JP6668256B2 - チロシンプロテインキナーゼ受容体ｕｆｏ（ａｘｌ）タンパク質のｓｒｍ／ｍｒｍアッセイ - Google Patents
チロシンプロテインキナーゼ受容体ｕｆｏ（ａｘｌ）タンパク質のｓｒｍ／ｍｒｍアッセイ Download PDFInfo
- Publication number
- JP6668256B2 JP6668256B2 JP2016565214A JP2016565214A JP6668256B2 JP 6668256 B2 JP6668256 B2 JP 6668256B2 JP 2016565214 A JP2016565214 A JP 2016565214A JP 2016565214 A JP2016565214 A JP 2016565214A JP 6668256 B2 JP6668256 B2 JP 6668256B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- axl
- protein
- peptide
- amount
- tissue
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102100037236 Tyrosine-protein kinase receptor UFO Human genes 0.000 title claims description 128
- 101000807561 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase receptor UFO Proteins 0.000 title claims description 123
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 77
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 77
- 101710192735 Tyrosine-protein kinase receptor UFO Proteins 0.000 title claims description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 title description 51
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 195
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 82
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 64
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 53
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 51
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 45
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 32
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 24
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 21
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 11
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 11
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 11
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 7
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 6
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 5
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 claims description 3
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 3
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 97
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 36
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 28
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 14
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 12
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 10
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 8
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- -1 but not limited to Proteins 0.000 description 2
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 229940044683 chemotherapy drug Drugs 0.000 description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000534 ion trap mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010030544 Peptidyl-Lys metalloendopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102400000745 Potential peptide Human genes 0.000 description 1
- 101800001357 Potential peptide Proteins 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 230000005880 cancer cell killing Effects 0.000 description 1
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000001531 micro-dissection Methods 0.000 description 1
- 238000011369 optimal treatment Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005173 quadrupole mass spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012207 quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 208000011581 secondary neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 235000020354 squash Nutrition 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001269 time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
- G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/91—Transferases (2.)
- G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/91—Transferases (2.)
- G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
- G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
- G01N2800/7028—Cancer
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
緒言
がんは、増殖及び分裂細胞を死滅させかつ様々な方法で機能する一群の治療薬を用いて治療される。一般的な化学療法薬の群は、個々に、または併用療法で数十年間にわたり使用されており、この一般的な薬剤群は、臨床腫瘍学の実践において伝統的な通常のがん治療となっている。これら伝統的な化学療法薬は、ほとんどのがん細胞の主な特徴のひとつである急速に分裂するすべての細胞を死滅させて働く。しかしながら、これらの薬剤は増殖する正常な細胞も死滅させ、それ故、これらの薬剤は、がん細胞を死滅させるための「標的」治療法とは見なされない。最近になって、がん細胞を標的とするがん治療薬の大きな集団が開発され、該治療薬は、がん細胞によってのみ発現され、正常細胞によっては発現されないタンパク質を特異的に攻撃する。この治療法は、がんの「標的」治療法と見なされる。ごく最近、標的方式でがん細胞を死滅させる別の治療法は、がん細胞を死滅させるためのがん患者の免疫系の能力を高めるため、免疫系を特異的に調節している。
がんは、増殖及び分裂細胞を死滅させかつ様々な方法で機能する一群の治療薬を用いて治療される。一般的な化学療法薬の群は、個々に、または併用療法で数十年間にわたり使用されており、この一般的な薬剤群は、臨床腫瘍学の実践において伝統的な通常のがん治療となっている。これら伝統的な化学療法薬は、ほとんどのがん細胞の主な特徴のひとつである急速に分裂するすべての細胞を死滅させて働く。しかしながら、これらの薬剤は増殖する正常な細胞も死滅させ、それ故、これらの薬剤は、がん細胞を死滅させるための「標的」治療法とは見なされない。最近になって、がん細胞を標的とするがん治療薬の大きな集団が開発され、該治療薬は、がん細胞によってのみ発現され、正常細胞によっては発現されないタンパク質を特異的に攻撃する。この治療法は、がんの「標的」治療法と見なされる。ごく最近、標的方式でがん細胞を死滅させる別の治療法は、がん細胞を死滅させるためのがん患者の免疫系の能力を高めるため、免疫系を特異的に調節している。
