WO2017100879A1 - Método de identificação por ressonância megnética nuclear (rmn) e quimiometria de biomarcadores para doenças mentais graves e uso do mesmo - Google Patents

Método de identificação por ressonância megnética nuclear (rmn) e quimiometria de biomarcadores para doenças mentais graves e uso do mesmo Download PDF

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Definitions

  • Metabolomics tools can be used to map changes in many biochemical pathways and interactions between them, and this information is critical for identifying bioraarkers and potential targets that are specific to each disease-investigated.
  • biomarkers in these mental disorders would reflect biological processes related to the pathophysiology of these disorders and (ii) would be measured noninvasively, as in a blood test.
  • Sensitive molecular markers related to underlining pathophysiological processes have the potential to be highly relevant to aid early detection and diagnosis, as well as to facilitate disease monitoring and treatment response. 1 is relatively well described that these diseases are associated with alterations in the central nervous system (CNS), which compromise the quantities and neurotransmitter function (dopamine, serotonin, and glu.tainato y-amino butyric acid or GABA), fatty acids (such as o: arachidonic acid) and other molecules associated with oxidative stress and mitochondrial dysfunction.
  • CNS central nervous system
  • GABA glu.tainato y-amino butyric acid
  • fatty acids such as o: arachidonic acid
  • the present invention relates to a method of nuclear magnetic resonance (NMR) identification and biomarker chemometrics for severe mental illness such as bipolar disorder (TB) and schizophenia (SCZ). Additionally, the present invention aims to compare the metabolic profile of individuals with SCZ and TB with healthy controls (control group) by applying the nuclear magnetic resonance (RN) 'tools, especially X H NMR, and chemometrics, in particular. for Principal Component Analysis (PCA) and Partial Least Square Discipline Analysis (PLS-DA).
  • PCA Principal Component Analysis
  • PLS-DA Partial Least Square Discipline Analysis
  • FIG. 1 shows the X H-NMR spectrum of human serum from a bipolar disorder (TB) subject with the enlargement of the spectrum region of 1.00-4.40 ppm in the upper left corner used for chemometric analysis.
  • FIG. 4 shows a graphical representation of results obtained from the PCA analysis for 131 spectra having two separate groups of healthy individuals (50, red) and schizophreniform enia (81, SCZ, green) due to differences in the NMR spectra X is H and the region 1.00-4.40 ppm.
  • FIG. 5 shows a graphical representation of the results obtained in PLS-DA analysis type 131 spectra, with two separate groups of healthy individuals (50, red) and schizophrenia (81, SCZ, green) due to differences in the NMR spectra l R is the region 1.00-4.40 ppm.
  • FIG. 9 shows a graphical representation of results obtained in PCA analysis for 107 spectra, being individuals with bipolar disorder (26, TB, red) and schizophrenia (81, SCZ, green). The differences in the NMR spectra ⁇ ⁇ and 1.00 to 4.40 ppm region were used to build the model.
  • D DO deuterated water
  • phosphate-saline buffer in the ratio 1: 1 to 1: 2, preferably 250 ⁇ l serum to 250 ⁇ l D2O or buffer;
  • j. 1) perform analysis of major components in the range (iPCA) for the spectral region of chemical displacements from 1.00 to 4.40 ppm and divide the spectra into regions, and then the FCA models were then caked. piara each region;
  • r-edited NMR spectra] H are obtained using CPMG pulse sequence ⁇ Carr-Purcell- Meiboo Gill).
  • DSM-IV Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders
  • SCID Structured Clinical Interview for DSM Disorders
  • Symptom severity analysis was performed using the following instruments: Positive and Negative Syndrome Scale (PANSS), Hamilton Depression Rat ⁇ ng Scale (Ham-D) and Young Mania Rat ⁇ ng Scale (YMRS). The inclusion and exclusion criteria and contrasts are described in Table 1.
  • PCA principal component analysis
  • PLS-DA supervised partial least-squares inate analysis
  • Chemometrics analyzes were conducted from data matrices composed of 3 H-NMR spectra (acquired from 1 H-NMR analysis as described above). After transferring the NMR data to a matrix, chemometrics analyzes were performed by self-scaling data preprocessing, that is, the principal component analysis in the range (iPCA) PLS-DA and identification of the most important variables (loadins) for group separation. Both analyzes were performed using MATLAB. The iPCA was performed for the spectral region of chemical displacements from 1.00 to 4.40 ppm, first dividing the spectra into regions and then calculating the PCA models for each region.
