CN1785476A - 一种全二维毛细管液相色谱分离系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种全二维毛细管液相色谱分离系统，其包括进样单元与分离单元，进样单元包括一个进样器与一个第一梯度泵，第一梯度泵的输出端连接进样器的输入端，分离单元包括一第一维色谱柱、一个两位十通阀、两根第二维色谱柱及一个第二梯度泵，第一维色谱柱的输入端连接进样器，输出端连接两位十通阀，二第二维色谱柱的两端分别与两位十通阀连接，第二梯度泵的输出端连接两位十通阀。本发明通过长柱全二维液相色谱阀柱间界面和接口技术的构建，提高了全二维液相色谱的选择性和分辨率，实现对复杂组分体系的难挥发化合物的分离分析。
Description
技术领域
本发明涉及一种液相色谱分离系统，特别是关于一种多维分离复杂组分的全二维毛细管液相色谱分离系统。
背景技术
气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)等分离技术及其与质谱仪(MS)的联用已在复杂样品的分离分析中发挥了积极的作用。随着生命科学(蛋白质组学、代谢组学等)、食品安全、环境污染、重大疾病和药物筛选分析(中药现代化等)等领域研究的迅速开展，一维分离模式所能提供的有限的分辨率和峰容量很难满足对极端复杂体系样品进行全组分分析的要求。多维色谱技术能极大地提高整个系统的峰容量和分离选择性，在解决成分复杂、含量不均、干扰严重、组分未知样品方面，具有独特的不可替代的作用，已迅速成为色谱科学研究领域的热点之一，日益受到重视。应用多维色谱技术，将分离机理不同而又互相独立的色谱柱耦联在一起，并配合采用质谱分析等鉴定手段，为解决这一问题提供了新的研究和应用思路。
组成多维色谱必须满足两个基本条件，一是两种或多种色谱模式的分离机理不同，即满足正交的要求，二是后续的分离不能降低前一维的分辨率。作为最简单的多维色谱模式，二维液相色谱由两种不同分离机理的液相色谱模式通过一定的切换接口构成，样品经过第一维色谱柱后进入切换接口，继续由第二维色谱柱进行分离。目前主要有两种二维色谱构建方式，其一为传统的采用“中心切割”技术的二维色谱，将第一维色谱柱所分离出的组分中某些感兴趣的部分离线或在线切入第二维色谱柱进行进一步的分离。这种模式比较适合目标组分分析，流路相对简单，但峰容量的增加有限，在分析未知组分样品时容易丢失样品信息，甚至无法完成分析任务。
另一种为在此基础上发展出的全二维色谱技术，它采用正交的两维色谱柱构成分离系统，通过阀切换技术，把第一维色谱柱分离出的所有组分都在线引入第二维色谱柱中进行再分离，得到的数据一般被处理为包含所有分离信息的三维图像或等高线图，或处理成不间断的一维模式，利于与质谱仪等检测器联机。与传统的中心切割技术相比，全二维液相色谱模式使第一维洗脱的产物全部进入第二维中继续分析，能得到样品全部组分的信息。同时避免了中心切割技术中收集一维洗脱产物再进样造成的样品污染与浪费，也缩短了分析时间，实现两种不同模式色谱同时分析。
目前全二维色谱模式主要有：全二维气相色谱(GC×GC)、全二维液相色谱(HPLC×HPLC)和全二维液相色谱毛细管电泳(HPLC×CE)等分离模式。由于全二维液相色谱(HPLC×HPLC)适于分析非挥发性组分或热不稳定物质，可根据不同的分离目的，采用尺寸排阻色谱(SEC)、离子交换色谱(IEC)、反相色谱(RP)、疏水作用色谱(HIC)、亲和色谱(AC)等色谱柱，构建二维液相色谱系统，在理论和应用领域方面具有广阔的应用发展空间。由于全二维液相色谱的构建涉及到流动相的变化，需综合考虑分析对象、柱系统、缓冲液、流速、阀切换的频率等多个因素间的匹配，流路的设计相对较为复杂，因此，有效的组合并不多。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种全二维毛细管液相色谱分离系统，通过全二维液相色谱阀柱间界面和接口技术，达到超强的分离能力。
