JP2006010491A

JP2006010491A - 体液分析方法及び分注良否判定装置

Info

Publication number: JP2006010491A
Application number: JP2004187755A
Authority: JP
Inventors: Hajime Takahashi; 一高橋; Akira Kawai; 彰河合; Satoshi Kimura; 聡木村
Original assignee: Mitsubishi Kagaku Bio-Clinical Laboratories Inc
Current assignee: Mitsubishi Kagaku Bio-Clinical Laboratories Inc
Priority date: 2004-06-25
Filing date: 2004-06-25
Publication date: 2006-01-12

Abstract

【課題】
本発明の課題は、マイクロプレート等の超微量検体の自動分注が確実に行われたかどうかを判定する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
体液中に存在するたんぱく質の構成成分であるフェニルアラニンやトリプトファン等の芳香族アミノ酸に着目し、これの紫外部吸収を利用して検体の分注の良否が判定可能かどうかを検討した。体液中には、干渉物質等が存在し、その測定系への影響が危惧されたが、思いがけないことに、約280nmの吸収波長での吸光度測定によって、確実に分注の良否が判定可能なことを見出し本発明を完成した。

Description

この発明は、体液分析方法における検体の小分け分注の良否を判定する方法及びその装置に関する。

体液分析は、人の健康状態、疾患を検査する臨床検査の分野で頻繁に行われる。この検査を行う一般的な方法は、採取した血液等から血清を分離し、分析項目ごとの必要量ごとに小分けし、所定の分析装置で分析を行う。この小分けは、通常自動分注装置によって所定量が分注されている。この分注に際して、分注が確実に行われていないと、測定が意味のないものとなるため、分注の良否を判定することが必要である。従来この良否判定には、液面高さをセンサーで検出する方法、ビリルビンの吸収波長で判定する方法（特許文献１）、目視による方法等が存在するが、特にマイクロプレート等を使った超微量検体の測定おいては、分注が確実に行われたかどうかを判定する手段は目視による確認手段が実用に供されてきたに過ぎない実情であった。
特開2003-004753

本発明の課題は、マイクロプレート等の超微量検体の自動分注が確実に行われたかどうかを判定する手段を提供することである。

上記課題を解決するために本発明者らは、体液中に存在するたんぱく質の構成成分であるフェニルアラニンやトリプトファン等の芳香族アミノ酸に着目し、これの紫外部吸収を利用して検体の分注の良否が判定可能かどうかを検討した。体液中には、干渉物質等が存在し、その測定系への影響が危惧されたが、思いがけないことに、約260〜約300nmの吸収波長での吸光度測定によって、確実に分注の良否が判定可能なことを見出し本発明を完成した。

すなわち本発明は、
「１．体液分析検査において、容器中に小分け分注された検体の分注良否判定のために約260〜約300nmの吸収波長で吸光度測定手段による測定を行う工程を含む体液分析方法。
２．体液分析検査において、検体を測定容器に分注する手段によって容器に小分け分注し、容器中に分注された検体の分注良否判定のために約260〜約300nmの吸収波長での吸光度測定手段によって吸光度測定を行い、測定によって得られた数値を記憶手段によって保存し、この数値をコントロールにおける測定数値との比較をする判定手段によって比較し、各小分けされた検体の分注良否の判定をおこなう工程を含む体液分析方法。
３．検体が血清である請求項１又は２の方法。
４．容器がマイクロプレートである請求項１〜３のいずれか一に記載の方法。
５．小分け分注量が、0〜100μｌである請求項１〜４のいずれか一に記載の方法。
６．判定が吸光度の増加によっておこなわれる請求項１〜５のいずれか一に記載の方法。
７．体液分析検査において使用する装置であって、検体を測定容器に小分け分注する手段、容器中に分注された検体の分注良否判定のために約260〜約300nmの吸収波長での吸光度測定手段、測定によって得られた数値の記憶手段、この数値をコントロールにおける測定数値との比較をする判定手段を含む分注良否判定装置。」からなる。

