JP2020005581A - γＨ２ＡＸを定量する方法、ヒストン含有試料を調製する方法、およびその利用 - Google Patents
γＨ２ＡＸを定量する方法、ヒストン含有試料を調製する方法、およびその利用 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】夾雑物を含む試料であってもγＨ２ＡＸを定量的に測定できる方法；上記方法を利用した、ＤＮＡ損傷を判定する方法、化合物のスクリーニング方法、化合物の遺伝毒性試験方法、化合物の薬効を予測する方法；およびヒストン含有試料を調製する方法、を提供すること。【解決手段】試料中のγＨ２ＡＸを定量する方法であって、試料を低張液で処理するａ１工程と、ａ１工程で得られる破砕処理した試料を高張液で洗浄処理するａ２工程と、ａ２工程で得られる洗浄処理した試料を硫酸で処理してヒストンを含む試料を調製するａ３工程とを含む、ヒストン含有試料を調製するａ工程と；ａ工程で得られるヒストン含有試料中のγＨ２ＡＸを質量分析法により検出するｂ工程と；ｂ工程で検出されるγＨ２ＡＸを絶対定量するｃ工程とを含む方法。【選択図】なし
Description
本発明は、試料中のγＨ２ＡＸを定量する方法、試料中のＤＮＡ損傷を判定する方法、化合物のスクリーニング方法、化合物の遺伝毒性試験方法、化合物の薬効を予測する方法、およびヒストン含有試料を調製する方法に関する。
ヒストンＨ２ＡＸは、ＤＮＡ二本鎖切断（double stand break：ＤＳＢ）や複製フォーク崩壊（replication fork collapse）に応答して１３９番目のセリン（Ｓｅｒ−１３９）がリン酸化されることが知られている（非特許文献１および２）。Ｓｅｒ−１３９リン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（γＨ２ＡＸ）は一か所のＤＳＢでも形成されること、ＤＳＢの数に比例して形成されること、並びに様々なＤＮＡ損傷がＤＳＢを介してγＨ２ＡＸを誘導することから、γＨ２ＡＸはＤＮＡ損傷の高感度かつ定量的なバイオマーカーとして利用されている。
γＨ２ＡＸの検出には、抗γＨ２ＡＸ抗体を用いた免疫学的手法（ウエスタンブロッティング法、免疫染色法、酵素免疫測定法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay：ＥＬＩＳＡ）、およびフローサイトメトリー法など）が汎用されている。しかしこれらの方法においては、抗体の入手先やロットにより不可避的に特異性や感度が異なる場合があることから、定量性に問題があり、絶対定量（試料中のγＨ２ＡＸ分子数を求めること）は非常に困難であった。
これらの問題を解消する方法として、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いたγＨ２ＡＸ定量法が報告された（非特許文献３）。この方法では、γＨ２ＡＸとＨ２ＡＸの２種のタンパク質が定量される。この方法では、γＨ２ＡＸおよびＨ２ＡＸを含む試料をトリプシン（消化酵素）で断片化し、得られた消化産物の中のγＨ２ＡＸおよび非リン酸化Ｈ２ＡＸに特異的な断片（ペプチド）を測定する。
また、同位体で標識された生体分子を内部標準物質として添加し、タンパク質を質量分析計で測定する方法が報告されている（特許文献１）。
Rogakou EP, Pilch DR, Orr AH, Ivanova VS, Bonner WM, DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139, Journal of Biological Chemistry, 273(10), p5858-5868, 1998.
Ward IM, Chen J, Histone H2AX is phosphorylated in an ATR-dependent manner in response to replicational stress, Journal of Biological Chemistry, 276(51), p47759-47762, 2001.
S Matsuda, T Ikura, T Matsuda, Absolute quantification of γH2AX using liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 407, p5521-5527, 2015.
特許文献１においては、測定に用いる試料（サンプル）として溶解液（生体試料から抽出して得た上清）を使用しているため、夾雑物が多く、γＨ２ＡＸの定量には不適である。非特許文献３の方法によればｉｎ ｖｉｔｒｏ（培養細胞）試料中のγＨ２ＡＸの高精度な定量が可能であるが、試料中の夾雑物が測定に干渉するため、ｉｎ ｖｉｖｏ試料中のγＨ２ＡＸを定量することができない。上記の通り、ｉｎ ｖｉｖｏ試料などの夾雑物を多く含む試料中のγＨ２ＡＸを精度よく分析するためにはさらなる改善が望まれていた。
本発明は、夾雑物を含む試料であってもγＨ２ＡＸを定量的に測定できる方法を提供することを解決すべき課題とする。また、本発明は、上記のγＨ２ＡＸの定量をもとに、試料中のＤＮＡ損傷を判定する方法、化合物のスクリーニング方法、化合物の遺伝毒性試験方法、化合物の薬効を予測する方法を提供することを解決すべき課題とする。さらに、本発明は、試料からヒストンをきれいに精製できる、ヒストン含有試料を調製する方法を提供することを解決すべき課題とする。
上記の課題は以下の手段により解決された。
＜１＞試料中のγＨ２ＡＸを定量する方法であって：
試料を低張液で処理するａ１工程と、ａ１工程で得られる破砕処理した試料を高張液で洗浄処理するａ２工程と、ａ２工程で得られる洗浄処理した試料を硫酸で処理してヒストンを含む試料を調製するａ３工程とを含む、ヒストン含有試料を調製するａ工程と；
ａ工程で得られるヒストン含有試料中のγＨ２ＡＸを質量分析法により検出するｂ工程と；
ｂ工程で検出されるγＨ２ＡＸを絶対定量するｃ工程と；
を含む方法。
＜２＞上記試料が、ヒトまたは動物から採取した体液または組織である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞体液または組織が、血液、骨髄、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胃、小腸および精巣から選ばれる、＜２＞に記載の方法。
＜４＞上記低張液が、０．５〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウムまたは０．５〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、および０．７〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを含む、＜１＞から＜３＞のいずれか一に記載の方法。
＜５＞上記高張液が、１５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウムまたは１５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む、＜１＞から＜４＞のいずれか一に記載の方法。
＜６＞ｂ工程が、ａ工程で得られるヒストン含有試料に内部標準ペプチドを添加して、トリプシン処理する工程を含む、＜１＞から＜５＞のいずれか一に記載の方法。
＜７＞ｂ工程が、液体クロマトグラフィー−質量分析法により、γＨ２ＡＸを検出する工程を含む、＜１＞から＜６＞のいずれか一に記載の方法。
＜８＞試料中のＤＮＡ損傷を判定する方法であって：
試料を低張液で処理するａ１工程と、ａ１工程で得られる破砕処理した試料を高張液で洗浄処理するａ２工程と、ａ２工程で得られる洗浄処理した試料を硫酸で処理してヒストンを含む試料を調製するａ３工程とを含む、ヒストン含有試料を調製するａ工程と；
ａ工程で得られるヒストン含有試料中のγＨ２ＡＸを質量分析法により検出するｂ工程と；
ｂ工程で検出されるγＨ２ＡＸを絶対定量するｃ工程と；
を含む方法。
＜９＞上記試料が、ヒトまたは動物から採取した体液または組織である、＜８＞に記載の方法。
＜１０＞体液または組織が、血液、骨髄、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胃、小腸および精巣から選ばれる、＜９＞に記載の方法。
＜１１＞上記低張液が、０．５〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウムまたは０．５〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、および０．７〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを含む、＜８＞から＜１０＞のいずれか一に記載の方法。
＜１２＞上記高張液が、１５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウムまたは１５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む、＜８＞から＜１１＞のいずれか一に記載の方法。
＜１３＞ｂ工程が、ａ工程で得られるヒストン含有試料に内部標準ペプチドを添加して、トリプシン処理する工程を含む、＜８＞から＜１２＞のいずれか一に記載の方法。
＜１４＞ｂ工程が、液体クロマトグラフィー−質量分析法により、γＨ２ＡＸを検出する工程を含む、＜８＞から＜１３＞のいずれか一に記載の方法。
＜１５＞上記ＤＮＡ損傷が、ＤＮＡの二本鎖切断による損傷を含む、＜８＞から＜１４＞のいずれか一に記載の方法。
＜１６＞＜１＞から＜１５＞のいずれか一に記載の方法を含む、化合物のスクリーニング方法。
＜１７＞＜１＞から＜１５＞のいずれか一に記載の方法を含む、化合物の遺伝毒性試験方法。
＜１８＞＜１＞から＜１５＞のいずれか一に記載の方法を含む、化合物の薬効を予測する方法。
＜１９＞試料を低張液で処理するａ１工程と、ａ１工程で得られる破砕処理した試料を高張液で洗浄処理するａ２工程と、ａ２工程で得られる洗浄処理した試料を硫酸で処理してヒストンを含む試料を調製するａ３工程とを含む、ヒストン含有試料を調製する方法。
＜１＞試料中のγＨ２ＡＸを定量する方法であって：
試料を低張液で処理するａ１工程と、ａ１工程で得られる破砕処理した試料を高張液で洗浄処理するａ２工程と、ａ２工程で得られる洗浄処理した試料を硫酸で処理してヒストンを含む試料を調製するａ３工程とを含む、ヒストン含有試料を調製するａ工程と；
ａ工程で得られるヒストン含有試料中のγＨ２ＡＸを質量分析法により検出するｂ工程と；
ｂ工程で検出されるγＨ２ＡＸを絶対定量するｃ工程と；
を含む方法。
＜２＞上記試料が、ヒトまたは動物から採取した体液または組織である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞体液または組織が、血液、骨髄、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胃、小腸および精巣から選ばれる、＜２＞に記載の方法。
＜４＞上記低張液が、０．５〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウムまたは０．５〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、および０．７〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを含む、＜１＞から＜３＞のいずれか一に記載の方法。
＜５＞上記高張液が、１５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウムまたは１５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む、＜１＞から＜４＞のいずれか一に記載の方法。
＜６＞ｂ工程が、ａ工程で得られるヒストン含有試料に内部標準ペプチドを添加して、トリプシン処理する工程を含む、＜１＞から＜５＞のいずれか一に記載の方法。
＜７＞ｂ工程が、液体クロマトグラフィー−質量分析法により、γＨ２ＡＸを検出する工程を含む、＜１＞から＜６＞のいずれか一に記載の方法。
＜８＞試料中のＤＮＡ損傷を判定する方法であって：
試料を低張液で処理するａ１工程と、ａ１工程で得られる破砕処理した試料を高張液で洗浄処理するａ２工程と、ａ２工程で得られる洗浄処理した試料を硫酸で処理してヒストンを含む試料を調製するａ３工程とを含む、ヒストン含有試料を調製するａ工程と；
ａ工程で得られるヒストン含有試料中のγＨ２ＡＸを質量分析法により検出するｂ工程と；
ｂ工程で検出されるγＨ２ＡＸを絶対定量するｃ工程と；
を含む方法。
＜９＞上記試料が、ヒトまたは動物から採取した体液または組織である、＜８＞に記載の方法。
＜１０＞体液または組織が、血液、骨髄、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胃、小腸および精巣から選ばれる、＜９＞に記載の方法。
＜１１＞上記低張液が、０．５〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウムまたは０．５〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、および０．７〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを含む、＜８＞から＜１０＞のいずれか一に記載の方法。
＜１２＞上記高張液が、１５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウムまたは１５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む、＜８＞から＜１１＞のいずれか一に記載の方法。
＜１３＞ｂ工程が、ａ工程で得られるヒストン含有試料に内部標準ペプチドを添加して、トリプシン処理する工程を含む、＜８＞から＜１２＞のいずれか一に記載の方法。
