JP7407776B2

JP7407776B2 - マススペクトロメトリーによるアミロイドベータの検出

Info

Publication number: JP7407776B2
Application number: JP2021129885A
Authority: JP
Inventors: トラン，ダイアナ; ウェバー，ダレン; クラーク，ニゲル
Original assignee: クエストダイアグノスティックスインヴェストメンツエルエルシー
Priority date: 2015-09-28
Filing date: 2021-08-06
Publication date: 2024-01-04
Anticipated expiration: 2036-09-28
Also published as: EP3356831A4; EP4275777A3; CN108291916B; CN108291916A; MX2023005452A; JP2024050535A; EP3356831A1; JP2021192038A; US20170089917A1; JP6979401B2; MX2018004017A; EP4275777A2; JP2018535398A; BR112018006018A2; CA3000178A1; EP3356831B1; CA3000178C; US20220349897A1; US11360098B2; WO2017058895A1

Description

関連特許出願に対する相互参照
本出願は、２０１５年９月２８日出願の米国仮特許出願第６２／２３４，０２７号、及
び２０１６年１月１２日出願の米国仮特許出願第６２／２７７，７７２号の利益を主張し
、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に援用される。

本発明は、アミロイドベータの検出又は定量に関する。ある特定の態様では、本発明は
、マススペクトロメトリーによりアミロイドベータ又はそのフラグメントを検出する方法
に関する。

アルツハイマー病は、高齢者集団に影響を及ぼす最も一般的な認知症の形態である。ア
ルツハイマー病は、認知能力、特に記憶及び学習の進行性の衰退により特徴付けられる。
この疾患の１つの特徴として、アミロイドベータ（Ａβ又はＡベータ）ペプチドから構成
される老人斑が挙げられる。

現行の臨床診断法でアルツハイマー病を予測又は診断する場合、その正確度及び感度は
低い。イムノアッセイ法が、アルツハイマー病の進行を予測するバイオマーカーであるア
ミロイドベータを検出するために現在提供されている。しかし、現在利用可能なイムノア
ッセイ法による観察結果において、施設間変動が懸念される。

アミロイドベータを検出するための正確且つ高感度なアッセイ法が必要とされる。

本明細書において、タンデム型質量分析などのマススペクトロメトリーにより、サンプ
ル中のアミロイドベータ（Ａβ）の量を検出又は決定する方法が提供される。

特定の実施形態では、アミロイドベータの量を決定するための本明細書に提供される方
法は、（ａ）サンプル中のアミロイドベータを精製すること；（ｂ）前記サンプル中のア
ミロイドベータをイオン化すること；及び（ｃ）マススペクトロメトリーにより、アミロ
イドベータイオンの量を決定することを含み、アミロイドベータイオンの量は、サンプル
中のアミロイドベータの量と関連する。

特定の実施形態では、アミロイドベータの量を決定するための本明細書に提供される方
法は、（ａ）サンプル中のアミロイドベータを精製すること；（ｂ）前記サンプル中のア
ミロイドベータをイオン化して、アミロイドベータの前駆イオンを産生すること；（ｃ）
１つ又は複数のアミロイドベータフラグメントのイオンを生成すること；及び（ｄ）マス
スペクトロメトリーにより、ステップ（ｃ）若しくは（ｄ）又はその両方からのイオンの
量を決定することを含み、アミロイドベータイオンの量は、サンプル中のアミロイドベー
タの量と関連する。

特定の実施形態では、アミロイドベータの量を決定するための本明細書に提供される方
法は、（ａ）サンプル中のアミロイドベータを消化して、１つ又は複数のアミロイドベー
タフラグメントを生成すること；（ｂ）前記１つ又は複数のアミロイドベータフラグメン
トを精製すること；（ｃ）前記１つ又は複数のアミロイドベータフラグメントをイオン化
して、前駆イオンを産生すること；（ｄ）１つ又は複数のフラグメントイオンを生成する
こと；及び（ｅ）マススペクトロメトリーにより、ステップ（ｃ）若しくは（ｄ）又はそ
の両方からのイオンの量を決定することを含み、イオンの量は、サンプル中のアミロイド
ベータフラグメントの量と関連する。

特定の実施形態では、アミロイドベータ４２（Ａβ４２）の量を決定する方法が、本明
細書に提供される。いくつかの実施形態では、Ａβ４２フラグメントは、配列ＧＡＩＩＧ
ＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号４）を含む。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）サ
ンプル中のアミロイドベータを消化して、アミロイドベータ４２（Ａβ４２）を生成する
こと；（ｂ）Ａβ４２を精製すること；（ｃ）Ａβ４２をイオン化して、前駆イオンを産
生すること；（ｄ）１つ又は複数のＡβ４２のフラグメントイオンを生成すること；及び
（ｅ）マススペクトロメトリーにより、ステップ（ｃ）若しくは（ｄ）又はその両方から
のイオンの量を決定することを含み、イオンの量は、サンプル中のＡβ４２の量と関連す
る。

特定の実施形態では、アミロイドベータ４０（Ａβ４０）の量を決定する方法が、本明
細書に提供される。いくつかの実施形態では、Ａβ４０フラグメントは、配列ＧＡＩＩＧ
ＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号２）を含む。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）サンプ
ル中のアミロイドベータを消化して、アミロイドベータ４０（Ａβ４０）を生成すること
；（ｂ）Ａβ４０を精製すること；（ｃ）Ａβ４０をイオン化して、前駆イオンを産生す
ること；（ｄ）１つ又は複数のＡβ４０のフラグメントイオンを生成すること；及び（ｅ
）マススペクトロメトリーにより、ステップ（ｃ）若しくは（ｄ）又はその両方からのイ
オンの量を決定することを含み、イオンの量は、サンプル中のＡβ４０の量と関連する。

特定の実施形態では、アミロイドベータ４２（Ａβ４２）及びアミロイドベータ４０（
Ａβ４０）の量を決定する方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、方
法は、（ａ）サンプル中のアミロイドベータを消化して、アミロイドベータ４２（Ａβ４
２）及びアミロイドベータ４０（Ａβ４０）を生成すること；（ｂ）Ａβ４２及びＡβ４
０を精製すること；（ｃ）Ａβ４２及びＡβ４０をイオン化して、前駆イオンを産生する
こと；（ｄ）１つ又は複数のＡβ４２及びＡβ４０のフラグメントイオンを生成すること
；及び（ｅ）マススペクトロメトリーにより、ステップ（ｃ）若しくは（ｄ）又はその両
方からのイオンの量を決定することを含み、イオンの量は、サンプル中のＡβ４２及びＡ
β４０の量と関連する。

特定の実施形態では、アミロイドベータ４０（Ａβ４０）に対するアミロイドベータ４
２（Ａβ４２）の比を決定する方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では
、方法は、（ａ）サンプル中のアミロイドベータを消化して、アミロイドベータ４２（Ａ
β４２）及びアミロイドベータ４０（Ａβ４０）を生成すること；（ｂ）Ａβ４２及びＡ
β４０を精製すること；（ｃ）Ａβ４２及びＡβ４０をイオン化して、前駆イオンを産生
すること；（ｄ）１つ又は複数のＡβ４２及びＡβ４０のフラグメントイオンを生成する
こと；及び（ｅ）マススペクトロメトリーにより、ステップ（ｃ）若しくは（ｄ）又はそ
の両方からのイオンの量を決定すること；及び（ｆ）Ａβ４０に対するＡβ４２の比を決
定することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、Ａβ４２に対するＡβ４０の比を
決定することを含む。

特定の実施形態では、アルツハイマー病又は認知症を診断又は予測する方法であって、
試験サンプル中のアミロイドベータの量を、マススペクトロメトリーにより決定すること
を含み、アミロイドベータのレベルが異常であれば、アルツハイマー病が予測又は診断さ
れる、方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）サンプル
中のアミロイドベータを精製すること；（ｂ）前記サンプル中のアミロイドベータをイオ
ン化すること；及び（ｃ）アミロイドベータイオンの量を、マススペクトロメトリーによ
り決定すること；及び（ｄ）アミロイドベータイオンの量を、前記サンプル中のアミロイ
ドベータの量と関連付けることを含み得、アミロイドベータのレベルが異常であれば、ア
ルツハイマー病が予測又は診断される。いくつかの実施形態では、方法は、アミロイドベ
ータフラグメントの比を決定することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、アミロ
イドベータ４０（Ａβ４０）に対するアミロイドベータ４２（Ａβ４２）の比を決定する
ことを含む。いくつかの実施形態では、方法は、アミロイドベータ４０（Ａβ４２）に対
するアミロイドベータ４２（Ａβ４０）の比を決定することを含む。

特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、サンプルと接触する機器の表面を
事前処理することを含む。いくつかの実施形態では、事前処理は、機器の表面を、アミロ
イドベータ又はそのフラグメントが表面に固着するのを防止する薬剤で事前コーティング
することを含む。いくつかの実施形態では、事前処理は、溶菌液による事前処理を含む。
いくつかの実施形態では、事前処理は、大腸菌〔E.coli〕溶解物による事前処理を含む。
いくつかの実施形態では、大腸菌溶解物は、トリプシン消化大腸菌溶解物を含む。いくつ
かの実施形態では、事前処理された機器として、試験管又はプレート、ピペットチップ、
サンプル調製装置、液体クロマトグラフィー装置、及びマススペクトロメトリー装置が挙
げられるが、但し、これらに限定されない。

特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、アミロイドベータ又はそのフラグ
メントを安定化させる薬剤を用いてサンプルを処理する、又はそれと共にインキュベート
することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、サンプルをア
ミロイドベータ抗体で処理すること、又はそれと共にインキュベートすることを含む。い
くつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、サンプルを少なくとも２つの異な
るアミロイドベータ抗体で処理する、又はそれと共にインキュベートすることを含む。い
くつかの実施形態では、アミロイドベータ抗体は、アミロイドベータのＣ末端と結合する
抗体を含む。いくつかの実施形態では、アミロイドベータ抗体は、アミロイドベータのＮ
末端と結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、アミロイドベータを安定化させる
薬剤は、アポリポタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、アミロイドベータを安定
化させる薬剤は、アポリポタンパク質Ｅ２を含む。いくつかの実施形態では、アミロイド
ベータを安定化させる薬剤は、アポリポタンパク質Ｅ４を含む。いくつかの実施形態では
、アミロイドベータを安定化させる薬剤は、アミロイドベータのＣ末端と結合する抗体、
アミロイドベータのＮ末端と結合する抗体、アポリポタンパク質Ｅ２、アポリポタンパク
質Ｅ４、又はその組合せを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるアミロ
イドベータを安定化させる薬剤は、－７０℃で少なくとも１カ月間、安定性を付与する。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるアミロイドベータを安定化させる薬剤は
、－７０℃で少なくとも２カ月間、安定性を付与する。いくつかの実施形態では、本明細
書に提供されるアミロイドベータを安定化させる薬剤は、－７０℃で少なくとも３カ月間
、安定性を付与する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるアミロイドベータ
を安定化させる薬剤は、凍結－解凍サイクルにわたり、安定性を付与する。いくつかの実
施形態では、本明細書に提供されるアミロイドベータを安定化させる薬剤は、少なくとも
２回の凍結－解凍サイクルにわたり、安定性を付与する。いくつかの実施形態では、本明
細書に提供されるアミロイドベータを安定化させる薬剤は、少なくとも３回の凍結－解凍
サイクルにわたり、安定性を付与する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される
アミロイドベータを安定化させる薬剤は、少なくとも４回の凍結－解凍サイクルにわたり
、安定性を付与する。

特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、サンプル中のアミロイドベータを
消化することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、酵素によ
りアミロイドベータを消化することを含む。いくつかの実施形態では、酵素は、Ｌｙｓ－
Ｃである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、尿素によりアミロイ
ドベータを消化することを含む。いくつかの実施形態では、尿素は、タンパク質消化に適
する濃度を有する。いくつかの実施形態では、尿素は６Ｍ尿素である。いくつかの実施形
態では、本明細書に提供される方法は、尿素及びＬｙｓ－Ｃによりアミロイドベータを消
化することを含む。いくつかの実施形態では、消化は、消化時間を短縮する又は消化効率
を高める条件で消化することを含む。いくつかの実施形態では、消化は、マイクロ波中で
消化することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、消化され
たアミロイドベータの量を決定することを含む。

