JP7460566B2 - 終末糖化産物の分析方法 - Google Patents
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- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Description
本発明は、終末糖化産物の分析方法に関する。
タンパク質中に存在するアミノ基とグルコース等の還元糖のアルデヒド基とが、非酵素的に反応すると糖化産物が形成される。この反応は、非酵素的糖化反応又はメイラード反応と称される。非酵素的糖化反応は、生体内においても起きている。非酵素的糖化反応は、シッフ塩基を経てアマドリ転位生成物が形成される前期反応と、複雑な開裂や縮合等が起こる後期反応との２段階で起こると考えられ、後期反応では、終末糖化産物（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ Ｅｎｄ－ｐｒｏｄｕｃｔ：ＡＧＥ）と呼ばれる、単一ではない様々な物質が生成する。
前期反応の生成物であるＨｂＡ１ｃは、糖尿病患者の血糖コントロールの指標として世界的に測定されて利用されているが、ＨｂＡ１ｃの値の高さと合併症の発症率とが必ずしも一致しないことから、糖尿病の合併症の発症や進展について他の因子の関与も指摘されている。
またＡＧＥは、糖尿病や老化に伴う各種の症状や疾患等との関連性が報告されている。また、様々な生活習慣病との関連も報告されている。しかしながら、ＡＧＥは、ＨｂＡ１ｃとは異なり、構造が多様でかつ不安定な構造のものも多く、生体における様々なＡＧＥを正確に定量することは困難である。
ＡＧＥの分析方法としては、分析対象のＡＧＥを認識・結合するモノクローナル抗体が利用できる場合は、それを利用したＥＬＩＳＡ測定法を用いることが可能であるが、そのようなモノクローナル抗体が確立できていない場合は、糖化された蛋白質を、酸又はアルカリによって加水分解し、酸又はアルカリの除去後に、ＨＰＬＣ分析、ＬＣ－ＭＳ分析、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析などによりＡＧＥを検出し、標品と比較することで特定、定量する方法が行われている。
ＡＧＥの分析方法としては、分析対象のＡＧＥを認識・結合するモノクローナル抗体が利用できる場合は、それを利用したＥＬＩＳＡ測定法を用いることが可能であるが、そのようなモノクローナル抗体が確立できていない場合は、糖化された蛋白質を、酸又はアルカリによって加水分解し、酸又はアルカリの除去後に、ＨＰＬＣ分析、ＬＣ－ＭＳ分析、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析などによりＡＧＥを検出し、標品と比較することで特定、定量する方法が行われている。
本出願人は先に、質量分析による高感度且つ高精度なＡＧＥの分析を可能にする試料の前処理方法として、生体試料を液相で酸処理するステップ、及び、酸処理した試料を強酸性陽イオン交換樹脂に添加して非酸性条件下で溶出するステップを含む調製方法を提案している（特許文献１参照）。この調製方法によって調整した試料は、ＡＧＥの純度が高く、該試料をＬＣ－ＭＳ／ＭＳ等の質量分析にかけると、夾雑物に由来するノイズが大幅に低減された測定データが得られる。
また本出願人は、終末糖化産物分析のための試料の調製方法として、蛋白質の完全加水分解を要しない方法も提案している（特許文献２参照）。特許文献２の方法は、生体試料に対し、限外濾過膜で濾過処理する工程及び還元処理を施す工程を含み、生体試料に対して酸処理を施す工程を含まない。
特許文献１に記載の方法では、質量分析によるＡＧＥ分析の前処理手法として、タンパク質を分解するための塩酸による加水分解処理や、夾雑物の除去のための陽イオン交換カラム処理を行っている。しかしながら、塩酸による加水分解処理後に、塩酸を除去するために乾固処理を行っており、例えば、遠心濃縮装置を用いて１ｍＬの塩酸を除去する場合、１０時間以上の時間を要する等、乾固処理には時間が掛かる。また使用する塩酸が高濃度であると、遠心濃縮装置にダメージを与えることになり、処理時間の長期化のみならず、装置の維持のための労力的又は経済的な負担という課題もある。
また特許文献１には、陽イオン交換カラム処理の工程においては、樹脂に吸着した物質を溶出させるために用いる溶出液として、アンモニア溶液やアンモニア溶液とメタノールの混合溶液が記載されており、例えば、実施例では７質量％アンモニア水溶液という比較的アンモニア濃度の高い溶離液を用いているため、回収した溶出液を吹付式試験管濃縮装置にセットして乾固させてアンモニアを除去している。しかしながら、例えば、吹付式試験管濃縮装置を用いて３ｍＬのアンモニア水溶液を乾固する場合、１０時間以上の時間を要する等、この段階の乾固処理にも時間が掛かる。
特許文献１の方法のように、質量分析に供する試料の前処理に時間を要することは、ＡＧＥの分析値を、臨床的に使用することの障害にもなる。
また蛋白質の加水分解処理に高濃度の塩酸を用いることは、ＡＧＥの分析のための、試料の前処理又は前処理を含む一連の処理を自動化装置で行うことを考えたときに、機器の腐食や有毒ガスの放出等の不都合を生じ得るため、分析の自動化の点でも好ましくない。
特許文献１の方法のように、質量分析に供する試料の前処理に時間を要することは、ＡＧＥの分析値を、臨床的に使用することの障害にもなる。