ＡＸＬとも呼ばれることがあるチロシンプロテインキナーゼ受容体ＵＦＯタンパク質を標的とする治療薬は、早期臨床試験において有望性を示している。しかしながら、そのがん細胞がＡＸＬタンパク質を大量に発現する患者のみが、かかるＡＸＬ標的治療薬での治療から恩恵を受けやすい。以下の方法は、ＡＸＬが通常は正常な組織及び／または正常な上皮細胞では発現されないため、ＡＸＬのシグナル経路活性化の関連測定を実現する定量的なプロテオミクスに基づく分析を提供する。とりわけ、本方法は、ホルマリン固定されたがん患者由来の組織におけるＡＸＬを定量化し、がん治療のための治療法の決定の改善を可能にする質量分析アッセイを提供する。
ＡＸＬとも呼ばれ、本明細書ではＡＸＬと呼ばれるチロシンプロテインキナーゼ受容体ＵＦＯタンパク質の部分配列由来の特異的ペプチドを提供する。該ペプチド配列及び各ペプチドのフラグメンテーション／トランジションイオンは、質量分析に基づく選択反応モニタリング（ＳＲＭ）で特に有用であり、これは、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）アッセイとも呼ばれる場合があり、ＳＲＭ／ＭＲＭと呼ばれる。ＡＸＬタンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭ定量分析用のペプチドの使用について記載する。
本ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを用いて、ＡＸＬタンパク質由来の特異的ペプチドの１つ以上の相対または絶対定量レベルを測定することができ、ゆえに、生体試料から得られる所与のタンパク質調製物におけるＡＸＬタンパク質の量を質量分析で測定する手段を提供することができる。
より具体的には、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ホルマリン固定したがん患者の組織等の患者の組織試料から得られる細胞から調製される複合タンパク質溶解物試料中で、直接これらのペプチドを測定することができる。ホルマリン固定組織からのタンパク質試料の調製方法は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，４７３，５３２号に記載されている。米国特許第７，４７３，５３２号に記載の方法は、好都合には、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（メリーランド州ロックビル）から入手可能なＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ試薬及びプロトコルを用いて行うことができる。
がん患者の組織由来の組織の最も広く有利に使用可能な形態は、ホルマリン固定のパラフィン包埋組織である。外科的に除去された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、世界中で断然最も一般的ながん組織試料の保存方法であり、病理学の標準的技法に認められた慣例である。ホルムアルデヒドの水溶液はホルマリンと呼ばれる。「１００％」のホルマリンは、少量の安定剤、通常はメタノールを、酸化及び重合度を抑えるために含む、ホルムアルデヒドの飽和水溶液（約４０体積％または３７質量％）からなる。組織を保存する最も一般的な方法は、組織全体を一般に１０％中性緩衝ホルマリンと呼ばれるホルムアルデヒド水溶液に長時間（８時間から４８時間）浸漬し、その後、室温での長期保存のため、固定された組織全体をパラフィンワックスに包埋することである。このように、ホルマリン固定されたがん組織を分析するための分子的分析法は、最も容認され、頻繁に使用されるがん患者の組織の分析法であろう。
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの結果は、組織（生体試料）が採取され、保存された患者または対象の特定の組織試料（例えば、がん組織試料）内でのＡＸＬタンパク質の正確かつ精密な定量レベルを関連付けるために用いることができる。これは、がんに関する診断情報を与えるだけでなく、医師または他の医療専門家が、その患者に対する適切な治療法を決定することを可能にもする。病変組織または他の患者の試料における、タンパク質発現のレベルについての診断上及び治療上重要な情報を提供するこのようなアッセイは、コンパニオン診断アッセイと呼ばれる。例えば、かかるアッセイは、がんの病期や重症度を診断し、患者が反応する可能性が最も高い治療薬を決定するように設計されうる。
本明細書に記載のアッセイは、ＡＸＬタンパク質の特定の未修飾ペプチドの相対的または絶対的レベルを測定し、また、ＡＸＬタンパク質の特定の修飾ペプチドの絶対的または相対的レベルも測定できる。修飾の例としては、ペプチド上に存在するリン酸化アミノ酸残基及びグリコシル化アミノ酸残基が挙げられる。
ＡＸＬタンパク質の相対定量レベルは、ＳＲＭ／ＭＲＭ法で、例えば、異なる試料中の個々のＡＸＬペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積（例えば、シグネチャーピーク面積または積分フラグメントイオン強度）を比較することによって決定される。別の方法として、各ペプチドがそれ自体固有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークを有する複数のＡＸＬシグネチャーペプチドに対する複数のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を比較し、１つの生体試料におけるＡＸＬタンパク質の、さらなる、または異なる生体試料の１つ以上におけるＡＸＬタンパク質に対する相対的ＡＸＬタンパク質含量を決定することができる。このようにして、ＡＸＬタンパク質の特定のペプチドまたはペプチド類の量、ゆえにＡＸＬタンパク質の量が、同じ実験条件下で２つ以上の生体試料にわたり、同じＡＸＬタンパク質またはタンパク質類に対して決定される。さらに、相対定量は、単一の試料内のＡＸＬタンパク質由来の所与のペプチドまたはペプチド類について、ＳＲＭ／ＭＲＭ法によるそのペプチドのシグネチャーピーク面積を、当該生体試料由来の同じタンパク質調製物内の異なるタンパク質またはタンパク質類由来の、別の異なるペプチドまたはペプチド類のシグネチャーピーク面積と比較することによって決定されうる。このようにして、ＡＸＬタンパク質由来の特定のペプチド量、ゆえにＡＸＬタンパク質の量が、同じ試料内で互いに相対的に決定される。これらの手法は、ＡＸＬタンパク質由来の個々のペプチドまたはペプチド類の、別のペプチドまたはペプチド類の量に対する定量を、試料間及び試料内でもたらし、シグネチャーピーク面積によって測定されるこれらの量は、当該生体試料由来のタンパク質調製物におけるＡＸＬペプチドの体積に対する、または重量に対する絶対重量に関わらず互いに相対的である。異なる試料間の個々のシグネチャーピーク面積に関する相対的定量データは、試料ごとに分析されるタンパク質量に正規化される。複数のタンパク質及びＡＸＬタンパク質由来の多くのペプチド間で単一の試料中、及び／または、多くの試料にわたって同時に相対定量を行い、相対的タンパク質量、例えば、１つのペプチド／タンパク質の他のペプチド類／タンパク質類に対する相対的タンパク質量を洞察することができる。
ＡＸＬタンパク質の絶対定量レベルは、例えば、ＳＲＭ／ＭＲＭ法で、１つの生体試料におけるＡＸＬタンパク質由来の個々のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、スパイクされた内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比べることによって決定される。１つの実施形態において、該内部標準は、１種以上の重同位体で標識された１つ以上のアミノ酸残基を含む、合成型の同一のＡＸＬペプチドである。かかる同位体標識内部標準は、質量分析法での分析の際、天然のＡＸＬペプチドのシグネチャーピークと異なり区別できる、予測可能な一貫したＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークであって、比較ピークとして使用できるピークを標準が生じるように合成される。このように、該内部標準が、既知の量で生体試料由来のタンパク質調製物にスパイクされ、質量分析法で分析される場合、天然のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積が、該内部標準ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較され、この数値比較が、当該生体試料由来の元のタンパク質調製物に存在する天然のペプチドの絶対モル濃度及び／または絶対重量のいずれかを示す。フラグメントペプチドの絶対定量データは、試料ごとに分析されるタンパク質量に応じて表示される。多くのペプチド間、ひいてはタンパク質間で単一の試料中及び／または多くの試料にわたって同時に絶対定量を行い、個々の生体試料並びに個々の試料のコホート全体のタンパク質の絶対量を洞察することができる。
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ法を用いて、例えば、ホルマリン固定組織等の患者由来の組織でのがんの病期の直接診断を補助すること、及び、その患者の治療に最も有利となる治療薬の決定を補助することが可能である。例えば、腫瘍の一部もしくは全部の治療的除去のための外科手術、または疑いのある疾患の有無を決定するために行われる生検法のどちらかによって患者から除去されたがん組織は、その患者の組織での特異的タンパク質またはタンパク質類の有無、及びどのタンパク質の型が存在するかを調べるために分析される。さらに、タンパク質もしくは複数のタンパク質類の発現レベルが測定可能であり、健康な組織で見られる「正常」または参照レベルと比較することができる。健康な組織で見られるタンパク質の正常または参照レベルは、例えば、がんのない１個体以上の関連組織由来でよい。別の方法として、正常または参照レベルは、がん患者のがんの影響を受けない関連組織の分析によって得てもよい。タンパク質レベル（例えば、ＡＸＬレベル）のアッセイは、患者、または該ＡＸＬレベルを用いてがんと診断された対象のがんの病期の診断にも使用できる。個々のＡＸＬペプチドのレベルは、分析されたタンパク質溶解物の総量当たりのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイで測定されたペプチドのモル量として定義される。このように、ＡＸＬに関する情報を用いて、ＡＸＬタンパク質（またはＡＸＬタンパク質のフラグメントペプチド類）のレベルを正常組織で観察されるレベルと相関させることにより、がんの病期もしくは悪性度の決定を補助することができる。がん細胞におけるＡＸＬタンパク質の量が定量的に決定されると、その情報は、例えば、アッセイされたタンパク質または（１つもしくは複数の）タンパク質（例えば、ＡＸＬ）の異常発現によって特徴づけられるがん組織を特異的に治療するために開発された治療薬（化学的及び生物学的）のリストと照合することができる。例えばＡＸＬタンパク質または該タンパク質を発現する細胞／組織を特異的に標的とする治療薬のリストに対するＡＸＬタンパク質アッセイからの照合情報は、疾患治療の個別化医療手法と呼ばれているものを特徴づける。本明細書に記載のアッセイ方法は、診断及び治療決定の情報源として患者自身の組織由来のタンパク質の分析を用いることによって、個別化医療手法の基礎となる。
