CN113358760A - 基于固定化金属离子亲和色谱法富集实现血浆中d-二聚体定量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于固定化金属离子亲和色谱法(immobilized metal affinity chromatography,IMAC)富集实现对血浆中D‑二聚体质谱定量的方法。取D‑二聚体血浆样品,酶解得到血浆蛋白酶解液,使用IMAC富集酶解液中D‑二聚体蛋白特异性的交联肽段,最后使用液相色谱‑质谱联用仪进行鉴定和后续定量。由于D‑二聚体结构中特异性的交联肽段氨基酸序列中含有4个组氨酸,可以和金属离子形成强的配位相互作用,使用该方法可以有效地将其进行富集,从而降低D‑二聚体样品的复杂性,提高其在质谱检测中的灵敏度。该方法可以实现完全不依赖抗体对血浆中D‑二聚体检测定量,具有潜在的临床使用价值。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质组学研究方向复杂生物样品生物标志物检测定量预处理方法技术领域,具体涉及将固定化金属离子亲和色谱富集方法用于血栓类疾病标志物D-二聚体的质谱检测和定量。
背景技术
作为血液凝结中交联纤维蛋白原水解的重要产物(文献1.Weisel,J.W.,Fibrinogen and fibrin.Advances in protein chemistry,2005.70:p.247-299.),D-二聚体是不同血栓类疾病的重要疾病标志物,比如静脉血栓栓塞(venous thromboembolism)(包括深静脉血栓和肺栓塞)和弥散性血管内凝血(disseminated intravascularcoagulation)(文献2.Kyrle,P.A.and S.Eichinger,Deep vein thrombosis.Lancet,2005.365(9465):p.1163-1174.文献3.Goldhaber,S.Z.and H.Bounameaux,Pulmonaryembolism and deep vein thrombosis.Lancet,2012.379(9828):p.1835-1846.文献4.Voves,C.,W.A.Wuillemin,and S.Zeerleder,International Society on Thrombosisand Haemostasis score for overt disseminated intravascular coagulationpredicts organ dysfunction and fatality in sepsis patients.Blood Coagulation&Fibrinolysis,2006.17(6):p.445-451.)。在凝血级联过程中,首先凝血酶对纤维蛋白原的酶切会使其形成纤维蛋白,并迅速通过非共价相互作用整齐的排列在一起,然后通过XIIIa因子催化这些纤维蛋白的D区域就会通过赖氨酸和谷氨酰胺氨基酸残基形成的异肽键共价交联在一起,最后通过纤溶酶水解,产生一些列纤维蛋白原水解产物(fibrin degradationproducts,FDPs),其中含有交联的D区域的被称为D-二聚体。作为交联的纤维蛋白的特异性产物,D-二聚体可以表明纤维蛋白的水解程度,因而可以作为不同血栓类疾病的疾病标志物,在临床疾病诊断中具有中要意义。
尽管D-二聚体是临床疾病诊断中一个重要的疾病标志物,但是目前仍然缺乏能够使D-二聚体定量标准化的方法。因为不同水解程度的纤维蛋白产生的D-二聚体具有内在的不均一性,目前常用的基于抗体的检测方法往往因为其识别的表位不同从而检测结果不一致,不同医院使用的不同的D-二聚体检测试剂盒往往具有不同的检测结果和诊断截断值,这使得发展一种不依赖于抗体的D-二聚体检测定量方法非常有必要,这将对促进D-二聚体方法标准化具有重要意义(文献5.Adam,S.S.,N.S.Key,and C.S.Greenberg,D-dimerantigen:current concepts and future prospects.Blood,2009.113(13):p.2878-87.文献6.Kahler,Z.P.and J.A.Kline,Standardizing the D-dimer Assay:Proposing the D-dimer International Managed Ratio.Clin Chem,2015.61(5):p.776-8.)。
