JP2012511154A - 生体分子の濃度を測定するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、全体として、神経性および神経変性の疾患、障害、および関連する過程の診断ならびに治療のための方法に関する。
アルツハイマー病(AD)は、最も一般的な痴呆の原因であり、ますます増えつつある公衆衛生上の問題である。現在、米国内では500万の人々を苦しめていると推定され、2050年までに1300万人まで増大すると予想されている(Herbert et al, 2001, Alzheimer Dis. Assoc. Disord. 15(4): 169-173(非特許文献1))。ADは他の中枢神経系(CNS)の変性疾患と同様に、タンパク質の産生、蓄積、およびクリアランスの障害によって特徴付けられる。ADでは、アミロイドβ(Aβ)というタンパク質の代謝の調節異常が、この疾患を有する者の脳内におけるこのタンパク質の塊状の蓄積によって示される。ADは、記憶喪失、認知機能の喪失、ならびに最終的には自立性の喪失および死につながる。この疾患は、患者、家族および社会に過酷な人的および経済的打撃を与える。この疾患の重篤性および人口内での有病率の増加のため、より良い治療を開発することが急務である。
本発明は、一つには、生体分子の安定同位体標識法が生体分子の分子量のわずかな相違をもたらすものの、生体分子の物理的または化学的な特性に影響を与えることはないという発見に基づく。本明細書において提供される技術を用い、生体分子の分析を使って、神経性障害または神経変性障害を有するまたはそれらを発症するリスクのある対象を診断するおよび/または治療することができる。したがって、本発明は、対象において関心対象の一つまたは複数の生体分子の濃度を算出するのに有用な方法およびキットを提供する。
(i) 非標識の生体分子の濃度 = (標識された生体分子に対する非標識の生体分子の比率)×(標識された生体分子の濃度)
この方程式は次のように単純化することができる。
(ii) 非標識の生体分子の濃度 = (非標識の生体分子:定量標準物質の比率)×(定量標準物質の濃度)
(iii) 標識された生体分子の濃度 = (非標識の生体分子に対する標識された生体分子の比率)×(非標識の生体分子の濃度)
(iv) 標識2の濃度 = (標識1に対する標識2の比率)×(標識1の濃度)
(v) 標識2の濃度 = (標識1に対する標識2の比率)×(標識1の濃度)
(vi) 標識3の濃度 = (標識1に対する標識3の比率)×(標識1の濃度)
(vii) 標識2の濃度 = (標識1に対する標識2の比率)×(標識1の濃度)
(viii) 非標識の生体分子の濃度 = (標識1に対する非標識の生体分子の比率)×(標識1の濃度)
安定同位体の動的標識化
本実施例では、SILK法に比べて明らかになった改善点について例証する。細胞培地を、非標識のAβに対する標識されたAβの既知比率で作製した。その後、この標準曲線培地を用いて、Aβの29-xペプチドの検出および定量を試験した。この培地を用い、一連の試験を行って、29-xペプチドの可溶性を向上させるために、およびペプチドの検出を増大させるために改善されたクロマトグラフィー条件を樹立した。
IPおよび洗浄段階のために0.5 Mグアニジンを用いる代わりに、0.025%の界面活性剤、例えばTween-20、TritonまたはCHAPSを使用することによってオリジナルのSILK-Aβ(商標)法を改変した。同様に消化の間、および質量分析計へ注入されるまで、ペプチドを0.025%の界面活性剤溶液中で保持する。Aβは高疎水性のペプチドであり、Tween-20の添加は大いに、可溶性を向上させ、かつ17-28ペプチドの場合と同じくらい高い29-40のイオン強度が得られるほどに、29-xペプチドの質量分析計シグナルを向上させる。これは、Aβ40が最も豊富なAβ種であり、したがって17-28ペプチドの大部分がAβ40ペプチドから生じるので、重要である。そのため、二つのペプチドのイオン強度が同様であることから、Aβ29-40の全てが質量分析計による検出に関して溶解状態であることが示唆される。
さらに、還元状態で29-xペプチドを保持するための方法を開発した。例えば、これらのペプチドは、酸化され得る一つのメチオニン残基を含む。一つの例示的な特徴付けにおいては、およそ10%のメチオニンがCSF中および培地中で酸化されることが分かったので、還元剤を添加することにより、酸化型を取り除くこと、および生体試料中にもともと存在する酸化状態に応じて、シグナルを10%またはそれ以上増大することが可能であった。この酸化状態は、特に、酸化的損傷を伴うことが公知のアルツハイマー病などの疾患状態によって変わり得る。β-メルカプトエタノールおよびトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)などの還元剤を用いて、メチオニン酸化を取り除く。
