CN115485562A - 减少药物调配物中聚山梨醇酯降解的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及具有减少的残余量的脂肪酶的组合物和制备此类组合物的方法。具体地，本公开涉及组合物以及如此制备组合物的方法，所述制备通过耗竭所述组合物中的某些脂肪酶，如肝羧酸酯酶B1样蛋白和肝羧酸酯酶1样蛋白来进行。

Description

减少药物调配物中聚山梨醇酯降解的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年2月27日提交的美国临时专利申请第62/982,346号、于2020年5月7日提交的美国临时专利申请第63/021,181号以及于2020年9月1日提交的美国临时专利申请第63/073,125号的优先权，所述美国临时专利申请的内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明通常涉及具有减少量的某些脂肪酶的组合物、制备此类组合物的方法以及减少由于此类脂肪酶的存在而导致的聚山梨醇酯降解的方法。具体地，本发明通常涉及组合物和制备具有减少存在的肝羧酸酯酶B1样蛋白和肝羧酸酯酶1样蛋白的组合物的方法。
背景技术
在药物产品中，基于蛋白质的生物治疗剂是一类重要的药物，所述药物提供高水平的选择性、效力和功效，在过去几年里单克隆抗体(mAb)的临床试验的显著增加就证明了这一点。将基于蛋白质的生物治疗剂引入临床可能是一项持续数年的任务，其需要在各种研究和开发学科中进行协调努力，所述研究和开发学科包含发现、过程和调配物开发、分析表征以及临床前毒理学和药理学。
临床和商业上可行的生物治疗剂的一个关键方面是药物产品在制造过程和保质期方面的稳定性。这通常需要采取适当的步骤来帮助提高基于蛋白质的生物治疗剂在制造和储存所需的不同溶液条件和环境中的物理和化学稳定性，同时使对产品质量的影响最小化，包含鉴定具有更高固有稳定性的分子、蛋白质工程化和调配物开发。表面活性剂，如聚山梨醇酯通常用于增强基于蛋白质的生物治疗剂产品的物理稳定性。超过百分之七十的投入市场的单克隆抗体治疗剂含有介于0.001％与0.1％之间的聚山梨醇酯(一种表面活性剂)，以赋予基于蛋白质的生物治疗剂物理稳定性。聚山梨醇酯易发生自氧化和水解，从而导致游离脂肪酸和随后的脂肪酸颗粒形成。聚山梨醇酯的降解会对药物产品质量产生不利影响，因为聚山梨醇酯可以预防界面应力，如聚集和吸附。某些脂肪酶的存在可能是调配物中聚山梨醇酯降解的原因。因此，需要检测、监测和减少药物产品中的此类脂肪酶。
脂肪酶的直接分析可能需要分离出足够大量的产物用于测定，这是不期望的并且仅在选定的情况下是可能的。因此，确定表征导致样品中聚山梨醇酯降解的脂肪酶所需的工作流程和分析测试是一项具有挑战性的任务。除了检测导致聚山梨醇酯降解的脂肪酶外，药物产品必须通过去除或减少此类脂肪酶的纯化方法获得。
应当理解，需要存在从调配的药物产品中耗竭脂肪酶的方法。
发明内容
保持药物调配物的稳定性，不仅在储存期间，而且在制造、运输、处理和施用期间都是一项重大挑战。在药物产品中，蛋白质生物治疗剂因其成功和多功能性而越来越受欢迎。蛋白质生物治疗剂开发的主要挑战之一是克服产品中的蛋白质和赋形剂的有限稳定性，这可能会受到脂肪酶的存在(作为宿主细胞蛋白存在)的影响。评估其对药物调配物的影响和此类脂肪酶的减少可能是药物调配物开发中的重要步骤，随后是制备药物调配物的方法，以便减少脂肪酶并且由于减少的脂肪酶而提高稳定性。
在一个示例性实施例中，本公开提供了一种从样品中耗竭脂肪酶的方法，所述方法包括将包含脂肪酶的所述样品与探针接触，所述探针能够与所述脂肪酶结合以形成复合物，并将所述复合物与所述样品分离以由此从所述样品中耗竭所述脂肪酶。一方面，所述样品可以包括所关注的蛋白质。一方面，所述样品可以包括聚山梨醇酯赋形剂。在一具体方面，所述聚山梨醇酯赋形剂可以选自聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-80或其组合。在又一具体方面，所述聚山梨醇酯赋形剂是聚山梨醇酯-80。
一方面，所述脂肪酶是肝羧酸酯酶B1样蛋白。一方面，所述脂肪酶是肝羧酸酯酶1样蛋白。
一方面，所述脂肪酶能够降解所述样品中的所述聚山梨醇酯。因此，此实施例的所述方法通过耗竭所述脂肪酶的所述样品来减少聚山梨醇酯的降解。
一方面，所述探针可以能够与固体载体连接。在一具体方面，所述固体载体可为琼脂糖珠或磁珠。
一方面，可以使用配体将所述探针与固体载体连接。在一具体方面，所述配体可为指示剂、生物素分子、经修饰的生物素分子、细胞核、序列、表位标签、缺电子分子或富电子分子。
一方面，所述方法可以进一步包括从所述复合物中回收所述脂肪酶。
在一个示例性实施例中，本公开提供了一种纯化具有所关注的蛋白质和脂肪酶的样品的方法，所述方法包括：使所述样品与探针接触，所述探针能够与所述脂肪酶结合以形成复合物；以及从所述样品中分离所述复合物。一方面，所述脂肪酶是肝羧酸酯酶B1样蛋白。一方面，所述脂肪酶是肝羧酸酯酶1样蛋白。
一方面，所述样品包括聚山梨醇酯赋形剂。在一具体方面，所述聚山梨醇酯赋形剂可以选自聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-80或其组合。在又一具体方面，所述聚山梨醇酯赋形剂可为聚山梨醇酯-80。
一方面，所述探针可以能够与固体载体连接。在一具体方面，所述固体载体可为琼脂糖珠或磁珠。
一方面，可以使用配体将所述探针与固体载体连接。在一具体方面，所述配体可为指示剂、生物素分子、经修饰的生物素分子、细胞核、序列、表位标签、缺电子分子或富电子分子。
在一个示例性实施例中，本公开提供了一种减少样品中的聚山梨醇酯降解的方法，所述方法包括：使包含脂肪酶和聚山梨醇酯的所述样品与探针接触，所述探针能够与所述脂肪酶结合以形成复合物；以及从所述样品中分离所述复合物以由此减少所述样品中的聚山梨醇酯降解。
一方面，所述脂肪酶是肝羧酸酯酶B1样蛋白。一方面，所述脂肪酶是肝羧酸酯酶1样蛋白。
一方面，所述样品可以包括所关注的蛋白质。一方面，所述样品可以包括聚山梨醇酯赋形剂。在一具体方面，所述聚山梨醇酯赋形剂选自聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-80或其组合。在又一具体方面，所述聚山梨醇酯赋形剂是聚山梨醇酯-80。
一方面，所述探针可以能够与固体载体连接。在一具体方面，所述固体载体可为琼脂糖珠或磁珠。
一方面，可以使用配体将所述探针与固体载体连接。在一具体方面，所述配体可为指示剂、生物素分子、经修饰的生物素分子、细胞核、序列、表位标签、缺电子分子或富电子分子。
在一个示例性实施例中，本公开提供了一种组合物，所述组合物包括从哺乳动物细胞中纯化的所关注的蛋白质和残余量的肝羧酸酯酶B1样蛋白。一方面，所述残余量的肝羧酸酯酶B1样蛋白小于约5ppm。另一方面，所述组合物可以进一步包括表面活性剂。在又另外的方面，所述表面活性剂可为亲水性非离子表面活性剂。另一方面，所述表面活性剂可为山梨糖醇脂肪酸酯。在一具体方面，所述表面活性剂可为聚山梨醇酯。在另一具体方面，所述组合物中的所述聚山梨醇酯的浓度可为约0.01％w/v到约0.2％w/v。在一另外的具体方面，所述表面活性剂可为聚山梨醇酯80。一方面，所述哺乳动物细胞可以包含CHO细胞。
一方面，所述肝羧酸酯酶B1样蛋白可使聚山梨醇酯80降解。
一方面，所述组合物可为肠胃外调配物。