原則として、例えば、特異性が既知のプロテアーゼ（例えばトリプシン）で消化することによって調製された、ＡＸＬタンパク質由来の任意の予測ペプチドを、標識化合物のレポーターとして用い、試料中のＡＸＬタンパク質の存在量を、質量分析に基づいたＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを用いて決定することができる。同様に、該ＡＸＬタンパク質において修飾される可能性があると知られている部位のアミノ酸残基を含む任意の予測ペプチド配列も、試料中のＡＸＬタンパク質の修飾量をアッセイするために使用される可能性がある。
ＡＸＬのフラグメントペプチドは、米国特許第７，４７３，５３２号に提供されるＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅプロトコルの使用を含めた様々な手段で生成されうる。該Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅプロトコル及び試薬によって、質量分光分析に適したペプチド試料を、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から、該組織／生体試料のタンパク質のタンパク分解消化によって製造できる。該Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅプロトコルでは、該組織／生体は、タンパク質の架橋を戻したり解除したりするため、緩衝液中で長時間加熱（約８０℃から約１００℃で約１０分から約４時間）される。採用される緩衝液は、中性緩衝液（例えば、トリス系緩衝液、または界面活性剤含有緩衝液）である。熱処理の後、該組織／生体試料は、限定されないが、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、及びエンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃ等の１種以上のプロテアーゼで、当該生体試料の組織及び細胞構造を破壊並びに当該試料を液化するのに十分な時間（例えば、３７℃から６５℃の温度で、３０分から２４時間）処理される。該加熱及びタンパク分解によって、液状の可溶性で希釈可能な生体分子の溶解物が得られる。
意外にも、理由は直ちには明白にならないが、ＡＸＬタンパク質由来の多くの潜在的ペプチド配列が、質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭアッセイでの使用に不適当または無効だということが見出された。ＭＲＭ／ＳＲＭアッセイに最適なペプチドの予測が不可能であったため、ＡＸＬタンパク質用の信頼性のある正確なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するため、実際のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物において修飾及び未修飾ペプチドを実験的に特定することが必要であった。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、一部のペプチドは、例えば、それらが十分にイオン化されないか、または他のタンパク質と異なるフラグメントを産生しないため、質量分析で検出することが困難な場合があると考えられる。ペプチドはまた、分離（例えば、液体クロマトグラフィー）において十分に分割できない場合や、ガラスやプラスチック製品に付着する場合がある。
本開示の多様な実施形態（例えば、表１及び２）に見出されるＡＸＬペプチドは、ホルマリン固定がん組織から得られた細胞から調製された複合Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物内のすべてのタンパク質のプロテアーゼ消化によって、ＡＸＬタンパク質から得られた。特に断りのない限り、各例においてプロテアーゼはトリプシンであった。該Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物は、その後、質量分析法で検出及び分析されるＡＸＬタンパク質由来のそれらペプチドを測定するため、質量分析法で分析された。質量分光分析に好適なペプチドの特異的サブセットの特定は：１）Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物の質量分光分析で、タンパク質のどのペプチドまたはペプチド類がイオン化するかの実験的決定、並びに２）Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物の調製に用いられるプロトコル及び実験条件でのペプチドの生存能力に基づく。後者の特性は、ペプチドのアミノ酸配列だけでなく、ペプチド内の修飾アミノ酸残基の、試料調製の間の修飾型での生存能力にも及ぶ。
ホルマリン（ホルムアルデヒド）固定組織から直接得られた細胞由来のタンパク質溶解物は、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ試薬、及び、組織の顕微解剖によって細胞を試料チューブに採取し、その後これらの細胞を長時間、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ緩衝液中で加熱することを必要とするプロトコルを用いて調製された。いったんホルマリン誘発架橋が悪影響を受けると、該組織／細胞はその後、例としては限定されないがプロテアーゼトリプシンが挙げられる、プロテアーゼを用いて予測可能な形で完全に消化される。各タンパク質溶解物は、無傷のポリペプチドの該プロテアーゼによる消化によって、ペプチドの集積に変化する。各Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物は、これらペプチドの複数の包括的なプロテオミクス調査を行うために分析され（例えば、イオントラップ質量分析法で）、データは、各タンパク質溶解物に存在するすべての細胞タンパク質から質量分析法で特定できるだけの数のペプチドの特定として示された。単一の複合タンパク質／ペプチド溶解物からできるだけ多くのペプチドの特定のための包括的なプロファイリングが実行できるイオントラップ質量分析計または別の型の質量分析計が一般的に採用される。しかしながら、イオントラップ質量分析計がペプチドの包括的なプロファイリングを行うための質量分析計の最良型でありうる。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、または三連四重極型を含めた任意の種類の質量分析計で発展及び実行されうるものの、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ用の最も有利な機器プラットフォームは、多くの場合、三連四重極型の機器プラットフォームであると考えられている。
できるだけ多くのペプチドを、使用される条件下で単一の溶解物の単一のＭＳ分析で特定した後、ペプチドのリストを配列し、これを用いてその溶解物中で検出されたタンパク質を調べた。その工程を複数のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物で繰り返し、その極めて広範なペプチドのリストを、単一のデータセットに配列した。その種のデータセットは、（プロテアーゼ消化後に）分析された生体試料の種類の中で、特に、該生体試料のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中で検出可能なペプチドを表すと考えられ、ゆえに、例えばＡＸＬタンパク質のような特定のタンパク質に対するペプチドを含む。
１つの実施形態において、ＡＸＬタンパク質の絶対量または相対量の決定に有用であると見なされるＡＸＬのトリプシンペプチドとしては、それぞれ表１に記載の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０のペプチドの１種以上、２種以上、３種以上、もしくは４種以上が挙げられる。これらペプチドの各々は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から調製されたＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物において質量分析法で検出された。従って、各ペプチドは、ヒト生体試料におけるＡＸＬタンパク質に対する、ホルマリン固定された患者の組織での直接的なアッセイを含む定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの展開での使用の対象である。
表１に記載のＡＸＬのトリプシンペプチドは、肺、結腸、及び胸部を含めたヒトの異なる器官の、複数の異なるホルマリン固定組織の複数のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物から検出されたものを含む。これらペプチドの各々が、ホルマリン固定組織におけるＡＸＬタンパク質の定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに有用であると考えられる。これらの実験のさらなるデータ分析は、いかなる特定の器官の部位由来のいかなる特定のペプチドにも優先が認められないことを示した。従って、これらペプチドの各々が、任意の生体試料由来の、または体内の任意の器官の部位由来の任意のホルマリン固定組織からのＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物におけるＡＸＬタンパク質のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うのに適していると考えられる。
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行う際に考慮すべき重要なことは、ペプチドの分析に使用されうる機器の種類である。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＭＡＬＤＩ、イオントラップ、または三連四重極型を含めた任意の種類の質量分析計で展開及び実行されうるものの、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ用の最も有利な機器プラットフォームは、多くの場合、三連四重極型の機器プラットフォームであると考えられている。この種類の質量分析計は、単一の単離された標的ペプチドを、細胞内に含まれるすべてのタンパク質由来の数十万から数百万の個々のペプチドからなりうる極めて複雑なタンパク質溶解物内で分析するために最適の機器であると考えてよい。
ＡＸＬタンパク質由来の各ペプチドについて、最も効率的にＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを実施するために、ペプチド配列に加えて、該分析の情報を使用することが望ましい。その追加情報は、該質量分析計（例えば、三連四重極型質量分析計）を、該分析が効率的に行われうるように、（１種または複数の）特定の標的ペプチドの正確かつ集中的な分析を行うように指揮及び指示することに使用されうる。
