JPWO2020017589A1 - 血管障害の判定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1) 血中のS‐(2‐スクシニル)システイン量を測定することを含む、血管障害の判定方法。
(2) 血中のS‐(2‐スクシニル)システイン量を測定することにより得られた測定値が基準値より高い場合に血管障害を有するものと判定する、(1)に記載の判定方法。
(3) 血中のS‐(2‐スクシニル)システイン量を測定することにより得られた測定値が基準値より高い場合に血管障害リスクが高いと判定する、(1)に記載の判定方法。
(4) 血中のS‐(2‐スクシニル)システイン量を、質量分析または免疫分析により測定する、(1)から(3)の何れか一に記載の方法。
(5) 候補物質を投与した対象の血中のS‐(2‐スクシニル)システイン量を測定することを含む、血管障害の予防又は治療のための候補物質のスクリーニング方法。
(6) 血中のS‐(2‐スクシニル)システイン量を、質量分析または免疫分析により測定する、(5)に記載のスクリーニング方法。
(7) 候補物質が、食品由来成分である、(5)又は(6)に記載のスクリーニング方法。
<血管障害の判定方法>
本発明による血管障害の判定方は、血中のS‐(2‐スクシニル)システイン量を測定することを含む方法である。
本発明においては、代謝によって生成する様々な翻訳後修飾構造を合成し、さらに13C標識された内部標準物質を合成し、質量分析装置による定量系を確立した。そして、血管障害で変動する翻訳後修飾物を探索した結果、2SCがヒト細小血管および大血管障害で血中レベルが上昇することが確認された。2SCの標準品は販売されておらず、LC−MS/MSで血中2SCを測定することは報告されていない。
本発明は、内部標準の合成およびLC−MS/MSにより血中2SCの正確な定量が可能となり、ヒト動脈硬化において血中2SCが上昇するデータが得られたことに基づく発明である。
また、血中に遊離して存在するS‐(2‐スクシニル)システインの量を測定することにより得られた測定値が基準値より高い場合に、下肢閉塞性動脈硬化または冠動脈疾患における大血管障害を有するものと判定することができ、また下肢閉塞性動脈硬化または冠動脈疾患における大血管障害リスクが高いと判定することができる。
本発明の一例においては、血中のS‐(2‐スクシニル)システイン量を、質量分析により測定することができる。質量分析は、例えば、特開2014−119370号公報に記載の方法に準じて行うことができるが、特に限定されない。
タンパク中に存在する2SCも含むTotalの2SCを測定する手法(Total)においては、血液に内部標準([13C3,5N1]2SC)および塩酸を加え、100℃などの高温下で加水分解し、溶液を乾固させた後に水を添加することにより試料を調製することができる。
本発明の別の例においては、血中のS‐(2‐スクシニル)システイン量を、免疫分析により測定することができる。免疫分析は、2SCを検出できるポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体を用いて行うことができる。血中2SCを定量できるモノクローナル抗体を用いることにより、より簡便に多検体の測定が可能である。
2SCを検出できる抗体は、2SCを免疫原として用いることにより作製することができる。2SCをタンパク質に結合して充分な免疫原性を有する免疫原としてもよい。2SCを結合させるタンパク質としては、キャリアタンパク質として公知の各種のものを使用することができ、例えば血清アルブミン等のアルブミンや、ヘモシアニン、ミオグロビン等が挙げられる。また、キャリアタンパク質としては、ウシ、ウサギ、ヒト等の哺乳動物、スカシ貝等の貝類、鶏等の鳥類等に由来するもの等を用いることができる。これらの中でも、スカシ貝ヘモシアニン(KLH)及びウシ血清アルブミン(BSA)が好ましい。これらのタンパク質は、一種を単独で又は二種以上を組み合わせて用いることもできる。
