KR20220147632A - 활성 기반 숙주 세포 단백질 프로파일링 - Google Patents

활성 기반 숙주 세포 단백질 프로파일링 Download PDF

Info

Publication number
KR20220147632A
KR20220147632A KR1020227033251A KR20227033251A KR20220147632A KR 20220147632 A KR20220147632 A KR 20220147632A KR 1020227033251 A KR1020227033251 A KR 1020227033251A KR 20227033251 A KR20227033251 A KR 20227033251A KR 20220147632 A KR20220147632 A KR 20220147632A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
probe
active site
protein
hcp
mass spectrometer
Prior art date
Application number
KR1020227033251A
Other languages
English (en)
Inventor
하이보 키우
로사린 몰덴
Original Assignee
리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. filed Critical 리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Publication of KR20220147632A publication Critical patent/KR20220147632A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
    • G01N30/724—Nebulising, aerosol formation or ionisation
    • G01N30/7266—Nebulising, aerosol formation or ionisation by electric field, e.g. electrospray
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01001—Carboxylesterase (3.1.1.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)

Abstract

본 출원은 제조 공정 중 샘플 및 바이오 약학적 생성물에서 효소적 활성을 갖는 숙주 세포 단백질 불순물을 식별하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 본 출원은 리포터 또는 친화성-기반 태그를 갖는 기능화된 분자를 함유하는 프로브를 포함하는 숙주 세포 단백질 불순물의 상이한 효소 부류를 특징규명하기 위한 다양한 활성-기반 프로브를 제공한다.

