ES2711876T3 - Métodos para el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades neurológicas y neurodegenerativas, trastornos y procesos asociados - Google Patents

Métodos para el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades neurológicas y neurodegenerativas, trastornos y procesos asociados Download PDF

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Abstract

Un método para medir el nivel de alfa-sinucleína in vitro que comprende: poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con un isótopo detectable; medir el nivel de alfa-sinucleína marcada en una muestra; y comparar el nivel de alfa-sinucleína marcada en la muestra con una muestra normal correspondiente; en dende se determina que un cambio en el nivel de sinucleína alfa de la muestra comparado con la muestra normal correspondiente para pronosticar la enfermedad neurológica o neurodegenerativa, y/o identifica la eficacia de un régimen terapéutico; y en donde la enfermedad neurológica o neurodegenerativa es la enfermedad de Parkinson.

Description

DESCRIPCION
Metodos para el diagnostico y tratamiento de las enfermedades neurologicas y neurodegenerativas, trastornos y procesos asociados
Campo de la invencion
La invencion se refiere en general a metodos para el pronostico de la enfermedad de Parkinson y los procesos asociados, y mas espedficamente, a los niveles de sinuclema alfa y la correlacion con dicha enfermedad.
Informacion de los antecedentes
La protema alfa-sinuclema se ha relacionado con la enfermedad de Parkinson (EP) a traves de una variedad de estudios en humanos y animales. Estudios recientes han demostrado que la concentracion de alfa-sinuclema en el CSF (por sus siglas en ingles) es significativamente menor en los pacientes con EP que en sujetos de control, lo que sugiere que el metabolismo de alfa-sinuclema esta alterado en pacientes con EP. Al igual que otras enfermedades de plegamiento incorrecto de protemas, el plegamiento de protemas depende de la concentracion. Por lo tanto, la disminucion de la smtesis o el aumento del aclaramiento de la sinuclema es una forma potencial de desarrollar tratamientos para la EP y compares farmaceuticas se han centrado en el metabolismo de esta protema como un objetivo farmacologico.
El ensayo cinetico de marcaje con isotopos estables (por sus siglas en ingles, SILK) se basa en la capacidad de detectar la incorporacion metabolica de aminoacidos marcados con isotopos estables en protemas y peptidos. Los isotopos estables agregan una pequena cantidad de peso (2-100 Daltons) a los peptidos que contienen el isotopo estable y este peso adicional se puede medir mediante un espectrometro de masas. Al medir la incorporacion metabolica de isotopos estables en protemas en el CSF en varios momentos despues de la administracion de un isotopo estable, el ensayo SILK se puede usar para medir la produccion y el aclaramiento de protemas en el sistema nervioso central humano.
A continuacion se describe el protocolo para medir el metabolismo de alfa-sinuclema derivada del cerebro en un sujeto humano. Un participante en el estudio se identifica y se inscribe en el estudio. En el primer dfa del estudio del participante, se le colocaran cateteres IV y lumbares en el participante y se les administrara un isotopo estable durante un penodo de tiempo predeterminado. Las muestras de plasma y CSF se extraeran a traves de los cateteres en tiempos predeterminados. La alfa-sinuclema se aislara despues de las muestras biologicas y la incorporacion del isotopo estable en la protema se medira mediante un espectrometro de masas. El cambio en la alfa-sinuclema marcada a no marcada a lo largo del tiempo permitira el calculo de las velocidades de produccion y aclaramiento de la protema.
La medida del metabolismo de alfa-sinuclema puede proporcionar resultados para informar sobre las velocidades de smtesis y aclaramiento de alfa-sinuclema en estados normales y patologicos, asf como un metodo para determinar directamente los efectos en humanos de tratamientos dirigidos a la smtesis y el aclaramiento de la alfa-sinuclema.
Sumario de la invencion
La invencion es como se expone en las reivindicaciones adjuntas.
En el presente documento se describen metodos mediante los cuales se afsla alfa-sinuclema de muestras biologicas mediante inmunoprecipitacion usando un anticuerpo que reconoce la alfa-sinuclema. En esta realizacion, la protema aislada se eluye del anticuerpo, por ejemplo, usando acido formico y despues se digiere con tripsina u otra proteasa. La incorporacion de isotopos estables en peptidos alfa-sinuclema se analiza despues en un espectrometro de masas y se calcula una relacion de alfa-sinuclema marcada a no marcada.
En una realizacion, se describe un metodo para determinar el pronostico, diagnostico o eficacia de un regimen terapeutico en un sujeto que comprende poner en contacto una muestra biologica de un sujeto con un isotopo detectable para detectar el nivel de alfa-sinuclema en la muestra.
En una realizacion, se describe un metodo para diagnosticar una enfermedad o trastorno relacionado con alfasinuclema que comprende: (a) administracion de un resto marcado a un sujeto sospechoso de tener una enfermedad o trastorno relacionado con alfa-sinuclema; (b) recoleccion de una muestra biologica del sujeto y una muestra normal correspondiente; (c) medida de alfa-sinuclema marcada y alfa-sinuclema sin marcar del sujeto y la muestra normal correspondiente; (d) determinacion de la relacion de alfa-sinuclema marcada a alfa-sinuclema sin marcar del sujeto y la muestra normal correspondiente; (e) determinacion del metabolismo de alfa-sinuclema a partir de las proporciones de la etapa (d); y (f) comparacion del metabolismo de alfa-sinuclema del sujeto con el metabolismo de alfa-sinuclema de la muestra normal correspondiente, en donde un cambio en el metabolismo de alfa-sinuclema del sujeto comparado con la muestra normal correspondiente es indicativo de un diagnostico positivo de una enfermedad o trastorno relacionado con la alfa-sinuclema, que diagnostica una enfermedad o trastorno relacionado con la alfa-sinuclema.
En otra realizacion, se describe un metodo para determinar el pronostico de una enfermedad o trastorno relacionado con alfa-sinuclema que comprende: (a) administracion de un resto marcado a un sujeto sospechoso de tener una enfermedad o trastorno relacionado con alfa-sinuclema; (b) recoleccion de una muestra biologica del sujeto y una muestra normal correspondiente; (c) medida de alfa-sinuclema marcada y alfa-sinuclema sin marcar del sujeto y la muestra normal correspondiente; (d) determinacion de la relacion de alfa-sinuclema marcada a alfa-sinuclema sin marcar del sujeto y la muestra normal correspondiente; (e) determinacion del metabolismo de alfa-sinuclema a partir de las proporciones de la etapa (d); y (f) comparacion del metabolismo de alfa-sinuclema del sujeto con el metabolismo de alfa-sinuclema de la muestra normal correspondiente, en donde un cambio en el metabolismo de alfa-sinuclema del sujeto comparado con la muestra normal correspondiente es indicativo de un pronostico positivo de una enfermedad o trastorno relacionado con la alfa-sinuclema, por lo que se pronostica una enfermedad o trastorno relacionado con la alfa-sinuclema.
En una realizacion adicional, se describe un metodo para determinar la eficacia de un regimen terapeutico para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con alfa-sinuclema que comprende: (a) administracion de un resto marcado y un agente terapeutico a un sujeto sospechoso de tener una alfa enfermedad o trastorno relacionado con la sinuclema; (b) recoleccion de una muestra biologica del sujeto y una muestra normal correspondiente; (c) medida de alfasinuclema marcada y alfa-sinuclema sin marcar del sujeto y la muestra normal correspondiente; (d) determinacion de la relacion de alfa-sinuclema marcada a alfa-sinuclema sin marcar del sujeto y la muestra normal correspondiente; y (e) determinacion del metabolismo de alfa-sinuclema a partir de las proporciones de la etapa (d); (f) comparacion del metabolismo de alfa-sinuclema del sujeto con el metabolismo de alfa-sinuclema de la muestra normal correspondiente, en donde un cambio en el metabolismo de alfa-sinuclema del sujeto comparado con la muestra normal correspondiente es indicativo de la eficacia de un agente terapeutico regimen de un agente terapeutico para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con alfa-sinuclema, determinando asf la eficacia de un regimen terapeutico para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con alfa-sinuclema.
