CN111239310A - 一种交替进样分析的高效液相色谱分离系统及操作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种交替进样分析的高效液相色谱分离系统及其应用，该系统由两套单维高效液相色谱系统(包括高效液相色谱输液泵、自动进样器、液相色谱柱、柱温箱)、检测器和两位六通阀构成。其特点在于通过对两套单维高效液相色谱系统分析时间差的调节，及两套单维高效液相色谱系统分别触发同一检测器采集，实现了两套高效液相色谱系统交替进行色谱梯度洗脱过程和色谱冲洗平衡过程。本发明提高了样品分析的通量，通过选择不同的色谱柱固定相和流动相组合，可以获取丰富的样品信息。

Description

一种交替进样分析的高效液相色谱分离系统及操作方法
技术领域：
本发明属于一种液相色谱分离系统，具体涉及一种交替进样分析的高效液相色谱分离系统。
背景技术：
代谢组学是对生物体内某一特定生理时期内所有的小分子代谢物进行定性和定量分析的一门学科，是系统生物学的重要组成部分。代谢物的组成极其复杂且物理化学性质差异极大，因此代谢物的全面解析是非常困难的。
液相色谱-质谱联用技术是代谢组学研究中常用的一种技术手段，具有较好的分离度、重复性和灵敏度。传统的反相色谱分析方法通常使用水，乙腈或甲醇作流动相，可以检测到极性和中等极性的代谢物，如氨基、肉碱、胆汁酸、溶血磷脂和脂肪酸等。但是极性代谢物在反相色谱上保留太弱在死时间流出，因此，分离度差，存在严重的离子抑制效应。然而亲水作用色谱可以很好的分离极性代谢物。另外，非极性较强的磷脂、胆固醇和甘油酯在传统的反相色谱分析方法保留太强无法洗脱出来，使用洗脱能力较强的异丙醇可以实现对脂质的分离。
由于分析条件的不同，如果想要获取尽可能多的样品中的代谢物信息，需要进行两次甚至多次进样分析的过程，浪费时间和精力。因此，发展快速简便的高通量代谢组学分析方法是代谢组学分析流程中一个十分必要的环节。
基于常规的代谢组学存在的上述各种问题，本发明构建了一种交替进样分析的高效液相色谱分离系统。调节使两套单维高效液相色谱系统的分析时间相同，在第一根液相色谱柱梯度时间结束的前0.3min开始第二根液相色谱柱的梯度洗脱，并且质谱交替的采集第一根液相色谱柱梯度洗脱时间和第二根液相色谱柱的梯度洗脱时间的数据，节省了色谱柱的冲洗平衡时间，实现了代谢组的高通量分析。该系统操作简单，易于构建，与质谱兼容性好，通量高，覆盖度广，在大规模的代谢组学分析中有着广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是基于代谢组学现有分析技术存在的一些问题，提供了一种高通量的液相色谱分离系统及其应用。通过在合适的时间开展第二根液相色谱柱的分析，结合两位六通阀的控制，实现了检测器交替地采集两根液相色谱柱梯度洗脱时间段的数据，节省了色谱柱的冲洗平衡时间，提高了分析方法的通量。
为实现上述目的，具体发明技术方案如下：
本发明涉及的交替进样分析的高效液相色谱装置包括单维高效液相色谱分离系统1(液相色谱泵1、自动进样器1、液相色谱柱1)、单维高效液相色谱分离系统2(液相色谱泵2、自动进样器2、液相色谱柱2)、六通阀和检测器。调节单维高效液相色谱分离系统2的分析时间使两套单维高效液相色谱分离系统完成一针分析所用的时间基本相等。
初始时，六通阀(⑦)的1号位与2号位相连；液相色谱泵1(④)的输出端经过自动进样器1(⑤)、液相色谱柱1(⑥)与六通阀(⑦)的1号位相连，六通阀(⑦)的2号位与检测器(⑧)相连；液相色谱泵2(①)的输出端经过自动进样器2(②)、液相色谱柱2(③)与六通阀(⑦)的3号位相连，六通阀(⑦)的6号位接入废液。单维高效液相色谱分离系统1进样触发检测器(⑧)采集数据，其数据采集时间与液相色谱柱1(⑥)的梯度洗脱时间相等。
在液相色谱柱1(⑥)的梯度洗脱时间结束的前0.3min，单维高效液相色谱分离系统2走样触发检测器(⑧)采集数据，在检测器(⑧)开始采集数据的同时切换六通阀(⑦)，六通阀(⑦)的2号位与3号位相连，其采集时间与液相色谱柱2(③)的梯度洗脱时间相等。