一方面，所述所关注的蛋白质可为单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、抗体片段、融合蛋白和抗体-药物复合物。一方面，所述所关注的蛋白质的浓度可为约20mg/mL到约400mg/mL。
一方面，所述组合物可以进一步包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。另一方面，所述组合物可以进一步包括缓冲液，所述缓冲液选自由以下组成的组：组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、藻酸盐缓冲液和精氨酸缓冲液。一方面，所述组合物可以进一步包括张力改性剂。在又另一方面，所述组合物可以进一步包括磷酸钠。
在一个示例性实施例中，本公开提供了一种组合物，所述组合物包括从哺乳动物细胞中纯化的所关注的蛋白质和残余量的肝羧酸酯酶1样蛋白。一方面，所述残余量的肝羧酸酯酶1样蛋白小于约5ppm。另一方面，所述组合物可以进一步包括表面活性剂。在又另外的方面，所述表面活性剂可为亲水性非离子表面活性剂。另一方面，所述表面活性剂可为山梨糖醇脂肪酸酯。在一具体方面，所述表面活性剂可为聚山梨醇酯。在另一具体方面，所述组合物中的所述聚山梨醇酯的浓度可为约0.01％w/v到约0.2％w/v。在一另外的具体方面，所述表面活性剂可为聚山梨醇酯80。一方面，所述哺乳动物细胞可以包含CHO细胞。
一方面，所述肝羧酸酯酶1样蛋白可使聚山梨醇酯80降解。
一方面，所述组合物可为肠胃外调配物。
一方面，所述所关注的蛋白质可为单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、抗体片段、融合蛋白和抗体-药物复合物。一方面，所述所关注的蛋白质的浓度可为约20mg/mL到约400mg/mL。
一方面，所述组合物可以进一步包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。另一方面，所述组合物可以进一步包括缓冲液，所述缓冲液选自由以下组成的组：组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、藻酸盐缓冲液和精氨酸缓冲液。一方面，所述组合物可以进一步包括张力改性剂。在又另一方面，所述组合物可以进一步包括磷酸钠。
在一个示例性实施例中，本公开提供了一种检测样品中的脂肪酶的方法。一方面，所述脂肪酶可为肝羧酸酯酶1样蛋白或肝羧酸酯酶B1样蛋白。一方面，检测样品中的脂肪酶的方法可以包括使所述样品与丝氨酸水解酶探针接触。一方面，检测样品中的脂肪酶的方法可以包括使样品与丝氨酸水解酶探针接触并将样品与丝氨酸水解酶探针一起温育以形成脂肪酶和丝氨酸水解酶探针的复合物。在另外的方面，检测样品中的脂肪酶的方法可以包括过滤掉不形成脂肪酶和丝氨酸水解酶探针的复合物的丝氨酸水解酶探针。
一方面，检测样品中的脂肪酶的方法可以进一步包括使所述样品与具有结合丝氨酸水解酶探针的能力的磁珠接触，使得所述磁珠与脂肪酶和丝氨酸水解酶探针的复合物结合。与脂肪酶和丝氨酸水解酶探针的复合物结合的磁珠可以进一步从样品中去除并用缓冲液洗涤。
另一方面，所述方法可以进一步包括去除所述磁珠，所述磁珠与脂肪酶和丝氨酸水解酶探针的复合物结合以形成富集脂肪酶的溶液。
一方面，所述方法可以进一步包括向所述溶液中添加水解剂以获得消化液。在一具体方面，所述水解剂可为胰蛋白酶。一方面，所述方法可以进一步包括分析所述消化液以检测所述脂肪酶。一方面，可以使用质谱仪分析所述消化液。在一具体方面，所述质谱仪可为串联质谱仪。在另一具体方面，所述质谱仪可以耦接到液相色谱系统。在又另一具体方面，所述质谱仪可以耦接到液相色谱-多反应监测系统。
一方面，所述方法可以进一步包括向所述溶液中添加蛋白质变性剂。在一具体方面，所述蛋白质变性剂可为尿素。一方面，所述方法可以进一步包括向所述溶液中添加蛋白质还原剂。在一具体方面，所述蛋白质还原剂可为DTT(二硫苏糖醇)。一方面，所述方法可以进一步包括向所述溶液中添加蛋白质烷基化剂。在一具体方面，所述蛋白质烷基化剂可为碘乙酰胺。
当结合以下描述和附图考虑时，将更好地认识和理解本发明的这些方面和其它方面。以下描述虽然表明各个实施例及其众多具体细节，但是是以说明而非限制的方式给出的。在本发明的范围内，可以进行许多替换、修改、添加或重新布置。
附图说明
图1示出了聚山梨醇酯中主要物种的化学结构。聚山梨醇酯主要由共享共同的山梨糖醇POE、异山梨醇POE或POE头基的脂肪酸酯构成，其中油酸是PS80的主要脂肪酸。右图A示出了通过在线2D-LC/MS分析得出的mAb调配物中PS80的总离子电流(TIC)色谱。标记的峰的属性是：(1)POE-POE异山梨醇-POE山梨糖醇；(2)POE山梨糖醇单亚油酸酯；(3)POE山梨糖醇单油酸酯；(4)POE异山梨醇单油酸酯和POE单油酸酯；(5)POE山梨糖醇亚油酸酯/油酸二酯；(6)POE山梨糖醇二油酸酯；(7)POE异山梨醇二油酸酯和POE二油酸酯；(8)可能的POE异山梨醇/POE亚油酸酯/油酸二酯，因为质谱法太复杂而无法解释；(9)POE山梨糖醇混合三油酸酯和四油酸酯。右图B示出了示出通过在线2D-LC/CAD分析得出的mAb调配物中PS80的分离和检测的CAD色谱。
图2示出了根据一示例性实施例的将含0.1％PS80的50mg/mL mAb-1在10mM组氨酸、pH 6中在5℃下温育持续0小时和36小时的色谱。介于11到17.5分钟之间洗脱的峰是POE、POE异山梨醇和POE山梨糖醇。
图3示出了PS80剩余的百分比针对温育时间绘制的图，其中原始mAb-1、与0.125μM、0.5μM和2μM FP探针混合的mAb-1分别用具有黑色实线的实心圆表、具有红色虚线的实心菱形、具有橙色虚线的实心正方形和具有蓝色虚线的实心三角形表示。
图4示出了根据一示例性实施例的脂肪酶耗竭实验的示意图。链霉亲和素dynabead磁珠与脱硫生物素-FP探针偶联并用于脂肪酶耗竭。将原始mAb-1和流出物mAb-1以及过程对照mAb-1与0.1％PS80在5℃下温育持续36小时，并进行PS降解测量。使用质谱对富集的脂肪酶进行消化和HCP分析。
图5示出了原始mAb-1、过程对照和脂肪酶耗竭的mAb-1中剩余的PS80百分比的图，其中原始mAb-1，过程对照和脂肪酶耗竭的mAb-1分别用具有黑色实线的实心菱形、具有蓝色虚线的实心正方形和具有橙色虚线的实心圆表示。
图6A示出了根据一示例性实施例的将含0.1％PS80的20μg/mL商业兔肝酯酶在10mM组氨酸、pH 6中在5℃下温育持续0小时、1.5小时和8小时的色谱。
图6B示出了根据一示例性实施例的将含0.1％PS80的100μg/mL商业人肝羧酸酯酶1在10mM组氨酸、pH 6中在5℃下温育持续0小时、5小时和18小时的色谱。
图6C示出了根据一示例性实施例的将含0.1％PS80的50mg/mL mAb-1在10mM组氨酸、pH 6中在5℃下温育持续0小时、18小时和36小时的色谱。
图6D示出了肝羧酸酯酶B1样(A0A06117X9)、肝羧酸酯酶1样(A0A061FE2)和人肝羧酸酯酶(hCES-1)的序列比对。
具体实施方式
