CN111448448A - 通过尺寸排阻色谱法确定颗粒尺寸分布 - Google Patents
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Abstract
公开了一种用于表征包括颗粒的样本的方法和设备(100,200,300)。该方法包括使用第一颗粒表征技术对样本执行第一测量;以及使样本从第一颗粒表征技术流到颗粒分离装置;用颗粒分离装置分离样本;以及对分离的样本执行第二测量。设备(100,200,300)被配置为执行该方法,并且包括用于根据第一颗粒表征技术(104,105,106)执行测量的测量系统,以及用于分离包括颗粒的样本的颗粒分离装置(102)。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于确定颗粒特性的方法和设备。
背景技术
新型生物药物通常使用聚集分析进行分析。尺寸排阻色谱法(SEC)通常用于基于颗粒尺寸或质量分离样本。然而,从SEC柱输出的样本可能不是该样本的真实表示。较大的颗粒或颗粒聚集体被禁止通过SEC柱,并且因此在颗粒尺寸/质量分布分析中将丢失。为了纠正该问题,必须通过另一种技术(通常是分析超速离心(AUC))验证SEC测量。AUC是一项困难、昂贵且耗时的技术。
研究颗粒的聚集特性需要研究大范围的颗粒尺寸。先前,已经使用具有不同测量模态的不同仪器进行了多种分析,以便提供大范围的颗粒尺寸的覆盖。这可能是耗时且不便的。
发明内容
根据本发明的第一方面,提供了一种表征包含颗粒的样本的方法,该方法包括:使用第一颗粒表征技术对样本执行第一测量;使样本从第一颗粒表征技术流到颗粒分离装置;用颗粒分离装置分离样本;以及对分离的样本执行第二测量。
在用颗粒分离装置分离样本之前,用第一测量技术执行第一测量产生了要通过颗粒分离装置的实际样本的真实样本组成的表示。这可用于确定分离期间是否丢失了任何样本,例如,较大的颗粒是否被禁止通过颗粒分离装置。例如,可以将第一测量与第二测量和/或与附加测量进行比较,以确定是否丢失了样本的任何颗粒。例如,可以将由第一测量确定的颗粒尺寸或颗粒质量分布与由第二测量或附加测量确定的颗粒尺寸或颗粒质量分布进行比较。
通过确定样本的真实表示是否已经被颗粒分离装置分离,可以避免对昂贵的验证技术(诸如AUC)的需求。
第二测量可以由颗粒分离装置本身执行,例如,颗粒分离装置可以包括用于测量分离的样本的样本测量仪器。可替代地或另外地,第二测量可以由被配置为测量从颗粒分离装置输出的样本的单独仪器执行。
第二测量可以确定随时间推移变化的分离的样本的性质,例如提供分离的样本中的颗粒的颗粒特性随时间推移变化的指示。颗粒分离装置可基于颗粒特性使颗粒及时分离(例如,使具有不同尺寸或与吸附剂的不同程度吸附相互作用的颗粒具有不同的洗脱时间)。第二测量可以使用第一颗粒表征技术或替代的颗粒表征技术。第二测量可以使用用于第一测量的相同仪器。
使样本流入第一颗粒表征技术或从第一颗粒表征技术流出的参考应当理解为是指使样本流向可以执行根据第一颗粒表征技术的测量的位置或从该位置流出。
使用第一颗粒表征技术执行第一测量可以包括执行多个第一测量,所述多个第一测量中的每个第一测量使用相应的颗粒表征技术来执行。
颗粒分离装置可以是分馏装置。颗粒分离装置可包括色谱柱,例如尺寸排阻色谱柱。颗粒分离装置可以执行可用于将样本混合物分离为多于一个的不同种群的任何技术,诸如:
-尺寸排阻色谱法(例如,凝胶渗透色谱法或凝胶过滤色谱法);
-场流分馏及其相关联的变型,诸如非对称流场流分馏(AF4);
-其它液相色谱柱(分析型和制备型二者),包括:亲和力、离子交换、疏水作用、整体式和微柱阵列柱;
-流体动力学色谱法;
-确定性横向位移(DLD)装置;
-填充的珠床,诸如二氧化硅;以及
-过滤器,其包括使用一个或多个尺寸截止过滤器。
第二测量可以是或包括光度测量(photometry measurement),例如UV光度测量。
该方法可以进一步包括确定样本的颗粒特性分布,例如颗粒质量分布或颗粒尺寸分布。
在一些实施例中,该方法可以进一步包括使样本从分离器装置流回到第一颗粒表征技术。然后可以使用第一颗粒表征技术执行进一步的测量,从而确定是否丢失了任何颗粒。进一步的测量可以是对整个样本的整体测量,或者可以是对分离的样本的时间相关性测量。
一些实施例可包括在用颗粒分离装置分离样本之前和/或之后对样本执行附加测量。执行附加测量可以包括使用第一颗粒表征技术,例如通过使样本从颗粒分离装置流到如上所述的第一测量技术,对样本执行附加测量。可替代地或另外地,对样本执行附加测量可以包括使用与第一颗粒表征技术不同的第二颗粒表征技术对样本执行附加测量。
该方法可以进一步包括比较第一测量和第二测量以确定样本的所有颗粒是否已经通过分离装置。在实施例中,比较第一测量和第二测量包括确定第二测量是否与第一测量匹配。如果第二测量与第一测量匹配,则确定样本的所有颗粒都已通过分离装置;并且如果第二测量与第一测量不匹配,则确定不是样本的所有颗粒都已经通过分离装置。
在一些实施例中,该方法可以进一步包括比较第一测量和附加测量以确定样本的所有颗粒是否已经通过分离装置。具体地,将第一测量和附加测量进行比较可以包括:确定附加测量是否与第一测量匹配。如果附加测量确实与第一测量匹配,则该方法可以包括确定样本的所有颗粒都已经通过分离装置。如果附加测量与第一测量不匹配,则该方法可以包括确定不是样本的所有颗粒都已经通过分离装置。
在一些实施例中,确定第二测量和/或附加测量是否与第一测量匹配包括确定从第二测量和/或附加测量中提取的颗粒尺寸是否与从第一测量提取的颗粒尺寸相匹配。颗粒尺寸可以是平均颗粒尺寸。颗粒尺寸可以是平均流体动力学半径。
