CN107179378A - 一种同时分离代谢组和脂质组组份的液相色谱分析方法及其应用 - Google Patents

一种同时分离代谢组和脂质组组份的液相色谱分析方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种同时分离代谢组和脂质组组份的液相色谱分析方法及其应用，该方法所涉及的装置包括五个高效液相色谱输液泵、一个自动进样器、一个检测器、三个两位多通阀、一根捕集柱、两根液相色谱分析柱。其特点在于通过引入合适的捕集柱将复杂样品中的代谢组和脂质组组份分离并转移，结合后续分别针对代谢组和脂质组的平行柱分析，实现一次进样同时有效的分离代谢组和脂质组代谢物。本发明方法适用于复杂样品中代谢组和脂质组的同时分析，具有通量高、代谢物覆盖度广、普适性强、操作简便、重复性好等优势。

Description

一种同时分离代谢组和脂质组组份的液相色谱分析方法及其应用
技术领域
本发明属于一种液相色谱分析方法，具体涉及一种同时分离代谢组和脂质组组份的高效液相色谱分析方法。
背景技术
代谢组学技术探寻代谢物与生理病理变化的相对关系，是系统生物学的重要组成部分。其定性定量分析的对象为生物体内的所有代谢物。这些代谢物的组成十分复杂且性质差异很大，给分离分析带来非常大的困难，使代谢组学的发展与分析技术的发展密切相关。
反相液相色谱-质谱联用技术因其较高的柱效、重复性、灵敏度和分辨率而成为代谢组学研究中的核心技术之一。由于代谢物性质差异非常大，发展了一系列非靶向和靶向的分析方法。一般来说，传统的非靶向的分析方法可以覆盖极性和中等极性的代谢物，如氨基酸、脂肪酸、肉碱和溶血磷脂等。这些分析方法主要有两个弊端，其一是极性代谢物由于在反相色谱柱上保留太弱而在死时间流出，分离度差，分辨率低且存在严重的离子抑制；其二是非极性较强的磷脂和甘油酯等代谢物由于保留太强而无法洗脱。
针对上述问题，后来发展了一些特定的分析方法，如使用洗脱能力较强的溶剂(如异丙醇)作为流动相对脂类进行分析；使用亲水液相色谱对极性代谢物进行分析等。但是由于分析条件不同，若想获得尽可能多的代谢信息需要进行两次甚至多次提取和分离，费时、费力且需要更大量的样品。因此，发展高通量、高代谢物覆盖度的分析方法在日常代谢组学分析中十分必要。
基于常规代谢组学分析方法中存在的上述问题，本发明建立了一种代谢组和脂质组同时分离的高效液相色谱分析方法。使用捕集柱将复杂样品中的代谢组和脂质组组份分离并转移，结合后续分别针对代谢组和脂质组的平行柱分离，实现一次进样同时有效的分离代谢组和脂质组代谢物。本发明所构建的液相色谱分析方法适用于多种复杂样品体系如植物样品、血样、尿样、组织等样品的高效分离。该方法通量高且代谢物覆盖度广，构建灵活，操作简便，与质谱兼容性好，在复杂样品分离分析中有非常广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是针对上述代谢组学分析技术中存在的问题，提供一种高通量、高覆盖度的液相色谱分析方法及其应用。通过引入合适的捕集柱将复杂样品中的代谢组和脂质组组份分离并转移，结合后续的高效液相色谱分析，实现一次进样同时分析代谢组和脂质组组份。
为实现上述目的，具体发明技术方案如下：
本发明涉及一种同时分离代谢组和脂质组的高效液相色谱分析方法，采用的装置包括液相色谱泵1、液相色谱泵2、稀释液泵、自动进样器、液相色谱柱1、液相色谱柱2、捕集柱、十通阀、八通阀、六通阀、和检测器。
主要包括代谢组组份转移、代谢组组份分离、脂质组组份分离三个过程。初始时，八通阀的3号位与4号位相连，十通阀的15号位与16号位相连，六通阀的28号位与33号位相连；液相色谱泵1的输出端经过自动进样器与八通阀的3号位相连，八通阀的4号位通过管线与十通阀的15号位相连，十通阀的16号位与捕集柱的输入端相连，捕集柱的输出端与十通阀的19号位相连，十通阀的20号位通过管线与八通阀的9号位相连，八通阀的10号位与液相色谱柱1的输入端相连，液相色谱柱1的输出端与六通阀的28号位相连，六通阀的33号位与检测器相连；液相色谱泵2与八通阀的5号位相连，八通阀的6号位和7号位通过管线相连，8号位与色谱柱2的输入端相连，色谱柱2的输出端与六通阀的32号位相连，六通阀的30号位与31号位通过管线相连，29号位接入废液；在该位置，自动进样器将复杂样品提取液由进样到捕集柱，样品中的代谢组组份首先流出并转移至液相色谱柱1中。
