CN111257405A - 一种利用质谱定量技术对基因毒性物质进行鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种利用质谱定量技术对基因毒性物质进行鉴定的方法。具体地，本申请涉及一种利用LC‑MS/MS对样品中下述蛋白的特征性多肽片段进行定量分析的方法：H2AX、γ‑H2AX、H3和/或p‑H3。通过该方法可灵敏和准确的定量区分不同毒作用模式的基因毒性物质，而且能够动态监测基因毒性物质影响DNA损伤、修复及转录的全过程，可用于基因毒性的快速筛查和定量评估。
Description
技术领域
本发明涉及基因毒性检测领域，具体涉及一种利用质谱定量技术对基因毒性物质进行鉴定的方法。
背景技术
由于受空气、水、食品及药品等污染，人类不可避免地会接触有毒物质。基因毒性物质属于有毒物质中重要的一类，它们能够直接或间接损伤DNA，导致基因突变、染色体断裂或非整倍体损伤，且有致癌性可能。近年来已屡次发生已上市药品因存在痕量的基因毒性杂质而被强行召回的案例，例如2018年浙江华海药业、2019年辉瑞日本分公司先后由于在缬沙坦原料药中检出了微量致癌物N-亚硝基二甲胺(NDMA)等杂质，而被迫召回已上市产品，给企业和社会造成了巨大的经济损失。目前各国的法规机构如ICH、FDA和EMA等都对新药研发中的基因毒性杂质提出了明确及严格的控制和检测要求。如何构建基因毒性筛查、鉴别、分类和定量分析技术，已成为新时期医药研究等领域的新挑战。
目前的基因毒性测试方法已经由传统的动物体内实验转向体外测试方法。至今已发展的基因毒性体外评价方法包括：细菌致突变Ames试验、淋巴瘤细胞Tk基因突变试验、单细胞凝胶电泳试验和微核试验等，这些方法已被较广泛应用，但遗憾的是，依然不适用于早期的高通量快速筛选、灵敏度和特异性仍有待提升以解决常见的假阳性问题、尤其是无法实现对基因毒性的准确定量。系列瓶颈问题的存在，极大限制了上述技术的进一步推广应用。更重要的是，现有技术不能够区分两类重要的基因毒性物质，即致染色体断裂化合物和非整倍体化合物。不同作用模式的基因毒性物质，其与癌症性的相关性差异显著，在候选药物的前期筛选过程中将会被决定不同的去留命运：致染色体断裂化合物会直接被淘汰，而非整倍体化合物则可先被留下参与后续的临床前研究。因此，亟待寻求新的途径以建立满足上述要求的基因毒性测试新方法。
H2AX是组蛋白2A家族成员之一，当DNA受到紫外线、电离辐射和基因毒性化合物等损伤作用后，尤其是发生DNA双链断裂后，H2AX蛋白C端139位的丝氨酸残基快速发生磷酸化，形成磷酸化组蛋白H2AX即γ-H2AX。γ-H2AX是DNA损伤的生物标志物，已被明确为致染色体断裂化合物基因毒性的特异性效应指标。p-H3是指组蛋白H3的10位丝氨酸发生磷酸化，在有丝分裂过程中，H3S10经Aurora激酶作用而发生磷酸化，以促使染色质凝集和染色体分离，众多研究已证实p-H3是细胞有丝分裂的生物标志物，是非整倍体基因毒性特异性效应指标。在基因毒性测试体系中，引入γ-H2AX和p-H3的组合分析策略，可望在检测基因毒性的同时实现对不同基因毒性作用模式的评价。
目前国内外研究γ-H2AX和p-H3的手段主要局限于免疫学方法，例如免疫印迹法和酶联免疫吸附试验等。上述方法具有特异性较好、直观的优点，但是其受限于抗体，不可避免免疫学方法中的一些缺陷，而更重要的是存在着共同的短板：无法对γ-H2AX和p-H3进行准确定量，进而无法实现对基因损伤、修复及转录具体过程的定量评估。
发明内容
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
如未特别说明，本文中对氨基酸位点的描述，均是以活性蛋白(例如组蛋白H3，H2AX)的野生型全长序列为基础的。
