JP2006528339A - クロマトグラフィー／質量分析における生体分子パターンのアノテーション法及びシステム - Google Patents

Abstract

本発明の方法及び測定システムはクロマトグラフィーと質量分析の複合分析を実施するためのもので、Ｃ／ＭＳ分析を実施する段階（３００）と、少なくとも１つの第一の溶出プロファイルを生成する段階（３０５）であって、１つの次元がクロマトグラフィーの溶出時間であり、１つの次元が質量／電荷比（ｍ／ｚ）であり、少なくとも１つの次元がシグナル強度であり、各生体分子種由来のシグナルが分散して各生体分子種について複数のシグナルピークを溶出プロファイルに形成する段階と、溶出プロファイル中のある生体分子種由来の分散シグナルを再構築する段階（３１０）とを含む。再構築段階は、同一生体分子種由来の溶出プロファイルのシグナル変化を再構築するように適合化された自動アノテーションと生体分子マップの作成とを含む。自動アノテーションは溶出時間次元とｍ／ｚ次元の両者に同時に基づく。
【選択図】 図２ｃ

Description

本発明は、ペプチドのような生体分子の混合物を含有する生体試料について、個々の生体分子の同定、特性決定及び定量のための研究に関し、さらに具体的には、様々な実験及び生物学的条件で個々の生体分子の少なくとも一部の相対存在比をプロファイリングし、適宜、同定又は追加の特性決定を行うための生体分子のサブセットを定義する方法及びシステムに関する。

生体試料中のタンパク質含量の普及した研究法は、二次元ゲル電気泳動を質量分析と組み合わせて用いることによるものである。例えば、Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｓ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．２００１，１２０，３７９−３８４参照。二次元ゲル電気泳動は、分子量が約１０ｋＤａを超える分子の分析に制限され、この下限を下回るタンパク質及びペプチドの含量に包括的に対処できる確立された方法は存在しない。

このような低分子量タンパク質及びペプチド分子の多くは、数多くの生物学的プロセスで重要な役割を果たしており、生体試料中のペプチド含量のルーチン分析法が出現すれば格段の進歩といえる。液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を質量分析（ＭＳ）と組み合わせた方法は、生体試料固有の複雑さを取り扱うことができるプロテオミクスにおける有望なツールとして浮上しており、ＬＣとＭＳの組合せの有用性を示す発表論文数も次第に増加している。“Ａ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ．”， Ｓｋｏｌｄ Ｋ， Ｓｖｅｎｓｓｏｎ Ｍ， Ｋａｐｌａｎ Ａ， Ｂｊｏｒｋｅｓｔｅｎ Ｌ， Ａｓｔｒｏｍ Ｊ ａｎｄ Ａｎｄｒｅｎ， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２，４４７−４５４には、オンラインナノスケールキャピラリー逆相液体クロマトグラフィー（ＣＲＰ ＬＣ）後にエレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型質量分析（Ｑ−ＴＯＦ ＭＳ）を行うことによって、３００〜５０００Ｄａの質量範囲の神経ペプチドを分析できることが記載されている。この論文には、実験及び生物学的条件の異なる試料で個々の生体分子の相対存在比、及び試料間の示す差異をどのようにプロファイリングできるか記載されている。生体分子を含有する試料をナノスケールＣＰＲ ＬＣ及びＱ−ＴＯＦ ＭＳにかける。各ランで溶出プロファイルが得られる。溶出プロファイルにおける個々のデータポイントは強度又はイオン数を表し、ＭＳ検出器で特定のクロマトグラフィー溶出時間と特定のｍ／ｚ値について得られる。これらの溶出プロファイルの３Ｄ図が表示されており、ｙ軸はｍ／ｚ比、ｘ軸は溶出時間、ｚ軸はイオン数を表している。異種試料間の比較は、異なる試料の３Ｄ表示で類似領域を手作業で選択し、これらの領域内でイオン数を積算し、対応領域間の積算イオン数を比較することによって行われている。

ＬＣ／ＭＳ分析は、溶出時間の次元とｍ／ｚの次元における各生体分子種由来のシグナル分散として説明でき、各ペプチド種は通例、溶出プロファイルに複数のピークを生じる。質量分析計の分解能が十分に高ければ、同一生体分子種の異なる同位体は溶出プロファイルで分離される。別のタイプのシグナル分散は実験方法によって生じる。さらに、実験操作中に生体分子が異なる荷電状態を取ることもある。荷電状態が異なると、溶出プロファイルの異なる位置に出現する。さらに別のタイプの分散は、試料の化学的前処理、例えば質量標識に起因することもある。異なる試料間での生体分子種の相対存在比を正確に比較するには、あるペプチド種由来のシグナルの分散を考慮する必要がある。Ｓｋｏｌｄ他の方法では、ある生体分子種の異なる同位体を手作業で同定し、アノテーションプロセスで再構築している。荷電状態の差は考慮されていない。異なる試料で得た３Ｄ表示間の比較は、異なる試料の３Ｄ表示で類似する領域を手作業で選択し、スポットのイオン数を積算し、対応領域間の積算イオン数を比較することによって行われている。ＬＣカラムでの試料の溶出時間はラン毎に変動しかねないので、様々な溶出プロファイル表示を単純に重ね合わすことができず、それらを比較するには様々な表示上での対応領域を手作業で同定、選択、マーキングしなければならない。

手動アノテーション及び異なる溶出プロファイル（試料）における対応領域の手動検出プロセスはいずれも多大な労力を必要とし、時間がかかる。手動法は大規模実験や工業的用途には有用ではない。

ＬＣ／ＭＳデータの自動処理法が何例か報告されている。Ｐｅａｒｃｙ ａｎｄ Ｌｅｅ， Ｊ ａｍ ｓｏｃ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍ，１２，（２００１）５９９−６０６：“ＭｏＷｅＤ， ａ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｐｒｏｇｒａｍ ｔｏ ｒａｐｉｄｌｙ ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅ ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｒｕｎｓ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔｓ”；及びＷｉｌｌｉａｍｓ， Ｌｅｏｐｏｌｄ ａｎｄ Ｍｕｓｓｅｒ， Ａｎａｌ ｃｈｅｍ ７４，（２００２）５８０７−５８１３：“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐｏｓｔｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ＬＣ／ＭＳ ｄａｔａ ｆｏｒ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ”にみられるような多くの方法では、個々の質量スペクトルを変換法でデコンボリューションする。これらの方法はペプチドの対応ピークの自動検出法を提供し、同一ペプチド種由来の分散シグナルをある程度取り扱うことができる。しかし、同時に処理される質量スペクトルは１個だけ又はほんの２〜３個で、スペクトル変換が用いられるので、弱いシグナルは無視されることが多い。さらに、これらの方法は、１又は２〜３のスペクトルに現れる偽ノイズピークがペプチド由来のピークであると誤解されやすいので、ノイズに弱い。この問題の影響を軽減すべくハードフィルタリングを用いるので、感度が下がる。

Ｈａｓｔｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．， Ｒａｐｉｄ ｃｏｍｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍ １６，（２００２）４６２−４６７：“Ｎｅｗ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｐｅａｋ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｄａｔａ”には、上述の溶出プロファイルと同様の二次元表示で実施される「ｖｅｃｔｏｒｉｚｅｄ ｐｅａｋ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」と呼ばれるピーク検出法が開示されている。ピークと考えられる位置（溶出時間、ｍ／ｚ）に関しては、質量スペクトルにおけるピークであると共に溶出時間次元におけるピークでなければならない。この方法は例えば偽ノイズピークを回避するのには有効であるが、分散シグナルの問題には対処していない。

上述の研究はＬＣ／ＭＳ法の有用性を明らかにしているが、ＬＣ／ＭＳ分析を生体試料中のペプチド含量のルーチン分析に使用できるようにするには、追加の条件を満たす必要がある。最も重要なことは、その方法で大量のデータをスクリーニングでき、しかも様々な実験及び生物学的条件で個々の生体分子の一部の相対存在比をプロファイリングできなければならないことである。この点で、上記方法は、溶出プロファイルのシグナル分散の問題に対処しなければならない。典型的な実験で生成する膨大な量のデータのため、この方法は少なくとも部分的に自動化する必要がある。

