CN108291916B - 质谱法检测淀粉状蛋白β - Google Patents

质谱法检测淀粉状蛋白β Download PDF

Info

Publication number
CN108291916B
CN108291916B CN201680068333.5A CN201680068333A CN108291916B CN 108291916 B CN108291916 B CN 108291916B CN 201680068333 A CN201680068333 A CN 201680068333A CN 108291916 B CN108291916 B CN 108291916B
Authority
CN
China
Prior art keywords
amyloid
sample
ions
amount
fragment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201680068333.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108291916A (zh
Inventor
D·陈
D·韦伯
N·克拉克
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Quest Diagnostics Investments LLC
Original Assignee
Quest Diagnostics Investments LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Quest Diagnostics Investments LLC filed Critical Quest Diagnostics Investments LLC
Priority to CN202311809070.7A priority Critical patent/CN117761323A/zh
Publication of CN108291916A publication Critical patent/CN108291916A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108291916B publication Critical patent/CN108291916B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6827—Total protein determination, e.g. albumin in urine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

提供了用于检测或定量淀粉状蛋白β的方法。在具体的方面，本文提供了通过质谱法检测淀粉状蛋白β或其片段的方法。在另一方面，本文提供了用于测定淀粉状蛋白β42(Aβ42)与淀粉状蛋白β40(Aβ40)的比率的方法。在另一方面，本文提供了用于诊断或预后阿耳茨海默病或痴呆的方法。