Description

활성 기반 숙주 세포 단백질 프로파일링
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 9월 1일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 63/073,125, 2020년 2월 27일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/982,346 및 2020년 5월 7일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 63/021,181에 대한 우선권을 주장하며, 이의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 발명은 일반적으로 효소적 활성을 갖는 숙주 세포 단백질 불순물을 식별하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다. 이러한 방법 및 시스템은 제조 공정 중 샘플 및 바이오 약학적 생성물에 적용되어 숙주 세포 단백질 불순물을 식별하고 모니터링할 수 있다.
배경
단클론 항체의 정제와 같은 바이오 약학적 생성물의 제조과정에서 고순도의 바이오 약학적 생성물을 수득하기 위해서는 불순물 제거가 필요하다. 특히, DNA 기술은 숙주 세포에서 바이오 약학적 생성물을 생산하는 데 널리 사용되었기 때문에, 잔류 숙주 세포 단백질(HCP)은 생성물의 품질 및 안정성이 저하되어 환자에게 잠재적인 안전성 위험을 줄 수 있다. 재조합 치료 항체를 생산하기 위해서는 항체 생성물이 고도로 정제되는 것을 보장하기 위해서는 여러 정제 공정이 필요하다. 생물공정을 수행한 후의 임의의 잔류 불순물은 임상 연구를 수행하기 전에 허용 가능한 낮은 수준으로 존재해야 한다. 특히, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포와 같은 포유류 발현 시스템으로부터 유래된 HCP는 최종 약물 물질(drug substance)에서 모니터링 및 제어되어야 한다. 때때로, 총 HCP가 매우 낮은 수준으로 존재할 수 있음에도 불구하고, 미량의 특정 HCP는 약물 주입 후 면역 반응 또는 독성 생물학적 활성을 유발할 수 있다. 따라서, 위험 평가를 위한 특정 HCP를 식별하고 모니터링해야 하는 충족되지 않은 필요성이 존재한다.
잔류 HCP의 존재는 잠재적인 안전성 위험 또는 약물 안정성의 문제를 유발할 수 있으며, 특히 활성 프로테아제와 같은 효소적 활성을 갖는 HCP는 더욱 그러하다. 효소적 활성을 갖는 HCP 불순물을 식별, 프로파일링, 특징규명 및 정량화하기 위한 방법 및 시스템이 필요하다는 것이 인식될 것이다. 이러한 방법 및 시스템은 제조 공정 중 샘플 및 바이오 약학적 생성물에서 효소적 HCP 불순물의 강력하고 신뢰할 수 있고 민감한 검출을 제공해야 한다.
개요
허용 가능한 수준의 숙주 세포 단백질(HCP) 불순물을 정의하는 것은 치료제를 제조하기 위해 생물학적 시스템을 사용하는 데 중요한 문제가 되었다. 바이오 약학적 생성물의 안전성 및 효능을 보장하기 위해 제어 및 모니터링되어야 하는 잠재적으로 수천 개의 성분과 같은 다수의 HCP 불순물이 존재한다.
본 출원은 효소적 활성을 갖는 HCP 불순물을 식별, 프로파일링, 특징규명 또는 정량화하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 이러한 방법 및 시스템은 HCP 불순물의 상이한 효소 부류를 특징규명하기 위한 다양한 활성-기반 프로브를 제공하는 것을 포함하는 제조 공정 중 샘플 및 바이오 약학적 생성물에서 HCP 불순물을 식별하고 모니터링하는 데 사용될 수 있다.
본 개시내용은 샘플의 HCP 불순물을 식별, 프로파일링, 특징규명 또는 정량화하는 방법을 제공한다. 일부 예시적인 실시양태에서, 본 출원의 방법은 샘플을 적어도 하나의 프로브와 접촉시켜 프로브-부착된 HCP 불순물을 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 프로브는 워헤드(warhead) 및 태그(tag)를 포함하고, 여기서 워헤드는 프로브-부착된 HCP 불순물의 활성 부위에 결합할 수 있고, 여기서 샘플은 적어도 하나의 고풍부성(high-abundance) 단백질을 포함한다. 일 측면에서, 방법의 프로브의 워헤드는 프로브-부착된 HCP 불순물의 활성 부위에 있는 잔기에 공유적으로 결합할 수 있다. 일 측면에서, 방법의 프로브의 태그는 접합 태그, 친화성 태그, 또는 리포터 태그이다.
일 측면에서, 본 출원의 방법은 고체 지지체와 샘플 접촉시키는 단계, 후속적으로 용액을 사용하여 프로브-부착된 HCP 불순물을 단리하고 용리액을 제공하기 위해 고체 지지체를 세척하는 단계, 단리된 프로브-부착된 HCP 불순물의 성분을 생성하기 위해 용리액을 효소적 분해 반응으로 처리하는 단계, 및 후속적으로 질량 분석기를 사용하여 단리된 프로브-부착된 HCP 불순물의 성분을 식별, 프로파일링, 특징규명 또는 정량화하는 단계를 추가로 포함하되; 여기서 고체 지지체는 리간드를 포함하고, 여기서 리간드는 태그에 결합할 수 있다.
일 측면에서, 본 출원의 방법의 프로브의 워헤드는 효소 억제제, 효소 기질-기반 스캐폴드 또는 단백질-반응성 분자를 포함한다. 일 측면에서, 본 출원의 방법의 적어도 하나의 프로브는 링커를 추가로 포함한다. 일 측면에서, 방법의 샘플에서 적어도 하나의 고풍부성 단백질은 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 항체의 Fab 영역, 항체-약물 접합체, 융합 단백질, 단백질 약학적 생성물 또는 약물이다. 또 다른 측면에서, 방법의 효소적 분해 반응의 효소는 트립신이다.
일 측면에서, 본 출원의 방법의 질량 분석기는 전자분무 이온화 질량 분석기, 나노-전자분무 이온화 질량 분석기, 예컨대 Orbitrap 질량 분석기, Q-TOF 질량 분석기 또는 삼중 사중극자(triple quadrupole) 질량 분석기이고, 여기서 질량 분석기는 액체 크로마토그래피 시스템에 커플링된다. 일 측면에서, 방법의 질량 분석기는 LC-MS(액체 크로마토그래피-질량 분석법), 나노-LC-MS, LC-MS/MS, 나노-LC-MS/MS 또는 LC-MRM-MS(액체 크로마토그래피-다중 반응 모니터링-질량 분석법) 분석을 수행할 수 있다.
일 측면에서, 방법의 프로브의 태그는 웨스턴 블롯, 모세관 전기이동(capillary electrophoresis), SDS-PAGE, 형광 가시화, 또는 형광 겔 이미징을 사용하여 검출된다. 또 따른 측면에서, 방법의 프로브-부착된 HCP 불순물의 활성 부위는 시스테인 프로테아제 활성 부위, 세린 프로테아제 활성 부위, 세린 가수분해효소 활성 부위, 카텝신 활성 부위, 메탈로프로테아제 활성 부위, 콜린에스테라아제 활성 부위, 지질-결합 단백질의 활성 부위, 스핑고리피드-결합 단백질의 활성 부위, 세라마이드-결합 단백질의 활성 부위, 리파아제 활성 부위, 프로테아제 활성 부위, 가수분해효소 활성 부위, 산화환원효소 활성 부위, 또는 이성질화효소 활성 부위이다.
일 측면에서, 방법의 프로브의 태그는 형광단 또는 형광단 접합 부위, 예컨대 로다민, 비오틴, 포스핀, 알킨, 아지드, 아세틸렌, 시클로옥틴, 페닐 아지드 또는 오메가-말단 아지드를 포함한다. 일 측면에서, 프로브의 워헤드는 플루오로포스포네이트, 에폭시숙시네이트, 광활성화 지질(Photo-activatable lipid), 광활성화 스핑고신, N-아세틸화 아미노산, 퀴놀리민 메티드 커플링된 아미노산, 또는 p-아미노만델산 커플링된 아미노산을 포함한다. 일 측면에서, 본 출원의 방법의 프로브는 아지도-플루오로포스포네이트; 데스티오비오틴-플루오로포스포네이트; 테트라메틸로다민-플루오로포스포네이트; 에틸(2S,3S)-에폭시숙시네이트-Leu-Tyr-Acp-Lys(비오틴)-NH2; 1-팔미토일-2-(9-(3-펜트-4-이닐-3-H-디아지린-3-일)-노나노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린; (2S,3R,E)-2-아미노-13-(3-(펜트-4-인-1-일)-3H-디아지린-3-일)트리데크-4-엔-1,3-디올; N-(9-(3-펜트-4-이닐-3-H-디아지린-3-일)-노나노일)-D-에리트로-스핑고신; 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(5-헥시노일); 또는 D-갈락토실-β-1,1' N-(6"-아지도헥사노일)-D-에리트로-스핑고신을 포함한다.
본 개시내용은 적어도 부분적으로 샘플의 HCP 불순물을 식별, 프로파일링, 특징규명 또는 정량화하기 위한 시스템을 제공한다. 일부 예시적인 실시양태에서, 본 출원의 시스템은 다음을 포함한다: 적어도 하나의 프로브로서, 여기서 적어도 하나의 프로브는 워헤드 및 태그를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 프로브는 프로브-부착된 HCP 불순물을 제공하기 위해 HCP 불순물에 결합할 수 있고, 여기서 워헤드는 프로브-부착된 HCP 불순물의 활성 부위에 결합할 수 있고, 여기서 샘플은 적어도 하나의 고풍부성 단백질을 포함하는, 적어도 하나의 프로브; 고체 지지체로서, 여기서 고체 지지체는 태그에 결합할 수 있는 리간드를 포함하는, 고체 지지체; 프로브-부착된 HCP 불순물을 단리하고 용리액을 제공하기 위해 고체 지지체를 세척하기 위한 용액; 단리된 프로브-부착된 HCP 불순물의 성분을 생성할 수 있는 효소적 분해 용액; 및 단리된 프로브-부착된 HCP 불순물의 성분을 식별, 프로파일링, 특징규명 및/또는 정량화할 수 있는 질량 분석기.
일 측면에서, 시스템의 프로브의 워헤드는 프로브-부착된 HCP 불순물의 활성 부위에 있는 잔기에 공유적으로 결합할 수 있다. 일 측면에서, 시스템의 프로브의 태그는 접합 태그, 친화성 태그 또는 리포터 태그이다. 또 다른 측면에서, 시스템의 프로브의 워헤드는 효소 억제제, 효소 기질-기반 스캐폴드 또는 단백질-반응성 분자를 포함한다. 또 다른 측면에서, 시스템의 적어도 하나의 프로브는 링커를 추가로 포함한다. 또 다른 측면에서, 시스템의 샘플의 적어도 하나의 고풍부성 단백질은 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 항체의 Fab 영역, 항체-약물 접합체, 융합 단백질, 단백질 약학적 생성물 또는 약물이다. 일 측면에서, 시스템의 효소적 분해 용액의 효소는 트립신이다.
일 측면에서, 시스템의 질량 분석기는 전자분무 이온화 질량 분석기, 나노-전자분무 이온화 질량 분석기, 예컨대 Orbitrap 질량 분석기, Q-TOF 질량 분석기 또는 삼중 사중극자 질량 분석기이고, 여기서 질량 분석기는 액체 크로마토그래피 시스템에 커플링된다. 또 다른 측면에서, 시스템의 질량 분석기는 LC-MS(액체 크로마토그래피-질량 분석법), 나노-LC-MS, LC-MS/MS, 나노-LC-MS/MS 또는 LC-MRM-MS(액체 크로마토그래피-다중 반응 모니터링-질량 분석법) 분석을 수행할 수 있다. 일 측면에서, 시스템의 프로브의 태그는 웨스턴 블롯, 모세관 전기이동, SDS-PAGE, 형광 가시화 또는 형광 겔 이미징을 사용하여 검출된다.
일 측면에서, 프로브-부착된 HCP 불순물의 활성 부위는 시스테인 프로테아제 활성 부위, 세린 프로테아제 활성 부위, 세린 가수분해효소 활성 부위, 카텝신 활성 부위, 메탈로프로테아제 활성 부위, 콜린에스테라아제 활성 부위, 지질-결합 단백질의 활성 부위, 스핑고리피드-결합 단백질의 활성 부위, 세라마이드-결합 단백질의 활성 부위, 리파아제 활성 부위, 프로테아제 활성 부위, 가수분해효소 활성 부위, 산화환원효소 활성 부위, 또는 이성질화효소 활성 부위이다. 일 측면에서, 시스템의 프로브의 태그는 형광단 또는 형광단 접합 부위, 예컨대 로다민, 비오틴, 포스핀, 알킨, 아지드, 아세틸렌, 시클로옥틴, 페닐 아지드 또는 오메가-말단 아지드를 포함한다.
일 측면에서, 시스템의 프로브의 워헤드는 플루오로포스포네이트, 에폭시숙시네이트, 광활성화 지질, 광활성화 스핑고신, N-아세틸화 아미노산, 퀴놀리민 메티드 커플링된 아미노산, 또는 p-아미노만델산 커플링된 아미노산을 포함한다. 일 측면에서, 시스템의 프로브는 아지도-플루오로포스포네이트; 데스티오비오틴-플루오로포스포네이트; 테트라메틸로다민-플루오로포스포네이트; 에틸(2S,3S)-에폭시숙시네이트-Leu-Tyr-Acp-Lys(비오틴)-NH2; 1-팔미토일-2-(9-(3-펜트-4-이닐-3-H-디아지린-3-일)-노나노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린; (2S,3R,E)-2-아미노-13-(3-(펜트-4-인-1-일)-3H-디아지린-3-일)트리데크-4-엔-1,3-디올; N-(9-(3-펜트-4-이닐-3-H-디아지린-3-일)-노나노일)-D-에리트로-스핑고신; 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(5-헥시노일); 또는 D-갈락토실-β-1,1' N-(6"-아지도헥사노일)-D-에리트로-스핑고신을 포함한다.
본 발명의 이러한 측면 및 기타 측면은 하기 설명 및 첨부 도면과 함께 고려될 때 더 잘 인식되고 이해될 것이다. 다음의 설명은 다양한 실시양태 및 이의 수많은 특정 세부사항을 나타내면서 제한이 아닌 예시로서 제공된다. 본 발명의 범위 내에서 많은 대체, 변형, 추가 또는 재배열이 이루어질 수 있다.
도 1은 예시적인 실시양태에 따른, 리파아제 및 프로테아제를 포함하는 세린 가수분해효소의 활성 부위에 있는 세린 잔기에 공유적 및 특이적으로 부착될 수 있는 플루오로포스포네이트(FP) 기 및 태그를 함유하는 프로브를 나타낸다.
도 2는 예시적인 실시양태에 따른 아지도-FP, 데스티오비오틴-FP 및 TAMRA-FP를 포함하는 세린 가수분해효소 프로브의 화학 구조를 나타낸다.
도 3은 예시적인 실시양태에 따른 시스테인 프로테아제 프로브, DCG-04, 예를 들어, 에틸 (2S,3S)-에폭시숙시네이트-Leu-Tyr-Acp-Lys(비오틴)-NH2, CD-892의 화학 구조를 나타낸다.
도 4는 예시적인 실시양태에 따른 지질 프로브, 16:0-pacFA PC, 예를 들어, 1-팔미토일-2-(9-(3-펜트-4-이닐-3-H-디아지린-3-일)-노나노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린의 화학 구조를 나타낸다.
도 5는 예시적인 실시양태에 따른 지질 프로브, PhotoClick 스핑고신(900600), 예를 들어, (2S,3R,E)-2-아미노-13-(3-(펜트-4-인-1-일)-3H-디아지린-3-일)트리데크-4-엔-1,3-디올의 화학 구조를 나타낸다.
도 6은 예시적인 실시양태에 따른 지질 프로브, pacFA 세라마이드(900404), 예를 들어, N-(9-(3-펜트-4-이닐-3-H-디아지린-3-일)-노나노일)-D-에리트로-스핑고신의 화학 구조를 나타낸다.
도 7은 예시적인 실시양태에 따른 구리-촉매된 아지드-알킨 고리화 첨가 반응의 화학 구조 및 메커니즘을 나타낸다.
도 8은 예시적인 실시양태에 따른 지질 프로브, 16:0 헥시노일 PE(870127), 예를 들어, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(5-헥시노일)(암모늄염)의 화학 구조를 나타낸다. 이 프로브는 PS-20(폴리소르베이트 20)에서 가수분해된 것과 유사한 에스테르 연결을 함유한다.
도 9는 예시적인 실시양태에 따른 지질 프로브, C6(6-아지도) GalCer(860833), 예를 들어, D-갈락토실-β-1,1' N-(6"-아지도헥사노일)-D-에리트로-스핑고신의 화학 구조를 나타낸다.
도 10은 예시적인 실시양태에 따른 정화된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포-상청액 샘플의 표지된 HCP에서 식별된 586개 단백질의 분자량 및 계산된 등전점, 예를 들어 pI를 나타낸다. 도트 크기는 예시적인 실시양태에 따른 프로브가 있는 경우 그리고 프로브가 없는 경우의 정화된-상청액 샘플에서 표지된 HCP의 단백질 풍부도의 차이를 나타낸다. 단백질 풍부도는 예시적인 실시양태에 따라 적색(높은 풍부성) 내지 청색(낮은 풍부성)의 색상 스케일로 표시되었다.
도 11은 예시적인 실시양태에 따른 세린 가수분해효소 프로브를 사용하여 농축된 HCP 불순물에 대한 유전자 온톨로지 분석 결과를 나타낸다.
도 12는 예시적인 실시양태에 따른 비농축 샘플, 16:0-pacFA PC 프로브 농축 샘플, 및 대조군 샘플(UV 없음) 간의 식별된 HCP 불순물의 비교를 나타낸다.
바이오 약학적 생성물에 숙주 세포 단백질(HCP) 불순물이 존재하면 약효 및 환자 안전성을 포함하는 일부 임상 결과에 영향을 미칠 수 있다. 다양한 접근 방식이 제조 단계의 샘플 및 바이오 약학적 생성물에서 HCP 불순물을 검출하고 식별하기 위해 사용되었다. 일부 HCP 불순물은 효소적 활성, 예를 들어, 효소적 HCP 불순물을 갖는다. 효소적 활성을 갖는 특이적 HCP의 식별은 생성물 안전성에 대한 HCP의 위험을 평가하는 데 중요한 정보를 제공할 수 있다.
본 출원은 활성-기반 프로브의 사용을 포함하는 활성-기반 HCP 프로파일링과 같은 효소적 활성을 갖는 HCP 불순물을 특징규명, 프로파일링, 식별 또는 정량화하는 방법 및 시스템을 제공한다. 본 출원은 상이한 효소 부류를 특징규명하기 위한 다양한 활성-기반 프로브를 제공한다. 본 출원의 활성-기반 프로브는 기능화된 소분자 및 주어진 표적 또는 표적 세트의 효소적 활성을 직접적으로 모니터링하기 위한 리포터 태그 또는 친화성-기반 태그와 같은 태그를 포함한다. 본 출원의 일부 활성-기반 프로브는 특정 촉매 메커니즘을 기반으로 하는 상이한 부류의 효소를 프로파일링하기 위해 효소적 활성 부위에 공유적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 리파아제에 친화성을 갖는 특이적 지질은 리파아제 활성을 갖는 HCP 불순물을 농축시키기 위한 활성-기반 프로브로서 사용될 수 있다. 세린 가수분해효소, 카텝신, 지질 결합 단백질 및 메탈로프로테아제를 특징규명, 프로파일링, 식별 또는 정량화하는 데 유사한 접근 방식을 사용할 수 있다.
활성-기반 단백질 프로파일링은 단백질 풍부도를 정량화하기보다는 복합적 프로테옴에서 효소 부류의 촉매 활성의 변화를 조사하는 데 사용되었다. 활성-기반 단백질 프로파일링은 단백질의 효소 기능을 기능적으로 분석(annotate)하는 데 사용할 수 있다. 상이한 프로브는 프로테아제, 가수분해효소, 산화환원효소 및 이성질화효소를 포함하는 활성 단백질을 차별적으로 표지하기 위해 사용되었다(Blais 등., Activity-based proteome profiling of hepatoma cells during Hepatitis C virus replication using protease substrate probes, Journal of Proteome Research, 2010 Feb 5;9(2):912-23. doi: 10.1021/pr900788a). Blais 등은 세린, 트레오닌, 페닐알라닌, 글루탐산 및 히스티딘과 같은 별개의 아미노산을 보유하는 프로테아제 펩티드 기질에서 P1 위치를 모방하는 N-아세틸화 아미노산으로 구성된(composed of) 프로브 군을 활용하였다. 활성-기반 프로브는 아미노산 커플링된 퀴놀리민 메티드 프로브 및 아미노산 커플링된 p-아미노만델산 프로브를 포함할 수 있다. 활성-기반 단백질 프로파일링은 또한 숙주-바이러스 상호작용을 위한 숙주 세포 세린 가수분해효소의 기능적 분석을 검출 및 분석하는 것과 같은 활성 부위-지정 프로브(active site-directed probe)를 활용하여 효소의 기능적 상태를 모니터링하는 데 사용되었다(Shahiduzzaman 등., Activity based protein profiling to detect serine hydrolase alterations in virus infected cells, Frontiers in Microbiology, August 22, 2012, volume 3, article 308, p 1-5). 또한, 활성 기반 프로브는 활성 프로테아제를 특이적으로 인식할 수 있으므로, 특히 양전자 방출 단층 촬영과 연계되어 제자리에서 단백질 분해 활성(proteolytic activity)을 검출하고 정량화하는 데 사용할 수 있다(Ulrich auf dem Keller 등., Proteomic techniques and activity-based probes for the system-wide study of proteolysis, Biochimie, 92 (2010), page 1705-1714).
일부 예시적인 실시양태에서, 본 출원은 샘플의 HCP 불순물을 식별, 프로파일링, 특징규명 또는 정량화하는 방법을 제공하며, 방법은 프로브-부착된 HCP 불순물을 제공하기 위해 샘플을 적어도 하나의 프로브와 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 프로브는 워헤드 및 태그를 포함하고, 여기서 워헤드는 프로브-부착된 HCP 불순물의 활성 부위에 결합할 수 있고, 여기서 샘플은 적어도 하나의 고풍부성 단백질을 포함한다. 일부 측면에서, 본 출원은 샘플의 HCP 불순물을 식별, 프로파일링, 특징규명 또는 정량화하기 위한 시스템을 제공하며, 시스템은 다음을 포함한다: 적어도 하나의 프로브로서, 여기서 적어도 하나의 프로브는 워헤드 및 태그를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 프로브는 프로브-부착된 HCP 불순물을 제공하기 위해 HCP 불순물에 결합할 수 있고, 여기서 워헤드는 프로브-부착된 HCP 불순물의 활성 부위에 결합할 수 있고, 여기서 샘플은 적어도 하나의 고풍부성 단백질을 포함하는, 적어도 하나의 프로브; 고체 지지체로서, 여기서 고체 지지체는 태그에 결합할 수 있는 리간드를 포함하는, 고체 지지체; 프로브-부착된 HCP 불순물을 단리하고 용리액을 제공하기 위해 고체 지지체를 세척하기 위한 용액; 단리된 프로브-부착된 HCP 불순물의 성분을 생성할 수 있는 효소적 분해 용액; 및 단리된 프로브-부착된 HCP 불순물의 성분을 식별, 프로파일링, 특징규명 또는 정량화할 수 있는 질량 분석기.
일 측면에서, 본 출원의 활성-기반 프로브는 효소적 활성 부위에 반응하고 결합하기 위한 반응기와 같은 워헤드를 포함하는 효소 활성 부위-지정 프로브이다. 일 측면에서, 본 출원의 활성-기반 프로브는 워헤드 및 태그, 예컨대 리포터 태그를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 출원의 활성-기반 프로브는 워헤드, 태그 및 링커를 포함한다. 또 다른 측면에서, 워헤드는 효소의 활성 부위에 결합하거나 공유적으로 표지할 수 있는 반응기이다. 또 다른 측면에서, 워헤드는 소분자 억제제, 기질-기반 스캐폴드 또는 단백질-반응성 분자와 같은 반응기이다. 일 측면에서, 워헤드는 활성 부위 잔기에 공유적으로 결합하여 시스테인 또는 세린 프로테아제를 표적으로 하도록 설계되었다. 동일한 효소 계열의 단백질은 유사한 기능을 갖고, 이러한 단백질의 활성 부위는 일반적으로 유사한 구조를 가지므로 활성 부위-지정 프로브는 주어진 효소 계열의 여러 구성원의 활성 부위에 반응성일 수 있다. 일 측면에서, 태그는 직접 분자 이미징 또는 방사성 표지와 같은 표지된 효소의 검출 및 식별을 위한 리포터 태그이다. 예를 들어, 태그는 가시화를 위한 로다민과 같은 형광단일 수 있다. 일 측면에서, 태그는 비오틴과 같은 농축 또는 정제를 위한 친화성 태그이다. 또 다른 측면에서, 태그는 단백질의 생체내 또는 제자리 표지를 위한 표지 태그, 예컨대 아지드 또는 아세틸렌이다. 또 다른 측면에서, 링커는 워헤드 및 태그를 연결하기 위한 연결기 역할을 한다. 일 측면에서, 링커는 다양한 길이 및 소수성을 갖는 가요성 쇄를 포함하는 태그 및 워헤드 사이의 스페이서 역할을 한다. 일부 측면에서, 본 출원의 활성-기반 프로브는 리포터 태그에 연결된 소분자 억제제로 이루어진 활성 부위-지정 프로브이다.
일부 예시적인 실시양태에서, 세린 가수분해효소 프로브는 세린 가수분해효소 활성을 갖는 효소적 HCP 불순물을 표지, 검정, 정제 또는 검출하는데 사용된다. 세린 가수분해효소 효소는 콜린에스테라제, 가수분해효소, 리파아제 및 프로테아제를 포함하는 효소의 큰 부류이다. 일 측면에서, 세린 가수분해효소 프로브는 세린 가수분해효소의 활성 부위를 공유적으로 변형시키는 플루오로포스포네이트(FP) 기를 갖는다. 활성 세린 가수분해효소가 단독으로 변형될 수 있다. 본 출원의 활성-기반 HCP 프로파일링의 방법 및 시스템은 활성 프로테아제 및 활성 리파아제와 같은 활성 효소적 활성을 갖는 HCP 불순물을 표지하는 이점을 제공한다. 이러한 활성 프로테아제 및 리파아제는 다양한 공정 단계에서 약물의 무결성에 문제점이 될 수 있다.
일부 예시적인 실시양태에서, 질량 분석법(MS)과 조합된 본 출원의 활성-기반 HCP 프로파일링 방법 및 시스템은 효소적 HCP 불순물의 단백질 서열을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 일 측면에서, MS와 조합된 본 출원의 방법 및 시스템은 활성 효소적 HCP 불순물을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 일 측면에서, 형광 프로브가 본 출원의 방법 및 시스템에서 활성-기반 프로브로 사용되는 경우, 활성 효소적 HCP 불순물이 가시화될 수 있다. 또 다른 측면에서, 본 출원의 활성-기반 HCP 프로파일링의 방법 및 시스템은 활성 효소적 HCP 불순물을 정량화하는데 사용될 수 있다.
본 출원의 방법 및 시스템은 단순히 HCP 불순물 존재의 풍부도를 정량화하는 것보다 HCP 불순물의 효소적 활성을 직접 검출하고 정량화하는 이점을 제공한다. 본 출원의 방법 및 시스템은 또한 HCP 불순물에서 다수의 효소의 기능적 상태를 모니터링하는 이점을 제공한다.
바이오 약학적 생성물의 생성물 품질, 효능 및 안전성 개선에 대한 요구로 인해 효소적 활성을 갖는 HCP 불순물 모니터링에 대한 요구가 증가하고 있다. 본 개시내용은 전술한 요구를 만족시키기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 본원에 개시된 예시적인 실시양태는 제조 공정 중 샘플 및 바이오 약학적 생성물에서 효소적 활성을 갖는 HCP 불순물을 식별, 프로파일링, 특징규명 또는 정량화하기 위한 방법 및 시스템을 제공함으로써 전술한 요구를 충족시킨다. 본 출원은 오랫동안 제기되어 온 필요성을 충족시키기 위해 HCP 불순물의 상이한 효소 부류를 특징규명하기 위한 다양한 활성-기반 프로브를 제공한다.
용어 "a"는 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 하고; 용어 "약" 및 "대략"은 당업자가 이해할 수 있는 표준 변형을 허용하는 것으로 이해되어야 하며; 범위가 제공되는 경우 엔드포인트가 포함된다. 본원에 사용된 용어 "포함하다(include)", "포함하는(includes)" 및 "포함되는(including)"은 비제한적인 의미이며 각각 "포함하다(comprise)", "포함하는(comprises)" 및 "포함되는(comprising)"을 의미하는 것으로 이해된다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 출원은 샘플의 HCP 불순물을 식별, 프로파일링, 특징규명 또는 정량화하기 위한 시스템을 제공하며, 시스템은 다음을 포함한다: 적어도 하나의 프로브로서, 여기서 적어도 하나의 프로브는 워헤드 및 태그를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 프로브는 프로브-부착된 HCP 불순물을 제공하기 위해 HCP 불순물에 결합할 수 있고, 여기서 워헤드는 프로브-부착된 HCP 불순물의 활성 부위에 결합할 수 있고, 여기서 샘플은 적어도 하나의 고풍부성 단백질을 포함하는, 적어도 하나의 프로브; 고체 지지체; 단리된 프로브-부착된 HCP 불순물의 성분을 생성할 수 있는 효소적 분해 용액; 및 단리된 프로브-부착된 HCP 불순물의 성분을 식별, 프로파일링, 특징규명 및/또는 정량화할 수 있는 질량 분석기.
본원에 사용된 용어 "단백질"은 공유적으로 연결된 아미드 결합을 갖는 임의의 아미노산 중합체를 포함한다. 단백질은 당업계에서 일반적으로 "폴리펩티드"로 알려진 하나 이상의 아미노산 중합체 쇄를 포함한다. 단백질은 단일 기능 생체분자를 형성하기 위해 하나 또는 여러 개의 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 일부 예시적인 실시양태에서, 단백질은 항체, 단클론 항체, 이중특이적 항체, 다중-특이적 항체, 항체 단편, 항체의 Fab 영역, 항체-약물 접합체, 융합 단백질, 단백질 약학적 생성물, 약물 또는 이들의 조합일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "질량 분석기"는 특이적 분자 종을 식별하고 이들의 정확한 질량을 측정할 수 있는 장치를 포함한다. 이 용어는 검출 및/또는 특징규명를 위해 폴리펩티드 또는 펩티드가 용리될 수 있는 임의의 분자 검출기를 포함하는 것을 의미한다. 질량 분석기는 세 가지 주요 부분을 포함할 수 있다: 이온원(ion source), 질량 분석기 및 검출기. 이온원의 역할은 기체상 이온을 생성하는 것이다. 분석물 원자, 분자 또는 클러스터는 기체상 내로 이동되고 동시에 (전자분무 이온화에서와 같이) 이온화될 수 있다. 이온원의 선택은 적용에 따라 크게 달라진다.
일 측면에서, 방법의 샘플에서 적어도 하나의 고풍부성 단백질은 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 항체의 Fab 영역, 항체-약물 접합체, 융합 단백질, 단백질 약학적 생성물 또는 약물일 수 있다.
본원에 사용된 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호-연결된 4개의 폴리펩티드 쇄, 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)로 이루어진 면역글로불린 분자를 지칭하는 것으로 의도된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH) 및 중쇄 불변 영역을 갖는다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3의 3개 도메인을 함유한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역을 갖는다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL)으로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변성 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단 내지 카르복시-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성될 수 있다. 용어 "항체"는 임의의 이소형 또는 서브클래스의 글리코실화된 및 비-글리코실화된 면역글로불린 둘 모두에 대한 참조를 포함한다. 용어 "항체"는 항체를 발현하도록 형질감염된 숙주 세포로부터 단리된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. IgG는 항체의 서브세트를 포함한다.
본원에 사용된 "단백질 약학적 생성물"은 본질적으로 완전히 또는 부분적으로 생물학적일 수 있는 유효성분(active ingredient)을 포함한다. 일 측면에서, 단백질 약학적 생성물은 펩티드, 단백질, 융합 단백질, 항체, 항원, 백신, 펩티드-약물 접합체, 항체-약물 접합체, 단백질-약물 접합체, 세포, 조직, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 단백질 약학적 생성물은 재조합, 조작, 변형, 돌연변이 또는 절단된 버전의 펩티드, 단백질, 융합 단백질, 항체, 항원, 백신, 펩티드-약물 접합체, 항체-약물 접합체, 단백질-약물 접합체, 세포, 조직, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일 측면에서, 본 출원의 방법의 질량 분석기는 전자분무 이온화 질량 분석기, 나노-전자분무 이온화 질량 분석기, 예컨대 Orbitrap 질량 분석기, Q-TOF 질량 분석기 또는 삼중 사중극자 질량 분석기일 수 있고, 여기서 질량 분석기는 액체 크로마토그래피 시스템에 커플링된다. 일 측면에서, 방법의 질량 분석기는 LC-MS(액체 크로마토그래피-질량 분석법), 나노-LC-MS, LC-MS/MS, 나노-LC-MS/MS 또는 LC-MRM-MS(액체 크로마토그래피-다중 반응 모니터링-질량 분석법) 분석을 수행할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "전기분무 이온화" 또는 "ESI"는 용액 중의 양이온 또는 음이온 중 하나가 용액을 함유하는 전자분무 바늘의 팁과 상대 전극 사이에 전위차를 인가함으로써 발생하는 고도로 하전된 액적 스트림의 대기압에서 형성 및 탈용매화를 통해 기체상으로 이동되는 분무 이온화 공정을 지칭한다. 일반적으로 용액의 전해질 이온으로부터 기체상 이온을 생산하는 데에는 세 가지 주요 단계가 있다. 단계는 다음과 같다: (a) ES 주입 팁에서 하전된 액적의 생산; (b) 용매 증발에 의한 하전된 액적 및 기체상 이온을 생산할 수 있는 작고 고도로 하전된 액적을 초래하는 반복된 액적 붕괴의 수축; 및 (c) 기체상 이온이 매우 작고 고도로 하전된 액적에서 생산되는 메커니즘. 단계 (a)-(c)는 일반적으로 장치의 대기압 영역에서 발생한다. 일부 예시적인 실시양태에서, 전자분무 이온화 질량 분석기는 나노-전자분무 이온화 질량 분석기일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "삼중 사중극자 질량 분석기"는 두 개의 사중극자 질량 분석기가 직렬로 이루어지고 이들 사이에 충돌-유도 해리를 위한 셀(cell)로서 작용하는 (비-질량-해상(non-mass-resolving)) 무선 주파수(RF) 전용 사중극자를 갖는 탠덤 질량 분석기를 지칭한다. 삼중 사중극자 질량 분석기에서 펩티드 샘플은 MS 기기와 커플링된 LC에 주입된다. 제1 사중극자는 표적화된 m/z로 펩티드를 단리하기 위한 질량 필터로 사용할 수 있다. 제2 사중극자는 펩티드를 단편으로 분해(break)하는 충돌 셀 역할을 한다. 제3 사중극자는 초기 모 펩티드에서 특이적 m/z 단편에 대한 제2 질량 필터 역할을 한다. 본원에 사용된 용어 "탠덤 질량 분석기"는 질량 선택 및 질량 분리의 여러 스테이지를 사용하여 샘플 분자에 대한 구조적 정보를 수득할 수 있는 기술을 포함한다. 전제 조건은 샘플 분자가 기체상 내로 이동되어 온전한 상태로 이온화될 수 있고 제1 질량 선택 단계 후에 일부 예측 가능하고 제어 가능한 방식으로 분해(fall apart)되도록 유도될 수 있다는 것이다. 탠덤 MS는 매우 다양한 분석기 조합으로 성공적으로 수행되었다. 특정 어플리케이션에 조합될 분석기는 민감도, 선택성, 및 속도 뿐만 아니라 크기, 비용 및 가용성과 같은 여러 상이한 요인에 의해 결정될 수 있다. 탠덤 MS 방법의 두 가지 주요 카테고리는 탠덤-인-스페이스(tandem-in-space) 및 탠덤-인-타임(tandem-in-time)이지만, 탠덤-인-타임 분석기가 스페이스 또는 탠덤-인-스페이스 분석기와 커플링되는 하이브리드 또한 존재한다. 탠덤-인-스페이스 질량 분석기는 이온원, 전구체 이온 활성화 장치, 및 적어도 2개의 비포착 질량 분석기(non-trapping mass analyzer)를 포함한다. 특이적 m/z 분리 기능은 기기의 한 섹션에서 이온이 선택되고 중간 영역에서 해리된 다음 프로덕트 이온(product ion)이 m/z 분리 및 데이터 수집을 위해 또 다른 분석기로 전송되도록 설계될 수 있다. 탠덤-인-타임 질량 분석기에서 이온원에서 생산된 이온은 동일한 물리적 장치에서 포착, 단리, 단편화 및 m/z 분리될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "액체 크로마토그래피"는 액체 또는 기체에 의해 운반되는 화학 혼합물이 정지된 액체 또는 고체상 주위 또는 위로 흐를 때 화학 물질의 차등 분포의 결과로 성분으로 분리될 수 있는 공정을 지칭한다. 크로마토그래피의 비제한적인 예는 종래의 역상(RP), 이온 교환(IEX), 혼합 모드 크로마토그래피 및 순상 크로마토그래피(NP)를 포함한다.
예시적인 실시양태
본원에 개시된 실시양태는 효소적 활성을 갖는 HCP 불순물을 식별, 프로파일링, 특징규명 또는 정량화하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다.
일부 예시적인 실시양태에서, 본 출원은 샘플의 HCP 불순물을 식별, 프로파일링, 특징규명 또는 정량화하는 방법을 제공하며, 방법은 프로브-부착된 HCP 불순물을 제공하기 위해 샘플을 적어도 하나의 프로브와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 프로브는 워헤드 및 태그를 포함하고, 여기서 워헤드는 프로브-부착된 HCP 불순물의 활성 부위에 결합할 수 있고, 여기서 샘플은 적어도 하나의 고풍부성 단백질을 포함한다.
일 측면에서, 방법의 프로브의 태그는 로다민, 비오틴, 포스핀, 알킨, 아지드, 아세틸렌, 시클로옥틴, 페닐 아지드 또는 오메가-말단 아지드와 같은 형광단 또는 형광단 접합 부위와 같은 접합 태그, 친화성 태그, 또는 리포터 태그이다. 일 측면에서, 프로브의 워헤드는 플루오로포스포네이트, 에폭시숙시네이트, 광활성화 지질, 광활성화 스핑고신, N-아세틸화 아미노산, 퀴놀리민 메티드 커플링된 아미노산, 또는 p-아미노만델산 커플링된 아미노산을 함유한다. 일 측면에서, 방법의 프로브는 아지도-플루오로포스포네이트; 데스티오비오틴-플루오로포스포네이트; 테트라메틸로다민-플루오로포스포네이트; 에틸(2S,3S)-에폭시숙시네이트-Leu-Tyr-Acp-Lys(비오틴)-NH2; 1-팔미토일-2-(9-(3-펜트-4-이닐-3-H-디아지린-3-일)-노나노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린; (2S,3R,E)-2-아미노-13-(3-(펜트-4-인-1-일)-3H-디아지린-3-일)트리데크-4-엔-1,3-디올; N-(9-(3-펜트-4-이닐-3-H-디아지린-3-일)-노나노일)-D-에리트로-스핑고신; 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(5-헥시노일); 또는 D-갈락토실-β-1,1' N-(6"-아지도헥사노일)-D-에리트로-스핑고신을 포함한다. 또 다른 측면에서, 방법의 프로브-부착된 HCP 불순물의 활성 부위는 시스테인 프로테아제 활성 부위, 세린 프로테아제 활성 부위, 세린 가수분해효소 활성 부위, 카텝신 활성 부위, 메탈로프로테아제 활성 부위, 콜린에스테라아제 활성 부위, 지질-결합 단백질의 활성 부위, 스핑고리피드-결합 단백질의 활성 부위, 세라마이드-결합 단백질의 활성 부위, 리파아제 활성 부위, 프로테아제 활성 부위, 가수분해효소 활성 부위, 산화환원효소 활성 부위, 또는 이성질화효소 활성 부위이다.
시스템은 전술된 HCP 불순물, 활성-기반 프로브, 효소적 활성 부위, 워헤드, 접합 태그, 친화성 태그, 리포터 태그, 고체 지지체, 약학적 생성물, 펩티드, 단백질, 항체, 항약물 항체, 크로마토그래피 컬럼 또는 질량 분석기 중 어느 것으로 제한되지 않는 것으로 이해된다.
숫자 및/또는 문자로 본원에 제공된 바와 같은 방법 단계의 연속적인 표지는 방법 또는 이의 임의의 실시양태를 특정적으로 지시된 순서로 제한하는 것을 의미하지 않는다. 특허, 특허 출원, 공개된 특허 출원, 수탁 번호, 기술 기사 및 학술 기사를 포함하는 다양한 간행물이 명세서 전체에 인용된다. 이들 인용된 참고 문헌 각각은 모든 목적을 위해 그 전체가 참고로 본원에 포함된다. 달리 기재되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 개시내용은 본 개시내용을 보다 상세하게 설명하기 위해 제공되는 하기 실시예를 참조하여 보다 완전하게 이해될 것이다. 이들은 예시를 위한 것이며 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
물질 및 시약
1. HCP 불순물을 함유하는 바이오 약학적 생성물
단클론 항체 및 HCP 불순물을 함유하는 샘플과 같은 HCP 불순물을 함유하는 여러 바이오 의약 샘플을 효소적 HCP 불순물을 특징규명하는 데 사용하였다. 이러한 샘플은 다음을 포함한다: (1) CHO 세포의 정화된 세포 배양 상청액(5 mg); (2) LPL-PLBD2 녹아웃 CHO 세포주로부터 유래된 CHO 세포의 세포 배양 상청액을 함유하고 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피에 의해 처리된 LPL(지단백질 리파아제) 및 PLBD2(포스포리파아제 B 도메인-함유 단백질 2) 녹아웃 AEX 물질(LPL-PLBD2 녹아웃-AEX, 5 mg); (3) 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 처리된 세포 배양 상청액을 함유하는 AEX 물질(AEX-상청액, 5 mg); (4) 정제된 단클론 항체와 같은 정제된 바이오 약학적 생성물을 함유한 약물 물질(DS, 10 mg); (5) 산 세라미다제, PLBD2, 지단백질 리파아제 및 리소좀 산 리파아제를 포함하는 10 ppm의 리파아제(스파이킹된(spiked)-DS, 10 mg)로 스파이킹된 약물 물질.
2. 세린 가수분해효소 프로브
세린 가수분해효소 프로브, 예를 들어 Pierce™ ActivX™ 세린 가수분해효소 프로브(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이 세린 가수분해효소 활성을 갖는 HCP 불순물을 표지, 검정, 정제 또는 검출하였다. 플루오로포스포네이트(FP)가 활성 부위에서 세린 친핵체의 공유적 변형을 특이적으로 개시할 수 있기 때문에, FP를 함유하는 여러 세린 가수분해효소 프로브는 리파아제 및 프로테아제를 포함하는 세린 가수분해효소의 활성 부위에서 세린 잔기를 변형시키는데 사용할 수 있다. 도 1은 세린 가수분해효소의 활성 부위를 변형시키는 세린 가수분해효소 프로브의 메커니즘 및 구조를 나타낸다. 도 2는 아지도-FP, 데스티오비오틴-FP 및 TAMRA-FP(테트라메틸로다민-플루오로포스포네이트)를 포함하는 세린 가수분해효소 프로브의 화학 구조를 나타낸다. 아지도-FP 프로브는 검출 또는 농축을 위해 포스핀- 또는 알킨-유래된 태그와 조합하여 사용할 수 있다. 데티오비오틴-FP 프로브는 스트렙타비딘 다이나비드와 조합하여 사용하는 것과 같이 웨스턴 블롯 또는 질량 분석법으로 세린 가수분해 효소의 친화성 농축 및 검출에 사용할 수 있다. TAMRA-FP 프로브는 형광 겔 이미징, 모세관 전기이동 또는 질량 분석법을 통해 샘플에서 세린 가수분해효소 활성의 표지 및 검출을 가능하게 하는 형광 태그를 갖는다.
ActivX™ FP 프로브를 사용하여 HCP 샘플의 세린 가수분해효소를 프로파일링, 포획 및 검출하기 위한 작업 흐름도는 프로브(예를 들어, 억제제)를 갖는 샘플의 사전-배양 및 웨스턴 블롯, 형광 SDS-PAGE 또는 질량 분석법을 통한 억제제 특이성, 결합 친화성 및 효능의 결정을 포함한다.
3. 시스테인 프로테아제 프로브
시스테인 프로테아제 프로브, DCG-04를 사용하여 도 3에 나타낸 바와 같은 카텝신 활성을 프로파일링하였다. DCG-04, 예를 들어, 에틸(2S,3S)-에폭시숙시네이트-Leu-Tyr-Acp-Lys(비오틴)-NH2, CD-892, 클랜 CA 시스테인 프로테아제에 대한 에폭시숙시네이트-함유 프로브는 천연 발생 억제제 E-64를 기반으로 하며 활성 부위 시스테인에 대한 에폭시숙시네이트 기의 공유적 부착을 통해 시스테인 프로테아제의 파파인 계열을 표적으로 한다. DCG-04 프로브는 스트렙타비딘 다이나비드와 조합하여 사용하는 것과 같이 웨스턴 블롯 또는 질량 분석법에 의한 시스테인 프로테아제의 친화성 농축 및 검출에 사용할 수 있다.
4. 지질 프로브, 16:0-pacFA PC
지질 프로브, 16:0-pacFA PC, 예를 들어, 1-팔미토일-2-(9-(3-펜트-4-이닐-3-H-디아지린-3-일)-노나노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린를 사용하여 도 4에 나타낸 바와 같은 스핑고리피드-결합 단백질을 정제하였다. 이 프로브는 근접한 단백질에 지질의 광활성화 연결을 제공한다. 지질-표지된 단백질은 후속적으로 아지드 기능화된 비드에 대한 아지드-알킨 휴이스겐(Huisgen) 고리화 첨가를 통해 알킨 모이어트를 사용하여 비드에 접합될 수 있다. 지질-표지된 단백질은 접합-비드의 단리를 통해 농축되거나 정제될 수 있다.
5. 지질 프로브, PhotoClick 스핑고신(900600)
지질 프로브, PhotoClick 스핑고신(900600), 예를 들어, (2S,3R,E)-2-아미노-13-(3-(펜트-4-인-1-일)-3H-디아지린-3-일)트리데크-4-엔-1,3-디올을 사용하여 도 5에 나타낸 바와 같은 스핑고신 단백질을 정제하였다. 이 프로브는 근접한 단백질에 지질의 광활성화 연결을 제공한다. 지질-표지된 단백질은 후속적으로 아지드 기능화된 비드에 대한 아지드-알킨 휴이스겐 고리화 첨가를 통해 알킨 모이어티를 사용하여 비드에 접합될 수 있다. 지질-표지된 단백질은 접합-비드의 단리를 통해 농축되거나 정제될 수 있다. 이 광활성화 및 클릭 가능한(clickable) 유사체의 스핑고신은 스핑고신-1-인산 리아제 결핍 세포에서 스핑고리피드-결합 단백질을 프로파일링하여 스핑고리피드와 상호 작용하는 단백질 간의 전반적인 세포 상호 작용을 이해하는 데 사용되었다 (Haberkant 등., Bifunctional Sphingosine for Cell-Based Analysis of Protein-Sphingolipid Interactions, ACS Chem Biol., 2016, Jan 15;11(1):222-30. doi: 10.1021/acschembio.5b00810. Epub 2015 Nov 25).
6. 지질 프로브, pacFA 세라마이드(900404)
지질 프로브, pacFA 세라마이드(900404), 예를 들어 N-(9-(3-펜트-4-이닐-3-H-디아지린-3-일)-노나노일)-D-에리트로-스핑고신을 사용하여 도 6에 나타낸 바와 같은 세라마이드-결합 단백질을 정제하였다. 이 프로브는 근접한 단백질에 지질의 연결을 제공한다. 지질-표지된 단백질은 후속적으로 아지드 기능화된 비드에 대한 아지드-알킨 휴이스겐 고리화 첨가를 통해 알킨 모이어티를 사용하여 비드에 접합될 수 있다. 지질-표지된 단백질은 접합-비드의 단리를 통해 농축되거나 정제될 수 있다.
7. 아지드-알킨 고리화 첨가 반응을 갖는 비드 및 아가로스
아가로스 및 자기 비드를 사용하여 표지된 단백질을 풀 다운(pull down)하였다. 아지드를 함유하는 자기 또는 아가로스 비드는 구리-촉매 아지드-알킨 고리화 첨가 반응을 통해 알킨-함유 지질에 가교된 단백질을 포획하는 데 사용할 수 있다. 도 7은 구리-촉매된 아지드-알킨 고리화 첨가 반응의 화학 구조 및 메커니즘을 나타낸다.
8. 지질 프로브, 16:0 헥시노일 PE(870127)
지질 프로브, 16:0 헥시노일 PE(870127), 예를 들어 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(5-헥시노일)(암모늄 염)을 사용하여 도 8에 나타낸 바와 같은 지질-결합 단백질을 정제하였다. 이 프로브는 아지드 기능화된 비드 또는 시클로옥틴 및 페닐 아지드 기능화된 비드 사이에 아지드-알킨 휴이스겐 고리화 첨가를 통해 알킨 모이어트를 사용하여 표지된 단백질을 정제하는 데 사용되었다. 표지된 단백질은 접합-비드의 단리를 통해 농축되거나 정제될 수 있다. 이 프로브는 PS-20(폴리소르베이트 20)에서 가수분해된 것과 유사한 에스테르 연결을 함유한다. 그러나, 광활성화 연결은 사용할 수 없다.
9. 지질 프로브, C6(6-아지도) GalCer(860833)
도 9에 나타낸 바와 같은 당 그룹을 갖는 아지드-기능화된 스핑고리피드인, 지질 프로브, C6(6-아지도) GalCer(860833), 예를 들어, D-갈락토실-β-1,1' N-(6"-아지도헥사노일)-D-에리트로-스핑고신을 사용하여 지질-결합 단백질을 정제하였다. 이 프로브는 오메가-말단 아지드를 함유하는 변형된 지질이다. 말단 아지드 기는 구리(Cu)-함유 촉매의 존재 하에 알킨-함유 시약, 예를 들어 클릭 화학(click chemistry)과의 매우 특이적인 연결 반응에서 사용될 수 있다.
10. 세린 가수분해효소 프로브를 사용하여 HCP 불순물을 표지하기 위한 시약 및 샘플 제조
표지 완충액(10X TBS(Tris 완충 식염수), MgCl2, CaCl2, NP-40): 500 mM 인산칼륨 완충액, pH 7.5, 20 mM MgCl2, 5 mM CaCl2 및 1% NP-40 함유. 100 mL의 10X TBS에 0.2 g의 MgCl2, 0.1 g의 CaCl2 및 1 mL의 NP-40이 첨가됨.
10 M 요소 용해 완충액: 각 표지 반응에 대해 1.5 mL의 용해 완충액으로 용해된 0.9 g의 요소.
1X TBS의 1.5 M 요소: 10mL 1X TBS으로 용해된 1.35g의 요소.
리파아제 혼합물: (LPL: 지단백질 리파아제; LIPA: 리파아제 A 리소좀 산 유형; ASAH: N-아실스핑고신 아미도가수분해효소, 산성 세라미다제; PLBD2: 포스포리파아제 B 도메인 함유 2). 실험을 수행하기 위해 샘플에 10 ppm 리파아제를 스파이킹하였다.
표 1. 리파아제 혼합물의 제조.
Figure pct00001
500 mM 요오도아세트아미드: 60 μL의 물을 요오도아세트아미드의 하나의 사전-칭량된 바이알(56 mg)에 첨가하였다.
5 M 요소 용해 완충액: 각 표지 반응에 대한 1 mL의 용해 완충액으로 희석된 1 mL의 10 M 요소/IP 용해 완충액.
1X TBS의 50 mM 비오틴: 40.9 mL의 1X TBS 및 1 mL의 수산화암모늄을 500 mg의 비오틴에 첨가하였다. 용액을 와동시키고 4℃에서 보관하였다.
1X TBS의 5 mM 비오틴: 900 μL의 1X TBS를 100 μL의 50 mM 비오틴에 첨가하였다.
트립신 함유 분해 완충액: 1000 μL의 5 mM 비오틴 용리 완충액에 용해된 20 μg 트립신의 하나의 바이알. 20 μL의 1 mU/μL PNGase F 및 100 μL의 1% 프로테아제 맥스(max)를 첨가.
11. 지질 프로브를 사용하여 HCP 불순물을 표지하기 위한 시약 및 샘플 제조.
10 M 요소 용해 완충액: 각 표지 반응에 대한 1.5 mL의 용해 완충액으로 용해된 0.9 g의 요소.
분해 완충액(2M 요소/20 mM Tris, pH 8.0): 0.4 mL 1M Tris, pH 8.0 및 19.6 mL의 LC-MS 등급 물로 용해된 2.4 g의 요소.
실험을 수행하기 위해 샘플에 10 ppm 리파아제를 스파이킹하였다. 리파아제는 LPL, LIPA, ASAH 및 PLBD2를 포함한다. (LPL: 지단백질 리파아제; LIPA: 리파아제 A 리소좀 산 유형; ASAH: N-아실스핑고신 아미도가수분해효소, 산 세라미다제; PLBD2: 포스포리파아제 B 도메인 함유 2). 샘플 MAB1-C3-DS는 단클론 항체(MAB1) 및 HCP 불순물을 함유한다.
완충액 S(PBS, 1% SDS): 1 mL의 10% SDS를 9 mL의 PBS에 첨가하고 와동시켜 혼합한다.
500 mM DTT: 0.1 mL 물로 용해된 7.7 mg의 DTT.
1M 요오도아세트아미드: 0.1 mL 물로 용해된 18.4 mg의 요오도아세트아미드.
16:0-pacFA PC 용액(분자량: 741.978 g/mol): 674 μL 에탄올을 16:0-pacFA PC에 첨가하여 2 mM 스톡 용액을 제조하였다.
방법
1. 세린 가수분해효소 프로브를 사용하여 HCP 불순물을 표지, 농축 및 식별한다:
HCP 불순물을 함유하는 샘플은 데티오비오틴-FP와 같은 세린 가수분해효소 프로브로 표지하였다. 후속적으로, 표지된 HCP 불순물을 농축 및 식별하였다. HCP 불순물을 함유하는 샘플을 세린 가수분해효소 프로브를 사용하여 HCP 불순물을 표지하기 위해 표 2에 따라 제조하였다. 용해물 샘플을 용해 완충액으로 희석하고 표 2에 따라 마이크로 원심분리 튜브로 이동시켰다. 표 2의 CCF는 세포 배양액, 예를 들어, 상청액 샘플, 정화된 세포 배양 상청액 샘플 또는 정화된 세포 배양액 샘플을 나타낸다. 표 2의 AEX는 음이온 교환 크로마토그래피를 나타낸다. 표 2의 DS는 약물 물질을 나타낸다. 표 2의 표준물은 표 1에 나타낸 바와 같은 재조합 리파아제 단백질의 혼합물을 나타낸다. "LPL 및 PLBD2 KO AEX 풀 물질"은 LPL(지단백질 리파아제)-PLBD2(포스포리파아제 B 도메인-함유 단백질 2) 이중 녹아웃 CHO 세포주의 세포로부터 수집된 세포 배양 물질을 나타낸다. Conc.는 농도를 나타낸다.
표 2. 세린 가수분해효소 프로브를 사용하여 HCP 불순물을 표지하기 위한 샘플 제조.
Figure pct00002
플루오로포스포네이트(FP)를 함유하는 세린 가수분해효소 프로브, 세린 가수분해효소 FP 프로브를 건조제를 갖는 파우치에서 실온으로 평형화시켰다. 후속적으로, 세린 가수분해효소 FP 프로브를 100 μL DMSO에 용해시켜 0.1 mM 스톡 용액을 제조하였다. 세린 가수분해효소 FP 프로브의 스톡 용액을 각 샘플에 첨가하여 4 μM의 최종 혼합 농도에 도달시켰다. 샘플을 실온에서 60분 동안 배양하였다.
다음 단계를 포함하는, 샘플을 비결합 프로브를 제거하기 위해 마이크로-바이오스핀 6 탈염 컬럼 또는 등가물을 사용하여 여과하였다: (1) 컬럼을 여러 번 급격하게 뒤집어 침전된 겔을 재현탁하고 임의의 기포를 제거하는 단계; 팁을 분리하고 컬럼을 2.0 mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣는 단계; 상단 캡을 제거하는 단계; 컬럼이 흐르기 시작하지 않는 경우, 컬럼의 캡을 밀어 넣은 다음 다시 제거하여 흐름을 시작시키는 단계; 과량의 패킹 완충액을 중력으로 겔 베드(gel bed) (약 2분) 상단으로 배수되도록 하는 단계; 배수된 완충액을 폐기하고 컬럼을 다시 2.0 mL 튜브에 넣는 단계; (2) 1,000 xg의 마이크로 원심분리기에서 2분 동안 원심분리하여 남아있는 패킹 완충액을 제거하는 단계; 완충액을 폐기하는 단계; (3) 500 μL의 5 M 요소/용해 완충액을 적용하는 단계; 새로운 완충액을 각각 적용한 후, 중력으로 완충액을 배수시키거나 컬럼을 1분 동안 원심분리하여 완충액을 제거하는 단계; 수집 튜브에서 완충액을 폐기하는 단계; 이를 3번 반복하는 단계; (4) 컬럼을 깨끗한 1.5 또는 2.0 mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣는 단계; 샘플(20-75 μl) (권장 샘플 부피보다 많거나 적게 적용하면 컬럼 성능이 저하될 수 있음)을 컬럼 중앙에 직접 조심스럽게 적용하는 단계; (5) 샘플을 로딩시킨 후, 컬럼을 4분 동안 1,000 xg로 원심분리하는 단계; 및 (6) 원심분리 후, 정제된 샘플은 5 M 요소 완충액에 존재하는 단계.
다음 단계를 포함하는, 표지된 HCP 불순물을 포획, 분해 및 분석하였다: (1) 1 mL의 총 부피가 되도록 각 반응물에 500 μL의 5 M 요소/용해 완충액을 첨가하는 단계; (2) 각 샘플에 2 mg의 스트렙타비딘 다이나비드(Thermo Fisher Scientific에서 구입함)를 첨가하여 표지된 HCP 불순물을 포획하고 회전 장치에서 일정하게 혼합하면서 실온에서 1시간 동안 배양하는 단계; 3분 동안 마그네틱 랙(magnetic rack)을 사용하여 다이나비드를 수집하는 단계; 상청액을 제거하는 단계; (4) 500 μL의 5 M 요소/용해 완충액을 첨가하고 간단히 와동시켜 혼합하는 단계; 자석을 사용하여 비드를 수집하고 상청액을 제거하는 단계; 이 단계를 두 번 추가적으로 반복하는 단계; 각 세척 후 완충액을 폐기하는 단계; (5) 5 mM TCEP를 갖는 1.5 M 요소 용액을 첨가하고 55℃에서 30분 동안 배양하는 단계; (6) 요오도아세트아미드를 10 mM의 최종 농도에 첨가하고 암실에서 실온으로 30분 동안 비드를 진탕하는 단계; (7) 1000 μL 1X TBS로 1회 세척하는 단계; (8) 표지된 HCP 불순물을 용리하기 위해, 75 μL 5 mM 비오틴 용리 용액을 첨가하고 37℃에서 10분 동안 진탕한 다음, 상청액을 수집하는 단계; (9) 비드에 트립신 용리 용액을 첨가하고 37℃에서 10분 동안 진탕한 다음, 상청액을 이전 용리 단계와 조합하는 단계; (10) 37℃에서 밤새 분해시키는 단계; (11) 4 μL의 20% TFA를 첨가하고, 와동시키고 실온에서 10분 동안 배양하는 단계; (12) 5분 동안 14,000 xg로 원심분리시키는 단계; 및 (13) 18 μL 처리된 용리된 표지된 HCP 불순물을 나노-LC에 로딩시키고 나노-LC-MS/MS로 분석하는 단계.
2. 지질 프로브를 사용하여 HCP 불순물을 표지, 농축 및 식별한다:
HCP 불순물을 함유하는 샘플을 16:0-pacFA PC와 같은 지질 프로브로 표지하였다. 후속적으로, 표지된 HCP 불순물을 농축 및 식별하였다. HCP 불순물을 함유하는 샘플을 지질 프로브로 HCP 불순물을 표지하기 위해 표 3에 따라 제조하였다. 용해물 샘플을 PBS(인산 완충 식염수)로 희석하고 표 3에 따라 마이크로 원심분리 튜브로 이동시켰다. 표 3의 AEX는 음이온 교환 크로마토그래피를 나타낸다. 표 3의 DS는 약물 물질을 나타낸다. MAB1-DS는 단클론 항체, MAB1을 함유하는 약물 물질을 나타낸다. 표 3의 표준물은 표 1에 나타낸 바와 같은 재조합 리파아제 단백질의 혼합물을 나타낸다. "LPL 및 PLBD2 KO AEX 풀 물질"은 LPL(지단백질 리파아제)-PLBD2(포스포리파아제 B 도메인-함유 단백질 2) 이중 녹아웃 CHO 세포주의 세포로부터 수집된 세포 배양 물질을 나타낸다.
표 3. 16:0-pacFA PC를 사용하여 HCP 불순물을 표지하기 위한 샘플 제조.
Figure pct00003
지질 프로브, 16:0-pacFA PC를 파우치에서 실온으로 평형화시켰다. 후속적으로, 지질 프로브를 674 μL 에탄올에 용해시켜 2 mM 스톡 용액을 제조하였다. 사용하지 않은 프로브는 -80℃에서 최대 6개월 동안 유리 바이알에 보관할 수 있다. 10 μL의 16:0-pacFA PC 스톡 용액을 20 μM의 최종 혼합 농도를 위해 각 샘플에 첨가하였다. 광활성화 프로브가 첨가되었을 때 반응 혼합물은 광(light)으로부터 보호되었다. 샘플을 실온에서 60분 동안 배양하였다. 샘플을 얼음 상에 광원으로부터 5cm 떨어진 거리에서 15분 동안 365 nm의 UV 트랜스-일루미네이터(trans-illuminator)에서 나온 345 nm 초과의 자외선(UV light)에 노출시켰다.
표지된 HCP 불순물을 포획, 분해 및 분석하였다. 후속적으로, 미반응 지질 프로브를 TCA(트리클로로아세트산) 침전을 통해 제거하였다. 세포 용해물, 빙냉 아세톤 및 TCA 용액(100% TCA, w/v)을 1 mL 세포 용해물, 8 mL 100% 빙냉 아세톤 및 1 mL 100% TCA를 혼합하는 것과 같이 1:8:1 비율로 혼합하였다. TCA 침전을 -20℃에서 1시간 동안 수행한 후 마이크로 원심분리기에서 4℃에서 15분 동안 11,500 rpm(18,000 xg)으로 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였다. 침전된 펠릿을 1 mL 빙냉 아세톤으로 세척하여 펠릿을 완전히 재현탁한 다음 4℃에서 15분 동안 11,500 rpm으로 원심분리하였다. 세척 및 원심분리 단계를 두 번 반복하여 TCA를 모두 제거하였다. 모든 아세톤을 제거하였다. 펠렛을 상온에서 건조시켜 잔류 아세톤을 제거하였다. 단백질 펠렛을 800 μL의 완충액 S에 용해시키고 1.5 mL 에펜도르프(eppendorf) 튜브로 이동시켰다. 단백질 용액을 대략 10분마다 와동시키는 것을 포함하여 37℃에서 30분 동안 진탕기에 보관하였다.
피콜릴 아지드-아가로스 수지를 완전한 재현탁을 위해 피콜릴 아지드-아가로스 수지를 50% 수지 슬러리에서 세척 및 혼합하는 단계, 200 μL의 잘 혼합된 수지를 1 mL 피펫으로 깨끗한 2 mL 원심분리기 튜브에 이동시키는 단계, 1.3 mL의 물을 첨가하는 단계, 2분 동안 1000 xg로 원심분리를 사용하여 수지를 펠렛화하는 단계, 및 대략 200 μL의 수지를 남겨두고 상청액을 흡인하는 단계를 통해 제조하였다. 촉매 용액을 4730 μL 물, 550 μL 첨가제 1, 110 μL 황산구리(II) 용액 및 110 μL 첨가제 2를 사용하여 농축을 위한 5.5 mL의 2X 구리 촉매 용액을 제조하는 단계를 통해 제조하였다. 샘플 혼합물을 200 μL 세척된 피콜릴 아지드-아가로스 수지, 800 μL 샘플 및 1000 μL의 2X 구리 용액을 조합하여 표지된 HCP 불순물을 아가로스 수지(비드)에 접합하기 위해 제조하였다. 샘플 용액을 밤새 혼합하기 위해 회전시켰다.
SDS를 함유하는 아가로스 세척 완충액을 실온으로 가온하였다. 수지를 원심분리하였다. 후속적으로, 상청액을 흡인하였다. 1.8 mL의 물을 수지에 첨가하였다. 후속적으로, 수지를 원심분리하였다. 후속적으로, 상청액을 흡인하였다. SDS 및 10 μL의 1 M DTT를 함유하는 1 mL 아가로스 세척 완충액을 수지에 첨가하여 수지를 재현탁하였다. 수지를 가열 블록 상에서 70℃에서 15분 동안 가열한 후, 상온으로 15분 동안 냉각하였다. 후속적으로, 수지를 5분 동안 1000 xg로 원심분리하였다. 상청액을 흡인하였다. 6 mL의 40 mM 요오도아세트아미드는 44.4 mg의 요오도아세트아미드를 SDS를 함유하는 6 mL의 아가로스 세척 완충액에 용해시켜 제조하였다. 1 mL의 40 mM 요오도아세트아미드를 수지에 첨가한 다음, 수지를 와동시켜 재현탁시켰다. 후속적으로, 수지를 실온에서 30분 동안 암실에서 배양하였다. 수지를 재현탁시키고 스핀 컬럼으로 이동시켰다. SDS를 함유하는 2 mL의 세척 완충액을 스핀 컬럼에 첨가한 다음 3회 반복 과정으로 1분 동안 1000 xg로 원심분리하였다. 2 mL의 8 M 요소/100 mM Tris pH 8을 스핀 컬럼에 첨가한 후 5회 반복 과정으로 1분 동안 1000 xg로 원심분리하였다. 2 mL의 20% 아세토니트릴을 스핀 컬럼에 첨가한 후 5회 반복 과정으로 1분 동안 1000 xg로 원심분리하였다. 캡을 스핀 컬럼의 하단에 첨가한 다음 500 μL의 분해 완충액(100 mM Tris, 2 mM CaCl2, 10% 아세토니트릴)을 첨가하였다. 1 mL 피펫을 사용하여 수지를 새 튜브로 이동시켰다. 스핀 컬럼을 새로운 튜브의 수지를 조합하여 또 다른 500 μL의 분해 완충액으로 헹구었다. 20 μL의 0.1 μg/μL 트립신 및 프로테아제 맥스를 샘플에 첨가하였다(프로테아제 맥스의 최종 농도 = 0.05%). 2 μL의 1 mU/μL PNGase F를 첨가한 다음 밤새 회전시키면서 배양하였다. 수지를 5분 동안 1000 xg로 원심분리하여 펠렛화하였다. 상청액을 유지하였다. 500 μL의 물을 첨가하여 비드를 2회 세척하였다. 모든 상청액을 조합하였다. 2 μL의 TFA를 첨가하였다. 분해 혼합물을 탈염하고 C-18 카트리지를 사용하여 농축하였다. 용리액을 탈염된 샘플에서 건조시키고 나노-LC-MS/MS로 분석하였다.
3. 시스테인 프로테아제 프로브를 사용하여 HCP 불순물을 표지, 농축 및 식별한다:
HCP 불순물을 함유하는 샘플을 DCG-04와 같은 시스테인 프로테아제 프로브를 사용하여 표지하였다. 후속적으로, 표지된 HCP 불순물을 농축하고 식별하였다. HCP 불순물을 함유하는 샘플을 시스테인 프로테아제 프로브를 사용하여 HCP 불순물을 표지하기 위해 표 4에 따라 제조하였다. 10X 반응 완충액은 500 mM 아세트산 나트륨(pH 6), 10 mM EDTA 및 25 mM DTT를 함유한다.
시스테인 프로테아제 프로브, DCG-04를 파우치에서 실온으로 평형화시켰다. 후속적으로, 프로브를 2000 μL DMSO에 용해시켜 0.5 mM 스톡 용액을 제조하였다. 5 μL의 DCG-04 스톡 용액을 2.5 μM의 최종 혼합 농도를 위해 각 샘플에 첨가하였다. 샘플을 실온에서 60분 동안 배양하였다.
다음 단계를 포함하는, 샘플을 결합되지 않은 프로브를 제거하기 위해 Amicon 3 kDa 분자량 탈염 필터를 사용하여 여과하였다: (1) 각 샘플을 탈염 필터의 상단에 적용하는 단계; (2) 500 μL의 8M 구아니딘을 각 필터의 상단에 적용하는 단계; (3) 500 μL의 5 M 요소/용해 완충액을 필터 상단에 적용하는 단계; (4) 각 단계가 끝날 때 20분 동안 14,000 xg로 원심분리한 다음 수집 튜브에서 부피를 폐기하는 단계. 마지막으로, 컬럼을 깨끗한 수집 튜브에 넣고 필터를 뒤집고 2분 동안 2,000 xg로 원심분리하여 완충액 교환 및 표지된 샘플을 수집한다.
다음 단계를 포함하는 표지된 HCP 불순물을 포획, 분해 및 분석하였다: (1) 각 반응물에 500 μL의 5 M 요소/용해 완충액을 첨가하는 단계; (2) 1 mg의 스트렙타비딘 다이나비드(Thermo Fisher Scientific에서 구입함)를 각 샘플에 첨가하여 표지된 HCP 불순물을 포획하고 회전 장치에서 일정하게 혼합하면서 실온에서 1시간 동안 배양하는 단계; 3분 동안 마그네틱 랙을 사용하여 다이나비드를 수집하는 단계; 상청액을 제거하는 단계; (4) 500 μL의 5 M 요소/용해 완충액을 첨가하고 간단히 와동시켜 혼합하는 단계; 자석을 사용하여 비드를 수집하고 상청액을 제거하는 단계; 이 단계를 두 번 추가적으로 반복하는 단계; 각 세척 후 완충액을 폐기하는 단계; (5) 5 mM TCEP를 갖는 1.5 M 요소 용액을 첨가하고 55℃에서 30분 동안 배양하는 단계; (6) 요오도아세트아미드를 10 mM의 최종 농도에 첨가하고 암실에서 실온으로 30분 동안 비드를 진탕하는 단계; (7) 1000 μL 1X TBS로 1회 세척하는 단계; (8) 트립신 용리 용액을 비드에 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 진탕하여 비드로부터 단백질을 완전히 분해 및 용리시키는 단계; (10) 4 μL의 20% TFA를 첨가하고, 와동시키고 실온에서 10분 동안 배양하는 단계; (11) 분해된 HCP를 함유하는 비드에서 상청액을 깨끗한 튜브로 이동시키는 단계; (12) 5분 동안 14,000 xg로 원심분리시키는 단계; 및 (13) 18 μL 처리된 용리된 표지된 HCP 불순물을 나노-LC에 로딩시키고 나노-LC-MS/MS로 분석하는 단계.
표 4. 시스테인 프로테아제 프로브를 사용하여 HCP 불순물을 표지하기 위한 샘플 제조.
Figure pct00004
4. 출발 물질의 직접 분해
4 부피의 빙냉 아세톤을 각 샘플에 첨가하고 -20℃ 냉동고에서 1시간 동안 침전시킨 후 빙냉 80% 아세톤으로 1회 세척하였다. 아세톤을 조심스럽게 따라내고 종이 타월 상에서 2분 동안 건조시켰다. 샘플을 20 μL 요소 변성 및 환원 용액에 재현탁시킨 다음, 열혼합기에서 56℃에서 30분 동안 800 rpm으로 진탕하고 실온으로 냉각시켰다. 6 μL의 50mM 요오도아세트아미드를 첨가한 다음 간단히 와동시켰다. 혼합물을 암실에서 30분 동안 실온에서 유지하였다. 시퀀싱 등급 변형 트립신(20 ug/바이알)을 1.95 mL의 50 mM Tris, pH 7.5에서 제조하여 10 ng/μL의 최종 농도를 제공하였다. 100 μL의 100 ng/μL의 트립신 및 4.5 μL의 프로테아제 맥스를 샘플에 첨가하였다(프로테아제 맥스의 최종 농도 = 0.05%). 2 μL의 1 mU/μL PNGase F를 첨가하였다. 샘플을 3-5초 동안 와동시킨 후 샘플(들)을 회전시켰다. 용액의 최종 부피는 125 uL이다. 요소의 최종 농도는 1.25 M이다. HCP 샘플을 열혼합기에서 750 rpm으로 진탕시키면서 암실에서 37℃에서 5시간 동안 배양하였다. 분해 혼합물을 5 μL의 빙초산으로 산성화한 다음 샘플을 3-5초 동안 와동시켰다. 후속적으로, 샘플을 5분 동안 14,000 xg로 원심분리하였다. 샘플의 pH는 pH 3 미만이다. 15μL의 각 샘플을 질량 분석기에 로딩시키고 데이터 종속 방법(date dependent method)(150분, 상위 20)을 사용하여 분석하였다.
실시예 1. 세린 가수분해효소 활성을 갖는 HCP 불순물의 농축
세린 가수분해효소 프로브인 데티오비오틴-FP를 사용하여 세린 가수분해효소 활성을 갖는 HCP 불순물을 농축, 식별, 특징규명 또는 프로파일링하였다. 단클론 항체와 같은 바이오 약학적 생성물 및 CHO 세포의 HCP 불순물을 함유하는 여러 샘플을 농축에 사용하였다. 이러한 샘플에는 정화된-상청액, LPL-PLBD2 녹아웃-AEX(표 5에서 AEX KO로 지정됨), AEX-상청액(표 5에서 AEX로 지정됨), DS 및 스파이킹된-DS(표 5에서 DS+리파아제로 지정됨)가 포함되었다. 실험은 샘플을 실온에서 1시간 동안 4 μM의 최종 프로브 농도에서 데티오비오틴-FP와 함께 배양하여 수행되었다. 과잉 프로브를 완충액 교환을 통해 제거하였다. 일부 샘플을 배양 동안 데티오비오틴-FP의 부재에서 비특이적 결합을 모니터링하기 위한 대조군으로 사용하였다. 단백질 농축을 위해 데티오비오틴-FP로 표지된 HCP 불순물을 스트렙타비딘 비드와 같은 자기 비드를 사용하여 포획하였다. 후속적으로, 비드를 엄격한 5 M 요소를 사용하여 세척하였다. 표지된 HCP는 5 mM 비오틴을 사용하여 용리시켰다. 용리된 표지된 HCP를 37℃에서 밤새 분해시킨 다음, 트랩을 사용하여 나노-LC(액체 크로마토그래피)에 직접 로딩시켰다. 단백질 식별은 나노-LC-MS/MS를 사용하여 수행되었다. 실험 결과를 표 5에 나타낸다. MAB1 HC는 단클론 항체 MAB1의 중쇄를 나타낸다. MAB1 LC는 단클론 항체 MAB1의 경쇄를 나타낸다,
표 5. HCP 불순물의 식별.
Figure pct00005
Figure pct00006
다양한 단백질을 정화된-상청액 샘플(예를 들어, 정화된 세포 배양 상청액 샘플 또는 세포 배양액 샘플)의 HCP 불순물에서 식별하였다. 586개의 단백질을 정화된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 상청액 샘플에서 용리된 표지된 HCP에서 식별하였다. 이러한 586개 단백질 중 359개의 단백질은 비특이적 결합 대조군 샘플(예를 들어, 배양 동안 데티오비오틴-FP가 부재인 경우)에서 발견되지 않았다. 유전자 온톨로지 분석에 따르면, 이들 586개의 단백질 중 68%가 촉매 활성을 갖는다. 이들 586개의 단백질의 분자량 및 계산된 등전점(pI)을 도 10에 나타낸 바와 같이 분석하였다. 도 10의 도트 크기는 프로브가 있는 경우 및 프로브가 없는 경우의 정화된-상청액 샘플에서 용리된 표지된 HCP의 단백질 풍부도의 차이를 나타낸다. 프로브가 없는 정화된 상청액 샘플은 비특이적 결합에 대한 대조군이다. 단백질 풍부도를 적색(높은 풍부성) 내지 청색(낮은 풍부성)의 색상 스케일로 표시하였다. 3개의 풍부한 단백질, 예를 들어 칼슘-의존성 세린 프로테아제, 보체 C1r-A 서브컴포넌트 및 세린 프로테아제 HTRA1을 도 10에 나타낸 바와 같이 표시하였다.
세린 가수분해효소 프로브로 농축한 후 정화된-상청액 샘플에서 식별된 HCP 불순물인 활성 리파아제 및 에스테라제를 표 6에 나타낸다. 표 6의 CCF는 세포 배양액, 예를 들어, 정화된-상청액 샘플, 정화된 세포 배양 상청액 샘플 또는 정화된 세포 배양액 샘플을 나타낸다. Calc. pI는 계산된 등전점을 나타낸다. PSM은 펩티드 스펙트럼 매치의 수를 나타낸다. PSM의 수는 단백질과 일치하는 식별된 펩티드 스펙트럼의 총 수이다. PSM 값은 펩티드가 반복적으로 식별될 수 있기 때문에 고 스코어링(high-scoring) 단백질에 대해 식별된 펩티드의 수보다 높을 수 있다. PEP는 관찰된 PSM이 부정확할 수 있는 확률인 사후 오차 확률을 나타낸다. 합계 PEP 점수는 PSM의 PEP 값을 기반으로 계산된다.
표 6. 세린 가수분해효소 프로브를 사용하여 처리된 정화된 상청액 샘플에서 식별된 활성 리파아제 및 에스테라제.
Figure pct00007
586개의 단백질을 정화된-상청액 샘플의 용리된 표지된 HCP에서 식별하였다. 이러한 586개의 단백질 중 359개의 단백질은 비특이적 결합 대조군 샘플(예를 들어, 배양 동안 데티오비오틴-FP가 부재인 경우)에서 발견되지 않았다. 이들 359개의 단백질의 유전자 온톨로지 분석 결과를 도 11에 나타낸다. 결과는 촉매 활성을 갖는 HCP 불순물 단백질이 대조군 샘플과 비교하여 세린 가수분해효소 프로브, 예를 들어, 데스티오비오틴-FP를 사용하여 유의미하게 농축되었음을 나타내었다.
실시예 2. 지질 결합 활성을 갖는 HCP 불순물의 농축
리파아제와 같은 많은 소수성 단백질은 세포의 지방산에 결합할 수 있다. 클릭 가능한 지질 프로브와 같은 지방산-기반 프로브를 사용하여 리파아제 또는 지질 결합 활성을 갖는 단백질, 예를 들어 지질 결합 단백질과 같은 소수성 HCP 불순물을 농축, 식별, 특징규명 또는 프로파일링하였다. 이러한 지질 프로브를 HCP 불순물의 활성-기반 프로파일링에 대해 테스트하였다. 또한, 이러한 지질 프로브를 세포 배양 상청액 또는 공정 샘플에서 폴리소르베이트-유사 분자에 결합할 수 있는 HCP 불순물을 식별하기 위해 테스트하였다.
지질 프로브, 16:0-pacFA PC, 예를 들어, 1-팔미토일-2-(9-(3-펜트-4-이닐-3-H-디아지린-3-일)-노나노일)-sn-글리세로-3 -포스포콜린을 사용하여 스핑고리피드 결합 HCP 불순물을 정제하였다. 이 프로브는 자외선에 노출될 때 근접한 단백질과 반응할 수 있는 광활성 디아지린 고리를 갖는다. 이 프로브는 클릭-화학 기반 정제를 위한 알킨 또한 함유한다. 지질-표지된 HCP 불순물을 아지드 기능화된 비드에 대한 아지드-알킨 휴이스겐 고리화 첨가를 통해 알킨 모이어티를 사용하여 비드에 후속적으로 접합시켰다. 지질 표지된 HCP 불순물을 접합-비드의 단리를 통해 후속적으로 농축하거나 정제하였다.
16:0-pacFA PC를 사용하여 특이적으로 농축된 세포 상청액 샘플의 HCP 불순물은 말산 탈수소효소(단편), 베타-갈락토시다아제(단편), 글루타티온 합성효소, 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 4, 백혈구 엘라스타제 억제제 A, 프로스타글란딘 환원 효소 1-유사 단백질, EGF 유사 도메인 단백질 2를 갖는 풍부한 시스테인, 색소 상피-유래 인자, 블레오마이신 가수분해효소, 구연산 합성효소, 안지오포이에틴-관련 단백질 4, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제 소단위 감마, 프로테아좀 소단위 베타 1형, 40S 리보솜 단백질 S28, 시스테인 및 글리신-풍부 단백질 1, 트리펩티딜-펩티다제 1 및 이어맞추기 인자(splicing factor) (프롤린 및 글루타민-풍부)를 포함한다. 이러한 식별된 HCP 불순물 중 베타-갈락토시다제, 인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 4, 프로스타글란딘 환원 효소 1-유사 단백질 및 안지오포이에틴-관련 단백질 4는 문헌에 기반하여 잠재적인 스핑고리피드 결합을 갖는 것으로 간주한다. 농축되지 않은 샘플, 16:0-pacFA PC 프로브에 의해 농축된 샘플 및 대조군 샘플(UV 없음) 간의 식별된 HCP 불순물의 비교는 도 12에 나타나 있다.
지질 프로브, 16:0-pacFA PC를 사용하여 스파이킹된 재조합 리파아제를 함유하는 DS(약물 물질) 샘플에서 단백질을 농축하였다. 특이적으로 농축된 단백질은 보메로나살 유형-2 수용체 26, 센트리올린, NFX1-형 징크핑거-함유 단백질 1, 데스모글레인-4-유사 단백질, 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소, 튜불린 알파 쇄, 산성 세라미다제, 추정 비특이적 세포독성 세포 수용체 단백질 1 유사 단백질(단편), 추정 비활성 세린 프로테아제 58-유사 단백질, 지방산-결합 단백질(지방세포), 히스톤 아세틸트랜스퍼라제, 프로테아좀 엔도펩티다제 복합체(단편), 프로테아좀 소단위 알파 유형 및 추정 포스포리파아제 B-유사 2를 포함한다. 이들 식별된 단백질 중 산성 세라미다제 및 추정 포스포리파아제 B-유사 2는 스파이킹된 재조합 리파아제 단백질이다.
실시예 3. 시스테인 프로테아제 활성을 갖는 단백질의 농축
시스테인 프로테아제 프로브인 DCG-04를 사용하여 100 ppm에서 스파이킹된 재조합 숙주 세포 단백질 혼합물(HCP 혼합)을 함유하는 DS 샘플에서 단백질을 농축하였다. 혼합물은 3개의 시스테인 프로테아제(카텝신 L1, 카텝신 Z, 카텝신 B) 및 임의의 시스테인 프로테아제 활성이 없어야 하는 일반적으로 검출되는 2개의 다른 숙주 세포 단백질(베타-헥소사미니다제 및 카텝신 D)로 이루어진다. 표 7에 나타난 바와 같이, 모든 스파이킹된 재조합 숙주 세포 단백질은 프로브로 배양된 샘플에서 식별되었지만, 프로브가 첨가되지 않은 샘플에서는 식별되지 않았다. 각 식별된 단백질의 상위 3개 펩티드에 대한 피크 면적을 평균화한 다음 트립신의 상위 3개 펩티드에 대한 피크 면적으로 나누어 샘플 전체에 걸쳐 단백질 풍부도를 정규화하였다. 2개의 재조합 시스테인 프로테아제(카텝신 Z 및 카텝신 B)를 다른 스파이킹된 재조합 단백질보다 ~11배 더 높은 수준으로 농축하였다.
표 7. 숙주 세포 단백질 혼합물로 스파이킹되고 시스테인 프로테아제 프로브로 처리된 DS 샘플에서 식별된 활성 프로테아제.
Figure pct00008

Claims (29)

  1. 적어도 하나의 고풍부성(high-abundance) 단백질을 함유하는 샘플에서 숙주 세포 단백질(HCP) 불순물을 식별하는 방법으로서,
    샘플을 HCP 불순물에 부착할 수 있는 적어도 하나의 프로브와 접촉시키되, 상기 프로브는 워헤드(warhead) 및 태그를 포함하고, 상기 워헤드는 프로브-부착된 HCP 불순물의 활성 부위에 결합할 수 있는, 단계;
    샘플을 고체 지지체와 접촉시키되, 상기 고체 지지체는 리간드를 포함하고, 상기 리간드는 태그에 결합할 수 있는, 단계; 및
    프로브-부착된 HCP 불순물을 단리하고 용리액을 제공하기 위해 용액을 사용하여 고체 지지체를 세척하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 워헤드는 프로브-부착된 HCP 불순물의 활성 부위의 잔기에 공유적으로 결합할 수 있는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 태그는 접합 태그, 친화성 태그 또는 리포터 태그인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는, 방법:
    단리된 프로브-부착된 HCP 불순물의 성분을 생성하기 위해 용리액을 효소적 분해 반응으로 처리하는 단계; 및
    후속적으로 질량 분석기를 사용하여 단리된 프로브-부착된 HCP 불순물의 성분을 식별하는 단계.
  5. 제1항에 있어서, 상기 워헤드는 효소 억제제, 효소 기질-기반 스캐폴드 또는 단백질-반응성 분자를 포함하는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 프로브는 링커를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 고풍부성 단백질은 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 항체의 Fab 영역, 항체-약물 접합체, 융합 단백질, 단백질 약학적 생성물 또는 약물인, 방법.
  8. 제4항에 있어서, 효소적 분해 반응의 효소는 트립신인, 방법.
  9. 제4항에 있어서, 상기 질량 분석기는 전자분무 이온화 질량 분석기, 나노-전자분무 이온화 질량 분석기, 예컨대 Orbitrap 질량 분석기, Q-TOF 질량 분석기 또는 삼중 사중극자(triple quadrupole) 질량 분석기이고, 상기 질량 분석기는 액체 크로마토그래피 시스템에 커플링되는, 방법.
  10. 제4항에 있어서, 상기 질량 분석기는 LC-MS(액체 크로마토그래피-질량 분석법), 나노-LC-MS, LC-MS/MS, 나노-LC-MS/MS 또는 LC-MRM-MS(액체 크로마토그래피-다중 반응 모니터링-질량 분석법) 분석을 수행할 수 있는, 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 태그는 웨스턴 블롯, 모세관 전기이동(capillary electrophoresis), SDS-PAGE, 형광 가시화, 또는 형광 겔 이미징을 사용하여 검출되는, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 프로브-부착된 HCP 불순물의 활성 부위는 시스테인 프로테아제 활성 부위, 세린 프로테아제 활성 부위, 세린 가수분해효소 활성 부위, 카텝신 활성 부위, 메탈로프로테아제 활성 부위, 콜린에스테라아제 활성 부위, 지질-결합 단백질의 활성 부위, 스핑고리피드-결합 단백질의 활성 부위, 세라마이드-결합 단백질의 활성 부위, 리파아제 활성 부위, 프로테아제 활성 부위, 가수분해효소 활성 부위, 산화환원효소 활성 부위, 또는 이성질화효소 활성 부위인, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 태그는 형광단 또는 형광단 접합 부위, 예컨대 로다민, 비오틴, 포스핀, 알킨, 아지드, 아세틸렌, 시클로옥틴, 페닐 아지드 또는 오메가-말단 아지드를 포함하는, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 워헤드는 플루오로포스포네이트, 에폭시숙시네이트, 광활성화 지질(Photo-activatable lipid), 광활성화 스핑고신, N-아세틸화 아미노산, 퀴놀리민 메티드 커플링된 아미노산, 또는 p-아미노만델산 커플링된 아미노산을 포함하는, 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 아지도-플루오로포스포네이트; 데스티오비오틴-플루오로포스포네이트; 테트라메틸로다민-플루오로포스포네이트; 에틸(2S,3S)-에폭시숙시네이트-Leu-Tyr-Acp-Lys(비오틴)-NH2; 1-팔미토일-2-(9-(3-펜트-4-이닐-3-H-디아지린-3-일)-노나노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린; (2S,3R,E)-2-아미노-13-(3-(펜트-4-인-1-일)-3H-디아지린-3-일)트리데크-4-엔-1,3-디올; N-(9-(3-펜트-4-이닐-3-H-디아지린-3-일)-노나노일)-D-에리트로-스핑고신; 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(5-헥시노일); 또는 D-갈락토실-β-1,1' N-(6"-아지도헥사노일)-D-에리트로-스핑고신을 포함하는, 방법.
  16. 하기를 포함하는 샘플에서 숙주 세포 단백질(HCP) 불순물을 식별하기 위한 시스템:
    적어도 하나의 프로브로서, 상기 적어도 하나의 프로브는 워헤드 및 태그를 포함하고, 상기 적어도 하나의 프로브는 프로브-부착된 HCP 불순물을 제공하기 위해 HCP 불순물에 결합할 수 있고, 상기 워헤드는 프로브-부착된 HCP 불순물의 활성 부위에 결합할 수 있고, 그리고 상기 샘플은 적어도 하나의 고풍부성 단백질을 포함하는, 적어도 하나의 프로브;
    고체 지지체로서, 상기 고체 지지체는 태그에 결합할 수 있는 리간드를 포함하는, 고체 지지체;
    프로브-부착된 HCP 불순물을 단리하고 용리액을 제공하기 위해 고체 지지체를 세척하기 위한 용액;
    단리된 프로브-부착된 HCP 불순물의 성분을 생성할 수 있는 효소적 분해 용액; 및
    단리된 프로브-부착된 HCP 불순물의 성분을 식별할 수 있는 질량 분석기.
  17. 제16항에 있어서, 상기 워헤드는 프로브-부착된 HCP 불순물의 활성 부위에 있는 잔기에 공유적으로 결합할 수 있는, 시스템.
  18. 제16항에 있어서, 상기 태그는 접합 태그, 친화성 태그 또는 리포터 태그인, 시스템.
  19. 제16항에 있어서, 상기 워헤드는 효소 억제제, 효소 기질-기반 스캐폴드 또는 단백질-반응성 분자를 포함하는, 시스템.
  20. 제16항에 있어서, 상기 적어도 하나의 프로브는 링커를 추가로 포함하는, 시스템.
  21. 제16항에 있어서, 상기 적어도 하나의 고풍부성 단백질은 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 항체의 Fab 영역, 항체-약물 접합체, 융합 단백질, 단백질 약학적 생성물 또는 약물인, 시스템.
  22. 제16항에 있어서, 효소적 분해 용액의 효소는 트립신인, 시스템.
  23. 제16항에 있어서, 상기 질량 분석기는 전자분무 이온화 질량 분석기, 나노-전자분무 이온화 질량 분석기, 예컨대 Orbitrap 질량 분석기, Q-TOF 질량 분석기 또는 삼중 사중극자 질량 분석기이고, 상기 질량 분석기는 액체 크로마토그래피 시스템에 커플링되는, 시스템.
  24. 제16항에 있어서, 상기 질량 분석기는 LC-MS(액체 크로마토그래피-질량 분석법), 나노-LC-MS, LC-MS/MS, 나노-LC-MS/MS 또는 LC-MRM-MS(액체 크로마토그래피-다중 반응 모니터링-질량 분석법) 분석을 수행할 수 있는, 시스템.
  25. 제16항에 있어서, 상기 태그는 웨스턴 블롯, 모세관 전기이동, SDS-PAGE, 형광 가시화, 또는 형광 겔 이미징을 사용하여 검출되는, 시스템.
  26. 제16항에 있어서, 상기 프로브-부착된 HCP 불순물의 활성 부위는 시스테인 프로테아제 활성 부위, 세린 프로테아제 활성 부위, 세린 가수분해효소 활성 부위, 카텝신 활성 부위, 메탈로프로테아제 활성 부위, 콜린에스테라아제 활성 부위, 지질-결합 단백질의 활성 부위, 스핑고리피드-결합 단백질의 활성 부위, 세라마이드-결합 단백질의 활성 부위, 리파아제 활성 부위, 프로테아제 활성 부위, 가수분해효소 활성 부위, 산화환원효소 활성 부위, 또는 이성질화효소 활성 부위인, 시스템.
  27. 제16항에 있어서, 상기 태그는 형광단 또는 형광단 접합 부위, 예컨대 로다민, 비오틴, 포스핀, 알킨, 아지드, 아세틸렌, 시클로옥틴, 페닐 아지드 또는 오메가-말단 아지드를 포함하는, 시스템.
  28. 제16항에 있어서, 상기 워헤드는 플루오로포스포네이트, 에폭시숙시네이트, 광활성화 지질, 광활성화 스핑고신, N-아세틸화 아미노산, 퀴놀리민 메티드 커플링된 아미노산, 또는 p-아미노만델산 커플링된 아미노산을 포함하는, 시스템.
  29. 제16항에 있어서, 상기 프로브는 아지도-플루오로포스포네이트; 데스티오비오틴-플루오로포스포네이트; 테트라메틸로다민-플루오로포스포네이트; 에틸(2S,3S)-에폭시숙시네이트-Leu-Tyr-Acp-Lys(비오틴)-NH2; 1-팔미토일-2-(9-(3-펜트-4-이닐-3-H-디아지린-3-일)-노나노일)-sn-글리세로-3-포스포콜린; (2S,3R,E)-2-아미노-13-(3-(펜트-4-인-1-일)-3H-디아지린-3-일)트리데크-4-엔-1,3-디올; N-(9-(3-펜트-4-이닐-3-H-디아지린-3-일)-노나노일)-D-에리트로-스핑고신; 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(5-헥시노일); 또는 D-갈락토실-β-1,1' N-(6"-아지도헥사노일)-D-에리트로-스핑고신을 포함하는, 시스템.
KR1020227033251A 2020-02-27 2021-02-27 활성 기반 숙주 세포 단백질 프로파일링 KR20220147632A (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202062982346P 2020-02-27 2020-02-27
US62/982,346 2020-02-27
US202063021181P 2020-05-07 2020-05-07
US63/021,181 2020-05-07
US202063073125P 2020-09-01 2020-09-01
US63/073,125 2020-09-01
PCT/US2021/020136 WO2021174153A1 (en) 2020-02-27 2021-02-27 Activity based host cell protein profiling

