JP4547327B2 - 分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、アミノ酸の測定に適した逆相型の樹脂を用いた分析方法に関する。

試料中のアミノ酸を液体クロマトグラフで分析する場合、通常除タンパク，脱塩，脱色等の前処理が要求されるが、茶抽出液の場合タンニンなどの除去が問題になる。

茶抽出液中のアミノ酸を分析する際、酢酸鉛を添加しタンニンを沈殿させ遠心分離で分離、あるいは酢酸エチルを使用した液液抽出法により茶抽出液中のタンニンを分離し、アミノ酸分析計で分析することが知られている。このような分析手法については、例えば、久保田 悦郎，中川 致之；茶のアミノ酸類の自動分析法，茶業技術報告，第４５号，
５２−５７（１９７３）に記載されている。

また、茶抽出液中のアミノ酸を分析する方法として、シリカ基材にオクタデシル基を結合した樹脂(ＯＤＳ)を用いた固相抽出法により茶抽出中のタンニンを分離し、アミノ酸分析計で分析することが知られている。このような分析方法については、例えば、桑野 和民，谷丸 恵美子，酒巻 千波，津久井 亜紀夫，三田村 敏男；緑茶中の遊離アミノ酸分析のための試料の前処理方法,東京家政学院大学紀要，第２４号,４１−４３(１９８４)に記載されている。

茶のアミノ酸類の自動分析法，茶業技術報告，第４５号，５２− ５７（１９７３） 緑茶中の遊離アミノ酸分析のための試料の前処理方法，東京家政学院大学紀要，第２４号，４１−４３（１９８４）

測定例として挙げる茶には、アミノ酸の他にタンニン，カフェイン，蛋白質，繊維，色素他を含んでいる。うち緑茶中にタンニンは約１０％含まれている。茶類飲料は、低温あるいは高温で茶葉から各成分を抽出し、製造される。アミノ酸は旨味成分、タンニンは苦味・渋味成分として知られているが、茶葉の抽出操作を行うと、両成分ともに溶出する。

また、一般試料を液体クロマトグラフで定量する場合、通常除タンパク，脱塩，脱色等が要求される。茶を液体クロマトグラフで定量する場合は、タンニンなどの除去が問題になる。測定試料中にタンニンが残存すると、配管あるいは分離カラムへのタンニンの吸着による装置内部の汚染および劣化を起こす。特に、分離カラムで吸着が起こると、詰まりによる分析中の圧力上昇といった障害を起こす可能性がある。

また、非特許文献１には、タンニンがアミノ酸分析におけるニンヒドリン反応を阻害することも報告されている。

そのため、茶抽出液のアミノ酸分析を行う場合には、前処理操作によりタンニンなどの除去を行うことが推奨される。しかし前処理操作は煩雑で時間がかかり、またアミノ酸の損失といった誤差の原因になる。

また、非特許文献１に報告されているように、酢酸エチルによる前処理は、茶抽出液中のタンニンの除去率は９０％以上であるが、アミノ酸の回収率は８７％と減少する。さらに、操作に２〜３時間を必要とする。また、非特許文献２に報告されているように、ODS樹脂を用いた前処理は、茶抽出液中のアミノ酸の回収率は９０％以上であり、操作は１サンプルにつき約２分で終わる。しかし、タンニンの除去率は約５０％である。

本発明の目的は、茶抽出液中のタンニンを除去し、アミノ酸分析用試料とすることのできる分析方法を提供することに関する。

本発明は、親水性の基材樹脂で疎水基を持つ逆相型の樹脂を充填した固相抽出剤に試料を通液し、試料中の疎水性物質を除去し、通過した溶液中のアミノ酸およびアミノ酸類縁物質を分析することに関する。

例えば、基材樹脂が親水性の多孔性メタクリレート系架橋ポリマーである逆相型の樹脂を充填した固相抽出剤に茶抽出液を通液し、茶抽出液中のタンニンを除去し、通過した溶液中のアミノ酸およびアミノ酸類縁物質を液体クロマトグラフで分析することに関する。

本発明により、試料中の疎水性物質を高効率で除去し、かつ、試料中のアミノ酸およびアミノ酸類縁物質を高効率で回収できる。

例えば、液体クロマトグラフにより茶抽出液を測定する際、前処理操作において測定対象であるアミノ酸の損失を抑えることができ、また、タンニンによる分析装置の汚染および劣化を低減することができる。

以下、図面を用いて本発明の実施例を説明する。本実施例は、親水性の多孔性メタクリレート系架橋ポリマーの基材樹脂に、疎水基がオクタデシルである逆相型の樹脂を用いる点が、最も特徴的な構成である。

本実施例の操作手順を図１に示す。

各ステップの通液方法は、注射器で注入，ポンプで入り口方向から液を送り込む，出口方向から液を引く，出口部分を減圧し液を吸引する、などがあるが、方法は限定されない。

ステップ１：固相抽出剤のコンディショニング
固相抽出剤に対して、有機溶媒，純水の順に通液させ、固相を活性化させる。

ここで使用する有機溶媒は、水混和性があり、極性の高い溶媒であることが好ましい。例えば、メタノール，アセトニトリルなどである。

ここで、固相抽出剤の構成を図２に示す。コマ型の固相抽出剤であり、多孔性のメタクリレート系架橋ポリマーの基材樹脂で疎水基にオクタデシルを持つ逆相型の樹脂とそれを挟むようにフィルター２，３が形成される。通液時は、上部から溶液を投入する。