可替代地或另外地,确定第二测量和/或附加测量是否与第一测量匹配可以包括确定从第二测量和/或附加测量中提取的颗粒浓度是否与从第一测量提取的颗粒浓度匹配。在另一个实施例中,确定第二测量和/或附加测量是否与第一测量匹配可以包括确定从第二测量和/或附加测量中提取的颗粒尺寸分布是否与从第一测量中提取的颗粒尺寸分布匹配。
提取颗粒尺寸分布可以包括执行非负最小二乘(NNLS)拟合。
在一些实施例中,使样本从第一颗粒表征技术流到颗粒分离装置可以包括操作一个阀(多个阀)以将样本从第一颗粒表征技术引导到颗粒分离装置。例如,使样本从第一颗粒表征技术流到颗粒分离装置可以包括操作阀以将第一颗粒表征技术的输出连接到颗粒分离装置的输入端。该阀可以是罗丹尼(Rheodyne)开关阀。
在其中样本从颗粒分离装置流回到第一颗粒表征技术的实施例中,使样本从颗粒分离装置流向第一颗粒表征技术可以包括操作阀以将样本从颗粒分离装置引导至第一颗粒表征技术,并且可以包括操作阀以将颗粒分离装置的输出端连接到第一颗粒表征技术的输入。
在一些实施例中,第一颗粒表征和/或第二颗粒表征技术是整体颗粒表征技术。颗粒表征技术可以选自包括如下的组:UV光谱法、动态光散射、静态光散射、泰勒分散分析以及UV光度法。
在颗粒表征技术为或包含泰勒分散分析(TDA)的情况下,颗粒表征测量的输出为或包含浓度分布(泰勒图(Taylorgram))。
确定第二测量和/或附加测量是否与第一测量匹配可以包括用一个或多个参数模型函数拟合泰勒图以提取颗粒尺寸。该一个或多个参数模型可以是或包括时间相关的高斯函数。
可替代地或另外地,确定第二测量和/或附加测量是否与第一测量匹配可以包括用一个或多个参数模型函数执行对泰勒图的NNLS拟合以提取颗粒尺寸分布。该一个或多个参数模型可以是或包括时间相关的高斯函数。
该方法可以包括将一个或多个参数模型函数拟合到来自第一测量的结果和/或来自第二测量的结果。参数模型函数可以包括时间相关的高斯函数。
该方法可以包括对以下类别的样本比例执行定量分析:
i)单体,其与所关注颗粒的相对分子量的大小对应;
ii)具有比单体更低的尺寸或分子量的颗粒(该类别可称为LMW);
iii)单体的低聚物,或具有比单体更大的尺寸或分子量,高至但不包括从第二测量中排除的颗粒尺寸或分子量的颗粒(该类别可称为HMW或聚集体);以及
iv)大的聚集体,其包括足够大以至于从第二测量中排除的颗粒(该类别可以称为VHMW)。
根据本发明的第二方面,提供了一种颗粒表征平台,其包括:测量系统,用于根据第一颗粒表征技术执行测量;以及颗粒分离装置,用于分离包含颗粒的样本;其中,颗粒表征平台被配置为执行第一方面的任何实施例中的任一项的方法。
在一些实施例中,颗粒分离装置可包括色谱柱,例如尺寸排阻色谱柱。
在一些实施例中,测量系统可以进一步被配置为根据第二颗粒表征技术来执行测量。
颗粒表征平台可以被配置为使样本流到测量系统以执行第一测量,然后流到颗粒分离装置以分离样本,并且然后流回到测量系统以执行第二测量。
测量系统可以是第一测量系统,并且颗粒表征仪器可以包括第二测量系统。颗粒表征平台可以被配置为使样本流到第一测量系统以执行第一测量,然后流到颗粒分离装置以分离样本,并且然后流到第二测量系统以执行第二测量。
第一测量可以包括UV光度法和静态光散射。第二测量可以包括UV光度法和静态光散射。
仪器可以被配置为提供以下类别中样本的定量分析:
i)单体,其与所关注颗粒的相对分子量的大小对应;
ii)具有比单体更低的尺寸或分子量的颗粒(该类别可称为LMW);
iii)单体的低聚物,或具有比单体更大的尺寸或分子量,高至但不包括从第二测量中排除的颗粒尺寸或分子量的颗粒(该类别可称为HMW或聚集体);以及
iv)大的聚集体,其包括足够大以至于从第二测量中排除的颗粒(该类别可以称为VHMW)。
附图说明
下面通过示例并参考附图进一步详细描述本发明,在附图中:
图1示出针对许多测量技术适用的颗粒尺寸范围;
图2是颗粒表征平台的示意表示;
图3是替代颗粒表征平台的示意表示;
图4a和图4b示出在另一替代颗粒表征平台中的开关阀的操作;
图5示出典型样本的颗粒尺寸分布;
图6示出泰勒分散测量;
图7是用于将SEC与泰勒分散分析结合的颗粒表征平台的示意表示;
图8a和图8b分别示出对于第一测试样本在颗粒分离之前和之后获得的模拟泰勒分散测量;
图9a和图9b分别示出对于第二测试样本在颗粒分离之前和之后获得的模拟泰勒分散测量;
图10a和图10b分别示出对于第三测试样本在颗粒分离之前和之后获得的模拟泰勒分散测量;
图11a和图11b分别示出从图8a和图8b的模拟数据获得的颗粒尺寸分布;
图12a和图12b分别示出从图9a和图9b的模拟数据获得的颗粒尺寸分布;
图13a和图13b分别示出从图10a和图10b的模拟数据获得的颗粒尺寸分布;
图14是根据实施例的平台的示意表示;以及
图15是由第一测量和第二测量产生的组合测量的示例。
具体实施方式
聚集研究需要考虑可能非常小的单体片段和聚集的颗粒(包括非常大的聚集颗粒)二者。蛋白质单体在直径上可能只有几纳米,而蛋白质片段甚至更小。聚集体可形成可见的颗粒,该颗粒可大到100微米(甚至更大)。如图1中所示,SEC-HPLC(尺寸排阻/高效液相色谱法)可用于研究聚集研究的范围较小端的颗粒,但还需要替代测量技术来研究较大的聚集体,诸如微流数字成像或光散射(动态或静态)。
因此,用于调查聚集的先前工作流可包括多种仪器,将样本的不同部分提供给执行一系列不同测量的不同仪器。例如,SEC-HPLC可用于研究蛋白质片段、单体和蛋白质寡聚物。诸如DLS的光散射技术可用于扩展所研究颗粒的尺寸,以包括更大的颗粒。成像技术可用于研究非常大的颗粒。