宿主细胞蛋白(HCP)是一类必须从所有细胞源性蛋白治疗剂中去除的杂质。FDA未规定HCP的最大可接受水平，但最终药物产品中的HCP浓度必须得到控制并且在批次之间是可再现的(FDA，1999)。一个主要的安全问题与HCP可能对人类患者造成抗原效应的可能性有关(Satish Kumar Singh，产品相关因素对生物治疗剂的免疫原性的影响(Impact ofProduct-Related Factors on Immunogenicity of Biotherapeutics)，以及100《药物科学杂志(JOURNALS oF PHARMACEUTICAL SCIENCES)》354-387(2011))。除了对患者的健康产生不利影响外，酶活性HCP可能会在处理或长期储存期间影响产品质量(haron X.Gao等人，归因于残余CHO细胞蛋白酶活性的高度纯化的单克隆抗体的片段(Fragmentation of a highlypurified monoclonal antibody attributed to residual CHO cell proteaseactivity)，108《生物技术与生物工程(BIOTECHNOLOGYAND BIOENGINEERING)》977-982(2010)；FlavieRobert等人，宿主细胞蛋白酶对Fc融合重组蛋白的降解：CHO组织蛋白酶D的鉴定(Degradation of an Fc-fusion recombinant protein by host cell proteases：Identification of a CHO cathepsin D protease)》，104《生物技术与生物工程》1132-1141(2009))。HCP可能存在通过纯化操作持续进入到最终药物产品中的最大风险。在长期储存期间，必须保持产物分子的关键质量属性，并且必须使最终产物调配物中赋形剂的降解最小化。
市场上的若干种药物调配物包括作为可以提高蛋白质稳定性并保护药物产品免于聚集和变性的生物制药蛋白调配物中最常用的非离子型表面活性剂之一的聚山梨醇酯(Sylvia Kiese等人，摇晃，不搅拌：IgG1抗体的机械应力测试(Shaken，Not Stirred：Mechanical Stress Testing of an IgG1 Antibody)，97《药物科学杂志》4347-4366(2008)；Ariadna Martos等人，生物制药调配物中聚山梨醇酯及其降解产物的分析表征趋势(Trends on Analytical Characterization of Polysorbates and TheirDegradation Products in Biopharmaceutical Formulations)，106《药物科学杂志》1722-1735(2017))。聚山梨醇酯20(PS20)和聚山梨醇酯80(PS80)是可以提高蛋白质稳定性并保护药物产品免于聚集和变性的生物制药蛋白调配物中最常用的非离子型表面活性剂。药物产品中的典型聚山梨醇酯浓度的范围可以介于约0.001％到约0.1％(w/v)之间，以对蛋白质稳定性提供足够的努力。
然而，聚山梨醇酯易于降解，这会导致调配的原料药中不期望的微粒形成。已知聚山梨醇酯通过两种主要途径降解：自氧化和水解。由于不饱和脂肪酸酯取代基的高含量，因此发现在PS80中更容易发生氧化，而在PS20中，氧化被认为发生在不经常观察到的聚氧乙烯链中的醚键上(Oleg V.Borisov，Junyan A.Ji&Y.John Wang，通过液相色谱-质谱研究聚山梨醇酯表面活性剂的氧化降解(Oxidative Degradation of Polysorbate SurfactantsStudied by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry)，104《药物科学杂志》1005-1018(2015)；Anthony Tomlinson等人，聚山梨醇酯20在生物制药调配物中的降解：游离脂肪酸的定量、微粒的表征和降解机制的洞察Polysorbate 20 Degradation inBiopharmaceutical Formulations：Quantification of Free Fatty Acids，Characterization of Particulates，and Insights into the DegradationMechanism)，12《分子药剂学(MOLECULAR PHARMACEUTICS)》3805-3815(2015)；Jia Yao等人，聚山梨醇酯自氧化的定量动力学研究：不饱和脂肪酸酯取代基的作用(A Quantitative KineticStudy of Polysorbate Autoxidation：The Role of Unsaturated Fatty Acid EsterSubstituents)，26《药学研究(PHARMACEUTICAL RESEARCH)》2303-2313(2009))。此外，聚山梨醇酯还可以通过破坏脂肪酸酯键进行水解。源自聚山梨醇酯降解的微粒可以形成可见的或者甚至亚可见的，这可能会提高患者的免疫原性的可能性，并且可能对药物产品质量产生不同的影响。一种此类可能的杂质可为在包括聚山梨醇酯的药物调配物的制造、运输、储存、处理或施用期间形成的脂肪酸颗粒。脂肪酸颗粒可能会导致不利的免疫原性效应并且影响保质期。另外地，聚山梨醇酯的降解还会导致调配物中表面活性剂总量的减少，从而影响产品在其制造、储存、处理和施用期间的稳定性。
通常，聚山梨醇酯降解只能在相当长的储存时间后在药物产品中观察到。然而，假使一种单克隆抗体(mAb)，尽管未检测到明显地高浓度脂肪酶，但在4℃下在24小时内观察到PS80降解，从而表明此原料药中存在不熟悉的脂肪酶。必须检测并降低此类脂肪酶的浓度以保持药物调配物的稳定性。
推定的磷脂酶B样2(PLBD2)是被提议引起PS20的酶水解的第一宿主细胞蛋白(NitinDixit等人，残余的宿主细胞蛋白促进硫酸酯酶药物产品中的聚山梨醇酯20降解，从而产生游离脂肪酸颗粒(Residual Host Cell Protein Promotes Polysorbate 20Degradation in a Sulfatase Drug Product Leading to Free Fatty AcidParticles)，105《药物科学杂志》1657-1666(2016))。据报道，猪肝酯酶能够特异性地水解聚山梨醇酯80(不是PS20)，并且随着时间的推移在mAb药物产品中导致PS85的形成(StevenR.Labrenz，聚山梨醇酯80在mAb药物产品中的酯水解：在观察到mAb调配物中的可见微粒后支持假设风险的证据(Ester Hydrolysis of Polysorbate 80 in mAb Drug Product：Evidence in Support of the Hypothesized Risk After the Observation of VisibleParticulate in mAb Formulations)，103《药物科学杂志》2268-2277(2014))。XV组溶酶体磷脂酶A2异构体X1(LPLA2)证明了在低于1ppm下的降解PS20和PS80的能力(Troii Hall等人，单克隆抗体调配物中XV组溶酶体磷脂酶A2异构体X1降解聚山梨醇酯20和80(Polysorbates 20 and 80 Degradation by Group XV Lysosomal Phospholipase A 2Isomer X1 in Monoclonal Antibody Formulations)，105《药物科学杂志》1633-1642(2016)和Ying Cheng等人，用于评估聚山梨醇酯20在蛋白质治疗剂中的降解的快速高灵敏度反相超高效液相色谱-质谱法(A Rapid High-Sensitivity Reversed-Phase UltraHigh Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry Method for AssessingPolysorbate 20 Degradation in Protein Therapeutics)，108《药物科学杂志》2880-2886(2019))。