为实现上述目的，本发明所提供的一种全二维毛细管液相色谱分离系统，其包括进样单元与分离单元，进样单元包括一个进样器与一个第一梯度泵，所述第一梯度泵的输出端连接所述进样器的输入端，所述分离单元包括一第一维色谱柱、一个两位十通阀、两根第二维色谱柱及一个第二梯度泵，所述第一维色谱柱的输入端连接所述进样器，输出端连接所述两位十通阀，二所述第二维色谱柱的两端分别与所述两位十通阀连接，所述第二梯度泵的输出端连接所述两位十通阀。
所述第一维色谱柱为离子交换色谱柱或尺寸排阻色谱柱中的一种，其柱长为0.5～20米，内径为75～320微米，填料粒度为20～150微米；所述第二维色谱柱为反相柱，其柱长为0.1～0.3米，内径为75～320微米，填料粒度为5～10微米。
所述第一维色谱柱为尺寸排阻色谱柱或疏水作用色谱柱或亲和色谱柱中的一种，柱长为0.2～5米，内径为75～320微米，填料粒度为10～90微米；所述第二维色谱柱为反相柱，柱长为0.1～0.3米，内径为75～320微米，填料粒度为5～10微米。
所述第一维色谱柱与所述两位十通阀之间连接一富集柱。
所述进样器与所述第一维色谱柱之间连接一流动转向阀。
由于采用了以上技术方案，使本发明具有以下优点：第一维使用长柱，可以使样量负载量增加，可以很好地满足第二维短柱分析的要求；第一维使用长柱，对于大分子分离复杂样品分离，使用大颗粒、大孔径填料时，柱压降不会很高(一般小于50巴)，并且可以获得较好的分离效果，提高了分离能力和分离选择性，而且色谱出峰时间适当延长了，色谱峰展宽，这些分离上的劣势，却可以很好地和第二维分离分析速度匹配，降低了第二维短柱的分离时间要求。
本发明适合于复杂体系组分的分离分析，特别是对蛋白组学、中药和植物提取液、代谢组学、环境等领域的分析提供了一种强有力的技术支持。
附图说明
图1为本发明处于第一种状态时的流路示意图
图2为本发明处于第二种状态(进样)时的流路示意图
图3是本发明的第一维色谱图
图4A～图4D是本发明的第二维色谱图
具体实施方式
如图1、图2所示，为本发明所提供的全二维毛细管液相色谱分离系统，其包括进样单元1与分离单元2，进样单元1包括一个自动进样器11、一个第一梯度泵12与一个流动转向阀13，其中自动进样器11中还包含一个六通阀14，导入第一维色谱流动相。六通阀14具有两种导通状态，如图1所示，为其采样或进样后又恢复采样状态，准备下一次进样。如图2所示，为六通阀14的进样状态。
分离单元2包括一第一维色谱柱21、一根组分富集柱22、一个两位十通阀23、两根第二维色谱柱24、25及一个第二梯度泵26。其中，第一维色谱柱21使用长柱，其长度在0.5～20米；第二维色谱柱24、25使用短柱，其长度0.1～0.3米，并优先选用整体柱。这是由于在蛋白组学等分离研究中主要涉及到大分子分离，需要选择大颗粒、大孔径填料，选择使用长柱柱压降不会很高，但是可以获得较好的分离效果，提高了分离能力和分离选择性。且使用长柱使色谱出峰时间延长，色谱峰展宽，可以很好地和第二维分离分析速度匹配，更好的完成全组分分离。两位十通阀23也具有两种导通状态，可采用手动或自动方式切换，将从第一维色谱柱21流出的组分分别导入两根第二维色谱柱24、25中的一根。
样品通过自动进样器11进样，通过流体转向阀13进入第一维色谱柱21中分离分析，第一维色谱流动相由梯度泵12驱动进入自动进样器11。通过第一维色谱柱21分离流出的组分，经过组分富集柱22富集后，由两位十通阀23连续地交替切换导入第二维的两根色谱柱24、25中进行第二维的分离，第二维色谱的流动相由梯度泵26驱动进入两位十通阀23。梯度泵12与梯度泵26均采用可根据流速自动调节或手动调节的二元梯度泵，以根据对实际需要分析选择是否梯度洗脱。
本发明的流路有两种状态，详细描述如下：