最後に、Aβペプチドがカラムに固着しないようにするため、C18カラムをC1カラムに替えた。C1、C4またはC8カラムなどの、C18の炭素含量よりもはるかに低い炭素含量を有するカラムは、疎水性がはるかに低く、より高いAβペプチドの回収を可能にし、ペプチドのピーク形状を向上し、および試料を流す間の持ち越し汚染を減らし得る。
定量標準物質
本実施例では、内因性ペプチドとスパイクされたペプチドとの間の比率の算出に定量標準物質のスパイキング(spiking)を使用できることを実証する。したがって、既知量の標識されたAβ37、Aβ38、Aβ39、Aβ40およびAβ42のスパイキングは、試料中の総Aβ濃度の定量に加えてそれらのアイソフォームの特異的定量を可能にする。
絶対濃度を算出するための定量標準物質
本実施例では、生体分子の絶対濃度を算出するために使用される、関心対象の生体分子の産生速度またはクリアランス速度を算出するための定量標準物質の使用を、実証する。
標準曲線を用いた試料についての複数回の実行
本実施例では、実施例3に記載した方法の変化形を実証する。非標識のAβも代謝的に(13C6ロイシン)標識されたAβも既に含んだ培地試料中に、Aβ定量標準物質20 ngをスパイクした。
Claims (81)
- 対象における生体分子の濃度を算出する方法であって、
(a) 定量標準物質と該対象由来の試料を接触させる段階であって、該定量標準物質が、既知濃度の関心対象の標識された生体分子を含む段階;
(b) 該試料から関心対象の生体分子を単離する段階;
(c) 該試料中の非標識の生体分子に対する標識された生体分子の比率を測定する段階; および
(d) 該試料中の該非標識の生体分子の濃度を算出する段階
を含む、方法。 - 前記非標識の生体分子の前記濃度を算出する段階が、前記定量標準物質の既知濃度を、前記試料中の非標識の生体分子に対する標識された生体分子の前記比率に乗ずることを含む、請求項1記載の方法。
- 算出された前記濃度を標準曲線に対して規準化する段階であって、該標準曲線が、定量標準物質に対する非標識の生体分子の比率の二つまたはそれ以上を測定することによって作成され、該非標識の生体物質の濃度が既知である段階
をさらに含む、請求項1記載の方法。 - 前記定量標準物質が、一つまたは複数の標識された部分を含む、請求項1記載の方法。
- 前記一つまたは複数の標識された部分が、2H、13C、15N、17O、18O、33S、34Sおよび36Sからなる群より選択される非放射性同位体を含む、請求項4記載の方法。
- 前記生体分子が、ペプチド、脂質、核酸および炭水化物からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 前記生体分子が、中枢神経系(CNS)において合成されるペプチドである、請求項6記載の方法。
- 前記ペプチドが、アミロイドβ(Aβ)、α-シヌクレイン、タウ、アポリポタンパク質E、アポリポタンパク質J、アミロイド前駆体タンパク質(APP)、α-2-マクログロブリン、S100B、ミエリン塩基性タンパク質、TDP-43、スーパーオキシドジスムターゼ-1、ハンチンチン、インターロイキンおよびTNFからなる群より選択されるタンパク質である、請求項7記載の方法。
- 前記標識された部分が、標識されたアミノ酸である、請求項4記載の方法。
- 前記アミノ酸が必須アミノ酸である、請求項9記載の方法。
- 前記必須アミノ酸が、ロイシン、イソロイシンおよびフェニルアラニンからなる群より選択される、請求項10記載の方法。
- 前記標識された部分が、x = 1〜6である13Cxロイシンである、請求項4記載の方法。
- 前記標識された部分が、15Nで標識されたアミノ酸である、請求項4記載の方法。
- 前記標識された部分が、x = 1〜9である13Cxで標識されたフェニルアラニンである、請求項4記載の方法。
- 前記標識された部分が、x = 1〜6である13Cxで標識されたイソロイシンである、請求項4記載の方法。
- 前記標識された部分が、13Cxで標識されたイソロイシンおよび13Cyで標識されたフェニルアラニンであり、x = 1〜6およびy = 1〜9である、請求項4記載の方法。
- 前記試料を二つまたはそれ以上の定量標準物質と接触させ、かつ二つまたはそれ以上の前記非標識の生体分子の濃度を算出する、請求項1記載の方法。
- 前記二つまたはそれ以上の生体分子が、同一タンパク質のアイソフォームである、請求項17記載の方法。
- 前記生体分子が、Aβ1-16、Aβ1-17、Aβ1-37、Aβ1-38、Aβ1-39、Aβ1-40、Aβ1-41、Aβ1-42およびAβ1-43からなる群より選択される、請求項10記載の方法。