特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、抽出を含む。いくつかの実施形態
では、本明細書に提供される方法は、混合モード陰イオン交換抽出を含む。いくつかの実
施形態では、本明細書に提供される方法は、固相抽出を含む。

特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、加熱された窒素を使用してサンプ
ルを溶出及び乾燥させることを含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、再構成用バ
ッファー中で再懸濁される。

特定の実施形態では、サンプルを精製することは、液体クロマトグラフィーを含む。い
くつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーとして、逆相液体クロマトグラフィー（
ＲＰＬＣ）、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、及び高乱流液体クロマトグラ
フィー（ＨＴＬＣ）が挙げられるが、但し、これらに限定されない。好ましい実施形態で
は、液体クロマトグラフィーは、ＨＰＬＣを含む。いくつかの実施形態では、ＨＰＬＣカ
ラムは、化学的部分の分離（すなわち、分画）を促進する媒体（すなわち、充填材料）を
一般的に含む。適するカラムは、Ｃ－４、Ｃ－８、Ｃ－１２、又はＣ－１８カラムを含み
得る。好ましい実施形態では、適するＨＰＬＣカラムはＣ－４カラムである。

特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、アミロイドベータの機器表面への
固着を低下させる機器を使用することを含む。いくつかの実施形態では、機器は、ＰＥＥ
Ｋ（ポリエーテルエーテルケトン）チューブ又は装置を備える。いくつかの実施形態では
、機器は、金属チューブ又は装置を含む。

特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、タンデム型質量分析を含む。いく
つかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、ポジティブモードでイオン化するこ
とを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、ネガティブモードで
イオン化することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、加熱
式エレクトロスプレーイオン化法（ＨＥＳＩ）を使用してイオン化することを含む。いく
つかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、エレクトロスプレーイオン化法（Ｅ
ＳＩ）を使用してイオン化することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供さ
れる方法は、大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）を使用してイオン化することを含む。好
ましい実施形態では、本明細書に提供される方法は、加熱式エレクトロスプレーイオン化
法（ＨＥＳＩ）を使用して、ポジティブモードでイオン化することを含む。いくつかの実
施形態では、衝突エネルギーは、５Ｖ～６０Ｖである。いくつかの実施形態では、衝突エ
ネルギーは、１０Ｖ～５０Ｖである。いくつかの実施形態では、衝突エネルギーは、２０
Ｖ～５０Ｖである。いくつかの実施形態では、衝突エネルギーは、２０Ｖ～４５Ｖである
。

特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、アミロイドベータ４０（Ａβ４０
）の量を検出又は決定することを含む。いくつかの実施形態では、Ａβ４０は、配列ＤＡ
ＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配
列番号１）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、Ａβ４０の
フラグメントの量を検出又は決定することを含む。いくつかの実施形態では、Ａβ４０フ
ラグメントは、配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号２）を含む。いくつかの実施形
態では、Ａβ４０フラグメントは、Ｎ末端又はＣ末端飛行化〔winged〕ペプチドを含有す
る配列を含む。いくつかの実施形態では、Ａβ４０フラグメントは、配列番号２、及びＮ
末端又はＣ末端飛行化ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、飛行化ペプチドは、親
水性である。いくつかの実施形態では、飛行化ペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸を
含む。いくつかの実施形態では、飛行化ペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、飛行化ペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸を含む。いくつ
かの実施形態では、飛行化ペプチドは、少なくとも４個のアミノ酸を含む。いくつかの実
施形態では、飛行化ペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態
では、飛行化ペプチドは、少なくとも６個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、
Ａβ４０フラグメントの量は、サンプル中でＡβ４０の量と相関する。

特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、アミロイドベータ４２（Ａβ４２
）の量を検出又は決定することを含む。いくつかの実施形態では、Ａβ４２は、配列ＤＡ
ＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ
（配列番号３）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、Ａβ４
２のフラグメントの量を検出又は決定することを含む。いくつかの実施形態では、Ａβ４
２フラグメントは、配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号４）を含む。いくつか
の実施形態では、Ａβ４２フラグメントは、Ｎ末端又はＣ末端飛行化ペプチドを含有する
配列を含む。いくつかの実施形態では、Ａβ４２フラグメントは、配列番号４、及びＮ末
端又はＣ末端飛行化ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、飛行化ペプチドは、親水
性である。いくつかの実施形態では、飛行化ペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸を含
む。いくつかの実施形態では、飛行化ペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸を含む。い
くつかの実施形態では、飛行化ペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸を含む。いくつか
の実施形態では、飛行化ペプチドは、少なくとも４個のアミノ酸を含む。いくつかの実施
形態では、飛行化ペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態で
は、飛行化ペプチドは、少なくとも６個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ａ
β４２フラグメントの量は、サンプル中のＡβ４２の量と相関する。

特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、Ａβ４２に対するＡβ４０の比（
Ａβ４０：Ａβ４２）を検出又は決定することを含む。いくつかの実施形態では、本明細
書に提供される方法は、Ａβ４２フラグメントに対するＡβ４０フラグメントの比（Ａβ
４０フラグメント：Ａβ４２フラグメント）を検出又は決定することを含む。いくつかの
実施形態では、本明細書に提供される方法は、Ａβ４０に対するＡβ４２の比（Ａβ４２
：Ａβ４０）を検出又は決定することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供
される方法は、Ａβ４０フラグメントに対するＡβ４２フラグメントの比（Ａβ４２フラ
グメント：Ａβ４０フラグメント）を検出又は決定することを含む。

特定の実施形態では、Ａβ４０に対するＡβ４２の比、又はＡβ４０フラグメントに対
するＡβ４２フラグメントの比が０．６又はそれ未満であれば、アルツハイマー病が予測
される、又はそれと診断される。いくつかの実施形態では、Ａβ４０に対するＡβ４２の
比、又はＡβ４０フラグメントに対するＡβ４２フラグメントの比が０．５又はそれ未満
であれば、アルツハイマー病が予測される、又はそれと診断される。いくつかの実施形態
では、Ａβ４０に対するＡβ４２の比、又はＡβ４０フラグメントに対するＡβ４２フラ
グメントの比が０．４５又はそれ未満であれば、アルツハイマー病が予測される、又はそ
れと診断される。いくつかの実施形態では、Ａβ４０に対するＡβ４２の比、又はＡβ４
０フラグメントに対するＡβ４２フラグメントの比が０．４又はそれ未満であれば、アル
ツハイマー病が予測される、又はそれと診断される。いくつかの実施形態では、Ａβ４０
に対するＡβ４２の比、又はＡβ４０フラグメントに対するＡβ４２フラグメントの比が
０．３５又はそれ未満であれば、アルツハイマー病が予測される、又はそれと診断される
。いくつかの実施形態では、Ａβ４０に対するＡβ４２の比、又はＡβ４０フラグメント
に対するＡβ４２フラグメントの比が０．３又はそれ未満であれば、アルツハイマー病が
予測される、又はそれと診断される。いくつかの実施形態では、Ａβ４０に対するＡβ４
２の比、又はＡβ４０フラグメントに対するＡβ４２フラグメントの比が０．２５又はそ
れ未満であれば、アルツハイマー病が予測される、又はそれと診断される。いくつかの実
施形態では、Ａβ４０に対するＡβ４２の比、又はＡβ４０フラグメントに対するＡβ４
２フラグメントの比が０．２又はそれ未満であれば、アルツハイマー病が予測される、又
はそれと診断される。いくつかの実施形態では、Ａβ４０に対するＡβ４２の比、又はＡ
β４０フラグメントに対するＡβ４２フラグメントの比が０．１５又はそれ未満であれば
、アルツハイマー病が予測される、又はそれと診断される。

特定の実施形態では、方法は、１つ若しくは複数のＡβ又はそのフラグメントの前駆イ
オンを生成することを含む。いくつかの実施形態では、前駆イオンの少なくとも１つは、
１０８５．６±０．５又は１２６９．７±０．５の質量／電荷の比を有する。いくつかの
実施形態では、方法は、１つ若しくは複数のＡβ又はそのフラグメントのフラグメントイ
オンを生成することを含み得る。いくつかの実施形態では、フラグメントイオンの少なく
とも１つは、８１２．３７±０．５、８６９．４±０．５、９６８．４３±０．５、８６
９．３９±０．５、９６８．４４±０．５、１０６７．５±０．５、又は１１８０．５７
±０．５の質量／電荷の比を有する。

特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、内部標準を添加することを含む。
いくつかの実施形態では、内部標準は、同位体で標識された内部標準を含む。いくつかの
実施形態では、内部標準は、^１３Ｃ^１５Ｎ標識を含む。いくつかの実施形態では、内部標
準は、^１３Ｃ^１５Ｎで標識された少なくとも１つのＰｈｅ、Ｌｅｕ、又はＭｅｔを含む。
いくつかの実施形態では、内部標準の前駆イオンの少なくとも１つは、１１１０．７±０
．５の質量／電荷の比を有する。いくつかの実施形態では、方法は、内部標準の１つ又は
複数のフラグメントイオンを生成することを含み得る。いくつかの実施形態では、フラグ
メントイオンの少なくとも１つは、７６８．４８±０．５、８２５．５±０．５、又は８
８２．５２±０．５の質量／電荷の比を有する。

特定の実施形態では、方法の定量限界は、１０ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。い
くつかの実施形態では、方法の定量限界は、５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いく
つかの実施形態では、方法の定量限界は、４ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつ
かの実施形態では、方法の定量限界は、３ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつか
の実施形態では、方法の定量限界は、２ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの
実施形態では、方法の定量限界は、１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの実
施形態では、方法の定量限界は、０．５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつかの
実施形態では、方法の定量限界は、０．２ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。いくつか
の実施形態では、方法の定量限界は、０．１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。

いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。
いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。い
くつかの実施形態では、方法の検出限界は、０．５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい。
いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、０．１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等しい
。いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、０．０５ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれに等
しい。いくつかの実施形態では、方法の検出限界は、０．０１ｎｇ／ｍＬ未満、又はそれ
に等しい。

いくつかの実施形態では、アミロイドベータは、マススペクトロメトリーの前に誘導体
化されない。いくつかの実施形態では、アミロイドベータは、マススペクトロメトリーの
前に誘導体化される。

特定の実施形態では、サンプルは、体液である。いくつかの実施形態では、サンプルは
、脳脊髄液（ＣＳＦ）である。いくつかの実施形態では、サンプルは、血漿又は血清であ
る。いくつかの実施形態では、サンプルは、全血である。いくつかの実施形態では、サン
プルは、唾液又は尿である。

いくつかの実施形態では、方法は、サンプルをタンパク質除去するのに十分な量で、薬
剤をサンプルに添加することを含み得る。

本明細書で用いる場合、別途記載がなければ、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ
」は、複数形の意味を含む。従って、例えば、「１つのタンパク質」と言う場合、複数の
タンパク質分子も含まれる。

本明細書で用いる場合、用語「精製」又は「精製すること」とは、サンプルから目的と
する分析物以外のすべての物質を除去することを意味しない。むしろ、精製とは、目的と
する分析物の検出を妨害する可能性がある、サンプル中のその他の成分と比較して、目的
とする１つ又は複数の分析物の量を富化させる手順を意味する。サンプルは、本明細書で
は、１つ又は複数の妨害物質、例えば、マススペクトロメトリーによる、選択されたアミ
ロイドベータの親及び娘イオンの検出を妨害する１つ又は複数の物質の除去を可能にする
様々な手段により精製される。

本明細書で用いる場合、用語「試験サンプル」とは、アミロイドベータを含み得る任意
のサンプルを意味する。本明細書で用いる場合、用語「体液」とは、個人の身体から単離
可能な任意の液を意味する。例えば、「体液」として、血液、血漿、血清、胆汁、唾液、
尿、涙、汗等を挙げることができる。

本明細書で用いる場合、用語「誘導体化すること」とは、２つの分子を反応させて新規
分子を形成することを意味する。誘導体化薬は、イソチオシアネート基、ジニトロフルオ
ロフェニル基、ニトロフェノキシカルボニル基、及び／又はフタルアルデヒド基等を含み
得る。

