WO2020017589A1 - 血管障害の判定方法 - Google Patents

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竜児 永井
松村　剛
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国立大学法人 熊本大学
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining a vascular disorder by measuring a specific blood marker.
  • HbA1c hemoglobin A1c
  • vascular disorder causes various aging-related diseases, and substances that are markers for vascular sclerosis are being searched worldwide.
  • 2SC S- (2-succinyl) cysteine
  • Vascular disorders such as arteriosclerosis develop with the progress of lifestyle-related diseases, but there are no clinically practical markers of vascular disorders.
  • arteriosclerosis When arteriosclerosis has progressed, the progress of arteriosclerosis can be confirmed by echo examination, etc., but once vascular disorders such as arteriosclerosis have progressed, it is difficult to completely cure them. Evaluation is paramount.
  • HMGCoA reductase inhibitors that lower blood cholesterol levels as conventional drugs for the treatment of arteriosclerosis. It is extremely difficult to do. For this reason, drugs for atherosclerosis treatment are being developed worldwide, but no drug with high therapeutic effect has been developed because there is no marker for a good drug discovery.
  • the present invention has been made to solve the problem of providing a method for determining a vascular disorder by identifying a vascular disorder marker at a clinically practical level. Further, the present invention has an object to provide a method for screening a candidate substance for the prevention or treatment of vascular disorders using the identified vascular disorder markers.
  • a method for determining a vascular disorder comprising measuring the amount of S- (2-succinyl) cysteine in blood.
  • diagnosis of arteriosclerosis can be performed. Further, according to the present invention, it is possible to evaluate a vascular disorder risk in a person who has not yet developed a complication such as arteriosclerosis in the early stage of a lifestyle-related disease.
  • FIG. 1 shows a comparison between a history of various diseases and 2SC in blood.
  • FIG. 2 shows a comparison between the value of 2SC released into the blood and the progression of the disease state in retinopathy and nephropathy.
  • FIG. 3 shows the results of measurement of CML in sera of patients with various diseases.
  • FIG. 4 shows the results of measurement of 2SC in blood in an atherosclerosis model mouse.
  • the method for determining a vascular disorder according to the present invention is a method including measuring the amount of S- (2-succinyl) cysteine in blood.
  • various post-translational modified structures generated by metabolism were synthesized, and further, a 13C-labeled internal standard substance was synthesized, and a quantitative system using a mass spectrometer was established. Then, as a result of searching for post-translational modifications that fluctuate due to vascular disorders, it was confirmed that 2SCs had elevated blood levels in human small and large vessel disorders.
  • the vascular disorder may be either a large vessel disorder or a small vessel disorder.
  • a macrovascular disorder for example, a macrovascular disorder in lower limb obstructive arteriosclerosis, coronary artery disease or cerebrovascular disease can be determined.
  • a microvascular disorder in retinopathy, neuropathy or nephropathy can be determined.
  • the measured value obtained by measuring the amount of S- (2-succinyl) cysteine in blood when the measured value obtained by measuring the amount of S- (2-succinyl) cysteine in blood is higher or lower than a reference value, it is determined that the patient has a vascular disorder. be able to.
  • the measured value obtained by measuring the amount of S- (2-succinyl) cysteine in blood is higher or lower than a reference value, it is determined that the risk of vascular injury is high. be able to.
  • the amount of S- (2-succinyl) cysteine in the blood the amount of S- (2-succinyl) cysteine free in the blood may be measured, or the amount of S- (2-succinyl) cysteine in the protein may be measured.
  • the amount of S- (2-succinyl) cysteine in Total including also-(succinyl) cysteine, may be measured.
  • the measured value obtained by measuring the amount of S- (2-succinyl) cysteine of Total including S- (2-succinyl) cysteine present in the protein is higher than a reference value.
  • a major vascular disorder eg, obstructive atherosclerosis, lower limb obstruction, coronary artery disease or cerebrovascular disease
  • a greater vascular disorder risk eg, lower limb obstructive atherosclerosis, coronary artery disease or Macrovascular disease in cerebrovascular disease
  • a microvascular disorder eg, , Microvascular disorder in retinopathy, neuropathy or nephropathy
  • high risk of microvascular disorder eg, microvascular disorder in retinopathy, neuropathy or nephropathy
  • a large vascular disorder in lower limb obstructive arteriosclerosis or coronary artery disease is obtained. And it can be determined that the risk of macrovascular damage in lower limb obstructive arteriosclerosis or coronary artery disease is high.
  • Mass spectrometry In one example of the present invention, the amount of S- (2-succinyl) cysteine in blood can be measured by mass spectrometry. Mass spectrometry can be performed, for example, according to the method described in JP-A-2014-119370, but is not particularly limited.
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ In the present invention, first, it is preferable to treat blood with acid.
  • blood whole blood, serum, plasma, or the like can be used, and serum is more preferable.
  • the acid used for the acid treatment may be an organic acid or an inorganic acid, but is preferably iron-free hydrochloric acid or formic acid.
  • the pH of the acid used is preferably pH 0.5 to 1.5, more preferably pH 0.8 to 1.2.
  • an acid solution may be added to blood, shaken or agitated if necessary, and then left still to hydrolyze the sample. Further, it is preferable to heat the reaction solution during the hydrolysis.