また蛋白質の加水分解処理に高濃度の塩酸を用いることは、ＡＧＥの分析のための、試料の前処理又は前処理を含む一連の処理を自動化装置で行うことを考えたときに、機器の腐食や有毒ガスの放出等の不都合を生じ得るため、分析の自動化の点でも好ましくない。
他方、特許文献２に記載の方法によれば、生体試料に対して酸処理を施す工程を不要とすることができる。しかしながら、酸処理を行わないことによって、酵素加水分解に用いる酵素の試薬代によって測定費用が高額となり、更に酵素に含まれるＡＧＥｓによって測定値が過剰に見積もられるという点において改善の余地がある。また、多数の生体試料の分析を行うためには、限外濾過膜を備えた部品が多量に必要となったり、その交換を高頻度に行う必要が生じる等の不都合がある。斯かる不都合は、例えば短時間での多量の生体試料の分析やロボットによる分析を図る等の観点から好ましくない。
本発明の解決課題は、生体試料に含まれるＡＧＥの高感度な分析が可能であり、且つ該分析に要する時間を大幅に短縮可能な終末糖化産物の分析方法を提供することにある。
本発明は、生体試料を塩酸溶液で処理する酸処理工程、酸処理後の試料含有液を強酸性陽イオン樹脂と接触させ、次いで溶離液で試料を溶出させて精製する精製工程、及び前記溶離液による溶出液をＬＣ－ＭＳ分析に供する分析工程を備える終末糖化産物の分析方法であって、前記酸処理工程においては、終濃度が１～１２Ｎの塩酸溶液で処理し、前記精製工程においては、酸処理後の試料含有液を水、又は揮発性で中性から塩基性の化合物を含む溶液で希釈し、該試料を含む酸処理後の希釈液を、乾固処理することなく前記強酸性陽イオン樹脂と接触させ、且つ、前記溶離液として、前記ＬＣ－ＭＳ分析に用いる有機溶媒を２０質量％以上８０質量％以下含み、且つ塩基性化合物を１質量％以上７質量％以下含む水溶液を用いて溶出させ、前記分析工程においては、前記精製工程で得られた溶出液を、乾固処理することなく前記ＬＣ－ＭＳ分析に供する、終末糖化産物の分析方法を提供することにより、上記の目的を達成したものである。
本発明の終末糖化産物の分析方法によれば、生体試料に含まれるＡＧＥの高感度な分析が可能であり、且つ該分析に要する時間を大幅に短縮可能である。
以下、本発明をその好ましい実施態様に基づいて説明する。
本発明の終末糖化産物の分析方法は、生体試料に含まれる終末糖化産物を分析する方法である。終末糖化産物の分析には、生体試料に含まれる終末糖化産物についての何らかの情報が得られる分析が広く包含され、生体試料に含まれる終末糖化産物の特定や定量、複数の終末糖化産物の比率の測定等であってもよく、また終末糖化産物の有無を問わずチャートを得るのみであってもよい。
本発明の終末糖化産物の分析方法は、生体試料に含まれる終末糖化産物を分析する方法である。終末糖化産物の分析には、生体試料に含まれる終末糖化産物についての何らかの情報が得られる分析が広く包含され、生体試料に含まれる終末糖化産物の特定や定量、複数の終末糖化産物の比率の測定等であってもよく、また終末糖化産物の有無を問わずチャートを得るのみであってもよい。
本発明で分析する対象の終末糖化産物（以下ＡＧＥという）としては、例えば、Ｎ－ε－（カルボキシメチル）リジン、Ｎ－ε－（カルボキシエチル）リジン、Ｓ－（２－スクシニル）システイン、メチルグリオキサール－イミダゾロン、カルボキシエチルアルギニン、Ｓ－（２－スクシニル）システイン（以下、２ＳＣともいう）が挙げられる。ＡＧＥは、生体中では、タンパク質若しくはペプチドと結合した非遊離体、又はタンパク質及びペプチドの何れとも結合していない遊離体として存在する。
本発明において分析するＡＧＥは、通常、酸処理工程を経て、遊離体のＡＧＥとなっている。
本発明において分析するＡＧＥは、通常、酸処理工程を経て、遊離体のＡＧＥとなっている。
本発明の終末糖化産物の分析方法は、酸処理工程及び精製工程を含む前処理工程と、前記精製工程により得られる前記溶離液による溶出液をＬＣ－ＭＳ分析に供する分析工程とを備えている。以下、本発明における各工程について説明する。
［酸処理工程］
前記酸処理工程においては、生体試料を酸で処理する。生体試料は、健常人から採取されたものであっても、疾病罹患患者から採取されたものでも良い。また生体試料としては、生体から採取されたあらゆる細胞、組織、及び体液、例えば、皮膚、筋肉、骨、毛髪、爪、脂肪組織、脳神経系、心臓及び血管等の循環器系、肺、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、消化器系、胸腺、血管、リンパ管、血液試料（全血、血清、血漿）、リンパ液、唾液、尿、精液、腹水、喀痰等、並びにそれらの培養物が挙げられる。このうち、低侵襲性の観点から血液試料（全血、血清、血漿）、リンパ液、尿、皮膚、末梢血管、筋肉、脂肪組織等が好ましく、血清、血漿がより好ましい。上記生体試料は、酸処理にかける前に、必要に応じてホモジナイズした後、遠心や濾過にかけ、細胞片や不溶性物質などの夾雑物を予め除去しておいてもよい。
前記酸処理工程においては、生体試料を酸で処理する。生体試料は、健常人から採取されたものであっても、疾病罹患患者から採取されたものでも良い。また生体試料としては、生体から採取されたあらゆる細胞、組織、及び体液、例えば、皮膚、筋肉、骨、毛髪、爪、脂肪組織、脳神経系、心臓及び血管等の循環器系、肺、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、消化器系、胸腺、血管、リンパ管、血液試料（全血、血清、血漿）、リンパ液、唾液、尿、精液、腹水、喀痰等、並びにそれらの培養物が挙げられる。このうち、低侵襲性の観点から血液試料（全血、血清、血漿）、リンパ液、尿、皮膚、末梢血管、筋肉、脂肪組織等が好ましく、血清、血漿がより好ましい。上記生体試料は、酸処理にかける前に、必要に応じてホモジナイズした後、遠心や濾過にかけ、細胞片や不溶性物質などの夾雑物を予め除去しておいてもよい。