本明細書で用いる場合、用語「クロマトグラフィー」とは、液体又は気体により搬送さ
れる化学的混合物が、静止した液相又は固相の周辺又は上方を流通する際に、化学的実体
の差動的分配の結果として成分に分離するプロセスを意味する。

本明細書で用いる場合、用語「液体クロマトグラフィー」又は「ＬＣ」とは、微細な物
質からなるカラムを通じて、又はキャピラリー通路を通じて流体が均一に浸透する際に、
流体の溶液の１つ又は複数の成分が選択的に遅延するプロセスを意味する。遅延は、１つ
又は複数の固定相とバルク液（すなわち、移動相）の間で、この流体が固定相に対して相
対的に移動する際に生ずる、混合物中の成分の分配に起因する。「液体クロマトグラフィ
ー」の例として、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）、高性能液体クロマトグラフ
ィー（ＨＰＬＣ）、及び高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）が挙げられる。

本明細書で用いる場合、用語「高性能液体クロマトグラフィー」又は「ＨＰＬＣ」とは
、固定相、一般的には稠密充填カラムを通じて、加圧条件下で移動相に力を加えることに
より、分離度が増加する液体クロマトグラフィーを意味する。

本明細書で用いる場合、用語「高乱流液体クロマトグラフィー」又は「ＨＴＬＣ」とは
、分離を実施する基本原理として、カラム充填材を通じてアッセイされる物質の乱流を活
用するクロマトグラフィーの一形態を意味する。ＨＴＬＣは、マススペクトロメトリーに
よる分析前に、２つの無名の薬物を含有するサンプルを調製するのに適用されてきた。例
えば、Ｚｉｍｍｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ８５４巻：２３～３５頁（１９９
９年）を参照；ＨＴＬＣについて更に説明する米国特許第５，９６８，３６７号、同第５
，９１９，３６８号、同第５，７９５，４６９号、及び同第５，７７２，８７４号も参照
。当業者は「乱流」について理解している。流体がゆっくりとスムーズに流れる場合、こ
の流れは「層流」と呼ばれる。例えば、ＨＰＬＣカラムを通じて、低い流速で移動する流
体は、層流である。層流内では、流体中の粒子の動きは規律正しく、粒子は直線的に移動
するのが一般的である。より高速では、水の慣性力が流体の摩擦力を上回り、その結果乱
流が生ずる。不規則な境界と接触しない流体は、摩擦により低速化した、又は不均等な表
面により向きが変わった流体を「追い越す」。流体が乱れた状態で流れるとき、ぐるぐる
渦巻いて（又は渦状に）流れ、流れが層状の場合よりもより「抵抗性」となる。どの場合
に流体の流れが層流又は乱流であるか判断するのに役立つ多くの参考資料が入手可能であ
る（例えば、ＴｕｒｂｕｌｅｎｔＦｌｏｗＡｎａｌｙｓｉｓ：Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎ
ｔａｎｄＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、Ｐ．Ｓ．Ｂｅｒｎａｒｄ＆Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｌａｃｅ
、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、（２０００年）；ＡｎＩｎｔｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎｔｏＴｕｒｂｕｌｅｎｔＦｌｏｗＦｌｏｗ、ＪｅａｎＭａｔｈｉｅ
ｕ＆ＪｕｌｉａｎＳｃｏｔｔ、ＣａｍｂｒｉｄｇｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓ
ｓ（２００１年））。

本明細書で用いる場合、用語「ガスクロマトグラフィー」又は「ＧＣ」とは、サンプル
混合物が気化され、そして液体又は微粒子固体から構成される固定相を含有するカラムを
通じて移動するキャリヤガス（窒素又はヘリウム）の流れの中に注入され、そして化合物
の固定相に対する親和性に基づき、その構成化合物に分離されるクロマトグラフィーを意
味する。

本明細書で用いる場合、用語「大型の粒子カラム」又は「抽出カラム」とは、約３５μ
ｍを上回る平均粒子径を含有するクロマトグラフィーカラムを意味する。この文脈で使用
される場合、用語「約」とは±１０％を意味する。好ましい実施形態では、カラムは、直
径約６０μｍの粒子を含有する。

本明細書で用いる場合、用語「分析カラム」は、カラムから溶出するサンプル中の物質
について、分析物の存否又は量の決定を可能にするのに十分な分離を有効にする、十分な
クロマトグラフプレートを有するクロマトグラフィーカラムを意味する。そのようなカラ
ムは、更なる分析用として精製されたサンプルを取得するために、保持された物質を保持
されない物質から分離又は抽出するという一般的な目的を有する「抽出カラム」から多く
の場合区別される。この文脈で使用される場合、用語「約」とは、±１０％を意味する。
好ましい実施形態では、分析カラムは、直径約４μｍの粒子を含有する。

本明細書で用いる場合、例えば「オンライン自動化方式」又は「オンライン抽出」とし
て使用されるような用語「オンライン」又は「インライン」とは、オペレーターの介入を
必要とせずに実施される手順を意味する。対照的に、用語「オフライン」とは、本明細書
で使用する場合、オペレーターの手動介入を必要とする手順を意味する。従って、サンプ
ルが沈殿処理され、そして次に上清が手作業によりオートサンプラーに負荷される場合、
沈殿及び負荷ステップは後続ステップからオフラインの状態にある。本方法の様々な実施
形態では、１つ又は複数のステップが、オンライン自動化方式で実施され得る。

本明細書で用いる場合、用語「マススペクトロメトリー」又は「ＭＳ」とは、化合物を
その質量別に識別する分析技法を意味する。ＭＳは、イオンを、その質量対電荷の比、又
は「ｍ／ｚ」に基づきフィルター処理、検出、及び測定する方法を意味する。ＭＳ技術は
、（１）化合物をイオン化して、荷電した化合物を形成すること；及び（２）荷電した化
合物の分子量を検出し、そして質量対電荷の比を計算すること一般的に含む。化合物は、
任意の適する手段によりイオン化及び検出され得る。「質量分析装置」は、イオン化装置
及びイオン検出器を一般的に含む。一般的に、１つ又は複数の目的とする分子がイオン化
され、イオンがその後マススペクトログラフィック装置に導入され、そこでは磁場と電場
の組合せにより、イオンは、質量（「ｍ」）及び電荷（「ｚ」）に依存する空間内の経路
をたどる。例えば、「ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙＦｒｏｍＳｕｒｆａｃｅ
ｓ」と題する米国特許第６，２０４，５００号、「ＭｅｔｈｏｄｓＡｎｄＡｐｐａｒ
ａｔｕｓｆｏｒＴａｎｄｅｍＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題する同第
６，１０７，６２３号、「ＤＮＡＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＢａｓｅｄＯｎＭａｓ
ｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」と題する同第６，２６８，１４４号、「Ｓｕｒｆａｃｅ
－ＥｎｈａｎｃｅｄＰｈｏｔｏｌａｂｉｌｅＡｔｔａｃｈｍｅｎｔＡｎｄＲｅｌ
ｅａｓｅＦｏｒＤｅｓｏｒｐｔｉｏｎＡｎｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＯｆＡｎａ
ｌｙｔｅｓ」と題する同第６，１２４，１３７号、Ｗｒｉｇｈｔら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ
ＣａｎｃｅｒａｎｄＰｒｏｓｔａｔｉｃＤｉｓｅａｓｅｓ、第２巻：２６４～７６
頁（１９９９年）；並びにＭｅｒｃｈａｎｔ及びＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒ、Ｅｌｅｃｔｒｏ
ｐｈｏｒｅｓｉｓ、第２１巻：１１６４～６７頁（２０００年）を参照。

本明細書で用いる場合、用語「陰イオンモードでの操作」とは、陰イオンが生成及び検
出されるマススペクトロメトリー法を意味する。用語「陽イオンモードでの操作」とは、
本明細書で用いる場合、陽イオンが生成及び検出されるマススペクトロメトリー法を意味
する。

本明細書で用いる場合、用語「イオン化」又は「イオン化すること」とは、１又は複数
のエレクトロンユニットに等しい正味の電荷を有する分析物イオンを生成するプロセスを
意味する。陰イオンは、１又は複数のエレクトロンユニットの正味負電荷を有するイオン
である一方、陽イオンは、１又は複数のエレクトロンユニットの正味正電荷を有するイオ
ンである。

本明細書で用いる場合、用語「電子イオン化法」又は「ＥＩ法」とは、気相〔gaseous
phase〕又は気相〔vapor phase〕の目的とする分析物が電子の流れと相互作用する方法を
意味する。分析物への電子の衝撃は分析物イオンを産生し、次にマススペクトロメトリー
技術の対象となり得る。

本明細書で用いる場合、用語「化学イオン化法」又は「ＣＩ法」とは、試薬気体（例え
ば、アンモニア）が電子の衝撃を受け、そして試薬気体イオンと分析物分子との相互作用
により、分析物イオンが形成される方法を意味する。

本明細書で用いる場合、用語「高速原子衝撃法」又は「ＦＡＢ法」とは、高エネルギー
原子（多くの場合Ｘｅ又はＡｒ）のビームが、不揮発性サンプルに衝撃を与え、サンプル
に含まれる分子を脱離及びイオン化させる方法を意味する。試験サンプルは、粘稠性の液
体マトリックス、例えばグリセロール、チオグリセロール、ｍ－ニトロベンジルアルコー
ル、１８－クラウン－６－クラウンエーテル、２－ニトロフェニルオクチルエーテル、ス
ルホラン、ジエタノールアミン、及びトリエタノールアミン等に溶解する。化合物又はサ
ンプルに適するマトリックスの選択は、実験に基づいたプロセスである。

本明細書で用いる場合、用語「マトリックス支援レーザー脱離イオン化法」又は「ＭＡ
ＬＤＩ」とは、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化、及びクラスター崩壊を含む様々
なイオン化経路によって、不揮発性サンプルが、サンプル中の分析物を脱離及びイオン化
させるレーザー照射に曝露される方法を意味する。ＭＡＬＤＩの場合、サンプルは、分析
物分子の脱離を促進するエネルギー吸収性マトリックスと混合される。

本明細書で用いる場合、用語「表面増強レーザー脱離イオン化法」又は「ＳＥＬＤＩ法
」とは、光イオン化、プロトン化、脱プロトン化、及びクラスター崩壊を含む様々なイオ
ン化経路によって、非揮発性サンプルが、サンプル中の分析物を脱離及びイオン化させる
レーザー照射に曝露される別の方法を意味する。ＳＥＬＤＩでは、サンプルは、１つ又は
複数の目的とする分析物を優先的に保持する表面に一般的に結合する。ＭＡＬＤＩと同様
に、このプロセスも、イオン化を促進するために、エネルギー吸収性材料を利用し得る。

本明細書で用いる場合、用語「エレクトロスプレーイオン化法」又は「ＥＳＩ法」は、
溶液が短尺のキャピラリー管に沿って通過し、そのキャピラリー管の端部に正又は負の高
電位が印加される方法を意味する。溶液が管の端部に到達すると気化（噴霧化）されて、
溶媒蒸気内で溶液の非常に小さい液滴からなるジェット又はスプレーとなる。この液滴の
ミストは、凝結を防止し、溶媒を蒸発させるためにわずかに加熱された蒸発チャンバーを
流通する。液滴がより小型になるに従い、表面電荷密度は増加し、やがて同一荷電間で自
然反発して、イオン並びに中性分子の放出が引き起こされる。

本明細書で用いる場合、用語「大気圧化学イオン化法」又は「ＡＰＣＩ法」とは、ＥＳ
Ｉと類似する質量分析法を意味するが、しかしＡＰＣＩは、大気圧でプラズマ内に生ずる
イオン－分子反応によりイオンを産生する。プラズマは、スプレーキャピラリーと対電極
の間の放電により維持される。次にイオンは、差次的にポンプ搬送される一連のスキマー
ステージの使用により質量分析器中に一般的に抽出される。乾燥及び事前加熱されたＮ_２
ガスの向流を使用して、溶媒の除去を改善することができる。極性がより低い種を分析す
る場合、ＡＰＣＩにおける気相イオン化の方がＥＳＩよりも有効であり得る。