通过D-二聚体的形成过程,我们可以发现在D-二聚体γ链C末端由XIIIa因子催化交联的交联肽段是特异性区分其他纤维蛋白水解产物和非交联的纤维蛋白原水解产物的唯一肽段(文献7.Wang,W.,et al.,Quantification of circulating D-dimer bypeptide immunoaffinity enrichment and tandem mass spectrometry.Anal Chem,2012.84(15):p.6891-8.),使用该肽段代表D-二聚体蛋白对其进行定量具有很好的特异性并且可以很好地解决D-二聚体内在的不均一性问题。
固定化金属离子亲和色谱(Immobilized Metal Affinity Chromatography,IMAC)的概念最早是在1975年由Porath等人提出,是将过渡金属离子通过配体螯合在固相基质上,通过过渡金属离子与靶分子的组氨酸或半胱氨酸特异性结合形成相对稳定的复合物,最后以竞争性洗脱方式实现靶分子的富集与纯化。在与金属离子相互作用时,氨基酸中的α-氨基和α-羧基,以及某些氨基酸侧链基团含有孤对电子的活性原子都能参与螯合作用,由于氨基酸的种类、数量、位置和空间构象不同,因而与金属配基的亲和力不同,可选择性地加以分离纯化,通过调节溶液pH值、添加竞争性洗脱剂(如咪唑等)将靶分子从亲和基质上洗脱。根据软硬酸碱理论,常用于含有组氨酸肽段或者蛋白的分离富集的金属离子有Zn(II),Cu(II),Ni(II),和Co(II)。
本发明正是以质谱检测D-二聚体蛋白特异性的交联肽段对样品中的D-二聚体蛋白检测和定量为基础,根据该交联肽段的氨基酸序列中含有4个组氨酸,和金属离子具有强的配位相互作用,通过固定化金属离子亲和色谱法富集血浆酶解液中的D-二聚体交联肽段,从而有效地降低D-二聚体样品的复杂程度,提高质谱检测的灵敏度,实现使用质谱对血浆中的D-二聚体蛋白进行定量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、快速实现血栓类疾病标志物D-二聚体在质谱中高灵敏度检测定量的方法。
本发明提供的方法是血浆样品酶解液中,D-二聚体蛋白特异性的交联肽段中含有4个组氨酸,利用金属离子与组氨酸之间的配位相互作用,使用IMAC对该交联肽段进行特异性富集,结合液相色谱-质谱联用仪实现对D-二聚体蛋白的定量。
本发明采用如下技术方案:
(1)取D-二聚体血浆样品,变性酶解;
(2)步骤(1)获得肽段溶液中添加稳定同位素标记的重标交联肽段;
(3)让步骤(2)中的混合肽段溶液在上样缓冲液中和使用上样缓冲液平衡好的IMAC微球进行结合;
(4)使用上样缓冲液反复清洗步骤(3)中的IMAC微球,除去不含组氨酸和含一个或者两个组氨酸的肽段;
(5)使用洗脱缓冲液将步骤(4)中结合的肽段洗脱下来;
(6)除盐和后续质谱检测和定量。
1.步骤(1)中的变性为蛋白质组学中常用的还原烷基化过程。
2.步骤(2)中所述的稳定同位素标记的重标交联肽段和目标内源性D-二聚体特异性的交联肽段氨基酸序列完全相同,其中一些元素被稳定同位素取代。
3.步骤(1)中可以使用不同酶解方式进行酶解,如果使用溶液酶解方法要求使用C18固相萃取柱除去溶液中的小分子然后冻干,如果使用超滤辅助酶解要求后续酶解液浓缩到50μL以内。
4.步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)中使用的IMAC材料中的金属离子为可以和组氨酸中的咪唑基团相互作用的镍离子、铜离子、锌离子或者钴离子。
5.步骤(3)、步骤(4)中的上样缓冲液可以根据选用的不同固定化金属离子适当加入低浓度的竞争洗脱剂(如咪唑等),使得含少量组氨酸的肽段也被清洗下来,增加富集的特异性。对于使用Ni(Ⅱ)-IMAC进行富集,上样缓冲液建议为磷酸缓冲液,并添加5mM咪唑。
6.步骤(5)中的洗脱可以通过添加高浓度的竞争洗脱剂(如咪唑等)或者调节pH值实现。对于使用Ni(Ⅱ)-IMAC进行富集,洗脱缓冲液建议为磷酸缓冲液,并添加20mM咪唑。