最近，选择一系列羧酸酯，包含immobead 150上的洋葱假单胞菌脂肪酶(PCL)、immobead 150上的南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)、immobead 150上的疏绵状嗜热丝孢菌(TLL)、兔肝酯酶(RLE)、南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)和猪胰脂肪酶II型(PPL)以研究分别含有99％的月桂酸酯和98％的油酸酯的两种独特的PS20和PS80的水解。不同的羧酸酯示出其独特的降解模式，从而指示此降解模式可以用于区分水解聚山梨醇酯的酶(A.C.Mcshan等人，一系列羧酸酯水解酶对聚山梨醇酯20和80的水解(Hydrolysis of Polysorbate 20and 80 by a Range of Carboxylester Hydrolases)，70《PDA药物科学与技术杂志(JOURNAL oF PHARMACEUTICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY)》332-345(2016))。评估与药物产品共同纯化的宿主细胞蛋白对聚山梨醇酯的影响对于确保药物调配物的稳定性至关重要。这可能需要鉴定宿主细胞蛋白及其降解聚山梨醇酯的能力。宿主细胞蛋白的鉴定可能特别具有挑战性，因为HCP的存在通常在ppm范围内，这使得HCP的分离和鉴定变得困难。
本发明公开了包括可以降解聚山梨醇酯的宿主细胞蛋白的水平降低的聚山梨醇酯的改进的组合物、检测此类宿主细胞蛋白的方法以及用于耗竭此类宿主细胞蛋白的方法。
除非另外描述，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管类似或等效于本文所述的任何方法和材料的方法和材料可以用于实践或测试，但现在对特定方法和材料进行描述。所提及的所有出版物特此通过引用并入本文。
术语“一个(a)”应理解为意指“至少一个”；并且术语“约”和“大约”应理解为允许标准变化，如本领域普通技术人员将理解的；并且在提供范围的情况下，包含端点。
在一些示例性实施例中，本公开提供了一种组合物，所述组合物包括所关注的蛋白质、聚山梨醇酯和剩余量的脂肪酶。
如本文所使用的，术语“组合物”是指与一种或多种药学上可接受的媒剂一起调配的活性药剂。
如本文所使用的，术语“活性药剂”可以包含药物产品的生物活性组分。活性药剂可以指用于药物产品中的任何物质或物质的组合，旨在提供药理活性或者以其它方式对疾病的诊断、治愈、缓解、治疗或预防具有直接作用，或者在恢复、纠正或改变动物的生理功能。制备活性药剂的非限制性方法可以包含使用发酵过程、重组DNA、从自然资源中分离和回收、化学合成或其组合。
在一些示例性实施例中，调配物中活性药剂的量可以在约0.01mg/mL到约600mg/mL的范围内。在一些具体实施例中，调配物中活性药剂的量可以为约0.01mg/mL、约0.02mg/mL、约0.03mg/mL、约0.04mg/mL、约0.05mg/mL、约0.06mg/mL、约0.07mg/mL、约0.08mg/mL、约0.09mg/mL、约0.1mg/mL、约0.2mg/mL、约0.3mg/mL、约0.4mg/mL、约0.5mg/mL、约0.6mg/mL、约0.7mg/mL、约0.8mg/mL、约0.9mg/mL、约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约35mg/mL、约40mg/mL、约45mg/mL、约50mg/mL、约55mg/mL、约60mg/mL、约65mg/mL、约70mg/mL、约5mg/mL、约80mg/mL、约85mg/mL、约90mg/mL、约100mg/mL、约110mg/mL、约120mg/mL、约130mg/mL、约140mg/mL、约150mg/mL、约160mg/mL、约170mg/mL、约180mg/mL、约190mg/mL、约200mg/mL、约225mg/mL、约250mg/mL、约275mg/mL、约300mg/mL、约325mg/mL、约350mg/mL、约375mg/mL、约400mg/mL、约425mg/mL、约450mg/mL、约475mg/mL、约500mg/mL、约525mg/mL、约550mg/mL、约575mg/mL或约600mg/mL。
在一些示例性实施例中，组合物的pH可以大于约5.0。在一个示例性实施例中，pH可以大于约5.0、大于约5.5、大于约6、大于约6.5、大于约7、大于约7.5、大于约8或大于约8.5。
在一些示例性实施例中，活性药剂可为所关注的蛋白质。
如本文所使用的，术语“蛋白质”或“所关注的蛋白质”可以包含具有共价连接的酰胺键的任何氨基酸聚合物。蛋白质包括一个或多个氨基酸聚合物链，在本领域中通常称为“多肽”。“多肽”是指由氨基酸残基、相关的天然存在的结构变体以及通过肽键连接的其合成的非天然存在的类似物、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物构成的聚合物。“合成肽或多肽”是指非天然存在的肽或多肽。合成肽或多肽可以例如使用自动化多肽合成仪合成。各种固相肽合成方法是本领域的技术人员已知的。蛋白质可以含有一个或多个多肽以形成单一功能性生物分子。蛋白质可以包含任何生物治疗性蛋白质、用于研究或疗法的重组蛋白、trap蛋白和其它嵌合受体Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体和双特异性抗体。另一个示例性方面，蛋白质可以包含抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、细胞因子、趋化因子、肽激素等。蛋白质可以使用基于重组细胞的生产系统来生产，如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如，毕赤酵母(Pichia sp.))、哺乳动物系统(例如，CHO细胞和CHO衍生物，如CHO-K1细胞)。对于最近讨论生物治疗性蛋白质及其生产的综述，参见Ghaderi等人，“用于生物治疗性糖蛋白的生产平台非人唾液酸化的发生、影响和挑战(Production platforms for biotherapeuticglycoproteins.Occurrence，impact，and challenges of non-human sialylation)，”(Darius Ghaderi等人，用于生物治疗性糖蛋白的生产平台非人唾液酸化的发生、影响和挑战，28《生物技术和基因工程综述(BIOTECHNOLOGY AND GENETIC ENGINEERING REVIEWS)》147-176(2012))。在一些实施例中，蛋白质包括改性、加合物和其它共价连接的部分。这些改性、加合物和部分包含例如亲和素、链霉亲和素、生物素分子、经改性的生物素分子、聚糖(例如，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、甘露糖和其它单糖)、PEG、聚组氨酸、FLAGtag、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)myc表位、荧光标记以及其它染料等。蛋白质可以根据组成和溶解度来分类，并且因此可以包含简单蛋白质，如球状蛋白质和纤维状蛋白质；缀合蛋白，如核蛋白、糖蛋白、粘蛋白、色蛋白、磷蛋白、金属蛋白和脂蛋白；以及源性蛋白质，如初级源性蛋白质和次级源性蛋白质。