用語「大気圧光イオン化法」又は「ＡＰＰＩ法」とは、本明細書で使用する場合、分子
Ｍを光イオン化する機構が、分子イオンＭ＋を形成する光子吸収及び電子放出である質量
分析法の形態を意味する。光子エネルギーは、一般的にイオン化電位のすぐ上にあるので
、分子イオンは、それほど解離しやすくない。多くの場合、クロマトグラフィーを必要と
せずにサンプルを分析することができると考えられ、従ってかなりの時間及び出費が抑え
られる。水蒸気又はプロトン性溶媒の存在下で、分子イオンは、Ｈを取り出してＭＨ＋を
形成することができる。これは、Ｍが高プロトン親和性を有する場合に生ずる傾向がある
。Ｍ＋とＭＨ＋の合計は一定なので、これは定量の正確性に影響を及ぼさない。プロトン
性溶媒中の薬物化合物は、通常ＭＨ＋として観察される一方、非極性化合物、例えばナフ
タレン又はテストステロン等は、通常Ｍ＋の形態を採る。Ｒｏｂｂ、Ｄ．Ｂ．、Ｃｏｖｅ
ｙ、Ｔ．Ｒ．及びＢｒｕｉｎｓ、Ａ．Ｐ．（２０００年）：例えば、Ｒｏｂｂら、Ａｔｍ
ｏｓｐｈｅｒｉｃｐｒｅｓｓｕｒｅｐｈｏｔｏｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：Ａｎｉｏｎ
ｉｚａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
－ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．第７２巻（１５号）：３
６５３～３６５９頁を参照。

本明細書で用いる場合、用語「誘導結合プラズマ法」又は「ＩＣＰ法」とは、ほとんど
の元素が微粒化及びイオン化されるような十分に高温度において、サンプルが部分的にイ
オン化した気体と相互作用する方法を意味する。

本明細書で用いる場合、用語「電界脱離法」とは、非揮発性の試験サンプルがイオン化
表面上に配置され、そして分析物イオンを生成するのに強電界が使用される方法を意味す
る。

本明細書で用いる場合、用語「脱離」とは、表面から分析物を取り出すこと、及び／又
は分析物を気相に導入することを意味する。

本明細書で用いる場合、用語「定量化限界〔limit of quantification〕」、「定量限
界〔limit of quantitation〕」、又は「ＬＯＱ」とは、測定が定量的に意味を有するよ
うになるポイントを意味する。このＬＯＱにおける分析物の応答は、識別可能であり、個
別的であり、並びに２０％の精密度及び８０％～１２０％の正確度で再現性を有する。

本明細書で用いる場合、用語「検出限界」又は「ＬＯＤ」は、測定値が、それと関連し
た不確実性より大きくなるポイントである。ＬＯＤは、ゼロ濃度から２標準偏差（ＳＤ）
として任意に定義される。

本明細書で用いる場合、体液サンプル中のアミロイドベータの「量」とは、体液の容積
中で検出可能なアミロイドベータの質量を反映する絶対値を一般的に意味する。但し、量
は、別のアミロイドベータの量と比較した相対的な量についても考慮する。例えば、体液
中のアミロイドベータの量は、通常存在するアミロイドベータの対照レベル又は正常レベ
ルを上回る又はそれ未満である量であり得る。

用語「約」とは、イオン質量測定を除き定量測定と関連して本明細書で使用する場合、
表示の数値±１０％を意味する。マススペクトロメトリー装置は、所与の分析物の質量を
決定する際に、ほとんど変化し得ない。用語「約」とは、イオンの質量又はイオンの質量
／電荷の比の文脈において、±０．５原子質量単位を意味する。

上記した本発明の概要は、非限定的であり、また本発明のその他の特性及び長所は、下
記の発明を実施するための形態から、及び特許請求の範囲から明白である。

Ａβ４０（配列番号１）、Ａβ４０フラグメント（配列番号２）、Ａβ４２（配列番号３）、及びＡβ４２フラグメント（配列番号４）の配列を示す図である。液体クロマトグラフィー法の情報を示す図である。水に溶解した０．１％ＦＡを移動相Ａ、及びＡＣＮに溶解した０．１％ＦＡを移動相Ｂとして使用した。（図２－１のつづき）液体クロマトグラフィー法の情報を示す図である。水に溶解した０．１％ＦＡを移動相Ａ、及びＡＣＮに溶解した０．１％ＦＡを移動相Ｂとして使用した。加熱したエレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）のイオン源条件を示す図である。Ａβ４２分析の直線範囲を示す図である。Ａβ４０分析の直線範囲を示す図である。Ａβ４０、Ａβ４２、及び内部標準の患者クロマトグラムの例を示す図である。（図６－１のつづき）Ａβ４０、Ａβ４２、及び内部標準の患者クロマトグラムの例を示す図である。Ａβ４０、Ａβ４２、及び内部標準の患者クロマトグラムの例を示す図である。（図７－１のつづき）Ａβ４０、Ａβ４２、及び内部標準の患者クロマトグラムの例を示す図である。アルツハイマー病患者９１例、ボーダーラインのアルツハイマー病患者６６例、及び正常な対象を含む、対象２１１例のＡβ４２：Ａβ４０の比を示す図である。女性と男性のアルツハイマー病患者におけるＡβ４２：Ａβ４０の比を示す図である。アルツハイマー病患者の年齢で階層化された群におけるＡβ４２：Ａβ４０の比を示す図である。Ｃ８とＣ４分析カラムの間での感度比較を示す図である。処理チューブと未処理チューブに由来するＡβ４０の回収率を示す図である。処理チューブと未処理チューブに由来するＡβ４２の回収率を示す図である。Ａβ４０減少レベルによるソート後の患者Ａβ値（ｐｇ／ｍＬ）を示す図である。Ａβ４２減少レベルによるソート後の患者Ａβ値（ｐｇ／ｍＬ）を示す図である。Ａβ４２／Ａβ４０値によるソート後の患者アルツハイマー病診断を示す図である。Ａβ４２／Ａβ４０の比に基づく患者アルツハイマー病診断を示す図である。

タンデム型質量分析などのマススペクトロメトリーにより、サンプル中のアミロイドベ
ータ（Ａβ）の量を検出又は決定する方法が、本明細書に提供される。特定の実施形態で
は、アミロイドベータの量を決定するための本明細書に提供される方法は、（ａ）サンプ
ル中のアミロイドベータを精製すること；（ｂ）前記サンプル中のアミロイドベータをイ
オン化すること；及び（ｃ）マススペクトロメトリーにより、アミロイドベータイオンの
量を決定することを含み、アミロイドベータイオンの量は、サンプル中のアミロイドベー
タの量と関連する。

特定の実施形態では、アミロイドベータの量を決定するための本明細書に提供される方
法は、（ａ）サンプル中のアミロイドベータを消化して、１つ又は複数のアミロイドベー
タフラグメントを生成すること；（ｂ）前記１つ又は複数のアミロイドベータフラグメン
トを精製すること；（ｃ）サンプル中のアミロイドベータをイオン化して、アミロイドベ
ータの前駆イオンを産生すること；（ｄ）１つ又は複数のアミロイドベータフラグメント
のイオンを生成すること；及び（ｅ）マススペクトロメトリーにより、ステップ（ｃ）若
しくは（ｄ）又はその両方からのイオンの量を決定することを含み、アミロイドベータイ
オンの量が、前記サンプル中のアミロイドベータの量と関連する。

特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、サンプルと接触する機器の表面を
事前処理することを含む。いくつかの実施形態では、事前処理は、機器の表面を、アミロ
イドベータ又はそのフラグメントが表面に固着するのを防止する薬剤で事前コーティング
することを含む。いくつかの実施形態では、事前処理は、溶菌液による事前処理を含む。
いくつかの実施形態では、事前処理は、大腸菌溶解物による事前処理を含む。いくつかの
実施形態では、大腸菌溶解物は、トリプシン消化大腸菌溶解物を含む。いくつかの実施形
態では、事前処理された機器として、試験管又はプレート、ピペットチップ、サンプル調
製装置、液体クロマトグラフィー装置、及びマススペクトロメトリー装置が挙げられるが
、但し、これらに限定されない。

特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、サンプル中のアミロイドベータを
消化することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、酵素によ
りアミロイドベータを消化することを含む。いくつかの実施形態では、酵素は、Ｌｙｓ－
Ｃである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、尿素によりアミロイ
ドベータを消化することを含む。いくつかの実施形態では、尿素は、タンパク質消化に適
する濃度を有する。いくつかの実施形態では、尿素は６Ｍ尿素である。いくつかの実施形
態では、本明細書に提供される方法は、尿素及びＬｙｓ－Ｃによりアミロイドベータを消
化することを含む。いくつかの実施形態では、消化は、消化時間を短縮する又は消化効率
を高める条件で消化することを含む。いくつかの実施形態では、消化は、マイクロ波中で
消化することを含む。

特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、タンデム型質量分析法を含む。い
くつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、ポジティブモードでイオン化する
ことを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、ネガティブモード
でイオン化することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、加
熱式エレクトロスプレーイオン化法（ＨＥＳＩ）を使用してイオン化させることを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、エレクトロスプレーイオン化法
（ＥＳＩ）を使用してイオン化させることを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に
提供される方法は、大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）を使用してイオン化させることを
含む。好ましい実施形態では、本明細書に提供される方法は、加熱式エレクトロスプレー
イオン化法（ＨＥＳＩ）を使用して、ポジティブモードでイオン化することを含む。いく
つかの実施形態では、衝突エネルギーは、５Ｖ～６０Ｖである。いくつかの実施形態では
、衝突エネルギーは、１０Ｖ～５０Ｖである。いくつかの実施形態では、衝突エネルギー
は、２０Ｖ～５０Ｖである。いくつかの実施形態では、衝突エネルギーは、２０Ｖ～４５
Ｖである。

特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、アミロイドベータ４０（Ａβ４０
）の量を検出又は決定することを含む。いくつかの実施形態では、Ａβ４０は、配列ＤＡ
ＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配
列番号１）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、Ａβ４０の
フラグメントの量を検出又は決定することを含む。いくつかの実施形態では、Ａβ４０フ
ラグメントは、配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号２）を含む。いくつかの実施形
態では、Ａβ４０フラグメントは、Ｎ末端又はＣ末端飛行化ペプチドを含有する配列を含
む。いくつかの実施形態では、Ａβ４０フラグメントは、配列番号２、及びＮ末端又はＣ
末端飛行化ペプチドを含む。いくつかの実施形態では、飛行化ペプチドは、親水性である
。いくつかの実施形態では、飛行化ペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸を含む。いく
つかの実施形態では、飛行化ペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸を含む。いくつかの
実施形態では、飛行化ペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形
態では、飛行化ペプチドは、少なくとも４個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では
、飛行化ペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、飛行
化ペプチドは、少なくとも６個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ａβ４０フ
ラグメントの量は、サンプル中でＡβ４０の量と相関する。

