JP6293802B2 - 血中アミロイドベータ代謝回転の測定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、国立衛生研究所によって授与される政府援助K-23-AG03094601およびR-01-NS065667下で行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
配列表への参照
紙およびコンピュータで可読形式の配列表が、以下に添付されるが、これは、全体として参照することにより本発明に援用される。コンピュータ可読形式で記録された情報は、37 C.F.R. 1.821 (f)にしたがって書かれた配列表と同一である。
技術分野
本発明は、血中Aβの代謝回転の測定方法を包含する。
本出願書類は、少なくとも1つのカラー写真を含んでいる。カラー写真を含む本願公報のコピーは、要求および必要な手数料の支払いのうえ、庁によって提供されるであろう。
発明の詳細な記載
本発明は、血液サンプル中のAβの代謝回転を測定することによるAβ代謝の測定方法を提供する。本明細書で用いる「代謝回転」は、後記するように、1つの実施態様において、標識Aβ生成速度、標識Aβクリアランス速度またはその両方の組合せを意味する。しかし、各例において、Aβ代謝の測定は、サンプル中の標識Aβの測定を必要とする。もう1つの実施態様において、「代謝回転」は、血中Aβの半減期を意味する。本明細書で用いる「Aβ」は、総アミロイドβ;Aβ38、Aβ40もしくはAβ42またはその組合せなどのアミロイドβイソ体を意味する。有利なことに、本発明方法は、Aβの代謝を測定するために、得るのがより困難であり、侵襲的な中枢神経系サンプルを必要としない。
本発明の1つの態様は、血中Aβ代謝の測定方法である。重要なことには、血中Aβの代謝回転は、中枢神経系のAβの代謝を反映する(このことは、中枢神経系Aβに正常に相関しない定常状態血中Aβレベルとは対照的である。)。一般的に言えば、血中Aβの代謝回転の測定は、被験者に標識を投与すること、被験者から血液サンプルを採取すること、およびサンプルを分析してサンプル中のAβの代謝回転を測定することを含む。各ステップを以下に詳述する。
本発明方法は、その一部として、被験者に標識を投与することを含む。適当な標識および適当な投与方法を以下に詳述する。
適当な標識は、血中Aβの代謝回転の測定を可能にする。適当な標識の非限定的な例として、標識アミノ酸または標識アミノ酸前駆体が挙げられる。1つの実施態様において、標識は、少なくとも1つの標識アミノ酸を含む。アミノ酸は、天然アミノ酸、合成アミノ酸またはアミノ酸類縁体であってよい。しかしながら、各例において、アミノ酸は、血中Aβの代謝回転の検出および定量を可能にするために、Aβに組込むことが可能であるべきである。天然アミノ酸の非限定的な例として、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンが挙げられる。1つの実施態様において、アミノ酸は、必須アミノ酸(たとえば、体内で生成されないアミノ酸)であってもよい。もう1つの実施態様において、アミノ酸は、非必須アミノ酸であってもよい。さらにもう1つの実施態様において、標識は、少なくとも1つの必須アミノ酸と少なくとも1つの非必須アミノ酸を含んでもよい。一般的に、アミノ酸の選択は、(1)アミノ酸が、目的のタンパク質またはペプチドの少なくとも1つの残基に存在するかどうか;(2)アミノ酸が、タンパク質合成のサイトにすぐに到達できるかどうか;(3)標識アミノ酸が、目的のタンパク質の代謝に影響を及ぼすかどうか(たとえば、ロイシンの非常に多い用量は、筋肉代謝に影響を及ぼす場合がある);および(4)所望のアミノ酸の利用可用性が考慮されるかもしれない(すなわち、いくつかのアミノ酸は、はるかに高価であるか、または他のものよりも製造が困難である);などの様々な因子に基づくものであってもよい。
適当な標識の投与方法としては、血中Aβの代謝回転を測定することができるいずれの方法も包含される。1つの実施態様において、標識は、たとえば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内などの非経口で投与される。さらにもう1つの実施態様において、標識は、経口で投与される。
本発明方法は、被験者から少なくとも1つの血液サンプルを採取することを含む。血液サンプルは、典型的に、標識されたAβを含む。サンプルは、また、非標識Aβを含んでもよい。本明細書で用いる「血液」は、全血、血漿または血清を意味する。血液サンプルを採取する方法は、当業界で周知である。1つの実施態様において、カテーテルによるか、またはかてーてるなしでの静脈穿刺を用いて、血液サンプルを採取してもよい。もう1つの実施態様において、手掌での採血または等価物を用いて、血液サンプルを採取してもよい。
本発明方法は、サンプルを分析して血中Aβの代謝回転を決定することを含む。一般的に言えば、サンプルを分析することは、(a)血液サンプル中の標識および非標識Aβを検出し、定量すること;および(b)血液サンプル中の標識および非標識Aβの量からAβの代謝回転を導き出すこと;を含む。各ステップを以下により詳細に議論する。
血液サンプル中の標識および非標識Aβを検出および定量する方法はさまざまでありうる。たとえば、検出方法は、使用する標識のタイプ(たとえば、放射性または非放射性など)によって変わる。1つの実施態様において、非放射性標識を用いる場合、検出方法は、非標識タンパク質に関して標識タンパク質の質量の変化を検出するのに十分感受性がある方法であるべきである。たとえば、標識および非標識Aβは、質量分析によって検出されうる。1つの実施態様において、実施例に概略する質量分析プロトコルを用いる。
上に概説した検出および定量ステップから、Aβの代謝回転を導き出す。1つの実施態様において、本明細書で用いる「代謝回転」は、標識Aβ生成の速度、標識Aβクリアランスの比速度またはその両方の組合せを意味する。もう1つの実施態様において、「代謝回転」は、血中Aβの半減期を意味する。さらにもう1つの実施態様において、「代謝回転」は、Aβ標識パーセントと、Aβの絶対定量値の積を意味する。たとえば、「代謝回転」は、Aβ42標識パーセントと、Aβ42の絶対定量値の積を意味することもできる。
本発明の別の実施態様は、キットを包含する。キットは、典型的に、少なくとも1つの標識アミノ酸の溶液を含む。1つの実施態様において、溶液は、経口摂取されてもよいシェイクまたはドリンクである。キットは、標識アミノ酸溶液を投与し、次いで少なくとも1つの血液サンプルを採取するための説明書も含む。キットは、血液サンプルを採取し、保管するための容器および/または付属品を含んでもよい。さらに、キットは、血液サンプルがAβの代謝回転ならびに標識および非標識Aβの絶対量測定について分析されるのに十分な品質であることを確実にするための内部標準を含んでもよい。
しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、多くの変更が、開示された特定の実施形態で行われ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを理解するべきであり、したがって、すべての記載された事項または添付の図面に示された事項は、例示として解釈されるべきであり、限定的な意味ではないと解釈されるべきである。
本明細書で用いる「ボーラス投与」は、標識の個別の投与を意味する。1回以上のボーラス投与を標識の投与に用いることができるが、各ボーラス投与は、個別の用量である。これは、時間をかけて継続投与される輸液とは対照的である。
1. サンプルを氷上で解凍した。
2. 20 μlのコンプリートプロテアーゼインヒビター(Roche、1 mlの水に1錠を溶解したもの)を添加した。
3. 14,000 RPM、4℃にて15分間遠心分離して、粒子を除去した。
4. 上清をプールした。
5. 標準培地をPBSで希釈した。
6. HJ5.1 (Aβ特異的抗体)ビーズを、1x PBS+0.02% アジドで2回洗浄した。最後に、50%ビーズスラリーを調製した。
7. 220 μlの5M グアニジン塩酸塩溶液を加えた。
8. 20 μlのTween-20 (5% PBS溶液、最終0.05%)を加えた
9. 5 μlのISTD (N15-Aβ)を加えた。
10. 30 μlの抗体ビーズ(〜20ng Aβに十分な50%スラリー)を加えた。
11. 4℃にて一夜インキュベートした。
12. ビーズを4500 RPMにて5分間遠心分離した。
13. 新しいチューブに上清を移し、保存した(血漿のみ)。
14. 1 ml 0.5M グアニジン塩酸塩溶液を加えた。
15. 最終0.05% Tween-20となるように10μlの5% Tween-20を加えた。
16. 一度再懸濁したビーズを1.5 mlチューブに移した。
17. ビーズを4500 RPMにて5分間遠心分離した。
18. 上清を捨てた。
19. ビーズを1x AmBiCリンスで2回洗浄した。上清を捨て、ビーズを乾燥した。
20. 50 μl(ビーズ体積)の98%ギ酸(溶出液)を加え、ビーズを遠心分離した。上清を除去し、1.5 mlチューブに入れた。
21. 溶出液をspeedvacで1時間乾燥して、ギ酸を除去した(37℃)。
23. 20 μgのトリプシンを解凍した。トリプシンを再懸濁させるために、1 mlの25mM AmBiC溶液を加え、最終濃度を20 ng/μlにした。
24. 25 mM AmBiCの10 μl溶液に。タンパク質を再懸濁させた。
25. 消化用ビーズに、10 μlの20 ng/μlトリプシン溶液を加えた。
26. インキュベーター内で37℃にてO/N(オーバーナイト)消化した(16時間)。
27. サンプルのショートスピンを行って、凝縮液をチューブの底に沈殿させた。
28. 消化物に、2 μlのギ酸を加えた(タンパク質を沈殿させるため)
29. サンプルを混合した。
30. トリプシン消化物を14,000 RPM、4℃にて15分間遠心分離した。
31. オートサンプラーバイアルに移し、次いで、speedvacを用いてサンプルをスピンダウンし、冷蔵庫内で4℃にて保管した。
Aβ 1-42のアミノ酸配列は、DAEFRHDSGYEVHH QKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (配列番号:1)であり、Aβ 1-40は、DAEFRHDSGYEVH HQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV (配列番号:2)である。トリプシンなどのプロテアーゼで消化される場合、4つの小さいペプチドが、Aβ 1-5 DAEFR (配列番号:3)、Aβ 6-16 HDSGYEVHHQK (配列番号:4)、Aβ 17-28 LVFFAEDVGSNK (配列番号:5)、およびAβ 29-42 GAIIGLMVGGVVIA (配列番号:6)として生成される。ので、これらのペプチドのうち2つの配列がロイシン残基を包含するので、それらだけがインビボで標識できるロイシン標識でのSILK技術(Stable Isotope Labeling Kinetics - Batemanら、2009)を用いる定量に関連する。これらのペプチドは、Aβ17-28 LVFFAEDVGSNK (配列番号:5)とAβ29-42 GAIIGLMVGGVVIA (配列番号:6)であるが、Aβ17-28 LVFFAEDVGSNK (配列番号:5)ペプチドが、血中Aβの総量を表し、より高いシグナルを生成するので、我々は、それのみを用いる。もちろん、血中c-末端(Aβ 29-42 GAIIGLMVGGVVIA (配列番号:6)もしくはAβ 29-40 GAIIGLMVGGVV (配列番号:7))またはn-末端フラグメントも同様に定量するために有用である。一般に、任意のアミノ酸標識を用いることができ、Aβを標識し、血中標識を定量するのに任意のエンドペプチダーゼを用いることができる。
Claims (11)
- (a)被験者から得た血液サンプル中の標識Aβの量、または標識Aβおよび非標識Aβの量を質量分析により決定すること;
(b)(i)被験者への少なくとも1つの安定な非放射性同位体で標識されたアミノ酸の9時間の輸液による静脈内投与が開始された後、10時間〜20時間の間に得られたサンプル中の標識Aβの量、または標識Aβおよび非標識Aβの量から計算するか;または(ii)被験者への少なくとも1つの安定な非放射性同位体で標識されたアミノ酸の経口ボーラスまたは静脈内ボーラス投与が開始された後、4、5、6、7、8、9または10時間後に得られたサンプル中の標識Aβの量、または標識Aβおよび非標識Aβの量から計算することによって、ステップ(a)で決定した標識Aβの量、または標識Aβおよび非標識Aβの量を用いてAβのクリアランス速度を計算すること;を含む、被験者の血中Aβのインビボ代謝回転速度のインビトロ測定方法。 - 標識されたアミノ酸が経口投与された、請求項1に記載の方法。
- 0.05g〜8gの安定な非放射性同位体で標識されたアミノ酸が投与された、請求項2に記載の方法。
- 標識されたアミノ酸が静脈内投与された、請求項1に記載の方法。
- 標識されたアミノ酸が、輸液にて、0.01mg/kg/時〜3 mg/kg/時で投与された、請求項4に記載の方法。
- ステップ(a)が、最初に血液サンプルからAβを単離することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 標識Aβまたは非標識Aβが、総Aβ、Aβ38、Aβ40およびAβ42から選択される、請求項1に記載の方法。
- Aβ代謝回転が、少なくとも2つの血液サンプルから計算される、請求項1に記載の方法。
- 安定な非放射性同位体が、2H、13C、15N、17O、18O、33S、34Sおよび36Sから選ばれる、請求項1に記載の方法。
- 安定な非放射性同位体が、13Cである、請求項9に記載の方法。
- 標識されたアミノ酸が、13C6-ロイシンまたは13C6-フェニルアラニンである、請求項1に記載の方法。
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