在一些示例性实施例中，所关注的蛋白质可为抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白和其组合。
在一特定方面，所关注的蛋白质可为阿柏西普(aflibercept)(参见US 7,279,159，所述文献的全部教导通过引用并入本文)。
如本文所使用的术语“抗体”包含包括四条多肽链、通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链以及其多聚体(例如，IgM)的免疫球蛋白分子。每条重链包括重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包括轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域(CL1)。可以将VH区和VL区进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的高变区，其间散布着更保守的被称作构架区(FR)的区域。每个VH和VL由自氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在本发明的不同实施例中，抗大ET-1抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同或可为天然的或经人工修饰的。可以基于两个或更多个CDR的并列分析来定义氨基酸共有序列。
如本文所使用的，术语“抗体”还包含完整抗体分子的抗原结合片段。如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包含任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或经基因工程化的多肽或糖蛋白，其特异性结合抗原以形成复合物。抗体的抗原结合片段可以例如使用任何合适的标准技术源自完整抗体分子，所述标准技术如蛋白水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变结构域以及任选地恒定结构域的DNA的重组基因工程技术。此类DNA是已知的和/或易于从例如商业来源、DNA文库(包含例如噬菌体-抗体文库)获得，或可以合成。可以以化学方式或通过使用分子生物学技术对DNA进行测序和操纵，例如，以将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域布置成合适的构型或引入密码子、产生半胱氨酸残基、改性、添加或缺失氨基酸等。
如本文所使用的，“抗体片段”包含完整抗体的一部分，如例如抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包含但不限于Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双抗体、dAb片段、Fd′片段、Fd片段和分离的互补性决定区(CDR)区域，以及三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。Fv片段是免疫球蛋白重链和轻链的可变区的组合，并且ScFv蛋白是重组单链多肽分子，其中免疫球蛋白轻链和重链可变区通过肽连接子连接。在一些示例性实施例中，抗体片段含有足够的亲本抗体的氨基酸序列，其中所述抗体片段是与亲本抗体结合同一抗原的片段；在一些示例性实施例中，片段以与亲本抗体的亲和力相当的亲和力与抗原结合和/或与亲本抗体竞争与抗原结合。抗体片段可以通过任何方式产生。例如，抗体片段可以通过完整抗体的片段化酶促地或化学地产生和/或其可以由编码部分抗体序列的基因重组地产生。可替代地或另外地，抗体片段可以完全地或部分地合成产生。抗体片段可以任选地包括单链抗体片段。可替代地或另外地，抗体片段可以包括例如通过二硫键连接在一起的多条链。抗体片段可以任选地包括多分子复合物。功能性抗体片段通常包括至少约50个氨基酸，并且更通常包括至少约200个氨基酸。
短语“双特异性抗体”包含能够选择性结合两个或多个表位的抗体。双特异性抗体通常包括两条不同的重链，每条重链特异性结合两个不同分子(例如，抗原)上或同一分子上(例如，同一抗原上)的不同表位。如果双特异性抗体能够选择性结合两个不同的表位(第一表位和第二表位)，则第一重链对第一表位的亲和力通常比第一重链对第二表位的亲和力低至少一到两个或三个或四个数量级，反之亦然。由双特异性抗体识别的表位可以位于相同或不同的靶标上(例如，位于相同或不同的蛋白质上)。双特异性抗体可以例如通过组合识别同一抗原的不同表位的重链来制备。例如，编码识别同一抗原的不同表位的重链可变序列的核酸序列可以与编码不同重链恒定区的核酸序列融合，并且此类序列可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达。
典型的双特异性抗体具有两条重链，所述两条重链各自具有三个重链CDR，随后是CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域以及免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链不赋予抗原结合特异性但可以与每条重链缔合，或可以与每条重链缔合且可以结合由重链抗原结合区结合的表位中的一个或多个表位，或可以与每条重链缔合且使得重链中的一个或两个重链能够与一个或两个表位结合。BsAb可以分成两个主要类别：一类是带有Fc区(IgG样)；以及另一类是缺乏Fc区，后者通常小于包括Fc的IgG和IgG样双特异性分子。IgG样bsAb可以具有不同的形式，如但不限于三功能抗体、旋钮成孔IgG(kih IgG)、crossMab、orth-FabIgG、双可变结构域Ig(DVD-Ig)、二合一或双功能Fab(DAF)、IgG-单链Fv(IgG-scFv)或κλ体。非IgG样不同形式包含串联scFv、双抗体形式、单链双抗体、串联双抗体(TandAbs)、双亲和力再靶向分子(DART)、DART-Fc、纳米抗体或通过对接锁定(dock-and-lock，DNL)方法产生的抗体(Gaowei Fan、zujian Wang和minutes ghu Hao，双特异性抗体及其应用(Bispecific antibodies and their applications)，8《血液学与肿瘤学杂志(JOURNALOFHEMATOLOGY&ONCOLOGY)》130；Dafne Müller和Roland E.Kontermann，双特异性抗体(BispecificAntibodies)，《治疗性抗体手册(HANDBOOK OF THERAPEUTIC ANTIBODIES)》265-310(2014))。
