KR102283623B1 - 초음파 기법을 활용한 gc-ms 동시 분석 방법 - Google Patents

초음파 기법을 활용한 gc-ms 동시 분석 방법 Download PDF

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Abstract

초음파 기법을 활용한 GC-MS 분석 방법에 관한 것으로, GC-MS 분석 방법에 초음파 기법을 도입하여 서로 다른 여러 형태를 포함하는 기질을 동시에 유도체화함으로써, 유도체화 전처리 시간을 매우 단축할 수 있고, 공정을 단축화 하였으므로 경제적이며, 단일화된 기법을 통해 기질 간의 정량 오류 발생을 줄일 수 있으므로 우수한 GC-MS 분석 기법을 제공할 수 있다.

Description

초음파 기법을 활용한 GC-MS 동시 분석 방법{GC-MS simultaneous analysis method using ultrasonication system}
초음파 기법을 활용한 GC-MS 동시 분석 방법에 관한 기술이다.
GC-MS(gas chromatography mass spectrometry)는 기체 크로마토그래프와 질량분석기를 조합한 분석기법으로, 기체 크로마토그래피의 분리성과 정량성을 활용한 정보와 질량분석법에 의한 화합물의 구조에 관한 정보를 얻을 수 있다. GC-MS를 이용하여 저분자 대사체를 분석하기 위해서는 비휘발성 대사체를 휘발성 형태로 전환하거나, 검출 감도를 높이기 위하여 유도체화하는 과정이 필요하다. 종래 대사체의 유도체화는 서로 다른 형태의 유도체를 분자량, 크기 등에 따라 선택적으로 유도체화를 선정한 뒤 많은 시간을 들여 유도체화 하는 과정이 필요하였다.
특히, 해당과정(glycolysis) 및 TCA 회로(TCA cycle)의 대사체의 분석을 위해서는 각 대사체마다 온도와 시간을 다르게 설정하여 유도체화하는 과정이 필요하고, 유도체화 공정이 6시간 이상 소요되었으며, 단일화된 측정 기법이 존재하지 않아 대사체 간의 정량 오류가 발생하여, GC-MS의 대사체 분석에 현실적인 어려움이 있었다. 예를 들어 종래 해당과정 및 TCA 회로 대사체 분석을 위한 프로토콜은 80 ℃에서 2시간 동안 메틸화 반응을 한 다음, 해당과정 대사체 유도체화를 위한 60 ℃에서 2시간 동안 MSTFA(N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide) 유도체 시약 반응과 TCA 회로 대사체 유도체화를 위한 60 ℃에서 2시간 동안 MTBSTFA(N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide) 유도체 시약 반응을 분리된 공정으로 실시한 다음 GC/MS 분석하였다(비특허문헌 1. Metabolites 2018, 8, 95, Dynamic metabolic response to adriamycin-induced senescence in breast cancer cells). 이에, 본 발명자들은 상기의 문제점을 해결하기 위해, 종래의 선택적이었던 유도체화 반응을 동시에 처리함으로써 공정 시간을 단축하기 위한 연구를 한 결과 초음파 기법을 활용한 새로운 GC-MS 분석 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면에서의 목적은, 당, 펩타이드, 아미노산 또는 이들의 대사체의 GC-MS 분석을 위한 실릴 유도체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면에서의 목적은, GC-MS를 활용한 당, 펩타이드, 아미노산 또는 이들의 대사체의 분석 모듈 형성 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에서의 목적은, 당, 펩타이드, 아미노산 또는 이들의 대사체를 분석하기 위한 GC-MS 분석 기법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에서의 목적은, 당, 펩타이드, 아미노산 또는 이들의 대사체를 분석하기 위한 GC-MS 분석 장치를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명의 일 측면은, 당, 펩타이드, 아미노산 또는 이들의 대사체의 GC-MS 분석을 위한 실릴 유도체의 제조방법에 있어서,