一般の標的ペプチド及び特定のＡＸＬペプチドに関する追加情報は、該ペプチドのモノアイソトピック質量、そのプリカーサーの荷電状態、該プリカーサーのｍ／ｚ値、該ｍ／ｚのトランジションイオン、及び各トランジションイオンのイオンタイプのうちの１つ以上を含みうる。ＡＸＬタンパク質に対するＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うために使用されうる追加のペプチド情報は、表１のリストからの３つのＡＸＬペプチドについての例によって示され、これを表２に示す。表２の例で示される３つのＡＸＬペプチドについて記載された同様の追加情報が、表１に含まれる他のペプチドの分析に対して準備、獲得、及び適用されうる。
以下に記載の方法は：１）ＡＸＬタンパク質についての質量分析に基づくＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに用いることができるＡＸＬタンパク質由来の対象ペプチドを特定し、２）関連付けのため、ＡＸＬタンパク質由来の標的ペプチドについての個々のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイまたは複数のアッセイを開発し、３）がん診断及び／または最適治療の選択に定量アッセイを適用するために用いた。
アッセイ方法
１．ＡＸＬタンパク質用のＳＲＭ／ＭＲＭ対象フラグメントペプチドの特定
ａ．ホルマリン固定生体試料から、タンパク質を消化するためプロテアーゼまたはプロテアーゼ類（トリプシンを含んでも含まなくてもよい）を用いてＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅタンパク質溶解物を調製する。
ｂ．該Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中のすべてのタンパク質フラグメントをイオントラップタンデム質量分析計で分析し、個々にリン酸化やグリコシル化等のいかなるペプチド修飾も含まないＡＸＬタンパク質由来のフラグメントペプチドをすべて特定する。
ｃ．該Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中のすべてのタンパク質フラグメントをイオントラップタンデム質量分析計で分析し、例えばリン酸化またはグリコシル化残基等のペプチド修飾を有するＡＸＬタンパク質由来のフラグメントペプチドをすべて特定する。
ｄ．完全な全長ＡＸＬタンパク質からの特異的消化法によって生成されたすべてのペプチドが潜在的に測定可能であるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うために好適に用いられるペプチドは、ホルマリン固定生体試料から調製される複合Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅタンパク質溶解物中、直接質量分析法で特定されるペプチドである。
ｅ．患者の組織で特異的に修飾（リン酸化、グリコシル化、等）され、ホルマリン固定生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物を分析する際に質量分析計中でイオン化し、それ故検出されるペプチドが、ＡＸＬタンパク質のペプチド修飾をアッセイするための対象ペプチドとして特定される。
１．ＡＸＬタンパク質用のＳＲＭ／ＭＲＭ対象フラグメントペプチドの特定
ａ．ホルマリン固定生体試料から、タンパク質を消化するためプロテアーゼまたはプロテアーゼ類（トリプシンを含んでも含まなくてもよい）を用いてＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅタンパク質溶解物を調製する。
ｂ．該Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中のすべてのタンパク質フラグメントをイオントラップタンデム質量分析計で分析し、個々にリン酸化やグリコシル化等のいかなるペプチド修飾も含まないＡＸＬタンパク質由来のフラグメントペプチドをすべて特定する。
ｃ．該Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中のすべてのタンパク質フラグメントをイオントラップタンデム質量分析計で分析し、例えばリン酸化またはグリコシル化残基等のペプチド修飾を有するＡＸＬタンパク質由来のフラグメントペプチドをすべて特定する。
ｄ．完全な全長ＡＸＬタンパク質からの特異的消化法によって生成されたすべてのペプチドが潜在的に測定可能であるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うために好適に用いられるペプチドは、ホルマリン固定生体試料から調製される複合Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅタンパク質溶解物中、直接質量分析法で特定されるペプチドである。
ｅ．患者の組織で特異的に修飾（リン酸化、グリコシル化、等）され、ホルマリン固定生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物を分析する際に質量分析計中でイオン化し、それ故検出されるペプチドが、ＡＸＬタンパク質のペプチド修飾をアッセイするための対象ペプチドとして特定される。
２．ＡＸＬタンパク質由来のフラグメントペプチドの質量分析アッセイ
ａ．Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中で特定される個々のフラグメントペプチドの三連四重極型質量分析計でのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイが、ＡＸＬタンパク質由来のペプチドに適用される。
ｉ．限定されないが、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーの最適条件のためのフラグメントペプチドについての最適保持時間を決定する。
ｉｉ．各ペプチドについてＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するため、該ペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドについてのプリカーサーの荷電状態、各ペプチドについての該プリカーサーのｍ／ｚ値、各ペプチドについての該ｍ／ｚのトランジションイオン、及び各フラグメントペプチドについての各トランジションイオンのイオンタイプを測定する。
ｉｉｉ．その後、（ｉ）及び（ｉｉ）からの情報を用い、三連四重極型質量分析計でＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うことができ、ここで各ペプチドは、三連四重極型質量分析計で行われる固有のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを明確に規定する特徴的で固有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークを有する。
ａ．Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中で特定される個々のフラグメントペプチドの三連四重極型質量分析計でのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイが、ＡＸＬタンパク質由来のペプチドに適用される。
ｉ．限定されないが、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーの最適条件のためのフラグメントペプチドについての最適保持時間を決定する。
ｉｉ．各ペプチドについてＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するため、該ペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドについてのプリカーサーの荷電状態、各ペプチドについての該プリカーサーのｍ／ｚ値、各ペプチドについての該ｍ／ｚのトランジションイオン、及び各フラグメントペプチドについての各トランジションイオンのイオンタイプを測定する。
ｉｉｉ．その後、（ｉ）及び（ｉｉ）からの情報を用い、三連四重極型質量分析計でＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行うことができ、ここで各ペプチドは、三連四重極型質量分析計で行われる固有のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを明確に規定する特徴的で固有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークを有する。
ｂ．検出されるＡＸＬタンパク質フラグメントペプチドの量が、ＳＲＭ／ＭＲＭ質量分光分析からの該固有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積に応じて、特定のタンパク質溶解物における該タンパク質の相対的及び絶対的な量の両方を示すことができるようにＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを行う。
ｉ．相対定量は下記により達成されうる：
１．１つのホルマリン固定生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物で検出される所与のＡＸＬペプチド由来のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、少なくとも第二、第三、第四、もしくはそれ以上のホルマリン固定生体試料由来の少なくとも第二、第三、第四、もしくはそれ以上のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中の同じＡＸＬフラグメントペプチドの同じＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較して、ＡＸＬタンパク質の存在の増加または減少を測定する。
２．１つのホルマリン固定生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中で検出される所与のＡＸＬペプチド由来のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、異なる別の生物学的起源由来の他の試料中の他のタンパク質由来のフラグメントペプチドから生成するＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較して、ＡＸＬタンパク質の存在の増加または減少を決定する。ここでは、ペプチドフラグメントについての該２つの試料間の該ＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積の比較は、各試料で分析されるタンパク質量に正規化される。