またここで、本実施例の固相抽出剤に用いられる逆相型の樹脂の構造を図３に示す。基材樹脂は親水性の多孔性メタクリレート系架橋ポリマーであり、疎水基はオクタデシルである。一般的に水溶液の前処理に用いることが可能であり、中性あるいはｐＨを調整することによりイオン性の成分を吸着することが可能である。有機溶媒に対する溶解性が高い成分であれば、固相抽出剤に吸着後有機溶媒を通液することで溶出させることができる。また、イオン性成分は固相抽出剤に吸着されず素通りする。

ステップ２：固相抽出剤へ試料通液
固相抽出剤に試料を通液する。試料中の疎水性物質は固相抽出剤に吸着し除去され、試料中のアミノ酸およびアミノ酸類縁物質は固相を素通りする。

ステップ３：分析用試料の回収
最初に出た通過液はコンディショニングで使用した純水の残存液が含まれるため、最初の素通り液を廃棄し、その後の素通り液を回収する。最初の廃棄する素通り液の量は、固相抽出部容量の１.５ 〜２倍が好ましい。

ステップ４：分析
素通りした溶液中のアミノ酸およびアミノ酸類縁物質を液体クロマトグラフにより分析する。

ここで液体クロマトグラフを使用したアミノ酸分析について説明する。なお、アミノ酸分析法はこれに限定されるものではない。

アミノ酸分析は、陽イオン交換−ポストカラム法で行う。反応試薬はニンヒドリンを使用する。分離カラムの充填剤はイオン交換樹脂であり、アミノ酸はイオン交換樹脂を充填した分離カラムで成分ごとに分離され、カラムを通過後反応試薬であるニンヒドリンと反応する。検出は、５７０，４４０ｎｍの吸収を測定し、比色定量する。

以上が、本実施例における分析のステップである。

なお、タンニンの分析は、化学研究室；茶の公定分析法，茶業試験場研究報告，第６号，１６７−１７２（１９７０）に従って行う。

ここで、比較対照として、市販されている逆相型の樹脂を充填した固相抽出剤を使用した分析例について説明する。比較に用いた逆相型の樹脂は、ＯＤＳ，ポリマー基材の樹脂では、ジビニルベンゼン／メタクリレートポリマー（ＤＶＢ／ＭＡ），スチレンジビニルベンゼン／メタクリレートポリマー（ＳＤＶＢ／ＭＡ），ジビニルベンゼン／Ｎ−ビニルピロリドンポリマー（ＤＶＢ／ＶＰ）を使用した。操作手順は前記分析法と同じであり、異なる点は樹脂の構造である。

アミノ酸の分析は、標準アミノ酸を分析用試料とし、前記分析法により処理した回収液を液体クロマトグラフにより測定し、前記処理を行わない標準アミノ酸を基準としてアミノ酸の添加回収率を求める。

タンニンの分析は、市販緑茶飲料を分析用試料とし、前記分析法により処理した回収液を茶の公定分析法に従って測定し、前記処理を行わない緑茶飲料を基準としてタンニンの除去率を求める。

アミノ酸の添加回収率を図４に示す。ほとんどの逆相型の樹脂において、Ｔyr，Ｐheの添加回収率は９０％以下であり、アミノ酸の損失が見られた。また、ＴyrよりＰheの損失の割合が大きいことが分かった。一方、本発明で使用する逆相型の樹脂では、Ｔyrの添加回収率は９９％、Ｐheは９４％の添加回収率である（図４）。

このような樹脂の違いによるアミノ酸の回収率の違いは、樹脂の構造に由来する。

逆相型の樹脂では、疎水性の強い成分は、樹脂に強く吸着される。一方、解離している成分はほとんど吸着されない。本方法では、タンニンが吸着され、通常水溶液中で解離しているアミノ酸は吸着されない性質を利用している。分析例で示した逆相型の樹脂の疎水性の強さは、ポリマー樹脂については、ＤＶＢ／ＶＰ＞ＳＤＶＢ／ＭＡ＞ＤＶＢ／ＭＡ＞本発明の逆相型の樹脂、となる。本実施例の逆相型の樹脂以外の基材には、全て芳香環が含まれており、芳香環を持つと疎水性は高くなる。ＴyrやＰheのように芳香環を持つアミノ酸は、比較的疎水性が高い。そのため、逆相型の樹脂の疎水性が強いほど、ＴyrやＰheのように芳香環を持つアミノ酸は、樹脂に吸着され易い。一方、芳香環を持たない本発明の逆相型の樹脂は疎水性が低く、芳香環を持つ疎水性の高いアミノ酸を若干吸着するが、９０％以上を回収することができる。