Description

质谱法检测淀粉状蛋白β
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2015年9月28日提交的美国临时申请号62/234,027和2016年1月12日提交的美国临时申请号62/277,772的权益，其每个通过引用以其全部并入本文。
技术领域
本发明涉及淀粉状蛋白β的检测或定量。在具体的方面，本发明涉及通过质谱法检测淀粉状蛋白β或其片段的方法。
背景技术
阿耳茨海默病是影响老年人群的最常见形式的痴呆。阿耳茨海默病的特征在于认知能力，具体而言，记忆和学习的进行性衰退。该疾病的标志之一是由淀粉状蛋白β(Aβ或Abeta)肽组成的神经炎性斑块。
当前的预测或诊断阿耳茨海默病的临床诊断方法的准确度和灵敏度低。当前提供免疫试验以检测淀粉状蛋白β，其是预测进展至阿耳茨海默病的生物标志物。然而，值得关注的是使用当前可用的免疫试验观察到的结果中的实验室间变化。
需要用于检测淀粉状蛋白β的准确的和灵敏的试验。
发明内容
本文提供了通过质谱法——包括串联质谱法——检测或测定样品中淀粉状蛋白β(Aβ)的量的方法。
在某些实施方式中，本文提供的用于测定淀粉状蛋白β的量的方法包括(a)纯化样品中的淀粉状蛋白β；(b)电离样品中的淀粉状蛋白β；和(c)通过质谱法测定淀粉状蛋白β离子(一种或多种)的量；其中淀粉状蛋白β离子(一种或多种)的量与样品中淀粉状蛋白β的量相关。
在某些实施方式中，本文提供的用于测定淀粉状蛋白β的量的方法包括(a)纯化样品中的淀粉状蛋白β；(b)电离样品中的淀粉状蛋白β以产生淀粉状蛋白β的先驱离子；(c)生成淀粉状蛋白β的一种或多种碎片离子；和(d)通过质谱法测定来自步骤(c)或(d)或二者的离子(一种或多种)的量；其中淀粉状蛋白β离子(一种或多种)的量与样品中淀粉状蛋白β的量相关。
在某些实施方式中，本文提供的用于测定淀粉状蛋白β的量的方法包括(a)消化样品中的淀粉状蛋白β以生成淀粉状蛋白β的一种或多种片段；(b)纯化一种或多种淀粉状蛋白β片段；(c)电离一种或多种淀粉状蛋白β片段以产生先驱离子；(d)生成一种或多种碎片离子；和(e)通过质谱法测定来自步骤(c)或(d)或二者的离子(一种或多种)的量；其中离子(一种多种)的量与样品中淀粉状蛋白β片段(一种多种)的量相关。
在某些实施方式中，本文提供了用于测定淀粉状蛋白β42(Aβ42)的量的方法。在一些实施方式中，Aβ42片段包括序列GAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO:4)。在一些实施方式中，方法包括(a)消化样品中的淀粉状蛋白β以生成淀粉状蛋白β42(Aβ42)；(b)纯化Aβ42；(c)电离Aβ42以产生先驱离子；(d)生成Aβ42的一种或多种碎片离子；和(e)通过质谱法测定来自步骤(c)或(d)或二者的离子(一种或多种)的量；其中离子(一种多种)的量与样品中Aβ42的量相关。
在某些实施方式中，本文提供了用于测定淀粉状蛋白β40(Aβ40)的量的方法。在一些实施方式中，Aβ40片段包括序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO:2)。在一些实施方式中，方法包括(a)消化样品中的淀粉状蛋白β以生成淀粉状蛋白β40(Aβ40)；(b)纯化Aβ40；(c)电离Aβ40以产生先驱离子；(d)生成Aβ40的一种或多种碎片离子；和(e)通过质谱法测定来自步骤(c)或(d)或二者的离子(一种或多种)的量；其中离子(一种多种)的量与样品中Aβ40的量相关。
在某些实施方式中，本文提供了用于测定淀粉状蛋白β42(Aβ42)和淀粉状蛋白β40(Aβ40)的量的方法。在一些实施方式中，方法包括(a)消化样品中的淀粉状蛋白β以生成淀粉状蛋白β42(Aβ42)和淀粉状蛋白β40(Aβ40)；(b)纯化Aβ42和Aβ40；(c)电离Aβ42和Aβ40以产生先驱离子；(d)生成Aβ42和Aβ40的一种或多种碎片离子；和(e)通过质谱法测定来自步骤(c)或(d)或二者的离子(一种或多种)的量；其中离子(一种多种)的量与样品中Aβ42和Aβ40的量相关。
在某些实施方式中，本文提供了用于测定淀粉状蛋白β42(Aβ42)与淀粉状蛋白β40(Aβ40)的比率的方法。在一些实施方式中，方法包括(a)消化样品中的淀粉状蛋白β以生成淀粉状蛋白β42(Aβ42)和淀粉状蛋白β40(Aβ40)；(b)纯化Aβ42和Aβ40；(c)电离Aβ42和Aβ40以产生先驱离子；(d)生成Aβ42和Aβ40的一种或多种碎片离子；和(e)通过质谱法测定来自步骤(c)或(d)或二者的离子(一种或多种)的量；和(f)测定Aβ42与Aβ40的比率。在一些实施方式中，方法包括测定Aβ40与Aβ42的比率。
在某些实施方式中，本文提供了阿耳茨海默病或痴呆的诊断或预后方法，方法包括通过质谱法测定测试样品中淀粉状蛋白β的量；其中异常水平的淀粉状蛋白β预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，方法可以包括：(a)纯化样品中的淀粉状蛋白β；(b)电离样品中的淀粉状蛋白β；和(c)通过质谱法测定淀粉状蛋白β离子(一种或多种)的量；和(d)淀粉状蛋白β离子(一种或多种)的量与样品中淀粉状蛋白β的量相关；其中异常水平的淀粉状蛋白β预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，方法包括测定淀粉状蛋白β片段的比率。在一些实施方式中，方法包括测定淀粉状蛋白β42(Aβ42)与淀粉状蛋白β40(Aβ40)的比率。在一些实施方式中，方法包括测定淀粉状蛋白β42(Aβ40)与淀粉状蛋白β40(Aβ42)的比率。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括预处理与样品接触的器材的表面。在一些实施方式中，预处理包括使用防止淀粉状蛋白β或其片段粘附至表面的试剂预涂覆器材的表面。在一些实施方式中，预处理包括细菌溶胞产物预处理。在一些实施方式中，预处理包括大肠杆菌溶胞产物预处理。在一些实施方式中，大肠杆菌溶胞产物包括胰蛋白酶消化的大肠杆菌溶胞产物。在一些实施方式中，预处理的器材包括但不限于试管或平板、吸管端(pipette tip)、样品制备设备、液相色谱设备、和质谱设备。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括使用稳定淀粉状蛋白β或其片段的试剂处理或培育样品。在一些实施方式中，本文提供的方法包括使用淀粉状蛋白β抗体处理或培育样品。在一些实施方式中，本文提供的方法包括使用至少两种不同的淀粉状蛋白β抗体处理或培育样品。在一些实施方式中，淀粉状蛋白β抗体包括结合至淀粉状蛋白β的C-端的抗体。在一些实施方式中，淀粉状蛋白β抗体包括结合至淀粉状蛋白β的N-端的抗体。在一些实施方式中，稳定淀粉状蛋白β的试剂包括载脂蛋白。在一些实施方式中，稳定淀粉状蛋白β的试剂包括载脂蛋白E2。在一些实施方式中，稳定淀粉状蛋白β的试剂包括载脂蛋白E4。在一些实施方式中，稳定淀粉状蛋白β的试剂包括结合至淀粉状蛋白β的C-端的抗体、结合至淀粉状蛋白β的N-端的抗体、载脂蛋白E2、载脂蛋白E4、或其组合。在一些实施方式中，本文提供的稳定淀粉状蛋白β的试剂给予-70℃下至少1个月的稳定性。在一些实施方式中，本文提供的稳定淀粉状蛋白β的试剂给予-70℃下至少2个月的稳定性。在一些实施方式中，本文提供的稳定淀粉状蛋白β的试剂给予-70℃下至少3个月的稳定性。在一些实施方式中，本文提供的稳定淀粉状蛋白β的试剂给予通过冻融循环的稳定性。在一些实施方式中，本文提供的稳定淀粉状蛋白β的试剂给予通过至少两个冻融循环的稳定性。在一些实施方式中，本文提供的稳定淀粉状蛋白β的试剂给予通过至少三个冻融循环的稳定性。在一些实施方式中，本文提供的稳定淀粉状蛋白β的试剂给予通过至少四个冻融循环的稳定性。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括消化样品中的淀粉状蛋白β。在一些实施方式中，本文提供的方法包括使用酶消化淀粉状蛋白β。在一些实施方式中，酶是Lys-C。在一些实施方式中，本文提供的方法包括使用尿素消化淀粉状蛋白β。在一些实施方式中，尿素是以适合蛋白质消化的浓度。在一些实施方式中，尿素是6M尿素。在一些实施方式中，本文提供的方法包括使用尿素和Lys-C消化淀粉状蛋白β。在一些实施方式中，消化包括在减少消化时间或增加消化效率的条件中消化。在一些实施方式中，消化包括在微波中消化。在一些实施方式中，本文提供的方法包括测定消化的淀粉状蛋白β的量。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括提取。在一些实施方式中，本文提供的方法包括混合模式阴离子交换提取。在一些实施方式中，本文提供的方法包括固相提取。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括使用加热的氮洗脱和干燥样品。在一些实施方式中，样品被重悬在重构缓冲液中。
在某些实施方式中，纯化样品包括液相色谱法。在一些实施方式中，液相色谱法包括但不限于反相液相色谱法(RPLC)、高效液相色谱法(HPLC)、和高湍流液相色谱法(HTLC)。在优选的实施方式中，液相色谱法包括HPLC。在一些实施方式中，HPLC柱通常包括介质(即，填充材料)以促进化学部分的分离(即，分级)。合适的柱可以包括C-4、C-8、C-12、或C-18柱。在优选的实施方式中，合适的HPLC柱是C-4柱。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括使用减少将淀粉状蛋白β粘附至器材的表面的器材。在一些实施方式中，器材包括PEEK(聚醚醚酮)管道系统或设备。在一些实施方式中，器材包括金属管道系统或设备。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括串联质谱法。在一些实施方式中，本文提供的方法包括以正模式进行电离。在一些实施方式中，本文提供的方法包括以负模式进行电离。在一些实施方式中，本文提供的方法包括使用加热电喷雾电离(HESI)进行电离。在一些实施方式中，本文提供的方法包括使用电喷雾电离(ESI)进行电离。在一些实施方式中，本文提供的方法包括使用大气压化学电离(APCI)进行电离。在优选的实施方式中，本文提供的方法包括使用加热电喷雾电离(HESI)以正模式进行电离。在一些实施方式中，碰撞能量在5V至60V之间。在一些实施方式中，碰撞能量在10V至50V之间。在一些实施方式中，碰撞能量在20V至50V之间。在一些实施方式中，碰撞能量在20V至45V之间。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括检测或测定淀粉状蛋白β40(Aβ40)的量。在一些实施方式中，Aβ40包括序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(SEQ IDNO:1)。在一些实施方式中，本文提供的方法包括检测或测定Aβ40的片段的量。在一些实施方式中，Aβ40片段包括序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO:2)。在一些实施方式中，Aβ40片段包括包含N-端或C-端翼状肽(winged peptide)的序列。在一些实施方式中，Aβ40片段包括SEQID NO:2和N-端或C-端翼状肽。在一些实施方式中，翼状肽是亲水性的。在一些实施方式中，翼状肽包括至少一个氨基酸。在一些实施方式中，翼状肽包括至少两个氨基酸。在一些实施方式中，翼状肽包括至少三个氨基酸。在一些实施方式中，翼状肽包括至少四个氨基酸。在一些实施方式中，翼状肽包括至少五个氨基酸。在一些实施方式中，翼状肽包括至少六个氨基酸。在一些实施方式中，Aβ40片段的量与样品中Aβ40的量关联。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括检测或测定淀粉状蛋白β42(Aβ42)的量。在一些实施方式中，Aβ42包括序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQID NO:3)。在一些实施方式中，本文提供的方法包括检测或测定Aβ42的片段的量。在一些实施方式中，Aβ42片段包括序列GAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO:4)。在一些实施方式中，Aβ42片段包括包含N-端或C-端翼状肽的序列。在一些实施方式中，Aβ42片段包括SEQ ID NO:4和N-端或C-端翼状肽。在一些实施方式中，翼状肽是亲水性的。在一些实施方式中，翼状肽包括至少一个氨基酸。在一些实施方式中，翼状肽包括至少两个氨基酸。在一些实施方式中，翼状肽包括至少三个氨基酸。在一些实施方式中，翼状肽包括至少四个氨基酸。在一些实施方式中，翼状肽包括至少五个氨基酸。在一些实施方式中，翼状肽包括至少六个氨基酸。在一些实施方式中，Aβ42片段的量与样品中Aβ42的量关联。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括检测或测定Aβ40与Aβ42的比率(Aβ40:Aβ42)。在一些实施方式中，本文提供的方法包括检测或测定Aβ40片段与Aβ42片段的比率(Aβ40片段:Aβ42片段)。在一些实施方式中，本文提供的方法包括检测或测定Aβ42与Aβ40的比率(Aβ42:Aβ40)。在一些实施方式中，本文提供的方法包括检测或测定Aβ42片段与Aβ40片段的比率(Aβ42片段:Aβ40片段)。
在某些实施方式中，0.6或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.5或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.45或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.4或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.35或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.3或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.25或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.2或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.15或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。
在某些实施方式中，方法包括生成Aβ或其片段的一种或多种先驱离子。在一些实施方式中，先驱离子中的至少一种具有1085.6±0.5或1269.7±0.5的质/荷比。在一些实施方式中，方法可以包括生成Aβ或其片段的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，碎片离子中的至少一种具有812.37±0.5、869.4±0.5、968.43±0.5、869.39±0.5、968.44±0.5、1067.5±0.5、或1180.57±0.5的质/荷比。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括添加内标。在一些实施方式中，内标包括同位素标记的内标。在一些实施方式中，内标包括13C15N标记。在一些实施方式中，内标包括至少一个以13C15N标记的Phe、Leu、或Met。在一些实施方式中，内标的先驱离子中的至少一种具有1110.7±0.5的质/荷比。在一些实施方式中，方法可以包括生成内标的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，碎片离子中的至少一种具有768.48±0.5、825.5±0.5、或882.52±0.5的质/荷比。