En una realizacion, se describe un metodo in vivo para identificar un agente terapeutico para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con alfa-sinuclema que comprende: (a) administracion de un resto marcado y un agente terapeutico a un sujeto sospechoso de tener una alfa-sinuclema relacionada enfermedad o desorden; (b) recoleccion de una muestra biologica del sujeto y una muestra normal correspondiente; (c) medida de alfa-sinuclema marcada y alfa-sinuclema sin marcar del sujeto y la muestra normal correspondiente; (d) determinacion de la relacion de alfasinuclema marcada a alfa-sinuclema sin marcar del sujeto y la muestra normal correspondiente; (e) determinacion del metabolismo de alfa-sinuclema a partir de las proporciones de la etapa (d); y (f) comparacion del metabolismo de alfasinuclema del sujeto con el metabolismo de alfa-sinuclema de la muestra normal correspondiente, en donde un cambio en el metabolismo de alfa-sinuclema del sujeto comparado con la muestra normal correspondiente es indicativo de la identificacion de un agente terapeutico para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con alfa-sinuclema, identificando asf un agente terapeutico para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con alfa-sinuclema.
En una realizacion, se describe un metodo in vitro para identificar un agente terapeutico para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con alfa-sinuclema que comprende: (a) la administracion de un resto marcado y un agente terapeutico a las celulas; (b) recoleccion de alfa-sinuclema de las celulas y una muestra normal correspondiente; (c) medida de alfa-sinuclema marcada y alfa-sinuclema sin marcar de las celulas y la muestra normal correspondiente; (d) determinacion de la relacion de alfa-sinuclema marcada a alfa-sinuclema sin marcar de las celulas y la muestra normal correspondiente; (e) determinacion del metabolismo de alfa-sinuclema a partir de las proporciones de la etapa (d); y (f) la comparacion del metabolismo de alfa-sinuclema de las celulas con el metabolismo de alfa-sinuclema de la muestra normal correspondiente, en donde un cambio en el metabolismo de alfa-sinuclema de las celulas comparado con la muestra normal correspondiente es indicativo de la identificacion de un agente terapeutico para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con alfa-sinuclema, identificando asf un agente terapeutico para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con alfa-sinuclema y una enfermedad o trastorno relacionado con alfa-sinuclema.
En una realizacion, se describe un metodo para predecir la respuesta del sujeto a un agente terapeutico para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con alfa-sinuclema que comprende: (a) administracion de un resto marcado y un agente terapeutico a un sujeto sospechoso de tener una enfermedad o trastorno relacionado con alfa-sinuclema; (b) recoleccion de una muestra biologica del sujeto y una muestra normal correspondiente; (c) medida de alfasinuclema marcada y alfa-sinuclema sin marcar del sujeto y la muestra normal correspondiente; (d) determinacion de la relacion de alfa-sinuclema marcada a alfa-sinuclema sin marcar del sujeto y la muestra normal correspondiente; (e) determinacion del metabolismo de alfa-sinuclema a partir de las proporciones de la etapa (d); y (f) comparacion del metabolismo de alfa-sinuclema del sujeto con el metabolismo de alfa-sinuclema de la muestra normal correspondiente, en donde un cambio en el metabolismo de alfa-sinuclema del sujeto comparado con la muestra normal correspondiente es indicativo de la identificacion de un agente terapeutico para tratar una enfermedad o trastorno relacionado con la alfa-sinuclema, diagnosticando asf una enfermedad o trastorno relacionado con la alfa-sinuclema.
En un aspecto, el resto marcado es un aminoacido marcado. En un aspecto adicional, el aminoacido esta marcado con un radioisotopo o un isotopo no radiomarcado. En un aspecto, el aminoacido se marca con un isotopo no radiomarcado. En un aspecto adicional, el isotopo no radiomarcado puede ser 2H,13C, 15N, 17 o 18O y 33, 34 o 36S. En un aspecto adicional, el aminoacido puede ser leucina, isoleucina y fenilalanina. Ademas, el aminoacido marcado puede ser uno o mas de leucina marcada con 15Nx, en donde x = 1-6; fenilalanina marcada con13Cx, en donde x = 1-9 y isoleucina marcada con 13Cx, en donde x = 1-6. En un aspecto, el resto marcado es agua marcada. En un aspecto adicional, el agua marcada es agua deuterada (2H2O), agua oxfgeno 18 (H218O) u otras moleculas similares. En un aspecto, la muestra biologica es un fluido corporal o una muestra de tejido. En un aspecto adicional, el fluido corporal puede ser sangre, plasma, suero sangumeo, fluido cefalorraqmdeo (CSF), orina, saliva, transpiracion y lagrimas. En un aspecto, el fluido corporal es CSF. En un aspecto adicional, la muestra de tejido es una muestra del SNC. En un aspecto adicional, la muestra del SNC puede ser tejido del sistema del SNC, tejido cerebral, tejido del cerebro anterior, tejido del cerebro intermedio, tejido del cerebro medio, tejido del cerebro posterior y tejido de la medula espinal.
En un aspecto, el agente terapeutico puede ser inhibidores de moleculas pequenas de alfa-sinuclema, anticuerpos contra alfa-sinuclema, activadores de aclaramiento de alfa-sinuclema, inhibidores de sirtuina 2, inhibidores del proteomsoma, inhibidores de moleculas pequenas de polimerizacion de alfa-sinuclema, L-DOPA, inhibidores de la protema transportadora de esteres de colesterol (CEPT), inhibidores de metaloproteasa, inhibidores de colinesterasa, antagonistas de receptores NMDA, hormonas, agentes neuroprotectores e inhibidores de muerte celular. En un aspecto, el agente terapeutico es L-DOPA.
En una realizacion, se describe un kit para determinar el pronostico, diagnostico o eficacia de un regimen terapeutico en un sujeto que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad o trastorno relacionado con alfa-sinuclema. En un aspecto, el kit comprende uno o mas restos marcados y un medio para administrar el uno o mas restos a un sujeto. En un aspecto adicional, el kit comprende ademas un medio para obtener una muestra biologica e instrucciones para determinar la relacion de alfa-sinuclema marcada a sin marcar.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra la secuencia de aminoacidos de alfa-sinuclema (SEC ID NO: 1) que muestra los sitios de escision tnptica.
La Figura 2 muestra una comparacion de secuencias multiples (SEC ID NOs: 1-3) que muestra diferencias en la secuencia de aminoacidos de alfa, beta y gamma-sinuclema.
La Figura 3 muestra peptidos tnpticos que se originan a partir de alfa-sinuclema (SEC ID NOs: 4-13) observados en el espectrometro de masas. Se han analizado alfa-sinuclema aislada de fuentes biologicas como lfquido cefalorraqmdeo, medios de cultivo de celulas condicionadas y lisados celulares, asf como alfa-sinuclema recombinante.
La Figura 4 muestra el espectro de masas del peptido alfa-sinuclema 81-96 (SEC ID NO: 13). Contiene el aminoacido esencial fenilalanina (F). La presencia de una fenilalanina en el peptido tnptico 81-96 hace de este peptido un peptido que se puede usar para controlar el metabolismo de alfa-sinuclema mediante la administracion de fenilalanina marcada con isotopos estables.