本発明によって、マイクロプレートのような超微量検体でもその小分け分注の良否を容易に確実に判定可能となり、体液検査の自動化をより確実に実行可能にした。

本発明において、体液分析検査とは、一般的に臨床検査分野でおこなわれる体液中の各成分の分析検査を意味する。特に検査方法としては、免疫学的反応を利用した検査方法が汎用されるが、本発明は検体の小分け分注が確実におこなわれたかどうかを判定するものであるから、後の測定手技は特に限定されるものではない。
本発明において、検体は、血清、血漿、尿、唾液、喀痰等自体或はその由来物が適用可能である。なお、唾液や喀痰を検体に使う場合は、粘度が高いので粘度を落とす手段が講じられていることが好ましい。
本発明において使用される容器は、微量測定用容器において最適な結果を得られるがこれに限定されるものではない。最適な容器としては、マイクロプレートが例示される。本発明において、容器への小分け分注は、好適には自動分注機を使い、採取された体液を予備調整し、自動吸引によって検体を定量吸引し、これを測定容器例えば透明性を有するプラスチック或はガラス容器に小分け吐出することによっておこなわれる。無論、この小分け操作は、手動でも良いが、マイクロプレートのような大量検体を同時に測定する場合にあっては自動化が好適である。
本発明における測定の基本的な手技は、約260〜約300nm、好ましくは約270〜約290nm、より好ましくは約280nmの吸収波長を利用し、その吸光度測定手段を適用することで行う。この測定に用いる機器は特に限定されるものではなく、紫外部における吸光度測定が可能な容器リーダー、プレートリーダーの手段で実施可能である。

本発明の体液分析検査方法は、検体を測定容器に分注する手段によって容器に小分け分注し、容器中に分注された検体の分注良否判定のために約260〜約300nm、好ましくは約270〜約290nm、より好ましくは約280nmの吸収波長での吸光度測定手段によって吸光度測定を行い、測定によって得られた数値を記憶手段によって保存し、この数値をコントロールにおける測定数値との比較をする判定手段によって比較し、各小分けされた検体の分注良否の判定をおこなう工程を含む体液分析方法である。本発明において、数値の記憶手段とは、吸光度測定結果をコンピュータハードウェアーの記憶手段によって記憶、保存させることを意味する。また、吸光度測定は、分注がされていない小分けセルとの対比で分注の良否判定がおこなわれるので、検体が分注されていないセルの吸光度数値をコントロール値として予め設定し、この数値との対比判定により、分注がされたかどうかが判定される。判定は、好適には、予め計算式をコンピュータにおいて設定し、得られた結果から、分注良否が判定されることが好ましい。

本発明における好ましい検体は、血清であり、また好ましい容器はマイクロプレートである。好適な小分け分注量は、0〜100μｌであり、極めて微量な1〜5μｌでも好適な結果をえることができる。測定容器中には、予め各種試薬類が分注されていてもよく、好適には緩衝液がはいっていてもよい。このように事前に試薬類が分注されている場合は、好適には、この事前分注の確実性を何らかの方法で担保されていることが好ましい。

本発明の特徴は、体液中に存在する各種干渉物質の影響を受けずに分注の良否を判定できることである。そのために、本発明では、判定を吸光度の増加を判定することによっておこなわれる。増加とは、例えば、検体が分注されていないホール（セル）では280nmでの吸光度が例えば3.05以下であるのに対し、分注が達成されておれば吸光度が3.1以上の高値を示し、例えばOD測定値3.1をカットオフ値として設定し、検体の各ホール（セル）への分注の良否が判定されるのである。

本発明にあっては、血液分析検査において使用する装置であって、検体を測定容器に小分け分注する手段、容器中に分注された検体の分注良否判定のために約260〜約300nm、好ましくは約270〜約290nm、より好ましくは約280nmの吸収波長での吸光度測定手段、測定によって得られた数値の記憶手段、この数値をコントロールにおける測定数値との比較をする判定手段を含む分注良否判定装置をも提供する。

以下に本発明を実施例、実験例で説明するが、これは本発明の最良の態様の一を例示するものであって、本発明はこの範囲に限定されるものではない。

（実施例１）
材料及び方法
マイクロプレートにおける検体分注の自動チェックの可能性を検討した。検討に用いた分析機は、大日本製薬製マルチスキャンヴィエントを用いた。本機は、200〜999nmという非常に広範囲における吸光度測定が可能なプレートリーダーであり、280nmでの吸光度測定が可能である。富士レビオ社96穴U底マイクロプレートに、血清を0〜35μl分注し、ミキサーで撹拌を行って血清がウェル全体に広がるようにしたのち、吸光度を測定した。なお、参考のために、580nm、585nm、590nm、595nmの各吸光度でも同様に測定した（図１〜４）。