상기 당, 펩타이드, 아미노산 및 이들의 대사체로부터 선택되는 2종 이상의 혼합체와 MTBSTFA(N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide)를 1차 반응시키는 단계; 및
상기 1차 반응 이후 MSTFA(N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide)와 2차 반응시키는 단계를 포함하며,
상기 1차 반응 및 2차 반응은 초음파 조사 하에 수행되는, 실릴 유도체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 측면은, 상기 실릴 유도체의 제조방법에 따라 실릴 유도체화 하는 단계;
실릴 유도체화된 2종 이상의 혼합체에 대한 GC-MS 분석 수행 단계; 및
상기 2종 이상의 혼합체에 대한 SIM(selected ion monitoring) 및 머무름 시간(retention time, RT) 정보를 획득하는 단계를 포함하는, GC-MS를 활용한 당, 펩타이드, 아미노산, 또는 이들의 대사체의 분석 모듈 형성 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은, 당, 펩타이드, 아미노산, 또는 이들의 대사체를 분석하기 위한 GC-MS 분석 기법으로서,
분석 대상 물질에 대해 상기 실릴 유도체의 제조방법에 따라 실릴 유도체화 하는 단계;
상기 실릴 유도체화된 물질에 대한 GC-MS 분석 수행 단계; 및
상기 GC-MS 분석 결과를 제10항의 분석 모듈과 비교하는 단계;를 포함하는, GC-MS 분석 기법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은, 당, 펩타이드, 아미노산, 또는 이들의 대사체를 분석하기 위한 GC-MS 분석 장치로서,
상기 실릴 유도체의 제조방법에 따라 실릴 유도체화하는 단계를 수행하기 위한 반응부와, 초음파 조사 수단이 구비된 장치가 일체화된 구성을 포함하는, GC-MS 분석 장치
기존의 유도체화 기법은 대사체에 따른 선택적 유도체화로 인해 다양한 비휘발성 유도체들을 한번에 분석하기 어려웠으나, 본 발명의 일 측면에서 제공하는 초음파 기법을 활용한 GC-MS 분석 모듈을 통해 유도체화 공정의 시간을 단축시키고, 한번에 여러 기질을 분석할 수 있으므로 공정을 단일화할 수 있으며, 단축된 유도체 시간을 통해 분석시간 내에 변할 수 있는 대사체 유동을 최대한 줄임으로써 기질 간의 정량 오류 발생을 줄일 수 있다.
도 1은 기질의 효과적인 GC-MS 분석과정의 전체 모식도를 나타내는 도면이다.
도 2는 실시예 1 내지 실시예 3 및 비교예 1의 글루코스의 농도별 GC-MS 분석한 결과(area)를 나타내는 도면이다.
도 3은 실시예 4 내지 실시예 7 및 비교예 2의 글루코스의 농도별 GC-MS 분석한 결과(area)를 나타내는 도면이다.
도 4는 실시예 4, 실시예 8 및 실시예 9의 글루코스의 농도별 GC-MS 분석한 결과(area)를 나타내는 도면이다.
도 5a는 시트르산염을 농도별로 MSTFA 시약으로 유도체화 하여 GC-MS 분석한 결과(area)를 나타내는 도면이고, 도 5b는 시트르산염을 농도별로 MTBSTFA 시약으로 유도체화 하여 GC-MS 분석한 결과(area)를 나타내는 도면이다.
도 6은 실시예 10 내지 실시예 12의 시트르산염의 농도별 GC-MS 분석한 결과(area)를 나타내는 도면이다.
도 7은 글루코스 및 시트르산염을 동시에 농도별로 GC-MS 분석한 결과(위)와 시트르산염을 단독으로 GC-MS 분석한 결과(아래)를 나타내는 도면이다.
도 8은 용해도가 다른 두 대사체 간의 최적 용매 설정 및 이를 통한 SPE 용출 시험을 한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9 내지 도 11은 해당과정과 TCA 회로의 모든 대사체를 혼합하여 유도체 후 농도 구배에 따른 해당과정 대사체의 정량곡선을 나타내는 도면이다.