待代谢组组份从捕集柱完全流出后，控制十通阀切换，液相色谱泵1的输出端经过自动进样器与八通阀的3号位相连，八通阀的4号位通过管线与十通阀的15号位相连，十通阀的24号位通过管线与21号位相连，十通阀的20号位通过管线与八通阀的9号位相连，八通阀的10号位与液相色谱柱1的输入端相连，液相色谱柱1的输出端与六通阀的28号位相连，六通阀的33号位与检测器相连；液相色谱泵2控制输出的流动相流路不变；十通阀的22号位和23号位堵死；在该位置，实现代谢组组份在液相色谱柱1中的分离以及液相色谱柱2的平衡。
待代谢组组份在液相色谱柱1中分离完成后，控制十通阀、八通阀、和六通阀同时切换，液相色谱泵1的输出端经过自动进样器与八通阀的3号位相连，八通阀的10号位与液相色谱柱1的输入端相连，液相色谱柱1的输出端与六通阀的28号位相连，六通阀的29号位接入废液；液相色谱泵2与八通阀的5号位相连，八通阀的4号位通过管线与十通阀的15号位相连，十通阀的16号位与捕集柱的输入端相连，捕集柱的输出端与十通阀的19号位相连，十通阀的20号位通过管线与八通阀的9号位相连，八通阀的8号位与液相色谱柱2的输入端相连，液相色谱柱2的输出端与六通阀的32号位相连，六通阀的33号位与检测器相连；在该位置，捕集柱中的脂质组组份转移到液相色谱柱2中并进行分离，与此同时，完成液相色谱柱1的平衡。
待脂质组组份分离完成后，控制十通阀切换；稀释液泵与十通阀的17号位相连，十通阀的16号位与捕集柱的输入端相连，捕集柱的输出端与十通阀的19号位相连，十通阀的18号位接入废液；在该位置，实现捕集柱中残留溶剂的替换。
液相色谱柱1和液相色谱柱2分别用于代谢组和脂质组组份的分离；捕集柱用于代谢组和脂质组组份的转移。
所述液相色谱分析方法用于同时分析复杂样品中的代谢组和脂质组组份。
所述的代谢组组份包含除脂类以外的小分子代谢物和溶血磷脂类代谢物；脂质组组份包括除溶血磷脂类外的其他脂类代谢物。
本发明最核心的过程是：复杂样品提取物进样后保留在捕集柱上，根据代谢物性质的差异将复杂样品中的代谢组和脂质组组份分离，通过控制十通阀的位置分别将代谢组和脂质组组份转移到液相色谱柱1和液相色谱柱2上，结合后续的高效液相色谱分离系统，实现一次进样同时分析代谢组和脂质组组份。
本发明具有如下优点：本发明方法适用于复杂样品中代谢组和脂质组组份的同时分析。与传统的液相色谱分析方法相比，使用本发明方法只需一次进样就可实现代谢组和脂质组组份的同时分析，缩短了分析时间，提高了分析通量；此外，降低了样品的使用量，对珍贵样品尤其有利；代谢物覆盖度广，对于极性较强的代谢物(如氨基酸)和非极性较强的代谢物(如脂质)均可得到良好的分离效果；操作简便，普适性强，可以实现对复杂体系如植物样品、生物样品、环境样品等的高效分离。
附图说明
图1为本发明提供的液相色谱分析方法的装置图；
图2a为本发明提供的液相色谱分析方法的流路图之一；
图2b为本发明提供的液相色谱分析方法的流路图之二；
图2c为本发明提供的液相色谱分析方法的流路图之三；
图2d为本发明提供的液相色谱分析方法的流路图之四；
图1-图2d中数字代表：1为液相色谱泵1，2为自动进样器，11为八通阀，3-10为八通阀(11)的接口，12为液相色谱柱1，13为液相色谱柱2，14为液相色谱泵2，25为十通阀，15-24为十通阀(25)的接口，26为捕集柱，27为稀释液泵，34为六通阀，28-33为六通阀(34)的接口，35为检测器。
图3为本发明对血浆样品提取物进行分析的总离子流图。图中横坐标为保留时间(min)，纵坐标为响应强度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步描述。
实施例1：代谢组脂质组组份同时分析的高效液相色谱方法建立
本发明方法采用的装置包括液相色谱泵1、液相色谱泵2、稀释液泵、自动进样器、液相色谱柱1、液相色谱柱2、捕集柱、十通阀、八通阀、六通阀和检测器；主要包括代谢组组份转移、代谢组组份分离、脂质组组份分离三个过程。