在某些实施方式中，方法的定量限小于或等于10ng/mL。在一些实施方式中，方法的定量限小于或等于5ng/mL。在一些实施方式中，方法的定量限小于或等于4ng/mL。在一些实施方式中，方法的定量限小于或等于3ng/mL。在一些实施方式中，方法的定量限小于或等于2ng/mL。在一些实施方式中，方法的定量限小于或等于1ng/mL。在一些实施方式中，方法的定量限小于或等于0.5ng/mL。在一些实施方式中，方法的定量限小于或等于0.2ng/mL。在一些实施方式中，方法的定量限小于或等于0.1ng/mL。
在一些实施方式中，方法的检测限小于或等于5ng/mL。在一些实施方式中，方法的检测限小于或等于1ng/mL。在一些实施方式中，方法的检测限小于或等于0.5ng/mL。在一些实施方式中，方法的检测限小于或等于0.1ng/mL。在一些实施方式中，方法的检测限小于或等于0.05ng/mL。在一些实施方式中，方法的检测限小于或等于0.01ng/mL。
在一些实施方式中，淀粉状蛋白β在质谱法之前不被衍生化。在一些实施方式中，淀粉状蛋白β在质谱法之前被衍生化。
在某些实施方式中，样品是体液。在一些实施方式中，样品是脑脊液(CSF)。在一些实施方式中，样品是血浆或血清。在一些实施方式中，样品是全血。在一些实施方式中，样品是唾液或尿。
在一些实施方式中，方法可以包括以足以使样品去蛋白的量添加试剂至样品。
如本文使用的，除非另外陈述，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。因而，例如，提及“蛋白质”包括多个蛋白质分子。
如本文使用的，术语“纯化(purification)”或“纯化(purifying)”不是指从样品去除除感兴趣的分析物(一种或多种)之外的所有材料。相反，纯化指的是相对于样品中可能干扰感兴趣的分析物的检测的其它组分富集一种或多种感兴趣的分析物的量的过程。本文通过多种手段纯化样品以允许去除一种或多种干扰物质，例如，将干扰通过质谱法检测选择的淀粉状蛋白β母离子和子离子的一种或多种物质。
如本文使用的，术语“测试样品”指的是可能包含淀粉状蛋白β的任何样品。如本文使用的，术语“体液”意思是可以从个体的身体分离的任何流体。例如，“体液”可以包括血液、血浆、血清、胆汁、唾液、尿、眼泪、汗等。
如本文使用的，术语“衍生化”意思是使两个分子反应以形成新分子。衍生化剂可以包括异硫氰酸酯基团、二硝基-氟苯基、硝基苯氧基羰基、和/或苯二醛基团等。
如本文使用的，术语“色谱法”指的是由于化学实体在固定液相或固相周围或之上流动时的差异性分布，液体或气体携带的化学混合物分离为组分的过程。
如本文使用的，术语“液相色谱法”或“LC”意思是在流体均匀地渗透过细碎物质的柱或渗透过毛细管通道时，选择性地阻滞流体溶液的一种或多种组分的过程。阻滞由如下引起：在此流体相对于固定相(一种或多种)移动时，混合物的组分在一种或多种固定相和体相流体(bulk fluid)(即，流动相)之间的分布。“液相色谱法”的实例包括反相液相色谱法(RPLC)、高效液相色谱法(HPLC)、和高湍流液相色谱法(HTLC)。
如本文使用的，术语“高效液相色谱法”或“HPLC”指的是通过在压力下迫使流动相穿过固定相——通常是密集填充柱——增加分离程度的液相色谱法。
如本文使用的，术语“高湍流液相色谱法”或“HTLC”指的是利用通过柱填充物被试验的材料的湍流作为进行分离的基础的色谱法形式。HTLC已经被应用于在通过质谱法分析之前制备包含两种不知名的药物的样品。参见，例如，Zimmer et al.,J.Chromatogr.A854:23-35(1999)；还参见，美国专利号5,968,367、5,919,368、5,795,469、和5,772,874，其进一步说明了HTLC。本领域普通技术人员理解“湍流”。当流体缓慢地和平稳地流动时，流动被称为“层流”。例如，以低流速移动通过HPLC柱的流体是层状的。在层流中，流体颗粒的运动是有序的，其中颗粒大体上以直线移动。在较快的速度下，水的惯性克服流体摩擦力并产生湍流。未接触不规则边界的流体“超过”由于摩擦减慢或由于粗糙表面偏离的流体。当流体湍急地流动时，其以涡流和旋转(或漩涡)流动，其具有比流动是层状时更大的“阻力”。许多参考文献可用于帮助测定流体流动何时是层流或湍流(例如，Turbulent Flow Analysis:Measurement and Prediction,P.S.Bernard&J.M.Wallace,John Wiley&Sons,Inc.,(2000)；An Introduction to Turbulent Flow,Jean Mathieu&Julian Scott,Cambridge University Press(2001))。
如本文使用的，术语“气相色谱法”或“GC”指的是如下色谱法：其中样品混合物被汽化并注入移动通过柱——其包含由液体或微粒固体组成的固定相——的运载气体流(如氮气或氦气)，并且根据化合物对固定相的亲和力分离为其组分化合物。
如本文使用的，术语“大颗粒柱”或“提取柱”指的是包含大于大约35μm的平均粒径的色谱柱。如在此上下文中使用的，术语“大约”意思是±10％。在优选的实施方式中，柱包含直径大约60μm的颗粒。
如本文使用的，术语“分析柱”指的是如下色谱柱：其具有足够的色谱板以实现从柱洗脱的样品中材料的分离，所述分离足以允许测定分析物的存在或量。这样的柱通常区别于“提取柱”，其具有从非保留的材料分离或提取保留的材料以便获得纯化的样品用于进一步的分析的一般目的。如在此上下文中使用的，术语“大约”意思是±10％。在优选的实施方式中，分析柱包含直径大约4μm的颗粒。
如本文使用的，术语“在线(on-line)”和“线上(inline)”，例如，如在“在线自动化方式”或“在线提取”中使用的，指的是在不需要操作者介入的情况下进行的程序。相反，如本文使用的术语“离线(off-line)”指的是需要操作者手动介入的程序。因而，如果样品经历沉淀，并且上清液然后被手动装载入自动进样器，则沉淀和装载步骤与后续步骤是离线的。在方法的多个实施方式中，一个或多个步骤可以以在线自动化方式进行。
如本文使用的，术语“质谱法”或“MS”指的是通过化合物的质量鉴定化合物的分析技术。MS指的是基于离子的质荷比或“m/z”过滤、检测、和测量离子的方法。MS技术通常包括(1)电离化合物以形成带电化合物；和(2)检测带电化合物的分子量和计算质荷比。可以通过任何合适的手段电离和检测化合物。“质谱仪”通常包括电离器和离子检测器。一般而言，一种或多种感兴趣的分子被电离，并且离子随后被引入质谱仪器，在其中由于磁场和电场的组合，离子沿着空间中依赖于质量(“m”)和电荷(“z”)的路径。参见，例如，标题为“MassSpectrometry From Surfaces”的美国专利号6,204,500；标题为“Methods and Apparatusfor Tandem Mass Spectrometry”的美国专利号6,107,623；标题为“DNA DiagnosticsBased On Mass Spectrometry”的美国专利号6,268,144；标题为“Surface-EnhancedPhotolabile Attachment And Release For Desorption And Detection Of Analytes”的美国专利号6,124,137；Wright et al.,Prostate Cancer and Prostatic Diseases 2:264-76(1999)；和Merchant and Weinberger,Electrophoresis 21:1164-67(2000)。
如本文使用的，术语“以负离子模式操作”指的是生成和检测负离子的那些质谱方法。如本文使用的，术语“以正离子模式操作”指的是生成和检测正离子的那些质谱方法。
如本文使用的，术语“电离(ionization)”或“电离(ionizing)”指的是生成具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。负离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的那些，而正离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的那些。
如本文使用的，术语“电子电离”或“EI”指的是气相或汽相中感兴趣的分析物与电子流动相互作用的方法。电子与分析物的碰撞产生然后可以经受质谱技术的分析物离子。
如本文使用的，术语“化学电离”或“CI”指的是如下方法：其中试剂气体(例如氨)经受电子碰撞，并且通过试剂气体离子和分析物分子的相互作用形成分析物离子。
如本文使用的，术语“快原子轰击”或“FAB”指的是如下方法：其中高能原子(通常，Xe或Ar)束碰撞不挥发的样品，解吸和电离在样品中包含的分子。测试样品溶解于粘性液体基质比如甘油、硫代甘油、间硝基苄醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯基辛基醚、环丁砜、二乙醇胺、和三乙醇胺中。用于化合物或样品的适当的基质的选择是经验过程。
如本文使用的，术语“基质辅助激光解吸电离”或“MALDI”指的是如下方法：其中不挥发的样品被暴露于激光照射，其通过多种电离途径——包括光致电离、质子化、去质子化、和簇衰变(cluster decay)——解吸和电离样品中的分析物。对于MALDI，样品与能量吸收基质混合，其促进分析物分子的解吸。
如本文使用的，术语“表面增强激光解吸电离”或“SELDI”指的是另一种方法：其中不挥发的样品被暴露于激光照射，其通过多种电离途径——包括光致电离、质子化、去质子化、和簇衰变——解吸和电离样品中的分析物。对于SELDI，样品通常被结合至优先地保留一种或多种感兴趣的分析物的表面。如在MALDI中，此过程也可以采用能量吸收材料以促进电离。
如本文使用的，术语“电喷雾电离”或“ESI”指的是使溶液沿着其末端被施加高的正或负电位的短毛细管长度穿过的方法。到达管的末端的溶液被汽化(雾化)为溶剂蒸汽中极小的溶液液滴的喷射(jet)或喷雾。此雾滴流动通过蒸发室，其被轻微地加热以防止凝结和以蒸发溶剂。在液滴变小时，电表面电荷密度增加，直到相同电荷之间的自然排斥引起离子以及中性分子释放的时间。
如本文使用的，术语“大气压化学电离”或“APCI”指的是类似于ESI的质谱方法；然而，APCI通过在大气压下在等离子体内发生的离子-分子反应产生离子。通过喷雾毛细管和对电极之间的放电维持等离子体。然后，通常通过使用一组差动泵送的分流器(skimmer)级将离子提取入质量分析器。干燥的和预热的N2气体的逆流可以被用于改进溶剂的去除。APCI中的气相电离可以比ESI更有效地用于分析低极性物类。
如本文使用的，术语“大气压光致电离”或“APPI”指的是分子M的光致电离机制是光子吸收和电子发射以形成分子离子M+的质谱法形式。因为光子能量通常仅高于电离电位，所以分子离子不易于解离。在许多情况下，可能在不需要色谱法的情况下分析样品，因而节约了显著的时间和费用。在存在水汽或质子溶剂的情况下，分子离子可以提取H以形成MH+。这倾向于在M具有高质子亲和力时发生。因为M+和MH+的总和是常数，所以这并不影响定量准确度。质子溶剂中的药物化合物通常被观察为MH+，而非极性化合物比如萘或睾酮通常形成M+。Robb,D.B.,Covey,T.R.and Bruins,A.P.(2000)：参见，例如，Robb et al.,Atmospheric pressure photoionization:An ionization method for liquidchromatography-mass spectrometry.Anal.Chem.72(15):3653-3659。
如本文使用的，术语“电感耦合等离子体”或“ICP”指的是如下方法：其中样品在足够高的温度下与部分电离的气体相互作用，以便大部分元素被原子化和电离。
如本文使用的，术语“场解吸”指的是如下方法：其中不挥发的测试样品被放置在电离表面上，并且强电场被用于生成分析物离子。
如本文使用的，术语“解吸”指的是从表面去除分析物和/或使分析物进入气相。
如本文使用的，术语“量化限”、“定量限”或“LOQ”指的是测量在数量上变得有意义的点。在此LOQ处的分析物反应是可辨别的、离散的和可再现的，其具有20％的精确度和80％至120％的准确度。
如本文使用的，术语“检测限”或“LOD”是测量值大于与其相关联的不确定性的点。LOD被任意地定义为与零浓度的2倍标准差(SD)。
如本文使用的，体液样品中淀粉状蛋白β的“量”通常指的是反映在体液的体积中可检测的淀粉状蛋白β的质量的绝对值。然而，量也考虑与另一种淀粉状蛋白β量比较的相对量。例如，体液中淀粉状蛋白β的量可以是大于或小于正常存在的淀粉状蛋白β的对照或正常水平的量。
如本文关于定量测量——不包括离子的质量的测量——使用的术语“大约”指的是指示的值加或减10％。在测定给定的分析物的质量中，质谱仪器可以轻微地变化。在离子的质量或离子的质/荷比的上下文中，术语“大约”指的是+/-0.50个原子质量单位。
上面描述的发明内容是非限制性的，并且根据本发明的下列具体实施方式和所附权利要求书，本发明的其它特征和优点将是明显的。
附图说明
图1显示了Aβ40(SEQ ID NO:1)、Aβ40片段(SEQ ID NO:2)、Aβ42(SEQ ID NO:3)、和Aβ42片段(SEQ ID NO:4)的序列。
图2显示了液相色谱方法信息。使用水中0.1％FA的流动相A和ACN中0.1％FA的流动相B。
图3显示了加热电喷雾电离(HESI)离子源条件。
图4显示了Aβ42分析的线性范围。
图5显示了Aβ40分析的线性范围。
图6和7显示了Aβ40、Aβ42、和内标的实例患者色谱图。
图8显示了211名对象中Aβ42:Aβ40的比率，包括91名阿耳茨海默病患者，66名临界阿耳茨海默病患者、和正常对象。
图9显示了女性对男性阿耳茨海默病患者中Aβ42:Aβ40的比率。
图10显示了阿耳茨海默病患者的年龄分层组中Aβ42:Aβ40的比率。
图11显示了C8对C4分析柱之间的灵敏度比较。
图12显示了来自处理的对未处理的管的Aβ40的回收。
图13显示了来自处理的对未处理的管的Aβ42的回收。
图14显示了通过降低Aβ40水平分类的患者Aβ值(pg/mL)。
图15显示了通过降低Aβ42水平分类的患者Aβ值(pg/mL)。
图16显示了通过Aβ42/Aβ40值分类的患者阿耳茨海默病诊断。
图17显示了基于Aβ42/Aβ40比率的患者阿耳茨海默病诊断。
具体实施方式
本文提供了通过质谱法——包括串联质谱法——检测或测定样品中淀粉状蛋白β(Aβ)的量的方法。在某些实施方式中，本文提供的用于测定淀粉状蛋白β的量的方法包括(a)纯化样品中的淀粉状蛋白β；(b)电离样品中的淀粉状蛋白β；和(c)通过质谱法测定淀粉状蛋白β离子(一种或多种)的量；其中淀粉状蛋白β离子(一种或多种)的量与样品中淀粉状蛋白β的量相关。
在某些实施方式中，本文提供的用于测定淀粉状蛋白β的量的方法包括(a)纯化样品中的淀粉状蛋白β；(b)电离样品中的淀粉状蛋白β以产生淀粉状蛋白β的先驱离子；(c)生成淀粉状蛋白β的一种或多种碎片离子；和(d)通过质谱法测定来自步骤(c)或(d)或二者的离子(一种或多种)的量；其中淀粉状蛋白β离子(一种或多种)的量与样品中淀粉状蛋白β的量相关。