도 12 내지 도 14는 야생형 특정 단백질 KO 마우스에 대한 해당과정 대사체를 정량 분석하여 비교한 결과를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
한편, 본 발명의 실시 형태는 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 '포함'한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
전술한 바와 같이, 종래 GC-MS 저분자 대사체 분석을 위해 비휘발성 대사체를 휘발성 형태로 유도체화 하는 과정에서 각 대사체에 따라 선택적으로 유도체화 시약이 선정되고, 유도체화 공정이 6시간 이상 소요됨에 따라 GC-MS를 이용한 대사체 분석에 현실적인 어려움이 있었다.
이러한 문제를 해결하기 위하여 연구하던 중, 본 발명자들은 대사체의 동시 유도체화를 통해 유도체 공정을 단일화 시키고, 초음파 유도체 촉매를 유도하여 유도체화 전처리를 기존 6시간 이상에서 1시간 이내로 단축시키는 동시에 공정을 단일화시키는 방법을 확인하였다.
본 발명의 일 측면은, 당, 펩타이드, 아미노산, 또는 이들의 대사체의 GC-MS 분석을 위한 실릴 유도체의 제조방법에 있어서,
상기 당, 펩타이드, 아미노산, 및 이들의 대사체로부터 선택되는 2종 이상의 혼합체와 MTBSTFA(N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide)를 1차 반응시키는 단계; 및
상기 1차 반응 이후 MSTFA(N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide)와 2차 반응시키는 단계를 포함하며,
상기 1차 반응 및 2차 반응은 초음파 조사하에 수행되는, 실릴 유도체의 제조방법을 제공한다.
이때, 상기 당은 6탄당, 5탄당, 4탄당 및 3탄당에서 선택되는 것이고;
상기 아미노산은 α-아미노산 및 β-아미노산에서 선택되는 것이고; 및
상기 펩타이드는 분자량 1000 g/mol 이하인 것일 수 있다.
상기 아미노산은 천연 아미노산, 합성 아미노산일 수도 있고, α-아미노산은 글라이신(Glycine), 알라닌(Alanine), 세린(Serine), 트레오닌(Threonine), 시스테인(Cysteine), 발린(Valine), 류신(Leucine), 아이소류신(Isoleucine), 메티오닌(Methionine), 프롤린(Proline), 페닐알라닌(Phenylalanine), 타이로신(Thyrosine), 트립토판(Tryptophan), 아스파르트산(Aspartic acid), 글루탐산(Glutamic acid), 아스파라진(Asparagine), 글루타민(Glutamine), 히스티딘(Histidine), 리신(Lysine), 아르지닌(Arginine)을 포함한다.
상기 1차 반응 및 2차 반응은 0 ℃ 내지 70 ℃의 온도범위에서 수행될 수 있는데, 10 ℃ 내지 50 ℃의 온도범위에서도 수행될 수 있고, 20 ℃ 내지 40 ℃의 온도범위에서도 수행될 수 있고, 20 ℃ 내지 30 ℃의 온도범위 또는 상온에서도 수행될 수 있다.
상기 1차 반응시간 및 2차 반응 시간은 각각 5분 내지 120분 동안 수행할 수 있고, 10분 내지 110분 동안 수행할 수도 있고, 15분 내지 100분 동안 수행할 수도 있고, 20분 내지 90분 동안 수행할 수도 있고, 30분 내지 80분 동안 수행할 수도 있고, 30분 내지 70분 동안 수행할 수도 있고, 30분 내지 60분 동안 수행할 수도 있고, 10분 내지 20분 동안 수행할 수도 있고, 10분 내지 30분 동안 수행할 수도 있고, 10분 내지 60분 동안 수행할 수도 있고, 5분 내지 60분 동안 수행할 수도 있고, 20분 내지 60분 동안 수행할 수도
상기 당, 펩타이드, 아미노산 및 이들의 대사체로부터 선택되는 2종 이상의 혼합체는 소정의 분자량 이하 물질과 이상 물질의 혼합체이다.
이때, 상기 소정의 분자량은 150 g/mol 내지 200 g/mol의 범위에서 선택될 수 있고, 또는 160 g/mol 내지 200 g/mol의 범위, 170 g/mol 내지 190 g/mol의 범위에서 선택될 수 있고, 또는 바람직하게는 180 g/mol일 수 있다.
상기 혼합체는 글루코스(glucose) 및 글루코스의 생체 내 대사체를 포함한다.