产生BsAb的方法不限于基于两种不同的杂交瘤细胞系的体细胞融合的四杂交瘤(quadroma)技术、涉及化学交联剂的化学缀合以及利用重组DNA技术的基因方法。bsAb的实例包含在以下专利申请中公开的bsAb，所述专利申请特此通过引用并入：于2010年6月25日提交的美国序列号12/823838；于2012年6月5日提交的美国序列号13/488628；于2013年9月19日提交的美国序列号14/031075；于2015年7月24日提交的美国序列号14/808171；于2017年9月22日提交的美国序列号15/713574；于2017年9月22日提交的美国序列号15/713569；于2016年12月21日提交的美国序列号15/386453；于2016年12月21日提交的美国序列号15/386443；于2016年7月29日提交的美国序列号15/22343；以及于2017年11月15日提交的美国序列号15814095。在制造双特异性抗体期间的若干个步骤中可能存在低水平的同二聚体杂质。当使用完整质量分析进行时，由于同二聚体杂质的低丰度以及当使用常规液相色谱进行时这些杂质与主要物种的共洗脱，此类同二聚体杂质的检测可能是具有挑战性的。
如本文所使用的，“多特异性抗体”或“Mab”是指对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。虽然这些分子通常将仅结合两种抗原(即，双特异性抗体，BsAb)，但具有另外特异性的抗体，如三特异性抗体和KIH三特异性抗体也可以通过本文公开的系统和方法来解决。
如本文所使用的，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体可以通过本领域的任何可获得或已知的方式源自单个克隆，包含任何真核、原核或噬菌体克隆。可以使用本领域已知的各种技术来制备可用于本公开的单克隆抗体，包含使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。
在一些示例性实施例中，所关注的蛋白质的pI可以在约4.5到约9.0的范围内。在一个示例性具体实施例中，pI可以为约4.5、约5.0、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9.0。
在一些示例性实施例中，组合物中的所关注的蛋白质的类型可以为至少两种。在一些具体实施例中，所述至少两种所关注的蛋白质之一可为单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、抗体片段、融合蛋白或抗体-药物复合物。在一些其它具体实施例中，所述至少两种所关注的蛋白质之一的浓度可以为约20mg/mL到约400mg/mL。在一些示例性实施例中，组合物中的所关注的蛋白质的类型有两种。在一些示例性实施例中，组合物中的所关注的蛋白质的类型有三种。在一些示例性实施例中，组合物中的所关注的蛋白质的类型有五种。
在一些示例性实施例中，组合物中的两种或更多种所关注的蛋白质可以选自trap蛋白、嵌合受体Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、纳米体、重组抗体嵌合体、细胞因子、趋化因子或肽激素。
在一些示例性实施例中，组合物可为共调配物。
在一些示例性实施例中，所关注的蛋白质可以从哺乳动物细胞中纯化。哺乳动物细胞可为人来源的或非人来源的，可以包含原代上皮细胞(例如，角质形成细胞、宫颈上皮细胞、支气管上皮细胞、气管上皮细胞、肾上皮细胞和视网膜上皮细胞)、已建立的细胞系及其菌株(例如，293胚肾细胞、BHK细胞、HeLa宫颈上皮细胞和PER-C6视网膜细胞、MDBK(NBL-1)细胞、911细胞、CRFK细胞、MDCK细胞、CHO细胞、BeWo细胞、Chang细胞、Detroit 562细胞、HeLa 229细胞、HeLa S3细胞、Hep-2细胞、KB细胞、LSI80细胞、LS174T细胞、NCI-H-548细胞、RPMI2650细胞、SW-13细胞、T24细胞、WI-28VA13、2RA细胞、WISH细胞、BS-C-I细胞、LLC-MK2细胞、克隆M-3细胞、1-10细胞、RAG细胞、TCMK-1细胞、Y-1细胞、LLC-PKi细胞、PK(15)细胞、GHi细胞、GH3细胞、L2细胞、LLC-RC 256细胞、MHiCi细胞、XC细胞、MDOK细胞、VSW细胞和TH-I、B1细胞、BSC-1细胞、RAf细胞、RK细胞、PK-15细胞或其衍生物)、来自任何组织或器官的成纤维细胞(包含但不限于心脏、肝脏、肾脏、结肠、肠、食道、胃、神经组织(脑、脊髓)、肺、血管组织(动脉、静脉、毛细管)、淋巴组织(淋巴腺、腺样、扁桃体、骨髓和血液)、脾和成纤维细胞和成纤维细胞样细胞系(例如，CHO细胞、TRG-2细胞、IMR-33细胞、Don细胞、GHK-21细胞、瓜氨酸血症细胞、邓普斯细胞(Dempseycell)、Detroit551细胞、Detroit 510细胞、Detroit525细胞、Detroit529细胞、Detroit 532细胞、Detroit 539细胞、Detroit 548细胞、Detroit 573细胞、HEL 299细胞、IMR-90细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WI-26细胞、Midi细胞、CHO细胞、CV-1细胞、COS-1细胞、COS-3细胞、COS-7细胞、Vero细胞、DBS-FrhL-2细胞、BALB/3T3细胞、F9细胞、SV-T2细胞、M-MSV-BALB/3T3细胞、K-BALB细胞、BLO-11细胞、NOR-10细胞、C3H/IOTI/2细胞、HSDMiC3细胞、KLN205细胞、McCoy细胞、小鼠L细胞、菌株2071(小鼠L)细胞、L-M菌株(小鼠L)细胞、L-MTK′(小鼠L)细胞、NCTC克隆2472和2555、SCC-PSA1细胞、Swiss/3T3细胞、印度麂细胞(Indian muntjac cell)、SIRC细胞、Cn细胞和詹森细胞(Jensen cell)、Sp2/0、NS0、NS1细胞或其衍生物)。
在一些示例性实施例中，组合物可以是稳定的。组合物的稳定性可以包括评估活性药剂的化学稳定性、物理稳定性或功能稳定性。本发明的调配物通常表现出活性药剂的高水平稳定性。
就蛋白质调配物而言，如本文所使用的术语“稳定的”是指调配物内的所关注的蛋白质在本文所定义的示例性条件下储存后能够保持可接受程度的化学结构或生物学功能。即使其中所含的所关注的蛋白质在储存规定时间量后不能保持其100％的化学结构或生物学功能，调配物也可能是稳定的。在某些情况下，蛋白质的结构或功能在储存规定时间量后保持约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％可以被视为“稳定的”。
除其它外，稳定性可以通过确定在规定温度下储存规定时间量后保留在调配物中的天然蛋白质的百分比来测量。除其它外，天然蛋白质的百分比可以通过尺寸排阻色谱法(例如，尺寸排阻高效液相色谱法[SE-HPLC])来确定，使得天然意指非聚集和非降解。如本文所使用的短语，“可接受的稳定性程度”意指在给定温度下储存规定时间量后，可以在调配物中检测到至少90％的天然形式的蛋白质。在某些实施例中，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的天然形式的蛋白质可以在规定温度下储存规定时间量后在调配物中检测到。测量稳定性后的规定时间量可为至少14天、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更长时间。