液相色谱柱1(⑥)和液相色谱柱2(③)可以是性能类似的液相色谱柱如两根反相液相色谱柱，也可以是性能互补的液相色谱柱如亲水作用液相色谱柱和反相液相色谱柱。
所述液相高效液相色谱分离系统既可以用于极性代谢物和中等极性代谢物的交替分析，也可以用于中等极性代谢物和非极性代谢物的交替分析。
本发明最核心的过程是：调节单维高效液相色谱分离系统2的分析时间，使两套单维高效液相色谱分离系统完成一针分析所用的时间基本相等。在单维高效液相色谱分离系统1梯度洗脱结束的前0.3min开始单维高效液相色谱分离系统2的梯度洗脱，并且检测器交替地采集单维高效液相色谱分离系统1梯度洗脱时间段和单维高效液相色谱分离系统2梯度洗脱时间段的数据。
本发明通过对两套单维高效液相色谱系统分析时间差的调节，及两套单维高效液相色谱系统分别触发同一检测器采集，实现了两套高效液相色谱系统交替进行色谱梯度洗脱过程和色谱冲洗平衡过程。本发明提高了样品分析的通量，通过选择不同的色谱柱固定相和流动相组合，可以获取丰富的样品信息。
本发明具有如下优点：本发明的系统适用于分析复杂样品中极性差异较大的代谢物，通过预实验调节使两套单维高效液相色谱分离系统的分析时间相等，并在合适的时间开始第二套单维高效液相色谱分离系统的分析，即可实现极性代谢物和中等极性代谢物或中等极性代谢物和非极性代谢物的交替进样分析。该系统操作简便，节省了分析时间，提高了分析通量，普适性强，可实现对血样、尿样、组织和细胞等复杂样品的高效分离。
附图说明
图1为本发明提供的液相色谱系统的装置图；
图2a为本发明提供的液相色谱系统的流路图之一；
图2b为本发明提供的液相色谱系统的流路图之一；
图1-图2b中数字代表：①为液相色谱泵2，②为自动进样器2，③液相色谱柱2，④为液相色谱泵1，⑤为自动进样器1，⑥液相色谱柱1，⑦为六通阀，1-6为六通阀(⑦)的接口，⑧为检测器。
图3a为本发明对血清样品提取物中极性代谢物使用亲水作用色谱进行分析的总离子流图。图中横坐标为保留时间(min)，纵坐标为响应强度。
图3b为本发明对血清样品提取物中中等极性代谢物使用反相色谱进行分析的总离子流图。图中横坐标为保留时间(min)，纵坐标为响应强度。
图4a为本发明对血浆样品提取物中非极性代谢物使用反相色谱进行分析的总离子流图。图中横坐标为保留时间(min)，纵坐标为响应强度。
图4b为本发明对尿样样品提取物中中等极性代谢物使用反相色谱进行分析的总离子流图。图中横坐标为保留时间(min)，纵坐标为响应强度。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明进行进一步描述。
实施例1：极性差异较大的代谢物交替进样分析的高效液相色谱系统构建
本发明系统装置包括单维高效液相色谱分离系统1(液相色谱泵1、自动进样器1、液相色谱柱1)、单维高效液相色谱分离系统2(液相色谱泵2、自动进样器2、液相色谱柱2)、六通阀和检测器。调节单维高效液相色谱分离系统2的分析时间使两套单维高效液相色谱分离系统完成一针分析所用的时间基本相等。
第一步，如图2a所示。初始时，六通阀(⑦)的1号位与2号位相连；液相色谱泵1(④)的输出端经过自动进样器1(⑤)、液相色谱柱1(⑥)与六通阀(⑦)的1号位相连，六通阀(⑦)的2号位六通阀(⑦)的2号位与检测器(⑧)相连；液相色谱泵2(①)的输出端经过自动进样器2(②)、液相色谱柱2(③)与六通阀(⑦)的3号位相连，六通阀(⑦)的6号位接入废液。单维高效液相色谱分离系统1进样触发检测器(⑧)采集数据，其数据采集时间与液相色谱柱1(⑥)的梯度洗脱时间相等。
第二步，如图2b所示。在液相色谱柱1(⑥)的梯度洗脱时间结束的前0.3min，单维高效液相色谱分离系统2走样触发检测器(⑧)采集数据，在检测器(⑧)开始采集数据的同时切换六通阀(⑦)，六通阀(⑦)的2号位与3号位相连，其采集时间与液相色谱柱2(③)的梯度洗脱时间相等。
在本实施例中，液相色谱泵1和液相色谱泵2为超高效液相色谱双元泵，检测器为质谱检测器。通过图2a-2b过程，实现了复杂样品中极性差异较大的代谢物的交替进样分析。
实施例2：极性代谢物和中等极性代谢物的交替进样分析
样品：血清提取物