7.步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)的实现方式可以为在离心管中振荡离心,将IMAC微球填充到固相萃取柱中,或者将IMAC微球填充到枪头中制成微柱等多种形式。
8.步骤(6)中除盐的样品用0.1%(v/v)甲酸水复溶后用于LC-MS/MS检测,数据采集可以使用数据依赖检测模式或者靶向检测模式;所使用的靶向检测模式可以为多反应监测模式和平行反应监测模式,可以使用同位素内标法实现对血浆样品中的D-二聚体进行绝对定量。
本发明的优点:
该方法原理简单,操作容易,样品损失少,方法学考察表明该方法具有很好的定量重现性,对实际血浆样品中D-二聚体的检测表明该方法具有潜在的临床使用价值。本发明首次将固定化金属离子亲和色谱法用于血浆中D-二聚体交联肽段的富集,结合高分辨的RPLC-MS/MS分析,可以很好地实现对样品中的交联肽段的鉴定,并结合靶向质谱检测模式和同位素内标法可以实现血浆中D-二聚体蛋白的质谱绝对定量。该方法具有好的重现性和宽的线性范围,可以完全不依赖抗体富集和检测,这将有效避免了抗体的昂贵和繁琐的构建过程,同时克服了基于抗体的D-二聚体定量方法的缺陷,可以应用于的临床血浆中D-二聚体样品检测和定量。
附图说明
图1为所述D-二聚体样品按照IMAC方法富集并加入稳定同位素内标使用质谱进行定量的实验流程。D-二聚体样品经过酶解之后,加入稳定同位素标记的重标肽段,使用IMAC进行富集,除盐,并使用质谱PRM模式进行检测定量。
图2样品中D-二聚体交联肽段检测结果。(A)为D-二聚体特异性交联肽段的结构;(B)为该特异性交联肽段使用稳定同位素标记的形式,其中两条肽段中间用*标注的亮氨酸上的6个C为13C标记,一个N用15N标记;(C)直接使用质谱检测重标交联肽段不同价态形式的分布;(D)质谱检测到内源性的交联肽段+4价形式的同位素峰分布;(E)内源性交联肽段使用质谱检测二级碎裂谱图,#0为未完全碎裂的母离子,#1-5为不同形式的碎片离子;(F)重标交联肽段使用质谱检测二级碎裂谱图,#0-5所代表的碎片离子和(E)中一一对应;(F)使用所述IMAC富集方法处理的血浆样品中,检测到的内源性交联肽段和重标交联肽段+4价态和+5价态进行二级碎裂后子离子的提取离子色谱峰。
图3所述IMAC富集方法结合PRM质谱检测模式定量血浆中D-二聚体蛋白的校准曲线。线性范围为3.125nmol/L-400nmol/L,R2=0.99。
图4使用所述IMAC富集方法结合PRM质谱检测模式对24例血浆实际样品定量检测结果和使用医院使用的D-二聚体试剂盒(Siemens HealthcareDiagnostics)定量结果的相关性。皮尔森相关系数达到0.94。
表1所述IMAC富集方法结合PRM质谱检测模式对血浆中D-二聚体进行定量不同步骤的批间批内重现性。
表2所述IMAC富集方法结合PRM质谱检测模式对血浆中D-二聚体进行定量的回收率。
表3使用所述IMAC富集方法结合PRM质谱检测模式对25例实际血浆样品中D-二聚体定量结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
固定化金属离子亲和色谱法富集血浆中D-二聚体并进行质谱定量检测:
(1)取含D-二聚体的血浆样品8μL,溶解200μL在含有8M尿素的50mM Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲溶液(pH 8.0)中,加入终浓度为20mM DTT(二硫苏糖醇),60℃水浴中1h,然后加入终浓度为40mM IAA(碘代乙酰胺),25℃避光反应40min;
(2)将步骤(1)处理结束后得到的样品,转移至分子量截留为3K的超滤管的超滤膜上,14000g离心30min除去变性液,再使用50mM Hepes缓冲液400μL清洗2次,每次14000g离心30min除去,加入200μL 50mM Hepes缓冲液,加入酶:蛋白质质量比为1/20的胰蛋白酶,37℃水浴中酶解12h,补加1/50(酶:蛋白质的质量比)的胰蛋白酶,继续酶解4h;
(3)步骤(2)处理结束后得到的肽段溶液,14000g离心30min,同时使用缓冲液400μL清洗2遍除去分子量小于~3K的肽段;
