CN109655531B - 一种同时分析短链、中链和长链酰基辅酶a的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同时分析短链、中链和长链酰基辅酶A的在线二维液相色谱‑质谱轮廓分析方法。其特征在于:采用甲醇‑氯仿‑水双相提取体系,提取样本中的酰基辅酶A。随后使用现有的二维液相色谱‑质谱联用系统在30分钟内实现短链、中链和长链酰基辅酶A的定性、定量分析。酰基辅酶A提取物经自动进样器进样后,首先通过第一维分析将具有不同链长的酰基辅酶A分离成性质不同的两个馏分,并在线转移至分别针对短链酰基辅酶A和中链、长链酰基辅酶A的平行柱分析系统,实现一次进样同时有效的分离短链、中链和长链酰基辅酶A。本发明方法简便、快速、易于操作,具有覆盖度广、通量高、重复性好等优势。
Description
技术领域
本发明属于一种液相色谱分析方法,具体涉及一种同时分析短链、中链和长链酰基辅酶A的在线二维液相色谱-质谱轮廓分析方法。
背景技术
酰基辅酶A是一类由脂肪酸和游离辅酶A形成的脂肪酸硫脂,在脂质合成、脂肪酸氧化、氨基酸代谢、酮体合成等许多代谢通路和生化过程中起着非常重要的作用。乙酰辅酶A多由糖代谢或脂肪酸代谢产生,其可进入三羧酸循环进一步氧化成二氧化碳和水,为机体提供能量。此外,乙酰辅酶A也是合成酮体、脂质、胆固醇等能源性或其他生理活性物质的前体物质。与乙酰辅酶A类似,其他酰基辅酶A同样参与许多复杂的生物过程,传递脂肪酸链进行表观遗传修饰。机体内酰基辅酶A的异常调节与癌症、肥胖、糖尿病等多种疾病的发生发展密切相关,对它们进行定性、定量分析是非常有意义的。
由于酰基辅酶A分子中存在腺苷基团,早期的分析多使用液相色谱(LC)-紫外检测方法。但是,紫外检测器灵敏度和分辨率不足。气相色谱(GC)-质谱(MS)方法同样可以用于酰基辅酶A的分析,但是复杂的衍生化步骤费时费力。
因反相液相色谱(RPLC)-MS技术具有较好的分离性能和较高的灵敏度,这种技术已广泛用于酰基辅酶A的分离分析。由于性质差别较大,具有不同链长的酰基辅酶A需要不同的LC条件以得到最佳的分离效果。短链和中链酰基辅酶A具有较强的极性,为了增强其在RPLC色谱柱上的保留,使用弱酸性流动相条件或者离子对试剂是两种常用的策略。但是在这种条件下,长链酰基辅酶A因保留过强而导致色谱峰严重拖尾,此外,离子对试剂对MS造成严重污染。长链酰基辅酶A多使用强碱性流动相条件进行分析,在该条件下酰基辅酶A分子脱质子化,从而减弱在RPLC色谱柱上的保留,进而避免色谱峰拖尾。综上所述,使用传统RPLC条件,单一方法仅能较好的覆盖并分离部分链长的酰基辅酶A,若想获得全部的酰基辅酶A轮廓信息,需进行两次分析。
针对常规酰基辅酶A分析方法存在的问题,本发明发展了一种可同时覆盖并良好分离短链、中链和长链酰基辅酶A的在线二维液相色谱-质谱方法。首先在第一维使用预分离柱将生物样品提取物分离成短链酰基辅酶A和中链、长链酰基辅酶A两个馏分,随后在线转移至第二维平行柱分离系统。依据各馏分的性质,分别使用弱碱性和强碱性流动相条件分离短链酰基辅酶A和中链、长链酰基辅酶A。本发明所建立的方法对酰基辅酶A的覆盖度广、分离度好、灵敏度高,适合用于组织、细胞等生物样本中酰基辅酶A的高效分离。
发明内容
本发明的目的是针对现有分析方法的不足,提供一种基于二维液相色谱-质谱技术的酰基辅酶A轮廓分析方法,可显著提高方法的覆盖度,用于短链、中链和长链酰基辅酶A的同时分析。
为实现上述目的,本发明采用的具体技术方案如下:
第一步:准确称取新鲜肝脏组织10-20mg并加入250-500μL甲醇,涡旋30-60秒,加入250-500μL氯仿,涡旋30-60秒,加入100-200μL水,涡旋30-60秒。
