JP2002526508A

JP2002526508A - フィブリル

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Publication number: JP2002526508A
Application number: JP2000574229A
Authority: JP
Inventors: ドブスン，クリストフアー・マーチン
Original assignee: イシス・イノベイシヨン・リミテツド
Priority date: 1998-09-21
Filing date: 1999-09-21
Publication date: 2002-08-20
Also published as: EP1115845A2; WO2000017328A3; WO2000017328A2; US20060128606A1

Abstract

(57)【要約】実質的に他のタンパク質を含まないアミロイドフィブリル。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はアミロイドフィブリル、それらの調製のための工程およびそれらの使
用に関する。本発明は特に、天然のアミロイドフィブリルおよびタンパク質を含
む非天然のアミロイドフィブリルの両方、それらの調製、ならびに、たとえばプ
ラスチック、製薬上活性なタンパク質の徐放性形態あるいは製造のための材料と
して、あるいは製薬上活性な化合物の送達、電子工学あるいは触媒作用における
それらの使用に関する。

【０００２】本文中で使用する「タンパク質」は、１又はそれ以上のタンパク質、タンパク
質断片、ポリペプチドあるいはペプチドを意味する。タンパク質はフィブリルを
形成することができるあらゆるタンパク質であり、製薬上活性なタンパク質であ
ってもよい。

【０００３】アミロイドーシスは、細胞内あるいは細胞外空隙での不溶性原線維タンパク質
物質の蓄積を特徴とするタンパク質のミスフォールディング（ｍｉｓｆｏｌｄｉ
ｎｇ）疾患の群である。通常は可溶性のタンパク質あるいはそれらの前駆物質が
この不溶性形態で沈着すると、組織機能不全と細胞死を導くと考えられている。
現在までに多くの異なるタンパク質とペプチドがアミロイド沈着物中で同定され
ている。これらは、アルツハイマー病におけるＡβペプチド、伝染性海綿状脳障
害におけるプリオンタンパク質、ＩＩ型糖尿病における膵島関連ポリペプチド、
および全身性アミロイドーシスにおける他の変異体、トランケートされたあるい
はミスプロセシングされたタンパク質を含む（Ｓ．Ｙ．ＴａｎとＭ．Ｂ．Ｐｅｐ
ｙｓ（１９９４）Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ２５，４０３−４１４および
Ｊ．Ｗ．Ｋｅｌｌｙ（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６
，１１−１７）。

【０００４】ｉｎｖｉｖｏでアミロイドフィブリルを形成することが知られているタンパ
ク質は、明らかな配列上あるいは構造上の類似性を持たないと思われ、アミロイ
ド形成前駆物質の可溶性折りたたみが既知である場合、それらは二次、三次およ
び四次構造要素の範囲にわたっている。この多様性にもかかわらず、すべてのア
ミロイドフィブリルが長く、直線で、非分枝性であり、直径７から１２ｎｍであ
ることを示唆する一連の証拠があり、そしてそれらすべてが交差−β回折パター
ンを示す。タンパク質分子は、フィブリルの長軸と垂直の方向に個別あるいは複
数のβ鎖を構成し、互いにねじれ合ってフィブリルの方向に広がる長いβシート
を形成している。

【０００５】アミロイド形成タンパク質が可溶性球状形態から、疾患関連フィブリルが示す
交差βコンフォメーションへの変換を生じる機序はまだ詳細には解明されていな
い。それにもかかわらず、アミロイド形成に関連する立体配座再構築は詳しく記
述されている（Ｊ．Ｗ．Ｋｅｌｌｙ（１９９７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ５，５９
５−６００）。トランスサイレチン、リゾチームおよびＩｇ軽鎖のアミロイド原
性変異体の一部に関する試験は、アミロイドの沈着を導く配座変化の過程を検討
している。少なくとも最後の３つのタンパク質についてのアミロイド形成は、タ
ンパク質の部分的に構造化された形態から始まると思われる。

【０００６】本発明は、これまで疾患に関連づけられてきた天然のアミロイドフィブリル、
ならびに種々の有用な適用を有すると考えられるタンパク質を含む、非天然のア
ミロイドフィブリルに関する。フィブリルは、たとえばプラスチックとしてある
いは製薬上活性なタンパク質の徐放性形態として、あるいは製薬上活性な化合物
の送達、電子工学あるいは触媒作用において使用しうる。第１の態様では、本発明は、実質的に他のタンパク質を含まないアミロイドフ
ィブリルを提供する。

【０００７】ひとつの実施態様では、フィブリルは、ｐＨ２．０でウシホスファチジルイノ
シトール３−キナーゼのｐ８５αサブユニットのＳＨ３ドメインから形成される
アミロイドフィブリル以外の他のタンパク質を実質的に含まないアミロイドフィ
ブリルである。

【０００８】さらなる実施態様では、フィブリルは、ウシホスファチジルイノシトール３−
キナーゼのｐ８５αサブユニットのＳＨ３ドメインから形成されるアミロイドフ
ィブリル以外の他のタンパク質を実質的に含まないアミロイドフィブリルである
。

【０００９】アミロイドフィブリルは天然あるいは非天然でありうる。本発明の天然のアミ
ロイドフィブリルは、たとえばアルツハイマー病に関連するＡβペプチド、伝染
性海綿状脳障害に関連するプリオンタンパク質、ＩＩ型糖尿病に関連する膵島関
連ポリペプチド、老年性全身性アミロイドーシスに関連するトランスサイレチン
およびその断片、家族性アミロイド多発ニューロパシーに関連するトランスサイ
レチン変異体およびその断片、あるいは全身性アミロイドーシスに関連する他の
変異体又はトランケートされた又はミスプロセシングされたタンパク質のフィブ
リルを含む。

【００１０】第二の態様では、本発明は、タンパク質を含む非天然のアミロイドフィブリル
を提供する。

【００１１】ひとつの実施態様では、フィブリルは、ｐＨ２．０でウシホスファチジルイノ
シトール３−キナーゼのｐ８５αサブユニットのＳＨ３ドメインから形成される
アミロイドフィブリル以外の他のタンパク質を含む、非天然のアミロイドフィブ
リルである。

【００１２】さらなる実施態様では、フィブリルは、ウシホスファチジルイノシトール３−
キナーゼのｐ８５αサブユニットのＳＨ３ドメインから形成されるアミロイドフ
ィブリル以外のタンパク質を含む、非天然のアミロイドフィブリルである。

【００１３】もうひとつの実施態様では、フィブリルは、ウシホスファチジルイノシトール
３−キナーゼのｐ８５αサブユニットのＳＨ３ドメインと、ウシホスファチジル
イノシトール３−キナーゼのｐ８５αサブユニットのＳＨ３ドメインの誘導体又
はアミノ酸変異体、ヒト筋肉アシルホスファターゼ又はその誘導体又はアミノ酸
変異体、ウシインスリン又はその誘導体又はアミノ酸変異体、ＣｓｐＢ（枯草菌
、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｕｂｔｉｌｉｓの主要低温ショックタンパク質）の最
初の２本（ＣｓｐＢ−１）、最初の３本（ＣｓｐＢ−２）又は最後の２本（Ｃｓ
ｐＢ−３）のβ鎖に対応するタンパク質又はその誘導体又はアミノ酸変異体、な
らびに野生型ヒトカルボキシペプチダーゼＡ２（ＷＴ−ＡＤＡ２ｈ）の活性化ド
メイン又はその誘導体又はアミノ酸変異体から選択される少なくとも１個のタン
パク質を含む、非天然のアミロイドフィブリルである。

【００１４】さらなる実施態様では、フィブリルは、ウシホスファチジルイノシトール３−
キナーゼのｐ８５αサブユニットのＳＨ３ドメインの誘導体又はアミノ酸変異体
、ヒト筋肉アシルホスファターゼ又はその誘導体又はアミノ酸変異体、ウシイン
スリン又はその誘導体又はアミノ酸変異体、ＣｓｐＢ（枯草菌、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓｓｔｕｂｔｉｌｉｓの主要低温ショックタンパク質）の最初の２本（Ｃｓｐ
Ｂ−１）、最初の３本（ＣｓｐＢ−２）又は最後の２本（ＣｓｐＢ−３）のβ鎖
に対応するタンパク質又はその誘導体又はアミノ酸変異体、あるいは野生型ヒト
カルボキシペプチダーゼＡ２（ＷＴ−ＡＤＡ２ｈ）の活性化ドメイン又はその誘
導体又はアミノ酸変異体を含む、非天然のフィブリルである。

【００１５】本発明のフィブリルは、非天然のタンパク質を含みうる。タンパク質は、たと
えばグリコシル化されたタンパク質あるいは修飾アミノ酸残基を含むタンパク質
のような化学修飾されたタンパク質、製薬上活性な化合物、金属、あるいは１又
はそれ以上の反応物に結合することができるチオール基のような官能基でありう
る。タンパク質は、たとえばウシホスファチジルイノシトール３−キナーゼのｐ
８５αサブユニットのＳＨ３ドメイン（ＰＩ３−ＳＨ３）の誘導体又はアミノ酸
変異体、ヒト筋肉アシルホスファターゼ、ウシインスリン、ＣｓｐＢ（枯草菌、
Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｕｂｔｉｌｉｓの主要低温ショックタンパク質）の最初
の２本（ＣｓｐＢ−１）、最初の３本（ＣｓｐＢ−２）又は最後の２本（Ｃｓｐ
Ｂ−３）のβ鎖に対応するタンパク質、あるいは野生型ヒトカルボキシペプチダ
ーゼＡ２（ＷＴ−ＡＤＡ２ｈ）の活性化ドメインである。

【００１６】本発明のフィブリルは、典型的には長く、直線で非分枝性である。フィブリル
の直径は一般に１から２０ｎｍ、好ましくは５から１５ｎｍ、より好ましくは７
から１２ｎｍである。フィブリルの直径は適当なタンパク質を選択することによ
って変化させうる。

【００１７】本発明のフィブリルの一部は、様々な適用において有用と考えられる中空コア
を含むと思われる。

【００１８】本発明のフィブリルは、タンパク質、典型的には１又はそれ以上の一本鎖ポリ
ペプチドを含む溶液を調製することによって得られ、かかる溶液はタンパク質の
核形成とフィブリルの成長が許容される時間にわたって起こる状態にあって、核
形成とフィブリルの成長が生じることを可能にする。

【００１９】本文中で使用する「核形成」は、フィブリルの形成を導く工程の開始を意味す
る。溶液からのフィブリルの形成は、連続的に、タンパク質の自己結合、凝集物
の形成、そしてフィブリルの成長を含む。この様に、好ましくは、開始溶液は正
に不安定な状態にある。核形成と成長はゆっくりとした工程であり、条件は通常
、フィブリルの形成が数時間あるいは数日間にわたって起こるように選択される
。核形成が急速に起こりすぎる場合、しばしばフィブリル形成に有害な作用を及
ぼすと考えられる。