３．変化するＡＸＬタンパク質のレベルを、様々な細胞条件下でその発現レベルを変えない他のタンパク質のレベルに対して正規化するため、所与のＡＸＬペプチドに対するＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、該ホルマリン固定生体試料由来の同じＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物内の異なるタンパク質由来の他のフラグメントペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較し、ＡＸＬタンパク質の存在の増加または減少を測定する。
４．これらのアッセイは、ＡＸＬタンパク質の未修飾フラグメントペプチド及び修飾フラグメントペプチドの両方に適用することが可能であって、該修飾としては、限定されないが、リン酸化及び／またはグリコシル化が挙げられ、修飾ペプチドの相対レベルは、未修飾ペプチドの相対量の決定と同じ方法で決定される。
ｉ．相対定量は下記により達成されうる：
１．１つのホルマリン固定生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物で検出される所与のＡＸＬペプチド由来のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、少なくとも第二、第三、第四、もしくはそれ以上のホルマリン固定生体試料由来の少なくとも第二、第三、第四、もしくはそれ以上のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中の同じＡＸＬフラグメントペプチドの同じＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較して、ＡＸＬタンパク質の存在の増加または減少を測定する。
２．１つのホルマリン固定生体試料由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物中で検出される所与のＡＸＬペプチド由来のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、異なる別の生物学的起源由来の他の試料中の他のタンパク質由来のフラグメントペプチドから生成するＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較して、ＡＸＬタンパク質の存在の増加または減少を決定する。ここでは、ペプチドフラグメントについての該２つの試料間の該ＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積の比較は、各試料で分析されるタンパク質量に正規化される。
３．変化するＡＸＬタンパク質のレベルを、様々な細胞条件下でその発現レベルを変えない他のタンパク質のレベルに対して正規化するため、所与のＡＸＬペプチドに対するＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、該ホルマリン固定生体試料由来の同じＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物内の異なるタンパク質由来の他のフラグメントペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較し、ＡＸＬタンパク質の存在の増加または減少を測定する。
４．これらのアッセイは、ＡＸＬタンパク質の未修飾フラグメントペプチド及び修飾フラグメントペプチドの両方に適用することが可能であって、該修飾としては、限定されないが、リン酸化及び／またはグリコシル化が挙げられ、修飾ペプチドの相対レベルは、未修飾ペプチドの相対量の決定と同じ方法で決定される。
ｉｉ．所与のペプチドの絶対定量は、個々の生体試料のＡＸＬタンパク質由来の所与のフラグメントペプチドに対するＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積を、該生体試料由来のタンパク質溶解物にスパイクされた内部フラグメントペプチド標準のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積と比較することによって達成されうる。
１．該内部標準は、調査対象のＡＸＬタンパク質由来のフラグメントペプチドの標識された合成型である。この標準は、試料に既知量でスパイクされ、ＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積は、該内部フラグメントペプチド標準及び該生体試料中の天然フラグメントペプチドの両方について別々に決定可能であり、その後、両方のピーク面積が比較される。
２．これは、未修飾フラグメントペプチド及び修飾フラグメントペプチドに適用することが可能であって、該修飾としては、限定されないが、リン酸化及び／またはグリコシル化が挙げられ、修飾ペプチドの絶対レベルは、未修飾ペプチドの絶対レベルの決定と同じ方法で決定できる。
１．該内部標準は、調査対象のＡＸＬタンパク質由来のフラグメントペプチドの標識された合成型である。この標準は、試料に既知量でスパイクされ、ＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピーク面積は、該内部フラグメントペプチド標準及び該生体試料中の天然フラグメントペプチドの両方について別々に決定可能であり、その後、両方のピーク面積が比較される。
２．これは、未修飾フラグメントペプチド及び修飾フラグメントペプチドに適用することが可能であって、該修飾としては、限定されないが、リン酸化及び／またはグリコシル化が挙げられ、修飾ペプチドの絶対レベルは、未修飾ペプチドの絶対レベルの決定と同じ方法で決定できる。
３．フラグメントペプチド定量のがん診断及び治療への応用
ａ．ＡＸＬタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対定量及び／または絶対定量を行い、がんの分野で十分理解されている、あらかじめ特定された、患者の腫瘍組織におけるがんの病期／悪性度／状態に対するＡＸＬタンパク質発現の関連性が裏付けられることを実証する。
ｂ．ＡＸＬタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対定量及び／または絶対定量を行い、異なる治療法からの臨床転帰との相関であって、すでにこの分野で実証されているか、または、患者のコホート及びそれら患者の組織の相関研究を通して将来実証されうる相関を実証する。以前に確立された相関または将来得られる相関のどちらかがこのアッセイによって確立されると、本アッセイ方法は、最適な治療法の決定に使用できる。
ａ．ＡＸＬタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対定量及び／または絶対定量を行い、がんの分野で十分理解されている、あらかじめ特定された、患者の腫瘍組織におけるがんの病期／悪性度／状態に対するＡＸＬタンパク質発現の関連性が裏付けられることを実証する。
ｂ．ＡＸＬタンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対定量及び／または絶対定量を行い、異なる治療法からの臨床転帰との相関であって、すでにこの分野で実証されているか、または、患者のコホート及びそれら患者の組織の相関研究を通して将来実証されうる相関を実証する。以前に確立された相関または将来得られる相関のどちらかがこのアッセイによって確立されると、本アッセイ方法は、最適な治療法の決定に使用できる。
特定のＡＸＬペプチドに関する具体的な固有の特徴が、イオントラップ及び三連四重極型質量分析計の両方でのすべてのＡＸＬペプチドの分析によって明らかになった。その情報は、該ペプチドのモノアイソトピック質量、そのプリカーサーの荷電状態、該プリカーサーのｍ／ｚ値、該プリカーサーのトランジションｍ／ｚ値、及び該特定されたトランジションの各々のイオンタイプを含む。その情報は、ホルマリン固定試料／組織由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物で直接、ありとあらゆる対象のＳＲＭ／ＭＲＭペプチドについて実験的に測定されなければならない；というのは、興味深いことに、ＡＸＬタンパク質由来のすべてのペプチドが、本明細書に記載のようにＳＲＭ／ＭＲＭを用いてかかる溶解物で検出できるとは限らず、このことは、検出されないＡＸＬペプチドは、ホルマリン固定試料／組織由来のＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ溶解物で直接、ペプチド／タンパク質の定量用にＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを開発するための対象ペプチドと見なすことができないことを示しているからである。
特定のＡＸＬペプチドに特有のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、三連四重極型質量分析計で行われる。特有のＡＸＬのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイで分析される実験試料は、例えば、ホルマリン固定され、パラフィンに包埋された組織から調製されたＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅタンパク質溶解物である。かかる分析のデータは、ホルマリン固定試料中のこのＡＸＬペプチドに固有のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャーピークの存在を示す。
このペプチドに特異的なトランジションイオンの特徴は、ホルマリン固定生体試料中の特定のＡＸＬペプチドを定量的に測定するのに使用される。これらのデータは、このＡＸＬペプチドの絶対量を、分析されるタンパク質溶解物のマイクログラム当たりの該ペプチドのモル量の関数として示す。ホルマリン固定した患者由来の組織の分析に基づく組織中のＡＸＬタンパク質レベルの評価は、患者一人一人に関する診断情報、予後情報、及び治療関連情報を提供することができる。１つの実施形態において、本開示は、生体試料中のチロシンプロテインキナーゼ受容体ＵＦＯタンパク質（ＡＸＬ）のレベルの測定方法であって、当該生体試料から調製されたタンパク質消化物における１つ以上の修飾もしくは未修飾のＡＸＬフラグメントペプチドの量を質量分析法で検出及び／または定量化し；当該試料における修飾または未修飾のＡＸＬタンパク質のレベルを算出することを含み、当該レベルが相対レベルまたは絶対レベルである測定方法を記載する。関連する実施形態では、１つ以上のＡＸＬフラグメントペプチドの定量化は、生体試料中のＡＸＬフラグメントペプチドの各々の量を、添加された既知量の内部標準ペプチドとの比較によって決定することを含み、該生体試料中のＡＸＬフラグメントペプチドの各々は、同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される。いくつかの実施形態では、該内部標準は、同位体標識された内部標準ペプチドであって、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ、またはこれらの組合せから選択される１種以上の安定重同位体を含む。
本明細書に記載の生体試料中のＡＸＬタンパク質（またはその代用物としてのフラグメントペプチド）レベルの測定方法は、患者または対象のがんの診断指標として用いてもよい。１つの実施形態において、ＡＸＬタンパク質レベルの測定の結果は、組織で見られるＡＸＬタンパク質レベルと、正常及び／またはがんもしくは前がん組織で見られるそのタンパク質レベルを関連付ける（例えば、比較する）ことによって、がんの病期／重症度／状態診断を決定するために採用されうる。
核酸とタンパク質の両方が同じＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）生体分子調製物から分析できるため、病気の診断及び薬物療法の決定に関する付加的な情報を、タンパク質が分析された同じ試料の核酸から生成することが可能である。例えば、ＡＸＬタンパク質が特定の細胞によって高いレベルで発現される場合、ＳＲＭでアッセイすると、そのデータは該細胞の状態に関する情報を提供することが可能であり、それらの無制限の増殖、潜在的な薬剤耐性、及びがんの発生の可能性が獲得可能である。それと同時に、ＡＸＬ遺伝子及び／または核酸、並びにそれらがコードするタンパク質の状態に関する情報（例えば、ｍＲＮＡ分子及びそれらの発現レベルまたはスプライス変異）が、同じＬｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ（商標）生体分子調製物に存在する核酸から入手でき、ＡＸＬタンパク質のＳＲＭ分析に対して同時に評価されうる。同じ生体分子調製物に存在するＡＸＬ由来ではない任意の遺伝子及び／または核酸は、ＡＸＬタンパク質のＳＲＭ分析に対して同時に評価されうる。１つの実施形態において、ＡＸＬタンパク質及び／または１、２、３、４、またはそれ以上の追加のタンパク質に関する情報が、これらのタンパク質をコードする核酸を調べることによって評価されうる。これらの核酸は、例えば：シーケンス法、ポリメラーゼ連鎖反応法、制限断片多型分析、欠失の特定、挿入、及び／または、限定されないが一塩基対多型、トランジション、トランスバージョン、もしくはこれらの組み合わせ等の突然変異の存在の決定のうちの１つ以上、２つ以上、または３つ以上によって、調べることができる。
本発明の１つの態様によれば、以下が提供される。
（１）生体試料中のチロシンプロテインキナーゼ受容体ＵＦＯタンパク質（ＡＸＬ）のレベルの測定方法であって、前記生体試料から調製されたタンパク質消化物における１つ以上の修飾もしくは未修飾のＡＸＬフラグメントペプチドの量を質量分析法で検出及び／または定量化し；前記試料における修飾もしくは未修飾のＡＸＬタンパク質のレベルを算出することを含み、前記レベルが相対レベルまたは絶対レベルである前記方法。
（２）さらに、前記タンパク質消化物を、１つ以上の修飾もしくは未修飾のＡＸＬフラグメントペプチドの量を検出及び／または定量化する前に、分画する段階を含む、（１）に記載の方法。
（３）前記分画する段階が、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーからなる群から選択される、（２）に記載の方法。
（４）前記生体試料の前記タンパク質消化物が、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅプロトコルによって調製される、（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む、（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（６）前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含む、（５）に記載の方法。
（７）前記質量分析法が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極型質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、及び／または飛行時間型質量分析を含む、（１）から（６）のいずれかに記載の方法。
（８）使用される質量分析法の様式が、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、及び／または多重選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）である、（７）に記載の方法。
（９）前記ＡＸＬフラグメントペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０として規定されるアミノ酸配列を含む、（１）から（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記生体試料が、血液試料、尿試料、血清試料、腹水試料、喀痰試料、リンパ液、唾液試料、細胞、または固形組織である、（１）から（９）のいずれか一項に記載の方法。
（１１）前記組織がホルマリン固定組織である、（１０）に記載の方法。
（１２）前記組織がパラフィン包埋組織である、（１０）または（１１）に記載の方法。
（１３）前記組織が腫瘍から採取される、（１０）に記載の方法。
（１４）前記腫瘍が原発腫瘍である、（１３）に記載の方法。
（１５）前記腫瘍が二次性腫瘍である、（１３）に記載の方法。
（１６）さらに、修飾または未修飾ＡＸＬフラグメントペプチドを定量化することを含む、（１）から（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）前記ＡＸＬフラグメントペプチドの定量化が、１つの生体試料における、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０で示される、ＡＸＬの約８から約４５のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む１つ以上のＡＸＬフラグメントペプチドの量を、異なる別の生体試料における同じＡＸＬフラグメントペプチドの量と比較することを含む、（１６）に記載の方法。
（１８）１つ以上のＡＸＬフラグメントペプチドの定量化が、生体試料中の前記ＡＸＬフラグメントペプチドの各々の量を、添加された既知量の内部標準ペプチドとの比較によって決定すること含み、前記生体試料中の前記ＡＸＬフラグメントペプチドの各々は、同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される、（１７）に記載の方法。
（１９）前記内部標準ペプチドが、同位体標識ペプチドである、（１８）に記載の方法。
（２０）前記同位体標識内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ、またはこれらの組合せから選択される１種以上の安定重同位体を含む、（１９）に記載方法。
（２１）前記タンパク質消化物における１つ以上の修飾もしくは未修飾ＡＸＬフラグメントペプチド量の検出及び／または定量化が、修飾もしくは未修飾ＡＸＬタンパク質の存在並びに対象におけるがんとの関連を示す、（１）から（２０）のいずれかに記載の方法。
（２２）さらに、１つ以上の修飾もしくは未修飾ＡＸＬフラグメントペプチド量の前記検出及び／または定量化の結果、または前記ＡＸＬタンパク質のレベルを、前記がんの病期／重症度／状態診断に関連付けることを含む、（２１）に記載の方法。
（２３）前記がんの病期／重症度／状態診断に関する付加的な情報を提供するため、１つ以上の修飾もしくは未修飾ＡＸＬフラグメントペプチド量の前記検出及び／もしくは定量化の結果、または前記ＡＸＬタンパク質のレベルの、前記がんの病期／重症度／状態診断への関連付けが、他のタンパク質もしくは他のタンパク質由来のペプチドの量の検出及び／または定量化と多重形式で組み合わせられる、（２２）に記載の方法。
（２４）さらに、前記生体試料が採取された対象の治療法を、１つ以上のＡＸＬフラグメントペプチドの存在、欠如、もしくは量またはＡＸＬタンパク質のレベルに基づいて選択することを含む、（１）から（２３）のいずれかに記載の方法。
（２５）さらに、前記生体試料が採取された患者に対し、治療有効量の治療薬を投与することを含み、前記治療薬及び／または前記治療薬の投与量が、１つ以上の修飾もしくは未修飾ＡＸＬフラグメントペプチドの量またはＡＸＬタンパク質のレベルに基づく、（１）から（２４）のいずれかに記載の方法。
（２６）治療薬が前記ＡＸＬタンパク質と結合する、及び／またはその生物活性を阻害する、（２４）または（２５）に記載の方法。
（２７）前記治療薬が、特異的にＡＸＬ発現がん細胞を標的とするように選択される、（２６）に記載の方法。
（２８）前記生体試料が、前記Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅプロトコル及び試薬を用い、１つ以上の修飾または未修飾ＡＸＬフラグメントペプチドの量の定量化用に処理された、ホルマリン固定腫瘍組織である（１）から（２７）のいずれかに記載の方法。
（１）生体試料中のチロシンプロテインキナーゼ受容体ＵＦＯタンパク質（ＡＸＬ）のレベルの測定方法であって、前記生体試料から調製されたタンパク質消化物における１つ以上の修飾もしくは未修飾のＡＸＬフラグメントペプチドの量を質量分析法で検出及び／または定量化し；前記試料における修飾もしくは未修飾のＡＸＬタンパク質のレベルを算出することを含み、前記レベルが相対レベルまたは絶対レベルである前記方法。
（２）さらに、前記タンパク質消化物を、１つ以上の修飾もしくは未修飾のＡＸＬフラグメントペプチドの量を検出及び／または定量化する前に、分画する段階を含む、（１）に記載の方法。
（３）前記分画する段階が、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーからなる群から選択される、（２）に記載の方法。
（４）前記生体試料の前記タンパク質消化物が、Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅプロトコルによって調製される、（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む、（１）から（３）のいずれかに記載の方法。
（６）前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含む、（５）に記載の方法。
（７）前記質量分析法が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極型質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析、及び／または飛行時間型質量分析を含む、（１）から（６）のいずれかに記載の方法。
（８）使用される質量分析法の様式が、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、及び／または多重選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）である、（７）に記載の方法。
（９）前記ＡＸＬフラグメントペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０として規定されるアミノ酸配列を含む、（１）から（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記生体試料が、血液試料、尿試料、血清試料、腹水試料、喀痰試料、リンパ液、唾液試料、細胞、または固形組織である、（１）から（９）のいずれか一項に記載の方法。
（１１）前記組織がホルマリン固定組織である、（１０）に記載の方法。
（１２）前記組織がパラフィン包埋組織である、（１０）または（１１）に記載の方法。
（１３）前記組織が腫瘍から採取される、（１０）に記載の方法。
（１４）前記腫瘍が原発腫瘍である、（１３）に記載の方法。
（１５）前記腫瘍が二次性腫瘍である、（１３）に記載の方法。
（１６）さらに、修飾または未修飾ＡＸＬフラグメントペプチドを定量化することを含む、（１）から（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）前記ＡＸＬフラグメントペプチドの定量化が、１つの生体試料における、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０で示される、ＡＸＬの約８から約４５のアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む１つ以上のＡＸＬフラグメントペプチドの量を、異なる別の生体試料における同じＡＸＬフラグメントペプチドの量と比較することを含む、（１６）に記載の方法。
（１８）１つ以上のＡＸＬフラグメントペプチドの定量化が、生体試料中の前記ＡＸＬフラグメントペプチドの各々の量を、添加された既知量の内部標準ペプチドとの比較によって決定すること含み、前記生体試料中の前記ＡＸＬフラグメントペプチドの各々は、同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される、（１７）に記載の方法。
（１９）前記内部標準ペプチドが、同位体標識ペプチドである、（１８）に記載の方法。
（２０）前記同位体標識内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ、またはこれらの組合せから選択される１種以上の安定重同位体を含む、（１９）に記載方法。
（２１）前記タンパク質消化物における１つ以上の修飾もしくは未修飾ＡＸＬフラグメントペプチド量の検出及び／または定量化が、修飾もしくは未修飾ＡＸＬタンパク質の存在並びに対象におけるがんとの関連を示す、（１）から（２０）のいずれかに記載の方法。
（２２）さらに、１つ以上の修飾もしくは未修飾ＡＸＬフラグメントペプチド量の前記検出及び／または定量化の結果、または前記ＡＸＬタンパク質のレベルを、前記がんの病期／重症度／状態診断に関連付けることを含む、（２１）に記載の方法。
（２３）前記がんの病期／重症度／状態診断に関する付加的な情報を提供するため、１つ以上の修飾もしくは未修飾ＡＸＬフラグメントペプチド量の前記検出及び／もしくは定量化の結果、または前記ＡＸＬタンパク質のレベルの、前記がんの病期／重症度／状態診断への関連付けが、他のタンパク質もしくは他のタンパク質由来のペプチドの量の検出及び／または定量化と多重形式で組み合わせられる、（２２）に記載の方法。
（２４）さらに、前記生体試料が採取された対象の治療法を、１つ以上のＡＸＬフラグメントペプチドの存在、欠如、もしくは量またはＡＸＬタンパク質のレベルに基づいて選択することを含む、（１）から（２３）のいずれかに記載の方法。
（２５）さらに、前記生体試料が採取された患者に対し、治療有効量の治療薬を投与することを含み、前記治療薬及び／または前記治療薬の投与量が、１つ以上の修飾もしくは未修飾ＡＸＬフラグメントペプチドの量またはＡＸＬタンパク質のレベルに基づく、（１）から（２４）のいずれかに記載の方法。
（２６）治療薬が前記ＡＸＬタンパク質と結合する、及び／またはその生物活性を阻害する、（２４）または（２５）に記載の方法。
（２７）前記治療薬が、特異的にＡＸＬ発現がん細胞を標的とするように選択される、（２６）に記載の方法。
（２８）前記生体試料が、前記Ｌｉｑｕｉｄ Ｔｉｓｓｕｅプロトコル及び試薬を用い、１つ以上の修飾または未修飾ＡＸＬフラグメントペプチドの量の定量化用に処理された、ホルマリン固定腫瘍組織である（１）から（２７）のいずれかに記載の方法。
Claims (15)
- ホルマリン固定組織の生体試料中のチロシンプロテインキナーゼ受容体ＵＦＯタンパク質（ＡＸＬ）のレベルの測定方法であって、前記生体試料から調製されたタンパク質消化物におけるＡＸＬフラグメントペプチドの量を質量分析法で検出及び定量化し；前記試料におけるＡＸＬタンパク質のレベルを算出することを含み、前記ペプチドが、配列番号４のペプチドであり、前記レベルが相対レベルまたは絶対レベルである前記方法。
- さらに、前記タンパク質消化物を、ＡＸＬフラグメントペプチドの量を検出及び定量化する前に、分画する段階を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記分画する段階が、液体クロマトグラフィー、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
- 前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含む、請求項４に記載の方法。
- 使用される質量分析法の様式が、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、及び／または多重選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）である、請求項１に記載の方法。
- 前記組織がパラフィン包埋組織である、請求項１に記載の方法。
- 前記組織が腫瘍から採取される、請求項１に記載の方法。
- 前記ＡＸＬフラグメントペプチドの定量化が、１つの生体試料における、ＡＸＬフラグメントペプチドの量を、異なる別の生体試料における同じＡＸＬフラグメントペプチドの量と比較することを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ＡＸＬフラグメントペプチドの定量化が、生体試料中の前記ＡＸＬフラグメントペプチドの各々の量を、添加された既知量の内部標準ペプチドとの比較によって決定すること含み、前記生体試料中の前記ＡＸＬフラグメントペプチドの各々は、同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される、請求項１に記載の方法。
- 前記内部標準ペプチドが、同位体標識ペプチドである、請求項１０に記載の方法。
- 前記同位体標識内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈ、またはこれらの組合せから選択される１種以上の安定重同位体を含む、請求項１１に記載方法。
- 前記タンパク質消化物におけるＡＸＬフラグメントペプチド量の検出及び定量化が、ＡＸＬタンパク質の存在並びに対象におけるがんとの関連を示す、請求項１に記載の方法。
- さらに、ＡＸＬフラグメントペプチド量の前記検出及び定量化の結果、または前記ＡＸＬタンパク質のレベルを、前記がんの病期／重症度／状態診断に関連付けることを含む、請求項１３に記載の方法。
- 前記がんの病期／重症度／状態診断に関する付加的な情報を提供するため、ＡＸＬフラグメントペプチド量の前記検出及び定量化の結果、または前記ＡＸＬタンパク質のレベルの、前記がんの病期／重症度／状態診断への関連付けが、他のタンパク質もしくは他のタンパク質由来のペプチドの量の検出及び／または定量化と多重形式で組み合わせられる、請求項１４に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201461986688P | 2014-04-30 | 2014-04-30 | |
| US61/986,688 | 2014-04-30 | ||
| PCT/US2015/028667 WO2015168484A1 (en) | 2014-04-30 | 2015-04-30 | Srm/mrm assay for the tyrosine-protein kinase receptor ufo (axl) protein |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2017519195A JP2017519195A (ja) | 2017-07-13 |
| JP6668256B2 true JP6668256B2 (ja) | 2020-03-25 |
Family
ID=54359356
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016565214A Active JP6668256B2 (ja) | 2014-04-30 | 2015-04-30 | チロシンプロテインキナーゼ受容体ｕｆｏ（ａｘｌ）タンパク質のｓｒｍ／ｍｒｍアッセイ |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10203336B2 (ja) |
| EP (2) | EP3137631B1 (ja) |
| JP (1) | JP6668256B2 (ja) |
| KR (1) | KR20160146993A (ja) |
| CN (1) | CN106255765B (ja) |
| AU (1) | AU2015252961B2 (ja) |
| CA (1) | CA2946888A1 (ja) |
| IL (1) | IL248587A0 (ja) |
| WO (1) | WO2015168484A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3137631B1 (en) | 2014-04-30 | 2020-01-15 | Expression Pathology, Inc. | Srm/mrm assay for the tyrosine-protein kinase receptor ufo (axl) protein |
| WO2017184905A1 (en) * | 2016-04-20 | 2017-10-26 | Expression Pathology, Inc. | Method for improved hepatocellular cancer diagnosis |
| WO2021091541A1 (en) * | 2019-11-05 | 2021-05-14 | Kri Technologies Incorporated | Identifying cancer neoantigens for personalized cancer immunotherapy |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7473532B2 (en) | 2003-03-10 | 2009-01-06 | Expression Pathology, Inc. | Liquid tissue preparation from histopathologically processed biological samples, tissues and cells |