酸処理には、塩酸を用いる。酸処理においては、例えば、上記生体試料に塩酸の溶液を添加し、必要に応じて振盪又は攪拌した後、静置し、試料を加水分解させればよい。上記酸処理は、液相において行われる。すなわち、液体の状態の反応液中で試料の加水分解反応を進行させる。蛋白質が充分に加水分解するようにする観点、及び乾固処理することなく希釈のみで酸の影響を軽減できるようにする観点から、塩酸は、塩酸溶液の終濃度が１～１２Ｎ、より好ましくは３～１２Ｎとなるように加える。酸処理に使用される塩酸の量、反応時間および温度の条件は、生体試料を十分に溶解できる条件且つ反応液が液相となる条件であればよく、使用する生体試料や酸の濃度等に応じて決定すればよい。酸処理は、例えば、血清試料が５μＬの場合は、２００μＬの６Ｎ塩酸を添加し、塩酸の添加を行った試料について、８０～１２０℃で１０～４８時間、好ましくは１００℃以上で１８時間以上の加水分解処理を行う。
［還元処理］
前記酸処理工程においては、酸処理工程の前に、生体試料に還元処理を施す還元処理を行うことも好ましい。還元処理を行う理由は次の通りである。従来、ＡＧＥを含む試料の質量分析には、液体クロマトグラフから溶離する液体試料をエレクトロスプレープローブ（ＥＳＩプローブ）によりイオン化して質量分析計に導入する、エレクトロスプレーイオン化質量分析法を利用することが好ましい。例えば、このＥＳＩ法を利用してＡＧＥ分析を行うと、その分析中に、液体試料に含まれていたアマドリ転位生成物がＥＳＩプローブにてＡＧＥへと変化してしまい、分析結果の信頼性が低下するという問題がある。生体試料に還元処理を施すことにより、ＥＳＩ法による質量分析中に生体試料中のカルボニル基のアマドリ転位を防止し、結果として生体試料中で非ＡＧＥ成分がＡＧＥに変化することを防止し、高感度且つ高精度のＡＧＥ分析の実現を図ることができる。
前記酸処理工程においては、酸処理工程の前に、生体試料に還元処理を施す還元処理を行うことも好ましい。還元処理を行う理由は次の通りである。従来、ＡＧＥを含む試料の質量分析には、液体クロマトグラフから溶離する液体試料をエレクトロスプレープローブ（ＥＳＩプローブ）によりイオン化して質量分析計に導入する、エレクトロスプレーイオン化質量分析法を利用することが好ましい。例えば、このＥＳＩ法を利用してＡＧＥ分析を行うと、その分析中に、液体試料に含まれていたアマドリ転位生成物がＥＳＩプローブにてＡＧＥへと変化してしまい、分析結果の信頼性が低下するという問題がある。生体試料に還元処理を施すことにより、ＥＳＩ法による質量分析中に生体試料中のカルボニル基のアマドリ転位を防止し、結果として生体試料中で非ＡＧＥ成分がＡＧＥに変化することを防止し、高感度且つ高精度のＡＧＥ分析の実現を図ることができる。
還元処理としては、還元処理剤としてヒドリド還元剤を用いたヒドリド還元（hydride reduction）処理が好ましい。ヒドリド還元とは、化合物の還元を求核剤としての水素供与体により行う還元反応である。ヒドリド還元剤としては公知の物を適宜使用可能であり、例えば、水素化ホウ素ナトリウム〔NaBH4〕、シアノ水素化ホウ素ナトリウム〔NaBH3CN〕、水素化トリエチルホウ素リチウム〔LiBH(C2H5)3〕、水素化トリ（ｓｅｃ－ブチル）ホウ素リチウム〔LiBH(sec-C4H9)3〕、水素化トリ（ｓｅｃ－ブチル）ホウ素カリウム〔KBH(sec-C4H9)3〕、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素亜鉛、アセトキシ水素化ホウ素ナトリウム、水素化アルミニウムリチウム〔(LAH) LiAlH4〕、水素化ビス（２－メトキシエトキシ）アルミニウムナトリウム〔NaAlH2(OC2H4OCH3)2〕等が挙げられる。これらのヒドリド還元剤の中でも特に、水素化ホウ素ナトリウムは、還元力が高く、且つカルボニル基を還元するが、エステルやアミド基は還元しないため、本発明で好ましく用いられる。
還元処理は、例えば、生体試料に還元剤処理剤を含む溶液を添加し、必要に応じて振盪又は攪拌した後、所定時間静置することで実施できる。還元処理に使用される還元処理剤の量、反応時間、温度等の条件は、使用する生体試料や還元処理剤の種類等に応じて決定すれば良い。例えば、生体試料として全血、血清、血漿等の血液試料を用い、その膜透過画分に対してヒドリド還元処理を施す際に、ヒドリド還元剤として２ｍＭのNaBH4溶液を用いる場合、血清試料の１／１０容量程度で良い。
〔精製工程〕
酸処理後の試料含有液は、水、又はアンモニア等の揮発性で中性から塩基性の化合物を含む溶液を加えて希釈する。この希釈により酸の影響を軽減することで、乾固処理することなく、強酸性陽イオン交換樹脂と接触させることが可能となる。希釈するための水としては、純水を用いることが好ましい。純水としては、蒸留水、イオン交換水、ＲＯ水等が挙げられる。比抵抗値が18MΩ・cm以上の超純水を用いてもよい。希釈に、アンモニア等の揮発性で中性から塩基性の化合物を含む溶液を用いることもでき、当該希釈用液のｐＨは、２～７であることが好ましい。
酸処理後の試料含有液は、その容量の２０倍から１００倍の希釈液で希釈することが好ましく、その容量の２５倍から６０倍の希釈液で希釈することが更に好ましい。例えば、酸処理後の試料含有液が２００μＬである場合、５ｍＬ以上の純水、又はアンモニア等の揮発性で中性から塩基性の化合物を含む溶液を加えて希釈する。
