TW202045927A - 以具內標之lc-ms於樣品中進行聚山梨醇酯定量之方法 - Google Patents

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Abstract

本申請案係關於藉由實施具內標之LC-MS分析於樣品中進行聚山梨醇酯定量之方法，及用於監測該樣品中聚山梨醇酯降解之方法。

Description

以具內標之LC-MS於樣品中進行聚山梨醇酯定量之方法
本發明係關於於生物治療劑樣品中定量聚山梨醇酯之分析方法。聚山梨醇酯(例如PS80)係生物治療劑調配物中之最常用表面活性劑。
聚山梨醇酯係常用於生物醫藥調配物中之兩親性非離子表面活性劑。其主要作用係保護蛋白質及單株抗體(mAb)免於界面誘導之聚集。聚山梨醇酯(例如PS80)係多於1500種分子之異質混合物，其涵蓋寬範圍之物理-化學性質且包括各種脂肪酸。PS80定義為聚氧乙烯山梨醇酐單油酸酯，但由於其合成方法，其係異質混合物，其亦已知易於發生自氧化及經酯化脂肪酸之酶水解。PS80異質性之主要來源可歸因於酯鍵及其中所涉及之幾種脂肪酸。實際上，有幾篇著作報導存在大量(高達34.1%)之二酯且有時甚至高級酯(Borisov等人，Pharm. Biotechnol. 2015, 104, 1005-1018)。此複雜性對於PS80定量及降解監測而言代表巨大挑戰。
在最近評論中(Martos等人 J.Pharm. Sci. 2017,106, 1722-1735)，闡述用於PS80監測之不同方法。所報導方法係基於不同檢測技術，該等技術主要與液相層析(LC)串聯。在所提及之方法中，能夠定量PS80之彼等對各種PS80降解均不敏感。舉例而言，具有ELSD或CAD之基於混合模式液相層析之方法適於PS80定量，但在PS80降解之情形中並非最敏感之方法。基於質譜(MS)之方法通常用於PS80表徵，但並不用於品質控制(QC)環境中之PS80定量及監測。最近關於PS80之液相層析質譜(LC-MS)表徵之進展係基於二氧戊環基鎓(dioxolanylium)離子之特徵信號(Borisov等人Anal. Chem. 2011 ,83 , 3934-3942)。該等特徵信號之所報導使用提及其對解釋及鑑別PS80物種且尤其脂肪酸組成之有用性。其亦已用於PS80氧化副產物之結構解析(Borisov等人，2015, 上文文獻)。迄今為止，該等信號尚未用於PS80定量。自所獲得之層析圖僅能擷取到相對或半定量資訊(Borisov等人，2011, 上文文獻)。
因此，仍期望提供有效且穩健之方法以允許在單一分析中進行聚山梨醇酯定量。
根據目標，本發明提供用於於樣品中定量至少一種聚山梨醇酯衍生物之方法，該方法包含： - 基於二氧戊環基鎓離子之信號實施該樣品之LC-MS分析之步驟； -利用該聚山梨醇酯之內標實施內部校正之步驟。
儘管使用內標(IS)係層析及質譜之眾所周知之做法，但從未報導使用IS進行聚山梨醇酯定量。藉由使用內標(IS)，改良線性度、可重複性、準確度且因此改良定量。
該方法之一個關鍵特徵係使用內標用於內部校正目的以避免基質效應之問題。通常，此內標作為完整聚山梨酸酯之替代物具有相似之化學結構且經歷相同之源內斷裂。根據本發明，該方法依賴於藉由源內解離生成之脂肪酸酯之特徵二氧戊環基鎓離子。
藉由使用精心選擇之內標，該方法允許定量典型mAb調配物中之聚山梨醇酯。
根據實施例，聚山梨醇酯係式(I)化合物之混合物：
Figure 02_image001
(I) 其中w、x、y及z相同或不同地獨立代表式(I)中之聚乙二醇單元數且不為0。
根據實施例，w+x+y+z=20，其中聚山梨醇酯具體而言係PS20或PS80。