| US20090099340A1 (en) | 2007-10-12 | 2009-04-16 | Cell Signaling Technology, Inc. | Reagents for the detection of protein phosphorylation in carcinoma signaling pathways |
| US7906301B2 (en) * | 2005-05-25 | 2011-03-15 | Expression Pathology, Inc. | Multiplex method for increased proteomic coverage from histopathologically processed biological samples, tissues cells |
| US20090253156A1 (en) * | 2006-05-05 | 2009-10-08 | Perkinelmer Las, Inc. | Mass spectrometry methods for multiplexed quantification of protein kinases and phosphatases |
| WO2007140352A2 (en) * | 2006-05-26 | 2007-12-06 | Invitrogen Corporation | Plasma membrane and secreted cancer biomarkers |
| EP1961825A1 (en) * | 2007-02-26 | 2008-08-27 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale) | Method for predicting the occurrence of metastasis in breast cancer patients |
| CN102421919B (zh) * | 2009-03-13 | 2017-10-24 | 卑尔根技术交易股份公司 | 采用Axl作为上皮‑间质转化的生物标志物的方法 |
| EP2494070A2 (en) * | 2009-10-30 | 2012-09-05 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for treating cancer in patients having igf-1r inhibitor resistance |
| US20110275065A1 (en) | 2010-05-07 | 2011-11-10 | Ranju Ralhan | Methods and compositions for the diagnosis and treatment of thyroid cancer |
| WO2012083338A1 (en) | 2010-12-24 | 2012-06-28 | Map Diagnostics Pty Ltd. | Selective reaction monitoring (srm) derived protein profiles for cancer and other pathologic entities |
| EP2659267B1 (en) * | 2010-12-27 | 2019-07-24 | Expression Pathology, Inc. | C-met protein srm/mrm assay |
| JP2014532184A (ja) | 2011-10-12 | 2014-12-04 | ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒルＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ａｔ Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌ | 多重化キナーゼ阻害剤ビーズ及びその使用 |
| EP3137631B1 (en) | 2014-04-30 | 2020-01-15 | Expression Pathology, Inc. | Srm/mrm assay for the tyrosine-protein kinase receptor ufo (axl) protein |
-
2015
- 2015-04-30 EP EP15786066.9A patent/EP3137631B1/en active Active
- 2015-04-30 WO PCT/US2015/028667 patent/WO2015168484A1/en active Application Filing
- 2015-04-30 CN CN201580020711.8A patent/CN106255765B/zh active Active
- 2015-04-30 EP EP20151305.8A patent/EP3656871A1/en not_active Withdrawn
- 2015-04-30 US US15/307,753 patent/US10203336B2/en active Active
- 2015-04-30 JP JP2016565214A patent/JP6668256B2/ja active Active
- 2015-04-30 AU AU2015252961A patent/AU2015252961B2/en active Active
- 2015-04-30 CA CA2946888A patent/CA2946888A1/en not_active Withdrawn
- 2015-04-30 KR KR1020167033095A patent/KR20160146993A/ko unknown
-
2016
- 2016-10-27 IL IL248587A patent/IL248587A0/en unknown
-
2019
- 2019-02-12 US US16/273,480 patent/US10718780B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2015252961A1 (en) | 2016-10-27 |
| EP3656871A1 (en) | 2020-05-27 |
| JP2017519195A (ja) | 2017-07-13 |
| IL248587A0 (en) | 2016-12-29 |
| EP3137631B1 (en) | 2020-01-15 |
| KR20160146993A (ko) | 2016-12-21 |
| WO2015168484A8 (en) | 2016-11-10 |
| CA2946888A1 (en) | 2015-11-05 |
| US10718780B2 (en) | 2020-07-21 |
| EP3137631A4 (en) | 2017-11-15 |
| AU2015252961B2 (en) | 2018-07-19 |
| US10203336B2 (en) | 2019-02-12 |
| WO2015168484A1 (en) | 2015-11-05 |
| CN106255765B (zh) | 2020-07-21 |
| CN106255765A (zh) | 2016-12-21 |
| US20190265252A1 (en) | 2019-08-29 |
| US20170052196A1 (en) | 2017-02-23 |
| EP3137631A1 (en) | 2017-03-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10718780B2 (en) | SRM/MRM assay for the tyrosine-protein kinase receptor UFO(AXL) protein | |
| US10620184B2 (en) | SRM/MRM assay for the cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (p16) protein | |
| JP6668255B2 (ja) | アンドロゲン受容体（ａｒ）タンパク質のｓｒｍ／ｍｒｍアッセイ | |
| US20190056406A1 (en) | SRM/MRM Assay for the 6-O-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) protein | |
| JP6670290B2 (ja) | ＧＴＰアーゼＫＲａｓタンパク質（ＫＲａｓ）のためのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ | |
| JP2018517136A (ja) | 線維芽細胞増殖因子受容体２（ｆｇｆｒ２）タンパク質のためのｓｒｍ／ｍｒｍアッセイ | |
| JP6605623B2 (ja) | メソテリン（ｍｓｌｎ）タンパク質のためのｓｒｍ／ｍｒｍアッセイ | |
| JP2014528081A (ja) | 死受容体５タンパク質に対するｍｒｍ／ｓｒｍアッセイ | |
| JP2017521664A (ja) | 腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー８（ｃｄ３０）タンパク質のためのｓｒｍ／ｍｒｍアッセイ |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180427 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190201 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20190131 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190507 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190701 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190801 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200131 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200226 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6668256 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |