KR20160146993A - 티로신-단백질 키나제 수용체 ufo(axl) 단백질에 대한 srm/mrm 검정 - Google Patents

티로신-단백질 키나제 수용체 ufo(axl) 단백질에 대한 srm/mrm 검정 Download PDF

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토드 헴브로프
아델 블랙클러
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익스프레션 패톨로지, 인크.
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Abstract

현재 개시 내용은 선택 반응 모니터링(SRM) 질량 분광법, 또는 다중 반응 모니터링(MRM) 질량 분광법으로 또한 지칭될 수 있는 것의 방법에 의해 포르말린 중에 고정된 생체 시료에서 직접적으로 AXL 단백질을 정량화하는 데 특히 유리한 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질(AXL)로부터, 특정 펩타이드, 및 상기 펩타이드의 유래된 이온화 특징을 제공한다. 이와 같은 생체 시료는 화학적으로 보존되고 고정되되, 상기 생체 시료는 포르말린-고정 조직/세포, 포르말린-고정/파라핀 포매(FFPE) 조직/세포, FFPE 조직 블록 및 상기 블록 유래의 세포, 및 포르말린으로 고정 및/또는 파라핀으로 포매된 조직 배양 세포를 포함하여 작용제/정착제를 함유하는 포름알데하이드로 처리된 조직 및 세포로부터 선택된다. 단백질 시료는 리퀴드 티슈 시약 및 프로토콜을 사용하여 상기 생체 시료로부터 제조되고, AXL 단백질은 단백질 시료에서 적어도 하나 이상의 기재된 펩타이드를 정량화함으로써 SRM/MRM 질량 분광법의 방법에 의해 리퀴드 티슈 시료 중에서 정량화된다. 이들 펩타이드가 변형 또는 비변형 형태로 존재한다면, 이들 펩타이드는 정량화될 수 있다. AXL 펩타이드의 변형 형태의 예는 펩타이드 서열 내 티로신, 트레오닌, 세린, 및/또는 다른 아미노산 잔기의 인산화이다.

Description

티로신-단백질 키나제 수용체 UFO(AXL) 단백질에 대한 SRM/MRM 검정{SRM/MRM ASSAY FOR THE TYROSINE-PROTEIN KINASE RECEPTOR UFO (AXL) PROTEIN}
암은 성장 및 분열하는 세포를 사멸시키고 다양한 방법으로 작용하는 치료제의 집합으로 치료된다. 화학요법제의 일반적인 집합은 개별적으로 또는 조합으로 수십년 동안 사용되어 왔으며, 이러한 작용제의 일반적인 집합은 임상적인 종양학 실무에서 전통적이고 일상적인 암 치료법이 되어 왔다. 이러한 전통적인 화학요법제는 대부분의 암 세포의 주요 특성 중 하나인, 빠르게 분열하는 모든 세포를 사멸시킴으로써 작동한다. 그러나, 이러한 작용제는 또한 성장하는 정상 세포를 사멸시키므로, 따라서 이러한 작용제는 암 세포를 사멸시키는 것에 대한 "표적화된" 접근법인 것으로 고려되지 않는다. 최근에, 암 치료제가 암세포에 의해서만 발현되고 정상 세포에 의해서는 발현되지 않는 단백질을 특이적으로 공격하는, 암 세포를 표적화하는 다양한 그룹의 암 치료제가 개발되었다. 이러한 접근법은 암 치료법에 대하여 "표적화된" 접근법인 것으로 고려된다. 최근, 표적화된 방식으로 암 세포를 사멸시키는 것에 대한 또 다른 접근법은 면역계를 특이적으로 조절하여 암 세포를 사멸시키는 암 환자의 면역계의 그 능력을 향상시키는 것이었다.
AXL이라고 또한 지칭될 수 있는 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질을 표적화하는 치료제가 초기 임상 시험에서 장래성을 나타내었다. 그러나, 암 세포가 다량의 AXL 단백질을 발현하는 환자들만 이와 같은 AXL-표적화 치료제를 이용한 치료로부터 이익을 얻을 가능성이 있다. AXL은 정상 조직 및/또는 정상 상피 세포에서 정상적으로 발현되지 않기 때문에, 하기 방법은 AXL 신호 경로의 활성화의 관련 척도를 산출하는 정량 프로테오믹스-기반 검정을 제공한다. 특히, 상기 방법은 암 환자로부터의 포르말린 고정 조직에서 AXL을 정량화하고, 암 치료에 대한 개선된 치료 결정을 가능하게 하는 질량 분광 검정을 제공한다.
ALX라고 또한 지칭되고 그리고 본 명세서에서 ALX라고 지칭될 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 하위 서열로부터 유래한 특정 펩타이드가 제공된다. 각각의 펩타이드에 대한 펩타이드 서열 및 단편화/전이 이온은, 다중 반응 모니터링(Multiple Reaction Monitoring: MRM) 검정이라고 또한 지칭될 수 있으며 그리고 본 명세서에서 SRM/MRM이라 지칭될, 질량 분광법-기반 선택 반응 모니터링(Selected Reaction Monitoring: SRM)에서 특히 유용하다. AXL 단백질의 SRM/MRM 정량 분석을 위한 펩타이드의 사용이 기재되어 있다.
이러한 SRM/MRM 검정은 AXL 단백질로부터 특이적 펩타이드 중 하나 이상의 상대적 또는 절대적 정량 수준을 측정하고, 따라서 생체 시료로부터 얻은 주어진 단백질 제조물 중 AXL 단백질의 양을 질량 분광법에 의해 측정하는 수단을 제공하는 데 사용될 수 있다.
보다 구체적으로, SRM/MRM 검정은 환자 조직 시료, 예컨대 포르말린 고정 암 환자 조직으로부터 입수된 세포로부터 제조된 복합 단백질 용해물 시료 중에서 직접적으로 이들 펩타이드를 측정할 수 있다. 포르말린-고정 조직으로부터 단백질 시료을 제조하는 방법은 미국 특허 제7,473,532호에 기재되어 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 전체가 참조로 포함되어 있다. 미국 특허 제7,473,532호에 기재된 방법은 익스프레션 패톨로지 인코포레이티드(Expression Pathology Inc.)(미국 메릴랜드주 록빌 소재)로부터 입수가능한 리퀴드 티슈(Liquid Tissue) 시약 및 프로토콜을 사용하여 편리하게 수행될 수 있다.
암 환자 조직으로부터 가장 널리 그리고 유리하게 입수가능한 형태의 조직은 포르말린으로 고정하고, 파라핀으로 포매된 조직이다. 수술로 제거된 조직의 포름알데하이드/포르말린 고정은 단연 전세계적으로 암 조직 시료을 보존하는 가장 일반적인 방법이며, 표준 병리학 실무에 대하여 허용되는 관습이다. 포름알데하이드의 수용액은 포르말린으로 지칭된다. "100%" 포르말린은, 산화 및 중합도를 제한하는 소량의 안정화제, 보통 메탄올과 함께, 수 중 포름알데하이드의 포화 수용액(약 40부피% 또는 37질량%)으로 이루어진다. 조직이 보존되는 가장 일반적인 방법은 수성 포름알데하이드(일반적으로 10%의 중성 완충 포르말린이라 칭하여짐) 중에서 장시간(8시간 내지 48시간) 동안 전체 조직을 침지한 다음, 실온에서 장기간의 저장 동안 파라핀 왁스에 고정된 전체 조직을 포매시키는 것이다. 따라서, 포르말린 고정 암 조직을 분석하는 분자 분석 방법은 암 환자 조직의 분석을 위해 가장 많이 허용되고 아주 많이 이용되는 방법이 될 것이다.
SRM/MRM 검정 결과는 조직(생체 시료)이 수집되고 보존된 환자 또는 대상체의 특정 조직 시료(예를 들어, 암 조직 시료) 내 AXL 단백질의 정확하고 정밀한 정량 수준의 상관관계를 보이는 데 사용될 수 있다. 이는 암에 대한 진단 정보를 제공할 뿐만 아니라, 의사 또는 다른 의료 전문가가 환자에 대한 적절한 치료법을 결정하는 것을 또한 가능하게 한다. 이환된 조직 또는 다른 환자 시료에서 단백질 발현의 수준에 대한 진단상 및 치료상 중요한 정보를 제공하는 이와 같은 검정은 동반 진단 검정이라 칭하여진다. 예를 들어, 이와 같은 검정은 암의 단계 또는 정도를 진단하고 환자가 가장 많이 반응할 가능성이 있는 치료제를 결정하도록 설계될 수 있다.
본 명세서에 기재된 검정은 AXL 단백질로부터 특정한 비변형 펩타이드의 상대적 또는 절대적 수준을 측정하고, 또한 AXL 단백질로부터 특정한 변형 펩타이드의 절대적 또는 상대적 수준을 측정할 수 있다. 변형의 예는 펩타이드에 존재하는 인산화 아미노산 잔기 및 글리코실화 아미노산 잔기를 포함한다.
AXL 단백질의 상대적 정량 수준은 SRM/MRM 방법에 의해, 예를 들어 상이한 시료에서 개별적인 AXL 펩타이드의 SRM/MRM 특징 피크 영역(예를 들어, 특징 피크 영역 또는 통합된 단편 이온 강도)을 비교함으로써 결정된다. 대안적으로, 각각의 펩타이드가 자체의 특이적인 SRM/MRM 특징 피크를 가지는, 다수의 AXL 특징 펩타이드에 대한 다수의 SRM/MRM 특징 피크 영역을 하나 이상의 추가적 또는 상이한 생체 시료에서 AXL 단백질 함량과 비교하여, 하나의 생체 시료 중 상대적 AXL 단백질 함량을 결정하는 것이 가능하다. 이러한 방법으로, AXL 단백질 유래의 특정 펩타이드 또는 펩타이드들의 양, 및 따라서 AXL 단백질의 양이 동일한 실험 조건 하에서 2개 이상의 생체 시료에 걸쳐서 동일한 AXL 펩타이드, 또는 펩타이드들에 대하여 결정된다. 추가적으로, 상대적인 정량은 SRM/MRM 방법에 의해 펩타이드에 대한 특징 피크 영역을, 생체 시료 유래의 동일한 단백질 제조물 내 상이한 단백질, 또는 단백질들 유래의 또 다른 및 상이한 펩타이드, 또는 펩타이드들에 대한 특징 피크 영역과 비교함으로써 단일 시료 내 AXL 단백질 유래의 주어진 펩타이드, 또는 펩타이드들에 대하여 결정될 수 있다. 동일한 방법으로, AXL 단백질 유래의 특정 펩타이드의 양, 및 따라서 AXL 단백질의 양은 동일한 시료 내 서로에 대해 결정된다. 이러한 접근법은 시료 사이 및 시료 내에서 또 다른 펩타이드 또는 펩타이드들의 양에 대하여 AXL 단백질 유래의 개별적인 펩타이드 또는 펩타이드들을 정량화시키되, 특징 피크 영역에 의해 결정된 바와 같은 양은 생체 시료 유래의 단백질 제조물 중 AXL 펩타이드의 양을 가중하는 부피 또는 중량에 대한 절대 중량에 관계없이 서로에 대해 상대적인 것이다. 상이한 시료 사이의 개별적인 특징 피크 영역에 대한 상대적인 정량 데이터는 시료 당 분석되는 단백질의 양에 대하여 정규화된다. 상대적인 정량은, 상대적인 단백질 양, 예컨대 다른 펩타이드들/단백질들에 대한 하나의 펩타이드/단백질에 대한 이해를 얻도록 단일 시료 내에서 및/또는 많은 시료에 걸쳐서 동시에 다수의 단백질 및 AXL 단백질 유래의 많은 펩타이드에 걸쳐서 실행될 수 있다.
AXL 단백질의 절대적 정량 수준은, 예를 들어 하나의 생체 시료에서 AXL 단백질 유래의 개별적인 펩타이드의 SRM/MRM 특징 피크 영역을 고정된 내부 표준의 SRM/MRM 특징 피크 영역과 비교하는 SRM/MRM 방법에 의하여 결정된다. 일 실시형태에서, 내부 표준은 하나 이상의 중동위원소로 표지화된 하나 이상의 아미노산 잔기를 함유하는 동일하고 정확한 AXL 펩타이드의 합성 형태이다. 질량 분광법에 의해 분석될 때 표준이, 천연 AXL 펩타이드 특징 피크와 상이하고 상기 피크와 구별되며, 비교 피크로서 사용될 수 있는, 예측가능하고 일관성있는 SRM/MRM 특징 피크를 생성하도록, 이와 같은 동위원소-표지 내부 표준이 합성된다. 따라서, 내부 표준이 공지된 양으로 생물학적 시료 유래의 단백질 제조물로 고정되고 질량 분광법에 의해 분석될 때, 천연 펩타이드의 SRM/MRM 특징 피크 영역은 내부 표준 펩타이드의 SRM/MRM 특징 피크 영역과 비교되고, 이러한 수치 비교는 생체 시료 유래 원래의 단백질 제조물에 존재하는 천연 펩타이드의 절대 몰농도 및/또는 절대 중량을 나타낸다. 단편 펩타이드에 대한 절대적 정량 데이터는 시료 당 분석되는 단백질의 양에 따라서 표시된다. 절대적 정량은, 단일 시료 중 및/또는 많은 시료에 걸쳐서 많은 펩타이드, 따라서 단백질에 걸쳐서 동시에 실행되어, 개별적인 생체 시료 및 개별적인 시료의 전체 코호트 중 절대적 단백질 양에 대한 이해를 얻을 수 있다.
SRM/MRM 검정 방법은, 예를 들어 환자-유래 조직, 예컨대 포르말린 고정 조직에서 직접적으로, 암의 단계의 진단을 돕고, 치료제가 환자를 치료함에 있어서 사용하기에 가장 유리할 것인지 여부를 결정하는 것에 도움을 주는 데 사용될 수 있다. 예컨대 부분 또는 전체 종양의 치료적 제거를 위한 수술을 통해 또는 의심되는 질환의 존재 또는 부재를 결정하는 데 수행되는 생검 절차를 통해 환자로부터 제거되는 암 조직은, 특정 단백질, 또는 단백질들, 및 어떠한 형태의 단백질들이 환자 조직에 존재하는지 여부를 결정하기 위해 분석된다. 게다가, 단백질, 또는 다수 단백질의 발현 수준이 결정되어 건강한 조직에서 발견되는 "정상" 또는 참조 수준과 비교될 수 있다. 건강한 조직에서 발견되는 단백질의 정상 또는 참조 수준은, 예를 들어 암을 가지지 않는 하나 이상의 개체의 관련 조직으로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 정상 또는 참조 수준은 암에 의해 영향을 받지 않은 관련 조직의 분석에 의해 암을 지니는 개체에 대하여 얻어질 수 있다. 단백질 수준(예를 들어, AXL 수준)의 검정은 또한 AXL 수준을 이용함으로써 암으로 진단된 환자 또는 대상체에서 암의 단계를 진단하는 데 사용될 수 있다. 개별적인 AXL 펩타이드의 수준은 분석되는 단백질 용해물의 전체 양 당 SRM/MRM 검정에 의해 결정되는 펩타이드의 몰량으로 정의된다. 따라서 AXL에 관한 정보는 AXL 단백질(또는 AXL 단백질의 단편 펩타이드)의 수준을 정상 조직에서 관찰되는 수준과의 상관관계를 보임으로써 암의 단계 또는 등급을 결정하는 데 있어서 도움을 주는 데 사용될 수 있다. 일단 AXL 단백질의 정량적인 양이 암 세포에서 결정되면, 상기 정보는, 예를 들어 검정된 단백질 또는 단백질(들)(예를 들어, AXL)의 비정상적인 발현에 의해 특징지어지는 암 조직을 특이적으로 치료하도록 개발된 치료제(화학적 및 생물학적)의 목록과 일치될 수 있다. AXL 단백질 검정으로부터의 정보를, 예를 들어 AXL 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 세포/조직을 특이적으로 표적화하는 치료제의 목록에 일치시키는 것은, 질환의 치료에 대한 개인화된 의학 접근법으로 칭하여진 것을 정의한다. 본 명세서에 기재된 검정 방법은 진단 및 치료 결정을 위한 공급원으로서 환자 자신의 조직으로부터의 단백질의 분석을 사용함으로써 개인화된 의학 접근법의 기초를 형성한다.
도 1(A 내지 C)은 삼중 사극자 질량 분광계 상에서 수행된 AXL 펩타이드의 정량화를 이용하여 양성 대조군 시료(포르말린으로 고정되지 않음) 및 포르말린 고정된 생체 시료로부터의 리퀴드 티슈 용해물에 대하여 실행된 AXL 단백질로부터의 단일 펩타이드의 SRM/MRM 검정의 결과. SRM/MRM 방법을 사용하여 포르말린에 고정된 생체 시료 중 이러한 펩타이드를 측정하는 데 사용된 전구체 및 전이 이온에 대한 특이적인 특징이 표시되어 있다.
원칙적으로, 예를 들어 공지된 특이성의 프로테아제(예를 들어, 트립신)로 분해시킴으로써 제조된, AXL 단백질로부터 유래된 임의의 예측된 펩타이드가, 질량 분광법-기반 SRM/MRM 검정을 사용하여 시료 중 AXL 단백질의 풍부도를 결정하는 데 대용 리포터로 사용될 수 있다. 유사하게, AXL 단백질에서 잠재적으로 변형된 것으로 공지된 부위에서 아미노산 잔기를 함유하는 임의의 예측된 펩타이드 서열은 또한 잠재적으로 시료 중 AXL 단백질의 변형 정도를 검정하는 데 사용될 수 있었다.
AXL 단편 펩타이드는 미국 특허 7,473,532에 제공된 리퀴드 티슈 프로토콜의 사용에 의한 것을 포함하여 다양한 수단에 의해 생성될 수 있다. 리퀴드 티슈 프로토콜 및 시약은 조직/생체 시료 중 단백질의 단백질 가수분해에 의한 분해에 의해 포르말린으로 고정되고 파라핀으로 포매된 조직으로부터 질량 분광 분석에 적합한 펩타이드 시료을 생성할 수 있다. 리퀴드 티슈 프로토콜에서, 조직/생체 시료는 장기간 동안 완충액 중에서 역 또는 방출 단백질 가교까지 가열된다(예를 들어, 약 10분 내지 약 4시간의 기간 동안 약 80℃ 내지 약 100℃). 이용되는 완충액은 중성 완충액(예를 들어, 트리스-기반 완충액, 또는 세제를 함유하는 완충액)이다. 열 처리 후, 조직/생체 시료는, 트립신, 키모트립신, 펩신, 및 엔도프로테이나제 Lys-C를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 프로테아제로 상기 생체 시료의 조직 및 세포 구조를 파괴시키고 상기 시료를 액화시키는 데 충분한 시간(예컨대, 37 내지 65℃의 온도에서 30분 내지 24시간의 기간) 동안 처리된다. 가열 및 단백질 분해의 결과는 액체인 가용성의 희석가능한 생체분자 용해물이다.