第二步:在12000-15000rpm,0-4℃的条件下离心10-20分钟后,移取200-450μL上层清液,并将上层清夜在0-4℃条件下冷冻干燥。
第三步:使用50-100μL甲醇/水(1:4-1:6,v:v)溶液将冻干的酰基辅酶A提取物复溶。
第四步:使用在线二维液相色谱-质谱系统同时分析短链、中链和长链酰基辅酶A。第一维分离旨在实现短链酰基辅酶A和中链、长链酰基辅酶A的分离,得到两个馏分。所用色谱柱为C18色谱柱(2.1×5mm,1.7μm)。使用弱碱性条件分析短链酰基辅酶A,流动相A1为水,其中含有10-20mM甲酸铵和0.05-0.1wt.%氨水,流动相B1为乙腈/水(95:5,v:v),其中含有10-20mM甲酸铵和0.05-0.1wt.%氨水。选择C6:0-酰基辅酶A作为两个馏分的边界。第二维为平行柱分析系统,旨在实现短链酰基辅酶A馏分和中链、长链酰基辅酶A馏分的精细分离分析。分离短链酰基辅酶A所使用的液相色谱仪器和流动相条件与第一维色谱分离系统相同,所使用的第二维色谱柱1为T3柱(2.1×50mm,1.7μm)。使用强碱性条件分析中链和长链酰基辅酶A,流动相A2为水,其中含有0.2-0.6wt.%氨水,流动相B2为乙腈,其中含有0.2-0.6wt.%氨水。分离过程采用梯度洗脱,其中流动相B1从3%升至100%,B2从10%升至100%。色谱柱温均为35℃,进样体积为5μL。
所述的在线二维液相色谱-质谱分析系统,采用的装置包括液相色谱泵1、液相色谱泵2、稀释液泵、自动进样器、第二维液相色谱柱1、第二维液相色谱柱2、第一维液相色谱柱、十通阀、八通阀、六通阀、和检测器。其分离过程包括馏分分离、短链酰基辅酶A分析、中链和长链酰基辅酶A分析、溶剂替换四个步骤,具体如下:
初始时,八通阀的3号位与4号位相连,十通阀的15号位与16号位相连,六通阀的28号位与33号位相连;液相色谱泵1的输出端经过自动进样器与八通阀的3号位相连,八通阀的4号位通过管线与十通阀的15号位相连,十通阀的16号位与第一维液相色谱柱的输入端相连,第一维液相色谱柱的输出端与十通阀的19号位相连,十通阀的20号位通过管线与八通阀的9号位相连,八通阀的10号位与第二维液相色谱柱1的输入端相连,第二维液相色谱柱1的输出端与六通阀的28号位相连,六通阀的33号位与检测器相连;液相色谱泵2与八通阀的5号位相连,八通阀的6号位和7号位通过管线相连,8号位与第二维液相色谱柱2的输入端相连,第二维液相色谱柱2的输出端与六通阀的32号位相连,六通阀的30号位与31号位通过管线相连,29号位接入废液;在该位置,自动进样器将酰基辅酶A提取液进样到第一维液相色谱柱,短链酰基辅酶A首先流出并转移至第二维液相色谱柱1中;
待C6:0-酰基辅酶A从第一维液相色谱柱完全流出后,控制十通阀切换,十通阀的15号位与24号位相连,十通阀的24号位通过管线与21号位相连,十通阀的22号位和23号位堵死;在该位置实现短链酰基辅酶A在第二维液相色谱柱1中的分离以及第二维液相色谱柱2的平衡;
待短链酰基辅酶A在第二维液相色谱柱1中分离完成后,控制十通阀、八通阀、和六通阀同时切换,在该位置,第一维液相色谱柱(26)中的中链和长链酰基辅酶A馏分转移到第二维液相色谱柱2中并进行分离;与此同时,完成第二维液相色谱柱1的平衡;
待中链和长链酰基辅酶A分离完成后,控制十通阀切换;稀释液泵与十通阀的17号位相连,十通阀的16号位与第一维液相色谱柱(26)的输入端相连,第一维液相色谱柱(26)的输出端与十通阀的19号位相连,十通阀的18号位接入废液;在该位置,实现第一维液相色谱柱中残留溶剂的替换。
本发明的核心过程是:使用在线二维液相色谱分离系统,在第一维实现不同极性酰基辅酶A的馏分分离,进一步结合第二维的超高效液相色谱平行柱分析系统,实现短链、中链和长链酰基辅酶A的同时覆盖。
