CN112996580A - 串联配对柱化学性质用于高通量蛋白质组学外泌体分析 - Google Patents

串联配对柱化学性质用于高通量蛋白质组学外泌体分析 Download PDF

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Abstract

本申请提供了用于从生物样品获得的肽样品的样品制备和质谱分析的组合物和方法。所述组合物和方法包括串联柱系统，其中捕集柱与分析柱诸如例如HPLC柱流体接触。当分析物从所述分析柱洗脱时，它们可以被传递至检测器(例如，质谱仪)进行肽分析。

Description

串联配对柱化学性质用于高通量蛋白质组学外泌体分析
关于联邦资助研究的声明
无。
相关申请的引用
本申请要求于2018年11月9日提交的美国申请第62/757,922号(Rosenblatt等)的优先权的权益，其全部内容以其整体并入本文。
共同研究协议各方的名称
无。
序列表
无。
技术领域
本申请属于用于肽分析，例如，通过高效液相色谱和/或质谱的分析的样品制备领域。
背景技术
许多诊断程序依赖于蛋白质组学分析。蛋白质组，即，在特定细胞中以特定发育状态存在的独特蛋白质集合，可以提供有关细胞状况的大量信息，并已发现其用于诊断和治疗策略，尤其是针对癌症和孕期病症诸如自发性早产(SPTB)和先兆子痫。
高效液相色谱(HPLC)由于其快速性和高分辨力而经常用于生物样品的分析。对于细胞样品，细胞外囊泡，也称为循环微粒(例如，外泌体)通常是方便进行分析的材料来源。外泌体含有蛋白质、脂质、核酸、碳水化合物和离子；因此，对于蛋白质组学分析，会希望从外泌体样品中去除非肽材料类。这样会防止分析柱(诸如HPLC柱)的超载和性能不佳，并促进后续的例如质谱法的分析。另外，它会使与样品相互作用而改变色谱柱化学性质的可能性降到最低。
当前用于蛋白质组学分析的大多数方法都涉及使用以下方法的细胞样品的破坏:例如，使用变性剂或离液剂(chaotropic agent)；随后进行一个或多个纯化或富集步骤，以去除非蛋白质污染物并富集蛋白质或肽组分；然后对富集的蛋白质样品进行蛋白水解以生成肽集合；然后例如通过质谱法(MS)分析肽。参见例如,Anderson和Hunter(2006)Mol.Cell.Proteomics 5(4):573-588。
在MS分析之前，用于富集细胞样品中蛋白质的三种主要技术是(1)色谱法，例如，使用下述的HPLC色谱法，例如，Sep Pak(Waters，Milford，MA)或ZipTip(Millipore，Billerica，MA)，(2)凝胶电泳和(3)有机萃取和沉淀。在蛋白质富集步骤之后，使样品经受蛋白水解，并通过MS分析肽片段。
存在许多有关这些当前的蛋白质组学分析方法的问题。首先，细胞样品含有高浓度的大分子，而不是蛋白质，诸如为脂质、碳水化合物和核酸以及盐，诸如氯化钠(NaCl)。这些可干扰后续的处理步骤(诸如例如蛋白水解)，可使分析仪器(诸如色谱柱)超载，并可在质谱分析中引起高背景信号。除了使色谱柱超载以外，非蛋白质大分子和盐类可改变HPLC柱的化学性质(例如，导致沿柱的pH值和离子强度的改变)；从而改变了肽与柱基质的相互作用，并导致了不同来源样品分析中的不可再现性。即使当前的方法通常含有使所述样品富集有蛋白质和多肽的步骤，但当前的富集方法并不总是足以提供足够纯净的材料来进行强健的质谱分析，尤其是对于获得最佳灵敏度所需的大样本量而言；而且在这些纯化步骤中样品损失可改变样品中肽的定量。
当前方法的第二个问题是，难以从诸如血液抽取物的生物学样品获得足够的材料用于MS分析。
当前方法的第三个问题是，由于涉及小的流体体积(因此需要低流速以获得最佳灵敏度)，它们是耗时的。
当前方法的第四个问题是，样品制备技术通常导致生成具有高离子强度的肽溶液，这会影响肽与HPLC树脂的相互作用并降低MS分析的灵敏度。
当前方法的第五个问题是，它们包含一系列的多个步骤，在每个步骤都会发生样品损失。
提高灵敏度的另一种方式是从细胞外囊泡(例如，外泌体)，而不是从细胞本身获得样品。然而，即使使用从细胞外囊泡获得的样品，纯度和灵敏度的问题仍然存在。
总之，由于上述原因，目前的蛋白质组学分析方法受到目标肽/蛋白质定量的灵敏度不足和不精确的困扰。另外，当前的方法是耗时的，且具有低产率。因此，需要用于分析生物样品的改进的方法和系统。
附图说明
并入本文并构成说明书一部分的附图示例说明了示例性实施方式，并且与说明书一起进一步用于使相关领域的技术人员做出和使用这些实施方案以及对本领域技术人员而言显而易见的其他实施方案。将结合以下附图更具体地描述本发明，其中:
图1示出了示例性串联柱系统1，其包含捕集柱10，其与分析柱20通过分散在捕集柱10的出口11和分析柱20的入口21之间的流体管线15流体接触。
图2示出了另一示例性串联柱系统2，其包含捕集柱10、多通阀30和分析柱20。捕集柱10通过第一流体导管40与阀30流体连通，所述第一流体导管40附接至捕集柱10的出口11和阀30上的进入端口32。转而，阀30经由附接至阀30的出口端口31和分析柱20的入口21的第二流体导管50与分析柱20流体连通。所述系统任选地包含附接到阀30的出口端口33的第三流体导管70，所述第三流体导管任选地附接至或流入废物容器60。
图3示出了另一示例性串联柱系统3，其包含捕集柱10、多通阀30、分析柱20和检测器80。捕集柱10经由流体导管40与阀30流体连通，所述流体导管40附接至捕集柱10的出口11和阀30的进入端口32。转而，阀30经由附接至阀30的出口端口31和分析柱20的入口21的流体导管50与分析柱20流体连通。分析柱20经由附接至分析柱出口22和检测器入口81的第四流体导管90与检测器80流体接触。所述系统任选地包含附接至阀30的出口端口33的第三流体导管70，其中所述第三流体导管任选地附接或流入废物容器60。
图4示出了另一示例性串联柱系统4，其包含捕集柱10、多通阀30、分析柱20、检测器80和泵100。泵100经由附接到泵出口101和捕集柱入口11的第五流体导管110与捕集柱10流体连通。捕集柱10经由流体导管40与阀30流体连通，所述流体导管40附接至捕集柱10的出口11和阀30上的进入端口32。转而，阀30经由附接至阀30的出口端口31和分析柱20的入口21的流体导管50与分析柱20流体连通。分析柱20经由附接至分析柱出口22和检测器入口81的第四流体导管90与检测器80流体接触。所述系统任选地包含附接至阀30的出口端口33的第三流体导管70，所述第三流体导管任选地附接或流入废物容器60。
图5示出了另一示例性串联柱系统。分析泵通过自动进样器将样品泵入捕集柱。捕集柱连接至多通阀，所述阀具有通向废液、上样泵和分析柱的端口(称为“蝰蛇塞(Viperplug)”)。上样泵将从捕集柱洗脱的样品泵入分析柱。分析柱转而连接到质谱仪。
图6A和6B显示了来自富含外泌体的样品的ITIH4肽的质谱结果，所述样品被尿素破坏并被胰蛋白酶消化。在图6A中，在质谱分析之前将样品直接上样至分析柱上。在图6B中，在质谱分析之前，首先使样品通过捕集柱。
图7A和7B显示了来自富含外泌体的样品的IC1肽的质谱结果，所述样品被尿素破坏并被胰蛋白酶消化。在图7A中，在质谱分析之前，将样品直接上样至分析柱上。在图7B中，在质谱分析之前，首先使样品通过捕集柱。
图8显示了通过细胞产生的多种微粒，包括外泌体、微泡和凋亡小体。
发明内容
本文公开了用于制备和分析生物样品的方法和组合物。
在某些实施方案中，所述样品是生物流体，诸如，例如，血液、血清、血浆、唾液、脑脊髓液、眼泪、羊水或尿液。在另外的实施方案中，所述样品是组织样品，例如活检或颊拭子。所述样品可以从患有或怀疑患有病理状况或正被筛查病理状况的受试者获得。示例性病理状况在本文其他地方描述，但可以包括癌症、糖尿病和孕期病症，诸如自发性早产(SPTB)和先兆子痫。
