ES2891530T3 - Método para determinar mutaciones de BRAF y proteína BRAF de tipo natural mediante espectrometría de masas - Google Patents

Abstract

Un método para determinar la proporción molar entre proteína BRAF (homólogo B1 del oncogén viral del sarcoma murino v-raf) de tipo natural (WT) y variantes proteicas de la misma en una muestra biológica, en donde las variantes de proteína BRAF son variantes mutadas en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 600 en BRAF WT, estando ocupada dicha posición por valina en la BRAF WT, que comprende las etapas de: a) digerir dicha muestra usando una serina proteinasa que escinde específicamente enlaces peptídicos C-terminales a restos de ácido glutámico o enlaces peptídicos C-terminales a restos de ácido glutámico o aspártico, para obtener una composición que comprende un fragmento peptídico resultante de la digestión de los péptidos por la proteinasa, en donde la masa de dicho fragmento difiere entre dicha proteína B-raf de tipo natural (WT) y una variante de proteína BRAF; b) evaluar cuantitativamente la cantidad molar de un fragmento peptídico resultante de la digestión de la proteína B-raf de tipo natural (WT) y la cantidad molar de un fragmento peptídico resultante de la digestión de variantes de la proteína B-raf de tipo natural (WT) usando una técnica de espectrometría de masas; y c) basándose en la evaluación cuantitativa calcular la al menos una proporción específica entre dicha proteína BRAF WT y una variante de la misma.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para determinar mutaciones de BRAF y proteína BRAF de tipo natural mediante espectrometría de masas

Campo de la invención

La presente invención pertenece en general al campo del diagnóstico médico y terapia dirigida. Más particularmente, la invención se refiere a un método específico para la determinación de la especiación de aminoácidos de las secuencias de BRAF de proteína serina/treonina quinasa; formas de tipo natural y mutadas mediante metodología de espectrometría de masas. Más particularmente, el método se refiere a la capacidad de analizar las secuencias de BRAF con una mutación puntual, tal como la posición 600 de aminoácido. Además, la presente invención se refiere a proporcionar una utilidad clínica para tomar decisiones para el tratamiento personalizado de pacientes con melanoma con inhibidores de quinasa.

Antecedentes de la invención

Se sabe que las demandas cada vez mayores de atención médica frente al cáncer en la actualidad plantean altas previsiones y orientaciones de la comunidad investigadora para desarrollar nuevas soluciones que puedan mejorar los resultados clínicos con una mayor rentabilidad. Como respuesta a estos desafíos, la atención médica moderna está buscando formas de tratar a los pacientes que sean más eficaces y beneficiosas para el paciente, así como un mayor ahorro de costes. El esquema de las directivas reguladoras es vital para que nuestra comunidad gestione y satisfaga las demandas de los pacientes con cáncer que esperan fármacos más seguros, con menor mortalidad, y con un inicio de eficacia rápido.

El National Cáncer Institute, una parte de los National Institutes of Health y médicos y científicos locales, han realizado un gran progreso para trabajar y proporcionar una estrategia de validación y descubrimiento de biomarcadores de proteínas. Estas directrices reguladoras proporcionan proteínas, péptidos, u otros biomarcadores de salud, enfermedad, respuesta a terapia de alta calidad, estandarizados, sensibles, específicos, cuantitativos, y fácilmente accesibles en los procesos de aprobación de las agencias reguladoras (por ejemplo, la Food and Drug Administration de Estados Unidos; FDA).

Es un hecho bien conocido que la causa de aproximadamente un 22 % de las muertes por cáncer se debe al consumo de tabaco. Otro 10 % se debe al sobrepeso y la obesidad, una mala alimentación y, a menudo, falta de ejercicio físico y consumo excesivo de alcohol. Otros factores incluyen determinadas infecciones y/o exposición a infecciones y contaminantes ambientales. En el mundo en desarrollo, cerca de un 20 % de los cánceres se deben a infecciones tales como hepatitis B, hepatitis C y virus del papiloma humano. Estos factores actúan, al menos parcialmente, cambiando los genes y proteínas de una célula. Generalmente se requieren muchos de estos cambios genéticos antes de que el cáncer se desarrolle. Estadísticamente, aproximadamente un 5-10 % de los cánceres se deben a defectos genéticos heredados de los padres de una persona.

La medicina personalizada es un modelo de tratamiento médico, adaptado al paciente individual. Dentro de la medicina personalizada, a menudo se emplean terapias óptimas para seleccionar tratamientos apropiados basándose en el contexto del contenido genético de un paciente u otro análisis molecular o celular. El uso de información genética, la farmacogenómica, ha desempeñado un papel importante en determinados aspectos de la medicina personalizada, y el término se acuñó por primera vez en el contexto de la genética, aunque desde entonces se ha ampliado para abarcar todo tipo de ensayos de diagnóstico de lectura personal dirigidos.

El cribado y la medición de todos y cada uno de los pacientes de forma individual permitirá un diagnóstico más exacto y un plan de acción personalizado. El genotipado moderno proporciona una explicación detallada de la secuencia de ADN de un individuo; a continuación su genoma puede compararse con un genoma de referencia, para evaluar las variaciones genéticas existentes que pueden explicar el estado de enfermedad concebible.

Un tratamiento preciso, mediante terapia dirigida, usando "medicina personalizada" puede ayudar enormemente en los avances de atención preventiva. Esto se ha demostrado a lo largo de los años, donde a las mujeres se les están realizando genotipado para determinadas mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2, respectivamente, investigando la predisposición debido a antecedentes familiares de melanoma, cáncer de mama y ovario.

Mediante la identidad de una multitud de fuentes de presentación de la enfermedad, que se cartografían de acuerdo con mutaciones que existen dentro de un genoma, indican que cuanto más fácilmente puedan identificarse en un individuo, mayor será la oportunidad de tratamientos satisfactorios. Diagnóstico complementario es la definición que se está usando para someter a ensayo la eficacia y seguridad de un fármaco específico para un grupo o subgrupo de pacientes objetivo. En muchos casos, el ensayo de diagnóstico complementario está adaptado a la mejora de la eficacia del tratamiento terapéutico.

En la actualidad, en la atención médica moderna, es común que los médicos usen a menudo un procedimiento de prueba y error, hasta que encuentren la terapia de tratamiento que sea más eficaz para su paciente. Por lo tanto, podrían ser ventajosos métodos de tratamiento mejorados que tengan en cuenta al individuo, con métodos novedosos que podrían ayudar a orientar el tratamiento en la biología de enfermedad altamente compleja.

La señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) y la correspondiente vía de activación, desempeña un papel fundamental en crecimiento celular, diferenciación y respuesta al estrés. Dentro de las enfermedades cancerosas, la actividad de la vía MAPK se ha visto implicada en muchos tipos de desarrollos de cáncer. En general, esta vía se activa mediante la unión de factores de crecimiento extracelulares a receptores unidos a la membrana, que a continuación reclutan proteínas intracelulares a la membrana celular, conduciendo a la activación de la proteína de unión a guanosina trifosfato pequeña, RAS. Por lo tanto, RAS adopta una conformación activada que estimula la señalización descendente. Esto dará como resultado fosforilación y activación de ERK, que controla una amplia gama de procesos funcionales dentro de la célula. Esta vía también puede activarse mediante la mutación de proteínas específicas, incluyendo BRAF. Parece que tales mutaciones activantes imitan la fosforilación reguladora de BRAF y aumentan su actividad de quinasa en comparación con la proteína de tipo natural.

El melanoma maligno es el sexto cáncer más común en todo el mundo con una incidencia creciente en los países del norte de Europa y Australia. De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud, cada año se diagnostican aproximadamente 132.000 nuevos casos de melanoma en todo el mundo. La mayoría de los casos iniciales de melanoma se curan quirúrgicamente; sin embargo, algunos tumores primarios presentarán recidiva y se volverán metastásicos. La estadificación de los tumores por el American Joint Committee on Cáncer (AJCC) se basa en grosor del tumor, índice mitótico y ulceración, así como en diseminación regional y alejada. El melanoma maligno ha sido intrínsecamente difícil de tratar con una supervivencia a 5 años muy baja (<15 %).

Las mutaciones de BRAF que activan constitutivamente la señalización de MAPK y evitan la necesidad de estímulos ascendentes ocurren con alta incidencia en el melanoma maligno. En consecuencia, la inhibición celular de la actividad de quinasa BRAFV600E por impacto farmacológico dará como resultado una disminución de la fosforilación de MEK y e Rk . Aproximadamente un 90 % de todas las mutaciones de BRAF identificadas en cánceres humanos son una transversión de T1799A en el exón 15, que da como resultado una sustitución de aminoácido V600E y activación de quinasa BRAF. La alta frecuencia de mutaciones activadoras en tumores y la consiguiente adicción a la vía MAPK hacen de BRAF una diana terapéutica atractiva, donde la inhibición de la actividad de quinasa de BRAFV600E y otros mutantes de BRAF activados podría proporcionar una terapia eficaz.

Se han identificado y sometido a ensayo clínico inhibidores de BRAF con diversos niveles de selectividad. La propagación del cáncer y las fases de inicio de enfermedad pueden detectarse mediante determinados signos y síntomas o ensayos de diagnóstico. A continuación, generalmente se investiga además mediante diversos tipos de plataformas de formación de imágenes médicas, tales como tomografía computarizada por rayos X (CT), tomografía por emisión de positrones (PET), formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) o formación de imágenes por espectrometría de masas y se confirma mediante diagnóstico patológico de una biopsia. Los beneficios del cribado en el cáncer de mama son valiosos tanto para el paciente como para nuestra sociedad, como lo demuestra el tratamiento de la mujer y cáncer de mama, así como para hombres con cáncer de próstata, donde, en ambas enfermedades, el desarrollo del diagnóstico ha disminuido significativamente las tasas de mortalidad durante la última década.

Los tipos de cáncer más comunes en hombres son cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer colorrectal y cáncer de estómago. Los sucesos más frecuentes en la mujer son cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón y cáncer de cuello uterino. Sin embargo, si se incluyera la piel y todos los tipos de melanoma maligno, esto podría representar aproximadamente un 40 % de los casos. Con respecto a los niños, los tipos de cáncer varían y los más comunes son leucemia linfoblástica aguda y tumores cerebrales. En África, sin embargo, la enfermedad cancerosa más común es el linfoma no Hodgkin. Los costes financieros del cáncer se han estimado en 1,16 billones de dólares estadounidenses al año desde 2010.

La mayoría de los melanomas albergan alteraciones en los genes BRAF, NP1, RAS, MDM2 (KIT), que dan como resultado la activación de las vías MAPK y RAS que confieren una ventaja de supervivencia al reprogramar el ciclo celular esencial y funciones celulares apoptóticas. Algunas propiedades clínicas y patológicas reflejan parcialmente los subtipos genómicos de melanoma identificados (BRAF, RAS, NF1, tipo natural triple), pero desde la perspectiva clínica y genética, los grupos aún son heterogéneos.