La Figura 5 muestra el espectro de masas del peptido alfa-sinuclema 33-43 (SEC ID NO: 6). Contiene aminoacido esencial leucina (L). La presencia de una leucina en el peptido tnptico 33-43 hace de este peptido un peptido que se puede usar para controlar el metabolismo de alfa-sinuclema mediante la administracion de leucina marcada con isotopos estables.
La Figura 6 muestra el espectro de masas del peptido alfa-sinuclema 35-43 (SEC ID NO: 7). Contiene aminoacido esencial leucina (L). La presencia de una leucina en el peptido tnptico 35-43 hace de este peptido un peptido que se puede usar para controlar el metabolismo de alfa-sinuclema mediante la administracion de leucina marcada con isotopos estables.
La Figura 7 muestra curvas estandar de alfa-sinuclema derivadas de muestras tomadas 3, 5 y 7 dfas despues de la administracion del resto marcado.
La Figura 8 muestra la intensidad relativa de iones alfa-sinuclema derivados de muestras tomadas 3, 5 y 7 dfas despues de la administracion del resto marcado.
La Figura 9 muestra la intensidad ionica relativa de alfa-sinuclema medida en muestras marcadas y no marcadas.
La Figura 10 muestra los niveles de protema beta amiloide y alfa-sinuclema detectados mediante el ensayo SILK durante las 36 horas posteriores a la administracion del resto marcado.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se basa, en parte, en el descubrimiento del marcaje con isotopos estables de biomoleculas conduce a pequenas diferencias en el peso molecular de las biomoleculas, pero no altera las propiedades ffsicas o qmmicas de las biomoleculas. Utilizando las tecnicas proporcionadas en el presente documento, el analisis de biomoleculas se puede usar para pronosticar a un sujeto que tiene o tiene riesgo de desarrollar un trastorno neurologico o neurodegenerativo, llamada, la enfermedad de Parkinson. Por consiguiente, en el presente documento se describen metodos y kits utiles para medir el nivel de alfa-sinuclema en un sujeto.
La presente descripcion tambien proporciona un metodo para evaluar si un agente terapeutico afecta la produccion o la velocidad de aclaramiento de alfa-sinuclema en el sujeto. Por consiguiente, el metodo puede usarse para determinar las dosis optimas y/o los regfmenes de dosificacion optimos del agente terapeutico. Ademas, el metodo puede usarse para determinar que sujetos responden mejor a un agente terapeutico particular. Por ejemplo, los sujetos con mayor produccion de alfa-sinuclema pueden responder mejor a un agente terapeutico, mientras que los sujetos con un aclaramiento reducido de alfa-sinuclema pueden responder mejor a otro agente terapeutico. Alternativamente, los sujetos con un genotipo particular pueden responder mejor a un agente terapeutico particular que aquellos con un genotipo diferente. Finalmente, al permitir la cuantificacion espedfica de la isoforma, el metodo puede usarse para determinar si un agente terapeutico puede modular la produccion de una alfa-sinuclema cambiando la produccion de una isoforma a otra isoforma.
Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asf, por ejemplo, las referencias a "el metodo" incluyen uno o mas metodos, y/o pasos del tipo descrito en el presente documento que seran evidentes para los expertos en la materia al leer esta descripcion, etc.
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Aunque cualquier metodo y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento se pueden usar en la practica o en el ensayo de la invencion, ahora se describen los metodos y materiales preferidos.
El termino "sujeto" tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier individuo o paciente al que se realizan los metodos del sujeto. En general, el sujeto es humano, aunque como apreciaran los expertos en la tecnica, el sujeto puede ser un animal. Por lo tanto, otros animales, incluidos marnfferos como roedores (incluidos ratones, ratas, hamsters y cobayas), gatos, perros, conejos, animales de granja, como vacas, caballos, cabras, ovejas, cerdos, etc., y primates (incluidos monos, chimpances, orangutanes y gorilas) estan incluidos dentro de la definicion de sujeto. Ademas, el termino "sujeto" puede referirse a un cultivo de celulas, donde se realizan los metodos de la invencion in vitro por ejemplo, evaluar la eficacia de un agente terapeutico.
Como se usa en el presente documento, los terminos "muestra" y "muestra biologica" se refieren a cualquier muestra adecuada para los metodos proporcionados por la presente invencion. Una muestra de celulas utilizadas en el presente metodo puede obtenerse a partir de muestras de tejido o lfquido corporal de un sujeto, o tejido obtenido mediante un procedimiento de biopsia (p.ej., una biopsia con aguja) o un procedimiento quirurgico. En ciertas realizaciones, la muestra biologica de la presente invencion es una muestra de fluido corporal, p.ej., lfquido cefalorraqrndeo (CSF), sangre, plasma, orina, saliva y lagrimas.
El termino "anticuerpo", como se usa en esta invencion, pretende incluir moleculas intactas de anticuerpos policlonales o monoclonales, asf como tambien fragmentos de los mismos, como Fab y F (ab ').2, Fv y fragmentos de SCA que son capaces de unirse a un determinante epitopico. El termino "se une espedficamente" o "interactua espedficamente", cuando se usa en referencia a un anticuerpo significa que una interaccion del anticuerpo y un epitope particular tiene una constante de disociacion de al menos aproximadamente 1 x 10-6 en general al menos aproximadamente 1 x 10-7, en generalal menos aproximadamente 1 x l0 -8, y en particular al menos aproximadamente 1 x 10-9 o 1 x 10-10 o menos.
Tal como se usa en el presente documento, el termino "enfermedad o trastorno relacionado con alfa-sinuclema" se refiere a cualquier enfermedad o trastorno en donde los niveles circulantes o la produccion de alfa-sinuclema o metabolismo de alfa-sinuclema cambien de normal. Este cambio puede ser un aumento o disminucion en los niveles de alfa-sinuclema o el metabolismo comparado con lo normal.
Como se describe en el presente documento, el isotopo estable de alfa-sinuclema marcado conduce a pequenas diferencias en el peso molecular de la alfa-sinuclema, pero no altera las propiedades ffsicas o qmmicas generales de la alfa-sinuclema. Asf, la alfa-sinuclema se unira a los anticuerpos y se eluira de una columna de cromatograffa lfquida de manera identica. Solo los instrumentos sensibles, como los espectrometros de masas, proporcionan la capacidad de medir las pequenas diferencias de peso entre la alfa-sinuclema marcada y la no marcada.
Se pueden usar varios restos diferentes para marcar alfa-sinuclema. En terminos generales, los dos tipos de restos de marcaje utilizados en el metodo son isotopos radiactivos e isotopos no radiactivos (estables). En una realizacion, los isotopos no radiactivos pueden usarse y medirse mediante espectrometna de masas. Los isotopos estables preferidos incluyen deuterio (2H), 13C, 15N, 17 o 18O, y 33, 34, o 36S, pero se reconoce que una cantidad de otros isotopos estables que cambian la masa de un atomo en mas o menos neutrones de lo que se ve en la forma nativa prevalente tambien senan efectivos. Un marcador adecuado en general cambiara la masa de alfa-sinuclema de manera que se pueda detectar en un espectrometro de masas. Alternativamente, se puede usar un isotopo radioactivo, y la alfasinuclema marcada se puede medir con un contador de centelleo (o mediante escintigraffa nuclear), asf como con un espectrometro de masas. Se pueden usar uno o mas restos marcados simultaneamente o en secuencia.