- 前記試料が、脳脊髄液(CSF)、血液、血漿、尿、唾液、涙液および生物組織からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- 前記試料が、CSFであり、かつアミロイドβタンパク質、アミロイドβタンパク質の変種、アミロイドβタンパク質の消化産物、アミロイド前駆体タンパク質(APP)、アポリポタンパク質E、アポリポタンパク質J、タウ、α-シヌクレイン、α-2-マクログロブリン、S100B、ミエリン塩基性タンパク質、TDP-43、スーパーオキシドジスムターゼ-1、ハンチンチン、インターロイキン、TNFまたはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項20記載の方法。
- 前記試料中の非標識の生体分子に対する標識された生体分子の前記比率が、質量分析計、タンデム質量分析計およびそれらの組み合わせからなる群より選択される手段によって検出される、請求項1記載の方法。
- 前記生体分子が、ペプチドであり、かつ前記比率を測定する前にエンドプロテアーゼで消化される、請求項22記載の方法。
- 前記エンドプロテアーゼがトリプシンまたはV8プロテアーゼである、請求項23記載の方法。
- 消化された前記ペプチドが、前記比率が測定される前にクロマトグラフィー分離によって分離される、請求項23記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー分離が、液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィーを含む、請求項25記載の方法。
- 前記生体分子が免疫沈降によって単離される、請求項1記載の方法。
- 関心対象の非標識の生体分子の濃度を、対応する正常試料中の同一生体分子の濃度と、既知の神経性疾患状態もしくは神経変性疾患状態の対象中の同一生体分子の濃度と、以前の時点で測定された同一対象由来の同一生体分子の濃度と、またはそれらの任意の組み合わせと比較する段階
をさらに含む、請求項1記載の方法。 - 前記神経性疾患または前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、前頭側頭型認知症(FTD)、ハンチントン病、進行性核上まひ(PSP)、大脳皮質基底核変性症(CBD)、加齢関連性の障害および認知症、多発性硬化症、プリオン病、レビー小体病、ならびに筋萎縮性側索硬化症からなる群より選択される、請求項26記載の方法。
- 対象における一つまたは複数の生体分子の濃度を定量するインビボ方法であって、
(a) 一つまたは複数の標識されたアミノ酸を該対象に投与する段階であって、該標識されたアミノ酸が、該対象中の関心対象の生体分子に組み込まれる段階;
(b) 該対象由来の生物体液または生物組織の試料を得る段階であって、該試料が、標識された生体分子の画分と非標識の生体分子の画分とを含む段階;
(c) 定量標準物質と該試料を接触させる段階であって、該定量標準物質が、該対象に投与された該一つまたは複数の標識されたアミノ酸とは異なる分子量を有する部分で標識された既知濃度の生体分子を含む段階;
(d) 該試料中の非標識の生体分子に対する標識された生体分子の比率、該定量標準物質に対する標識された生体分子の比率、および該定量標準物質に対する非標識の生体分子の比率を測定する段階; ならびに
(e) 該試料中の該非標識の生体分子の濃度、および該標識された生体分子の濃度を算出する段階
を含む、方法。 - 前記非標識の生体分子の濃度を算出する段階が、前記定量標準物質の濃度を、該定量標準物質に対する非標識の生体分子の測定された比率に乗ずることを含む、請求項30記載の方法。
- 前記標識された生体分子の濃度を算出する段階が、前記定量標準物質の濃度を、該定量標準物質に対する標識された生体分子の測定された前記比率に乗ずることを含む、請求項30記載の方法。
- 非標識の生体分子の標準曲線に対して、非標識の生体分子の算出された前記濃度を規準化する段階、および
標識された生体分子の標準曲線に対して、標識された生体分子の算出された前記濃度を規準化する段階
をさらに含む、方法であって、
それぞれの該標準曲線が、定量標準物質に対する非標識の生体分子または標識された生体分子の比率の二つまたはそれ以上を測定することによって作成され、非標識の生体物質または標識された生体分子の前記濃度が既知である、請求項30記載の方法。 - 前記標識されたアミノ酸および前記定量標準物質が、2H、13C、15N、17O、18O、33S、34Sおよび36Sからなる群より選択される非放射性同位体で独立して標識される、請求項30記載の方法。