【００２０】核形成は、下記で論じるように溶媒、濃度、塩、リガンド、温度およびｐＨの
変化を含めた様々な手段によって生じさせることができる。たとえば、好ましく
は４から７Ｍの濃度での尿素の添加によって核形成を生じさせうる。振とう、撹
拌、およびある種の表面、たとえばガラス又はプラスチック容器の表面への暴露
は局所的な変性を生じさせることができ、それによってフィブリル形成を開始さ
せうる。

【００２１】タンパク質を含む溶液は、核形成が起こりうるいかなる溶媒あるいは溶媒の混
合物も含みうる。たとえば、溶液はＤＭＳＯ、ジオキサンおよび／あるいは水を
含みうる。好ましくは溶液は水溶液である。

【００２２】核形成とフィブリルの成長を促進しうる１又はそれ以上の有機溶媒を溶液に組
み込むことができる。天然のタンパク質の場合、条件は、典型的には自己結合が
起こりうる条件を保持しながら、少なくとも部分的にタンパク質を変性させるよ
うに選択される。有機溶媒は一般に水混和性であり、好ましくはアルコールある
いはアセトニトリルのような脂肪族ニトリルである。アルコールは、典型的には
、たとえば１又はそれ以上のハロゲン原子、特にフッ素原子によって置換された
又は置換されていないＣ_１−６アルカノールである。例としては、メタノール、
エタノール、プロパノールあるいはブタノール、あるいはトリフルオロエタノー
ル又はヘキサフルオロイソプロパノールのようなフッ素化アルコールを含む。好
ましくはアルコールはトリフルオロエタノールである。アルコールの濃度は、典
型的には５から４０％ｖ／ｖ、好ましくは約２５％ｖ／ｖである。脂肪族ニトリ
ルの濃度は広い範囲内で変化しうるが、典型的には５から９５％ｖ／ｖである。

【００２３】溶液中のタンパク質の濃度はいかなる意味においても制限されないが、核形成
が起こりうることを絶対条件とする。一般には濃度は０．１ｍＭから１０ｍＭで
ある。好ましくはタンパク質の濃度は約１ｍＭである。

【００２４】溶液の温度は一般に０℃から１００℃である。好ましくは温度は０℃から７０
℃、より好ましくは０℃から４０℃、最も好ましくは５℃から３０℃である。

【００２５】溶液のｐＨは核形成に適したあらゆるｐＨである。好ましくは溶液は酸性であ
り、より好ましくは溶液のｐＨは０．５から６．５である。

【００２６】溶液に、たとえばあらかじめ形成したタンパク質の粒子を接種することができ
、これにより工程を大幅にスピードアップすることができる。

【００２７】本発明のフィブリルを、溶媒の遠心分離、濾過あるいは蒸発によって適切に単
離する。次にこのようにして得たフィブリルを洗浄し、乾燥することができる。

【００２８】本発明のフィブリルは、インスリン、カルシトニン、アンギオスタチンあるい
はフィブリノゲンのような製薬上活性なタンパク質から形成されうる。それ故当
該フィブリルは、ｉｎｖｉｖｏでのフィブリルの溶解度が低いことにより、そ
のようなタンパク質の徐放性形態として使用できる。

【００２９】あるいは、本発明のフィブリルは、製薬上活性な化合物の送達において使用し
うる。それらは、たとえば製薬上活性な化合物を組み込むように化学修飾された
タンパク質を含むことができ、あるいは製薬上活性な化合物が、たとえば水素結
合によって中空コアを持つフィブリルの内部に保持されていてもよい。本発明の
フィブリルを用いて送達しうる製薬上活性な化合物は、たとえばシスＰｔのよう
な抗癌剤、抗生物質、抗炎症薬および鎮痛薬を含む。

【００３０】本発明のフィブリルは、１又はそれ以上の反応物に結合することができる１又
はそれ以上の官能基を含みうる。官能基はフィブリルのタンパク質中に天然に生
じるか、あるいは化学修飾によって組み込むことができる。反応物は、中空コア
を持つフィブリルの内部あるいはフィブリルの外部に集めることができる。

【００３１】本発明のフィブリルは、たとえば糖尿病、血液凝固疾患、癌および心臓病の治
療において使用しうる。

【００３２】本発明のフィブリルは、銅、銀あるいは金のような金属を含むことができ、電
子工学において有用と考えられるワイヤを形成することができる。

【００３３】本適用のフィブリルはまたプラスチックとしても使用でき、あるいは構造物に
することもできる。

【００３４】下記のような図を参照しながら、単なる例として、本発明をさらに例示する：図１（ａ）−１（ｄ）はＳＨ３アミロイドの陰性染色電子顕微鏡画像を示した
ものであり、疾患関連フィブリルで認められるものと同様の一連の形態を示す。
図１（ｅ）は低温ＥＭ画像を示し、（ｆ）は３Ｄ再構築のために使用した、明ら
かならせんねじれを持つ（ｄ）で見られた形態の回折パターンを示す。層状の線
の間隔はほぼ６０ｎｍであり、二重らせんの非対称ユニットである。様々なリボ
ンと平滑なフィブリルがｐＨ２（ａ，ｂ）とｐＨ２．６６（ｃ）で形成された。
ｐＨ２で形成されるらせん線維は、（ｄ）の陰性染色および（ｅ）の低温ＥＭに
よって認められる。

【００３５】図２は、それぞれ５８および６１ｎｍのロングリピートについてのクラス平均
（ａ、ｅ）、３Ｄ再構築の再投影（ｂ、ｆ）、ＩＤ投影（ｃ、ｇ）および再投影
の回折パターン（ｄ，ｈ）を示す。（この図においてのみ、線維軸は水平である
）。〜３ｎｍの周期性を示す（ａ）の領域を拡大し、線で明示している。入力ク
ラス平均と３Ｄマップの間（ａとｂ、ｅとｆを比較する）、また単一フィブリル
と再投影マップの回折パターン（ｇ、ｈ）の間での良好な一致は、再構築手順の
有効性を裏付けている。線投影の比較（ｃ、ｇ）は、３Ｄマップが、線維を連続
らせんとして処理した場合よりも、２．７ｎｍのサブユニットリピートを再構築
手順において使用したときにより良好な入力画像に適合することを示している。

【００３６】図３は、６１ｎｍ（ａ、ｃ）と５８ｎｍ形態（ｂ、ｄ）の３Ｄ再構築と外形密
度断面図を示す。フィブリルは、ａとｃでは表面描写として、またｃとｄでは外
形密度横断面として示されている。２つの独立した再構築は非常に似通っており
、どちらも中空コアの周囲に巻きついた４つのプロトフィラメントと突出した縁
領域を示している。２．７ｎｍのサブユニットリピートは縁構造で最も著明であ
る。

【００３７】図４はフィブリル中のポリペプチドの折りたたみのモデリングを示す。図４（
ａ）は線維の横断面を示し、図４（ｂ）は１個のプロトフィラメントの側面図を
示す。ＰＩ３−キナーゼＳＨ３構造から誘導したβシートを、βサンドイッチ折
りたたみを開き、鎖を方向づけて強化したあと、マップに適合させた。ポリペプ
チド配列の残りの領域は不連続の点として示されており、多くの残基が存在する
がコンフォメーションは存在しないことを示唆している。（ａ）の図面の角度で
は、右上方および左下方のプロトフィラメントは図の水平面より下で内向きに屈
曲しており、適合性の度合が低くなっている。（ｂ）の側面図は、βシートが密
度に良好に適合することを示している。

【００３８】図５Ａは、線維形成過程の間に得られた筋肉アシルホスファターゼの遠紫外線
円偏光二色性スペクトルを示す。図に示した最初と最後のスペクトルは、それぞ
れ反応開始から３分および６００分後に得られた。スペクトルは、有意の量のα
らせんとβシート構造を含む２つのコンフォメーション間での緩慢な２つの状態
の遷移を示す。６００分後、スペクトルはその形を変えなかったが、大きなサイ
ズのタンパク質凝集物の蓄積の結果として、シグナルの漸進的な低下と陰性ピー
クのより高い波長へのシフトを生じた。図５Ｂは、筋肉アシルホスファターゼの
赤外線スペクトルのアミドＩ領域を示す。１６１３と１６８５ｃｍ−１での２つ
のピークは交差β構造を示唆する。

【００３９】図６Ａ−Ｃは、筋肉アシルホスファターゼ凝集物の形態発生を示す電子顕微鏡
写真である。図６Ａは、反応の開始から７２分後の顆粒状の様相の凝集物を示す
。図６Ｂは３２時間後の短いフィブリルを示す。図６Ｃは２週間後のアミロイド
フィブリルを示す。縮尺バーは１００ｎｍの距離を表す。図６Ｄは、インキュベ
ーションの２週間後に得た筋肉アシルホスファターゼ誘導の凝集物を含むサンプ
ルの光学顕微鏡写真を示す。矢印はアミロイドフィブリルの領域から生じる緑色
複屈折のブロットを示す。

【００４０】図７は、枯草菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓからの低温ショックタ
ンパク質ＣｓｐＢの配列と二次構造内容物を示す。数字は３個のペプチド：Ｃｓ
ｐＢ−１（１−２２）、ＣｓｐＢ−２（１−３５）およびＣｓｐＢ−３（３６−
６７）の最初と最後のアミノ酸を示す。

【００４１】図８は、ＣＤ分光法によるＣｓｐＢペプチドの希釈溶液の特性指摘を示す。ア
セトニトリル濃度を図に示したように変化させた。Ａ−Ｃ：０．４ｍｇ／ｍＬの
（ａ）ＣｓｐＢ−１、（ｂ）ＣｓｐＢ−２および（ｃ）ＣｓｐＢ−３を含む、２
．５−９７．５％の範囲のアセトニトリル濃度の溶液で記録したＣＤスペクトル
。Ｄ：アセトニトリル濃度に対してプロットした２１５ｎｍでの楕円性。丸：Ｃ
ｓｐＢ−１、四角：ＣｓｐＢ−２、三角：ＣｓｐＢ−３。

【００４２】図９は、ランダムコイルモデルから推定されたものと、（ａ）ＣｓｐＢ−１と
（ｂ）ＣｓｐＢ−３についてシミュレートした横断面に適合させることによりＣ
ＯＳＹスペクトルにおけるアンチフェーズスプリットから導いた残基特異的３−
Ｊ_ＮＨα結合定数の差を示す。これらのランダムコイル値との正の差はψψ空隙
のβ領域の個体群の上昇を示唆し、負の差はα領域の個体群の上昇を示唆する。

【００４３】図１０は、アセトニトリル濃度を低下したときにＣｓｐＢ−１によって形成さ
れるアミロイドフィブリルに関して得た証拠を示す。Ａ：コンゴーレッドアッセ
イのＶＩＳスペクトルの例。破線は１０％アセトニトリルにＣｓｐＢ−１のサン
プルを加える前、実線は添加の１時間後を表す。より高い波長へのシフトとより
大きな強度はフィブリルの形成を示唆する。Ｂ：陰性染色したフィブリルの電子
顕微鏡写真。縮尺バーは２００ｎｍの長さに相当する。Ｃ：５０％アセトニトリ
ル中５ｍｇ／ｍＬ溶液から乾燥したサンプルから得たＸ線線維回折パターン。Ｄ
：βシート構造の典型的な距離に対応するピークを割り当てた、ｃの回折パター
ンの横断面。

