ES2583033T3

ES2583033T3 - Métodos de determinación del recambio de amiloide beta en sangre

Info

Publication number: ES2583033T3
Application number: ES11787251.5T
Authority: ES
Inventors: Randall J. Bateman; David M. Holtzman; Kwasi G. Mawuenyega
Original assignee: University of Washington; Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: University of Washington; Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 2010-05-24
Filing date: 2011-05-24
Publication date: 2016-09-16
Anticipated expiration: 2031-05-24
Also published as: EP2575596A2; CA2800680C; JP2016153788A; KR20130116792A; US20130115716A1; AU2011258462B2; JP5886837B2; WO2011149947A3; DK2575596T3; EP3066979B1; EP3066979A1; CA2800680A1; WO2011149947A2; AU2011258462A1; EP2575596A4; US20170146557A1; JP6293802B2; JP2013532277A; EP2575596B1; BR112012029985A2

Abstract

Un método in vitro para medir el recambio in vivo de Aß en la sangre de un sujeto, comprendiendo el método: (a) determinar por espectrometría de masas la cantidad de Aß marcado, o la cantidad tanto de Aß marcado como de Aß no marcado en una muestra de sangre obtenida del sujeto; y (b) calcular el recambio de Aß usando la cantidad de Aß marcado, o la cantidad tanto de Aß marcado como de Aß no marcado, determinada en la etapa (a), en el cual (i) el recambio de Aß se calcula a partir de la cantidad de Aß marcado, o la cantidad de Aß marcado y Aß no marcado, en una muestra obtenida entre 15 minutos y 4 horas después de que haya comenzado la administración oral o intravenosa al sujeto de al menos un aminoácido marcado con un isótopo no radiactivo estable; o (ii) el recambio de Aß se determina a partir del pico de producción de Aß marcado que aparece entre aproximadamente 1 y 5 horas después de que haya comenzado la administración del bolo oral al sujeto de al menos un aminoácido marcado con un isótopo no radiactivo estable, o entre aproximadamente 5 y 10 horas después de que haya comenzado la administración intravenosa mediante una infusión de 9 horas de al menos un aminoácido marcado con un isótopo no radiactivo estable al sujeto.

Description

DESCRIPCION

Metodos de determinacion del recambio de amiloide beta en sangre 5 Referencia a la lista de secuencias

[0001] Se adjunta a continuacion una copia en papel de la lista de secuencias y una forma legible por ordenador de la misma lista de secuencias y se incorporan en la presente memoria por referencia. La informacion registrada en la forma legible por ordenador es identica a la lista de secuencias por escrito, segun 37 C.F.R. 1.821 (f).

10

Campo de la invencion

[0002] La invencion se refiere a un metodo para determinar el metabolismo de Ap en la sangre.

15 Antecedentes de la invencion

[0003] La enfermedad de Alzheimer (AD) es la causa mas comun de demencia y es un problema creciente de salud publica. Actualmente se estima que afecta a 5 millones de personas en los Estados Unidos, con un aumento esperado hasta 13 millones para el ano 2050. AD conduce a perdida de memoria, funcion cognitiva, y finalmente

20 independencia. La AD conlleva una pesada carga personal y financiera en el paciente y la familia. A causa de la gravedad y prevalencia creciente de la enfermedad en la poblacion, es urgente desarrollar mejores tratamientos y suministrarlos en la fase mas temprana de la enfermedad.

Referencia a figuras de color

25

[0004] El archivo de solicitud contiene al menos una fotograffa ejecutada en color. Las copias de esta publicacion de solicitud de patente con fotograffas de color se proporcionaran por la oficina tras peticion y pago de la tasa necesaria.

30 Breve descripcion de las figuras

[0005]

La FIG. 1 representa un grafico que muestra el porcentaje de Ap total marcado en la sangre sobre 36 a 48 horas 35 para 6 participates (trculos azules) y el porcentaje de Ap total marcado en FCR en doce participates (cuadrados rojos). Observese la rapida elevacion hasta la meseta en 9 horas con una rapida tasa de eliminacion en la sangre, aunque FCR no se aproxima a la meseta hasta 18 horas o despues. Tambien observese la eliminacion mucho mas rapida de Ap en la sangre en comparacion con FCR Ap. Tambien puede haber un segundo pico de Ap marcado en la sangre desde 20 hasta 30 horas (pico ~26 horas).

40 La FIG. 2 representa el porcentaje de Ap marcado en la sangre sobre 40 horas despues (a) marcaje intravenoso y (b) marcaje oral.

La FIG. 3 representa la cuantificacion absoluta de isoformas de Ap en la sangre sobre 40 horas. Se anadieron patrones internos de Amiloide-beta marcados con 15N (ISTD) a la muestra antes del procesamiento. Las muestras se procesaron como se describe en los ejemplos, y se representaron las cantidades absolutas de 45 isoformas de amiloide beta.

Descripcion detallada de la invencion

[0006] La presente invencion proporciona un metodo para determinar el metabolismo de Ap midiendo el recambio 50 de Ap en una muestra de sangre. En mas detalle, la invencion proporciona la <reivindicacion 1>. Como se usa en la

presente memoria "recambio" se refiere en una realizacion a la tasa de produccion de Ap marcado, la tasa de eliminacion de Ap marcado, o una combinacion de ambas, como se detalla a continuacion. En cada caso, sin embargo, la determinacion del metabolismo de Ap requiere una medicion de Ap marcado en una muestra. En otra realizacion, "recambio" se refiere a la vida media de Ap en la sangre. Como se usa en ese documento, " Ap " se 55 refiere a amiloidep total, una isoforma de amiloidep tal como Ap38, Ap40, o Ap42, o una combinacion de los mismos. De forma ventajosa, un metodo de la invencion elimina la necesidad de una muestra, mas diffcil de obtener e invasiva del sistema nervioso central para determinar el metabolismo de Ap.