以该方式使用多种测量技术非常耗时。必须为每种仪器分别进行样本制备,并且每次测量的累积运行时间可能很长,从而限制了该类研究的生产量。另外,通常必须手动处理、组合和综合来自不同测量技术的结果,以便提供聚集研究的结果。对样本的不同部分执行不同类型的分析,这会降低一致性并消耗相对大量的样本。本公开的实施例可以解决这些问题中的至少一些问题。
图2示出根据本公开的颗粒表征平台100的示意表示。平台100包括:多个第一测量系统101,每个第一测量系统被配置为执行第一颗粒表征技术;以及颗粒分离装置102。连接件(例如管道)允许样本在多个第一测量系统101中的每个第一测量系统之间流动,并且然后流至颗粒分离装置102。
在所示的示例中,多个第一测量系统101包括:动态光散射(DLS)系统104,用于对样本执行DLS测量;泰勒分散分析(TDA)系统105,用于对样本进行TDA测量;以及紫外(UV)光度计106,用于对样本执行UV光谱测量(例如,在一个或多个波长下的UV吸收)。在一些实施例中,可以存在单个第一测量系统(例如,上述那些之一),而不是多个不同的测量系统。
在使用中,样本从输入端103流到第一测量系统,在该示例中,流到DLS系统104。样本可以通过泵(未在图2中示出)泵送到输入端103。泵可提供足够的压力以使样本完全绕着平台100流动。DLS系统104对样本执行DLS测量。可以从DLS测量中确定关于颗粒尺寸分布以及因此关于样本中颗粒的任何聚集的信息。
然后将样本流入TDA系统105,该TDA系统105对样本执行TDA测量。可以从TDA测量中确定关于以下至少一项的信息:颗粒尺寸、扩散特性、不同组分的相对浓度和聚集(特别是样本中任何较大的聚集体)。
然后将样本流入UV光度计106,该UV光度计106在例如280nm处对样本执行UV光度测量。例如,关于样本的总颗粒/蛋白质浓度的信息可以从UV测量中确定。
在UV测量之后,已经由第一测量系统101测量的整个样本流入颗粒分离装置102。颗粒分离装置102基于诸如颗粒尺寸的颗粒特性分离样本。例如,较大的颗粒能够以与较小的颗粒不同的速率(例如更快)通过颗粒分离装置102,并且因此颗粒从分离装置102洗脱的时间可以由其尺寸确定。颗粒分离装置102进一步包括样本测量仪器,诸如UV光度计,其提供了洗脱的颗粒浓度随时间推移变化的指示。据此,可以确定样本中不同颗粒尺寸的相对比例,例如识别样本中单体、二聚体、三聚体和较大聚集体的量(浓度与浓度-时间曲线的每个峰的面积对应,并且每个峰的洗脱时间与颗粒尺寸对应)。
在所示的示例中,颗粒分离装置102包括尺寸排阻色谱(SEC)柱。样本中的某些颗粒可能太大而根本无法通过SEC色谱柱。因此,对分离的样本执行的聚集测量(如传统系统一样,在洗脱后)可能并不指示存在较大的聚集体,该聚集体可能已经被SEC色谱柱捕获。
然而,在本发明中,来自颗粒分离装置102(例如SEC仪器)的测量不是孤立进行的。从一个或多个第一测量系统101获取的第一测量提供了有关与进料到颗粒分离装置102中的样本完全相同的样本的颗粒分布的信息(并且以最小的时间延迟(例如少于5分钟延迟)顺序执行测量)。没有通过颗粒分离装置102的任何聚集体可以在第一测量中被识别,但是在被分离的样本的测量中将不被识别。因此,通过将第一测量与对分离的样本的测量进行比较,可以确定样本的任何组分是否已经丢失或保留,从而允许真实的样本组成的识别。
在所示的示例中,在通过颗粒分离装置102之后,样本流到可选的附加测量系统107。附加测量系统107对样本执行附加测量。然后,可以将附加测量与一个或多个第一测量进行比较,以进一步确认全部样本是否已通过颗粒分离装置102。特别地,附加测量系统107可以使用与一个(或多个)第一测量系统101相同的颗粒表征技术,从而允许将附加测量与匹配的第一测量进行直接比较。例如,附加测量系统107可以是UV光度计,与UV光度计106相似(相同配置)。UV光度计可以提供样本中总蛋白质浓度的指示。特别是一些蛋白质(或其聚集体)可能太大而无法通过颗粒分离装置102,并且因此与第一UV光度测量相比时,附加UV光度测量能够快速确定由于颗粒分离装置102引起的蛋白质的损失(或在测量平台100中的保留)。
在执行附加测量之后,样本流到平台出口108,在该处可以将其收集或处置。
在图2中所示的平台100中,附加测量系统107是与第一测量系统101分离的测量系统。然而,在替代实施例中,附加测量可以由第一测量系统101中的一个第一测量系统执行。图3示出此类平台200的此类示例。
平台200包括第一测量系统201和颗粒分离装置202,类似于上面关于平台100所述的对应特征。样本从平台入口203流过串联的每个第一测量系统204-206,每个第一测量系统都执行第一测量,并且然后流到颗粒分离装置202。与平台100相比,在平台200中,样本从颗粒分离装置流回多个第一测量系统201中的一个(或多个)第一测量系统。在该示例中,样本流回UV光度计206,但是它可以流回测量系统的任何组合。UV光度计206对分离的样本执行附加测量,并且然后样本流到平台出口208。可以将由UV光度计206执行的第一测量与由UV光度计206执行的附加测量直接进行比较以确定样本中是否丢失了任何颗粒或颗粒聚集体。
样本通过平台100、200的流动可以由阀控制。例如,在测量期间,至少一个阀可用于将样本保持在平台100、200的特定系统或装置中;并在已经执行相应的测量时释放样本。该至少一个阀可以手动或自动操作。
图4a和图4b示出平台300,该平台300包括罗丹尼开关阀303,该开关阀303控制样本通过平台300的流动。图4a示出处于第一配置的开关阀,而图4b示出处于第二配置的开关阀。