具体提取过程如下：准确移取200μL血清于eppendorf管中，加入800μL甲醇，涡旋1min；4℃下以14000rpm的速度离心15min；取两份400μL上清液真空冷冻干燥。进样前，一份使用100μL 50％乙腈复溶用于亲水作用色谱分析；一份使用100μL 20％甲醇复溶用于反相色谱分离；进样量均为5μL。
亲水作用色谱分析参数：液相色谱柱1：ZIC-cHILIC(3μm，2.1mm×100mm)。流动相A1为含有10mM乙酸铵和体积分数0.02％乙酸的乙腈/水溶液(乙腈/水＝90/10，v/v)，流动相B1为含有10mM乙酸铵和体积分数0.02％乙酸的乙腈/水(乙腈/水＝20/80，v/v)溶液。流速0.3mL/min。柱温为40℃。
反相色谱分析参数：液相色谱柱2：C8柱(1.7μm，2.1mm×50mm)。流动相A2为含有0.1％甲酸的水溶液，流动相B2为含有0.1％甲酸的乙腈溶液。流速0.4mL/min。柱温为60℃。
本实施例中，单维高效液相色谱分离系统1的分析时间为25.40min，根据对单维高效液相色谱分离系统2分析时间的调节，其分析时间设为25.39min。亲水作用色谱的梯度条件是：0-1min，100％A1；1-15min，100-30％A1；15-17min，30％A1；17-17.1min,30-100％A1；17-25.4min,100％A1.反相色谱的梯度条件是：0-1min，95％A2；1-3min，95-60％A2；3-10min，60-0％A2；10-15min,0％A1；15-15.1min,0-95％A1；15.1-25.39min,95％A2。开始亲水作用色谱的分析，如附图2a所示，质谱的采集时间为15min；在亲水作用色谱的分析时间到14.7min时，提交反相色谱的序列，即开始反相色谱的分析，待质谱15min的采集结束后，如图2b所示，质谱的采集时间为10min。
具使用本发明分析血浆样品提取物，在上述液相色谱条件下，质谱采集的亲水作用色谱的总离子流图如附图3a所示,质谱采集的反相作用色谱的总离子流图如附图3b所示。
实施例3：中等极性代谢物和非极性代谢物的交替进样分析
样品：血清提取物和尿样提取物
非极性代谢物的提取：准确移取40μL尿样于eppendorf管中，加入300μL甲醇，涡旋30s；加入1mLMTBE，震荡15min；加入300μL水，涡旋30s；4℃下静置10min后4℃下以14000rpm的速度离心15min；取400μL上层清液真空冷冻干燥。进样前使用40μL复溶液(二氯甲烷/甲醇＝2:1，v/v)复溶,再加入160μL的稀释液(乙腈/异丙醇/水＝65:30:5，含5mM乙酸铵)，进样量为5μL。
中等极性代谢物的提取：准确移取100μL尿样于eppendorf管中，加入400μL甲醇，涡旋1min；4℃下以14000rpm的速度离心15min；取400μL上清液真空冷冻干燥。进样前使用100μL 20％甲醇复溶用于中等极性代谢物的反相色谱分离，进样量为5μL。
非极性代谢物反相色谱分析参数：液相色谱柱1：C8(1.7μm，2.1mm×100mm)。流动相A1为含有10mM乙酸铵乙腈/水溶液(乙腈/水＝60/40，v/v)，流动相B1为含有10mM乙酸铵异丙醇/乙腈溶液(异丙醇/乙腈＝90/10，v/v)。流速0.3mL/min。柱温为60℃。
中等极性代谢物反相色谱分析参数：液相色谱柱2：C8柱(1.7μm，2.1mm×50mm)。流动相A2为含有0.1％甲酸的水溶液，流动相B2为含有0.1％甲酸的乙腈溶液。流速0.4mL/min。柱温为60℃。
本实施例中，单维高效液相色谱分离系统1的分析时间为17.40min，根据对单维高效液相色谱分离系统2分析时间的调节，每8针中前6针的分析时间是17.55min，后两针的分析时间是17.56min。液相色谱柱1的梯度条件是：0-1.5min，50％A1；1.5-9min，50-15％A1；9-9.1min，15-0％A1；9.1-13min,0％A1；13-13.1min,0-50％A1,13.1-17.40min，50％A1。液相色谱柱1的梯度条件是：0-0.5min，95％A2；1-2min，95-60％A2；2-8min，60-0％A2；8-12min,0％A1；12-12.1min,0-95％A1；12.1-17.55/17.56min,95％A2。开始非极性代谢物的分析，如附图2a所示，质谱的采集时间为9min；在非极性代谢物的分析时间到8.7min时，提交中等极性代谢物分析的序列，即开始中等极性代谢物的分析，待质谱9min的采集结束后，如图2b所示，质谱的采集时间为8min。