与传统方法相比本发明具有如下优点:本发明方法覆盖度广,可实现同时分离分析短链、中链和长链酰基辅酶A。不同链长酰基辅酶A均在最优条件下分析,分离度高。分析通量高,一次进样即可实现酰基辅酶A轮廓信息的全覆盖,缩短了分析时间。此外,本发明方法操作简便,灵敏度高,样本用量少,普适性强。
附图说明
图1为本发明提供的二维液相色谱分析方法的装置图;
图2为本发明提供的二维液相色谱分析方法的流路图;
图3为使用本发明方法分析正常裸鼠肝脏提取物所鉴定的酰基辅酶A的提取离子流图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步描述。
实施例1:裸鼠新鲜肝脏组织中酰基辅酶A轮廓分析方法
酰基辅酶A的提取过程如下:准确称取新鲜肝脏组织20mg并加入500μL甲醇,涡旋30秒,加入500μL氯仿,涡旋30秒,加入200μL水,涡旋30秒。在15000rpm,4℃的条件下高速离心10分钟后,移取450μL上层清液,在4℃条件下冷冻干燥。使用50μL甲醇-水(1:5,v:v)溶液将冻干的酰基辅酶A提取物复溶。
使用在线二维液相色谱-质谱系统同时分析短链、中链和长链酰基辅酶A。本发明方法所使用的二维液相色谱系统如附图1所示,包括液相色谱泵1(1)、液相色谱泵2(14)、稀释液泵2)、自动进样器2、第二维液相色谱柱1(12)、第二维液相色谱柱2(13)、第一维液相色谱柱26、十通阀25、八通阀11、六通阀34、和检测器35。其流路图如附图2所示,分离过程包括馏分分离、短链酰基辅酶A分析、中链和长链酰基辅酶A分析、溶剂替换四个步骤,具体如下:
初始时,三个切换阀均处于附图2所示实线所示位置,即,八通阀11的3号位与4号位相连,十通阀25的15号位与16号位相连,六通阀34的28号位与33号位相连;液相色谱泵1(1)的输出端经过自动进样器2与八通阀11的3号位相连,八通阀11的4号位通过管线与十通阀25的15号位相连,十通阀25的16号位与第一维液相色谱柱26的输入端相连,第一维液相色谱柱26的输出端与十通阀25的19号位相连,十通阀25的20号位通过管线与八通阀(11)的9号位相连,八通阀11的10号位与第二维液相色谱柱1(12)的输入端相连,第二维液相色谱柱1(12)的输出端与六通阀34的28号位相连,六通阀34的33号位与检测器相连;液相色谱泵2(14)与八通阀11的5号位相连,八通阀11的6号位和7号位通过管线相连,8号位与第二维液相色谱柱2(13)的输入端相连,第二维液相色谱柱2(13)的输出端与六通阀34的32号位相连,六通阀34的30号位与31号位通过管线相连,29号位接入废液;在该位置,酰基辅酶A提取物经自动进样器进样后进入液相色谱分离系统。经第一维预分离实现短链酰基辅酶A和中链、长链酰基辅酶A两个馏分的分离。本发明选择C6:0-酰基辅酶A作为两个馏分的边界,使用终浓度为5μg/mL的C6:0-酰基辅酶A标准样品(溶解标准样品所使用的溶剂为甲醇:水=1:5,V:V)优化确定馏分切割时间。
经优化,在5.5min时,第一个馏分完全流出,此时,将切换阀A切换至虚线所示位置,即,十通阀25的15号位与24号位相连,十通阀25的24号位通过管线与21号位相连,十通阀25的22号位和23号位堵死。在该位置实现短链酰基辅酶A在第二维液相色谱柱1(12)中的分离以及第二维液相色谱柱2(13)的平衡。
待第一个馏分分离完成,将切换阀A切换至实线所示位置,同时切换阀B和切换阀C切换至虚线所示位置。此时,第二个馏分包括中链和长链酰基辅酶A在线转移至第二维色谱柱2进一步分离,同时完成第二维液相色谱柱1(12)的平衡。
第二个馏分分离完成后,将三个切换阀同时切换至虚线所示位置,在该位置,使用水将第一维色谱柱中填充的流动相置换,为下一个样本的分析做准备。