开关阀最初位于第一配置中。样本通过注射器301注入平台,并通过泵302泵送至平台周围。样本从注射器301流过管道,流向开关阀303的连接件1,连接件1在第一配置中连接至连接件6。样本从连接件6流到第一测量系统304、305。在所示示例中,第一测量仪器304、305可以包括UV光度计304和光散射系统305,或UV光度计304和泰勒分散分析系统305(包括毛细管环)。光散射系统305可以在样本通过光散射系统305时对样本执行动态或静态光散射测量。类似于上面关于平台100所描述的那些,第一测量系统304、305对样本执行第一测量。
然后,样本流到开关阀303的连接件3,该连接件3在第一配置中连接至连接件2,并且然后流到颗粒分离装置306中。如上面关于平台100所述,颗粒分离装置306(其可以是SEC仪器)将样本分离并测量。
在样本从颗粒分离装置306洗脱之前,开关阀303移入图4b中所示的其第二配置中。样本从颗粒分离装置306流到开关阀303的连接件5,该连接件5现在在第二配置中连接到连接件6。该连接件将样本引导回到第一测量系统304、305,该第一测量系统304、305对样本执行附加测量。如上所述,这些附加测量可用于确定是否已经从样本中损失了较大的颗粒。样本从第一测量系统304、304流到开关阀303的连接件3,并且然后从那里经由开关阀303的连接件4流到平台出口307。
在上述示例中,第一测量系统包括两个或三个不同的系统。在替代实施例中,可以使用任何数量的第一测量系统,特别是可以仅使用一个第一测量系统。因此,在其中对第一测量系统执行附加测量的实施例中,平台可仅包括第一测量系统和颗粒分离装置,以及引导样本流所必需的管道和阀。类似地,可以通过任何数量的附加测量系统来执行任何数量的附加测量,该附加测量系统可以与平台的第一测量系统相同或不同。
然而,有利地,诸如在平台100、200中使用多个第一测量系统可以提供更宽的总体颗粒特性测量窗口。图5示出在三个量级的颗粒尺寸上扩展的典型样本的颗粒尺寸分布400。分布400上方的条形表示上述颗粒表征技术可以在其上进行测量的颗粒尺寸窗口。DLS对大颗粒尺寸范围内的颗粒敏感,而SEC和TDA仅限于较小的颗粒尺寸,而280nm处的UV光度法则限于较大的颗粒尺寸。上面针对平台100、200描述的颗粒表征技术的组合因此可以提供关于颗粒尺寸的补充数据,从而允许确定整个颗粒尺寸分布。
分布400包括不同的峰401、402和403,分别表示样本中的单体、二聚体和较大的聚集体。聚集体峰403中的一些聚集体在直径上大于200nm。这大于典型的玻璃料极限,该极限限制了可以进入SEC柱的最大颗粒尺寸(多孔玻璃料通常用于限制进入SEC柱的最大颗粒尺寸,从而定义了玻璃料极限)。因此,该样本中最大的聚集体可能无法通过颗粒分离装置102、202、302。在仅使用SEC测量的传统系统中,可能无法识别出这些较大的聚集体。然而,使用上述平台100、200、300,可以通过第一测量来识别较大的聚集体,并且因此可以检测到由于颗粒分离装置引起的任何颗粒损失。
用于第一测量和附加测量的颗粒表征技术可以是或包括TDA测量。
泰勒分散是剪切流用于增强样本的有效扩散率的过程。毛细管中的层流会导致流速随径向位置而变化。在毛细管壁附近,流动基本上是静止的,而在毛细管的中心处,流速最大。这导致相邻薄片的剪切,该剪切在样本沿毛细管行进时起到增强样本分散的作用。
在典型的TDA测量中,沿毛细管在固定窗口位置处放置的一个或多个检测器(响应于样本的种类)用于检测流过该检测器窗口或每个检测器窗口的样本的每个横截面中的样本浓度(通常通过光学吸收度测量)。该检测器或每个检测器的输出是时间分辨的浓度分布(泰勒图)。对于沿毛细管到测量窗口的足够长的行进持续时间,使得样本完全分散,泰勒图轮廓近似为高斯分布,其宽度(σ)通过如下等式与流体动力学半径(Rh)成比例
其中,kB是玻尔兹曼常数,T是温度,η是缓冲溶液的粘度,r是毛细管的半径,并且τ是样本在毛细管中(大约是高斯中心)的停留时间。
图6示出沿毛细管在两个单独的测量窗口A和B上获得的泰勒图示例,其中,第二窗口B的停留时间(τ2)大于第一窗口A的停留时间(τ1)。如图6中所示,由于随时间推移沿着毛细管的进一步分散,在窗口B处获得的泰勒图的宽度(σ2)大于在窗口A处获得的泰勒图的宽度(σ1)。在该情况下,Rh通过以下等式与两个高斯的宽度σ1、σ2和停留时间τ1、τ2相关:
众所周知,上述两窗口分析可解决单窗口分析中源自非理想初始样本轮廓(t=0时)的缺陷。
在样本中存在多于一个的种类或种群的情况下,在给定检测器窗口获得的泰勒图包含存在的每个种类的浓度分布的叠加。
在传统的TDA中,例如在分离前,每个种类的组成组分各自具有相同的停留时间。可以通过拟合单个高斯来确定获得的泰勒图的平均Rh。然而,由于多种多样可能的解决方案,这可能是不精确的,特别是在每个组成分布的宽度和幅度相差达到泰勒图不再很好地近似于高斯的程度的情况下。确定泰勒图的平均Rh的一种更稳健的方法是分析分布的矩,这实质上涉及通过计算分布的第二矩和第一矩(经由积分)来确定泰勒图的宽度和中心。
泰勒图的零矩d(t)是面积积分,面积=∫d(t).dt,并且得出总浓度。第一矩除以面积得出平均停留时间,
第二矩除以面积得出平均方差,
提取与每个单独的种类对应的分布通常涉及将获得的泰勒图分解为与每个种类对应的组成组分之和,例如通过拟合多个高斯函数,针对包含泰勒图的每个组分种类提取σ(并且因此针对每个种类提取Rh)。然而,在传统的TDA中,当每个种类的组成组分各自享有相同的停留时间时,由于多种多样的可能解决方案,例如分离前多组分分析也可能不精确。例如,通常很难区分单体和二聚体峰,其中Rh值可能相差仅几nm。在样本已经通过颗粒分离装置102、202之后,即在分离之后,可以通过执行TDA来减少该问题。