상기 글루코스의 생체 내 대사체는 해당과정 대사체 및 TCA 회로 대사체로부터 선택되는 1종 이상일 수 있는데,
상기 해당과정 대사체는, 글루코스-6-인산(glucose-6-phosphate), 프룩토스-6-인산(fructose-6-phosphate), 프룩토스-1,6-이인산(fructose-1,6-bisphosphate), 글리세르알데하이드-3-인산(glyceraldehyde-3-phosphate), 다이하이드록시아세톤인산(dihydroxyacetone phosphate), 1,3-비스포스포글라이세레이트(1,3-bisphosphoglycerate), 3-포스포글라이세레이트(3-phosphoglycerate), 2-포스포글라이세레이트(2-phosphoglycerate), 포스포에놀피루브산(phosphoenol pyruvate), 피루브산(pyruvate) 및 락테이트(lactate)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사체 또는 그 염이고,
상기 TCA 회로 대사체는, 시트르산염(citrate), 시스아코니틴산(cis-aconitic acid), 아이소시트르산염(iso-citrate), 케토글루타르산(ketoglutaric acid), 석신산염(succinate), 푸마르산(fumaric acid), 말산(malic acid) 및 옥살로아세테이트(oxaloacetate)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 대사체 또는 그 염이다.
상기 당 대사체는 예를 들어 카르복실기, 아미노기, 하이드록시기로부터 선택된 하나 이상의 기가 치환된 당 대사체일 수 있고, 분자량은 1000 g/mol 이하일 수 있고, 900 g/mol 이하, 800 g/mol 이하일 수 있고, 700 g/mol이하, 600 g/mol 이하일 수 있고, 바람직하게는 500 g/mol 일 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은, 상기 당, 펩타이드, 아미노산 또는 이들의 대사체의 GC-MS 분석을 위한 실릴 유도체의 제조방법에 따라 실릴 유도체화 하는 단계;
실릴 유도체화된 2종 이상의 혼합체에 대한 GC-MS 분석 수행 단계; 및
상기 2종 이상의 혼합체에 대한 SIM(selected ion monitoring) 및 머무름 시간(retention time, RT) 정보를 획득하는 단계를 포함하는, GC-MS를 활용한 당, 펩타이드, 아미노산 또는 이들의 대사체의 분석 모듈 형성 방법을 제공한다.
이때, 상기 2종 이상의 혼합체는 구조 및 농도가 정해진 표준물질의 혼합체일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면은, 당, 펩타이드, 아미노산 또는 이들의 대사체를 분석하기 위한 GC-MS 분석 기법으로서,
분석 대상 물질에 대해 상기 당, 펩타이드, 아미노산 또는 이들의 대사체의 GC-MS 분석을 위한 실릴 유도체의 제조방법에 따라 실릴 유도체화 하는 단계;
상기 실릴 유도체화된 물질에 대한 GC-MS 분석 수행 단계; 및
상기 GC-MS 분석 결과를 제10항의 분석 모듈과 비교하는 단계;를 포함하는, GC-MS 분석 기법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은, 당, 펩타이드, 아미노산 또는 이들의 대사체를 분석하기 위한 GC-MS 분석 장치로서,
상기 당, 펩타이드, 아미노산 또는 이들의 대사체의 GC-MS 분석을 위한 실릴 유도체의 제조방법에 따라 실릴 유도체화하는 단계를 수행하기 위한 반응부와, 초음파 조사 수단이 구비된 장치가 일체화된 구성을 포함하는, GC-MS 분석 장치를 제공한다(도 1).