在某些实施方式中，本文提供的用于测定淀粉状蛋白β的量的方法包括(a)消化样品中的淀粉状蛋白β以生成淀粉状蛋白β的一种或多种片段；(b)纯化一种或多种淀粉状蛋白β片段；(c)电离样品中的淀粉状蛋白β以产生淀粉状蛋白β的先驱离子；(d)生成淀粉状蛋白β的一种或多种碎片离子；和(e)通过质谱法测定来自步骤(c)或(d)或二者的离子(一种或多种)的量；其中淀粉状蛋白β离子(一种或多种)的量与样品中淀粉状蛋白β的量相关。
在某些实施方式中，本文提供了用于测定淀粉状蛋白β42(Aβ42)的量的方法。在一些实施方式中，Aβ42片段包括序列GAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO:4)。在一些实施方式中，方法包括(a)消化样品中的淀粉状蛋白β以生成淀粉状蛋白β42(Aβ42)；(b)纯化Aβ42；(c)电离Aβ42以产生先驱离子；(d)生成Aβ42的一种或多种碎片离子；和(e)通过质谱法测定来自步骤(c)或(d)或二者的离子(一种或多种)的量；其中离子(一种多种)的量与样品中Aβ42的量相关。
在某些实施方式中，本文提供了用于测定淀粉状蛋白β40(Aβ40)的量的方法。在一些实施方式中，Aβ40片段包括序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO:2)。在一些实施方式中，方法包括(a)消化样品中的淀粉状蛋白β以生成淀粉状蛋白β40(Aβ40)；(b)纯化Aβ40；(c)电离Aβ40以产生先驱离子；(d)生成Aβ40的一种或多种碎片离子；和(e)通过质谱法测定来自步骤(c)或(d)或二者的离子(一种或多种)的量；其中离子(一种多种)的量与样品中Aβ40的量相关。
在某些实施方式中，本文提供了用于测定淀粉状蛋白β42(Aβ42)和淀粉状蛋白β40(Aβ40)的量的方法。在一些实施方式中，方法包括(a)消化样品中的淀粉状蛋白β以生成淀粉状蛋白β42(Aβ42)和淀粉状蛋白β40(Aβ40)；(b)纯化Aβ42和Aβ40；(c)电离Aβ42和Aβ40以产生先驱离子；(d)生成Aβ42和Aβ40的一种或多种碎片离子；和(e)通过质谱法测定来自步骤(c)或(d)或二者的离子(一种或多种)的量；其中离子(一种多种)的量与样品中Aβ42和Aβ40的量相关。
在某些实施方式中，本文提供了用于测定淀粉状蛋白β42(Aβ42)与淀粉状蛋白β40(Aβ40)的比率的方法。在一些实施方式中，方法包括(a)消化样品中的淀粉状蛋白β以生成淀粉状蛋白β42(Aβ42)和淀粉状蛋白β40(Aβ40)；(b)纯化Aβ42和Aβ40；(c)电离Aβ42和Aβ40以产生先驱离子；(d)生成Aβ42和Aβ40的一种或多种碎片离子；和(e)通过质谱法测定来自步骤(c)或(d)或二者的离子(一种或多种)的量；和(f)测定Aβ42与Aβ40的比率。在一些实施方式中，方法包括测定Aβ40与Aβ42的比率。
在某些实施方式中，本文提供了用于诊断或预后阿耳茨海默病或痴呆的方法，方法包括通过质谱法测定测试样品中淀粉状蛋白β的量；其中异常水平的淀粉状蛋白β预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，方法可以包括：(a)纯化样品中的淀粉状蛋白β；(b)电离样品中的淀粉状蛋白β；和(c)通过质谱法测定淀粉状蛋白β离子(一种或多种)的量；和(d)淀粉状蛋白β离子(一种或多种)的量与样品中淀粉状蛋白β的量相关；其中异常水平的淀粉状蛋白β预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，方法包括测定淀粉状蛋白β片段的比率。在一些实施方式中，方法包括测定淀粉状蛋白β42(Aβ42)与淀粉状蛋白β40(Aβ40)的比率。在一些实施方式中，方法包括测定淀粉状蛋白β42(Aβ40)与淀粉状蛋白β40(Aβ42)的比率。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括预处理与样品接触的器材的表面。在一些实施方式中，预处理包括使用防止淀粉状蛋白β或其片段粘附至表面的试剂预涂覆器材的表面。在一些实施方式中，预处理包括细菌溶胞产物预处理。在一些实施方式中，预处理包括大肠杆菌溶胞产物预处理。在一些实施方式中，大肠杆菌溶胞产物包括胰蛋白酶消化的大肠杆菌溶胞产物。在一些实施方式中，预处理的器材包括但不限于试管或平板、吸管端、样品制备设备、液相色谱设备、和质谱设备。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括使用稳定淀粉状蛋白β或其片段的试剂处理或培育样品。在一些实施方式中，本文提供的方法包括使用淀粉状蛋白β抗体处理或培育样品。在一些实施方式中，本文提供的方法包括使用至少两种不同的淀粉状蛋白β抗体处理或培育样品。在一些实施方式中，淀粉状蛋白β抗体包括结合至淀粉状蛋白β的C-端的抗体。在一些实施方式中，淀粉状蛋白β抗体包括结合至淀粉状蛋白β的N-端的抗体。在一些实施方式中，稳定淀粉状蛋白β的试剂包括载脂蛋白。在一些实施方式中，稳定淀粉状蛋白β的试剂包括载脂蛋白E2。在一些实施方式中，稳定淀粉状蛋白β的试剂包括载脂蛋白E4。在一些实施方式中，稳定淀粉状蛋白β的试剂包括结合至淀粉状蛋白β的C-端的抗体、结合至淀粉状蛋白β的N-端的抗体、载脂蛋白E2、载脂蛋白E4、或其组合。在一些实施方式中，本文提供的稳定淀粉状蛋白β的试剂给予-70℃下至少1个月的稳定性。在一些实施方式中，本文提供的稳定淀粉状蛋白β的试剂给予-70℃下至少2个月的稳定性。在一些实施方式中，本文提供的稳定淀粉状蛋白β的试剂给予-70℃下至少3个月的稳定性。在一些实施方式中，本文提供的稳定淀粉状蛋白β的试剂给予通过冻融循环的稳定性。在一些实施方式中，本文提供的稳定淀粉状蛋白β的试剂给予通过至少两个冻融循环的稳定性。在一些实施方式中，本文提供的稳定淀粉状蛋白β的试剂给予通过至少三个冻融循环的稳定性。在一些实施方式中，本文提供的稳定淀粉状蛋白β的试剂给予通过至少四个冻融循环的稳定性。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括消化样品中的淀粉状蛋白β。在一些实施方式中，本文提供的方法包括使用酶消化淀粉状蛋白β。在一些实施方式中，酶是Lys-C。在一些实施方式中，本文提供的方法包括使用尿素消化淀粉状蛋白β。在一些实施方式中，尿素是以适合蛋白质消化的浓度。在一些实施方式中，尿素是6M尿素。在一些实施方式中，本文提供的方法包括使用尿素和Lys-C消化淀粉状蛋白β。在一些实施方式中，消化包括在减少消化时间或增加消化效率的条件中消化。在一些实施方式中，消化包括在微波中消化。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括提取。在一些实施方式中，本文提供的方法包括混合模式阴离子交换提取。在一些实施方式中，本文提供的方法包括固相提取。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括使用加热的氮洗脱和干燥样品。在一些实施方式中，样品被重悬在重构缓冲液中。
在某些实施方式中，纯化样品包括液相色谱法。在一些实施方式中，液相色谱法包括但不限于反相液相色谱法(RPLC)、高效液相色谱法(HPLC)、和高湍流液相色谱法(HTLC)。在优选的实施方式中，液相色谱法包括HPLC。在一些实施方式中，HPLC柱通常包括介质(即，填充材料)以促进化学部分的分离(即，分级)。合适的柱可以包括C-4、C-8、C-12、或C-18柱。在优选的实施方式中，合适的HPLC柱是C-4柱。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括使用减少将淀粉状蛋白β粘附至器材的表面的器材。在一些实施方式中，器材包括PEEK(聚醚醚酮)管道系统或设备。在一些实施方式中，器材包括金属管道系统或设备。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括串联质谱法。在一些实施方式中，本文提供的方法包括以正模式进行电离。在一些实施方式中，本文提供的方法包括以负模式进行电离。在一些实施方式中，本文提供的方法包括使用加热电喷雾电离(HESI)进行电离。在一些实施方式中，本文提供的方法包括使用电喷雾电离(ESI)进行电离。在一些实施方式中，本文提供的方法包括使用大气压化学电离(APCI)进行电离。在优选的实施方式中，本文提供的方法包括使用加热电喷雾电离(HESI)以正模式进行电离。在一些实施方式中，碰撞能量在5V至60V之间。在一些实施方式中，碰撞能量在10V至50V之间。在一些实施方式中，碰撞能量在20V至50V之间。在一些实施方式中，碰撞能量在20V至45V之间。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括检测或测定淀粉状蛋白β40(Aβ40)的量。在一些实施方式中，Aβ40包括序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV(SEQ IDNO:1)。在一些实施方式中，本文提供的方法包括检测或测定Aβ40的片段的量。在一些实施方式中，Aβ40片段包括序列GAIIGLMVGGVV(SEQ ID NO:2)。在一些实施方式中，Aβ40片段包括包含N-端或C-端翼状肽的序列。在一些实施方式中，Aβ40片段包括SEQ ID NO:2和N-端或C-端翼状肽。在一些实施方式中，翼状肽是亲水性的。在一些实施方式中，翼状肽包括至少一个氨基酸。在一些实施方式中，翼状肽包括至少两个氨基酸。在一些实施方式中，翼状肽包括至少三个氨基酸。在一些实施方式中，翼状肽包括至少四个氨基酸。在一些实施方式中，翼状肽包括至少五个氨基酸。在一些实施方式中，翼状肽包括至少六个氨基酸。在一些实施方式中，Aβ40片段的量与样品中Aβ40的量关联。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括检测或测定淀粉状蛋白β42(Aβ42)的量。在一些实施方式中，Aβ42包括序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQID NO:3)。在一些实施方式中，本文提供的方法包括检测或测定Aβ42的片段的量。在一些实施方式中，Aβ42片段包括序列GAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO:4)。在一些实施方式中，Aβ42片段包括包含N-端或C-端翼状肽的序列。在一些实施方式中，Aβ42片段包括SEQ ID NO:4和N-端或C-端翼状肽。在一些实施方式中，翼状肽是亲水性的。在一些实施方式中，翼状肽包括至少一个氨基酸。在一些实施方式中，翼状肽包括至少两个氨基酸。在一些实施方式中，翼状肽包括至少三个氨基酸。在一些实施方式中，翼状肽包括至少四个氨基酸。在一些实施方式中，翼状肽包括至少五个氨基酸。在一些实施方式中，翼状肽包括至少六个氨基酸。在一些实施方式中，Aβ42片段的量与样品中Aβ42的量关联。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括检测或测定Aβ40与Aβ42的比率(Aβ40:Aβ42)。在一些实施方式中，本文提供的方法包括检测或测定Aβ40片段与Aβ42片段的比率(Aβ40片段:Aβ42片段)。在一些实施方式中，本文提供的方法包括检测或测定Aβ42与Aβ40的比率(Aβ42:Aβ40)。在一些实施方式中，本文提供的方法包括检测或测定Aβ42片段与Aβ40片段的比率(Aβ42片段:Aβ40片段)。
在某些实施方式中，0.6或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.5或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.45或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.4或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.35或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.3或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.25或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.2或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.19或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.18或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.17或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.16或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.15或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。在一些实施方式中，0.1或更小的Aβ42与Aβ40的比率或Aβ42片段与Aβ40片段的比率预测或诊断阿耳茨海默病。
在某些实施方式中，方法包括生成Aβ或其片段的一种或多种先驱离子。在一些实施方式中，先驱离子中的至少一种具有1085.6±0.5或1269.7±0.5的质/荷比。在一些实施方式中，方法可以包括生成Aβ或其片段的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，碎片离子中的至少一种具有812.37±0.5、869.4±0.5、968.43±0.5、869.39±0.5、968.44±0.5、1067.5±0.5、或1180.57±0.5的质/荷比。
在某些实施方式中，本文提供的方法包括添加内标。在一些实施方式中，内标包括同位素标记的内标。在一些实施方式中，内标包括13C15N标记。在一些实施方式中，内标包括至少一个以13C15N标记的Phe、Leu、或Met。在一些实施方式中，内标的先驱离子中的至少一种具有1110.7±0.5的质/荷比。在一些实施方式中，方法可以包括生成内标的一种或多种碎片离子。在一些实施方式中，碎片离子中的至少一种具有768.48±0.5、825.5±0.5、或882.52±0.5的质/荷比。
在某些实施方式中，方法的定量限小于或等于10ng/mL。在一些实施方式中，方法的定量限小于或等于5ng/mL。在一些实施方式中，方法的定量限小于或等于4ng/mL。在一些实施方式中，方法的定量限小于或等于3ng/mL。在一些实施方式中，方法的定量限小于或等于2ng/mL。在一些实施方式中，方法的定量限小于或等于1ng/mL。在一些实施方式中，方法的定量限小于或等于0.5ng/mL。在一些实施方式中，方法的定量限小于或等于0.2ng/mL。在一些实施方式中，方法的定量限小于或等于0.1ng/mL。
在一些实施方式中，方法的检测限小于或等于5ng/mL。在一些实施方式中，方法的检测限小于或等于1ng/mL。在一些实施方式中，方法的检测限小于或等于0.5ng/mL。在一些实施方式中，方法的检测限小于或等于0.1ng/mL。在一些实施方式中，方法的检测限小于或等于0.05ng/mL。在一些实施方式中，方法的检测限小于或等于0.01ng/mL。
在一些实施方式中，淀粉状蛋白β在质谱法之前不被衍生化。在一些实施方式中，淀粉状蛋白β在质谱法之前被衍生化。
在某些实施方式中，样品是体液。在一些实施方式中，样品是脑脊液(CSF)。在一些实施方式中，样品是血浆或血清。在一些实施方式中，样品是全血。在一些实施方式中，样品是唾液或尿。