组蛋白H3与组蛋白H2A、H2B和H4是真核细胞染色质的组成部分。组蛋白H3可通过几种不同类型的表观遗传修饰来影响细胞的生命进程，如转录激活/失活、染色体包装和DNA损伤/修复。表观遗传修饰包括乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化和ADP核糖基化，通过组蛋白修饰酶的催化，对组蛋白H3的N-末端结构域进行修饰，导致核小体结构重构为更容易接近转录复合物的一个开放构象。在大多数物种中，组蛋白H3的乙酰化主要发生在第9、14、18、23和56位赖氨酸上；甲基化主要发生在第4、9、27、36和79位赖氨酸上；磷酸化主要发生在第10和28位丝氨酸(Ser)、第3和11位酪氨酸上。组蛋白H3的磷酸化，特别是10位Ser(Ser10)的磷酸化，和立即早期基因(immediate early gene，例如c-jun,c-fos,c-mys)的诱导表达直接相关。
本发明人用胰蛋白酶水解组蛋白H3获得一段含有Ser10的多肽，即H3的9-17位氨基酸片段KSTGGKAPR，并对9-位，14-位以及N末端进行烷基化或酰基化修饰，得到用于H3定量分析的特征性多肽片段。在一些实施方案中，对所述多肽片段进一步进行Ser10磷酸化，得到用于磷酸化组蛋白p-H3定量分析的特征性多肽片段。在一些实施方案中，所述用于H3定量分析的特征性多肽片段为上述氨基酸片段的9-位，14-位赖氨酸(K)以及N末端氨基经丙酰化修饰得到的氨基酸片段(即本文所述多肽3)。在一些实施方案中，所述用于p-H3定量分析的特征性多肽片段为多肽3的Ser10被磷酸化的氨基酸片段(即本文中所述多肽4)。
H2AX多肽链有142个氨基酸残基，其N端120个残基与H2A1的该段氨基酸序列几乎完全相同，C端的22个残基序列与目前已知的脊椎动物H2A家族其它蛋白序列没有同源性，这段序列在进化上高度保守，包括一个139位丝氨酸残基的丝氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸(Ser-Gln-Glu，SQE)结构域，该结构域中的丝氨酸残基在DNA双链断裂后会迅速发生磷酸化，该结构域可作为定量检测DNA断裂损伤的一个重要切入点。本发明人创造性地用胰蛋白酶水解H2AX获得一段含该结构域的多肽，即H2AX的135-142位氨基酸片段ATQASQEY(即本文中所述多肽1)，并以其作为H2AX的特征性肽段，结合发明人开发的液相色谱-质谱联用的方法，可用于H2AX的定量分析。对所述多肽1进一步进行Ser139磷酸化，得到用于磷酸化组蛋白γ-H2AX定量分析的特征性多肽片段，即本文中所述多肽2。
如本文中所使用的，术语“样品”为经处理的或未经处理的含有特定组蛋白(例如H2AX、γ-H2AX、H3和/或p-H3)的样品，例如可以为受试细胞或从受试细胞中提取的组蛋白样品等。
如本文中所使用的，术语“细胞”特指具有药物代谢酶的敏感细胞，例如HepG2细胞或HeLa细胞。
为了解决前述现有技术中所面临的问题，本发明人从基因毒性化合物共性效应靶分子γ-H2AX和p-H3入手，以两类经典基因毒性化合物和敏感细胞株为研究对象，建立高效液相色谱串联质谱技术，对γ-H2AX磷酸化位点即139位丝氨酸的特定肽段及p-H3磷酸化位点即10位丝氨酸的靶肽段进行定量检测；并同时对H2AX及H3肽段进行检测，实现γ-H2AX/H2AX和p-H3/H3动态定量监测。本发明不仅能对具不同基因毒作用模式的物质做出灵敏及准确的定量区分，而且能够对基因毒性物质影响DNA损伤、修复及转录过程进行动态监测。
在一个方面，本申请提供一种利用LC-MS/MS对样品中H2AX和/或γ-H2AX进行定量分析的方法，其包括以下步骤：
(1)用胰蛋白酶对样品进行水解，得到含H2AX特征性多肽片段(多肽1)和/或γ-H2AX特征性多肽片段(多肽2)的水解样品；
(2)以同位素标记的多肽1作为多肽1的内标；和/或以同位素(例如，13C和/或15N)标记的多肽2作为多肽2的内标，用LC-MS/MS对所述水解样品进行检测，得到所述水解样品中多肽1和/或多肽2的质量浓度；
(3)根据步骤(2)结果等摩尔计算得到样品中H2AX和/或γ-H2AX的摩尔含量；其中，