이때, 상기 GC-MS 분석 장치는 상기 반응부에 대한 항온 수단을 더 포함할 수도 있고, 상기 항온 수단은 반응부에 버블을 공급하는 버블 형성장치일 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예 및 실험예를 하기에 구체적으로 예시하여 설명한다. 다만, 후술하는 실시예 및 실험예는 본 발명의 일부를 예시하는 것일 뿐, 본 발명에 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 초음파 기법을 활용한 글루코스(glucose)의 GC-MS 분석
글루코스의 MSTFA 유도체화 반응에 있어, 초음파 기법의 효과를 확인하기 위하여, 다음과 같이 실험하였다. 글루코스 0.5, 1, 2 mM을 2 mL 유리바이얼에서 30% EtOH에 용해시킨 다음, 30% EtOH로 SPE 컬럼(ODS)으로 분리하고 Speed Vac. system으로 건조시켰다. 그 다음 글루코스를 80 ℃에서 2시간 동안 동일하게 메틸화 반응을 한 다음, 비교예 1은 기존의 방법대로 60 ℃에서 30분 동안 MSTFA 유도체화 하였으며, 실시예 1 내지 3은 온도는 설정하지 않고 초음파 기법을 활용하여 각각 10분, 20분, 30분 동안 MSTFA 유도체화 한 다음, GC-MS 분석하였다. 비교예 1 및 실시예 1 내지 3의 실험 조건은 아래와 같다.
비교예 1: 80 ℃. 2시간, 메틸화반응 + 60 ℃, 30분, MSTFA 유도체화
실시예 1: 80 ℃. 2시간, 메틸화반응 + 초음파, 상온, 10분, MSTFA 유도체화
실시예 2: 80 ℃. 2시간, 메틸화반응 + 초음파, 상온, 20분, MSTFA 유도체화
실시예 3: 80 ℃. 2시간, 메틸화반응 + 초음파, 상온, 30분, MSTFA 유도체화
상기 비교예 1 및 실시예 1 내지 실시예 3의 조건에서 글루코스를 메틸화반응 및 MSTFA 유도체화한 결과를 도 2에 나타내었다.
그 결과, 도 2에서도 알 수 있듯이 기존의 방법처럼 글루코스를 60 ℃의 온도처리를 하지 않고도, 10분의 초음파 처리만으로 기존의 방법처럼 MSTFA 유도체화되는 것을 확인하였다.
<실시예 2> 초음파 기법을 활용한 글루코스(glucose)의 GC-MS 분석
글루코스의 메틸화반응 및 MSTFA 유도체화 반응에 있어, 초음파 기법을 이용한 메틸화반응의 효과를 확인하기 위하여, 아래와 같은 조건으로 실험하였다.
2-1. 30분 내지 120분의 초음파 처리
실시예 2-1에서는 초음파 처리를 30분 내지 120분 하였을 때의 메틸화반응의 효과를 확인하기 위하여, 다음과 같이 실험하였다. 글루코스 0.5, 1, 2 mM을 유리바이얼에서 30% EtOH에 용해시킨 다음, 30% EtOH로 SPE 컬럼(ODS)으로 분리하고 Speed Vac. system으로 건조시켰다. 그 다음 MSTFA 유도체화는 모두 동일하게 10분 동안 초음파 처리하고, 비교예 2는 메틸화 반응을 기존의 방법처럼 글루코스를 80 ℃에서 2시간 동안 메틸화 반응하였으며, 실시예 4 내지 실시예 7은 온도는 설정하지 않고 초음파 기법을 활용하여 각각 30분, 60분, 90분, 120분 동안 메틸화반응한 다음, GC-MS 분석하였다. 비교예 2 및 실시예 4 내지 실시예 7의 실험 조건은 아래와 같다.
비교예 2: 0 ℃. 2시간, 메틸화반응 + 초음파, 상온, 10분, MSTFA 유도체화
실시예 4: 초음파, 30분, 메틸화반응 + 초음파, 상온, 10분, MSTFA 유도체화
실시예 5: 초음파, 60분, 메틸화반응 + 초음파, 상온, 10분, MSTFA 유도체화
실시예 6: 초음파, 90분, 메틸화반응 + 초음파, 상온, 10분, MSTFA 유도체화
실시예 7: 초음파, 120분, 메틸화반응 + 초음파, 상온, 10분, MSTFA 유도체화
상기 비교예 2 및 실시예 4 내지 실시예 7의 조건에서 글루코스를 메틸화반응 및 MSTFA 유도체화한 결과를 도 3에 나타내었다.
그 결과, 도 3에서도 알 수 있듯이 기존의 방법처럼 글루코스를 0 ℃의 온도처리를 하지 않고도, 30분의 초음파처리만으로 기존의 방법처럼 메틸화반응할 수 있는 것을 확인하였다.