酸処理後の試料含有液は、水、又はアンモニア等の揮発性で中性から塩基性の化合物を含む溶液を加えて希釈する。この希釈により酸の影響を軽減することで、乾固処理することなく、強酸性陽イオン交換樹脂と接触させることが可能となる。希釈するための水としては、純水を用いることが好ましい。純水としては、蒸留水、イオン交換水、ＲＯ水等が挙げられる。比抵抗値が18MΩ・cm以上の超純水を用いてもよい。希釈に、アンモニア等の揮発性で中性から塩基性の化合物を含む溶液を用いることもでき、当該希釈用液のｐＨは、２～７であることが好ましい。
酸処理後の試料含有液は、その容量の２０倍から１００倍の希釈液で希釈することが好ましく、その容量の２５倍から６０倍の希釈液で希釈することが更に好ましい。例えば、酸処理後の試料含有液が２００μＬである場合、５ｍＬ以上の純水、又はアンモニア等の揮発性で中性から塩基性の化合物を含む溶液を加えて希釈する。
酸処理後の試料含有液は、上述のように希釈により酸の影響を軽減した後、エバポレーター等により乾固処理することなく、強酸性陽イオン樹脂と接触させる精製工程に供される。以下、酸処理後の試料含有液を希釈したものを酸処理後の希釈液ともいう。
強酸性陽イオン交換樹脂による精製処理は、基本的には、通常の方法に従って行うことができる。強酸性陽イオン交換樹脂による精製処理は、通常、強酸性陽イオン交換樹脂に、酸処理後に希釈した試料を添加した後、該樹脂を洗浄し、その後、溶離液により該樹脂に吸着した物質を溶出させ、溶出液を回収することで実施される。
強酸性陽イオン交換樹脂による精製処理は、基本的には、通常の方法に従って行うことができる。強酸性陽イオン交換樹脂による精製処理は、通常、強酸性陽イオン交換樹脂に、酸処理後に希釈した試料を添加した後、該樹脂を洗浄し、その後、溶離液により該樹脂に吸着した物質を溶出させ、溶出液を回収することで実施される。
強酸性陽イオン交換樹脂としては、スルホン酸型強酸性陽イオン交換樹脂が好ましい。強酸性陽イオン交換樹脂は、市販品の強酸性陽イオン交換樹脂を使用することができる。例えば、ダイヤイオン（登録商標）ＵＢＫ－５５０、ダイヤイオン（登録商標）ＳＫ１Ｂ（三菱化学）、Ｏａｓｉｓ（商標）ＭＣＸ（日本ウォーターズ社）、ＳＴＲＡＴＡ（商標）Ｘ－Ｃ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）、アンバーライト（登録商標）ＩＲ１２０Ｂ、アンバーライト（登録商標）２００Ｃ、ダウエックス（登録商標）ＭＳＣ－１（Ｔｈｅ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）、デュオライトＣ２６（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ）、ＬＥＷＡＴＩＴ（登録商標）ＳＰ－１１２（ＬＡＮＸＥＳＳ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ＧｍｂＨ）等が好適に使用され得る。精製に使用する樹脂の量としては、例えば血清試料を用いる場合、血清試料１ｍＬに対して５０ｍｇ～３００ｍｇが好ましく、７０ｍｇ～１５０ｍｇがより好ましい。
強酸性陽イオン交換樹脂は、酸処理後の希釈液を添加する前に、予め洗浄しておくことが好ましい。例えば、樹脂量の５０倍容量以上の１００％メタノールを、試料を添加する前のカラムに通液させて洗浄することが好ましく、１００％メタノールの通液後、樹脂量の５０倍容量以上の純水を通液させて、該樹脂を平衡化させることも好ましい。
酸処理後の希釈液を強酸性陽イオン交換樹脂に添加する方法は特に限定されないが、例えば、強酸性陽イオン交換樹脂を充填したカラムに、酸処理後に希釈した液体を通液させればよい。酸処理後の希釈液は、例えば強酸性陽イオン交換樹脂を充填したカラムに滴下し、通液させる。通液の速度は、特に限定されないが、例えば減圧ポンプを用いた真空マニホールドを用いて１ｍＬ／３０秒以下が好ましい。カラムに添加した試料中のＡＧＥ等の目的物質は、強酸性陽イオン交換樹脂に吸着する。
次いで、目的物質が吸着した樹脂を洗浄する。洗浄は、希酸、例えば０．０５～０．２Ｎ塩酸溶液、または１．５～２．５質量％ギ酸溶液、または終濃度が上記濃度となる希酸とメタノールの等量混合溶液を添加し、カラムを通過させればよい。洗浄によりカラム中の夾雑物が除去されるので、その後の溶出処理により、目的物質を選択的に回収することが可能となる。
次いで、強酸性陽イオン交換樹脂に吸着させた試料を溶出させる。溶出処理に用いる溶離液としては、後の分析工程で行う質量分析装置に使用可能な有機溶媒を含む水溶液を基本とし、非酸性条件とするべく塩基性化合物をわずかに加えた溶離液を用いることが好ましい。より具体的には、ＬＣ－ＭＳ分析に用いる有機溶媒を２０質量％以上８０質量％以下含み、且つ塩基性化合物を１質量％以上７質量％以下含む水溶液を用いることが好ましい。ＬＣ－ＭＳ分析に用いる有機溶媒とは、アセトニトリル、メタノール等の、ＬＣ－ＭＳ分析において、液体クロマトグラフィーの移動相（以下、ＬＣの移動相ともいう）に用いられる有機溶媒のことであり、ＬＣの移動相として、アセトニトリルを主成分とするものを用いる場合は、溶離液に含まれる有機溶媒もアセトニトリルであることが好ましく、ＬＣの移動相として、メタノールを主成分とするものを用いる場合は、溶離液に含まれる有機溶媒もメタノールであることが好ましい。