根據實施例，該聚山梨醇酯係PS20或PS80。PS20及PS80係市售購得(具體而言來自Seppic - Puteaux, France)。
根據實施例，該LC-MS分析涉及單四極質量檢測器，例如QDa® (自Waters購得)。藉由在QDa質量檢測器中使用源內斷裂，自聚山梨醇酯生成二氧戊環基鎓離子。QDa能夠在同一分析運行中在正及負電離模式下並行實施多個單離子記錄(SIR)信號。此允許定量完整的聚山梨醇酯，尋找特徵聚山梨醇酯氧化副產物以及定量游離油酸(聚山梨醇酯水解之副產物)。通常，在PS80之情形中，追蹤最少四個SIR信號：一個用於油酸酯之二氧戊環基鎓離子(完整PS80之特定離子)，一個用於IS之二氧戊環基鎓離子，一個用於在負電離模式下之游離油酸(PS80水解之主要副產物)，一個用於經氧化油酸酯(經氧化PS80之主要副產物)之二氧戊環基鎓離子。可記錄其他信號用於資訊目的。
根據實施例，該方法允許追蹤與PS80降解之副產物有關之SIR信號：在水解之情形中油酸(SIR負m/z 281.3)及在氧化之情形中經氧化油酸酯(SIR正m/z 325.3)。
此新的方法允許在僅一次分析中獲得至少相同位準之資訊，由此減少分析PS80所花費之時間。藉由此方法收集之資訊更易於理解，此乃因分析物對完整的PS80或經降解PS80之標記物實際上均係特異性的。
因此，根據實施例，方法亦包括檢測該聚山梨醇酯之氧化及/或水解之步驟。與現有方法相反，本發明方法允許於無論係發生可使PS80化合物之總濃度減小之降解(氧化或水解)還是吸附之調配物中定量PS80。
圖2(b)圖解說明用於定量完整PS80之m/z 309.3處之SIR信號。根據實施例，方法可藉由使用對PS80氧化及PS80水解二者敏感之適宜替代物定量完整PS80。單酯對降解更敏感且可用作聚山梨醇酯定量之替代物。根據實施例，完整聚山梨醇酯之該特定替代物可為單酯。對於PS80，替代物係在圖2(b)中鑑別為峰2.1之化合物。通常，端視實驗條件而定，此峰具有包含在6與7分鐘之間之滯留時間；更特定地，在下文實驗部分所述之實驗條件下，峰具有包含在6.85 min與6.95 min之間、更具體地約6.9 min之滯留時間。使用此替代物，在因水解或氧化而降解之情況中，此方法之使用與完整PS80定量相關。先前發佈之方法均未能如此。
如本文所用，「內標」係指在化學分析中以恆定量添加至樣品、空白及校正標準品之化學化合物。然後可藉由繪製聚山梨醇酯信號與內標信號之比率隨標準品中聚山梨醇酯濃度之變化將此化合物用於校正。內標係通常與樣品中之聚山梨醇酯極為相似但不相同之化合物，此乃因在理想情況下，相對於每一物種之量，樣品製備之效應對於來自內標之信號與來自感興趣物種之信號應係相同的。所用內標通常需要提供與聚山梨醇酯信號在大多數方面相似但又足夠不同之信號，以使該兩個信號可藉由儀器容易地區分。
內標在結構上通常應與感興趣分析物相似，與感興趣分析物相比具有相似滯留時間，且應經歷相似源內斷裂。其亦必須穩定且不能干擾樣品組分。
根據實施例，內標(IS)可選擇具有經一或幾個羧酸酯化之聚乙二醇鏈的化合物，以使其具有與聚山梨醇酯相似之物理-化學性質。通常，羧酸部分需要不同於聚山梨醇酯混合物中存在之脂肪酸。
根據實施例，內標係式(I)之乙氧基化脂肪酸：
Figure 02_image003
(I) 其中：
Figure 02_image005
代表脂肪酸殘基 其中R代表C3-C24直鏈或具支鏈飽和烷基； R’係H或
Figure 02_image007
，其中R’’代表C3-C24直鏈或具支鏈飽和烷基；且 n定義為通式(I)中PEG (聚乙二醇)單元之數目，應理解，式(I)化合物係呈一或多種式(I)化合物之混合物的形式，其中n相同或不同且包含在1與100之間； 及其混合物。