除其它外，稳定性可以通过确定在规定温度下储存规定时间量后在调配物内的聚集体中形成的蛋白质的百分比来测量，其中稳定性与形成的聚集体百分比成反比。这种形式的稳定性在本文中还称为“胶体稳定性”。除其它外，所聚集的蛋白质的百分比可以通过尺寸排阻色谱法(例如，尺寸排阻高效液相色谱法[SE-HPLC])来确定。如本文所使用的短语，“可接受的稳定性程度”意指在给定温度下储存规定时间量后，在调配物中检测到的至多6％的蛋白质呈聚集形式。在某些实施例中，可接受的稳定性程度意指在给定温度下储存规定时间量后，在调配物中的聚集体中最多可以检测到约6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的蛋白质。测量稳定性后的规定时间量可为约至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更长时间。在评估稳定性时，药物调配物可以储存的温度可为以下中的任何温度：约-80℃到约45℃，例如，在约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃、约5℃、约25℃、约35℃、约37℃或45℃下储存。例如，如果在5℃下储存六个月后，检测到的少于约3％、2％、1％、0.5％或0.1％的蛋白质呈聚集形式，则药物调配物可以被视为是稳定的。如果在约25℃下储存六个月后，检测到的少于约4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的蛋白质呈聚集形式，则药物调配物也可以被视为是稳定的。如果在45℃下储存28天后，检测到少于约6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的蛋白质呈聚集形式，则药物调配物也可以被视为是稳定的。如果在-20℃、-30℃或-80℃下储存三个月后，检测到的少于约3％、2％、1％、0.5％或0.1％的蛋白质呈聚集形式，则药物调配物也可以被视为是稳定的。
除其它外，稳定性还可以通过确定在规定温度下储存规定时间量后在调配物内的聚集体中形成的蛋白质的百分比来测量，其中稳定性与形成的聚集体百分比成反比。这种形式的稳定性在本文中还称为“胶体稳定性”。除其它外，所聚集的蛋白质的百分比可以通过尺寸排阻色谱法(例如，尺寸排阻高效液相色谱法[SE-HPLC])来确定。如本文所使用的短语，“可接受的稳定性程度”意指在给定温度下储存规定时间量后，在调配物中检测到的至多约6％的蛋白质呈聚集形式。在某些实施例中，可接受的稳定性程度意指在给定温度下储存规定时间量后，在调配物中的聚集体中最多可以检测到约6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的蛋白质。测量稳定性后的规定时间量可为约至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更长时间。在评估稳定性时，药物调配物可以储存的温度可为以下中的任何温度：约-80℃到约45℃，例如，在约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4°-8℃、约5℃、约25℃、约35℃、约37℃或45℃下储存。例如，如果在约5℃下储存六个月后，检测到的少于约3％、2％、1％、0.5％或0.1％的蛋白质呈聚集形式，则药物调配物可以被视为是稳定的。如果在约25℃下储存六个月后，检测到的少于约4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的蛋白质呈聚集形式，则药物调配物也可以被视为是稳定的。如果在45℃下储存约28天后，检测到少于约6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的蛋白质呈聚集形式，则药物调配物也可以被视为是稳定的。如果在约-20℃、-30℃或-80℃下储存三个月后，检测到的少于约3％、2％、1％、0.5％或0.1％的蛋白质呈聚集形式，则药物调配物也可以被视为是稳定的。
除其它外，稳定性还可以通过确定在离子交换期间以在比蛋白质的主要级分(“主要电荷形式”)更酸性的级分(“酸性形式”)中迁移的蛋白质的百分比来测量，其中稳定性与酸性形式的蛋白质级分成反比。虽然不希望受到理论束缚，但蛋白质的脱酰胺基作用可能导致蛋白质变得更带负电荷，并且因此相对于非脱酰胺基的蛋白质更酸性(参见，例如，Robinson，N.(2002)“蛋白质脱酰胺(Protein Deamidation)”《美国国家科学院院刊(PNAS)》，99(8)：5283-5288)。除其它外，“酸化的”蛋白质的百分比可以通过离子交换色谱法(例如，阳离子交换高效液相色谱法[CEX-HPLC])来确定。如本文所使用的短语，“可接受的稳定性程度”意指在给定温度下储存规定时间量后，在调配物中检测到的至多49％的蛋白质呈酸性更强的形式。在某些示例性实施例中，可接受的稳定性程度意指在给定温度下储存规定时间量后，在调配物中最多可以检测到的约49％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的蛋白质呈酸性形式。测量稳定性后的规定时间量可为约至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月或更长时间。
在评估稳定性时，药物调配物可以储存的温度可为以下中的任何温度：约-80℃到约45℃，例如，在约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约4℃-8℃、约5℃、约25℃或45℃下储存。例如，如果在-80℃、-30℃或-20℃下储存三个月后，少于约30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的蛋白质呈酸性更强的形式，则药物调配物可以被视为是稳定的。如果在5℃下储存六个月后，少于约32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的蛋白质呈酸性更强的形式，则药物调配物也可以被视为是稳定的。如果在25℃下储存六个月后，少于约43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、约32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的蛋白质呈酸性更强的形式，则药物调配物也可以被视为是稳定的。如果在45℃下储存28天后，可以检测到的少于49％、48％、47％、46％、45％、44％、约43％、42％、41％、40％、39％、38％、37％、36％、35％、34％、33％、约32％、31％、30％、29％、28％、27％、26％、25％、24％、23％、22％、21％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％的蛋白质呈酸性更强的形式，则药物调配物也可以被视为是稳定的。
其它方法可以用于评估本发明的调配物的稳定性，例如，差示扫描量热法(DSC)用于确定热稳定性，控制搅拌用于确定机械稳定性，以及在约350nm或约405nm处的吸光度用于确定溶液浊度。例如，如果在约5℃到约25℃下储存6个月或更多个月后，调配物的OD405的变化在时间零点处小于来自调配物的OD405的约0.05(例如，0.04、0.03、0.02、0.01或更少)，则可以认为本发明的调配物是稳定的。测量蛋白质与其靶标的生物活性或结合亲和力也可以用于评估稳定性。例如，如果在例如5℃、25℃、45℃等下储存规定时间量(例如，1到12个月)后，调配物内所含的蛋白质与其靶标结合的亲和力至少为所述储存前蛋白质的结合亲和力的90％、95％或更高，则可认为本发明调配物是稳定的。结合亲和力可以通过例如，ELISA或等离子体共振来确定。生物活性可以通过蛋白质活性测定，例如使表达蛋白质的细胞与包括蛋白质的调配物接触来确定。可以直接测量蛋白质与此类细胞的结合，例如通过FACS分析。可替代地，可以在存在蛋白质的情况下测量蛋白质系统的下游活性，并将其与在不存在蛋白质的情况下的蛋白质系统的活性进行比较。