前記塩基性化合物としては、例えば、アンモニア等が挙げられる。溶出処理用の溶離液に塩基性化合物を含ませることにより、樹脂に吸着したＡＧＥｓを溶出させることができる。塩基性化合物は、測定物質のイオンを妨害しない点から揮発性であることが好ましい。ここでいう、揮発性とは、室温でのイオン化の段階でも容易に気化する性質を有することをいう。
溶出溶液は、中性から塩基性であることが好ましく、ｐＨ７以上１３以下であることが好ましい。
溶離液の量や濃度は、試料や樹脂の種類によって最適化することができ、樹脂に吸着した目的物質が回収され、質量分析装置にて目的とするＡＧＥ構造が検出可能な量及び濃度とすることが好ましい。
溶出溶液は、中性から塩基性であることが好ましく、ｐＨ７以上１３以下であることが好ましい。
溶離液の量や濃度は、試料や樹脂の種類によって最適化することができ、樹脂に吸着した目的物質が回収され、質量分析装置にて目的とするＡＧＥ構造が検出可能な量及び濃度とすることが好ましい。
［濾過工程］
前記手順で得られた溶出液は、好ましくは更なる精製処理に供される。
前記手順で得られた溶出液は、そのまま液体クロマトグラフィー－質量分析法による分析（ＬＣ－ＭＳ分析）に用いることができるが、夾雑物質等の所望しない混入物を除去する目的で、前記手順で得られた溶出液に対して、濾過処理を施してもよい。濾過処理としては、例えば、遠心や減圧処理による精密濾過、又は限外濾過を行うことができる。
精密濾過で用いる濾過膜の孔径は、分析装置のカラム流路及び質量分析装置のイオン化部等に干渉する物質を除去する観点から、好ましくは０．４５μｍ以下、より好ましくは０．３μｍ以下、更に好ましくは０．２μｍ以下である。
前記手順で得られた溶出液は、好ましくは更なる精製処理に供される。
前記手順で得られた溶出液は、そのまま液体クロマトグラフィー－質量分析法による分析（ＬＣ－ＭＳ分析）に用いることができるが、夾雑物質等の所望しない混入物を除去する目的で、前記手順で得られた溶出液に対して、濾過処理を施してもよい。濾過処理としては、例えば、遠心や減圧処理による精密濾過、又は限外濾過を行うことができる。
精密濾過で用いる濾過膜の孔径は、分析装置のカラム流路及び質量分析装置のイオン化部等に干渉する物質を除去する観点から、好ましくは０．４５μｍ以下、より好ましくは０．３μｍ以下、更に好ましくは０．２μｍ以下である。
濾過工程で用いる限外濾過膜の分画分子量は、遊離体のＡＧＥ、特に修飾アミノ酸を通過させ、非遊離体のＡＧＥ、特に修飾アミノ酸以外の高分子化合物を除去する観点から、好ましくは１００００以下、より好ましくは５０００以下、更に好ましくは３０００以下である。精密濾過膜及び限外濾過膜としては市販のものも好ましく用いられ、例えば、精密濾過には、エキクロディスク１３ＣＲ（孔径０．２μｍ、日本ポール社）、ミニザルトＲＣ４（孔径０．２μｍ、ザルトリウス社）、マイレクスＬＧ（孔径０．２μｍ、メルクミリポア社）等のフィルターを用いることができ、限外濾過には、ナノセップＵＦ（分画分子量３Ｋ～３００Ｋ、日本ポール社）、ビバスピン５００（分画分子量３Ｋ～１０００Ｋ、ザルトリウス社）等のフィルターを用いることができる。使用するフィルターは、試料を溶解した溶媒に対して溶媒耐性を有するものを特に制限なく用いることができる。
［分析工程］
前記精製工程で得られた溶出液は、全画分をＡＧＥ分析用試料として使用してもよいが、目的物質の含有量の高い画分を選択的に回収してＡＧＥ分析用試料として使用することが好ましい。目的物質の含有量の高い画分は、標準溶液を用いてカラム精製を行い、経時的に分取した溶出液の各画分について目的物質の含有量を調べることによって、予め決定しておくことができる。
前記精製工程で得られた溶出液は、ＡＧＥ分析に適切な形態へと調製され、ＡＧＥ分析に供される。ＡＧＥ分析用試料は、ＡＧＥ分析の方法や使用する機器に応じて適宜調製し得る。
前記精製工程で得られた溶出液は、全画分をＡＧＥ分析用試料として使用してもよいが、目的物質の含有量の高い画分を選択的に回収してＡＧＥ分析用試料として使用することが好ましい。目的物質の含有量の高い画分は、標準溶液を用いてカラム精製を行い、経時的に分取した溶出液の各画分について目的物質の含有量を調べることによって、予め決定しておくことができる。
前記精製工程で得られた溶出液は、ＡＧＥ分析に適切な形態へと調製され、ＡＧＥ分析に供される。ＡＧＥ分析用試料は、ＡＧＥ分析の方法や使用する機器に応じて適宜調製し得る。
本発明の方法においては、前記の精製工程で得られた溶出液を、乾固処理することなくＬＣ－ＭＳ分析に供する。すなわち、本発明においては、前記の溶出処理に用いる溶離液として、ＬＣ－ＭＳ分析において液体クロマトグラフィーの移動相として用いられる有機溶媒を含むものを用いることによって、強酸性陽イオン交換樹脂から遊離した成分を含む溶出液を、乾固処理することなく、ＬＣ－ＭＳ分析に供することが可能である。
本発明におけるＡＧＥ分析の手法は、ＬＣ－ＭＳ分析である。すなわち、液体クロマトグラフィーと質量分析とを組み合わせたＬＣ－ＭＳ法によりＡＧＥの分析を行う。ＬＣ－ＭＳ法としては、ＬＣ－ＭＳ法、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ等法が挙げられる。検出感度をより向上させるためには、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法や、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ法などの液体クロマトグラフィー－タンデム型質量分析法がより好ましい。