根據實施例，n係包含在1與100之間之整數。
根據實施例，該內標係選自：
Figure 02_image009
聚(乙二醇)雙(2-乙基己酸酯) 其中n如上文所定義包含在1與100之間。
更具體而言，內標係聚乙二醇單月桂酸酯(下文中稱為PEG-C12)或聚乙二醇單肉豆蔻酸酯(下文中稱為PEG-C14)；仍更特定地：
Figure 02_image011
(聚乙二醇肉豆蔻酸酯, PEG-C14)。
PEG-C12及聚(乙二醇)雙(2-乙基己酸酯)係自Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France)購得，且PEG-C14用作PEG-C12中存在之組分。
在PEG-C12之情形中，n可使得平均分子量包含在300與600 g/mol之間，通常約400 g/mol。
在聚(乙二醇)雙(2-乙基己酸酯)之情形中，n可使得平均分子量包含在400與700 g/mol之間，通常約650 g/mol。
PEG-C14可自PEG-C12分離，或可經由PEG-C12作為PEG-C12中存在之組分使用。
已發現，可利用調整移動相及/或錐孔電壓來調諧聚山梨醇酯單酯及高級酯以及游離油酸之檢測以及對聚山梨醇酯及游離油酸之敏感度。
根據實施例，LC-MS相之移動相包含甲酸梯度。通常，移動相係包含水、有機溶劑(例如乙腈或異丙醇)及酸(例如甲酸或乙酸)之三元移動相。通常，移動相係由水、乙腈及甲酸組成，其具有乙腈及甲酸之梯度，通常具有在0.01至0.1%範圍內之甲酸梯度。通常，溶析相之組成自包含80-90%水、10-20%乙腈及0.01-0.05%甲酸之初始組成朝向包含0-10%水、90-99.9%乙腈及0.05-0.1%甲酸之最終組成變化(分成幾個部分)。
錐孔電壓可誘導源內斷裂。通常，錐孔電壓低於100 V、較佳低於70 V。通常，對於聚山梨醇酯及油酸，可使用不同的錐孔電壓(CV)。作為說明，可使用針對PS80之CV 50及針對油酸之CV 15以達成對PS80及游離油酸之更高敏感度。
根據實施例，方法包含添加內標至樣品之起始步驟。方法亦可包含處理樣品以使其中可包含之蛋白質沈澱之步驟。該處理可包含將乙腈添加至樣品及/或使該樣品離心。
根據實施例，該樣品係生物醫藥調配物。
如本文所用，生物醫藥調配物係包含至少一種生物產品(例如，蛋白質)之醫藥組合物。因此，該樣品可包含至少一種治療性蛋白或生物治療劑或生物藥物(Biologic)，例如單株抗體(mAb)或其片段、單鏈可變片段(scFv)、單結構域抗體(VHH抗體，即奈米抗體)、抗體藥物偶聯物、雙特異性抗體、三特異性抗體。
根據另一目標，本發明亦係關於監測樣品中至少一種聚山梨醇酯降解之方法。該方法包含實施根據本發明之定量該等聚山梨醇酯之方法。
實例 材料 . 聚山梨醇酯80係自Seppic (Puteaux, France)獲得。對於LC-MS，在容量瓶中將1 g聚山梨醇酯溶解於100 mL水中以獲得10 g/L原液，將其儲存於2-8℃下並避光。LC-MS級乙腈係自Fisher Scientific (Illkirch, France)購買。使用來自milliQ系統之純化水。甲酸、聚乙二醇單月桂酸酯(PEG-C12, Mn= ±400 g/mol)、聚乙二醇雙2-乙基己酸酯(PEG-bis C8, Mn= ±650g/mol)及油酸均自Sigma-Aldrich (Saint Quentin Fallavier, France)購買。使用PEG-C12作為內標。PEG-C12原液係藉由在容量瓶中將500 mg溶於100 mL乙腈中以獲得5 g/L原液來製備。100 µg/mL之工作溶液係藉由於乙腈中稀釋來製備。整個研究中僅使用一個批次之PEG-C12。油酸原液係藉由在容量瓶中將100 mg溶於100 mL乙腈中以獲得1 g/L原液來製備。用於校正目的之工作標準品溶液係在20 mL容量瓶中製備，其中PEG-C12最終濃度為5 µg/mL，PS80濃度自5至75 µg/mL變化且油酸濃度自1至20 µg/mL變化。所添加溶劑係由水/乙腈混合物(20% / 80%)組成。