さらに、魅力的な方法は、結果を確認・検証する手段を提供する必要がある。これは、完全自動化法及び／又は多変量解析のような最新の統計法を使用する場合には、特に重要である。いくら統計手段が高い精度を示したとしても、通常は強力な解析法が場合によっては不正確又は誤った結果をもたらすおそれがあるからである。こうした場合、最終結果又は中間結果を例えば未処理の溶出プロファイルと対比することができれば非常に有用である。
Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｓ．，Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．２００１，１２０，３７９−３８４ "Ａ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ．"， Ｓｋｏｌｄ Ｋ， Ｓｖｅｎｓｓｏｎ Ｍ， Ｋａｐｌａｎ Ａ， Ｂｊｏｒｋｅｓｔｅｎ Ｌ， Ａｓｔｒｏｍ Ｊ ａｎｄ Ａｎｄｒｅｎ， Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２，４４７−４５４ Ｐｅａｒｃｙ ａｎｄ Ｌｅｅ， Ｊ ａｍ ｓｏｃ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍ，１２，（２００１）５９９−６０６："ＭｏＷｅＤ， ａ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｐｒｏｇｒａｍ ｔｏ ｒａｐｉｄｌｙ ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅ ｌｏｗ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｒｕｎｓ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔｓ" Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｌｅｏｐｏｌｄ ａｎｄ Ｍｕｓｓｅｒ， Ａｎａｌ ｃｈｅｍ ７４，（２００２）５８０７−５８１３："Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐｏｓｔｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ＬＣ／ＭＳ ｄａｔａ ｆｏｒ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ" Ｈａｓｔｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．， Ｒａｐｉｄ ｃｏｍｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍ １６，（２００２）４６２−４６："Ｎｅｗ ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｐｅａｋ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｄａｔａ" Ｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，"Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｍａｓｓｅｓ ａｎｄ Ｉｏｎ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｌａｒｇｅ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｒｏｍ ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ"， Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ， １９９５， ６， ２２９−２３３

本願発明の課題は、様々な実験及び生物学的条件で個々の生体分子の一部について相対存在比をプロファイリングするための、実際の実験で通例生成する膨大な量のデータに適合化したＬＣ／ＭＳデータ解析法及び測定システムを提供することである。さらに、これらは好ましくは、高レベルの結果をそのソースデータの起点まで遡って追跡できるべきであり、また追加の分析のため生体分子種のサブセットの定義が可能であるべきである。

上記の課題は、請求項１に記載の方法、請求項１９に記載の測定システムと、請求項２３に記載のコンピュータプログラムプロダクトによって解決される。さらに改良された方法及び測定システムは各従属請求項に記載された特徴を有する。

本発明のクロマトグラフィーと質量分析の複合分析（Ｃ／ＭＳ）を実施する方法は、以下の段階を含む。
・Ｃ／ＭＳ分析を実施する段階。
・少なくとも１つの第一の溶出プロファイルを生成する段階。ここで、第一の溶出プロファイルはＣ／ＭＳ分析で得られたデータの多次元表示であり、１つの次元はクロマトグラフィーの溶出時間であり、１つの次元は質量／電荷比（ｍ／ｚ）であり、少なくとも１つの次元はシグナル強度である。溶出プロファイルはシグナル強度に特徴的変化を有しており、その特徴的変化が特定の生体分子種の存在の指標となる。
各生体分子種由来のシグナルは分散して、各生体分子種について複数のシグナルピークを溶出プロファイルに形成する。
・溶出プロファイル中のある生体分子種由来の分散シグナルを再構築する段階。再構築段階は、同一生体分子種由来の溶出プロファイルのシグナル変化を再構築するように適合化された自動アノテーションと生体分子マップの作成とを含む。自動アノテーションは少なくとも溶出時間次元とｍ／ｚ次元の両者に同時に基づく。

本発明の方法の一実施形態では、各生体分子種由来のシグナルの分散は生体分子種の異なる同位体及び／又は荷電状態の存在に起因し、自動アノテーションは、実質的に各生体分子種について生体分子種の異なる同位体及び／又は異なる荷電状態の両者に起因するシグナル分散を再構築する。

別の実施形態では、試料は、異なる化学標識で処理された生体分子種を含み、少なくとも第一の標識を有する第一の化学標識生体分子と第二の標識を有する第二の質量標識生体分子とを生じる。化学的差異によって溶出プロファイルにシグナルのさらなる分散が起こり、自動アノテーションは、化学標識で生じたシグナル分散を再構築する。

別の実施形態では、自動アノテーションは、分散シグナルの再構築に質量分析計の分解能に関する知見を用いる。

本発明のさらに別の実施形態では、分散シグナルの再構築における自動アノテーションは、分散シグナルの再構築における同一生体分子種の異なる荷電状態及び／又は異なる同位体の関係に関する先験的仮定を用いる。これと別個に或いはこれとの組合せとして、自動アノテーションは、例えば再構築プロセスにおける異なる荷電状態間のシグナルパターンなどでの分析で検出された類似点を用いる。

本発明で得られる利点の一つは、自動アライメントによって、大量のデータをスクリーニングでき、しかも異なる試料間での一部の生体分子種の相対存在比をプロファイリングできるようになることである。

もう一つの利点は、コンセンサスプロファイルで得られるシグナル強度の増大を、存在量の低い生体分子種の概して弱いシグナルの検出に利用できることである。

別の利点は、本発明の方法では、高レベルの結果をそのソースデータの起点まで遡って追跡でき、追加の分析のための生体分子種のサブセットを定義することができることである。

本発明の上述の特徴及び利点について、図面と共に以下の詳細な説明でさらに詳しく説明する。なお、図面全体を通して類似の要素には類似の符号を付した。

生体系のクロマトグラフィー／質量分析（Ｃ／ＭＳ）法は、通例、研究対象の生体系で様々な状態を呈する複数の試料をＣ／ＭＳ複合機器にかけることによって実施される。クロマトグラフィーは分離法として、質量分析は検出法として把握することができる。生体分子の分離に現在最も多用され最も有望な方法には、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）が含まれる。ただし、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）などその他の分離法も使用できる。本発明の方法及び装置を、液体クロマトグラフィーを例にとって説明するが、これに限定されるものではない。本発明の方法によるＬＣ／ＭＳ分析の実施に適した機器構成（図１にその概略を示す）は、試料導入口１１０、キャリア導入口１１５、流量制御ユニット１２０、１以上のクロマトグラフィーカラム１２５、質量分析計インターフェース１３０、質量分析計１３５、制御ユニットのような制御手段１４０、及び解析ユニットのような解析手段１４５を備える。液体クロマトグラフは典型的には逆相カラムからなり、例えばＬＣ Ｐａｃｋｉｎｇｓ社（オランダ国アムステルダム）又はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｎｎｉｇａｎ社（米国サンノゼ）から市販されている。質量分析計は好ましくは飛行時間型（ＴＯＦ）型又はトリプルステージ四重極型（ＴＳＱ）の原理で動作するものであるが、その他のＭＳ機器も考えられる。本発明による測定システムに適した市販の分析計及びエレクトロスプレーユニットは、例えばＭｉｃｒｏｍａｓｓ社（英国マンチェスター）及びＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ社（米国サンノゼ）から入手し得る。本発明の方法及び装置には高分解能の質量分析計を使用するのが特に好ましいが、本発明の方法は、低分解能の質量分析計を含む機器構成の性能を劇的に向上させるのに使用することもできる。制御手段１４０及び解析手段１４５は、計算負荷がかなりのものになると予想されるので、典型的には計算能力と記憶容量の高い１以上のＰＣによって実現される。制御手段１４０及び解析手段１４５はクロマトグラフィーカラム１２５及びＭＳ１３５と接続しており、例えば試料の調製又は輸送を担うその他のユニット（図示せず）と接続することも可能である。本発明の方法は、好ましくは少なくとも部分的に自動化され、制御手段１４０及び／又は解析手段１４５で記憶・実行される１以上のソフトウェアプログラムとして実現される。以上で例示した機器構成を用いることによって、背景技術の項で説明したタイプの溶出プロファイルを作成することができる。溶出プロファイルの一例を図２ａに示すが、ｙ軸はｍ／ｚ比、ｘ軸は溶出時間ｔ、ｚ軸はイオン数Ｉを表す。試料中の各生体分子は、通例、以下でさらに詳しく説明する通り、ｚ次元に特徴的変化、ピークを生ずる。例えば異なる同位体及び異なる荷電状態の存在に起因して、各生体分子種は通例複数のピークを生じる。

当業者には明らかであろうが、上記の特徴をもつ溶出プロファイルの作成に適した機器構成は様々な方法で実現することができ、上記の説明は本発明の方法の実施に適合した機器構成の非限定的な例とみなすべきである。

本明細書において、本発明の方法及び測定機器構成の使用を生体系のペプチドの分析を例にとって説明する。ペプチドは多くの生物学的プロセスにおける重要性のため特に関心が高い。ペプチドは天然のものでも、完全長タンパク質をトリプシンのような酵素で消化して得られたものでもよい。ただし、本発明の方法及び装置はペプチドの研究に限定されるものではない。広範な生体分子、特に質量１０ｋＤａ未満の分子を本明細書に開示した方法及び装置で好適に分析できる。生体分子という用語は、単一の生体分子及び生体分子複合体の両者を包含するものと解釈すべきである。

