された方法Ｔｏｗａｒｄ Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅｓ ｂｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｗｉｔｈ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ－Ａｉｄｅｄ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ，８３ ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ３９３４－３９４２（２０１１）に従って、２Ｄ－ＬＣ－ＣＡＤ／ＭＳによって分離、同定、および定量化した。ｍＡｂを除去するようにＯａｓｉｓ Ｍａｘカラムによる一次元ＬＣを設計し、二次元逆相クロマトグラフィーを実施して、残存するＰＯＥおよびＰＯＥエステルを、それらの脂肪酸含有量およびタイプに基づいて分離した。ＰＳ８０種は、ＰＯＥ、ＰＯＥイソソルビド、ＰＯＥソルビタン、モノエステル、ジエステル、トリエステル、およびテトラエステルの順に溶出した（図１、右パネル）。ポリマーの化学式およびインソース断片化によって生成されたジオキソラニリウムイオンに基づく質量分析によって、各エステルの構造を解明した。図１右パネルＡは、ＰＯＥ－ＰＯＥイソソルビド－ＰＯＥソルビタン、ＰＯＥソルビタンモノリノレアート、ＰＯＥソルビタンモノオレアート、ＰＯＥイソソルビドモノオレアートおよびＰＯＥモノオレアート、ＰＯＥソルビタンリノレアート／オレアートジエステル、ＰＯＥソルビタンジ－オレアート、ＰＯＥイソソルビド－ジオレアートおよびＰＯＥジ－オレアート、おそらくＰＯＥイソソルビド／ＰＯＥリノレアート／オレアートジエステル、ならびにＰＯＥソルビタン混合トリオレアートおよびテトラオレアートの溶出順で標識した主要なピークを有するＰＳ８０の代表的なトータルイオンカレント（ＴＩＣ）クロマトグラムである。図１のピーク８は、質量スペクトルによって解釈するには複雑すぎるため、可能性のあるＰＯＥイソソルビド／ＰＯＥリノレアート／オレアートジエステル混合機として標識したことに留意されるべきである。荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）クロマトグラフィー分析によって、ポリソルベートの定量化を決定した（図１、右パネルＢ）。

実施例２．ｍＡｂ－１製剤中の急速なＰＳ８０分解
５℃で３６時間の保存中に、ｍＡｂ－１中の急速なＰＳ８０分解が観察された。ＰＯＥモノエステル、すなわち、ＰＯＥソルビタンモノリノレアート、ＰＯＥソルビタンモノオレアート、ＰＯＥイソソルビドモノオレアート、およびＰＯＥモノオレアートを表す２５～３０分に溶出するピークで、有意な減少が生じ、１０～１８分に溶出するＰＯＥは、有意な増加を示した（図２）。３２～４５分に溶出するＰＯＥジ－、トリ－、およびテトラ－エステルには、変化はなかった。この特有の分解パターンは、ＰＳ８０分解を担うリパーゼ／エステラーゼの１つのファミリーである可能性が高いことを示唆している。このヒドロラーゼファミリーは、高水準のエステルをそのままにしておきながら、ＰＳ８０のモノエステル部分のみを分解することができる。２つ以上のタイプのヒドロラーゼが分解に関与している場合、分解パターンはより複雑であろう。

実施例３．デスチオビオチン－フルオロホスホネート（ＦＰ）プローブによるリパーゼの阻害はＰＳ８０分解の消失を生じる
ポリソルベートを分解することが報告されているリパーゼのうちのほとんどがセリンヒドロラーゼのファミリーに属するため、ＦＰプローブを使用して阻害実験を実行した。この実験は、酵素活性加水分解物を、それらの酵素原形態または内因性阻害物質のいずれかの他の不活性加水分解物から同定および区別することを可能にする。この実験の理論的根拠は、活性セリンヒドロラーゼが存在する場合、その阻害物質を添加することによって、酵素の機能、この場合ＰＳ８０の分解を停止させるであろうことである。デスチオビオチン－ＦＰプローブは、市販のセリンヒドロラーゼプローブのうちの１つであり、セリンタイプのヒドロラーゼの触媒中心でＳｅｒと共有結合を形成し、その酵素活性を遮断する反応性フルオロホスホネート基を含む。阻害実験は、わずか０．１２５μＭのＦＰプローブを添加することによって、酵素活性が完全に停止したことを明らかに示した（図３）。この実験はまた、デスチオビオチン－ＦＰプローブがセリンヒドロラーゼに特異的であるため、セリンタイプのリパーゼのみが製剤化された原薬中に存在することを示した。

実施例４．デスチオビオチン－フルオロホスホネート（ＦＰ）プローブによるリパーゼの枯渇は製剤化されたｍＡｂ中のＰＳ８０分解の減少を生じる
次いで、固定したＡｃｔｉｖＸ ＦＰセリンヒドロラーゼプローブを使用して、リパーゼの枯渇を実施した。プローブのビオチン部分は、ストレプトアビジン表面に捕捉および固定することができ、捕捉したセリンヒドロラーゼの濃縮および精製が可能になる。枯渇実験の設計は、以下の２つの目標に役立つ：１）ＰＳ８０の分解がセリンヒドロラーゼファミリーに属するリパーゼによって引き起こされる場合、枯渇はＰＳ８０分解の減少を生じるであろうこと；２）デスチオビオチン－ＦＰプローブ上で捕捉されたリパーゼは、質量分析によってさらに同定することができること。

図４に示されているｍＡｂの枯渇スキームを用いて、材料および方法セクションに概説されているように枯渇実験を実施した。デスチオビオチン－ＦＰプローブを、リパーゼの枯渇のためにストレプトアビジンダイナビーズに連結させた。図５に示されるように、リパーゼ枯渇の前に、ｍＡｂ－１中のおよそ４４．７％のＰＳ８０モノエステル分解が、５℃での１８時間のインキュベーション後に観察された。追加の１８時間のインキュベーションによって、ＰＳ８０モノエステルの完全な損失がもたらされた。リパーゼ枯渇後、１８時間または３６時間のインキュベーションのいずれかの後に、８％未満のＰＳ８０分解が観察された。枯渇結果は、ｍＡｂ－１中のＰＳ８０を分解したリパーゼが、デスチオビチン－ＦＰプローブによって除去されたことを示した。リパーゼと相互作用したのがストレプトアビジン磁性ビーズではなくプローブであることを確実にするために、プロセス対照試料を導入することによって実験を実施した。プロセス対照試料は、デスチオビオチン－ＦＰプローブを添加せずに、ｍＡｂ－１をストレプトアビジン磁性ビーズのみと混合することによって生成した。ｍＡｂ１中のおよそ２９％および８６％のＰＳ８０分解は、それぞれ、５℃での１８時間および３６時間のインキュベーション後に観察され、これは、リパーゼと磁性ビーズとの間のある特定の非特異的相互作用が存在したことを示している。ＦＰプローブと比較して、非特異的相互作用によって除去されたリパーゼは有意に少なく、したがって、リパーゼの大部分は、固定したＦＰプローブとリパーゼとの間の特異的結合によって除去された。

実施例５．ＦＰプローブが濃縮されたｍＡｂ－１からの画分中で肝カルボキシルエステラーゼを同定した
デスチオビオチン－ＦＰプローブによって捕捉された宿主細胞タンパク質に、材料および方法セクションに記載のトリプシン消化および質量分析を施した。同定された１５個の宿主細胞タンパク質（表１）のうち、ＣＥＳ－Ｂ１ＬおよびＣＥＳ－１Ｌが初めて同定された。変性した対照試料（表２）と比較することによって、両方のタンパク質がＦＰプローブへの特異的結合によって捕捉されたと結論付けた。ＣＥＳ－１Ｌは活性形態でのみ同定されたが、変性形態では同定されず、ｍＡｂ－１中で生物学的に活性であったことを示唆している。ＣＥＳ－Ｂ１Ｌは、１３個の特有のペプチド、変性形態では２個の特有のペプチドのみを有する活性形態で同定され、少量のＣＥＳ－Ｂ１Ｌタンパク質が、磁性ビーズに非特異的に結合することが可能であることが示唆され、その結果は、枯渇実験におけるプロセス対照結果と一致した（図５）。にもかかわらず、活性形態で同定された特有のペプチドの数がはるかに多いことは、ＣＥＳ－Ｂ１ＬもまたＰＳ８０分解を担っていることを示唆している。他の同定された宿主細胞タンパク質については、ほとんどは、同様の数の特有のペプチドを有して両方の条件で見出されたため、非活性酵素、例えば、キュリン－９様タンパク質およびセルロプラスミンとして容易に決定することができる。アニオン性トリプシン－２は、セリンプロテアーゼでもあるため、ｍＡｂ－１の活性形態で同定されたが、しかしながら、ＰＳ８０分解とは無関係なプロテアーゼとしての機能に起因するので除外することができる。他の２つの同時に捕捉されたタンパク質、アクチンおよびアネキシンもまた、それらの酵素機能の欠如のためにＰＳ８０分解から除外することができる。

新たに同定されたリパーゼ、ＣＥＳ－Ｂ１ＬおよびＣＥＳ－１Ｌの存在量を決定するために、ＰＲＭ分析を実施した。ＣＥＳ－Ｂ１ＬおよびＣＥＳ－１Ｌの濃度は、それぞれ、９．６および９．０ｐｐｍであることが決定された。これら２つのリパーゼの存在量が比較的少ないことは、ＰＳ８０を分解するための酵素活性が強いことを示唆している。

（表１）天然ｍＡｂ－１において同定されたＦＰプローブによって濃縮された宿主細胞タンパク質

（表２）変性ｍＡｂ－１において同定されたＦＰプローブによって濃縮された宿主細胞タンパク質

実施例６．ヒト肝カルボキシルエステラーゼ－１およびウサギ肝エステラーゼによるＰＳ８０分解パターン
ＨＣＰ分析における一般的かつ重要な１つの実施は、リパーゼ活性の機能を検証することである。阻害および枯渇実験は、ＣＥＳ－Ｂ１ＬおよびＣＥＳ－１Ｌが、ＰＳ８０分解を担うリパーゼである可能性が最も高いという強力な証拠を提供している。しかしながら、使用されたＦＰプローブが、単一のタンパク質に特異的ではなく、タンパク質ファミリーに特異的であることを考慮すると、分解経路にも役割を果たし得る他のリパーゼが医薬品中に存在する可能性がある。スパイクイン実験は、疑われるリパーゼがＰＳ８０分解の根本原因であるかどうかの本質的な検証を提供することができる。スパイクインしたリパーゼが、内因性リパーゼと全く同じ分解パターンを生成することができる場合、同定されたリパーゼがＰＳ分解のための重要な要素であることを確認することができる。この確認は、通常、利用可能な活性リパーゼの欠如によって困難である。これらの２つの新たに同定されたリパーゼの役割をさらに確認するために、ＢＬＡＳＴ検索を実施した。検索結果は、市販のウサギ肝エステラーゼおよびヒト肝カルボキシルエステラーゼ１が機能的に同様であり、それぞれ、ＣＥＳ－Ｂ１ＬおよびＣＥＳ－１Ｌの第１のセグメントに対して５６．０％および６９．７％の配列相同性を各々有することを示唆した（図６Ｄ）。ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１およびウサギ肝エステラーゼの両方を選択して、ｍＡｂ－１としてのＰＳ８０分解パターンを比較した。図６は、ヒトおよびウサギの両方の肝エステラーゼが、ｍＡｂ－１中で示されるものと同等の分解パターンを示したことを示した（図６、Ａ～Ｃ）。３つすべての試料において、ＰＳ８０の急速に分解された成分は、２５～３０分に溶出したモノエステルであったが、３２分後に溶出したジ－、トリ－、およびテトラ－エステルは、変化しないままであった。既知のリパーゼによる特徴的分解パターン実験により、ＣＥＳ－Ｂ１ＬおよびＣＥＳ－１ＬがｍＡｂ－１中のＰＳ８０分解を担っていることが検証された。

[本発明1001]
試料からリパーゼを枯渇させる方法であって、
リパーゼを含む前記試料をプローブと接触させることであって、前記プローブが、前記リパーゼに結合して複合体を形成することが可能である、前記接触させることと、
前記複合体を前記試料から分離して、それによって前記試料から前記リパーゼを枯渇させることと
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記試料が目的のタンパク質を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記試料がポリソルベート賦形剤を含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記ポリソルベート賦形剤が、ポリソルベート20、ポリソルベート60、ポリソルベート80、またはそれらの組み合わせから選択される、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記リパーゼが肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ1様タンパク質である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記リパーゼが肝カルボキシルエステラーゼ－1様タンパク質である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記プローブが、固体支持体に連結することが可能である、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記固体支持体がアガロースビーズである、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記固体支持体が磁性ビーズである、本発明1007の方法。
[本発明1010]
前記プローブが、リガンドを使用して固体支持体に結合している、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記リガンドが、インジケーター、ビオチン分子、修飾ビオチン分子、核、配列、エピトープタグ、電子不足分子、または電子豊富分子であり得る、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記複合体から前記リパーゼを回収することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1013]
目的のタンパク質とリパーゼとを有する試料を精製する方法の方法であって、
前記試料をプローブと接触させることであって、前記プローブが、前記リパーゼに結合して複合体を形成することが可能である、前記接触させることと、
前記複合体を前記試料から分離して、それによって前記試料中の前記目的のタンパク質を精製することと
を含む、前記方法。
[本発明1014]
前記試料がポリソルベート賦形剤を含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記ポリソルベート賦形剤が、ポリソルベート20、ポリソルベート60、ポリソルベート80、またはそれらの組み合わせから選択される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記リパーゼが肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ1様タンパク質である、本発明1013の方法。
[本発明1017]
前記リパーゼが肝カルボキシルエステラーゼ－1様タンパク質である、本発明1013の方法。
[本発明1018]
前記プローブが、固体支持体に連結することが可能である、本発明1013の方法。
[本発明1019]
前記固体支持体がアガロースビーズである、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記固体支持体が磁性ビーズである、本発明1018の方法。
[本発明1021]
前記プローブが、リガンドを使用して固体支持体に結合している、本発明1013の方法。
[本発明1022]
前記リガンドが、インジケーター、ビオチン分子、修飾ビオチン分子、核、配列、エピトープタグ、電子不足分子、または電子豊富分子であり得る、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記複合体から前記リパーゼを回収することをさらに含む、本発明1013の方法。
[本発明1024]
試料中のポリソルベートの分解を減少させる方法であって、
リパーゼとポリソルベートとを含む前記試料をプローブと接触させることであって、前記プローブが、前記リパーゼに結合して複合体を形成することが可能である、前記接触させることと、
前記複合体を前記試料から分離して、それによって前記試料中のポリソルベートの分解を減少させることと
を含む、前記方法。
[本発明1025]
前記試料が目的のタンパク質をさらに含む、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記ポリソルベートが、ポリソルベート20、ポリソルベート60、ポリソルベート80、またはそれらの組み合わせから選択される、本発明1024の方法。
[本発明1027]
前記リパーゼが肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ1様タンパク質である、本発明1024の方法。
[本発明1028]
前記リパーゼが肝カルボキシルエステラーゼ－1様タンパク質である、本発明1024の方法。
[本発明1029]
前記プローブが、固体支持体に連結することが可能である、本発明1024の方法。
[本発明1030]
前記固体支持体がアガロースビーズである、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記固体支持体が磁性ビーズである、本発明1029の方法。
[本発明1032]
前記プローブが、リガンドを使用して固体支持体に結合している、本発明1024の方法。
[本発明1033]
前記リガンドが、インジケーター、ビオチン分子、修飾ビオチン分子、核、配列、エピトープタグ、電子不足分子、または電子豊富分子であり得る、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記複合体から前記リパーゼを回収することをさらに含む、本発明1024の方法。
[本発明1035]
哺乳類細胞から精製された目的のタンパク質と、界面活性剤と、肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ1様タンパク質の残留量とを有する組成物であって、肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ1様タンパク質の前記残留量が約5ｐｐｍ未満である、前記組成物。
[本発明1036]
前記界面活性剤がポリソルベート80である、本発明1035の組成物。
[本発明1037]
前記肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ1様タンパク質が前記ポリソルベート80の分解を引き起こす、本発明1036の組成物。
[本発明1038]
非経口製剤である、本発明1035の組成物。
[本発明1039]
前記組成物中の前記ポリソルベートの濃度が約0．01％ｗ／ｖ～約0．2％ｗ／ｖである、本発明1036の組成物。
[本発明1040]
前記目的のタンパク質が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、抗体断片、および抗体－薬物複合体からなる群から選択される、本発明1035の組成物。
[本発明1041]
1つ以上の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、本発明1035の組成物。
[本発明1042]
ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、アルギン酸緩衝液、およびアルギニン緩衝液からなる群から選択される緩衝液をさらに含む、本発明1035の組成物。
[本発明1043]
張性改変剤をさらに含む、本発明1035の組成物。
[本発明1044]
前記目的のタンパク質の濃度が約20ｍｇ／ｍＬ～約400ｍｇ／ｍＬである、本発明1035の組成物。
[本発明1045]
哺乳類細胞から精製された目的のタンパク質と、界面活性剤と、肝カルボキシルエステラーゼ－1様タンパク質の残留量とを有する組成物であって、リソソーム酸性リパーゼの前記残留量が約5ｐｐｍ未満である、前記組成物。
[本発明1046]
前記界面活性剤がポリソルベートである、本発明1045の組成物。
[本発明1047]
前記界面活性剤がポリソルベート80である、本発明1046の組成物。
[本発明1048]
前記肝カルボキシルエステラーゼ－1様タンパク質が前記ポリソルベート80の分解を引き起こす、本発明1047の組成物。
[本発明1049]
非経口製剤である、本発明1046の組成物。
[本発明1050]
前記組成物中の前記ポリソルベートの濃度が約0．01％ｗ／ｖ～約0．2％ｗ／ｖである、本発明1046の組成物。
[本発明1051]
前記目的のタンパク質が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、抗体断片、および抗体－薬物複合体からなる群から選択される、本発明1045の組成物。
[本発明1052]
1つ以上の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、本発明1045の組成物。
[本発明1053]
ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、アルギン酸緩衝液、およびアルギニン緩衝液からなる群から選択される緩衝液をさらに含む、本発明1045の組成物。
[本発明1054]
張性改変剤をさらに含む、本発明1045の組成物。
[本発明1055]
前記目的のタンパク質の濃度が約20ｍｇ／ｍＬ～約400ｍｇ／ｍＬである、本発明1045の組成物。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の説明および添付の図面と併せて考慮される場合、より良好に認識され、理解されるであろう。以下の説明は、その様々な実施形態および多数の特定の詳細を示しているが、例示のために与えられており、限定のためではない。多くの置換、修正、追加、または再配置は、本発明の範囲内で行われ得る。

ポリソルベート中の主要種の化学構造を示す。ポリソルベートは、主に、一般的なソルビタンＰＯＥ、イソソルビドＰＯＥまたはＰＯＥ頭基を共有する脂肪酸エステルで構成され、オレイン酸がＰＳ８０の主な脂肪酸である。右パネルＡは、オンライン２Ｄ－ＬＣ／ＭＳ分析による、ｍＡｂ製剤中のＰＳ８０のトータルイオンカレント（ＴＩＣ）クロマトグラムを示す。標識されたピークの同定は、（１）ＰＯＥ－ＰＯＥイソソルビド－ＰＯＥソルビタン、（２）ＰＯＥソルビタンモノリノレアート、（３）ＰＯＥソルビタンモノオレアート、（４）ＰＯＥイソソルビドモノオレアートおよびＰＯＥモノオレアート、（５）ＰＯＥソルビタンリノレアート／オレアートジエステル、（６）ＰＯＥソルビタンジ－オレアート、（７）ＰＯＥイソソルビドジ－オレアートおよびＰＯＥジ－オレアート、（８）解釈するには質量スペクトルが複雑すぎるため、可能性として、ＰＯＥイソソルビド／ＰＯＥリノレアート／オレアートジエステル、（９）トリオレアートとテトラオレアートとを混合したＰＯＥソルビタン、である。右パネルＢは、オンライン２Ｄ－ＬＣ／ＣＡＤ分析による、ｍＡｂ製剤中のＰＳ８０の分離および検出を示すＣＡＤクロマトグラムを示す。 例示的な実施形態による、ｐＨ６の１０ｍＭのヒスチジン中、５℃で０時間および３６時間インキュベートした５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－１中０．１％のＰＳ８０のクロマトグラムを示す。１１～１７．５分に溶出したピークは、ＰＯＥ、ＰＯＥイソソルビド、およびＰＯＥソルビタンであった。 インキュベーション時間に対してプロットした残存するＰＳ８０の割合のチャートを示し、元のｍＡｂ－１、０．１２５μＭ、０．５μＭ、および２μＭのＦＰプローブと混合したｍＡｂ－１を黒い実線と塗りつぶした円、赤い点線と塗りつぶした菱形、橙色の点線と塗りつぶし正方形、および青い点線と塗りつぶした三角形によって示す。 例示的な実施形態による、リパーゼ枯渇実験の概略図を示す。ストレプトアビジンダイナビーズ磁性ビーズをデスチオビオチン－ＦＰプローブと連結させ、リパーゼ枯渇に使用した。元のｍＡｂ－１、および素通り画分ｍＡｂ－１、ならびにプロセス対照ｍＡｂ－１を５℃で３６時間０．１％のＰＳ８０とともにインキュベートし、ＰＳ分解測定を施した。濃縮されたリパーゼに、消化、および質量分析を使用するＨＣＰ分析を施す。 元のｍＡｂ－１、プロセス対照ｍＡｂ－１、およびリパーゼを枯渇させたｍＡｂ－１中に残存するＰＳ８０の割合のチャートを示し、元のｍＡｂ－１、プロセス対照ｍＡｂ－１、およびリパーゼを枯渇させたｍＡｂ－１は、黒い実線と塗りつぶした菱形、青い点線と塗りつぶした正方形、および橙色の破線と塗りつぶした円によって示す。 図６Ａは、例示的な実施形態による、ｐＨ６の１０ｍＭのヒスチジン中、５℃で０時間、１．５時間、および８時間インキュベートした２０μｇ／ｍＬの市販ウサギ肝エステラーゼ中０．１％のＰＳ８０のクロマトグラムを示す。図６Ｂは、例示的な実施形態による、ｐＨ６の１０ｍＭのヒスチジン中、５℃で０時間、５時間、および１８時間インキュベートした１００μｇ／ｍＬの市販ヒト肝カルボキシルエステラーゼ１中０．１％のＰＳ８０のクロマトグラムを示す。図６Ｃは、例示的な実施形態による、ｐＨ６の１０ｍＭのヒスチジン中、５℃で０時間、１８時間、および３６時間インキュベートした５０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ－１中０．１％のＰＳ８０のクロマトグラムを示す。 図６Ｄは、肝カルボキシルエステラーゼＢ－１様（Ａ０Ａ０６１Ｉ７Ｘ９）、肝カルボキシルエステラーゼ１様（Ａ０Ａ０６１ＦＥ２）、およびヒト肝カルボキシルエステラーゼ（ｈＣＥＳ－１）の配列アラインメントを示す。図は、配列番号：１０～１２をそれぞれ記載順に開示している。

ｍＡｂ－１中のＣＥＳ－Ｂ１ＬおよびＣＥＳ－１ＬのＰＲＭ分析
試料の直接消化物（０．８μｇ）を、脱塩のために２０ｃｍ×０．０７５ｍｍのＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ１００ Ｃ１８トラップカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に充填し、その後、ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ ｎａｎｏＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内の２５０ｍｍ×０．０７５ｍｍのＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐ１００ Ｃ１８分析カラム上で分離した。カラムを、３００ｎＬ／分の流量で、９８％の移動相Ａ（水中０．１％のギ酸で作製）および２％の移動相Ｂ（８０％のＡＣＮ中０．１％のギ酸で作製）で予め平衡化した。試料注入後、２％～３７％の移動相Ｂの直線勾配を１００分かけて適用して、ペプチドを分離した。ＣＥＳ－１Ｌからの３つのペプチドＬＮＶＱＧＤＴＫ（配列番号：１）［ｍ／ｚ４３７．７３５１^２＋］、ＡＩＳＥＳＧＶＩＬＶＰＧＬＦＴＫ（配列番号：２）［ｍ／ｚ８１５．９７４４^２＋］、およびＥＮＨＡＦＶＰＴＶＬＤＧＶＬＬＰＫ（配列番号：３）［ｍ／ｚ９２５．０１４５^２＋］、ＣＥＳ－Ｂ１Ｌからの３つのペプチドＡＰＥＥＩＬＡＥＫ（配列番号：４）［ｍ／ｚ５００．２７１５^２＋］、ＤＧＡＳＥＥＥＴＮＬＳＫ（配列番号：５）［ｍ／ｚ６４０．２８６１^２＋］、およびＩＲＤＧＶＬＤＩＬＧＤＬＴＦＧＩＰＳＶＩＶＳＲ（配列番号：６）［ｍ／ｚ８１９．１３５５^３＋］、ならびにｍＡｂ－１からの３つのペプチドＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲ（配列番号：７）［６４４．３２９３^２＋］、ＬＬＩＹＤＡＳＮＲＰＴＧＩＰＡＲ（配列番号：８）［５８６．３２８３^３＋］、およびＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号：９）［７１２．３５８５^２＋］を標的とする並列反応モニタリング（ＰＲＭ）によって、質量分析データを取得した。すべての実験において、ｍ／ｚ２００に対する１２０，０００分解能（ＡＧＣ標的１ｅ６、最大注入時間６０ｍｓ、ｍ／ｚ３５０－２０００）での質量フルスペクトルに続いて、３０，０００分解能（ＡＧＣ標的１ｅ５、最大注入時間１００ｍｓ）での時間を調節したＰＲＭスキャンを行った。ＭＳ／ＭＳ分析では、２７ｅＶの正規化衝突エネルギーおよび２ｍ／ｚの単離枠でのより高いエネルギー衝突解離（ＨＣＤ）を使用した。

Claims (55)

1. 試料からリパーゼを枯渇させる方法であって、
   リパーゼを含む前記試料をプローブと接触させることであって、前記プローブが、前記リパーゼに結合して複合体を形成することが可能である、前記接触させることと、
   前記複合体を前記試料から分離して、それによって前記試料から前記リパーゼを枯渇させることと
   を含む、前記方法。
2. 前記試料が目的のタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記試料がポリソルベート賦形剤を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記ポリソルベート賦形剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項３に記載の方法。
5. 前記リパーゼが肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ１様タンパク質である、請求項１に記載の方法。
6. 前記リパーゼが肝カルボキシルエステラーゼ－１様タンパク質である、請求項１に記載の方法。
7. 前記プローブが、固体支持体に連結することが可能である、請求項１に記載の方法。
8. 前記固体支持体がアガロースビーズである、請求項７に記載の方法。
9. 前記固体支持体が磁性ビーズである、請求項７に記載の方法。
10. 前記プローブが、リガンドを使用して固体支持体に結合している、請求項１に記載の方法。
11. 前記リガンドが、インジケーター、ビオチン分子、修飾ビオチン分子、核、配列、エピトープタグ、電子不足分子、または電子豊富分子であり得る、請求項１０に記載の方法。
12. 前記複合体から前記リパーゼを回収することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
13. 目的のタンパク質とリパーゼとを有する試料を精製する方法の方法であって、
    前記試料をプローブと接触させることであって、前記プローブが、前記リパーゼに結合して複合体を形成することが可能である、前記接触させることと、
    前記複合体を前記試料から分離して、それによって前記試料中の前記目的のタンパク質を精製することと
    を含む、前記方法。
14. 前記試料がポリソルベート賦形剤を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記ポリソルベート賦形剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記リパーゼが肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ１様タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
17. 前記リパーゼが肝カルボキシルエステラーゼ－１様タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
18. 前記プローブが、固体支持体に連結することが可能である、請求項１３に記載の方法。
19. 前記固体支持体がアガロースビーズである、請求項１８に記載の方法。
20. 前記固体支持体が磁性ビーズである、請求項１８に記載の方法。
21. 前記プローブが、リガンドを使用して固体支持体に結合している、請求項１３に記載の方法。
22. 前記リガンドが、インジケーター、ビオチン分子、修飾ビオチン分子、核、配列、エピトープタグ、電子不足分子、または電子豊富分子であり得る、請求項２１に記載の方法。
23. 前記複合体から前記リパーゼを回収することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
24. 試料中のポリソルベートの分解を減少させる方法であって、
    リパーゼとポリソルベートとを含む前記試料をプローブと接触させることであって、前記プローブが、前記リパーゼに結合して複合体を形成することが可能である、前記接触させることと、
    前記複合体を前記試料から分離して、それによって前記試料中のポリソルベートの分解を減少させることと
    を含む、前記方法。
25. 前記試料が目的のタンパク質をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
26. 前記ポリソルベートが、ポリソルベート２０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２４に記載の方法。
27. 前記リパーゼが肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ１様タンパク質である、請求項２４に記載の方法。
28. 前記リパーゼが肝カルボキシルエステラーゼ－１様タンパク質である、請求項２４に記載の方法。
29. 前記プローブが、固体支持体に連結することが可能である、請求項２４に記載の方法。
30. 前記固体支持体がアガロースビーズである、請求項２９に記載の方法。
31. 前記固体支持体が磁性ビーズである、請求項２９に記載の方法。
32. 前記プローブが、リガンドを使用して固体支持体に結合している、請求項２４に記載の方法。
33. 前記リガンドが、インジケーター、ビオチン分子、修飾ビオチン分子、核、配列、エピトープタグ、電子不足分子、または電子豊富分子であり得る、請求項３２に記載の方法。
34. 前記複合体から前記リパーゼを回収することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
35. 哺乳類細胞から精製された目的のタンパク質と、界面活性剤と、肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ１様タンパク質の残留量とを有する組成物であって、肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ１様タンパク質の前記残留量が約５ｐｐｍ未満である、前記組成物。
36. 前記界面活性剤がポリソルベート８０である、請求項３５に記載の組成物。
37. 前記肝カルボキシルエステラーゼ－Ｂ１様タンパク質が前記ポリソルベート８０の分解を引き起こす、請求項３６に記載の組成物。
38. 非経口製剤である、請求項３５に記載の組成物。
39. 前記組成物中の前記ポリソルベートの濃度が約０．０１％ｗ／ｖ～約０．２％ｗ／ｖである、請求項３６に記載の組成物。
40. 前記目的のタンパク質が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、抗体断片、および抗体－薬物複合体からなる群から選択される、請求項３５に記載の組成物。
41. １つ以上の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項３５に記載の組成物。
42. ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、アルギン酸緩衝液、およびアルギニン緩衝液からなる群から選択される緩衝液をさらに含む、請求項３５に記載の組成物。
43. 張性改変剤をさらに含む、請求項３５に記載の組成物。
44. 前記目的のタンパク質の濃度が約２０ｍｇ／ｍＬ～約４００ｍｇ／ｍＬである、請求項３５に記載の組成物。
45. 哺乳類細胞から精製された目的のタンパク質と、界面活性剤と、肝カルボキシルエステラーゼ－１様タンパク質の残留量とを有する組成物であって、リソソーム酸性リパーゼの前記残留量が約５ｐｐｍ未満である、前記組成物。
46. 前記界面活性剤がポリソルベートである、請求項４５に記載の組成物。
47. 前記界面活性剤がポリソルベート８０である、請求項４６に記載の組成物。
48. 前記肝カルボキシルエステラーゼ－１様タンパク質が前記ポリソルベート８０の分解を引き起こす、請求項４７に記載の組成物。
49. 非経口製剤である、請求項４６に記載の組成物。
50. 前記組成物中の前記ポリソルベートの濃度が約０．０１％ｗ／ｖ～約０．２％ｗ／ｖである、請求項４６に記載の組成物。
51. 前記目的のタンパク質が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、抗体断片、および抗体－薬物複合体からなる群から選択される、請求項４５に記載の組成物。
52. １つ以上の薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項４５に記載の組成物。
53. ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、アルギン酸緩衝液、およびアルギニン緩衝液からなる群から選択される緩衝液をさらに含む、請求項４５に記載の組成物。
54. 張性改変剤をさらに含む、請求項４５に記載の組成物。
55. 前記目的のタンパク質の濃度が約２０ｍｇ／ｍＬ～約４００ｍｇ／ｍＬである、請求項４５に記載の組成物。

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