ＬＣ－ＭＳ分析の液体クロマトグラフィーの移動相としては、前述した溶離液に含まれる有機溶媒を用いることが好ましい。溶離液に、アセトニトリルを含む水溶液を用いた場合の移動相、好ましくは最終条件の移動相としては、例えば、メタノールの水溶液やアセトニトリルの水溶液、アセトニトリルとトリフルオロ酢酸の混合水溶液、アセトニトリルとギ酸の混合水溶液などが挙げられる。
ＬＣ－ＭＳ分析計によりＡＧＥを測定する際の測定条件は、目的とするＡＧＥの種類や、機器の型、試料の状態等に応じて、当業者が通常の知識に基づいて適宜設定すればよい。液体クロマトグラフィーの条件は供される試料によって異なるが、例えば、８０体積％アセトニトリル＋０．１質量％ギ酸溶液に対しては、移動相にギ酸水溶液とギ酸アセトニトリル溶液でグラジエントを形成させると好ましい。質量分析計としては、二重収束磁場型質量分析計、イオントラップ型質量分析計、四重極型質量分析計などが挙げられるが、これらに限定されない。
上記手順で測定された試料中のＡＧＥに関する測定値を、同様の手順で測定された標準溶液からの測定値と比較することによって、生体試料由来のＡＧＥを定量することができる。具体的には、所定濃度のＡＧＥを含有する標準溶液からの測定結果に基づいて、検量線を作成する。検量線作成の際には、内部標準を用いて各測定値を校正しておくと、より精度の高い検量線が得られるため好ましい。
上述した本発明の好ましい実施形態によれば、高濃度の塩酸溶液で処理することによって、生体試料中の蛋白質が加水分解されるため、ＬＣ－ＭＳ分析によるＡＧＥの分析を高精度に行うことができる上に、酸処理後の酸除去のための乾固処理や強酸性陽イオン樹脂からの溶出液の乾固処理を不要とでき、ＬＣ－ＭＳ分析に供する試料の調整に要する工程や時間を大幅に軽減できる。斯かる効果が奏されることは、ＡＧＥの測定の臨床的な使用を容易とする。また酸処理後の乾固処理が不要であること等は、塩酸による装置の劣化を防止することも可能となり、ロボットにより前処理及び一連の分析処理を行うことも容易となる。
以下、実施例を基に本発明を更に詳述するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
ヒト血清５μＬに、蒸留水５μＬ及びそれらと等量（１０μＬ）のホウ酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍホウ酸、２ｍＭ ＤＴＰＡ、ｐＨ９．０）を添加し、更に水素化ホウ素ナトリウム溶液（２ｍＭ ＮａＢＨ４、０．１Ｎ ＮａＯＨ）を、該緩衝液の１／１０量（１μＬ）添加し、軽く撹拌し遠心した後、室温で４時間放置して還元処理を行った。
還元処理後、各ＡＧＥ及びＬｙｓｉｎｅの内部標準を添加し、６Ｎの無鉄塩酸を２００μＬ加え、１００℃で１８時間加熱し、加水分解を行った。
加水分解後、蒸留水によって１０ｍＬまで倍希釈したサンプルを、陽イオン交換カラムであるＳｔｒａｔａ－Ｘ－Ｃカラム(Phenomenex, Torrance, CA, USA)にアプライして分画を行なった。カラムは１ｍＬのＭｅＯＨにて洗浄後、１ｍＬの蒸留水で平衡化した後、サンプルを全量通過させた後、２％ギ酸３ｍＬで洗浄し、１％のアンモニアを含む２０％アセトニトリル１ｍＬで溶出した。溶出した画分を０．２μｍのポアフィルターによって濾過し、それをＡＧＥ分析用試料として、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ(TSQ Quantiva triple stage quadrupole mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)）にて測定を行った。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳのＬＣの移動相は、０．１％のギ酸を含む蒸留水と０．１％のギ酸を含むアセトニトリルを用いた。
ヒト血清５μＬに、蒸留水５μＬ及びそれらと等量（１０μＬ）のホウ酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍホウ酸、２ｍＭ ＤＴＰＡ、ｐＨ９．０）を添加し、更に水素化ホウ素ナトリウム溶液（２ｍＭ ＮａＢＨ４、０．１Ｎ ＮａＯＨ）を、該緩衝液の１／１０量（１μＬ）添加し、軽く撹拌し遠心した後、室温で４時間放置して還元処理を行った。
還元処理後、各ＡＧＥ及びＬｙｓｉｎｅの内部標準を添加し、６Ｎの無鉄塩酸を２００μＬ加え、１００℃で１８時間加熱し、加水分解を行った。
加水分解後、蒸留水によって１０ｍＬまで倍希釈したサンプルを、陽イオン交換カラムであるＳｔｒａｔａ－Ｘ－Ｃカラム(Phenomenex, Torrance, CA, USA)にアプライして分画を行なった。カラムは１ｍＬのＭｅＯＨにて洗浄後、１ｍＬの蒸留水で平衡化した後、サンプルを全量通過させた後、２％ギ酸３ｍＬで洗浄し、１％のアンモニアを含む２０％アセトニトリル１ｍＬで溶出した。溶出した画分を０．２μｍのポアフィルターによって濾過し、それをＡＧＥ分析用試料として、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ(TSQ Quantiva triple stage quadrupole mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)）にて測定を行った。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳのＬＣの移動相は、０．１％のギ酸を含む蒸留水と０．１％のギ酸を含むアセトニトリルを用いた。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定の条件は以下のとおりである。
（ＨＰＬＣ条件）
クロマトグラフィーカラム：SeQuant、ZIC-HILIC,150×2.1mm、5μm、200A Peek Hplc Column
カラム温度：４０℃
移動相：Ａ：０．１質量％ギ酸水溶液、Ｂ：０．１質量％ギ酸含有アセトニトリル溶液
グラジュエント条件：Ａ：１０％＋Ｂ：９０％
流速：２００μＬ／ｍｉｎ
インジェクション量：１０μＬ
分析時間：２０分
溶出時間：ＭＧ－Ｈ（約１２分）、ＣＭＡ（約１３分）、ＣＭＬ（約１２分）
（質量分析条件）
イオン化方法：Ｈ－ＥＳＩ
キャピラリー温度：３００℃
イオン化エネルギー：約３５００Ｖ（陽性イオン化時）
（検出ピーク（ｍ／ｚ））
Ｌｙｓｉｎｅ：１４７ｍ／ｚ→８４ｍ／ｚ
Ｌｙｓｉｎｅ ｄ６：１５３ｍ／ｚ→８９ｍ／ｚ
ＣＭＬ ：２０５ｍ／ｚ→１３０ｍ／ｚ
ＣＭＬ ｄ２：２０７ｍ／ｚ→１３０ｍ／ｚ
ＭＧ－Ｈ１ ：２２９ｍ／ｚ→１１４ｍ／ｚ
ＭＧ－Ｈ１ ｄ３：２３２ｍ／ｚ→１１７ｍ／ｚ
ＣＭＡ ：２３３ｍ／ｚ→１１６ｍ／ｚ又は１１８ｍ／ｚ
ＣＭＡ ｄ６：２３９ｍ／ｚ→１１９ｍ／ｚ又は１２１ｍ／ｚ
（ＨＰＬＣ条件）
クロマトグラフィーカラム：SeQuant、ZIC-HILIC,150×2.1mm、5μm、200A Peek Hplc Column
カラム温度：４０℃
移動相：Ａ：０．１質量％ギ酸水溶液、Ｂ：０．１質量％ギ酸含有アセトニトリル溶液
グラジュエント条件：Ａ：１０％＋Ｂ：９０％
流速：２００μＬ／ｍｉｎ
インジェクション量：１０μＬ
分析時間：２０分
溶出時間：ＭＧ－Ｈ（約１２分）、ＣＭＡ（約１３分）、ＣＭＬ（約１２分）
（質量分析条件）
イオン化方法：Ｈ－ＥＳＩ
キャピラリー温度：３００℃
イオン化エネルギー：約３５００Ｖ（陽性イオン化時）
（検出ピーク（ｍ／ｚ））
Ｌｙｓｉｎｅ：１４７ｍ／ｚ→８４ｍ／ｚ
Ｌｙｓｉｎｅ ｄ６：１５３ｍ／ｚ→８９ｍ／ｚ
ＣＭＬ ：２０５ｍ／ｚ→１３０ｍ／ｚ
ＣＭＬ ｄ２：２０７ｍ／ｚ→１３０ｍ／ｚ
ＭＧ－Ｈ１ ：２２９ｍ／ｚ→１１４ｍ／ｚ
ＭＧ－Ｈ１ ｄ３：２３２ｍ／ｚ→１１７ｍ／ｚ
ＣＭＡ ：２３３ｍ／ｚ→１１６ｍ／ｚ又は１１８ｍ／ｚ
ＣＭＡ ｄ６：２３９ｍ／ｚ→１１９ｍ／ｚ又は１２１ｍ／ｚ
〔比較例１〕
ヒト血清５μＬに蒸留水１５μＬ、等量（２０μＬ）のホウ酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍホウ酸、２ｍＭ ＤＴＰＡ、ｐＨ９．０）を添加し、水素化ホウ素ナトリウム溶液（２ｍＭ ＮａＢＨ４、０．１Ｎ ＮａＯＨ）を、該緩衝液の１／１０量（２μＬ）添加し、軽く撹拌し遠心した後、室温で４時間放置して還元処理を行った。還元処理後、各ＡＧＥ及びＬｙｓｉｎｅの内部標準を添加し、６Ｎの無鉄塩酸を１ｍＬ 加え、１００℃で１８時間加熱し、加水分解を行った。加水分解後、遠心濃縮により乾固させたサンプルを１ｍＬの蒸留水に溶解し、陽イオン交換カラムであるＳｔｒａｔａ－Ｘ－Ｃカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ， Ｔｏｒｒａｎｃｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて分画を行った。カラムは１ｍＬのＭｅＯＨにて洗浄後、１ｍＬの蒸留水で平衡化した後、サンプルを全量通過させ、２％ギ酸３ｍＬで洗浄、７％アンモニア３ｍＬで溶出した。溶出した画分を乾固し、０．１％ギ酸を含む２０％アセトニトリル１ｍＬにて溶解後、０．２μｍのポアフィルターによって濾過し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（TSQ Quantiva triple stage quadrupole mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)）にて測定した。
ヒト血清５μＬに蒸留水１５μＬ、等量（２０μＬ）のホウ酸ナトリウム緩衝液（０．２Ｍホウ酸、２ｍＭ ＤＴＰＡ、ｐＨ９．０）を添加し、水素化ホウ素ナトリウム溶液（２ｍＭ ＮａＢＨ４、０．１Ｎ ＮａＯＨ）を、該緩衝液の１／１０量（２μＬ）添加し、軽く撹拌し遠心した後、室温で４時間放置して還元処理を行った。還元処理後、各ＡＧＥ及びＬｙｓｉｎｅの内部標準を添加し、６Ｎの無鉄塩酸を１ｍＬ 加え、１００℃で１８時間加熱し、加水分解を行った。加水分解後、遠心濃縮により乾固させたサンプルを１ｍＬの蒸留水に溶解し、陽イオン交換カラムであるＳｔｒａｔａ－Ｘ－Ｃカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ， Ｔｏｒｒａｎｃｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）を用いて分画を行った。カラムは１ｍＬのＭｅＯＨにて洗浄後、１ｍＬの蒸留水で平衡化した後、サンプルを全量通過させ、２％ギ酸３ｍＬで洗浄、７％アンモニア３ｍＬで溶出した。溶出した画分を乾固し、０．１％ギ酸を含む２０％アセトニトリル１ｍＬにて溶解後、０．２μｍのポアフィルターによって濾過し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（TSQ Quantiva triple stage quadrupole mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)）にて測定した。
実施例１におけるＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる測定（分析）開始までの各工程の進行実績及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるＡＧＥ及びＬｙｓｉｎｅの測定（分析）結果を図１に示し、比較例１におけるＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる測定（分析）開始までの各工程の進行実績及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるＡＧＥ及びＬｙｓｉｎｅの測定（分析）結果を図２に示した。
図１（ｂ）に示すように、実施例１の方法によれば、各種のＡＧＥ及びＬｙｓｉｎｅの各ピークが明瞭に検出され、目的物質のピーク以外のピークやノイズの発生も僅かであった。また、図２（ａ）に示すように、比較例１の方法によれば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる測定（分析）開始までに４日間要したのに対して、図１（ａ）に示すように、実施例１の方法によれば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる測定（分析）開始までに２日のみ要しており、実施例の方法によれば、生体試料に含まれるＡＧＥの高感度な分析を可能であること、及び該分析に要する時間を大幅に短縮可能であることが判る。
図１（ｂ）に示すように、実施例１の方法によれば、各種のＡＧＥ及びＬｙｓｉｎｅの各ピークが明瞭に検出され、目的物質のピーク以外のピークやノイズの発生も僅かであった。また、図２（ａ）に示すように、比較例１の方法によれば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる測定（分析）開始までに４日間要したのに対して、図１（ａ）に示すように、実施例１の方法によれば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる測定（分析）開始までに２日のみ要しており、実施例の方法によれば、生体試料に含まれるＡＧＥの高感度な分析を可能であること、及び該分析に要する時間を大幅に短縮可能であることが判る。
Claims (4)
- 生体試料を塩酸溶液で処理する酸処理工程、酸処理後の試料含有液を強酸性陽イオン樹脂と接触させ、次いで溶離液で試料を溶出させて精製する精製工程、及び前記溶離液による溶出液をＬＣ－ＭＳ分析に供する分析工程を備える終末糖化産物の分析方法であって、
前記酸処理工程においては、終濃度が１～１２Ｎの塩酸溶液で処理し、
前記精製工程においては、酸処理後の試料含有液を水、又は揮発性で中性から塩基性の化合物を含む溶液で希釈し、該試料を含む酸処理後の希釈液を、乾固処理することなく前記強酸性陽イオン樹脂と接触させ、且つ、
前記溶離液として、前記ＬＣ－ＭＳ分析に用いる有機溶媒を２０質量％以上８０質量％以下含み、且つ塩基性化合物を１質量％以上７質量％以下含む水溶液を用いて溶出させ、
前記分析工程においては、前記精製工程で得られた溶出液を、乾固処理することなく前記ＬＣ－ＭＳ分析に供する、終末糖化産物の分析方法。 - 前記酸処理工程の前に、生体試料に対し、還元処理を施す工程を具備する、請求項１に記載の終末糖化産物の分析方法。
- 前記分析する終末糖化産物が、糖修飾アミノ酸である、請求項１又は２に記載の終末糖化産物の分析方法。
- 前記ＬＣ－ＭＳ分析が液体クロマトグラフィー－タンデム型質量分析法である、請求項１～３の何れか１項に記載の終末糖化産物の分析方法。
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|---|---|---|---|---|
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| JP2014119370A (ja) | 2012-12-18 | 2014-06-30 | Tokai Univ | 試料前処理方法 |
| WO2017033256A1 (ja) | 2015-08-24 | 2017-03-02 | 株式会社島津製作所 | 分取精製装置 |
| JP2017049024A (ja) | 2015-08-31 | 2017-03-09 | 学校法人東海大学 | 最終糖化産物分析のための試料の調製方法及び最終糖化産物の分析方法 |
| US20190285645A1 (en) | 2018-03-13 | 2019-09-19 | Korea Basic Science Institute | Mass spectrometry based bioinformatics platform for high-throughput identification of glycation proteins and advanced glycation end-products |
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2021
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