プロテオミクス実験は、典型的には、複数の種、例えば患者、動物、コロニーなどの被験体の処理群と対照群とを含み、膨大かつ多様なデータセットが生成される。ＬＣ／ＭＳ分析は、溶出時間の次元とｍ／ｚの次元における各ペプチド種由来のシグナルの分散として説明できる。この大量のデータセットとシグナルの分散が情報処理上の問題をなす。本発明の方法では、膨大な量のデータを、詳細化データ表示と元の溶出プロファイルを交互に使用し、溶出プロファイルから作成されたペプチドマップを用いて処理する。詳細化データ表示は、例えば、幾つかの溶出プロファイルのデータを結合したコンセンサス溶出プロファイル、或いは個々の溶出プロファイルの差異を強調した示差プロファイルである。この方法全体を通して、詳細化データ表示を用いるものの、結果の確認のため「逆戻り」できて、しかも既に収集したデータの追加分析の実施又は追加分析プロセスの開始ができるように、好ましくは生データ及び生データと詳細化データとのリンクが常に保存される。生データの保存、併せて詳細化データとそれに対応する元の生データを二者択一的に使用できることは、本発明の方法で得られた結果の信頼性をチェックするのに有用である。

本発明の方法では、関心のもたれる領域、即ち一組の試料で興味深い変化を示すペプチドに相当する領域を、ペプチドを同定する前に、その変化の挙動に基づいて選択し得る。選択の前にペプチドを同定しようとせずに、異なるプロファイル間での興味深いシグナル変化を有する領域を検出し、追加の分析のため問題とされる領域を選択するという思想は本発明の一部とみなす。

上述の通り、ＬＣ／ＭＳ分析は、溶出時間及びｍ／ｚの次元における各ペプチド種由来のシグナルの分散として説明することができ、各ペプチド種は通例溶出プロファイルに複数のピークを生じる。質量分析計の分解能が十分に高い場合、同一ペプチド種の異なる同位体は、溶出プロファイルで分離される。図２ｂに例示されるように、特徴的な「同位体ラダー」２０５を、溶出プロファイルに見ることができる。別のタイプのシグナル分散が、実験方法によって生ずる。一般に使用される、質量分析計のエレクトロスプレーインターフェースは、付加イオンの数の異なる何種類かの分子付加イオン複合体を、しばしば生成する。これらを、異なる荷電状態のペプチドと呼ぶ。質量分析計が、質量だけではなくて質量／電荷比を測定するとき、これら異なる荷電状態は、溶出プロファイルの異なる位置で終わる。したがって、１つのペプチド種が幾つかの荷電状態で現れる可能性があるが、それぞれは、図２ｃに示すように幾つかの分子同位体からなるものである。ｉ個の追加中性子を含有し、ｚ個の付加イオンと凝集した（荷電状態）質量Ｍのペプチド種の場合、ピークは以下の式で予測することができる。

式中、同位体同士の間隔、及び付加イオンの質量は、正確に１Ｄａであると仮定する。図に示されるように、同一ペプチド種の異なる同位体間の「距離」は、１／ｚになる。

異なる同位体の分離が識別可能であるか否かは、質量分析計の分解能に依存する。また質量分析計の分解能は、ｍ／ｚに依存する。ペプチド種は、同位体が分離して、即ち、低ｚの荷電状態では明確なピークとして、また、より高いｚに対しては、幾つかの同位体を含む、より不明確な「小塊」として、通常溶出プロファイルに現れよう。

例えば、異なる試料同士で、ある特定のペプチド種の存在量を比較するには、ほとんどの用途において、同一ペプチド種から生じた全てのピークを再構築し又はリンクすることが有利である。再構築する目的は、溶出プロファイルに対応したペプチドマップを作成することである。ペプチドマップでは、１つの溶出プロファイルで各ペプチド種に関係する全ての分散シグナルを、可能な場合には一緒にする。

通常は異なる試料によって表される（したがって異なる溶出プロファイルである）、異なるペプチド種同士の相対存在比、及び／又は異なる実験及び生物学的条件でのある特定のペプチドの存在量の変化を比較できるようにするには、個々の溶出プロファイルで表される異なる試料間でペプチド種とペプチドマップをリンクさせる必要もあり、それによって、包括的アノテーションが行われる。包括的アノテーションは、以下に述べるように、自動マッチングプロセスによって実現することが好ましい。

同一ペプチド種の異なるピーク間の理論的な関係が、上記事項により知られているとしても、ペプチドマップの作成とマッチングは、実際には、些細な作業ではない。複雑な問題が幾つかの要因から生ずる。典型的な試料には、多数の異なるペプチドが存在し、ピークが非常に近接し又は重なり合う可能性があり、実験の不確かさを考慮に入れると、例えば正しい荷電状態が特定のペプチドによるものだとすることが困難になる。さらに、通常は、全ての荷電状態が表されるとは限らず、それらの関係はわかっていない。ノイズは、バックグラウンドノイズレベルとして、且つ偽ノイズピークとして常に存在する。ノイズによって、誤って同定されたペプチドピークになる可能性がある。特に重要な、ある複雑な問題は、実験のばらつきによって引き起こされるが、そのほとんどは、溶出時間中の予測不可能なばらつきであると言える。同一試料からの溶出プロファイルは、互いに比較するときに、溶出時間内でシフトさせることができ、且つ／又は圧縮することができ、又は拡張することができる。本発明の方法は、各溶出プロファイルごとに又は溶出プロファイルの群からペプチドマップが作成される適合化された自動アノテーションプロセスを提供する。この方法は、高い品質及び信頼性のペプチドマップを作成し、さらに重要なことは、アノテーションプロセスに必要とされる時間が、従来技術の方法に比べて著しく短縮されることである。本発明の方法は、その他の特徴の中でも、荷電状態と同様に同位体を再構築することが可能な点が、自動アノテーションの従来技術の方法とは異なっている。さらに本発明の方法は、非常に弱いシグナルを検出することができ、自動アノテーションによって処理することができるので、増大した有効感度を提供する。これは、ピーク検出が溶出時間の次元とｍ／ｚの次元との両方で同時に実施されるので可能であるが、ピークは両方の次元で拡張部を有する必要があり、ノイズに対してそれほど感度の高くない検出法をもたらすものである。

アノテーションによって作成されたペプチドマップは、マッチングプロセスに対する入力である。マッチングの結果、並びに必要とされる処理時間は、アノテーションの品質、即ちペプチドマップに非常に左右される。正確で信頼性あるペプチドマップを与える本発明による自動アノテーション方法は、効果的で正確なマッチングプロセスに必要であり、したがって正しい包括的アノテーションを実現するのに必要である。包括的アノテーションは、実験の、信頼性ある統計評価にも必要である。

試料の、異なるタイプの化学的前処理は、生体分子の質量に差を引き起こす可能性もあり、したがって、シグナルの分割を引き起こす可能性がある。これらの差が望まれたものであり、ある種の分析を容易にする目的のものであったとしても、これらの差の影響は、溶出プロファイルの生体分子ピークの再構築において明らかにしなければならない。本発明による自動アノテーションの方法は、このタイプの望ましい質量差にも容易に適合される。

本発明の方法の、複数の分析段階では、分析を、溶出時間とｍ／ｚとによって画定された二次元空間で実施する。これは、一見すると複雑であるように見えるが、例えば、各ペプチドから広がったシグナルを再構築するプロセスを、簡単にすることが示される。溶出プロファイルの、溶出時間の次元とｍ／ｚの次元との両方を同時に使用する概念は、有利である。

図３のフローチャートを参照しながら以下に記述する、本発明の方法の主な段階は、以下の段階を含む。
・Ｃ／ＭＳ分析を実施する段階３００。
・第一の溶出プロファイルを作成する段階３０５。
・自動アノテーションプロセスによって分散シグナルを再構築しペプチドマップを作成する段階３１０。ペプチドマップでは、１つの溶出プロファイルの、各ペプチド種に関係した全ての分散シグナルが、可能な場合には一緒になり、例えばあるペプチド種の異なる荷電状態及び同位体が再構築される。自動アノテーションは、溶出時間の次元とｍ／ｚの次元の両者に同時に基づくものである。
・個々のペプチドマップを互いにマッチングさせる段階３１５。マッチングは、例えば異なる実験及び生物学的条件を示す、異なる試料間でペプチド種を結び付け、包括的アノテーションを行う。
・異なる実験及び生物学的条件間での個々のペプチド種の一部の相対存在比をプロファイルするための測定及び評価を実施する段階３２０。存在量プロファイルは、先の段階で得られた包括的アノテーションに基づく。
・適宜、追加の分析のためのペプチド種のサブセットを定義する段階３２５。サブセットは、例えばＭＳ／ＭＳを使用して、さらなる特性決定及びおそらくは同定に向けた「問題とされるペプチド」を定義する。サブセットは、自動的に又は手動で定義することができる。

