JPH11509086A

JPH11509086A - 標識生化学化合物の組合わせライブラリーとその作成方法

Info

Publication number: JPH11509086A
Application number: JP9503898A
Authority: JP
Inventors: ブラウン，ジョナサン，エム; オールナット，エフ・シー，トーマス; チェン，ハオ; ラドマー，リチャード
Original assignee: マーテック・バイオサイエンシズ・コーポレイション
Priority date: 1995-06-21
Filing date: 1996-06-13
Publication date: 1999-08-17
Also published as: DE69619825T2; DE69619825D1; WO1997000887A1; DK0839152T3; US5741713A; EP0839152B1; PT839152E; ES2174075T3; ATE214396T1; AU6180696A; EP0839152A1; CA2225313A1

Abstract

(57)【要約】標識生化学化合物の組合わせライブラリーとこの組合わせライブラリーの作成方法。この作成方法は、標識された生化学化合物の個々のユニットを生産する工程と、少なくとも２つの標識された個々のユニットを組み合わせて、標識された形の生化学化合物を生産する工程と、この工程を少なくとも１回繰り返して標識生化学化合物の組合わせライブラリーを作成する工程とからなる。また、標識された生化学化合物の組合わせライブラリーを作成する工程と、標識生化学化合物の組合わせライブラリーをターゲット受容体分子に接触させ、選択された標識生化学化合物がターゲット受容体分子に結合する工程と、受容体分子に結合したとき、選択された標識生化学化合物のコンフォメーションを決定する工程とからなる選択された生化学化合物のコンフォメーションの決定方法。

Description

【発明の詳細な説明】標識生化学化合物の組合わせライブラリーとその作成方法技術分野この発明は、標識組合わせライブラリーとその作成方法に関する。この標識組合わせライブラリーは、多くの機能を有するが、ターゲット受容体分子の構造が分かっていようといまいと、ターゲット受容体分子に結合する候補薬剤の三次元構造の決定を助ける。発明の背景技術エーリッヒ（Erhlich）（Ber ．Dtsch．Chem．Ges.，Vol.42，p.17(1909)）が、薬剤は「受容体（レセプター）」と呼ばれる特定の体内分子ターゲットに結合することにより作用することを、最初に提唱してから、薬剤研究において構造− 機能の相関関係を解明するために受容体との結合を用いることに強い関心が持たれている。歴史的に、活性化合物を求めて、菌や植物などの天然起源物質がスクリーニングされており、実際、これらの天然物から抗生物質ペニシリンや抗ガン剤ビンクリスチンなどの重要な薬剤が得られている。生物学的活性化合物の構造が決定されているので、有機化学者は、さらなる活性化合物の研究において、天然由来活性化合物を変更する。天然由来化合物とそれらの化学誘導体との間の相互作用が現代製薬業界の研究の基礎となっている。さらに最近では、生物学的に活性な化合物を設計するために２つの新しい技術が開発された。第一の技術である構造に基づく薬剤設計は、最初にターゲット受容体分子の三次元（３Ｄ）構造を決定し、その後ターゲット受容体に「フィットする」薬剤を設計することにより、薬剤設計するものである。ターゲット受容体分子の構造は、ターゲット蛋白質を結晶化し、その結晶をＸ線結晶学（例えば、１９９４年１２月１４〜１６日カナダのサンディエゴで開催されたケミカル・アンド・バイオモルキュラー・ディバーシィティ会議（以下、ＣＢＤ会議という）で示されたアグロンのＨＩＶ−１プロテアーゼを用いた研究を参照）または核磁気共鳴（「ＮＭＲ」）（米国特許第 5,324,658号とそこに引用されている文献を参照）を用いて検討することにより決定することができる。研究者は、分子全体の構造から、活性分子薬剤が結合する分子の一部である「結合部位」を同定できる。その後、コンピューター技術を用いて結合部位の正確な空間や形にフィットするような推定薬剤を設計する。この技術を用いて、チミジレート・シンテアーゼ阻害剤（Appelt，K et．al，J ．Med．Chem.，34: 1925(1991)）や幾つかのＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤（ＣＢＤ会議の発表参照）を含む、多くの期待される候補薬剤が設計された。第二の技術である「組合わせライブラリー」アプローチは、事実上反対のアプローチを用いる。この技術は、可能なかぎり多くの異なる化合物を合成し、目的のターゲット受容体分子に対する結合活性についてスクリーニングして候補化合物を選択する。１つのアプローチは、アミノ酸の混合物をランダムに反応させて膨大な数のオリゴペプチドを合成することである。例えば、２０のアミノ酸がランダムに結合して６個からなるペプチドを形成すると、６４００万以上の化合物ができる。その後、得られた化合物の混合体、即ち化合物の「ライブラリー」を目的のターゲット受容体分子に添加し、最も大きな親和性でターゲット受容体分子に結合した化合物を候補化合物として選択する。このアプローチの多くの変更が試されている。オリゴペプチドライブラリーを作成するのにアミノ酸の混合体を使用するほか（Lam et al.，Nature，354:82(1 991)）、他の例として、オリゴペプチドライブラリーの化学的誘導体を生成したり（Houghten，Current Biology，Vol．4．No．6，p．564（1994））、オリゴヌクレオチドライブラリー（Wang et al.，Biochemistry，32:11285(1993)）と有機薬効分子ライブラリー（ＣＢＤ会議のPharmacopeiaによる発表参照）を使用したりする。最も進んだ化学的組合わせライブラリー技術は、リード化合物の迅速なスクリーニング、精製、同定のための方法と戦略を含む。かかる技術の例として、ポリスチレンビーズへの化合物の合成（Rapp，Technical Bulletein，Rapp Polymer GmbH，Eugenstrasse 38/1，D72072，Tubingen，Germanyおよびそこに引用されている文献）とタグを付ける技術（ＣＢＤ会議のファーマコピアによる発表参照）が挙げられる。かかる技術により、膨大な化合物ライブラリーから比較的速くリード化合物を選択して同定することが可能となる（例えば、数週間以内）。これら進歩にかかわらず、上述の技術には両方とも欠点があり、特に所定の目的にあった最適な薬剤を最終的に設計するための時間とコストが問題である。例えば、構造に基づく薬剤設計アプローチでは、Ｘ線結晶学またはＮＭＲのいずれによるターゲット受容体分子の高分解能三次元構造決定に時間がかかり、しばしば多くの年数がかかる。この構造から薬剤を設計し試験するのにも時間がかかり、一般に設計−合成−試験のサイクルを少なくとも数回繰り返す必要がある。さらに、組合わせライブラリーアプローチでは、このアプローチによって所定のターゲット受容体分子に結合した化合物群が非常に速やかに選定されても、次の工程、いわゆる「構造−機能」相関関係を確立するのが困難である。理想的には、最終薬剤製品の有効性を最大にするためには、i)選択された化合物のターゲット受容体分子に結合する部分、ii）選択された化合物のターゲット受容体分子との結合に構造的に重要な部分（即ち、化合物の結合機能のための距離、障害などにおける重要な部分）、およびiii)選択された化合物の結合に不要な部分を決定することが避けられない。残念なことに、組合わせライブラリー技術の最も一般的で便利な化学的戦略は、オリゴペプチドなどのオリゴマーを製造することである。独立した化合物として、これらのオリゴマーは本質的に明瞭な分子構造を有さずに「流動的（フロッピィ）」である。従って、結合状態でこれらの化合物のコンフォメーション（立体配座）を推定することは不可能ではないが非常に困難である。実際、ターゲット受容体分子の構造、および特に結合部位の構造が既に知られているならば、構造機能相関関係はずっと容易に決定される。このような状況なら、ターゲット受容体分子に結合した選択された化合物の構造は推定できる可能性がある。しかし、上述したように、ターゲット受容体分子の構造は不明かまたは決定するのに何年もかかる場合がある。従って、ターゲット受容体分子の構造が知られていないなら、組合わせライブラリーアプローチのスピードの利点の多くは無意味になる。受容体に結合した小分子配位子のコンフォメーションを決定するために、ＮＭＲを用いた幾つかの技術が開発された。これらの技術では、配位子または受容体のいずれか、または両方がＮＭＲ活性な安定性同位体¹³Ｃおよび／または¹⁵Ｎで標識されることが必要である。例えば、最近では、シュレバーとその仲間が、ＮＭＲを用いて特定の分子の結合コンフォメーションが決定できた技術を説明している（Science，Vol．266，p．1241（1994））。結合分子のコンフォメーションは２つの方法で決定された。第一の方法では、これらの分子が、¹³Ｃと¹⁵Ｎの培地で培養した大腸菌の発現によりＮＭＲ活性な同位体¹³Ｃと¹⁵Ｎに富んだ蛋白ターゲットに結合した。この場合、¹³Ｃと¹⁵Ｎ同位体は、標識蛋白から標識蛋白に結合する非標識分子へと磁性を移すために使用し、これによりその結合コンフォメーションにおける分子構造を決定した。第二の方法では、分子そのものが大腸菌の発現により標識された。この場合、¹³ Ｃと¹⁵Ｎ同位体は、配位子のプロトンへ磁性を移すために使用し、これによりその結合コンフォメーションにおける分子構造を決定した。以前には、フェシックとその仲間が、ターゲット分子であるシクロフィリン［引用］に結合したシクロスポリンＡのコンフォメーションを決定した（Natrue， Vol．361，p．88(1993)）。これらの研究者は、標識シクロフィリンに結合したシクロスポリンを研究しただけでなく、標識されていないシクロフィリンに結合した¹³Ｃ−標識シクロスポリンも研究した。両方の方法とも、シクロスポリンＡの結合構造の決定に成功した。ターゲット受容体に結合した配位子のコンフォメーションを決定する第三の技術では、配位子を¹³Ｃで、受容体を¹⁵Ｎで、またはその反対で標識する。上記の３つの方法は全て、受容体そのものの３Ｄ構造の解明するために使用する技術よりも、有用性が配位子／受容体複合体の大きさによって比較的影響されない点で利点を有する（ＮＭＲ技術の詳細については、ブージャのメディシナルケミストリー・アンド・ドラッグデリバリー、１巻、原理と実際、マンフレッド・イ・ウォルフ、３１４〜３１５頁とそこに引用された文献を参照）。上記の方法全ては、ターゲット受容体分子に結合した候補薬剤の構造を決定する方法学において、かなり進歩したものである。しかし、これらの方法は、組合わせライブラリーアプローチに必要な構造機能相関関係を決定するのに時間がかかるという欠点を有する。例えば、シュリバー等はバクテリアのターゲット分子を標識した。対照的に、多くの蛋白、特に医学的に興味が持たれる多くの蛋白はバクテリアでは発現できず、この方法では標識されない。哺乳類と昆虫の細胞で¹³ Ｃと¹⁵Ｎ同位体で標識した蛋白を生成する方法が最近説明されたが（米国特許第 5,324,658号参照）、組換え哺乳類細胞系統の構成と選択には時間がかかり、しばしば１年以上かかる。組合わせライブラリーアプローチで同位体標識合物を使用することは、結合分子のコンフォメーションを決定するのに必要な時間を短縮できる可能性の点で、望ましい。このような標識化合物を使用すると、ターゲット受容体分子に結合する候補薬剤の構造を決定するスピードが上がる。さらに、かかる化合物の使用は、たとえターゲット受容体分子の構造が分からなくても組合わせライブラリーアプローチを使用する候補薬剤のスピィディな決定を可能とする。組合わせライブラリーアプローチにおいてこのような標識化合物を使用することは、不可能ではなくても、利用可能な標識化合物の組合わせライブラリーを作成する手段がなかったため、今日まで実際的ではなかった。従って、薬剤設計での組合わせライブラリーアプローチに使用できる標識合物の組合わせライブラリーを作成する方法が必要とされている。発明の開示本発明によれば、標識された生化学化合物の組合わせライブラリーと、その組合わせライブラリーを作成する方法では、（１）標識された形の生化学化合物の個々のユニットを生産し、（２）少なくとも２つの標識された個々のユニットを組み合わせて、標識された形の生化学化合物を生産し、（３）、（２）の工程を少なくとも１回繰り返して、標識生化学化合物の組合わせライブラリーを作成する。また、本発明によれば、生化学化合物の構造を決定する方法では、（１）標識生化学化合物の組合わせライブラリーを作成し、（２）この標識生化学化合物の組合わせライブラリーをターゲット受容体分子に接触させて選択された標識合物をターゲット受容体分子に結合させ、（３）受容体分子に結合したときに、選択された標識合物の構造を決定する。好ましい実施形態の説明本発明によれば、標識生化学化合物の組合わせライブラリーの作成方法と、標識生化学化合物の組合わせライブラリーが提供される。本発明の方法では、（１）標識された形の生化学化合物の個々のユニットを生産し、（２）少なくとも２つの標識された個々のユニットを組み合わせて、標識された形の生化学化合物を生産し、（３）（２）の工程を少なくとも１回繰り返して、標識生化学化合物の組合わせライブラリーを作成する。さらに、本発明によれば、生化学化合物のコンフォメーション決定方法が提供される。本発明の方法では、（１）標識生化学化合物の組合わせライブラリーを作成し、（２）この標識生化学化合物の組合わせライブラリーをターゲット受容体分子に接触させて選択された標識生化学化合物をターゲット受容体分子に結合させ、（３）ターゲット受容体分子に結合したときに、選択された標識合物のコンフォメーションを決定する。ここで使用される「個々のユニット」の用語は、微生物の成分とその誘導体を意味する。微生物の成分の例として、限定はされないが、アミノ酸、核酸、脂肪酸、炭水化物が挙げられる。ここで使用される「核酸」の用語は、核酸およびその誘導体のみならず、ヌクレオチドやヌクレオシドなどの核酸分解生成物をも意味する。ここで使用される「組合わせライブラリー」の用語は、生化学化合物の集合を意味する。組合わせライブラリーは少なくとも２つの生化学化合物からなる。ここで使用される「選択された標識生化学化合物」の用語は、ターゲット受容体分子に結合し、そのためターゲット受容体分子に結合するという事実によって「選択された」標識合物を意味する。本発明の一つの好ましい実施例によると、標識生化学化合物の組合わせライブラリーが作成される。本発明による標識生化学化合物の組合わせライブラリーを作成するためには、初めに標識された個々のユニットを生成する。既に述べたように、個々のユニットは微生物の成分または成分の誘導体である。安定性同位体に富んだ（アイソトープリッチな）環境で微生物を培養した結果、個々のユニットは「標識」される。上記リッチな環境は、²Ｈ、¹³Ｃ、¹⁵Ｎまたはそれらの組合せ等のＮＭＲ活性な安定性同位体を含む。同位体に富んだ環境で微生物を培養するためのどのような手段も、本発明に使用できる。微生物のアイソトープリッチについて、例えば以下のような多くの技術が公表されている。標識炭水化物と塩の存在下でのバクテリアの培養（Kay，L .，et al.，Science，249:411(1990)）、藻類溶解物でのバクテリアの培養（米国特許第 5,324,658号； Chubb，R.T.，et al.，Biochemistry，30:7718(1991) ）、藻類溶解物での酵母の培養（Powers，R.，et al，Biochemistry，31:4334(1 992)）、標識メタノールでのバクテリアと酵母の培養（Moat，A.G．and Foster ，J.W.，Microbial Physiology，2nd Ed.，John Wiley & Sons，New York，p．2 18(1988)）、標識培地での哺乳類と昆虫の細胞の培養（米国特許第 5,324,658号）、同位体標識した¹³ＣＯ₂および／または¹⁵Ｎ塩の存在下での藻類の光合成培養（米国特許第 4,952,511号、第 5,104,803号、第 5,151,347号、第 5,162,051 号）。上記の引用した文献の全てを参考としてここに取り込む。本発明によれば、上記の微生物のいずれの成分も、組合わせライブラリーの生化学化合物のための個々のユニットとして使用できる。各微生物は、微生物によって多量に生産される多くの潜在成分を含む。好ましくは、個々のユニットはアミノ酸、核酸、脂肪酸、炭水化物、それらの誘導体である。最も好ましくは、個々のユニットはアミノ酸または核酸である。後述の実施例１と実施例２はそれぞれ標識アミノ酸と標識核酸の生産に関する。上記成分そのものは一般に多価である。従って、これら成分は互いに結合して、組合わせライブラリーでは生化学化合物の混合体を形成する。これら成分は、微生物が生育する環境（即ち、バイオマス）から適当な手段により単離することができる。例えば、アミノ酸は、米国特許第 5,324,658号、Mo ore，SおよびStein，W.T.の J ．Biol．Chem.，192:663(1951)に記載されている技術によりバイオマスから単離できる。核酸は、Maniatis，T.，Fritsh，E.F.， and Sambrook，J.，Molecular Cloning，Cold Springs Harbor Laboratory(1982 )に記載されている技術により単離できる。脂肪酸は、米国特許第 5,376,540号に記載されているように生産し単離できる。上記の引用した文献の全てを参考としてここに取り込む。アミノ酸個々ユニットの調製本発明の好ましい面によれば、個々ユニットは、好ましくは藻類のバイオマスから単離したアミノ酸を同位体（アイソトープ）で標識したものである。同位体に富んだ環境において藻類を培養するために多くの技法が存在する。好ましくは、米国特許第 4,952,511号、第 5,104,803号、第 5,151,347号または第 5,162,0 51号に記載されたような閉鎖型フォトバイオリアクター（これらの開示が参照によりここに取り入れられる）を使用する。組合わせライブラリーの大きさを最大とするためには、できる限り多くのアミノ酸をバイオマスから取得するすることが重要である。この理由により、存在するいかなる不安定なアミノ酸も破壊しないような手順を用いることが好ましい。従って、バイオマスは、好ましくはＰＣＴ出願公開第WO 9401329号に記載された手順（アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アルギニンおよびシステインを共に混合された凍結乾燥粉末として得る手順）によって処理される。この手順によれば、凍結乾燥粉末で得られたアミノ酸は次に分離される。数多くの分離方法が分析規模で記載されており、本発明により使用することができる。しかしながら、好ましくは、Moore，SおよびStein，W.T.の J ．Biol．Chem.， 192:663(1951)の分離方法の適合が用いられる。ムーアおよびスタインの方法では、アミノ酸は、陽イオン交換樹脂を使用して、ベンジルアルコールやチオジグリコールなどの試薬を低レベルで含有したクエン酸緩衝液で溶出させることにより分離される。カラムと溶出液の温度を６０℃に上げて、違ったように共に溶出するイソロイシン／メチオニンとフェニルアラニン／チロシンの分離を行う。 MooreおよびSteinの分離方法は、アミノ酸混合物の分析用には価値ある方法であるが、チオジグリコールなどの取扱いが好ましくない試薬を要件としており、またカラムの温度を周囲温度以上に上げなければならないので、大規模に行うことは容易でない。本発明の好ましい面によれば、凍結乾燥粉末で得られたアミノ酸は陽イオン交換樹脂で分離される。原理的には、どのような陽イオン交換樹脂も用いることができる。しかし、陽イオン交換樹脂はナトリウムまたはカリウムのような単純な金属イオンの型のものが好ましく、ナトリウムが最も好ましい。樹脂は、適切な塩の型の金属イオンの溶液で前処理される。原理的には、どのような型の塩も使用できる。好ましくは、塩は酢酸またはクエン酸のような弱いカルボン酸の塩であり、これにより溶液のｐＨを緩衝する。緩衝液の濃度は約０．０５Ｍないし約０．５Ｍの範囲にあるのが好ましく、０．１Ｍの濃度が最も好ましい。緩衝液のｐＨは約３．０と約３．５の間、特に好ましくはｐＨ３．２に調整する。この工程を通じて周囲温度に維持される溶出液には、他の試薬を添加する必要はない。凍結乾燥粉末のアミノ酸は緩衝液中で溶解させる。当業者には、アミノ酸を少量の緩衝液に溶解させれば、より高度な再溶解の溶出アミノ酸を得られることが分かるであろう。従って、約５mlないし約５０mlの緩衝液当たり、約１ｇのアミノ酸の濃度でアミノ酸を溶解させるのが好ましく、１０ml当たり１ｇの濃度が特に好ましい。この濃度では、ある比率のチロシンが存在する場合を除いては、凍結乾燥粉末で得られたアミノ酸のすべてが可溶である。ある比率のチロシンが存在するのであれば、この比率のチロシンは濾過または遠心分離のような適切な手段により、純粋な物質として単離することができる。アミノ酸を含有する緩衝液をカラムにかけ、アミノ酸を含有しない緩衝液をポンプでカラムを通して流す。アミノ酸であるスレオニン、セリン、プロリン、アラニン、グリシンおよびバリンが、ほぼ純粋なかたちでカラムから溶出する。溶出する緩衝液のｐＨを約４と約５の間、特に好ましくはｐＨ４．２に変え、この緩衝液をポンプでカラムを通して流す。アミノ酸であるイソロイシン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニンおよびチロシンが、ほぼ純粋なかたちでカラムから溶出する。溶出する緩衝液のｐＨを約８．０と約８．５の間、特に好ましくはｐＨ８．２に変え、この緩衝液をポンプでカラムを通して流す。ヒスチジンがほぼ純粋なかたちでカラムから溶出する。溶出する緩衝液のｐＨを約９と約１０の間、特に好ましくはｐＨ９．３に増大させ、この緩衝液をポンプでカラムを通して流す。ヒスチジンがほぼ純粋なかたちでカラムから溶出する。アミノ酸であるリシンおよびトリプトファンがほぼ純粋なかたちでカラムから溶出する。精製された各アミノ酸は、イオン交換クロマトグラフィを使用するなどの適切な手段により溶出する緩衝液から単離される。好ましくは、ＰＣＴ出願公開第WO 9401329号に記載された手順を修正した次のような方法が用いられる。特定のアミノ酸を含有するフラクションを組み合わせ、酸性化剤を用いて、この溶液のｐＨを約１と約３の間、特に好ましくはｐＨ２に調整する。酸性化剤は、どのような強酸であってもよい。好ましくは、酸性化剤は塩酸である。この得られた溶液を、溶出緩衝液と同じイオンの型の陽イオン交換樹脂にかける。結合されるアミノ酸の損失（ロス）が生じないように、好ましくは多量の陽イオン交換樹脂を用いる。好ましくは、カラムを通してポンプで流される約３０リットルの溶出液当たり、約２ないし約３kgの樹脂を用いる。次に、溶出液のｐＨが約４と約５の間になるまで、カラムを水で洗浄する。水で洗浄した後に、陽イオン交換樹脂に結合したアミノ酸を塩基性媒体を用いる溶出により流出させることになる。原理的には、どのような塩基性媒体も使用することができる。好ましくは、使用する塩基性媒体は溶出緩衝液と同じ陽イオンを有する。好ましい塩基性媒体は水酸化ナトリウム溶液である。塩基性媒体のｐＨは、アミノ酸のカルボキシル官能基が負に帯電する一方でアミノ酸のアミノ官能基が脱プロトン化されるようなものである。このため、塩基性媒体のｐＨは好ましくは約１０よりも大きい。しかしながら、強すぎる塩基性条件下でのアミノ酸のラセミ化を避けるために、塩基性媒体のｐＨは約１３よりも小さく、約１１ないし約１２の範囲にあることが好ましい。結合したアミノ酸の溶出に伴い、塩基性媒体は陽イオン交換樹脂を中和する。特定のアミノ酸の精製はこの時点で終了する。ただし、アミノ酸をさらに濃縮することが好ましい。好ましくは、この時点で中和した酸性イオン交換カラムからの流出液を塩基型の陰イオン交換樹脂に添加する。原理的には、どのような型の塩基の樹脂も使用することができる。好ましくは、水酸化物などの単純な型の塩基を使用する。アミノ酸を濃縮するためには、使用する陰イオン交換樹脂の量はアミノ酸を溶出させるのに用いた陽イオン交換樹脂の量よりもかなり少ない。陰イオン交換樹脂のカラムの大きさは好ましくは約１００ｇないし約７５０ｇの範囲にあり、約２００ｇないし約５００ｇの範囲が特に好ましい。アミノ酸は、そのアミノ基がこの時点では負の電荷を帯びていない一方でカルボキシル官能基が負に帯電しているので、塩基イオン交換樹脂上に吸着される。次に、塩基性媒体は、水を用いた溶出によりＯＨ^-型カラムから流出する。樹脂に結合したアミノ酸と接して残っている塩基性媒体が無いことは重要である。従って、カラムを洗浄するために約２体積ないし約８体積の水を用いるのが好ましい。より好ましくは、少なくとも４ベッド体積を用いる。水を用いた溶出による塩基性媒体の流出に続いて、酸を用いた溶出により、塩基性陰イオン交換樹脂から、濃縮されたアミノ酸が流出する。原理的には、どのような酸性溶液も使用することができる。好ましくは、ギ酸または酢酸のような弱酸や、あるいは希釈した塩酸のような鉱酸を使用する。使用する酸の濃度は、酸性溶液のｐＨが約２と約６の間の範囲となるようなもの、好ましくはｐＨ３とｐＨ５の間の範囲となるようなものである。この時点で、精製されたアミノ酸は、減圧下での蒸発または凍結乾燥などの適切な手段によって単離することができる。必要であれば、こうして精製されたアミノ酸を、結晶化などの適切な手段により、さらに精製してもよい。これらの手順によって、安定性同位体、好ましくはＮＭＲ活性な安定性同位体である²Ｈ，¹³Ｃおよび／または¹⁵Ｎの任意の組合わせで標識したアミノ酸の調製が可能となる。標識した組合わせライブラリーの生成本発明によれば、標識された個々のユニットが作られると、少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個の標識された個々ユニットが組み合わされて、標識生化学化合物を形成する。例えば、２個の標識アミノ酸は、組み合わされて２アミノ酸長さの標識生化学化合物を形成することができ、あるいは２個の標識核酸は、組み合わされて２核酸長さの標識生化学化合物を形成することができる。個々ユニットがアミノ酸である場合には、アミノ酸を組合わせる前に標識アミノ酸の各々をアルファ−アミノ位で、適切な保護基によって保護する。このような保護基は容易に入手可能である。このような保護基の例としは、ｔ−ｂｏｃ、ｆ−ｍｏｃ等があるが、これに限られない。必要ならば、アミノ酸の側鎖を保護するために追加の保護基を使用することができる。例えば、システインの側鎖を保護するためにＳ−ベンジル基を使用することができる。（アミノ酸の保護基を含め、保護基の化学の概説については、Greene，T.およびWatts，P.G.M．の Protectiv e Group Chemistry ，2nd Ed.，John Wiley & Sons，New York,（1991）参照。参照によりここに取り入れられる。）保護されたアミノ酸の各々は、活性化剤によってアルファ−カルボキシル位で活性化される。このような活性化剤の例としては、塩化オキサリル、ジイミダゾールカルボニル等があるが、これに限られない。保護され活性化された標識アミノ酸は、組み合わされて標識生化学化合物を形成することができる。アミノ酸を組み合わせることは、どのような適切な手段によっても行うことができ、例えば、Geisenにより（ＣＢＤ会議で）開示された手段、Houghtenにより（Houghten，Current Biology ，Vol．4，No．6，p.564(1994)）開示された手段、またはLam（ Lam et．al.，Nature，Vol．354，p.82（1991））により行うことができ、そのすべてが参照によりここに取り入れられる。これとは別に、個々ユニットが核酸である場合は、標識生化学化合物の組合わせライブラリーを作るために、どのような適切な手段も使用することができる。好ましい技法には、化学合成や、酵素が触媒する重合を用いた個々ユニットの組み合わせにより、個々ユニットをつなぎ合わせることが含まれる。化学合成法では、核酸の各々を遊離したヌクレオシドとして単離する（好ましくは実施例２に記載した技法による）。次に、各ヌクレオシドを５’位置で保護し、必要ならば、各ヌクレオシドの環外のアミノ官能基の位置でも保護する。どのような適切な保護基も使用することができる。適切な５’保護基の例としては、トリチル、ジメトキシトリチル、ピキシル等があるが、これに限られない。適切な環外保護基としては、アセチル、イソブチリル、フェノキシアセチル等があるが、これに限られない。次に、ヌクレオシドの３’位をリン酸化する。３’位のリン酸化（ホスホリレーション）は、誘導した（即ち、保護した）ヌクレオシドを、適切なリン酸化剤で処理することによって行う。好ましくは、リン酸化剤は、２−シアノエチル− Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイトまたはメチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト等のホスホルアミダイト試薬である。次に、保護された核酸の各々を、誘導した亜リン酸基の位置で、活性化する。適切な活性化剤は当業者にとって入手可能な公知のものであり、テトラゾール、トリアゾール等を含むが、これに限られない。保護され活性化された核酸は、組み合わされて標識生化学化合物を形成することができる。核酸を組み合わせることは、どのような適切な手段によっても行うことができ、例えば、Wangら，Bioc hemistry ，32:11285（1993）の方法により行うことができ、参照によりここに含まれる。これとは別に、酵素触媒重合法では、核酸個々ユニットは、組み合わされて標識生化学化合物を形成することができる。この方法では、標識個々ユニットは、５’モノホスフェートとして単離され、酵素により５’トリホスフェートに変換され、そして酵素触媒と適切なテンプレート（鋳型）を用いて組み合わされる。このような組合わせ方法の例としてはＤＮＡテンプレート上でのＤＮＡ伸長（ＰＣＲ）、およびＲＮＡテンプレート上でのＲＮＡ伸長（ＲＴ）が含まれる。本発明によれば、少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個の標識された個々ユニットが組み合わされて、標識された生化学化合物を形成し、この標識生化学化合物は大きさが少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個の個々ユニットである。本発明によれば、どのような大きさの化合物も生産することができ、生化学化合物の大きさは、生化学化合物を生産するために組み合わされた個々ユニットの数に依存することに留意すべきである。本発明の別の面によれば、少なくとも２個の標識された生化学化合物を含有するライブラリーが存在するように、１個の標識生化学化合物を生産する工程が少なくとも１回は繰り返される。本発明のこの標識生化学化合物の組合わせライブラリーは、どのような数の標識化合物も含有することができ、組合わせライブラリーが含有する化合物の数は、１個の標識生化学化合物を生産する工程が繰り返される回数に依存することに留意すべきである。例えば、上記工程が１０００回繰り返されれば、１０００個の標識生化学化合物を含有する組合わせライブラリーが作られることになる。このため、本発明は、数千、数百万あるいは数十億個の化合物を含有する標識生化学化合物の組合わせライブラリーの作成方法を提供し、そのライブラリーの大きさは、１個の標識生化学化合物を生産する工程が繰り返される回数によって決定される。さらに、標識生化学化合物の生産は、順次に（即ち、１回に１個）起こる必要はないことを理解すべきである。むしろ、所望の数の標識生化学化合物を生産されるために要する時間が短くて済むように、標識生化学化合物が同時に生産することが好ましい。標識生化学化合物の同時生産は、例えば、全アミノ酸（２０個）の混合物が単一のアミノ酸と組み合わされる場合に起こり、これにより、２アミノ酸長さの２０個の異なる化合物が生産される。このような多数の化合物を含有する標識生化学化合物の組合わせライブラリーの作成は、組合わせライブラリーに接触するターゲット受容体分子の構造が既知であるか否かにかかわらず、組合わせライブラリーのアプローチを用いて、結合した候補薬剤のコンフォメーション（立体配座）を迅速に決定することを可能とする。ターゲット受容体への結合による標識化合物の選択本明細書に記載した方法は、標識生化学化合物の組合わせライブラリーをつくる。これらの標識生化学化合物の組合わせライブラリーは、全体的に、ある選択されたターゲット受容体分子に結合する分子をスクリーニングし選択するために使用する方法に相当する。それ故に、これらの組合わせライブラリーは、従来技術で既知の組合わせライブラリーのアプローチに従って使用することができる。しかしながら、従来のアプローチとは対照的に、本発明のライブラリーは、ターゲット受容体分子のコンフォメーション（立体構造）が既知であるか否かにかかわらず、生化学化合物に取り込まれたＮＭＲ活性な安定性同位体を利用してＮＭＲにより、ターゲット受容体分子に結合する生化学化合物のコンフォメーションを調べることを可能とするものである。結合した標識化合物のコンフォメーションの決定本発明の好ましい実施の形態によれば、ある選択した生化学化合物のコンフォメーションが決定される。ある選択した生化学化合物のコンフォメーションを決定するためには、標識生化学化合物の組合わせライブラリー（これらの化合物は少なくとも１種類の安定性同位体で標識されている。）を、まず作成しなければならない。標識生化学化合物は、ＮＭＲ活性な安定性同位体であることが好ましい。さらに、組合わせライブラリーは、本願において詳細に上述した手順に従って作成されることが好ましい。標識生化学化合物の組合わせライブラリーが作成されると、安定性同位体標識の存在により、ターゲット受容体に結合する選択された標識生化学化合物のコンフォメーションを決定することができる。例えば、選択された生化学化合物がＮＭＲ活性な安定性同位体で標識されていれば、選択された生化学化合物のコンフォメーションはＮＭＲ分析により決定することができる（ＮＭＲ技法の詳細な概説については、Burger's Medical Chemistry and Drug Discovery，Vol．1，Pri nciples and Practice，Ed．Manfred E．Wolff，pp．314-315 およびその引用文献を参照）。明らかに、選択された標識生化学化合物のコンフォメーション決定方法は用いられる標識の種類に依存することになる。本発明の一つの重要な面は、ある選択された標識生化学化合物のコンフォメーションを、その選択された生化学化合物が結合するターゲット受容体分子のコンフォメーションを知ることなく、決定することができることである。従って本発明は、ある選択された標識生化学化合物のコンフォメーションを、ターゲット受容体分子のコンフォメーション（立体構造）が既知であるか否かにかかわらずに決定するために使用することができる。本発明を特定の好ましい実施形態に対して説明してきたが、当業者は、本発明の精神から外れることなく様々な修正、変更、省略および置換が可能であることが分かるであろう。実施例１同位体標識したアミノ酸の調製 50％ ²Ｈ，¹³Ｃ，¹⁵Ｎ標識した混合アミノ酸（ＰＣＴ出願公開第WO 9401329号の実施例９に記載された手順に従って調製した22g）をクエン酸ナトリウム緩衝液（0.1M，pH3.3，0.001Mアジ化ナトリウム含有，250ml）に添加し、その懸濁液を室温で１時間攪拌した。不溶物質（主にチロシン）を遠心分離で除去し、上澄みを、クエン酸ナトリウム緩衝液（0.1M，pH3.3，0.001Mアジ化ナトリウム含有）で前処理したDowex 50WX4，200-400メッシュのカラム（15×200 cm）にかけた。このカラムをクエン酸ナトリウム緩衝液（0.1M，pH3.3，0.001Mアジ化ナトリウム含有）を用いて室温で流量 25 ml／分で溶出させた。２リットルのフラクションが集められた。スレオニンがフラクション33〜38で、セリンがフラクション 41〜50で、プロリンがフラクション53〜60で、アラニンがフラクション71〜74で、グリシンがフラクション75〜87で、およびバリンがフラクション92〜99で溶出した。フラクション102 の時点で、溶出液をクエン酸緩衝液（0.1M，pH4.2，0.001M アジ化ナトリウム含有）に変え、室温で前と同じ流量で溶出を続けた。イソロイシンがフラクション123〜124 で、メチオニンがフラクション126〜127 で、ロイシンがフラクション129〜135 で、フェニルアラニンがフラクション170〜177 で、およびチロシンがフラクション183〜189 で溶出した。フラクション201 の時点で、溶出液をクエン酸緩衝液（0.1M，pH6.3，0.001M アジ化ナトリウム含有）に変え、フラクション222 の時点で、溶出液をクエン酸緩衝液（0.1M，pH8.2，0.001Mアジ化ナトリウム含有）に変えた。両方の場合とも、室温で前と同じ流量で溶出を続けた。ヒスチジンがフラクション238〜241 で溶出した。フラクション261 の時点で、溶出液をクエン酸緩衝液（0.1M，pH9. 3，0.001M アジ化ナトリウム含有）に変え、室温で前と同じ流量で溶出を続けた。トリプトファンがフラクション274〜278 で、およびリシンがフラクション279 〜281 で溶出した。上記各アミノ酸は、以下のような手順で単離した。ロイシン含有フラクションを混合し、そのｐＨを濃塩酸でｐＨ２に調整した。得られた溶液を、流量200 ml ／分で、Dowex 50WX4，200-400メッシュのイオン交換樹脂（ナトリウム型，2.5K g）のカラムにかけた。次に、この樹脂を、溶出液のｐＨが約5 になるまで水で2 00 ml／分で洗浄した。ポンプを止め、そのカラムを底部でDowex 50X8-100イオン交換樹脂（ＯＨ^-型，500g）のカラムに接続した。ＯＨ^-型カラムからの溶出液のｐＨが約12となるまで、水酸化ナトリウム溶液（pH12）を100 ml／分でポンプ流しした。さらに 5リットルポンプ流しを続けた。次に、ポンプを止め、直接ＯＨ^-型カラムに接続し、得られる溶出液のｐＨが約8 になるまで、水をＯＨ^-型カラムを通じて100 ml／分でポンプ流しした。次に、酢酸水溶液を、ＯＨ^-型カラムを通じて100 ml／分でポンプ流しし、幾つかのフラクション（100 ml）が集められた。ニンヒドリン陽性フラクションを貯め、減圧下で蒸発させた。得られた固体をエタノール水溶液から結晶化して、 50％ ²Ｈ，¹³Ｃ，¹⁵Ｎロイシンを1.1g得た。実施例２均一に安定性同位体標識したヌクレオシドとヌクレオチドの標識原栄養的培養バイオマスからの生産バイオマスは、ある原栄養株（例えばChlorella vulgaris）から、非常に単純な安定性同位体で標識した炭素源と窒素源（例えばChlorella vulgarisについては¹³ＣＯ₂と¹⁵ＮＯ₃または¹⁵ＮＨ₃）で培養することにより得る。これらの細胞は、回分遠心分離により、あるいは連続的遠心分離器を使用して収穫する。核酸を放出するために、細胞は、数多くの技法のいずれか（例えば空洞形成）を使用して破壊する。（全ての時点でリボヌクレアーゼの無い系を維持することに注意しながら）全く標準的な手順に従い、全ての核酸を抽出する。一つの方法では、破壊したバイオマスを等量の２４：２４：１のTris(pH8.0)で飽和したフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールと混合して激しく振ることにより抽出する。遠心分離により相に分離する。水相を、２４：１クロロホルム：イソアミルアルコールと混合して激しく振ることにより抽出し、遠心分離により相に分離する。水相に酢酸アンモニウムを補充し、低温で等量のイソプロパノールを用いて塩析をする。その結果沈殿した核酸を、酢酸アンモニウム含有エタノールで洗浄して過剰の塩を除去する。最終的なペレット（沈殿物）を乾燥させ、酢酸アンモニウムを除去する。乾燥したペレットを、塩化マグネシウムとＥＤＴＡとを添加したTris(pH8.0)緩衝液の最少量に溶解させる。この核酸を、分光測定法により定量し、デオキシリボヌクレアーゼＩで処理する。この加水分解は、膵臓リボヌクレアーゼインヒビターの存在下、３７℃で６〜８時間行う。ＤＮＡの全体が小さな断片（テトラマー以下）に確実に加水分解されるように、最初のインキュベーションの後に、第二のデオキシリボヌクレアゼＩの添加を行う。全体で２４時間のインキュベーションの後に、反応混合物を、3,000 MWCO（分子量3,000 カットオフ）膜を用いた限外濾過攪拌セルの中に入れ、透過液を集める一方で、保持される液量が最少となるようにする。次に保持物をTris緩衝液で２回洗浄し、残留するモノ−デオキシヌクレオチドおよびオリゴ−デオキシヌクレオチドを除去する。透過液のすべてを凍結乾燥する。この時点で、その物質を酢酸アンモニウム緩衝液に懸濁させ、ヌクレアーゼＰ１で処理して小さなオリゴマーをモノマーのデオキシリボヌクレオチド５’モノホスフェート（ｄＮＭＰｓ）に分解する。このｄＮＭＰ加水分解混合物を、酵素を除去するために3,000 MWCOフィルターに通し、保持物を水で１回洗浄する。透過液をＨＰＬＣで試験して混合し、次に酢酸アンモニウムを除去するために凍結乾燥する。最終用途によっては、この時点でこれらの透過液を脱塩する必要があるかもしれない。デオキシリボヌクレアーゼＩ加水分解から攪拌セルに保持された物を、次に、残留物質（ほとんど完全なＲＮＡ）をモノマーに分解するためにヌクレアーゼＰ１で処理する。このインキュベーションは酢酸アンモニウム緩衝液中で行い、攪拌セル全体を３７℃のインキュベーターに移して一晩加水分解を行う。完全に加水分解されたことがＨＰＬＣにより確認されると、その物質を、最少液量が保持されるまで、3,000 MWCOフィルターを通じて濾過する。保持物を蒸留水で２回洗浄する。かなりの量のリボヌクレオチド５’モノホスフェートを含有する透過液すべてを貯め、過剰の塩を除去するために蒸留水に対して透析する。次に、これを凍結乾燥してリボヌクレオチド５’モノホスフェート（ＮＭＰｓ）を得る。出発バイオマスによっては、これらの調製から追加的の標識生化学化合物を得ることもできる。例えば、Chlorella vulgarisでは、その細胞を破壊し遠心分離して澱粉ペレットを回収する。この澱粉は、標識された澱粉として、またはさらに処理してグルコースとして使用することができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年１月６日【補正内容】請求の範囲１．（ａ）標識された形の生化学化合物の個々のユニットを生産する工程と、（ｂ）少なくとも２つの前記標識された個々のユニットを組み合わせて、そのコンフォメーションが決定可能な標識された形の生化学化合物を生産する工程と、（ｃ）工程（ｂ）を少なくとも１回繰り返して、標識生化学化合物の組合わせライブラリーを作成する工程とからなる標識生化学化合物の組合わせライブラリーの作成方法。２．前記個々のユニットはアミノ酸、核酸、脂肪酸、炭水化物またはそれらの誘導体からなるグループから選択される請求項１記載の方法。３．前記個々のユニットはアミノ酸である請求項２記載の方法。４．前記個々のユニットは核酸である請求項２記載の方法。５．（ａ）藻類バイオマスで標識アミノ酸を生産する工程と、（ｂ）前記標識アミノ酸を前記藻類バイオマスから回収する工程とからなる方法により前記標識アミノ酸を生産する請求項３記載の方法。６．１つより多い標識生化学化合物を生産するように個々のユニットの組合せが同時におこる請求項１記載の方法。７．（ａ）標識アミノ酸を生産する工程と、（ｂ）少なくとも２つの前記標識アミノ酸を組み合わせて、そのコンフォメーションが決定可能な標識生化学化合物を生産する工程と、（ｃ）工程（ｂ）を少なくとも１回繰り返して、標識生化学化合物の組合わせライブラリーを作成する工程とからなる標識生化学化合物の組合わせライブラリーの作成方法。８．（ａ）標識核酸を生産する工程と、（ｂ）少なくとも２つの前記標識核酸を組み合わせて、そのコンフォメーションが決定可能な標識生化学化合物を生産する工程と、（ｃ）工程（ｂ）を少なくとも１回繰り返して、標識生化学化合物の組合わせライブラリーを作成する工程とからなる標識生化学化合物の組合わせライブラリーの作成方法。９．組合わせライブラリーアプローチを用いた候補薬剤の探索方法であって、請求項１で作成される標識生化学化合物の組合わせライブラリーを用いることにより改善された方法。１０．各化合物はそのコンフォメーションが決定可能であり、ライブラリーは少なくとも１，０００の標識生化学化合物を含む、標識生化学化合物の組合わせライブラリー。１１．前記ライブラリーは少なくとも１０，０００の標識生化学化合物を含む請求項１０記載の組合わせライブラリー。１２．前記ライブラリーは少なくとも１００，０００の標識生化学化合物を含む請求項１０記載の組合わせライブラリー。１３．前記ライブラリーは少なくとも１，０００，０００の標識生化学化合物を含む請求項１０記載の組合わせライブラリー。１４．前記ライブラリーは少なくとも１０，０００，０００の標識生化学化合物を含む請求項１０記載の組合わせライブラリー。１５．前記ライブラリーは請求項１記載の方法により作成される請求項１０記載の組合わせライブラリー。１６．前記標識生化学化合物がアミノ酸を含む請求項１０記載の組合わせライブラリー。１７．前記標識生化学化合物が核酸を含む請求項１０記載の組合わせライブラリー。１８．前記標識生化学化合物がＮＭＲ活性な同位体で標識されている請求項１０記載の組合わせライブラリー。１９．（ａ）標識生化学化合物の組合わせライブラリーを作成する工程と、（ｂ）選択された標識生化学化合物がターゲット受容体分子に結合するように前記標識生化学化合物の組合わせライブラリーをターゲット受容体分子に接触させる工程と、（ｃ）前記受容体分子に結合したときに、前記選択された標識生化学化合物のコンフォメーションを決定する工程とからなる選択された生化学化合物のコンフォメーションの決定方法。２０．前記安定同位体がＮＭＲ活性な同位体である請求項２３記載の方法。２１．前記選択された標識生化学化合物のコンフォメーションをＮＭＲ分析により決定する請求項２０記載の方法。２２．前記受容体分子のコンフォメーションが未知である請求項１９記載の方法。２３．前記生化学化合物が安定性同位体で標識されている請求項１９記載の方法。２４．（ａ）標識された形の生化学化合物の個々のユニットを生産する工程と、（ｂ）少なくとも２つの前記標識された個々のユニットを組み合わせて、標識された形の生化学化合物を生産する工程と、（ｃ）工程（ｂ）を少なくとも１回繰り返して、標識生化学化合物の組合わせライブラリーを作成する工程とからなる方法によって、前記標識生化学化合物の組合わせライブラリーが作成される請求項１９記載の方法。。２５．前記個々のユニットはアミノ酸、核酸、脂肪酸、炭水化物またはそれらの誘導体からなるグループから選択される請求項２４記載の方法。２６．前記個々のユニットはアミノ酸である請求項２５記載の方法。２７．（ａ）藻類バイオマスで標識アミノ酸を生産する工程と、（ｂ）前記標識アミノ酸を前記藻類バイオマスから回収する工程とからなる方法により前記標識アミノ酸を生産する請求項２６記載の方法。２８．１つより多い標識生化学化合物を生産するように個々のユニットの組合せが同時におこる請求項２４記載の方法。２９．（ａ）標識アミノ酸を生産する工程と、（ｂ）少なくとも２つの前記標識アミノ酸を組み合わせて、標識生化学化合物を生産する工程と、（ｃ）工程（ｂ）を少なくとも１回繰り返して、標識生化学化合物の組合わせライブラリーを作成する工程とからなる方法によって、前記標識生化学化合物の組合わせライブラリーを作成する請求項１９記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者チェン，ハオアメリカ合衆国、20783 メリーランド州、アデルフィ、デキンス・ホール・ドライブ 10219 (72)発明者ラドマー，リチャードアメリカ合衆国、21029 メリーランド州、クラークスビル、トウェルブ・オークス・コート 14016

Claims

【特許請求の範囲】１．（ａ）標識された形の生化学化合物の個々のユニットを生産する工程と、（ｂ）少なくとも２つの前記標識された個々のユニットを組み合わせて、標識された形の生化学化合物を生産する工程と、（ｃ）工程（ｂ）を少なくとも１回繰り返して、標識生化学化合物の組合わせライブラリーを作成する工程とからなる標識生化学化合物の組合わせライブラリーの作成方法。２．前記個々のユニットはアミノ酸、核酸、脂肪酸、炭水化物またはそれらの誘導体からなるグループから選択される請求項１記載の方法。３．前記個々のユニットはアミノ酸である請求項２記載の方法。４．前記個々のユニットは核酸である請求項２記載の方法。５．（ａ）藻類バイオマスで標識アミノ酸を生産する工程と、（ｂ）前記標識アミノ酸を前記藻類バイオマスから回収する工程とからなる方法により前記標識アミノ酸を生産する請求項３記載の方法。６．１つより多い標識生化学化合物を生産するように個々のユニットの組合せが同時におこる請求項１記載の方法。７．（ａ）標識アミノ酸を生産する工程と、（ｂ）少なくとも２つの前記標識アミノ酸を組み合わせて、標識された生化学化合物を生産する工程と、（ｃ）工程（ｂ）を少なくとも１回繰り返して、標識生化学化合物の組合わせライブラリーを作成する工程とからなる標識生化学化合物の組合わせライブラリーの作成方法。８．（ａ）標識核酸を生産する工程と、（ｂ）少なくとも２つの前記標識核酸を組み合わせて、標識生化学化合物を生産する工程と、（ｃ）工程（ｂ）を少なくとも１回繰り返して、標識生化学化合物の組合わせライブラリーを作成する工程とからなる標識生化学化合物の組合わせライブラリーの作成方法。９．組合わせライブラリーアプローチを用いた候補薬剤の探索方法であって、請求項１で作成される標識生化学化合物の組合わせライブラリーを用いることにより改善された方法。１０．ライブラリーは少なくとも１，０００の標識生化学化合物を含む標識生化学化合物の組合わせライブラリー。１１．前記ライブラリーは少なくとも１０，０００の標識生化学化合物を含む請求項１０記載の組合わせライブラリー。１２．前記ライブラリーは少なくとも１００，０００の標識生化学化合物を含む請求項１０記載の組合わせライブラリー。１３．前記ライブラリーは少なくとも１，０００，０００の標識生化学化合物を含む請求項１０記載の組合わせライブラリー。１４．前記ライブラリーは少なくとも１０，０００，０００の標識生化学化合物を含む請求項１０記載の組合わせライブラリー。１５．前記ライブラリーを請求項１記載の方法により作成する請求項１０記載の組合わせライブラリー。１６．前記標識生化学化合物がアミノ酸を含む請求項１０記載の組合わせライブラリー。１７．前記標識生化学化合物が核酸を含む請求項１０記載の組合わせライブラリー。１８．前記標識生化学化合物がＮＭＲ活性な同位体で標識されている請求項１０記載の組合わせライブラリー。１９．（ａ）標識生化学化合物の組合わせライブラリーを作成する工程と、（ｂ）選択された標識生化学化合物がターゲット受容体分子に結合するように前記標識生化学化合物の組合わせライブラリーをターゲット受容体分子に接触させる工程と、（ｃ）前記受容体分子に結合したときに、前記選択された標識生化学化合物のコンフォメーションを決定する工程とからなる、選択された生化学化合物のコンフォメーションの決定方法。２０．前記安定性同位体がＮＭＲ活性な同位体である請求項１９記載の方法。２１．前記選択された標識生化学化合物のコンフォメーションをＮＭＲ分析により決定する請求項２０記載の方法。２２．前記受容体分子のコンフォメーションが未知である請求項１９記載の方法。