具体梯度条件如下表所示:
备注:表中“-”表示从一个点到另一个点的变化。
本实施例中,第一维分析所用液相色谱仪器为Shimadzu Prominence系统(Shimadzu,Japan)。第一维色谱柱为UPLC ACQUITY BEH C18色谱柱(2.1×5mm,1.7μm,Waters,USA)。流动相A1为水,含10mM甲酸铵和0.05%氨水;B1为95%乙腈,含10mM甲酸铵和0.05%氨水。第二维分离馏分1所使用的液相色谱仪器和流动相条件与第一维色谱分离系统相同,所使用的第二维色谱柱1为UPLC ACQUITY HSS T3色谱柱(2.1×50mm,1.7μm,Waters,Milford,USA)。第二维分离馏分2所用液相色谱仪器为Shimadzu Nexera系统(Shimadzu,Japan)。第二维色谱柱2为UPLC ACQUITY BEH C18色谱柱(2.1×100mm,1.7μm,Waters,Milford,USA)。流动相A1为水,含0.5%氨水;B1为乙腈,含0.5%氨水。色谱柱温均为35℃,进样体积为5μL。
质谱数据使用Q-Exactive HF orbitrap质谱仪(ThermoFisher Scientific,Rockford,USA)在ESI源正离子模式下采集。数据采集使用全扫描的方式,从而得到酰基辅酶A的轮廓信息。
使用本发明所建立的方法,在30min内可完成对90种酰基辅酶A的同时检测。所得酰基辅酶A提取离子流图如附图3所示。方法具有很好的重复性,日间精密度95%以上的酰基辅酶A其RSD<20%。动态范围达3-5个数量级。灵敏度高,检测限在pg/mL水平。附表1为本发明所建立的方法所鉴定到的新鲜肝脏组织中的酰基辅酶A分子信息。
附表1
本发明方法简便、快速、易于操作,具有覆盖度广、通量高、重复性好等优势。
Claims (6)
1.一种同时分析短链、中链和长链酰基辅酶A的方法,其特征在于:
第一步:使用甲醇-氯仿-水双相体系提取新鲜生物组织中的酰基辅酶A,其中甲醇、氯仿和水的体积比为2.5:2.5:1;
第二步:离心后,移取上层清液,并将上层清夜冷冻干燥;
第三步:使用甲醇-水的混合溶剂作为复溶溶剂将冻干提取物溶解;
第四步:使用在线二维液相色谱-质谱系统同时分析短链、中链和长链酰基辅酶A;
第四步使用弱碱性条件分析短链酰基辅酶A,流动相A1为水,其中含有终浓度10-20 mM甲酸铵和0.05-0.1 wt.%氨水,流动相B1为乙腈/水,乙腈与水的体积比为95:5,其中含有终浓度10-20 mM甲酸铵和0.05-0.1 wt.%氨水;使用强碱性条件分析中链和长链酰基辅酶A,流动相A2为水,其中含有终浓度0.2-0.6 wt.%氨水,流动相B2为乙腈,其中含有终浓度0.2-0.6 wt.%氨水;分离过程采用梯度洗脱,其中流动相B1从3%升至100%,B2从10%升至100%;
在线二维液相色谱-质谱分析系统使用C18色谱柱作为第一维预分离柱,旨在将短链酰基辅酶A和中链、长链酰基辅酶A分离,得到两个馏分;选择C6:0-酰基辅酶A作为两个馏分的边界;定义在C6:0-酰基辅酶A之前流出的为短链酰基辅酶A,在C6:0-酰基辅酶A与C12:0-酰基辅酶A之间流出的为中链酰基辅酶A,在C12:0-酰基辅酶A之后流出的为长链酰基辅酶A;第二维为平行柱分析系统,使用T3色谱柱分离短链酰基辅酶A,使用C18色谱柱分离中链和长链酰基辅酶A;
所述的在线二维液相色谱-质谱分析系统,其分离过程包括馏分分离、短链酰基辅酶A分析、中链和长链酰基辅酶A分析、溶剂替换四个步骤,具体如下:
初始时,八通阀(11)的3号位与4号位相连,十通阀(25)的15号位与16号位相连,六通阀(34)的28号位与33号位相连;液相色谱泵1(1)的输出端经过自动进样器(2)与八通阀(11)的3号位相连,八通阀(11)的4号位通过管线与十通阀(25)的15号位相连,十通阀(25)的16号位与第一维液相色谱柱(26)的输入端相连,第一维液相色谱柱(26)的输出端与十通阀(25)的19号位相连,十通阀(25)的20号位通过管线与八通阀(11)的9号位相连,八通阀(11)的10号位与第二维液相色谱柱1(12)的输入端相连,第二维液相色谱柱1(12)的输出端与六通阀(34)的28号位相连,六通阀(34)的33号位与检测器相连;液相色谱泵2(14)与八通阀(11)的5号位相连,八通阀(11)的6号位和7号位通过管线相连,8号位与第二维液相色谱柱2(13)的输入端相连,第二维液相色谱柱2(13)的输出端与六通阀(34)的32号位相连,六通阀(34)的30号位与31号位通过管线相连,29号位接入废液;
在该位置,自动进样器(2)将酰基辅酶A提取液进样到第一维液相色谱柱(26),短链酰基辅酶A首先流出并转移至第二维液相色谱柱1(12)中;
待C6:0-酰基辅酶A从第一维液相色谱柱(26)完全流出后,控制十通阀(25)切换,十通阀(25)的15号位与24号位相连,十通阀(25)的24号位通过管线与21号位相连,十通阀(25)的22号位和23号位堵死;在该位置实现短链酰基辅酶A在第二维液相色谱柱1(12)中的分离以及第二维液相色谱柱2(13)的平衡;
待短链酰基辅酶A在第二维液相色谱柱1(12)中分离完成后,控制十通阀(25)、八通阀(11)、和六通阀(34)同时切换,在该位置,第一维液相色谱柱(26)中的中链和长链酰基辅酶A馏分转移到第二维液相色谱柱2(13)中并进行分离;与此同时,完成第二维液相色谱柱1(12)的平衡;
待中链和长链酰基辅酶A分离完成后,控制十通阀(25)切换;稀释液泵(27)与十通阀(25)的17号位相连,十通阀(25)的16号位与第一维液相色谱柱(26)的输入端相连,第一维液相色谱柱(26)的输出端与十通阀(25)的19号位相连,十通阀(25)的18号位接入废液;在该位置,实现第一维液相色谱柱(26)中残留溶剂的替换。
2.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:第一步中所用的新鲜生物组织为10-20mg;加入甲醇250-500 µL并涡旋30-60秒,随后加入氯仿250-500 µL并涡旋30-60秒,加入水100-200 µL并涡旋30-60秒。
3.按照权利要求1或2所述的方法,其特征在于:第二步中使用12000-15000 rpm,0-4℃的条件下离心10-20分钟后,移取200-450 µL上层清液,在0-4 ℃条件下冷冻干燥。
4.按照权利要求1或2所述的方法,其特征在于:第三步使用50-100 µL复溶溶剂复溶,复溶溶剂为甲醇与水体积比=1:4 - 1:6。
5.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:新鲜生物组织为新鲜肝脏组织样本、脑组织样本、心脏组织样本、肾脏组织样本或细胞样本中的一种或二种以上。
6.按照权利要求1所述的方法,其特征在于:所述的在线二维液相色谱-质谱分析系统,采用的装置包括液相色谱泵1(1)、液相色谱泵2(14)、稀释液泵(27)、自动进样器(2)、第二维液相色谱柱1(12)、第二维液相色谱柱2(13)、第一维液相色谱柱(26)、十通阀(25)、八通阀(11)、六通阀(34)、和检测器(35)。
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PB01 | Publication | ||
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