第一步，如图2a所示。初始时，八通阀11的3号位与4号位相连，十通阀25的15号位与16号位相连，六通阀34的28号位与33号位相连；液相色谱泵1(1)的输出端经过自动进样器2与八通阀11的3号位相连，八通阀(11)的4号位通过管线与十通阀25的15号位相连，十通阀25的16号位与捕集柱26的输入端相连，捕集柱26的输出端与十通阀25的19号位相连，十通阀25的20号位通过管线与八通阀11的9号位相连，八通阀11的10号位与液相色谱柱1(12)的输入端相连，液相色谱柱1(12)的输出端与六通阀34的28号位相连，六通阀34的33号位与检测器相连；液相色谱泵2(14)与八通阀11的5号位相连，八通阀11的6号位和7号位通过管线相连，8号位与色谱柱2(13)的输入端相连，色谱柱2(13)的输出端与六通阀34的32号位相连，六通阀34的30号位与31号位通过管线相连，29号位接入废液。在图2a所示过程，自动进样器2将复杂样品提取液由进样到捕集柱26，样品中的代谢组组份首先流出并转移至液相色谱柱1(12)中。
第二步，如图2b所示，待代谢组组份从捕集柱26完全流出后，控制十通阀25切换，液相色谱泵1(1)的输出端经过自动进样器2与八通阀11的3号位相连，八通阀11的4号位通过管线与十通阀25的15号位相连，十通阀25的24号位通过管线与21号位相连，十通阀25的20号位通过管线与八通阀11的9号位相连，八通阀11的10号位与液相色谱柱1(12)的输入端相连，液相色谱柱1(12)的输出端与六通阀34的28号位相连，六通阀34的33号位与检测器相连；液相色谱泵2(14)控制输出的流动相流路不变；十通阀25的22号位和23号位堵死。通过图2b所示过程可实现代谢组组份在色谱柱1(12)中的分离以及液相色谱柱2的平衡。
第三步，如图2c所示，待代谢组组份在液相色谱柱1(12)中分离完成后，控制十通阀25、八通阀11、和六通阀34同时切换，液相色谱泵1(1)的输出端经过自动进样器2与八通阀11的3号位相连，八通阀11的10号位与液相色谱柱1(12)的输入端相连，液相色谱柱1(12)的输出端与六通阀34的28号位相连，六通阀34的29号位接入废液；液相色谱泵2(14)与八通阀11的5号位相连，八通阀11的4号位通过管线与十通阀25的15号位相连，十通阀25的16号位与捕集柱26的输入端相连，捕集柱26的输出端与十通阀25的19号位相连，十通阀25的20号位通过管线与八通阀11的9号位相连，八通阀11的8号位与液相色谱柱2(13)的输入端相连，液相色谱柱2(13)的输出端与六通阀34的32号位相连，六通阀34的33号位与检测器相连。在图2c所示过程，捕集柱26中的脂质组组份的转移到液相色谱柱2(13)中并进行分离，与此同时，完成液相色谱柱1(12)的平衡。
第四步，如图2d所示，待脂质组组份分离完成后，控制十通阀25切换；稀释液泵27与十通阀25的17号位相连，十通阀25的16号位与捕集柱26的输入端相连，捕集柱26的输出端与十通阀25的19号位相连，十通阀25的18号位接入废液。通过图2d所示过程可实现捕集柱26中残留流动相的替换。
在本实施例中，液相色谱泵1为两个高效液相色谱单元泵，液相色谱泵2为两个超高效液相色谱单元泵，稀释液泵为一个高效液相色谱单元泵，检测器为质谱检测器。通过图2a-2d过程，便实现了复杂样品中代谢组和脂质组组份的同时分析。
实施例2：复杂样品体系分离
样品：血浆提取物
具体提取过程如下：准确移取50μL血浆与eppendorf管中，加入200μL甲醇，涡旋1分钟后加入50μL异丙醇，涡旋1分钟；12℃下以14000rpm的速度离心15分钟；取250μL上层清液真空冷冻干燥。进样前使用50μL 50％异丙醇复溶；进样量为5μL。
代谢组组分离色谱参数：液相色谱柱1：C18柱(1.7μm，2.1×50mm)。流动相A1为含有体积分数0.1％甲酸的水溶液，流动相B1为含有体积分数0.1％甲酸的乙腈溶液。流速0.35mL/min。柱温为50℃。
脂质组组分离色谱参数：液相色谱柱2：T3柱(1.7μm，2.1×50mm)。流动相A2为含有10mM乙酸铵的乙腈/水溶液(乙腈/水＝40/60，v/v)，流动相B2为含有10mM乙酸铵的异丙醇/乙腈溶液(异丙醇/乙腈＝90/10，v/v)。流速0.3mL/min。柱温为50℃。
捕集柱参数：C8柱(1.7μm，2.1×5mm)。稀释液为纯水。
本实施例中，根据捕集柱优化结果，设定十通阀(25)由图2a切换至图2b的时间为7.5min。在0min到29min时间范围内，设定稀释液流速为0，29min到30min，设定稀释液流速为0.4mL/min。具体梯度条件如下表所示：
使用本发明方法分析血浆样品提取物，在上述液相色谱条件下，质谱采集的总离子流图如附图3所示。

Claims (5)

1.一种同时分离代谢组和脂质组组份的液相色谱分析方法，其特征在于：
采用的装置包括液相色谱泵1(1)、液相色谱泵2(14)、稀释液泵(27)、自动进样器(2)、液相色谱柱1(12)、液相色谱柱2(13)、捕集柱(26)、十通阀(25)、八通阀(11)、六通阀(34)、和检测器(35)；
主要包括代谢组组份转移、代谢组组份分离、脂质组组份分离三个过程；
初始时，八通阀(11)的3号位与4号位相连，十通阀(25)的15号位与16号位相连，六通阀(34)的28号位与33号位相连；液相色谱泵1(1)的输出端经过自动进样器(2)与八通阀(11)的3号位相连，八通阀(11)的4号位通过管线与十通阀(25)的15号位相连，十通阀(25)的16号位与捕集柱(26)的输入端相连，捕集柱(26)的输出端与十通阀(25)的19号位相连，十通阀(25)的20号位通过管线与八通阀(11)的9号位相连，八通阀(11)的10号位与液相色谱柱1(12)的输入端相连，液相色谱柱1(12)的输出端与六通阀(34)的28号位相连，六通阀(34)的33号位与检测器相连；液相色谱泵2(14)与八通阀(11)的5号位相连，八通阀(11)的6号位和7号位通过管线相连，8号位与色谱柱2(13)的输入端相连，色谱柱2(13)的输出端与六通阀(34)的32号位相连，六通阀(34)的30号位与31号位通过管线相连，29号位接入废液；在该位置，自动进样器(2)将复杂样品提取液进样到捕集柱(26)，样品中的代谢组组份首先流出并转移至液相色谱柱1(12)中；
待代谢组组份从捕集柱(26)完全流出后，控制十通阀(25)切换，十通阀(25)的15号位与24号位相连，十通阀(25)的24号位通过管线与21号位相连，十通阀(25)的22号位和23号位堵死；在该位置实现代谢组组份在液相色谱柱1(12)中的分离以及液相色谱柱2(13)的平衡；
待代谢组组份在液相色谱柱1(12)中分离完成后，控制十通阀(25)、八通阀(11)、和六通阀(34)同时切换，在该位置，捕集柱(26)中的脂质组组份转移到液相色谱柱2(13)中并进行分离；与此同时，完成液相色谱柱1(12)的平衡；
待脂质组组份分离完成后，控制十通阀(25)切换；稀释液泵(27)与十通阀(25)的17号位相连，十通阀(25)的16号位与捕集柱(26)的输入端相连，捕集柱(26)的输出端与十通阀(25)的19号位相连，十通阀(25)的18号位接入废液；在该位置，实现捕集柱(26)中残留溶剂的替换。
2.按照权利要求1所述的液相色谱分析方法，其特征在于：液相色谱柱1(12)和液相色谱柱2(13)分别用于代谢组和脂质组组份的分离；捕集柱(26)用于代谢组和脂质组组份的转移。
3.按照权利要求1所述的液相色谱分析方法，其特征在于：所述的代谢组组份包含所有除脂类以外的小分子代谢物和溶血磷脂类代谢物；脂质组组份包括除溶血磷脂类外的其他脂类代谢物。
4.按照权利要求3所述的液相色谱分析方法，其特征在于：所述液相色谱分析方法可以用于复杂样品中代谢组和脂质组组份的同时分析。
5.按照权利要求1或4所述的液相色谱分析方法的应用，其特征在于：所述的复杂样品为人或动物的血浆提取液、人或动物的尿液、人或动物的组织提取液、细胞提取液、植物提取液中的一种或二种以上。
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