当本发明处于第一种状态时，如图1所示，自动进样器11中的六通阀14将样品导入第一维色谱柱21，第一维色谱流动相由梯度泵12驱动经流体转向阀13进入第一维色谱柱21，使样品分离。从第一维色谱柱21流出的组分通过组分富集柱22富集后进入两位十通阀23，此时两位十通阀23处于第一位状态，将从第一维色谱柱21流出的组分导入第二维色谱柱，同时第二维色谱流动相由梯度泵26驱动进入两位十通阀23。由二维色谱柱25对样品进行洗脱分离，并通过两位十通阀23将组分送入检测器3进行检测，再进入质谱仪4进行定性分析。另一个二维色谱柱24对一维柱21的洗脱样品进行上样、脱盐或进一步富集平衡柱子，上样后的废液导入废液池。
手动或自动切换两位十通阀23后，本发明处于第二种状态，如图2所示，第一维的流出组分通过组分富集柱22富集后进入两位十通阀23，此时两位十通阀23处于第二位状态，将从第一维色谱柱21流出的组分导入第二维色谱柱，同时第二维色谱流动相由梯度泵26驱动进入两位十通阀23。由二维色谱柱24对样品进行洗脱分离，并通过两位十通阀23将组分送入检测器3进行检测，再进入质谱仪4进行定性分析。另一个二维色谱柱25则对一维柱21的洗脱样品进行脱盐或进一步富集平衡柱子，并导入废液池。如此循环完成样品的全组分分离。通过匹配适合的一维色谱柱21和二维色谱柱24、25的类型和分离时间，恰当切换两位十通阀23，就能实现对复杂样品的高效分析。
本发明中的流体转向阀13起了流动转向增加仪器灵活性的作用，也可以不设置流体转向阀13，第一维液体流动相由梯度泵12驱动进入六通阀14后直接导入一维柱21进行分离，同样可实现本发明。连接在一维柱21的出口端与两位十通阀23入口端之间的组分富集柱22起了浓缩富集的作用，同样也可不设置。另外，也可以从一维色谱柱21的输出端27将洗脱液直接引入检测器3，用于检测一维色谱柱21。
综上所述，本发明具有分离、平衡、检测高度集成的特点，在二维色谱柱中的一根色谱柱分离的同时，另一根色谱柱采样、富集、平衡，实现对第一维色谱柱的全组分分离。
要最大限度地发挥全二维液相色谱分离系统分析复杂样品的潜力，就必须正确地选择色谱分离模式、柱系统及其匹配和优化分离条件。基于正交分离特性所要求的柱系统和规律，在多维系统中，考虑到选择性、分离能力、峰容量、样品负载量、生物兼容性和分离速度等因素，在全二维液相色谱平台的柱类型选择上，针对不同的分析对象及其结构组分的出峰规律，选择相应的匹配类型，一般搭配如下：
a)蛋白组学领域中大分子蛋白质和多肽的分离分析鉴定
第一维选择离子交换色谱(IEC)或尺寸排阻色谱(SEC)，柱长0.5～20米，内径75～320微米，填料粒度20～150微米，为第二维色谱柱提供足够的样品量和样品通道间隙；
第二维采用反相柱(RPLC)，柱长0.1～0.3米，内径75～320微米，填料粒度5～10微米；整体柱的柱压降小，柱制备和与阀连接方便，并且可以高流速分离，保证第二维的分析速度，避免分离效率的损失，因此优先选用整体柱。
第一维和第二维之间必要时，可以增加富集柱。
IEC/RP和SEC/RP模式提供两种不同的分离机理，满足正交的要求。同时，该类模式具有溶剂匹配、易与质谱在线联用对组分的定性分析、可以采用大进样量及方便实现快速分析等。
b)复杂体系如体液、中药、植物提取液、食品、微生物代谢物和环境样品等的分离分析鉴定
第一维选择尺寸排阻色谱柱(SEC)、疏水作用色谱柱(HIC)、亲和色谱柱(AC)。一般地，柱长在0.2～5米，内径在75～320微米，填料粒度为10～90微米，为第二维色谱柱提供足够的样品量和适当的通道间隙。
第二维采用反相柱(RPLC)，柱长在0.1～0.3米，内径在75～320微米，填料粒度为5～10微米，优先选用整体柱。
第一维和第二维之间必要时，可以增加富集柱。
正交的实现也可以通过流动相的改变实现，上述多维柱系统可以针对组分性质通过流动相的调节实现全二维分析。