  • the amount of the acid used for the acid treatment, the reaction time, and the temperature may be set as long as the condition can sufficiently dissolve the blood and the reaction solution becomes a liquid phase.
  • a method (Free) of measuring 2SC that is present in the blood in a free state may be adopted, or a method of measuring 2SC of Total including 2SC present in the protein (Free) ( Total) may be employed.
  • the serum was synthesized using isotope internal standard ([13 C 3, 5 N 1] 2SC) was added, further added water By doing so, a sample can be prepared.
  • the method (Total) measuring the 2SC of Total including also 2SC present in the protein, the internal standard in the blood ([13 C 3, 5 N 1] 2SC) and hydrochloric acid was added, hydrolysis at a high temperature such as 100 ° C.
  • a sample can be prepared by adding water after decomposing and drying the solution.
  • the sample prepared as described above can be added into Captiva ND Lipids (Agilent Technologies) filled with methanol containing formic acid, mixed well, and allowed to pass. Thereby, degreasing and deproteinization can be performed.
  • the collected sample is dried and resuspended in water containing formic acid, and then can be passed through a C18 column, Sep-pak (Waters Corp.). Sep-pak is preliminarily equilibrated with water containing 1% formic acid, and after passing through the sample, 2 ml of 20% methanol containing 1% formic acid can be passed through to collect the fraction that has passed.
  • the collected solution was evaporated to dryness, resuspended in 1 ml of 20% acetonitrile containing 0.1% formic acid, and then filtered through a VIVASPIN 500 (Sartorius Stedim), which is a 3000 molecular weight cut filter, to remove the sample for mass spectrometry. Obtainable. Note that the method for preparing the sample for mass spectrometry is not limited to the above-described preparation method since it can be appropriately prepared according to the method of analysis and the equipment to be used.
  • the method of mass spectrometry is not particularly limited as long as it is a measurable method, but an analytical method combining liquid chromatography and mass spectrometry is preferable.
  • liquid chromatography-mass spectrometry for example, LC-MS, LC-MS / MS, LC-MS / MS / MS, etc.
  • liquid chromatography-tandem mass spectrometry such as LC-MS / MS and LC-MS / MS / MS is more preferable.
  • a suitable solvent for dissolving a dried sample for liquid chromatography-mass spectrometry it is preferable to use the same solvent as the final condition of the mobile phase of liquid chromatography.
  • an aqueous solution of methanol, an aqueous solution of acetonitrile, a mixed aqueous solution of acetonitrile and trifluoroacetic acid, a mixed aqueous solution of acetonitrile and formic acid, and the like are not particularly limited.
  • the measurement conditions for measuring 2SC with a liquid chromatography-mass spectrometer may be appropriately set by those skilled in the art based on ordinary knowledge according to the type of the instrument, the state of the sample, and the like.
  • the conditions of the liquid chromatography vary depending on the sample to be provided, but for example, it is preferable to form a gradient with an aqueous formic acid solution and an acetonitrile formate solution in the mobile phase.
  • Mass spectrometers include, but are not limited to, double focusing magnetic field mass spectrometers, ion trap mass spectrometers, quadrupole mass spectrometers, and the like.
  • 2SC derived from the biological sample can be quantified. Specifically, a calibration curve is created based on the measurement results from a standard solution containing a predetermined concentration of 2SC. In preparing a calibration curve, it is preferable to calibrate each measured value using an internal standard, since a more accurate calibration curve can be obtained.
  • the amount of S- (2-succinyl) cysteine in blood can be measured by immunoassay.
  • the immunoassay can be performed using a polyclonal antibody capable of detecting 2SC or a monoclonal antibody. By using a monoclonal antibody capable of quantifying 2SC in the blood, multiple samples can be measured more easily.
  • An antibody capable of detecting 2SC can be prepared by using 2SC as an immunogen.
  • 2SC may be linked to a protein to provide an immunogen with sufficient immunogenicity.
  • various types of proteins known as carrier proteins can be used, and examples thereof include albumin such as serum albumin, hemocyanin, and myoglobin.
  • albumin such as serum albumin, hemocyanin, and myoglobin.
  • the carrier protein proteins derived from mammals such as cows, rabbits and humans, shellfish such as squash shells, birds such as chickens and the like can be used. Of these, keyhole limpet hemocyanin (KLH) and bovine serum albumin (BSA) are preferred. These proteins can be used alone or in combination of two or more.
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • BSA bovine serum albumin
  • crosslinker for binding of # 2SC to the carrier protein.
  • various known linkers can be used, and for example, glutaraldehyde, EDC (1-ethy-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), SPDP, DST, DSG and the like can be used. Among these, it is preferable to use glutaraldehyde or EDC.
  • One crosslinker can be used alone, or two or more crosslinkers can be used in combination.
  • a non-human animal is immunized using 2SC or a conjugate of 2SC and a carrier protein as an antigen, and antibody-producing cells are produced in the animal.
  • a polyclonal antibody against 2SC can be isolated from a serum obtained from an immunized animal using a protein G column. Further, it can be carried out according to a conventional method for producing a monoclonal antibody.
  • the type of animal is not particularly limited, but mammals are preferred. Examples of mammals include rodents such as mice, rats, and rabbits. It is preferable to use a BALB / C mouse as a myeloma-derived cell line used for hybridoma production.