多肽1：ATQASQEY，其为H2AX第135-142位氨基酸片段；
多肽2序列与多肽1相同，但其丝氨酸被磷酸化。
在一些实施方案中，所述胰蛋白酶可以为普通胰蛋白酶或经TPCK处理的胰蛋白酶，优选测序级胰蛋白酶。所述测序级胰蛋白酶为普通胰蛋白酶进一步经过TPCK处理和亲和层析纯化，活性更高和更稳定；另外，其经过甲基化还原反应修饰，极大程度的阻止自身水解，进而避免产生干扰靶标肽段。
在第二方面，本申请一种利用LC-MS/MS对样品中H3和/或p-H3进行定量分析的方法，其包括以下步骤：
(1)烷基化或酰基化处理样品，用胰蛋白酶对样品进行水解，含H3特征性多肽片段(多肽3)和/或p-H3特征性多肽片段(多肽4)；优选地，在胰酶水解后进一步进行烷基化或酰基化处理；
(2)以同位素标记的多肽3作为多肽3的内标；和/或以同位素标记的多肽4作为多肽4的内标，用LC-MS/MS对所述水解样品进行检测，得到所述水解样品中多肽3和/或多肽4的质量浓度；
(3)根据步骤(2)结果等摩尔计算得到样品中H3和/或p-H3的摩尔含量；其中，
多肽3为H3第9-17位氨基酸片段，且9-位，14-位以及N末端经烷基化或酰基化修饰，其中，H3第9-17位氨基酸片段为KSTGGKAPR；
多肽4序列与多肽3相同，但其丝氨酸被磷酸化。
在一些实施方案中，所述烷基化或酰基化是指甲基化、乙酰化或丙酰化，优选为乙酰化或丙酰化，更优选为丙酰化。
在第一方面和第二方面，所述内标为13C和/或15N标记的多肽，优选为13C和15N标记的多肽。
在第一方面或第二方面的一些实施方案中，采用反相色谱柱对所述水解样品进行分离。在一些实施方案中，所述反相色谱柱选自ACQUITYUPLC BEH C18(1.7μm，2.1×50mm)、ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×100mm)和ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×150mm)。在一些实施方案中，所述反相色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×100mm)。
在第一方面或第二方面的一些实施方案中，色谱分离条件为：流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：强极性溶剂；梯度洗脱程序：0-100％B；流速为0.1-1.2mL/min，进样量范围为0.1-20μL，柱温范围为20℃-60℃。在一些实施方案中，所述强极性溶剂为醇类溶剂(甲醇、乙醇或异丙醇)或乙腈。在一些实施方案中，色谱分离条件为：流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0→8min，1→30％B；8→8.5min，30→80％B；8.5-10.1min，80→1％B；10.1→12min，1％B；流速为0.25mL/min；进样体积为10μL；柱温为40℃。
在第一方面或第二方面的一些实施方案中，采用正离子多反应监测模式(MRM)进行质量扫描。
在第一方面或第二方面的一些实施方案中，质谱条件为：电喷雾(ESI)离子源；离子源温度范围为300℃-550℃，雾化气(GS1)和辅助加热干燥气(GS2)流量范围为40-60psi，喷雾电压范围为2.0-5.5kV。在一些实施方案中，质谱条件为：电喷雾离子源正离子检测模式和多反应监测的质谱扫描模式；离子源温度：500℃；雾化气(GS1)：40psi，辅助加热干燥气(GS2)：60psi，喷雾电压：5.5kV。
在第一方面或第二方面的一些实施方案中，以H2AX为例，所述摩尔含量具体计算方式为：分别配制多个(例如8个)不同浓度梯度的多肽1的P标准溶液，并加入500ng/mL的同位素标记的多肽1的内标作为标准溶液，以H2AX与内标浓度的比值作为横坐标，峰面积比值作为纵坐标，绘制各自标准曲线。以标准溶液浓度为X轴，标准和内标峰面积的比值为Y轴，进行线性回归分析，经“1/X”权重得回归方程；将样品中待测成分与其内标峰面积比代入标准曲线方程，计算样品中多肽1的质量浓度。并等摩尔换算得到H2AX的浓度。γ-H2AX、H3以及p-H3摩尔含量计算方法同此。
在第三方面，本申请提供一种定量分析细胞DNA损伤的方法，其包括以下步骤：
(1)平行条件下设置受试组和阴性对照组；
(2)分别收集受试组细胞以及阴性对照组细胞，并提取细胞核；
(3)从步骤(2)得到的细胞核中提取组蛋白并定量；
(4)用第一方面和第二方面任一项的方法分别检测步骤(3)所得组蛋白中H2AX、γ-H2AX、H3和p-H3的摩尔含量；
(5)如受试组细胞中γ-H2AX与H2AX的摩尔含量比值相较于阴性对照组升高，则判定受试细胞染色体断裂；
如受试细胞中p-H3与H3的摩尔含量比值相较于阴性对照组升高，则判定受试细胞纺锤体受损。
可采用本领域已知方法提取组蛋白，例如采用酸抽提法、RIPA缓冲液水解法或组蛋白提取试剂盒提取组蛋白。对于酸提法，因组蛋白富含精氨酸和赖氨酸，而精氨酸带有正电荷的胍基，赖氨酸在其脂肪链上带有两个氨基，所以组蛋白呈碱性。酸提法基于组蛋白易溶于酸的特性，将细胞核或染色质从细胞裂解之后在酸溶液富集从而提纯。RIPA裂解法名称来源于Radio-Immunoprecipitation Assay(放射性免疫沉淀法)，RIPA裂解液是一种经典的细胞裂解液，因其可配合蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂使用，可显著增加溶解蛋白的范围。RIPA裂解法是提取总蛋白最通用的蛋白质提取方法，也可以直接使用该方法提取的总蛋白直接进行组蛋白检测。组蛋白提取试剂盒综合了高离子强度解离法和酸提法，只需稀释浓缩液为工作液，之后即可立即开展试验，可以节约研究工作时间。试剂盒中的预裂解液(pH6.5～7.5)中含有去污剂和盐用于裂解细胞核，裂解液(pH≈2)中含有盐和酸用于溶解组蛋白，而平衡液中含有盐和碱来中和租蛋白提取物(pH 6～7)。
在第四方面，本申请提供一种评价物质对基因的毒性的方法，其包括以下步骤：
(1)将受试细胞暴露于有效浓度的所述物质中至少0.1小时(例如0.1-24小时)，同时设立阴性对照组(例如DMSO组)；
(2)按照第三方面步骤(2)-(5)定量分析细胞DNA损伤；
(3)如判定受试细胞染色体断裂，则所述物质为致染色体断裂物质；
如判定受试细胞纺锤体受损，则所述物质为纺锤体毒剂。
在第五方面，本申请提供一种高通量评价化合物基因毒性的方法，其包括采用第四方面的方法对化合物对基因的毒性进行评价的步骤。
发明的有益效果
本申请采用质谱定量技术，成功建立了基于γ-H2AX及p-H3特异性靶标肽段的基因毒性物质定量监测的方法，其中H2AX组蛋白及γ-H2AX蛋白靶标肽段的最低定量限分别为1ng/mL和2ng/mL，H3组蛋白及p-H3蛋白靶标肽段的最低定量限分别为0.5ng/mL和0.5ng/mL，准确度及精密度均满足要求。应用该方法分析经典基因毒性化合物与细胞中γ-H2AX/H2AX及p-H3/H3之间的量效和时效关系，确认本方法不仅能灵敏及准确的定量区分具不同基因毒性作用机制的物质，而且能够动态监测基因毒性物质影响DNA损伤、修复及转录的过程。
附图说明
图1显示了喜树碱、秋水仙碱暴露HepG2细胞后H2AX和γ-H2AX靶标肽段的提取离子色谱图。
图2显示了喜树碱、秋水仙碱暴露HepG2细胞后H3和p-H3靶标肽段的提取离子色谱图。
图3显示了喜树碱暴露HepG2和HeLa细胞后γ-H2AX/H2AX及p-H3/H3的量效关系，其中纵坐标fold induction表示不同浓度喜树碱暴露细胞后，所引起的磷酸化蛋白量与对照组磷酸化蛋白的比值。
图4显示了秋水仙碱暴露HepG2和HeLa细胞后γ-H2AX/H2AX及p-H3/H3的量效关系，其中纵坐标fold induction表示不同浓度秋水仙碱暴露细胞后，所引起的磷酸化蛋白量与对照组磷酸化蛋白的比值。
图5显示了喜树碱暴露HepG2细胞后γ-H2AX/H2AX的时效关系。
图6显示了喜树碱暴露HeLa细胞后γ-H2AX/H2AX的时效关系。
图7显示了喜树碱暴露HepG2细胞后p-H3/H3的时效关系。
图8显示了喜树碱暴露HeLa细胞后p-H3/H3的时效关系。
图9显示了秋水仙碱暴露HepG2细胞后p-H3/H3的时效关系。
图10显示了秋水仙碱暴露HeLa细胞中p-H3/H3的时效关系。
各图中γ-H2AX/H2AX表示单个细胞中γ-H2AX磷酸化肽段占总H2AX肽段百分比；p-H3/H3表示单个细胞中p-H3磷酸化肽段占总H3肽段百分比。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下实施例中，细胞核提取试剂盒和BCA蛋白测定试剂盒均购自北京索莱宝生物科技有限公司。H2AX和γ-H2AX的合成肽段以及稳定同位素标记的目的肽段是上海生物工程股份有限公司的产品。H3和p-H3的合成肽段以及稳定同位素标记的目标肽段购自南京杰肽生物科技有限公司。标准品喜树碱、秋水仙碱(纯度大于98％)购于中检所。色谱级乙腈购自北京百灵威科技有限公司。甲酸(纯度为98％)购于美国Sigma公司。超纯水由Milli-QA10纯化系统制备。C18膜购自上海安谱科学仪器有限公司。
CO2培养箱(美国Thermo公司)。ACQUITY型超高效液相色谱仪(美国Waters公司)。Q-TRAP 5500型四级杆-离子肼串级质谱仪(美国AB Sciex公司)。ACQUITY UPLC BEH C18液相色谱柱(1.7μm，2.1×100mm，美国Waters公司)。恒温震荡金属浴(瑞士GINGKO公司)。倒置显微镜(日本Olympus公司)。低温离心机(美国Sigma公司)。
实施例1：H2AX肽段和H3肽段标准品的合成
由于蛋白的分子量大，经酶解后的肽通常被用于前体蛋白定量。在本实施例中，选择C-末端胰蛋白酶酶解产物135ATQASQEY142用于测定组蛋白H2AX，分别合成四种含有S139位点的肽段标准品，包括未磷酸化形式，S139磷酸化形式和相应的同位素标记肽。对于组蛋白H3，采用胰蛋白酶酶解肽段9KSTGGKAPR17进行定量，分别合成不同形式的肽段标准品，包括磷酸化肽段、未磷酸化肽段和同位素标记肽段，其中，考虑到K9和K14甲基化和乙酰化对S10磷酸化的影响，H3蛋白肽段的N端游离氨基和赖氨酸上的游离氨基或单甲基化胺均进行了丙酰化修饰。
表1 不同形式的KSTGGKAPR肽段
ac：乙酰化；ph：磷酸化；me1：单甲基化；me2：双甲基化；me3：三甲基化；pr：丙酰化；IS：内标
实施例2：H2AX和H3肽段标准品的检测方法建立
采用上述优选的色谱和质谱条件，优化质谱采集参数，如表2、3，实现对靶标肽段的灵敏和特异检测。
以下如无特殊说明，液质联用的仪器参数设置与本实施例条件相同。
表2 H2AX肽段和H3肽段标准品的色谱条件参数
注：A为0.1％甲酸水溶液，B为乙腈
表3 H2AX肽段和H3肽段标准品的质谱条件参数
实施例3：组蛋白H2AX和H3样品的制备
本实施例中，细胞样品的制备方法为：HepG2细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM完全培养基中，HeLa细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI 1640完全培养基中，于37℃，5％CO2条件下培养，定期换液传代，取对数生长期细胞用于实验。以传统方式染毒细胞，考察量效关系时，将细胞分别暴露于三个不同浓度的喜树碱或秋水仙碱，染毒时间均为24h；同时设置0.1％DMSO的处理细胞对照组；考察时效关系时，将细胞分别暴露于1μM喜树碱或1μM秋水仙碱，暴露时间点设为0.09、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24h。染毒结束后，用磷酸盐缓冲液洗涤并收集细胞，1000g离心5min。根据细胞核提取试剂盒的说明提取细胞核，然后加入400μL0.2M H2SO4提取组蛋白，并通过逐滴加入100％三氯乙酸以沉淀组蛋白。上述步骤均在4℃条件下进行。最后，用预冷的丙酮将组蛋白洗涤两次，并室温干燥。将组蛋白溶解于100μL50mM碳酸氢铵溶液中，在4℃条件下16,000g离心10min后，将上清液转移到新的1.5mL离心管中，通过BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。对于组蛋白H2AX，用测序级胰蛋白酶消化过夜(胰蛋白酶和组蛋白样品的质量比为1:10-1:30)，加入20％醋酸终止反应，利用C18Stagetips对样品脱盐并浓缩，用水复溶后进行质谱分析。对于组蛋白H3，胰酶消化前后进行丙酰化处理，其余同H2AX。
实施例4：组蛋白H3磷酸化肽段的确定
本实施例中，从细胞中提取组蛋白H3，在胰酶消化前后进行丙酰化处理，用实施例2中建立的方法进行检测，结果表明组蛋白H3的主要磷酸化肽段形式为S10(ph)，即仅10位丝氨酸发生磷酸化，如图2显示。因此，以下实施例中重点考察H3的肽段为K9和S10(ph)。
实施例5：方法学验证
本实施例中，对于组蛋白H2AX，分别配制8个浓度梯度的ATQASQEY肽段和ATQAS(ph)QEY肽段的混合标准溶液，并加入500ng/mL的ATQASQEY(IS)肽段和ATQAS(ph)QEY(IS)肽段的混合内标溶液；对于组蛋白H3，分别配制8个浓度梯度的K9肽段和S10(ph)肽段的混合标准溶液，并加入500ng/mL的K9(IS)肽段的内标溶液；以分析物与内标浓度的比值为横坐标，峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线。采用标准加入法，计算对应肽段的准确度与精密度，其中，精密度用变异系数表示。
表4为检测肽段的线性范围、回归方程、准确度及精密度
实施例6：喜树碱和秋水仙碱暴露HepG2细胞对γ-H2AX和p-H3的影响
该实施例中，分别以致染色体断裂剂喜树碱和纺锤体毒剂秋水仙碱染毒HepG2细胞24h，并设置空白对照组为0.1％DMSO处理，依照实施例3制备H2AX和H3样品，用建立的质谱方法进行检测。与对照组样品的色谱信号相比，喜树碱染毒细胞后，细胞中ATQAS(ph)QEY信号强度显著升高，S10(ph)信号强度显著降低；秋水仙碱染毒细胞后，细胞中ATQAS(ph)QEY信号强度几乎不变，S10(ph)信号强度则显著升高，结果分别见图1和图2。初步表明γ-H2AX和p-H3两种磷酸化标记物的组合检测能够区分作用模式不同的基因毒性化合物。
实施例7：喜树碱和秋水仙碱暴露HepG2和HeLa两种细胞后γ-H2AX/H2AX及p-H3/
H3的量效变化
本实施例中，分别以三个浓度梯度(10倍梯度增加)的喜树碱和秋水仙碱染毒HepG2和HeLa细胞24h，依照实施例3制备H2AX和H3样品，用建立的质谱方法进行检测。进而考察毒性作用模式不同的基因毒性化合物在两种细胞中的γ-H2AX/H2AX和p-H3/H3的量效变化。结果如图3、图4。量效关系表明：喜树碱在较低浓度即会引起细胞中H2AX发生显著性磷酸化，其引起两种细胞中H2AX发生显著磷酸化的最低有效浓度均为0.01μM，在一定范围内，γ-H2AX的形成呈现剂量依赖性；在所测浓度范围内喜树碱引起两种细胞中H3磷酸化显著降低。秋水仙碱在所用的三个浓度下均不引起两种细胞中H2AX显著磷酸化；但是均引起两种细胞中H3发生显著磷酸化，其最低有效浓度均为0.01μM。
实施例8：喜树碱暴露两种细胞后γ-H2AX/H2AX和p-H3/H3的时效变化
本实施例中，以1μM喜树碱染毒HepG2和HeLa细胞，染毒时间为0.09、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24h。依照实施例3制备H2AX和H3样品，用建立的质谱方法进行检测。考察致染色体断裂剂喜树碱作用于两种细胞后γ-H2AX/H2AX和p-H3/H3的时效变化，结果如图5至图8所示。
结果表明：在染毒后5min至30min期间，H2AX迅速磷酸化，此时细胞的修复机制尚未完全激活，因此DNA损伤的速度大于DNA修复的速度。由于喜树碱对细胞的持续暴露，在30min至8h期间，DNA损伤仍然存在，而细胞的DNA修复机制已经完全激活，使得在该阶段γ-H2AX的水平呈下降趋势；而且随着时间的延长，单个细胞中磷酸化肽段比例表现为前期快速衰减而后缓慢下降，即DNA损伤前期为快速修复，后期为缓慢修复。在8h时间点，单个细胞中的γ-H2AX/H2AX水平与对照组细胞接近，推测此时损伤和修复处于动态平衡。从8h到24h，由于随着细胞周期的进展，DNA修复能力渐达饱和，而DNA损伤仍然存在，因此γ-H2AX呈现上升趋势。根据喜树碱与p-H3/H3的时效关系，无论暴露时间长短，喜树碱均使p-H3/H3含量明显降低，表明转录在DNA修复过程中受到抑制；而且在8h时间点，细胞中的p-H3/H3处于最低水平，结合γ-H2AX/H2AX和p-H3/H3在8h时间点的含量特征，表明此时DNA损伤修复达最大程度，转录则几乎完全被抑制。
实施例9：秋水仙碱暴露两种细胞后p-H3/H3的时效变化
本实施例中，以1μM秋水仙碱染毒HepG2和HeLa细胞，染毒时间为0.09、0.25、0.5、1、2、4、8、12和24h。依照实施例3制备H2AX和H3样品，用建立的质谱方法进行检测。进而考察致纺锤体毒剂秋水仙碱在两种细胞中p-H3/H3的时效关系，结果如图9和图10所示。秋水仙碱与p-H3/H3的时效关系呈时间依赖性，其时效曲线表现为类“S”型。秋水仙碱通过与微管蛋白作用抑制纺锤体形成，导致有丝分裂延迟，从而表现为p-H3显著增加。
实施例10：建立的方法应用于区分致染色体断裂剂和纺锤体毒剂
本实施例中，扩大受试化合物对象，应用建立的方法，检测致染色体断裂化合物、纺锤体毒性化合物和非基因毒性化合物分别暴露HepG2和HeLa细胞后，细胞中γ-H2AX和p-H3的变化情况，结果如表5所示，致染色体断裂剂可导致细胞γ-H2AX的显著升高和p-H3的显著下降；而纺锤体毒剂不影响细胞γ-H2AX水平，但导致p-H3的显著升高；非基因毒性化合物则对γ-H2AX和p-H3均无影响。进一步证实，γ-H2AX和p-H3的组合检测能够区分作用模式不同的基因毒性化合物。
环磷酰胺需要经代谢酶CYP2B6活化后方表现出基因毒性，而此代谢酶在HepG2细胞中存在但在HeLa细胞中缺乏，因此环磷酰胺作用后γ-H2AX的升高和p-H3的降低仅能在HepG2细胞中被检测到。
表5为建立的方法应用于不同作用模式基因毒性化合物的鉴定
↑表示被测值显著升高，↓表示被测值显著降低，MEC为引起被测值显著变化的化合物最低起效浓度，括号里的数值即表示相应的MEC值，单位为μM。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。本说明书中未详细描述的内容属于本领域专业人员公知的现有技术。
Claims (11)
1.一种利用LC-MS/MS对样品中H2AX和/或γ-H2AX进行定量分析的方法，其包括以下步骤：
(1)用胰蛋白酶对样品进行水解，得到含H2AX特征性多肽片段(多肽1)和/或γ-H2AX特征性多肽片段(多肽2)的水解样品；
(2)以同位素(例如，13C和/或15N)标记的多肽1作为多肽1的内标；和/或以同位素(例如，13C和/或15N)标记的多肽2作为多肽2的内标，用LC-MS/MS对所述水解样品进行检测，得到所述水解样品中多肽1和/或多肽2的质量浓度；
(3)根据步骤(2)结果等摩尔计算得到样品中H2AX和/或γ-H2AX的摩尔含量；其中，
多肽1：ATQASQEY，其为H2AX第135-142位氨基酸片段；
多肽2序列与多肽1相同，但其丝氨酸被磷酸化。
2.一种利用LC-MS/MS对样品中H3和/或p-H3进行定量分析的方法，其包括以下步骤：
(1)烷基化或酰基化处理样品，用胰蛋白酶对样品进行水解，含H3特征性多肽片段(多肽3)和/或p-H3特征性多肽片段(多肽4)；优选地，在胰酶水解后进一步进行烷基化或酰基化处理；
(2)以同位素(例如，13C和/或15N)标记的多肽3作为多肽3的内标；和/或以同位素(例如，13C和/或15N)标记的多肽4作为多肽4的内标，用LC-MS/MS对所述水解样品进行检测，得到所述水解样品中多肽3和/或多肽4的质量浓度；
(3)根据步骤(2)结果等摩尔计算得到样品中H3和/或p-H3的摩尔含量；其中，
多肽3为H3第9-17位氨基酸片段，且9-位，14-位以及N末端经烷基化或酰基化修饰，其中，H3第9-17位氨基酸片段为KSTGGKAPR；
多肽4序列与多肽3相同，但其丝氨酸被磷酸化。
3.权利要求2的方法，其中所述烷基化或酰基化是指甲基化、乙酰化或丙酰化，更优选为乙酰化或丙酰化。
4.权利要求1-3任一项的方法，采用反相色谱柱对所述水解样品进行分离；优选地，所述反相色谱柱选自ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×50mm)、ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×100mm)、ACQUITY UPLC BEH C18(1.7μm，2.1×150mm)和ACQUITY UPLC BEHC18(1.7μm，2.1×100mm)。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中色谱分离条件为：流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：强极性溶剂；梯度洗脱程序：0-100％B；流速为0.1-1.2mL/min，进样量范围为0.1-20μL，柱温范围为20℃-60℃；
优选地，所述强极性溶剂为醇类溶剂(甲醇、乙醇或异丙醇)或乙腈。
6.权利要求1-5任一项的方法，采用正离子多反应监测模式(MRM)进行质量扫描。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中质量分析条件为：电喷雾(ESI)离子源；离子源温度范围为300℃-550℃，雾化气(GS1)和辅助加热干燥气(GS2)流量范围为40-60psi，喷雾电压范围为2.0-5.5kV。
8.一种定量分析细胞DNA损伤的方法，其包括以下步骤：
(1)平行条件下设置受试组和阴性对照组；
(2)分别收集受试组细胞以及阴性对照组细胞，并提取细胞核；
(3)从步骤(2)得到的细胞核中提取组蛋白并定量；例如采用酸抽提法、RIPA缓冲液水解法或组蛋白提取试剂盒提取组蛋白；
(4)用权利要求1-7任一项的方法分别检测步骤(3)所得组蛋白中H2AX、γ-H2AX、H3和p-H3的摩尔含量；
(5)如受试组细胞中γ-H2AX与H2AX的摩尔含量比值相较于阴性对照组升高，则判定受试细胞染色体断裂；
如受试细胞中p-H3与H3的摩尔含量比值相较于阴性对照组升高，则判定受试细胞纺锤体受损。
9.一种评价物质对基因的毒性的方法，其包括以下步骤：
(1)将受试细胞暴露于有效浓度的所述物质中至少0.1小时(例如0.1-24小时)，同时设立阴性对照组(例如DMSO组)；
(2)按照权利要求8中步骤(2)-(5)定量分析细胞DNA损伤；
(3)如判定受试细胞染色体断裂，则所述物质为致染色体断裂物质；
如判定受试细胞纺锤体受损，则所述物质为纺锤体毒剂。
10.权利要求9的方法，其中所述细胞为具有药物代谢酶的敏感细胞；优选地，所述细胞选自HepG2细胞和HeLa细胞。
11.一种高通量评价化合物基因毒性的方法，其包括采用权利要求9或10的方法对化合物对基因的毒性进行评价的步骤。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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