对于按尺寸分馏颗粒的颗粒分离装置,在样本已经通过颗粒分离装置102、202之后,由于洗脱时间随Rh的变化,每种不同尺寸的样本组分的停留时间将不相同。在该情况下,每个种类/组分的组成峰可以完全或至少部分地分辨。因此,在颗粒分离装置之后执行TDA可以显著地提高提取每个种类可靠的Rh值的能力。
图7示出根据本发明的实施例的颗粒表征平台400的示意表示。平台400包括颗粒分离装置402、位于颗粒分离装置402上游的第一TDA测量系统405以及位于颗粒分离装置402下游的第二TDA测量系统405'。可以提供另外的测量系统,诸如分光光度计或光度计(例如UV分光光度计或光度计),例如用于在离开颗粒分离装置402之后立即测量种类浓度(例如以执行传统SEC测量)。
第一TDA测量系统405包括毛细管405a、第一检测器窗口A和第二检测器窗口B,并且第二TDA测量系统405'包括毛细管405a'、第一检测器窗口A'和第二检测器窗口B'。在使用中,样本从输入端403流到第一TDA测量系统405,在该处执行第一分离前TDA测量。然后,样本流至颗粒分离装置402,以基于诸如颗粒尺寸的颗粒特性分离样本。在通过颗粒分离装置402之后,样本流到第二TDA测量系统405'以执行第二分离后TDA测量。
尽管在图7中示为单独的测量系统,但是第一TDA测量系统405和第二TDA测量系统405'可以共享相同的检测器。例如,毛细管405a可以通过第一TDA测量系统405的检测器窗口A和B被反馈。应当理解,如图2和图3中所示,其它测量系统可以被包括在颗粒分离装置402的上游和下游。
在下文中,模拟了各种样本混合物的分离前和分离后的泰勒图,以验证所提出的方法。在模拟中,假定颗粒分离装置402是SEC柱,并且假定每个种类的泰勒图呈高斯分布。在该示例中,检测窗口A和B以及A’和B’各自通过相应的720秒的保留时间的差而分离。假定相对SEC柱保留时间(或洗脱时间)t通过t=a+bRh 3与Rh 3(并且因此与分子量)相关,其中,a任意设置为2703,并且b任意设置为-2.1(可以通过实验,使用该函数或一些其它代表性函数来确定与实际测量设置的经验匹配)。模拟的泰勒图表示在每个检测器窗口A、B、A'、B'处执行的吸光度测量。
图8a示出在第一TDA测量系统405的窗口A和B处针对包含具有平均颗粒尺寸为3.8±0.2nm的单体牛血清白蛋白(BSA)的测试样本1获得的SEC前泰勒图。图8b示出在第二TDA测量系统405'的窗口A'和B'处获得的对应的SEC后泰勒图。由于样本中只有一个种类,因此SEC前和SEC后的泰勒图二者都表现出单一分布。
图9a和图9b分别示出测试样本2的SEC前和SEC后的泰勒图,该测试样本2包含以80:15:5的相对比例的BSA(3.8±0.2nm)和尺寸为5.4nm和10nm的洗脱聚集体的混合物。在分离前,每个检测窗口中只分辨出单峰(见图8a)。如图9b中所示,在分离后的泰勒图A'和B'中,分辨了与一个或多个附加聚集体对应的较短保留时间处的附加峰。
图10a和图10b示出测试样本3的模拟结果,该测试样本3包含以80:15:5的相同相对比例的BSA(3.8±0.2nm)和尺寸为5.4nm和60nm的洗脱聚集体的混合物。在该情况下,SEC柱排除了60nm颗粒,并且未观察到较短的保留时间峰。BSA和5.4nm聚集体的单独分布被叠加,并且在SEC后泰勒图A’和B’中没有分辨出。
表1
SEC后计算的矩(等式3和4)的相对变化给出了平均Rh,该平均Rh可以与SEC前的平均Rh值进行比较(注意,在SEC后,矩方法无法在单个窗口上运行,因为标准偏差/第二矩会由于分离而错误并被高估。然而,两个窗口处的值之间的差与分离无关)。
上面的表1示出Rh的加权平均值和泰勒图下的面积(与颗粒的浓度成比例),该Rh的加权平均值和泰勒图下的面积用等式2-4使用矩分析从每个测试样本的颗粒分离前和分离后的模拟得到。如图所示,测试样本1和2的SEC前和SEC后Rh加权平均值非常匹配。这提供分离期间没有颗粒丢失的指示。SEC前和SEC后面积的比较提供了证实该点的另外的或替代的指标。相比之下,包含更大的60nm颗粒的测试样本3的SEC前和SEC后的Rh加权平均值以及面积不匹配。这提供了在分离期间颗粒已经丢失的指示。
另外或可替代地(例如,通过使用矩)确定平均Rh值或通过拟合多个高斯确定每个组成成分的Rh值,泰勒图的非负最小二乘(NNLS)分析可用于提取样本中存在的该种类或每个种类的颗粒尺寸分布。有利地,颗粒分离后泰勒图的NNLS分析也可能产生更可分辨的颗粒分布,如下所示。
NNLS方法是一种拟合方法,该拟合方法旨在找到设置为以下等式的非负解:
F*A=d (5)
其中,A是组成矩阵F的任意函数f的系数(或比例)的阵列。矩阵相乘的结果是合成分布d。因此,如果F是m×n矩阵(即,存在长度为m的变量的n个函数),则A是n×1阵列,而d是m×1阵列。通常,无法找到等式5的精确解,因此在A的元素大于或等于零(即非负)的条件下,通过最小化残差范数||F*A-d||2来获得最优解。
在该情况下,d是时间相关的泰勒图。对于其中样本完全分散的脉冲泰勒图,函数F包括以下形式的时间相关的高斯:
其中,t是测量时间,τ是停留时间,并且σ是确定样本的Rh的宽度(例如根据等式1或2)。A是每个时间相关的高斯系数的阵列,该阵列给出函数F对泰勒图d的贡献。这样,A被称为颗粒尺寸分布。以下是两分量的泰勒图的示例:
F的每一列都是泰勒图的每个分量(即样本中存在的每个种类)的时间相关的高斯。可以通过将左侧的两边乘以F的倒数来求解A的等式5(或7),
A=F-1*d (8)
在传统的TDA测量的分离前NNLS分析中,假定所有函数F具有相同的停留时间,例如τ1,τ2=τ。然而,对于分离后分析,假定每个函数F具有不同的停留时间,例如τ1≠τ2。