具使用本发明分析血浆样品提取物，在上述液相色谱条件下，质谱采集的非极性代谢物分析的总离子流图如附图4a所示,质谱采集的中等极性代谢物分析的总离子流图如附图4b所示。

Claims (7)

1.一种交替进样分析的高效液相色谱分离系统，其特征在于：
包括单维高效液相色谱分离系统1(液相色谱泵1(④)、自动进样器1(⑤)、液相色谱柱1(⑥))、单维高效液相色谱分离系统2(液相色谱泵2(①)、自动进样器2(②)、液相色谱柱2(③))、六通阀(⑦)和检测器(⑧)；
单维高效液相色谱分离系统1包括液相色谱泵1(④)、自动进样器1(⑤)、液相色谱柱1(⑥)；液相色谱柱1(⑥)置于柱温箱中；
单维高效液相色谱分离系统2包括液相色谱泵2(①)、自动进样器2(②)、液相色谱柱2(③)；液相色谱柱2(③)置于柱温箱中；
六通阀(⑦)的1号位与液相色谱柱1(⑥)出口相连，液相色谱泵1(④)出口与自动进样器1(⑤)进口相连，自动进样器1(⑤)出口与液相色谱柱1(⑥)进口相连；
六通阀(⑦)的3号位与液相色谱柱2(③)出口相连，液相色谱泵2(①)出口与自动进样器2(②)进口相连，自动进样器2(②)出口与液相色谱柱2(③)进口相连；
六通阀(⑦)的2号位与检测器(⑧)相连；
六通阀(⑦)的6号位接入废液。
2.一种权利要求1所述的高效液相色谱分离系统的操作方法，其特征在于：
单维高效液相色谱分离系统1、单维高效液相色谱分离系统2和检测器(⑧)各自单独控制；
初始时，六通阀(⑦)的1号位与2号位相连；液相色谱泵1(④)的输出端经过自动进样器1(⑤)、液相色谱柱1(⑥)与六通阀(⑦)的1号位相连，六通阀(⑦)的2号位与检测器(⑧)相连；液相色谱泵2(①)的输出端经过自动进样器2(②)、液相色谱柱2(③)与六通阀(⑦)的3号位相连，六通阀(⑦)的6号位接入废液；单维高效液相色谱分离系统1走样触发检测器(⑧)采集数据，其数据采集时间与液相色谱柱1(⑥)的梯度洗脱时间相等；在液相色谱柱1(⑥)的梯度洗脱时间结束的前0.3min(控制在0.3min和0.29min之间)，单维高效液相色谱分离系统2进样触发检测器(⑧)采集数据，检测器(⑧)开始采集数据的同时切换六通阀(⑦)，六通阀(⑦)的2号位与3号位相连，其采集时间与液相色谱柱2(③)的梯度洗脱时间相等。
3.按照权利要求2所述的高效液相色谱分离系统的操作方法，其特征在于：通过调节单维高效液相色谱分离系统2的分析时间，使两套单维高效液相色谱分离系统完成一次进样分析所用的时间基本相等。
4.按照权利要求2所述的高效液相色谱分离系统的操作方法，其特征在于：在单维高效液相色谱分离系统1梯度洗脱时间结束的前0.3min开始单维高效液相色谱分离系统2的分析。
5.按照权利要求2所述的高效液相色谱分离系统的操作方法，其特征在于：检测器交替地采集单维高效液相色谱分离系统1梯度洗脱时间段和单维高效液相色谱分离系统2梯度洗脱时间段的数据。
6.按照权利要求2所述的高效液相色谱分离系统的操作方法，其特征在于：液相色谱柱1(⑥)和液相色谱柱2(③)可以是性能类似的液相色谱柱如两根反相液相色谱柱，或也可以是性能互补的液相色谱柱如亲水作用液相色谱柱和反相液相色谱柱。
7.按照权利要求2所述的高效液相色谱分离系统的操作方法，其特征在于：所述液相高效液相色谱分离系统可以用于氨基酸，有机酸等极性代谢物和胆汁酸，溶血磷脂，脂肪酸等中等极性代谢物的交替分析，或也可以用于胆汁酸，溶血磷脂，脂肪酸等中等极性代谢物和磷脂，甘油三脂等非极性代谢物的交替分析。
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