合适的测试样品包括可能包含感兴趣的分析物的任何测试样品。在一些优选的实施方式中，样品是生物学样品；即，从任何生物学来源比如动物、细胞培养物、或器官培养物等获得的样品。在某些优选的实施方式中，从哺乳动物比如狗、猫、马等获得样品。特别优选的哺乳动物是灵长类，最优选地，男人或女人。特别优选的样品包括血液、血浆、血清、毛发、肌肉、尿、唾液、眼泪、脑脊液、或其它组织样品。例如，这样的样品可以获得自患者；即，自身处于用于诊断、预后、或治疗疾病或病症的临床环境的活人，男性或女性。测试样品优选地获得自患者，例如，血清。
质谱法的样品制备
可以用于相对于样品中的其它组分(例如蛋白质)富集淀粉状蛋白β的方法包括例如过滤、离心、薄层色谱法(TLC)、电泳(包括毛细管电泳)、亲和分离(包括免疫亲和分离)、提取方法(包括乙酸乙酯提取和甲醇提取)、和使用离液剂或上面的任意组合等。
蛋白质沉淀是一种优选的制备测试样品的方法。这样的蛋白质纯化方法是本领域熟知的，例如，Polson et al.,Journal of Chromatography B 785:263-275(2003)描述了适合用于该方法的蛋白质沉淀技术。蛋白质沉淀可以被用于从样品去除大多数蛋白质，留下淀粉状蛋白β在上清液中。可以离心样品以分离液体上清液与沉淀的蛋白质。得到的上清液可以然后被应用于液相色谱法和后续质谱分析。在某些实施方式中，例如，在HPLC和质谱法之前使用蛋白质沉淀比如乙腈蛋白质沉淀消除对高湍流液相色谱法(HTLC)或其它在线提取的需要。因此，在这样的实施方式中，方法涉及(1)进行感兴趣的样品的蛋白质沉淀；和(2)将上清液直接装载至HPLC-质谱仪上而不使用在线提取或高湍流液相色谱法(HTLC)。
在一些优选的实施方式中，HPLC，单独地或与一种或多种纯化方法组合地，可以被用于在质谱法之前纯化淀粉状蛋白β。在这样的实施方式中，在电离之前，样品可以使用捕获分析物的HPLC提取柱体进行提取，然后在第二HPLC柱或分析型HPLC柱上进行洗脱和色谱法。因为可以以自动化方式连接涉及这些色谱程序的步骤，所以可以最小化纯化分析物期间对操作者参与的需要。此特征可以导致节约时间和成本，并且消除操作者失误的可能。
认为湍流比如由HTLC柱和方法提供的湍流可以增强质量传递的速率，改进分离特性。HTLC柱借助通过包含刚性颗粒的填充柱的高色谱流速分离组分。通过采用高流速(例如，3-5mL/min)，在固定相和感兴趣的分析物(一种或多种)之间引起几乎彻底的相互作用的柱中出现湍流。使用HTLC柱的优点是由于在湍流条件下不保留高分子量物类，避免了与生物学流体基质相关联的大分子集聚。在一个程序中组合多个分离的HTLC方法减少对冗长的样品制备的需要并且以显著较大的速度操作。这样的方法还取得优于层流(HPLC)色谱法的分离性能。HTLC允许生物学样品(血浆、尿等)的直接注入。在传统形式的色谱法中难以实现直接注入，这是因为变性的蛋白质和其它生物学碎片迅速地阻塞分离柱。HTLC还允许小于1mL，优选地小于0.5mL，优选地小于0.2mL，优先地0.1mL的非常低的样品体积。
其它地方已经描述了在通过质谱法分析之前应用于样品制备的HTLC的实例。参见，例如，Zimmer et al.,J.Chromatogr.A 854:23-35(1999)；还参见美国专利号5,968,367；5,919,368；5,795,469；和5,772,874。在方法的某些实施方式中，样品在装载在HTLC柱上之前经受如上面描述的蛋白质沉淀；在可选的优选实施方式中，样品可以被直接装载在HTLC上，而不经受蛋白质沉淀。HTLC提取柱优选地是大颗粒柱。在多个实施方式中，方法的多个步骤之一可以以在线自动化方式进行。例如，在一个实施方式中，步骤(i)-(v)以在线自动化方式进行。在另一个中，电离和检测的步骤在步骤(i)-(v)之后在线进行。
包括高效液相色谱法(HPLC)的液相色谱法(LC)依赖于相对慢的层流技术。传统的HPLC分析依赖于柱填充物，其中通过柱的样品的层流是从样品分离感兴趣的分析物的基础。技术人员将理解这样的柱中的分离是扩散过程。HPLC已经被成功地应用于分离生物学样品中的化合物，但是在使用质谱仪(MS)的分离和后续分析之前需要显著量的样品制备，这使得此技术是劳动密集型的。此外，大多数HPLC系统没有最大限度地利用质谱仪，这使得仅一个HPLC系统被连接至单个MS仪器，导致用于进行大量试验的冗长的时间需要。
已经描述了在质谱分析之前将HPLC用于样品净化(clean-up)的多种方法。参见，例如，Taylor et al.,Therapeutic Drug Monitoring 22:608-12(2000)；and Salm etal.,Clin.Therapeutics 22Supl.B:B71-B85(2000)。
技术人员可以选择适合与淀粉状蛋白β一起使用的HPLC仪器和柱。色谱柱通常包括促进化学部分的分离(即，分级)的介质(即，填充材料)。介质可以包括微小的颗粒。颗粒包括与多种化学部分相互作用以促进化学部分的分离的结合表面。一种适合的结合表面是疏水性结合表面，比如烷基结合表面。烷基结合表面可以包括C-4、C-8、C-12、或C-18结合的烷基，优选地C-18结合的基团。色谱柱包括接收样品的入口和排出包括分级样品的流出物的出口。在一个实施方式中，样品(或预纯化的样品)在入口处被施加至柱，使用溶剂或溶剂混合物洗脱，并且在出口处排出。可以选择不同溶剂模式用于洗脱感兴趣的分析物(一种或多种)。例如，可以使用梯度模式、无梯度模式、或多型(即混合)模式进行液相色谱法。在色谱法期间，材料的分离被变量影响，比如洗脱剂(也称为“流动相”)、洗脱模式、梯度条件、温度等的选择。
在某些实施方式中，可以通过如下纯化分析物：在感兴趣的分析物通过柱填充材料可逆地保留的条件下将样品施加至柱，而不保留一种或多种其它材料。在这些实施方式中，可以采用通过柱保留感兴趣的分析物的第一流动相条件，并且一旦未保留的材料被洗涤通过，可以随后采用第二流动相条件以从柱去除保留的材料。可选地，可以通过如下纯化分析物：在以与一种或多种其它材料比较差异的速率下洗脱感兴趣的分析物的流动相条件下将样品施加至柱。这样的程序可以相对于样品的一种或多种其它组分富集一种或多种感兴趣的分析物的量。
在优选的实施方式中，在疏水柱色谱系统上，HTLC可以接着HPLC。在某些优选的实施方式中，使用来自Cohesive Technologies的TurboFlow Cyclone 聚合物基柱(60μm粒径，50×1.0mm柱尺寸，/>孔径)。在相关的优选实施方式中，使用具有亲水性封端的来自Phenomenex Inc的Synergi/>醚交联的苯基分析柱(4μm粒径，150×2.0mm柱尺寸，/>孔径)。在某些优选的实施方式中，使用HPLC级超纯水和100％甲醇作为流动相进行HTLC和HPLC。
通过仔细选择阀和连接器管道，可以根据需要连接两个或更多个色谱柱，以便材料从一个传至下一个，而不需要任何手动步骤。在优选的实施方式中，通过预编程以执行必需步骤的计算机控制阀和管道的选择。最优选地，色谱系统还以这样的在线方式被连接至检测器系统，例如，MS系统。因而，操作者可以将一盘样品放置在自动进样器中，并且在计算机控制下进行其余的操作，其导致纯化和分析选择的所有样品。
在某些优选的实施方式中，可以在电离之前纯化样品中的淀粉状蛋白β或其片段。在特别优选的实施方式中，色谱法不是气相色谱法。
通过质谱法的检测和定量
在多个实施方式中，可以通过技术人员已知的任何方法电离淀粉状蛋白β或其片段。使用质谱仪进行质谱法，其包括用于电离分级样品和产生带电分子用于进一步分析的离子源。例如，可以通过电子电离、化学电离、电喷雾电离(ESI)、质子电离、大气压化学电离(APCI)、光致电离、大气压光致电离(APPI)、快原子轰击(FAB)、液体二次电离(LSI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场电离、场解吸、热喷雾/等离子体喷雾电离、表面增强激光解吸电离(SELDI)、电感耦合等离子体(ICP)和粒子束电离进行样品的电离。技术人员将理解，可以基于待测量的分析物、样品的类型、检测器的类型、正对负模式的选择等确定电离方法的选择。
在优选的实施方式中，通过加热电喷雾电离(HESI)以正或负模式电离淀粉状蛋白β或其片段。在可选的实施方式中，通过电喷雾电离(ESI)或大气压化学电离(APCI)以正或负模式电离淀粉状蛋白β或其片段。
在样品已经被电离后，可以分析由此产生的带正电或负电的离子以测定质荷比。用于测定质荷比的合适的分析器包括四极分析器、离子阱分析器、和飞行时间分析器。可以使用数种检测模式检测离子。例如，即，可以使用选择性离子监测模式(SIM)检测选择的离子，或可选地，可以使用扫描模式，例如，多反应监测(MRM)或选择反应监测(SRM)检测离子。优选地，使用四极分析器测定质荷比。例如，在“四极”或“四极离子阱”仪器中，振荡射频场中的离子经历与在电极之间施加的DC电位、RF信号的振幅、和质/荷比成比例的力。可以选择电压和振幅，使得仅具有特定质/荷比的离子行进四极的长度，而所有其它离子被偏转。因而，四极仪器可以充当注入仪器的离子的“质量过滤器”和“质量检测器二者。
可以通过采用“串联质谱法”或“MS/MS”增强MS技术的分辨率。在此技术中，可以在MS仪器中过滤由感兴趣的分子生成的先驱离子(也称为母离子)，并且随后破碎先驱离子以产生一种或多种碎片离子(也称为子离子或产物离子)，其然后在第二个MS程序中被分析。通过仔细选择先驱离子，仅由某些分析物产生的离子被传至破碎室，在其中与惰性气体的原子的碰撞产生碎片离子。因为在给定的电离/破碎条件组下以可再现方式产生先驱离子和碎片离子二者，所以MS/MS技术可以提供极强大的分析工具。例如，过滤/破碎的组合可以被用于消除干扰物质，并且在复杂的样品比如生物学样品中可以是特别有用的。
质谱仪通常给使用者提供离子扫描；即，在给定范围(例如，100至1000amu)内具有特定质量/电荷的每种离子的相对丰度。分析试验即质谱的结果可以通过本领域已知的众多方法与原始样品中分析物的量相关。例如，考虑到仔细地控制取样和分析参数，给定离子的相对丰度可以与将该相对丰度转换为原始分子的绝对量的表格比较。可选地，分子标准物可以与样品一起运行，并且基于由那些标准物生成的离子构建标准曲线。使用这样的标准曲线，给定离子的相对丰度可以被转换为原始分子的绝对量。在某些优选的实施方式中，内标被用于生成计算淀粉状蛋白β的数量的标准曲线。生成和使用这样的标准曲线的方法是本领域熟知的并且普通技术人员能够选择适当的内标。例如，淀粉状蛋白β的同位素可以被用作内标。用于使离子的量与原始分子的量相关的众多其它方法将是本领域普通技术人员熟知的。
可以使用自动化机器进行方法的一个或多个步骤。在某些实施方式中，在线进行一个或多个纯化步骤，并且更优选地，可以以在线方式进行所有纯化和质谱法步骤。
在某些实施方式中，比如MS/MS，其中先驱离子被分离用于进一步的破碎，碰撞活化解离通常被用于生成碎片离子用于进一步检测。在CAD中，先驱离子通过与惰性气体碰撞获得能量，并且随后通过被称为“单分子分解”的过程破碎。必须在先驱离子中蓄积足够的能量，使得离子内的某些键可以由于增加的振动能量而被破坏。
在特别优选的实施方式中，如下使用MS/MS检测和/或定量淀粉状蛋白β。样品经受液相色谱法，优选地HPLC，来自色谱柱的液体溶剂的流动进入MS/MS分析器的加热的喷雾器接口，并且在接口的加热的带电管道系统中将溶剂/分析物混合物转化为蒸汽。通过选择的喷雾器电离分析物。离子例如先驱离子穿过仪器的孔口并且进入第一个四极。四极1和3(Q1和Q3)是质量过滤器，其允许基于它们的质荷比(m/z)选择离子(即，“先驱”离子和“碎片”离子)。四极2(Q2)是碰撞池(collision cell)，在其中离子被破碎。质谱仪的第一个四极(Q1)选择用于具有淀粉状蛋白β的质荷比的分子。具有正确的淀粉状蛋白β的质/荷比的先驱离子被允许传入碰撞室(Q2)，而具有任何其它质/荷比的不需要的离子与四极的侧面碰撞并且被消除。进入Q2的先驱离子与中性氩气分子碰撞并且破碎。此过程被称为碰撞活化解离(CAD)。生成的碎片离子被传入四极3(Q3)，在其中选择淀粉状蛋白β的碎片离子同时消除其它离子。
方法可以包含以正或负离子模式进行的MS/MS。使用本领域熟知的标准方法，普通技术人员能够鉴定淀粉状蛋白β的特定先驱离子的一种或多种碎片离子，其可以被用于四极3(Q3)中的选择。
如果淀粉状蛋白β的先驱离子包括醇或胺基团，则一般形成分别代表先驱离子脱水或脱氨基的碎片离子。在包括醇基团的先驱离子的情况下，通过脱水形成的这样的碎片离子由从先驱离子失去一个或多个水分子引起(即，其中先驱离子和碎片离子之间质荷比的差异对于失去一个水分子是大约18，或对于失去两个水分子是大约36，等等)。在包括胺基团的先驱离子的情况下，通过脱氨基形成的这样的碎片离子由失去一个或多个氨分子引起(即其中先驱离子和碎片离子之间质荷比的差异对于失去一个氨分子是大约17，或对于失去两个氨分子是大约34，等等)。同样，包括一个或多个醇和胺基团的先驱离子一般形成代表失去一个或多个水分子和/或一个或多个氨分子的碎片离子(即，其中先驱离子和碎片离子之间质荷比的差异对于失去一个水分子和失去一个氨分子是大约35)。通常，代表先驱离子脱水或脱氨基的碎片离子对特定的分析物不是特异性碎片离子。因此，在本发明的优选实施方式中，进行MS/MS，以便检测淀粉状蛋白β的至少一种碎片离子，其不仅仅代表从先驱离子失去一个或多个水分子和/或失去一个或多个氨分子。
在离子与检测器碰撞时，它们产生转换为数字信号的电子脉冲。获取的数据被中继至计算机，其绘出收集的离子的计数对时间图。得到的质量色谱图与传统的HPLC方法中生成的色谱图类似。测量对应于特定离子的峰下面积、或这样的峰的振幅，并且面积或振幅与感兴趣的分析物的量关联。在某些实施方式中，测量碎片离子(一种或多种)和/或先驱离子的曲线下面积、或峰的振幅以测定淀粉状蛋白β的量。如上面描述的，基于内标分子的一种或多种离子的峰，使用校准标准曲线，可以将给定离子的相对丰度转换为原始分析物的绝对量。
下列实施例用来说明本发明。这些实施例绝不意欲限制方法的范围。
实施例
实施例1：器材预处理和淀粉状蛋白β稳定化
96孔聚丙烯板和微型离心机试管预处理
将大肠杆菌进行细胞溶解，并且在96孔板中使用甲醇进行沉淀。
然后丢弃甲醇，同时沉淀物被重悬在碳酸氢铵pH 8中。
添加Sigma牛胰蛋白酶，并且样品在60℃下培育2天。
所有消化物然后被丢弃为废料或被合并以预处理吸管端。
完全干燥空白板和试管。
吸管端预处理
吸管端被用于吸取大肠杆菌消化物上下至少3次并且然后在60℃下培育2天或直到完全干燥。
淀粉状蛋白β肽稳定化
AB40、AB42、和内标在预处理的试管中被合成并且被重悬在具有4mg BSA的6M尿素中。
然后使用N-端和C-端抗体以及载脂蛋白E2和E4在0.1M PBS中分别地1:10稀释标准物。
在室温下在振动器上培育每种混合物1小时。
AB40和AB42然后被组合并且在0.1M PBS和0.4mg/mL BSA中稀释以在冷冻前制作高校准品标准物。
下面的表格显示了在处理的和未处理的小瓶中制备的相同样品的并排比较。
AB42 处理的计算值 未处理的计算值 ％回收率
AB212 2.52 0.33 13.10
AB213 2.14 0.81 37.85
AB214 5.73 1.45 25.31
AB215 0.92 0.21 22.83
AB216 1.85 0.99 53.51
AB40 处理的计算值 未处理的计算值
AB212 15.01 2.73 18.19
AB213 13.11 4.93 37.60
AB214 19.18 5.62 29.30
AB215 6.02 2.23 37.04
AB216 7.08 4.76 67.23
实施例2：样品制备
使用预处理的吸管端将0.5mL的样品或标准物吸取入预处理的96孔板。
添加5ng的内标。
添加250μL的18M尿素。
2μg的Lys-C被添加至每个样品用于消化淀粉状蛋白β。