在NNLS拟合过程中,Rh横跨值的范围进行扫描,以确定等式5或7到实验数据的最优拟合。在特定停留时间扫描的Rh值的数量和范围可以由用户定义,但可以先验估计。在诸如图7中所示的理想实验设置中,泰勒图宽度和停留时间之间存在已知的先验相关性,其可用于限制在特定停留时间扫描Rh的范围。例如,在SEC中,分子量和停留时间之间存在相关性。该相关性可以是已知的,或者可以从初始校准步骤中确定,由此分析具有已知Rh值的样本范围以确定其停留时间。在以下结果中,假定相关性t=a+bRh 3(如用于初始模拟)。
图11a和图11b分别示出使用NNLS方法从图8a和图8b的泰勒图中提取的SEC前和SEC后颗粒尺寸分布(对于测试样本1)。窗口A’和B’处的泰勒图产生相同的结果(未示出)。SEC前和SEC后的颗粒分布均在约3.8nm处表现出峰,与BSA尺寸高度吻合。图12a和图12b分别示出从图9a和图9b的泰勒图中提取的对应的SEC前和SEC后颗粒尺寸分布(对于测试样本2)。如图12a中可见,在SEC前颗粒分布中,约10nm处的峰被分辨,但是BSA(3.8nm)和5.4nm颗粒的分布无法彼此区分。相比之下,在SEC后颗粒分布中,BSA(3.8nm)和5.4nm颗粒的分离峰被清晰分辨。
图13a和图13b分别示出从图10a和图10b的泰勒图中提取的SEC前和SEC后颗粒尺寸分布(对于测试样本3)。在SEC前颗粒分布中(图13a),分辨出约60nm处的峰,但BSA(3.8nm)和5.4nm峰无法彼此区分。在SEC后的颗粒分布中,与测试样本2的结果一样,BSA(3.8nm)和5.4nm颗粒的峰被清晰分辨,但是在该情况下,由于在SEC柱中排除了60nm颗粒,因此未在60nm处观察到峰。
上述NNLS方法依赖于分离后停留时间与组分的Rh之间的相关性的先验知识。如上所述,这可以通过参考测量来校准。此外,由于柱的几何形状,在特定停留时间下的期望泰勒图宽度可能与传统分离前TDA所期望的泰勒图宽度不同。还可能需要从参考测量中确定该效果。相比之下,通过拟合多个高斯来分析多分量分离后泰勒图相对简单,并且不需要泰勒图宽度和停留时间之间的相关性的先验知识。
可替代地或另外地,可以调节停留时间以匹配在两个连续的测量窗口(例如,窗口A’和B’)之间观察到的分散。
以上示例说明了该方法的优点。分离前和分离后的TDA提供正交结果,该正交结果可用于验证或增强SEC测量的结果。尽管以上示例分析和比较了SEC前和SEC后的TDA测量,但是应该理解,这仅仅是将颗粒分离之前执行的第一测量与颗粒分离之后执行的第二测量进行比较的一个示例。例如,可以使用其它测量技术(诸如UV光度法和DLS)获得类似的结果。特别地,以上NNLS拟合方法也可以应用于颗粒分离之前和之后执行的DLS测量。
在一些实施例中,第一颗粒表征技术可以包括UV光谱法和静态光散射,颗粒分离装置可以包括色谱柱(例如SEC柱),并且第二颗粒表征技术可以包括UV光谱法和静态光散射。
例如,Omnisec Resolve或类似仪器可用于提供第一表征技术和第二表征技术。Omnisec Resolve中的传感模态包括下面列出的四种检测器类型。原则上,可以省略折射率检测器和粘度计中的一个或二者。
检测器1
检测器:光散射
测量原理:90°散射角的直角光散射(RALS),7°散射角的低角光散射(LALS)
光源:640nm激光
检测器2
检测器:示差折射率(Differential refractive index)
测量原理:挠度
细胞体积:12μL
检测器3
检测器:粘度计
测量原理:具有自平衡机制和用户可交换毛细管的四毛细管惠斯通(Wheatstone)电桥
检测器4
检测器:基于二极管阵列的UV/V是光谱仪
波长:190-900nm
波长数:1024
波长精度:<1nm
波长分辨率:0.6nm
四种不同的检测器类型可以用于执行多种不同的测量类型。
测量类型1
测量类型:绝对分子量
测量范围:200->107g/mol
最小可量化质量:THF中100ng分子量为100kDa的聚苯乙烯测量原理:光散射(LALS或RALS)
测量类型2
测量类型:特征粘度
最小可量化质量:THF中1μg分子量为100kDa的聚苯乙烯
测量原理:四毛细管惠斯通电桥
测量类型3
测量类型:浓度
最小可量化质量:THF中100ng分子量为100kDa的聚苯乙烯
测量原理:示差折射率检测
颗粒分离装置可包括具有色谱柱的Omnisec Reveal。这提供了使用色谱法分离颗粒的自动化HPLC系统。在其它实施例中,任何色谱系统可以用于颗粒分离(例如,具有大于40MPa的压力的液相色谱系统)。
可以将包括单独的SEC分析、光散射分析和光学显微镜分析的混合工作流程与自动化系统进行比较,在该自动化系统中,在同一样本流过SEC柱之前和之后,对同一样本进行光散射和UV-可见光光谱测量(例如光吸收测量)。
对于实施例,执行测量和综合结果所花费的时间可以比典型的混合工作流程快约5倍。
可以确定多个类别中的每个类别中的颗粒的定量比。类别可以包括:
LMW/片段(具有比单体更小的尺寸或分子量的颗粒),
单体,
HMW/聚集体(具有比单体更大的尺寸或分子量,诸如二聚体、三聚体和其它低聚物),以及
VHMW(非常高分子量的颗粒或具有非常大尺寸的颗粒)。
定量比率可以包括基于颗粒质量的浓度(例如,基于吸收比率)。
VHMW的量可以根据分离之前和之后的总吸收差来推断(例如根据分离前的吸收峰下的面积减去通过分离装置/SEC柱洗脱后的吸收峰下的总面积)。
LMW、单体和HMW的比率可以从光散射(当分离的样本通过光散射检测器时提供有关分离样本的每个组分的颗粒尺寸或分子量的信息)和UV光度测量的组合来推断,该组合提供每个组分浓度的定量测量。例如,洗脱时间和光散射测量的组合可以用于将洗脱的UV光度测量中的每个峰分类为LMW、单体或HMW。分离之前和之后总浓度之差可用于提供VHMW浓度。