＜１４＞ｂ工程が、液体クロマトグラフィー−質量分析法により、γＨ２ＡＸを検出する工程を含む、＜８＞から＜１３＞のいずれか一に記載の方法。
＜１５＞上記ＤＮＡ損傷が、ＤＮＡの二本鎖切断による損傷を含む、＜８＞から＜１４＞のいずれか一に記載の方法。
＜１６＞＜１＞から＜１５＞のいずれか一に記載の方法を含む、化合物のスクリーニング方法。
＜１７＞＜１＞から＜１５＞のいずれか一に記載の方法を含む、化合物の遺伝毒性試験方法。
＜１８＞＜１＞から＜１５＞のいずれか一に記載の方法を含む、化合物の薬効を予測する方法。
＜１９＞試料を低張液で処理するａ１工程と、ａ１工程で得られる破砕処理した試料を高張液で洗浄処理するａ２工程と、ａ２工程で得られる洗浄処理した試料を硫酸で処理してヒストンを含む試料を調製するａ３工程とを含む、ヒストン含有試料を調製する方法。
本発明により、夾雑物を含む試料であってもγＨ２ＡＸを定量的に測定することが可能である。また本発明によれば、上記のγＨ２ＡＸの定量をもとに、試料中のＤＮＡ損傷を判定する方法、化合物のスクリーニング方法、化合物の遺伝毒性試験方法、化合物の薬効を予測する方法が提供される。本発明のヒストン含有試料を調製する方法によれば、試料からヒストンをきれいに精製することができる。
以下、本発明について詳細に説明する。
本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示す。
＜用語の説明＞
（γＨ２ＡＸ）
Ｈ２ＡＸタンパク質はヒストンの一種であり、その１３９番目のセリンがリン酸化したものをγＨ２ＡＸと呼ぶ。ヒストンは、ＤＮＡ分子を折り畳んで核内に収納する役割をもつ。
（γＨ２ＡＸ）
Ｈ２ＡＸタンパク質はヒストンの一種であり、その１３９番目のセリンがリン酸化したものをγＨ２ＡＸと呼ぶ。ヒストンは、ＤＮＡ分子を折り畳んで核内に収納する役割をもつ。
コアヒストンはＨ２Ａ，Ｈ２Ｂ，Ｈ３，Ｈ４の４種類に分類される。それぞれ２分子ずつ集まり、ヒストン八量体（ヒストンオクタマー）を形成する。ヒストン八量体は、ＤＮＡを巻き付け、ヌクレオソームを構成する。ヌクレオソームはクロマチン構造の最小単位である。ヒストンにはバリアントと呼ばれるサブタイプ（亜種）が存在する。例えばヒストンＨ２ＡにはＨ２ＡＸやＨ２ＡＺなどのバリアントがある。
ヒトの遺伝情報を担うＤＮＡには様々な損傷が発生している。その中でも特にＤＮＡの二本鎖切断（double-strand break：ＤＳＢ）は、染色体異常、細胞の老化、さらには細胞のがん化に深くかかわる致死的な損傷になりうる。そのため細胞は相同組み換えや非相同ＤＮＡ末端再結合など複数の損傷修復経路を有しており、日々発生するＤＮＡ ＤＳＢを修復している。ＤＮＡ ＤＳＢ損傷修復過程における重要な因子がヒストンＨ２ＡＸである。上記のとおり、Ｈ２ＡＸはヌクレオソームを構成するコアヒストンの一つであるＨ２Ａのバリアントである。ＤＮＡ ＤＳＢが発生すると傷周辺のＨ２ＡＸはリン酸化され、γＨ２ＡＸが生成される。多くのＤＮＡ損傷修復タンパク質はγＨ２ＡＸと相互作用することでＤＳＢ部位に局在し、ＤＮＡ損傷修復を行う。つまり、ＤＳＢ発生後Ｈ２ＡＸが速やかにγＨ２ＡＸに変化することによって、その位置を損傷修復タンパク質に知らせる役割を果たす。したがって、γＨ２ＡＸを絶対的に定量することができれば、ＤＮＡ損傷の程度を検知することができる。
（定量）
本発明において「定量」とは、測定対象物質の量または濃度に関する情報を検知することであり、絶対定量および相対定量を含む概念である。本発明において「絶対定量」とは、測定結果を、測定対象物質の絶対量または濃度として得ることを目的とする定量方法である。これに対し、「相対定量」とは絶対定量以外の定量方法を指し、比較対象との相対比を求める定量方法が含まれる。
本発明において「定量」とは、測定対象物質の量または濃度に関する情報を検知することであり、絶対定量および相対定量を含む概念である。本発明において「絶対定量」とは、測定結果を、測定対象物質の絶対量または濃度として得ることを目的とする定量方法である。これに対し、「相対定量」とは絶対定量以外の定量方法を指し、比較対象との相対比を求める定量方法が含まれる。
「相対定量」とは、例えば、量的には未定な所定のマススペクトルピークの強度を１００などと基準化して、これに対する他のマススペクトルピーク強度の相対的な比率（単位のない数値）を順次特定する場合が挙げられる。相対定量では、例えばγＨ２ＡＸを介したＤＮＡ損傷の測定の際にも、得られた数値（比率）に対して一義的に判断することができず、各試料間での比較がそのままではできないか、できたとしても手間のかかるものとなる。一方、絶対定量ができれば、得られた量または濃度についてその多寡を一義的に判断することができ、得られた量または濃度をもって試料間の対比や判定が可能となる。
（低張液および高張液）
低張液とは、生理食塩水の浸透圧である２８５ｍＯｓＭ未満（溶質濃度（電解質の場合イオン濃度）が２８５ｍｍｏｌ／Ｌ未満）の水溶液である。
高張液とは、生理食塩水の浸透圧である２８５ｍＯｓＭより高い（溶質濃度（電解質の場合イオン濃度）が２８５ｍｍｏｌ／Ｌより高い）水溶液である。
低張液とは、生理食塩水の浸透圧である２８５ｍＯｓＭ未満（溶質濃度（電解質の場合イオン濃度）が２８５ｍｍｏｌ／Ｌ未満）の水溶液である。
高張液とは、生理食塩水の浸透圧である２８５ｍＯｓＭより高い（溶質濃度（電解質の場合イオン濃度）が２８５ｍｍｏｌ／Ｌより高い）水溶液である。
（内部標準物質）
本発明において「内部標準物質」とは、質量分析法にて測定対象物質を定量するときに、試料中に一定量を加えられる物質をいう。本発明では、内部標準物質は、実験操作の誤差や、試料中マトリックスの影響により定量値が変動することを補正するため、試料中に一定量を加えることが好ましい。
本発明において「内部標準物質」とは、質量分析法にて測定対象物質を定量するときに、試料中に一定量を加えられる物質をいう。本発明では、内部標準物質は、実験操作の誤差や、試料中マトリックスの影響により定量値が変動することを補正するため、試料中に一定量を加えることが好ましい。
（試料）
本発明における試料の種類は特に限定されないが、試料としては、ヒトまたは動物から採取した体液または組織が好ましい。
体液または組織は、特に限定されないが、組織としては、例えば、脳、脳の各部位（例えば、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、十二指腸、小腸、大腸、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、耳下腺、舌下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などが挙げられる。体液としては、例えば、血液（血漿、血清を含む）、尿、糞、唾液、涙液、浸潤液（腹水、組織液を含む）などが挙げられる。なかでも、血液、骨髄、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胃、小腸、また精巣であることが好ましい。
本発明における試料の種類は特に限定されないが、試料としては、ヒトまたは動物から採取した体液または組織が好ましい。
体液または組織は、特に限定されないが、組織としては、例えば、脳、脳の各部位（例えば、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆嚢、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、十二指腸、小腸、大腸、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、耳下腺、舌下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などが挙げられる。体液としては、例えば、血液（血漿、血清を含む）、尿、糞、唾液、涙液、浸潤液（腹水、組織液を含む）などが挙げられる。なかでも、血液、骨髄、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胃、小腸、また精巣であることが好ましい。
（夾雑物）
本発明において「夾雑物」とは、試料中に混じっている余計なものを意味する。具体的には、試料中の検出対象物質（γＨ２ＡＸ、Ｈ２ＡＸ）以外の物質が該当する。夾雑物を構成する物質としては、生体分子が挙げられ、タンパク質、核酸、糖類、ペプチド、またはそれらの断片が例示される。
本発明において「夾雑物」とは、試料中に混じっている余計なものを意味する。具体的には、試料中の検出対象物質（γＨ２ＡＸ、Ｈ２ＡＸ）以外の物質が該当する。夾雑物を構成する物質としては、生体分子が挙げられ、タンパク質、核酸、糖類、ペプチド、またはそれらの断片が例示される。
＜試料中のγＨ２ＡＸを定量する方法＞
本発明による試料中のγＨ２ＡＸを定量する方法は、
試料を低張液で処理するａ１工程と、ａ１工程で得られる破砕処理した試料を高張液で洗浄処理するａ２工程と、ａ２工程で得られる洗浄処理した試料を硫酸で処理してヒストンを含む試料を調製するａ３工程とを含む、ヒストン含有試料を調製するａ工程と；
ａ工程で得られるヒストン含有試料中のγＨ２ＡＸを質量分析法により検出するｂ工程と；
ｂ工程で検出されるγＨ２ＡＸを絶対定量するｃ工程と；
を含む方法である。
本発明による試料中のγＨ２ＡＸを定量する方法は、
試料を低張液で処理するａ１工程と、ａ１工程で得られる破砕処理した試料を高張液で洗浄処理するａ２工程と、ａ２工程で得られる洗浄処理した試料を硫酸で処理してヒストンを含む試料を調製するａ３工程とを含む、ヒストン含有試料を調製するａ工程と；
ａ工程で得られるヒストン含有試料中のγＨ２ＡＸを質量分析法により検出するｂ工程と；
ｂ工程で検出されるγＨ２ＡＸを絶対定量するｃ工程と；
を含む方法である。
（ａ工程）
ａ工程では、体液または組織からヒストン含有試料を調製する。
ａ工程は、下記の工程ａ１、工程ａ２、および工程ａ３の手順で行われる。
ａ１工程：試料を低張液で処理する。
ａ２工程：ａ１工程で得られる破砕処理した試料を高張液で洗浄処理する。
ａ３工程：ａ２工程で得られる洗浄処理した試料を硫酸で処理してヒストンを含む試料を調製する。
ａ工程では、体液または組織からヒストン含有試料を調製する。
ａ工程は、下記の工程ａ１、工程ａ２、および工程ａ３の手順で行われる。
ａ１工程：試料を低張液で処理する。
ａ２工程：ａ１工程で得られる破砕処理した試料を高張液で洗浄処理する。
ａ３工程：ａ２工程で得られる洗浄処理した試料を硫酸で処理してヒストンを含む試料を調製する。
本発明によれば、上記したａ１工程と、ａ２工程と、ａ３工程とを含む、ヒストン含有試料を調製する方法も提供される。
本発明においては、ａ１工程〜ａ３工程の間またはその前後に、任意の別工程を含むことを妨げるものではない。例えば、低張液による処理（ａ１工程）を複数回行ってもよいし、低張液と高張液との処理（ａ１工程、ａ２工程）を複数回行って、その後に、硫酸による処理（ａ３工程）を行ってもよい。あるいは、高張液による洗浄（ａ２工程）の後に、別の有機溶剤（アセトンなど）で追加洗浄し、その後に硫酸による処理（ａ３工程）を行ってもよいし、低張液による処理（ａ１工程）の前に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄処理を行ってもよい。
（ａ１工程：低張液による試料の破砕処理）
ａ１工程で用いられる低張液は、０．１〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウム（ＫＣｌ）または０．１〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および０．５〜４．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を含むことが好ましく、０．５〜２．０ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌまたは０．５〜２．０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、および０．７〜３．０ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２を含むことがより好ましく、０．７〜１．７ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌまたは０．７〜１．７ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、および１．０〜２．０ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２を含むことがさらに好ましい。
ａ１工程で用いられる低張液は、０．１〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウム（ＫＣｌ）または０．１〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および０．５〜４．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を含むことが好ましく、０．５〜２．０ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌまたは０．５〜２．０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、および０．７〜３．０ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２を含むことがより好ましく、０．７〜１．７ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌまたは０．７〜１．７ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、および１．０〜２．０ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２を含むことがさらに好ましい。