  • Immunization can be performed by various known methods, for example, injection into a mammal subcutaneously, intradermally, intravenously, or intraperitoneally.
  • the immunization is preferably repeated several times after the first immunization, and the immunization schedule can be appropriately determined according to the type and strain of the animal to be immunized.
  • Various known adjuvants can be used.
  • two or more adjuvants can be used, such as using complete Freund's adjuvant (CFA) at the time of the first immunization and using incomplete Freund's adjuvant (IFA) at the second and subsequent times.
  • CFA complete Freund's adjuvant
  • IFA incomplete Freund's adjuvant
  • a hybridoma capable of producing a monoclonal antibody against 2SC can be produced.
  • Blood is collected from the animals after the above immunization at appropriate intervals to confirm that antibodies against 2SC are produced.
  • known analysis methods such as enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), and fluorescence immunoassay can be used.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescence immunoassay After confirmation of antibody production, it is also preferable to perform a boost (additional injection of immunogen).
  • spleen cells are excised from the immunized animal and fused with cells derived from myeloma.
  • a cell fusion method for example, a known method such as a polyethylene glycol method, a method using Sendai virus, and a method of applying electrical stimulation can be used.
  • the fused cells can be selected on a HAT medium containing hypoxanthine, aminopterin, thymidine or the like.
  • a fused cell having a high ability to produce an antibody against 2SC is selected by a known analysis method such as enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), or fluorescence immunoassay.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescence immunoassay e.g., fluorescence immunoassay.
  • cloning is performed by a known method such as a limiting dilution method or a soft agar method.
  • a hybridoma producing a monoclonal antibody having high specificity for 2SC or high binding ability for 2SC can be obtained.
  • the hybridoma obtained as described above is cultured and proliferated, and a monoclonal antibody against 2SC is separated and purified from the culture solution or the like, whereby a large amount of the monoclonal antibody can be obtained.
  • a method for culturing a hybridoma various known methods such as a method of injecting into a peritoneal cavity of a mammal and growing in ascites and a method of culturing the animal outside the body using an appropriate medium can be adopted.
  • culture solution or culture supernatant known methods such as ion exchange chromatography and affinity chromatography can be used without any particular limitation.
  • the monoclonal antibody against 2SC includes not only the antibody obtained as described above, but also a fragment of the antibody containing the 2SC recognition site. Further, the monoclonal antibody against 2SC may be a chimeric antibody or a humanized antibody produced by using a genetic recombination technique so as to include the 2SC identification site.
  • the antibody against SC2SC is excellent in specificity for 2SC and / or binding ability for 2SC.
  • the method for detecting and / or quantifying 2SC using an antibody against 2SC is not particularly limited.
  • enzyme immunoassay ELISA
  • radioimmunoassay RIA
  • luminescence immunoassay sedimentation
  • aggregation Method Western blot analysis
  • flow cytometry and the like.
  • enzyme immunoassay a competitive inhibition assay or a competitive binding assay can also be performed.
  • the present invention further relates to a method for screening a candidate substance for preventing or treating a vascular disorder, comprising measuring the amount of S- (2-succinyl) cysteine in the blood of a subject to which the candidate substance has been administered.
  • the amount of S- (2-succinyl) cysteine in blood is measured by mass spectrometry or immunoassay as described herein above.
  • the subject to which the candidate substance is administered is not particularly limited, but is preferably a non-human mammal, and includes, for example, rodents such as mice, hamsters, guinea pigs, rats, rabbits, dogs, cats, goats, sheep, cattle, Pigs and monkeys can be used.
  • rodents such as mice, hamsters, guinea pigs, rats, rabbits and the like are preferred, and among them, mice are most preferred.
  • the candidate substance may be an individual low molecular compound, a compound present in a natural product extract, or a synthetic peptide.
  • the candidate substance may be a compound library, a phage display library or a combinatorial library. Construction of compound libraries is known to those skilled in the art, and commercially available compound libraries can also be used.
  • An example of a candidate substance is a food-derived component.
  • a substance that reduces the amount of 2SC in blood can be selected as a candidate substance for preventing or treating vascular disorders.
  • a substance that reduces the 2SC level in the blood can be identified.
  • ⁇ 2SC pre-processing method and detection method> Two methods have been established for measuring 2SC in serum: a method of measuring 2SC that is free in blood (Free) and a method of measuring 2SC that includes 2SC present in protein (Total).
  • an internal standard [ 13 C 3 , 15 N 1 ] 2SC) synthesized using an isotope was added to 30 ⁇ l of serum, and up to 700 ⁇ l with water was added to methanol (2%) containing 0.1% formic acid. .1 ml) was added to a filled Captiva ND Lipids (Agilent Technologies), mixed well, passed through, and degreased and gradually proteinated. The collected sample was dried and resuspended in 1 ml of water containing 1% formic acid, and then passed through a C18 column, Sep-pak (Waters Corp).
  • Sep-pak was previously equilibrated with water containing 1% formic acid, and after passing through the sample, 2 ml of 20% methanol containing 1% formic acid was passed through to collect the fraction that passed. After the collected solution was dried and resuspended in 1 ml of 20% acetonitrile containing 0.1% formic acid, a sample filtered with VIVASPIN500 (Sartorius Stedim) which is a 3000 molecular weight cut filter was used for measurement.