特定の実施形態では、Ａβ４０に対するＡβ４２の比、又はＡβ４０フラグメントに対
するＡβ４２フラグメントの比が０．６又はそれ未満であれば、アルツハイマー病が予測
される、又はそれと診断される。いくつかの実施形態では、Ａβ４０に対するＡβ４２の
比、又はＡβ４０フラグメントに対するＡβ４２フラグメントの比が０．５又はそれ未満
であれば、アルツハイマー病が予測される、又はそれと診断される。いくつかの実施形態
では、Ａβ４０に対するＡβ４２の比、又はＡβ４０フラグメントに対するＡβ４２フラ
グメントの比が０．４５又はそれ未満であれば、アルツハイマー病が予測される、又はそ
れと診断される。いくつかの実施形態では、Ａβ４０に対するＡβ４２の比、又はＡβ４
０フラグメントに対するＡβ４２フラグメントの比が０．４又はそれ未満であれば、アル
ツハイマー病が予測される、又はそれと診断される。いくつかの実施形態では、Ａβ４０
に対するＡβ４２の比、又はＡβ４０フラグメントに対するＡβ４２フラグメントの比が
０．３５又はそれ未満であれば、アルツハイマー病が予測される、又はそれと診断される
。いくつかの実施形態では、Ａβ４０に対するＡβ４２の比、又はＡβ４０フラグメント
に対するＡβ４２フラグメントの比が０．３又はそれ未満であれば、アルツハイマー病が
予測される、又はそれと診断される。いくつかの実施形態では、Ａβ４０に対するＡβ４
２の比、又はＡβ４０フラグメントに対するＡβ４２フラグメントの比が０．２５又はそ
れ未満であれば、アルツハイマー病が予測される、又はそれと診断される。いくつかの実
施形態では、Ａβ４０に対するＡβ４２の比、又はＡβ４０フラグメントに対するＡβ４
２フラグメントの比が０．２又はそれ未満であれば、アルツハイマー病が予測される、又
はそれと診断される。いくつかの実施形態では、Ａβ４０に対するＡβ４２の比、又はＡ
β４０フラグメントに対するＡβ４２フラグメントの比が０．１９又はそれ未満であれば
、アルツハイマー病が予測される、又はそれと診断される。いくつかの実施形態では、Ａ
β４０に対するＡβ４２の比、又はＡβ４０フラグメントに対するＡβ４２フラグメント
の比が０．１８又はそれ未満であれば、アルツハイマー病が予測される、又はそれと診断
される。いくつかの実施形態では、Ａβ４０に対するＡβ４２の比、又はＡβ４０フラグ
メントに対するＡβ４２フラグメントの比が０．１７又はそれ未満であれば、アルツハイ
マー病が予測される、又はそれと診断される。いくつかの実施形態では、Ａβ４０に対す
るＡβ４２の比、又はＡβ４０フラグメントに対するＡβ４２フラグメントの比が０．１
６又はそれ未満であれば、アルツハイマー病が予測される、又はそれと診断される。いく
つかの実施形態では、Ａβ４０に対するＡβ４２の比、又はＡβ４０フラグメントに対す
るＡβ４２フラグメントの比が０．１５又はそれ未満であれば、アルツハイマー病が予測
される、又はそれと診断される。いくつかの実施形態では、Ａβ４０に対するＡβ４２の
比、又はＡβ４０フラグメントに対するＡβ４２フラグメントの比が０．１又はそれ未満
であれば、アルツハイマー病が予測される、又はそれと診断される。

適する試験サンプルは、目的とする分析物を含有し得る任意の試験サンプルを含む。い
くつかの好ましい実施形態では、サンプルは、生体サンプルである；すなわち、任意の生
物起源物質、例えば動物、細胞培養物、臓器培養物等から得られるサンプルである。特定
の好ましい実施形態では、サンプルは、哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ等から得られ
る。特に好ましい哺乳動物は、霊長類、最も好ましくは男性又は女性のヒトである。特に
好ましいサンプルとして、血液、血漿、血清、毛髪、筋肉、尿、唾液、涙、脳脊髄液、又
はその他の組織サンプルが挙げられる。そのようなサンプルは、例えば患者；すなわち、
疾患又は状態を診断、予測、又は処置するために、臨床現場において自己を提示する生存
者、男性又は女性から取得され得る。試験サンプルは、好ましくは患者から得られ、例え
ば血清である。

マススペクトロメトリーのためのサンプル調製
サンプル中のその他の成分（例えば、タンパク質）と比較してそれよりもアミロイドベ
ータを富化させるのに利用可能である方法として、例えば、フィルター処理法、遠心分離
法、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）法、キャピラリー電気泳動法を含む電気泳動法、
免疫親和性分離法を含む親和性分離法、酢酸エチル抽出法及びメタノール抽出法を含む抽
出法、及びカオトロピック薬剤の使用、又は上記の任意の組合せ等が挙げられる。

タンパク質沈殿法は、試験サンプルを調製する１つの好ましい方法である。そのような
タンパク質精製法は、当技術分野に周知であり、例えば、Ｐｏｌｓｏｎらの、Ｊｏｕｒｎ
ａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＢ、第７８５巻：２６３～２７５頁（２０
０３年）は、本方法で使用するのに適するタンパク質沈殿技術について記載する。タンパ
ク質沈殿法は、上清にアミロイドベータを残して、サンプルからほとんどのタンパク質を
取り除くのに利用可能である。サンプルは、沈殿したタンパク質から液体上清を分離する
ために遠心分離され得る。得られた上清は、次に、液体クロマトグラフィー及び後続する
マススペクトロメトリー分析に適用され得る。特定の実施形態では、タンパク質沈殿法、
例えばアセトニトリルタンパク質沈殿法等を使用すれば、ＨＰＬＣ及びマススペクトロメ
トリーを行う前に、高乱流液体クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）又はその他のオンライン
抽出を行う必要がなくなる。従って、そのような実施形態では、方法は、（１）目的とす
るサンプルのタンパク質沈殿を実施すること；及び（２）オンライン抽出又は高乱流液体
クロマトグラフィー（ＨＴＬＣ）を使用することなく、上清をＨＰＬＣ－質量分析装置に
直接負荷することと関係する。

いくつかの好ましい実施形態では、ＨＰＬＣは、単独で、又は１つ若しくは複数の精製
法と組み合わせて、マススペクトロメトリーの前にアミロイドベータを精製するのに利用
可能である。そのような実施形態では、サンプルは、分析物を捕捉するＨＰＬＣ抽出カー
トリッジを使用して抽出され、次に溶出され、そして第２のＨＰＬＣカラム上でクロマト
グラフされ得る、又はイオン化前に分析用ＨＰＬＣカラム上に溶出され得る。このような
クロマトグラフィー手順に関与するステップは、自動化方式で連結可能であるので、分析
物の精製期間中にオペレーターが関与する必要性は、最低限に抑えることができる。この
ような特性は、その結果、時間とコストの節約をもたらし、またオペレーターがミスする
機会を取り除くことができる。

例えば、ＨＴＬＣカラムや諸方法等が引き起こす乱流は、物質移動速度を増強する可能
性があり、分離特性を改善すると考えられている。ＨＴＬＣカラムは、剛性粒子を含有す
る充填カラムを通じた、クロマトグラフィーの高い流速によって成分を分離する。高速流
速（例えば、３～５ｍＬ／分）を利用することにより、乱流がカラム内に生じ、固定相と
目的とする分析物の間でほぼ完全な相互作用を引き起こす。ＨＴＬＣカラムを使用する長
所として、高分子量の種は、乱流条件下では保持されないので、生体液マトリックスと関
連した高分子の蓄積が回避されることが挙げられる。１つの手順において複数の分離法を
組み合わせるＨＴＬＣ法では、サンプル調製を長時間行う必要性が低下し、また著しく高
速で作動する。そのような方法は、層流（ＨＰＬＣ）クロマトグラフィーよりも優れた分
離性能も実現する。ＨＴＬＣは、生体サンプル（血漿、尿、等）の直接注入を可能にする
。直接注入する場合、変性したタンパク質及びその他の生物学的デブリが分離カラムを急
速にブロックするので、従来型のクロマトグラフィーでは実現が難しい。また、ＨＴＬＣ
は、１ｍＬ未満、好ましくは０．５ｍＬ未満、好ましくは０．２ｍＬ未満、好ましくは０
．１ｍＬの非常に少ないサンプルボリュームも可能にする。

マススペクトロメトリーによる分析前に、サンプル調製に適用されるＨＴＬＣの例は、
別途記載されている。例えば、Ｚｉｍｍｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ８５４巻
：２３～３５頁（１９９９年）を参照；米国特許第５，９６８，３６７号；同第５，９１
９，３６８号；同第５，７９５，４６９号；及び同第５，７７２，８７４号も参照。本方
法の特定の実施形態では、サンプルは、ＨＴＬＣカラムに負荷する前に上記のようなタン
パク質沈殿処理がなされる；代替的な好ましい実施形態では、サンプルは、タンパク質沈
殿処理されることなく、ＨＴＬＣ上に直接負荷され得る。ＨＴＬＣ抽出カラムは、好まし
くは大型の粒子カラムである。様々な実施形態では、方法の１つ又は複数のステップは、
オンラインの自動化された方式で実施され得る。例えば、１つの実施形態では、ステップ
（ｉ）～（ｖ）は、オンラインの自動化された方式で実施される。別の場合、イオン化及
び検出のステップは、ステップ（ｉ）～（ｖ）の後に、オンラインで実施される。

高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む液体クロマトグラフィー（ＬＣ）は
、比較的低速の層流技術に基づく。従来型のＨＰＬＣ分析法は、カラムを通過するサンプ
ルの層流が、サンプルから目的とする分析物を分離する基礎となる、カラム充填材に依存
する。当業者は、そのようなカラムにおける分離は、拡散プロセスであると理解している
。ＨＰＬＣは、生体サンプル中の化合物の分離に問題なく適用されるが、かなりの量のサ
ンプル調製が、分離及び質量分析装置（ＭＳ）によるその後の分析の前に必要とされ、こ
の技術を労働集約的なものとしている。更に、ほとんどのＨＰＬＣシステムは、質量分析
装置をその能力の最大限まで活用しておらず、１つのＨＰＬＣシステムが１つのＭＳ装置
に接続可能としているにすぎず、その結果、多数のアッセイを実施するのに冗長な時間を
必要とする。

マススペクトロメトリー分析前のサンプル除去を目的としたＨＰＬＣの使用について、
様々な方法が記載されている。例えば、Ｔａｙｌｏｒら、ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒ
ｕｇＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇ、第２２巻：６０８～１２頁（２０００年）；及びＳａｌｍ
ら、Ｃｌｉｎ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２２巻Ｓｕｐｌ．Ｂ：Ｂ７１～Ｂ８５頁（２
０００年）を参照。

当業者は、アミロイドベータと共に利用するのに適するＨＰＬＣ装置及びカラムを選択
し得る。クロマトグラフ用カラムは、化学的部分の分離（すなわち、分画）を促進する媒
体（すなわち、充填材料）を一般的に含む。媒体として微細粒子を挙げることができる。
粒子は、様々な化学的部分と相互作用して化学的部分の分離を促進する結合表面を備える
。１つの適する結合表面は、疎水結合表面、例えばアルキル結合表面等である。アルキル
結合表面は、Ｃ－４、Ｃ－８、Ｃ－１２、又はＣ－１８結合アルキル基、好ましくはＣ－
１８結合基を含み得る。クロマトグラフ用カラムは、サンプルを受け取るための注入ポー
トと、分画されたサンプルを含む流出物を排出するための排出ポートを備える。１つの実
施形態では、サンプル（又は事前精製されたサンプル）が、注入ポートにおいてカラムに
適用され、溶媒又は溶媒混合物により溶出され、そして排出ポートから排出される。異な
る溶媒モードが、目的とする分析物を溶出させるのに選択され得る。例えば、液体クロマ
トグラフィーは、勾配モード、アイソクラチックモード、又は多型（すなわち、混合）モ
ードを使用して実施され得る。クロマトグラフィー期間中に、材料の分離は、変動要因、
例えば溶離液（「移動相」としても知られている）の選択、溶出モード、勾配条件、温度
等により影響を受ける。

特定の実施形態では、分析物は、目的とする分析物がカラム充填材料により可逆的に保
持される一方、１つ又は複数のその他の物質は保持されない条件下で、サンプルをカラム
に適用することにより精製され得る。このような実施形態では、第１の移動相の条件は、
目的とする分析物がカラムにより保持されるように設定可能であり、また第２の移動相の
条件は、その後、保持されなかった物質が洗い出されたら、保持された物質がカラムから
取り出されるように、設定可能である。或いは、分析物は、１つ又は複数のその他の物質
と比較して、異なる速度で目的とする分析物が溶出するような移動相の条件下でサンプル
をカラムに適用することにより精製され得る。そのような手順は、サンプルの１つ又は複
数のその他の成分と比較して、目的とする１つ又は複数の分析物の量を富化させる可能性
がある。