動物の種類は、特に限定されないが、哺乳動物が好ましい。哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、ウサギ等のげっ歯類が挙げられる。マウスは、BALB/C系統のマウスを用いることが、ハイブリドーマの作製に用いる骨髄腫由来の細胞株が確立している点から好ましい。免疫は、各種公知の方法により行うことができ、例えば、哺乳動物の皮下、皮内、静脈、または腹腔内に注射する。免疫は、初回の免疫後に何度か繰り返し行うことが好ましく、免疫のスケジュールは、免疫する動物の種類や系統に応じて適宜に決定することができる。また、免疫応答を増強させるために、抗原は、投与前又は投与時にアジュバントと混合して投与することが好ましい。アジュバントとしては、各種公知のものを用いることができる。また、例えば、初回免疫時には完全フロイントアジュバント(CFA:Complete Freund's adjuvant)を用い、2回目以降は不完全フロイントアジュバント(IFA:Incomplete Freund's adjuvant)を用いる等、2種以上のアジュバントを用いることもできる。
本発明はさらに、候補物質を投与した対象の血中のS−(2‐スクシニル)システイン量を測定することを含む、血管障害の予防又は治療のための候補物質のスクリーニング方法に関する。血中のS‐(2‐スクシニル)システイン量は、本明細書中において上記した質量分析または免疫分析により測定することが好ましい。
血清中2SCは、血中に遊離して存在する2SCを測定する手法(Free)と、タンパク中に存在する2SCを含めて測定する手法(Total)の2つの手法を確立した。
(1)各種疾患の既往歴と血中2SCとの比較
各種疾患の既往歴と血中2SCとの比較を行った。測定した患者は、平均年齢67歳の計32人(男17人、女15人)である。各病態の既往歴を有する人数は以下の通りである。下肢閉塞性動脈硬化:3人、冠動脈疾患:9人、脳血管疾患:2人、網膜症:11人、神経障害:11人、腎症:15人。
細小血管障害において有意な増加が認められた血中に遊離する2SCの値を網膜症および腎症における病態の進行と比較を行った。測定した患者は、平均年齢66歳の計68人(男30人、女38人)である。各群の人数は以下の通りである。網膜症無し:52人、単純糖尿病網膜症:10人、前増殖糖尿病網膜症:2人、増殖糖尿病網膜症:4人。腎症無し・1期:46人、腎症2期:18人、腎症3期:3人、腎症4期:1人。
図1で測定を行った患者の血清において代表的なAGEs構造であるCMLを測定し、既往歴との比較を行った。
結果を図3に示す。CMLでは2SCとは異なり、各疾患における増加は認められなかった。CMLは血管障害のマーカーとして期待されているが、血管障害の進展では変化しないことが明らかとなった。
動脈硬化モデルマウスであるapoE欠損マウス(20週齢)の血中2SCを測定し、健常個体と比較した(各群3個体ずつ)。
結果を図4に示す。FreeおよびTotalどちらの2SC値もapoE欠損マウスで高値を示し、ヒト同様モデルマウスにおいても血管障害の発症と血中2SC値との関連性が明らかとなった。
Claims (7)
- 血中のS‐(2‐スクシニル)システイン量を測定することを含む、血管障害の判定方法。
- 血中のS‐(2‐スクシニル)システイン量を測定することにより得られた測定値が基準値より高い場合に血管障害を有するものと判定する、請求項1に記載の判定方法。
- 血中のS‐(2‐スクシニル)システイン量を測定することにより得られた測定値が基準値より高い場合に血管障害リスクが高いと判定する、請求項1に記載の判定方法。
- 血中のS‐(2‐スクシニル)システイン量を、質量分析または免疫分析により測定する、請求項1から3の何れか一項に記載の方法。
- 候補物質を投与した対象の血中のS‐(2‐スクシニル)システイン量を測定することを含む、血管障害の予防又は治療のための候補物質のスクリーニング方法。
- 血中のS‐(2‐スクシニル)システイン量を、質量分析または免疫分析により測定する、請求項5に記載のスクリーニング方法。
- 候補物質が、食品由来成分である、請求項5又は6に記載のスクリーニング方法。
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