- 前記標識されたアミノ酸が必須アミノ酸である、請求項34記載の方法。
- 前記必須アミノ酸が、ロイシン、イソロイシンおよびフェニルアラニンからなる群より選択される、請求項35記載の方法。
- 前記標識されたアミノ酸または前記定量標準物質が、x = 1〜6である13Cxロイシンを含む、請求項34記載の方法。
- 前記標識されたアミノ酸または前記定量標準物質が、x = 1〜6である13Cxイソロイシンを含む、請求項34記載の方法。
- 前記標識されたアミノ酸または前記定量標準物質が、x = 1〜9である13Cxフェニルアラニンを含む、請求項34記載の方法。
- 前記定量標準物質が15Nを含む、請求項34記載の方法。
- 前記標識されたアミノ酸が、経口的に、静脈内に、筋肉内に、または皮下に投与される、請求項30記載の方法。
- 前記標識されたアミノ酸が、単回経口投与量として投与される、請求項41記載の方法。
- 前記標識されたアミノ酸が、1時間毎に6〜12時間投与される、請求項41記載の方法。
- 前記標識されたアミノ酸が、1時間毎に9〜12時間投与される、請求項41記載の方法。
- 前記生体分子が、ペプチド、脂質、核酸および炭水化物からなる群より選択される、請求項30記載の方法。
- 前記生体分子が、中枢神経系(CNS)において合成されるペプチドである、請求項45記載の方法。
- 前記ペプチドが、アミロイドβ(Aβ)、α-シヌクレイン、タウ、アポリポタンパク質E、アポリポタンパク質J、アミロイド前駆体タンパク質(APP)、α-2-マクログロブリン、S100B、ミエリン塩基性タンパク質、TDP-43、スーパーオキシドジスムターゼ-1、ハンチンチン、インターロイキンおよびTNFからなる群より選択されるタンパク質である、請求項46記載の方法。
- 前記ペプチドがAβであり、かつ前記定量標準物質が、15Nで標識されたアミノ酸を含む、請求項45記載の方法。
- 前記ペプチドがAβであり、かつ前記定量標準物質が、x = 1〜9である13Cxで標識されたフェニルアラニンを含む、請求項45記載の方法。
- 前記ペプチドがAβであり、かつ前記定量標準物質が、x = 1〜6である13Cxで標識されたイソロイシンを含む、請求項45記載の方法。
- 前記ペプチドがAβであり、かつ前記定量標準物質が、13Cxで標識されたイソロイシンおよび13Cyで標識されたフェニルアラニンの両方を含み、x = 1〜6およびy = 1〜9である、請求項45記載の方法。
- 前記生体分子がAβであり、前記標識されたアミノ酸が13C6ロイシンであり、かつ前記定量標準物質が、13C6で標識されたイソロイシンおよび13C6で標識されたフェニルアラニンの両方を含む、請求項45記載の方法。
- 既知濃度の標識されたアミノ酸の二つまたはそれ以上を前記対象に投与し、かつ一つまたは複数の生体分子の濃度を算出する、請求項30記載の方法。
- 既知濃度の標識されたアミノ酸の一つまたは複数を前記対象に投与し、かつ二つまたはそれ以上の生体分子の濃度を算出する、請求項30記載の方法。
- 前記二つまたはそれ以上の生体分子が同一タンパク質のアイソフォームである、請求項54記載の方法。
- 前記生体分子が、Aβ1-16、Aβ1-17、Aβ1-37、Aβ1-38、Aβ1-39、Aβ1-40、Aβ1-41、Aβ1-42およびAβ1-43からなる群より選択される、請求項55記載の方法。
- 前記試料が、脳脊髄液(CSF)、血液、血漿、尿、唾液および涙液からなる群より選択される、請求項30記載の方法。
- 前記試料が、CSFであり、かつアミロイドβタンパク質、アミロイドβタンパク質の変種、アミロイドβタンパク質の消化産物、アミロイド前駆体タンパク質(APP)、アポリポタンパク質E、アポリポタンパク質J、タウ、α-シヌクレイン、α-2-マクログロブリン、S100B、ミエリン塩基性タンパク質、TDP-43、スーパーオキシドジスムターゼ-1、ハンチンチン、インターロイキン、TNFまたはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項57記載の方法。
- 前記試料を単一の所定の時点で得る、請求項57記載の方法。
- 前記試料を、前記対象から1時間毎に0から12時間まで、0から24時間までまたは0から36時間まで得る、請求項57記載の方法。
- 前記試料中の非標識の生体分子に対する標識された生体分子の前記比率が、質量分析計、タンデム質量分析計およびそれらの組み合わせからなる群より選択される手段によって検出される、請求項30記載の方法。
- 前記生体分子が、ペプチドであり、かつ前記比率を測定する前にエンドプロテアーゼで消化される、請求項30記載の方法。
- 前記エンドプロテアーゼがトリプシンまたはV8プロテアーゼである、請求項62記載の方法。
- 消化された前記ペプチドが、前記比率が測定される前にクロマトグラフィー分離によって分離される、請求項62記載の方法。
- 前記クロマトグラフィー分離が液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィーを含む、請求項64記載の方法。
- 前記試料から前記関心対象の生体分子を単離する段階をさらに含む、請求項30記載の方法。
- 前記関心対象の生体分子が免疫沈降によって単離される、請求項66記載の方法。
- 関心対象の非標識の生体分子の濃度を、対応する正常試料中の同一生体分子の濃度と、既知の神経性疾患状態もしくは神経変性疾患状態の対象中の同一生体分子の濃度と、以前の時点で測定された同一対象由来の同一生体分子の濃度と、またはそれらの任意の組み合わせと比較する段階をさらに含む、請求項30記載の方法。
- 前記神経性疾患または前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、前頭側頭型認知症(FTD)、ハンチントン病、進行性核上まひ(PSP)、大脳皮質基底核変性症(CBD)、加齢関連性の障害および認知症、多発性硬化症、プリオン病、レビー小体病、ならびに筋萎縮性側索硬化症からなる群より選択される、請求項68記載の方法。
- 対象における神経性疾患または神経変性疾患の進行または治療を診断またはモニタリングするためのキットであって、
(a) 一つまたは複数の標識されたアミノ酸;
(b) 該一つまたは複数の標識されたアミノ酸を該対象に投与するための手段であって、それにより、該標識されたアミノ酸が、該対象中の関心対象の生体分子に組み込まれることができる、および該対象中の該関心対象の生体分子を標識することができる、手段;
(c) 標識された生体分子の画分と非標識の生体分子の画分とを含む生体試料を、該対象から一定時間毎に得るための手段;
(d) 関心対象の非標識の生体分子に対する標識された生体分子の比率を経時的に検出および測定するための、ならびに該試料中の該非標識の生体分子の濃度を算出するための使用説明書であって、それにより、非標識の生体分子の該濃度を、対応する正常試料中の同一生体分子の濃度と、既知の神経性疾患状態もしくは神経変性疾患状態の対象中の同一生体分子の濃度と、以前の時点で測定された同一対象由来の同一生体分子の濃度と、またはそれらの任意の組み合わせと比較することができる、使用説明書
を含む、キット。 - 前記標識されたアミノ酸が必須アミノ酸である、請求項70記載のキット。
- 前記必須アミノ酸が、ロイシン、イソロイシンおよびフェニルアラニンからなる群より選択される、請求項71記載のキット。
- 前記標識されたアミノ酸が非放射性原子を含む、請求項70記載のキット。
- 前記非放射性原子が、2H、13C、15N、17O、18O、33S、34Sおよび36Sからなる群より選択される、請求項73記載のキット。
- 前記生体分子が、ペプチド、脂質、核酸および炭水化物からなる群より選択される、請求項70記載のキット。
- 前記生体分子が、中枢神経系(CNS)において合成されるペプチドである、請求項75記載のキット。
- 前記ペプチドが、アミロイドβ(Aβ)、α-シヌクレイン、タウ、アポリポタンパク質E、アポリポタンパク質J、アミロイド前駆体タンパク質(APP)、α-2-マクログロブリン、S100B、ミエリン塩基性タンパク質、TDP-43、スーパーオキシドジスムターゼ-1、ハンチンチン、インターロイキンおよびTNFからなる群より選択されるタンパク質である、請求項76記載のキット。
- 一つまたは複数のさらなる標識されたアミノ酸を前記対象に投与するための手段、ならびに
一つまたは複数のさらなる生体分子の比率および一つまたは複数のさらなる生体分子の濃度を測定するための使用説明書
をさらに含む、請求項65記載のキット。 - 前記一つまたは複数のさらなる生体分子が、同一タンパク質のアイソフォームである、請求項78記載のキット。
- 質量分析計、タンデム質量分析計およびそれらの組み合わせからなる群より選択される手段によって検出される、標識された生体分子および非標識の生体分子の量から、前記試料中の非標識の生体分子に対する標識された生体分子の前記比率を測定する、請求項70記載のキット。
- 前記神経性疾患または前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、前頭側頭型認知症(FTD)、ハンチントン病、進行性核上まひ(PSP)、大脳皮質基底核変性症(CBD)、加齢関連性の障害および認知症、多発性硬化症、プリオン病、レビー小体病、ならびに筋萎縮性側索硬化症からなる群より選択される、請求項70記載のキット。
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