Por lo tanto, en una realizacion, cuando el metodo se emplea para medir el metabolismo de alfa-sinuclema, el resto marcado normalmente sera un aminoacido. Los expertos en la materia apreciaran que pueden usarse varios aminoacidos para proporcionar el marcador de alfa-sinuclema. En general, la eleccion del aminoacido se basa en una variedad de factores, tales como: (1) el aminoacido en general esta presente en al menos un residuo de alfa-sinuclema. (2) El aminoacido en general puede alcanzar rapidamente el sitio de produccion de protemas y equilibrarse rapidamente a traves de la barrera hematoencefalica u otro tejido o barrera celular. (3) El marcador de aminoacidos en general no influye en el metabolismo de la protema de interes (p.ej., dosis muy grandes de leucina pueden afectar el metabolismo muscular). Y (4) la disponibilidad del aminoacido deseado (es dear., algunos aminoacidos son mucho mas caros o mas diffciles de fabricar que otros).
En una realizacion, el aminoacido es un aminoacido esencial (no producido por el cuerpo), por lo que se puede lograr un mayor porcentaje de marcado. En otra realizacion, el aminoacido es un aminoacido no esencial. Los aminoacidos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, leucina, isoleucina y fenilalanina. Como tal, en una realizacion, el aminoacido marcado es uno o mas de un Aminoacido marcado con 15N, una fenilalanina marcada con 13Cx, donde x = 1 a 9, una isoleucina marcada con 13Cx, donde x = 1 a 6. Por ejemplo, 13C6-fenilalanina, que contiene seis 13atomos de C, se pueden usar para marcar alfa-sinuclema. En otra realizacion, 13C6-leucina se puede usar para marcar alfa-sinuclema.
Existen numerosas fuentes comerciales de aminoacidos marcados, tanto isotopos no radiactivos como isotopos radiactivos. En general, los aminoacidos marcados pueden producirse biologicamente o sinteticamente. Los aminoacidos producidos biologicamente pueden obtenerse de un organismo (p.ej., algas/algas marinas) cultivadas en una mezcla enriquecida de 13C, 15N, u otro isotopo que se incorpora a los aminoacidos a medida que el organismo produce protemas. Los aminoacidos se separan y se purifican. Alternativamente, los aminoacidos pueden prepararse con procesos qmmicos sinteticos conocidos.
En una realizacion, cuando el metodo se emplea para medir el metabolismo de alfa-sinuclema, el resto marcado normalmente se marcara con agua. En un aspecto el agua marcada es agua deuterada (2H2O). En otro aspecto, el agua marcada es agua oxfgeno 18 (H218O). En un aspecto adicional, el agua marcada es una molecula similar al agua deuterada o al agua oxfgeno 18.
El resto marcado (p.ej., aminoacido marcado) puede administrarse a un sujeto por varios metodos. Las vfas de administracion adecuadas incluyen la administracion intravenosa, intraarterial, subcutanea, intraperitoneal, intramuscular u oral. En una realizacion, el resto marcado puede administrarse por infusion intravenosa. En otra realizacion, el resto marcado puede ingerirse por via oral.
El resto marcado puede administrarse lentamente durante un penodo de tiempo, como una gran dosis unica, dependiendo del tipo de analisis elegido (p.ej., estado estacionario o bolo/persecucion), o lentamente durante un penodo de tiempo despues de una dosis inicial de bolo. Para lograr niveles de estado estacionario de la alfa-sinuclema marcada, el tiempo de marcado en general debe ser de una duracion suficiente para que la alfa-sinuclema marcada pueda cuantificarse de manera fiable. En una realizacion, el resto marcado se administra como una dosis oral unica. En otra realizacion, el resto marcado se administra durante un penodo de tiempo que vana de aproximadamente una hora a aproximadamente 36 horas. En otra realizacion, el resto marcado se administra durante un penodo de tiempo que vana de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 12 horas. En otra realizacion mas, el resto marcado se administra durante un penodo de tiempo que vana de aproximadamente 9 horas a aproximadamente 12 horas. En otra realizacion mas, el resto marcado se administra durante un penodo de tiempo que vana de aproximadamente 9 horas a aproximadamente 24 horas. La velocidad de administracion del resto marcado puede variar desde aproximadamente 0,5 mg/kg/h hasta aproximadamente 5 mg/kg/h. En una realizacion, la velocidad de administracion de leucina marcada es desde aproximadamente 1 mg/kg/h hasta aproximadamente 3 mg/kg/h. En otra realizacion, la velocidad de administracion de leucina marcada es de 1,8 mg/kg/h a aproximadamente 2,5 mg/kg/h. En otra realizacion, la leucina marcada puede administrarse como un bolo de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal del sujeto, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 300 mg/kg de peso corporal del sujeto, o entre aproximadamente 100 y aproximadamente 300 mg/kg de peso corporal del sujeto. En otra realizacion mas, la leucina marcada puede administrarse como un bolo de aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal del sujeto. En una realizacion alternativa, la leucina marcada puede administrarse por via intravenosa como se detalla anteriormente despues de un bolo inicial de entre aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 mg/kg, entre aproximadamente 1 a aproximadamente 4 mg/kg, o aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal de tema. En otra realizacion, el agua se administrara diariamente durante 1-7 dfas.
Los expertos en la tecnica apreciaran que la cantidad (o dosis) del resto marcado puede variar y variara. En general, la cantidad depende de (y se estima por) los siguientes factores: (1) El tipo de analisis deseado. Por ejemplo, para lograr un estado estacionario de aproximadamente 15% de leucina marcada en plasma se requieren aproximadamente 2 mg/kg/h durante aproximadamente 9 horas despues de un bolo inicial de 3 mg/kg durante 10 min. Por el contrario, si no se requiere un estado estacionario, un gran bolo del resto marcado (p.ej., 1 o 5 gramos de leucina marcada) pueden administrarse inicialmente. (2) La velocidad de metabolismo de la alfa-sinuclema. Por ejemplo, si la alfasinuclema se produce rapidamente, es posible que se necesite menos tiempo de marcaje y que se necesite menos marcaje, tal vez tan poco como 0,5 mg/kg durante 1 hora. Sin embargo, la mayona de las protemas tienen una vida media de horas a dfas y, por lo tanto, es mas probable que se pueda usar una infusion continua durante 9, 12 o 24 horas a una dosis de 0,5 mg/kg a 4 mg/kg. Y (3) la sensibilidad de deteccion del marcador. Por ejemplo, a medida que aumenta la sensibilidad de la deteccion de marcadores, la cantidad de marcadores necesaria puede disminuir.
Debe entenderse que puede usarse mas de un resto marcado en un solo sujeto. Esto permitina el etiquetado multiple de alfa-sinuclema y podna proporcionar informacion sobre la produccion o aclaramientode alfa-sinuclema en diferentes momentos. Por ejemplo, puede realizar un primer marcado al sujeto durante un penodo de tiempo inicial, seguido de un agente farmacologico (medicamento), y despues puede administrarse un segundo marcador. En general, el analisis de las muestras obtenidas del sujeto proporcionana una medida del metabolismo de la alfa-sinuclema antes y despues de la administracion del farmaco, midiendo directamente el efecto farmacodinamico del farmaco en el mismo sujeto. Alternativamente, se pueden usar multiples marcadores al mismo tiempo para aumentar el marcado de alfa-sinuclema.
Los metodos proporcionan que se obtenga una muestra del sujeto de manera que pueda determinarse el metabolismo de la alfa-sinuclema. En una realizacion, la muestra es un fluido corporal. Los lfquidos corporales adecuados incluyen, entre otros, lfquido cefalorraqrndeo (CSF), plasma sangrnneo, suero sangrnneo, orina, saliva, transpiracion y lagrimas. En otra realizacion, la muestra es una muestra de tejido, tal como una muestra de tejido del sistema nervioso central (SNC). La muestra en general se recolectara usando procedimientos estandar bien conocidos por los expertos en la tecnica.
En una realizacion, la muestra es una muestra del SNC, que incluye, pero no se limita a, tejido del sistema nervioso central, que comprende tejido cerebral y tejido de la medula espinal. En una realizacion, la muestra del SNC puede tomarse de tejido cerebral, que incluye, pero no limita a, el tejido del cerebro anterior (p.ej., corteza cerebral, ganglios basales, hipocampo), el cerebro intermedio (p.ej., talamo, hipotalamo, subtalamo), el cerebro medio (p.ej., tectum, tegmentum), o el cerebro posterior (p.ej., pons, cerebelo, medula oblongata). En otra realizacion, la muestra del SNC se puede recoger del tejido de la medula espinal. En otras realizaciones mas, se pueden tomar muestras del SNC de mas de una region del SNC. Por consiguiente, el metabolismo de la alfa-sinuclema se puede medir en diferentes muestras del SNC, por ejemplo, en la corteza y el hipocampo, simultaneamente.
Las muestras del SNC pueden obtenerse mediante tecnicas conocidas. Por ejemplo, el tejido cerebral o el tejido de la medula espinal puede obtenerse mediante diseccion o reseccion. Alternativamente, las muestras del SNC pueden obtenerse mediante microdiseccion con laser.
En una realizacion, la muestra se obtiene del sujeto en un solo punto de tiempo predeterminado, por ejemplo, dentro de una hora de marcado. En general, para protemas con metabolismo rapido, las muestras obtenidas durante las primeras 12 a 18 horas despues del inicio de la administracion del resto marcado se pueden usar para determinar la velocidad de produccion de alfa-sinuclema, y muestras tomadas durante las 24 a 36 horas posteriores al inicio de la administracion del resto marcado se puede usar para determinar la velocidad de aclaramiento de alfa-sinuclema. En general, para protemas con metabolismo lento, las muestras obtenidas durante los primeros 1-4 dfas despues del inicio de la administracion del resto marcado se pueden usar para determinar la velocidad de produccion de alfasinuclema, y las muestras tomadas durante 4-14 dfas despues El inicio de la administracion del resto marcado se puede usar para determinar la velocidad de aclaramiento de alfa-sinuclema. En otra realizacion, la muestra se obtiene del sujeto cada hora de 0 a 12 horas, de 0 a 24 horas, o de 0 a 36 horas. En otra realizacion mas, se pueden tomar muestras de una hora a dfas o incluso semanas de diferencia, dependiendo de las velocidades de produccion y aclaramiento de alfa-sinuclema.
Aquellos expertos en la tecnica apreciaran que el resto marcado debe administrarse de manera oportuna, lo que permitira la observacion de la incorporacion del resto marcado en alfa-sinuclema. El marcado de alfa-sinuclema se llevara a cabo a medida que la protema se sintetice dentro de la celula. Pero la incorporacion del marcador en la alfasinuclema solo se mide una vez que la protema ha salido de la celula y ha entrado en el ffquido cefalorraqrndeo o en el torrente sangrnneo. Si la protema experimenta un procesamiento complejo para salir de la celula, el tiempo desde la smtesis hasta la aparicion en el fluido corporal podna ser significativo. Por lo tanto, si tarda 24-48 horas para que aparezca la alfa-sinuclema en el CSF, la administracion del marcador puede ocurrir entre 24 y 48 horas antes del inicio del muestreo del CSF. Alternativamente, si se tarda 48-72 horas para que aparezca alfa-sinuclema en el CSF, la administracion del marcador puede tener lugar entre 48 y 72 horas antes del inicio del muestreo del CSF. Ademas, si la alfa-sinuclema tarda de 3 dfas a una semana en aparecer en el CSF, es posible que la administracion del marcador tenga que realizarse de 3 dfas a una semana antes del inicio del muestreo del CSF.
Debe entenderse que si se desean muestras en diferentes puntos de tiempo, se puede usar mas de un sujeto. Por ejemplo, un sujeto puede usarse para una muestra de referencia, otro sujeto para un punto de tiempo de una hora despues de la administracion del resto marcado, otro sujeto para un punto de tiempo seis horas despues de la administracion del resto marcado.
En consecuencia, la presente descripcion proporciona que la deteccion de la cantidad de alfa-sinuclema marcada y la cantidad de alfa-sinuclema no marcada en la muestra se puede usar para determinar la relacion de alfa-sinuclema marcada a alfa-sinuclema no marcada, que a su vez, puede ser utilizado para estimar las velocidades de produccion y aclaramiento de alfa-sinuclema en el sujeto. Los medios ilustrativos para detectar diferencias en la masa entre la alfa-sinuclema marcada y no marcada incluyen, entre otros, espectrometna de masas con cromatograffa ffquida, espectrometna de masas con cromatograffa de gases, espectrometna de masas MALDI-TOF y espectrometna de masas en tandem.
Sin embargo antes de detectar la relacion de alfa-sinuclema marcada a alfa-sinuclema no marcada, puede ser conveniente aislar y/o separar la alfa-sinuclema de otras biomoleculas en la muestra. Por lo tanto, en una realizacion, la inmunoprecipitacion puede usarse para aislar y purificar la alfa-sinuclema antes de que se analice. En otra realizacion, la alfa-sinuclema puede aislarse o purificarse mediante cromatograffa de afinidad o cromatograffa de inmunoafinidad. Alternativamente, los espectrometros de masas que tienen configuraciones de cromatograffa pueden usarse para separar biomoleculas sin inmunoprecipitacion, y despues la alfa-sinuclema puede medirse directamente. En una realizacion ilustrativo, la alfa-sinuclema puede inmunoprecipitarse y despues analizarse mediante un sistema de cromatograffa Kquida interconectado con una unidad de MS en tandem equipada con una fuente de ionizacion por electrospray (LC-ESl- MS tandem).
En otro aspecto, la presente descripcion proporciona que el metabolismo de multiples biomoleculas en la misma muestra puede medirse simultaneamente. Es decir, tanto la cantidad de biomolecula marcada como no marcada se pueden detectar y medir por separado o al mismo tiempo para multiples biomoleculas. Como tal, la presente descripcion proporciona un metodo util para detectar cambios en la produccion y aclaramiento de una o mas biomoleculas a gran escala (es decir., proteomica/metabolomica) y proporciona un medio sensible para detectar y medir biomoleculas involucradas en la fisiopatologfa subyacente. En un aspecto, la presente descripcion tambien proporciona un medio para medir multiples tipos de biomoleculas. En este contexto, por ejemplo, una protema y un ifpido pueden medirse de forma simultanea o secuencial. Por ejemplo, tanto alfa-sinuclema como Ap podnan aislarse de una muestra de CSF y la produccion y el aclaramiento de las dos protemas individuales podnanse determinar en el mismo sujeto.
Una vez que la cantidad de alfa-sinuclema marcada y no marcada se haya detectado en una muestra, la relacion o el porcentaje de alfa-sinuclema marcada con respecto a la alfa-sinuclema no marcada puede determinarse dividiendo la cantidad de alfa-sinuclema marcada con la cantidad de alfa-sinuclema marcada con la cantidad de alfa-sinuclema sin marcar. Si se usa un espectrometro de masas para la deteccion de alfa-sinuclema, la relacion se calculana dividiendo la intensidad de iones de alfa-sinuclema marcada con la intensidad de iones de la alfa-sinuclema sin marcar.
La presente descripcion permite la medida de la protema marcada y no marcada al mismo tiempo, de modo que se puede hacer la relacion de protema marcada a no marcada, asf como otros calculos. Como las medidas de las relaciones de marcaje se combinan en diferentes tiempos de muestreo despues de la infusion del isotopo estable, los datos pueden combinarse para formar un perfil metabolico. Los expertos en la tecnica estaran familiarizados con los modelos cineticos de primer orden de marcado que pueden usarse con el metodo de la presente descripcion. Por ejemplo, se puede calcular la velocidad de smtesis fraccional (por sus siglas en ingles, FSR). El FSR es igual a la velocidad inicial de aumento de la protema marcada a no marcada dividida por el enriquecimiento del precursor. Asimismo, se puede calcular la velocidad de aclaramiento fraccional (por sus siglas en ingles, FCR). Ademas, otros parametros, como la velocidad de rotacion fraccional (por sus siglas en ingles, FTR), el tiempo de demora y el estado estacionario del trazador isotopico, pueden determinarse y usarse como medidas del metabolismo y la fisiologfa de la protema. Ademas, se puede realizar un modelado en los datos para ajustar modelos de multiples compartimentos para estimar la transferencia entre compartimentos. Por supuesto, el tipo de modelado matematico elegido dependera de los parametros individuales de smtesis y aclaramiento (p.ej., una agrupacion, agrupaciones multiples, estado estacionario, estado no estacionario, modelado compartimental, etc.). Como se usa en presente documento, "estado estacionario" se refiere a un estado durante el cual hay un cambio insignificante en el parametro medido durante un penodo de tiempo espedfico.
Se ha demostrado que la metodologfa del marcaje cinetico de isotopos estables (SILK) detecta la incorporacion metabolica de isotopos (no radiactivos) estables en protemas recien sintetizadas en el lfquido cefalorraqmdeo de un sujeto vivo. Para informacion detallada sobre SILK, ver Pub. EE.UU. Nos. 2008/014594l y 2009/0142766, y PCT Internacional Pub. No. WO 2006/107814). SILK permite medir las velocidades de produccion y aclaramiento de protemas en el sistema nervioso central. Hasta ahora, esta metodologfa se ha aplicado para medir la produccion y el aclaramiento de la protema beta amiloide (Ap) implicada en la enfermedad de Alzheimer (EA).
Sin embargo, hasta ahora, la version actual del ensayo SILK mide solo el metabolismo de Ap. En los datos que se muestran en el presente documento, se muestra que el metodo SILK tambien se puede aplicar a la alfa-sinuclema. Este ensayo es distinto en el uso de un anticuerpo que se une espedficamente a la alfa-sinuclema para el aislamiento de la alfa-sinuclema del fluido biologico y en la seleccion de peptidos espedficos de la alfa-sinuclema para controlar la incorporacion de isotopos estables en la alfa-sinuclema.
Por consiguiente, la produccion de protemas se basa habitualmente en la velocidad de aumento de la relacion de protemas marcadas/no marcadas con el tiempo (es decir., la pendiente, la curva de ajuste exponencial o un ajuste de modelo compartimental definen la velocidad de produccion de protemas). Para estos calculos, en general se requiere un mmimo de una muestra (se podna estimar el marcador de referencia), se prefieren dos y se prefieren las multiples muestras para calcular una curva precisa de la captacion del marcador en la protema (es decir., la velocidad de produccion). Si se usan o prefieren multiples muestras, no es necesario que las muestras se tomen del mismo tema. Por ejemplo, las protemas se pueden marcar en cinco sujetos diferentes en el punto cero del tiempo, y despues tomar una sola muestra de cada sujeto en un punto de tiempo diferente despues del marcado.
A la inversa, una vez que finaliza la administracion del aminoacido marcado, la velocidad de disminucion de la relacion de la protema marcada a la no marcada refleja habitualmente la velocidad de aclaramiento de esa protema. Para estos calculos, en general se requiere un mmimo de una muestra (podna estimarse el marcador de referencia), se prefieren dos y se prefieren las multiples muestras para calcular una curva precisa de la disminucion del marcador de la protema a lo largo del tiempo (es decir., la velocidad de liquidacion). Si se usan o prefieren multiples muestras, no es necesario que las muestras se tomen del mismo tema. Por ejemplo, las protemas se pueden marcar en cinco sujetos diferentes en el punto cero del tiempo, y despues tomar una sola muestra de cada sujeto en un punto de tiempo diferente despues del marcado. La cantidad de protema marcada en una muestra del SNC en un momento dado refleja la velocidad de produccion o la velocidad de aclaramiento (es dedr., aclaramiento o destruccion) y en general se expresa como porcentaje por hora o la masa/tiempo (p.ej., mg/h) de la protema en el sujeto.
Los metodos de la presente descripcion se pueden usar para diagnosticar o monitorear la progresion de una enfermedad neurologica o neurodegenerativa mediante la medida in vivo del metabolismo de alfa-sinuclema en un sujeto. Ademas, los metodos pueden usarse para monitorear el tratamiento de una enfermedad neurologica o neurodegenerativa mediante la medida in vivo del metabolismo de alfa-sinuclema en un sujeto. El metabolismo de la alfa-sinuclema puede estar vinculado a una enfermedad neurologica o neurodegenerativa, de manera que cualquier aumento o disminucion puede ser indicativo de la presencia o progresion de la enfermedad. Por lo tanto, el metabolismo de la alfa-sinuclema puede compararse con el metabolismo de la alfa-sinuclema en una muestra normal correspondiente, con el metabolismo de la alfa-sinuclema en un sujeto con un estado de enfermedad neurologica o neurodegenerativa conocida, con el metabolismo de la alfa-sinuclema el mismo sujeto determinado en un tiempo anterior, o cualquier combinacion de los mismos.
Ademas, tales metodos pueden ayudar a identificar a un individuo que tiene una predisposicion para el desarrollo de la enfermedad, o pueden proporcionar un medio para detectar la enfermedad antes de la aparicion de smtomas clmicos reales. Un diagnostico mas definitivo de este tipo puede permitir que los profesionales de la salud empleen medidas preventivas o un tratamiento agresivo antes, lo que evita el desarrollo o la progresion de la enfermedad.
Como se usa en presente documento, una "muestra normal correspondiente" se refiere a una muestra del mismo organo y/o del mismo tipo que la muestra que se examina. En un aspecto, la muestra normal correspondiente comprende una muestra de celulas obtenidas de un individuo sano. Dicha muestra normal correspondiente puede, pero no es necesario, de un individuo de la misma edad y/o del mismo sexo que el individuo que proporciona la muestra que se esta examinando. En otro aspecto, la muestra normal correspondiente comprende una muestra de celulas obtenidas de una parte del tejido del sujeto, por lo demas sano, del cual se obtiene la muestra que se esta analizando.
Con referencia al metabolismo de alfa-sinuclema en un sujeto con un estado de enfermedad neurologica o neurodegenerativa conocida incluye un metabolismo predeterminado de alfa-sinuclema unido a una enfermedad neurologica o neurodegenerativa. Por lo tanto, el metabolismo puede compararse con un metabolismo conocido de alfa-sinuclema obtenido de una muestra de un solo individuo o puede ser de una lmea celular establecida del mismo tipo que la del sujeto. En un aspecto, la lmea celular establecida puede ser una de un panel de tales lmeas celulares, en donde el panel puede incluir diferentes lmeas celulares del mismo tipo de enfermedad y/o diferentes lmeas celulares de diferentes enfermedades asociadas con alfa-sinuclema. Dicho panel de lmeas celulares puede ser util, por ejemplo, para practicar el presente metodo cuando solo puede obtenerse un pequeno numero de celulas del sujeto a tratar, proporcionando asf una muestra sustituta de las celulas del sujeto, y tambien puede ser util Incluir como control las muestras en la practica de los metodos actuales.
Las enfermedades neurologicas o neurodegenerativas ilustrativos que pueden estar relacionadas con el metabolismo de alfa-sinuclema incluyen, entre otras pero no limitan a, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, los accidentes cerebrovasculares, las demencias frontotemporales (FTD), los trastornos relacionados con el envejecimiento y las demencias, la enfermedad corporal de Lewy, Lesion cerebral traumatica (por sus siglas en ingles, TBI ) y esclerosis lateral amiotrofica (ELA o enfermedad de Lou Gehrig). Tambien se preve que el metodo de la invencion pueda usarse para estudiar la fisiologfa normal, el metabolismo y la funcion del SNC.
En otro aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para evaluar si un agente terapeutico usado para tratar una enfermedad neurologica o neurodegenerativa afecta el metabolismo de alfa-sinuclema en el sujeto. Por ejemplo, el metabolismo de la alfa-sinuclema se puede medir para determinar si un agente terapeutico dado produce un aumento, o una disminucion en la produccion o aclaramiento de la alfa-sinuclema. En una realizacion, el metodo se realiza in vivo, como se describe en el presente documento. En otra realizacion, el metodo se realiza in vitro utilizando un cultivo de celulas, donde el cultivo de celulas es el "sujeto" en los metodos descritos en el presente documento. Por consiguiente, el uso de los metodos proporcionados en el presente documento permitira a los expertos en la tecnica determinar con precision el grado de cambio en el metabolismo de la alfa-sinuclema, y correlacionar estas medidas con el resultado clmico del tratamiento modificador de la enfermedad. Los resultados de este aspecto de la presente descripcion, por lo tanto, pueden ayudar a determinar las dosis optimas y la frecuencia de las dosis de un agente terapeutico, pueden ayudar en la toma de decisiones con respecto al diseno de ensayos clmicos y, en ultima instancia, pueden acelerar la validacion de agentes terapeuticos eficaces para el tratamiento de enfermedades neurologicas o neurodegenerativas.
Por lo tanto, el metodo de la presente descripcion puede usarse para predecir que sujetos responderan a un agente terapeutico particular. Por ejemplo, los sujetos con metabolismo aumentado de alfa-sinuclema pueden responder a un agente terapeutico particular de manera diferente que los sujetos con metabolismo disminuido de alfa-sinuclema. En particular, los resultados del metodo pueden utilizarse para seleccionar el tratamiento apropiado (p.ej., un agente que bloquea la produccion de alfa-sinuclema o un agente que aumenta el aclaramiento de alfa-sinuclema) para un sujeto en particular. De manera similar, los resultados del metodo pueden usarse para seleccionar el tratamiento apropiado para un sujeto que tiene un genotipo particular.
El metodo para predecir que sujetos responderan a un agente terapeutico particular incluye administrar un agente terapeutico y un resto marcado al sujeto, en donde el resto marcado se incorpora a alfa-sinuclema a medida que se produce en el sujeto. En una realizacion, el agente terapeutico puede administrate al sujeto antes de la administracion del resto marcado. En otra realizacion, el resto marcado puede administrate al sujeto antes de la administracion del agente terapeutico. El penodo de tiempo entre la administracion de cada uno puede ser de varios minutos, una hora, varias horas o muchas horas. En otra realizacion mas, el agente terapeutico y el resto marcado pueden administrarse simultaneamente. El metodo incluye ademas recolectar al menos una muestra biologica, que incluye alfa-sinuclema marcada y no marcada, determinar una relacion de alfa-sinuclema marcada y alfa-sinuclema no marcada en la muestra, y calcular el metabolismo de la alfa-sinuclema en el sujeto. Posteriormente, una comparacion del metabolismo calculado con un valor de control determinara si el agente terapeutico altera el metabolismo (p.ej., alterando la velocidad de produccion o la velocidad de aclaramiento) de alfa-sinuclema en el sujeto.
Los expertos en la tecnica apreciaran que el agente terapeutico puede variar y dependera de la enfermedad o trastorno neurologico o neurodegenerativo a tratar. Los ejemplos no limitantes de agentes terapeuticos adecuados incluyen inhibidores de moleculas pequenas de la produccion de alfa-sinuclema, anticuerpos humanizados contra la alfasinuclema, activadores de aclaramiento del SNC de la alfa-sinuclema, inhibidores de sirtuina 2, inhibidores del proteosoma, inhibidores de moleculas pequenas de la polimerizacion de alfa-sinuclema.
Otros agentes terapeuticos de la EA adecuados incluyen inhibidores de la protema de transferencia de colesterilester (CETP), inhibidores de la metaloproteasa, inhibidores de la colinesterasa, antagonistas del receptor de NMDA, hormonas, agentes neuroprotectores, inhibidores de la produccion de Ap, tales como inhibidores y moduladores de las secretasas gamma y beta, anticuerpos anti-ap, anticuerpos tau, e inhibidores de la muerte celular. Muchos de los agentes terapeuticos mencionados anteriormente tambien pueden afectar al metabolismo in vivo de otras protemas implicadas en trastornos neurodegenerativos.
El agente terapeutico puede administrarse al sujeto de acuerdo con metodos conocidos. Habitualmente, el agente terapeutico se administrara por via oral, pero tambien se pueden usar otras vfas de administracion tales como parenteral o topica. La cantidad de agente terapeutico que se administra al sujeto puede y variara dependiendo del tipo de agente, el sujeto y el modo particular de administracion. Los expertos en la materia apreciaran que las dosis pueden determinarse con la orientacion de Goodman & Goldman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Decima edicion (2001), Apendice II, paginas 475-493, y el Physicians' Desk Reference.
En otro aspecto, la presente descripcion proporciona un kit para realizar los metodos descritos en presente documento. En una realizacion, se proporciona un kit para diagnosticar y/o controlar la progresion o el tratamiento de una enfermedad neurologica o neurodegenerativa en un sujeto. El kit incluye uno o mas restos marcados (p.ej., aminoacidos marcados) y un medio para administrar uno o mas aminoacidos al sujeto. El kit puede incluir ademas un medio para obtener una muestra biologica a intervalos regulares de tiempo del sujeto. En ciertas realizaciones, el kit tambien incluira instrucciones para detectar y determinar la relacion de alfa-sinuclema marcada y sin marcar a lo largo del tiempo y para calcular el metabolismo de la alfa-sinuclema. En una realizacion, las instrucciones divulgaran metodos para comparar la concentracion calculada con ciertos estandares y/o controles como se describe en presente documento.
En otra realizacion, el kit de la presente descripcion proporciona un vehmulo compartimentado que incluye uno o mas recipientes que contienen el resto marcado y los diversos medios para realizar los metodos de la invencion.
En esta realizacion, se demuestra la viabilidad de un ensayo de alfa-sinuclema de cinetica de marcaje de isotopos estables (SILK). La Figura 1 muestra los sitios de escision tnptica en la secuencia alfa-sinuclema y, por lo tanto, una lista de posibles peptidos tnpticos que se originan a partir de alfa-sinuclema. Pueden usarse otras proteasas en lugar de tripsina y produciran diferentes patrones de escision y diferentes peptidos. Cuando se digiere alfa-sinuclema recombinante o alfa-sinuclema aislada de fuentes biologicas, se observa varios peptidos tnpticos que se originan a partir de la alfa-sinuclema. La Figura 3 muestra una lista de peptidos que ha observado a partir de alfa-sinuclema recombinante o de alfa-sinuclema que se ha aislado de CSF u otras fuentes biologicas.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar con mas detalle las ventajas y caractensticas de la presente descripcion, pero no pretenden limitar el alcance de la invencion. Si bien son habituales de los que podnan usarse, alternativamente se pueden usar otros procedimientos, metodologfas o tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica.
Ejemplos
Ejemplo 1: Medida de incorporacion de leucina 13C6 en alfa-sinuclema producida por celulas
Las celulas de cultivo de tejidos (SH-SY5Y) se transfectaron de forma estable con un constructo que conduce a la sobreexpresion de alfa-sinuclema. Las celulas se cultivaron en medios que contienen relaciones conocidas de leucina marcada con 13C6 a 12C6 (relacion trazadora/traza; TTR) (TTR = 0.00, 0.0127, 0.0256, 0.0526, 0.111, 0.25). Los medios se recolectaron despues de 3, 5 y 7 dfas de crecimiento en los medios marcados. La alfa-sinuclema se aislo a partir de muestras de medios mediante inmunoprecipitacion utilizando C2N-ASMAB3. Las protemas aisladas se digirieron con tripsina y se analizaron en un espectrometro de masas de triple cuadrupolo TSQ-Vantage para monitorear el peptido alfa-sinuclema 35-43 marcado y no marcado. Se calculo la relacion de alfa-sinuclema marcada a no marcada para cada muestra. La concentracion aproximada de alfa-sinuclema medida por la intensidad de la alfa-sinuclema

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un metodo para medir el nivel de alfa-sinuclema in vitro que comprende:
poner en contacto una muestra biologica de un sujeto con un isotopo detectable;
medir el nivel de alfa-sinuclema marcada en una muestra; y
comparar el nivel de alfa-sinuclema marcada en la muestra con una muestra normal correspondiente;
en dende se determina que un cambio en el nivel de sinuclema alfa de la muestra comparado con la muestra normal correspondiente para pronosticar la enfermedad neurologica o neurodegenerativa, y/o identifica la eficacia de un regimen terapeutico; y
en donde la enfermedad neurologica o neurodegenerativa es la enfermedad de Parkinson.
2. Un metodo para medir los niveles de alfa-sinuclema marcada y alfa-sinuclema no marcada in vitro que comprende:
(a) medida de alfa-sinuclema marcada y alfa-sinuclema no marcada de una muestra biologica de un sujeto que ha sido administrado con un resto marcado y de la muestra normal correspondiente;
(b) determinacion de la relacion de alfa-sinuclema marcada a alfa-sinuclema no marcada a partir de la muestra y la muestra normal correspondiente;
(c) determinacion del metabolismo de alfa-sinuclema a partir de las proporciones de la etapa (b); y
(d) comparacion del metabolismo de alfa-sinuclema de la muestra con el metabolismo de alfa-sinuclema de la muestra normal correspondiente,
en donde el marcador es un isotopo detectable;
en donde se determina un cambio en el metabolismo de la alfa sinuclema de la muestra comparado con la muestra normal correspondiente para pronosticar la enfermedad neurologica o neurodegenerativa y/o predecir la respuesta del sujeto a un agente terapeutico; y
en donde la enfermedad neurologica o neurodegenerativa es la enfermedad de Parkinson.
3. Un metodo para medir los niveles de alfa-sinuclema marcada y alfa-sinuclema no marcada. in vitro que comprende:
(a) medida de alfa-sinuclema marcada y alfa-sinuclema no marcada a partir de una muestra biologica de un sujeto administrado con el resto marcado y un agente terapeutico y la muestra normal correspondiente;
(b) determinacion de la relacion de alfa-sinuclema marcada a alfa-sinuclema no marcada a partir de la muestra y la muestra normal correspondiente;
(c) determinacion del metabolismo de alfa-sinuclema a partir de las proporciones de la etapa (b); y
(d) comparacion del metabolismo de alfa-sinuclema de la muestra con el metabolismo de alfa-sinuclema de la muestra normal correspondiente;
en donde el marcador es un isotopo detectable;
en donde se determina un cambio en el metabolismo de la alfa sinuclema de la muestra comparado con el nivel en la muestra normal para identificar la eficacia de un regimen terapeutico; y
en donde la enfermedad neurologica o neurodegenerativa es la enfermedad de Parkinson.
4. Un metodo para identificar un agente terapeutico para tratar una enfermedad neurologica o neurodegenerativa, en donde el metodo comprende:
(a) proporcionar una muestra biologica de un sujeto administrado con un resto marcado y un agente terapeutico y una muestra normal correspondiente;
(b) medida de alfa-sinuclema marcada y alfa-sinuclema sin marcar en la muestra biologica del sujeto y la muestra normal correspondiente;
(c) determinacion de la relacion de alfa-sinuclema marcada a alfa-sinuclema no marcada de la muestra y la muestra normal correspondiente;
(d) determinacion del metabolismo de alfa-sinuclema a partir de las proporciones de la etapa (c);
(e) comparacion del metabolismo de alfa-sinuclema de la muestra con el metabolismo de alfa-sinuclema de la muestra normal correspondiente;
en donde el marcador es un isotopo detectable;
en donde la enfermedad neurologica o neurodegenerativa es la enfermedad de Parkinson; y en donde un cambio en el metabolismo de la alfa sinuclema de la muestra comparado con la muestra normal correspondiente indica si el agente terapeutico es eficaz para tratar la enfermedad neurologica o neurodegenerativa, identificando asf un agente terapeuti
5. Un metodo in vitro para identificar un agente terapeutico para tratar una enfermedad neurologica o neurodegenerativa que comprende:
(a) administracion de un resto marcado y un agente terapeutico a las celulas in vitro
(b) coleccion de alfa-sinuclema de las celulas y una muestra normal correspondiente in vitro
(c) medida de alfa-sinuclema marcada y alfa-sinuclema sin marcar de las celulas y la muestra normal correspondiente;
(d) determinacion de la relacion de alfa-sinuclema marcada a alfa-sinuclema sin marcar de las celulas y la muestra normal correspondiente;
(e) determinacion del metabolismo de alfa-sinuclema a partir de las proporciones de la etapa (d); y
(f) comparacion del metabolismo de la alfa-sinuclema de las celulas con el metabolismo de la alfa-sinuclema de la muestra normal correspondiente;
en donde el marcador es un isotopo detectable;
en donde la enfermedad neurologica o neurodegenerativa es la enfermedad de Parkinson; y en donde un cambio en el metabolismo de la alfa sinuclema de la muestra comparado con la muestra normal correspondiente indica si el agente terapeutico es eficaz para tratar la enfermedad neurologica o neurodegenerativa por lo que se identifica un agente terapeuti
6. El metodo de las reivindicaciones 2 a 5, en donde el resto marcado es un aminoacido marcado o agua marcada.
7. El metodo de la reivindicacion 6, en donde el aminoacido esta marcado con un radioisotopo o un isotopo no marcado con radio.
8. El metodo de la reivindicacion 7, en donde el aminoacido esta marcado con un isotopo no radiomarcado.
9. El metodo de la reivindicacion 8, en donde el isotopo no radiomarcado se selecciona del grupo que consiste en: 2H, 13q 15^ 17 o 18Q y 33, 34 o 36g
10. El metodo de la reivindicacion 6, en donde el aminoacido se selecciona del grupo que consiste en leucina, isoleucina y fenilalanina.
11. El metodo de las reivindicaciones 2-5, en donde el resto marcado es un agua marcada.
12. El metodo de las reivindicaciones 2-5, en donde la muestra biologica se selecciona del grupo que consiste en: un fluido corporal o una muestra de tejido.
13. El metodo de las reivindicaciones 3-5, en donde en el agente terapeutico se selecciona del grupo que consiste en: inhibidores de molecula pequena de alfa-sinuclema, anticuerpos contra alfa-sinuclema, activadores de aclaramiento de alfa-sinuclema, inhibidores de sirtuina 2, inhibidores de proteomsoma, inhibidores de molecula pequena de la polimerizacion de alfa-sinuclema, L-DOPA, inhibidores de la protema transportadora de esteres de colesterol (CEPT), inhibidores de la metaloproteasa, inhibidores de la colinesterasa, antagonistas del receptor de NMDA, hormonas, agentes neuroprotectores e inhibidores de la muerte celular.
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