【００４４】図１１は、ＷＴ−ＡＤＡ２ｈ試料の電子顕微鏡分析を示す。ａについては１時
間、ｂ−ｄについては４８時間、９０℃でタンパク質サンプルをインキュベーシ
ョンすることによって調製したＷＴ−ＡＤＡ２ｈフィブリル。より後の試料ほど
より長く直線状のフィブリルが認められる。細い矢印は可能性のある交差部位を
示し、太い矢印はらせんリボン様のコンフォメーションを示す。

【００４５】下記の実施例は、図面を参照しながら本発明をさらに例示する。

【００４６】実施例実施例１顕微鏡検査および画像の分類ｐＨ２で数ヵ月間インキュベーションしたあと形成されるＰＩ３−キナーゼＳ
Ｈ３ドメインのねじれたフィブリルのサンプル（Ｊ．Ｉ．Ｇｕｉｊａｒｒｏら（
１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９５，４２２４−
４２２８）を穴のある炭素グリッドで確認し、低電子線量画像を３０，０００ｘ
のＯｘｆｏｒｄＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓクリオトランスファーステージを備え
たＪＯＥＬ１２００ＥＸ顕微鏡において１２０ｋＶ、１．３−１．５μｍアン
ダーフォーカスで記録した。フィルムを１０μｍの間隔でＬｅａｆｓｃａｎ４５
線形ＣＣＤスキャナー（ＩｌｆｏｒｄＬｔｄ．，Ｃｈｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を
用いてデジタル化し、プロセシングのため０．６７ｎｍ／ピクセルに補間した。
Ｐｈｏｅｌｉｘソフトウエアで線維を直線化することにより算定回折パターン（
図１ｆ）を得たが、軸方向分解能はピッチで大きく制限され、５４．５−６６ｎ
ｍの範囲であった。非線形補間による分解能損失を避けるため、デジタル化した
線維を個々のリピートに切断し、単一粒子として処理した。８９０に切断したリ
ピートを交互作用的に整列し、ＩｍａｇｉｃあるいはＳｐｉｄｅｒのいずれかを
用いて多変量解析によってクラスに分類した。これにより、天然に直線性で同じ
長さを持つリピートのクラスを同定することができた。

【００４７】３Ｄ再構築それぞれ５８と６１ｎｍリピートに対応する、９２および７７画像（データセ
ットの〜２０％）を含む画像間分散の低い２つのクラスの平均を３Ｄ再構築のた
めに選択した。切出した交差領域に関するクラス平均の相互相関によってリピー
トの長さを決定した。平方根増幅濾過後クラス平均の軸方向１Ｄ投影においてサ
ブユニットが明瞭に認められた（図２ｃ、ｇ）。両方の場合にリピートは約２．
７ｎｍと測定され、使用した数値は５８および６１ｎｍリピートにおいて整数の
サブユニットを生じるように選択した（それぞれ２１および２２サブユニット）
。３Ｄ再構築は、連続らせんあるいは２７ｎｍサブユニットリピートのいずれか
と仮定して、後方向投影によって算定した。プロトフィラメントの詰込みおよび
密度横断面の全体的特徴は、サブユニットリピートの負荷によって影響されなか
ったが、再投影画像の外形投影（図２ｃ、ｇ）と回折パターン（図２ｄ、ｈ）は
、２７ｎｍリピートを負荷したとき入力データとより良好に一致した。再投影し
たらせんの回折パターンは、線形化した線維からの最初のものと極めて良好な一
致を生じ、赤道（放射）方向の２２ｎｍ分解能に対して強い強度を示した（図１
ｆ）。フーリエ殻相関および２つのマップの横断面間の位相残余による分解能試
験（図３ｃ、ｄ）は２．５ｎｍへの一致を示すが、各々のマップについて赤道方
向で２．２ｎｍへの一致の信頼しうる情報がある。絶対的な利き手はこの方法に
よっては測定されず、恣意的である。相互相関および後方向投影に基づくらせん
障害の相関については他の手順を使用した。３ＤマップはＡＶＳ（Ａｄｖａｎｃ
ｅｄＶｉｓｕａｌｉｓａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ）で検討し、βシートの適合
は０で実施した。

【００４８】ウシＰＩ３キナーゼのｐ８５αサブユニットの８４残基ＳＨ３ドメインの天然
の折りたたみは、βサンドイッチに配置された５本のβ鎖を含む。低いｐＨでは
、タンパク質は部分的に開いて、アミロイドフィブリルへと集合する。図１ａ−
１ｄにおける画像は、一連のねじれて扁平なリボンと平滑でねじれた管状線維を
示す。構造分析に関しては、著明ならせんねじれを有する形態を選択した。低温
ＥＭ画像（図１ｅ）から算定した回折パターン（図１ｆ）は、二重らせん構造に
おけるらせん交差間の距離、すなわちらせんリピートの長さである、５４．５か
ら６６ｎｍの間隔の層を含む。

【００４９】回折データは、赤道方向（線維軸に直角）の２．２ｎｍ分解能への構造情報を
示すが、らせんピッチの変動（角度障害）により経線パターンは１５ｎｍ付近で
次第に消失する。角度障害のために失われる構造情報を埋め合わせるために、フ
ィブリルのデジタル化画像を個々のらせんリピートに分割した。これらのリピー
トを整列し、それらの長さに従ってクラスに分類した。２８および６１ｎｍのリ
ピートのクラス平均を、これら２つのリピートから算定した３Ｄマップの再投影
（２ｂ、ｆ）およびそれらの回折パターン（２ｄ、ｈ）と共に図２ａ、ｅに示し
ている。クラス平均において（図２ａ、拡大）、また時として生の画像において
（示していない）サブユニットリピートが見える。クラス平均の２．７±０．３
ｎｍ投影のサブユニット周期性を測定した（図２ｃ、ｇ）。

【００５０】５８と６１ｎｍリピートから誘導した２つの独立した３Ｄマップは同じ特徴を
明らかにしている（図３）。表面図と横断面は、中空コアの周囲に巻きついた２
対の細いプロトフィラメントを示す。より低い密度の領域は、フィブリルに特徴
的なねじれた外観を与える拡大した縁を形成している。プロトフィラメントは約
４ｎｍの部分で、厚さ２ｎｍであり（図３ｃ、ｄ）、最小直径が３ｎｍである天
然のＳＨ３構造を収容するには薄すぎる。ＳＨ３アミロイドのＸ線線維回折は、
それぞれ線維間の距離とシート間の距離を規定する０．４７ｎｍの経線および０
．９４ｎｍの赤道リピートを有する交差β構造の配列されたコアを示唆する。２
ｎｍの幅は２つのβシートにのみ適合することができ、それらは、すべての鎖を
線維軸に対して直角にするために天然の折りたたみにおけるものとは異なるよう
に方向づけられていなければならない。β鎖間のねじれはまた、プロトフィラメ
ントの狭い寸法とラインピッチによって大きく制限され、２°未満の鎖間角度を
有する扁平なシートを生じる。

【００５１】ＳＨ３がＥＭ密度に適合するように再構成されたモデルが図４に示されている
。残りの短いループと長いループは正しいサイズ範囲であり、隣接するプロトフ
ィラメント間の結び付きを提供し、構造の突出した縁において散漫な密度を生じ
させる。線維がサブフィブリルに分割するのが見られるという所見と一致して、
個々のポリペプチド鎖は１対のプロトフィラメントの各成員にβ鎖を寄与するこ
とができる。軸方向のリピートはβ鎖に対応するので、これがドメイン交換機序
と同様の再配列によって天然の折りたたみの２本鎖および３本鎖シートに関連す
る可能性がある。その際には、非共有結合相互作用が隣接するサブフィブリルを
二重らせん構造に組み立てる結合を提供するであろう。

【００５２】プロトフィラメントが有効に連続するβシートである、ここで決定した構造は
、鎖の長さおよび成分タンパク質の天然のコンフォメーションにかかわりなく、
すべてのアミロイド線維についての基本的モデルを提供しうる。実際に、Ａβ（
１−４０）フィブリルの陰性染色ＥＭ、原子力顕微鏡および線維回折は、２つの
サブフィブリルと３−５プロトフィラメントに関して非常に類似した形態を示唆
する。ｅｘｖｉｖｏでのトランスサイレチンフィブリルのＥＭ試験は、これら
が直径５から６ｎｍの４つのプロトフィラメントから成ることを示唆している。
トランスサイレチンプロトフィラメントコアは、Ｘ線線維回折データに基づき、
隣接する鎖間で１５°のねじれを有する４つのβシートとしてモデリングされた
。しかしながら、ここで示した２つのシートプロトフィラメントモデルは、より
厚いプロトフィラメントについてのより大きな数のシートに拡大することができ
るであろう。現在のところ、より大きなプロトフィラメント型においてねじれた
βシートと扁平なβシートを識別する証拠は存在しないが、マップはＳＨ３プロ
トフィラメントについてのねじれたシート立体配置とは一致しない。それらは２
ｎｍの厚さしかなく、非常に小さな全体的ねじれを有しているからである。扁平
なねじれのないβシートはタンパク質構造データベースでは異例であるが、アル
カリプロテアーゼのβらせんの一部はそのような構造を持つ。

【００５３】低温ＥＭ検査は、ポリペプチド鎖がどのようにしてアミロイドフィブリルへと
集合するかについての３Ｄ情報を提供する。フィブリルへの重合は、天然タンパ
ク質が少なくとも部分的にほぐれる必要があると思われ、天然の折りたたみがβ
シートを含むタンパク質に限定されないと思われる。実際に、タンパク質の天然
シートからのフィブリルの形成は、しばしばらせん構造からシート構造への変換
に結びついている。天然の折りたたみが主としてβ構造であるＳＨ３ドメインの
場合であっても、フィブリルの構造は、これが天然タンパク質のものに比例して
実質的に再配列されなければならないことを示唆している。

【００５４】実施例２実施例２（ｉ）筋肉アシルホスファターゼを、前述のように（Ａ．モデスティ（Ｍｏｄｅｓｔ
ｉ）ら（１９９５）ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓＰｕｒｉｆ．６，７９９
）精製し、２５％ｖ／ｖトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）酢酸緩衝液（ｐＨ５
．５）中０．３７５ｍｇ／ｍｌ（３４μＭ）の濃度で一定速度で撹拌しながら２
５℃でインキュベートした。一定時間間隔で少量を取り出し、電子顕微鏡分析お
よび分光分析を行った。円偏光二色性スペクトルは、ＪａｓｃｏＪ−７２０分
光偏光計と光路長１ｍｍのキュベットによって直接測定した。電子顕微鏡写真は
、ＪＥＭ１０１０透過型電子顕微鏡を励起電圧８０ｋＶで使用して撮影した。
３μｌのタンパク質溶液試料をホルムバール（Ｆｏｒｍｖａｒ）と炭素をコーテ
ィングしたグリッド上に配置して５分間乾燥させた。次に試料を、１％リンタン
グステン酸溶液３μｌで染色し、２５〜１００ｋの倍率で観察した。