在本发明的全二维毛细管液相色谱分离系统中，毛细管柱对流路死体积的要求严格，要求尽可能地减少死体积、减小峰展宽。一般采用适当内径的连接管路进行连接，将全二维高效液相色谱仪的死体积控制在不影响二维系统的分离能力的范围内。假定色谱柱长度L＝0.25米，理论塔板数N＝10,000，孔隙率ε＝0.7，k＝0。其指标如表1所示，一般选用0.05毫米连接管或0.10毫米的连接管。
表1各种直径色谱柱的连接管参数
| 色谱柱直径(毫米) | 各种内径的连接管允许长度(厘米) | ||
| 0.25毫米连接管 | 0.10毫米连接管 | 0.05毫米连接管 | |
| 1.0 | 0.65 | 25.4 | 408 |
| 0.30.1 | 0.0570.0065 | 2.20.25 | 364.1 |
本发明的全二维毛细管液相色谱分离系统还可与质谱仪联用，色谱-质谱联用即可实现正交，实现对样品的定性分析。质谱检测不仅有利于定性分析，而且与全二维毛细管液相色谱组成了三维分析系统，提高了全二维毛细管液相色谱分离系统的分离分析能力。在质谱或多级质谱(MS/MS)检测器前可以使用紫外检测，或二极管阵列(PDA)、蒸发光散射检测器(ELSD)等多种检测器，为质谱检测提供信息，可以保证质谱的定性分析高质量运行。
主要的连接方式有多维质谱(MS/MS)和飞行时间质谱(TOFMS)两种，即HPLC×HPLC-TOF-MS和HPLC×HPLC-MS/MS。针对不同的分析对象，根据其极性选用不同的质谱离子源(大气压化学电离APCI，电喷雾离子ESI，纳喷雾)。依据各类化合物的特征结构单元(如核苷中的共有核糖单元)，结合不同的质谱扫描模式，如母离子扫描、中性丢失、多反应监测等，消除复杂体系中基质和其它共存组分的干扰，提高信噪比，实现对目标化合物的多水平、高灵敏度、高选择性检测。
在连接质谱进行分析时，液相色谱的第二维分离流动相流速和质谱检测所需要的流速是匹配的，可以直接联机，不需要特殊的设计。
应用本发明进行分析之前，首先考察分析对象，确定色谱和质谱条件：即选定第一维离子交换色谱(IEC)或尺寸排阻色谱(SEC)的柱长、内径、填料粒度等，预分离，确定流动相流速、等度或梯度等条件；第二维反相柱(RPLC)的柱长、填充床长度、内径、填料粒度和孔径等，预分离，确定流动相条件，包括流动相组成、流速和等度或梯度洗脱条件。根据分析对象，确定质谱条件。
其次，考察全二维液相色谱的匹配条件。第二维色谱分析采用平行柱交替捕集分析形式作切换接口，要求两只色谱柱有相同的色谱性能，实验比较两只反相柱在相同条件下的运行情况及同一色谱柱多次运行的情况，考察柱重复性，消除两柱间的误差。设第二维色谱流速为v2(μL/min)下，第二维色谱的分析时间及柱平衡为t2(min)。第一维的色谱柱的死体积为v1(μL)，在t1(μL/min)流速下对应的死时间为v1/t1(min)，因此实验中将第一维的色谱柱前(v1/t1)+t2(min)的洗脱产物捕集在一个反相柱中，同时在(v1/t1)+t2(min)进行阀切换，之后每t2 min切换一次，由反相柱交替捕集分析一维洗脱产物。当系统处于位置1时(参见图1)，第一维的色谱柱的流出组分，进入第二维，一个二维柱25洗脱分析，并将组分带入检测器进行检测，流动相携带组分可以直接进入MS检测；另一个二维柱24从一维柱脱盐平衡柱子，直接导入废液池。切换两位十通阀，系统处于位置2时(参见图1)，第一维的流出组分，进入第二维，一个二维柱24洗脱分析，并将组分带入检测器进行检测，流动相携带组分可以直接进入MS检测；另一个二维柱25从一维柱脱盐平衡柱子，直接导入废液池。如此循环完成样品的全组分分析。为了和质谱仪联机，一般需要连续一维谱图，并实现了对复杂样品的高效分析。可以根据需要选择是否需要组分富集柱等。
下面以蛋白质分析为例，举例说明。