(4)取100μL Ni(Ⅱ)-IMAC微球(GE Healthcare,17-5268-01)于填有筛板的200μL移液枪枪头中,1000rpm离心除去保存液,加入200μL水溶液1000rpm离心除去残留的保存液,重复一次,再加入200μL缓冲溶液A(20mM磷酸二氢钠,500mM氯化钠,5mM咪唑,pH 7.4),1000rpm离心使溶液流过微球进行平衡,重复一次;
(5)向步骤(3)中超滤管膜上的溶液,加入600μL缓冲溶液A和800fmol使用稳定同位素标记的重标交联肽段,
(6)将步骤(5)中得到的溶液逐步将其加入步骤(4)中的200μL枪头中,通过离心和Ni(Ⅱ)-IMAC微球结合,结合时间控制在35min,然后使用200μL缓冲液A清洗4次除去非特异性吸附肽段;
(7)继续向枪头中加入200μL缓冲液B(20mM磷酸二氢钠,500mM氯化钠,20mM咪唑,pH 7.4)将步骤(6)中结合到Ni(Ⅱ)-IMAC微球上的肽段洗脱下来,重复3次,将所有洗脱液合并;
(8)向步骤(7)中的洗脱液加入三氟乙酸调pH至2-3,然后用C18固相萃取柱除去溶液中的小分子,使用离心浓缩干燥仪冷冻干燥,得到的肽段即是通过Ni(Ⅱ)-IMAC富集后的含有D-二聚体交联肽段的样品。
(9)使用30μL 0.1%(v/v)甲酸水复溶步骤(8)中冻干的样品,上样6μL,使用LC-MS/MS检测采用PRM模式采集数据。最后使用Skyline软件进行数据处理。
在步骤(5)中使用稳定同位素标记的重标交联肽段结构如图2B,氨基酸序列和内源性的D-二聚体特异性交联肽段(图2A),其中上下两条肽段中的亮氨酸(*标记L)中的六个碳使用13C标记,一个N用15N标记,总共产生14Da的质量偏差。
图2为血浆中D-二聚体蛋白特异性交联肽段的检测结果。(C)中不同价态的重标肽段分布可以看到+4价和+5价有相当的强度,(D)为内源性的D-二聚体特异性交联肽段+4价态形式的一级同位素分布,可以计算其精确分子量为3995.9845,与该交联肽段的理论计算分子量3995.9839之间偏差不到1ppm。(E)和(D)中检测到的内源性的交联肽段和重标交联肽段有相似的二级谱,可以由二级谱碎片离子确认该检测结果为D-二聚体蛋白特异性的交联肽段。(F)中实际血浆样品通过该IMAC富集后检测到D-二聚体交联肽段的提取色谱峰,内源性的交联肽段和重标交联肽段具有相同的保留时间。
实施例2
使用固定化金属离子亲和色谱法富集血浆中D-二聚体并进行质谱定量检测方法的校准曲线:
操作流程同实施例1,只是处理33份同样的样品,在步骤(5)添加重标肽段处分别添加0,5,10,25,50,100,200,400,800,1600,3200fmol,每个浓度有三个重复。数据处理时使用重标肽段的提取色谱峰峰面积除以内源性交联肽段的色谱峰峰面积得到样品中重标交联肽段的相对量,绘制校准曲线。
图3为该所述IMAC富集方法结合PRM质谱检测模式血浆中D-二聚体蛋白的校准曲线。通过添加不同浓度的重标交联肽段,最后得到该方法的检出限为1.25nmol/L,定量限LOD为3.125nmol/L,线性范围为3.125nmol/L-400nmol/L,线性相关性R2=0.99。
实施例3
使用固定化金属离子亲和色谱法富集血浆中D-二聚体并进行质谱定量检测方法的重现性考察:
同一个血浆样品,每天按照实施例1中的操作流程准备四份,准备三天,进行检测定量。数据处理时使用重标肽段的提取色谱峰峰面积除以内源性交联肽段的色谱峰峰面积得到样品中重标交联肽段的相对量,然后计算批间批内重现性。
表1所述IMAC富集方法结合PRM质谱检测模式对血浆中D-二聚体进行定量的批间批内重现性。由定量结果的CV值(标准≤15%)可以看出该定量方法具有很好的重现性。
实施例4
使用固定化金属离子亲和色谱法富集血浆中D-二聚体并进行质谱定量检测方法的回收率考察:
操作流程同实施例1,同一个血浆样品处理9份,在处理样品时分别在不同步骤中加入重标肽段:①步骤(2)之后,步骤(3)之前;②步骤(5)中;③步骤(7)之后,步骤(8)之前。数据处理时使用重标肽段的提取色谱峰峰面积除以内源性交联肽段的色谱峰峰面积得到样品中重标交联肽段的相对量,②/①得到酶解过程的回收率,③/②得到富集过程的回收率,③/①为整个处理流程的回收率。