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220147632A true KR20220147632A (ko) 2022-11-03

Family

ID=75173439

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227033064A KR20220147626A (ko) 2020-02-27 2021-02-27 약물 제형 중 폴리소르베이트의 분해 감소 방법
KR1020227033251A KR20220147632A (ko) 2020-02-27 2021-02-27 활성 기반 숙주 세포 단백질 프로파일링

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227033064A KR20220147626A (ko) 2020-02-27 2021-02-27 약물 제형 중 폴리소르베이트의 분해 감소 방법

Country Status (11)

Country Link
US (2) US20210268073A1 (ko)
EP (2) EP4111206A1 (ko)
JP (2) JP2023516950A (ko)
KR (2) KR20220147626A (ko)
CN (2) CN115516313A (ko)
AU (2) AU2021228763A1 (ko)
BR (2) BR112022016744A2 (ko)
CA (2) CA3172037A1 (ko)
IL (2) IL295870A (ko)
MX (2) MX2022010601A (ko)
WO (2) WO2021174153A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW202045927A (zh) * 2019-02-27 2020-12-16 法商賽諾菲公司 以具內標之lc-ms於樣品中進行聚山梨醇酯定量之方法
WO2022047416A1 (en) * 2020-08-31 2022-03-03 Genentech, Inc. High throughput, fluorescence-based esterase activity assay for assessing polysorbate degradation risk during biopharmaceutical development
US20230408527A1 (en) * 2022-06-17 2023-12-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for characterizing host-cell proteins
CN116297915B (zh) * 2023-02-10 2023-12-01 中国食品药品检定研究院 聚山梨酯类辅料的分析鉴定方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1522343A (en) 1923-05-02 1925-01-06 Thom Clarence Magnetic separator
NO155316C (no) 1982-04-23 1987-03-11 Sintef Fremgangsmaate for fremstilling av magnetiske polymerpartikler.
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
AR102198A1 (es) * 2014-10-09 2017-02-08 Regeneron Pharma Proceso para reducir partículas subvisibles en una formulación farmacéutica
WO2018039499A1 (en) * 2016-08-24 2018-03-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Host cell protein modification
CN114206381A (zh) * 2019-07-10 2022-03-18 瑞泽恩制药公司 宿主细胞蛋白水平降低的合成物及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP4111207A1 (en) 2023-01-04
WO2021174151A1 (en) 2021-09-02
BR112022016744A2 (pt) 2022-10-18
IL295607A (en) 2022-10-01
MX2022010601A (es) 2022-09-09
JP2023516950A (ja) 2023-04-21
CA3172037A1 (en) 2021-09-02
CN115516313A (zh) 2022-12-23
AU2021228763A1 (en) 2022-09-15
AU2021226595A1 (en) 2022-09-22
CN115485562A (zh) 2022-12-16
KR20220147626A (ko) 2022-11-03
JP2023516949A (ja) 2023-04-21
IL295870A (en) 2022-10-01
BR112022016148A2 (pt) 2022-10-04
EP4111206A1 (en) 2023-01-04
US20210270824A1 (en) 2021-09-02
CA3172898A1 (en) 2021-09-02
US20210268073A1 (en) 2021-09-02
MX2022010654A (es) 2022-11-16
WO2021174153A1 (en) 2021-09-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20220147632A (ko) 활성 기반 숙주 세포 단백질 프로파일링
TWI551687B (zh) 胜肽片段的調製方法、使用於該方法的胜肽片段調製用套件以及分析方法
KR20210153102A (ko) 숙주세포 단백질의 확인
CN118671361A (zh) 蛋白a色谱-电喷雾电离质谱仪
Edelson-Averbukh et al. Gas-phase intramolecular phosphate shift in phosphotyrosine-containing peptide monoanions
US20100311114A1 (en) Preparation of samples for proteome analysis
US20230266335A1 (en) Maximizing hydrophobic peptide recovery using a mass spectrometry compatible surfactant
JP2011516463A (ja) 複合試料からのｎ末端修飾されたペプチドの選択的濃縮
JP7203407B2 (ja) 質量分析用のペプチド試料の調製方法
US20100075356A1 (en) Analysis of proteolytic processing by mass spectrometry
US20230083288A1 (en) Probe and method for identifying host cell protein impurities
US20210080471A1 (en) Lc-ms methods for antibody isotyping and quantification
Malarvanan et al. Advances in Analytical Technologies for Emerging Drug Modalities and Their Separation Challenges in LC-MS Systems
Zilberman et al. Antibody Affinity Extraction Outperforms Native Digestion as a Sample Preparation Method for LC-MS Detection of Host Cell Proteins in Drug Substances
CN116490777A (zh) 用于使用氢交换质谱法鉴定结合位点的方法
EA044417B1 (ru) Количественное определение и идентификация димеров в совместных составах