【００５５】実施例２（ｉｉ）赤外スペクトルを、光路長５０μｍのＢａＦ_２ウインドウを使用して測定した
。

【００５６】実施例２（ｉｉｉ）チオフラビンＴ分析およびコンゴレッド分析を、それぞれル・バイン（Ｌｅ
Ｖｉｎｅ）ＩＩＩ（Ｈ，ＬｅＶｉｎｅＩＩＩ（１９９５）Ａｍｙｌｏｉｄ：
Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２，１）およびクランク（Ｋｌ
ｕｎｋ）（Ｗ．Ｅ．Ｋｌｕｎｋら（１９８９）Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔ
ｏｃｈｅｍ，３７，１２９３）に従って実施した。コンゴレッド複屈折実験では
、少量のタンパク質をスライドガラス上で風乾した。得られた薄膜を、１％水酸
化ナトリウムでｐＨ１０．０に調節したコンゴレッドと塩化ナトリウムの飽和溶
液で染色した。染色したスライドを交差する偏光子の間で光学顕微鏡によって調
べた。

【００５７】アミロイドがタンパク質の未変性で機能的な構造からアミロイドが直接生じる
のではなく、未変性タンパク質の構造とはあまり類似しておらず、ある量の残基
構造を含む変性した構造と同定することができるアミロイド形成的前駆物質から
生じるという証拠が増えてきている。この構造はアミロイド形成的中間体と呼ば
れることが多い。筋肉アシルホスファターゼは、生理学的条件下で非常にはっき
りと折り畳まれるタンパク質であり、その安定性はこの大きさのタンパク質の平
均的な値に近い。トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）を使用した試験から、筋肉
アシルホスファターゼは２０〜２２％ｖ／ｖを超えるＴＦＥ濃度で変性すること
が分かった。筋肉アシルホスファターゼのＴＦＥによる変性では、タンパク質の
未変性時のαらせん構造を維持することができ、同時に疎水性コアが実質的に破
壊され非天然αらせん構造が形成される。さらにＴＦＥの添加によって、さらな
るαらせん構造が形成され、より低いアルコール濃度では存在すると推定される
疎水性相互作用が不安定化する。従って、未変性タンパク質が実質的に存在しな
い最低アルコール濃度である２５％ｖ／ｖのＴＦＥを含有する水溶液を、フィブ
リル形成のために選択した。

【００５８】混合後に起こる一連の事象は、遠紫外円偏光二色性（ＣＤ）、トリプトファン
固有蛍光、コンゴレッドおよびチオフラビンＴ結合、電子顕微鏡、ならびにコン
ゴレッド複屈折などの種々の技術によって調べることができる。秒単位のタイム
スケールで起こるタンパク質の急速な変性の後で、遠紫外ＣＤ分析より２〜３時
間以内に完了する緩やかな転移が存在し、αらせん構造の多い構造からβシート
構造の含有率が高い別の構造に転移することが分かった（図５Ａ）。遠紫外ＣＤ
スペクトルは、この期間の規則的な時間間隔で測定した。第１のＣＤスペクトル
は、αらせん構造の多い構造に典型的なもので、２０８ｎｍと２２２ｎｍが中心
となる２つの負のピークを有する。このスペクトルが、２１６ｎｍ付近の１つの
負のピークを有するβシートスペクトルへと徐々に変化する（図５Ａ）。２１０
ｎｍと２２５ｎｍで円二色性が等しい２つの点が存在することは、このようなα
／β遷移が２段階過程からなることを示している。タンパク質凝集体内に形成さ
れる分子間水素結合によるこのようなβシート構造は、赤外スペクトルのアミド
領域の１６８５ｃｍ^−１と１６１３ｃｍ^−１の２つのバンド（図５Ａ）と、凝集
過程のこの段階で回収した試料の粒子状外観のタンパク質凝集体が電子顕微鏡写
真で確認できる（図６Ａ）ことによって示される。

【００５９】約３２時間後、短いフィラメントの存在が電子顕微鏡写真から確認でき、これ
は線維状タンパク質凝集体量がかなり増加したことを示している。２週間後、線
維状物質はより明確になった。電子顕微鏡写真で観察されるフィブリルは長く分
岐がなく幅が８．５ｎｍであるのに対し、非常に短いフィラメントまたは粒子状
外観の他のタンパク質凝集体はもはや存在しなかった。一連の光学的分析を行っ
て、この線維状物質のアミロイドの性質をさらに調べた。チオフラビンＴ染料の
４８２ｎｍにおける蛍光強度（励起４４０ｎｍ）の３倍の増加が、アミロイドに
よるものと考えられるタンパク質凝集体の添加の結果観察された。さらに、タン
パク質凝集体によってコンゴレッド染料の最大吸光の赤方偏移が起こった。凝集
体とコンゴレッド染料の両方を含むスペクトルから、凝集体単独およびコンゴレ
ッド染料単独のスペクトルを引くと、５４０ｎｍで最大強度となるスペクトルが
得られる。これら２つの知見も、アミロイドフィブリルの存在を示している。最
後に、筋肉アシルホスファターゼ由来フィブリルを含む試料へコンゴレッドを添
加することによって、交差偏光下で特徴的な緑色複屈折が得られる（図６Ｄ）。
緑色複屈折はアミロイドフィブリルの存在に対して非常に特徴的である。要約す
ると、筋肉アシルホスファターゼは、アミロイドフィブリルの存在を確認するた
めのすべての診断テストで陽性の応答を示した。

【００６０】最近、リン脂質などの両親媒性化合物が、フィブリルの伸長を促進することが
示唆されている。ＴＦＥなどのフルオロアルコール類によるアミロイドフィブリ
ルの形成は、生体系に通常存在するこのような両親媒性化合物がアミロイドフィ
ブリルのインビボにおける増殖の媒体として機能しうるというこの提言を支持し
ている。

【００６１】２０％未満の濃度または３５％を超える濃度のＴＦＥではフィブリル形成が起
こらない。これは、低ＴＦＥ濃度におけるタンパク質の未変性構造の存在、また
は高ＴＦＥ濃度におけるαらせん構造が多すぎる変性状態の存在によって、フィ
ブリル形成が妨害されるためと考えられる。これらはアミロイド形成的前駆物質
の濃度を減少させることができ、そのためフィブリル形成過程の動力学的トラッ
プとして作用しうる。非常に高濃度の場合もフィブリル形成過程の障害となりう
る。３ｍｇ／ｍｌを超える濃度でインキュベートすると、筋肉アシルホスファタ
ーゼによってゲル状沈殿物が急速かつ不可逆に形成され、これは非晶質タンパク
質凝集体として電子顕微鏡で確認された。結晶形成と同様にアミロイド形成は、
タンパク質分子が自己集合して規則的構造を形成する過程である。高タンパク質
濃度は、分子の集中に好都合となり、任意の凝集過程を促進しうる。しかし、こ
のような条件下では、規則的で反復性の構造を形成するためには時間が十分では
ない。

【００６２】実施例３ペプチド合成ペプチドは、α−アミノ基の保護のために塩基不安定性の９−フルオレニルメ
トキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）を使用してアプライド・バイオシステムズ（Ａｐ
ｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（フォスターシティ（ＦｏｓｔｅｒＣｉ
ｔｙ）、カリフォルニア）４３０Ａ自動ペプチド合成装置で合成した。側鎖の官
能基は、ｔ−Ｂｕ基（Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ）、トリチル基（Ａｓｎ
、Ｇｌｎ）またはＰｍｃ基（Ａｒｇ）によって保護した。合成および精製は公知
の方法によって行った。ペプチドの同定および純度はＥＳＩ−ＭＳによって確認
した。ＣｓｐＢ−１、ＣｓｐＢ−２、およびＣｓｐＢ−３の質量測定の結果は、
それぞれ２，５３１．１、３，９７６．６、および３，４４９．５ｇ／ｍｏｌで
あった（配列から予測される質量は：２，５３１．９、３，９７６．６、３，４
４８．７である）。

【００６３】試料調製３種類のペプチドはいずれも、まず５０％アセトニトリルｐＨ４．０（ギ酸で
調整、緩衝液なし）に溶解し、続いて所望のペプチド濃度およびアセトニトリル
濃度まで希釈することによって最適の溶解性が得られることが分かった。

【００６４】光学分光法ＣＤスペクトルは、光路長１ｍｍの石英キュベットを使用したＪａｓｃｏＪ
７２０分光偏光計で測定し、１９５〜２５０ｎｍを１ｎｍ間隔で測定した。慣例
的にＣＤ試料は、５０％のアセトニトリルを含有するペプチドストック溶液を希
釈してから３０分後に測定した。動力学的試験から、この時間の後、所与の比較
的低濃度（０．４ｍｇ／ｍｌ）のＣＤ試料は、分単位のタイムスケールで時間に
依存する影響は認められないことが確認された。

【００６５】 βシート含有率の計算は、１残基当りで規格化した２１５ｎｍでの楕円率を使
用して行った（単位：ｄｅｇ・ｃｍ^２／ｄｍｏｌ）。この実験において観察され
た最高値（−９，２６０ｄｅｇ・ｃｍ^２／ｄｍｏｌ）は１００％β構造に対応し
、他の研究者による値（２１６ｎｍにおいて−９，２１０ｄｅｇ・ｃｍ^２／ｄｍ
ｏｌ）とよく合っている。

【００６６】フィブリル形成のコンゴレッド結合分析の場合、分析緩衝液（５ｍＭリン酸緩
衝液ｐＨ７．４、０．１５ｍＭＮａＣｌ）中に染料を１０μＭ含む溶液の吸収ス
ペクトルを、ペプチド溶液の添加前と後に、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ）（フォスターシティ、カリフォルニア）Ｌａｍｂｄａ１６分光計
で４００〜７００ｎｍの範囲で測定した。通常、ペプチド試料１０μｌを全体積
１．０ｍｌに使用した。