一方、ＯＤＳについても同様に、疎水性が本実施例での逆相型の樹脂より高く、ＴyrやＰheといったアミノ酸の吸着が起こる。さらに、樹脂のＳｉ−ＯＨ基とアミノ酸のアミノ基による相互作用，水素結合的な吸着，シリカ基材の不純物の金属酸化物と結合、などのシリカ基材由来の複合した機構が働くため、本方法での使用は望ましくない。

また、タンニンの除去率は、いずれの樹脂についても９０％以上（図５）であり、タンニンの除去については逆相型の樹脂の選択性は広いといえる。

以上の結果から、逆相型の樹脂として、芳香環を持たず疎水性が高くない、親水性の多孔性メタクリレート系架橋ポリマーを基材樹脂とした逆相型の樹脂が、本方法の目的のために優れているといえる。

本実施例による市販緑茶飲料中のアミノ酸分析について説明する。試料は、緑茶飲料と緑茶飲料に標準アミノ酸を添加したものを用意した。標準アミノ酸は、注入試料中に各２nmol／２０μＬ（Ｐroのみ４nmol／２０μＬ）となるように添加した。

固相抽出剤は、親水性の多孔性メタクリレート系架橋ポリマーの基材樹脂で疎水基がオクタデシルである逆相型の樹脂２４０mg，０.８ｍＬ とそれを挟むフィルターから形成される。

固相抽出剤の上部からメタノール５ｍＬ，純水５ｍＬを順に通液し、続いて緑茶飲料５ｍＬを通液した。固相抽出剤を通過した最初の溶液２ｍＬは廃棄し、残りの３ｍＬを回収し、分析用試料とした。分析用試料は孔径０.２μｍ のフィルターでろ過し、アミノ酸分析計を使用してアミノ酸を測定した。アミノ酸分析はタンパク質加水分解物分析法の、陽イオン交換−ポストカラム法により行った。

本実施例の方法を用いて、緑茶飲料および緑茶飲料中に標準アミノ酸を添加したものを分析し添加回収率を求めた結果を図６に示す。

この結果、添加回収率はＰhe，Ｔyrを含む全成分で９０％以上となった。また、タンニンの除去率は９３％と、緑茶飲料中のタンニンをほぼ除去することができた。なお、Ｔhrは緑茶中に含まれる遊離アミノ酸とピークが重なり、今回の測定条件では定量できていない。

実施例１と同様に分析用試料を調製した。ここでは、アミノ酸分析は生体液アミノ酸分析法で行った。

前記本実施例の方法を用いて、緑茶飲料および緑茶飲料中に標準アミノ酸を添加したものを分析し添加回収率を求めた結果を図７に示す。

この結果、添加回収率は全成分で９０％以上となり、アミノ酸の分析法の違いによる添加回収率の低下は起きなかった。

〔比較例〕
スチレンジビニルベンゼン／メタクリレートポリマーを基材樹脂とする逆相型の樹脂を固相抽出剤に用い、実施例１と同様の処理を行い、分析用試料を調製した。アミノ酸分析はタンパク質加水分解物分析法で行った。

緑茶飲料および緑茶飲料中に標準アミノ酸を添加したものを分析し添加回収率を求めた結果を図８に示す。この結果、Ｐhe以外の成分は全て９０％の添加回収率を得たが、Ｐheは７４％となった。

本実施例の操作手順を示す図である。 固相抽出剤の構造を示す図である。 逆相型の樹脂の構造を示す図である。 アミノ酸標準試料の添加回収率を示す図である。 緑茶飲料中のタンニンの除去率を示す図である。 実施例１によるアミノ酸の添加回収率結果を示す図である。 実施例２によるアミノ酸の添加回収率結果を示す図である。 比較例によるアミノ酸の添加回収率結果を示す図である。

符号の説明

１…逆相型の樹脂、２，３…フィルター。

Claims (7)

1. 親水性の基材樹脂で疎水基を持つ逆相型の樹脂を充填した固相抽出剤に試料を通液し、試料中の疎水性物質を除去し、通過した溶液中のアミノ酸およびアミノ酸類縁物質を分析する分析方法。
2. 請求項１記載の分析方法であって、
   前記基材樹脂が、親水性の多孔性メタクリレート系架橋ポリマーであることを特徴とする分析方法。
3. 請求項１記載の分析方法であって、
   前記逆相型の樹脂の疎水基が、炭素数１２から２２のアルキル基であることを特徴とする分析方法。
4. 請求項１記載の分析方法であって、
   試料通液前に有機溶媒と水溶媒を通液し樹脂のコンディショニングを行うことを特徴とする分析方法。
5. 請求項１記載の分析方法であって、
   前記疎水性物質が、タンニン，カテキン類，カフェイン、又はクロロフィルを含むことを特徴とする分析方法。
6. 請求項１記載の分析方法であって、
   前記アミノ酸類縁物質が、テアニン、又はγ−アミノ酪酸を含むことを特徴とする分析方法。
7. 請求項１記載の分析方法であって、
   通過した溶液中のアミノ酸およびアミノ酸類縁物質を、液体クロマトグラフを用いて測定することを特徴とする分析方法。
   

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