Algunos fármacos recién desarrollados que permiten terapia dirigida, tales como inhibidores de quinasa o fármacos que modulan la respuesta inmunitaria, son más prometedores. Dos compuestos, Vemurafenib y Dabrafenib (inhibidores de quinasa), han conseguido la aprobación de la FDA para el tratamiento de melanomas metastásicos e irresecables con mutación de BRAF (V600E). El trametinib, un inhibidor de quinasa regulada por señales extracelulares activada por mitógenos (MEK), también está aprobado por la FDA. Sin embargo, estos tratamientos más recientes también se han sometido a desarrollo de resistencias. Recientemente, la FDA aprobó Nivolumab (anticuerpo anti-PDl) en combinación con Ipilimumab (anticuerpo anti-CTLA-4), para el tratamiento de pacientes con melanoma metastásico tanto no resecable de tipo natural BRAF V600 como con mutación de BRAF.

En Chen Hang et al., Anal. Chim. Acta, vol. 933 (2016), pág. 144-155, se evalúa el inmunoenriquecimiento acoplado a dos técnicas cuantitativas basadas en MS para detectar y cuantificar proteínas BRAF de tipo natural (WT) y mutante de V600E en muestras de tejido de CRC confirmadas en secuencia de ADN.

En Mark Kriegsmann et al., Diagn. Pathol. (2015), 10:132, se desvela un ensayo para análisis espectrométrico de masas de rutina para someter a ensayo la presencia/ausencia de 18 mutaciones de KRAS, 14 de n Ra S y 4 de BRAF a nivel de ADN.

En el documento US 2015/344957 A1 se desvelan métodos para determinar la cantidad de una mutación BRAF V600E en un nivel de ADN a lo largo del tiempo en un sujeto con histiocitosis de células de Langerhans (LCH) o enfermedad de Erdheim-Chester (ECD) que se está tratando con vemurafenib o dabrafenib.

En Paolo A Ascierto et al., J. Transl. Med., (2012), 10:85, se sugiere usar vemurafenib y dabrafenib dirigidos a mutaciones de BRAF para el tratamiento del melanoma.

Por lo tanto, existe una gran demanda para investigar mutaciones de BRAF y las consecuencias de estas de forma individual, antes de iniciar el tratamiento específico de los pacientes con melanoma maligno con medicamentos inhibidores de quinasa dirigidos.

Sumario de la invención

Por lo tanto, la presente invención busca preferentemente mitigar, aliviar o eliminar una o más de las deficiencias en la técnica identificadas anteriormente y desventajas individualmente o en cualquier combinación y resuelve al menos los problemas mencionados anteriormente al proporcionar un método para determinar la proporción molar entre proteína BRAF de tipo natural (WT) y variantes proteicas de la misma en una muestra biológica, en donde las variantes de proteína BRAF son variantes mutadas en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 600 en BRAF WT, estando dicha posición ocupada por valina en BRAF WT, que comprende las etapas de: a) Digerir dicha muestra usando una serina proteinasa que escinde específicamente enlaces peptídicos C-terminales a restos de ácido glutámico o enlaces peptídicos C-terminales a restos de ácido glutámico o aspártico, para obtener una composición que comprende un fragmento peptídico resultante de la digestión de los péptidos por la proteinasa, en donde la masa de dicho fragmento difiere entre dicha proteína B-raf de tipo natural (WT) y una variante de proteína BRAF. b) Evaluar cuantitativamente la cantidad molar de un fragmento peptídico resultante de la proteína B-raf de tipo natural (WT) y la cantidad molar del fragmento peptídico resultante de la digestión de variantes de la proteína B-raf de tipo natural (WT) usando una técnica de espectrometría de masas. Y, c) basándose en la evaluación cuantitativa calcular la al menos una proporción específica entre dicha proteína BRAF WT y una variante de la misma.

También se proporciona un método para estimar la susceptibilidad de un sujeto a un tratamiento farmacológico dado para una enfermedad relacionada con BRAF, que comprende las etapas de (i) proporcionar una muestra de un sujeto que padece una enfermedad relacionada con BRAF; y determinar la proporción molar específica entre proteína BRAF Wt y variantes de la misma mediante un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9. (ii) Comparar la proporción molar específica entre proteína BRAF WT y variantes de la misma, con un valor de referencia de la proporción molar específica entre proteína BRAF WT y una variante de la misma determinado a partir de una multitud de muestras de sujetos que se sabe que padecen dicha enfermedad relacionada con BRAF y que son susceptibles a dicho tratamiento farmacológico dado. (iii) Basándose en dicha comparación determinar la susceptibilidad del sujeto a un tratamiento farmacológico dado, en donde una proporción definida por proteína BRAF WT con respecto a dicha al menos una variante de proteína BRAF en dicha muestra por encima del valor de referencia de la proporción definida por proteína BRAF WT con respecto a dicha al menos una variante de proteína BRAF es indicativa de mayor susceptibilidad a un tratamiento farmacológico dado, el valor de referencia es una proporción molar específica entre proteína BRAF WT y dicha al menos una variante de proteína BRAF determinado a partir de una multitud de muestras de sujetos que se sabe que padecen dicha enfermedad relacionada con BRAF y que son susceptibles a dicho tratamiento farmacológico dado, la enfermedad relacionada con BRAF es un cáncer con mutaciones de BRAF en la posición de aminoácido 600, y dicho tratamiento farmacológico es un tratamiento que usa un inhibidor de quinasa, tal como Vemurafenib, Dabrafenib o Sorafenib.

Además se proporciona, pero no se incluye en las reivindicaciones, un método de tratamiento para un sujeto con una enfermedad relacionada con BRAF, que comprende las etapas de (i) proporcionar una muestra de un sujeto que padece una enfermedad relacionada con BRAF; y determinar la proporción molar específica entre proteína BRAF WT y variantes de la misma mediante un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9. (ii) Comparar la proporción molar específica entre proteína BRAF WT y variantes de la misma, con un valor de referencia de la proporción molar específica entre proteína BRAF WT y una variante de la misma determinado a partir de una multitud de muestras de sujetos que se sabe que padecen dicha enfermedad relacionada con BRAF y que son susceptibles a dicho tratamiento farmacológico dado. (iii) Basándose en dicha comparación determinar la susceptibilidad del sujeto a un tratamiento farmacológico dado, en donde una proporción de BRAF WT con respecto a dicha al menos una variante de proteína BRAF en dicha muestra por encima del valor de referencia de la proporción BRAF WT con respecto a dicha al menos una variante de proteína BRAF es indicativa de mayor susceptibilidad a un tratamiento farmacológico dado. Y, (iv) si se encuentra que el paciente es susceptible a un tratamiento farmacológico dado, administrar el fármaco de dicho tratamiento farmacológico a una dosis diaria definida (DDD) o prescrita durante un periodo de tratamiento prescrito, o si se encuentra que el paciente no es susceptible a un tratamiento farmacológico determinado, iniciar tratamientos alternativos en su lugar, tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia y/u otros tratamientos beneficiosos para dicha enfermedad relacionada con BRAF.

Breve descripción de los dibujos

Estos y otros aspectos, características y ventajas de los que es capaz la invención serán evidentes y se aclararán a partir de la siguiente descripción de realizaciones de la presente invención, haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los que;

la figura 1 es una ilustración del procedimiento experimental general de cuantificación basada en SRM de BRAF (tipo natural y formas mutadas),

la figura 2 demuestra los picos cromatográficos de precursor de característica de SRM para los péptidos generados por GluC, el tipo natural y las cuatro variantes mutadas de BRAF, en lisado de tejido tumoral de una muestra de tumor recién congelado. Los tiempos de retención para WT, V600E, V600D, V600 R y V600K son 19,9, 23,2, 18,3, 15,9 y 15,8 min, respectivamente,

la figura 3 muestra los iones de transición característicos que definen la característica de SRM de los péptidos en lisado de tejido tumoral de una muestra de tumor recién congelado. Aquí se muestran dos ejemplos A) tipo natural y B) V600E,y

la figura 4 ilustra una de las mutaciones de BRAF en la posición de aminoácido 600 (V600E) y la inhibición celular de la actividad de quinasa BRAFV600E dando como resultado una disminución de la fosforilación de MEK.

Descripción de realizaciones

Últimamente, el campo del cáncer ha descubierto mucho sobre la variedad genética de tipos de cáncer que se presenta dentro de la patología de enfermedades tradicional. La definición de heterogeneidad tumoral entre pacientes con cáncer es una diversidad genética dentro de un solo tumor. Entre otras posibilidades, estos descubrimientos plantean la posibilidad de identificar qué fármacos, con resultados aplicados a la población general, pueden tener éxito para una proporción de casos con un perfil genético particular.

Con la medicina personalizada, los tratamientos pueden adaptarse más específicamente a un individuo y dar una idea de cómo responderá su cuerpo al fármaco y si ese fármaco funcionará basándose en su genoma, y posterior transcripción con una proteína expresada final. El genotipado es una herramienta valiosa para la medicina personalizada, donde se determinan diferencias en la composición genética (genotipo) de un individuo, examinando la secuencia de ADN del individuo y comparándola con una secuencia de referencia. Aunque esto puede descubrir la presencia de mutaciones génicas en un individuo, se sabe que la expresión génica con mayor frecuencia no se corresponde con el nivel de proteína de la célula. Además, existe la posibilidad de tener múltiples genes presentes, que expresan tanto proteína mutada como de tipo natural.

El fenotipado realizado mediante secuenciación de proteínas es la única forma en que puede garantizarse la mutación verdadera y el estado de tipo natural a nivel cuantitativo, proporcionando una medición estequiométrica de formas mutadas y no mutadas de BRAF.

La señalización de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK) y la correspondiente vía de activación, desempeña un papel fundamental en crecimiento celular, diferenciación y respuesta al estrés. Dentro de las enfermedades cancerosas, la actividad de la vía MAPK se ha visto implicada en muchos tipos de desarrollos de cáncer. En general, esta vía se activa mediante la unión de factores de crecimiento extracelulares a receptores unidos a la membrana, que a continuación reclutan proteínas intracelulares a la membrana celular, conduciendo a la activación de la proteína de unión a guanosina trifosfato pequeña, RAS. Por lo tanto, RAS adopta una conformación activada que estimula la señalización descendente. Esto dará como resultado fosforilación y activación de ERK, que controla una amplia gama de procesos funcionales dentro de la célula. Esta vía también puede activarse mediante la mutación de proteínas específicas, incluyendo BRAF. Parece que tales mutaciones activantes imitan la fosforilación reguladora de BRAF y aumentan su actividad de quinasa en comparación con la proteína de tipo natural.

Las mutaciones de BRAF que activan constitutivamente la señalización de MAPK y evitan la necesidad de estímulos ascendentes ocurren con alta incidencia en el melanoma maligno. En consecuencia, la inhibición celular de la actividad de quinasa BRAFV600E por impacto farmacológico dará como resultado una disminución de la fosforilación de MEK y ERK. El efecto funcional de estas modificaciones postraduccionales dará como resultado una inhibición de la proliferación celular mediante una parada inicial del ciclo celular G1, seguida de muerte celular.

Hasta ahora, se han identificado más de 45 mutaciones de BRAF asociadas a cáncer con una alta frecuencia en cánceres específicos, donde un 40-60 % están relacionados con melanoma maligno. Aproximadamente un 90 % de todas las mutaciones de BRAF identificadas en cánceres humanos son una transversión de T1799A en el exón 15, que da como resultado una sustitución de aminoácido V600E y activación de quinasa BRAF. Se ha informado que la variación de la mutación es >80 % en los cánceres y nevus de melanomas (lesiones crónicas y muy circunscritas de la piel o mucosas). También se ha informado de una variedad menor de incidencias; que varían de un 0 a un 18 % en otros tumores (Namba H, Nakashima M, Hayashi T, Hayashida N, Maeda S, Rogounovitch TI, Ohtsuru A, Saenko VA, Kanematsu T, Yamashita S (septiembre de 2003). "Clinical implication of hot spot BRAF mutation, V599E, in papillary thyroid cancers". J. Clin. Endocrinol. Metab. 88 (9): 4393-7.).

En el diagnóstico del paciente se ha encontrado que en un 90 % de los casos, la timina está sustituida por adenina en el nucleótido 1799. Esto dará como resultado un cambio de aminoácido; valina (V) sustituida por glutamato (E). Esto ocurrirá en la posición 600, en el segmento de activación, descrito con detalle anteriormente (Tan YH, Liu Y, Eu KW, Ang PW, Li Wq , Salto-Tellez M, Iacopetta B, Soong R (abril de 2008). "Detection of BRAF V600E mutation by pyrosequencing". Pathology. 40 (3): 295-8.).

La alta frecuencia de mutaciones activa antes en tumores y la consiguiente dependencia de la vía MAPK hacen de BRAF una diana terapéutica atractiva, donde la inhibición de la actividad de quinasa de BRAFV600E y otros mutantes de BRAF activados podría proporcionar una terapia eficaz.

Existen fármacos diseñados para dirigirse a cánceres con la mutación V600E, tal como Vemurafenib, que causa muerte celular programada en líneas celulares de melanoma. Sin embargo, la eficacia de respuesta, que se informó recientemente en un estudio de fase 2 de vemurafenib en pacientes dio como resultado que los pacientes con melanoma metastásico, que albergaban una posición de mutación en la mutación V600-BRAF a E600-BRAF, mostraran una tasa de respuesta global confirmada y revisada independientemente de un 53 %. La mediana con una supervivencia sin progresión de 6,8 meses y una supervivencia global mediana de 15,9 meses (J.A. Sosman, K.B. Kim, L. Schuchter, et al., "Survival in BRAF V600-mutant advanced melanoma treated with vemurafenib" The New England Journal Medicine, 2012, 366; 8707-714).

Esto muestra que incluso en casos con mutación E600-BRAF confirmada, la tasa de respuesta es solo la mitad de los pacientes (53 %). Por lo tanto, para el otro 47 % que no respondió al tratamiento, hubiera sido no solo beneficioso sino también vital tener una indicación de si el tratamiento funcionaría o no, para dar tiempo para usar otros tratamientos en su lugar. En el caso de Vemurafenib, funciona interrumpiendo la etapa B-Raf/MEK en la vía B-Raf/MEK/ERK. En efecto, la vulnerabilidad a inhibidores de proteasoma depende de la señalización de BRAF persistente. Por lo tanto, se postula que el nivel de proteína real de BRAF V600E y su proporción con respecto a BRAF de tipo natural es fundamental para que el tratamiento funcione para el tumor. Por lo tanto, existe una gran demanda para investigar la heterogeneidad de la proteína BRAF, WT frente a variantes mutadas, antes de iniciar el tratamiento del melanoma maligno con inhibidores de quinasa. La razón por la que el análisis de proteínas específicas es de importancia obligatoria es que los fármacos inhibidores de quinasa se desarrollan hacia región o regiones específicas de la estructura tridimensional de la proteína. En muchos casos, la interacción de afinidad y la constante de unión entre la molécula farmacológica y la proteína diana (BRAF), tiene un nivel de umbral de energía dado que es óptimo para esta unión específica, y está determinada por la ventana operativa, lo que significa que los fármacos para el cáncer son muy específicos para la estructura tridimensional correcta. Cualquier alteración de la estructura de la proteína BRAF y el fármaco pueden unirse correctamente, dando como resultado que una molécula farmacológica se una correctamente a, e inhiba, una fracción específica de las proteínas BRAF en un entorno de proteína BRAF heterogéneo.

La siguiente descripción se centra en realizaciones de la presente invención aplicables a un método de espectrometría de masas para medir el estado de secuencias de proteínas BRAF, tipo natural y variantes mutadas. La cuantificación de la forma o formas mutadas de BRAF y BRAF no mutado (tipo natural) se determina dentro de esta metodología, proporcionando de ese modo una lectura cuantitativa de las formas de proteína BRAF.

La espectrometría de masas es una técnica analítica valiosa porque mide una propiedad intrínseca de cualquier molécula determinada, su masa, con una sensibilidad muy alta. Por lo tanto, la MS puede usarse para medir una amplia gama de tipos de moléculas y una amplia variedad de tipos de muestras/materiales biológicos. En este proceso de ionización, el ion precursor se activa por aceleración en una trampa iónica lineal selectiva de masa en condiciones por las que algunos de los iones de fragmento formados son inestables dentro de la trampa. Después de un retraso, los parámetros de estabilidad de la trampa iónica se cambian para permitir la captura de fragmentos que previamente eran inestables. El resultado es un espectro iónico de producto que se origina a partir de iones precursores con una distribución de energía interna modificada. Es posible seguir la evolución de la distribución de energía interna del precursor durante muchos milisegundos después de la admisión de los iones precursores en la trampa iónica lineal. Los espectros iónicos de productos de fragmentación retardada en el tiempo generalmente muestran productos de fragmentación secuencial reducidos conduciendo a espectros que se interpretan más fácilmente. Se han identificado varios parámetros experimentales importantes para fragmentación retardada y la técnica tiene aplicaciones tanto para iones precursores pequeños como para moléculas con carga múltiple.

La espectrometría de masas en tándem (MS/MS) está en el centro de la mayoría de las investigaciones modernas de espectrometría de masas de mezclas complejas. La fragmentación implica la activación de un ion precursor mediante colisiones con un gas objetivo y puede producir fragmentos cargados y neutros. La naturaleza de los iones de fragmento, así como sus intensidades, a menudo son indicativas de la estructura del ion precursor y, por lo tanto, puede proporcionar información útil para la identificación de analitos desconocidos, además de proporcionar una técnica de detección útil para diferentes clases de analitos. La activación mediante múltiples colisiones prolonga el tiempo de activación y permite que se depositen energías más altas en iones precursores. Las presiones de gas de colisión más altas también implican tasas de relajación de colisión más altas.

La ionización por electronebulización (ESI) es la técnica de ionización usada más comúnmente en espectrometría de masas que se ha convertido en una técnica cada vez más importante en el laboratorio clínico para la medición cuantitativa de biomarcadores en una muestra biológica compleja. La ESI-MS tradicional es un proceso de varias etapas, donde los analitos se introducen primero en la fuente de ionización del espectrómetro de masas, donde los analitos se ionizan primero para adquirir cargas positivas o negativas. A continuación, los iones cargados se desplazan a través del analizador de masas y los iones se clasifican y separan de acuerdo con su relación masa/carga (valor m/z). A continuación los iones separados pasan al sistema detector para medir sus concentraciones, y los resultados se muestran en un gráfico llamado espectro de masas mediante un sistema informático.

Cuando ESI-MS se combina con cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para fraccionamiento de analitos antes del análisis espectrométrico de masas, HPLC/ESI-MS se convierte en una técnica muy poderosa para analizar muestras biológicas complejas. El instrumento registrará la distribución espacial de especies moleculares tales como compuestos farmacológicos y moléculas farmacológicas de metabolito. A partir de ese momento, puede usarse un software de procesamiento de imágenes adecuado para importar datos del espectrómetro de masas para permitir la visualización y comparación con la imagen óptica de la muestra.

En la presente invención, se fracciona previamente una muestra, tumores recién congelados digeridos, tumores fijados en formalina y embebidos en parafina, así como biofluidos (es decir, fluidos corporales), usando HPLC con un gradiente de pH alto, o separación cromatográfica electrostática, seguida de una segunda dimensión de nano-HPLC interconectada a MS/MS en el ensayo de SRM. Un ensayo cuantitativo de los péptidos de BRAF revela el estado de BRAF de los tumores a nivel proteico, y se obtiene una proporción entre las proteínas BRAF de tipo natural y mutadas. La proporción de BRAF entre el tipo natural y mutaciones tendrá un impacto crítico en la respuesta al tratamiento del melanoma maligno con inhibidores de quinasa. Dependiendo de la proporción, esto servirá como una herramienta predictiva de quién se beneficiará y responderá al tratamiento.

La tripsina, serina proteasa, se emplea más comúnmente para digestión proteica, ya que genera péptidos que son altamente susceptibles de análisis de MS(/MS). La proteína se corta enzimáticamente en un número limitado de fragmentos más cortos durante la digestión y estos fragmentos se denominan péptidos y permiten la identificación de la proteína con su masa y patrón característicos. Sin embargo, estudios adicionales encontraron que la proporción obtenida no imitaba la proporción real entre péptidos V600 WT y BRAF V600 mutados en la célula. De hecho, otras proteínas encontradas en las células tumorales generaron fragmentos con la misma secuencia que los fragmentos obtenidos del tipo natural de BRAF usando tripsina para digestión, dando como resultado una proporción de BRAF WT y V600 mutado que no es correcta, lo que podría conducir a decisiones de tratamiento incorrectas. La enzima de uso común, tripsina, no genera un péptido único para la forma de tipo natural de BRAF. Por ejemplo, la secuencia generada, IGDFGLATVK (SEQ ID NO: 11) también se encuentra en otras dos proteínas ARAF (Swizz prot. P10398) y RAF1 (Swizz prot. P04049). La secuencia de referencia de la proteína BRAF se encuentra en Swizz prot. P15056.

En la invención se encontró que usar una serina proteinasa que escinde con alta especificidad en el extremo C-terminal de los ácidos glutámico y aspártico, aquí la serina proteinasa Glu-C, generaba péptidos únicos tanto para el tipo natural como para las variantes mutadas de BRAF. La endoproteinasa GluC escinde selectivamente enlaces peptídicos C-terminales a restos de ácido glutámico. La endoproteinasa GluC también escinde a restos de ácido aspártico, pero a una tasa 100-300 veces más lenta que en los restos de ácido glutámico y, por lo tanto, se denomina endoproteasa específica de ácido glutámico.

En una realización de la invención, un método para determinar la proporción molar entre proteína BRAF de tipo natural (WT) y variantes proteicas de la misma en una muestra biológica, en donde las variantes de proteína BRAF son variantes mutadas en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 600 en BRAF WT, estando ocupada dicha posición por valina en BRAF WT, que comprende las etapas de: (a) digerir dicha muestra usando una serina proteinasa que escinde específicamente enlaces peptídicos C-terminales a restos de ácido glutámico o enlaces peptídicos C-terminales a restos de ácido glutámico o aspártico. Esto para obtener una composición que comprende un fragmento peptídico resultante de la digestión de los péptidos por la proteinasa, en donde la masa de dicho fragmento difiere entre dicha proteína B-raf de tipo natural (WT) y una variante de proteína BRAF. A partir de ese momento (b) evaluar cuantitativamente la cantidad molar de un fragmento peptídico resultante de la digestión de proteína B-raf de tipo natural (WT)y la cantidad molar del fragmento peptídico resultante de la digestión de variantes de la proteína B-raf de tipo natural (WT) usando una técnica de espectrometría de masas. (c) Basándose en la evaluación cuantitativa calcular la al menos una proporción específica entre dicha proteína BRAF WT y una variante de la misma.

En una realización, las variantes de proteína BRAF son BRAF V600E, V600D, V600 R y/o V600K.

En una realización, la serina proteinasa es glutamil endopeptidasa (Glu-C), tal como serina endoproteinasa Glu-C (EC 3.4.21.19), tal como serina endoproteinasa Glu-C perteneciente a la familia SIB de peptidasas, tal como una GluC de Staphylococcus aureus, tal como GluC de V8 de Staphylococcus aureus, tal como GluC de calidad para secuenciación de V8 de Staphylococcus aureus (Promega, Madison, WI). La endoproteinasa Glu-C de la cepa V8 de Staphylococcus aureus tiene una masa molecular promedio de 29,02 kDa.

Se encontró que es necesario controlar el microentorno y la especificidad catalítica y se determinan por las condiciones del tampón del ensayo. La especificidad de la serina proteinasa específica de ácido glutámico depende del tampón y del pH empleados, así como de la estructura alrededor del sitio de escisión potencial. En acetato de amonio (pH ~4) o bicarbonato de amonio (pH ~8), la serina proteinasa GluC escinde preferentemente enlaces glutamilo. Se descubrió usando bicarbonato de amonio se generan péptidos únicos para BRAF, que posteriormente dan como resultado fragmentos únicos de MS/MS dentro del ensayo:

SEQ ID NO: 1: DLTVKIGDFGLATVKSRWSGSHQFE (WT),

SEQ ID NO: 2: DLTVKIGDFGLATE (V600E),

SEQ ID NO: 3: DLTVKIGDFGLATKKSRWSGSHQFE (V600K),

SEQ ID NO: 4: DLTVKIGDFGLATRKSRWSGSHQFE (V600R) y

SEQ ID NO: 5: DLTVKIGDFGLATDKSRWSGSHQFE (V600D).

Igualmente, también se encontró que usando tampón fosfato (pH ~8) la serina proteinasa GluC escindirá específicamente enlaces tanto glutamilo como aspartilo, por lo tanto pudieron generarse péptidos más pequeños que estaban mutados; de acuerdo con las siguientes secuencias de proteína BRAF

SEQ ID NO: 6: FGLATE (V600E),

SEQ ID NO: 7: GLATD (V600D),

además de secuencias peptídicas de BRAF específicas en cierto modo más largas;

SEQ ID NO: 8: FGLATVKSRWSGSHQFE (WT),

SEQ ID NO: 9: FGLATKKSRWSGSHQFE (V600K), y

SEQ ID NO: 10: FGLATRKSRWSGSHQFE (V600R).

En una realización, la etapa de digestión comprende tratar dicha muestra con acetato de amonio, bicarbonato de amonio y/o un tampón fosfato.

En una realización, la etapa de digestión comprende tratar dicha muestra con acetato de amonio a un pH (a 25 °C) entre 3,6 y 5,6, tal como de 3,8 a 4,6, tal como aproximadamente 4.

En una realización, la etapa de digestión comprende tratar dicha muestra con bicarbonato de amonio a un pH (a 25 °C) entre 8,0 y 11,3, tal como de 8,2 a 9,5, tal como aproximadamente 8,5.

En una realización, la etapa de digestión comprende tratar dicha muestra con un tampón fosfato a un pH (a 25 °C) entre 5,7 y 8, tal como de 7,0 a 8,0, tal como aproximadamente 7,6.

En una realización, el fragmento polipeptídico resultante de la digestión de proteína B-raf de tipo natural (WT) usado en la etapa de evaluación cuantitativa es un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 8.

En una realización, el fragmento polipeptídico resultante de la digestión de variantes proteicas de la proteína BRAF de tipo natural (WT) usado en la etapa de evaluación cuantitativa es un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 y/o SEQ ID NO: 10.

En una realización, el fragmento polipeptídico resultante de la digestión de la variante de proteína BRAF V600E de la proteína BRAF de tipo natural (WT) usado en la etapa de evaluación cuantitativa es un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 2 y/o SEQ ID NO: 6.

En una realización, el fragmento polipeptídico resultante de la digestión de la variante de proteína BRAF V600K de la proteína BRAF de tipo natural (WT) usado en la etapa de evaluación cuantitativa es un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 9.

En una realización, el fragmento polipeptídico resultante de la digestión de la variante de proteína BRAF V600R de la proteína BRAF de tipo natural (WT) usado en la etapa de evaluación cuantitativa es un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 4 y/o SEQ ID NO: 10.

En una realización, el fragmento polipeptídico resultante de la digestión de la variante de proteína BRAF V600D de la proteína BRAF de tipo natural (WT) usado en la etapa de evaluación cuantitativa es un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 5 y/o SEQ ID NO: 7.

Por lo tanto, se proporcionan péptidos específicos derivados de la secuencia de BRAF que alberga WT (V600) y las mutaciones (V600E, V600D, V600R y V600K). Las secuencias peptídicas y los iones de fragmentación para cada péptido se usan en un ensayo de monitorización de reacción seleccionada (SRM) usando espectrometría de masas-cromatografía líquida (LC-MS/MS). En una realización, la técnica de espectrometría de masas es HPLC/ESI-MS.

Dado que las proteasas no siempre dan lugar a un 100 % de escisiones completas de una proteína, tal escisión alternativa durante la digestión puede dar como resultado otros posibles fragmentos peptídicos. Sin embargo, usando métodos de espectrometría de masas para análisis, esto puede tenerse en cuenta, ya que los péptidos resultantes de la escisión alternativa son todavía únicos y, por lo tanto, permiten la detección y cuantificación de WT y/o las variantes mutadas de los mismos. Se observará que algunos de los péptidos alternativos se encuentran más frecuentemente que otras variantes. Se encontró que la escisión alternativa daba como resultado principalmente los siguientes fragmentos:

SEQ ID NO: 11: LTVKIGDFGLATVKSRWSGSHQFE (WT)

SEQ ID NO: 12 DFGLATVKSRWSGSHQFE (WT)

SEQ ID NO: 13 DLTVKIGDFGLATEKSRWSGSHQFE (V600E)

SEQ ID NO: 14 DFGLATEKSRWSGSHQFE (V600E)

SEQ ID NO: 15 FGLATEKSRWSGSHQFE (V600E)

SEQ ID NO: 16 LTVKIGDFGLATEKSRWSGSHQFE (V600E)

SEQ ID NO: 17 DLTVKIGDFGLATEKSRWSGSHQFE (V600E)

SEQ ID NO: 18 LTVKIGDFGLATEKSRWSGSHQFE (V600E)

SEQ ID NO: 19 DFGLATEKSRWSGSHQFE (V600E)

SEQ ID NO: 20: FGLATEKSRWSGSHQFE (V600E)

SEQ ID NO: 21 LTVKIGDFGLATE (V600E)

SEQ ID NO: 22: DFGLATE (V600E)

SEQ ID NO: 23: DFGLATKKSRWSGSHQFE (V600K)

SEQ ID NO: 24: FGLATKKSRWSGSHQFE (V600K)

SEQ ID NO: 25: LTVKIGDFGLATKKSRWSGSHQFE (V600K)

SEQ ID NO: 26: DLTVKIGDFGLATKSRWSGSHQFE (V600K)

SEQ ID NO: 27: LTVKIGDFGLATKKSRWSGSHQFE (V600K)

SEQ ID NO: 28: DFGLATKKSRWSGSHQFE (V600K)

SEQ ID NO: 29: DFGLATRKSRWSGSHQFE (V600R)

SEQ ID NO: 30: FGLATRKSRWSGSHQFE (V600R)

SEQ ID NO: 31 LTVKIGDFGLATRKSRWSGSHQFE (V600R)

SEQ ID NO: 32: DLTVKIGDFGLATRKSRWSGSHQFE (V600R)

SEQ ID NO: 33: LTVKIGDFGLATRKSRWSGSHQFE (V600R)

SEQ ID NO: 34: DFGLATRKSRWSGSHQFE (V600R)

SEQ ID NO: 35: DFGLATDKSRWSGSHQFE (V600D)

SEQ ID NO: 36: FGLATDKSRWSGSHQFE (V600D)

SEQ ID NO: 37: LTVKIGDFGLATDKSRWSGSHQFE (V600D)

SEQ ID NO: 38: DLTVKIGDFGLATDKSRWSGSHQFE (V600D)

SEQ ID NO: 39: LTVKIGDFGLATDKSRWSGSHQFE (V600D)

SEQ ID NO: 40: DFGLATDKSRWSGSHQFE (V600D)

SEQ ID NO: 41 FGLATDKSRWSGSHQFE (V600D)

SEQ ID NO: 42: DLTVKIGDFGLATD (V600D)

SEQ ID NO: 43: LTVKIGDFGLATD (V600D)

SEQ ID NO: 44: DFGLATD (V600D)

SEQ ID NO: 45: FGLATD (V600D)

Además en una divulgación, un fragmento polipeptídico resultante de escisión alternativa durante la digestión de la proteína B-raf de tipo natural (WT) se usa en la etapa de evaluación cuantitativa. El fragmento polipeptídico resultante de tal escisión alternativa durante la digestión de la proteína B-raf de tipo natural (WT) puede ser un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 11 y/o SEQ ID NO: 12.

Además en una divulgación, un fragmento polipeptídico resultante de escisión alternativa durante la digestión de variantes proteicas de la proteína B-raf de tipo natural (WT) se usa en la etapa de evaluación cuantitativa. El fragmento polipeptídico resultante de tal escisión alternativa durante la digestión de variantes proteicas de la proteína B-raf de tipo natural (WT) puede ser un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, y/o SEQ ID NO: 45.

Además en una divulgación, un fragmento polipeptídico resultante de escisión alternativa durante la digestión de la variante proteica V600E de la proteína B-raf de tipo natural (WT) se usa en la etapa de evaluación cuantitativa. El fragmento polipeptídico resultante de tal escisión alternativa durante la digestión de la variante proteica V600E de la proteína B-raf de tipo natural (WT) puede ser un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y/o SEQ ID NO: 22.

Además en una divulgación, un fragmento polipeptídico resultante de escisión alternativa durante la digestión de la variante proteica V600K de la proteína B-raf de tipo natural (WT) se usa en la etapa de evaluación cuantitativa. El fragmento polipeptídico resultante de tal escisión alternativa durante la digestión de la variante proteica V600K de la proteína B-raf de tipo natural (WT) puede ser un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 y/o SEQ ID NO: 28.

Además en una divulgación, un fragmento polipeptídico resultante de escisión alternativa durante la digestión de la variante proteica V600R de la proteína B-raf de tipo natural (WT) se usa en la etapa de evaluación cuantitativa. El fragmento polipeptídico resultante de tal escisión alternativa durante la digestión de la variante proteica V600R de la proteína B-raf de tipo natural (WT) puede ser un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 y/o SEQ ID NO: 34.

Además en una divulgación, un fragmento polipeptídico resultante de escisión alternativa durante la digestión de la variante proteica V600D de la proteína B-raf de tipo natural (WT) se usa en la etapa de evaluación cuantitativa. El fragmento polipeptídico resultante de tal escisión alternativa durante la digestión de la variante proteica V600D de la proteína B-raf de tipo natural (WT) puede ser un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 y/o SEQ ID NO: 45.

En una realización, dicha proporción está entre una sola BRAF de tipo natural y una sola variante de proteína BRAF. En una realización alternativa, dicha proporción es entre una sola BRAF de tipo natural y al menos dos variantes de proteína BRAF, tal como dos, tres, cuatro o cinco variantes de proteína BRAF.

Sin embargo, usando el método proporcionado, pueden obtenerse más péptidos. El análisis cuantitativo de los péptidos de la proteína BRAF se describe a continuación en material y métodos. Este ensayo de SRM puede usarse para cuantificar niveles relativos o absolutos de la proteína WT o péptidos mutados de proteína BRAF en una preparación de proteína obtenida de muestras biológicas, tal como tumores recién congelados digeridos, tumores fijados en formalina y embebidos en parafina, así como biofluidos (es decir, fluidos corporales). El tejido tumoral puede ser de un melanoma maligno, un cáncer de tiroides, un cáncer colorrectal, un cáncer de pulmón, un glioma de bajo grado, o un tumor canceroso de ovario. Los biofluidos pueden ser plasma sanguíneo (EDTA, citrato, heparina), suero, sangre completa, capa leucocitaria, plaquetas, orina y saliva.

Por lo tanto, en una realización de la invención, la muestra es una muestra de tejido tumoral o un fluido corporal. Además en una realización, la muestra es un tejido tumoral, siendo el tejido tumoral preferentemente tejido de un melanoma maligno, un cáncer de tiroides, un cáncer colorrectal, un cáncer de pulmón, un glioma de bajo grado, o un tumor canceroso de ovario. Además en una realización, la muestra es un fluido corporal, siendo el fluido corporal preferentemente plasma sanguíneo (EDTA, citrato, heparina), suero, sangre completa, capa leucocitaria y plaquetas.

Los péptidos actuales también pueden usarse como base para generación y producción de una nueva colección de anticuerpos que proporcionará nuevos anticuerpos para BRAF y sus formas proteicas mutadas, para mejorar la sensibilidad y la especificidad.

Los resultados del ensayo de SRM pueden usarse para niveles cuantitativos precisos de las variantes mutadas y WT de la proteína BRAF en muestras biológicas (por ejemplo, tejido canceroso) y el grado de heterogeneidad, WT con respecto a mutado, dentro de la muestra biológica. La información sobre la heterogeneidad de los péptidos de BRAF dentro de las muestras biológicas puede permitir que un médico u otro profesional médico determinen con mayor precisión la terapia apropiada para el paciente. Un ensayo de SRM de este tipo puede predecir qué paciente es más probable que responda a los inhibidores de quinasa. Los inhibidores de quinasa, tal como Vemurafenib, se desarrollan para que actúen y se unan específicamente a la posición de aminoácido 600, donde las propiedades de unión se optimizan para la posición 600 mutada, y no para el tipo natural. Un ejemplo de esto son las mutaciones de BRAF en la posición del aminoácido 600, ilustradas en la figura 4.

En una realización de la invención, la técnica de espectrometría de masas es una técnica de cromatografía líquida interconectada a espectrometría de masas. Además en una realización, la técnica de cromatografía líquida de masas interconectada a espectrometría de masas es HPLC/ESI-MS.

En una realización, la susceptibilidad de un sujeto a un tratamiento farmacológico dado para una enfermedad relacionada con BRAF se estima mediante las etapas de; proporcionar una muestra de un sujeto que padece una enfermedad relacionada con BRAF. La proporción molar específica entre proteína BRAF WT y variantes de la misma se determina. La proporción molar específica entre proteína BRAF WT y variantes de la misma se compara con un valor de referencia de la proporción molar específica entre proteína BRAF WT y una variante de la misma determinado a partir de una multitud de muestras de sujetos que se sabe que padecen dicha enfermedad relacionada con BRAF y que son susceptibles a dicho tratamiento farmacológico dado. Basándose en dicha comparación determinar la susceptibilidad del sujeto a un tratamiento farmacológico dado, en donde una proporción definida por proteína BRAF WT con respecto a dicha al menos una variante de proteína BRAF en dicha muestra por encima del valor de referencia de la proporción definida por proteína BRAF WT con respecto a dicha al menos una variante de proteína BRAF es indicativa de mayor susceptibilidad a un tratamiento farmacológico dado. El valor de referencia es una proporción molar específica entre proteína BRAF WT y dicha al menos una variante de proteína BRAF determinado a partir de una multitud de muestras de sujetos que se sabe que padecen dicha enfermedad relacionada con BRAF y que son susceptibles a dicho tratamiento farmacológico dado. La enfermedad relacionada con BRAF es un cáncer con mutaciones de BRAF en la posición de aminoácido 600, y el tratamiento farmacológico es un tratamiento que usa un inhibidor de quinasa, tal como Vemurafenib o Sorafenib.

El diagnóstico después del tratamiento también es una necesidad muy insatisfecha para los pacientes con melanoma, donde las metodologías que determinan el estado de mutación, así como el resultado de la proporción de WT al nivel proteico, son un ensayo de lectura del paciente que puede proporcionar eficacia del estado del paciente. Esto puede ser importante en casos donde el paciente ha albergado un tumor que comprende células con perfiles de mutación heterogéneos, donde el tratamiento solo se dirige específicamente a una parte de las células tumorales, dando como resultado una reducción general del tumor, pero dejando un tumor más pequeño que no responde al tratamiento farmacológico.

Por lo tanto, en una realización, la susceptibilidad de un sujeto a un tratamiento farmacológico dado se monitoriza antes y después del tratamiento, en donde se determina un cambio en la proporción molar específica entre proteína BRAF WT y variantes de la misma, lo que indica un estado de mutación cambiado del tejido tumoral. Por lo tanto, un cambio en la proporción molar específica puede indicar que el tratamiento ha erradicado satisfactoriamente células tumorales susceptibles a un tratamiento dado; sin embargo, puede ser necesario un tratamiento de seguimiento para erradicar otras células tumorales restantes. Por lo tanto, el método de la invención puede usarse tanto para explorar la susceptibilidad de tratamiento de BRAF para las células tumorales iniciales como para las células tumorales restantes después del tratamiento.

Este método también se refiere a la determinación de la proporción donde podrían estar presentes otras mutaciones en el tejido tumoral, excepto la mutación en 600 de V a E de BRAF, con respecto a BRAF WT. Como tal, una lectura de ensayo que se refiere a la proporción medida dentro de este método e innovación también se refiere a los pacientes homocigotos con BRAF WT frente a mutado, así como a los pacientes heterocigotos con BRAF WT frente a mutado. Actualmente, se está usando diagnóstico con ensayos moleculares para aquellos inhibidores selectivos de la mutación V a E-BRAF, en la detección de V a E-BRAF en ADN aislado de material de paciente. En la actualidad, esta es una práctica clínica estándar, donde generalmente se aísla del paciente un material de biopsia que se fija en formalina y se embebe en parafina. Este ensayo es específico para este entorno y está aprobado por la FDA. La cigosidad dentro de estos ensayos de la mutación V a E-BRAF no se evalúa de forma rutinaria. Por lo tanto, en una divulgación más, la proporción molar específica entre proteína BRAF WT y variantes de la misma también se refiere a los pacientes homocigotos con BRAF WT frente a mutado así como a los pacientes heterocigotos con BRAF WT frente a mutado.

Se ha mostrado que vemurafenib podría potenciar la inducción de moléculas de MHC mediante los IFN en células de melanoma que albergan una mutación de BRAF V600E homocigoto, pero no BRAF heterocigoto o de tipo natural. Las moléculas de MHC son fundamentales para la interacción entre células tumorales y linfocitos y la expresión mejorada de MHC por vemurafenib podría promover el reconocimiento inmunitario de células tumorales. Este efecto de vemurafenib en la expresión de genes relevantes para el sistema inmunitario podría depender de la cigosidad de BRAF V600E, que no se establece de forma rutinaria en pacientes con melanoma.

(Sapkota B, Hill CE, Pollack BP. Vemurafenib enhances MHC induction in BRAF(V600E) homozygous melanoma cells. Oncoimmunology. 2013;2:e22890). El porcentaje de mutaciones de V a E-BRAF homocigotas en el melanoma no está claro, pero ocurre frecuentemente a nivel genético. Se sabe que aproximadamente un 50 % de pacientes con melanoma que albergan la mutación V a E-BRAF, según la evaluación de un procedimiento de secuenciación convencional, son homocigotos (Rubinstein JC, Sznol M, Pavlick AC, Ariyan S, Cheng E, Bacchiocchi A, et al. Incidence of the V600K mutation among melanoma patients with BRAF mutations, and potential therapeutic response to the specific BRAF inhibitor PLX4032. J T ransl Med. 2010; 8:67). Además, la cigosidad de V a E-BRa F puede cambiar con el tiempo de heterocigoto a homocigoto, esto se mostró en metástasis de melanoma metacrónico de diferentes localizaciones anatómicas. Parecía que el estado mutacional permanecía sin cambios en las metástasis posteriores del melanoma, una vez que el melanoma había alcanzado la etapa metastásica. Parecía que V a E-BRAF era estable en un suceso mutacional precoz (presente también en nevus benignos) (Sigalotti L, Fratta E, Parisi G, Coral S, Maio M. Stability of BRAF V600E mutation in metastatic melanoma: new insights for therapeutic success? Br J Cancer.

2011; 105:327-8).

Por lo tanto, en un aspecto de la divulgación, un aumento con el tiempo de una variante de proteína BRAF en la proporción molar específica de un sujeto entre proteína BRAF WT y variantes de la misma, puede indicar un cambio en, o acumulación de, mutaciones heterocigotas y homocigotas, una base para la predisposición a enfermedad.

Usando el método de la invención descrito, un médico podrá tomar una decisión de tratamiento mejor para el tratamiento dirigido a un individuo que padece una enfermedad relacionada con BRAF. Por lo tanto, en un ejemplo (no incluido en las reivindicaciones), un método de tratamiento para un sujeto con una enfermedad relacionada con BRAF, comprende las etapas de proporcionar una muestra de un sujeto que padece una enfermedad relacionada con BRAF. La proporción molar específica entre proteína BRAF WT y variantes de la misma se determina. La proporción molar específica entre proteína BRAF WT y variantes de la misma se compara con un valor de referencia de la proporción molar específica entre proteína BRAF WT y una variante de la misma determinado a partir de una multitud de muestras de sujetos que se sabe que padecen dicha enfermedad relacionada con BRAF y que son susceptibles a dicho tratamiento farmacológico dado. Basándose en dicha comparación determinar la susceptibilidad del sujeto a un tratamiento farmacológico dado, en donde una proporción definida por proteína BRAF WT con respecto a dicha al menos una variante de proteína BRAF en dicha muestra por encima del valor de referencia de la proporción definida por proteína BRAF WT con respecto a dicha al menos una variante de proteína BRAF es indicativa de mayor susceptibilidad a un tratamiento farmacológico dado. Si se encuentra susceptibilidad del paciente a un tratamiento farmacológico dado, administrar el fármaco de dicho tratamiento farmacológico a una dosis diaria definida (DDD) o prescrita. Para vemurafenib, tal dosis prescrita puede ser de 500 a 2000 mg, tal como 960 mg por vía oral dos veces al día. En el caso de Dabrafenib, la dosis prescrita puede ser de 50 a 300, tal como 150 mg dos veces al día. Para sorafenib, tal dosis prescrita puede ser de 200 a 800, tal como 400 mg dos veces al día. La duración del tratamiento suele ser hasta que se alcanza la eficacia o se produce una toxicidad inaceptable. Si no se encuentra susceptibilidad del paciente a un tratamiento farmacológico dado, esto indica que deben utilizarse otros tratamientos en su lugar, tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia y otros tratamientos beneficiosos para dicha enfermedad relacionada con BRAF.

En un aspecto alternativo desvelado, se determina una proporción molar específica entre una proteína BRAF WT y al menos dos variantes proteicas de la misma. La proporción molar específica entre dicha proteína BRAF WT y dichas al menos dos variantes de la misma se compara con un valor de referencia de la proporción molar específica entre una proteína BRAF WT y al menos dos variantes de la misma determinado a partir de una multitud de muestras de sujetos que se sabe que padecen dicha enfermedad relacionada con BRAF y que son susceptibles a dicho tratamiento farmacológico dado. Basándose en dicha comparación determinar la susceptibilidad del sujeto a un tratamiento farmacológico dado, en donde una proporción de BRAF WT con respecto a dichas al menos dos variantes de proteína BRAF en dicha muestra por encima del valor de referencia de la proporción de BRAF WT con respecto a dichas al menos dos variantes de proteína BRAF el valor de referencia es indicativa de mayor susceptibilidad a un tratamiento farmacológico dado.

Si se encuentra susceptibilidad del paciente a un tratamiento farmacológico dado, la administración de dicho fármaco puede ser en forma de tratamiento de combinación. Tal tratamiento de combinación puede comprender una terapia de combinación, tal como dabrafenib en combinación con trametinib. Tal tratamiento de combinación también puede ser la administración del fármaco al que el paciente presenta susceptibilidad en combinación con otros tratamientos, tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia e inmunoterapia. Por lo tanto, el tratamiento se presenta en forma de tratamiento de combinación. Además en una realización, tal tratamiento de combinación se presenta en forma de terapia de combinación usando dos fármacos, o en forma de terapia de combinación de un fármaco y otra forma de tratamiento, tal como cirugía, radioterapia, quimioterapia e inmunoterapia.

Una proporción molar específica entre proteína BRAF WT y variantes proteicas de la misma, tal como se define en las reivindicaciones, también puede clasificarse como baja, media y alta, en donde baja incluye una proporción >10:1, media de 10:1 a 1:10 y alta 1:>10. Por lo tanto, en una realización, una proporción molar específica entre proteína BRAF WT y variantes proteicas de la misma se clasifica como baja, media y alta, en donde baja incluye una proporción >10:1, media de 10:1 a 1:10 y alta de 1:>10.

En casos donde una variante de BRAF tumoral domina significativamente, se espera que el tratamiento sea más eficaz. En casos donde el tumor de tipo natural de BRAF domina significativamente, se espera que el tratamiento sea menos eficaz. En un aspecto desvelado, un método de tratamiento para un sujeto con una enfermedad relacionada con BRAF, comprende las etapas de proporcionar una muestra de un sujeto que padece una enfermedad relacionada con BRAF. La proporción molar específica entre proteína BRAF WT y variantes de la misma se determina. En un caso, una proporción baja (>10:1) de BRAF WT con respecto a dicha al menos una variante de proteína BRAF en dicha muestra es indicativa de baja susceptibilidad a un tratamiento farmacológico dado. En un caso, una proporción media (10:1 a 1:10) de BRAF WT con respecto a dicha al menos una variante de proteína BRAF en dicha muestra es indicativa de una susceptibilidad al menos parcial a un tratamiento farmacológico dado. También puede ser indicativa de un tumor heterogéneo que alberga poblaciones de células tanto con BRAF WT como sin BRAf WT. En un caso, una proporción alta (1:>10) de BRAF WT con respecto a dicha al menos una variante de proteína BRAF en dicha muestra es indicativa de una alta susceptibilidad a un tratamiento farmacológico dado. Si el paciente es susceptible a un tratamiento farmacológico dado, administrar el fármaco de dicho tratamiento farmacológico a una dosis diaria definida (DDD) o prescrita.

Materiales y métodos

Los siguientes ejemplos son más ejemplos de la invención. Más bien, la invención está limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Preparación de muestra de tejido humano

Se cortaron muestras de tejido congelado de tumor en secciones de 10 x 10 |jm de grosor usando un criostato, realizado a -20 °C. Las secciones se sometieron a lisis en 200 j l de bicarbonato de amonio 50 mM y urea 6 M. Los tejidos tumorales embebidos en parafina fijados con formalina se seccionaron usando un micrótomo o se retiraron los núcleos de los bloques embebidos en parafina. La sección o los núcleos se desparafinaron usando solución de recuperación de diana EnVision TM FLEx (pH alto) (Dako, Glostrup, Dinamarca y se calentaron durante 10 min a 98 °C. Las muestras se centrifugaron durante 10 min, 14.000 x g a 4 °C). La parafina que flotaba en la superficie se retiró y la solución de recuperación se aspiró. Esta etapa se repitió una vez. A las muestras se les añadieron 300 j l de cloruro de guanidina 6 M en bicarbonato de amonio 50 mM. Las muestras se sometieron a ultrasonidos con un aparato de ultrasonidos Branson Sonifier 250 (salida 4, ciclo de trabajo de un 10 %) durante 2 minutos seguido de centrifugación a 10.000 g durante 5 minutos.

La cantidad de proteína en las muestras se determinó mediante el método BCA (Pierce, Rockford, IL). Se redujo una cantidad fija (150 jg ) de proteína con DTT 10 mM (1 h a 37 °C) y se alquiló usando yodoacetamida 40 mM (30 min, mantenido en oscuridad a temperatura ambiente) seguido de intercambio de tampón por tampón bicarbonato de amonio 50 mM. (pH 7,6). A continuación, las muestras se digirieron durante la noche a 37 °C con GluC de calidad para secuenciación (Promega, Madison, WI) en una proporción 1:20 p/p (enzima:proteína). La digestión se detuvo añadiendo 30 j l de ácido fórmico al 1 %. Las muestras se secaron usando un evaporador centrífugo y se resuspendieron en 150 j l de ácido fórmico al 1 % y se centrifugaron durante 5 min a 10.000 g. Los sobrenadantes se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior.

Péptidos

Read Glead Discovery AB (Lund, Suecia) suministró los péptidos con una pureza de más de un 95 %.

Generación de listado de transiciones

Los listados de transición se crearon en el software Skyline v3.1.0 (MacCoss Lab Software, Seattle, WA). Principalmente, se seleccionó un gran número de transiciones, todas las posibles series de ion y que coinciden con los criterios (de m/z > precursor-2 hasta el último ion-2, ventana de exclusión de m/z de precursor: 20 Th), para cada péptido en los estados de carga 2+, 3+ y 4+.

Desarrollo del ensayo de SRM utilizando MS de triple cuadrupolo TSQ Vantage

La mezcla peptídica se analizó mediante nano LC-MS/MS usando un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo TSQ Vantage (Thermo Scientific, Waltham, MA). El TSQ estaba equipado con una bomba Easy n-LC II (Thermo Scientific, Waltham, MA). Las muestras se inyectaron en una precolumna Acclaim PepMap100 C8 (5 x 0,3 mm, 5 jm ) (Thermo Scientific, Waltham, MA) y, tras desalinización y concentración en línea, los péptidos se separaron en un Acclaim PepMap100 C8 (150 jm x 0,075 mm, 3 jm ) (Thermo Scientific, Waltham, MA). Las separaciones se realizaron en un gradiente lineal de 35 min desde un 10 a un 35 % de acetonitrilo que contenía ácido fórmico al 0,1 %; a un caudal de 300 nl/min. El análisis de MS se realizó en modo ion positivo con el voltaje de nebulización y el potencial de desagrupamiento estableciéndose en 1750 V y 0, respectivamente. La temperatura del capilar de transferencia se estableció en 270 °C y la amplitud de la lente S fue 143. Las transiciones de SRM se adquirieron en Q1 y Q3 operados a resolución unitaria (0,7 FWHM), la presión del gas de colisión en Q2 se estableció en 1,2 mTorr. El tiempo de ciclo fue de 3,0 s. Las transiciones por precursor se seleccionaron mediante inspección manual de los datos en Skyline y se crearon listados de transición programados para los ensayos finales. Las transiciones seleccionadas se sometieron a ensayo en matriz real añadiendo las mezclas peptídicas en digestiones de tejido MM humano.

Desarrollo del ensayo de SRM utilizando MS QExactive

La mezcla peptídica se analizó mediante nano LC-MS/MS usando un espectrómetro de masas QExactive (Thermo Scientific, Waltham, MA). El QExactive estaba equipado con una bomba Easy n-LC 1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA). Las muestras se inyectaron en una precolumna Acclaim PepMap100 C8 (5 x 0,3 mm, 5 jm ) (Thermo Scientific, Waltham, MA), y, tras desalinización y concentración en línea, los péptidos se separaron en un Acclaim PepMap100 C8 (150 jm x 0,075 mm, 3 jm ) (Thermo Scientific, Waltham, MA). Las separaciones se realizaron en un gradiente lineal de 60 min de un 5 a un 40 % de acetonitrilo que contenía ácido fórmico al 0,1 %; a un caudal de 300 nl/min. Se adquirieron barridos completos de MS en el analizador de masas Orbitrap en un intervalo de m/z 400-1600 con resolución 70.000 (a m/z 200). El valor objetivo fue 1,00E+06. En el método un listado de inclusión para los péptidos de BRAF y los 15 picos más intensos con estado de carga > 2 se fragmentaron en la celda de colisión HCD con una energía de colisión normalizada de un 30 %, y los espectros de masas en tándem se adquirieron en el analizador de masas Orbitrap con resolución 17.500 a m/z 200. El valor objetivo fue 1,00E+05. El umbral de selección iónico fue 3,30E+05 cuentas, y los tiempos máximos de acumulación iónica permitida fueron 100 ms para barridos completos de MS y 60 ms para espectros de masas en tándem. Las transiciones por precursor se seleccionaron mediante inspección manual de los datos en Skyline y se crearon listados de transiciones programadas para los ensayos finales. Las transiciones seleccionadas se sometieron a ensayo en matriz real añadiendo las mezclas peptídicas en digestiones de tejido MM humano.

Resultados

Por lo tanto, se encontraron 10 fragmentos peptídicos únicos para V600 WT, V600E, V600D, V600R y V600K, parte de los cuales se ilustran en la figura 2, donde los picos cromatográficos de precursor de característica de SRM para los péptidos generados por GluC, el tipo natural y se muestran las cuatro variantes mutadas de BRAF, en lisado de tejido tumoral de una muestra de tumor recién congelado. Se obtienen características de SRM correspondientes para los péptidos, que se muestran para A) tipo natural y B) V600E en la figura 3. La Tabla 1 resume además características de los picos cromatográficos de firma de SRM/MRM de estos péptidos (SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 5).

La mutagénesis de un solo aminoácido produce una combinación de secuencias de proteínas potenciales que influirán funcionalmente en las patologías y la estadificación de la enfermedad en pacientes. Esto se ejemplifica mediante mutaciones de BRAF en la posición 600 del aminoácido, ilustradas en la Figura 4.

A continuación se incluye un listado de secuencias de péptidos GluC y transiciones SRM seleccionadas para los péptidos de BRAF:

SEQ ID NO: 1: DLTVKIGDFGLATVKSRWSGSHQFE

Masa monoisotópica: 2779,10

m/z de precursor: 1389,714 (estado de carga: 2)

m/z de transición: 1548,7554 (y13), 1447,7077 (y12), 1348,6393 (y11), 1220,5443 (y10), 1133,5123 (y9), 977.4112 (y8), 791,3319 (y7), 704,2998 (y6), 647,2784 (y5), 560,2463 (y4), 423,1874 (y3), 1332,2006 (y24), 1275.6586 (y23), 1225,1348 (y22), 1175,6006 (y21), 1111,5531 (y20), 1055,0111 (y19), 1026,5003 (y18), 968.9868 (y17), 895,4526 (y16), 866,9419 (y15), 810,3999 (y14), 774,8813 (y13), 724,3575 (y12), 674,8233 (y11), 610,7758 (y10), 567,2598 (y9), 489,2092 (y8), 396,1696 (y7), 352,6536 (y6), 324,1428 (y5).

m/z de precursor: 926,8118 (estado de carga: 3)

m/z de transición: 1548,7554 (y13), 1447,7077 (y12), 1348,6393 (y11), 1220,5443 (y10), 1133,5123 (y9), 977.4112 (y8), 791,3319 (y7), 704,2998 (y6), 647,2784 (y5), 560,2463 (y4), 423,1874 (y3), 1332,2006 (y24), 1275.6586 (y23), 1225,1348 (y22), 1175,6006 (y21), 1111,5531 (y20), 1055,0111 (y19), 1026,5003 (y18), 968.9868 (y17), 895,4526 (y16), 866,9419 (y15), 810,3999 (y14), 774,8813 (y13), 724,3575 (y12), 674,8233 (y11), 610,7758 (y10), 567,2598 (y9), 489,2092 (y8), 396,1696 (y7), 352,6536 (y6), 324,1428 (y5), 888,4695 (y24), 850,7748 (y23), 817,0923 (y22), 784,0695 (y21), 741,3711 (y20), 703,6765 (y19), 684,6693 (y18), 646.3270 (y17), 597,3042 (y16), 578,2970 (y15), 540,6023 (y14), 516,9233 (y13), 483,2407 (y12), 450,2179 (y11), 407,5196 (y10), 378,5089 (y9), 326,4752 (y8).

m/z de precursor: 695,3607 (estado de carga: 4)

m/z de transición: 1548,7554 (y13), 1447,7077 (y12), 1348,6393 (y11), 1220,5443 (y10), 1133,5123 (y9), 977.4112 (y8), 791,3319 (y7), 704,2998 (y6), 647,2784 (y5), 560,2463 (y4), 423,1874 (y3), 1332,2006 (y24), 1275.6586 (y23), 1225,1348 (y22), 1175,6006 (y21), 1111,5531 (y20), 1055,0111 (y19), 1026,5003 (y18), 968.9868 (y17), 895,4526 (y16), 866,9419 (y15), 810,3999 (y14), 774,8813 (y13), 724,3575 (y12), 674,8233 (y11), 610,7758 (y10), 567,2598 (y9), 489,2092 (y8), 396,1696 (y7), 352,6536 (y6), 324,1428 (y5), 888,4695 (y24), 850,7748 (y23), 817,0923 (y22), 784,0695 (y21), 741,3711 (y20), 703,6765 (y19), 684,6693 (y18), 646.3270 (y17), 597,3042 (y16), 578,2970 (y15), 540,6023 (y14), 516,9233 (y13), 483,2407 (y12), 450,2179 (y11), 407,5196 (y10), 378,5089 (y9), 326,4752 (y8).

SEQ ID NO: 2: DLTVKIGDFGLATDKSRWSGSHQFE

Masa monoisotópica: 2795,06

m/z de precursor: 1397,693 (estado de carga: 2)

m/z de transición: 1564,7139 (y13), 1463,6662 (y12), 1348,6393 (y11), 1220,5443 (y10), 1133,5123 (y9), 977.4112 (y8), 791,3319 (y7), 704,2998 (y6), 647,2784 (y5), 560,2463 (y4), 423,1874 (y3), 1340,1799 (y24), 1283.6379 (y23), 1233,1140 (y22), 1183,5798 (y21), 1119,5323 (y20), 1062,9903 (y19), 1034,4796 (y18), 976.9661 (y17), 903,4319 (y16), 874,9212 (y15), 818,3791 (y14), 782,8606 (y13), 732,3367 (y12), 674,8233 (y11), 610,7758 (y10), 567,2598 (y9), 489,2092 (y8), 396,1696 (y7), 352,6536 (y6), 324,1428 (y5).

m/z de precursor: 932,1313 (estado de carga: 3)

m/z de transición: 1564,7139 (y13), 1463,6662 (y12), 1348,6393 (y11), 1220,5443 (y10), 1133,5123 (y9), 977.4112 (y8), 791,3319 (y7), 704,2998 (y6), 647,2784 (y5), 560,2463 (y4), 423,1874 (y3), 1340,1799 (y24), 1283.6379 (y23), 1233,1140 (y22), 1183,5798 (y21), 1119,5323 (y20), 1062,9903 (y19), 1034,4796 (y18), 976.9661 (y17), 903,4319 (y16), 874,9212 (y15), 818,3791 (y14), 782,8606 (y13), 732,3367 (y12), 674,8233 (y11), 610,7758 (y10), 567,2598 (y9), 489,2092 (y8), 396,1696 (y7), 352,6536 (y6), 324,1428 (y5), 893,7890 (y24), 856,0943 (y23), 822,4118 (y22), 789,3890 (y21), 746,6907 (y20), 708,9960 (y19), 689,9888 (y18), 651,6465 (y17), 602,6237 (y16), 583,6165 (y15), 545,9219 (y14), 522,2428 (yl3), 488,5603 (y12), 450,2179 (y11), 407,5196 (y10), 378,5089 (y9), 326,4752 (y8).

m/z de precursor: 699,3503 (estado de carga: 4)

m/z de transición: 1564,7139 (y13), 1463,6662 (y12), 1348,6393 (y11), 1220,5443 (y10), 1133,5123 (y9), 977,4112 (y8), 791,3319 (y7), 704,2998 (y6), 647,2784 (y5), 560,2463 (y4), 423,1874 (y3), 1340,1799 (y24), 1283,6379 (y23), 1233,1140 (y22), 1183,5798 (y21), 1119,5323 (y20), 1062,9903 (y19), 1034,4796 (y18), 976,9661 (y17), 903,4319 (y16), 874,9212 (y15), 818,3791 (y14), 782,8606 (y13), 732,3367 (y12), 674,8233 (y11), 610,7758 (y10), 567,2598 (y9), 489,2092 (y8), 396,1696 (y7), 352,6536 (y6), 324,1428 (y5), 893,7890 (y24), 856,0943 (y23), 822,4118 (y22), 789,3890 (y21), 746,6907 (y20), 708,9960 (y19), 689,9888 (y18), 651,6465 (y17), 602,6237 (y16), 583,6165 (y15), 545,9219 (y14), 522,2428 (yl3), 488,5603 (y12), 450,2179 (y11), 407,5196 (y10), 378,5089 (y9), 326,4752 (y8).

SEQ ID NO: 3: DLTVKIGDFGLATRKSRWSGSHQFE

Masa monoisotópica: 2836,16

m/z de precursor: 1418,23 (estado de carga: 2)

m/z de transición: 1504,7404 (y12), 1348,6393 (y11), 1220,5443 (y10), 1133,5123 (y9), 977,4112 (y8), 791.3319 (y7), 704,2998 (y6), 647,2784 (y5), 560,2463 (y4), 423,1874 (y3), 1360,7170 (y24), 1304,1750 (y23), 1253.6511 (y22), 1204,1169 (y21), 1140,0694 (y20), 1083,5274 (y19), 1055,0167 (y18), 997,5032 (y17), 923.9690 (y16), 895,4583 (y15), 838,9162 (y14), 803,3977 (y13), 752,8738 (y12), 674,8233 (y11), 610,7758 (y10), 567,2598 (y9), 489,2092 (y8), 396,1696 (y7), 352,6536 (y6), 324,1428 (y5).

m/z de precursor: 945,8227 (estado de carga: 3)

m/z de transición: 1504,7404 (y12), 1348,6393 (y11), 1220,5443 (y10), 1133,5123 (y9), 977,4112 (y8), 791.3319 (y7), 704,2998 (y6), 647,2784 (y5), 560,2463 (y4), 423,1874 (y3), 1360,7170 (y24), 1304,1750 (y23), 1253.6511 (y22), 1204,1169 (y21), 1140,0694 (y20), 1083,5274 (y19), 1055,0167 (y18), 997,5032 (y17), 923.9690 (y16), 895,4583 (y15), 838,9162 (y14), 803,3977 (y13), 752,8738 (y12), 674,8233 (y11), 610,7758 (y10), 567,2598 (y9), 489,2092 (y8), 396,1696 (y7), 352,6536 (y6), 324,1428 (y5), 907,4804 (y24), 869,7857 (y23), 836,1032 (y22), 803,0804 (y21), 760,3820 (y20), 722,6874 (y19), 703,6802 (y18), 665,3379 (y17), 616.3151 (y16), 597,3079 (y15), 559,6132 (y14), 535,9342 (y13), 502,2516 (y12), 450,2179 (y11), 407,5196 (y10), 378,5089 (y9), 326,4752 (y8).

m/z de precursor: 709,6189 (estado de carga: 4)

m/z de transición: 1504,7404 (y12), 1348,6393 (y11), 1220,5443 (y10), 1133,5123 (y9), 977,4112 (y8), 791.3319 (y7), 704,2998 (y6), 647,2784 (y5), 560,2463 (y4), 423,1874 (y3), 1360,7170 (y24), 1304,1750 (y23), 1253.6511 (y22), 1204,1169 (y21), 1140,0694 (y20), 1083,5274 (y19), 1055,0167 (y18), 997,5032 (y17), 923.9690 (y16), 895,4583 (y15), 838,9162 (y14), 803,3977 (y13), 752,8738 (y12), 674,8233 (y11), 610,7758 (y10), 567,2598 (y9), 489,2092 (y8), 396,1696 (y7), 352,6536 (y6), 324,1428 (y5), 907,4804 (y24), 869,7857 (y23), 836,1032 (y22), 803,0804 (y21), 760,3820 (y20), 722,6874 (y19), 703,6802 (y18), 665,3379 (y17), 616.3151 (y16), 597,3079 (y15), 559,6132 (y14), 535,9342 (y13), 502,2516 (y12), 450,2179 (y11), 407,5196 (y10), 378,5089 (y9), 326,4752 (y8).

SEQ ID NO: 4: DLTVKIGDFGLATKKSRWSGSHQFE

Masa monoisotópica: 2808,15

m/z de precursor: 1404,227 (estado de carga: 2)

m/z de transición: 1577,7819 (y13), 1476,7342 (y12), 1348,6393 (y11), 1220,5443 (y10), 1133,5123 (y9), 977.4112 (y8), 791,3319 (y7), 704,2998 (y6), 647,2784 (y5), 560,2463 (y4), 423,1874 (y3), 1346,7139 (y24), 1290.1719 (y23), 1239,6480 (y22), 1190,1138 (y21), 1126,0664 (y20), 1069,5243 (y19), 1041,0136 (y18), 983.5001 (y17), 909,9659 (y16), 881,4552 (y15), 824,9132 (y14), 789,3946 (y13), 738,8708 (y12), 674,8233 (y11), 610,7758 (y10), 567,2598 (y9), 489,2092 (y8), 396,1696 (y7), 352,6536 (y6), 324,1428 (y5).

m/z de precursor: 936,4874 (estado de carga: 3)

m/z de transición: 1577,7819 (y13), 1476,7342 (y12), 1348,6393 (y11), 1220,5443 (y10), 1133,5123 (y9), 977.4112 (y8), 791,3319 (y7), 704,2998 (y6), 647,2784 (y5), 560,2463 (y4), 423,1874 (y3), 1346,7139 (y24), 1290.1719 (y23), 1239,6480 (y22), 1190,1138 (y21), 1126,0664 (y20), 1069,5243 (y19), 1041,0136 (y18), 983.5001 (y17), 909,9659 (y16), 881,4552 (y15), 824,9132 (y14), 789,3946 (y13), 738,8708 (y12), 674,8233 (y11), 610,7758 (y10), 567,2598 (y9), 489,2092 (y8), 396,1696 (y7), 352,6536 (y6), 324,1428 (y5), 898,1450 (y24), 860,4504 (y23), 826,7678 (y22), 793,7450 (y21), 751,0467 (y20), 713,3520 (y19), 694,3448 (y18), 656.0025 (y17), 606,9797 (y16), 587,9725 (y15), 550,2779 (y14), 526,5988 (y13), 492,9163 (y12), 450,2179 (y11), 407,5196 (y10), 378,5089 (y9), 326,4752 (y8).

m/z de precursor: 702,6173 (estado de carga: 4)

m/z de transición: 1577,7819 (y13), 1476,7342 (y12), 1348,6393 (y11), 1220,5443 (y10), 1133,5123 (y9), 977.4112 (y8), 791,3319 (y7), 704,2998 (y6), 647,2784 (y5), 560,2463 (y4), 423,1874 (y3), 1346,7139 (y24), 1290.1719 (y23), 1239,6480 (y22), 1190,1138 (y21), 1126,0664 (y20), 1069,5243 (y19), 1041,0136 (y18), 983.5001 (y17), 909,9659 (y16), 881,4552 (y15), 824,9132 (y14), 789,3946 (y13), 738,8708 (y12), 674,8233 (y11), 610,7758 (y10), 567,2598 (y9), 489,2092 (y8), 396,1696 (y7), 352,6536 (y6), 324,1428 (y5), 898,1450 (y24), 860,4504 (y23), 826,7678 (y22), 793,7450 (y21), 751,0467 (y20), 713,3520 (y19), 694,3448 (y18), 656.0025 (y17), 606,9797 (y16), 587,9725 (y15), 550,2779 (y14), 526,5988 (y13), 492,9163 (y12), 450,2179 (y11), 407,5196 (y10), 378,5089 (y9), 326,4752 (y8).

SEQ ID NO: 5: DLTVKIGDFGLATE

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar la proporción molar entre proteína BRAF (homólogo B1 del oncogén viral del sarcoma murino v-raf) de tipo natural (WT) y variantes proteicas de la misma en una muestra biológica, en donde las variantes de proteína BRAF son variantes mutadas en la posición correspondiente a la posición de aminoácido 600 en BRAF WT, estando ocupada dicha posición por valina en la BRAF WT, que comprende las etapas de:

a) digerir dicha muestra usando una serina proteinasa que escinde específicamente enlaces peptídicos C-terminales a restos de ácido glutámico o enlaces peptídicos C-terminales a restos de ácido glutámico o aspártico, para obtener una composición que comprende un fragmento peptídico resultante de la digestión de los péptidos por la proteinasa, en donde la masa de dicho fragmento difiere entre dicha proteína B-raf de tipo natural (WT) y una variante de proteína BRAF;

b) evaluar cuantitativamente la cantidad molar de un fragmento peptídico resultante de la digestión de la proteína B-raf de tipo natural (WT) y la cantidad molar de un fragmento peptídico resultante de la digestión de variantes de la proteína B-raf de tipo natural (WT) usando una técnica de espectrometría de masas; y

c) basándose en la evaluación cuantitativa calcular la al menos una proporción específica entre dicha proteína BRAF WT y una variante de la misma.

2. El método de la reivindicación 1, en donde las variantes de proteína BRAF son BRAF V600E, V600D, V600R, y/o V600K.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la serina proteinasa es glutamil endopeptidasa (Glu-C).

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3, en donde dicha etapa de digestión comprende tratar dicha muestra con acetato de amonio, bicarbonato de amonio y/o un tampón fosfato.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la muestra es una muestra de tejido tumoral o un fluido corporal.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la muestra es tejido tumoral, siendo el tejido tumoral tejido de un melanoma maligno, un cáncer de tiroides, un cáncer colorrectal, un cáncer de pulmón, cáncer tumoral cerebral, glioma de bajo grado o un tumor canceroso de ovario.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el fragmento polipeptídico resultante de la digestión de proteína B-raf de tipo natural (WT) usado en la etapa de evaluación cuantitativa es un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 1 y/o SEQ ID NO: 8.

8. El método de la reivindicación 2, en donde el fragmento polipeptídico resultante de la digestión de variantes proteicas de la proteína B-raf de tipo natural (WT) medido en la etapa de evaluación cuantitativa es un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, y/o SEQ ID NO: 10.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la técnica de espectrometría de masas es una técnica de cromatografía líquida interconectada a espectrometría de masas.

10. El método de la reivindicación 9, en donde la técnica de cromatografía líquida de masas interconectada a espectrometría de masas es HPLC/ESI-MS.

11. Método para estimar la susceptibilidad de un sujeto a un tratamiento farmacológico dado para una enfermedad relacionada con BRAF, que comprende las etapas de:

(i) proporcionar una muestra de un sujeto que padece una enfermedad relacionada con BRAF; y determinar la proporción molar específica entre proteína BRAF WT y variantes de la misma mediante un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10;

(ii) comparar la proporción molar específica entre proteína BRAF WT y variantes de la misma, con un valor de referencia de la proporción molar específica entre proteína BRAF WT y variante de la misma determinado a partir de una multitud de muestras de sujetos que se sabe que padecen dicha enfermedad relacionada con BRAF y que son susceptibles a dicho tratamiento farmacológico dado;

(iii) basándose en dicha comparación determinar la susceptibilidad del sujeto a un tratamiento farmacológico dado,

en donde una proporción definida por proteína BRAF WT con respecto a dicha al menos una variante de proteína BRAF en dicha muestra por encima del valor de referencia de la proporción definida por proteína BRAF WT con respecto a dicha al menos una variante de proteína BRAF es indicativa de mayor susceptibilidad a un tratamiento farmacológico dado,

el valor de referencia es una proporción molar específica entre proteína BRAF WT y dicha al menos una variante de proteína BRAF determinado a partir de una multitud de muestras de sujetos que se sabe que padecen dicha enfermedad relacionada con BRAF y que son susceptibles a dicho tratamiento farmacológico dado,

la enfermedad relacionada con BRAF es un cáncer con mutaciones de BRAF en la posición de aminoácido 600, y dicho tratamiento farmacológico es un tratamiento que usa un inhibidor de quinasa, tal como Vemurafenib, Dabrafenib o Sorafenib.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la susceptibilidad de un sujeto a un tratamiento farmacológico dado se monitoriza antes y después del tratamiento, en donde un cambio en la proporción molar específica entre proteína BRAF WT y variantes de la misma antes y después de la operación, indica un estado de mutación cambiado del tejido tumoral.