  • iPCA principal component analysis in the range
  • amino acids whose side chains are aliphatic having methyl (C.H3-) / methylenic groups ( ⁇ CHa ⁇ and / or branches (-CH-) in their structure such as: alanaria, valine, leucine, isoleucine, proin, glutamic acid aspartic acid, glutamine, asparagine, lysine, and arginine, having chemical shifts in the range of 1.00-4.40 ppm;

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Abstract

A presente invenção se refere a um método de identificação por ressonância magnética nuclear (RMN) e quimiometria de biomarcadores para doenças mentaís graves, como transtorno bipolar e esquizofrenia que por meio do perfil metabólico de indivíduos com SCZ e TB com controles saudáveis (grupo controle), aplica ferramentas de ressonância magnética nuclear (RMN) e de quimiometria

Description

MÉTODO DE IDENTIFICAÇÃO POR RESSONÂNCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN) E QOIMIOMETRIA DE BIOMARCADORES PARA DOENÇAS MENTAIS
GRAVES E OSQS DO MESMO CAMPO DA INVENÇÃO
[I] A presente invenção se insere no campo da iologi química, mais precisamente na área da saúde e descreve um método de identificação por ressonância magnética nuclear (RMN) e quiraíometria de biornarcadores para doenças mentais graves, como transtorno bipolar e esquizof enia.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[2] Mos últimos anos, diferentes metodologias foram desenvolvidas para permitir a investigação quantitativa abrangente (plataforma "ômica"} de uma multiplicidade de metabolitos, chamadas em conjunto de metabolômica. Na metabolômica, geralmente, há uma comparação entre os níveis dos raetabólitos basais do organismo e dos metabolitos bíossintetizados após um estímulo ou uma disfunção, e que: comprometem, o organismo. Atualmente, apenas uma pequena parte da informação contida no metabo1orna é utilizada para o moriitoramento da saúde humana, como por exemplo, a dosagem de glicose ou colesterol para avaliar a diabetes e a saúde cardiovascular, respectivarnente .
[3] As ferramentas de metabolômica podem ser usadas para mapear as alterações em muitas vias bioquímicas e as interações entre elas, e esta informação é fundamental para a identificação dos bioraarcadores e potenciais alvos, que são específicos para cada doença- investigada.
[4] Alterações metabólicas- em distúrbios do sistema nervoso central (S C) , como esquizofrenia (SCZ), transtorno depressivo maior (TDM) , transtorno bipolar (TB) , esclerose lateral amiotrófica (ΕΙ ) e doença de Parkinson (DP) foram divulgadas era vários artigos científicos como descrito por Sussulini et al {Sussulini A, Prando A, Maxetto D, Poppí RJ, Banzato CEM, Tasic L, Arruda MAZ . Metabolic profilínç of huraan blood seruin f om treated patients íth bipolar dísoroler employxng IH MR spectroscopy and chemometrics . Anal- Chem. 2009, 81, 9755-9763) . Porém, ainda não há dados suficientes que permitam propo novos métodos para o diagnóstico ou para a identificação de novos alvos para o desenvolvimento de novas medicações com eficácia superior ás disponíveis.
[5] Os transtornos mentais como a SCZ e o TB são um grande desafio para o sistema de saúde, com sérias consequências financeiras, tanto em países desenvolvidos quanto em desenvolvimento. A ausência de cura e as limitações dos tratamentos disponíveis são reflexos do conhecimento limitado que se tem do cérebro e dos mecanismos moleculares e celulares que regulam as suas funções. Por conta disto, a descoberta de mecanismos etiopatogênicos e fatores de risco, bem. como de biomarcadores que possibilitem um diagnóstico precoce e/ou estadiamento dos transtornos mentais maiores para a estratificação dinâmica de pacientes, e a sua integração com a farmacologia clínica é considerada uma das grandes prioridades da pesquisa em psiquiatria na tualidade .
[6] Idealmente, biomarcadores nesses transtornos mentais (í) refietíriam processos biológicos relacionados â isiopatologia dessas doenças e (ii) seriam medidos de forma não-invasiva, como em u exame cíe sangue. Marcadores moleculares sensíveis relacionados a processos fisiopatológicos sub acentes possuem o potencial de serem altamente relevantes para auxiliar a detecção e o diagnóstico precoce, e também para facilitar o monitoramento da doença e da resposta ao tratamento . É relativamente1 bem descrito que estas doenças se associam a alterações no sistema nervoso central (SNC) , que comprometem as quantidades e funções de neurotransmissores (dopamina, serotonina, glu.tainato e ácido y-amino butirico ou GABA) , ácidos graxos (como o: ácido araquidônico) e de outras moléculas comuinente associadas ao estresse oxídativo e à disfunção mitocondriai . Porém, a maior parte dos estudos usa plataformas de investigação de biomarcadores bastante limitadas, o que fez com que, até o momento, nenhum bíornarcador tenha sido incorporado à prática clinica no cuidado dos pacientes com tais transtornos.