놀랍게도, AXL 단백질로부터의 많은 잠재적인 펩타이드 서열이 즉시 눈에 띄지 않는 이유로 질량 분광-기반 SRM/MRM 검정에 사용하는 데 적합하지 않거나 효과적이지 않음이 발견되었다. MRM/SRM 검정에 가장 적합한 펩타이드인 것으로 예측하는 것이 가능하지 않았으므로, AXL 단백질을 위하여 믿을 수 있고 정확한 SRM/MRM 검정을 개발하기 위해 실제 리퀴드 티슈 용해물에서 변형 및 비변형 펩타이드를 실험적으로 식별하는 것이 필요하였다. 임의의 이론에 의해 구속받고자 하는 것은 아니지만, 일부 펩타이드는, 예를 들어 다른 단백질과 구별되는 잔편을 잘 이온화하거나 생성하지 않기 때문에 질량 분광에 의해 검출하는 것이 어려울 수 있는 것으로 여겨진다. 펩타이드는 또한 분리(예를 들어, 액체 크로마토그래피)에서 잘 분리되지 않을 수 있거나, 또는 유리 또는 플라스틱 제품에 부착할 수 있다.
본 개시 내용의 다양한 실시형태에서 발견된 AXL 펩타이드(예를 들어, 표 1 및 표 2)는 포르말린 고정 암 조직으로부터 생성된 세포로부터 제조된 복합 리퀴드 티슈 용해물 내에서 모든 단백질의 프로테아제 분해에 의해 AXL 단백질로부터 유래되었다. 달리 언급되어 있지 않다면, 각각의 예에서 프로테아제는 트립신이었다. 그 다음 리퀴드 티슈 용해물은 질량 분광법에 의해 분석되어 질량 분광법에 의해 검출되고 분석되는 AXL 단백질로부터 유래된 펩타이드를 결정하였다. 질량-분광 분석에 대한 펩타이드의 특이적인 바람직한 하위세트의 식별은, 1) 리퀴드 티슈 용해물의 질량 분광 분석에서 단백질 유래의 펩타이드 또는 펩타이드들이 이온화하는 실험 결정, 및 2) 리퀴드 티슈 용해물을 제조함에 있어서 사용된 프로토콜 및 실험 조건을 견디는 펩타이드의 능력을 기반으로 한다. 이러한 후자의 특성은 펩타이드의 아미노산 서열로뿐만 아니라, 시료 제조 동안 변형된 형태로 견디는 펩타이드 내 변형된 아미노산 잔기의 능력으로도 연장된다.
포르말린(포름알데하이드) 고정 조직으로부터 직접적으로 생성된 세포로부터의 단백질 용해물은, 조직 현미해부를 통하여 시료 튜브로 세포를 수집한 다음, 장시간 동안 리퀴드 티슈 완충액에서 세포를 가열하는 것을 수반하는 리퀴드 티슈 시약 및 프로토콜을 사용하여 제조되었다. 일단 포르말린-유도 가교가 부정적으로 영향을 받으면, 그 다음 조직/세포는, 예를 들어 프로테아제 트립신을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 것으로서, 프로테아제를 사용하여 예측가능한 방식으로 완전히 분해된다. 각각의 단백질 용해물은 프로테아제를 이용한 본래 폴리펩타이드의 분해에 의해 펩타이드의 수집물로 된다. 각각의 리퀴드 티슈 용해물을 (예를 들어, 이온 트랩 질량 분광법에 의해) 분석하여, 데이터가 각각의 단백질 용해물에 존재하는 모든 세포 단백질로부터 질량 분광법에 의해 식별될 수 있는 만큼 많은 펩타이드의 식별으로서 제시된, 펩타이드의 다수의 전체 프로테오믹 조사를 실행하였다. 단일 복합 단백질/펩타이드 용해물로부터 가능한 한 많은 펩타이드의 식별을 위하여 전체 프로파일링을 실행할 수 있는 이온 트랩 질량 분광계 또는 질량 분광계의 다른 형태가 전형적으로 이용된다. 그러나, 이온 트랩 질량 분광계는 펩타이드의 전체 프로파일링을 수행하기 위한 질량 분광계의 최선의 유형일 수 있다. SRM/MRM 검정은 MALDI, 이온 트랩, 또는 삼중 사극자를 포함하여, 질량 분광계의 임의의 유형 상에서 전개되고 실행될 수 있지만, SRM/MRM 검정에 대한 가장 유리한 기기 플랫폼이 종종 삼중 사극자 기기 플랫폼인 것으로 고려된다.
일단 이용되는 조건 하에서 가능한 한 많은 펩타이드가 단일 용해물의 단일 MS 분석으로 식별되면, 펩타이드의 목록은 수집되어 용해물에서 검출된 단백질을 결정하는 데 사용되었다. 다수의 리퀴드 티슈 용해물에 대하여 공정을 반복하고, 펩타이드의 매우 큰 목록은 단일 데이터세트로 수집되었다. 데이터세트의 유형은 (프로테아제 분해 후) 분석된 생체 시료의 유형, 및 특이적으로 생체 시료의 리퀴드 티슈 용해물에서 검출될 수 있는 펩타이드를 나타내는 것으로 고려될 수 있으며, 따라서 예를 들어 AXL 단백질과 같은 특이적인 단백질에 대한 펩타이드를 포함한다.
일 실시형태에서, AXL 단백질의 절대적 또는 상대적 양의 결정에 유용한 것으로 확인된 AXL 트립신 펩타이드는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9 및 서열 번호 10의 펩타이드 중 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상, 또는 넷 이상을 포함하며, 이의 각각은 표 1에 열거되어 있다. 포르말린으로 고정되고, 파라핀으로 포매된 조직으로부터 제조된 리퀴드 티슈 용해물에서 이들 펩타이드의 각각은 질량 분광법에 의해 검출되었다. 따라서, 각각의 펩타이드는, 포르말린 고정 환자 조직에서 직접적인 것을 포함하여, 인간 생체 시료에서 AXL 단백질에 대한 정량적 SRM/MRM 검정을 전개하는 데 사용하기 위한 후보이다.
Figure pct00001
표 1에 열거된 AXL 트립신 펩타이드는, 폐, 결장, 및 유방을 포함하여 상이한 인간 기관의 다수의 상이한 포르말린 고정 조직의 다수의 리퀴드 티슈 용해물로부터 검출된 것을 포함한다. 이들 펩타이드의 각각은 포르말린으로 고정된 조직 중 AXL 단백질의 정량적 SRM/MRM 검정에 유용한 것으로 고려된다. 이들 실험의 추가 데이터 분석은 임의의 특이적 기관 부위로부터 임의의 특이적 펩타이드에 대하여 바람직한 것이 관찰되지 않은 것으로 나타났다. 따라서, 이들 펩타이드의 각각은 임의의 생체 시료 또는 신체 내 임의의 기관 부위에서 비롯한 임의의 포르말린 고정 조직으로부터 리퀴드 티슈 용해물에 대하여 AXL 단백질의 SRM/MRM 검정을 수행하는 데 적합한 것으로 여겨진다.
SRM/MRM 검정을 수행할 때 중요한 고려 사항은 펩타이드의 분석에서 이용될 수 있는 기기의 유형이다. SRM/MRM 검정이 MALDI, 이온 트랩, 또는 삼중 사극자를 포함하여, 질량 분광계의 임의의 유형 상에서 전개되고 실행될 수 있지만, SRM/MRM 검정에 대한 가장 유리한 기기 플랫폼이 종종 삼중 사극자 기기 플랫폼인 것으로 고려된다. 질량 분광계의 유형은 세포 내에 함유된 모든 단백질로부터 수십만 내지 수백만의 개별적인 펩타이드로 이루어질 수 있는 매우 복잡한 단백질 용해물 내 단일의 분리된 표적 펩타이드를 분석하는 데 가장 적합한 기기인 것으로 고려될 수 있다.
AXL 단백질로부터 유래된 각각의 펩타이드에 대한 SRM/MRM 검정을 가장 효율적으로 구현하기 위하여, 분석에서 펩타이드 서열에 추가적으로 정보를 이용하는 것이 바람직하다. 추가적인 정보는 질량 분광계(예를 들어, 삼중 가극자 질량 분광계)를 안내하고 지시하는 것에서 사용되어 특이적인 표적화된 펩타이드(들)의 올바르고 집중된 분석을 수행할 수 있어, 검정은 효과적으로 실행될 수 있다.
일반적으로 표적 펩타이드 및 특이적인 AXL 펩타이드에 대한 추가적인 정보는 펩타이드의 단일 동위원소 질량, 펩타이드의 전구체 하전 상태, 전구체 m/z 값, m/z 전이 이온, 및 각각의 전이 이온의 이온 유형 중 하나 이상을 포함할 수 있다. AXL 단백질에 대한 SRM/MRM 검정을 전개하는 데 사용될 수 있는 추가적인 펩타이드 정보는 표 1의 목록으로부터 AXL 펩타이드의 세가지(3)에 대한 예에 의해 나타내어지며, 표 2에 기재되어 있다. 표 2에 예에 의해 나타낸 세가지(3) AXL 펩타이드에 대하여 기재된 유사한 추가적인 정보는 제조되고, 얻어지며, 표 1에 포함된 다른 펩타이드의 분석에 적용될 수 있다.
Figure pct00002
하기 기재된 방법은, 1) AXL 단백질에 대한 질량 분광법-기반 SRM/MRM 검정에 사용될 수 있는 AXL 단백질로부터 후보 펩타이드를 식별하고, 2) 상관관계를 보이기 위하여 AXL 단백질로부터 표적 펩타이드에 대하여 개별적인 SRM/MRM 검정, 또는 검정들을 전개하며, 3) 최적 치료법의 암 진단 및/또는 선택에 정량적인 검정을 적용하는 데 사용되었다.
검정 방법
1. AXL 단백질에 대한 SRM/MRM 후보 단편 펩타이드의 식별
a. 단백질을 분해하는 프로테아제 또는 프로테아제들(트립신을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있음)을 사용하여 포르말린 고정 생체 시료로부터 리퀴드 티슈 단백질 용해물을 제조
b. 이온 트랩 탠덤 질량 분광계 상에서 리퀴드 티슈 용해물 중 모든 단백질 단편을 분석하고, AXL 단백질로부터 모든 단편 펩타이드를 식별(여기서, 개별적인 단편 펩타이드는 인산화 또는 글리코실화와 같은 임의의 펩타이드 변형을 포함하지 않음)
c. 이온 트랩 탠덤 질량 분광계 상에서 리퀴드 티슈 용해물 중 모든 단백질 단편을 분석하고, 예를 들어 인산화 또는 글리코실화 잔기와 같은 펩타이드 변형을 가지는 AXL 단백질로부터 모든 단편 펩타이드를 식별
d. 전체의, 전장 AXL 단백질로부터 특이적인 분해 방법에 의해 생성되는 모든 펩타이드가 측정될 수 있지만, SRM/MRM 검정의 전개에 사용되는 바람직한 펩타이드는 포르말린 고정 생체 시료로부터 제조된 복잡한 리퀴드 티슈 단백질 용해물에서 질량 분광에 의해 직접적으로 식별되는 것임
e. 포르말린 고정 생체 시료로부터 리퀴드 티슈 용해물을 분석할 때 환자 조직에서 특이적으로 변형(인산화, 글리코실화 등)되고 이온화하며, 따라서 질량 분광계에서 검출되는 펩타이드가 AXL 단백질의 펩타이드 변형을 분석하기 위한 후보 펩타이드로서 식별됨
2. AXL 단백질로부터 단편 펩타이드에 대한 질량 분광 검정
a. 리퀴드 티슈 용해물에서 식별되는 개별적인 단편 펩타이드에 대한 삼중 사극자 질량 분광계 상에서의 SRM/MRM 검정은 AXL 단백질 유래 펩타이드에 적용됨
i. 겔 전기영동, 액체 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 나노-역상 액체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 또는 역상 고성능 액체 크로마토그래피를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 최적의 크로마토그래피 조건을 위한 단편 펩타이드에 대한 최적의 체류 시간 결정
ii. 각각의 펩타이드에 대한 SRM/MRM 검정을 전개시키기 위하여, 펩타이드의 단일 동위원소 질량, 각각의 펩타이드에 대한 전구체 하전 상태, 각각의 펩타이드에 대한 전구체 m/z 값, 각각의 펩타이드에 대한 m/z 전이 이온, 및 각각의 단편 펩타이드에 대한 각각의 전이 이온의 이온 유형을 결정
iii. 그 다음 SRM/MRM 검정은 삼중 사극자 질량 분광계 상에서 실행된 바와 같은 독특한 SRM/MRM 검정을 정확하게 한정하는 각각의 펩타이드가 특징적이고 독특한 SRM/MRM 특징 피크를 가지는 삼중 사극자 질량 분광계 상에서 (i) 및 (ii)로부터의 정보를 사용하여 수행될 수 있음
b. SRM/MRM 질량 분광계 분석으로부터 독특한 SRM/MRM 특징 피크 영역에 따라서, 검출되는 AXL 단백질의 단편 펩타이드의 양이 특정 단백질 용해물 중 단백질의 상대적 및 절대적 양 둘 다를 나타낼 수 있도록 SRM/MRM 분석을 실행
i. 다음에 의해 달성될 수 있는 상대적 정량화:
1. 하나의 포르말린 고정 생체 시료로부터 리퀴드 티슈 용해물에서 검출되는 주어진 AXL 펩타이드로부터의 SRM/MRM 특징 피크 영역을, 적어도 제2, 제3, 제4 이상의 포르말린 고정 생체 시료로부터의 적어도 제2, 제3, 제4 이상의 리퀴드 티슈 용해물에서 동일한 AXL 단편 펩타이드의 동일한 SRM/MRM 특징 피크 영역과 비교함으로써 AXL 단백질의 증가 또는 감소된 존재를 결정
2. 하나의 포르말린 고정 생체 시료로부터 리퀴드 티슈 용해물에서 검출되는 주어진 AXL 펩타이드로부터의 SRM/MRM 특징 피크 영역을, 상이한 그리고 별개의 생물학적 공급원으로부터 유래된 다른 시료에서 다른 단백질로부터의 단편 단백질로부터 전개된 SRM/MRM 특징 피크 영역과 비교함으로써 AXL 단백질의 증가 또는 감소된 존재를 결정(여기서, 펩타이드 단편에 대한 2개의 시료 사이의 SRM/MRM 특징 피크 영역 비교는 각각의 시료에서 분석된 단백질의 양에 대하여 정규화됨).
3. 다양한 세포 조건 하에서 AXL 단백질의 수준 변경을 발현의 수준을 변경시키지 않는 다른 단백질의 수준에 대하여 정규화하도록 주어진 AXL 펩타이드에 대한 SRM/MRM 특징 피크 영역을, 포르말린 고정 생체 시료로부터의 동일한 리퀴드 티슈 용해물 내 상이한 단백질로부터 유래한 다른 단편 펩타이드로부터의 SRM/MRM 특징 피크 영역과 비교함으로써 AXL 단백질의 증가 또는 감소된 존재를 결정.
4. 이러한 검정은 AXL 단백질의 비변형 단편 펩타이드 및 변형 단편 펩타이드 둘 다에 적용할 수 있음(여기서, 변형은 인산화 및/또는 글리코실화를 포함하지만 이로 제한되지 않으며, 변형 펩타이드의 상대적 수준은 비변형 펩타이드의 상대적 양을 결정하는 것과 동일한 방식으로 결정됨).
ii. 주어진 펩타이드의 절대적 정량화는 개별적인 생체 시료 중 AXL 단백질로부터 주어진 단편 펩타이드에 대한 SRM/MRM 특징 피크 영역을, 생체 시료로부터 단백질 용해물로 고정된 내부 단편 펩타이드 표준의 SRM/MRM 특징 피크 영역과 비교함으로써 달성될 수 있음
1. 내부 표준은 조사 중인 AXL 단백질로부터 단편 펩타이드의 표지화된 합성 형태임. 이러한 표준은 공지된 양으로 시료로 고정되고, SRM/MRM 특징 피크 영역은 내부 단편 펩타이드 표준 및 생체 시료 중 천연 단편 펩타이드 둘 다에 대하여 개별적으로 결정된 다음, 피크 영역 둘 다를 비교할 수 있음.
2. 이는 비변형 단편 펩타이드 및 변형 단편 펩타이드에 적용될 수 있음(여기서, 변형은 인산화 및/또는 글리코실화를 포함하지만, 이로 제한되지 않으며, 변형 펩타이드의 절대 수준은 비변형 펩타이드의 절대 수준을 결정하는 것과 동일한 방식으로 결정됨).
3. 암 진단 및 치료에 단편 펩타이드 정량화의 적용
a. AXL 단백질의 단편 펩타이드 수준의 상대적 및/또는 절대적 정량화를 실행하고, 암의 분야에서 잘 이해되는 바와 같이, 환자 종양 조직에서 암의 단계/등급/상태에 대한 AXL 단백질 발현의 앞서 결정된 연관성을 확인하는 것을 입증
b. AXL 단백질의 단편 펩타이드 수준의 상대적 및/또는 절대적 정량화를 실행하고 상이한 처리 전략으로부터의 임상 결과와의 상관관계를 입증하되, 이러한 상관관계는 이미 업계에서 입증되었거나 환자의 코호트 및 환자로부터의 조직에 걸쳐 상관관계 연구를 통해 장래에 입증될 수 있음. 일단 앞서 확립된 상관관계 또는 장래에 유래된 상관관계는 이러한 검정에 의해 확인된 다음, 검정 방법은 최적의 처리 전략을 결정하는 데 사용될 수 있음
특이적 AXL 펩타이드에 대한 특이적 및 독특한 특징은 이온 트랩 및 삼중 사극자 질량 분광계 둘 다에서 모든 AXL 펩타이드의 분석에 의해 전개되었다. 정보는 펩타이드의 단일 동위원소 질량, 상기 펩타이드의 전구체 하전 상태, 전구체 m/z 값, 전구체의 전이 m/z 값, 및 식별된 전이의 각각의 이온 유형을 포함한다. 정보는 각각 및 모든 후보 SRM/MRM 펩타이드에 대하여 포르말린 고정 시료/조직으로부터 리퀴드 티슈 용해물에서 직접적으로 실험으로 결정되어야 하는데; 이는 흥미롭게도 AXL 단백질 유래의 모든 펩타이드가 본 명세서에 기재된 바와 같은 SRM/MRM을 사용하여 이와 같은 용해물에서 검출될 수 있기 때문이며, 이는 검출되지 않은 AXL 펩타이드가 포르말린 고정 시료/조직으로부터 리퀴드 티슈 용해물에서 직접적으로 펩타이드/단백질을 정량화하는 데 사용하기 위하여 SRM/MRM 검정을 전개하기 위하여 후보 펩타이드로 고려될 수 없음을 나타낸다.
특이적 AXL 단백질에 대한 특정 SRM/MRM 검정은 삼중 사극자 질량 분광계 상에서 실행된다. 특정 AXL SRM/MRM 검정에 의해 분석되는 실험 시료는, 예를 들어 포르말린으로 고정되고 파라핀으로 포매된 조직으로부터 제조된 리퀴드 티슈 단백질 용해물이다. 이러한 검정으로부터의 데이터는, 포르말린 고정 시료에서 이러한 AXL 펩타이드에 대한 독특한 SRM/MRM 특징 피크의 존재를 나타낸다.
이 펩타이드에 대한 특이적 전이 이온 특징은 포르말린 고정 생체 시료에서 특정 AXL 펩타이드를 정량적으로 측정하는 데 사용된다. 이들 데이터는 분석된 단백질 용해물의 마이크로그램 당 펩타이드의 몰량에 따라서 이러한 AXL 펩타이드의 절대적 양을 나타낸다. 포르말린 고정 환자-유래 조직의 분석에 기초한 조직에서 AXL 단백질 수준의 평가는 각각의 특정 환자에 대한 진단, 예후, 및 치료-관련 정보를 제공할 수 있다. 일 실시형태에서, 이러한 개시 내용은, 질량 분광법을 사용하여 생체 시료로부터 제조된 단백질 소화물(digest) 중 하나 이상의 변형 또는 비변형 AXL 단편 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량화하는 단계; 및 상기 시료 중 변형 또는 비변형 AXL 단백질의 수준을 산정하는 단계를 포함하는, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질(AXL)의 수준을 측정하는 방법을 기재하되; 상기 수준은 상대적 수준 또는 절대적 수준이다. 관련 실시형태에서, 하나 이상의 AXL 단편 펩타이드를 정량화하는 것은, 공지된 양의 첨가된 내부 표준 펩타이드와의 비교에 의해 생물학적 시료 중 AXL 단편 펩타이드의 각각의 양을 결정하는 단계를 포함하되, 생체 시료 중 AXL 단편 펩타이드의 각각은 동일한 아미노산 서열을 가지는 내부 표준 펩타이드와 비교된다. 일부 실시형태에서, 동위원소로 표지된 내부 표준 펩타이드의 내부 표준은 18O, 17O, 34S, 15N, 13C, 2H 또는 이의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 안정적인 중동위원소를 포함한다.
본 명세서에 기재된 생체 시료 중 AXL 단백질(또는 이의 대용물로서 단편 펩타이드)의 수준을 측정하는 방법은 환자 또는 대상체에서 암의 진단 지표로서 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, AXL 단백질의 수준의 측정으로부터의 결과는 조직에서 발견되는 AXL 단백질의 수준을, 정상 및/또는 암 또는 전암 조직에서 발견되는 단백질의 수준과의 상관관계를 보임으로써(예를 들어, 비교함으로써) 암의 진단 단계/등급/상태를 결정하는 데 이용될 수 있다.
핵산 및 단백질 둘 다 동일한 리퀴드 티슈(상표명) 생체분자 제조물로부터 분석될 수 있으므로, 단백질이 분석될 때 동일한 시료 중 핵산으로부터 질환 진단 및 약물 치료 결정에 대한 추가적인 정보를 생성하는 것이 가능하다. 예를 들어, AXL 단백질이 증가된 수준으로 특정 세포에 의해 발현된다면, SRM에 의해 검정될 때 데이터는 세포의 상태 및 비제어 성장에 대한 세포 잠재력에 대한 정보를 제공할 수 있고, 암의 잠재적인 약물 저항성 및 개발이 얻어질 수 있다. 동시에, AXL 유전자의 상태 및/또는 유전자가 암호화하는 핵산 및 단백질에 대한 정보(예를 들어, mRNA 분자 및 이들의 발현 수준 또는 스플라이스 변화)는 동일한 리퀴드 티슈(상표명) 생체분자 제조물에 존재하는 핵산으로부터 얻어질 수 있고, AXL 단백질의 SRM 검정에 대하여 동시에 평가될 수 있다. AXL 및 동일한 생체분자 제조물에 존재하는 것으로부터의 유래가 아닌 임의의 유전자 및/또는 핵산은 AXL 단백질의 SRM 분석에 대하여 동시에 평가될 수 있다. 일 실시형태에서, AXL 단백질 및/또는 하나, 둘, 셋, 넷 이상의 추가적인 단백질에 대한 정보가 이들 단백질을 암호화하는 핵산을 조사함으로써 평가될 수 있다. 핵산은, 예를 들어 서열결정 방법, 중합효소 연쇄 반응 방법, 제한 단편 다형성 분석, 결실, 삽입의 식별 및/또는, 단일 염기쌍 다형성, 전이, 전환, 또는 이의 조합을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 돌연변이의 존재의 결정 중 하나 이상, 둘 이상, 또는 셋 이상에 의해 조사될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> EXPRESSION PATHOLOGY, INC. <120> SRM/MRM ASSAY FOR THE TYROSINE-PROTEIN KINASE RECEPTOR UFO (AXL) PROTEIN <130> 001152-8036.WO00 <150> 61/986,688 <151> 2014-04-30 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Leu Thr Gly Thr Leu Arg 1 5 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr Ala Thr Ile Thr Val Leu Pro Gln Gln Pro Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Leu Gly Ser Leu His Pro His Thr Pro Tyr His Ile Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Pro Leu Gln Gly Thr Leu Leu Gly Tyr Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Tyr Gly Glu Val Phe Glu Pro Thr Val Glu Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Thr Thr Glu Ala Thr Leu Asn Ser Leu Gly Ile Ser Glu Glu Leu Lys 1 5 10 15 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 His Gly Asp Leu His Ser Phe Leu Leu Tyr Ser Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ile Tyr Asn Gly Asp Tyr Tyr Arg 1 5 <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Gln Thr Pro Tyr Pro Gly Val Glu Asn Ser Glu Leu Tyr Asp Tyr 1 5 10 15 Leu Arg <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Glu Asp Leu Glu Asn Thr Leu Lys 1 5

Claims (28)

  1. 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질(AXL)의 수준을 측정하는 방법으로서,
    질량 분광법을 사용하여 상기 생체 시료로부터 제조된 단백질 소화물(digest) 중 하나 이상의 변형 또는 비변형 AXL 단편 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량화하는 단계; 및 상기 시료 중 변형 또는 비변형 AXL 단백질의 수준을 산정하는 단계를 포함하되;
    상기 수준은 상대적 수준 또는 절대적 수준인, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 변형 또는 비변형 AXL 단편 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량화하는 단계 전에 상기 단백질 소화물을 분별하는 단계를 추가로 포함하는, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 분별 단계는 겔 전기영동, 액체 크로마토그래피, 모세관 전기영동, 나노-역상 액체 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피, 또는 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 시료의 상기 단백질 소화물은 리퀴드 티슈(Liquid Tissue) 프로토콜에 의해 제조되는, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 소화물은 프로테아제 소화물을 포함하는, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단백질 소화물은 트립신 소화물을 포함하는, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질량 분광법은 탠덤 질량 분광법, 이온 트랩 질량 분광법, 삼중 사극자 질량 분광법, MALDI-TOF 질량 분광법, MALDI 질량 분광법, 및/또는 비행시간 질량 분광법을 포함하는, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 사용되는 질량 분광법의 방식은 선택 반응 모니터링(SRM), 다중 반응 모니터링(MRM), 및/또는 다중 선택 반응 모니터링(mSRM)인, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AXL 단편 펩타이드는 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9 및 서열 번호 10으로서 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  10. 제0항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 시료는 혈액 시료, 소변 시료, 혈청 시료, 복수 시료, 가래 시료, 림프액, 타액 시료, 세포, 또는 고체 조직인, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 조직은 포르말린 고정 조직인, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 조직은 파라핀 포매 조직인, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 조직은 종양으로부터 얻어진, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 종양은 원발성 종양인, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 종양은 2차 종양인, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  16. 제0항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 변형 또는 비변형 AXL 단편 펩타이드를 정량화하는 단계를 추가로 포함하는, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 AXL 단편 펩타이드를 정량화하는 단계는 하나의 생체 시료에서 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9 및 서열 번호 10에 나타낸 바와 같은 AXL의 약 8 내지 약 45개의 아미노산 잔기의 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 AXL 단편 펩타이드의 양을, 상이한 그리고 별개의 생체 시료 중 동일한 AXL 단편 펩타이드의 양과 비교하는 단계를 포함하는, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 하나 이상의 AXL 단편 펩타이드를 정량화하는 단계는 공지된 양의 첨가된 내부 표준 펩타이드와 비교함으로써 생체 시료 중 상기 AXL 단편 펩타이드의 각각의 양을 결정하는 단계를 포함하되, 상기 생체 시료 중 상기 AXL 단편 펩타이드의 각각은 동일한 아미노산 서열을 가지는 내부 표준 펩타이드와 비교되는, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 내부 표준 펩타이드는 동위원소로 표지된 펩타이드인, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 동위원소 표지 내부 표준 펩타이드는 18O, 17O, 34S, 15N, 13C, 2H 또는 이의 조합으로부터 선택되는 하나 이상의 안정적인 중동위원소를 포함하는, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 소화물 중 하나 이상의 변형 또는 비변형 AXL 단편 펩타이드의 양을 검출 및/또는 정량화하는 단계는 상기 대상체에서 변형 또는 비변형 AXL 단백질의 존재 및 암과의 연관성을 나타내는, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 하나 이상의 변형 또는 비변형 AXL 단편 펩타이드의 양, 또는 상기 암의 진단 단계/등급/상태에 대한 상기 AXL 단백질의 수준을 검출 및/또는 정량화하는 것의 결과의 상관관계를 보이는 단계를 추가로 포함하는, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 하나 이상의 변형 또는 비변형 AXL 단편 펩타이드의 양, 또는 상기 암의 진단 단계/등급/상태에 대한 상기 AXL 단백질의 수준을 검출 및/또는 정량화하는 것의 결과의 상관관계를 보이는 단계는 복합 포맷으로 다른 단백질로부터의 다른 단백질 또는 단백질들의 양을 검출 및/또는 정량화하는 것과 조합되어 상기 암의 진단 단계/등급/상태에 관한 추가적인 정보를 제공하는, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 시료가 얻어지는 대상체에 대하여 하나 이상의 AXL 단편 펩타이드의 존재, 부재, 또는 양 또는 AXL 단백질의 수준에 기반한 치료를 선택하는 단계를 추가로 포함하는, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 시료가 얻어지는 환자에게 치료적 유효량의 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 치료제 및/또는 투여되는 치료제의 양은 하나 이상의 변형 또는 비변형 AXL 단편 펩타이드의 양 또는 AXL 단백질의 수준을 기반으로 하는, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 치료제는 상기 AXL 단백질에 결합하고/결합하거나 상기 AXL 단백질의 생물학적 활성을 저해하는, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 치료제는 AXL-발현 암 세포를 특이적으로 표적화하도록 선택되는, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생체 시료는 상기 리퀴드 티슈 프로토콜 및 시약을 이용하여 하나 이상의 변형 또는 비변형 AXL 단편 펩타이드의 양을 정량화하기 위하여 처리된 포르말린 고정 종양 조직인, 생체 시료에서 티로신-단백질 키나제 수용체 UFO 단백질의 수준을 측정하는 방법.
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