在某些实施方案中，所述生物样品富含微粒，诸如例如外泌体。微粒的富集可以例如通过尺寸排阻色谱法、超滤或反相色谱法中的一种或多种来实现。
在某些实施方案中，本文公开的组合物是串联配对柱系统1，其用于富集肽的生物样品并用于分离富集的肽。所述系统包含彼此流体接触的捕集柱10和分析柱(或“分离柱”)20，例如，通过一根或多根流体导管或流体管线流体接触。任选地，多端口(例如，2、3、4、5、6或更多个端口)阀30设置在捕集柱10和分析柱20之间(图2)。在一个实施方案中，所述阀具有三个端口:从捕集柱开始的进入端口31，到达分析柱的出口端口32以及到达废物的出口端口33。在某些实施方案中，分析柱20流体接触于检测器80(例如，质谱仪)(图3)。在另外的实施方案中，所述系统与泵100接触，所述泵100任选地在上游并且与捕集柱10(图4)流体连接。
在另外的实施方案中，所述系统包含(a)捕集柱10，(b)通过第一流体导管40连接至捕集柱10的多通阀30，(c)通过第二流体导管50连接至多通阀30的分析柱20，和(d)连接到多通阀30的第三流体导管70；其中捕集柱10上样有针对循环微粒富集的样品(例如，外泌体)，其中所述样品已经经受了颗粒破坏和蛋白水解消化。
在某些实施方案中，所述样品或所述捕集柱10包含稳定同位素标准品(SIS)肽。
在另外的实施方案中，所述系统还包含检测器80，所述检测器80通过第四流体导管90连接到分析柱20。在另外的实施方案中，所述系统还包含通过第五流体导管110连接到捕集柱10的泵100。可以是，检测器80和泵100两者都存在于系统中，或者可以是，存在一个或另一个。
在本文所述的系统中，捕集柱10可以是高效液相色谱(HPLC)柱(例如，C18柱或C6柱)、反相色谱(RPC)柱、阴离子交换柱、阳离子交换柱或尺寸排阻柱。
在本文所述的系统中，分析柱20可以是高效液相色谱(HPLC)柱(例如，C18柱或C6柱)、反相色谱(RPC)柱、阴离子交换柱、阳离子交换柱或尺寸排阻柱。
在某些实施方案中，本文公开的系统包含检测器80，所述检测器80用于鉴定和定量从分析柱20洗脱的肽。所述检测器可以是质谱仪，例如，四极杆质谱仪、飞行时间质谱仪、串联质谱仪，诸如三重四极杆质谱仪。在某些实施方案中，所述检测器包括三重四极杆质谱仪，并且检测包含多重反应监测。
在使用上段中所述的系统的某些实施方案中，捕集柱10上样有针对循环微粒富集的生物样品(例如，外泌体)，其中所述样品已经经受了颗粒破坏和蛋白水解作用。微粒的破坏通过下述实现，例如，用一种或多种变性剂处理微粒(例如，尿素、氯化胍、高氯酸钠、高氯酸锂、醋酸锂或硫脲)；还原剂，诸如二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、三(2-羧乙基)膦、谷胱甘肽(例如，L-谷胱甘肽)或β-巯基乙醇；和/或烷基化剂，诸如例如碘乙酰胺或碘乙酸酯(它们结合到半胱氨酸残基的巯基基团上，由此破坏二硫键)。如本领域已知的，也可以使用其他二硫键断裂剂替代本文公开的烷基化剂或与烷基化剂一起使用。
蛋白水解酶和蛋白水解剂是本领域公知的。破坏的微粒的蛋白水解可以通过使破坏的微粒(例如，外泌体)暴露于下述来实现:氨肽酶，羧肽酶，或胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶或蛋白酶K中的任意一种或多种酶。化学试剂溴化氰(CnBr)也可用作蛋白水解剂。
已经经受颗粒破坏和蛋白水解的微粒样品(例如，外泌体样品)，还可以包括一种或多种肽靶标(标准品)(即，已知序列的肽)，以帮助检测样品中的肽。在某些实施方案中，把一种或多种重同位素标记的肽标准品用于生成稳定同位素标准品(SIS)肽，以定量和验证靶标肽的存在。
已经经受颗粒破坏以及蛋白水解的微粒样品(例如，外泌体样品)可以上样到捕集柱10上，例如到反相柱、阴离子交换柱、阳离子交换柱、聚苯乙烯-二乙烯基苯柱或尺寸排阻柱。所述捕集柱10也可以是使用反相树脂诸如例如C18或C6的高效液相色谱(HPLC)柱。
除蛋白质外，循环微粒(诸如外泌体)的制剂还含有脂质、核酸、碳水化合物、小的代谢分子和盐。在本文公开的方法中，微粒的这些非蛋白质组分没有被捕集柱10保留:它们在将样品施加到捕集柱之后流过或被洗掉。如上所述由蛋白水解产生的肽被捕集柱10保留，并且可以洗脱以在分析柱20上分离。因此，在某些实施方案中，未捕获的材料包含盐、小分子、大分子(例如脂质、核酸和碳水化合物)和尺寸大于1kD的复合物。在另外的实施方案中，未捕获的材料的尺寸大于0.5kD，或大于2kD，或大于3kD，或大于4kD，或大于5kD。在一些实施方案中，未捕获的材料包含长度大于约50个氨基酸或约100个氨基酸的多肽。
已与捕集柱10结合并已从其中洗脱出来的肽材料任选地经由阀30传递到分析柱20进行分离，所述阀允许将柱流出物传递到废物60或分析柱20中。分析柱20可以是高效液相色谱(HPLC)柱，其包含诸如C18或C6的反相树脂。如所指出的，捕集柱10可以与分析柱20流体连接，使得离开捕集柱10的材料被直接上样到分析柱20上，由此最小化时间并防止材料的损失。在某些实施方案中，捕集柱10与分析柱20之间的流体连接包含第一流体导管40，所述第一流体导管40与捕集柱10以及经由进入端口31与多通阀30流体接触，所述阀30经由出口端口32与第二流体导管50流体接触，所述第二流体导管50与分析柱20流体接触。即，捕集柱10和分析柱20之间的流体连接可以包含第一流体导管40和第二流体导管50，在它们之间设置有多通阀30。
从分析柱20洗脱的肽分析物被提供给检测器80以进行分析。在某些实施方案中，检测包含通过分析柱20和检测器80之间的流体导管90将分离的分析物提供给检测器80。在某些实施方案中，检测器80通过质谱法检测分析物。在这些实施方案的一些中，检测器80包含质谱仪，例如，四极杆质谱仪，飞行时间质谱仪，三重四极杆质谱仪或某种其他类型的串联质谱仪。在某些实施方案中，检测器80包括三重四极杆质谱仪，并且鉴定和定量包含了多重反应监测。
在另外的实施方案中，本文提供了利用本文描述的系统的方法，其中所述方法包括(a)捕集柱10上样有样品，所述样品包含已经受蛋白水解处理的破坏的外泌体，从而使流过物通过第一流体导管40、多通阀30和第三流体导管70；(b)清洗捕集柱10，以使清洗物通过第一流体导管40、多通阀30和第三流体导管70；(c)洗脱捕集柱10，使得洗脱物通过第一流体导管40、多通阀30和第二流体导管50到达分析柱20上；(d)在分析柱20上分离洗脱物的组分；(e)使步骤(d)的分离的组分通过第四流体导管90到达检测器80；以及检测一个或多个分离的组分。所述检测器可以是但不限于四极杆质谱仪、飞行时间质谱仪或串联质谱仪，诸如三重四极杆质谱仪。质谱检测可以例如通过多重反应监测(MRM)质谱进行，并且检测可以包括使用SIS肽。例如，在MRM-MS中，样品用蛋白酶处理样品以将全长蛋白质转化为肽片段。如果要测试一种特定的蛋白质，则将样品掺有含有稳定重同位素(SIS肽)的肽片段，所述片段具有与预期从被测试的蛋白质产生的那些序列相同的序列。对同一肽的重质和未标记的、内源性版本的检测证实正在测试中的蛋白质的存在。
本文公开的用于样品制备和分析的方法和组合物使得有可能获得足够高的浓度和纯度的生物样品，以能够通过质谱法进行灵敏的肽分析。与以前的方法相比，可能使用破坏的微粒的复合混合物作为分析的起始材料(例如，已经受蛋白水解消化的破坏的外泌体)。这样的混合物可以在不富集蛋白质和伴随这样的富集程序的伴随损失的情况下上样至捕集柱上。先前的方法在分离和分析之前需要蛋白质富集步骤，然后再将样品注入HPLC-质谱系统(见上文)。在某些实施方案中，将5至200微克(或其之间的任何整数值)的蛋白质或肽上样至捕集柱上。在某些实施方案中，将5μg蛋白质或肽上样至捕集柱上。
增强的灵敏度也由以下事实产生:外泌体肽保留在捕集柱10上，并且一次仅将一小部分保留的肽洗脱到分析柱20上。这样，分析柱20不会超载，并且分析物可以常规地分离并洗脱到检测器80(例如质谱仪)中，用于例如，MRM分析。所述方法还利用了与检测器80的速度匹配的连续流速。
在一个方面，本文提供了一种方法，所述方法包括:(a)提供生物样品；以及(b)针对循环微粒富集样品；(c)使富集的样品经受颗粒破坏和蛋白水解消化以产生分析样品；(d)将分析样品上样到捕获多肽的捕集柱上；(e)从捕集柱清洗未捕获的材料；(f)从捕集柱洗脱捕获的多肽，并将洗脱的多肽上样到与捕集柱流体连接的分析柱上；(g)在分析柱上分离的多肽；(h)用检测器检测分离的多肽。在一个实施方案中，所述生物样品包含血液、血清、血浆、唾液、脑脊髓液、羊水或尿液。在另一个实施方案中，所述生物样品是从患有选自以下病况的受试者中提供的：怀孕、癌症、自发性早产、先兆子痫或糖尿病。在另一个实施方案中，通过尺寸排阻色谱、超滤或反相色谱中的一种或多种针对微粒富集生物样品。在另一个实施方案中，所述循环微粒是外泌体。在另一个实施方案中，颗粒破坏包括:暴露于尿素、还原剂(诸如DTT、DTE、巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦或谷胱甘肽)或碘乙酰胺中的一种或多种。
在另一个实施方案中，蛋白水解消化包括:将样品暴露于溴化氰(CnBr)或一种或多种蛋白酶，诸如氨肽酶、羧肽酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶和蛋白酶k。在另一个实施方案中，所述方法包括向分析样品中添加用于检测特定蛋白质标志物的稳定同位素标准品肽。在另一个实施方案中，所述捕集柱进行选自下述的色谱法:反相色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱或尺寸排阻色谱，或者为聚苯乙烯-二乙烯基苯柱。在另一个实施方案中，所述捕集柱包含高效液相色谱(HPLC)柱。在另一个实施方案中，所述HPLC柱包含选自C18或C6的反相材料。在另一个实施方案中，步骤(e)中的未捕获的材料包含选自以下的材料:盐和大分子或大小大于5.5kD的复合物，或者所述大分子是大于约50个氨基酸长的多肽。在另一个实施方案中，所述分析柱包含高效液相色谱(HPLC)柱。在另一个实施方案中，所述HPLC柱包含选自C18或C6的反相材料。在另一个实施方案中，在捕集柱和分析柱之间的流体连接包含第一流体导管和第二流体导管，和在它们之间设置的多通阀。在另一个实施方案中，检测包括:通过分析柱和检测器之间的流体连接将分离的分析物提供给检测器。在另一个实施方案中，检测器通过质谱法检测分析物。在另一个实施方案中，其中所述检测器包含选自四极杆质谱仪或飞行时间质谱仪的质谱仪。在另一个实施方案中，所述检测器包含串联质谱仪。在另一个实施方案中，所述检测器包含三重四极杆质谱仪。在另一个实施方案中，所述检测器包括三重四极杆质谱仪，并且检测包括多重反应监测。
本文提供的另一方面是一种系统，其包含:(a)捕集柱；(b)通过第一流体导管连接到捕集柱的多通阀；(c)通过第二流体导管连接到多通阀的分析柱。在另一个实施方案中，所述捕集柱上样有针对循环微粒富集的样品，其中所述样品已经经受了颗粒破坏和蛋白水解消化。在另一个实施方案中，所述捕集柱还包含稳定同位素标准品多肽。在另一个实施方案中，所述系统进一步包含:出口流体导管，其将出口端口连接到多通阀。在另一个实施方案中，所述系统进一步包含:通过检测器流体导管连接至分析柱的检测器。在另一个实施方案中，所述系统进一步包含:泵，其中所述泵通过泵流体导管连接至捕集柱。在另一个实施方案中，所述捕集柱选自反相色谱柱、阴离子交换色谱柱、阳离子交换色谱柱、聚苯乙烯-二乙烯基苯柱或尺寸排阻柱。在另一个实施方案中，所述捕集柱包含高效液相色谱(HPLC)柱。在另一个实施方案中，HPLC柱包含选自C18或C6的反相材料。在另一个实施方案中，所述分析柱包含高效液相色谱(HPLC)柱。在另一个实施方案中，所述检测器包含质谱仪。在另一个实施方案中，所述检测器是选自四极杆质谱仪或飞行时间质谱仪的质谱仪。在另一个实施方案中，所述检测器包含串联质谱仪。在另一个实施方案中，所述检测器包含三重四极杆质谱仪。在另一个实施方案中，所述循环微粒是外泌体。
本文提供的另一方面是一种方法，所述方法包括:(a)提供一种系统，所述系统包括:(i)捕集柱；(ii)通过第一流体导管连接到捕集柱的多通阀；(iii)通过第二流体导管连接到多通阀的分析柱；(iv)出口端口通过出口流体导管连接至多通阀；(v)通过检测器流体导管连接到分析柱的检测器；(b)使捕集柱上样有样品该样品包含选自以下的一个或多个分子：多肽、复合碳水化合物、核酸和复合脂质，以使流过物通过第一流体导管、多通阀、第三流体导管；(c)清洗捕集柱，以使清洗物通过第一流体导管、多通阀和第三流体导管；(d)洗脱捕集柱，使洗脱物通过第一流体导管、多通阀和第二流体导管进入分析柱；(e)在分析柱上分离洗脱物的组分；(f)使步骤(d)的分离的组分通过第四流体导管到达检测器；(g)检测一种或多种分离的组分。在另一个实施方案中，检测包括质谱法。在另一个实施方案中，质谱法包含多重反应监测质谱。在另一个实施方案中，步骤(a)的样品包含约1μg至约5μg的蛋白质或肽。在另一个实施方案中，所述样品包含已经经受蛋白水解处理的破坏的外泌体。在另一个实施方案中，所述样品包含选自多肽、复合碳水化合物、核酸和复合脂质的多个分子。在另一个实施方案中，所述样品还包含盐。在另一个实施方案中，所述样品包含细胞匀浆或组织匀浆。在另一个实施方案中，所述样品包含多肽、脂质和盐。在另一个实施方案中，所述样品还包含核酸和/或复合碳水化合物。在另一个实施方案中，所述样品还包含金属。
具体实施方式
I.介绍
所述方法尤其提供了用于分析复合生物样品的系统和方法，所述系统和方法包含一种或多种不同种类的分子，例如，至少任意一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种生物分子以及其他分子类型，诸如氨基酸或多肽(蛋白质或肽)、碳水化合物(复合碳水化合物或简单碳水化合物，诸如单糖、二糖和三糖)、核苷酸或多核苷酸(核酸、RNA、DNA)、脂质(脂肪酸、复合脂质)、盐和金属。一般而言，这些混合物将以细胞或组织匀浆的形式，或分离和破坏的微泡形式存在，这些微泡已经用酶(诸如蛋白酶)处理过，以将较大的分子切割成较小的分子。用于分析的系统包括与分析柱流体连通的捕集柱，所述分析柱与诸如质谱仪的检测器流体连通。将复合样品上样至捕集柱上，在此处去除碎屑和非分析物分子。现在，已与其他分子(诸如盐、脂肪、核酸和碳水化合物)至少部分地分离的分析物(例如，肽)直接通过流体导管移动到分析柱上，在此处基于由分析柱选择的性质来分选相同类型的分子。所述分析柱的出口直接通过流体导管移动到检测器(诸如质谱仪)上进行检测。
本公开内容尤其提供了用于分析来自微粒的分析物的系统和方法。在某些实施方案中，所述方法包括以下操作:(a)提供生物样品；(b)针对循环微粒富集样品；(c)使富集的样品经受颗粒破坏和蛋白水解消化以产生分析样品；(d)将(c)之后的分析样品上样至捕获多肽的捕集柱上；(e)从捕集柱清洗未捕获的材料；(f)从捕集柱洗脱捕获的多肽，并将洗脱的多肽上样至与捕集柱流体连接的分析柱上；(g)在分析柱上分离多肽；(h)用检测器检测分离的多肽。
本文还提供了用于样品分析例如来自微粒的分析物的分析的系统。在某些实施方案中，所述系统包含:(a)捕集柱；(b)通过第一流体导管连接到捕集柱的多通阀；(c)通过第二流体导管连接至多通阀的分析柱；其中所述捕集柱上样有针对循环微粒富集的样品，其中所述样品已经经受了颗粒破坏和蛋白水解消化。
通过在强度曲线图上及时看到尖锐的峰，本文描述的方法可以比传统方法更快速，这允许相同的时间量内的更多样品。
本文所述的方法显著地提高了检测测定的灵敏度，特别是通过质谱法的检测测定。灵敏度可以例如提高至少任意两倍、五倍或十倍。这可以通过在较低的检测限(即，在同一样品中降低的浓度)检测分析物的能力来证明。它还可以以将较少量的相同样品上样至柱上以检测柱中分析物的能力来证明。例如，与包含捕集柱与分析柱结合的系统相比，上样至仅包括分析柱的系统上的样品的量可以从约100微克至约200微克减少至约1微克至约5微克。本文所述的方法还显著地增加了样品通量，即，减少了上样样品与生成输出之间的时间。通量可以增加25％、50％、100％、200％或500％中的至少任意。不希望受到理论的束缚，首先在捕集柱上清洁样品可以允许快速结合(fasting binding)以及从分析柱上洗脱。
II.生物样品
用于本公开内容的方法的样品是获自受试者的生物样品。如本文所用，术语“样品”是指包含分析物的组合物。样品可以是原始样品，其中分析物以其天然形式与其他材料(例如，源材料)混合；分级样品，其中分析物至少部分富集；或者纯化样品，其中分析物至少是基本上纯净的。如本文所用，术语“生物样品”是指包含生物材料的样品，所述生物材料包括例如多肽、多核苷酸、多糖、脂质和更高阶水平的那些材料诸如微粒、细胞、组织或器官。
受试者可以是例如哺乳动物、灵长类动物或人。在某些实施方案中，所述样品是血液、唾液、眼泪、汗液、鼻分泌物、尿液、羊水或子宫颈阴道液。在另外的实施方案中，所述样品是血液样品，在某些实施方案中其是血清或血浆。特别地，所述生物样品可以包含诸如外泌体的微粒并且可以来源于血液或其级分。在其他实施方案中，所述样品是组织样品，例如，活检或颊拭子。在一些实施方案中，所述样品已经冷冻储存(例如-20℃或-80℃)。
A.受试者
在一些实施方案中，所述受试者是怀孕的人类。在一些实施方案中，怀孕的人类受试者处于孕早期(例如，妊娠的1-12周)、孕中期(例如，妊娠的13-28周)或孕晚期(例如，妊娠的29-37周)。在一些实施方案中，怀孕的人类受试者处于早孕(例如，来自妊娠8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周，但是早于妊娠21周；例如，来自妊娠20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或9周，但是晚于妊娠8周。在一些实施方案中，怀孕的人类受试者处于中孕(例如，来自妊娠21、22、23、24、25、26、27、28、29或30周，但是早于妊娠31周；来自妊娠30、29、28、27、26、25、24、23、22或21周，但晚于妊娠20周)。在一些实施方案中，怀孕的人类受试者处于晚孕(例如，来自妊娠31、32、33、34、35、36或37周，但是早于妊娠38周；来自妊娠37、36、35、34、33、32或31周，但晚于妊娠30周)。在一些实施方案中，怀孕的人类受试者处于小于17周，小于16周，小于15周，小于14周或小于13周的妊娠中；来自妊娠20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10或9周，但晚于妊娠8周)。在一些实施方案中，怀孕的人类受试者处于妊娠的约8-12周。在一些实施方案中，怀孕的人类受试者处于妊娠的约18-24周。在一个示例性的实施方案中，怀孕的人类受试者处于妊娠10-12周。在一些实施方案中，怀孕的人类受试者处于妊娠约22-24周。可以从怀孕受试者最后一次正常月经期的第一天开始计算怀孕的阶段。
在一些实施方案中，怀孕的人类受试者是初产孕妇。在其他实施方案中，怀孕的受试者是经产孕妇。在一些实施方案中，怀孕的受试者已经具有至少一个先前的自发早产(例如，在妊娠第38周之前出生)。在一些实施方案中，怀孕的人类受试者是无症状的。在一些实施方案中，受试者可具有早产的危险因素，诸如妊娠前高血压病史、糖尿病、肾病、已知的血栓形成倾向和/或其他明显的既往医学状况(例如，短的子宫颈长度)。
在一些实施方案中，所述样品获自患有或怀疑患有或正被筛查癌症或肿瘤的受试者。术语“癌症”可以指白血病、癌、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、实体瘤和淋巴癌等。不同类型的癌症的实例包括但不限于，肺癌(例如，非小细胞肺癌或NSCLC)、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、白血病、肝脏癌(即，肝癌)、肾癌(即，肾细胞癌)、甲状腺癌、胰腺癌、子宫癌、子宫颈癌、睾丸癌、食道癌、胃(胃部的)癌、中枢神经系统癌、皮肤癌、胶质母细胞瘤和黑色素瘤。
B.微粒
图8示出了产生三种微粒:微泡、凋亡小体和外泌体的细胞。如本文所用，术语“微粒”是指具有约50nm至约5000nm的流体动力学直径的细胞外微泡或脂质筏蛋白聚集体。因此，术语微粒涵盖了外泌体(约50nm至约100nm)，微泡(约100nm至约300nm)，核外粒体(约50nm至约1000nm)，凋亡小体(约50nm至约5000nm)以及脂质蛋白相同尺寸的聚集体。有关值使用的术语“约”是指该值的90％至110％。例如，约1000nm的直径是900nm至1100nm范围内的直径。
在生理、病理生理和凋亡情况下，越来越多地，微粒被认为是细胞间通讯的重要手段。而不同类型微粒的内容物随细胞类型而改变，它们可以包括核蛋白、胞质蛋白和膜蛋白、以及脂质、信使RNA和微小RNA、以及来源于新陈代谢的小分子。关于起源的细胞类型的状态的信息可以从微粒内容物的检查中得出。因此，微粒代表了进入细胞、组织和器官实时活动的独特且方便的窗口，否则可能很难采样。
如本文所用，术语“多肽”是指包含通过肽键附接的氨基酸的聚合物。该术语涵盖了“蛋白质”，其可以包括除了一级结构(氨基酸序列)之外还具有二级结构(氢键的模式，其确定多肽局部片段的一般三维形式，例如，α-螺旋或β-折叠)、三级结构(三维形状)和/或四级结构(在多个亚基复合物中的多个蛋白质分子的数量和排列)的大多肽。可以通过例如糖基化、脂质化、磷酸化等修饰蛋白质。该术语还涵盖“肽”，例如通常具有不超过约50个氨基酸的短多肽。
蛋白质的“片段”包括长度比感兴趣的全长或成熟蛋白质短的多肽。片段可以短至4个氨基酸，但优选为更长的(例如，最多5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸的任意或它们之间的任意整数值)。片段可以是比全长蛋白质短的蛋白质的任意部分，并且不一定必须具有全长蛋白质的末端之一。平均的胰蛋白酶生成的片段约6至约14个氨基酸长。除了氨基酸残基的数目外，蛋白质片段还可以通过其分子量来表征。由于氨基酸的平均分子量为110Da，10-聚体肽会具有约1100Da(1.1kDA)的分子量；50聚体会具有约5500Da(5.5kDA)的分子量，等等。
微粒相关蛋白是指蛋白质或其片段(例如，多肽或肽)其在例如来自哺乳动物(例如，人类)受试者富集微粒的样品中可检测到。因此，微粒相关蛋白不限于在检测时与微粒物理相关的蛋白质或其片段；可以将蛋白质或片段掺入微粒之间，或者可以将蛋白质或片段在检测之前的某些较早时间与微粒结合。在某些实施方案中，微粒相关蛋白留驻在微粒内，并且可以通过破坏微粒而释放，例如通过使微粒与离液剂、还原剂、烷基化剂和/或蛋白酶接触而释放。
与来自没有病况的受试者的样品相比，已确定在患有病理状况的受试者的样品中，许多微粒相关蛋白都发生了改变(例如，癌症、早产)，并且因此可以用作病理状况的生物标志物。如本文所用，“微粒相关蛋白的改变”是指微粒相关蛋白的量(即，水平)的变化或成分的变化。蛋白质成分的变化可以包括氨基酸序列的变化、糖基化的变化、磷酸化的变化、泛素化的变化和/或脂化的变化。
III.循环微粒(CMP)的富集的方法
CMP，例如外泌体，来自血浆样品，可通过尺寸排阻色谱(SEC)富集，并用水(无RNA酶、无DNA酶的蒸馏水)或PBS等度洗脱。例如，PD-10柱(GE Healthcare Life Sciences)用10mL的2％琼脂糖珠(标准孔径为50-150μm，得自ABT，Miami，FL)填充、清洗(例如，用水或PBS清洗)，并且(使用前)在4℃下储存至少24小时且使用前不超过三天。在使用当天，清洗柱子(例如，用水或PBS)而1mL融化的净血浆样品(即，在色谱法之前未经过滤、稀释或处理的血浆样品)施加至色谱柱。在柱空隙容积中捕获循环微粒，从高丰度蛋白质的峰中部分分辨出来。Ezrin等(2015)Am.J.
Perinatol.32:605-614。
本文所述的用于微粒(例如，外泌体)富集的方法具有另一个优势是耗尽高丰度非分析物血清蛋白(诸如白蛋白、触珠蛋白和抗体)的微粒样品。另外，通过用水或低离子强度缓冲液从柱上洗脱微粒，可以在低离子强度溶液中获得富集的微粒，从而最大程度地减少了柱化学性质(例如，pH、离子强度)的变化，其出现在将高离子强度样品(诸如，未经纯化而获得的)应用于捕集柱并在分析柱上进行分级时。
IV.颗粒破坏和蛋白水解
为释放微粒(例如，外泌体)相关蛋白，并将所述蛋白质转化为适合于通过MS分析的较小的肽，要处理外泌体以释放其内容物，并消化蛋白质。例如，外泌体(任选地，例如通过尺寸排阻色谱法富集)可以被破坏，并且通过使外泌体与离液剂、变性剂、还原剂、烷基化剂和/或蛋白酶接触，将蛋白质转化为肽。离液剂和变性剂破坏了颗粒的完整性，从而释放了内容物。变性剂还使蛋白质去折叠，例如，通过破坏氢键，由此使蛋白质更易于蛋白水解。还原剂和烷基化剂会破坏二硫键，这也有助于蛋白质解折叠。
示例性的离液剂和变性剂包括尿素、氯化胍、高氯酸钠、高氯酸锂、醋酸锂和硫脲。还原剂是本领域已知的，并且包括例如二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、三(2-羧乙基)膦、谷胱甘肽和β-巯基乙醇。示例性的烷基化剂包括:与半胱氨酸残基的巯基结合的碘乙酰胺和碘乙酸酯，由此破坏了二硫键。如本领域已知的，其他二硫键断裂剂也可以代替烷基化剂或与烷基化剂一起使用。
蛋白水解酶和蛋白水解剂是本领域公知的。示例性蛋白水解酶包括氨肽酶、羧肽酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶和蛋白酶K。化学试剂溴化氰(CnBr)也可用作蛋白水解剂。
如本文所用，术语“微粒制剂”或“外泌体制剂”是指其中微粒或外泌体被破坏并且多肽片段化例如为肽的样品。
V.系统和方法
本文所公开的系统可包括流体连接至阀的捕集柱，所述捕集柱具有与容器流体连接的第一端口和与分析柱流体连接的第二端口。在某些实施方案中，所述分析柱还流体连接至检测器。如本文中所使用的，如果第一设备和第二设备通过适于引导流体或液体的流动的导管连接，则第一设备流体地连接至第二设备。所述导管可以是例如管或具有腔的管线，流体可以通过其行进。当第一设备与第二设备通过连续流体流连接时他们流体连通。
分级微粒体或外泌体制剂以进行分析物检测的方法包括:将微粒体或外泌体制剂上样至捕集柱以捕获肽，从捕集柱上洗脱废料，例如，通过经与阀的流体连接发送它们至废物容器，然后通过与分析柱的流体连接洗脱分析物。上样至分析柱上的分析物可以在分析柱上分离，然后对其进行分析，例如，使它们通过与检测器(诸如质谱仪)的流体连接。
反相或疏水色谱柱可以使用C1-C18脂族烃或芳族烃官能团(诸如苯基基团)。正相或亲水色谱柱可以采用氧化硅(即玻璃)作为吸附剂。阳离子交换色谱柱可采用硫酸根阴离子(即SO3 -)、羧酸根阴离子(即COO-)或磷酸根阴离子(OPO3 -)。阴离子交换色谱柱可以采用仲、叔或季胺，诸如铵离子。固定化染料色谱柱可以采用染料，诸如CIBACHRONTM蓝。金属离子色谱柱可以采用金属螯合剂，诸如铜、镍、钴、锌和铁。其他选择性树脂包括三乙铵、硫醇、氨基膦酸、亚氨二醋酸、甲基葡糖胺、双-吡啶甲基胺和硫脲。生物特异性色谱柱可以采用与目标分子特异性结合的分子(例如抗体、适体、蛋白质受体或具有特定核苷酸序列的核酸)。
A.串联柱系统
在某些实施方案中，本公开提供了一种串联配对的柱系统，用于制备例如通过MS进行分析的样品。在如图1所示的示例性实施方案中，所述系统1包含彼此例如经由流体导管15流体连接的捕集柱10和分析柱20。
在某些实施方案中，如图2所示，捕集柱10和分析柱20经由多通阀30流体连接。多通阀30可以含有多个端口(例如，31、32和33)允许进出所述阀。在另外的实施方案中，捕集柱10经由第一流体导管40连接到阀30，所述第一流体导管40连接到阀30上的进入端口32。在另外的实施方案中，阀30经由第二流体导管50连接到分析柱20，第二流体导管50附接到阀30上的出口端口31。在另外的实施方案中，阀30流至废物，或通过附接到阀30上的出口端口33的第三流体导管70连接到废物容器60。
在另外的实施方案中，如图3所示，分析柱20通过第四流体导管90连接到检测器80。
在另外的实施方案中，如图4所示，泵100通过第五流体导管110连接到捕集柱10。
在一个实施方案中，所述系统以从上游到下游顺序包含泵100，所述泵100连接到第五流体导管110，转而所述第五流体导管110连接到捕集柱10，转而所述捕集柱10连接到第一流体导管40，转而所述第一流体导管40经由进入端口32连接至多通阀30，转而所述阀30经由出口端口31连接到第二流体导管50以及经由出口端口33连接到第三流体导管70两者。第三流体导管70可以任选地与废物容器60连接或被引入废物容器60。转而第二流体导管50连接到分析柱20，转而所述分析柱20连接到第四流体导管90，转而所述第四流体导管90连接到检测器80。
B.捕集柱
能够保留蛋白质的本领域已知的任何色谱树脂都可以用作捕集柱。捕集柱通常是含有高容量、低效能树脂的短柱。它们包括例如阴离子交换、阳离子交换、尺寸排阻、反相和聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂，可以使用。也可以使用HPLC色谱柱。示例性的HPLC树脂包括C18和C6。
捕集柱可商购自例如ThermoFisher Scientific(Waltham，MA)。这些包括例如DionexTM、IonPacTM和OmniPacTM反相柱以及离子交换柱。它们还包括WatersTM反相柱。
在某些实施方案中，将所述微粒制剂以低盐条件上样至捕集柱上。在某些实施方案中，将微粒制剂以“无盐”条件例如使用蒸馏水从SEC柱洗脱微粒后在蒸馏水中上样至捕集柱(参见上文)。
C.分析柱
能够分辨肽的本领域已知的任何色谱树脂都可以用作分析柱。例如，可以使用阴离子交换、阳离子交换、尺寸排阻和反相以及聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂。也可以使用HPLC色谱柱。示例性的HPLC树脂包括C18和C6。在某些实施方案中，分析柱是25cm的C18柱。与目前的10-1000nl/min的“纳米流量(nano-flow)”速率相反；本文公开的方法中使用的“正常流量(normo-flow)”速率范围为0.25-0.5ml/min，允许更快速的分析物鉴定。
D.检测器
在某些方面，本公开提供了用于确定样品中至少一种分析物(例如，微粒相关蛋白)的定量测量的方法和组合物。定量测量包括但不限于存在或不存在、绝对或相对的量或浓度、绝对或相对的增加或减少以及离散或连续范围(例如，数量、程度、水平、阈值、分位数或桶量(a bucket))。在一些实施方案中，定量测量可以是数字的绝对值、比率、平均值、中位数或范围。
1.质谱
在一些实施方案中，检测微粒相关蛋白的水平(例如，包括检测存在)是使用基于液相色谱/质谱(LCMS)的蛋白质组学分析完成的。在一个示例性的实施方案中，所述方法涉及使样品经受尺寸排阻色谱法并收集高分子量级分(例如，通过尺寸排阻色谱法)，以获得富集微粒的样品。然后将富集微粒的样品破坏(使用例如离液剂、变性剂、还原剂和/或烷基化剂)，并且使释放的内容物经受蛋白水解。然后，在通过质谱进行肽分析之前，使用本文所述的串联柱系统加工含有多个肽的破坏的外泌体制剂，以提供所述样品的蛋白质组学概况。本文公开的方法避免了与先前方法相关的蛋白质浓缩/纯化、缓冲液交换和液相色谱步骤的必要性。
样品中的蛋白质可以通过质谱检测。质谱仪通常包括离子化分析物的离子源，以及一个或多个确定质量的质量分析器。质量分析器可以在串联质谱仪中一起使用。电离方法尤其包括电喷雾或激光解吸电离。质量分析器包括四极杆、离子阱、飞行时间仪器以及扇形磁场或扇形电动仪器(magnetic or electric sector instrument)。在某些实施方案中，所述质谱仪是串联质谱仪(例如，“MS-MS”)，其使用第一质量分析器来选择一定质量的离子并且使用第二质量分析器来分析所选择的离子。串联质谱仪的一个实例是三重四极杆仪器，第一和第三四极杆用作质量过滤器，中间四极杆用作碰撞池。质谱法也可以与上游分离技术结合，诸如液相色谱或气相色谱。因此，例如，液相色谱结合串联质谱可以称为“LC-MS-MS”。
可用于本文所述分析的质谱仪包括但不限于，来自ThermoFisher Scientific的AltisTM四极杆，QuantisTM四极杆，QuantivaTM或FortisTM三重四极杆，以及来自PerkinElmer的QSightTM三重四极杆LC/MS/MS。
选择的反应监测是一种质谱方法，其中第一质量分析器选择感兴趣的多肽(前体)，碰撞池将多肽片段化为产物片段，然后在第二质量分析器中检测一个或多个片段。前体和产物离子对被称为SRM“跃迁(transition)”。所述方法通常在三重四极杆仪器中进行。当分析多肽的多个片段时，所述方法被称为多重反应监测质谱法(“MRM-MS”)。一般而言，蛋白质样品用蛋白水解酶(诸如胰蛋白酶)消化以产生肽片段。这些肽的某些的重同位素标记的类似物合成为标准品。这些标准品称为稳定同位素标准品或“SIS”。SIS肽与蛋白酶处理的样品混合。所述混合物经受三重四极杆质谱法。对应于SIS标准品的肽以高精度检测。肽可以按订单合成，或者可以作为商业试剂盒从供应商处获得，诸如例如，ThermoFisher(Waltham，MA)或Biognosys(Zurich，瑞士)。
因此，通过MRM-MS进行目标蛋白质的检测涉及检测蛋白质的一个或多个肽片段，通常通过检测稳定的同位素标准品肽来比较该肽片段。。
一般而言，可以提供有关肽质量的精确信息，并且还可以提供有关所选则的肽的片段化和/或(部分)氨基酸序列的精确信息(例如，在串联质谱法(MS/MS)或在源后衰变(TOF MS)中)的任何质谱(MS)技术均可用于本文公开的方法和组合物。合适的肽MS和MS/MS技术和系统是本领域已知的(参见，例如,Methods in Molecular Biology,第146卷:“MassSpectrometry of Proteins and Peptides”,由Chapman编辑,Humana Press 2000；Kassel和Biemann(1990)Anal.Chem.62:1691-1695；Methods Enzymol 193:455-79；或Methods inEnzymology,第402卷:“Biological Mass Spectrometry”,由Burlingame编辑,AcademicPress 2005)并且可以用于实践本文所公开的方法。因此，在一些实施方案中，所公开的方法包括:进行定量MS以测量一种或多种肽。可以以自动化的(Villanueva等，NatureProtocols(2006)1(2):880-891)或半自动化的形式进行这样的定量方法。在具体的实施方案中，MS可以可操作地连接至液相色谱装置(LC-MS/MS或LC-MS)或气相色谱装置(GC-MS或GC-MS/MS)。
如本文所用，术语“多重反应监测(MRM)”或“选择反应监测(SRM)”是指基于MS的定量方法，其特别适用于定量低丰度的分析物。在SRM实验中，通过三重四极杆仪器的两个质量过滤器选择预定义的前体离子及其一个或多个片段，并随时间监控以进行精确定量。多个SRM前体和片段离子对可以在同一实验中在色谱时间尺度上通过在不同的前体/片段对之间快速切换来测量以进行MRM实验。一系列的跃迁(前体/片段离子对)与目标分析物(例如，肽或小分子(诸如化学实体、类固醇、激素)的保留时间结合，可以构成确定的测定。在单个LC-MS实验中可以对大量分析物进行定量。相对于MRM或SRM，术语“计划的”或“动态的”是指一种测定的变体，其中特定分析物的跃迁仅在预期保留时间附近的时间窗口内获取，这大大增加了可以在单个LC-MS实验中检测和定量分析物的数量并且有助于测试的选择性，这是由于保留时间是一种取决于分析物物理性质的特性。单个分析物也可以用多于一个跃迁进行监控。最后，所述测定可以包括与感兴趣的分析物(例如，具有与分析物肽相同的氨基酸序列的肽)相对应的标准品，但由于含有稳定同位素而有所不同。可以将稳定的同位素标准品(SIS)以精确水平掺入测定中，并用于定量相应的未知分析物。额外的特异性水平获益于未知分析物及其对应的SIS的共洗脱及他们跃迁的特性(例如，分析物的两个跃迁的水平之比与其对应的SIS的两个跃迁之比的相似性)。
适用于生物标志物肽分析的质谱测定、仪器和系统可包括但不限于:基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)MS；MALDI-TOF源后衰变(PSD)；MALDI-TOF/TOF；表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱(SELDI-TOF)MS；电喷雾电离质谱(ESI-MS)；ESI-MS/MS；ESI-MS/(MS)n(n是大于零的整数)；ESI 3D或线性(2D)离子阱MS；ESI三重四极杆MS；ESI四极杆正交TOF(Q-TOF)；ESI傅里叶变换MS系统；硅上解吸/电离(DIOS)；二次离子质谱(SIMS)；大气压化学电离质谱(APCI-MS)；APCI-MS/MS；APCI-(MS)n；离子迁移光谱(IMS)；电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)；大气压光电离质谱法(APPI-MS)；APPI-MS/MS；和APPI-(MS)n。串联MS(MS/MS)排列中的肽离子片段化可以使用本领域已知的技术来实现，诸如例如，碰撞诱导解离(CID)。如本文所述，通过质谱对生物标志物进行检测和定量可以涉及多重反应监测(MRM)，诸如尤其通过Kuhn等(2004)Proteomics 4:1175-1186描述的。在LC-MS/MS分析过程中进行计划的多重反应监测(Scheduled MRM)模式采集增强肽定量的灵敏度和准确性。Anderson和Hunter(2006)Mol.Cell.Proteomics 5(4):573-588。基于质谱的测定法可以有利地与上游的肽或蛋白质分离或分级方法组合，诸如，例如，与本文所述的串联柱系统组合。
VI.诊断方法
如本文所公开的蛋白质组学分析允许鉴定生物样品中的蛋白质，所述蛋白质是病理状况的标志物。用于病理学状况的蛋白质和肽标志物是本领域已知的。例如，可以通过来自孕妇的生物学样品中某些蛋白质的存在来预测孕期病症，诸如自发性早产。参见例如WO2017/096405。癌症标志物也是已知的。参见，例如，Zhu等(2011)Oncogene 30:457-470；和Wang等(2017)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 114:13519-13524。
实施例
使用冷冻的母体血浆样品。样品可以在干冰上运输并储存在-80℃下。
通过尺寸排阻色谱法(SEC)富集微粒，并用水(无RNA酶、无DNA酶的蒸馏水)等度洗脱。尺寸排阻色谱程序使用AmericanBio(Natick，MA)制造的柱进行。简而言之，这些柱中装载有10mL的购自GE Healthcare Life Sciences(Marlborough,MA)的2％Sepharose 2B(孔径60-200um)。所述柱在冷藏条件下储存。在将所述柱用于外泌体分离之前，允许它们平衡至室温。平衡至室温后，用无RNA酶、无DNA酶的蒸馏水清洗所述柱。将至少0.5mL的融化的纯净血浆应用于所述柱。用无RNA酶、无DNA酶的蒸馏水洗脱微粒。
循环微粒在柱空隙容积中捕获，并从高丰度的蛋白质峰中部分分辨出来。来自每个临床样本的汇合的CMP柱级分的一份等分试样，其含有200ug的总蛋白(由BCA确定)，用于进一步分析。
通过将样品调节至8摩尔尿素来破坏外泌体，并用Trypsin Gold,质谱级别(Promega，100μg),消化蛋白质。将ITIH4和/或IC1的同位素标记肽添加到所述样品中进行MRM分析。所述样品分为第一等分试样和第二等分试样。
将第一等份试样上样至ThermoFisher Vanquish Flex UHPLC C18分析柱上，并在ThermoFisher TSQ Quantiva三重四极杆LC-MS/MS系统上分析。将第二等分试样上样至聚苯乙烯-二乙烯基苯捕集柱上。未结合的材料被洗脱至废物。剩余的材料先通过ThermoFisher Vanquish Flex UHPLC C18分析柱，然后在T ThermoFisher TSQ Quantiva三重四极杆LC-MS/MS系统上分析。
以上用于ITIH4分析的程序类型的示例性结果显示在图6A和6B中。在时间维度上示出了具有序列ILDDLSPR(SEQ ID NO:1)的ITIH4肽的三个重叠片段。IC1分析的结果显示在图7A和7B中。在时间维度上显示了具有序列LLDSLPSDTR(SEQ ID NO:2)的IC1肽的三个片段。直接上样至分析柱上的样品产生低强度、嘈杂的峰，而首先在捕集柱上纯化的样品在上样至分析柱上之前显示出更大丰度更尖锐的峰，具有更高的强度。
表1显示了IC1分析的可重复性，在此将样品直接上样到分析柱上-此数据对应于图7A中进行的实验。低强度、嘈杂的峰与高可变性相关，CV在40％到50％的范围内；这会导致测量值不可靠，并且无法区分两个样品，除非它们的值差异非常大(例如，一个样品的值必须大于1.1ng/mL，对比一个样品的值必须大于0.55ng/mL，以被可靠地定量为浓度不同)。与捕集法相比，平均值较低，这可能是由于样品损失和光谱仪检测能力较弱所致。此处报道的CV代表了平台的可重复性，从柱上的外泌体富集到质谱仪上目标肽的测量，整个过程从一路采集样品。
表1.无需在线捕集IC1肽的外泌体质谱平台的代表性重现性。
Figure BDA0003054436810000221
该表显示了IC1分析的可重复性，由此样品首先在捕集柱上纯化，然后再上样到分析柱上-该数据对应于图7B中进行的实验。CV在4％范围内时，明显更高的强度，更尖锐的峰与较低可变性相关；这会导致非常可靠的测量，与ELISA和其他基于抗体的技术相比非常有利，并且能够区分平均值彼此接近的两个样品(例如，可以可靠地使值为12.2ng/mL区分于值为11.3ng/mL的样品)。捕集法的平均值较高，这可能是由于在制备过程中样品损失很小，并且通过分光计可以灵敏地检测到所述肽。此处报道的CV代表了平台的可重复性，从柱上的外泌体富集到质谱仪上目标肽的测量，整个过程从一路采集样品。响应率是标准品肽和内源肽之间的比率的测量。它与标准曲线一起用于定量。所述响应率具有很高的可重复性，其表明可以可靠地检测出重(标准品)和轻(内源)肽及其相对浓度；这是系统高性能的另一个指标。
表2.具有IC1肽在线捕集的外泌体质谱分析平台的代表性重现性。
Figure BDA0003054436810000231
技术人员到技术人员可变性很低-下面的值组成了可重复性的总体平均值(在上面的表2中)，这表明优异的操作人员内部的可重复性(在同一条件下，由单个仪器或个人采集的测量值的变化)和总体可重复性。
表3.外泌体平台对于不同技术人员的可重复性
Figure BDA0003054436810000232
除非本文另有说明，否则本文公开的方法和组合物利用生物样品(例如，抽血、活检、颊拭子)和肽加工、肽分析和质谱法领域中的标准程序。
如本文所用，除非另有说明，否则以下含义适用。“可以”一词的使用是宽松的(即，意味着有可能)，而不是强制性的(即，意味着必须)。词语“包括(include)”，“包括(including)”和“包括(includes)”等表示包括但不限于。单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指代。因此，例如，对“一个元件”的提及包括两个或更多个元件的组合，尽管对于一个或更多个元件使用其他术语和短语，诸如“一个或更多个”。短语“至少一个”包括“一个”、“一个或更多个”、“一个或多个”和“多个”。除非另外指出，否则术语“或”是非排他性的，即涵盖“和”和“或”。修饰词词和序列之间的术语“…的任意”是指修饰词修饰序列的每个成员。因此，例如，短语“至少1、2或3中的任意”是指“至少1、至少2或至少3个”。术语“基本上由……组成”是指涵盖所列举的元件和其他元件，其并不实质上影响要求保护的组合的基本的和新颖的特征。
应当理解，说明书和附图并非旨在将本发明限制为所公开的特定形式，而是相反，其意图是涵盖落入本发明的精神和范围内的所有修改、等同形式和替代形式，如所附权利要求书所定义的。鉴于该描述，本发明各个方面的进一步修改和备选的实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，该说明书和附图仅应被解释为说明性的，并且目的是向本领域技术人员教导实施本发明的一般方式。应当理解，本文示出和描述的本发明的形式被视为实施方案的实例。元件和材料可以代替本文中实例说明和描述的那些，部件和过程可以颠倒或省略，并且本发明的某些特征可以独立地利用，在受益于本发明的描述之后，所有这些对于本领域技术人员将是显而易见的。在不脱离如以下权利要求书所述的本发明的精神和范围的情况下，可以对本文所述的元件做出改变。本文使用的标题仅用于组织目的，并不意味着用来限制本说明书的范围。

Claims (47)

1.一种方法，其包括:
(a)提供生物样品；
(b)针对循环微粒富集样品；
(c)使所述富集的样品经受颗粒破坏和蛋白水解消化以产生分析样品；
(d)将所述分析样品上样至捕获多肽的捕集柱上；
(e)从所述捕集柱清洗未捕获的材料；
(f)从所述捕集柱洗脱捕获的多肽，并将所述洗脱的多肽上样至与所述捕集柱流体连接的分析柱上；
(g)在所述分析柱上分离所述多肽；以及
(h)用检测器检测分离的多肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物样品包含血液、血清、血浆、唾液、脑脊髓液、羊水或尿液。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物样品是从患有选自怀孕、癌症、自发性早产、先兆子痫或糖尿病的病况的受试者中提供的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，通过尺寸排阻色谱法、超滤或反相色谱法中的一种或多种来富集所述生物样品中的微粒。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述循环微粒是外泌体。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述颗粒破坏包括:暴露于尿素、还原剂(诸如DTT、DTE、巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦或谷胱甘肽)或碘乙酰胺中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的方法，其中蛋白水解消化包括:将所述样品暴露于溴化氰(CnBr)或一种或多种蛋白酶，诸如氨基肽酶、羧肽酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶和蛋白酶k。
8.根据权利要求1所述的方法，其包括向所述分析样品中添加用于检测特定蛋白质标志物的稳定同位素标准品肽。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述捕集柱进行选自反相色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱或尺寸排阻色谱的色谱法，或者为聚苯乙烯-二乙烯基苯柱。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述捕集柱包含高效液相色谱(HPLC)柱。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述HPLC柱包含选自C18或C6的反相材料。
12.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(e)中的未捕获的材料包含选自盐和大分子或复合物的材料，所述复合物的大小大于5.5kD，或者所述大分子是大于约50个氨基酸长的多肽。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述分析柱包含高效液相色谱(HPLC)柱。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述HPLC柱包含选自C18或C6的反相材料。
15.根据权利要求1所述的方法，其中，所述捕集柱与所述分析柱之间的流体连接包含第一流体导管和第二流体导管，在它们之间设置有多通阀。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，检测包括通过所述分析柱与所述检测器之间的流体连接将分离的分析物提供给所述检测器。
17.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测器通过质谱法检测分析物。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测器包含:选自四极杆质谱仪或飞行时间质谱仪的质谱仪。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测器包含串联质谱仪。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测器包含三重四极杆质谱仪。
21.根据权利要求1所述的方法，其中，所述检测器包含三重四极杆质谱仪，并且所述检测包含多重反应监测。
22.一种系统，其包含:
(a)捕集柱；
(b)通过第一流体导管连接到所述捕集柱的多通阀；以及
(c)通过第二流体导管连接到所述多通阀的分析柱。
23.根据权利要求22所述的系统，其中，所述捕集柱上样有针对循环微粒富集的样品，其中，所述样品已经经受了颗粒破坏和蛋白水解消化。
24.根据权利要求22所述的系统，其中，所述捕集柱还包含稳定同位素标准品多肽。
25.根据权利要求22所述的系统，其还包含:
出口流体导管，其将出口端口连接到所述多通阀。
26.根据权利要求22所述的系统，其还包含:
检测器，其通过检测器流体导管连接到所述分析柱。
27.根据权利要求22所述的系统，其还包含:
泵，其中所述泵通过泵流体导管连接到所述捕集柱。
28.根据权利要求22所述的系统，其中，所述捕集柱选自反相色谱柱、阴离子交换色谱柱、阳离子交换色谱柱、聚苯乙烯-二乙烯基苯柱或尺寸排阻柱。
29.根据权利要求22所述的系统，其中，所述捕集柱包含高效液相色谱(HPLC)柱。
30.根据权利要求28所述的系统，其中，所述HPLC柱包含选自C18或C6的反相材料。
31.根据权利要求22所述的系统，其中，所述分析柱包含高效液相色谱(HPLC)柱。
32.根据权利要求26所述的系统，其中，所述检测器包含质谱仪。
33.根据权利要求26所述的系统，其中，所述检测器是选自四极杆质谱仪或飞行时间质谱仪的质谱仪。
34.根据权利要求26所述的系统，其中，所述检测器包含串联质谱仪。
35.根据权利要求26所述的系统，其中，所述检测器包含三重四极杆质谱仪。
36.根据权利要求22所述的系统，其中，所述循环微粒是外泌体。
37.一种方法，其包括:
(a)提供一种系统，其包含:
(i)捕集柱；
(ii)通过第一流体导管连接到所述捕集柱的多通阀；
(iii)通过第二流体导管连接到所述多通阀的分析柱；
(iv)通过出口流体导管连接到所述多通阀的出口端口；以及
(v)通过检测器流体导管连接到所述分析柱的检测器；
(b)使所述捕集柱上样有样品，该样品包含一种或多种分子，所述分子选自多肽、复合碳水化合物、核酸以及复合脂质，以使流过物通过所述第一流体导管、所述多通阀、以及第三流体导管；
(c)清洗所述捕集柱，以使清洗液通过所述第一流体导管、所述多通阀和所述第三流体导管；
(d)洗脱所述捕集柱，以使洗脱液通过所述第一流体导管、所述多通阀和所述第二流体导管进入所述分析柱；
(e)在所述分析柱上分离所述洗脱液的组分；
(f)使步骤(d)中分离出的组分通过第四流体导管到达所述检测器；以及
(g)检测一种或多种分离的组分。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，检测包括质谱法。
39.根据权利要求38所述的方法，其中，质谱法包含多重反应监测质谱法。
40.权利要求37所述的方法，其中步骤(a)的样品包含约1μg至约5μg的蛋白质或肽。
41.根据权利要求37所述的方法，其中所述样品包含已经经受蛋白水解处理的破坏的外泌体。
42.根据权利要求37所述的方法，其中所述样品包含选自多肽、复合碳水化合物、核酸和复合脂质的多种分子。
43.根据权利要求37或42所述的方法，其中，所述样品还包含盐。
44.根据权利要求37所述的方法，其中，所述样品包含细胞匀浆或组织匀浆。
45.根据权利要求37所述的方法，其中所述样品包含多肽、脂质和盐。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，所述样品还包含核酸和/或复合碳水化合物。
47.根据权利要求45所述的方法，其中，所述样品还包含金属。
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