１つの好ましい実施形態では、ＨＴＬＣは、疎水性カラムクロマトグラフィーシステム
上のＨＰＬＣに後続し得る。特定の好ましい実施形態では、ＣｏｈｅｓｉｖｅＴｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＴｕｒｂｏＦｌｏｗＣｙｃｌｏｎｅＰ（登録商標）ポリマー
ベースカラム（粒径６０μｍ、カラム寸法５０×１．０ｍｍ、ポアサイズ１００Å）が使
用される。関連する好ましい実施形態では、親水性エンドキャッピングを有する、Ｐｈｅ
ｎｏｍｅｎｅｘＩｎｃ社製のＳｙｎｅｒｇｉＰｏｌａｒ－ＲＰ（登録商標）エーテル
結合型フェニルの分析カラム（粒径４μｍ、カラム寸法１５０×２．０ｍｍ、ポアサイズ
８０Å）が使用される。特定の好ましい実施形態では、ＨＴＬＣ及びＨＰＬＣが、移動相
としてＨＰＬＣグレード超純水及び１００％メタノールを使用して実施される。

慎重なバルブの選択及びコネクター配管作業により、手動ステップを一切必要とせずに
、物質が１つのカラムから次のカラムへと通過するように、２つ以上のクロマトグラフィ
ーカラムが、必要に応じて接続され得る。好ましい実施形態では、バルブの選択及び配管
作業は、必要なステップを実施するように事前プログラムされたコンピューターにより管
理される。最も好ましくは、クロマトグラフィーシステムも、検出器システム、例えばＭ
Ｓシステムと、そのようなオンライン方式で接続される。従って、オペレーターは、サン
プルのトレーをオートサンプラーに配置すればよく、そして残りの作業は、コンピュータ
ー制御下で実施され、その結果、選択されたすべてのサンプルの精製及び分析が完了する
。

特定の好ましい実施形態では、サンプル中のアミロイドベータ又はそのフラグメントは
、イオン化の前に精製され得る。特に好ましい実施形態では、クロマトグラフィーは、ガ
スクロマトグラフィーではない。

マススペクトロメトリーによる検出及び定量
様々な実施形態では、アミロイドベータ又はそのフラグメントは、当業者にとって公知
の任意の方法によりイオン化することができる。マススペクトロメトリーは、分画された
サンプルをイオン化し、そして更なる分析用として荷電分子を生み出すイオン源を備える
質量分析装置を使用して実施される。例えば、サンプルのイオン化は、電子イオン化、化
学イオン化、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、光子イオン化、大気圧化学イオン
化（ＡＰＣＩ）、光イオン化、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、高速原子衝撃（ＦＡＢ）
、液体二次イオン化（ＬＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）
、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレー／プラズマスプレーイオン化、表面増強レー
ザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）、誘導結合プラズマ（ＩＣＰ）、及び粒子ビームイオン
化により実施され得る。当業者は、イオン化法の選択は、測定される分析物、サンプルの
種類、検出器の種類、ポジティブモードとネガティブモードの選択等に基づき決定され得
るものと理解する。

好ましい実施形態では、アミロイドベータ又はそのフラグメントは、ポジティブモード
又はネガティブモードでの加熱式エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）によりイオン
化する。代替的実施形態では、アミロイドベータ又はそのフラグメントは、ポジティブモ
ード又はネガティブモードでのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）又は大気圧化学イ
オン化（ＡＰＣＩ）によりイオン化する。

サンプルがイオン化した後、これにより生成した正に荷電したイオン又は負に荷電した
イオンは、質量対電荷の比を決定するために分析され得る。質量対電荷の比を決定するた
めの適するアナライザーとして、四重極型アナライザー、イオントラップアナライザー、
及び飛行時間アナライザーが挙げられる。イオンは、いくつかの検出モードを使用して検
出可能である。例えば、選択されたイオンは、すなわち、選択的イオンモニタリングモー
ド（ＳＩＭ）を使用して検出可能であるか、また或いは、イオンは、スキャニングモード
、例えば、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）又は選択的反応モニタリング（ＳＲＭ）を使
用して検出可能である。好ましくは、質量対電荷の比は、四重極型アナライザーを使用し
て決定される。例えば、「四重極」又は「四重極型イオントラップ」装置では、電極間に
印加されたＤＣ電位、ＲＦシグナルの振幅、及び質量／電荷の比に比例した力が、振動性
ラジオ周波数場内のイオンに加わる。電圧及び振幅は、特定の質量／電荷の比を有するイ
オンのみが、四重極の長さを移動する一方、その他のすべてのイオンは外れるように選択
され得る。従って、四重極型装置は、装置に注入されたイオンに対して、「マスフィルタ
ー」及び「マス検出器」の両方として作用し得る。

「タンデム型質量分析」又は「ＭＳ／ＭＳ」を利用することにより、ＭＳ技術の分解能
を強化することができる。この技術では、目的とする分子から生成した前駆イオン（親イ
オンとも呼ばれる）を、ＭＳ装置内でフィルター処理することができ、そして前駆イオン
は、その後フラグメント化されて、次に第２のＭＳ手順において分析の対象とされる１つ
又は複数のフラグメントイオン（娘イオン又はプロダクトイオンとも呼ばれる）となる。
前駆イオンを慎重に選択することにより、特定の分析物より産生するイオンのみが、フラ
グメント化チャンバーを通過し、そこで、不活性気体の原子と衝突してフラグメントイオ
ンが産生する。前駆イオン及びフラグメントイオンのいずれも、イオン化／フラグメント
化させる一連の所定条件下で再現的に産生するので、ＭＳ／ＭＳ技術は、極めて強力な分
析ツールを提供し得る。例えば、フィルター処理／フラグメント化の組合せは、妨害物質
を取り除くのに利用可能であり、また複合サンプル、例えば生体サンプル等において特に
有用であり得る。

質量分析装置は、一般的に、イオンスキャン；すなわち、所定の範囲（例えば、１００
～１０００ａｍｕ）において、特定の質量／電荷を有する各イオンの相対的存在量をユー
ザーに提供する。分析物アッセイの結果、すなわち質量スペクトルは、当技術分野におい
て公知の非常に多くの方法により、オリジナルサンプル内の分析物の量と関連付けること
ができる。例えば、サンプリング及び分析パラメーターが慎重に管理されることを前提と
すれば、所定のイオンの相対的存在量は、相対的存在量をオリジナル分子の絶対量に変換
する表と比較することができる。或いは、分子標準をサンプルと共にランニングすること
ができ、そしてその標準から生成したイオンに基づき、標準曲線が構築される。そのよう
な標準曲線を使用して、所定のイオンの相対的存在量が、オリジナル分子の絶対量に変換
され得る。特定の好ましい実施形態では、内部標準が、アミロイドベータの量を計算する
ための標準曲線を生成するのに使用される。そのような標準曲線を生成及び使用する方法
は、当技術分野に周知であり、また当業者は、適切な内部標準を選択する能力を有する。
例えば、アミロイドベータの同位体が、内部標準として利用可能である。イオンの量をオ
リジナル分子の量と関連付けるための非常に多くのその他の方法が、当業者に周知である
。

方法の１つ又は複数のステップは、自動化された機械を使用して実施され得る。特定の
実施形態では、１つ又は複数の精製ステップが、オンラインで実施され、またより好まし
くは、精製及びマススペクトロメトリーステップのすべてが、オンライン方式で実施され
得る。

特定の実施形態、例えば前駆イオンが更なるフラグメント化を目的として単離されるよ
うなＭＳ／ＭＳ等では、衝突活性化解離法〔collision activation dissociation〕が、
更なる検出を目的としてフラグメントイオンを生成するのに多くの場合使用される。ＣＡ
Ｄでは、前駆イオンは、不活性気体との衝突を通じてエネルギーを獲得するが、その後「
単分子分解反応」と呼ばれるプロセスによりフラグメント化する。振動エネルギーの増加
に起因して、イオン内の特定の結合が破壊され得るように、十分なエネルギーが、前駆イ
オン内に蓄積しなければならない。

特に好ましい実施形態では、アミロイドベータが、ＭＳ／ＭＳを使用して、以下のよう
に検出及び／又は定量化される。サンプルは、液体クロマトグラフィー、好ましくはＨＰ
ＬＣで処理され、クロマトグラフ用カラムからの液体溶媒の流れは、ＭＳ／ＭＳアナライ
ザーの加熱されたネブライザーインターフェースに進入し、そして溶媒／分析物混合物が
、インターフェースの加熱されたチューブ内で蒸気に変換される。分析物は、選択された
イオン化装置によりイオン化される。イオン、例えば前駆イオンは、装置の開口部を通過
し、そして第１の四重極に進入する。四重極１及び３（Ｑ１及びＱ３）は、質量フィルタ
ーであり、その質量対電荷の比（ｍ／ｚ）に基づき、イオン（すなわち、「前駆」及び「
フラグメント」イオン）の選択を可能にする。四重極２（Ｑ２）は衝突セルであり、そこ
でイオンがフラグメント化される。質量分析装置の第１の四重極（Ｑ１）は、アミロイド
ベータの質量対電荷の比を用いて分子を選択する。アミロイドベータの正しい質量／電荷
の比を有する前駆イオンが、衝突チャンバー（Ｑ２）に導入可能となる一方、その他の質
量／電荷の比を有する望ましくないイオンはいずれも四重極の側面と衝突し、除去される
。Ｑ２に進入する前駆イオンは、中性のアルゴン気体分子と衝突して、フラグメント化す
る。このプロセスは衝突活性化解離（ＣＡＤ）と呼ばれる。生成したフラグメントイオン
は、四重極３（Ｑ３）に導入され、そこでは、アミロイドベータフラグメントのイオンが
選択される一方、その他のイオンは除去される。

本方法は、ポジティブ又はネガティブイオンモードのいずれかで実施されるＭＳ／ＭＳ
と関係し得る。当技術分野において周知の標準法を使用して、当業者は、四重極３（Ｑ３
）における選択で利用可能な、特定のアミロイドベータの前駆イオンの１つ又は複数のフ
ラグメントイオンを識別する能力を有する。

アミロイドベータの前駆イオンがアルコール又はアミン基を含む場合、一般的に、前駆
イオンの脱水又は脱アミノに該当するフラグメントイオンがそれぞれ形成される。アルコ
ール基を含む前駆イオンの場合、脱水により形成されるそのようなフラグメントイオンは
、前駆イオンから１つ又は複数の水分子の喪失により引き起こされる（すなわち、前駆イ
オンとフラグメントイオンの間の質量対電荷の比の差異は、水分子１個の喪失では約１８
であり、又は水分子２個の喪失では約３６である、等）。アミン基を含む前駆イオンの場
合、脱アミノにより形成されるそのようなフラグメントイオンは、１つ又は複数のアンモ
ニア分子の喪失により引き起こされる（すなわち、前駆イオンとフラグメントイオンの間
の質量対電荷の比の差異は、アンモニア分子１個の喪失では約１７であり、又はアンモニ
ア分子２個の喪失では約３４である、等）。同様に、１つ又は複数のアルコール及びアミ
ン基を含む前駆イオンは通常、１つ若しくは複数の水分子及び／又は１つ若しくは複数の
アンモニア分子の喪失に該当するフラグメントイオンを形成する（すなわち、前駆イオン
とフラグメントイオンの間の質量対電荷の比の差異は、水分子１個の喪失、及びアンモニ
ア分子１個の喪失について約３５である）。概して、前駆イオンの脱水又は脱アミノに該
当するフラグメントイオンは、特定の分析物に対する固有のフラグメントイオンではない
。従って、本発明の好ましい実施形態では、ＭＳ／ＭＳは、アミロイドベータの少なくと
も１つのフラグメントイオンが検出され、それが、前駆イオンから１つ若しくは複数の水
分子が喪失した唯一のもの、及び／又は１つ若しくは複数のアンモニア分子が喪失した唯
一のものに該当しないように実施される。

イオンが検出器と衝突すると、イオンは、デジタルシグナルに変換される電子のパルス
を産生する。取得されたデータは、収集されたイオンのカウントを時間に対してプロット
するコンピューターに伝達される。得られた質量クロマトグラムは、従来型のＨＰＬＣ法
で生成されるクロマトグラムと類似している。特定のイオンに対応するピーク下面積、又
はそのようなピークの振幅が測定され、そして面積又は振幅が、目的とする分析物の量と
関連付けられる。特定の実施形態では、フラグメントイオン及び／又は前駆イオンに関す
る曲線下面積又はピークの振幅が、アミロイドベータの量を決定するために測定される。
上記のように、内部分子標準の１つ又は複数のイオンに由来するピークに基づく校正標準
曲線を使用して、所定のイオンの相対的存在量は、オリジナルの分析物の絶対量に変換さ
れ得る。