【００６７】ＮＭＲ分光分析すべてのＮＭＲスペクトルは、ＯｘｆｏｒｄＣｅｎｔｒｅｆｏｒＭｏｌ
ｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓの自作のＮＭＲ分光計を使用して５００ＭＨｚ
または６００ＭＨｚにおける^１Ｈ周波数を測定した。１次元（１Ｄ）スペクトル
は、通常８Ｋの複合データ点（ｃｏｍｐｌｅｘｄａｔａｐｏｉｎｔ）を含む
。２次元（２Ｄ）測定では２Ｋの複合データ点が、ｔ_２ディメンションと、ｔ_１における直交検出の時間比例相増分（ＴＰＰＩ）を使用する位相感受性モードで
得た。拡散定数は、８Ｋ複合点のパルスフィールドグラジエント測定から求めた
。すべての測定で、８，０００Ｈｚのスペクトル幅を使用した。共鳴の割り当て
のため、それぞれ３２〜１２８スキャンの５１２〜８００のｔ_１増分を含む、Ｄ
ＱＦ−ＣＯＳＹ、ＴＯＳＣＹ、ＲＯＥＳＹ、およびＮＯＥＳＹスペクトルを測定
した。水のシグナルは、１．２ｓの緩和遅延の間の先行飽和、またはグラジエン
ト二重エコーのいずれかを使用することによって抑制した。ＴＯＣＳＹ測定の混
合時間は２３〜６０ｍｓを変動し、ＮＯＥＳＹおよびＲＯＥＳＹ測定の場合は１
００〜２６０ｍｓを変動した。Ｓｕｎワークステーション上のＦｅｌｉｘ２．３
（ＢＩＯＳＹＭ）を使用してデータを処理した。通常、データは一度０を入力し
、１Ｄの二重指数ウインドウ関数と、２Ｄスペクトルの各ディメンションで９０
°を超えてシフトしたｓｉｎｅｂｅｌｌｓｑｕａｒｅｄ関数を使用して処理し
た。すべてのスペクトルは、３．７４３ｐｐｍにおけるジオキサン内部標準を基
準とした。

【００６８】 ^３Ｊ_ＨＮα結合定数を求めるため、高解像度ＤＱＦ−ＣＯＳＹスペクトルを、
４Ｋ複合点を８Ｋにゼロ充填して測定し、ウインドウ関数ＧＭ３．７５および
ＴＭ１６４０９６４０９６を適用した。次に、Ｆｅｌｉｘ２．３プログラ
ムで実施される手順を使用して、クロスピークをＦ２ディメンションに沿った模
擬逆位相断面と一致させた。

【００６９】一連の１Ｄスペクトル、溶液ＮＭＲによって観察されるペプチドの割合を評価
するために使用した。これらの１Ｄスペクトルはすべて、同種の５００ＭＨｚＮ
ＭＲ分光計による連続した測定における７，０００スキャンおよび２５６スキャ
ンのゲインから求めた。トリプトファン溶液の濃度は、２８０ｎｍの吸光度から
計算した。トリプトファン溶液およびペプチド溶液のこれらの１Ｄスペクトルの
インドール共鳴の積分値を、ペプチド溶液の濃度の推定に使用した。

【００７０】電子顕微鏡検査フィブリル形成およびその形態を透過型電子顕微鏡（ＥＭ）で観察した。ペプ
チド試料をホルムバールと炭素をコーティングしたグリッド上で乾燥させ、１％
リンタングステン酸（ＰＴＡ）で陰性染色した。ＪＥＯＬＪＥＭ−１０１０電
子顕微鏡を使用して励起電圧８０ｋＶでグリッドを観察した。

【００７１】光学顕微鏡検査ペプチド試料中のアミロイドフィブリルの存在を確認するために、コンゴレッ
ド染色したフィブリルをスライドガラス上で乾燥させ、そのプレパラートを交差
偏光子を使用した双眼顕微鏡で観察した。黄緑色の複屈折が交差β構造の存在を
示す。

【００７２】Ｘ線線維回折１０μｌのペプチド溶液の液滴を、蝋で封をした２本の毛細管の両端間に懸濁
させた。通常の手順では約１日のタイムスケールで溶媒を蒸発させることを含む
が、試料中にアセトニトリルが存在するため約１時間で液滴が蒸発した。毛細管
の両端に付着して２本の細い針の形態で残留する固体の回折パターンを、１８０
ｍｍ撮像板（ＭＡＲＲｅｓｅａｒｃｈ，ハンブルク（Ｈａｍｂｕｒｇ）、ドイ
ツ）を取付けたＣｕＫα回転陽極を使用して得た。得られた回折パターンをＭａ
ｒ−Ｖｉｅｗソフトフェア（ＭＡＲＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用して解析した。

【００７３】結果Ｘ線結晶学およびＮＭＲによってＣｓｐＢは、Ｓ１ドメインと相同の単純な全
βシート配置を有することが分かった。Ｓ１および相同Ｅｓｃｈｅｎｃｈｉａ
ｃｏｉｌ低温ショックタンパク質ＣｓｐＡと同様に、Ｂａｃｉｌｌｕｓタンパク
質は１本鎖ＲＮＡと結合することが示され、低温で不要な二次構造が形成される
ことでｍＲＮＡを停止させる点においてＲＭＡシャペロンとして作用すると考え
られる。ＣｓｐＢは、非常に迅速に折り畳まれ、比較的接触順序が少ない（すな
わち、線状配列において互いに接近する残基間で接触する割合が高い）という点
で顕著である。すべてのβシート形成相互作用は配列で隣接する鎖の間で生じる
ため、二次構造形成はリボソーム上での合成の間、および本明細書で研究される
短いペプチドフラグメントの間の両方で行われる。

【００７４】このタンパク質は病的アミロイドフィブリルの少なくとも１８の公知の真核性
成分のいずれとも関係がないが、３つすべてのＣｓｐＢペプチドはフィブリルと
して沈着し、高度に構造が壊れたモノマーが溶液中で優勢な種となる種々の条件
の哺乳動物アミロイドと非常によく似た特性を有する。モノマー性ポリペプチド
の初期の二次構造内容がアミロイド形成の主決定要因とはならないこともあり得
る。最も重要な条件は、水素結合または疎水性接触などの相互作用がなお存在し
うる条件下で、規則的三次構造が失われることであろう。この条件は、無傷のタ
ンパク質の少なくとも部分的な変性を誘発する条件、または協同的球状構造を形
成することができないより短いペプチドにポリペプチド鎖を切断することによっ
て満たしうる。

【００７５】小さなβサンドイッチ構造内に配列する５つのβストランドからなるＢ．ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ低温ショックタンパク質ＣｓｐＢの既知の構造に基づくと、ペプチ
ドＣｓｐＢ−１（残基１〜２２）、ＣｓｐＢ−２（１〜３５）、およびＣｓｐＢ
−３（３６〜６７）は、最初の２つ、最初の３つ、および最後の２つのＣｓｐＢ
タンパク質βストランドにそれぞれ対応するように意図されている（図７参照）
。ＣｓｐＢ−１およびＣｓｐＢ−２はＮ−末端から成長する新生タンパク質を表
すが、ＣｓｐＢ−２およびＣｓｐＢ−３はβサンドイッチの半分ずつを表し、元
のタンパク質の配列全体をカバーしている。

【００７６】低温ショックタンパク質ＢはｐＨ値が６．０〜７．２の水性緩衝液に、タンパ
ク質濃度が最低１．３ｍＭ（１０ｍｇ／ｍｌ）で溶解するが、このことはそのＮ
ＭＲ構造がこれらの条件で得られることで実証される。対照的に、３種類のペプ
チドのいずれも同様の条件下でほとんど溶解せず、例えばＣｓｐＢ−２は約０．
２ｍｇ／ｍｌしか溶解しない。ペプチドを可溶化するため、アセトニトリルをｐ
Ｈ４．０（ギ酸、緩衝液なし）において共溶媒として使用した。３種類のペプチ
ドのすべてはこれらの条件下で１０ｍｇ／ｍｌ以上溶解するが、アセトニトリル
濃度が５０％から上下に大きく外れた値に変化した場合に、これらの溶解性は劇
的に低下する。例えば、５０％アセトニトリル中に２０ｍｇ／ｍｌのペプチドを
含むストック溶液を４倍の体積の水またはアセトニトリルのいずれかで希釈して
ＮＭＲ試料を調製しようとすると、ペプチドが急速に沈殿する結果となった。ペ
プチド濃度０．４、２、および１０ｍｇ／ｍｌ、ならびにアセトニトリル濃度１
０、５０、および９０％を含むペプチド濃度および溶媒組成の組み合わせの標準
セットを使用した。

【００７７】３種類のペプチドのＮＭＲ分析は、最も溶解性の高い（５０％アセトニトリル
ｐＨ４．０中に１０ｍｇ／ｍｌのペプチド）条件下で行った。ＣＤ測定はアセト
ニトリル濃度が５〜９５％の範囲で行った。ＣＤ分光法ではより低いペプチド濃
度（０．４ｍｇ／ｍｌ）が必要なので、比較的溶解性の低い（すなわち、アセト
ニトリル濃度がより高いおよびより低い）条件下でもスペクトルを得ることがで
きた。溶媒の変化によって生成した不溶性物質は、アミロイドフィブリルの存在
を調べる特殊な試験などの種々の技術によって分析した。

【００７８】ＣＤ測定ＣＤ分光法によって、特に比較的不溶性である条件およびフィブリル形成が開
始しうる条件で、３種類のペプチドは構造的性質が実質的に異なることが分かっ
た。溶解性状態（５０％アセトニトリル）では、ＣｓｐＢ−１は０．４ｍｇ／ｍ
ｌで大きく非構造化されるが（図８Ａおよび８Ｄ参照）、非常に高いペプチド濃
度でβシート構造が形成され、このことは０．１ｍｍ光路長セルを使用した別の
ＣＤ測定から分かる。アセトニトリル濃度を９０％まで増加させると、残基当り
の楕円率は−１，７３０ｄｅｇ・ｃｍ^２／ｄｍｏｌから−６，４８０ｄｅｇ・ｃ
ｍ^２／ｄｍｏｌまで増加し、最高アセトニトリル濃度においてβ構造が約７０％
となることを示している。

【００７９】ＣｓｐＢ−２（図８Ｂおよび８Ｄ）は、非常に高いおよび非常に低いアセトニ
トリル濃度でβシート構造が多く形成される（アセトニトリル２．５％でβシー
ト１００％、アセトニトリル９７．５％でβシート７１．５％）。中間の溶媒条
件ではあまり形成されない（アセトニトリルが１５〜７０％の範囲で平均残留楕
円率が約−３，４１０ｄｅｇ・ｃｍ^２／ｄｍｏｌであり、これはβシート含有率
約２０％を示している）。ＣｓｐＢ−３（図８Ｃおよび８Ｄ）は、アセトニトリ
ル濃度に依存して、非構造化状態が支配的、部分的にらせん、またはβシートが
多いという状態になりうるという、特に興味深い挙動を示す。ＣＤデータは、ア
セトニトリル濃度が５％から７５％に増加するとらせん含有率が徐々に増加する
ことを示しているが、アセトニトリル濃度が７５〜９５％の間でペプチドはβシ
ートが支配的となる。この後者の濃度で、２１５ｎＭにおけるこのペプチドの残
基当りの楕円率は−３，８３０ｄｅｇ・ｃｍ^２／ｄｍｏｌであり、βシート４１
％に対応する。

