JP6667229B2 - 最終糖化産物分析のための試料の調製方法及び最終糖化産物の分析方法 - Google Patents
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また、本発明の最終糖化産物の分析方法によれば、本発明の試料の調製方法によって調製された試料を液体クロマトグラフィー−質量分析法によって分析するため、その質量分析の際に試料中のアマドリ転位生成物がAGEへと変化する不都合が防止され、また、夾雑物質によるピークを除去してノイズを低減することができるだけでなく、AGEの検出レベルを向上することができるため、分析対象とするAGEを誤判読する危険性が低く、高感度且つ高精度なAGE分析が可能になる。
本発明に係る濾過処理の対象物である生体試料は、健常体から採取されたものであっても、疾病罹患患者のような非健常体から採取されたものでも良い。また生体試料としては、生体から採取されたあらゆる細胞、組織、及び体液、例えば、皮膚、筋肉、骨、脂肪組織、脳神経系、心臓及び血管等の循環器系、肺、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、消化器系、胸腺、リンパ、血液、全血、血清、血漿、リンパ液、唾液、尿、腹水、喀痰等、並びにそれらの培養物が挙げられる。このうち、全血、血清、血漿、尿が好ましく、血清、血漿がより好ましい。生体試料を濾過処理するに際しては、必要に応じ、生体試料に水等の適当な溶媒を添加して希釈し、その希釈液を濾過処理する。
本発明の試料の調製方法において、生体試料に還元処理を施す理由は次の通りである。従来、AGEを含む試料の質量分析には、液体クロマトグラフから溶離する液体試料をエレクトロスプレープローブ(ESIプローブ)によりイオン化して質量分析計に導入する、エレクトロスプレーイオン化質量分析法が利用されているところ、このESI法を利用してAGE分析を行うと、その分析中に、液体試料に含まれていたアマドリ転位生成物がESIプローブにてAGEへと変化してしまい、分析結果の信頼性が低下するという問題があった。そこで、本発明においては、生体試料に還元処理を施すことにより、ESI法による質量分析中に生体試料中のカルボニル基のアマドリ転位を防止し、結果として生体試料中で非AGE成分がAGEに変化することを防止し、高感度且つ高精度のAGE分析の実現を図っている。
本発明の試料の調製方法においては、該方法によって調製された試料の定量分析の精度向上を図る観点から、生体試料に濃度既知の内部標準物質を添加しても良い。この場合、内部標準物質が添加された試料の質量分析は、いわゆる内部標準法によって行われることになる。内部標準物質としては、質量分析におけるクロマトグラムが分析対象のAGEと同じ挙動を示し、且つAGEのそれと重ならず、且つ試料に元来含まれていない物質を用いることができ、例えば、AGEの13Cの安定同位体を用いることができる。内部標準物質の添加処理の実施時期は特に制限されず、濾過処理の前若しくは後のどちらでも良いし、又は、還元処理の前若しくは後のどちらでも良いが、後述する精製処理の前に生体試料に添加することが好ましい。生体試料に内部標準物質を添加する場合、本発明の試料の調製方法の好ましい一実施態様として、「生体試料に対し、限外濾過膜で濾過処理した後、その膜透過画分に還元処理を施し、さらにその還元処理が施された試料に対し、精製処理(後述する)を施す工程を含み、且つ該還元処理の前又は後において、生体試料に内部標準物質を添加する態様」が挙げられる。
前記の濾過処理、還元処理が施された生体試料(膜透過画分)は、そのままAGE分析用試料として使用することができるが、分析感度及び精度をより一層向上させる観点から、強酸性陽イオン交換樹脂により精製することが好ましい。即ち、本発明の試料の調製方法は、限外濾過膜による濾過処理、及び還元処理を施した生体試料に、さらに強酸性陽イオン交換樹脂による精製処理を施す態様を含む。
前記手順により精製された試料は、AGE分析に適切な形態へと調製され、AGE分析に供される。AGE分析用試料は、AGE分析の方法や使用する機器に応じて適宜調製され得るため、その形態は特に限定されない。
下記(1)〜(4)の手順に従って、AGE分析用試料を調製した。分析対象のAGEは下記の通り。
1)N−ε−(カルボキシメチル)リジン〔以下、「CML」ともいう〕
2)メチルグリオキサール−イミダゾロン〔以下、「MG−H1」ともいう〕
3)N−ε−(カルボキシエチル)リジン〔以下、「CEL」ともいう〕
4)カルボキシエチルアルギニン〔以下、「CEA」ともいう〕
5)カルボキシメチルアルギニン〔以下、「CMA」ともいう〕
−80℃のディープフリーザで凍結保存されていた血清を室温で解凍・溶解した。この凍結保存されていた血清は、健常体のラット(Wister)及びストレプトゾトシン誘発糖尿病ラットをそれぞれ解剖し、腹大動脈より採血した血清を凍結保存したものである。2mLチューブに溶解した血清を50μL注入し、さらに、この血清に各内部標準物質を溶解した蒸留水50μLを添加し、よく撹拌して血清希釈液を得た。
尚、分析対象のAGEがS−(2−スクシニル)システインである場合は、蒸留水に加えてさらにメチオニンを20μg添加する。また、ここで、内部標準物質として安定同位体(13C若しくは2H)で標識した各AGE(CML、MG−H1、CEL、CEA、CMA)、をそれぞれ10pmol、さらにリジンを5 nmolを添加している。リジンはタンパク質中に一定量存在するアミノ酸であるため、一定のタンパク量当たりのAGEを定量するために必要となる。
分画分子量3000のPES製限外濾過膜として前記VIVASPIN 500を用いて、前記血清希釈液を濾過処理した。より具体的には、限外濾過膜に前記血清希釈液を全量入れ、回転数12000rpmで30分間遠心処理した後、該血清希釈液を約50μL程度回収した。この遠心処理及び液回収を3回行い、計90分間の遠心処理を行った。
濾過処理後の前記血清希釈液の入った2mLチューブに、該血清希釈液と等量(例えば50μL)のホウ酸ナトリウム緩衝液(0.2Mホウ酸、2mMDTPA、pH 9.0)を添加し、さらにヒドリド還元剤としての水酸化ホウ素ナトリウム溶液(2mM NaBH4、0.1 N NaOH)を、該緩衝液の1/10量(例えば5μL)添加し、軽く撹拌し遠心した後、室温で4時間放置して還元処理を行った。還元処理後、吹付式試験管濃縮装置(EYELA社製, MG-2200、マニホールドS-040)にて40℃で乾固し、未精製のAGE分析用乾固試料を得た。
強酸性陽イオン交換樹脂充填カラム(以下、「陽イオン交換カラム」ともいう)として前記STRATA(商標) X−Cを用いて、還元処理が施され内部標準物質が添加された前記AGE分析用乾固試料を精製処理した。より具体的には、先ず、前記(3)の還元処理後、試料に蒸留水にて1000μLまでメスアップし、よく撹拌した。次いで、陽イオン交換カラムをサンプル分用意し、バキュームマニホールドにセットした。陽イオン交換カラムに100%メタノールを1mLずつ滴下し、バキュームマニホールドの減圧を開始した状態でチューブとの接続部のコックを開いて該メタノールを通過させた。同様の方法で、さらに陽イオン交換カラムに超純水を1mLずつ滴下し、通過させ、陽イオン交換カラムを平衡にした。試料全量を陽イオン交換カラムへ滴下し通過させた。次いで、陽イオン交換に2%ギ酸を3mL通過させ、これを洗浄した。バキュームマニホールドにセットされた陽イオン交換カラムの下方に溶出液回収用の試験管をセットし、且つ該カラムの下端から延びる溶出液導出用チューブの下端を該試験管内に挿入した。そして、陽イオン交換カラムに7%アンモニア溶液を3mL滴下し、試験管内に溶出した液を回収した。その回収液を2mLチューブに2mL分注し、その分注物を吹付式試験管濃縮装置にセットして40℃で乾固させ、さらにその乾固物に、回収液を1mL追加してオーバーナイトで乾固し、AGE分析用乾固試料を調製した。
還元処理を実施しなかった以外は実施例1と実質的に同様にして、AGE分析用乾固試料を調製した。
ラットに代えてマウスの血清を用いた、即ち、健常体のマウス(ddY)及びストレプトゾトシン誘発糖尿病マウスの血清を用いた以外は実施例1と同様にして、AGE分析用乾固試料を調製した。
ストレプトゾトシン誘発糖尿病ラットに代えて、通常のラットから卵巣を摘出したラットの血清を用いた以外は実施例1と同様にして、AGE分析用乾固試料を調製した。本実施例で使用した卵巣摘出ラットは、脂肪蓄積・肥満モデル動物である。
実施例及び比較例で得られた乾固試料を、それぞれ、ボルテックス又はソニケーターを使って、濃度20質量%のアセトニトリルと濃度0.1質量%のギ酸水溶液との混合液100μLに溶解させた。その溶液を、孔径0.2μmのポアフィルター付き遠心チューブ(ウルトラフリーLG:メルクミリポア, UFC30LG 00)に全量入れ、遠心機(TOMY MC-150)を用い回転数10000rpmで3分間遠心処理した。ポアフィルターを通過した溶液を回収し、その回収液に、前記のアセトニトリル−ギ酸混合液を900μL添加し、AGE分析用液体試料を得た。
前記〔AGE分析用液体試料の調製〕によって得られた各AGE分析用液体試料を、エレクトロスプレーイオン化質量分析法を利用したLC−MS/MSにかけ、内部標準法によりAGE(CML、MG−H1、CEL、CEA、CMA)の定量分析を行った(実施例3はMG−H1、CEA、CMAのみ)。その分析結果を図1〜図3に示す。LC−MS/MS測定条件は以下の通り。
・クロマトグラフィーカラム:SeQuant、ZIC−HILIC,150×2.1mm、5μm、200APeek Hplc Column
・カラム温度:40℃
・移動相A:0.1質量%ギ酸水溶液、移動相B:0.1質量%ギ酸含有アセトニトリル溶液
・グラジュエント条件:移動相A10%+移動相B90%
・流速:200μL/min
インジェクション量:10μL
・分析時間:20分
・溶出時間:CML(約12分)、MG−H1(約13分)、CEL(約12分)、CEA(約13分)、CMA(約13分)
・イオン化方法:H−ESI
・インジェクション量:10μL
・キャピラリー温度:300℃
・イオン化エネルギー:約3500V(陽性イオン化時)
・CMLの検出ピーク(m/z):205
・MG−H1の検出ピーク(m/z):229
・CELの検出ピーク(m/z):219
・CEAの検出ピーク(m/z):247
・CMAの検出ピーク(m/z):233
図1に示す通り、実施例1の調製方法によって得られたラット由来試料の分析結果からは斯かる傾向を明確に読み取ることができ、遊離のAGEを高感度且つ高精度で分析できていることがわかる。これに対し、比較例1の調製方法、即ち還元処理を行っていない調製方法によって得られたラット由来試料の分析結果は、健常な生体と糖尿病の生体とでAGEの量に明確な差異が見られない場合があった。
このことから、遊離体のAGEを高感度且つ高精度で網羅的に分析するためには、本発明のように、生体試料に対し、限外濾過膜で濾過処理した後、その膜透過画分に還元処理を施すことが有効であることがわかる。そして、この本発明の試料の調製方法は、ラットのみならず、マウスや脂肪蓄積・肥満モデル動物にも有効であることが、図2及び図3から明らかである。
Claims (6)
- 生体試料中に、遊離した状態で存在する最終糖化産物を分析するための試料の調製方法であって、
生体試料に対し、限外濾過膜で濾過処理する工程、及び生体試料に対し、還元処理を施す工程、を含み、
生体試料に対し、酸処理を施す工程を含まない、試料の調製方法。 - 限外濾過膜の分画分子量が10000以下である請求項1に記載の試料の調製方法。
- 生体試料に対し、限外濾過膜で濾過処理した後、その膜透過画分に還元処理を施す、請求項1又は2に記載の試料の調製方法。
- 限外濾過処理及び還元処理が施された試料に対し、強酸性陽イオン交換樹脂による精製処理を施す請求項1〜3の何れか一項に記載の試料の調製方法。
- 請求項1〜4の何れか一項に記載の方法により調製された試料を液体クロマトグラフィー−質量分析法によって分析する、最終糖化産物の分析方法。
- 前記液体クロマトグラフィー−質量分析法が、液体クロマトグラフから溶離する液体試料をエレクトロスプレープローブによりイオン化して質量分析計に導入する、液体クロマトグラフィー−質量分析法である請求項5に記載の最終糖化産物の分析方法。
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