2-2. 10분 내지 30분의 초음파 처리
실시예 2-2에서는 초음파 처리를 10분 내지 30분 하였을 때의 메틸화반응의 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 2-1의 실험 방법에서 초음파 시간만 바꾸어 실험하였다. 실시예 4, 실시예 8 및 실시예 9의 실험 조건은 아래와 같다.
실시예 8: 초음파, 10분, 메틸화반응 + 초음파, 상온, 10분, MSTFA 유도체화
실시예 9: 초음파, 20분, 메틸화반응 + 초음파, 상온, 10분, MSTFA 유도체화
실시예 4: 초음파, 30분, 메틸화반응 + 초음파, 상온, 10분, MSTFA 유도체화
상기 실시예 4, 실시예 8 및 실시예 9의 조건에서 글루코스를 메틸화반응 및 MSTFA 유도체화한 결과를 도 4에 나타내었다.
그 결과, 상기 실시예 2-1에서의 실험 조건인 30분 동안 초음파 처리하여 메틸화반응하는 조건보다 시간을 더 단축시킨 10분(실시예 8)에서도 충분히 유도체화가 되는 것을 확인하였다.
<실시예 3> 초음파 기법을 활용한 시트르산염(citrate)의 GC-MS 분석
3-1. 시트르산염의 MSTFA 및 MTBSTFA 유도체화 비교
초음파 기법을 활용한 시트르산염의 유도체화 효율성을 실험하기에 앞서, 유도체 시약 MSTFA 및 MTBSTFA에 의한 유도체화를 실시하여 더 높은 GC-MS 시그널을 보여주는 시약을 선택하였다. 그 결과를 도 5a 및 도 5b에 나타내었다. 실험 결과, 시트르산염의 유도체화는 MSTFA 및 MTBSTFA가 모두 가능하나, MTBSTFA가 더 높은 GC-MS 시그널을 보여주는 것을 확인하였다. 이에, TCA cycle 내 대사체 분석은 MTBSTFA가 더 좋다고 판단하였다.
3-2. 초음파 기법을 활용한 시트르산염의 MTBSTFA 유도체화
시트르산염의 MTBSTFA 유도체화 반응에 있어, 초음파 기법의 효과를 확인하기 위하여, 다음과 같이 실험하였다. 시트르산염 1.25, 2.5, 5 mM을 2 mL 유리바이얼에서 30% EtOH에 용해시킨 다음, 30% EtOH로 SPE 컬럼(ODS)으로 분리하고 Speed Vac. system으로 건조시켰다. 실시예 10 내지 실시예 12에서 시트르산염을 각각 10분, 20분, 30분 동안 MTBSTFA 유도체화 한 다음, GC-MS 분석하였다. 실시예 10 내지 12의 실험 조건은 아래와 같다.
실시예 10: 초음파, 상온, 10분, MTBSTFA
실시예 11: 초음파, 상온, 20분, MTBSTFA
실시예 12: 초음파, 상온, 30분, MTBSTFA
상기 실시예 10 내지 실시예 12의 조건에서 시트르산염을 MTBSTFA 유도체화한 결과를 도 6에 나타내었다.
그 결과, 도 6에서도 알 수 있듯이 초음파 처리를 10분만 하여도 기존의 결과처럼 GC-MS 시그널 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.
<실시예 4> 초음파 기법을 활용한 글루코스 및 시트르산염의 동시 GC-MS 분석
초음파 기법을 활용하여 두가지 형태의 대사체인 글루코스와 시트르산염을 동시에 유도체화할 수 있는지를 확인하기 위하여, 다음과 같이 실험하였다. 글루코스 0.5, 1, 2 mM와 시트르산염 1.25, 2.5, 5 mM을 2 mL 유리바이얼에서 30% EtOH에 같이 용해시킨 다음, 30% EtOH로 SPE 컬럼(ODS)으로 분리하고 Speed Vac. system으로 건조시켰다. 그 다음 10분 동안 초음파 처리하여 메틸화반응하는 단계, 10분 동안 초음파 처리하여 MTBSTFA 유도체화하는 단계, 10분 동안 초음파 처리하여 MSTFA 유도체화 하는 단계를 거친 다음, GC-MS 분석하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
글루코스와 시트르산염을 동시에 유도체화 하여 GC-MS 분석한 도 7을 확인하면, 초음파 기법을 사용하면 서로 다른 형태의 두 대사체를 동시에 분석하는 것이 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 5> 서로 다른 두 대사체의 용매에 따른 GC-MS 분석
다른 용해도를 보이는 두 가지의 대사체의 전처리 기법을 확립하기 위하여, 0%, 30%, 50%, 100% EtOH에 글루코스+푸마르산염을 용해한 후 SPE 컬럼(ODS)으로 분리하고 Speed Vac. system으로 건조시켰다. 그 다음 10분 동안 초음파 처리하여 메틸화반응하는 단계, 10분 동안 초음파 처리하여 MTBSTFA 유도체화하는 단계, 10분 동안 초음파 처리하여 MSTFA 유도체화 하는 단계를 거친 다음, GC-MS 분석하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
그 결과, 30% EtOH에서 용해도가 다른 대사체가 모두 검출되는 것으로 보아, 대사체 추출의 조건에 있어서 30% EtOH를 통해 SPE 컬럼을 용출시키는 것이 가장 적절한 것을 확인하였다.
<실시예 6> 해당과정(glycosis) 및 TCA 회로(TCA cycle) 대사체 표준물질의 동시 GC-MS 분석
해당과정 및 TCA 회로 대사체 표준물질을 동시에 GC-MS 분석하기 위한 모듈을 형성하기 위하여 해당과정 및 TCA 회로 대사체의 혼합체를 유리바이얼에서 30% EtOH에 같이 용해시킨 다음, 30% EtOH로 SPE 컬럼(ODS)으로 분리하고 Speed Vac. system으로 건조시켰다. 그 다음 10분 동안 초음파 처리하여 메틸화반응하는 단계, 10분 동안 초음파 처리하여 MTBSTFA 유도체화하는 단계, 10분 동안 초음파 처리하여 MSTFA 유도체화 하는 단계를 순차적 거친 다음, GC-MS 분석하였다. 이를 분석하여 얻는 SIM(selected ion monitoring) 및 머무름 시간(retention time, RT) 정보를 하기 표 1에 나타내었다.
다음으로, 해당과정 및 TCA 회로 대사체의 혼합체를 상기와 같은 방법으로 GC-MS 분석하고, 하기 표 1과 같이 얻은 정보와 비교한 결과, 해당과정 및 TCA 회로의 대사체를 동시에 분석하여 도 9 내지 도 11과 같은 정보를 얻을 수 있었다. 이를 통해, 본 발명에 따른 GC-MS를 활용한 글루코스 및 대사체의 동시 분석 모듈을 활용하여 대사체의 혼합물을 동시에 분석할 수 있는 것을 확인하였다.
Name SIM RT
Glucose 361 14.918
Phosphoglyceric acid 585 16.9
D-fructose-1,6-bisphosphate 267 17.2
D-fructose-6-phosphate 341 17.98
Dihydroxyacetone 484 15.856
DL-glyceraldehyde 269 14.537
Glucose-6-phosphate 471 17.39
Lactic acid 261 11.425
Phosphoenolpyruvate 145 8.327
Pyruvate 174 9.737
Citrate 591 16.857
cis-Aconitic acid 459 15.934
Iso-citrate 591 16.905
α-Ketoglutaric acid 346 14.273
Succinate 289 12.996
Fumarate 419 14.756
Malate 419 14.756
Oxaloacetate 262 11.691
Glutamine 300 13.995
Glutamic acid 318 14.183
<실시예 7> 동물 조직 내 해당과정(glycolysis) 및 TCA cycle 대사체의 동시 GC-MS 분석
High Fat diet를 3주간 처리한 마우스 근육 조직을 적출한 후, 액체 질소에 바로 동결하고 15~20 mg을 무게로 적정하여 tissue lyser을 통해 0, 100% EtOH로 각각 추출하여 합친 후, 30% EtOH로 SPE 컬럼으로 추출물을 용출시켰다. 용출된 추출물을 Speed back을 통해 건조시킨 후 10분 동안 초음파 처리하여 메틸화 반응하는 단계, 10분 동안 초음파 처리하여 MTBSTFA 유도체화하는 단계, 10분 동안 초음파 처리하여 MSTFA 유도체화 하는 단계를 거친 후, 각 대사체에 대한 정량 곡선에 대비하여 농도를 계산하여 도 12 내지 도 14에 나타내었다.