この方法の段階について、以下に詳細に記述する。

Ｃ／ＭＳ分析の実施３００及び第一の溶出プロファイルの作成３０５
２種以上の生体分子含有試料を、上述の機器構成に従うＬＣ／ＭＳ複合機器にかける。これらの試料は、典型的な場合、研究がなされる生体系の異なる状態を示すことになる。最も単純なケースは、２つの異なる実験条件では存在量に大きな変化のある生体分子種を、強調することを目的とした示差的実験である。より発展した実験設計では、３以上の条件があり、且つ／又は反復を導入し、即ち１つの実験条件に対して複数の試料を使用するのである。十分確立された統計法を使用することによって、異なる条件同士での存在量の変化に対し、統計上の有意性を割り当てることが可能である。

図１による測定システムは、本発明の方法を実施するのに使用する。各実験操作毎に、溶出プロファイルが得られる。溶出プロファイルでの個々のデータポイントのそれぞれは、特定のクロマトグラフィー溶出時間及び特定のｍ／ｚ値に対してＭＳ検出器から得られた、強度値又はイオン総数を表していた。これらの溶出プロファイルの３Ｄ表示を描いたが、ｙ軸にはｍ／ｚ比、ｘ軸には溶出時間が示され、ｚ軸はイオン総数を表していた。ある場合には、測定システムの特性に応じて、ｍ／ｚ次元でのサンプリングの差を補償するために再サンプリングが必要とされる。これは、確立された周知のプロセスである。この作成段階は、典型的な場合、一組の第一の溶出プロファイルを生成し、このプロファイルでのシグナル強度の特徴的変化は、特定のペプチド種の存在、又は特定のペプチド種の一部が存在することを示している。

自動アノテーションプロセスによるペプチドマップの作成３１０
本発明の方法による自動アノテーションプロセスは、溶出プロファイルに分散した同一ペプチド種から生じ複数のピークとして現れるシグナルを、自動的に再構築する。これらのピークは、典型的な場合、明確なものから弱いものにまで及び、同一ペプチド種に関して拡散する。自動アノテーションプロセスは、各溶出プロファイルごとにペプチドマップを作成する。

自動アノテーションアルゴリズムは、溶出プロファイルのシグナル変化のピークにおそらくは対応する一次的特徴を、検出することによって開始する。一次的特徴には、例えば、シグナル強度の極大、形態操作の閾値処理から得られるシード、又は勾配の分析によって選択された位置を含めることができる。スポットは、高強度のコンパクトな領域であり、一次的特徴から開始して検出される。スポットは、機器の分解能がこれらのスポットを分離するほど十分良好ではない場合、個々の同位体ピーク、又は同位体ピークのクラスターに対応させることができる。スポットは、ノイズ及びデータ収集アーチファクトから得てもよい。一次的特徴の検出、及びスポット検出の段階では、ｍ／ｚと溶出時間との両次元でのデータポイントの、局所的な周囲環境を利用する。スポットは、両次元において、少なくとも予め定義された延長部を持たなければならない。このようにして、例えばノイズピークが回避される。

スポットが見出されたら、それをその場に入れる試み、即ち溶出プロファイルのスポットを生じさせるペプチド種の、別の痕跡を見出すよう試みる。前述のように、これらの痕跡は非常に構造化されており、スポットが、ペプチド種のある特定の荷電状態、おそらくはある特定の分子同位体に対応し、その他の分子同位体及び追加の荷電状態に関するスポットもある。標識方法を使用する場合、同一ペプチド種に関して種々に標識されたものに対応するスポットが存在する可能性もある。このように、ペプチド種に対するペプチドマップのエントリーは、単一のスポットから開始して構築される。この段階は、各スポット毎に実施する。

このプロセスの最後の段階は、詳細化（ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）段階であり、２重のエントリーが除去され、重複部分が分解される。ペプチド種は、アルゴリズムによって数回検出される可能性があり（例えば各荷電状態ごとに１回）、それが、ペプチドマップへの２重のエントリーになる。そのような重複は、系統的な比較によって検出され、２重のエントリーは自動的に又は手動により除去される。不十分なクロマトグラフィーによる分離が原因で、２以上のペプチド種が重なっている領域が存在する可能性もある。２つのペプチド種の間に大きい重なりがある領域は、それぞれの種の量を測定するのに使用することができず、したがって、どちらの種のマップエントリーからも除去しなければならず、そうでない場合には、信頼性がないものであることを示さなければならない。

次に図３ａのフローチャートを参照すると、上記事項による自動アノテーション段階３１０は、図３ｂのフローチャートを参照しつつ記述される以下のサブ段階を含む。
・３１０：１ 第一の溶出プロファイルのシグナル変化のピークに対応する、一次的特徴を見出しマークする段階。
・３１０：２ 各スポットが少なくとも１つの一次的特徴を含む、第一の組のスポットを画定する段階。これらのスポットは、ｍ／ｚ次元に可変延長部を有し、溶出時間次元に可変延長部を有する。スポットは、生体分子の特定の荷電状態及び１種又は１群の同位体に対応し、おそらくは特定の化学標識に対応すると仮定される。
・３１０：３ 各スポット毎にペプチドマップエントリーを構築し、即ち既知の構造関係を有する一組の領域を検出し、溶出プロファイルに１つのペプチド種からのパターンを限定する段階。使用するＣ−ＭＳ機器及び標識スキームに応じて、この段階は、サブ段階３１０：３ａ〜ｃの１以上を含む。特定の電荷ｚに関する知見が有意であり且つ一貫したものである場合、それらを使用してペプチドマップエントリーを生成する。適切な電荷がを見出すことができない場合、不完全なペプチドマップがスポット自体から生成される。
・３１０：３：１ 各推定電荷ｚに対して、可能であれば、ｍ／ｚ±１／ｚ、ｍ／ｚ±２／ｚなどで追加の同位体を検出する。
・３１０：３：２ 各推定電荷ｚに対して、可能であれば、（ｍ−１）／（ｚ±１）＋１、（ｍ−１）／（ｚ±２）＋１などで追加の荷電状態を検出する。
・３１０：３：３ 各推定電荷ｚに対して、異なる標識の変種を検出する。ｍ／ｚ及び溶出時間における予測変位は、用いた特定の標識スキームによって決まる。
・３１０：４ ２重のペプチドマップエントリーを、適宜除去する。
・３１０：５ 適宜、重なり合ったペプチドマップエントリーを調節し、又は信頼性のないものであることを示す。
・３１０：６ 適宜、得られたペプチドマップの手動検証。

段階３１０：３で検出された同位体、荷電状態、及び標識の種類の有意性及び一貫性を評価するために、例えば、幾つかの対策を用いることができる。
・ａ）検出された特徴とスポットの間での、溶出時間についてのシグナルパターンに関する類似性。これは、例えば、生体分子種の１つの荷電状態又は同位体に対応するピークの形状が、同一生体分子種の別の荷電状態又は同位体にそれぞれ対応する別のピークの形状と似ているように描くことができる。類似の程度が高い場合、それは、検出された特徴及びスポットが同一ペプチド種から生ずる可能性が高いことを示す。
・ｂ）荷電状態の場合：荷電状態同士の同位体分布の類似性。同一生体分子種の、異なる荷電状態は、類似する同位体分布を示すことを予測することができる。したがって、異なる荷電状態の「同位体ラダー」が高い類似性を示す場合、検出された特徴及びスポットが、同一生体分子種に対応する可能性が高い。
・ｃ）信号対雑音比
・ｄ）シグナル強度
・ｅ）同位体の場合：想定される同位体が所与のペプチド集団に関するものである可能性がどのくらい高いかを示す、所定のモデル同位体分布との類似性。所定のモデル同位体分布、及びそのような分布を得る方法は、Ｓｅｎｋｏ ｅｔ．ａｌ．， “Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｍａｓｓｅｓ ａｎｄ Ｉｏｎ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｌａｒｇｅ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｒｏｍ ｒｅｓｏｌｖｅｄ Ｉｓｏｔｏｐｉｃ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ”， Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ， １９９５， ６， ２２９−２３３に示されている。

以上のように、これらの対策では、ｍ／ｚと溶出時間との両次元を最大限に利用する。対策ａ）及びｂ）は、例えば荷電状態及び同位体に関する仮定を検証するために、本発明の方法がどのように、シグナルの分散の構造に関する先験的知見を用いるかという例である。上述の対策は、組み合わせできることが好ましい。

ペプチド種の異なる同位体が、識別可能であるか否かは、荷電状態ｚと、特定のｍ／ｚ比での質量分析計の分解能に左右される。ペプチド種は、同位体が分離して、即ち、低ｚの荷電状態では明確なピークとして、また、より高いｚに対しては、幾つかの同位体を含む、より不明確な「小塊」として、通常溶出プロファイルに現れよう。飛行時間（ＴＯＦ）の原理に従って動作する質量分析計を使用する場合、この質量分析計の分解能はｍ／ｚにも左右され、同位体検出段階３１０：３：１を複雑にする。

本発明の一実施形態では、ペプチドマップエントリー構築段階３１０：３は、質量分析計の分解能特性を反映する異なるモードを含むことによって改善される。分析計の分解能は、典型的な場合、質量分析計の製造業者により示されるように、ｍ／ｚに左右されると想定され、分析計の分解能関数Ｒ（ｍ／ｚ）によって規定される。次いでペプチドマップエントリー構築段階３１０：３は、２以上の異なるモード、即ち高分解能モードと低分解能モードで操作することができ、この場合、これらモード間のシフトは動的である。モード間のシフトに関する基準は、例えばＲ（ｍ／ｚ）及びｚに左右される。この実施形態では、２つの分解能モードとそれらの動的切換えを使用して、アルゴリズムは、同位体分離が質量分析計の分解能に従って期待される荷電状態に対して、ペプチド種の異なる同位体を探すことだけをするであろう。これは、処理時間を節約するだけではなく、作成されるペプチドマップの品質及び信頼性も改善する。これは、後続のマッチング段階３１５の、信頼性ある結果の必須条件である。

分析計の分解能が関数Ｒ（ｍ／ｚ）によって十分記述される場合、分解能モード間のシフトに関する基準を設定するために、有効分解能βＲを使用することができる。βは、溶出プロファイルのピークと谷の間に必要とされる最小限の差に関する、経験的に予め定義されたパラメーターである。適切なβの値は、０．８５（単位なし）である。Ｒ（ｍ／ｚ）は、質量分析計の性質に左右され、通常は、製造業者から入手可能である。所与のｍ／ｚ及びｚについて、以下の式が成り立つ場合には高分解能モードを使用し、それ以外の場合は低分解能モードを使用する。

バックグラウンドノイズは、溶出プロファイルに常に存在し、したがってアノテーションプロセスは、ノイズ除去段階の後に行われる。例えば、閾値を下回る全てのシグナル強度を除去することができる。シグナルレベルは、溶出プロファイル間で著しく変動する可能性があるので、任意のシグナル強度の閾値は、好ましくは各溶出プロファイルごとに個々に選択されるべきである。バックグラウンド及びピークの適切な閾値は、それぞれ、溶出プロファイルの強度分布の９５パーセンタイル及び９９パーセンタイルであると解釈される。

現在最良の動作モードを示す、自動アノテーションアルゴリズムの詳細な例は、実施例のセクションに示す。

幾つかの従来技術の方法と比較した、本発明の方法の有用性を、図４に示す。概略図では、ペプチドＡの２つの同位体ピークＡ_１及びＡ_２に、部分的に、ペプチドＢの２つの同位体ピークＢ_１及びＢ_２が挿入されている。従来技術の方法、例えば背景技術のセクションで述べた方法であって、その時に１つ又は２〜３のＭＳスペクトルを分析し、通常は入手できるスペクトルを全て分析するものではない方法は、データを３つの異なるペプチドであると解釈しがちである（例えば、線ｅ、ｆ、及びｇに沿って選択されたスペクトル）。保持時間の次元及びｍ／ｚの次元の両方を同時に考慮する、発明による方法は、２つのペプチドをそれぞれ２つの同位体ピークによって正しく同定する。

ペプチドマップのマッチング３１５
マッチング段階３３０の目的は、異なる試料間での個々のペプチドに関する存在量プロファイルに必要な、包括的アノテーションをもたらすことである。マッチングは、例えば、異なる実験及び生物学的条件を示す、異なる溶出プロファイル間でのペプチド種を結び付ける。

ある特定の用途では、１つのマップ内の生体分子の数がそれほど大きくならず（典型的な場合、１００〜１０，０００）、質量分析計は、各ペプチドごとに、非常に正確で特異的な質量測定を行うことができる。このような場合、又溶出プロファイルは位置合わせされるので、ペプチドマップのマッチングは、１つの溶出プロファイル（又はコンセンサス）のペプチドマップを別の溶出プロファイル上に単に投影したものになる。

その他の場合、個々のペプチドに固有の集団は、完全に分解することができず、クラスターが形成される。このようなクラスターは、包括的アノテーションを行うために、分解しなければならない。これは、マッチングプロセスを最適化の問題として取り扱うことによって、実現することが好ましい。当業者なら、このタイプの問題に対し、貪欲アルゴリズム、模擬アニーリング、動的プログラミング、又は遺伝的アルゴリズムも含めた多くの異なる最適化方法を使用できることを、理解するであろう。

ペプチドマップを作成した、自動アノテーションとの組み合わせに適切なマッチングアルゴリズムの例を、実施例のセクションで示す。

存在比の測定３２０
関連するペプチドマップを備えた各溶出プロファイルでは、マップ内の各ペプチド種に属するデータポイント上のシグナル強度を、一体化することができる。これにより、各ペプチド種ごとに、また（適宜）その荷電状態及び分子同位体に関する強度測定値がもたらされる。

溶出プロファイルのデータポイントは、ある特定の時間間隔中に、ある特定の質量と電荷の比の間隔で検出されたイオンの計測数である。イオンが全て同一ペプチド種から来たとすると、これは、試料中のその種の量の測定値とみなすことができる。異なる分子種は、質量分析計内でそれぞれ異なる程度にイオン化されるので、測定値は、分子種の間で直接比較することができない。しかし、Ｓｋｏｌｄ他による前述の調査は、これらの測定値が少なくとも再現可能であることを示している。ペプチド種はマッチングされているので、異なる試料間でのペプチド種の相対存在比を、確立することができる。

存在量、及び相対存在比の精度をさらに増大させるため、ある特定の対策をとることができる：例えば、ＬＣ／ＭＳの実験操作間の不均一な試料投入を補償するため、正規化手順を適用することができる；内部標準（スパイク）、即ち既知量のある特定のペプチド種を試料に添加し、その後、ＬＣ／ＭＳ分析にかけることができる。各実験では、多数の溶出プロファイルがあり、多数の存在量測定値が得られる。これらの測定値は、高い構造度を有する。まず、ペプチド種−荷電状態−同位体の関係が存在するが、これらを集めることにより、測定値の数を減少させることができる。また、実験操作を互いに関係付け、多数の因子／次元をデータセットに加える実験設計もある。多くの場合、データのさらなる分析によって、解釈が容易になる。この種のデータは、多変量統計法、例えばＡＮＯＶＡ（差異分析）、ＰＣＡ（主成分分析）、及びＦＡ（因子分析）によって、優先的に分析される。様々な回帰法も、モデル構築に有用であると証明することができる。この分析は、専用特注のソフトウェアを使用して、又は汎用統計及びデータ分析パッケージ、例えばＳＡＳ（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ ＵＳＡ）又はＳｐｏｔｆｉｒｅ（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ，Ｕ．Ｓ．Ｈｅａｄｑｕａｒｔｅｒｓ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって行うことができる。

追加の分析のためのペプチド種のサブセットの定義３２５
本発明の方法の１つの目的は、ペプチドマップによって表される、試料からのペプチド種のサブセットを、さらなる分析のために定義することができることである。この方法の先行段階では、異なる試料間での存在量及び／又は相対存在比が測定されるので、その問題となっているペプチド種を選択することが可能になる。ペプチド種のサブセットは、試料間での存在量に大きな変化を示すペプチドでも、又は試料のレプリカ群同士で統計的に有意な変化を示すペプチドでも、又は高い存在量で個々の測定値をもたらすペプチドでもよい。これら生体分子の選択は、選択基準に対してユーザ指定の閾値を適用することにより、自動的に実現することができる。選択基準は、例えば「試料間で、閾値を上回る有意な変化を持つ全てのペプチド」、「最高の存在量を持つ１０個のペプチド」などである。選択は、手動で行ってもよく、又は手動選択と自動選択との組み合わせによるものでもよい。手動、又は自動化された選択プロセスは、試料間の差を強調するために、異なるプロファイルを使用できることが有利である。

ペプチドのサブセットのさらなる分析は、典型的な場合、及び好ましくは、ＭＳ／ＭＳによる同定又はさらなる特性決定を含む。図１に関連して既に例示した、市販の測定システムは、ＭＳ／ＭＳ分析を実施することも可能である。

本発明の別の実施形態では、上述の方法に従って、試料の第一の部分を分析し、ペプチド種の少なくとも１つのサブセットを選択する。溶出されたと考えられる経過時間と、中間で溶出されると考えられるものは、溶出プロファイルの表示からわかり、したがって、同じ試料の第二の部分に関するその後の同定／特性決定の実験操作中、注目すべき特徴のリストを構成することが可能である。これらの特徴は、溶出時間の実験的ばらつきを補正することが可能な、マーカー／マイルストンとして働く幾つかの「センチネル特徴」と組み合わせた、同定候補自体からなる。次いでサブセットを、ＭＳ／ＭＳによりさらに分析する。特徴リストを使用することによって、手の込んだＭＳ／ＭＳ分析は、本質的に、選択されたペプチドに関してのみ行われる。このリストを構成する能力は、生データ（溶出プロファイル）と、包括的アノテーション、ペプチドマップ、及び保存される生データの結び付きによって、本発明の方法によって与えられる。

クロマトグラフィーの領域では、複数の分離段階を導入する可能性について、最近ではより多くの注意が払われてきた。これらの技法を多次元クロマトグラフィーと呼び、当技術分野では周知である。多次元液体クロマトグラフィーは、質量分析と組み合わせることが有利である（ＭＤＬＣ／ＭＳ）。追加の分離段階を導入することによって、より複雑な試料、例えば血漿を、目的を持って分析することができる。図１を参照しつつ述べた測定システムを二次元的に拡張したものは、さらなるクロマトグラフィーカラムを含むことができ、それによってシステムは、例えばイオン交換カラム（ＩＥＸ）と、その後に逆相カラム（ＲＰＣ）を備え、これを、検出器として上記例示した質量分析計の１つと組み合わせたものを得ることができる。図５に、そのような２ＤＬＣ／ＭＳ測定システムの出力を、概略的に示す。前述の１ＤＬＣ／ＭＳと比較すると、その結果は、さらなるクロマトグラフィー次元が加えられたことがわかる。各試料は、２ＤＬＣ／ＭＳにおいて、加えられたクロマトグラフィーカラムによってもたらされた追加の分離に対応する複数の溶出プロファイルを生成する。

自動アノテーション溶出プロファイルの本発明の方法は、わずかならぬ改良を全く加えることなく、このタイプの実験にも有効であろう。ＭＤＬＣ／ＭＳからの溶出プロファイルは、１ＤＬＣ／ＭＳで述べたものと同じ手法でアノテーションされる。多次元であると溶出プロファイルの数が増大し、かなり少ない数の試料を用いる実験でもデータ量が非常に大きくなるので、本発明の方法は、特に有用になる。

さらに、追加の分離段階、例えば電気泳動及び等電点電気泳動（ＩＥＳ）又はその他の方法によって生成される、その他のタイプの多次元性は、本発明の方法によって、同じ手法で取り扱うことができる。

試料中の分子を化学的に標識する方法は、徐々に注目を集めつつある。化学標識の考え方は、例えば、サンプリング、調製、及び測定手順を通して全く同じ方法で、処置群及び対照群からの試料を処理することである。化学標識は、分析の後期において群を分離するのに使用する。プロテオミクス及びＬＣ／ＭＳ技法の分野で特に興味ある化学標識は、質量標識である。

本発明による自動アノテーションの方法は、段階３１０：３：３で述べたような化学標識、例えば質量標識を取り扱う。当業者には明らかであろうが、例えば同位体標識を含めたその他のタイプの標識を、同じ手法で使用することができる。

図６に、異なる質量標識が付されたペプチド由来の２つの領域６０５（破線）及び６１０（実線）を示す、溶出プロファイルを例示する。上記修正がなされた本発明の方法は、これら２つの領域を、異なる質量標識が付された同一ペプチド種から生じたものであると同定する。

質量標識と、本発明による自動アノテーション方法とを利用する実験の例を、実施例のセクションで述べる。

本発明の自動アライメントにおいて、並びにアノテーション及びマッチングプロセスにおいても、溶出プロファイルの元データ、並びに詳細化データと元データとの間の相関性を保存することが好ましい。さらに、この方法は非常に視覚的であり、コンピュータグラフィックスの助けを借りて、例えばペプチドマップが溶出プロファイル上にどのように投影されるのかを視覚化することが好ましい。このようにすることで、この方法の各段階を視覚化し、並びに、元データを用いた高度の結果を確認し、検証することができる。例えば、包括的アノテーションの第一の溶出プロファイルの一貫性をチェックすることである。例えば高度の統計的方法が存在量測定に必要である場合、これは特に重要なものである。そのような高度の方法は、いかに強力であろうと、統計的手段によって高い精度を示すことができる場合であっても、ある特定の場合には疑わしい結果をもたらす可能性がある。このような場合、結果をその元データまで遡って追跡する能力と、溶出プロファイルやペプチドマップなどの結果及び中間結果の視覚的性質は、非常に価値あるものである。

Ａ． ＬＣ／ＭＳ溶出プロファイルの自動アノテーション
１．スポット検出
１．１．バックグラウンド及びピークの閾値の選択
シグナルレベルは、溶出プロファイル間で著しく変動することがあるので、どのシグナル強度閾値も、各溶出プロファイルごとに個々に選択すべきである。この実施例で、バックグラウンド及びピークの閾値は、それぞれ溶出プロファイルの強度分布の９５パーセンタイル及び９９パーセンタイルであると解釈される。

１．２．一次的特徴の検出
局所極大を見出すために、溶出プロファイルの各データポイントを、その隣接のものと比較する。ピーク閾値を上回る全ての局所極大は、有効な一次的特徴であるとみなす。

１．３．スポット検出（３１０：２に対応）
各局所極大に対し、その極大を中心とするｍ／ｚ間隔を設定する。その間隔の幅を、質量分析計の製造業者から入手可能な数字である特定のｍ／ｚでの、質量分析計ピークのＦＷＨＭ（半値全幅）とする。

次いで溶出時間軸に沿った両次元でのｍ／ｚ間隔内で、バックグラウンド閾値を上回るシグナルを走査することにより、溶出時間間隔を見出す。ｍ／ｚ間隔と溶出時間間隔とを組み合わせることによって、スポットを形成する。

閾値処理手順を利用して、偽ノイズから生じたと考えられる、短すぎる時間範囲を有するスポットを除去する。

２．ペプチドマップエントリーの構築（ペプチドパターンの再構築）（３１０：３に対応）
この段階は、各スポットごとに個々に実施する。スポットは、ピーク強度が高いものから低いものになるよう順に並べた。

２．１．シード−スポット電荷スクリーニング
推定される電荷ｚの集合を、段階２．１．１〜２．１．３の候補に関してスクリーニングする。このスクリーニングを通る各ｚを、スコアに割り当て、最良のスコアを持つｚを選択する。

まず、ａ）が有意であり（質量分析計の分解能に依存）ｂ）に小塊が無い場合、同位体の検出を試みる。

次いで荷電状態について試みる。

次いで標識スキームを使用する場合、標識を試みる。

最後に、１つのｚを選択した後、いくらか詳細化を行う。

２．１．１．同位体の検出
以下の式が成り立ち（即ち高分解能モードが適切である）、ピークが十分分解されている場合（モデルピークとの比較によって試験される）、間隔１／ｚＤａで同位体を探索する。最小限の数の検出可能な同位体は、平均同位体分布から推定される（ある特定の質量の平均は、その質量の全てのペプチドの平均である）。暫定的な同位体の位置、ｍ／ｚ±１／ｚ、±２／ｚ等々について調査する。

・シグナルは、バックグラウンド閾値を上回らなければならない。
・シグナルは、同位体の位置同士の間でうまく振る舞わなければならない（より高いｚからのピークを除去する）。

十分に有効な同位体の位置がある場合、荷電状態はスクリーニングを通過する。

２．１．２．近隣の荷電状態の検出
追加の荷電状態を、（ｍ−１）／（ｚ±１）＋１で検出する。

スポットと同じ時間間隔を使用して、以下の事項を探す。
・バックグラウンドを上回るシグナル
・スポットシグナルパターンとの類似性
質量分析計の不正確な較正が、結果を乱さないように、小さい質量偏差が可能になる。

２．１．３．他の標識の検出
これは、各標識スキームごとに、特異的に実施しなければならない。

２．１．４．ペプチドマップエントリーの詳細化
・上記方法と基本的に同じ方法を使用して、より多くの荷電状態を検出する。
・時間間隔、同位体間隔などを詳細化する。
・同位体のシフト。

最も低い同位体は、非常に低い存在量を有し、したがって検出されない可能性がある（大きなペプチドでは、その可能性がより高い）。経験的な同位体分布は、平均同位体分布が様々にシフトしたものにマッチし、最も近接したマッチングは、ペプチドの質量を計算するために選択される。

後続の段階は、スポットを含有する同位体ラダーの開始点を見出すことである。これは、ペプチド種に正確な質量を帰属するのに必要である。第一の検出可能なスポットを開始点に単純にとるのは、第一の分子同位体の相対存在比がほぼ０となる、大きいペプチド又はタンパク質では機能しない。代わりに、近似の分子同位体分布を、上掲のＳｅｎｋｏ他の報文に記載の通り計算し、次いでこれを、幾つかの可能性ある整数−質量シフトに関するスポットの周囲領域に当てはめる。

３．ペプチドマップの詳細化（３１０：４〜５に対応）
この段階では、重なり合ったペプチドを検出し、その重なり合いを分解する。この方法は、４つの場合を同定し、それらを別々に取り扱う：
・大きい重なり合い、同じｚ；
・大きい重なり合い、異なるｚ、どちらもシード荷電状態に対応する；
・同じ質量（長いピーク／スプリットピーク）；
・その他の種類の重なり合い、非常に小さい重なり合いを除外する。

Ｂ．マッチングアルゴリズム
アルゴリズムは、入力として２以上のペプチドマップを要する。出力は、マッチングテーブルであり、各ペプチドマップごとに１つの列を保持する。このテーブルの行は、固有のペプチドに対応する。空でないテーブルセルは、固有のペプチド（テーブル行）から特定のマップ内のペプチド（テーブル列）へのマッピングを表す。空のテーブルセルは、固有のペプチドが、特定のペプチドマップ内のどのペプチドにもマッチしないことを示す。各マップ内の各ペプチドに関して、質量（Ｍ／ｚ、通常はＭ）及び溶出時間がわかっている。

マッチングは、２段階で行う。どちらの段階でも、貪欲アルゴリズムを用いる。貪欲アルゴリズムは最適ではないが、問題となるサイズに十分対応し、したがってこのアルゴリズムが選択される。模擬アニーリングや遺伝的アルゴリズムなどのその他のアルゴリズムを用いることもできる。

１．クラスターの形成：
クラスターは、マッチングテーブル内の推定上の行である。第一の段階では、各ペプチドごとに最適なクラスターを見出すが、この段階では、他のクラスターとの矛盾を無視する。

全てのペプチドマップを結合して、大きいペプチドリストを形成する。このリストを、Ｍ（又は、電荷が利用できない場合はＭ／ｚ）に関して選別する。このリストへの各エントリーごとに、最適なクラスターを全数探索によって特定する（質量許容差内で）。所与のリストエントリー（即ちペプチド）に最適なクラスターは、特定リストエントリー（基準と呼ぶ）及びその他すべてからの多くとも１つのリストエントリーを含む、最良のスコアリングクラスターであると定義し、これは以下の要件を満たすものである：ａ）ペプチドと基準との質量差が、予め画定された限度内になければならず、ｂ）ペプチドは、選択されたクラスターに属さない（以下参照）。

各クラスターをスコアに割り当てるが、これは、クラスター内で、溶出時間対の差スコア全ての合計として計算される。

式中、｜ｔ_ｉ−ｔ_ｊ｜は、溶出時間対の差である。パラメーターｔは、完全マッチと見なされる最大時間差と解釈される。スコア１は、２つのペプチド間の完全マッチと見なされ、０は、限りなく悪いマッチである。クラスターは、スコア０の対を含んではならない。

２．クラスターの選択：
第二の段階では、クラスターをスコアに関して選別する。次いで幾つかのクラスターが残っている限り、以下の手順を繰返す。
ａ）最良のスコアリングクラスターを、線形探索を使用して見出す。
ｂ）クラスター形成アルゴリズム、１）を、このクラスターに関して再び実行する。スコアが減少した場合、クラスター内のペプチドの一部は、選択されたクラスターに属していると想定され、クラスターのスコアが更新され、手順が再開する。スコアの増加も生ずる可能性があるが、これは、貪欲アルゴリズムの非最適性に起因し、無視される。
ｃ）最良のスコアリングクラスターを選択し、即ちマッチングテーブルにコピーする。

この例示的なアルゴリズムは、幾つかの方法で拡張できることが好ましい。例えば、有効なマッチングを行うためには、溶出時間をマッチさせなければならない、その程度に制限を課すことになる。この問題を解決する簡単な方法は、クラスター形成要件にカットオフ閾値を付加することである。或いは、例えば全てのペプチドをいかにうまくマッチさせるかに関する統計的な対策に基づいた動的閾値を、使用することができる。

Ｃ．質量標識試料のアノテーション
薬物の作用について試験をする目的で、単純な実験について考える。２種の実験的変種があり、即ち薬物の治療を受ける「治療」変種と、薬物をプラセボに代え、他は同様に処置した「対照」変種である。
１：各変種の動物から組織試料を収集し、ＬＣ−ＭＳ分析用に調製する。
２：各試料を、異なる標識で標識する。ＩＣＡＴの場合、標識は、ペプチド内のシステイン残基に結合する分子である。一方の標識は８個の水素原子を含有し、他種の標識は８個の重水素原子を含有する。
３：標識試料をプールする。
４：標識ペプチドを、アフィニティカラムで精製する。標識のないペプチド及びその他の分子は、直ちに通過し、除去され、その結果、後続の分析段階でのバックグラウンドが少なくなる。
５：精製したプール試料のＬＣ−ＭＳ分析を行う。この実施例では、ペプチドが８Ｄａだけ離れた対をなして現れるであろう。
６：プロファイルのアノテーションをする、即ちペプチド検出アルゴリズムを実行し、各ペプチドを定量する。
７：ペプチド対（又は、３以上の標識がある場合はｎ個１組）を同定し、各標識ペプチドを、それに対応する変種でマークする。これは、標識スキーム（したがって予測される質量差）がわかっているので容易に行われるが、その質量差は、溶出時間の大きな差を生じてはならない。このプロセスの結果、適切な統計的方法によってさらに分析することのできる、＜質量、対照強度、治療強度＞のエントリーのクロス集計が得られる。アノテーションアルゴリズムの段階３１０：３：３で実施されることになる。

以上の実施形態は本発明の例示を目的としたものにすぎず、特許請求の範囲に記載された保護範囲を限定するものではない。

本発明の方法を実施するためのシステムを示す概略ブロック図。 図１のシステムで作成された溶出プロファイルの一例を示す図。 異なる同位体に起因するシグナル分散を示す図。 異なる荷電状態に起因するシグナル分散を示す図。 本発明の方法の主な段階を示すフローチャート。 本発明の方法のアノテーションアルゴリズムの詳細を示すフローチャート。 本発明の方法の有用性を従来技術の方法と対比して概略的に示す図。 ２ＤＬＣ／ＭＳ実験の溶出プロファイルの概略を示す図。 溶出プロファイルにおける異なる化学標識の再構築に本発明の方法がどのように用いられるかを示す図。

Claims (24)

1. １種以上の試料中の生体分子種の特性決定のため試料でクロマトグラフィーと質量分析の複合分析（Ｃ／ＭＳ）を実施する方法であって、当該方法が、
   Ｃ／ＭＳ分析を実施する段階（３００）、
   少なくとも１つの第一の溶出プロファイルを生成する段階（３０５）であって、第一の溶出プロファイルがＣ／ＭＳ分析で得られたデータの多次元表示であって、１つの次元がクロマトグラフィーの溶出時間であり、１つの次元が質量／電荷比（ｍ／ｚ）であり、少なくとも１つの次元がシグナル強度であり、溶出プロファイルにおけるシグナル強度の特徴的変化が特定の生体分子種の存在の指標であり、各生体分子種由来のシグナルが分散して各生体分子種について複数のシグナルピークを溶出プロファイルに形成する段階、及び
   溶出プロファイル中のある生体分子種由来の分散シグナルを再構築する段階（３１０）
   を含んでおり、
   再構築段階が、同一生体分子種由来の溶出プロファイルのシグナル変化を再構築するように適合化された自動アノテーションと生体分子マップの作成とを含み、自動アノテーションが少なくとも溶出時間次元とｍ／ｚ次元の両者に同時に基づくことを特徴とする方法。
2. 各生体分子種由来のシグナルの分散が生体分子種の異なる同位体及び／又は荷電状態の存在に起因し、自動アノテーション種が、実質的に各生体分子種について生体分子種の異なる同位体及び／又は異なる荷電状態の両者に起因する実質的に各生体分子種についてシグナル分散を再構築する、請求項１記載のＣ／ＭＳ分析法。
3. 生体分子種を含む試料が複数の異なる化学標識で処理されていて、少なくとも第一の標識を有する第一の化学標識生体分子と第二の標識を有する第二の質量標識生体分子とを生じ、化学的差異によって溶出プロファイルにシグナルのさらなる分散が起こり、自動アノテーションが化学標識で生じたシグナル分散を再構築する、請求項２記載のＣ／ＭＳ分析法。
4. 化学標識が質量標識であって、少なくとも第一の質量を有する第一の質量標識生体分子と第二の質量を有する第二の質量標識生体分子とを生じ、質量の差異によって溶出プロファイルにシグナルの分散が起こり、自動アノテーションが質量標識で生じたシグナル分散を再構築する、請求項３記載のＣ／ＭＳ分析法。
5. 化学標識が同位体標識であって、少なくとも第一の種類の同位体を含む第一の同位体標識生体分子と第二の種類の同位体を含む第二の同位体標識生体分子とを生じ、同位体の差異によって溶出プロファイルにシグナルの分散が起こり、自動アノテーションが同位体標識で生じたシグナル分散を再構築する、請求項３記載のＣ／ＭＳ分析法。
6. 分散シグナルの再構築における自動アノテーションが、質量分析計の分解能に関する知見を用いる、請求項２乃至請求項５のいずれか１項記載のＣ／ＭＳ分析法。
7. 分散シグナルの再構築における自動アノテーションが、分散シグナルの再構築における同一生体分子種の異なる荷電状態間及び／又は異なる同位体間の関係に関する先験的仮定を用いる、請求項６記載のＣ／ＭＳ分析法。
8. 分散シグナルの再構築における自動アノテーションが、生体分子種の第一の荷電状態に関する第一のシグナルパターンがその生体分子種の第二の荷電状態に関する第二のシグナルパターンと類似しているという仮定を用いる、請求項６記載のＣ／ＭＳ分析法。
9. 分散シグナルの再構築における自動アノテーションが、生体分子種の第一の荷電状態に関する第一の同位体分布がその生体分子種の第二の荷電状態に関する第二の同位体分布と類似しているという仮定を用いる、請求項６記載のＣ／ＭＳ分析法。
10. 自動アノテーションが、
    ａ）第一の溶出プロファイルのシグナル変化のピークを検出しマークする段階（３１０：１）と、
    ｂ）各々少なくとも１つの一次的特徴を含む複数のスポットからなる一組のスポットで、ｍ／ｚ次元に可変延長部と溶出時間次元に可変延長部とを有し、各スポットが少なくとも生体分子の特定の荷電状態と１種又は１群の同位体とに対応すると推定される一組のスポットを画定する段階（３１０：２）と、
    ｃ）溶出プロファイルにおける１ペプチド種由来のパターンを限定する既知の構造関係をもつ一組の領域を検出することによって、各スポット毎にペプチドマップエントリーを構築する段階（３１０：３）と、
    ｄ）各スポットに対して段階（ｂ）〜（ｄ）を繰返す段階と
    を含んでおり、上記構築段階において、荷電状態に関して一組の領域の構造関係に基本的一貫性と有意性が認められる場合にはペプチドマップエントリーを作成し、一組の領域の既知の構造関係を生じる荷電状態を見出すことができない場合には、スポット自体から不完全なペプチドマップエントリーを作成する、請求項６乃至請求項９のいずれか１項記載のＣ／ＭＳ分析法。
11. ペプチドエントリーの構築段階が、各推定電荷ｚに対して、可能であれば、ｍ／ｚ±１／ｚ、ｍ／ｚ±２／ｚなどの追加の同位体を検出すること（３１０：３：１）を含む、請求項１０記載のＣ／ＭＳ分析法。
12. ペプチドエントリーの構築段階が、各推定電荷ｚに対して、可能であれば、（ｍ−１）／（ｚ±１）＋１、（ｍ−１）／（ｚ±２）＋１などの追加の荷電状態を検出すること（３１０：３：２）を含む、請求項１０記載のＣ／ＭＳ分析法。
13. ペプチドエントリーの構築段階が、各推定電荷ｚに対して、可能であれば、異なる標識の変種を検出することを含み、予測変位が用いた標識スキームに特異的である（３１０：３：３）、請求項１０記載のＣ／ＭＳ分析法。
14. 自動アノテーションのペプチドエントリーの構築段階が、質量分析計の分解能特性を反映する２以上の異なるモードを含む、請求項１０記載のＣ／ＭＳ分析法。
15. 分析計の分解能がｍ／ｚに依存するとともに分析計の分解能パラメーター（Ｒ（ｍ／ｚ））によって規定され、荷電状態の帰属段階が高分解能モードと低分解モードとを含んでいて、それらのモード間のシフトが動的であり、モード間のシフトの判定基準がｍ／ｚ、ｚ及び分析計の分解能パラメーターに依存する、請求項１４記載のＣ／ＭＳ分析法。
16. 所与のｍ／ｚ値及びｚ値について、以下の式が成り立つ場合には高分解能モードを使用し、それ以外の場合は低分解能モードを使用する、請求項１５記載のＣ／ＭＳ分析法。
    式中、Ｒは分析計の分解能パラメーターであり、βは実験に基づいて予め定義されるパラメーターである。
17. 当該方法が、さらに、
    再構築段階（３１０）で作成した個々の生体分子マップをマッチングさせて（３１５）、包括的アノテーションを形成する段階と、
    異なる試料間での個々の生体分子種の一部の相対存在比を前段階で得られた包括的アノテーションに基づいてプロファイルするための測定及び評価を実施する段階（３２０）と
    を含む、請求項１記載のＣ／ＭＳ分析法。
18. 生体分子種のサブセットを定義する段階（３２５）をさらに含み、サブセットの定義段階が、追加の分析のためのサブセットを、異なる試料間での一部の生体分子種の相対存在比の変化に基づいて、選択するのに適合化されている、請求項１７記載のＣ／ＭＳ分析法。
19. １種以上の試料中の生体分子種の特性決定のため試料でクロマトグラフィーと質量分析の複合分析（Ｃ／ＭＳ）を実施するための測定システムであって、測定システムが、少なくとも１つのクロマトグラフィーカラム（１２５）と、質量分析計インターフェース（１３０）と、質量分析計（１３５）と、制御・解析手段（１４０、１４５）とを備えており、当該測定システムが、
    Ｃ／ＭＳ分析の実施と、
    少なくとも１つの第一の溶出プロファイルの生成であって、第一の溶出プロファイルがＣ／ＭＳ分析で得られたデータの多次元表示であって、１つの次元がクロマトグラフィーの溶出時間であり、１つの次元が質量／電荷比（ｍ／ｚ）であり、少なくとも１つの次元がシグナル強度であり、溶出プロファイルにおけるシグナル強度の特徴的変化が特定の生体分子種の存在の指標であり、各生体分子種由来のシグナルが分散して各生体分子種について複数のシグナルピークを溶出プロファイルに形成する、第一の溶出プロファイルの生成と、
    溶出プロファイル中のある生体分子種由来の分散シグナルの再構築と
    に適合化されており、
    再構築が、同一生体分子種由来の溶出プロファイルのシグナル変化を再構築するように適合化された自動アノテーションと生体分子マップの作成とを含み、自動アノテーションが少なくとも溶出時間次元とｍ／ｚ次元の両者に同時に基づくことを特徴とする測定システム。
20. 分散シグナルの自動アノテーションにおいて同一生体分子種由来のシグナルを再構築するのに質量分析計の分解能に関する知見を用いるのにさらに適合化されている、請求項１９記載の測定システム。
21. 自動アノテーションを、質量分析計の分解能特性を反映する２以上の異なるモードで操作することができる、請求項２０記載の測定システム。
22. 分析計の分解能がｍ／ｚに依存するとともに分析計の分解能パラメーター（Ｒ（ｍ／ｚ））によって規定され、荷電状態の帰属段階が高分解能モードと低分解モードとを含んでいて、それらのモード間のシフトが動的であり、モード間のシフトの判定基準がｍ／ｚ、ｚ及び分析計の分解能パラメーターに依存する、請求項２１記載の測定システム。
23. 制御・解析手段（１４０、１４５）内の処理手段の内部メモリに、直接ロード可能なコンピュータプログラムプロダクトであって、請求項１乃至請求項１８のいずれかの段階を制御するように適合化されたソフトウェアコード手段を含む、コンピュータプログラムプロダクト。
24. コンピュータで使用可能な媒体に記憶されたコンピュータプログラムプロダクトであって、制御・解析手段（１４０、１４５）内の処理ユニットの処理手段で、請求項１乃至請求項１８のいずれか１項記載の段階の実行を制御させる適合化された読取り可能なプログラムを含む、コンピュータプログラムプロダクト。