在450w、45℃下在酶促微波(enzymatic microwave)中消化4小时前使用粘性盖密封平板。
然后使用Waters混合模式强阴离子交换提取样品。
然后使用加热的氮完全地干燥样品洗脱液。
然后将样品重悬在重构缓冲液中用于LC-MS/MS分析。
实施例3：通过MS/MS检测和定量淀粉状蛋白β片段
离子被传至第一个四极(Q1)，其以分别对于Aβ40片段和Aβ42片段选择质荷比为1085.6±0.5m/z或1269.7±.5m/z的离子。进入四极2(Q2)的离子与氩气碰撞以生成离子碎片，其被传入四极3(Q3)用于进一步选择。同时，以内标进行使用同位素稀释质谱法的相同过程。下列质量转变被用于在验证正极性期间检测和定量。
表1.淀粉状蛋白β片段的质量转变(正极性)
图6和7中显示了实例患者色谱图。
比较多种提取以优化淀粉状蛋白β片段的回收。
表2.固相提取回收比较
Waters MAX：混合模式强阴离子交换→用于最终试验验证
Waters MXC：混合模式强阳离子交换
Waters HLB：用于制作疏水性化合物的二氧化硅
Agilent C18：典型的C18填充物
Phenomenex CX：混合模式强阳离子交换
Thermo SAX：强阴离子交换
混合模式强阴离子交换提供了淀粉状蛋白β片段的最好回收。
尿素在消化中增加分析物的回收。测定下列值：
表3.尿素对无尿素的回收比较
关于灵敏度比较C4分析柱与C8分析柱。C4柱提供了更优越的灵敏度，这是出人意料的，因为C8和C18柱在本领域是通常优选的。图11。
实施例4：试验可报告的范围和线性度
为了在试验中建立淀粉状蛋白β检测的线性度，制备和分析指定为零标准物的一个空白和掺加的标准物。来自五次连续运行的二次回归产生0.995或更大的关联系数，其中±20％的准确度揭示了0.1至25ng/mL的可定量的线性范围。图4和5。
实施例5：试验精确度
针对下列质量控制水平测试试验内样品的再现性：
质量控制水平 β淀粉状蛋白40(pg/mL) β淀粉状蛋白42(pg/mL)
低 750 750
中 7500 7500
高 15000 15000
在运行精确度内：以下列次序在单个试验内分析每种质量控制的十次重复；低、中和高。
接受标准：％CV应当小于容许值≤TEa/2。此试验的TEa被确定为30％。
β淀粉状蛋白40的％CV对所有三种质量控制水平在14.31％至6.55％的范围内。
β淀粉状蛋白42的％CV对所有三种质量控制水平在14.93％至7.51％的范围内。
总精确度：分析试验间验证的数据。
接受标准：如果总SD≥1/2TEa则不可接受，或总SD必须小于限定的最大SD或CV。
％CV应当小于容许值≤TEa/2。此试验的TEa被确定为30％。
β淀粉状蛋白40的％CV对所有三种质量控制水平在10.21％至4.28％的范围内。
β淀粉状蛋白42的％CV对所有三种质量控制水平在14.63％至8.17％的范围内。
实施例6：分析灵敏度(检测限)
空白限(LOB)：计算值：LOB＝空白的平均值+2SD。
在单个试验内分析二十一个基质空白，反向计算的值然后被用于计算下面的LOB。
AB40的LOB：31.32pg/mL。
AB42的LOB：32.11pg/mL。
/>
检测限(LOD)：计算值：LOD＝空白的平均值+4SD。
在单个试验内分析二十一个基质空白，反向计算的值然后被用于计算下面的LOD。
AB40的LOD：77.78pg/mL。
AB42的LOD：74.21pg/mL。
/>
定量限(LOQ)：接受标准：当TEa是30％时％CV小于或等于2SD的最低浓度。
β淀粉状蛋白40和42二者的定量限被测定为100pg/mL。
/>
/>
实施例7：分析物测量范围(AMR)
接受标准：当TEa是30％时观察值的平均数应当偏离期望范围不超过2SD或20％CV。
β淀粉状蛋白40的％CV在6.52至12.01％的范围内，其被视为是可接受的。
β淀粉状蛋白42的％CV在6.27至14.24％的范围内，其被视为是可接受的。
/>
实施例8：准确度
已知标准物的回收。
接受标准：当TEa是30％时，由于缺乏完美回收造成的误差(回收的量减去添加的量)应当≤2SD或15％CV。
以下列浓度掺加六个处理的(stripped)牛脑脊液样品：1000、2000、3000，4000、8000、和9000pg/mL，一式三份地试验每种掺加水平。
然后使用处理的牛脑脊液作为稀释剂以1/3和1/5比率稀释六种不同的掺加水平，并且还一式三份地进行试验。
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
实施例9：样本稳定性
接受标准：样品被认为是稳定的，只要当TEa等于30％时，基线值和时间/温度样品值之间的平均差对于该分析物≤TEa/2。
冷冻/解冻稳定性：通过分析六个患者库——其被分为四个平均的等分试样——来实施冻融分析。在-60至-80℃下冷冻每个患者库的所有四个等分试样。等分试样二到四被解冻至18-26℃的环境温度并且冷冻。等分试样三和四被解冻至18-26℃的环境温度并且冷冻。等分试样四然后被解冻至18-26℃的环境温度并且冷冻。
所有等分试样被最后一次解冻至环境温度18-26℃，并且以技术性一式三份地进行。冻融分析包含跨越三个冻融循环的数据。
β淀粉状蛋白40和β淀粉状蛋白42具有高至两个冻融循环的可接受的稳定性。
/>
提取的样品稳定性：十个样品在样品提取的同一天进行基线值分析。第二天，再次注入相同的样品用于针对基线值的分析。
β淀粉状蛋白40和42显示了在CTC自动进样器的C-组套(stack)中在4℃下高至1天的提取的样品稳定性。
β 淀粉状蛋白 40 pg/mL
基线 1天 平均值 SD ％CV ％回收率
样品1 0.10 0.11 0.11 0.01 6.73％ 110.00％
样品2 0.21 0.22 0.22 0.01 3.29％ 104.76％
样品3 0.49 0.52 0.51 0.02 4.20％ 106.12％
样品4 1.17 1.07 1.12 0.07 6.31％ 91.45％
样品5 2.90 2.86 2.88 0.03 0.98％ 98.62％
样品6 4.62 5.20 4.91 0.41 8.35％ 112.55％
样品7 25.07 25.37 25.22 0.21 0.84％ 101.20％
样品8 0.80 0.76 0.78 0.03 3.63％ 95.00％
样品9 8.17 8.02 8.10 0.11 1.31％ 98.16％
样品10 16.24 14.33 15.29 1.35 8.84％ 88.24％
冷藏稳定性(2.0至8.0℃)：样品已经显示冷藏稳定至高5天。
/>
/>
/>
室温稳定性(18.0至26.0℃)：样品在18-26℃下稳定至高3天。
/>
/>
冷冻稳定性(-10.0至-30.0℃)：样品在-10至-30℃下稳定至高31天。
/>
/>
实施例10：干扰研究
接受标准：由于潜在的干扰物质造成的差异应当≤2SD或20％CV被认为是可接受的。
溶血干扰：对于基线、轻度、中度和重度(gross)溶血干扰，一式三份地分析六个掺加库。
β淀粉状蛋白40和β淀粉状蛋白42仅对于不溶血和轻度溶血的脑脊液样品是可接受的。
/>
/>
/>
/>
脂血症干扰：对于基线、轻度、中度和重度脂血症干扰，一式三份地分析六个掺加库。
β淀粉状蛋白40和β淀粉状蛋白42对于轻度和中度脂血症脑脊液样品是可接受的。
/>
/>
/>
胆红素干扰：对于基线、轻度、中度和重度黄疸干扰，一式三份地分析六个掺加库。
β淀粉状蛋白40和β淀粉状蛋白42对于无黄疸和轻度黄疸脊液样品是可接受的。
/>
/>
/>
/>
实施例11：离子抑制
提取十个患者样品。
获取窗口被打开高至10分钟以在整个梯度监测离子抑制。十个样品被注射通过分析柱，同时在柱后灌注β淀粉状蛋白40和42的消化的肽混合物。
如果当洗脱AB40或AB42的内标时AB40或AB42的总离子色谱图(TIC)显示信号强度的≥15％的降低，则将确定在试验中存在离子抑制。
当正在洗脱分析物时，AB40和42的消化的肽的TIC在梯度中没有显示抑制。TIC信号强度是平的线并且显示≤15％的信号强度差异，其在试验的可接受的参数内。
实施例12：遗留(carryover)
分析高校准品标准物，接着是四个基质空白，此顺序又重复两次。高校准品后基质空白的平均计算浓度对于β淀粉状蛋白40和42二者产生0.06％的％回收率。
对于此试验不存在观察到的遗留。
实施例13：参考区间(RI)
β淀粉状蛋白40：6000.00-15000.00pg/mL
β淀粉状蛋白42：700.00-4000.00pg/mL
实施例14：阿耳茨海默病患者数据
分析211名对象的脑脊液(CSF)，其包括诊断有阿耳茨海默病的患者和正常对象。图8-10。
在所有CSF样品中检测Aβ40和Aβ42。令人惊讶地，Aβ42水平比已经公布的高大约10倍。大多数患者样品在1至8ng/mL的范围中。与临界患者和正常对象(最高比率)比较，阿耳茨海默病患者基于Aβ42:Aβ40的低比率是可区分的。图8。
实施例15：另外的回收率研究
样品制备：预处理所有塑料一次性用品，并且稳定Aβ标准物以防止非特异性结合和增强长期储存稳定性。
强蛋白质变性剂被添加至人CSF(500μL)，并且样品经历蛋白质消化，接着是固相提取。在连接CEREX IP8(SPEware)固相提取岐管的机器人液体处理器(Hamilton MicrolabStar A857)上加工样品。
分离：在使用Waters XBridge Protein BEH C4柱，4.6×100mm，3.5微米的Aria TLX-4系统(Thermo Scientific)上进行HPLC分离。
检测：Thermo TSQ Quantiva三重四极质谱仪。
线性度数据显示了两种肽的至少0.98的R2值，其中跨越8种校准品标准物％CV≤15％。
两种肽的定量限是100pg/mL。
试验精确度(％CV)≤15％，其中Aβ40和Aβ42的回收率范围是84％至112％。
试验内(N＝10)和试验间(N＝5，5天)精确度和准确度
8个月内的试验稳定性
实现Aβ肽的稳定化，其允许校准品和质量控制标准物的长期储存。
当在-80℃下储存时，冷冻的校准品稳定至少8个月。
稳定化措施消除非特异性结合并且产生较高的分析物回收。图12和13。
与使用ELISA试验的那些相比，使用LC-MS/MS试验的患者CSF Aβ42浓度的值更高。这与先前的比较2种方法的报道一致。进一步的工作将确定本文描述的分析前因素是否可以帮助说明差异。
患者 LC-MS/MS(pg/mL) ELISA(pg/mL)
1 1,668 536
2 1,617 534
3 2,808 624
4 3,184 850
5 4,061 913
6 2,142 672
7 1,878 627
8 2,829 566
9 1,882 633
10 1,634 614
11 2,706 644
12 773 466
13 1,801 602
14 3,891 739
15 1,524 671
16 2,300 605
17 1,167 458
18 1,842 625
19 2,431 665
20 2,814 938
结论：此新型方法消除了定量Aβ40和Aβ42中的主要挑战之一：由非特异性结合引起的差的再现性。
实施例16：患者诊断研究
运行三种质量控制(低、中、高)，其代表沿着校准曲线的三个不同的点。在运行开始和结束时运行QC以确保贯穿平板的准确定量。下面显示了质量控制准确度：
Aβ40 预期值(pg/mL) 计算值(pg/mL) ％准确度
前：低QC 750 743.28 99.10％
前：中QC 7500 6724.33 89.66％
前：高QC 15000 13554.62 90.36％
后：低QC 750 754.58 100.61％
后：中QC 7500 7351.87 98.02％
后：高QC 15000 13911.65 92.74％
Aβ42 预期值(pg/mL) 计算值(pg/mL) ％准确度
前：低QC 750 815.71 108.76％
前：中QC 7500 6930.69 92.41％
前：高QC 15000 13976.57 93.18％
后：低QC 750 667.22 88.96％
后：中QC 7500 6341.3 84.55％
后：高QC 15000 13384.45 89.23％
Aβ40和42名患者样品范围
基于72名患者样品
Aβ40：5135.33-25348.94pg/mL
Aβ42：1068.00-5499.76pg/mL
Aβ40和42的归一化变化水平。
随着Aβ42值由于斑块生成(plaqueing)或不充分的清除而减小，Aβ42/40的比率也减小。
Aβ40和42水平显示独立于彼此增加/降低。
数据通过Aβ42/40比率分类并且基于中值划分为两组(Aβ42/40＝0.17)
一半数据进入<Aβ42/40中值
一半数据进入>Aβ42/40中值
计算平均值、标准差、和％CV：
对于比值<Aβ42/40中值，去除≥1SD的值
对于比值>Aβ42/40中值，去除≤1SD的值
1SD异常值被放置入“临界”类别
本文提及或引用的文章、专利、和专利申请以及所有其它文件和可电子获取的信息的内容由此通过引用以其全部并入，如同每个单独的出版物被具体地和单独地指示通过引用并入一样。申请人保留将来自任何这样的文章、专利、专利申请、或其它物理和电子文件的任何和所有材料与信息物理地并入本申请的权利。
本文说明性地描述的方法可以适合在不存在本文未特别地公开的任何要素(一种或多种)、限制(一种或多种)的情况下实践。因而，例如，应当广义地和非限制性地理解术语“包含”、“包括”、“含有”等。另外，已经将本文采用的术语和表述用作描述而非限制的术语，并且不意欲使用排除显示和描述的特征的任何等价物或其部分的这样的术语和表述。应当认识到多种修改在要求保护的发明的范围内是可能的。因而，应当理解虽然已经通过优选的实施方案和任选的特征具体地公开了本发明，但是本领域的技术人员可以采取本文公开的其中体现的本发明的修改和变化，并且这样的修改和变化被认为在本发明范围内。
本文已经宽泛地和一般地描述了本发明。落入一般公开内容内的较窄物类和下位分组中的每种也形成构成方法的一部分。这包括使用限制性条款或消极限定对方法的一般描述，其从种类去除任何主题，而不管被除去的材料是否在本文被具体地引用。
其它实施方案在所附权利要求的范围内。另外，在按照马库什组描述方法的特征或方面时，本领域技术人员将认识到还因此按照马库什组的任何单个成员或亚组成员来描述本发明。
序列表
<110> 奎斯特诊断投资有限公司
<120> 质谱法检测淀粉状蛋白β
<130> 034827-5203
<150> 62/234,027
<151> 2015-09-28
<150> 62/277,772
<151> 2016-01-12
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> PRT
<213> 智人()
<400> 1
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
35 40
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人()
<400> 2
Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
1 5 10
<210> 3
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人()
<400> 3
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人()
<400> 4
Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
1 5 10