【００８０】低アセトニトリル濃度（１０％）では、ＣｓｐＢ−２はβシート構造を取るが
、他の２つのペプチドは非構造化状態が支配的である。しかし高アセトニトリル
濃度（９０％）では、すべてのペプチドである程度のβシート形成が見られ、２
つのＮ−末端ペプチドではランダムコイル特性も見られ、Ｃ−末端ペプチドでは
αらせん構造が見られる（図８）。アセトニトリルが５％から９５％まで徐々に
変化すると、ＣｓｐＢ−３は未構造化状態かららせん構造、さらにβシート構造
へと順次変化する。従って、一般により低い溶解性またはより高いアセトニトリ
ル濃度に向かって条件が変化すると、βシート含有率が増加する。このことは、
分子内ではなく分子間でβシートが形成されることを示している。モノマーの大
部分が非構造化状態（あるいはＣｓｐＢ−３の場合は部分的にらせん）であり、
すべての凝集体はβ構造を含むことをデータは示している。

【００８１】ＮＭＲ実験アセトニトリル５０％中のペプチド濃度１０ｍｇ／ｍｌで行ったＮＭＲ拡散測
定は、各ペプチドの単純拡散定数が折り畳まれていないモノマーに関して予測さ
れる流体力学的半径に近い値に対応していることを示している（表１参照）。

【００８２】

【表１】これは、試料は大部分がモノマーからなることを示している。任意の小さなオ
リゴマー（この方法で解像可能なタイムスケールよりも短いタイムスケール、す
なわち約１００ｍｓ未満で、配座の相互交換が起こる場合には、モノマーのシグ
ナルとともにこれらのオリゴマーのシグナルが現われる）は少数の集団としての
み存在しうる。しかし、スペクトル強度の較正は、スペクトル強度が含まれるペ
プチドの濃度で予測される値よりも低いことを意味する。このことはＣｓｐＢ−
１の場合に定量的に分析され、試料に存在する全ペプチド濃度の約２０％のみが
ＮＭＲスペクトルで検出可能であることが分かった。従って、残りは大きな可溶
性凝集体として存在し、その全体の回転時間が長すぎて解像可能なＮＭＲ源とは
ならない。

【００８３】３種類すべてのペプチドの詳細な構造的ＮＭＲ分析は、５０％のアセトニトリ
ルを含む溶液中２０℃および３５℃で行った。すべてのペプチドについてのアミ
ド共鳴の完全な割当ては、３５℃におけるＣＯＳＹおよびＴＯＣＳＹスペクトル
の分析により行った。どのペプチドもあらゆる測定可能な広範囲のＮＯＥまたは
ＲＯＥは示さなかった。これは任意の有意な持続的構造がないことを意味する。
従ってペプチドの構造的特徴は、化学シフトと結合定数をランダムコイルモデル
から予測される値と比較することによって推測した。ランダムコイルの化学シフ
トの値はよく報告されているが、アミドプロトンに関して得られた値は周知のよ
うに溶媒条件に依存する。従って、本発明者らはＣ_αプロトンの化学シフトのみ
をこの分析に使用した。これらは典型的なランダムコイル値とわずかのずれしか
ない（ほとんどは±０．１ｐｐｍであり、−０．２０〜＋０．１５ｐｐｍの間に
すべておさまる）。

【００８４】ＣｓｐＢ−１について測定した結合定数のほとんどは、ランダムコイルに予測
される値よりもわずかに大きい（図９Ａ）。これは、ＣｓｐＢ−１がランダムコ
イルに予測されるよりもφψ空間のβ領域の占有率がわずかに高いことを示して
いる。このことは残基５〜９および１７〜２０の領域において最も明白である（
図９Ａ）。これらの残基群の両方は、未変性タンパク質のβストランド領域内に
ある（２〜１０、１５〜２０）。ＣｓｐＢ−３の場合、結合定数測定の結果はラ
ンダムコイルの予測値よりも小さい値となり、ＣＤスペクトルで観察される少量
のらせん構造が、残基３８〜５３の間で局在しているらしいことを示唆している
（図９Ｂ）。この結果は、使用した数種類の二次構造予測法で明らかとなったこ
の領域におけるわずかならせん形成の傾向とも適合している。従って、Ｇｉｂｒ
ａｔ法、Ｌｅｖｉｎ法、ＤＰＭ法、およびＳＯＰＭＡ法では、位置３８〜４７の
残基の大部分の構造がらせんであると予測している（データは示していない）。
カルボキシ末端付近に形成されると予測される別のらせんは、ＮＭＲでは観測さ
れなかった。

【００８５】アミロイドフィブリル形成の証拠全３種のペプチドの濃縮溶液をアセトニトリル５０％から１０％または９０％
まで希釈（１０．０ｍｇ／ｍｌを最終濃度２．０ｍｇ／ｍｌに希釈）することに
よって作製した試料について、３つの異なる方法で分析を行い、アミロイドフィ
ブリルの存在を調べた。フィブリル形成のすべての他の研究にはＣｓｐＢ−を使
用した。ジアゾ染料コンゴレッドを使用する顕微鏡的結合分析（図１０Ａ）では
、アミロイドフィブリルに特徴的である波長の赤方偏移と強度増加が見られる。
透過型電子顕微鏡（図１０Ｂ）では、直径約１０ｎｍで最大長さ３００ｎｍの直
鎖および分岐フィブリルの密集した網目構造がアセトニトリル１０％まで希釈し
たＣｓｐＢ−１で観察された。他の実験条件および他のペプチドでは、より少な
いフィブリルが観察されたが、同様の形態が見られた。コンゴレッド染色したポ
リペプチドを交差偏光子を使用して光学顕微鏡観察を行うと（図示していない）
、アミロイドフィブリルに特徴的な緑色複屈折が観察された。

【００８６】アセトニトリル１０％および９０％で形成された３種類すべてのペプチドの凝
集状態を、これらの方法を使用して分析した。すべての種類の実験で、アセトニ
トリル１０％中のＣｓｐＢ−１の場合にアミロイドの存在が強く認められたが、
他の条件の一部ではより変動した結果が得られた。にもかかわらず、すべての条
件でアミロイドフィブリル形成を示す肯定的証拠が得られた（表２参照）。

【００８７】

【表２】アセトニトリル１０％中のＣｓｐＢ−１によって形成されるフィブリルについ
てさらなる検討を行った。フィブリル形成と共存可能な分子間βシート構造も、
ペプチドＣｓｐＢ−１のＦＴＩＲにより示された。Ｘ線線維回折でもアミロイド
フィブリルに特徴的な結果が得られた。後者の方法では、アセトニトリル５０％
中のＣｓｐＢ−１の試料を２つの毛細管の間で懸濁させた後に乾燥させた。アセ
トニトリルの揮発性がより高いため、溶剤組成が蒸発の間に変化し、実際の沈殿
過程中にアセトニトリルが約１０％になると予想される。この結果、細い針状の
沈殿物が得られ、アミロイドフィブリルに典型的である０．４７ｎｍおよび１．
０４ｎｍで最大回折が得られるＸ線回折パターンが示された（図１０Ｃおよび１
０Ｄ）。

【００８８】従って、すべてβ構造を有する小型細菌タンパク質に由来する３種類のペプチ
ドはアミロイドフィブリルを形成しうる。これらのフィブリルの形成は、より高
濃度または低濃度のアセトニトリルへの溶媒の移行による全く異なる出発状況で
起こりうる。通常、溶液は、大部分が非構造化状態であるモノマーに加えて、オ
リゴマーとβシート構造を多量に含む可溶性凝集体を含む。このことは、アミロ
イド形成は、多数のあらかじめ形成された二次構造要素が溶液のモノマー種に存
在することには依存しないが、凝集体およびアミロイドフィブリル自体が多量の
βシート構造を含むことを示している。より一般的には、β構造は異なる形態の
広範囲の凝集体によく見られる。このようなβ構造を有する凝集体を形成する能
力は、規則的アミロイドフィブリルへ後に転化するための重要な因子であると思
われる。

【００８９】実施例４ＷＴ−ＡＤＡ２ｈの発現および精製野生型ヒトカルボキシペプチダーゼＡ２の活性化部位（ＷＴ−ＡＤＡ２ｈ）を
前述のように発現させ精製した。この組み換えタンパク質をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ
−ＭＳで分析すると、配列から予想される分子量を有することが分かった。

【００９０】円偏光二色性５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）または２５ｍＭのグリシン（ｐＨ
３．０）中２０μＭ、８０μＭ、１６０μＭ、および２００μＭのタンパク質試
料のＣＤスペクトルを、ＪＡＳＣＯ−７１０分光偏光計を使用し、２７８Ｋ、２
９８Ｋ、および３６８Ｋにおいて、２．０ｍｍまたは０．２ｍｍ石英キュベット
中で測定した。測定値は５０ｎｍ／分で測定して３０スキャンにわたって平均化
した。２２２ｎｍまたは２１４ｎｍの楕円率を測定することによって、２０μＭ
タンパク質試料の熱誘発変性を、５０℃／時の加熱速度で２７８〜３６８Ｋの温
度範囲で調べた。

【００９１】沈降分析２５ｍＭのグリシンを含むｐＨ３．０の緩衝溶液中２０μＭおよび２００μＭ
のタンパク質試料について、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＸＬＡ分析用超遠心
機を３０００Ｇで使用して沈降実験を行った。５０℃／時の速度で５℃から９５
℃まで試料を加熱し、９５℃で１０分間維持してから沈降実験を行った。５０ｍ
Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中２００μＭのタンパク質試料を陰性対照
として使用した。

【００９２】チオフラビン−Ｔおよびコンゴレッド結合分析ＷＴ−ＡＤＡ２ｈ試料（２０〜５００μＭの範囲の濃度）を分析前に９０℃で
３０分間インキュベートした。１０ｍＭのリン酸カリウムおよび１５０ｍＭのＮ
ａＣｌ（ｐＨ７．０）から２．５ｍＭのチオフラビン−Ｔストック溶液を新しく
調製し、使用前に０．２μｍフィルターに通した。通常は１０μｌの試料を、６
５μＭのチオフラビン−Ｔを含む反応緩衝液（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１
５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で希釈した（最終体積１ｍｌ）。フィブリル
の分散を促進し、大きな凝集体を分裂させるために試料をピペットに吸い込み押
出す操作を数回繰り返した。データは、パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ
ｌｍｅｒ）ＬＳ５０Ｂルミネセンス分光計を、励起波長４４０ｎｍ（スリット
幅５ｎｍ）および発光波長４８２ｎｍ（スリット幅１０ｎｍ）で使用して収集し
た。熱平衡が達成されるようにするため、蛍光値は３〜５分後に測定した。大き
なフィブリル凝集体の存在による信号の振動を防止するため試料を連続的に撹拌
し、信号対雑音比を上昇させるために信号は６０秒で平均化した。コンゴレッド
結合分析は、クランク（Ｋｌｕｎｋ）らに従って行った。１０μｌの試料の一部
を、５μＭのコンゴレッドを含む１０ｍＭのリン酸カリウムおよび１５０ｍＭの
Ｎａｃｌ（ｐＨ７．０）で希釈した（最終体積１ｍｌ）。コンゴレッド溶液は使
用する直前に調製し、０．２μｍフィルターに通した。染料の吸収に関する信号
と信号に寄与する散乱を差し引くために、反応溶液中の試料の吸収スペクトルを
陰性対照（タンパク質試料を含まない染料、および染料を含まないタンパク質試
料）と共に測定した。