低張液の塩濃度（ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２の濃度）を上記した範囲内にすることにより、臓器や細胞などの粉砕効果を発揮することができる。
上記で規定するＮａＣｌまたはＫＣｌ、およびＭｇＣｌ２とは、典型的には、ＮａＣｌとＭｇＣｌ２との組合せ、あるいは、ＫＣｌとＭｇＣｌ２との組合せが想定される。しかし、本発明においては、ＮａＣｌとＫＣｌとＭｇＣｌ２とを組み合わせることを妨げるものではない。ただし、このときは、ＮａＣｌとＫＣｌとの合計で上記の好ましい範囲（例えば、一番広い範囲で示すと０．１〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌ）となることが好ましい。
上記で規定するＮａＣｌまたはＫＣｌ、およびＭｇＣｌ２とは、典型的には、ＮａＣｌとＭｇＣｌ２との組合せ、あるいは、ＫＣｌとＭｇＣｌ２との組合せが想定される。しかし、本発明においては、ＮａＣｌとＫＣｌとＭｇＣｌ２とを組み合わせることを妨げるものではない。ただし、このときは、ＮａＣｌとＫＣｌとの合計で上記の好ましい範囲（例えば、一番広い範囲で示すと０．１〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌ）となることが好ましい。
低張液には、ヒドロキシ基とリン酸基とを分子中に含む有機化合物（炭素数２〜２４が好ましく、２〜１２がより好ましく、２〜８がさらに好ましい）を添加してもよく、好ましくはグリセロリン酸、より好ましくはβ−グリセロリン酸を添加してもよい。また、必要に応じて他のホスファターゼ阻害剤を添加してもよい。
低張液には、芳香族基とフッ素原子と硫黄原子とを分子中に含む有機化合物（炭素数６〜２４が好ましく、６〜１２がより好ましく、６〜８がさらに好ましい）を添加してもよく、例えば、フッ化フェニルメチルスルホニルを添加してもよい。また、必要に応じて他のプロテアーゼ阻害剤を添加してもよい。
低張液にはさらに、酸化防止剤（ジチオトレイトール（ＤＴＴ））、緩衝剤（Ｔｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）−ＨＣｌ）などを添加してもよい。
低張液には、芳香族基とフッ素原子と硫黄原子とを分子中に含む有機化合物（炭素数６〜２４が好ましく、６〜１２がより好ましく、６〜８がさらに好ましい）を添加してもよく、例えば、フッ化フェニルメチルスルホニルを添加してもよい。また、必要に応じて他のプロテアーゼ阻害剤を添加してもよい。
低張液にはさらに、酸化防止剤（ジチオトレイトール（ＤＴＴ））、緩衝剤（Ｔｒｉｓ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）−ＨＣｌ）などを添加してもよい。
低張液の添加量は、試料の量に応じて適宜定めればよいが、例えば、試料５〜５０ｍｇに対し、０．０１ｍＬ以上であることが好ましく、０．２ｍＬ以上であることがより好ましく、０．４ｍＬ以上であることがさら好ましく、０．５ｍＬ以上であることがよりさらに好ましい。上限は特にないが、低張液の量が、１００ｍＬ以下であることが好ましく、１０ｍＬ以下であることがより好ましく、５ｍＬ以下であることがさらに好ましい。
本処理により、細胞の細胞膜を低張液処理で膨張させて壊し、細胞核をむき出しにすることが好ましい。
破砕し抽出する方法は、ビーズ式細胞破砕装置、ダウンス型テフロン（登録商標）・ホモジナイザー、ポリトロン、ワーリング・ブレンダー、ポッター型ガラス・ホモジナイザー、超音波破砕装置を用いる方法または凍結融解法などが挙げられる。
定量される組織が臓器の場合、臓器に０．１〜１０ｍＬ（好ましくは、０．５〜５ｍＬ）の低張液を加え、ビーズ式細胞破砕装置などで破砕することが好ましい。その後、遠心操作により上清を除くことが好ましい。この操作で必要な臓器量は、好ましくは５ｍｇ以上５０ｍｇ未満であり、より好ましくは５ｍｇ以上３０ｍｇ未満である。
より重量の大きい臓器を処理する場合は、複数回に分けて処理することが好ましい。具体的には、臓器に０．１〜１０ｍＬ（好ましくは、０．５〜５ｍＬ）の低張液を加えて破砕した後に、５〜１００ｍｇ（好ましくは、１０〜５０ｍｇ）臓器等量分（脾臓の場合は１〜５０ｍｇ（好ましくは、２〜３０ｍｇ）等量分）の破砕液を別の容器に取り分け、これに０．１〜１０ｍＬ（好ましくは、０．５〜５ｍＬ）の低張液を加えて０〜１０℃（好ましくは、１〜５℃）で１〜３０分間（好ましくは、２〜２０分間）回転混和させることが好ましい。その後遠心操作（例えば５００〜３，０００×ｇ、１〜１０℃、２〜２０分）により上清を除くことが好ましい。
骨髄の場合は、回収した骨髄に０．１〜１０ｍＬ（好ましくは、０．５〜５ｍＬ）の低張液を加えて懸濁させ、０〜１０℃（好ましくは、１〜５℃）で１〜３０分間（好ましくは、２〜２０分間）回転混和させることが好ましい。その後遠心操作（例えば５００〜３，０００×ｇ、１〜１０℃、２〜４０分）により上清を除くことが好ましい。
血液の場合は、回収した血液から、Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）などを用いて、所定のプロトコールに従って有核細胞を回収することが好ましい。回収した有核細胞に０．１〜１０ｍＬ（好ましくは、０．５〜５ｍＬ）の低張液を加えて懸濁させ、０〜１０℃（好ましくは、１〜５℃）で１〜３０分間（好ましくは、２〜２０分間）回転混和させることが好ましい。その後遠心操作（例えば５００〜３，０００×ｇ、１〜１０℃、２〜４０分）により上清を除くことが好ましい。
（ａ２工程：高張液による試料の洗浄処理）
ａ２工程で用いられる高張液は、１００〜６００ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌまたは１００〜６００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含むことが好ましく、１５０〜５００ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌまたは１５０〜５００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含むことがより好ましく、２００〜４００ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌまたは２００〜４００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含むことがさらに好ましい。上記の濃度範囲とすることにより、十分な洗浄効果を発揮することができる。
ａ２工程で用いられる高張液は、１００〜６００ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌまたは１００〜６００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含むことが好ましく、１５０〜５００ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌまたは１５０〜５００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含むことがより好ましく、２００〜４００ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌまたは２００〜４００ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含むことがさらに好ましい。上記の濃度範囲とすることにより、十分な洗浄効果を発揮することができる。
上記で規定するＮａＣｌまたはＫＣｌは、ＮａＣｌ単独で添加する態様とＫＣｌ単独で添加する態様が想定されるが、本発明においては、ＮａＣｌとＫＣｌとを組み合わせて併用してもよい。この場合、ＮａＣｌとＫＣｌとの合計で上記の好ましい範囲（例えば、一番広い範囲で示すと１００〜６００ｍｍｏｌ／Ｌ）となることが好ましい。
低張液と高張液との電解質の濃度の差は、特に限定されないが、試料の破砕処理とその後の洗浄処理との作用的な棲み分けの観点からは、高張液の濃度と低張液の濃度との比率（高張液濃度／低張液濃度）で、２〜５０倍であることが好ましく、５〜３０倍であることがより好ましい。
高張液には、ヒドロキシ基とリン酸基とを分子中に含む有機化合物（炭素数２〜２４が好ましく、２〜１２がより好ましく、２〜８がさらに好ましい）を添加してもよく、好ましくはグリセロリン酸、より好ましくはβ−グリセロリン酸を添加してもよい。また、必要に応じて他のホスファターゼ阻害剤を添加してもよい。
高張液には、芳香族基とフッ素原子と硫黄原子とを分子中に含む有機化合物（炭素数６〜２４が好ましく、６〜１２がより好ましく、６〜８がさらに好ましい）を添加してもよく、例えば、フッ化フェニルメチルスルホニルを添加してもよい。また、必要に応じて他のプロテアーゼ阻害剤を添加してもよい。
高張液にはさらに、酸化防止剤（ＤＴＴ）、緩衝剤（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）などを添加してもよい。
高張液には、芳香族基とフッ素原子と硫黄原子とを分子中に含む有機化合物（炭素数６〜２４が好ましく、６〜１２がより好ましく、６〜８がさらに好ましい）を添加してもよく、例えば、フッ化フェニルメチルスルホニルを添加してもよい。また、必要に応じて他のプロテアーゼ阻害剤を添加してもよい。
高張液にはさらに、酸化防止剤（ＤＴＴ）、緩衝剤（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）などを添加してもよい。
高張液の添加量は、試料の量に応じて適宜定めればよいが、例えば、試料５〜５０ｍｇに対し、０．０１ｍＬ以上であることが好ましく、０．２ｍＬ以上であることがより好ましく、０．４ｍＬ以上であることがさらに好ましく、０．５ｍＬ以上であることがよりさらに好ましい。上限は特にないが、高張液の量が、１００ｍＬ以下であることが好ましく、１０ｍＬ以下であることがより好ましく、５ｍＬ以下であることがさらに好ましい。
ａ１工程で処理した試料に０．１〜１０ｍＬ（好ましくは、０．５〜５ｍＬ）の高張液を加えて懸濁させた後は、０〜１０℃（好ましくは、１〜５℃）で１〜３０分間（好ましくは、２〜２０分間）回転混和させることが好ましい。その後遠心操作（例えば５００〜３，０００×ｇ、１〜１０℃、２〜２０分）により上清を除くことが好ましい。
本処理により、夾雑物（核中の遊離タンパク質や、ＤＮＡに弱く結合したタンパク質など）を、高張液を用いて細胞核から溶出して除くことが好ましい。このとき、ヒストンはＤＮＡに強く結合しているために溶出しない。
（ａ３工程：ヒストンの硫酸抽出）
ａ３工程では、ａ２工程で得られる洗浄処理した試料を硫酸で処理してヒストンを含む試料を調製する。具体的には、試料中のヒストンを、硫酸で溶出し、溶出液中のタンパク質をトリクロロ酢酸で沈殿精製することが好ましい。
ａ３工程では、ａ２工程で得られる洗浄処理した試料を硫酸で処理してヒストンを含む試料を調製する。具体的には、試料中のヒストンを、硫酸で溶出し、溶出液中のタンパク質をトリクロロ酢酸で沈殿精製することが好ましい。
具体的には、以下の実施形態が挙げられる。
硫酸処理：
ａ２工程で処理した試料に１００〜１０００μＬ（好ましくは２００〜５００μＬ）の０．０２５〜１ｍｏｌ／Ｌ（好ましくは、０．０５〜０．５ｍｏｌ／Ｌ）の硫酸を加えて懸濁させ、３０分間以上０〜１０℃（好ましくは、１〜６℃）で回転混和する。その後遠心操作（５，０００〜３０，０００×ｇ、１〜１０℃、２〜４０分）により上清を回収する。回転混和および遠心操作を低温で行うことで、意図しない生化学反応や測定対象の分解を抑え、効率的にヒストンが抽出されるという効果が期待できる。また、遠心操作の遠心力を上記の範囲とすることで、硫酸で溶出されない夾雑物と上清が分離されるという効果が期待できる。
硫酸処理：
ａ２工程で処理した試料に１００〜１０００μＬ（好ましくは２００〜５００μＬ）の０．０２５〜１ｍｏｌ／Ｌ（好ましくは、０．０５〜０．５ｍｏｌ／Ｌ）の硫酸を加えて懸濁させ、３０分間以上０〜１０℃（好ましくは、１〜６℃）で回転混和する。その後遠心操作（５，０００〜３０，０００×ｇ、１〜１０℃、２〜４０分）により上清を回収する。回転混和および遠心操作を低温で行うことで、意図しない生化学反応や測定対象の分解を抑え、効率的にヒストンが抽出されるという効果が期待できる。また、遠心操作の遠心力を上記の範囲とすることで、硫酸で溶出されない夾雑物と上清が分離されるという効果が期待できる。
トリクロロ酢酸による処理：
硫酸処理において得た上記の上清に１０〜１０００μＬ（好ましくは５０〜５００μＬ）の９８〜１０２％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：ＴＣＡ）を加えて転倒混和し、氷上で１０〜１００分（好ましくは、２０〜５０分）静置する。氷上での静置により、効率的にタンパク質が沈殿するという効果が期待できる。次に遠心操作（５，０００〜３０，０００×ｇ、１〜１０℃、２〜４０分）によりタンパク質を沈殿させる。遠心操作を低温で行うことで、効率的にタンパク質が沈殿するという効果が期待できる。また、遠心操作の遠心力を上記の範囲とすることで、沈殿したタンパク質と上清が分離するという効果が期待できる。
硫酸処理において得た上記の上清に１０〜１０００μＬ（好ましくは５０〜５００μＬ）の９８〜１０２％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ：ＴＣＡ）を加えて転倒混和し、氷上で１０〜１００分（好ましくは、２０〜５０分）静置する。氷上での静置により、効率的にタンパク質が沈殿するという効果が期待できる。次に遠心操作（５，０００〜３０，０００×ｇ、１〜１０℃、２〜４０分）によりタンパク質を沈殿させる。遠心操作を低温で行うことで、効率的にタンパク質が沈殿するという効果が期待できる。また、遠心操作の遠心力を上記の範囲とすることで、沈殿したタンパク質と上清が分離するという効果が期待できる。
アセトンによる洗浄：
タンパク質を沈殿させた後に、沈殿を１０〜２０００μＬ（好ましくは、５０〜１０００μＬ）氷冷アセトンで２回洗浄し、風乾する。洗浄時の遠心操作は、５，０００〜３０，０００×ｇ、１〜１０℃、２〜４０分で行う。洗浄の遠心操作を低温で行うことで、意図しないタンパク質の溶出が抑えられるという効果が期待できる。また、遠心操作の遠心力を上記の範囲とすることで、沈殿タンパク質と上清が分離するという効果が期待できる。
タンパク質を沈殿させた後に、沈殿を１０〜２０００μＬ（好ましくは、５０〜１０００μＬ）氷冷アセトンで２回洗浄し、風乾する。洗浄時の遠心操作は、５，０００〜３０，０００×ｇ、１〜１０℃、２〜４０分で行う。洗浄の遠心操作を低温で行うことで、意図しないタンパク質の溶出が抑えられるという効果が期待できる。また、遠心操作の遠心力を上記の範囲とすることで、沈殿タンパク質と上清が分離するという効果が期待できる。
（ｂ工程：液体クロマトグラフィー−質量分析法）
ｂ工程では、ａ工程で得られるヒストン含有試料中のγＨ２ＡＸおよびＨ２ＡＸを質量分析法により検出する。γＨ２ＡＸおよびＨ２ＡＸの質量分析計による測定（ｂ４工程）に先立って、ｂ１工程の内部標準ペプチドの添加、ｂ２工程の消化、ｂ３工程の脱塩を行うことが好ましい。
ｂ工程では、ａ工程で得られるヒストン含有試料中のγＨ２ＡＸおよびＨ２ＡＸを質量分析法により検出する。γＨ２ＡＸおよびＨ２ＡＸの質量分析計による測定（ｂ４工程）に先立って、ｂ１工程の内部標準ペプチドの添加、ｂ２工程の消化、ｂ３工程の脱塩を行うことが好ましい。
（ｂ１工程：内部標準ペプチドの添加）
ｂ１工程により、試料に、同位体で標識された生体分子（好ましくはペプチド）を添加することが好ましい。特に、測定対象に安定同位体で標識した非リン酸化Ｈ２ＡＸおよびγＨ２ＡＸに特異的なペプチドを一定量で用いることが好ましい。同位体による標識には、放射性同位体を適用することもできるが、放射性を有さない安定同位体が、取り扱いが容易であることから好ましい。好ましくは、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏなどが挙げられる。具体的には、同位体で標識された生体分子であることが好ましく、同位体で標識されたペプチド（内部標準ペプチド）であることがより好ましい。
ｂ１工程により、試料に、同位体で標識された生体分子（好ましくはペプチド）を添加することが好ましい。特に、測定対象に安定同位体で標識した非リン酸化Ｈ２ＡＸおよびγＨ２ＡＸに特異的なペプチドを一定量で用いることが好ましい。同位体による標識には、放射性同位体を適用することもできるが、放射性を有さない安定同位体が、取り扱いが容易であることから好ましい。好ましくは、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏなどが挙げられる。具体的には、同位体で標識された生体分子であることが好ましく、同位体で標識されたペプチド（内部標準ペプチド）であることがより好ましい。
具体的には、マウスＨ２ＡＸ ［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡＳＱＥＹ、マウスγＨ２ＡＸ ［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ、ヒトＨ２ＡＸ ［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＴＱＡＳＱＥＹ、ヒトγＨ２ＡＸ ［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＴＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹが挙げられる。Ａはアラニン、Ｓはセリン、Ｑはグルタミン、Ｅはグルタミン酸、Ｙはチロシン、Ｔはトレオニンである。ｐＳはセリンがリン酸化されたことを意味している。
内部標準ペプチドの添加量は適宜必要に応じて定めればよいが、例えば、ａ工程で得られた試料１００μＬに対して、γＨ２ＡＸおよびＨ２ＡＸに対応する内部標準ペプチドを、各０．１〜２０ｎｇで添加することが好ましく、０．５〜１０ｎｇ添加することがより好ましく、１〜５ｎｇで添加することが特に好ましい。
ｂ１工程では、重炭酸アンモニウムを添加してもよい。重炭酸アンモニウムの添加量は、例えば、試料（５ｍｇ以上５０ｍｇ未満の臓器から抽出したヒストン）に対して、１００ｍｍｏｌ／Ｌの重炭酸アンモニウムを１０〜１０００μＬであることが好ましく、５０〜５００μＬであることがより好ましく、７０〜３００μＬであることが特に好ましい。
（ｂ２工程：消化）
ｂ２工程により、ヒストンをＬＣ−ＭＳで定量可能なペプチドに消化することが好ましい。消化方法には、酵素消化、化学分解などが挙げられ、好ましくは酵素消化であるが、これに限定されるものではなく、適当なものを選択すればよい。酵素消化に用いる酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｎ、Ａｓｐ−Ｎ、Ｇｌｕ−Ｃなどが挙げられ、好ましくはトリプシンである。消化処理の温度は特に限定されないが２０℃〜５０℃が好ましく、３０℃〜４０℃であることがより好ましい。
消化酵素の添加量は、上記ａ工程で得た試料（５ｍｇ以上５０ｍｇ未満の臓器から抽出したヒストン）に対して、０．１μｇ／μＬの濃度で０．１〜２００μＬであることが好ましく、１〜１００μＬであることがより好ましく、２〜５０μＬであることがさらに好ましい。
ｂ２工程により、ヒストンをＬＣ−ＭＳで定量可能なペプチドに消化することが好ましい。消化方法には、酵素消化、化学分解などが挙げられ、好ましくは酵素消化であるが、これに限定されるものではなく、適当なものを選択すればよい。酵素消化に用いる酵素としては、トリプシン、キモトリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｎ、Ａｓｐ−Ｎ、Ｇｌｕ−Ｃなどが挙げられ、好ましくはトリプシンである。消化処理の温度は特に限定されないが２０℃〜５０℃が好ましく、３０℃〜４０℃であることがより好ましい。
消化酵素の添加量は、上記ａ工程で得た試料（５ｍｇ以上５０ｍｇ未満の臓器から抽出したヒストン）に対して、０．１μｇ／μＬの濃度で０．１〜２００μＬであることが好ましく、１〜１００μＬであることがより好ましく、２〜５０μＬであることがさらに好ましい。
（ｂ３工程：ペプチドの脱塩）
ｂ３工程により、消化産物のうち、測定対象を含むペプチドを脱塩精製することが好ましい。精製する方法は、例えば、脱塩チップ（例えば、ＧＬ−Ｔｉｐ ＧＣ（ＧＬサイエンス社）など）を用いて、所定のプロトコールに従って脱塩精製する態様が挙げられる。脱塩チップを用いた脱塩精製の一例を示すと、ペプチド試料を脱塩チップに通液させることで、チップに充填されたレジンにペプチドを吸着させる。次いで、洗浄ステップを繰り返し実行することで、汚染物を除去し、超高純度なペプチド分画を達成することができる。最終段階で、少量の低ｐＨ溶出バッファでレジンからペプチドが溶出し、高純度な濃縮ペプチドを得ることができる。
ｂ３工程により、消化産物のうち、測定対象を含むペプチドを脱塩精製することが好ましい。精製する方法は、例えば、脱塩チップ（例えば、ＧＬ−Ｔｉｐ ＧＣ（ＧＬサイエンス社）など）を用いて、所定のプロトコールに従って脱塩精製する態様が挙げられる。脱塩チップを用いた脱塩精製の一例を示すと、ペプチド試料を脱塩チップに通液させることで、チップに充填されたレジンにペプチドを吸着させる。次いで、洗浄ステップを繰り返し実行することで、汚染物を除去し、超高純度なペプチド分画を達成することができる。最終段階で、少量の低ｐＨ溶出バッファでレジンからペプチドが溶出し、高純度な濃縮ペプチドを得ることができる。
あるいは、アフィニティーカラム精製、カチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、順相クロマトグラフィーなどを利用する方法、免疫沈降法、硫安沈殿法、有機溶媒による沈殿法、限外ろ過法、ゲルろ過法、透析法などが挙げられる。
脱塩精製した後は、ペプチド溶出液を遠心濃縮機で乾燥させることが好ましい。
脱塩精製した後は、ペプチド溶出液を遠心濃縮機で乾燥させることが好ましい。
（ｂ４工程：検出工程）
ｂ４工程では、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳやＬＣ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳなどのＬＣ−ＭＳ）により、γＨ２ＡＸおよびＨ２ＡＸ並びにそれらの内部標準ペプチドを検出する工程を含むことが好ましい。
ｂ４工程では、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳやＬＣ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳなどのＬＣ−ＭＳ）により、γＨ２ＡＸおよびＨ２ＡＸ並びにそれらの内部標準ペプチドを検出する工程を含むことが好ましい。
・液体クロマトグラフィー（ＬＣ）
液体クロマトグラフィーは、従来公知のものを適宜選定して使用することができ、例えば、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー：High Performance Liquid Chromatography）が挙げられる。ＨＰＬＣ装置は、分離カラム、試料導入部、および移動相を分離カラムに送り込むポンプを備える。ＨＰＬＣ装置は、それ以外の要素、例えば、オートサンプラー、ヒーター、分離された成分を検出する検出器、脱気装置、カラムオーブン、データ処理装置などを備えていてもよい。検出器としては、例えば、ＵＶ検出器や蛍光検出器、示差屈折率検出器、蒸発光散乱検出器、荷電化粒子検出器、電気化学検出器、電気伝導度検出器などが挙げられる。例えば、検出器は、カラムとイオン源（イオン化部）の間に接続することができる。
液体クロマトグラフィーは、従来公知のものを適宜選定して使用することができ、例えば、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー：High Performance Liquid Chromatography）が挙げられる。ＨＰＬＣ装置は、分離カラム、試料導入部、および移動相を分離カラムに送り込むポンプを備える。ＨＰＬＣ装置は、それ以外の要素、例えば、オートサンプラー、ヒーター、分離された成分を検出する検出器、脱気装置、カラムオーブン、データ処理装置などを備えていてもよい。検出器としては、例えば、ＵＶ検出器や蛍光検出器、示差屈折率検出器、蒸発光散乱検出器、荷電化粒子検出器、電気化学検出器、電気伝導度検出器などが挙げられる。例えば、検出器は、カラムとイオン源（イオン化部）の間に接続することができる。
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）は、より迅速に高感度で分離分析が可能な超高速液体クロマトグラフィー（Ultra High Performance Liquid Chromatography、以下、ＵＨＰＬＣ、ＵＰＬＣなどと記載することがある）を用いてもよい。ＵＰＬＣは６０ＭＰａ以上で高圧送液が可能であることが好ましく、１００ＭＰａ程度での高圧送液が可能であることがより好ましい。ＨＰＬＣとの明確な境はないが、ＵＰＬＣは通常粒径２μｍ程度の充填剤のカラムを用い、例えばＨＰＬＣの１／１０程度でより高速に、より高分離能での分析が可能である。分離カラムやポンプなどの装置部品の基本構成は、各仕様は別として、ＨＰＬＣと同様である。
ＵＰＬＣは、高圧に耐え得る粒子を充填したカラムを使用しており、上記のとおり、ＨＰＬＣ装置に比べてより迅速に高感度で分離分析が可能である。ＵＰＬＣによる分離条件はＨＰＬＣの条件設定を行う場合の検討と同様に行うことができ、当業者であれば適宜条件を設定できる。
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）による分離の方法としては、ＨＩＬＩＣ（親水性相互作用クロマトグラフィー：Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography）、ＲＰＬＣ（逆相クロマトグラフィー：Reversed Phase Liquid Chromatography）、イオンペア試薬を用いたクロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーなどを挙げることができる。
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）に用いる移動相としては、酸性または塩基性である水溶液の移動相Ａと、有機溶媒を含む移動相Ｂとを組み合わせて使用することが好ましい。
移動相ＡのｐＨ値は、使用するカラムの種類に応じて設定すればよい。ＬＣに用いる移動相Ａとして、例えば、酸性の場合はギ酸水溶液、塩基性の場合は重炭酸アンモニウム水溶液を用いることができる。酸性の移動相Ａがギ酸水溶液であるとき、例えば０．０１％〜１．０％（Ｖ／Ｖ）のギ酸水溶液を用いることができる。溶媒としての水は、純水または超純水であることが好ましい。
移動相ＡのｐＨ値は、使用するカラムの種類に応じて設定すればよい。ＬＣに用いる移動相Ａとして、例えば、酸性の場合はギ酸水溶液、塩基性の場合は重炭酸アンモニウム水溶液を用いることができる。酸性の移動相Ａがギ酸水溶液であるとき、例えば０．０１％〜１．０％（Ｖ／Ｖ）のギ酸水溶液を用いることができる。溶媒としての水は、純水または超純水であることが好ましい。
移動相Ｂに用いられる有機溶媒としては、非プロトン性極性有機溶媒が好ましく、具体的には、アセトニトリル、メタノール、２−プロパノールまたはエタノールなどが挙げられ、好ましくはアセトニトリルまたはメタノールであり、より好ましくはアセトニトリルである。
移動相Ｂとして、アセトニトリルを使用する場合、移動相中のアセトニトリルの濃度は任意に調節すればよく、例えば、０〜１００％（ｖ／ｖ）で調節でき、さらに１〜８０％（ｖ／ｖ）で調節できる。移動相Ａの溶媒としては、水（純水または超純水が好ましい）を使用することができる。
溶出は、移動相Ａと移動相Ｂの比率を経時的に変化させるリニアグラジエント溶出により行っても、移動相Ａと移動相Ｂの比率を変化させないイソクラティック溶出により行ってもよい。
溶出は、移動相Ａと移動相Ｂの比率を経時的に変化させるリニアグラジエント溶出により行っても、移動相Ａと移動相Ｂの比率を変化させないイソクラティック溶出により行ってもよい。
液体クロマトグラフィーに用いられる分析カラムの条件としては、特に制限されず、諸条件に応じて適宜選択することができる。分配クロマトグラフィーにおける分離カラムとしては、順相カラムを用いても、逆相カラムを用いてもよい。順相（normal phase）の場合は固定相の極性が移動相の極性よりも大きい。逆相（reversed phase）の場合は、固定相の極性が移動相の極性よりも小さい。順相カラムの充填剤（固定相）の代表例としては、シリカゲルである。逆相カラムの充填剤の典型例としては、ＯＤＳ（オクタデシルシリル化シリカゲル）充填剤を充填したカラムが挙げられる。したがって、順相分配クロマトグラフィーでは、極性が大きな溶質ほどカラムに保持される。逆に、逆相分配クロマトグラフィーでは、疎水性が大きな溶質ほどカラムに保持される。本発明において、必要に応じてカラムを使い分ければよいが、γＨ２ＡＸおよびＨ２ＡＸ並びにそれらの内部標準物質を分離する観点で、ＯＤＳカラムを用いた逆相分配クロマトグラフィーが好ましい。ＵＰＬＣによる分析を行う観点からは、粒径が１．５μｍ以上のオクタデシルシリル化シリカゲル充填剤を充填したカラム（ＯＤＳカラム）を使用することが好ましい。充填剤（ＯＤＳ）の粒径はさらに１．７〜５．０μｍであることがより好ましく、粒径は１．８〜３．０μｍであることがさらに好ましい。
溶出法は、イソクラティック溶出法とグラジエント溶出法を適宜選択すればよいが、クロマトグラム上で確認できる夾雑物と測定対象物質を十分に分離することが好ましい。クロマトグラム上では確認できないがマトリクス由来の成分がイオン化効率に悪影響を与える可能性があるため、保持時間を長く保つことが、好ましい。グラジエントの条件は特に限定されず、例えば、アセトニトリル（移動相Ｂ）と、ギ酸水溶液（移動相Ａ）の送液の比率を調節することが挙げられる。
流速は、分離カラムの内径などの諸条件に応じて適宜選択できる。分離溶液の流速は、分離工程を通じて一定であってもよく、そうでなくてもよい。例えば、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）に合わせて０．１〜１．５ｍＬ／分の範囲で適宜選択することができる。
また、液体クロマトグラフィーにおけるカラム温度は、当業者であれば、分析対象や使用する分析カラムの仕様に合わせて適宜選択することができる。
また、液体クロマトグラフィーにおけるカラム温度は、当業者であれば、分析対象や使用する分析カラムの仕様に合わせて適宜選択することができる。
・質量分析計（ＭＳ）
本工程では、上記の液体クロマトグラフィーで分離したγＨ２ＡＸとＨ２ＡＸの質量を質量分析法（ＭＳ：mass spectrometry）により同定することが好ましい。
質量分析計（mass spectrometer）は公知の質量分析計が使用できるが、特にＬＣ装置に直列に接続することが可能なものが好ましい。用いられる質量分析計は、１つであってもよく、２つまたはそれ以上であってもよい。２つまたはそれ以上の質量分析計は、直列に接続して用いることができる。すなわち、ＬＣ−ＭＳシステムは、例えば、直列に接続された２つまたはそれ以上の質量分析計を備える、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳやＬＣ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳであってよい。
本工程では、上記の液体クロマトグラフィーで分離したγＨ２ＡＸとＨ２ＡＸの質量を質量分析法（ＭＳ：mass spectrometry）により同定することが好ましい。
質量分析計（mass spectrometer）は公知の質量分析計が使用できるが、特にＬＣ装置に直列に接続することが可能なものが好ましい。用いられる質量分析計は、１つであってもよく、２つまたはそれ以上であってもよい。２つまたはそれ以上の質量分析計は、直列に接続して用いることができる。すなわち、ＬＣ−ＭＳシステムは、例えば、直列に接続された２つまたはそれ以上の質量分析計を備える、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳやＬＣ−ＭＳ／ＭＳ／ＭＳであってよい。
質量分析計としては、磁場セクター型質量分析計（magnetic sector mass spectrometer）、四重極型質量分析計（quadrupole mass spectrometer：ＱＭＳ）、飛行時間質量分析計（time-of-flight mass spectrometer：ＴＯＦ−ＭＳ）、イオントラップ質量分析計（ion trap mass spectrometer）、フーリエ変換質量分析計（fourier transform mass spectrometer）などが挙げられる。本発明においては、なかでも、タンデム四重極型質量分析計が好ましい。
質量分析計におけるイオン化法としては、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）、高速原子衝撃法（ＦＡＢ）、光イオン化法（ＡＰＰＩ）、電子イオン化法（ＥＩ法）、化学イオン化法（ＣＩ法）、電界脱離法（ＦＤ法）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ法）、および音速イオン化法（ＳＳＩ）が挙げられるが、特にエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）が好ましい。
タンデム四重極型質量分析計は、イオン源、四重極（Ｑ１）、コリジョンセル（Ｑ２）、四重極（Ｑ３）、検出器で構成される質量分析計である。測定対象物質は、イオン源でイオン化され、プリカーサーイオンが生成され、その質量電荷比（ｍ／ｚ）によって、四重極（Ｑ１）で質量分離される。次いで、コリジョンセル（Ｑ２）内で窒素やアルゴンなどの不活性ガスと衝突させることでプロダクトイオンが生成される（衝突誘起解離：ＣＩＤ）。プロダクトイオンの質量電荷比（ｍ／ｚ）によって、四重極（Ｑ３）で再度、質量分離され、検出器で検出される。
上述のように、本発明においては、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いることが好ましく、液体クロマトグラフィーにより分離した試料を、インターフェース（イオン源）を介してイオン化し、生成したイオンは第一の質量分析計（ＭＳ）で分離して特定の質量イオンを解離・フラグメント化させる。そのイオンを第二の質量分析計で検出することが好ましい。このとき、系内には、ポジティブイオン、ネガティブイオン、荷電していない中性分子が生成しうる。
ＭＳ／ＭＳは、プリカーサーイオンを衝突誘起解離させて得られたプロダクトイオンをモニターする手法が好ましい。すなわち、多重反応モニタリング（Multiple Reaction Monitoring：ＭＲＭ）あるいは選択反応モニタリング（selected reaction monitoring：ＳＲＭ）があるが、本発明においては、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）が好ましい。
ＳＲＭは、プロダクトイオンスキャンにより得られた特定のプロダクトイオンのｍ／ｚを利用することで、選択性の高い高感度定量が行える。ここでは、Ｑ１でプリカーサーを選択し、コリジョンセルにおいてＣＩＤを行い、Ｑ３で特定のプロダクトイオンを選定し検出する。
ＭＲＭは、イオン化プローブでイオン化したさまざまなイオンに対し、Ｑ１において特定のプリカーサーイオンを選択し、コリジョンセルでそのイオンを壊し（ＣＩＤ）、Ｑ３において壊したイオン（プロダクトイオン）の中から特定のイオンを検出する方法である。一度の測定で複数のチャンネルを設定することができる利点を有し、同時定量には好ましいモニタリング法である。例えば、市販品で、一分析最大５１２イベント×３２チャンネルの設定が可能である。
一方、アナライザは真空下に導入されたイオンを分離する部分である。イオン源では分子関連イオンであるポジティブイオンおよびネガティブイオン、また荷電していない中性分子も生成する。しかし、正負両イオンを同時に取り込むことは原理的に不可能である。そのため、正負イオンを同時にモニターするには時間で正負を切り替えて測定しなければならない。本発明においては、多重反応モニタリングをポジティブイオンモードで行うことが好ましい。
検出部は、分析部で選別されたイオンを電子増倍管またはマイクロチャンネルプレートで増感して検出する部位である。データ処理部は、得られたデータからマススペクトルを作製する部位である。
ｂ工程における具体的な検出条件としては、ＬＣ−ＭＳを通じた条件として、１〜２００μＬ（好ましくは、１０〜１００μＬ）の０．１〜５０％（好ましくは、１〜１０％）（ｖ／ｖ）アセトニトリル／０．０１〜５％（好ましくは、０．０５〜１％）（ｖ／ｖ）ギ酸混合液を加えて溶解し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に用いることが好ましい。その後、０．１〜５０μＬ（好ましくは、１〜２０μＬ）試料を流速０．０１〜５０ｍＬ／分（好ましくは、０．１〜２ｍＬ／分）でカラムに展開し、溶出することが好ましい。
ＬＣ−ＭＳにおける各保持時間（Retention Time）で、イソクラティックとリニアグラジエントの溶出分を分離し、質量分析計に連動させることが好ましい。ＭＳ／ＭＳ分析は多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで行うことが好ましい。
ペプチド定量に用いることができるＭＲＭ条件は、測定対象物質の標準品（ペプチド）を用いて適宜最適化したものを用いることが好ましく、例えば、本発明のＭＲＭ条件（ヒト、マウス）は、以下のとおりに設定することがより好ましい。
（Ｑ１ ｍ／ｚ ＞ Ｑ３ ｍ／ｚ）
（Ｑ１ ｍ／ｚ ＞ Ｑ３ ｍ／ｚ）
マウスＨ２ＡＸ
ＡＳＱＡＳＱＥＹ（配列番号１）（４４２．３＞１８２．０）
［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡＳＱＥＹ（配列番号１）（４４４．３＞１８２．０）内部標準ぺプチド
ＡＳＱＡＳＱＥＹ（配列番号１）（４４２．３＞１８２．０）
［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡＳＱＥＹ（配列番号１）（４４４．３＞１８２．０）内部標準ぺプチド
マウスγＨ２ＡＸ
ＡＳＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ（４８２．４＞１８２．１）
［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ（４８４．４＞１８２．０）内部標準ぺプチド
ＡＳＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ（４８２．４＞１８２．１）
［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ（４８４．４＞１８２．０）内部標準ぺプチド
ヒトＨ２ＡＸ
ＡＴＱＡＳＱＥＹ（配列番号２）（４４９．５＞１８２．０）
［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＴＱＡＳＱＥＹ（配列番号２）（４５１．５＞１８２．０）内部標準ぺプチド
ＡＴＱＡＳＱＥＹ（配列番号２）（４４９．５＞１８２．０）
［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＴＱＡＳＱＥＹ（配列番号２）（４５１．５＞１８２．０）内部標準ぺプチド
ヒトγＨ２ＡＸ
ＡＴＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ（４８９．４＞１８２．１）
［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＴＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ（４９１．５＞１８２．１）内部標準ぺプチド
ＡＴＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ（４８９．４＞１８２．１）
［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＴＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ（４９１．５＞１８２．１）内部標準ぺプチド
（ｂ５工程：Ｈ２ＡＸの総分子数に対するγＨ２ＡＸの分子数の割合の算出）
本工程および次のｃ工程により、試料中のγＨ２ＡＸおよびＨ２ＡＸに特異的なペプチドを定量することができる。具体的には、Ｈ２ＡＸの総分子数（γＨ２ＡＸ分子数＋Ｈ２ＡＸ分子数）に対するγＨ２ＡＸの分子数の割合（以下、この比率を「γＨ２ＡＸ存在率」と呼ぶ）を算出する。なお、図２においては、「γＨ２ＡＸ分子数＋Ｈ２ＡＸ分子数」を、「総Ｈ２ＡＸ」と表記している。
本工程および次のｃ工程により、試料中のγＨ２ＡＸおよびＨ２ＡＸに特異的なペプチドを定量することができる。具体的には、Ｈ２ＡＸの総分子数（γＨ２ＡＸ分子数＋Ｈ２ＡＸ分子数）に対するγＨ２ＡＸの分子数の割合（以下、この比率を「γＨ２ＡＸ存在率」と呼ぶ）を算出する。なお、図２においては、「γＨ２ＡＸ分子数＋Ｈ２ＡＸ分子数」を、「総Ｈ２ＡＸ」と表記している。
（ｃ工程）
ｃ工程では、ｂ工程で検出されるγＨ２ＡＸを絶対定量する。
ｃ工程では、ｂ工程で検出されるγＨ２ＡＸを絶対定量する。
γＨ２ＡＸ存在率を求める手段としては、例えば、本目的に適合する計算ソフトまたはプログラムを有する電子計算機（コンピューター）を使用することができる。
各ペプチドの定量は、各ペプチドのクロマトグラムピーク面積と同位体で標識した内部標準物質のクロマトグラムピーク面積の比を求めて定量する。具体的に、非リン酸化Ｈ２ＡＸ（マウスＡＳＱＡＳＱＥＹ）の絶対定量測定をする場合の例を下記に挙げる。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより非リン酸化Ｈ２ＡＸ（マウスＡＳＱＡＳＱＥＹ）のピークが得られたとする。このピークの位置と、同位体で標識した内部標準物質のピークとが一致しペアとなるものを確認する。内部標準物質のピークが同位体非リン酸化Ｈ２ＡＸ（マウスＡＳＱＡＳＱＥＹ）のものだったとする。であれば、検出されたピークは非リン酸化Ｈ２ＡＸ（マウスＡＳＱＡＳＱＥＹ）のものと特定できる。他のペプチドも同様にして種類が特定される。特定された各ペプチドとその内部標準ペプチドのクロマトグラムピーク面積を計測する。この面積の比を求めれば、相対的な定量が可能となる。
本発明においては、各ペプチドの検量線を予め作成し、作成した検量線に基づいて各ペプチドを定量することが好ましい。これにより、例えば、非リン酸化Ｈ２ＡＸ（マウスＡＳＱＡＳＱＥＹ）の検量線と照らし合わせることで、先に検出された非リン酸化Ｈ２ＡＸ（マウスＡＳＱＡＳＱＥＹ）と同位体非リン酸化Ｈ２ＡＸ（マウスＡＳＱＡＳＱＥＹ）のクロマトグラムピーク面積との比から、絶対量を測定することができる。同様にして、各ペプチドの絶対定量が可能となる。検量線作成用試料として、分析対象の各ペプチドの標準物質、および内部標準物質としての同位体で標識した上記各ペプチドを含むサンプルを用いることが好ましい。Ｈ２ＡＸの総分子数は、非特許文献１に従い、非リン酸化Ｈ２ＡＸ（マウスＡＳＱＡＳＱＥＹ、ヒトＡＴＱＡＳＱＥＹ）とγＨ２ＡＸ（マウスＡＳＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ、ヒトＡＴＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ）の和として算出する。
＜試料中のＤＮＡ損傷を判定する方法＞
本発明によれば、化学物質の遺伝毒性や、抗がん剤のがん殺傷作用（薬効）や正常組織への殺傷作用（副作用）を、夾雑物を相当量含むサンプル、すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏだけではなく、ｉｎ ｖｉｖｏサンプル（組織、血液）でも定量することが可能となる。したがって、上述したようなＤＮＡ損傷のレベルを、直接生体から採取した検体によって判定することができ、より正確な評価が可能となる。
本発明によれば、化学物質の遺伝毒性や、抗がん剤のがん殺傷作用（薬効）や正常組織への殺傷作用（副作用）を、夾雑物を相当量含むサンプル、すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏだけではなく、ｉｎ ｖｉｖｏサンプル（組織、血液）でも定量することが可能となる。したがって、上述したようなＤＮＡ損傷のレベルを、直接生体から採取した検体によって判定することができ、より正確な評価が可能となる。
化学物質のＤＮＡを傷つける活性は、細胞のがん化や細胞死に繋がりうる。細胞のがん化で捉えると、化学物質の安全性評価においてＤＮＡ損傷性は遺伝毒性と呼ばれ、重要視される毒性の１つである。細胞死で捉えると、ＤＮＡ損傷の誘導はがん細胞を殺傷する抗がん剤の作用メカニズムに関する有力な情報となりうる。
バイオマーカーであるγＨ２ＡＸは、細胞内のＤＮＡ二本鎖が切断された際に形成される生体内分子であり、ＤＮＡ損傷の高感度かつ定量的なバイオマーカーとして利用されている。このγＨ２ＡＸを利用することにより、細胞のＤＮＡ損傷の場所やレベルを特定することが可能となる。さらに、個体全体の生物学的影響を評価することもできる。がん治療薬の多くはがん細胞にＤＮＡ損傷を誘発することでがん細胞を死滅させる。そのため、がん治療薬投与後、実際にがん細胞にＤＮＡ損傷が誘発されているか、また逆に、がん細胞以外に過度のＤＮＡ損傷が誘発されていないかをγＨ２ＡＸの検出によって確認することが可能となる。
上記の通り、本発明の一実施形態としては、上記したａ工程、ｂ工程およびｃ工程を含む、試料中のＤＮＡ損傷を判定する方法が提供される。本実施形態においても、低張液の濃度や高張液の濃度、その他の検出条件など、あるいは、その好ましい範囲は、上記で述べた通りである。上記したＤＮＡ損傷は、ＤＮＡの二本鎖切断による損傷を含むことが好ましい。
＜化合物のスクリーニング方法、化合物の遺伝毒性試験方法および化合物の薬効を予測する方法＞
ＤＮＡ損傷マーカーとしてのγＨ２ＡＸの適用例として、レギュラトリーサイエンスにおける化学物質や環境汚染物質の遺伝毒性評価、創薬におけるＤＮＡ損傷を誘導する抗がん剤の薬効評価、臨床におけるがんの放射線治療や化学療法の治療成績評価などが挙げられる。したがって、本発明のγＨ２ＡＸの定量方法は、化合物のスクリーニング方法、化合物の遺伝毒性試験方法および化合物の薬効を予測する方法として使用することができる。
ＤＮＡ損傷マーカーとしてのγＨ２ＡＸの適用例として、レギュラトリーサイエンスにおける化学物質や環境汚染物質の遺伝毒性評価、創薬におけるＤＮＡ損傷を誘導する抗がん剤の薬効評価、臨床におけるがんの放射線治療や化学療法の治療成績評価などが挙げられる。したがって、本発明のγＨ２ＡＸの定量方法は、化合物のスクリーニング方法、化合物の遺伝毒性試験方法および化合物の薬効を予測する方法として使用することができる。
以下に本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれにより限定して解釈されるものではない。
（実施例１）マウスへの遺伝毒性物質マイトマイシンＣ投与による遺伝毒性評価
本実施例においては、遺伝毒性物質マイトマイシンＣをマウスに投与した後の、各臓器、体液中のγＨ２ＡＸの経時変化を定量した。
本実施例においては、遺伝毒性物質マイトマイシンＣをマウスに投与した後の、各臓器、体液中のγＨ２ＡＸの経時変化を定量した。
（マウスへの投与）
８週齢の雄ＩＣＲマウスに２ｍｇ／ｋｇマイトマイシンＣを腹腔内投与し、投与後２、４、８、２４、および４８時間後に安楽死させ、血液、骨髄、肝臓、胃、小腸、脾臓、肺、腎臓、および精巣を採取した。陰性対照として無処理のマウスを用いた。
８週齢の雄ＩＣＲマウスに２ｍｇ／ｋｇマイトマイシンＣを腹腔内投与し、投与後２、４、８、２４、および４８時間後に安楽死させ、血液、骨髄、肝臓、胃、小腸、脾臓、肺、腎臓、および精巣を採取した。陰性対照として無処理のマウスを用いた。
（１）低張液による試料の処理
臓器：
臓器に１ｍＬの低張液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール、０．２ｍｍｏｌ／Ｌフッ化フェニルメチルスルホニル、１０ｍｍｏｌ／Ｌ β−グリセロリン酸）（以下、本低張液を低張液Ａと称する）を加え、ビーズ式細胞破砕装置で破砕した。その後遠心操作（１，３００×ｇ、４℃、５分）により上清を除いた。
臓器：
臓器に１ｍＬの低張液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール、０．２ｍｍｏｌ／Ｌフッ化フェニルメチルスルホニル、１０ｍｍｏｌ／Ｌ β−グリセロリン酸）（以下、本低張液を低張液Ａと称する）を加え、ビーズ式細胞破砕装置で破砕した。その後遠心操作（１，３００×ｇ、４℃、５分）により上清を除いた。
骨髄：
回収した骨髄に１ｍＬの低張液Ａを加えて懸濁させ、４℃で１０分間回転混和した。その後遠心操作（１，３００×ｇ、４℃、５分）により上清を除いた。
回収した骨髄に１ｍＬの低張液Ａを加えて懸濁させ、４℃で１０分間回転混和した。その後遠心操作（１，３００×ｇ、４℃、５分）により上清を除いた。
血液：
回収した血液から、Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、所定のプロトコールに従って有核細胞を回収した。回収した有核細胞に１ｍＬの低張液Ａを加えて懸濁させ、４℃で１０分間回転混和した。その後遠心操作（１，３００×ｇ、４℃、５分）により上清を除いた。
回収した血液から、Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、所定のプロトコールに従って有核細胞を回収した。回収した有核細胞に１ｍＬの低張液Ａを加えて懸濁させ、４℃で１０分間回転混和した。その後遠心操作（１，３００×ｇ、４℃、５分）により上清を除いた。
（２）高張液による試料の洗浄処理
（１）で処理した試料に１ｍＬの高張液（３００ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、０．２ｍｍｏｌ／Ｌフッ化フェニルメチルスルホニル、１０ｍｍｏｌ／Ｌ β−グリセロリン酸）を加えて懸濁させ、４℃で１０分間回転混和した。その後、遠心操作（１，３００×ｇ、４℃、５分）により上清を除去した。
（１）で処理した試料に１ｍＬの高張液（３００ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、０．２ｍｍｏｌ／Ｌフッ化フェニルメチルスルホニル、１０ｍｍｏｌ／Ｌ β−グリセロリン酸）を加えて懸濁させ、４℃で１０分間回転混和した。その後、遠心操作（１，３００×ｇ、４℃、５分）により上清を除去した。
図１には、マウス肝臓から抽出したヒストンの精製度を示している。ここでは、マウス肝臓１５．６〜２３．２ｍｇから低張液中で破砕した後に、沈殿からヒストンを酸抽出（高張液による洗浄なし）、または低張液〜高張液にあたるＫＣｌ濃度の洗浄液で沈殿を洗浄した後にヒストンを酸抽出した。その後、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動で展開してクマシーブリリアントブルー染色を行った。ヒストンを示すバンドを矢印で示した。この結果から、高張液による洗浄を行わない場合は、ヒストンを分離できていないことが分かる。これに対し、高張液を用いたものではヒストンを好適に分離できていることが分かる。特に、高張液の濃度が１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上になると、より精度よくヒストンを分離できていることが分かる。
（３）ヒストンの硫酸による抽出
（２）で処理した試料に４００μＬの０．２ｍｏｌ／Ｌ硫酸を加えて懸濁させ、３０分間以上４℃で回転混和した。その後遠心操作（１６，０００×ｇ、４℃、１０分）により上清を回収した。上清に１３２μＬの１００％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を加えて転倒混和し、氷上で３０分間静置した。次に遠心操作（１６，０００×ｇ、４℃、１０分）によりタンパク質を沈殿させた後に、沈殿を５００μＬ氷冷アセトンで２回洗浄し、風乾した。洗浄時の遠心操作は、１６，０００×ｇ、４℃、５分で行った。
（２）で処理した試料に４００μＬの０．２ｍｏｌ／Ｌ硫酸を加えて懸濁させ、３０分間以上４℃で回転混和した。その後遠心操作（１６，０００×ｇ、４℃、１０分）により上清を回収した。上清に１３２μＬの１００％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を加えて転倒混和し、氷上で３０分間静置した。次に遠心操作（１６，０００×ｇ、４℃、１０分）によりタンパク質を沈殿させた後に、沈殿を５００μＬ氷冷アセトンで２回洗浄し、風乾した。洗浄時の遠心操作は、１６，０００×ｇ、４℃、５分で行った。
（４）トリプシン消化
（３）の試料に１００μＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウムと、測定対象の安定同位体で標識したペプチド、つまり非リン酸化Ｈ２ＡＸおよびγＨ２ＡＸに特異的な内部標準ペプチド（マウスＨ２ＡＸ ［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡＳＱＥＹ、マウスγＨ２ＡＸ ［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ）を各１．５ｎｇで添加し、溶解、懸濁した。
次に１０μＬの０．１μｇ／μＬトリプシンを添加し、３７℃で一晩静置した。
（３）の試料に１００μＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウムと、測定対象の安定同位体で標識したペプチド、つまり非リン酸化Ｈ２ＡＸおよびγＨ２ＡＸに特異的な内部標準ペプチド（マウスＨ２ＡＸ ［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡＳＱＥＹ、マウスγＨ２ＡＸ ［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ）を各１．５ｎｇで添加し、溶解、懸濁した。
次に１０μＬの０．１μｇ／μＬトリプシンを添加し、３７℃で一晩静置した。
（５）ペプチドの脱塩
（４）の試料中のペプチドを、脱塩チップＧＬ−Ｔｉｐ ＧＣ（ＧＬサイエンス）を用いて、所定のプロトコールに従って脱塩精製した。次にチップから溶出したペプチド溶出液を遠心濃縮機で乾燥させた。
（４）の試料中のペプチドを、脱塩チップＧＬ−Ｔｉｐ ＧＣ（ＧＬサイエンス）を用いて、所定のプロトコールに従って脱塩精製した。次にチップから溶出したペプチド溶出液を遠心濃縮機で乾燥させた。
（６）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
（５）の試料に５０μＬ ５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸混合液を加えて溶解し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に用いた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳはＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ−ＣｌａｓｓＢｉｏ／Ｘｅｖｏ ＴＱ−Ｓ ｍｉｃｒｏ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いた。５μＬ試料を流速０．３ｍＬ／分でＵＨＰＬＣ−ＰＥＥＫ ２．１×１００ｍｍ ｃｏｌｕｍｎ ｐａｃｋｅｄ ｗｉｔｈ ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＳｗｉｆｔ Ｃ１８ １．９μｍ （ＧＬサイエンス）に展開し、以下のように溶出した（溶離液Ａ ０．１％ギ酸、溶離液Ｂ アセトニトリル）。
（５）の試料に５０μＬ ５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸混合液を加えて溶解し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に用いた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳはＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ−ＣｌａｓｓＢｉｏ／Ｘｅｖｏ ＴＱ−Ｓ ｍｉｃｒｏ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いた。５μＬ試料を流速０．３ｍＬ／分でＵＨＰＬＣ−ＰＥＥＫ ２．１×１００ｍｍ ｃｏｌｕｍｎ ｐａｃｋｅｄ ｗｉｔｈ ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＳｗｉｆｔ Ｃ１８ １．９μｍ （ＧＬサイエンス）に展開し、以下のように溶出した（溶離液Ａ ０．１％ギ酸、溶離液Ｂ アセトニトリル）。
０−０．５分：１％ 溶離液Ｂ イソクラティック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）、０．５−７分：３０％ 溶離液Ｂへのリニアグラジエント（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）、７−９分：８０％ 溶離液Ｂへのリニアグラジエント、９−１０分：８０％ 溶離液Ｂ イソクラティック、１０−１３．５分：１％ 溶離液Ｂ イソクラティック
ＭＳ／ＭＳ分析は多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで、以下の条件で行った。
霧化ガス，窒素、イオン源温度，１５０°Ｃ、脱溶媒温度，５５０°Ｃ、脱溶媒ガス流量，１２００Ｌ／ｈ、キャピラリー電圧，１．５ｋＶ、コーン電圧，２５Ｖ、コーンガス流量，１１０Ｌ／ｈ、衝突ガス，アルゴン
ペプチド定量に用いたＭＲＭ条件は以下のとおりである。
（Ｑ１ ｍ／ｚ ＞ Ｑ３ ｍ／ｚ）。
ＡＳＱＡＳＱＥＹ（配列番号１）（４４２．３ ＞ １８２．０）
ＡＳＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ（４８２．４ ＞ １８２．０）
［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡＳＱＥＹ（配列番号１）（４４４．３ ＞ １８２．０）
［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ（４８４．４ ＞ １８２．０）
（Ｑ１ ｍ／ｚ ＞ Ｑ３ ｍ／ｚ）。
ＡＳＱＡＳＱＥＹ（配列番号１）（４４２．３ ＞ １８２．０）
ＡＳＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ（４８２．４ ＞ １８２．０）
［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡＳＱＥＹ（配列番号１）（４４４．３ ＞ １８２．０）
［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ（４８４．４ ＞ １８２．０）
各ペプチドは、測定対象ペプチドとその同位体で標識された内部標準ペプチドのピーク面積比で定量した。検量線の作成には内部標準を添加したペプチド標準品を用いた。Ｈ２ＡＸの総分子数は、非特許文献１に従い、非リン酸化Ｈ２ＡＸ（マウスＡＳＱＡＳＱＥＹ）とγＨ２ＡＸ（マウスＡＳＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ）の和として算出した。
図２は、上記のとおりＨ２ＡＸの総分子数に対するγＨ２ＡＸの分子数の比率（γＨ２ＡＸ存在率）を測定した結果をグラフに整理したものである。陰性対照（０時間）として無処理のマウスを用いた。平均±標準偏差、ｎ＝５（小腸、血液以外）。小腸の標本数は、グラフの各測定点に示した。血液は、５匹分を１つにプールして測定した。
無処理条件では、精巣のγＨ２ＡＸレベルが最も高く（２．１８％）、次いで骨髄（０．３５％）、胃（０．２６％）、血液（０．２４％）、脾臓（０．２３％）、腎臓（０．１６％）、肝臓（０．１２％）、小腸（０．１１％）、肺（０．０７％）の順にγＨ２ＡＸレベルが高かった。２ｍｇ／ｋｇマイトマイシンＣを腹腔内投与したところ、精巣以外の臓器でγＨ２ＡＸの増加が見られたが、その経時変化は臓器によって異なっていた。精巣ではγＨ２ＡＸの変化は見られなかった。
以上の結果より、本発明によれば、夾雑物が含まれるｉｎ ｖｉｖｏ試料（臓器や体液）であっても、高張液による洗浄を行うことにより、γＨ２ＡＸを定量的に測定することができた。これにより、生物へのマイトマイシンＣの投与によるγＨ２ＡＸの経時的変化をとらえることができる。
＜比較例＞
（１）の処理として、細胞塊を１ｍＬ低張液に懸濁させ、４℃で３０分間回転混和させた。その後遠心操作（１０，０００×ｇ、４℃、１０分）により上清を除いた。高張液による処理は行わず、（３）、（４）、および（５）の処理は実施例と同様にして行った。（６）の分析は実施例と同様に行った。その結果、本試料では、夾雑物の影響から、満足な分析結果を得ることはできなかった。
（１）の処理として、細胞塊を１ｍＬ低張液に懸濁させ、４℃で３０分間回転混和させた。その後遠心操作（１０，０００×ｇ、４℃、１０分）により上清を除いた。高張液による処理は行わず、（３）、（４）、および（５）の処理は実施例と同様にして行った。（６）の分析は実施例と同様に行った。その結果、本試料では、夾雑物の影響から、満足な分析結果を得ることはできなかった。
（実施例２）マウスＸｅｎｏｇｒａｆｔモデルによる抗がん剤の薬効および副作用評価
本実施例においては、ヒト卵巣癌細胞株ＥＳ−２細胞を皮下移植したＸｅｎｏｇｒａｆｔモデルマウスに抗がん剤を投与した後の、各臓器のγＨ２ＡＸの経時変化を定量した。
トポテカン塩酸塩（Topotecan-HCl）は、Biocompounds Pharmaceutical社より購入した。トポテカン塩酸塩溶液の調製には、生理食塩水(大塚製薬)を用いた。
１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジン／９．４％スクロース溶液は、スクロース９．４ｇ／１００ｍＬである水溶液に、ヒスチジン濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにした溶液である。
マウス卵巣癌細胞株ES-2細胞は、ATCC細胞バンクより入手した。
１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジン／９．４％スクロース溶液は、スクロース９．４ｇ／１００ｍＬである水溶液に、ヒスチジン濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにした溶液である。
マウス卵巣癌細胞株ES-2細胞は、ATCC細胞バンクより入手した。
（試料採取）
ヒト卵巣癌細胞株ＥＳ−２細胞３×１０６個を雌性ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕマウスの脇腹部皮下に移植し、皮下腫瘍を形成させた。移植7日後に２ｍｇ／ｋｇのトポテカン塩酸塩溶液を静脈内に投与し、投与３時間後または２４時間後に腫瘍および骨髄細胞を採取した。腫瘍はメスを用いて壊死のない中央部分を薄く輪切りにし、約２０ｍｇの切片を作成した。骨髄細胞は両脛骨を取り出した後、脛骨遠位端骨頭を切断し、遠心機にて９，１００×ｇ、１分遠心して回収した。試料は使用直前まで−８０℃で冷凍保存した。陰性対照として、１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジン／９．４％（ｗ／ｖ）スクロース溶液を投与して２４時間後のマウスを用いた。
（１）低張液による試料の処理
腫瘍：
腫瘍に１ｍＬの低張液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール、０．２ｍｍｏｌ／Ｌフッ化フェニルメチルスルホニル、１０ｍｍｏｌ／Ｌ β−グリセロリン酸）（以下、本低張液を低張液Ａと称する）を加え、ビーズ式細胞破砕装置で破砕した。その後遠心操作（１，３００×ｇ、４℃、５分）により上清を除いた。
骨髄：
回収した骨髄に１ｍＬの低張液Ａを加えて懸濁させ、４℃で１０分間回転混和した。その後遠心操作（１，３００×ｇ、４℃、５分）により上清を除いた。
ヒト卵巣癌細胞株ＥＳ−２細胞３×１０６個を雌性ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕマウスの脇腹部皮下に移植し、皮下腫瘍を形成させた。移植7日後に２ｍｇ／ｋｇのトポテカン塩酸塩溶液を静脈内に投与し、投与３時間後または２４時間後に腫瘍および骨髄細胞を採取した。腫瘍はメスを用いて壊死のない中央部分を薄く輪切りにし、約２０ｍｇの切片を作成した。骨髄細胞は両脛骨を取り出した後、脛骨遠位端骨頭を切断し、遠心機にて９，１００×ｇ、１分遠心して回収した。試料は使用直前まで−８０℃で冷凍保存した。陰性対照として、１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジン／９．４％（ｗ／ｖ）スクロース溶液を投与して２４時間後のマウスを用いた。
（１）低張液による試料の処理
腫瘍：
腫瘍に１ｍＬの低張液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌ２、１ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール、０．２ｍｍｏｌ／Ｌフッ化フェニルメチルスルホニル、１０ｍｍｏｌ／Ｌ β−グリセロリン酸）（以下、本低張液を低張液Ａと称する）を加え、ビーズ式細胞破砕装置で破砕した。その後遠心操作（１，３００×ｇ、４℃、５分）により上清を除いた。
骨髄：
回収した骨髄に１ｍＬの低張液Ａを加えて懸濁させ、４℃で１０分間回転混和した。その後遠心操作（１，３００×ｇ、４℃、５分）により上清を除いた。
（２）高張液による試料の洗浄処理
実施例１の（２）高張液による試料の洗浄処理と同様の方法で、洗浄処理を行った。
実施例１の（２）高張液による試料の洗浄処理と同様の方法で、洗浄処理を行った。
（３）ヒストンの硫酸による抽出
実施例１の（３）ヒストンの硫酸による抽出と同様の方法で、抽出処理を行った。
実施例１の（３）ヒストンの硫酸による抽出と同様の方法で、抽出処理を行った。
（４）トリプシン消化
（３）の試料に１００μＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウムと、測定対象の安定同位体で標識したペプチド、つまり非リン酸化Ｈ２ＡＸおよびγＨ２ＡＸに特異的な内部標準ペプチド（マウスＨ２ＡＸ ［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡＳＱＥＹ、マウスγＨ２ＡＸ ［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ、ヒトＨ２ＡＸ ［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＴＱＡＳＱＥＹ、ヒトγＨ２ＡＸ ［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＴＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ）を各１．５ｎｇで添加し、溶解、懸濁した。
次に１０μＬの０．１μｇ／μＬトリプシンを添加し、３７℃で一晩静置した。
（３）の試料に１００μＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌ重炭酸アンモニウムと、測定対象の安定同位体で標識したペプチド、つまり非リン酸化Ｈ２ＡＸおよびγＨ２ＡＸに特異的な内部標準ペプチド（マウスＨ２ＡＸ ［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡＳＱＥＹ、マウスγＨ２ＡＸ ［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ、ヒトＨ２ＡＸ ［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＴＱＡＳＱＥＹ、ヒトγＨ２ＡＸ ［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＴＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ）を各１．５ｎｇで添加し、溶解、懸濁した。
次に１０μＬの０．１μｇ／μＬトリプシンを添加し、３７℃で一晩静置した。
（５）ペプチドの脱塩
実施例１の（５）ペプチドの脱塩と同様の方法で、脱塩処理を行った。
実施例１の（５）ペプチドの脱塩と同様の方法で、脱塩処理を行った。
（６）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
（５）の試料に５０μＬ ５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸混合液を加えて溶解し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に用いた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳはＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ−ＣｌａｓｓＢｉｏ／Ｘｅｖｏ ＴＱ−Ｓ ｍｉｃｒｏ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いた。５μＬ試料を流速０．３ｍＬ／分でＵＨＰＬＣ−ＰＥＥＫ ２．１×１００ｍｍ ｃｏｌｕｍｎ ｐａｃｋｅｄ ｗｉｔｈ ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＳｗｉｆｔ Ｃ１８ １．９μｍ （ＧＬサイエンス）に展開し、以下のように溶出した（溶離液Ａ ０．１％ギ酸、溶離液Ｂ アセトニトリル）。
（５）の試料に５０μＬ ５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル／０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸混合液を加えて溶解し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に用いた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳはＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ−ＣｌａｓｓＢｉｏ／Ｘｅｖｏ ＴＱ−Ｓ ｍｉｃｒｏ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いた。５μＬ試料を流速０．３ｍＬ／分でＵＨＰＬＣ−ＰＥＥＫ ２．１×１００ｍｍ ｃｏｌｕｍｎ ｐａｃｋｅｄ ｗｉｔｈ ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＳｗｉｆｔ Ｃ１８ １．９μｍ （ＧＬサイエンス）に展開し、以下のように溶出した（溶離液Ａ ０．１％ギ酸、溶離液Ｂ アセトニトリル）。
０−１分：１％ 溶離液Ｂ イソクラティック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）、１−７分：３０％ 溶離液Ｂへのリニアグラジエント（ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）、７−９分：８０％ 溶離液Ｂへのリニアグラジエント、９−１０分：８０％ 溶離液Ｂ イソクラティック、１０−１３．５分：１％ 溶離液Ｂ イソクラティック
ＭＳ／ＭＳ分析は多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで、以下の条件で行った。
霧化ガス，窒素、イオン源温度，１５０°Ｃ、脱溶媒温度，５５０°Ｃ、脱溶媒ガス流量，１２００Ｌ／ｈ、キャピラリー電圧，１．５ｋＶ、コーン電圧，２５Ｖ、コーンガス流量，１１０Ｌ／ｈ、衝突ガス，アルゴン
ペプチド定量に用いたＭＲＭ条件は以下のとおりである。
（Ｑ１ ｍ／ｚ ＞ Ｑ３ ｍ／ｚ）。
ＡＳＱＡＳＱＥＹ（配列番号１）（４４２．３ ＞ １８２．０）
ＡＳＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ（４８２．４ ＞ ４３３．３）
ＡＴＱＡＳＱＥＹ（配列番号２）（４４９．５ ＞ １８２．０）
ＡＴＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ（４８９．４ ＞ １８２．１）
［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡＳＱＥＹ（配列番号１）（４４４．３ ＞ １８２．０）
［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ（４８４．４ ＞ ４３５．３）
［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＴＱＡＳＱＥＹ（配列番号２）（４５１．５ ＞ １８２．０）
［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＴＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ（４９１．５ ＞ １８２．１）
（Ｑ１ ｍ／ｚ ＞ Ｑ３ ｍ／ｚ）。
ＡＳＱＡＳＱＥＹ（配列番号１）（４４２．３ ＞ １８２．０）
ＡＳＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ（４８２．４ ＞ ４３３．３）
ＡＴＱＡＳＱＥＹ（配列番号２）（４４９．５ ＞ １８２．０）
ＡＴＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ（４８９．４ ＞ １８２．１）
［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡＳＱＥＹ（配列番号１）（４４４．３ ＞ １８２．０）
［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＳＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ（４８４．４ ＞ ４３５．３）
［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＴＱＡＳＱＥＹ（配列番号２）（４５１．５ ＞ １８２．０）
［１３Ｃ３，１５Ｎ］ＡＴＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ（４９１．５ ＞ １８２．１）
各ペプチドは、測定対象ペプチドとその同位体で標識された内部標準ペプチドのピーク面積比で定量した。検量線の作成には内部標準を添加したペプチド標準品を用いた。Ｈ２ＡＸの総分子数は、非特許文献１に従い、非リン酸化Ｈ２ＡＸ（マウスＡＳＱＡＳＱＥＹまたはヒトＡＴＱＡＳＱＥＹ）とγＨ２ＡＸ（マウスＡＳＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹまたはヒトＡＴＱＡ（ｐＳ）ＱＥＹ）の和として算出した。
図３は、上記のとおりＨ２ＡＸの総分子数に対するγＨ２ＡＸの分子数の比率（γＨ２ＡＸ存在率）を測定した結果をグラフに整理したものである。ヒト卵巣癌細胞株ＥＳ−２細胞を播種した雌性ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕマウスに２ｍｇ／ｋｇトポテカンを投与し、３時間または２４時間後の骨髄および腫瘍内のγＨ２ＡＸレベルを測定した。陰性対照として１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジン／９．４％（ｗ／ｖ）スクロース溶液を投与して２４時間後のマウスを用いた。測定値（ｎ＝１）または平均値（ｎ＝２）を棒グラフで、各個体の測定値をひし形で示した。
骨髄からはヒト非リン酸化およびリン酸化（γ）Ｈ２ＡＸは検出されなかった。陰性対照群の骨髄中マウスγＨ２ＡＸレベルは０．４１％であったのに対し、トポテカン投与３時間後には０．９１％に増加した。以上より、骨髄にはマウス非リン酸化およびリン酸化（γ）Ｈ２ＡＸのみが存在し、トポテカン投与により骨髄にＤＮＡ損傷が生じたことが強く示唆された。腫瘍からは、ヒトおよびマウス両方の非リン酸化およびリン酸化（γ）Ｈ２ＡＸが検出された。腫瘍中ヒトγＨ２ＡＸレベルは、陰性対照群では４．５％であったのに対し、トポテカン投与３時間後には１３．７％にまで増加し、投与２４時間後には１１．３％に減少した。腫瘍中マウスγＨ２ＡＸレベルは陰性対照群で０．４％であったのに対し、トポテカン投与３時間後には２．３％にまで増加し、投与２４時間後には０．６％に減少した。このことは、マウス皮下で形成されたヒト由来腫瘍にはヒトとマウス由来の細胞が混在し、トポテカン投与により双方の細胞にＤＮＡ損傷が生じたことを強く示唆している。
以上の結果により、本測定法は抗がん剤の薬効および副作用評価に有用であること、臓器間のγＨ２ＡＸレベルを同じ手法で直接比較可能であること、同一サンプル中のヒトおよびマウス由来細胞に生じたＤＮＡ損傷の程度（γＨ２ＡＸレベル）を切り分けて定量的に評価できることが示された。
Claims (19)
- 試料中のγＨ２ＡＸを定量する方法であって：
試料を低張液で処理するａ１工程と、ａ１工程で得られる破砕処理した試料を高張液で洗浄処理するａ２工程と、ａ２工程で得られる洗浄処理した試料を硫酸で処理してヒストンを含む試料を調製するａ３工程とを含む、ヒストン含有試料を調製するａ工程と；
ａ工程で得られるヒストン含有試料中のγＨ２ＡＸを質量分析法により検出するｂ工程と；
ｂ工程で検出されるγＨ２ＡＸを絶対定量するｃ工程と；
を含む方法。 - 前記試料が、ヒトまたは動物から採取した体液または組織である、請求項１に記載の方法。
- 体液または組織が、血液、骨髄、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胃、小腸および精巣から選ばれる、請求項２に記載の方法。
- 前記低張液が、０．５〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウムまたは０．５〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、および０．７〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記高張液が、１５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウムまたは１５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
- ｂ工程が、ａ工程で得られるヒストン含有試料に内部標準ペプチドを添加して、トリプシン処理する工程を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
- ｂ工程が、液体クロマトグラフィー−質量分析法により、γＨ２ＡＸを検出する工程を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
- 試料中のＤＮＡ損傷を判定する方法であって：
試料を低張液で処理するａ１工程と、ａ１工程で得られる破砕処理した試料を高張液で洗浄処理するａ２工程と、ａ２工程で得られる洗浄処理した試料を硫酸で処理してヒストンを含む試料を調製するａ３工程とを含む、ヒストン含有試料を調製するａ工程と；
ａ工程で得られるヒストン含有試料中のγＨ２ＡＸを質量分析法により検出するｂ工程と；
ｂ工程で検出されるγＨ２ＡＸを絶対定量するｃ工程と；
を含む方法。 - 前記試料が、ヒトまたは動物から採取した体液または組織である、請求項８に記載の方法。
- 体液または組織が、血液、骨髄、肺、肝臓、腎臓、脾臓、胃、小腸および精巣から選ばれる、請求項９に記載の方法。
- 前記低張液が、０．５〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウムまたは０．５〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、および０．７〜３．０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウムを含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記高張液が、１５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化カリウムまたは１５０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む、請求項８から１１のいずれか一項に記載の方法。
- ｂ工程が、ａ工程で得られるヒストン含有試料に内部標準ペプチドを添加して、トリプシン処理する工程を含む、請求項８から１２のいずれか一項に記載の方法。
- ｂ工程が、液体クロマトグラフィー−質量分析法により、γＨ２ＡＸを検出する工程を含む、請求項８から１３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＤＮＡ損傷が、ＤＮＡの二本鎖切断による損傷を含む、請求項８から１４のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１から１５の何れか一項に記載の方法を含む、化合物のスクリーニング方法。
- 請求項１から１５の何れか一項に記載の方法を含む、化合物の遺伝毒性試験方法。
- 請求項１から１５の何れか一項に記載の方法を含む、化合物の薬効を予測する方法。
- 試料を低張液で処理するａ１工程と、ａ１工程で得られる破砕処理した試料を高張液で洗浄処理するａ２工程と、ａ２工程で得られる洗浄処理した試料を硫酸で処理してヒストンを含む試料を調製するａ３工程とを含む、ヒストン含有試料を調製する方法。
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|---|---|---|---|---|
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| CN113625325A (zh) * | 2021-08-12 | 2021-11-09 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种用于检测环境低剂量电离辐射的方法 |
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