I. Metodo para determinar el metabolismo de Ap en la sangre

60

[0007] Un aspecto de la presente invencion es un metodo para determinar el metabolismo de Ap en la sangre. De forma importante, el recambio de Ap en la sangre puede reflejar el metabolismo de Ap en el sistema nervioso central. (Esto es contrario a los niveles constantes de Ap en la sangre, que no se han correlacionado satisfactoriamente con Ap del sistema nervioso central.) Hablando en lmeas generales la medicion del recambio de

65 Ap en la sangre comprende administrar un marcador a un sujeto, recoger una muestra de sangre del sujeto y

2

analizar la muestra para determinar el recambio de Ap en la muestra. Cada etapa se describe en mas detalle a continuacion.

(a) administracion de un marcador

5

[0008] El metodo de la invencion requiere en parte, que se haya administrado un marcador a un sujeto. Los marcadores adecuados y metodos adecuados de administracion se detallan a continuacion.

i. marcadores

10

[0009] Los marcadores adecuados deben permitir la medicion del recambio de Ap en la sangre. A modo de ejemplo no limitante, un marcador adecuado puede incluir un aminoacido o un precursor de aminoacido marcado. En una realizacion, el marcador puede comprender al menos un aminoacido marcado. El aminoacido puede ser de origen natural, sintetico, o un analogo de aminoacido. En cada caso, sin embargo, el aminoacido debe ser capaz de

15 incorporarse en Ap para permitir la deteccion y cuantificacion del recambio de Ap en la sangre. Ejemplos no limitantes de aminoacidos naturales pueden incluir alanina, arginina, asparagina, acido aspartico, cistema, acido glutamico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, o valina. En una realizacion, el aminoacido puede ser un aminoacido esencial (por ejemplo, un aminoacido no producido por el organismo). En otra realizacion, el aminoacido puede ser un aminoacido no esencial. 20 En otra realizacion mas, un marcador puede comprender al menos un aminoacido esencial y al menos un aminoacido no esencial. En lmeas generales, la eleccion del aminoacido puede basarse en una diversidad de factores, incluyendo (1) si el aminoacido esta presente en al menos un resto de la protema o peptido de interes; (2) si el aminoacido puede alcanzar rapidamente el sitio de smtesis proteica; (3) si el aminoacido marcado afecta al metabolismo de la protema de interes (por ejemplo, dosis muy grande de leucina pueden afectar al metabolismo del 25 musculo); y (4) puede considerarse la disponibilidad del aminoacido deseado (es decir, algunos aminoacidos son mucho mas caros o diffciles de fabricar que otros).

[0010] En algunas realizaciones, un marcador puede comprender al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al

30 menos once, al menos doce, al menos trece, al menos catorce, al menos quince, al menos dieciseis, al menos diecisiete, al menos dieciocho, al menos diecinueve, al menos veinte, o mas de los veinte diferentes tipos de aminoacidos marcados.

[0011] Los aminoacidos pueden marcarse usando cualquier metodo conocido en la tecnica, siempre que el 35 aminoacido pueda incorporarse en Ap y permita la deteccion del recambio de Ap en la sangre. En la presente

invencion los marcadores son isotopos no radiactivos estables. Ejemplos no limitantes pueden incluir 2H, 13C, 15N,

17 -i q oc oa oe 1 J ' '

O, O, S, S, o S. Adicionalmente, se reconoce que tambien senan eficaces otros varios isotopos estables que cambian la masa de un atomo en mas o menos neutrones que lo observado en la forma nativa prevalente. En otra realizacion, un aminoacido puede marcarse con mas de un marcador (por ejemplo, 13C y 15N).

40

[0012] En una realizacion, puede usarse 13C6 fenilalanina, que contiene seis atomos de 13C, para marcar Ap. En una realizacion ejemplar puede usarse 13C6 leucina para marcar Ap. En otra realizacion mas, puede usarse una combinacion de un isotopo no radiactivo y un aminoacido numerado en la Tabla A para marcar Ap.

45 [0013] Existen numerosas fuentes comerciales de aminoacidos marcador. En lmeas generales, los aminoacidos marcados pueden producirse de forma biologica o sintetica. Los aminoacidos producidos de forma biologica pueden obtenerse de un organismo (por ejemplo, kelp/alga marina) cultivado en una mezcla enriquecida de 13C, 15N, u otro isotopo que se incorpora en los aminoacidos segun el organismo produce las protemas. Los aminoacidos despues se separan y purifican. Alternativamente, los aminoacidos pueden fabricarse con procedimientos qmmicos sinteticos 50 conocidos.