【００９３】プロテイナーゼ抵抗性２５ｍＭのグリシン（ｐＨ３．０）中にＷＴ−ＡＤＡ２ｈを２０μＭ含む試料
を４Ｍ尿素中で４時間インキュベートした後、尿素濃度１Ｍまで希釈し、プロテ
イナーゼを加えてインキュベートする前に透析を行った。同じ緩衝液中の試料を
、タンパク質分解の前に９５℃で１０分間インキュベートした。これらの試料を
、同じタンパク質を含む未処理試料とともに、２つの異なるＷＴ−ＡＤＡ２ｈ：
ペプシン比（１００：１および４００：１）のペプシンの存在下、それぞれ２０
℃で２時間、または０℃で１５分間消化させた。次に消化させた試料を、Ｖｙｄ
ａｃＣ４カラム（２１４ＴＰ５４、粒径５μｍ、空隙３００Å、１．０×２５
ｃｍ）を使用したＲＰ−ＨＰＬＣによってアセトニトリル１０％から５２％の直
線グラジエントで分析した。ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）９９４モデルにより
２１４ｎｍで検出を行った。

【００９４】フーリエ変換赤外分光法赤外スペクトルは、液体Ｎ_２で冷却されるＭＣＴ検出器を備えたバイオラド（
Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＦＴＳ１７５ＣＦＴ−ＩＲ分光計を使用し、Ｎ_２ガス連続
流をパージしながら測定した。５００μＭのＷＴ−ＡＤＡ２ｈ試料を^２Ｈ_２Ｏ、
グリシン２５ｍＭからｐ^２Ｈ３．０（電極の読取値を同位体効果に関して補正し
た）で調製し、９０℃で３０分間の試料のインキュベートの前後に、２５℃でス
ペクトルを測定した。タンパク質溶液を、１２μｍのマイラー（Ｍｙｌａｒ）ス
ペ−サーで分離された１組のＣａＦ_２ウインドウの間に配置した。各試料につい
て、スペクトル解像度２ｃｍ^−１で２５６のインターフェログラムを記録した。
タンパク質を含まない緩衝液について同一条件下でスペクトルを測定し、タンパ
ク質試料のスペクトルから差し引いた。アミドＩバンドスペクトルの二次導関数
から異なるスペクトル成分の波数を求めた。

【００９５】電子顕微鏡検査試料を、ホルムバールをコーティングしたニッケルグリッド（４００メッシュ
）に適用し、２％酢酸ウラニル（ｗ／ｖ）で陰性染色し、ＪＥＯＬＪＥＭ１０
１０透過型電子顕微鏡を８０ｋＶで操作して観察を行った。

【００９６】Ｘ線回折フィブリル懸濁液をマイクロコン（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ）−１００超遠心管（ア
ミコン（Ａｍｉｃｏｎ））を使用して洗浄し、Ｘ線測定に干渉しうる塩および緩
衝液を除去した。蝋を充填した２本の毛細管の間でＡＤＡ２ｈ−ＷＴフィブリル
を風乾し塩を除去して試料を調製した。延伸軸に沿ってフィブリルが配向しやす
いようにするため、乾燥中に毛細管をゆっくりと分離した。毛細管の一端から突
出するフィブリルの小さな軸を得た。試料をＸ線ビームに配列させ、１８０また
は３００ＭＡＲ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ撮像板（ＭＡＲＲｅｓｅａｒｃｈ、ハンブ
ルク、ドイツ）を備えたＣｕＫ_α回転陽極を使用し２０〜３０分間で回折像を撮
影した。画像はＩＰＤＩＳＰおよびＭａｒＶｉｅｗＳｏｆｔｗａｒｅを使用
して分析した。

【００９７】結果この実施例は、８１残基タンパク質である、野生型ヒトカルボキシペプチダー
ゼＡ２の活性化領域、ＷＴ−ＡＤＡ２ｈの研究に関する。この領域は、１つの４
本鎖βシートをはさむ２つのαらせんを有する。中性ｐＨにおいて、ある程度の
二次構造と未発達な疎水性コアを有する密集転移状態を経由する２つの状態で折
り畳まれることを発見した。

【００９８】ｐＨ７．０におけるＷＴ−ＡＤＡ２ｈの熱変性は、可逆的であることが分かっ
ており、２段階で転移が起こる。ｐＨ３．０では、ＷＴ−ＡＤＡ２ｈは非可逆の
変性転移（１０μＭ〜３ｍＭの範囲の濃度で）が起こる。９５℃のＣＤスペクト
ルおよび２５℃に冷却した後のＣＤスペクトルから、タンパク質が大規模なβシ
ート構造を有する構造に転化することが分かる。分析用遠心分析の結果は、試料
が高度に凝集していることを示している（試料の４０％はＳ_ｗ，２０が３５Ｓで
あり、これはＭ_ｒが１０^６Ｄａを超えることを意味し、平均１００分子を超える
タンパク質分子を含む凝集体に対応する）。ＷＴ−ＡＤＡ２ｈタンパク質の熱変
性によるαらせん構造からβシートへの転化はＦＴ−ＩＲ分光法によって確認さ
れる。加熱前では、アミドＩバンドはそれぞれ１６２２ｃｍ^−１と１６４９ｃｍ ^−１の２つの主成分を示し、それぞれβシートとαらせん構造に起因するもので
あり、未変性状態のタンパク質と一致している。試料を９０℃でインキュベート
した後では、元のバンドの代わりにそれぞれ１６１５^−１および１６８５ｃｍ⁻ ^１の２つの新しいバンドが現われる。このパターンは、βシート構造を有する凝
集体に通常関連するものである。１６１５ｃｍ^−１のバンドはβシートを示して
いるのに対し、１６８５ｃｍ^−１のバンドは逆平行分子鎖間の相互作用によるア
ミドＩバンドの分裂と関連している。加熱後のタンパク質は、コンゴレッドの吸
収スペクトルが４８６ｎｍから５００ｎｍにはっきりと移行し、同時に吸収率が
増加し、チオフラビン−Ｔ結合も示す（表３）。これらすべての性質は、アミロ
イド沈着物の形成の場合と一致している。

【００９９】

【表３】タンパク質の挙動は、ある範囲の濃度（４〜７Ｍ）の尿素の存在下でのインキ
ュベート後にも調べた。尿素７Ｍの場合、タンパク質のＣＤスペクトルは未変性
種が多いことを示している（２２２ｎｍで楕円率が減少）。７Ｍの尿素中のＷＴ
−ＡＤＡ２ｈ試料を尿素濃度１Ｍまで急速に希釈すると、タンパク質が未変性状
態に再度折り畳まれる。しかし、ＷＴ−ＡＤＡ２ｈタンパク質を４Ｍ尿素中で１
時間インキュベートし、１Ｍ尿素まで希釈して１時間インキュベートした場合は
、広範囲のβシート構造を示す異なるＣＤスペクトルが得られる。ＷＴ−ＡＤＡ
２ｈタンパク質は、凝集が検出された場合にはすべての試料についてペプシンに
よる消化に対する感受性が低下する（表４）。さらに、ＣＤおよびＦＴ−ＩＲよ
り確認されるβ構造への転移と、タンパク質分解に対する抵抗性の増加との間に
明確な相関が存在する。

【０１００】

【表４】凝集したＷＴタンパク質を電子顕微鏡で分析すると、長く、未分岐で、細く（
直径３０〜１００Å）明らかに非常に可撓性であるフィブリルの形跡が明らかに
見られる。これらは通常相互にからみあう構造の密な網目構造を形成する（図１
１ａ）。９０℃においてより長時間インキュベートした後に調製した試料は、よ
り長くより規則性の高いフィブリル（図１１ｂ〜ｄ）が特徴であり、不規則な間
隔でねじれるリボン様パターンがよりはっきりと確認される（図１１ｂ〜ｄ、矢
印参照）。高温においてインキュベートをより長く行うことによる構造の相違は
、フィブリルを形成するプロトフィラメントがさらにゆっくりと再組織化するた
めと説明することができる。経時によるこのようなフィブリル構造の発達は、い
くつかの他のタンパク質から生成したアミロイドフィブリルについては従来観察
されている。２０μＭの低濃度のタンパク質を含む溶液からは、フィブリルが凝
集体になるのが観察される。図１１ａと同様の性質を有するフィブリルは、化学
変性処理したＷＴ−ＡＤＡ２ｈ試料でも認められ、タンパク質分解に対する抵抗
性の出現と一致している。

【０１０１】ＷＴ−ＡＤＡ２ｈの異なる熱変性から得たフィブリルについても、線維Ｘ線回
折で特性決定を行った。これらは、４．７Å（フィブリル軸方向の分子鎖間距離
に対応）および９．３Å（フィブリル軸と直交する方向のβシート間の距離に対
応）の反射を有するアミロイドフィブリルに特徴的である明確な交差βＸ線回折
パターンを示す。ある程度の異方性が鋭い９．３Å反射で観察することができる
。９．３Åの異方性で鋭い反射と共に、別の弱い反射が３．１Åで観察すること
ができるがこれは調和振動で発生するものと思われる。第４の弱い反射が３．８
Åで観察されるが明確な異方性は見られない。この種の反射は、種々の物質源か
らのアミロイドフィブリルの研究において以前から観察されている。

【０１０２】従って、ＷＴ−ＡＤＡ２ｈは未変性時の折り畳み構造が不安定化した場合にア
ミロイドフィブリルの形態で凝集しうる、あらゆる公知の疾患と関連性のないタ
ンパク質のさらなる例となる。