Claims (46)

1.用于非治疗和诊断目的的测定样品中淀粉状蛋白β的量的方法，所述方法包括：
(a)使用防止淀粉状蛋白β粘附至表面的试剂预处理与所述样品接触的器材的所述表面，其中所述试剂是大肠杆菌溶胞产物；
(b)纯化所述样品中的淀粉状蛋白β；
(c)电离所述样品中的淀粉状蛋白β以产生淀粉状蛋白β的先驱离子；
(d)生成淀粉状蛋白β的一种或多种碎片离子；和
(e)通过质谱法测定来自步骤(c)或(d)或二者的所述离子的量；其中来自步骤(c)或(d)或二者的所述离子的量与所述样品中淀粉状蛋白β的量相关。
2.权利要求1所述的方法，其中所述纯化包括液相色谱法。
3.权利要求2所述的方法，其中所述液相色谱法包括高效液相色谱法。
4.权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括C-4分析柱。
5.权利要求1所述的方法，进一步包括使用稳定淀粉状蛋白β的试剂培育所述样品。
6.权利要求5所述的方法，其中所述试剂包括结合至淀粉状蛋白β的C-端的抗体、结合至淀粉状蛋白β的N-端的抗体、载脂蛋白E2、载脂蛋白E4、或其组合。
7.权利要求5所述的方法，其中所述试剂给予通过至少三个冻融循环的稳定性。
8.权利要求5所述的方法，其中所述试剂给予-70℃下至少2个月的稳定性。
9.权利要求1所述的方法，其中所述方法包括混合模式阴离子交换提取。
10.权利要求1所述的方法，其中所述电离包括加热电喷雾电离。
11.权利要求1所述的方法，其中所述电离包括以正模式进行电离。
12.权利要求1所述的方法，其中所述生成碎片离子包括使用20V至45V之间的碰撞能量。
13.权利要求1所述的方法，其中所述淀粉状蛋白β包括具有序列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV的Aβ40或具有序列
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA的Aβ42。
14.权利要求1所述的方法，进一步包括添加内标。
15.权利要求14所述的方法，其中所述内标是同位素标记的。
16.权利要求15所述的方法，其中所述内标包括13C15N标记。
17.权利要求1所述的方法，其中所述方法的定量限小于或等于10ng/mL。
18.权利要求1所述的方法，其中所述样品是脑脊液。
19.用于非治疗和诊断目的的测定样品中淀粉状蛋白β的量的方法，所述方法包括：
(a)使用防止淀粉状蛋白β粘附至表面的试剂预处理与所述样品接触的器材的所述表面，其中所述试剂是大肠杆菌溶胞产物；
(b)消化所述样品中的淀粉状蛋白β以生成一种或多种淀粉状蛋白β片段；
(c)纯化所述一种或多种淀粉状蛋白β片段；
(d)电离所述淀粉状蛋白β片段以产生先驱离子；和
(e)生成一种或多种碎片离子；和
(f)通过质谱法测定来自步骤(d)或(e)或二者的所述离子的量；其中来自步骤(d)或(e)或二者的所述离子的量与所述样品中淀粉状蛋白β片段的量相关。
20.权利要求19所述的方法，其中所述纯化包括液相色谱法。
21.权利要求20所述的方法，其中所述液相色谱法包括高效液相色谱法。
22.权利要求19所述的方法，其中所述方法进一步包括C-4分析柱。
23.权利要求19所述的方法，进一步包括使用稳定淀粉状蛋白β的试剂培育所述样品。
24.权利要求23所述的方法，其中所述试剂包括结合至淀粉状蛋白β的C-端的抗体、结合至淀粉状蛋白β的N-端的抗体、载脂蛋白E2、载脂蛋白E4、或其组合。
25.权利要求23所述的方法，其中所述试剂给予通过至少三个冻融循环的稳定性。
26.权利要求23所述的方法，其中所述试剂给予-70℃下至少2个月的稳定性。
27.权利要求19所述的方法，其中所述方法包括混合模式阴离子交换提取。
28.权利要求19所述的方法，其中所述电离包括加热电喷雾电离。
29.权利要求19所述的方法，其中所述电离包括以正模式进行电离。
30.权利要求19所述的方法，其中所述生成碎片离子包括使用20V至45V之间的碰撞能量。
31.权利要求19所述的方法，其中所述淀粉状蛋白β片段包括具有序列GAIIGLMVGGVV的Aβ40片段或具有序列GAIIGLMVGGVVIA的Aβ42。
32.权利要求31所述的方法，其中所述先驱离子具有1085.6+0.5或1269.7+0.5的质/荷比。
33.权利要求31所述的方法，其中所述一种或多种碎片离子具有812.37+0.5、869.4+0.5、968.43+0.5、869.39+0.5、968.44+0.5、1067.5+0.5、或1180.57+0.5的质/荷比。
34.权利要求19所述的方法，进一步包括添加内标。
35.权利要求34所述的方法，其中所述内标是同位素标记的。
36.权利要求35所述的方法，其中所述内标包括13C15N标记。
37.权利要求35所述的方法，其中所述内标的先驱离子具有1110.7+0.5的质/荷比。
38.权利要求35所述的方法，其中所述内标的一种或多种碎片离子具有768.48+0.5、825.5+0.5、或882.52+0.5的质/荷比。
39.权利要求19所述的方法，其中所述方法的定量限小于或等于10ng/mL。
40.权利要求19所述的方法，其中所述样品是脑脊液。
41.权利要求19所述的方法，其中所述消化包括使用Lys C消化。
42.权利要求41所述的方法，其中所述消化进一步包括添加尿素。
43.权利要求41所述的方法，其中所述消化进一步包括在微波中消化。
44.权利要求31所述的方法，其中所述淀粉状蛋白β片段进一步包括翼状肽。
45.权利要求44所述的方法，其中所述翼状肽是亲水性的。
46.权利要求44所述的方法，其中所述翼状肽包括一种或多种N-端或C-端氨基酸残基。
CN201680068333.5A 2015-09-28 2016-09-28 质谱法检测淀粉状蛋白β Active CN108291916B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311809070.7A CN117761323A (zh) 2015-09-28 2016-09-28 质谱法检测淀粉状蛋白β