[7 J. O metaboloma de indivíduos com SCZ foi avaliado em poucos estudos,, apesar de ser o transtorno mental mais estudado.: Xian colaboradores (2011), usando a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas, estudaram pacientes nâo-medicados e encontraram que as quantidades de citrato, ácido palmítico, io-inositoi e alantoína poderiam ser utilizadas para diferenciar os pacientes dos controles saudáveis. He e colaboradores (2012) compararam 103 metabóiitos no plasma de 265 pessoas com SCZ com os de 216 controles saudáveis. Os níveis de 5 substâncias apresentaram diferenças significativas entre os dois grupos, sendo 4 aminoácidos (argínina, giutamina, histidina, ornitina) e um lipídio (fosfatidilcolina, PC a C38:6), e que foram sugeridos como possíveis biomarcadores da SCZ. Ma mesma linha, Oresic e colaboradores (2011) mostraram que pessoas com SCZ têm níveis elevados de 6 clusters de lipídios, contendo principalmente triglicerídeos saturados, e em 2 clusters de pequenas moléculas, contendo outros metacólitos, sendo um com aminoácidos aromáticos ( fenílalanína e tiros ina) e outro com prolina e ácidos glutâmico, láctico e pirúvico. Porém, não foi encontrado um estudo comparativo entre modelos animais e pacientes SCZ que permita validar estes biomarcadores em estudos, translacionais .
[8] O TB foi menos estudado usando metabolômíca, e há poucos dados disponíveis. Após uma revisão bibliográfica dos estudos realizados até o momento, nota-se o estudo do tecido cerebral post-mortem (Lan et al., 2009) e de Lorenzo e colaboradores que incluíram apenas 9 indivíduos (Lorenzo et al , 2013). O terceiro estudo, de Sussulini e colaboradores (2009) , realizou uma comparação entre 25 pacientes bipolares e igual número de controles. Entre os 25 pacientes bipolares, todos- tratados com drogas convencionais, 15 foram tratados adicionalmente com sais de lítio (I). Estes subgrupos de pacientes, ou seja, com ou sem. tratamento com lítio (I) , puderam ser diferenciados do grupo controle de acordo com o seu perfil metabólico. Os principais metabóíitos cujas concentrações foram importantes para a separação dos três grupos estudados foram: lipídios, moléculas relacionadas ao metabolismo iípídieo- (acetato, colina e mio-inositõl) e alguns aminoácidos-chave, como a lisina, glutamato e glutamina. Por exemplo, as concentrações variadas de mio- inositol podem indicar o aumento da atividade da enzima mío- iriositcl monofosfatase (I Pase) , o que levou a nível mais alto da concentração do mio-inositoi em pacientes tratados com lítio em comparação ao grupo controle, e a nível mais baixo do mio-inositol no soro de doentes bipolares tratados com drogas convencionais, mas sem o lítio (I) em comparação ao grupo controle. Dessa forma, foi demonstrado ser possível diferenciar um portador de TB do grupo controle, enquanto as diferenças observadas entre os pacientes tratados com lítio (I) ou não poderiam indicar vias relevantes de ação do lítio (Ί ) .
[9] Conforme discutido acima, não há muitos estudos relacionados ás ferramentas de etabolômíca, nem tampouco métodos para identificação de bíomarcadores e/ou potenciais alvos específicos para doenças mentais graves, por exemplo, o transtorno bipolar e a esquizofrenia. Portanto, há uma grande motivação na busca do desenvolvimento de um método para identificação de tais bíomarcadores e assim possibilitar ura diagnóstico precoce para as citadas doenças entais g a es.
[10] Por exemplo, alguns documentos de patentes sugerem métodos para a identificação de bíomarcadores , como: é o caso do documento WO20G7045865 que descreve um método para diagnóstico e monítora ento de indivíduos que sofrem de transtorno psicótico e utiliza espectroscopia de RMN de 1B. e amostras obtidas do paciente (plasma sanguíneo) para identificação de biomarcador.es relacionados a tal doença. Os biomarcadores propostos em tal documento, embora utilizem RMN para a detecção, além de outras técnicas sugeridas como H.PLC e US, se restringem à detecção de proteínas séricas como a transretina e a Apo A, que podem estar alteradas em outras afecções além do transtorno psicótico. De maneira diferente, o conjunto: de biomarcadores identificados pela presente invenção é especificamente relacionado a transtornos psiquiátricos, já que são me aboli tos relacionados com neurotransmissores sabidamente envolvidos nestes transtornos, e a avaliação conjunta cia presença ou ausência de alguns deste conjunto de biomarcadores garantem uma maior especificidade no diagnóstico.
[11] Outro documento, o WO200-6129131, diz respeito ao monitoramento no fluido cérebro-es inha1 de biomarcadores que incluem a glicose, lactato, espécies de acetato e pH. A presente invenção, diferentemente, analisa os biomarcadores a partir do soro humano, çuja obtenção e coleta são consideravelmente mais simples e de menor custo e risco para o paciente do que a obtenção e coleta de liquour como proposto pelo documento de anterioridade.
[12] O documento intitulado "Díscovery of biomazkexs in human urine and cerebrospinal fluíd by capillazy electrop oresis coupled to mass spectrometry: Towards new díagnostic and therapeutic approaches" propõe a detecção de biomarcadores, que consistem em peptideos ε proteínas de baixo peso molecular, em urina e fluído cêrebro-espinbal., e que podem ser detectados por eletroforese capilar acoplado a MS - O uso de urina se refere apenas a doenças renais, enquanto que para o transtorno mental como a esquizofrenia, o material biológico analisado é o líquido cerebroespinal , que apresenta a mesma limitação apresentada acima. Os resultados apresentados na presente invenção, especificamente para a esquizofrenia indicam que não há exclusão total entre controle e paciente, já que alguns biomarcadores parecem estar presentes nos dois grupos, apenas era proporções diferentes, mas sem limite de exclusão definida .
[13] O documento EP15 8129 propõe uma avaliação da expressão gênica de células mononucleares do sangue periférico. Entretanto, o alto custo e complexidade de isolamento destas células mononucleares em condições clinicas, bem corno o fato de serem susceptíveis a variações em populações de diferente origem ou background genético, o torna unia opção inviável em relação à presente invenção.
[14] 0 documento intitulado "A study of enzy es involved in catecholamine metabolism in parentes of patients v/ith schxzophzenía" propõe, o monitoramento das enzimas envolvidas no metabolismo de catecolaminas em pais de. pacientes com transtorno mental (esquizofrenia) , sugerindo a influência da herdabilidade de aielos alterados associados com o metabolismo de catecolaminas. No entanto, este é um estudo com caráter de ciência básica visando associar alterações no metabolismo de catecolaminas com a susceptibilidade a transtornos mentais. Não há a preocupação em utilizar um método para a identificação de biomarcadores usando a ressonância magnética nuclear e a quimiornetria a partir do soro humano, como proposto pela presente invenção.
[15] 0 documento intitulado " Prctein Biomarkers in Serim of Patients with Schizophrenia" , sugere a identificação de potenciais biomarcadores por uso de im obilized metal affínity capture protein chips (I AC30) e surface-enhanced laser desorption-ionization time-of~f1íght mass spectrometry, que levaram a detecção de dois fragmentos peptidicos do N-terminal da proteína fibrinogênio, amplamente encontrada no sangue periférico humano. 0 foiomarcador proposto é um fragmento: peptídico de urna proteína amplamente encontrada no material biológico a ser analisado. Entretanto, não há menção ou sugestão alguma do grau de discriminação entre pacientes e controles saudáveis, e sem análise de especificidade, conforme proposto na presente invenção .
[16] Portanto, a presente invenção apresenta uma forma fácil e eficaz para a identificação de biomarcadores para doenças mentais graves, mediante o uso de ressonância magnética nuclear de hidrogénio e quimiometria a partir do soro humano.
BREVE DESCRIÇÃO D¾ INVENÇÃO
[17] A presente invenção refere-se um método de identificação por ressonância magnética nuclear (RMN) e quimiometria de biomarcadores para doenças mentais graves, como transtorno bipolar (TB) e esquizof enia (SCZ). Adicionalmente,, a presente, invenção visa comparar o perfil metabólico de indivíduos com SCZ e TB com controles saudáveis (grupo controle) , aplicando as ferramentas de ressonância magnética nuclear <R N)' , principalmente RMN de XH, e de quimiometria, com destaque para análise de componentes principais (PCA) e Partial Least Square Discri inant Analysis (PLS-DA) . A presente invenção contribuiu para um melhor conheci ento acerca de doenças me tais graves e pode ser empregada no suporte ao diagnóstico mais precoce e/ou acompanhamento de tratamento destes transtornos psiquiátricos .
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[18] A FIG. 1 mostra o espectro de RM de XH de soro humano de um individue com transtorno bipolar (TB) com a ampliação da região do espectro de 1,00-4,40 ppm no canto esquerdo superior usada na análise d quimiometria.
[19] A FIG. 2 mostra o espectro de RMN de ;lH de soro humano cie um indivíduo com esquizof enia (SCZ) com a ampliação cia região do espectro de 1, 00-4, 40- ppm no canto esquerdo superior usada na análise de quimiometría.
[20] A FIG. 3 mostra o espectro de RMN' de lH de soro humano de um individuo saudável com a ampliação da região do espectro de 1,00-4,40 ppm, no canto esquerdo superior, usada na análise de quimiometría.
[21] A FIG. 4 mostra uma representação gráfica de resultados obtidos em análise de PCA para 131 espectros, tendo dois grupos separados em indivíduos saudáveis (50, vermelho) e com esquizof enia (81, SCZ, verde) devido as diferenças nos espectros de RMN de XH e a região 1,00-4,40 ppm .
[22] A FIG. 5 mostra uma representação gráfica de resultados obtidos em análise de tipo PLS-DA para 131 espectros, tendo dois grupos separados em indivíduos saudáveis (50, vermelho) e com esquizofrenia (81, SCZ, verde) devido as diferenças nos espectros de RMN de lR e a região 1,00-4,40 ppm.
[23] A FIG. 6 mostra uma representação gráfica de resultados obtidos em análise do tipo PCA para 76 espectros, tendo dois grupos separados em indivíduos saudáveis (50, vermelho) e com transtorno bipolar (26, TB, verde) devido as diferenças nos espectros de RMN de ;lH e a região 1,00-4,40 pp .
[24] FIG'. 7 mostra uma representação gráfica de resultados obtidos e análise do tipo PLS-DA para 76 espectros, tendo dois grupos separados em indivíduos saudáveis (50, vermelho) e com transtorno bipolar (26, TB, verde) devido as diferenças nos espectros de RMN de iE e a região 1,00-4,40 ppm. [25] A FIG. 8 mostra uma representação: gráfica de resultados obtidos em análise de PCA para 157 espectros, sendo indivíduos saudáveis (50, vermelho) , com transtorno bipolar (26, TB, verde) e com esquizofrenia (81, SCZ, azul). Devido as diferenças nos espectros de RMN d lH e a região 1,00-4,40 ppm foi possível observar a separação das amostras de grupo saudável do grupo de indivíduos doentes.
[26] A FIG. 9 mostra uma representação gráfica de resultados obtidos em análise de PCA para 107 espectros, sendo indivíduos com transtorno bipolar (26, TB, vermelho) e com esquizofrenia (81, SCZ, verde) . As diferenças nos espectros de RMN de ΧΗ e a região 1,00-4,40 ppm foram usadas para construção do modelo.
[27] A FIG. 1.0 mostra uma representação gráfica de resultados obtidos em análise de PCA para 104 espectros, sendo indivíduos saudáveis (5G vermelho) , com transtorno bipolar (26, TB, verde) e com esquizofrenia (28, SCZ, azul) . As diferenças nos espectros de RMN de 1B e a região 1,00- 4,40 ppm foram usadas para construção do modelo,
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[28] A presente invenção se refere a um método de identificação por ressonância magnética nuclear (RMN) e qu miometria de biomareadores para doenças mentais graves, como TB e SCZ. O referido método compreende as etapas de:
a) diluir o soro humano com água deuterada (D^O) ou com tampão fosfato—salino na proporção entre 1:1 e 1:2, preferencialmente 250 pL d soro para 250 pL de D2O ou tampão;
b) transferir a amostra para o tubo de RMN;
c) adquirir os espectros de RMN de 'LU em 25 °C; d) obter os espectros Tf-edited de RMN de :H:
d.1 ) eliminar os sinais de RMN de ;tH de moléculas maiores, de proteínas e/ou de alguns componentes lipídicos;
e) obter os espectros de 2D heteronucleares do tipo H-SQC Í1 C, ¾};
f) formar matriz de dados composta de espectros de RMN de ]-H obtidas na etapa c) ;
g) realizar as análises de quimiometria aplicando um pré-processaraento de dados por auto-escalonamento;
j .1 ) rea1i zar análise de compone tes principais no intervalo (iPCA) para a região espectral de deslocamentos químicos de 1,00 a 4,40 ppm e divide-se os espectros em regiões e, posteriormente caicuia-se os modelos de FCA piara cada região;
g.2) realizar análises do tipo PLS-DA; e g.3) identificar as mais importantes variáveis (loadings) para separação dos grupos;
h) encontrar as variáveis obtidas na etapa h) nos dados dos espectros obtidos nas etapas c) e d) ;
h.1) identificar os deslocamentos químicos de hidrogénio- 1 dos biomarcadores;
i). encontrar os padrões de acoplamento para os biomarcadores obtidos n etapa h) em dados de espectros obtidos na etapa e) ;
i .1) indicar as estruturas dos biomarcadores a partir dos dados de deslocamentos químicos de h.idrogênio-1 , de carbono-13 e de padrões de acoplamentos, e j) validar a identificação de biomarcadores .
[29] Sendo que:
- na etapa a) a amostra de soro humano deverá ter sido armazenada por não mais de 14 dias em -80°C, descongelada a °C e diluída cora água deuterada (ΌζΟ) , preferencialmente 1/1 (v/v) com 1¾0.
- na etapa c) , os espectros de RMN de *H são adquiridos usando saturação da água residual (HDO) via sequência cie pulsos Watergate (p3919gpj.
- na etapa d), os espectros r-edited de RMN de ]H são obtidos usando a sequência de pulso CPMG {Carr-Purcell- Meiboo Gill) .
- na etapa ) , a identificação de biomarcadores ser validada pela consulta de bases (BMRB, HDMB: e PRIME) de dados de RMN de 1Ή e de 13C para metabolitos humanos.
[30] É um objeto adicionai o uso do método da presente invenção para a avaliação de perfis metabólicos do soro humano,- classificação dos pacientes peia análise por RMN de ;Ή e ainda para o acompanhamento e estudo dos efeitos de fármacos, drogas e os efeitos farmacológicos no tratamento aplicado ,
Exemplo de concretização
Preparação das amostras
[31] As amostras de sangue de todos os indivíduos foram co.letadas por punção da veia periférica em 2 tubos Vacutainer no período da manhã, entre 8 e 10 h. O sangue coietado foi imediatamente colocado em gelo e após coagulação durante pelo menos 30 min, o soro obtido por centrifugação, a 1500 x g durante 15 min, foi aliquotado em 4 amostras de 250 pL e transferido para tubos de polipropileno, nos quais foram BR2016/000131
13
adicionados 0,01% (m/v) de azida de sódio e armazenado a - 80 °C até a análise. O período máximo de armazenamento até a análise foi de 1-14 dias (duas semanas.} .
[32] Os soros de 10 indivíduos com transtornos psiquiátricos, sendo 81 deles com esquizofrenia (SCZ) , e 26 com transtorno bipolar (TB) foram comparados com 50 indivíduos saudáveis (grupo controle) .
[33] O diagnóstico foi realizado por entrevista clinica usando a entrevista clínica estruturada do Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (DSM-IV) - Structured Clinicai Interview for DSM Disorders (SCID) . A análise da gravidade de sintomas foi feita util í zando-se os seguintes instrumentes: Positive and Negative Syndrome Scale (PANSS) , Hamilton Depression Ratíng Scale (Ham-D) e Young Mania Ratíng Scale (YMRS) . Os critérios de inclusão e exclusão e contram-se descritos na Tabela 1.
Tabela 1. Indicação de critérios usados na inclusão e exclusão de indivíduos de três grupos de estudo, esquizofrenia, transtorno bipolar (TB) e controle:
Grupo Esquizofrenia Grupo TB Grupo controle
Critérios de Inclusão
Preencher critérios Preencher crité rios Não preencher critério para esquizofrenia cie para transtorno para nenhum transtorno acordo com. o DSM-IV bipolar de acordo com psiquiátrico de Eixo I o DSM-IV a uai ou ao longo da vida .
Estar em tratamento Estar em tratamento Nào ter história psiquiátrico-. psíqu át ico - familiar de. transtorno psiquiátrico maior em pa entes de primeiro g au .
Idad entre 18 e 60 Idade entre 18 e 60 Idade entre 18 e 6 anos . a os . anos .
Capacidade de Capacidade de Capacidade de entendimento dos en tendimentc dos entendimento dos ofoj etívos do estudo . objetivos do estudo. ob etí vos do estudo .
Assinar termo de As s iriar termo de As inar termo de consent ímen10: CORsentímento conseritimento í níarmado . informado . i n formado .
Critérios de Exclusão
Doença sistémica Doença sistémica Doença s i. stêm ica instável ou grave instável ou grave instável ou grave
Uso de medicamentos Uso de medicamentos Uso de medicamentos para co orbidades para comorbidades para comorb idades médicas gerais. médicas gerais. médicas gera is .
Risco de suicídio ou Risco de suicídio ou Risco de suicídio ou de ag essão de agressão de agressão
Retardo meo ta.1 Retardo mental Diagnóstico
inferido inferido psiquiá rico de Eixo I
(atua.I ou passado}
Demência ou possível Demência ou possível Demência ou possível demência por dados demência por dados demência por dados clínicos clínicos c l ir; icos
[34] Após contato com o paciente e o familiar, foi agendada uma entrevista para. verificai: se o mesmo preenche os critérios de inclusão e não preenche os critérios de exclusão-, e, a partir dai, iniciou-se a entrevista clinica e aplicação das escalas.
[35] Ka avaliação química/bioquímica foram utilizados os seguintes instrumentos: Análise por RMN
[36] As amostras cio soro humano (250 uL) foram então cuidadosamente descongeladas a 4 °C e diluídas com água deuterada (ΏζΟ:, 250 pL} o com o tampão fosfato~sali.no (Phosphate Buffered Saline, PBS-, 250 p.L contendo 10% de Ό?.0) e transferidas para os tubos de RMN de 5 mm.
[37 ¾ Todas as análises de RMN foram adquiridas em um equipamento de 600 MHz equipado com a sonda de 5 mm (TBI) em 25 "C. Os espectros de RMN de !H {lOr 600 MHz) foram adquiridos usando sequência d pulsos Wat.erga.te {p3919gp) que permitiu saturação da água residual ÍHDO) . Foram usados 132 transientes e 32 k de pontos de dados, uma largura espectral de 12 kHz, 'Todos os espectros foram cuidadosamente processados tendo a fase e a linha de base corrigidos e referenciados ao sinal de metila do lactato em 1,33 ppm (3H, d, 3J = 7 Hz) .
138} Usando a sequência de pulso CPMG ( Carr-Purcell - Meiboom Gill) foram obtidos os espectros Ts-ed teci de RMM de XH . Os sinais de RMN de H de moléculas maiores, tais como, de proteínas e/ou alguns componentes lipídicos, foram liminados nos espectros do tipo -edít&d. Desta forma, filtro de T2 ajudou na identificação de metabolitos de interesse. Também, os espectros de 2D heteronucieares do tipo HSQC {13G, lH} foram utilizados na identificação ae biornarcadores .
Análise por Qui iometria
[39] Para identificação e reconhecimento de biomarcadores e padrões de diferenciação de grupos (doentes e saudáveis) foram empregadas análises quimiométricas : análise de componentes principais (PCA) e supervised partial least-squares díscri inate analysis (PLS-DA) .
[40] As análises de quimiometria foram conduzidas a partir de matrizes de dados compostos de espectros de RMN de 3-H (adquiridos na análise por RMN de *H, conforme descrito anteriormente) . Após a transferência dos dados de RMN para uma matriz, realizou-se as análises de quimiometria aplicando um pré-processamento de dados por auto- escalonamento, isto é, a análise de componentes principais no intervalo (iPCA) análises do tipo PLS-DA e identificação das mais importantes variáveis (loadíngs) para separação dos grupos. Ambas as análises foram realizadas utilizando MATLAB. A iPCA foi realizada para a região espectral de deslocamentos químicos de 1,00 a 4,40 ppm, primeiramente dividindo-se os espectros em regiões e posteriormente calculando-se os modelos de PCA para cada região.
[41] O principio deste algoritmo é permitir a divisão dos espectros em regiões e, depois, calcular os modelos de PCA para cada intervalo. Os resultados de PLS-DA permitiram uma visão geral dos dados, e podem auxiliar na identificação e interpretação das variáveis mais importantes para a separação dos grupos, identificando, desta forma, os deslocamentos químicos de hidrogénio-1 dos bi.omarcado.res .
[42] Além disso, foram encontrados os padrões de deslocamento para os biomarcadores obtidos em dados de espectros de 20 heteronucleares do tipo HSQC {13C, ¾} obtidos anteriormente, indicando as estruturas dos biomarcadores a partir dos dados de deslocamentos químicos de hidrogénio-- 1 , de carbono-13: e de padrões de acoplamentos. [43] Desse modo, a validação de identificação dos biomarcadores pôde ser realizada mediante a consulta de bases (BMRB, H.DMB e PRIME) de dados de RMN para metaboiitos humanos, conforme mostrado a Tabela 2 abaixo.
Tabela 2. Identificação de metaboiitos chave, biomarcadores, nos espectros de soros humanos. As estruturas com indicação de átomos de carbono (roetabólito - A) , deslocamentos químicos teóricos de átomo.» de carbonos (B) e assinalados nos espectros foram comparados (controle - C e Bipolar - D) com os dados depositados nos bancos de dados indicados (E) :
Figure imgf000019_0001
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3,67 - 63,7 (5) 3,62 ■- 60,7 3, 64 - 60, g
Resul tados
[44] Quando comparados todos os espectros de RMN de XH, conforme ilustrado nas FIGs . 1, 2. e 3 para amostras de exemplos para: transtorno bipolar (TB), esquizofrenia (SCZ) e saudáveis (grupo controle) , foram observadas poucas diferenças e um perfil similar e típico para soro humano.
[45] Importantes diferença entre os perfis metabolômieos de soros foram observadas na região espectral de 1, 00-4, 40 ppm (RMN de 'Η) de indivíduos que sofrem de SCZ e os controles saudáveis, como pode ser visto em PCA (FIG. 4) e na análise do tipo PLS-DA (FIG. 5)■
[46] Também foram observadas diferenças entre os perfis metabolômieos entre os indivíduos afetados por TB e os controles saudáveis na mesma região espectral (1,00-4,40 ppm), co o pode ser visto em PCA (FIG. 6) e na análise do tipo PLS-DA (FIG . 7) .
[47] Por fim, as diferenças entre os indivíduos afetados por transtornos psiquiátricos e os controles saudáveis na mesma região espectral (1,00-4,40 ppm) foram vistos e utilizados para classificação de amostras em doentes e saudáveis.
[48] Os resultados mais interessantes foram obtidos quando os indivíduos com TB e SCZ foram analisados ern conjunto com os indivíduos saudáveis e estes 157 espectros puderam ser classificadas em dois grupos: (a) grupo de doentes (indivíduos portadores de SCZ e TB) e (b) o grupo de controle de saudáveis, como podem ser observados na FIG. 8.
[453] O grupo de indivíduos com transtornos psiquiátricos graves com sobreposição no espectro na faixa espectral cie 1, 00-4, 40 ppm é. composto por indivíduos com SCZ e com. TB, sugerindo semelhanças nos perfis metabólicos (FIG. 9} . Porém, 1/3 das amostras (28 dos 81 espectros de pacientes cora SCZ") apresentaram perfil completamente diferente, como observado na análise de PCA (FIG. 10) , quando o grupo de amostras de SCZ que apresentam sobreposição com o TB foi excluído da matriz de dados. Estudos estão sendo conduzidos para analisar individualmente cada um destes pacientes com SCZ para identificar os parâmetros que determinam esta sobreposição com os pacientes com TB.
[50] Adicionalmente, constatou-se que os deslocamentos químicos de 1,00-4,40 ppm e os metabóiitos correspondentes (ao redor de 20 metabóiitos chave) são responsáveis pela distinção dos indivíduos saudáveis e TB, saudáveis e SCZ, e doentes e saudáveis. Esses metabóiitos são de classes de:
• lipídeos contendo os ácidos graxos de cadeias longas, tendo grupos metila {CH3-, 1,00 ppm), etilénicos (- CH'2-, 1,20-1,40 ppm) e insaturados com geometria Z (ou eis) (CH3-CH2-CH-CH-, 1,60-2,10 ppm) /
• aminoácidos cujas cadeias laterais são alifáticas tendo grupos metila (C.H3-) / metilénicos (~CHa~ e/ou ramificações (-CH-) na sua estrutura, tais como: alaníria, valina, leucina, isoleucina, proiína, ácido glutãmíco, ácido aspârtico, glutamina, asparagina, lis na, e arginina, tendo deslocamentos químicos no intervalo de 1,00-4,40 ppm;
• colina (3,19-4,01 ppm) e myo-inositoi (3,24-4,05 ppm) como metabóiitos importantes e presentes em quantidades diferentes era três grupos de soros humanos ínveS:tígados . [51] Os resultados obtidos podem ser utilizados em ensaios clínicos de rotina para avaliar perfis metabólicos do soro humano, classificar os pacientes pela análise rápida e sensível .(RMN de ¾) como alterado (doente) ou saudável, diferenciar grupo com TB do grupo saudável, grupo de SCZ de saudáveis, e ainda, para acompanhar e estudar os efeitos de fármacos, drogas e os efeitos farmacológicos no tratamento aplicado. Isto torna a presente invenção pioneira na aplicação de perfis metabólicos por RMN e químiometria em análise bioquímica, química e psiquiát ica comparati a de pacientes TB e SCZ.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Método de identificação por ressonância magnética nuclear (RMN) , e quimiometria de biomarcadores para doenças mentais graves, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:
a) diluir soro humano;
b) transferir a amostra para o tubo de RMK;
c) adquirir os espectros de RMN de XH em 25°C;
d) obter os espectros T.?~eàited de RMN de :iH;
e) obter os espectros de 2D heteronucleares do tipo HSQC {i3C:, ¾};
f) formar matriz de dados composta de espectros de RMN de 1H obtidas na etapa c)
g) realizar as análises de qu miometria aplicando um pré-processamento de dados por auto-escalonamento;
li) encontrar as variáveis obtidas na etapa g) nos dados dos espectros obtidos na etapa, c) ;
i) encontrar os padrões de acoplamento para os biomarcadores obtidos na etapa h) em dados de espectros obtidos na etapa e) ; e
j) validar a identificação de biomarcadores.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de na etapa a) as amostreis de soro humano serem diluídas na proporção entre 1:1 e 1:2 com água deuterada (D2O) ou co solução tampão na proporção 4:1 fosfáto-salino e de água deuterada (DaO) , preferencialmente diluir 1/1 (v/v) de ¾0, e ser armazenada por não mais de 14 dias em -80 °C e descongelada a eC.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de na etapa c) , os espectros de RMN serem adquiridos usando a sequência de pulso Wate gate (p39l9gp) para saturação da água residual (HDO) .
4, Método, de acordo cora a reivindicação 1, carac eri zado pelo fato de na. etapa d) , os espectros Ts- edíted de RMM de 5-H são obtidos usando a sequência de pulso CPMG e compreender ainda a subetapa de:
d.l) eliminar os sinais de RM de XH de moléculas maiores, de proteínas e/ou de alguns componentes lipídícos.
5:. Método, de acordo com a r ivindicação 1, caracterizado pelo fato da etapa g) compreender ainda as subetpas de:
g.l) realizar análise de componentes principais no intervalo (iPCA) parei a região espectral de deslocamentos químicos de 1,00 a 4,40 ppm;
g.2) realizar análises do tipo PLS-DA; e
g.3) identificar as mais importantes variáveis {loadlngs} para separação dos grupos.
6. Método, de . acordo com a. reivindicação 6, caracterizado pelo fato de na subetapa g) primeiramente divide-se os espectros em regiões e, posteriormente caicula- se os modelos de PCA para cada região,
7. Método, de acordo com a reivindicação í, caracterizado pelo: fato d etapa h) compreender ainda a subetapa de:
h.1) identificar o deslocamentos químicos de 1H cios bioraarcadores .
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado peio fato da etapa .1} compreender ainda a subetapa de:
i. l) indicar as estrutura dos biemarcadores a partir dos dados de deslocamentos q ímicos de hidrogênio~l , de carbono-13 e de padrões de acoplamentos.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracter1aado pelo fato de na etapa j), a identificação de biomarcadores ser validada pela consulta de bases (BMRB, í-IDMB e PRIME) de dados de RMN para metaholitos humanos.
10. Uso do método conform definido em qualquer uma das reivindicações 1 a. 9, carac erizado pelo fato de ser para a avaliação de perfis metabólicos do soro humano-, classificação dos pacientes pela anális por RMN de 5-H e ainda para o acompanhamento e estudo dos efeitos de fármacos, drogas e os efeitos farmacológicos no tratamento aplicado.
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