表2所述IMAC富集方法结合PRM质谱检测模式对血浆中D-二聚体进行定量不同步骤的回收率。可以看出每一步都有基本100%的回收率,表明该富集方法损失少。
实施例5
使用固定化金属离子亲和色谱法富集血浆中D-二聚体并进行质谱定量检测实际血浆样品并和商品化试剂盒结果对比:
使用实施例1中相同的操作流程处理25例临床血浆样品(包括10例肺栓塞病人和15例健康人),质谱重复两次检测,进行定量,通过添加重标肽段的量计算内源性D-二聚体的量,并通过假设纤维蛋白原的分子量为340kDa,将摩尔浓度转化为质量浓度(FEU,纤维蛋白原当量)。定量结果和医院使用的D-二聚体试剂盒检测浓度(医院提供血浆样品时提供的浓度数据)进行对比。
图4使用所述IMAC富集方法结合PRM质谱检测模式对25例血浆实际样品定量检测结果和医院商品化试剂盒定量结果的相关性。除去一个异常值,皮尔森相关系数达到0.94,具有很好的一致性,说明该方法具有潜在的临床使用价值。定量浓度列于表3.
表1.
表2.
表3
总之,本发明为一种基于固定化金属离子亲和色谱法富集血浆中D-二聚体并使用质谱进行检测定量的方法。该方法利用D-二聚体特异性交联肽段中含有4个组氨酸,可以和金属离子形成强的配位相互作用,从而使用IMAC对其进行富集,实现对血浆样品中的D-二聚体蛋白进行定量。该方法原理简单,操作容易,样品损失少,方法学考察证明该定量方法重现性好,线性范围可以实现对不同浓度的实际血浆样品中的D-二聚体蛋白进行定量。该方法是一种完全不依赖于抗体的D-二聚体检测定量的方法,可以有效避免D-二聚体蛋白内在的不均一性导致的不同基于抗体检测方法定量结果不一致的问题,具有潜在的临床使用价值。
Claims (10)
1.基于固定化金属离子亲和色谱法富集实现血浆中D-二聚体定量的方法,其特征在于:
取D-二聚体血浆样品,酶解得到血浆蛋白酶解液,使用IMAC富集酶解液中D-二聚体蛋白特异性的交联肽段,最后使用液相色谱-质谱联用仪进行鉴定和后续定量。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:
该方法的步骤如下:
(1)取血浆样品,变性酶解;
(2)步骤(1)获得肽段溶液中添加稳定同位素标记的重标交联肽段;
(3)让步骤(2)中的混合肽段溶液在上样缓冲液中和使用上样缓冲液平衡好的IMAC微球进行结合;
(4)使用上样缓冲液反复清洗步骤(3)中的IMAC微球,除去不含组氨酸和含一个或者两个组氨酸的肽段;
(5)使用洗脱缓冲液将步骤(4)中结合的肽段洗脱下来;
(6)除盐和后续质谱检测和定量。
3.根据权利要求2所述方法,其特征在于:
步骤(1)中的变性为蛋白质组学中的还原烷基化过程。
4.根据权利要求2所述方法,其特征在于:
步骤(2)中所述的稳定同位素标记的重标交联肽段和目标内源性D-二聚体特异性的交联肽段氨基酸序列完全相同,其中一个或二个以上的氨基酸中碳、氢、氧或氮元素中一种或者二种以上的元素被对应的稳定同位素形式取代。
5.根据权利要求2所述方法,其特征在于:
步骤(1)中酶解所用的酶为胰蛋白酶;步骤1中可以使用不同酶解方式进行酶解(包括溶液酶解、超滤辅助酶解或胶内酶解),如果使用溶液酶解方法要求酶解物使用C18固相萃取柱除去酶解溶液中的小分子变性剂和缓冲液然后冻干之后复溶进行后续步骤,如果使用超滤辅助酶解要求后续酶解液浓缩到50μL以下再进行后续步骤。
6.根据权利要求2所述方法,其特征在于:
步骤(3)、步骤(4)和步骤(5)中使用的IMAC材料中的金属离子为可以和组氨酸中的咪唑基团相互作用的镍离子、铜离子、锌离子或者钴离子中的一种。
7.根据权利要求2所述方法,其特征在于:
步骤(3)和步骤(4)中的上样缓冲液可以根据选用的不同固定化金属离子适当加入低浓度的竞争洗脱剂(如咪唑等),使得含少量组氨酸的肽段也被清洗下来,增加富集的特异性;对于使用Ni(Ⅱ)-IMAC进行富集,上样缓冲液建议为磷酸缓冲液,并添加终浓度为3-6mM的咪唑。
8.根据权利要求2所述方法,其特征在于:
步骤(5)中的洗脱可以通过添加高浓度的竞争洗脱剂(如咪唑等)或者调节pH值实现。对于使用Ni(Ⅱ)-IMAC进行富集,洗脱缓冲液建议为磷酸缓冲液,并添加15-50mM咪唑。
9.根据权利要求2所述方法,其特征在于:
步骤(3)、步骤(4)、步骤(5)的实现方式可以为在离心管中振荡离心,或将IMAC微球填充到固相萃取柱中,或者将IMAC微球填充到移液枪枪头中制成微柱等多种形式。
10.根据权利要求2所述方法,其特征在于:
步骤(6)中除盐的样品用0.1%(v/v)甲酸水复溶后用于LC-MS/MS检测,数据采集可以使用数据依赖检测模式和/或者靶向检测模式;所使用的靶向检测模式可以为多反应监测模式和平行反应监测模式,可以使用同位素内标法实现对血浆样品中的D-二聚体进行绝对定量。
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CN202010143175.3A Active CN113358760B (zh) | 2020-03-04 | 2020-03-04 | 基于固定化金属离子亲和色谱法富集实现血浆中d-二聚体定量的方法 |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114839253A (zh) * | 2022-04-21 | 2022-08-02 | 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) | 血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法及应用 |
CN117169489A (zh) * | 2023-07-18 | 2023-12-05 | 西湖实验室(生命科学和生物医学浙江省实验室) | 一种用于处理生物样品以鉴定其中蛋白质的方法 |
Citations (1)
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---|---|---|---|---|
CN105891176A (zh) * | 2016-04-06 | 2016-08-24 | 上海奥普生物医药有限公司 | 基于微球的杯式时间分辨荧光d-二聚体分析方法及试剂盒 |
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2020
- 2020-03-04 CN CN202010143175.3A patent/CN113358760B/zh active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN105891176A (zh) * | 2016-04-06 | 2016-08-24 | 上海奥普生物医药有限公司 | 基于微球的杯式时间分辨荧光d-二聚体分析方法及试剂盒 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
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S.CHEBIL ET AL.: "Polypyrrole functionalized with new copper complex as platform for His-tag antibody immobilization and direct antigen detection", 《SENSORS AND ACTUATORS B: CHEMICAL》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114839253A (zh) * | 2022-04-21 | 2022-08-02 | 深圳市第二人民医院(深圳市转化医学研究院) | 血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法及应用 |
CN117169489A (zh) * | 2023-07-18 | 2023-12-05 | 西湖实验室(生命科学和生物医学浙江省实验室) | 一种用于处理生物样品以鉴定其中蛋白质的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN113358760B (zh) | 2023-07-25 |
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