下記の実施例は、本発明を説明する役目を果たす。これらの実施例には、本方法の範囲
に制限を設けるような意図は一切存在しない。

［実施例１］
機器の事前処理及びアミロイドベータの安定化
９６ウェルポリプロピレンプレート及び微量遠心試験管の事前処理
９６ウェルプレート内で大腸菌を溶解し、そしてメタノールを使用して沈殿させた。

次に、メタノールを廃棄する一方、炭酸水素アンモニウムｐＨ８内でペレットを再懸濁
した。

Ｓｉｇｍａ社製のウシトリプシンを添加し、そしてサンプルを、６０℃で２日間インキ
ュベートした。

次に、すべての消化物を、廃棄目的で廃棄した、又はピペットチップを事前処理するた
めにプールした。

空のプレート及び試験管を完全に乾燥させた。

ピペットチップの事前処理
ピペットチップを使用して、大腸菌消化物を少なくとも３回ピペット吸引及び吐出し、
次に６０℃で２日間、又は完全に乾燥するまでインキュベートした。

アミロイドベータペプチドの安定化
事前処理した試験管内でＡＢ４０、ＡＢ４２、及び内部標準を合成し、そして４ｍｇの
ＢＳＡを含む６Ｍ尿素中に再懸濁した。

標準を、次に、Ｎ末端及びＣ末端抗体、並びにアポリポタンパク質Ｅ２及びＥ４を含む
０．１ＭのＰＢＳ中で１：１０にそれぞれ希釈した。

シェーカーで各混合物を室温で１時間インキュベートした。

次に、ＡＢ４０及びＡＢ４２を混合し、そして凍結する前に、０．１ＭのＰＢＳ及び０
．４ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ中で希釈して、高値キャリブレータ標準を作成した。

下記の表は、処理バイアル及び未処理バイアル中で調製した同一サンプルの左右比較を
示す。

［実施例２］
サンプル調製
事前処理したピペットチップを使用して、サンプル又は標準０．５ｍＬを、事前処理し
た９６ウェルプレートにピペット採取した。

５ｎｇの内部標準を添加した。

１８Ｍの尿素２５０ｕＬを添加した。

２ｕｇのＬｙｓ－Ｃを各サンプルに添加して、アミロイドベータを消化した。

４５０ｗ、４５℃で酵素を伴うマイクロ波中で４時間消化する前に、接着性の蓋でプレ
ートを密閉した。

次に、サンプルを、水混合強陰イオン交換モードを使用して抽出した。

次に、サンプル溶出液を、加熱窒素を使用して完全に乾燥させた。

次に、サンプルを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析用の再構成用バッファー中で再懸濁した。

［実施例３］
ＭＳ／ＭＳによるアミロイドベータフラグメントの検出及び定量
イオンを第１の四重極（Ｑ１）に導入し、Ａβ４０フラグメント及びＡβ４２フラグメ
ントのそれぞれについて、１０８５．６±０．５ｍ／ｚ又は１２６９．７±０．５ｍ／ｚ
のいずれかの質量対電荷の比を用いてイオンを選択した。四重極２（Ｑ２）に進入したイ
オンは、アルゴンガスと衝突して、イオンフラグメントを生成したが、更なる選択のため
に、イオンフラグメントを四重極３（Ｑ３）に導入した。同時に、同位体希釈マススペク
トロメトリーを使用する同一のプロセスを、内部標準を用いて実施した。下記の質量遷移
を、陽性極性での妥当性確認期間中に、検出及び定量するために使用した。

患者クロマトグラムの例を、図６及び図７に示す。

様々な抽出を比較して、アミロイドベータフラグメントの回収率を最適化した。

ＷａｔｅｒｓＭＡＸ：混合強陰イオン交換モード→最終的なアッセイの妥当性確認用に
使用
ＷａｔｅｒｓＭＸＣ：混合強陽イオン交換モード
ＷａｔｅｒｓＨＬＢ：疎水化合物用に作製されたシリカ
ＡｇｉｌｅｎｔＣ１８：代表的なＣ１８充填材
ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＣＸ：混合強陽イオン交換モード
ＴｈｅｒｍｏＳＡＸ：強陰イオン交換

混合強陰イオン交換モードは、アミロイドベータフラグメントについて、最良の回収率
をもたらした。

消化物中に含まれる尿素は、分析物の回収率を増加させる。下記の数値が決定された：

Ｃ４分析カラムとＣ８分析カラムを感度について比較した。Ｃ４カラムは、優れた感度
をもたらしたが、当技術分野においては、Ｃ８及びＣ１８カラムが一般的に好ましいので
、それは予想外である。図１１。

［実施例４］
アッセイの報告可能な範囲及び直線性
アッセイにおけるアミロイドベータ検出の直線性を立証するために、ゼロ標準として割
り振られた１つのブランクとスパイクした標準を調製及び分析した。５回の連続したラン
に由来する二次回帰から、±２０％の正確性で、０．９９５又はそれを超える相関係数が
得られ、定量可能な直線範囲は０．１～２５ｎｇ／ｍＬの範囲であることが判明した。図
４及び図５。

［実施例５］
アッセイの精密度
サンプルのアッセイ内再現性を、下記の品質コントロールレベルについて試験した：

ラン中の精密度：各品質コントロールの１０回の反復測定を、単一アッセイ内において
下記の順序で分析した；低、中、及び高。

合否基準：％ＣＶは、≦ＴＥａ／２の許容可能な値未満であるべきである。このアッセ
イのＴＥａは、３０％と決定されている。

ベータアミロイド４０の％ＣＶは、３つの品質コントロールレベルすべてにおいて１４
．３１％～６．５５％の範囲であった。

ベータアミロイド４２の％ＣＶは、３つの品質コントロールレベルすべてにおいて１４
．９３％～７．５１％の範囲であった。

総精密度：アッセイ間妥当性確認データを分析した。

合否基準：総ＳＤ≧１／２ＴＥａの場合、許容されない、又は総ＳＤは、定義された最
大ＳＤ又はＣＶ未満でなければならない。

％ＣＶは、≦ＴＥａ／２の許容可能な値未満であるべきである。このアッセイのＴＥａ
は、３０％と決定されている。

ベータアミロイド４０の％ＣＶは、３つの品質コントロールレベルすべてにおいて１０
．２１％～４．２８％の範囲であった。

ベータアミロイド４２の％ＣＶは、３つの品質コントロールレベルすべてにおいて１４
．６３％～８．１７％の範囲であった。

［実施例６］
分析感度（検出限界）
ブランクの限界（ＬＯＢ）：計算：ＬＯＢ＝ブランクの平均値＋２ＳＤ。

２１のマトリックスブランクを、単一アッセイ内において分析したが、次に、逆算値は
下記のＬＯＢを計算するのに使用される。

ＡＢ４０のＬＯＢ：３１．３２ｐｇ／ｍＬ。

ＡＢ４２のＬＯＢ：３２．１１ｐｇ／ｍＬ。

検出限界（ＬＯＤ）：計算：ＬＯＤ＝ブランクの平均値＋４ＳＤ。

２１つのマトリックスブランクを、単一アッセイ内において分析したが、次に、逆算値
は下記のＬＯＤを計算するのに使用される。

ＡＢ４０のＬＯＤ：７７．７８ｐｇ／ｍＬ。

ＡＢ４２のＬＯＤ：７４．２１ｐｇ／ｍＬ。

定量限界（ＬＯＱ）：合否基準：ＴＥａが３０％のときに、％ＣＶが２ＳＤ未満、又は
それに等しい最低濃度。

ベータアミロイド４０及び４２の両方の定量限界は、１００ｐｇ／ｍＬと決定されてい
る。

［実施例７］
分析物測定範囲（ＡＭＲ）
合否基準：ＴＥａが３０％のとき、実測値の平均値につき、その予想範囲からの逸脱は
、２ＳＤ又は２０％ＣＶ以下であるべきである。

ベータアミロイド４０の％ＣＶは、６．５２～１２．０１％の範囲であり、許容される
とみなされる。

ベータアミロイド４２の％ＣＶは、６．２７～１４．２４％の範囲であり、許容される
とみなされる。

［実施例８］
正確度
既知標準の回収率
合否基準：完全回収できなかったことに起因する誤差（回収量－添加量）は、ＴＥａが
３０％のとき、２ＳＤ又は１５％ＣＶ以下であるべきである。

６つのストリップウシ脳脊髄液サンプルを下記の濃度：１０００、２０００、３０００
、４０００、８０００、及び９０００ｐｇ／ｍＬでスパイクし、各スパイクレベルを三連
でアッセイした。

次に、６つの異なるスパイクレベルを、ストリップウシ脳脊髄液を希釈剤として使用し
て１：３及び１：５の比で希釈し、ここでも三連でアッセイした。

［実施例９］
試料の安定性
合否基準：ＴＥａが３０％に等しいとき、ベースライン値と時間／温度サンプル値の間
の平均値の差が、分析物に関して≦ＴＥａ／２である限り、サンプルは安定とみなされる
。

凍結／解凍の安定性：凍結解凍分析を、４つのアリコートに等分した６例の患者プール
を分析することにより実施した。各患者プールの４つのアリコートすべてを、－６０～－
８０℃で凍結した。第２～４のアリコートを１８～２６℃の周囲温度で解凍し、そして凍
結した。第３及び第４のアリコートを１８～２６℃の周囲温度で解凍し、そして凍結した
。第４のアリコートを、次に１８～２６℃の周囲温度で解凍し、そして凍結した。

最終的に、アリコートすべてを１８～２６℃の周囲温度で解凍し、そして技術的に三連
で分析した。凍結解凍分析は、３種類の凍結解凍サイクルに関わるデータを含有する。

ベータアミロイド４０及びベータアミロイド４２は、最大２回の凍結解凍サイクルまで
許容される安定性を有する。

抽出後のサンプルの安定性：ベースライン値としてサンプル抽出した日と同じ日に、１
０サンプルを分析した。翌日、同一サンプルを再注入して、ベースライン値と対比分析し
た。

ベータアミロイド４０及び４２は、ＣＴＣオートサンプラーのＣ－スタックにおいて、
４℃で最長１日、抽出後サンプル安定性を示す。

冷蔵安定性（２．０～８．０℃）：サンプルは、最長５日間冷蔵保存しても安定である
ことを示した。

室温安定性（１８．０～２６．０℃）：サンプルは、１８～２６℃で最長３日間安定で
ある。

凍結安定性（－１０．０～－３０．０℃）：サンプルは、－１０～－３０℃で最長３１
日間安定である。

［実施例１０］
妨害試験
合否基準：潜在的妨害物質に起因する差異は、≦２ＳＤであるべきである、又は２０％
ＣＶは許容されるとみなされる。

溶血による妨害：６つのスパイクプールを、ベースライン、小規模、中規模、及び大規
模な溶血による妨害について三連で分析した。

ベータアミロイド４０及びベータアミロイド４２は、非溶血、及び小規模溶血した脳脊
髄液サンプルのみが許容される。

脂肪血症による妨害：６つのスパイクプールを、ベースライン、小規模、中規模、及び
大規模な脂肪血症の妨害について、三連で分析した。

ベータアミロイド４０及びベータアミロイド４２は、小規模及び中規模の脂肪血症脳脊
髄液サンプルにつき許容される。

ビリルビンによる妨害：６つのスパイクプールを、ベースライン、小規模、中規模、及
び大規模な黄疸による妨害について、三連で分析した。

ベータアミロイド４０及びベータアミロイド４２は、黄疸なし及び小規模な黄疸の脳脊
髄液サンプルにつき、許容される。

［実施例１１］
イオン抑制
患者サンプル１０例を抽出した。

勾配全体にわたりイオン抑制をモニターするために、取得ウィンドウを最長１０分間開
放した。サンプル１０例を、分析カラムを通じて注入した一方、ベータアミロイド４０及
び４２の消化されたペプチド混合物を、ポストカラム注入した。