이상, 본 발명을 바람직한 제조예, 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명하였으나, 본 발명의 범위는 특성 실시예에 한정되는 것은 아니며, 첨부된 특허청구범위에 의하여 해석되어야 할 것이다. 또한, 이 기술분야에서 통상의 지식을 습득한 자라면, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서도 많은 수정과 변형이 가능함을 이해하여야 할 것이다. 또한, 본 발명에 의해 제공되는 각 기질(대사체)에 대한 GC-MS fragment 대표 질량(mass)는 향후 이를 활용하여 제공되는 데이터 베이스 및 관련 프로그램 및 장치 개발 모든 범위에 해당된다.

Claims (14)

  1. 글루코스 및 이의 대사체 혼합물의 GC-MS 분석을 위한 실릴 유도체의 제조방법에 있어서,
    상기 혼합물을 메틸화시키는 단계;
    상기 메틸화시킨 혼합물과 MTBSTFA(N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide)를 1차 반응시키는 단계; 및
    상기 1차 반응 이후 MSTFA(N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide)와 2차 반응시키는 단계;를 포함하며,
    상기 1차 반응 및 2차 반응은 초음파 조사 하에 상온에서 수행되며,
    상기 글루코스의 대사체는 해당과정 대사체 및 TCA 회로 대사체를 포함하며,
    상기 해당과정 대사체는, 글루코스-6-인산(glucose-6-phosphate), 프룩토스-6-인산(fructose-6-phosphate), 프룩토스-1,6-이인산(fructose-1,6-bisphosphate), 글리세르알데하이드-3-인산(glyceraldehyde-3-phosphate), 다이하이드록시아세톤인산(dihydroxyacetone phosphate), 1,3-비스포스포글라이세레이트(1,3-bisphosphoglycerate), 3-포스포글라이세레이트(3-phosphoglycerate), 2-포스포글라이세레이트(2-phosphoglycerate), 포스포에놀피루브산(phosphoenol pyruvate), 피루브산(pyruvate) 및 락테이트(lactate)를 포함하고,
    상기 TCA 회로 대사체는, 시트르산염(citrate), 시스아코니틴산(cis-aconitic acid), 아이소시트르산염(iso-citrate), 케토글루타르산(ketoglutaric acid), 석신산염(succinate), 푸마르산(fumaric acid), 말산(malic acid) 및 옥살로아세테이트(oxaloacetate)를 포함하는, 실릴 유도체의 제조방법.
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  10. 제1항에 기재된 글루코스 및 이의 대사체의 혼합물이되, 구조 및 농도가 정해진 표준물질의 혼합물을 대상으로 제1항의 방법에 따라 실릴 유도체화 하는 단계;
    실릴 유도체화된 2종 이상의 혼합체에 대한 GC-MS 분석 수행 단계; 및
    상기 2종 이상의 혼합체에 대한 SIM(selected ion monitoring) 및 머무른 시간(retention time, RT) 정보를 획득하는 단계를 포함하는, GC-MS를 활용한 글루코스 및 이의 대사체의 분석 모듈 형성 방법.
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  12. 제1항에 기재된 글루코스 및 이의 대사체의 혼합물을 분석하기 위한 GC-MS 분석 기법으로서,
    제1항에 기재된 글루코스 및 이의 대사체의 혼합물을 포함하는 분석 대상 물질에 대해 제1항의 방법에 따라 실릴 유도체화 하는 단계;
    상기 실릴 유도체화된 물질에 대한 GC-MS 분석 수행 단계; 및
    상기 GC-MS 분석 결과를 제10항의 분석 모듈과 비교하는 단계;를 포함하는, GC-MS 분석 기법.
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