LC-MS 分析 . 逆相分離係在配備有來自Waters (Saint Quentin en Yvelines, France)之QDa質量檢測器的Acquity UPLC系統上實施。在最佳化之前，將QDa參數設置為預設值，此後將詳細說明。來自Agilent (Les Ulis, France)之zorbax Sb-Aq管柱(100 x 2.1 mm；3.5 µm)係根據Christiansen等人(Pharmazie. 2011 ,66 , 666-671)在50℃下以1 mL/min之流速操作。移動相A及B分別為水 + 0.1%甲酸及乙腈 + 0.1%甲酸。分析梯度係如下：85% A以及15% B持續1分鐘，隨後在6分鐘時線性斜坡上升至60% B直至8分鐘，隨後在10分鐘時線性斜坡上升至100%B並再保持3分鐘，隨後在13.1分鐘時返回至初始狀態並再持續3分鐘。典型移動相梯度闡述於以下梯度表中：表 1. 移動相梯度之時間表
A ( 水 ) B ( 乙腈 ) C ( 乙腈 + 0.1% 甲酸 )
初始 85 % 5 % 10 %
1 min 85 % 5 % 10 %
6 min 40 % 50 % 10 %
8 min 40 % 50 % 10 %
9 min 20 % 70 % 10 %
9.1 min 18 % 0 % 82 %
10 min 0 % 0 % 100 %
13 min 0 % 0 % 100 %
13.1 min 85 % 5 % 10 %
根據所獲得之結果對分析條件(例如移動相及梯度)進行調適。
樣品製備 . 使用來自生物治療劑調配物之樣品(包括mAb及不同賦形劑)。PS80濃度保持在200 µg/mL。樣品製備由利用乙腈之蛋白質沈澱步驟組成。向80 µL經調配mAb中添加20 µL內標工作溶液及300 µL乙腈。攪拌後，使混合物在10℃下以1500 g離心10分鐘。收集上清液並轉移至HPLC小瓶中。最終濃度為約40 µg/mL PS80及5 µg/mL內標。
結果及討論 PS80 組分之分離及脂肪酸酯利用「源內」解離之鑑別 . 根據大量的先前出版物，聚山梨醇酯係異質混合物，其在化學結構及酯化物種之濃度方面具有極大的多樣性。此外，涉及酯鍵之脂肪酸的性質可有所不同。根據歐洲藥典(EU pharmacopeia)，油酸及棕櫚酸(分別為單不飽和及飽和脂肪酸)係PS80之兩種主要脂肪酸。使用一系列聚乙二醇脂肪酸酯特徵性低m/z離子(稱為二氧戊環基鎓離子)來鑑別PS80之酯化物種。PS80之典型輪廓顯示自單酯至四酯之不同脂肪酸酯(圖2a)，而m/z 309.3及283.3之單離子記錄(SIR)係油酸酯及棕櫚酸酯物種之特定輪廓(圖2b及2c)。藉由SIR獲得之層析圖由於層析分離之人工增益而更易於解釋及整合。不同酯物種之鑑別係基於Borisov等人，2015 (上文文獻)發佈之關於在逆相層析中聚山梨醇酯物種之溶析順序之著作(圖2a及2b)。
LC-MS 方法 發展 . QDa能夠對ESI源在負及正電離模式下同時實施分析。為獲得此能力之優勢，LC-MS條件已仔細進行最佳化。移動相中之甲酸百分比及ESI源之錐孔電壓(CV)之系統評估允許以高靈敏度獲得PS80及其降解產物之同時分離。自0.01%至0.1%之甲酸百分比對油酸酯單酯檢測幾乎沒有影響，但對於高級酯至關重要(圖3a)。增加之錐孔電壓導致由單酯及高級酯之峰面積表示之信號增加(圖3b及3c)，直至CV50。超過CV50，經歷信號之急劇損失。此現象係由源內斷裂來解釋。增加之錐孔電壓誘導源內斷裂增加，此導致形成更多二氧戊環基鎓離子，直至CV50為止。對於更高CV，強烈源內斷裂導致形成二級碎片，此解釋了信號之損失。
油酸之負電離模式檢測所需之移動相中之甲酸比例很小，不超過0.01% (圖4a)。油酸之未斷裂分子離子的檢測需要低錐孔電壓以最小化源內斷裂(圖4b)。
單酯、油酸及高級酯之間之溶析順序使得能夠建立三元移動相梯度，以在整個分析過程中獨立地改變乙腈及甲酸百分比。LC-MS方法根據實驗部分如下進行調試。具有85% A (水)、5% B (乙腈)及10% C (乙腈 + 0.1%甲酸)之移動相梯度持續1分鐘，隨後在6分鐘時線性斜坡上升至40% A、50% B及10% C並保持2分鐘。在9分鐘時添加至20% A、70% B及10% C之另一斜坡上升。在9.1分鐘時，添加至18% A以及82% C之切換以使甲酸百分比增加至0.1%，並在10分鐘時使斜坡繼續升至100％C並保持3分鐘，然後在13.1分鐘時返回至初始狀態。在9分鐘時添加移動相B與C之間之切換，以使移動相中之甲酸百分比自0.01%變為0.1%，同時保持移動相中之乙腈百分比在相同梯度斜坡上。以CV50記錄正電離模式下之SIR信號，而以CV15記錄負電離模式下之SIR信號。
藉由外部校正進行聚山梨醇酯定量 . 在先前發佈之方法中，藉由使用適宜替代物利用外部校正曲線來定量PS80或PS20。熟知之實例係基於水解及隨後在甲醇中酯化以形成脂肪酸甲酯(例如油酸甲酯)之方法。然後將此油酸甲酯視為PS80之替代物並進行定量。此處用於定量之替代物係峰2.1 (圖2b)，此乃因此峰對應於POE山梨醇酐單油酸酯，其結構接近PS80之理論結構。基於此峰，構建七個濃度位準之校正曲線，其中PS80於水溶液中之濃度範圍為5至75 µg/mL。利用峰面積對濃度之未加權線性回歸評估線性度。線性度較差，其中r²為0.977。殘差展現二次行為，此解釋了差的線性度性能。藉由注入每個校正位準之6個重複樣品評估之可重複性較差，其中峰面積之RSD%超過22%。據推測，該等較差結果係由於「源內」斷裂期間之競爭所致，此乃因此斷裂在QDa (單四極)之ESI源中沒有得到很好的控制。
外部校正與內部校正之間之比較 . 為克服此問題，使用內標(IS)以實施內部校正而非外部校正。在LC-MS中用於定量目的之最常用內標係氘化化合物。鑒於PS80混合物之異質性，因此未考慮此方法。選擇具有相似化學結構且因此相似源內斷裂途徑之化合物：聚乙二醇單肉豆蔻酸酯(PEG-C14)、聚乙二醇單月桂酸酯(PEG-C12)及聚乙二醇雙2-乙基己酸酯(PEG-bis C8)。PEG-C12及PEG-bis C8係市售購得(Sigma-Aldrich/Merck)。PEG-C14不能自傳統化學化合物製造商購得，但發現係PEG-C12之雜質。
由於此PEG-C14係由PEG利用C14飽和脂肪酸酯化而製得，因此其經受相同斷裂，從而在正電離模式下在m/z 255.3處形成特徵性二氧戊環基鎓離子。在使用其作為內標之前，檢查PS80與PEG-C14/PEG-C12/PEG bis C8之間之干擾。來自PS80之信號不干擾PEG-C14/PEG-C12/PEG bis C8信號，且反之亦然。PEG-C14/PEG-C12/PEG bis C8及PS80替代物峰之滯留時間接近，使得其在源內斷裂期間經歷相同競爭。
圖7圖解說明來自PEG-C14/PEG-C12/PEG bis C8之信號與PS80之信號不存在干擾。
圖8至10圖解說明來自PS80之信號與PEG-C14/PEG-C12/PEG bis C8之信號不存在干擾以及來自PEG-C14/PEG-C12/PEG bis C8之感興趣峰之滯留時間。
出於比較目的，內部校正係利用與外部校正相同之實驗設置進行評估。利用PS80替代物峰相對於IS之峰面積比率對濃度之未加權線性回歸來評估線性度。線性度良好，其中r²大於0.999。殘差或多或少係隨機分佈且相對偏差保持低於10%。藉由注入每個校正位準之6個重複樣品評估之可重複性再次良好，其中對於所有校正位準，峰面積比率之RSD%均低於6%。表2比較該等關於外部及利用以下之內部校正之可重複性之結果：聚乙二醇單肉豆蔻酸酯(PEG-C14)、聚乙二醇單月桂酸酯(PEG-C12)、聚乙二醇雙2-乙基己酸酯(PEG-bis C8)。該等IS之間之比較係基於線性度(r²)及可重複性(RSD%)。表 2. 峰面積 ( 外部校正 ) 及 6 個重複樣品 ( 惟 PEG bis C8 ，僅 4 個重複樣品 ) 之峰面積比率 ( 內部校正 ) 的 RSD% 值。
      線性度 目標濃度(µg/mL)
      r² 5 7.5 10 20 30 50 75
外部校正 0.977 27.0 27.8 27.1 24.8 23.4 22.8 23.1
內部校正 PEG C14 0.999 4.8 5.4 4.3 4.3 4.6 5.1 5.5
PEG C12 0.991 6.1 5.5 4.3 3.0 3.4 4.4 5.9
PEG bis C8 0.988 6.1 3.8 3.5 1.8 2.2 1.7 1.3
基於該等資料，內部校正(例如PEG-C12、PEG-C14及PEG bis C8)顯示展現優於外部校正之較高可重複性。該等內標展現相似的可重複性行為。
油酸定量 . 作為PS80水解之主要副產物，油酸係需要追蹤之參數。已開發若干方法(如在Martos等人(2017, 上文文獻)中所報導)以定量藉由PS20或PS80水解所釋放之游離脂肪酸(包括油酸)。
由於QDa特徵，在同一分析運行中記錄游離油酸之SIR信號(m/z 281.3，在負電離模式下)以及完整及經氧化PS80之SIR信號。油酸係藉由外部校正利用添加至PS80之校正位準之六個校正位準(自1 µg/mL至20 µg/mL)進行定量。舉例而言，具有20 µg/mL PS80之典型校正位準亦含有5 µg/mL內標及5 µg/mL油酸。利用峰面積對濃度之未加權線性回歸評估線性度。線性度良好，其中r²大於0.997，且殘差係隨機分佈。以類似於PS80之方式評價可重複性。RSD%值係在6.0至13.1%之間，其中2 µg/mL濃度下觀察到最大值。儘管RSD%值高於預期，但由於此資訊僅用於調查之情形，故認為該分析係滿意的。據推測，該等高值係由於移動相組成導致之負電離模式下之高基線雜訊。實際上，在開發期間做出了妥協，以有利於PS80油酸酯物種檢測。
應用於經調配 mAb 樣品 . 該方法適用於具有不同mAb性質及賦形劑但每次利用200 µg/mL PS80之mAb調配物的不同情況。
使用以5 mg/mL調配之mAb1來評估樣品製備之可重複性以及方法準確度。製得三種製劑並連續三天進行分析，獲得PS80濃度之九次測定。總平均值為182 µg/mL且RSD值為3.1%。該等結果與先前利用正統混合模式LC-CAD分析之量測結果一致，在正統混合模式LC-CAD分析中發現在六次量測中平均值為188 µg/mL且RSD為1.2%。
使以20 mg/mL調配之mAb2在40℃下經受熱應力條件達兩週。結果顯示PS80含量自198 µg/mL急劇下降至小於25 µg/mL。自其他記錄之信號擷取更多資訊。棕櫚酸酯物種之層析圖顯示受應力與未受應力樣品之間沒有差異，此指示降解僅影響通常在氧化之情形中觀察到之油酸酯物種。未發現游離油酸之痕跡，此排除水解作為降解途徑。SIR信號m/z 325.3 (在正電離模式下)顯示受應力與未受應力樣品之間之巨大差異(圖5)。m/z 325.3處之離子闡述為PS80氧化之特徵副產物，無論係環氧-硬脂酸酯還是羥基-油酸酯修飾之聚山梨醇酯。在此，利用在一個分析中記錄之三個不同層析圖獲得此降解樣品中PS80之整個圖片，此允許明確推斷出PS80降低係由於氧化引起的。
以50 mg/mL調配之mAb3係另一實例。在分析之前，將來自不同批次之樣品在5℃下保持近一個月。結果顯示批料A與批料B之間之PS80含量之差異，其分別為100及190 µg/mL，而非200 µg/mL。此於圖6a中在查看峰2.1 (用於PS80定量之替代物)時進行圖解說明。經氧化PS80之SIR信號顯示批次間沒有差異，此意味著PS80氧化副產物沒有增加，尤其當與在mAb2之情形中所觀察到之強度相比時。在有問題之批料A中發現溶液中之游離油酸濃度約為25 µg/mL。在批料B中僅發現少量油酸(圖6)。游離油酸之存在係PS80水解之證據。根據自此分析擷取之所有資訊，推斷出PS80降解係由於水解所致。由於高級酯不受影響，因此據推測此水解係來自酶促起源。
結論 . PS80廣泛用於生物治療劑調配物中。最近，越來越關注藥物產品中聚山梨醇酯之穩定性及其維持其抗蛋白質聚集之保護作用的能力。在過去幾年中，已報導量測PS80含量並監測其降解之有效方法(Martos等人，上文文獻)。其中，基於LC-MS之方法在表徵及半定量資訊方面顯示滿意結果。在「源內」CID之後使用脂肪酸酯之二氧戊環基鎓離子的特徵信號以顯著簡化層析圖並更容易地鑑別PS80亞類。在所提及之先前工作中，並未證實其方法係定量的。在此研究中，應用相同方法，目的係使用其以利用單四極質量檢測器以QC位準進行定量。不幸地，首次定量結果證實了Borisov (上文文獻)結論。此問題藉由使用精心選擇的具有相似化學性質之內標來克服。已顯示，甲酸梯度允許更靈敏的且在正及負電離模式下同時檢測自PS80酯亞類至游離脂肪酸之所有感興趣化合物。
此方法成功地應用於PS80監測之不同情形且尤其其中兩者具有PS80降解之獨特特徵之情形。在該兩種情形中，僅使用一個16分鐘分析即鑑別出PS80降解之根本原因。在不使用此方法之情形下為達到相同目標，將需要三至四種不同方法：一種用於PS80定量(混合模式LC-CAD)，加一種用於PS80輪廓分析(逆相CAD)，以及其他用於鑑別特徵副產物(經氧化PS80及游離油酸)之方法。此處呈現之方法可有效地替代迄今為止所需之大量分析工具箱。
此方法之目的係提供PS80之準確且穩定之指示量測以及有價值資訊以明確鑑別PS80降解之根本原因。
圖1概述PS80理論結構及降解途徑。 圖2顯示強度(以任意單位計)對滯留時間(以分鐘計)。其圖解說明PS80之代表性總離子電流(TIC)輪廓，其中峰標記為1 – 未酯化物種、2 –單酯及3 – 高級酯(a)；指示油酸酯物種之溶析之m/z 309.3之單離子記錄(SIR)，其中峰標記為2.1 – POE山梨醇酐單油酸酯、2.2 – POE異山梨醇單油酸酯及2.3 – POE單油酸酯(b)；及指示棕櫚酸酯物種之溶析之m/z 283.3之SIR (c)。 圖3代表油酸酯之二氧戊環基鎓離子在正電離模式下不同百分比之甲酸以及CV 50 (a)及在0.1%甲酸下利用不同CV (b)之層析圖。將自(b)提取之峰面積針對用於單酯及高級酯之錐孔電壓繪圖(c)。 圖4代表油酸在負電離模式下利用不同百分比之甲酸以及CV 15 (a)及在0.01%甲酸下利用不同CV (b)之層析圖。 圖5圖解說明於受熱應力(頂部層析圖)及不受應力(底部層析圖)樣品中PS80降解之鑑別診斷(differential diagnosis)的代表性層析圖。PS80油酸酯亞種在受熱應力樣品中減少(a – pos m/z 309.3)。