ＡＢ４０又はＡＢ４２の内部標準が溶出したときに、ＡＢ４０又はＡＢ４２の全イオン
クロマトグラム（ＴＩＣ）が、シグナル強度について≧１５％の減少を示した場合には、
アッセイにおいてイオン抑制が存在すると判断される。

ＡＢ４０及び４２の消化されたペプチドのＴＩＣは、分析物の溶出時に、勾配内で抑制
を示さなかった。ＴＩＣシグナル強度は一定であり、シグナル強度の差異は≦１５％であ
ることを示しており、許容されるアッセイパラメーターの範囲内である。

［実施例１２］
キャリーオーバー
高値キャリブレータ標準を分析した後に、４つのマトリックスブランクを続けて分析し
、この順番で更に２回反復した。高値キャリブレータ分析後のマトリックスブランクの平
均計算濃度から、ベータアミロイド４０及び４２の両方について、回収率は０．０６％で
ある。

このアッセイでは、キャリーオーバーは観察されない。

［実施例１３］
参照間隔（ＲＩ）
ベータアミロイド４０：６０００．００～１５０００．００ｐｇ／ｍＬ

ベータアミロイド４２：７００．００～４０００．００ｐｇ／ｍＬ

［実施例１４］
アルツハイマー病患者データ
アルツハイマー病と診断された患者、及び健常対象を含む対象２１１例の脳脊髄液（Ｃ
ＳＦ）を分析した。図８～１０。

Ａβ４０及びＡβ４２を、すべてのＣＳＦサンプルにおいて検出した。驚くべきことに
、Ａβ４２レベルは、公表されていたレベルよりも約１０倍高かった。大部分の患者サン
プルは、１～８ｎｇ／ｍＬの範囲であった。アルツハイマー病患者は、Ａβ４２：Ａβ４
０の比が、ボーダーラインの患者及び健常対象（最高の比）と比較して低いことに基づき
区別可能であった。図８。

［実施例１５］
追加の回収試験
サンプル調製：すべてのプラスチック製ディスポーザブル用具を事前処理し、そして非
特異結合を防止し、またＡβ標準を安定化させて長期保存安定性を強化した。

強いタンパク質変性剤を、ヒトＣＳＦ（５００ｕＬ）に添加し、そしてサンプルをタン
パク質消化させ、その後に固相抽出した。ＣＥＲＥＸＩＰ８（ＳＰＥｗａｒｅ）固相抽
出マニフォールドと連結したロボット型リキッドハンドラー（ＨａｍｉｌｔｏｎＭｉｃ
ｒｏｌａｂＳｔａｒＡ８５７）上で、サンプルを処理した。

分離：ＨＰＬＣ分離を、ＷａｔｅｒｓＸＢｒｉｄｇｅＰｒｏｔｅｉｎＢＥＨＣ
４カラム、４．６×１００ｍｍ、３．５ミクロン３００Åを使用して、ＡｒｉａＴＬＸ
－４システム（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）上で実施した。

検出：ＴｈｅｒｍｏＴＳＱＱｕａｎｔｉｖａ三連四重極質量分析装置

直線性データは、両ペプチドについて少なくとも０．９８のＲ^２値を示し、８つのキャ
リブレータ標準全体を通じて％ＣＶ≦１５％である。

定量限界は、両ペプチドについて１００ｐｇ／ｍＬであった。

Ａβ４０及びＡβ４２について、アッセイ精密度（％ＣＶ）は≦１５％であり、回収率
は８４％～１１２％の範囲であった。

アッセイ内（Ｎ＝１０）及びアッセイ間（Ｎ＝５、５日間）の精密度及び正確度

８カ月にわたるアッセイの安定性

Ａβペプチドの安定化を実現し、キャリブレータ及び品質コントロール標準の長期保管
を可能にした。

凍結したキャリブレータは、－８０℃で保管したとき、少なくとも８カ月安定であった
。

安定化措置は非特異結合をなくし、高い分析物回収率をもたらした。図１２及び１３。

患者ＣＳＦのＡβ４２濃度値は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳアッセイを使用した方が、ＥＬＩＳ
Ａアッセイを使用した場合より高かった。これは、この２つの方法論について比較する既
報と整合する。将来的な研究により、本明細書に記載する分析前因子が差異を説明するの
に役立つかどうかを明確になると予想される。

結論：この新規アプローチは、Ａβ４０及びＡβ４２の定量における重要な課題の１つ
:非特異結合により引き起こされる再現性不良を取り除いた。

［実施例１６］
患者診断試験
３つの品質コントロール（低、中、高）をランニングし、校正曲線に沿って異なる３つ
の点を表示した。ＱＣは、プレート全体を通じて正確な定量を保証するために、ラン開始
時及び終了時にランニングした。品質コントロールの正確度を以下に示す：

Ａβ４０及び４２の患者サンプル範囲
患者サンプル７２例に基づく。
Ａβ４０：５１３５．３３～２５３４８．９４ｐｇ／ｍＬ
Ａβ４２：１０６８．００～５４９９．７６ｐｇ／ｍＬ。

Ａβ４０及び４２の異なるレベルを標準化する。

プラーキング又は洗浄不十分に起因してＡβ４２の数値は低下するので、Ａβ４２／４
０の比も低下する。

Ａβ４０及び４２のレベルは、互いに独立に増加／低下するものと思われる。

データをＡβ４２／４０の比によりソートし、そしてメジアンに基づき２つのセットに
分割した（Ａβ４２／４０＝０．１７）。

データの半分を、＜Ａβ４２／４０のメジアンとして分割した。

データの半分を、＞Ａβ４２／４０のメジアンとして分割した。

平均値、標準偏差、及び％ＣＶを計算した。

比の数値が、＜Ａβ４２／４０のメジアンの場合、数値≧１ＳＤを除去した。

比の数値が、＞Ａβ４２／４０のメジアンの場合、数値≦１ＳＤを除去した。

１ＳＤ外れ値を、「ボーダーライン」分類とした。

本明細書に記載又は引用する文献、特許、及び特許出願、並びにその他のすべての文書
及び電子的に利用可能な情報の内容は、個々の公開資料が参照として組み込まれるものと
特別及び個別に示唆されたのと同程度に、参照により本明細書にその全体が援用される。
出願者らは、任意のそのような文献、特許、特許出願、又はその他の物理的及び電子的な
文書に由来する任意の及びすべての資料及び情報を本出願に物理的に組み込む権利を留保
する。

本明細書に事例的に記載する方法は、本明細書に特に開示されない、任意の１つの要素
又は複数の要素、１つの制限又は複数の制限が存在しなくても、好適に実践できる。従っ
て、例えば、用語「含む〔comprising〕」、「含む〔including〕」、「含有する〔conta
ining〕」等は、拡大的及び非限定的に解釈されなければならない。更に、本明細書で採
用されている用語及び表現は、制限の用語としてではなく、説明の用語として使用されて
おり、そのような用語及び表現の使用において、提示及び記載された特性の任意の等価物
又はその一部分を排除する意図は存在しない。様々な修正が、主張された本発明の範囲内
で可能であると認識される。従って、本発明は、好ましい実施形態及び任意選択的な特性
により特別に開示されているが、本明細書に開示する本発明に取り込まれた本発明の修正
及び変更は、当業者により実施可能であるものと理解し、またそのような修正及び変更は
、本発明の範囲内であるとみなされるものと理解すべきである。

本発明は、本明細書において広範且つ全体的に記載されている。一般的な開示の範囲に
含まれるより狭い種及び亜属のグルーピングのそれぞれも、本方法の一部をなす。これに
は、属から主題のいずれかを除去する条件又は否定的限定を伴う方法の一般的な説明が、
切り取られた題材が本明細書において特に列挙されるか、又はされないかを問わず含まれ
る。

その他の実施形態は、下記の特許請求の範囲内に含まれる。更に、方法の特徴又は態様
が、マーカッシュ群によって記載されている場合、当業者は、発明は、これにより、マー
カッシュ群の個々のメンバー又はメンバーのサブグループのいずれについても記載されて
いるものと認識する。

Claims

サンプル中のアミロイドベータの量を決定する方法であって、
（ａ）サンプルと接触する機器の表面を、アミロイドベータフラグメントが前記表面に固着するのを防止する薬剤で事前処理すること、
（ｂ）前記サンプル中のアミロイドベータを消化して、１つ又は複数のアミロイドベータフラグメントを生成すること、ここで、前記１つ又は複数のアミロイドベータフラグメントは、配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号２）を含むＡβ４０フラグメント、又は配列ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号４）を含むＡβ４２を含む、
（ｃ）前記１つ又は複数のアミロイドベータフラグメントを精製すること、
（ｄ）前記アミロイドベータフラグメントをイオン化して、前駆イオンを産生すること、及び
（ｅ）１つ又は複数のフラグメントイオンを生成すること、及び
（ｆ）マススペクトロメトリーにより、ステップ（ｄ）若しくは（ｅ）又はその両方からのイオンの量を決定すること
を含み、前記イオンの量が、前記サンプル中のアミロイドベータフラグメントの量と関連し、
前記薬剤が、大腸菌溶解物である、方法。
前記精製することが、液体クロマトグラフィーを含む、請求項１に記載の方法。
前記液体クロマトグラフィーが、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む、請求項２に記載の方法。
Ｃ－４分析カラムを更に含む、請求項１に記載の方法。
前記サンプルを、アミロイドベータを安定化させる薬剤と共にインキュベートすることを更に含む、請求項１に記載の方法。
前記薬剤が、アミロイドベータのＣ末端と結合する抗体、アミロイドベータのＮ末端と結合する抗体、アポリポタンパク質Ｅ２、アポリポタンパク質Ｅ４、又はその組合せを含む、請求項５に記載の方法。
前記薬剤が、少なくとも３回の凍結－解凍サイクルにわたり、安定性を付与する、請求項５に記載の方法。
前記薬剤が、－７０℃で少なくとも２カ月間、安定性を付与する、請求項５に記載の方法。
混合モード陰イオン交換抽出を含む、請求項１に記載の方法。
前記イオン化が、加熱式エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）を含む、請求項１に記載の方法。
前記イオン化が、ポジティブモードでイオン化することを含む、請求項１に記載の方法。
前記フラグメントイオンの生成が、２０Ｖ～４５Ｖの衝突エネルギーを使用することを含む、請求項１に記載の方法。
前記前駆イオンが、１０８５．６±０．５又は１２６９．７±０．５の質量／電荷の比を有する、請求項１に記載の方法。
前記１つ又は複数のフラグメントイオンが、８１２．３７±０．５、８６９．４±０．５、９６８．４３±０．５、８６９．３９±０．５、９６８．４４±０．５、１０６７．５±０．５、又は１１８０．５７±０．５の質量／電荷の比を有する、請求項１に記載の方法。
内部標準を添加することを更に含む、請求項１に記載の方法。
前記内部標準が、同位体で標識されている、請求項１５に記載の方法。
前記内部標準が、^１３Ｃ^１５Ｎ標識を含む、請求項１６に記載の方法。
前記内部標準の前記前駆イオンが、１１１０．７±０．５の質量／電荷の比を有する、請求項１６に記載の方法。
前記内部標準の前記１つ又は複数のフラグメントイオンが、７６８．４８±０．５、８２５．５±０．５、又は８８２．５２±０．５の質量／電荷の比を有する、請求項１６に記載の方法。
方法の定量限界が、１０ｎｇ／ｍＬ未満又はそれに等しい、請求項１に記載の方法。
前記サンプルが、脳脊髄液（ＣＳＦ）である、請求項１に記載の方法。
前記消化が、ＬｙｓＣにより消化することを含む、請求項１に記載の方法。
前記消化が、尿素を添加することを更に含む、請求項２２に記載の方法。
前記消化が、マイクロ波中での消化を更に含む、請求項２２に記載の方法。
前記アミロイドベータフラグメントが、飛行化ペプチドを更に含む、請求項１に記載の方法。
前記飛行化ペプチドが、親水性である、請求項２５に記載の方法。
前記飛行化ペプチドが、１つ又は複数のＮ末端又はＣ末端アミノ酸残基を含む、請求項２５に記載の方法。
Ａβ４０に対するＡβ４２の比を決定することを含む、請求項１に記載の方法。