【図面の簡単な説明】

【図１ａ】ＳＨ３アミロイドの陰性染色電子顕微鏡画像を示したものであり、疾患関連フ
ィブリルで認められるものと同様の一連の形態を示す。

【図１ｂ】ＳＨ３アミロイドの陰性染色電子顕微鏡画像を示したものであり、疾患関連フ
ィブリルで認められるものと同様の一連の形態を示す。

【図１ｃ】ＳＨ３アミロイドの陰性染色電子顕微鏡画像を示したものであり、疾患関連フ
ィブリルで認められるものと同様の一連の形態を示す。

【図１ｄ】ＳＨ３アミロイドの陰性染色電子顕微鏡画像を示したものであり、疾患関連フ
ィブリルで認められるものと同様の一連の形態を示す。

【図１ｅ】低温ＥＭ画像を示す。

【図１ｆ】３Ｄ再構築のために使用した、明らかならせんねじれを持つ図１ｄで見られた
形態の回折パターンを示す。

【図２ａ】５８および６１ｎｍのロングリピートについてのクラス平均を示す。

【図２ｂ】３Ｄ再構築の再投影を示す。

【図２ｃ】ＩＤ投影の回折パターンを示す。

【図２ｄ】再投影の回折パターンを示す。

【図２ｅ】５８および６１ｎｍのロングリピートについてのクラス平均を示す。

【図２ｆ】３Ｄ再構築の再投影を示す。

【図２ｇ】ＩＤ投影の回折パターンを示す。

【図２ｈ】再投影の回折パターンを示す。

【図３ａ】６１ｎｍ形態の３Ｄ再構築と外形密度断面図を示す。

【図３ｂ】５８ｎｍ形態の３Ｄ再構築と外形密度断面図を示す。

【図３ｃ】６１ｎｍ形態の３Ｄ再構築と外形密度断面図を示す。

【図３ｄ】５８ｎｍ形態の３Ｄ再構築と外形密度断面図を示す。

【図４ａ】フィブリル中のポリペプチドひだのモデリングを示し、線維の横断面を示す。

【図４ｂ】フィブリル中のポリペプチドひだのモデリングを示し、１個のプロトフィラメ
ントの側面図を示す。

【図５ａ】線維形成過程の間に得られた筋肉アシルホスファターゼの遠紫外線円偏光二色
性スペクトルを示す。

【図５ｂ】筋肉アシルホスファターゼの赤外線スペクトルのアミドＩ領域を示す。

【図６ａ】筋肉アシルホスファターゼ凝集物の形態発生を示す電子顕微鏡写真であり、反
応の開始から７２分後の顆粒状の様相の凝集物を示す。

【図６ｂ】筋肉アシルホスファターゼ凝集物の形態発生を示す電子顕微鏡写真であり、３
２時間後の短いフィブリルを示す。

【図６ｃ】筋肉アシルホスファターゼ凝集物の形態発生を示す電子顕微鏡写真であり、２
週間後のアミロイドフィブリルを示す。

【図６ｄ】筋肉アシルホスファターゼ凝集物の形態発生を示す電子顕微鏡写真であり、イ
ンキュベーションの２週間後に得た筋肉アシルホスファターゼ誘導の凝集物を含
むサンプルの光学顕微鏡写真を示す。

【図７】枯草菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓからの低温ショックタンパク質
ＣｓｐＢの配列と二次構造内容物を示す。数字は３個のペプチド：ＣｓｐＢ−１
（１−２２）、ＣｓｐＢ−２（１−３５）およびＣｓｐＢ−３（３６−６７）の
最初と最後のアミノ酸を示す。

【図８ａ】ＣＤ分光法によるＣｓｐＢペプチドの希釈溶液の特性指摘を示す。

【図８ｂ】ＣＤ分光法によるＣｓｐＢペプチドの希釈溶液の特性指摘を示す。

【図８ｃ】ＣＤ分光法によるＣｓｐＢペプチドの希釈溶液の特性指摘を示す。

【図８ｄ】ＣＤ分光法によるＣｓｐＢペプチドの希釈溶液の特性指摘を示す。

【図９ａ】ランダムコイルモデルから推定されたものと、ＣｓｐＢ−１についてシミュレ
ートした横断面に適合させることによりＣＯＳＹスペクトルにおけるアンチフェ
ーズスプリットから導いた残基特異的３−Ｊ_ＮＨα結合定数の差を示す。

【図９ｂ】ランダムコイルモデルから推定されたものと、ＣｓｐＢ−３についてシミュレ
ートした横断面に適合させることによりＣＯＳＹスペクトルにおけるアンチフェ
ーズスプリットから導いた残基特異的３−Ｊ_ＮＨα結合定数の差を示す。

【図１０ａ】アコンゴーレッドアッセイのＶＩＳスペクトルを例を示す。

【図１０ｂ】陰性染色したフィブリルの電子顕微鏡写真を示す。

【図１０ｃ】５０％アセトニトリル中５ｍｇ／ｍＬ溶液から乾燥したサンプルから得たＸ線
線維回折パターンを示す。

【図１０ｄ】 βシート構造の典型的な距離に対応するピークを割り当てた、ｃの回折パター
ンの横断面を示す。

【図１１ａ】ＷＴ−ＡＤＡ２ｈ試料の電子顕微鏡分析を示す。

【図１１ｂ】ＷＴ−ＡＤＡ２ｈ試料の電子顕微鏡分析を示す。

【図１１ｃ】ＷＴ−ＡＤＡ２ｈ試料の電子顕微鏡分析を示す。

【図１１ｄ】ＷＴ−ＡＤＡ２ｈ試料の電子顕微鏡分析を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｎ 9/12 35/00 9/16 ＢＣ１２Ｎ 9/12 9/48 9/16 Ａ６１Ｋ 37/12 9/48 37/14 (31)優先権主張番号９９０９９２７．７ (32)優先日平成11年４月29日(1999．4．29) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者ドブスン，クリストフアー・マーチンイギリス国、オツクスフオード・オー・エツクス・１・３・キユー・テイー、サウス・パークス・ロード、ユニバーシテイ・オブ・オツクスフオード、ニユー・ケミストリー・ラボラトリー、オツクスフオード・センター・フオー・モレキユラー・サイエンシイズ（番地なし) Ｆターム(参考） 4B050 CC02 DD11 GG01 GG02 LL01 4C084 AA02 AA03 AA07 BA33 BA44 CA18 DC10 DC50 NA14 ZA361 ZA531 ZB261 ZC351 4H045 AA10 AA30 CA11 CA40 DA37 DA89 EA23 EA24 EA27 EA28 FA34

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】実質的に他のタンパク質を含まないアミロイドフィブリル。
【請求項２】天然のアミロイドフィブリルである、請求項１に記載のフィ
ブリル。
【請求項３】アルツハイマー病に関連するＡβペプチド、伝染性海綿状脳
障害に関連するプリオンタンパク質、ＩＩ型糖尿病に関連する膵島関連ポリペプ
チド、老年性全身性アミロイドーシスに関連するトランスサイレチンおよびその
断片、家族性アミロイド多発ニューロパシーに関連するトランスサイレチン変異
体およびその断片、あるいは全身性アミロイドーシスに関連する他の変異体又は
トランケートされた又はミスプロセシングされたタンパク質を含む、請求項２に
記載のフィブリル。
【請求項４】タンパク質を含む、非天然のアミロイドフィブリル。
【請求項５】ｐＨ２．０でウシホスファチジルイノシトール３−キナーゼ
のｐ８５αサブユニットのＳＨ３ドメイン（ＰＩ３−ＳＨ３）から形成されるア
ミロイドフィブリルではない、上記請求項のいずれかに一項に記載のフィブリル
。
【請求項６】ウシホスファチジルイノシトール３−キナーゼのｐ８５αサ
ブユニットのＳＨ３ドメイン（ＰＩ３−ＳＨ３）から形成されるアミロイドフィ
ブリルではない、請求項５に記載のフィブリル。
【請求項７】タンパク質が非天然のタンパク質である、請求項４から６の
いずれか一項に記載のフィブリル。
【請求項８】タンパク質が、ウシホスファチジルイノシトール３−キナー
ゼのｐ８５αサブユニットのＳＨ３ドメイン（ＰＩ３−Ｈ３）の誘導体又はアミ
ノ酸変異体、ヒト筋肉アシルホスファターゼ、ウシインスリン、ＣｓｐＢの最初
の２本（ＣｓｐＢ−１）、最初の３本（ＣｓｐＢ−２）又は最後の２本（Ｃｓｐ
Ｂ−３）のβ鎖に対応するタンパク質、ならびに野生型ヒトカルボキシペプチダ
ーゼＡ２（ＷＴ−ＡＤＡ２ｈ）およびその誘導体又はアミノ酸変異体から選択さ
れる、請求項４から７のいずれか一項に記載のフィブリル。
【請求項９】ウシホスファチジルイノシトール３−キナーゼのｐ８５αサ
ブユニットのＳＨ３ドメイン（ＰＩ３−Ｈ３）と、請求項８で定義されたタンパ
ク質から選択される少なくとも１つのタンパク質を含む、非天然のアミロイドフ
ィブリル。
【請求項１０】製薬上活性な化合物をさらに含む、上記請求項のいずれか
一項に記載のフィブリル。
【請求項１１】金属をさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載
のフィブリル。
【請求項１２】銅、銀あるいは金から選択される金属をさらに含む、請求
項１１に記載のフィブリル。
【請求項１３】１又はそれ以上の反応物に結合することができる１又はそ
れ以上の官能基をさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のフィブ
リル。
【請求項１４】フィブリルの直径が１から２０ｎｍである、請求項１から
１３のいずれか一項に記載のフィブリル。
【請求項１５】フィブリルの直径が５から１５ｎｍである、請求項１４に
記載のフィブリル。
【請求項１６】フィブリルの直径が７から１２ｎｍである、請求項１５に
記載のフィブリル。
【請求項１７】タンパク質を含む溶液を調製することを含み、かかる溶液
が核形成とフィブリルの成長が許容される時間にわたって起こる状態にあって、
核形成とフィブリルの成長が生じることを可能にするような、上記請求項のいず
れか一項に記載のフィブリルを調製するための工程。
【請求項１８】溶液がアルコールをさらに含む、請求項１７に記載の工程
。
【請求項１９】溶液が、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノ
ール、トリフルオロエタノールおよびヘキサフルオロイソプロパノールから選択
されるアルコールをさらに含む、請求項１８に記載の工程。
【請求項２０】溶液がアセトニトリルをさらに含む、請求項１７に記載の
工程。
【請求項２１】溶液が尿素をさらに含む、請求項１７に記載の工程。
【請求項２２】溶液中のタンパク質の濃度が０．１ｍＭから１０ｍＭであ
る、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の工程。
【請求項２３】溶液の温度が０℃から１００℃である、請求項１７から２
２のいずれか一項に記載の工程。
【請求項２４】溶液が酸性である、請求項１７から２３のいずれか一項に
記載の工程。
【請求項２５】溶液のｐＨが０．５から６．５である、請求項２４に記載
の工程。
【請求項２６】溶液にあらかじめ形成されたタンパク質の粒子が接種され
ている、請求項１７から２５のいずれか一項に記載の工程。
【請求項２７】請求項１７から２６のいずれか一項に記載の工程によって
調製される、請求項１から１６のいずれか一項に記載のフィブリル。
【請求項２８】プラスチックとしての、あるいは電子工学又は触媒作用に
おける、請求項１から１６又は２７のいずれか一項に記載のフィブリルの使用。
【請求項２９】ヒトあるいは動物の身体の治療において使用するための、
請求項１から１６又は２７のいずれか一項に記載のフィブリル。
【請求項３０】糖尿病、血液凝固障害、癌および心臓病の治療において使
用するための薬剤の製造における、請求項１から１６又は２７のいずれか一項に
記載のフィブリルの使用。
【請求項３１】請求項１から１６又は２７のいずれか一項に記載のフィブ
リルの無毒性で有効な量をヒトあるいは動物に投与することを含む、ヒトあるい
は動物を治療する方法。
【請求項３２】ヒトあるいは動物が、糖尿病、血液凝固障害、癌および心
臓病に罹患している、あるいは罹患する可能性が高い、請求項３１に記載の方法
。