简单地说,UV光度测量可用于推断上述类别中每个类别的各种比率。如果已知单体的洗脱时间,则可以将早于其洗脱的峰分类为LMW,并将其后的峰分类为HMW(在预期洗脱时间处的峰为单体)。任何“缺失”浓度(分离之前存在但在分离之前不存在)可归因于VHMW。
无需任何其它测量模态(除分离之前和之后的UV光度法之外),就可以推断出有关VHMW的一些信息。例如,VHMW颗粒的尺寸必须足够大以不被允许进入或不通过分离装置。这可以允许推断出最小颗粒尺寸(例如基于柱输入处的玻璃料尺寸)。
然而,可能希望能够获得有关样本的VHMW组分特性的更多信息,诸如该组分的平均颗粒尺寸(例如Dv50)、多分散性或颗粒尺寸分布。在分离之前和之后执行的光散射测量(例如静态光散射或动态光散射)是可以实现的一种方法。可以将分离之前的散射光的特性与分离之后的散射光的特性进行比较。关于LMW、单体和HMW组分的信息可以从第二测量中推断(分离之后)。一旦已知LMW、单体和HMW组分的散射贡献,就可以推断出VHMW组分的散射贡献,并且该散射贡献用于表征VHMW组分(例如,提供VHMW组分的平均颗粒尺寸、多分散性,或颗粒尺寸分布)。
已经执行了基于这些原理执行的实验,并将其与现有技术的混合测量方法进行了比较,并发现高度吻合。
图14示出根据实施例的颗粒表征平台的示例实施例,包括:自动采样器601、第一测量系统611、第一过滤器621、SEC柱602、第二过滤器622和第二测量系统612。
自动采样器601被配置为接收多个样本,诸如HPLC小瓶或微量滴定板,并且经由第一测量系统611将样本自动注入到柱上以被洗脱液洗脱,以便执行液相色谱法。
第一测量系统611和第二测量系统612包括UV光度计和散射光检测器(例如,直角散射或低角散射)。平台600被配置为使样本流过第一测量系统611,流过SEC柱602,并且然后流过第二测量系统612。在一些实施例中,来自SEC柱602的输出可以被重定向回到第一测量系统611以用于第二测量(并且省略了第二测量系统612)。
在图15中示出了根据实施例获得的色谱图500的示意性示例。在该示例中,色谱图信号可以被认为是UV吸收的,并且包括包含所有样本组分(包括与分离过程不兼容的任何大颗粒)的分离前的峰501。色谱图500进一步包含分离后的信号峰502。这些分离后的峰中的每一个峰与样本的组分对应。对于第一测量包括UV光度测量和散射测量二者的示例,测量数据可以包括两个色谱图:一个用于UV吸收(即UV色谱图),以及一个用于散射强度(其可以称为散射色谱图)。
现在将描述用于定量分析不同类别中相同颗粒的比例的示例工作流程。
为了减少计算开销,可以首先对UV色谱图进行二次采样。这不是必需的,但是可以加快处理速度。二次采样可有助于减少使基线拟合数据和识别峰所需的时间。完整的数据集可用于确定峰面积,以便保持精度。
可以将基线拟合到数据,并且识别出明显的峰(例如,通过在数据中找到局部最大值)。可以参考最大峰的位置来定义色谱图的活性区域,该峰在聚集研究中应与关注单体相对应。可以参考最大峰的位置和宽度来定义活性区域,以便响应于所分析的单体的特性。例如,活性区域可以开始于最大峰的位置减去预定数量的最大峰宽度,并且终止于最大峰的位置加上预定数量的最大峰宽度。
活性区域中的数据可以传递给解卷积算法,该算法对数据执行时间分离的伪高斯分布的完全拟合:
未知数是幅度An和宽度σn,可以通过在中心时间cn处拟合轮廓来求解,直到找到与数据最优拟合为止。这可以通过求解以下矩阵方程的非负最小二乘拟合来实现:
其中,在该表示中,T是单位幅度伪高斯矩阵,具有选定的宽度和中心时间的组合,y是色谱图数据,并且A是要求解的幅度向量。
色谱图中与单体、片段和聚集体相对应的区域可以从拟合方案中确定。单体峰的任一侧的第一明显肩部可被识别为单体区域的端部。
在以下情况下,可以识别出明显肩部:
i.渐变中转折点的突出度大于最大突出度的0.5%;或
ii.转折点是宽峰,突出度>最大值的0.1%,并且具有大于估计的单体宽度的五分之一的半峰宽度;或
iii.满足条件(i)和(ii)中的任何一个,并且肩部距单体峰最大值大于1.2*单体宽度的距离。这是为了确保不会拾取最大值周围的虚假肩部。
一旦识别并拟合了每个区域中的峰,就可以直接确定每个区域中的面积之和,并将其转换为反映样本中各个比例浓度的百分比。
使用UV色谱法识别色谱法的区域(即与样本中这些组分相对应的洗脱时间)并且然后将其应用于散射色谱图可能是有利的。
对于每个峰(与样本组分相对应),可以计算UV色谱法和散射色谱法的面积比,以便提供该峰的颗粒尺寸/相对分子量的估计。
可以将分离前的测量数据视为线性拟合(以去除基线)与拟合到分离前的UV吸收峰的拟高斯(例如时间相关的高斯)的组合。
可以将该峰下的面积与分离后的UV吸收峰下的总面积进行比较,以提供有关样本中存在的任何潜在VHMW组分的信息。分离之前和分离之后总UV吸收之间的差异并不总是归因于样本中VHMW含量。在一些情况下,分离装置/SEC柱中可能会出现聚集体、单体或片段的损失,这将导致分离之前和之后的总吸收差,这不归因于VHMW颗粒。
为了避免错误地识别VHMW颗粒,可以使用VHMW颗粒的辅助指标。辅助指标可以包括总信号差异(例如,UV吸收或散射)的阈值。至少5%或至少10%的UV吸收差异可指示VHMW颗粒。总散射光的差异(即分离之前和之后散射光强度信号下的面积差)也可能指示VHMW颗粒。由于较大的颗粒更强烈地散射光,因此光散射可能对较大的颗粒更敏感,并且在存在VHMW颗粒时,分离之前和之后的光散射中可能会观察到相对较大的差异(例如,大于40%或大于50%)。将UV吸收差异与总散射差异结合起来提供相对可靠的VHMW颗粒指示。例如,如果UV吸收差异为5%或更大,并且总散射差异为40%或45%或更大,则可以高度确信地推断出VHMW颗粒是造成这种情况的原因。