Tabla A

2h: alanina

13c: alanina

15n: alanina

17O y/o 18O: alanina

33S y/o 34S y/o 36S: alanina

2H: arginina

13c: arginina

15n: arginina

17O y/o 18O: arginina

33S y/o 34S y/o 36S: arginina

2H: asparagina

13c: asparagina

15n: asparagina

17O y/o 18O: asparagina

33S y/o 34S y/o 36S: asparagina

2H: acido aspartico

13c: acido aspartico

15n: acido aspartico

17O y/o 18O: acido aspartico

33S y/o 34S y/o 36S: acido aspartico

2H: cistema

13c: cistema

15n: cistema

17O y/o 18O: cistema

33S y/o 34S y/o 36S: cistema

2H: acido glutamico

13c: acido glutamico

15n: acido glutamico

17O y/o 18O: acido glutamico

33S y/o 34S y/o 36S: acido glutamico

2H: glutamina

13c: glutamina

15n: glutamina

17O y/o 18O: glutamina

33S y/o 34S y/o 36S: glutamina

2H: glicina

13c: glicina

15n: glicina

17O y/o 18O: glicina

33S y/o 34S y/o 36S: glicina

2H: histidina

13c: histidina

15n: histidina

17O y/o 18O: histidina

33S y/o 34S y/o 36S: histidina

2h: isoleucina

13c: isoleucina

15n: isoleucina

17O y/o 18O: isoleucina

33S y/o 34S y/o 36S: isoleucina

2h: leucina

13c: leucina

15n: leucina

17O y/o 18O: leucina

33S y/o 34S y/o 36S: leucina

2h: lisina

13c: lisina

15n: lisina

17O y/o 18O: lisina

33S y/o 34S y/o 36S: lisina

2h: metionina

13c: metionina

15n: metionina

17O y/o 18O: metionina

33S y/o 34S y/o 36S: metionina

2h: fenilalanina

13c: fenilalanina

15n: fenilalanina

17O y/o 18O: fenilalanina

33S y/o 34S y/o 36S: fenilalanina

2h: prolina

13c: prolina

15n: prolina

17O y/o 18O: prolina

33S y/o 34S y/o 36S: prolina

2h: serina

13c: serina

15n: serina

17O y/o 18O: serina

33S y/o 34S y/o 36S: serina

2h: treonina

13c: treonina

15n: treonina

17O y/o 18O: treonina

33S y/o 34S y/o 36S: treonina

2H: triptofano

13c: triptofano

15n: triptofano

17O y/o 18O: triptofano

33S y/o 34S y/o 36S: triptofano

2H: tirosina

13c: tirosina

15n: tirosina

17O y/o 18O: tirosina

33S y/o 34S y/o 36S: tirosina

2H: valina

13c: valina

15n: valina

17O y/o 18O: valina

33S y/o 34S y/o 36S: valina

ii. metodos de administracion

[0014] Los metodos adecuados de administracion de un marcador pueden incluir cualquier metodo que permita la 5 medicion del recambio de Ap en la sangre. En una realizacion, un marcador puede administrarse por v^a parenteral,

por ejemplo, por v^a intravenosa, intraarterial, subcutanea, intraperitoneal, o intramuscular. En otra realizacion mas. Un marcador puede administrarse por via oral.

[0015] Un marcador puede administrarse de varios modos diferentes, dependiendo en parte del tipo de marcador. 10 En una realizacion, un marcador puede administrarse como una infusion en el tiempo. Por ejemplo, un marcador

puede administrarse mediante una infusion de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,

17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,

48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78,

79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106,

15 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, o 120 minutos. Alternativamente, un marcador puede administrarse mediante una infusion durante aproximadamente 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 3,5, 3,75, 4, 4,25,

4,5, 4,75, 5, 5,25, 5,5, 5,75, 6, 6,25, 6,5, 6,75, 7, 7,25, 7,5, 7,75, 8, 8,25, 8,5, 8,75, 9, 9,25, 9,5, 9,75, 10, 10,25, 10,5,

10,75, 11, 11,25, 11,5, 11,75, 12, 12,25, 12,5, o 12,75 horas. En otras realizaciones mas, un marcador puede administrarse como una infusion durante mas de 13 horas. En una realizacion ejemplar, el marcador puede 20 administrarse como una infusion IV. 0016 * * * *

[0016] Un marcador tambien puede administrarse en uno o mas bolos. Por ejemplo, un marcador puede administrarse en un bolo, dos bolos, tres bolos, cuatro bolos, cinco bolos, o mas de cinco bolos. Hablando en lmeas generales, un bolo es una administracion concreta de una duracion de no mas de aproximadamente 1 hora. En una

25 realizacion, un bolo se administra en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55,

56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86,

87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, o 120 segundos. En otra realizacion, un bolo se administra en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 30 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, o 60 minutos. El tiempo entre los bolos puede ser de segundos, minutos, horas, o dfas. Por ejemplo, el tiempo entre los bolos puede ser de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60,

35 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,

92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116,

117, 118, 119, o 120 s. Alternativamente, el tiempo entre los bolos puede ser de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 5 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, o 120 minutos. En otra alternativa, el tiempo entre los bolos puede ser de aproximadamente 1, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 3,5, 3,75, 4, 4,25, 4,5, 4,75, 5, 5,25, 5,5, 5,75, 6, 6,25, 6,5, 6,75, 7, 7,25, 7,5, 7,75, 8, 8,25, 8,5, 8,75, 9, 9,25,

9.5, 9,75, 10, 10,25, 10,5, 10,75, 11, 11,25, 11,5, 11,75, 12, 12,25, 12,5, 12,75, 13, 13,25, 13,5, 13,75, 14, 14,25,

14,5,14,75, 15, 15,25, 15,5, 15,75, 16, 16,25, 16,5, 16,75, 17, 17,25, 17,5, 17,75, 18, 18,25, 18,5, 18,75, 19, 19,25,

10 19,5, 19,75, 20, 20,25, 20,5, 20,75, 21, 21,25, 21,5, 21,75, 22, 22,25, 22,5, 22,75, 23, 23,25, 23,5, 23,75, 24, 24,25,

24.5, 24,75, 25, 25,25, 25,5, 25,75, 26, 26,25, 26,5, 26,75, 27, 27,25, 27,5, 27,75, 28, 28,25, 28,5, 28,75, 29, 29,25,

29.5, 29,75, 30, o mas de 30 horas.

[0017] En una realizacion ejemplar, el marcador puede administrate en al menos un bolo oral o IV. En ciertas 15 realizaciones, un marcador puede administrarse mediante una combinacion de un bolo y una infusion. Por ejemplo,

puede administrarse a un sujeto un bolo de marcador, seguido por una infusion de marcador.

[0018] Los expertos en la materia apreciaran que la cantidad (o dosis) del marcador puede variar y variara, dependiendo en parte de la via de administracion y el marcador usado. Hablando en lmeas generales, la cantidad

20 debe ser suficiente para permitir la medicion del recambio de Ap en la sangre. En algunas realizaciones, si el marcador se administra mediante infusion, la cantidad puede ser entre aproximadamente 0,01 mg/kg/h a aproximadamente 4,5 mg/kg/h. Por ejemplo, la cantidad puede ser de aproximadamente 0,001, 0,005, 0,01, 0,15, 0,2, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 3,5, 3,75, 4, 4,25, o 4,5 mg/kg/h. En otras realizaciones, si el marcador se administra mediante bolo, la cantidad puede ser entre aproximadamente 0,01 g a 25 aproximadamente 8 g. Por ejemplo, la cantidad puede ser de 0,001, 0,005, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 7 u 8 g.

30 (b) recogida de una muestra de sangre

[0019] El metodo d la invencion requiere, en parte, que se haya recogido al menos una muestra de sangre de un sujeto. La muestra de sangre tfpicamente contiene Ap marcado. La muestra tambien puede contener Ap no marcado. Como se usa en la presente memoria, "sangre" se refiere a sangre completa, plasma, o suero. Los

35 metodos de recogida de una muestra de sangre son bien conocidos en la tecnica. En una realizacion ejemplar, puede usarse venipuncion, con o sin un cateter, para recoger una muestra de sangre. En otra realizacion ejemplar, puede usarse una puncion en el dedo o equivalente, para recoger una muestra de sangre.

[0020] Hablando en lmeas generales, una muestra de sangre se recoge despues de la administracion de un 40 marcador, descrito en la seccion I (a) anterior. Un experto en la materia apreciara que el momento en que se recoge

una muestra de sangre (despues de la administracion de un marcador) puede variar y variara dependiendo del marcador y el metodo de administracion del marcador. En una realizacion, se recoge una muestra de sangre entre aproximadamente 1 min y aproximadamente 48 horas despues de la administracion de un marcador. Por ejemplo, puede recogerse una muestra de sangre entre aproximadamente 1 min y 48 horas, entre aproximadamente 1 min y 45 10 horas, o entre aproximadamente 1 min y 30 horas. En otra realizacion, puede recogerse una muestra de sangre entre aproximadamente 10 min y aproximadamente 24 horas despues de la administracion de un marcador. En otra realizacion mas, puede recogerse una muestra de sangre entre aproximadamente 10 min y aproximadamente 10 horas despues de la administracion de un marcador. Por ejemplo, puede recogerse una muestra de sangre entre aproximadamente 15 min y 8 horas, entre aproximadamente 15 min y 6 horas, entre aproximadamente 15 min y 4 50 horas, entre aproximadamente 30 min y 5 horas, entre aproximadamente 1 horas y 5 horas, entre aproximadamente 1 hora y 4 horas, entre aproximadamente 2 horas y 4 horas, o entre aproximadamente 2 horas y 6 horas. En otra realizacion mas, puede recogerse una muestra de sangre entre aproximadamente 10 horas y aproximadamente 20 horas despues de la administracion de un marcador. Por ejemplo, puede recogerse una muestra de sangre entre aproximadamente 12 horas y 20 horas, entre aproximadamente 14 horas y 20 horas, entre aproximadamente 16 55 horas y 20 horas, o aproximadamente 18 horas y 20 horas. En otra realizacion mas, puede recogerse una muestra de sangre entre aproximadamente 20 horas y aproximadamente 30 horas despues de la administracion de un marcador. Por ejemplo, puede recogerse una muestra de sangre entre aproximadamente 22 horas y 28 horas o entre aproximadamente 24 horas y 28 horas. En una realizacion alternativa, puede recogerse una muestra de sangre despues de 30 horas despues de la administracion de un marcador. Por ejemplo, puede recogerse una

60 muestra de sangre despues de 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o mas de 48 horas despues de la

administracion de un marcador. 0021

[0021] En algunas realizaciones, puede recogerse una muestra de sangre despues de aproximadamente 1, 2, 3, 4,

5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,

65 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,

68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, o 120 s despues de la administracion de un marcador. En otras realizaciones, puede recogerse una muestra de sangre despues de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 23, 25, 26,

5 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57,

58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88,

89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114,

115, 116, 117, 118, 119, o 120 minutos despues de la administracion de un marcador. En ciertas realizaciones, puede recogerse una muestra de sangre despues de aproximadamente 1, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 10 3,5, 3,75, 4, 4,25, 4,5, 4,75, 5, 5,25, 5,5, 5,75, 6, 6,25, 6,5, 6,75, 7, 7,25, 7,5, 7,75, 8, 8,25, 8,5, 8,75, 9, 9,25, 9,5,

9.75, 10, 10,25, 10,5, 10,75, 11, 11,25, 11,5, 11,75, 12, 12,25, 12,5, 12,75, 13, 13,25, 13,5, 13,75, 14, 14,25,

14.5.14.75, 15, 15,25, 15,5, 15,75, 16, 16,25, 16,5, 16,75, 17, 17,25, 17,5, 17,75, 18, 18,25, 18,5, 18,75, 19, 19,25,

19.5, 19,75, 20, 20,25, 20,5, 20,75, 21, 21,25, 21,5, 21,75, 22, 22,25, 22,5, 22,75, 23, 23,25, 23,5, 23,75, 24, 24,25,

15 29,5, 29,75, o 30 horas despues de la administracion de un marcador.

[0022] En realizaciones ejemplares, si el marcador se administra por via intravenosa durante aproximadamente 9 horas, puede recogerse una muestra de sangre entre aproximadamente una hora y aproximadamente 15 horas, entre aproximadamente 5 horas y aproximadamente 13 horas, o entre aproximadamente 8 horas y

20 aproximadamente 10 horas despues de la administracion del marcador. En una realizacion ejemplar, si el marcador se administra por via intravenosa puede recogerse una muestra de sangre aproximadamente 9 horas despues de la administracion del marcador. En otras realizaciones ejemplares, si el marcador se administra por via oral, puede recogerse una muestra de sangre entre aproximadamente 30 min y aproximadamente 5 horas o entre aproximadamente 1 horas y 4 horas despues de la administracion del marcador. En una cierta realizacion ejemplar, 25 si el marcador se administra por via oral, puede recogerse una muestra de sangre aproximadamente 3 horas despues de la administracion del marcador.

[0023] Puede recogerse mas de una muestra de sangre de un sujeto. Por ejemplo, pueden recogerse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,

30 38, 39, 40, o mas de 40 muestras de sangre de un sujeto. El tiempo entre las muestras puede ser de segundos, minutos, horas, o dfas. Por ejemplo, el tiempo entre las muestras puede ser de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 35 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, o 120 s. Alternativamente, el tiempo entre las muestras puede ser de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 40 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, o 120 minutos. En otra alternativa, el tiempo entre las muestras puede ser de aproximadamente 1, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 3,5, 3,75, 4, 4,25, 4,5, 4,75, 5, 5,25, 5,5, 5,75, 6, 6,25, 6,5, 6,75, 7, 7,25, 7,5, 7,75, 8, 8,25, 8,5, 8,75, 9, 9,25, 9,5, 9,75, 10, 10,25,

10.5, 10,75, 11, 11,25, 11,5, 11,75, 12, 12,25, 12,5, 12,75, 13, 13,25, 13,5, 13,75, 14, 14,25, 14,5,14,75, 15, 15,25,

15.5, 15,75, 16, 16,25, 16,5, 16,75, 17, 17,25, 17,5, 17,75, 18, 18,25, 18,5, 18,75, 19, 19,25, 19,5, 19,75, 20, 20,25, 45 20,5, 20,75, 21, 21,25, 21,5, 21,75, 22, 22,25, 22,5, 22,75, 23, 23,25, 23,5, 23,75, 24, 24,25, 24,5, 24,75, 25, 25,25,

25.5, 25,75, 26, 26,25, 26,5, 26,75, 27, 27,25, 27,5, 27,75, 28, 28,25, 28,5, 28,75, 29, 29,25, 29,5, 29,75, 30 o mas de 30 horas.

[0024] La muestra de sangre tipicamente debe ser suficientemente grande para permitir la medicion del recambio 50 de Ap. Puede combinarse mas de una muestra para un punto temporal particular. En una realizacion, una muestra

de sangre puede ser de aproximadamente 50 pl a aproximadamente 3000 pl. Por ejemplo, una muestra de sangre puede ser de aproximadamente 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250, 2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 55 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, o 3000 pl. En otras realizaciones, una muestra de sangre puede ser de mas de 3000 pl.

(c) analisis de la muestra para determinar el recambio de Ap

60 [0025] El metodo de la invencion, comprende, en parte, analizar la muestra para determinar el recambio de Ap en la sangre. Hablando en lmeas generales, el analisis de la muestra abarca (a) deteccion y cuantificacion de Ap marcado y no marcado en una muestra de sangre y (b) deduccion del recambio de Ap a partir de la cantidad de Ap marcado y no marcado en la muestra de sangre. Cada etapa se analiza en mas detalle a continuacion.

i. deteccion y cuantificacion de marcado y no marcado en una muestra de sangre

[0026] El metodo de deteccion y cuantificacion de Ap marcado y no marcado en una muestra de sangre puede variar y variara. Por ejemplo, variaran los metodos de deteccion con el tipo de marcador usado (por ejemplo,

5 radiactivo o no radiactivo). Como se usa un marcador no radiactivo en la presente invencion, el metodo de deteccion debe ser suficientemente sensible para detectar cambios en la masa de la protema marcada con respecto a la protema no marcada. Por lo tanto, en la presente invencion, se detecta Ap marcado y no marcado con espectrometna de masas. En una realizacion, se usa el protocolo de espectrometna de masas resumido en los Ejemplos.

10

[0027] Pueden usarse tecnicas adicionales para separar Ap marcado y no marcado de otros componentes de la sangre, o para concentrar Ap marcado y no marcado en una muestra. Por ejemplo, Ap marcado y no marcado pueden inmunoprecipitarse de una muestra de sangre. Los protocolos para inmunoprecipitacion son conocidos en la tecnica. En una realizacion, el anticuerpo de inmunoprecipitacion puede estar adherido a un soporte solido, tal como

15 una perla o resina. En otra realizacion, puede usarse el protocolo de inmunoprecipitacion detallo en los Ejemplos. Otros metodos de separacion y concentracion de Ap pueden incluir cromatograffa. En particular, pueden usarse tecnicas que vinculan una etapa cromatografica con una etapa de espectrometna de masas.

[0028] Para ayudar en la deteccion y cuantificacion de Ap marcado y no marcado, el Ap puede dividirse en 20 peptidos mas pequenos. Por ejemplo, puede digerirse Ap con una proteasa para crear varios peptidos pequenos. En

una realizacion, se usa tripsina para digerir Ap.

[0029] Hablando en lmeas generales, el metodo de deteccion de Ap marcado y no marcado tambien puede usarse para cuantificar la cantidad de Ap marcado y no marcado. En algunas realizaciones, la cuantificacion abarcad

25 determinar la relacion entre Ap marcado y no marcado.

ii. deduccion del recambio de ^6

[0030] A partir de la etapa de deteccion y cuantificacion resumida anteriormente, puede deducirse el recambio de 30 Ap. Como se usa en la presente memoria, "recambio" se refiere en una realizacion a la tasa de produccion de Ap

marcado, la tasa de eliminacion de Ap marcado, o una combinacion de ambas. En otra realizacion, "recambio" se refiere a la vida media de Ap en la sangre. En otra realizacion mas, el "recambio" se refiere al producto del porcentaje de Ap marcado y el valor de cuantificacion absoluta de Ap. Por ejemplo, "recambio" puede referirse al producto del porcentaje de Ap42 marcado respecto al valor de cuantificacion absoluto de Ap42.

35

[0031] El recambio puede calcularse, en parte, a partir del cambio en el tiempo en Ap marcado, no marcado o la relacion de Ap marcado a no marcado. En otras realizaciones, el recambio puede determinarse a partir del pico de Ap marcado. En otras realizaciones mas, puede usarse la tasa de smtesis fraccionada, la tasa de eliminacion fraccionada, la tasa de smtesis absoluta, la tasa de eliminacion absoluta, la vida media, la tasa de descomposicion, o

40 modelado compartimental para determinar el recambio. En cada realizacion, el recambio puede calcularse usando Ap marcado in vivo, Ap no marcado in vivo, el patron interno ex vivo (cuantificacion absoluta), o una combinacion de los mismos.

[0032] Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invencion. Los expertos 45 en la materia deben apreciar que las tecnicas descritas en los siguientes ejemplos representan tecnicas

descubiertas por los inventores que funcionan bien en la practica de la invencion. Los expertos en la materia deben, sin embargo, a la luz de la presente descripcion, apreciar que pueden hacerse muchos cambios en las realizaciones espedficas que se describen y aun obtener un resultado parecido o similar a la invencion, por lo tanto, toda la materia expuesta o mostrada en los dibujos adjuntos debe interpretarse como ilustrativa y no en un sentido limitante. 50

Definiciones

[0033] Como se usa en la presente memoria, "bolo" se refiere a una dosificacion concreta de marcador. Puede usarse mas de un bolo para administrar un marcador, pero cada bolo es una dosis concreta. Esto esta en contraste

55 con una infusion, que es una dosis continua administrada en el tiempo.

[0034] Como se usa en la presente memoria, "sistema nervioso central" se refiere al cerebro, fluido cefalorraqrndeo, o cualquier otro tejido o fluido del sistema nervioso central donde pueda encontrarse Ap.

60 [0035] Como se usa en la presente memoria, "infusion" se refiere a una dosificacion continua de marcador en el tiempo. En algunas realizaciones, la tasa de dosificacion puede cambiar en el tiempo. 0036

[0036] Como se usa en la presente memoria, "metabolismo" se refiere a cualquier combinacion de la tasa de smtesis, transporte, descomposicion, modificacion, o eliminacion de una biomolecula.

[0037] Como se usa en la presente memoria, "sujeto" se refiere a cualquier sujeto que tenga un sistema nervioso central. En realizaciones ejemplares, "sujeto" se refiere a cualquier sujeto que sea susceptible a una enfermedad o trastorno caracterizado por placas amiloides. En una realizacion ejemplar, "sujeto" se refiere a un individuo con AD o un individuo que esta riesgo de AD. En otra realizacion ejemplar, "sujeto" se refiere a un individuo en edad

5 avanzada.

Ejemplos

[0038] Los siguientes ejemplos ilustran diversas iteraciones de la invencion.

10

[0039] Recientemente se desarrollo un enfoque pionero para medir directamente el metabolismo de Ap en el sistema nervioso central de seres humanos vivos (Bateman et. al 2006). Este metodo requiere que los participates sean admitidos en una habitacion de hospital para investigacion, y tener dos cateteres iV y un cateter espinal en el area lumbar, colocados de modo pueden obtenerse, cada hora, muestras de sangre y fluido cefalorraqrndeo.

15 Usando este metodo, estudios recientes han demostrado que Ap tiene un rapido metabolismo (vida media de 8-10 horas) en el cerebro y fluido cefalorraqrndeo (FCR) humano.

[0040] La dinamica de Ap en sangre, sin embargo, no esta bien comprendida ya que previamente no habfa metodo para medir Ap marcado en la sangre. Si estuviera disponible dicho metodo, podna entenderse mejor la fisiologfa (y

20 patofisiologfa) de Ap como medida cuantitativa de la produccion de Ap en el cerebro, el transporte a la sangre y fluido cefalorraqrndeo, y la eliminacion desde la sangre. Un ensayo de Ap marcado en la sangre permitina medir la fisiologfa y patofisiologfa de Ap sin cateteres espinales invasivos.

[0041] Se desarrollo un enfoque de espectrometna de masas-inmunoprecipitacion para la cinetica de marcaje de 25 isotopos estables para medir Ap marcado en sangre. Esto proporciona la capacidad de medir las tasas de

produccion, transporte entre compartimentos, y eliminacion de Ap de la sangre en seres humanos.

[0042] La vida media de Ap en sangre/plasma es marcadamente diferente que en el SNC/FCR, con un t1/2 de 1 a 3 horas en la produccion (FIG. 1). Esto contrastas con una vida media de 8 a 10 horas medida en FCR (Bateman et.

30 al 2006). Para la FIG. 1, se administro a los sujetos un aminoacido marcado (13C6 leucina; infundido en 9 horas con una infusion cebada de 10 minutos de 2 mg/kg, seguida por 2 mg/kg/hora durante 8 horas y 50 minutos) y despues se tomaron muestras de sangre cada hora durante 0-15 horas, despues cada hora impar hasta la hora 35, despues a las 36 y 48 horas. Se tomaron 28 muestras en totas. Las muestras se almacenaron congeladas. Despues, las muestras se descongelaron y se anadio un coctel de inhibidor de proteasa. Las muestras se centrifugaron y despues 35 se combinaron a partir de dos muestras de plasma (2 ml en total) en cada punto temporal. A continuacion, se inmunoprecipito Ap de las muestras como se describe a continuacion:

Dfa 1:

40 1. Se descongelan las muestras en hielo.

2. Se anaden 20 pl de Complete Protease Inhibitors (Roche, 1 comprimido disuelto en 1 ml de agua)

3. Se centrifugan a 14.000 RPM a 4 °C durante 15 minutos para retirar los particulados.

4. Se combinan los sobrenadantes.

5. Se diluyen patrones de medio en PBS.

45 6. Se lavan perlas HJ5.1 (anticuerpo especffico de Ap) dos veces con PBS 1 x con azida al 0,02 %. Se hace

una suspension de perlas al 50 % al final.

7. Se anaden 220 pl de solucion de clorhidrato de guanidina 5 M.

8. Se anaden 20 ul de Tween-20 (5 % en PBS para 0,05 % final).

9. Se anaden 5 ul de ISTD (N15- Ap).

50 10. Se anaden 30 pl de perlas de anticuerpo (suspension al 50 % suficiente para ~20 ng de Ap).

11. Se incuban durante una noche a 4 °C.

Dfa 2:

55 12. Se centrifugan las perlas a 4500 RPM durante 5 minutos.

13. Se retira el sobrenadante en un nuevo tubo y se guarda (plasma solamente).

14. Se anade 1 ml de solucion de clorhidrato de guanidina 0,5 M.

15. Se anaden 10 ul de Tween-20 al 5 % para 0,05 % final.

16. Una vez resuspendidas se transfieren las perlas a un tubo de 1,5 ml.

60 17. Se centrifugan las perlas a 4500 RPM durante 5 minutos.

18. Se descarta el sobrenadante.

19. Se lavan las perlas dos veces con enjuague AmBic 1 x. Se descarta el sobrenadante y se secan las perlas.

20. Se anaden 50 pl (volumen de perlas) de acido formico al 98 % (solucion de elucion) y se centrifugan las

65 perlas. Se retira el sobrenadante y se coloca en tubo de 1,5 ml.

21. Se seca la solucion de elucion en un speedvac durante 1 hora para retirar el acido formico (37 °C).

23. Se descongelan 20 jl de tripsina. Se anade 1 ml de solucion AmBic 25 mM para resuspender la tripsina hasta una concentracion final de 20 ng/ul.

24. Se resuspenden las protemas en 10 ul de solucion de AmBic 25 mM.

5 25. Se anaden 10 jl de la solucion de tripsina a 20 ng/ jl a las perlas para la digestion.

26. Se digiere O/N (16 horas) a 37 °C en la incubadora.

Dfa 3:

10 27. Se realiza un corto centrifugado de las muestras para dejar el condensado sedimentado en el fondo del

tubo.

28. Se anaden 2 ul de acido formico a la digestion (para precipitar las protemas).

29. Se mezclan las muestras.

30. Se centrifuga la digestion tnptica a 14.000 RPM a 4 °C durante 15 minutos.

15 31. Se transfieren a viales de tomamuestras automatico y despues se centrifugan las muestras usando el

speedvac y se mantienen en el refrigerador a 4 °C.

[0043] Las muestras despues se analizan por espectrometna de masas del siguiente modo:

20 [0044] La secuencia de aminoacidos de Ap 1-42 es DAEFRHDSGYEVHH QKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 1) y de Ap 1-40 es DAEFRHDSGYEVH HQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV (SEQ ID NO: 2). Cuando se digiere con una proteasa tipo tripsina, se generan cuatro peptidos mas pequenos como Ap 1-5 1-5 DAEFR (SEQ ID NO: 3), Ap 6-16 HDSGyEvHHQK (SEQ ID NO:4), Ap 17-28 LVFFAEDVGSNK (SEQ ID NO: 5), y Ap 29-42 GAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 6). Solamente

25 dos de estos peptidos son de relevancia para la cuantificacion usando la tecnologfa SILK (Stable Isotope Labeling Kinetics - Bateman et. al 2009) con marcaje con leucina porque su secuencia incluye un resto de leucina que puede marcarse in vivo. Estos peptidos son Ap 17-28 LVFFAEDVGSNK (SEQ ID NO: 5), y Ap 29-42 GAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 6), pero usamos solamente el peptido Ap 17-28 LVFFAEDVGSNK (SeQ ID NO: 5) porque representa las cantidades totales de Ap en la sangre y produce una senal mayor. Por supuesto, puede ser util cuantificar

30 tambien los fragmentos C-terminales (Ap 29-42 GAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 6) o Ap 29-40 GAIIGLMVGGVV (SEQ ID NO: 7)) o N-terminales en la sangre tambien. En general, puede usarse cualquier aminoacido marcado, puede usarse cualquier endoproteasa (o ninguna en absoluto) para marcar Ap y cuantificar el marcador en la sangre.

35 [0045] Los experimentos se realizaron en un espectrometro de masas TSQ Vantage acoplado a una fuente ESI de nanoflujo y una cromatograffa lfquida nano-2D (NanoLC-2D). Las muestras se mantuvieron a una temperatura de 4 °C en la placa del tomamuestras automatico. Las muestras se inyectaron en una nano-columna fabricada en el propio laboratorio (diametro de 150 mm) con una punta extrafda, se compactaron hasta 15 cm con material de compactacion de columna Ace 5 C18 AR (MAC-MOD Analytical, Chadds Ford, PA). Los peptidos se separaron por el

40 Nano2D-LC (Eksigent, Inc. Ultra NanoLC-2D) a un caudal de 1 ml/min. El disolvente A fue acido formico al 0,1 % en agua y el disolvente B fue acido formico al 0,1 % en acetonitrilo. El gradiente fue del 15 % de B hasta el 25 % de B en 10 minutos seguido por el 25 % de B hasta el 95 % de B en 5 minutos, despues, se disminuyo gradualmente hasta el 15 % de B en 2 minutos y la columna se re-equilibro durante 3 minutos mientras el tomamuestras automatico escogfa otra muestra para inyeccion.