  • VIVASPIN500 Sudim
  • FIG. 4 shows the results. Both the Free and Total 2SC values were high in apoE-deficient mice, and the relationship between the onset of vascular disorders and the blood 2SC value became apparent in model mice as well as in humans.

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Abstract

本発明の課題は、臨床的に実用レベルの血管障害マーカーを同定することにより血管障害の判定方法を提供することである。本発明によれば、血中のＳ‐（２‐スクシニル）システイン量を測定することを含む、血管障害の判定方法が提供される。

Description

血管障害の判定方法
　本発明は、特定の血中マーカーを測定することによる血管障害の判定方法に関する。
　糖尿病の診断においては、血糖コントロールのマーカーとしてヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）が世界的に測定されている。しかし、動脈硬化などの血管障害の進展あるいは進展リスクを評価するマーカーについては、臨床において用いられているものは存在しない。動脈及び静脈の硬化（血管障害）は様々な加齢関連疾患の原因となるため、世界的に血管硬化のマーカーとなる物質が探索されている。翻訳後修飾で生成される構造として永井らはＳ‐（２‐スクシニル）システイン（以下、２ＳＣとも称する：Ｓ－（２－ｓｕｃｃｉｎｙｌ）ｃｙｓｔｅｉｎｅ）を見いだし、２ＳＣが脂肪細胞内に顕著に蓄積することを見いだした（非特許文献１）。
Nagai R.,他、Succination of protein thiols during adipocyte maturation - a biomarker of mitochondrial stress. J Biol Chem. 282, 34219-34228 (2007)
　生活習慣病の進展に伴って動脈硬化をはじめとする血管障害を発症するが、臨床的に実用レベルの血管障害マーカーは存在しない。動脈硬化が進展した場合には、エコー検査などにより動脈硬化の進展を確認できるが、動脈硬化等の血管障害は、一度進行してしまうと完治が困難であるため、血管障害の初期にリスクを評価することが最重要となる。また、これまでの動脈硬化治療の薬剤としてＨＭＧＣｏＡ還元酵素阻害剤で血中コレステロール値を低下させるものがあるが、ひとたび進行した動脈硬化は、これら薬剤でさらに悪化することは抑制できても、治療することは極めて困難である。そのため、世界的に動脈硬化治療の薬剤開発が行われているが、良い創薬のマーカーがないため、治療効果の高い薬剤は開発されていない。
　本発明は、臨床的に実用レベルの血管障害マーカーを同定することにより血管障害の判定方法を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、同定された血管障害マーカーを利用した血管障害の予防又は治療のための候補物質のスクリーニング方法を提供することを解決すべき課題とした。
　本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、血管障害患者で有意に血中２ＳＣが上昇することを確認した（図１）。細小血管障害である網膜症、腎症でも上昇した（図２）。これに対して動脈硬化のマーカー候補と考えられていたＣＭＬでは変化が認められなかった（図３）。確認のため、動脈硬化のモデルであるａｐｏＥ欠損マウスで測定した結果、やはり２ＳＣが上昇することも確認された（図４）。上記の結果から、２ＳＣは血管障害の初期、あるいは発症の予測マーカーとして機能することが実証された。２ＳＣは血管障害のリスクを評価するマーカーのみならず、血管障害治療の、創薬のターゲットとしても有用である。本発明は上記の知見に基づいて完成したものである。
　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）　血中のＳ‐（２‐スクシニル）システイン量を測定することを含む、血管障害の判定方法。
（２）　血中のＳ‐（２‐スクシニル）システイン量を測定することにより得られた測定値が基準値より高い場合に血管障害を有するものと判定する、（１）に記載の判定方法。
（３）　血中のＳ‐（２‐スクシニル）システイン量を測定することにより得られた測定値が基準値より高い場合に血管障害リスクが高いと判定する、（１）に記載の判定方法。
（４）　血中のＳ‐（２‐スクシニル）システイン量を、質量分析または免疫分析により測定する、（１）から（３）の何れか一に記載の方法。
（５）　候補物質を投与した対象の血中のＳ‐（２‐スクシニル）システイン量を測定することを含む、血管障害の予防又は治療のための候補物質のスクリーニング方法。
（６）　血中のＳ‐（２‐スクシニル）システイン量を、質量分析または免疫分析により測定する、（５）に記載のスクリーニング方法。
（７）　候補物質が、食品由来成分である、（５）又は（６）に記載のスクリーニング方法。
　本発明によれば、動脈硬化の診断を行うことができる。本発明によればさらに、生活習慣病の初期で、まだ動脈硬化などの合併症が現れていない者の血管障害リスク評価が可能となる。
図１は、各種疾患の既往歴と血中２ＳＣとの比較を示す。 図２は、血中に遊離する２ＳＣの値と網膜症および腎症における病態の進行の比較を示す。 図３は、各種疾患の患者の血清におけるＣＭＬの測定の結果を示す。 図４は、動脈硬化モデルマウスにおける血中２ＳＣの測定の結果を示す。