实施例1：分离猪心胰蛋白酶切混合样品
色谱和质谱条件：第一维选择离子交换色谱柱(IEC)(TOYOPEARL SP-650S，日本)，柱长200厘米，内径320微米，填料粒度20～50微米，流动相选用10mmol/L醋酸胺溶液，流速为2μL/min等度洗脱；第二维采用反相柱(RPLC)(ChrmatorexSMB-300A-C18，5微米)，柱长15厘米，填充床长度6厘米，内径320微米，填料粒度5微米，孔径300纳米；流动相选用乙腈/水(70/30，V/V)，流速为8μL/min等度洗脱；第一维和第二维的检测方式均采用可变波长紫外检测，选定检测波长210nm。十通切换接口采用EV750-102peek10通切换阀(Rheodyne公司)。所有流动相均经过超声仪超声除气。质谱仪采用安捷伦的LC-MSD TOF系统。
样品为猪心胰蛋白酶切混合样品，进样2μL。实验比较了两只反相柱在相同条件下的运行情况及同一色谱柱多次运行的情况，发现柱重复性良好，消除了两柱之间的误差。流速8μL/min下，第二维色谱地分析时间及柱平衡为2min。第一维的IEC色谱柱的死体积为140μL，在2μL/min流速下对应的死时间为70min，因此实验中将IEC前72min的洗脱产物捕集在一个反相柱中，同时在72min进行阀切换，之后2min切换一次，由反相柱交替捕集分析一维洗脱产物。如此循环进行阀切换完成样品的全组分分析，得到样品的定量信息。如图3所示，为本发明的第一维色谱图，图4A～图4D所示为本发明的第二维色谱图，实验结果表明，第一维色谱中没有出现的信号，可以在第二维色谱中清楚完整的表现出来，将第二维色谱与质谱仪联机，即可以得到样品的定性信息，能实现对复杂样品的高效分析。本发明的全二维毛细管液相色谱分离系统可以显著地增加色谱峰容量，特别适合于微量复杂样品的分离分析。
综上所述，本发明提供了一种全二维毛细管液相色谱分离系统，通过长柱全二维液相色谱阀柱间界面和接口技术的构建，并采用质谱分析，提高全二维液相色谱的选择性和分辨率，实现对复杂组分体系的难挥发化合物的分离分析。
Claims (6)
1、一种全二维毛细管液相色谱分离系统，其包括进样单元与分离单元，所述进样单元包括一个进样器与一个第一梯度泵，所述第一梯度泵的输出端连接所述进样器的输入端，其特征在于：
所述分离单元包括一第一维色谱柱、一个两位十通阀、两根第二维色谱柱及一个第二梯度泵，所述第一维色谱柱的输入端连接所述进样器，输出端连接所述两位十通阀，二所述第二维色谱柱的两端分别与所述两位十通阀连接，所述第二梯度泵的输出端连接所述两位十通阀。
2、如权利要求1所述的一种全二维毛细管液相色谱分离系统，其特征在于：
所述第一维色谱柱为离子交换色谱柱或尺寸排阻色谱柱中的一种，其柱长为0.5～20米，内径为75～320微米，填料粒度为20～150微米；
所述第二维色谱柱为反相柱，其柱长为0.1～0.3米，内径为75～320微米，填料粒度为5～10微米。
3、如权利要求1所述的一种全二维毛细管液相色谱分离系统，其特征在于：
所述第一维色谱柱为尺寸排阻色谱柱或疏水作用色谱柱或亲和色谱柱中的一种，柱长为0.2～5米，内径为75～320微米，填料粒度为10～90微米；
所述第二维色谱柱为反相柱，柱长为0.1～0.3米，内径为75～320微米，填料粒度为5～10微米。
4、如权利要求1或2或3所述的一种全二维毛细管液相色谱分离系统，其特征在于：所述第一维色谱柱与所述两位十通阀之间连接一富集柱。
5、如权利要求1或2或3所述的一种全二维毛细管液相色谱分离系统，其特征在于：所述进样器与所述第一维色谱柱之间连接一流动转向阀。
6、如权利要求4所述的一种全二维毛细管液相色谱分离系统，其特征在于：所述进样器与所述第一维色谱柱之间连接一流动转向阀。
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