未觀察到油酸增加(b – neg m/z 281.3)且氧化副產物顯著增加(c – pos m/z 325.3)。 圖6圖解說明兩個不同批料A (頂部層析圖)或B (底部層析圖)中PS80降解之鑑別診斷的代表性層析圖。PS80油酸酯亞種在批料A樣品中減少(a – pos m/z 309.3)。觀察到油酸之極大增加(b – neg m/z 281.3)且氧化副產物在兩個批料中無差異(c – pos m/z 325.3)。 圖7圖解說明在正離子化模式下在309.3 m/z下對於50 µg/mL之PS80樣品(點劃線)以及PEG bis C8 (a)及PEG C12與PEG C14 (b)之內標(實線)之SIR信號。 圖8係在正電離模式下在用於PS80樣品之PEG bis C8 (點劃線 – 面板b)及PEG bis C8 (實線 – 面板a)之171 m/z特定信號下之提取離子層析圖。給出了作為內標之峰的滯留時間(Rt)。 圖9係在正電離模式下在用於PS80樣品之PEG C12 (點劃線 – 面板b)以及PEG bis C8 (實線 – 面板a)之227.3 m/z特定信號下之提取離子層析圖。給出了作為內標之峰的滯留時間(Rt)。 圖10顯示在正電離模式下在用於PS80樣品之PEG C14 (點劃線)及PEG C14 (實線)之255.3 m/z特定信號下之單離子記錄。給出了作為內標之峰的滯留時間(Rt)。

Claims (14)

  1. 一種於樣品中定量至少一種聚山梨醇酯衍生物之方法，該方法包含： 基於二氧戊環基鎓離子之信號實施該樣品之LC-MS分析之步驟； 利用該聚山梨醇酯之內標實施內部校正之步驟。
  2. 如請求項1之方法，其中該聚山梨醇酯係PS20或PS80。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該內標係式(I)之乙氧基化脂肪酸：
    Figure 03_image013
    (I) 其中：
    Figure 03_image015
    代表脂肪酸殘基 其中R代表C3-C24直鏈或具支鏈飽和烷基； R’係H或
    Figure 03_image017
    ，其中R’’代表C3-C24直鏈或具支鏈飽和烷基；且 n係包含在1與100之間； 及其混合物。
  4. 如前述請求項中任一項之方法，其中該內標係選自：
    Figure 03_image019
    Figure 03_image021
    聚(乙二醇)雙(2-乙基己酸酯) 其中n係包含在1與100之間。
  5. 如前述請求項中任一項之方法，其中該內標係
    Figure 03_image023
    ，n係包含在1與100之間。
  6. 如前述請求項中任一項之方法，其中該LC-MS分析涉及單四極質量檢測器(QDa)。
  7. 如前述請求項中任一項之方法，其中LC-MS移動相包含甲酸梯度。
  8. 如前述請求項中任一項之方法，其中該LC-MS移動相係三元移動相。
  9. 如請求項8之方法，其中三元移動相包含水、乙腈及甲酸。
  10. 如前述請求項中任一項之方法，其中該樣品係生物醫藥調配物。
  11. 如前述請求項中任一項之方法，其中該樣品包含至少一種蛋白質。
  12. 如前述請求項中任一項之方法，其中該樣品包含至少一種單株抗體。
  13. 如前述請求項中任一項之方法，其中該方法亦包括檢測該聚山梨醇酯之氧化及/或水解之步驟。
  14. 一種監測樣品中至少一種聚山梨醇酯之降解之方法，其包含實施如前述請求項中任一項之方法。
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