　以下、本発明について更に詳細に説明する。
＜血管障害の判定方法＞
　本発明による血管障害の判定方は、血中のＳ‐（２‐スクシニル）システイン量を測定することを含む方法である。
　本発明においては、代謝によって生成する様々な翻訳後修飾構造を合成し、さらに１３Ｃ標識された内部標準物質を合成し、質量分析装置による定量系を確立した。そして、血管障害で変動する翻訳後修飾物を探索した結果、２ＳＣがヒト細小血管および大血管障害で血中レベルが上昇することが確認された。２ＳＣの標準品は販売されておらず、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで血中２ＳＣを測定することは報告されていない。
　本発明は、内部標準の合成およびＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより血中２ＳＣの正確な定量が可能となり、ヒト動脈硬化において血中２ＳＣが上昇するデータが得られたことに基づく発明である。
　血管障害としては、大血管障害または細小血管障害のいずれでもよい。大血管障害としては、例えば、下肢閉塞性動脈硬化、冠動脈疾患または脳血管疾患における大血管障害を判定することができる。細小血管障害としては、例えば、網膜症、神経障害または腎症における細小血管障害を判定することができる。
　本発明の第一の例においては、血中のＳ‐（２‐スクシニル）システイン量を測定することにより得られた測定値が基準値より高い場合あるいは低い場合に血管障害を有するものと判定することができる。本発明の第二の例においては、血中のＳ‐（２‐スクシニル）システイン量を測定することにより得られた測定値が基準値より高い場合あるいは低い場合に血管障害リスクが高いと判定することができる。
　血中のＳ‐（２‐スクシニル）システイン量としては、血中に遊離して存在するＳ‐（２‐スクシニル）システインの量を測定してもよいし、タンパク中に存在するＳ‐（２‐スクシニル）システインも含むＴｏｔａｌのＳ‐（２‐スクシニル）システインの量を測定してもよい。
　本発明の一例においては、タンパク中に存在するＳ‐（２‐スクシニル）システインも含むＴｏｔａｌのＳ‐（２‐スクシニル）システインの量を測定することにより得られた測定値が基準値より高い場合に、大血管障害（例えば下肢閉塞性動脈硬化、冠動脈疾患または脳血管疾患における大血管障害）を有するものと判定することができ、また大血管障害リスク（例えば下肢閉塞性動脈硬化、冠動脈疾患または脳血管疾患における大血管障害）が高いと判定することができる。
　本発明の別の例においては、血中に遊離して存在するＳ‐（２‐スクシニル）システインの量を測定することにより得られた測定値が基準値より高い場合に、細小血管障害（例えば、網膜症、神経障害または腎症における細小血管障害）を有するものと判定することができ、また細小血管障害リスク（例えば、網膜症、神経障害または腎症における細小血管障害）が高いと判定することができる。
　また、血中に遊離して存在するＳ‐（２‐スクシニル）システインの量を測定することにより得られた測定値が基準値より高い場合に、下肢閉塞性動脈硬化または冠動脈疾患における大血管障害を有するものと判定することができ、また下肢閉塞性動脈硬化または冠動脈疾患における大血管障害リスクが高いと判定することができる。
＜質量分析＞
　本発明の一例においては、血中のＳ‐（２‐スクシニル）システイン量を、質量分析により測定することができる。質量分析は、例えば、特開２０１４－１１９３７０号公報に記載の方法に準じて行うことができるが、特に限定されない。
　本発明においては、まず、血液を酸で処理することが好ましい。血液としては、全血、血清、又は血漿などを使用でき、血清がより好ましい。
　酸処理に使用される酸は、有機酸でも無機酸でもよいが、無鉄塩酸またはギ酸が好ましい。使用する酸のｐＨは、好ましくはｐＨ０．５～１．５、より好ましくはｐＨ０．８～１．２である。酸処理においては、例えば、血液に酸の溶液を添加し、必要に応じて振盪又は攪拌した後、静置し、試料を加水分解させればよい。さらに、加水分解中に反応液を加温すると好ましい。酸処理に使用される酸の量、反応時間および温度の条件は、血液を十分に溶解できる条件且つ反応液が液相となる条件であればよい。
　本発明においては、血中２ＳＣは、血中に遊離して存在する２ＳＣを測定する手法（Ｆｒｅｅ）を採用してもよいし、タンパク中に存在する２ＳＣも含むＴｏｔａｌの２ＳＣを測定する手法（Ｔｏｔａｌ）を採用してもよい。
　血中に遊離して存在する２ＳＣを測定する手法（Ｆｒｅｅ）においては、血清に同位体を用いて合成した内部標準（［１３Ｃ３，５Ｎ１］２ＳＣ）を添加し、さらに水を添加することにより試料を調製することができる。
　タンパク中に存在する２ＳＣも含むＴｏｔａｌの２ＳＣを測定する手法（Ｔｏｔａｌ）においては、血液に内部標準（［１３Ｃ３，５Ｎ１］２ＳＣ）および塩酸を加え、１００℃などの高温下で加水分解し、溶液を乾固させた後に水を添加することにより試料を調製することができる。
　上記のようにして調製した試料は、ギ酸を含むメタノールを充填したＣａｐｔｉｖａ　ＮＤ　Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内に添加し、よく混合させた後に通過させることができる。これにより脱脂および除タンパクを行うことができる。
　さらに回収した試料を乾固し、ギ酸を含む水に再懸濁した後、Ｃ１８カラムであるＳｅｐ－ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ　Ｃｏｒｐ）を通過させることができる。Ｓｅｐ－ｐａｋはあらかじめ１％のギ酸を含む水で平衡化し、サンプルを通過させた後、さらに１％ギ酸を含む２０％メタノールを２ｍｌ通過させ通過した画分を回収することができる。回収した溶液を乾固し、０．１％のギ酸を含む２０％アセトニトリル１ｍｌに再懸濁した後、分子量３０００カットフィルターであるＶＩＶＡＳＰＩＮ　５００（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　Ｓｔｅｄｉｍ）によって濾過することにより、質量分析用試料を得ることができる。なお、質量分析用試料の調製方法は、分析の方法や使用する機器に応じて適宜調製され得るため、上記の調製方法に限定されない。
　質量分析の方法としては、測定可能な方法であれば特に限定されないが、液体クロマトグラフィーと質量分析とを組み合わせた分析方法が好ましく、例えば、液体クロマトグラフィー－質量分析（例えば、ＬＣ－ＭＳ法、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ等）法が挙げられる。検出感度をより向上させるためには、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法や、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ／ＭＳ法などの液体クロマトグラフィー－タンデム型質量分析法がより好ましい。
　液体クロマトグラフィー－質量分析のための乾固試料溶解用の適切な溶媒としては、液体クロマトグラフィーの移動相の最終条件と同じ溶媒を用いることが好ましい。例えば、メタノールの水溶液やアセトニトリルの水溶液、アセトニトリルとトリフルオロ酢酸の混合水溶液、アセトニトリルとギ酸の混合水溶液などが挙げられるが、特に限定されない。
　液体クロマトグラフィー－質量分析計により２ＳＣを測定する際の測定条件は、機器の型、試料の状態等に応じて、当業者が通常の知識に基づいて適宜設定すればよい。液体クロマトグラフィーの条件は供される試料によって異なるが、例えば、移動相にギ酸水溶液とギ酸アセトニトリル溶液でグラジエントを形成させると好ましい。質量分析計としては、二重収束磁場型質量分析計、イオントラップ型質量分析計、四重極型質量分析計などが挙げられるが、これらに限定されない。
　上記手順で測定された測定値を、同様の手順で測定された標準溶液からの測定値と比較することによって、生体試料由来の２ＳＣを定量することができる。具体的には、所定濃度の２ＳＣを含有する標準溶液からの測定結果に基づいて、検量線を作成する。検量線作成の際には、内部標準を用いて各測定値を校正しておくと、より精度の高い検量線が得られるため好ましい。
＜免疫分析＞
　本発明の別の例においては、血中のＳ‐（２‐スクシニル）システイン量を、免疫分析により測定することができる。免疫分析は、２ＳＣを検出できるポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体を用いて行うことができる。血中２ＳＣを定量できるモノクローナル抗体を用いることにより、より簡便に多検体の測定が可能である。
　２ＳＣを検出できる抗体の製造方法について説明する。
　２ＳＣを検出できる抗体は、２ＳＣを免疫原として用いることにより作製することができる。２ＳＣをタンパク質に結合して充分な免疫原性を有する免疫原としてもよい。２ＳＣを結合させるタンパク質としては、キャリアタンパク質として公知の各種のものを使用することができ、例えば血清アルブミン等のアルブミンや、ヘモシアニン、ミオグロビン等が挙げられる。また、キャリアタンパク質としては、ウシ、ウサギ、ヒト等の哺乳動物、スカシ貝等の貝類、鶏等の鳥類等に由来するもの等を用いることができる。これらの中でも、スカシ貝ヘモシアニン(KLH)及びウシ血清アルブミン(BSA)が好ましい。これらのタンパク質は、一種を単独で又は二種以上を組み合わせて用いることもできる。
　２ＳＣのキャリアタンパク質への結合には、クロスリンカーを用いることが好ましい。クロスリンカーとしては、各種公知のものを用いることができ、例えば、グルタルアルデヒド、EDC(1-ethy-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)、SPDP、DST、DSGなどを用いることができる。これらの中でも、グルタルアルデヒド、又はEDCを用いることが好ましい。クロスリンカーは、一種を単独で又は二種以上を組み合わせて用いることもできる。
　２ＳＣ、又は２ＳＣとキャリアタンパク質との結合体を抗原としてヒト以外の動物を免疫し、その動物体内に抗体産生細胞を産生させる。免疫動物から得られた血清からプロテインGカラムを用いて２ＳＣに対するポリクローナル抗体を単離できる。また、モノクローナル抗体の製法の常法に従って行うことができる。
　動物の種類は、特に限定されないが、哺乳動物が好ましい。哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、ウサギ等のげっ歯類が挙げられる。マウスは、ＢＡＬＢ／Ｃ系統のマウスを用いることが、ハイブリドーマの作製に用いる骨髄腫由来の細胞株が確立している点から好ましい。免疫は、各種公知の方法により行うことができ、例えば、哺乳動物の皮下、皮内、静脈、または腹腔内に注射する。免疫は、初回の免疫後に何度か繰り返し行うことが好ましく、免疫のスケジュールは、免疫する動物の種類や系統に応じて適宜に決定することができる。また、免疫応答を増強させるために、抗原は、投与前又は投与時にアジュバントと混合して投与することが好ましい。アジュバントとしては、各種公知のものを用いることができる。また、例えば、初回免疫時には完全フロイントアジュバント(CFA:Complete Freund's adjuvant)を用い、２回目以降は不完全フロイントアジュバント(IFA:Incomplete Freund's adjuvant)を用いる等、２種以上のアジュバントを用いることもできる。
　上記にようにして免疫した動物の抗体産生細胞を用いて、２ＳＣに対するモノクローナル抗体の産生能を有するハイブリドーマを作製することができる。
　上記の免疫後の動物は、適宜の間隔で採血し、２ＳＣに対する抗体が産生されていることを確認する。抗体産生の確認には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法等の公知の分析方法を用いることができる。抗体産生の確認後、ブースト（免疫原の追加注射）を行うことも好ましい。最終免疫後、免疫した動物から脾臓細胞を摘出し、骨髄腫由来の細胞と細胞融合させる。細胞融合の方法は、例えば、ポリエチレングリコール法、センダイウイルスを用いる方法、電気刺激を与える方法等の公知の方法を用いることができる。融合細胞は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含むＨＡＴ培地等で選択可能である。また、得られた融合細胞から、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法等の公知の分析方法により、２ＳＣに対する抗体の産生能が高い融合細胞を選択する。そして、選択した細胞を用いて、限界希釈法、軟寒天法等の公知の方法によりクローニングを行う。このようにして、２ＳＣに対する特異性又は２ＳＣに対する結合能が高いモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得られる。
　上記のようにして得られたハイブリドーマは、培養して増殖させ、その培養液等から２ＳＣに対するモノクローナル抗体を分離精製することにより、モノクローナル抗体が大量に得られる。ハイブリドーマの培養方法としては、哺乳動物の腹腔内に注射し腹水内で増殖させる方法や動物の体外で適切な培地を用いて培養する方法等の各種公知の方法を採用可能である。また、腹水や培養液または培養上清から得た抗体の精製には、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知の方法を特に制限なく使用可能である。
　なお、２ＳＣに対するモノクローナル抗体としては、上記のようにして得られた抗体のほか、２ＳＣの識別部位を含む抗体の断片も含まれる。また、２ＳＣに対するモノクローナル抗体としては、２ＳＣの識別部位を含むように遺伝子組換え技術を用いて製造したキメラ抗体やヒト化抗体でもよい。
　２ＳＣに対する抗体としては、２ＳＣに対する特異性及び／又は２ＳＣに対する結合能に優れていることが好ましい。このような抗体を用いて免疫分析を行うことにより、血中の２ＳＣを高感度あるいは高精度に検出及び／又は定量することが可能である。２ＳＣに対する抗体を用いて２ＳＣを検出及び／又は定量する方法としては、特に限定されないが、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ法（ＲＩＡ）、発光免疫測定法、沈降法、凝集法、ウエスタンブロット分析、フローサイトメトリー等が挙げられる。酵素免疫測定法としては、競合阻害アッセイや競合結合アッセイを行うこともできる。
＜スクリーニング＞
　本発明はさらに、候補物質を投与した対象の血中のＳ－（２‐スクシニル）システイン量を測定することを含む、血管障害の予防又は治療のための候補物質のスクリーニング方法に関する。血中のＳ‐（２‐スクシニル）システイン量は、本明細書中において上記した質量分析または免疫分析により測定することが好ましい。
　候補物質を投与する対象としては、特に限定されないが、非ヒト哺乳動物が好ましく、例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類の他、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、サル等を使用することができる．上記の中でも、マウス、ハムスター、モルモット、ラット、ウサギ等のげっ歯類が好ましく、そのなかでもマウスが最も好ましい。
　候補物質としては任意の物質を使用することができ、特には限定されない。候補物質としては、個々の低分子化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、合成ペプチドでもよい。候補物質は、化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリーもしくはコンビナトリアルライブラリーでもよい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。候補物質の一例としては、食品由来成分である。
　本発明のスクリーニング方法においては、血中の２ＳＣ量を低減させる物質を、血管障害の予防又は治療のための候補物質として選別することができる。候補物質を投与した対象と、コントロール物質を投与した対象とを用いて、両者の血中の２ＳＣ量を比較することによって、血中の２ＳＣ量を低減させる物質を同定することができる。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
＜２ＳＣの前処理方法と検出方法＞
　血清中２ＳＣは、血中に遊離して存在する２ＳＣを測定する手法（Ｆｒｅｅ）と、タンパク中に存在する２ＳＣを含めて測定する手法（Ｔｏｔａｌ）の２つの手法を確立した。
　Ｆｒｅｅでは、血清３０μｌに同位体を用いて合成した内部標準（［１３Ｃ３，１５Ｎ１］　２ＳＣ）を添加し、水で７００μｌまでｕｐしたものを０．１％のギ酸を含むメタノール（２．１ｍｌ）を充填したＣａｐｔｉｖａ　ＮＤ　Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内に添加し、よく混合させた後に通過させ、脱脂および徐タンパクを行った。回収した試料を乾固し、１％のギ酸を含む水１ｍｌに再懸濁した後、Ｃ１８カラムであるＳｅｐ－ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ　Ｃｏｒｐ）を通過させた。Ｓｅｐ－ｐａｋはあらかじめ１％のギ酸を含む水で平衡化し、サンプルを通過させた後、さらに１％ギ酸を含む２０％メタノールを２ｍｌ通過させ通過した画分を回収した。回収した溶液を乾固し、０．１％のギ酸を含む２０％アセトニトリル１ｍｌに再懸濁した後、分子量３０００カットフィルターであるＶＩＶＡＳＰＩＮ５００（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ　Ｓｔｅｄｉｍ）によって濾過したサンプルを測定に用いた。
　一方、Ｔｏｔａｌでは、最初に血清１μｌに内部標準および１ｍｌの６Ｎ　ＨＣｌを加え、１００℃で１８時間加水分解し、溶液を乾固させた後に水で７００μｌまでｕｐし、Ｃａｐｔｉｖａ　ＮＤ　Ｌｉｐｉｄｓ　を用いた処理以降はＦｒｅｅと同様に処理した。
　液体クロマトグラフィータンデム質量分析装置（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を用いて測定を行う際には０．１％のギ酸を含むアセトニトリルと０．１％のギ酸を含む水のグラジュエントの条件においてＺＩＣ（登録商標）－ＨＩＬＩＣ　ｃｏｌｕｍｎ（１５０ｘ２．１ｍｍ，　５μｍ）（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて液体クロマトグラフィーによる分離を行い、ＥＳＩポジティブでイオン化し、ＭＳ／ＭＳによる検出を行った。２ＳＣおよび内部標準として用いた［１３Ｃ３，１５Ｎ１］２ＳＣはイオン化によって、それぞれのペアレントイオンが２３８（ｍ／ｚ）と２４２（ｍ／ｚ）となり、それらから得られるプロダクトイオン１４９（ｍ／ｚ）を検出することで２ＳＣの測定を行った。
＜結果＞
（１）各種疾患の既往歴と血中２ＳＣとの比較
　各種疾患の既往歴と血中２ＳＣとの比較を行った。測定した患者は、平均年齢６７歳の計３２人（男１７人、女１５人）である。各病態の既往歴を有する人数は以下の通りである。下肢閉塞性動脈硬化：３人、冠動脈疾患：９人、脳血管疾患：２人、網膜症：１１人、神経障害：１１人、腎症：１５人。
　結果を図１に示す。血中に遊離する２ＳＣ（Ｆｒｅｅ）は主に細小血管障害において有意に増加し、血中のトータル２ＳＣ（Ｔｏｔａｌ）は大血管障害において増加することが明らかとなった。
（２）血中に遊離する２ＳＣの値と網膜症および腎症における病態の進行の比較
　細小血管障害において有意な増加が認められた血中に遊離する２ＳＣの値を網膜症および腎症における病態の進行と比較を行った。測定した患者は、平均年齢６６歳の計６８人（男３０人、女３８人）である。各群の人数は以下の通りである。網膜症無し：５２人、単純糖尿病網膜症：１０人、前増殖糖尿病網膜症：２人、増殖糖尿病網膜症：４人。腎症無し・１期：４６人、腎症２期：１８人、腎症３期：３人、腎症４期：１人。
　結果を図２に示す。各群のサンプル数が少ないため、有意な差は認められないが、増加する傾向が示された。
（３）各種疾患の患者の血清におけるＣＭＬの測定
　図１で測定を行った患者の血清において代表的なＡＧＥｓ構造であるＣＭＬを測定し、既往歴との比較を行った。
　結果を図３に示す。ＣＭＬでは２ＳＣとは異なり、各疾患における増加は認められなかった。ＣＭＬは血管障害のマーカーとして期待されているが、血管障害の進展では変化しないことが明らかとなった。
（４）動脈硬化モデルマウスにおける血中２ＳＣの測定
　動脈硬化モデルマウスであるａｐｏＥ欠損マウス（２０週齢）の血中２ＳＣを測定し、健常個体と比較した（各群３個体ずつ）。
　結果を図４に示す。ＦｒｅｅおよびＴｏｔａｌどちらの２ＳＣ値もａｐｏＥ欠損マウスで高値を示し、ヒト同様モデルマウスにおいても血管障害の発症と血中２ＳＣ値との関連性が明らかとなった。

Claims (7)

  1. 血中のＳ‐（２‐スクシニル）システイン量を測定することを含む、血管障害の判定方法。
  2. 血中のＳ‐（２‐スクシニル）システイン量を測定することにより得られた測定値が基準値より高い場合に血管障害を有するものと判定する、請求項１に記載の判定方法。
  3. 血中のＳ‐（２‐スクシニル）システイン量を測定することにより得られた測定値が基準値より高い場合に血管障害リスクが高いと判定する、請求項１に記載の判定方法。
  4. 血中のＳ‐（２‐スクシニル）システイン量を、質量分析または免疫分析により測定する、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
  5. 候補物質を投与した対象の血中のＳ‐（２‐スクシニル）システイン量を測定することを含む、血管障害の予防又は治療のための候補物質のスクリーニング方法。
  6. 血中のＳ‐（２‐スクシニル）システイン量を、質量分析または免疫分析により測定する、請求項５に記載のスクリーニング方法。
  7. 候補物質が、食品由来成分である、請求項５又は６に記載のスクリーニング方法。
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