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562234027P 2015-09-28 2015-09-28
US62/234,027 2015-09-28
US201662277772P 2016-01-12 2016-01-12
US62/277,772 2016-01-12
PCT/US2016/054148 WO2017058895A1 (en) 2015-09-28 2016-09-28 Amyloid beta detection by mass spectrometry

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311809070.7A Division CN117761323A (zh) 2015-09-28 2016-09-28 质谱法检测淀粉状蛋白β

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108291916A CN108291916A (zh) 2018-07-17
CN108291916B true CN108291916B (zh) 2024-01-02

Family

ID=58407005

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311809070.7A Pending CN117761323A (zh) 2015-09-28 2016-09-28 质谱法检测淀粉状蛋白β
CN201680068333.5A Active CN108291916B (zh) 2015-09-28 2016-09-28 质谱法检测淀粉状蛋白β

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311809070.7A Pending CN117761323A (zh) 2015-09-28 2016-09-28 质谱法检测淀粉状蛋白β

Country Status (8)

Country Link
US (2) US11360098B2 (zh)
EP (2) EP4275777A3 (zh)
JP (3) JP6979401B2 (zh)
CN (2) CN117761323A (zh)
BR (1) BR112018006018A2 (zh)
CA (1) CA3000178C (zh)
MX (2) MX2018004017A (zh)
WO (1) WO2017058895A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11360098B2 (en) * 2015-09-28 2022-06-14 Quest Diagnostics Investments Llc Amyloid beta detection by mass spectrometry
WO2019028080A1 (en) * 2017-07-31 2019-02-07 Quest Diagnostics Investments Llc DETECTION OF THE ISOTYPE OF APOLIPOPROTEIN E BY MASS SPECTROMETRY
CN109045311B (zh) * 2018-08-29 2021-07-20 王金环 普鲁士蓝纳米mri示踪剂及其制备方法和应用
CN110045046A (zh) * 2019-03-28 2019-07-23 东莞市中鼎检测技术有限公司 一种生鲜食材的预处理方法及氨基酸含量测定方法
CN110441428B (zh) * 2019-08-19 2021-08-24 江南大学 一种快速分析蛋白质及强极性长氨基酸序列糖肽的方法
CN113527459B (zh) * 2021-06-28 2023-07-11 广州睿徕医学诊断技术有限公司 一种萃取剂及其制备方法与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101946005A (zh) * 2007-12-13 2011-01-12 奎斯特诊断投资公司 通过质谱法检测雌酮的方法
CN102439451A (zh) * 2009-06-02 2012-05-02 德克萨斯大学系统董事会 患神经退行性疾病的对象中抗体所识别的小分子的鉴定

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4774175A (en) * 1985-03-01 1988-09-27 Centocor, Inc. Immunochemical methods for the detection of antibody against HTLV-III
US5605798A (en) 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
DE69432791T2 (de) 1993-05-28 2004-06-03 Baylor College Of Medicine, Houston Verfahren und massenspektrometer zur desorption und ionisierung von analyten
US5772874A (en) 1995-11-02 1998-06-30 Cohesive Technologies, Inc. High performance liquid chromatography method and apparatus
JP3452936B2 (ja) 1996-01-19 2003-10-06 コヒースィヴ テクノロジーズ，インク． 高速液体クロマトグラフィー法および装置
GB9717926D0 (en) 1997-08-22 1997-10-29 Micromass Ltd Methods and apparatus for tandem mass spectrometry
WO1999038194A1 (en) 1998-01-23 1999-07-29 Analytica Of Branford, Inc. Mass spectrometry from surfaces
WO2000017328A2 (en) * 1998-09-21 2000-03-30 Isis Innovation Limited Fibrils
US20040226056A1 (en) * 1998-12-22 2004-11-11 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating neurological disorders and diseases
SE0103084D0 (sv) 2001-09-14 2001-09-14 Amersham Pharm Biotech Ab Generation of ion exchange media
US20040096907A1 (en) 2002-11-06 2004-05-20 Bernd Bohrmann Quantification of beta amyloid
CN101374555B (zh) * 2005-04-06 2013-04-17 圣路易斯华盛顿州立大学 神经衍生的生物分子体内代谢的检测方法
JP2008547003A (ja) * 2005-06-16 2008-12-25 バーミリオン， インコーポレイテッド アルツハイマー病についてのバイオマーカーとしての神経分泌タンパク質ｖｇｆのフラグメント
US20070134802A1 (en) * 2005-06-30 2007-06-14 Heinz Doebeli Ionization modifier for mass spectrometry
EP1907423A4 (en) * 2005-07-13 2010-01-13 Coimmune Inc CATALYTIC IMMUNOGLOBULINS
US9377465B2 (en) 2007-09-18 2016-06-28 Dako Denmark A/S Rapid and sensitive method for detection of biological targets
US20090142766A1 (en) * 2007-11-09 2009-06-04 Washington University In St. Louis Methods for measuring the metabolism of cns derived biomolecules in vivo
JP5080945B2 (ja) * 2007-11-09 2012-11-21 株式会社日立ハイテクノロジーズ 質量分析装置および質量分析方法
AU2014265047A1 (en) * 2008-11-12 2014-12-11 The Washington University Simultaneous measurement of the in vivo metabolism of isoforms of a biomolecule
WO2010065878A1 (en) 2008-12-05 2010-06-10 C2N Diagnostics Methods for measuring concentrations of biomolecules
US20130137120A1 (en) 2010-01-28 2013-05-30 Panasonic Corporation Amyloid b measurement method
DE102010026094B4 (de) * 2010-07-05 2012-01-12 Sigeng Han Ein neues Verfahren zum Charakterisieren und multidimensionalen Darstellen des Faltungsvorgangs der Proteine
HUE055674T2 (hu) 2010-10-29 2021-12-28 Thermo Fisher Scientific Oy Rendszerelrendezés automatizált mintaelõkészítõ és -elemzõ rendszerhez
BR112014014960A2 (pt) 2011-12-19 2017-06-13 Univ Washington métodos para o diagnóstico da doença de alzheimer
US11360098B2 (en) * 2015-09-28 2022-06-14 Quest Diagnostics Investments Llc Amyloid beta detection by mass spectrometry

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101946005A (zh) * 2007-12-13 2011-01-12 奎斯特诊断投资公司 通过质谱法检测雌酮的方法
CN102439451A (zh) * 2009-06-02 2012-05-02 德克萨斯大学系统董事会 患神经退行性疾病的对象中抗体所识别的小分子的鉴定

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CSF Aβ42/40 AND Aβ42/38 RATIOS BY PRM MASS SPECTROMETRY OR ELISA: IMPROVED BIOMARKERS OF ALZHEIMER’S DISEASE;Shorena Janelidze et al.;《Alzheimer"s & Dementia》;20150731;第11卷(第7期);第P866页 *
Nonspecific binding of Aβ42 to polypropylene tubes and the effect of Tween-20;Arnaldo M. Pica-Mendez et al.;《Clinica Chimica Acta》;第1833页 *
Pauline Bros et al..Quantitative detection of amyloid-β peptides by mass spectrometry: state of the art and clinical applications.《Clinical Chemistry and Laboratory Medicine》.2015,第1-11页. *
Quantitative analysis of amyloid b peptides in cerebrospinal fluid of Alzheimer’s disease patients by immunoaffinity purification and stable isotope dilution liquid chromatography/negative electrospray ionization tandem mass spectrometry;Tomoyuki Oe et al.;《RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY》;20061231;第20卷;第3723-3735页 *
Quantitative detection of amyloid-β peptides by mass spectrometry: state of the art and clinical applications;Pauline Bros et al.;《Clinical Chemistry and Laboratory Medicine》;20150302;第1-11页 *
Shorena Janelidze et al..CSF Ab42/40 AND Ab42/38 RATIOS BY PRM MASS SPECTROMETRY OR ELISA: IMPROVED BIOMARKERS OF ALZHEIMER’S DISEASE.《Alzheimer's & dementia: the journal of the Alzheimer's Association》.2015,第P866页. *
Tomoyuki Oe et al..Quantitative analysis of amyloid beta peptides in cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease patients by immunoaffinity purification and stable isotope dilution liquid chromatography/negative electrospray ionization tandem mass spectrometry.《RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY》.2006,第3723-3735页. *

Also Published As

Publication number Publication date
US11360098B2 (en) 2022-06-14
MX2018004017A (es) 2018-06-27
JP2018535398A (ja) 2018-11-29
BR112018006018A2 (pt) 2018-11-06
JP6979401B2 (ja) 2021-12-15
US20170089917A1 (en) 2017-03-30
MX2023005452A (es) 2023-05-26
EP4275777A3 (en) 2024-01-10
EP3356831A1 (en) 2018-08-08
CA3000178A1 (en) 2017-04-06
WO2017058895A1 (en) 2017-04-06
EP3356831B1 (en) 2023-09-27
JP2021192038A (ja) 2021-12-16
EP3356831A4 (en) 2019-08-21
JP7407776B2 (ja) 2024-01-04
CN108291916A (zh) 2018-07-17
EP4275777A2 (en) 2023-11-15
CN117761323A (zh) 2024-03-26
US20220349897A1 (en) 2022-11-03
JP2024050535A (ja) 2024-04-10
CA3000178C (en) 2022-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11099198B2 (en) Quantitation of insulin by mass spectrometry of insulin A chain
CN108291916B (zh) 质谱法检测淀粉状蛋白β
CA2739506A1 (en) Methods for detecting dihydrotestosterone by mass spectrometry
CN111148998B (zh) 通过质谱法进行的载脂蛋白e同种型检测
CN112189137A (zh) 多重患者样品中的睾丸酮的质谱法测定
US11885780B2 (en) Methods for detecting chromogranin a by mass spectrometry
WO2023196587A1 (en) Detection of insulin-like growth factor-2 variants by mass spectrometry
CN118225957A (zh) 通过质谱检测嗜铬粒蛋白a的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant