JP5080945B2

JP5080945B2 - 質量分析装置および質量分析方法

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Publication number: JP5080945B2
Application number: JP2007291460A
Authority: JP
Inventors: 清美吉成; 集平林; 俊之横須賀; 金也小林
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2007-11-09
Filing date: 2007-11-09
Publication date: 2012-11-21
Anticipated expiration: 2027-11-09
Also published as: JP2009115724A

Description

本発明は、試料中に含まれる複数の物質をイオン化し解離し質量分析を行うタンデム型の質量分析装置および質量分析方法に関する。

一般的な質量分析方法（ＭＳ^１）では、分析対象の試料に含まれる複数の物質を分離しイオン化した後、このイオン化した複数のイオン種を質量分析部に送り、イオン種の質量数ｍ、価数ｚの比である質量対電荷比ｍ／ｚ毎に、イオン種の強度を測定する。この測定によって、各質量対電荷比ｍ／ｚの値に対する、測定されたイオン種の強度（ピーク）からなるマススペクトルが得られる。このような一般的な質量分析方法（ＭＳ^１）に対して、多段解離が可能なタンデム型の質量分析装置では、ＭＳ^１でピークの測定された特定の質量対電荷比ｍ／ｚのイオン種を選択し、この選択したイオン種を親イオンとしてガス分子との衝突等により解離分解する。こうして、生成した解離イオンに対して、質量分析して前記と同様にマススペクトルを得ている。このように、親イオンを１段解離して、その解離により生成した解離イオンを質量分析することをＭＳ^２と呼んでいる。タンデム型の質量分析装置では、多段（１段，２段，…，ｎ段）（ここでｎは自然数）に解離した解離イオン中から新たな親イオンを選択して解離し、各段で生成した解離イオンの質量分析（ＭＳ^２，ＭＳ^３，…，ＭＳ^ｎ＋１）を行う（例えば、特許文献１参照）。

前記のようなタンデム型の質量分析装置によれば、試料中に含まれる物質の種類の同定や、その物質の定量解析が可能であり、近年では、特に、クルードな生体サンプル中のタンパク質・ペプチドや代謝物などの同定や定量解析に用いられている。特に、患者と健常者間での比較や、投薬前と投薬後での比較のために、複数の検体の生体サンプルを質量分析することが行われ、生成有無や生成量が変化している変動成分がつきとめられることで、病気の診断の為のバイオマーカの発見や、薬の代謝メカニズム解明や薬効予測などが可能になっている。
特開２００７−１２１１３４号公報

従来のタンデム型の質量分析装置では、分析対象の試料に含まれる物質の種類が多いために、試料のイオン化の前に前処理系として例えば液体クロマトグラフィ（ＬＣ）を用いて、質量分析部にイオン化した物質を導入する時間をずらし、先行して導入される複数の物質の中に、変動成分が含まれているか否かがわかった後に、後続する物質が質量分析部に導入されるようにしている。しかし、先行する物質が導入されてから後続する物質が導入するまでの時間、いわゆるリアルタイムに、変動成分が含まれているか否かの判定ができない場合があった。これは、解離して質量分析すべき親イオンの種類がリアルタイムに処理できないほど多いためである。
そこで、本発明の目的は、解離して質量分析すべき親イオンの種類を減らし、リアルタイムに分析が可能な質量分析装置および質量分析方法を提供することにある。

本発明は、試料中に含まれる複数の物質を分離する前処理系と、前記複数の物質をイオン化した複数のイオン種を生成するイオン化部と、前記複数のイオン種の中から親イオンを選択し前記親イオンを解離した複数の解離イオンの質量分析を行う質量分析部と、前記質量分析部で取得される前記複数のイオン種の質量対電荷比と前記前処理系で取得され前記複数のイオン種を識別可能な特性データとを記憶するデータベースとを有し、前記質量分析部では、前記複数の解離イオンを前記複数のイオン種に替えて前記親イオンの選択と前記解離イオンの質量分析を繰り返しながら、前記データベースに基づいて前記親イオンを前記選択する質量分析装置において、
試薬を使用するか否かの指定をユーザにより入力されるユーザインタフェースを有し、
前記ユーザインタフェースでは、前記ユーザによる前記試薬の種類の指定を可能にし、
前記ユーザにより前記試薬の種類が指定されると、制御部が、前記データベースにおいて、試薬により標識される前記複数の物質がイオン化した前記複数のイオン種の前記質量対電荷比と前記特性データとを複製し、複製された前記質量対電荷比を、前記試薬により前記複数の物質が標識された場合の質量数の増減に基づいて書き換えることを特徴とする。また、このような質量分析装置を用いた質量分析方法であることを特徴とする。

本発明によれば、解離して質量分析すべき親イオンの種類を減らし、リアルタイムに分析の可能な質量分析装置および質量分析方法を提供できる。

次に、本発明の実施形態について、適宜図面を参照しながら詳細に説明する。なお、各図において、共通する部分には同一の符号を付し重複した説明を省略する。

（第１の実施形態）
図１に、本発明の第１の実施形態に係る質量分析装置１の構成図を示す。質量分析装置１は、前処理系１１と、イオン化部１２と、コリジョンセル１３Ａを有する質量分析部１３と、イオン検出部１４と、データ処理部（ＣＰＵ）１５と、表示部・入力部１６と、ユーザ入力部（ユーザインタフェース）９と、制御部２と、内部データベース（ＤＢ）７と、分析データ記憶部８とを有している。そして、制御部２は、分析制御部３と、標識化特性データ生成支援部４と、複製部５と、書き換え部６とを有している。

まず、質量分析装置１のユーザは、分析対象の試料１０として、詳細は後記するが標準試料と混合試料を用意する。試料１０中に含まれる複数の物質を分離するために、試料１０は、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）や液体クロマトグラフィや２次元電気泳動などの前処理系１１で前処理される。例えば、大元の試料１０がタンパク質である場合、前処理系１１にて、消化酵素によりポリペプチドの大きさに分解され、液体クロマトグラフィ等により分離・分画される。以下では特にことわらない限り、前処理系１１として液体クロマトグラフィを採用した場合の例を示す。なお、前処理系１１では、イオン種の分離の状況を示すカラムでの保持時間（カラムの通過時間）τが、そのイオン種がカラムを出て質量分析部１３に入った時刻とともに取得されている。この保持時間τや、ガスクロマトグラフィの保持時間τや、２次元電気泳動であれば分離したスポットの２次元的位置は、試料１０に含まれる複数の物質それぞれの固有の特性データであり、この特性データに基づいて、物質を他の物質と識別することができる。

イオン化部１２では、試料１０の分離・分画の後、試料１０に含まれる前記複数の物質をイオン化した複数のイオン種を生成する。

次に、質量分析部１３で、複数のイオン種は、質量対電荷比ｍ／ｚに応じて分離される。ここで、ｍはイオン種の質量、ｚはイオン種の帯電価数である。この分離により、複数のイオン種の中から親イオンを選択することが可能になり、選択した親イオンをコリジョンセル１３Ａで解離して複数の解離イオンを生成し、この解離イオンの質量分析を行うことができる。

なお、第１の実施形態では、親イオンの解離方法として、コリジョンセル１３Ａを用いているが、コリジョンセル１３Ａでは、親イオンをヘリウム（Ｈｅ）などのバッファーガスと衝突させて解離させる衝突解離（Collision Induced Dissociation）法を採用することができる。衝突解離する為には、ヘリウムガスなどの中性ガスが必要となる為、衝突解離するためのコリジョンセル１３Ａと質量分析部１３とを、図１に示すように別に設けても良いし、質量分析部１３に中性ガスを充満させて、質量分析部１３内で衝突解離させても良い。その場合、コリジョンセル１３Ａを省くことができる。また、別の解離方法として、低エネルギーの電子を照射し、親イオンに多量に低エネルギー電子を捕獲させることにより、親イオンを解離させる電子捕獲解離（Electron Capture Dissociation）を採用しても良い。

質量分析部１３で分離されたイオン種は、イオン検出部１４で検出され、そのイオン種がカラムを出て質量分析部１３に入った時刻とともに質量対電荷比ｍ／ｚに応じたイオン種の強度が計測される。

データ処理部（ＣＰＵ）１５では、イオン種がカラムを出て質量分析部１３に入った時刻によって、前記保持時間τとイオン種質量対電荷比ｍ／ｚおよびイオン種の強度とを関係付けるような、データ整理・処理が行われる。前記保持時間τとイオン種質量対電荷比ｍ／ｚおよびイオン種の強度とを関係付けることにより、特定のイオン種を他のイオン種と識別することが可能になる。

このデータ整理・処理の結果は、例えばマススペクトルのような分析結果として、表示部・入力部１６に表示される。この一連の質量分析の過程にある前処理系１１、イオン化部１２、質量分析部１３、イオン検出部１４、データ処理部（ＣＰＵ）１５、表示部・入力部１６は、互いに連携して動作し質量分析が可能なように、制御部２の分析制御部３で制御されている。

質量分析方法には、試料１０をイオン化して質量分析する方法（ＭＳ^１）と、特定の質量対電荷比のイオン種を親イオンとして選択し、この親イオンをコリジョンセル１３Ａで解離させて生成した解離イオンを質量分析するタンデム質量分析法がある。タンデム質量分析法では、解離イオンの中から、特定の質量対電荷比を持つ解離イオンを親イオンとして選択し、更に、その親イオンを解離し、その際、生成した複数の解離イオンの質量分析を行うといったように、選択・解離・質量分析を多段に行うＭＳ^ｎの機能が用いられる。このＭＳ^ｎの機能によれば、試料１０中の物質の質量対電荷比の分布をマススペクトルとして計測（ＭＳ^１に相当）後、このＭＳ^１の計測に基づいて、ある質量対電荷比を持つ親イオンを選択して解離し、得られた解離イオンのマススペクトルを計測（ＭＳ^２に相当）後、このＭＳ^２の計測に基づいて、ある質量対電荷比を持つ解離イオンを親イオンとして選択してさらに解離し、得られた解離イオンのマススペクトルを計測（ＭＳ^３に相当）するといったことができるようになる。

このようなタンデム質量分析法によれば、周知の解離イオンが出現するまで選択・解離・質量分析の段数を重ねることで、最終段での解離前の状態である親イオンの分子構造を同定することができる。この同定された親イオンを手がかりに、段をさかのぼりながら、各段毎に解離前の状態である親イオンの分子構造を同定し、最終的に、試料１０に含まれていた物質がイオン化した大元の親イオンの分子構造を高精度に推定することができる。そして、タンデム質量分析法は、試料中に含まれる物質の種類の同定ができるだけでなく、マススペクトルの強度に基づいて、試料中に含まれる物質の定量解析が可能である。試料１０としては、クルードな生体サンプル中のタンパク質・ペプチドや代謝物などを対象とでき、病気の診断の為のバイオマーカの発見や、薬の代謝メカニズム解明や薬効予測などを目的として、例えば、患者と健常者間での比較や、投薬前と投薬後での比較のために、複数の検体の生体サンプルを質量分析することで、特定物質の種類や量が変化している変動成分を解析・探索することができる。

分析データ記憶部８では、前処理系１１で取得された保持時間τが自動格納されたり、質量分析部１３で取得されたイオン種質量対電荷比ｍ／ｚおよびイオン種の強度が自動格納されたりする。そして、前記保持時間τとイオン種質量対電荷比ｍ／ｚおよびイオン種の強度とは、分析制御部３を介してデータ処理部（ＣＰＵ）１５によって引出され、互いに関係付けるような、データ整理・処理が行われる。
内部データベース（ＤＢ）７では、前記質量分析部１３で取得される複数のイオン種の質量対電荷比と前処理系１１で取得され複数のイオン種を識別可能な特性データとが記憶されている。記憶されているイオン種は、分子構造が同定されていれば好ましいが、同定されていなくても、すでに出現したことのあるイオン種である。このようなイオン種を記憶しておくことにより、同じイオン種が分析された場合には、このようなイオン種を再度親イオンにしないようにして、重複した分析を省き、分析時間の短縮を図っている。このため、質量分析部１３では、内部データベース７に記憶されたイオン種に一致しない親イオンを選択している。

また、試料１０を試薬により標識した場合、試薬により標識される試料１０に含まれる複数の物質がイオン化した複数のイオン種の前記質量対電荷比は変化するが、前記特性データの保持時間τ等はほとんど変化しない。そして、質量対電荷比の変化量は、試薬によって決まっている。このため、標識されたイオン種に関するデータ（質量対電荷比ｍ／ｚや特性データ等）を、すでに内部データベース７に記憶されている標識されていないイオン種のデータに基づいて生成することができる。

内部データベース７では、標識されたイオン種のデータを生成するために、まず、制御部２の複製部５で、試薬により標識される複数のイオン種のデータ（質量対電荷比ｍ／ｚや特性データ等）を複製している。次に、書き換え部６で、複製された前記質量対電荷比を、試薬により前記複数の物質が標識された場合の質量数の増減に基づいて書き換えている。内部データベース７が、標識されたイオン種のデータを有することにより、質量分析部１３で標識されたイオン種が親イオンに選択されることが無くなる。従来であれば、標識されたイオン種は、標識されていないイオン種と質量対電荷比が異なっているので、標識されたイオン種は今まで出現したことのないイオン種であると判定され、親イオンに選択されていた。しかし、対応する標識されていないイオン種の分子構造が同定されていれば、標識されたイオン種を同定する必要は無く、したがって、親イオンに選択する必要も無い。そこで、内部データベース７に、標識されたイオン種のデータを生成し、質量分析部１３では、この標識されたイオン種のデータに基づいて、標識されたイオン種を選択しないようにして、分析時間の短縮化を図っている。

なお、標識されたイオン種のデータを生成するために、試薬を使用するか否かの指定をユーザが入力可能なユーザ入力部（ユーザインタフェース）９が設けられている。制御部２の標識化特性データ生成支援部４により、ユーザインタフェース９を介して、ユーザに試薬の使用の有無の判断を促す。ユーザが試薬を使用すると判断すれば、標識化特性データ生成支援部４により、ユーザインタフェース９でのユーザによる試薬の種類の指定が可能になる。ユーザにより試薬の種類が指定されることにより、指定された試薬の種類に基づきデータベース７での前記複製と前記書き換えとが行われる。

図２に、本発明の第１の実施形態に係る質量分析方法（変動解析方法）のフローチャートを示す。

まず、ステップＳ１で、分析制御部３の制御のもとで、健常者から採取した標準試料を、タンデム質量分析する。なお、標準試料のタンデム質量分析においては、分析中（リアルタイム）に、標準試料から取得される前記質量対電荷比や前記特性データ等の標準特性データを、内部データベース（ＤＢ）７に記憶し、同一イオン種の重複測定を省いている。

図３に、本発明の第１の実施形態に係る質量分析方法における試料の分析（タンデム質量分析）のフローチャートを示す。以下では、このフローチャートを用いて、ステップＳ１における標準試料のタンデム質量分析について説明する。

まず、ステップＳ１１で、分析制御部３のもと標準試料の質量分析ＭＳ^１を実施する。

ステップＳ１２で、制御部２が、質量分析ＭＳ^１によって得られた（質量分析）データを、分析データ記憶部８に格納する。質量分析データには、質量対電荷比ｍ／ｚや特性データの保持時間τ等が含まれている。

ステップＳ１３で、制御部２が、質量対電荷比ｍ／ｚに対してイオン種が検出されたこと示す強度を求め、質量対電荷比ｍ／ｚのどこにいわゆるピークが存在するかの判定を行う。なお、ピークの強度は、マススペクトル上では面積となって現れるので、面積と呼ばれることもある。図４（ａ）に示すように、質量数２０００、価数１価のペプチドの場合、ピークが、質量対電荷比の２０００、２００１、２００２、２００３、２００４、２００５において計測されていることになる。

ステップＳ１４で、制御部２が、炭素（Ｃ）同位体により生じたピークを省き、炭素同位体がない場合のピークのみを残すように分析データ記憶部８に記憶させる。このことにより、ピーク数を、ピーク総数Ｎｐから炭素同位体がない場合のピーク数Ｎｐｉまで減らすことができる。図４（ａ）に示すように、質量数２０００、価数１価のペプチドの場合、質量対電荷比２０００のピークが炭素元素^１２Ｃを含んだペプチドのピークを示し、質量対電荷比２００１、２００２、２００３、２００４、２００５のピークは、炭素元素^１２Ｃの同位体元素^１３Ｃ等を含んだペプチドのピークである。炭素元素^１２Ｃと同位体元素^１３Ｃ等の存在比と等しい比率で、炭素元素^１２Ｃを含んだペプチドと、同位体元素^１３Ｃ等を含んだペプチドも存在するので、炭素元素^１２Ｃを含んだペプチドの強度がわかれば、同位体元素^１３Ｃ等を含んだペプチドの強度を算出することができる。このため、炭素元素^１２Ｃを含んだペプチド（質量対電荷比２０００）のピークのみを、分析データ記憶部８に記憶させている。

図５（ａ）に健常者から採取した標準試料の分析によって得られたマススペクトルを示す。このマススペクトルが、ステップＳ１３でのピーク判定が行われたマススペクトルである。ペプチド毎に炭素同位体に起因し互いの強度の比率が一定である複数のピークの束が３つ計測されている。そして、ステップＳ１４で、炭素同位体がない場合のピーク（イオン種）ｄ０１、ｄ０２のみを残している。

図３のステップＳ１５で、制御部２が、炭素同位体がない場合のピークの強度を、分析データ記憶部８に記憶させる。そして、図６に示すように、分析データ記憶部８には、ピーク（イオン種）毎に、識別子、質量数ｍ、価数ｚ、強度（面積）、保持時間τ等のデータを有する非標識データ群８ａが構成される。具体的には、識別子ｄ１が、図５（ｂ）のピーク（イオン種）ｄ０１に対応し、識別子ｄ２が、ピーク（イオン種）ｄ０２に対応するような関係になっている。

ステップＳ１６で、制御部２が、分析データ記憶部８に記憶された炭素同位体がない場合のピークの全てについて、内部データベース７に記憶されたデータと比較・照合する。この時点で、内部データベース７には、一般的に周知なタンパク質やペプチドやアミノ酸などのデータ（質量対電荷比ｍ／ｚや特性データ等）が記憶されている。

ステップＳ１６内において、まず、ステップＳ１６−１で、分析データ記憶部８から、炭素同位体がない場合のピーク（イオン種）全てのＮｐｉ個に対して、各ピーク（イオン種）ｉの特性データ（イオン種の質量数ｍや、強度、マスクロマトグラムでの面積など）を導出する（引き出す）。

次にステップＳ１６−２で、分析データ記憶部８から、炭素同位体がない場合のピーク（イオン種）全てのＮｐｉ個に対して、各ピーク（イオン種）ｉの特性データ（ＬＣの保持時間τや、ＧＣの保持時間や、２次元電気泳動におけるスポット名など）を導出する（引き出す）。

ステップＳ１６−３で、制御部２が、各ピーク（イオン種）ｉ毎に、ステップＳ１６−１とＳ１６−２とで引き出した特性データに一致するデータが、内部データベース７に存在するか否かを判定する。一致するデータが存在する場合（ステップＳ１６−３、Ｙｅｓ）は、ステップＳ１６−４に進み、そのピーク（イオン種）ｉを、ＭＳ^２における親イオンの対象から除外する。一致するデータが存在しない場合（ステップＳ１６−３、Ｎｏ）は、ステップＳ１６−５に進む。

ステップＳ１６−５で、一致するデータが存在しなかったピーク（イオン種）ｉの特性データを内部データベース７に格納する。したがって、実質的には、図６の分析データ記憶部８に記憶されているデータは、図８に示すように、内部データベース７記憶されているといった状態になる。内部データベース７記憶されている非標識データ群７ａが、標準特性データになる。

ステップＳ１６−６で、一致するデータが存在しなかったピーク（イオン種）ｉ全てをＭＳ^２における親イオンにできれば良いが、量的に多すぎる場合は、不一致のイオンの強度の大きい順から所定の個数を選んで分析時間を短縮する。あるいは、不一致のイオンを表示して、ユーザに選択させても良い。なお、ステップＳ１における標準試料のタンデム質量分析であるので、変動イオン（変動成分）に関しては考慮する必要はない。以上でステップＳ１６が終了する。

ステップＳ１７で、制御部２が、ＭＳ^２における親イオンが存在するか否か判定する。存在する場合（ステップＳ１７、Ｙｅｓ）は、ステップＳ１８に進む。存在しない場合（ステップＳ１７、Ｎｏ）は、ステップＳ２１に進み、制御部２が、次の試料分析（ＭＳ^１）が用意され存在しているか否かを判定する。次の試料分析（ＭＳ^１）が有れば（ステップＳ２１、Ｙｅｓ）、ステップＳ１１に戻る。次の試料分析（ＭＳ^１）が無ければ（ステップＳ２１、Ｎｏ）、ステップＳ１における標準試料のタンデム質量分析を終了する。

ステップＳ１８で、制御部２が、ＭＳ^２の分析内容を決定し、ステップＳ１９で、不一致となったイオン種を親イオンとしてＭＳ^２の分析を行う。

ステップＳ２０で、ＭＳ^２の質量分析データを格納するためにステップＳ１２に戻る。また、質量分析データに基づいて、親イオンの同定（構造解析）が行われ、親イオンがどのようなアミノ酸残基を有するかのようなデータが得られ、このようなデータが内部データベース７に格納される。

以上の説明で、図２のフローチャートにおいて、ステップＳ１が終了したことになる。

次に、ステップＳ２で、標識化特性データ生成支援部４（図１参照）が、ユーザインタフェース９において、図７（ａ）に示すような画面表示９ａをユーザに見せて、ユーザが標識化特性データの生成の決定が容易にできるように支援する。ユーザは、「Ｙｅｓ」の表示の横の丸に黒丸を入力することで、標識化特性データの生成をすることの決定をすることができる。なお、ユーザに理解しやすいように、標識化特性データの生成のことを、「内部データベースの加工追加を実施しますか？」と翻訳して記載している。

ステップＳ３で、複製部５が、図９に示すように、標準特性データ（非標識データ群）７ａを複製した標識化特性データ（第１標識データ群と第２標識データ群）７ｂ、７ｃを内部データベース７に生成する。

ステップＳ４で、標識化特性データ生成支援部４（図１参照）が、ユーザインタフェース９において、図７（ｂ）に示すような画面表示９ｂをユーザに見せて、ユーザが想定している標識種（試薬）の指定が容易にできるように支援する。ユーザは、たとえば、「^１５Ｎ」の表示の横の四角内にチェックを入力することで、標識種に窒素の同位体^１５Ｎを指定することができる。窒素^１４Ｎの同位体^１５Ｎは、タンパク質やペプチドのＮ末端の窒素が置換されることで標識化する。また、ユーザは、たとえば、「^１８Ｏ」の表示の横の四角内にチェックを入力することで、標識種に酸素^１６Ｏの同位体^１８Ｏを指定することができる。酸素の同位体^１８Ｏは、タンパク質やペプチドのＯ末端の酸素が置換されることで標識化する。なお、Ｏ末端には酸素原子が２つ配置されていて、置換させる酸素原子の個数を１つか２つか変えることができる。そこで、標識化特性データ生成支援部４（図１参照）は、ユーザインタフェース９において、図７（ｃ）に示すような画面表示９ｃをユーザに見せて、ユーザが想定している標識箇所の個数の指定が容易にできるように支援する。

ステップＳ５で、書き換え部６（図１参照）が、指定された標識種とその個数に基づいて、図９の標識化特性データ（第１標識データ群と第２標識データ群）７ｂ、７ｃの質量数（質量対電荷比）を書き替える。具体的に、図４（ｂ）に示すように、質量数２０００で価数１価のペプチドを、酸素の同位体^１８Ｏを１つ用いて標識すると、図４（ａ）のマススペクトルを、質量対電荷比が２大きくなるようにシフトしたマススペクトルが得られる。図４（ｂ）では、標識していないペプチドと同位体^１８Ｏで標識したペプチドとを等量混合したサンプルのマススペクトルを示している。これより、標識していないペプチドのマススペクトルと、同位体^１８Ｏで標識したペプチドのマススペクトルとは互いに重なってしまう。しかし、それぞれのマススペクトルの波形は、炭素の同位体の存在比により決まっているので、分離することができる。すなわち、炭素同位体を有するペプチドによるピーク（イオン種）を省けば、標識していないペプチドのピーク（イオン種）ｄ０１と、同位体^１８Ｏで標識したペプチドのピーク（イオン種）ｄ１１とを並べて表示できるので、互いの比較を容易にすることができる。

そして、図９に示すように、第１標識データ群７ｂでは、タンパク質やペプチドに１つの同位体^１８Ｏを標識したと想定して、質量数に２を加える書き換えを行っている。すなわち、識別子ｄ１１の質量数は、複製の直後は識別子ｄ０１の質量数１２００を複写して１２００であったところ、書き換えによって１２００に２を加え１２０２に変更している。また、識別子ｄ１２の質量数は、複製の直後は識別子ｄ０２の質量数６２５を複写して６２５であったところ、書き換えによって６２５に２を加え６２７に変更している。

同様に、第２標識データ群７ｃでは、タンパク質やペプチドに２つの同位体^１８Ｏを標識したと想定して、質量数に４を加える書き換えを行っている。すなわち、識別子ｄ２１の質量数は、複製の直後は識別子ｄ０１の質量数１２００を複写して１２００であったところ、書き換えによって１２００に４を加え１２０４に変更している。また、識別子ｄ２２の質量数は、複製の直後は識別子ｄ０２の質量数６２５を複写して６２５であったところ、書き換えによって６２５に４を加え６２９に変更している。

これらの複製と書き換えでは、図５（ｃ）に示すように、質量分析した結果として得られたピーク（イオン種）ｄ０１、ｄ０２に基づいて、識別子ｄ１１、ｄ２１、ｄ１２、ｄ２２の標識したピーク（イオン種）を生成している。識別子ｄ１１、ｄ２１、ｄ１２、ｄ２２の標識したピーク（イオン種）は、質量分析することなしに取得されているので、それに要する質量分析の時間だけ分析時間を短縮することができる。

次に、図２のステップＳ６で、健常者から採取した標準試料を標識化した標識化試料を生成する。

ステップＳ７で、患者から採取した患者試料を標識化せずに標識化試料に混合し、混合試料を生成する。

ステップＳ８で、分析制御部３（図１参照）の制御のもとで、混合試料を、タンデム質量分析する。なお、混合試料のタンデム質量分析においては、分析中（リアルタイム）に、混合試料から取得される前記質量対電荷比や前記特性データ等の混合特性データを、内部データベース７に記憶し、同一イオン種の重複測定を省く。さらに、内部データベース７には、標識化に対応するデータも記憶されているので、標識されたイオン種を質量分析することなしに同定したり定量解析したりすることができ、最終的に変動イオンを抽出し特定することができる。

ステップＳ８の混合試料のタンデム質量分析でも、ステップＳ１の標準試料のタンデム質量分析と同様に、図３に示すフローチャートに従って分析が行われる。

まず、試料１０を標準試料から混合試料に替えて、ステップＳ１１、Ｓ１２、Ｓ１３を実施する。このことにより、図５（ｄ）に示すようなマススペクトルが得られる。そして、ステップＳ１４を実施することにより、図５（ｅ）に示すようなマススペクトルが得られる。図５（ｃ）と図５（ｅ）を比較すると、標識されていないピークｄ０１、ｄ０２の質量対電荷比と等しいところに患者由来のピークｄ００１、ｄ００２が計測され、標識されているピークｄ１１、ｄ２１、ｄ１２、ｄ２２の質量対電荷比と等しいところに健常者由来のピークｄ０１１、ｄ０２１、ｄ０１２、ｄ０２２が計測されている。このため、ステップＳ１６において、ピークｄ００１、ｄ００２、ｄ０１１、ｄ０２１、ｄ０１２、ｄ０２２は、内部データベース７に一致するデータを有することになる。このため、ピークｄ００１、ｄ００２、ｄ０１１、ｄ０２１、ｄ０１２、ｄ０２２を、ＭＳ^２の親イオンの対象から外すことができる。それ以外のピークに対してＭＳ^２の分析を実施すれば良いので、ＭＳ^２の分析（Ｓ１９）の回数を減らすことができ、分析時間を短縮することができる。

なお、ステップＳ８の混合試料のタンデム質量分析では、ステップＳ１の標準試料のタンデム質量分析と異なり、ステップＳ１６−６において、不一致イオンだけでなく、強度の変動した変動イオンも抽出する。具体的には、図１０（ａ）と図１０（ｂ）に示すように、標識したピークの質量対電荷比をシフトさせ、対応するピーク同士の強度を比較する。強度が異なっている場合は、患者ゆえに発現量が異なっていると考えられるので、このイオン種を変動イオンと特定することができる。なお、不一致イオンも強度が異なっている場合と考えられ、変動イオンと特定することができる。

第１の実施形態によると、同位体標識していないデータを用いて、同位体標識時のデータを加工することにより、同位体標識データの取得を省くことができる。また、同位体標識していないデータに基づいて、抜けなく同位体標識時のデータを加工することができる。同位体標識データの取得を省くことで、分析時間を短縮できるので、リアルタイムの分析が可能となる。

（第２の実施形態）
第２の実施形態では、試薬として、タンパク質やペプチド内のアミノ酸残基の修飾基が置き換わることで標識される化学標識試薬を用いた場合について説明する。図１１に示すように、非標識データ群７ａからリン酸基の付くアミノ酸残基を有するデータを抽出して複製し、第１標識データ群７ｂを生成する。

第１標識データ群７ｂでは、タンパク質やペプチドに１つのリン酸基を標識（修飾）したと想定して、質量数に９８を加える書き換えを行っている。すなわち、識別子ｄ１１の質量数は、複製の直後は識別子ｄ０１の質量数１２００を複写して１２００であったところ、書き換えによって１２００に９８を加え１２９８に変更している。また、識別子ｄ１２の質量数は、複製の直後は識別子ｄ０２の質量数６２５を複写して６２５であったところ、書き換えによって６２５に９８を加え７２３に変更している。第２の実施形態によると、標識（修飾）していないデータを用いて、標識（修飾）時のデータを加工することにより、標識（修飾）データの取得を省くことができる。また、標識（修飾）していないデータに基づいて、抜けなく標識（修飾）時のデータを加工することができる。標識（修飾）データの取得を省くことで、分析時間を短縮できるので、リアルタイムの分析が可能となる。

また、第２の実施形態の特有の効果を得るために、図３のステップＳ１６−３で修飾データに一致するピーク（イオン種）をＭＳ^２の親イオンに設定しても良い。これにより、修飾されたイオン種を優先的にＭＳ^２分析でき、翻訳後修飾したイオン種を優先的に抽出分析することが可能となる。

また、修飾基による標識であっても、図１２（ａ）に示すように、ユーザインタフェース９を介して、ユーザが標識化特性データの生成の決定が容易にできるように支援することができる。ユーザは、画面表示９ａを見て、「Ｙｅｓ」の表示の横の丸にクリックして黒丸を入力することで、内部データベース７の加工追加を決定することができる。内部データベース７の加工追加を決定した場合は、図１２（ｂ）に示すような画面表示９ｄをユーザに見せて、ユーザが想定している修飾基種の個数の指定が容易にできるように支援する。さらに、図１２（ｃ）に示すような画面表示９ｅをユーザに見せて、ユーザが想定している修飾基の指定が容易にできるように支援する。ユーザは、たとえば、「メチル機」の表示の横の四角内にチェックを入力することで、修飾種にメチル基を指定することができる。また、ユーザは、たとえば、「リン酸基」の表示の横の四角内にチェックを入力することで、修飾種にリン酸基を指定することができる。

本発明の第１の実施形態に係る質量分析装置の構成図である。本発明の第１の実施形態に係る質量分析方法（変動解析方法）のフローチャートである。本発明の第１の実施形態に係る質量分析方法における試料の分析のフローチャートである。（ａ）は炭素の同位体に起因するスペクトル形状を説明するための図であり、（ｂ）は炭素の同位体と酸素の同位体に起因するスペクトル形状を説明するための図である。（ａ）は健常者から採取した標準試料の分析によって得られたスペクトルであり、（ｂ）は標準試料のスペクトルから炭素の同位体のピークを省いたスペクトルであり、（ｃ）は酸素の同位体で標識した場合を想定して標準試料のスペクトルを複製し書き換えたスペクトルであり、（ｄ）は健常者から採取した標準試料を標識化した試料と患者から採取した試料とを混合した混合試料の分析によって得られたスペクトルであり、（ｅ）は混合試料のスペクトルから炭素の同位体のピークを省いたスペクトルである。第１の実施形態の標準試料分析時の分析データ記憶部に記憶されたデータ構造を示す図である。（ａ）は第１の実施形態のユーザ入力部（ユーザインタフェース）の画面表示（その１）であり、（ｂ）は第１の実施形態のユーザ入力部（ユーザインタフェース）の画面表示（その２）であり、（ｃ）は第１の実施形態のユーザ入力部（ユーザインタフェース）の画面表示（その３）である。第１の実施形態の標準試料分析時の内部データベースに記憶されたデータ構造を示す図である。第１の実施形態の標準試料分析後（混合試料分析前）の内部データベースに記憶されたデータ構造を示す図である。（ａ）は健常者から採取した試料の分析によって得られたスペクトル（第１標識データ群）であり、（ｂ）は患者から採取した試料の分析によって得られたスペクトル（非標識データ群）である。第２実施形態の標準試料分析後（混合試料分析前）の内部データベースに記憶されたデータ構造を示す図である。（ａ）は第２の実施形態のユーザ入力部（ユーザインタフェース）の画面表示（その１）であり、（ｂ）は第２の実施形態のユーザ入力部（ユーザインタフェース）の画面表示（その２）であり、（ｃ）は第２の実施形態のユーザ入力部（ユーザインタフェース）の画面表示（その３）である。

符号の説明

１質量分析装置
２制御部
３計測制御部
４標識化特性データ生成支援部
５複製部
６書き換え部
７内部データベース（ＤＢ）
８分析データ記憶部
９ユーザ入力部
１０試料（標準試料、混合試料）
１１前処理系
１２イオン化部
１３質量分析部
１４イオン検出部
１５データ処理部（ＣＰＵ）
１６表示部・入力部

Claims

試料中に含まれる複数の物質を分離する前処理系と、前記複数の物質をイオン化した複数のイオン種を生成するイオン化部と、前記複数のイオン種の中から親イオンを選択し前記親イオンを解離した複数の解離イオンの質量分析を行う質量分析部と、前記質量分析部で取得される前記複数のイオン種の質量対電荷比と前記前処理系で取得され前記複数のイオン種を識別可能な特性データとを記憶するデータベースとを有し、前記質量分析部では、前記複数の解離イオンを前記複数のイオン種に替えて前記親イオンの選択と前記解離イオンの質量分析を繰り返しながら、前記データベースに基づいて前記親イオンを前記選択する質量分析装置において、
試薬を使用するか否かの指定をユーザにより入力されるユーザインタフェースを有し、
前記ユーザインタフェースでは、前記ユーザによる前記試薬の種類の指定を可能にし、
前記ユーザにより前記試薬の種類が指定されると、制御部が、前記データベースにおいて、前記試薬により標識される前記複数の物質がイオン化した前記複数のイオン種の前記質量対電荷比と前記特性データとを複製し、複製された前記質量対電荷比を、前記試薬により前記複数の物質が標識された場合の質量数の増減に基づいて書き換えることを特徴とする質量分析装置。
前記試薬は、前記複数の物質内の元素が安定同位体に置き換わることで標識される標識試薬であることを特徴とする請求項１に記載の質量分析装置。
前記元素は、酸素と窒素の少なくともどちらか一方であることを特徴とする請求項２に記載の質量分析装置。
前記試薬は、前記複数の物質内のアミノ酸残基の修飾基が置き換わることで標識される化学標識試薬であることを特徴とする請求項１に記載の質量分析装置。
前記データベースは、
前記質量対電荷比に替えて、前記イオン種の質量数と価数とを記憶していることを特徴とする請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の質量分析装置。
炭素の同位体に起因して前記質量対電荷比の異なる前記複数のイオン種を前記親イオンとして選択しないことを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の質量分析装置。
前記データベースは、
前記複数のイオン種毎に、前記質量対電荷比に対するスペクトルの強度と面積の少なくとも１つを記憶していることを特徴とする請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の質量分析装置。
試料中に含まれる複数の物質を分離する前処理ステップと、前記複数の物質をイオン化した複数のイオン種を生成するイオン化ステップと、前記複数のイオン種の中から親イオンを選択し前記親イオンを解離した複数の解離イオンの質量分析を行う質量分析ステップとを有し、前記質量分析ステップでは、前記複数の解離イオンを前記複数のイオン種に替えて前記親イオンの選択と前記解離イオンの質量分析を繰り返しながら、前記質量分析ステップで取得される前記複数のイオン種の質量対電荷比と前記前処理ステップで取得され前記複数のイオン種を識別可能な特性データとを記憶するデータベースに基づいて前記親イオンを前記選択する質量分析方法において、
制御部が、その質量分析方法を用いて試薬により標識されていない基準となる標準試料の分析をして得られた前記質量対電荷比と前記特性データとに基づいて作成された前記データベースに対して、前記試薬により標識される前記標準試料中に含まれる前記複数の物質がイオン化した前記複数のイオン種の前記質量対電荷比と前記特性データとを複製し、複製された前記質量対電荷比を、前記試薬により前記複数の物質が標識された場合の質量数の増減に基づいて書き換え、再度、その質量分析方法を用いて、前記標準試料と比較したい前記試薬により標識されていない変動解析対象試料と、前記試薬により標識された前記標準試料とを混合した混合試料の分析をすることを特徴とする質量分析方法。