45

[0046] El espectrometro de masas (MS) TSQ Vantage se hizo funcionar en modo de iones positivos usando un voltaje de pulverizacion de 1,2 kV, con parametros optimizados para calibrarlo con los peptidos. Los datos se adquirieron en modo de control de reaccion multiple (MRM). Durante estos experimentos MRM, la masa del peptido se detecto primero en la primera dimension, o como MS1. Aunque se usa MS1 para realizar la cuantificacion, la

50 tecnica adolece de la ausencia de especificidad especialmente en matrices muy complejas como sangre y debido al hecho de que muchos peptidos tienen la misma masa intacta. Los iones de los peptidos se fragmentaron y detectaron en el espectrometro de masas y esta segunda dimension de fragmentacion MS (MS2) proporciono fragmentos unicos. La combinacion de la masa espedfica del precursor y los iones unicos del fragmento se usaron para controlar selectivamente que se cuantificara el peptido. En este caso, se controlaron selectivamente multiples

55 iones de fragmentos (tambien conocidos como reacciones) para cuantificar Ap 17-28, produciendo un experimento MRM unico. Ap 17-28 tiene una masa de precursor (MS1) con una relacion de carga a masa de 663,340 para el peptido endogeno y 666,340 para el peptido con marcador incorporado. Se controlaron tres de cada uno de los iones de fragmentos despues de la fragmentacion MS2. Los iones del fragmento tambien conocidos como iones de transicion controlados tienen unas relaciones de masa a carga de 819,38, 966,45 y 1113,52. Los experimentos MRM

60 se detectan y representan como picos cromatograficos unicos que se procesaron por Xcalibur, que es el software de control de instrumento.

[0047] La Figura 2 muestra la diferencia entre la administracion de un marcador oral (B) frente a un marcador intravenoso (A). Para cada una de las isoformas ensayadas, el pico de marcaje aparecio entre aproximadamente 1 y

65 5 horas de administracion oral y entre aproximadamente 5 y 10 horas de administracion intravenosa. El marcador y

las muestras se administraron y recogieron, respectivamente, como se ha descrito anteriormente.

[0048] La Figura 3 muestra la cuantificacion absoluta de isoformas de Ap en plasma, de nuevo medidas usando el protocolo anterior. Se anadieron patrones internos de amiloide-beta marcado con 15N (ISTD) a la muestra antes del 5 procesamiento. Las muestras se procesaron como se ha descrito anteriormente.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un metodo in vitro para medir el recambio in vivo de Ap en la sangre de un sujeto, comprendiendo el metodo:

5 (a) determinar por espectrometna de masas la cantidad de Ap marcado, o la cantidad tanto de Ap marcado como

de Ap no marcado en una muestra de sangre obtenida del sujeto; y

(b) calcular el recambio de Ap usando la cantidad de Ap marcado, o la cantidad tanto de Ap marcado como de Ap no marcado, determinada en la etapa (a), en el cual

10 (i) el recambio de Ap se calcula a partir de la cantidad de Ap marcado, o la cantidad de Ap marcado y Ap no

marcado, en una muestra obtenida entre 15 minutos y 4 horas despues de que haya comenzado la administracion oral o intravenosa al sujeto de al menos un aminoacido marcado con un isotopo no radiactivo estable; o

(ii) el recambio de Ap se determina a partir del pico de produccion de Ap marcado que aparece entre 15 aproximadamente 1 y 5 horas despues de que haya comenzado la administracion del bolo oral al sujeto de al

menos un aminoacido marcado con un isotopo no radiactivo estable, o entre aproximadamente 5 y 10 horas despues de que haya comenzado la administracion intravenosa mediante una infusion de 9 horas de al menos un aminoacido marcado con un isotopo no radiactivo estable al sujeto.

20 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el cual la administracion del bolo oral de la parte (b) (ii) se sustituye por un bolo IV.
3. El metodo de la reivindicacion 1, en el cual el aminoacido marcado se administra por via oral.

25 4. El metodo de la reivindicacion 3, en el cual se administraron entre aproximadamente 0,05 g y aproximadamente 8

g de aminoacido marcado con un isotopo no radiactivo estable.
5. El metodo de la reivindicacion 1, en el cual el aminoacido marcado se administro por via intravenosa.

30 6. El metodo de la reivindicacion 5, en el cual el aminoacido marcado se administro como una infusion entre

aproximadamente 0,01 mg/kg/hora y aproximadamente 3 mg/kg/hora.
7. El metodo de la reivindicacion 1, en el cual la etapa (a) comprende adicionalmente aislar inicialmente Ap de la muestra de sangre.

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8. El metodo de la reivindicacion 1, en el cual la al menos una muestra de sangre se recogio despues de aproximadamente 30 minutos despues de la administracion al sujeto de al menos un aminoacido marcado.
9. El metodo de la reivindicacion 1, en el cual la cantidad de Ap marcado o Ap no marcado se selecciona del grupo 40 que consiste en Ap total, Ap38, Ap40, y Ap42.
10. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente determinar la cuantificacion absoluta de Ap en la muestra.

45 11. El metodo de la reivindicacion 10, en el cual se determina el recambio de Ap usando el producto del porcentaje de Ap marcado y la cuantificacion absoluta de Ap.