１）分注の確認
280nmを採用した結果、吸光度は検体が分注されていないホールでは3.05以下なのに対し、分注が確認されているホールでは3.1以上の値を示した。従ってOD値3.10をCUT OFF値として設定して検体が分注されているかどうかを判定することが可能と判断された。図５。

２）干渉物質の影響
「干渉チェック・Aプラス」（国際試薬製）と10μlの検体量について、分注の確認ができるかを検討した。その結果、遊離型及び抱合型ビリルビン、溶血、乳び、いずれの場合においても吸光度は上昇がみられた。しかし、本発明の方法では吸光度の増加をもって血清の有無を判定するため、干渉物質による分注を見落とすことにはならず、影響はみられなかった。図８。

３）80ウェルでの応用
Cut Off 値を3.10として、マイクロプレート（96穴）に80検体を分注し、実際に検体の有無を検出できるかを検討した。検体は5μlずつ分注し、これを50枚のプレートで確認したところ、判定は100％一致した。図９。

４）緩衝液の入っているホールへの分注
あらかじめ緩衝液20μl の入っているホールに、血清を5μl ずつ加える工程において、分注を自動確認できるか検討したところ、判定は100%一致していた。図７。

結論
本発明の方法によって、検体のマイクロプレートへの分注が確実になされているかを、目視でなく自動的に検出できることが確認された。

580nmでの測定結果を示す。図６に各セル（ホール）の血清の有無を示す。 585nmでの測定結果を示す。図６に各セル（ホール）の血清の有無を示す。 590nmでの測定結果を示す。図６に各セル（ホール）の血清の有無を示す。 595nmでの測定結果を示す。図６に各セル（ホール）の血清の有無を示す。 280nmでの測定結果を示す。図６に各セル（ホール）の血清の有無を示す。各セル（ホール）の血清の有無。検体のあるところは（+）、無いところは（#####）であらわした。 280nmでの測定結果を示す。各上からプレートNo.7のOD値、プレートNo.7の各セル（ホール）の血清の有無（検体のあるところは（+）、無いところは（#####））、プレートNo.5のOD値、プレートNo.5の各セル（ホール）の血清の有無（検体のあるところは（+）、無いところは（#####））。干渉物質の影響を示す。各干渉物質と280nmでの吸光度を測定した。干渉物質は上から、ビリルビン遊離型、ビリルビン抱合型、溶血ヘモグロビン、乳ビを示し、各検体は基準量を5μｌ及び10μｌとし、血清量を順次増加させていき、吸光度変化をみた。 280nmでの測定結果を示す。上は吸光度、下は、血清の有無（全て検体があるので（+）表示）を示す。

Claims

体液分析検査において、容器中に小分け分注された検体の分注良否判定のために約260〜約300nmの吸収波長で吸光度測定手段による測定を行う工程を含む体液分析方法。
体液分析検査において、検体を測定容器に分注する手段によって容器に小分け分注し、容器中に分注された検体の分注良否判定のために約260〜約300nmの吸収波長での吸光度測定手段によって吸光度測定を行い、測定によって得られた数値を記憶手段によって保存し、この数値をコントロールにおける測定数値との比較をする判定手段によって比較し、各小分けされた検体の分注良否の判定をおこなう工程を含む体液分析方法。
検体が血清である請求項１又は２の方法。
容器がマイクロプレートである請求項１〜３のいずれか一に記載の方法。
小分け分注量が、0〜100μｌである請求項１〜４のいずれか一に記載の方法。
判定が吸光度の増加によっておこなわれる請求項１〜５のいずれか一に記載の方法。
体液分析検査において使用する装置であって、検体を測定容器に小分け分注する手段、容器中に分注された検体の分注良否判定のために約260〜約300nmの吸収波長での吸光度測定手段、測定によって得られた数値の記憶手段、この数値をコントロールにおける測定数値との比較をする判定手段を含む分注良否判定装置。