用于确定VHMW颗粒在分离前和分离后测量中引起总信号差异(例如吸光度或散射)的另一种辅助指标是查看从分离前和分离后分析确定的平均分子量。平均分子量超过特定阈值的差异可指示VHMW颗粒。该阈值可以是例如2或2.2。
如果存在辅助指标,则分离之前和之后的UV吸收差可用于估计包含VHMW颗粒的样本的质量比例。没有伴随着VHMW颗粒的辅助指标的UV吸收差异可以忽略(并且仅基于第二测量后分离,片段、单体和聚集体的比例)。
其它实施例有意地在由所附权利要求书限定的本发明的范围内。
Claims (20)
1.一种表征包含颗粒的样本的方法,所述方法包括:
使用第一颗粒表征技术对所述样本执行第一测量;
使所述样本从所述第一颗粒表征技术流到颗粒分离装置;
用所述颗粒分离装置分离所述样本;以及
对所分离的样本执行第二测量。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述颗粒分离装置包括色谱柱,并且可选地,其中,所述色谱柱是尺寸排阻色谱柱。
3.根据权利要求1或2所述的方法,进一步包括确定所述样本的颗粒特性分布,并且可选地,其中,所述颗粒特性是颗粒质量或颗粒尺寸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,进一步包括使所述样本从所述分离器装置流回到所述第一颗粒表征技术。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,执行所述第二测量包括使用所述第一颗粒表征技术对所述样本执行所述第二测量。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,进一步包括:在用所述颗粒分离装置分离所述样本之前和/或之后,对所述样本执行附加测量。
7.根据权利要求6所述的方法,其中,执行所述附加测量包括:使用所述第一颗粒表征技术对所述样本执行附加测量;或者使用第二颗粒表征技术对所述样本执行附加测量,所述第二颗粒表征技术不同于所述第一颗粒表征技术。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,进一步包括比较所述第一测量和所述第二测量以确定所述样本的所有颗粒是否已经通过所述分离装置。
9.根据权利要求8所述的方法,其中,比较所述第一测量和第二测量包括:
确定所述第二测量是否与所述第一测量匹配;以及
如果所述第二测量确实与所述第一测量匹配,则确定所述样本的所有颗粒都已通过所述分离装置;以及
如果所述第二测量与所述第一测量不匹配,则确定不是所有的所述样本的所述颗粒都已通过所述分离装置。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,将所述样本从所述第一颗粒表征技术流到所述颗粒分离装置包括操作阀以将所述样本从所述第一颗粒表征技术引导到所述颗粒分离装置。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述第一颗粒表征和/或第二颗粒表征技术包括一种或多种整体颗粒表征技术。
12.根据权利要求11所述的方法,其中,一种或多种整体颗粒表征技术选自包括以下项的组:UV光谱法、动态光散射、静态光散射,以及泰勒分散分析,以及UV光度法。
13.一种颗粒表征平台,包括:
测量系统,用于根据第一颗粒表征技术执行测量;以及
颗粒分离装置,用于分离包含颗粒的样本;
其中,所述颗粒表征平台被配置为执行权利要求1至12中任一项的方法。
14.根据权利要求13所述的颗粒表征平台,其中,所述颗粒分离装置包括色谱柱,并且可选地,其中,所述色谱柱是尺寸排阻色谱柱。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的颗粒表征平台,其中,所述测量系统进一步被配置为根据第二颗粒表征技术来执行测量。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的颗粒表征平台,其中,所述颗粒表征平台被配置为使样本流至所述测量系统以执行所述第一测量,然后使样本流至所述颗粒分离装置以分离所述样本,并且然后使样本流回至所述测量系统以执行所述第二测量。
17.根据权利要求13至15中任一项所述的颗粒表征平台,其中,所述测量系统是第一测量系统,并且所述颗粒表征仪器包括第二测量系统;其中,所述颗粒表征平台被配置为使样本流至所述第一测量系统以执行所述第一测量,然后使样本流至所述颗粒分离装置以分离所述样本,并且然后使样本流至所述第二测量系统以执行所述第二测量。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的颗粒表征平台,其中,所述第一测量包括UV光度法和光散射。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的颗粒表征平台,其中,所述第二测量包括UV光度法和光散射。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的颗粒表征平台,其中,所述仪器被配置为提供对以下类别中的所述样本的所述比例的定量分析:
i)单体,其与所关注颗粒的相对分子量的大小对应;
ii)具有比所述单体更小的尺寸或分子量的颗粒;
iii)所述单体的低聚物,或具有比所述单体更大的尺寸或分子量,高至从所述第二测量中排除的颗粒尺寸或分子量的颗粒;以及
iv)大的聚集体,包括从所述第二测量中排除的颗粒。
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