在一些示例性实施例中，组合物可以用于治疗、预防和/或改善疾病或病症。可以通过施用本发明的药物调配物来治疗和/或预防的示例性的、非限制性疾病和病症包含：感染；呼吸疾病；由与神经源性、神经性或伤害性疼痛相关的任何病状引起的疼痛；遗传性病症；先天性病症；癌症；疱疹样皮炎；慢性特发性荨麻疹；硬皮病、肥厚性瘢痕；惠普耳氏病(Whipple′s Disease)；良性前列腺增生；肺部病症，如轻度、中度或重度哮喘、过敏反应；川崎氏病(Kawasaki disease)、镰状细胞疾病；变应性肉芽肿血管炎(Churg-Strausssyndrome)；格雷夫斯病(Grave′s disease)；先兆子痫；干燥综合征；自身免疫性淋巴增生综合征；自身免疫性溶血性贫血；巴雷特食管(Barrett′s esophagus)；自身免疫性葡萄膜炎；结核病；肾病；关节炎，包含慢性类风湿性关节炎；炎性肠疾病，包含克罗恩病(Crohn′sdisease)和溃疡性结肠炎；系统性红斑狼疮；炎症性疾病；HIV感染；AIDS；LDL单采术(LDLapheresis)；PCSK9激活突变(功能获得性突变，“GOF”)引起的病症，杂合家族性高胆固醇血症(heFH)引起的病症；原发性高胆固醇血症；血脂异常；胆汁淤积性肝病；肾病综合征；甲状腺功能减退；肥胖症；动脉粥样硬化；心血管疾病；神经退行性疾病；新生儿发病多系统炎症性病症(NOMID/CINCA)；肢痛综合征(Muckle-Wells Syndrome)(MWS)；家族性寒冷型自身炎症综合征(FCAS)；家族性地中海热(FMF)；肿瘤坏死因子受体相关周期性发热综合征(TRAPS)；络全身型幼年类风湿性关节炎(斯提耳氏病(Still′s Disease))；1型和2型糖尿病；自身免疫性疾病；运动神经元病；眼病；性传播疾病；结核病；通过VEGF拮抗剂改善、抑制或减轻的疾病或病状；通过PD-1抑制剂改善、抑制或减轻的疾病或病状；通过白介素抗体改善、抑制或减轻的疾病或病状；通过NGF抗体改善、抑制或减轻的疾病或病状；通过PCSK9抗体改善、抑制或减轻的疾病或病状；通过ANGPTL抗体改善、抑制或减轻的疾病或病状；通过激活素抗体改善、抑制或减轻的疾病或病状；通过GDF抗体改善、抑制或减轻的疾病或病状；通过Fel d 1抗体改善、抑制或减轻的疾病或病状；通过CD抗体改善、抑制或减轻的疾病或病状；通过C5抗体或其组合改善、抑制或减轻的疾病或病状。
在一些示例性实施例中，可以将组合物施用于患者。施用可以通过本领域技术人员可接受的任何途径。施用的非限制性途径包含口服施用、局部施用或肠胃外施用。通过某些肠胃外途径施用可能涉及通过针头或导管将本发明的调配物引入到患者体内，由无菌注射器或连续输注系统等一些其它机械装置推动。本发明所提供的组合物可以使用注射器、注入器、泵或本领域公认的用于肠胃外施用的任何其它装置来施用。本发明的组合物还可以作为气雾剂施用以在肺腔或鼻腔中吸收。还可以施用组合物以通过粘膜，如含服施用吸收。
如本文所使用的，“聚山梨醇酯”是指在调配物开发中用于保护抗体免受各种物理应力如搅拌、冻融过程和空气/水界面的常见赋形剂(Emily Ha，Wei Wang&Y.John Wang，聚山梨醇酯80中的过氧化物形成和蛋白质稳定性(Peroxide formation in polysorbate 80and protein stability)，91《药物科学杂志》2252-2264(2002)；Bruce A.Kerwin，蛋白质生物治疗剂的调配物中使用的聚山梨醇酯20和80：结构和降解途径(Polysorbates 20 and80 Used in the Formulation of Protein Biotherapeutics：Structure andDegradation Pathways)，97《药物科学杂志》2924-2935(2008)；Hanns-Christian Mahler等人，表面活性剂和单克隆抗体对灭菌级过滤器的吸附行为(Adsorption Behavior of aSurfactant and a Monoclonal Antibody to Sterilizing-Grade Filters)，99《药物科学杂志》2620-2627(2010))并且可以包含由聚氧乙烯山梨糖醇的脂肪酸酯构成的非离子型两亲性表面活性剂。酯可以包含聚氧乙烯山梨糖醇头基和饱和单月桂酸酯侧链(聚山梨醇酯20；PS20)或不饱和单油酸酯侧链(聚山梨醇酯80；PS80)。在一些示例性实施例中，聚山梨醇酯可以以0.001％到2％(重量/体积)的范围存在于调配物中。聚山梨醇酯还可以含有多种脂肪酸链的混合物；例如，聚山梨醇酯80含有油酸、棕榈酸、肉豆蔻酸和硬脂酸脂肪酸，其中单油酸酯级分大约占多分散混合物的58％(Nitin Dixit等人，残余的宿主细胞蛋白促进硫酸酯酶药物产品中的聚山梨醇酯20降解，从而产生游离脂肪酸颗粒，105《药物科学杂志》1657-1666(2016))。聚山梨醇酯的非限制性实例包含聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-40、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-65和聚山梨醇酯-80。
聚山梨醇酯容易以pH依赖性和温度依赖性方式发生自氧化，并且另外地，暴露于UV也会产生不稳定性(Ravuri S.k.Kishore等人，聚山梨醇酯20和80的降解：热自氧化和水解研究(Degradation of Polysorbates 20 and 80：Studies on Thermal Autoxidationand Hydrolysis)，100《药物科学杂志》721-731(2011))，从而导致溶液中的游离脂肪酸与山梨糖醇头基一起出现。由聚山梨醇酯产生的游离脂肪酸可以包含任何具有六到二十个碳的脂肪族脂肪酸。游离脂肪酸的非限制性实例包含油酸、棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、月桂酸或其组合。
在一些示例性实施例中，聚山梨醇酯可以形成游离脂肪酸颗粒。游离脂肪酸颗粒的大小可以为至少5μm。进一步地，这些脂肪酸颗粒可以根据其大小分类为可见(>100μm)、亚可见(<100μm，其可以细分为微米(1-100μm)和亚微米(100nm-1000nm))以及纳米颗粒(<100nm)(Linda Narhi，Jeremy Schmit和Deepak Sharma，蛋白质聚集的分类(Classification of protein aggregates)，101《药物科学杂志》493-498)。在一些示例性实施例中，脂肪酸颗粒可为可见颗粒。可见颗粒可以通过目测确定。在一些示例性实施例中，脂肪酸颗粒可为亚可见颗粒。根据美国药典(USP)，可以通过光阻法监测亚可见颗粒。
在一些示例性实施例中，组合物中的聚山梨醇酯的浓度可以为约0.001％w/v、约0.002％w/v、约0.003％w/v、约0.004％w/v、约0.005％w/v、约0.006％w/v、约0.007％w/v、约0.008％w/v、约0.009％w/v、约0.01％w/v、约0.011％w/v、约0.015％w/v、约0.02％w/v，0.025％w/v、约0.03％w/v、约0.035％w/v、约0.04％w/v、约0.045％w/v、约0.05％w/v、约0.055％w/v、约0.06％w/v、约0.065％w/v、约0.07％w/v、约0.075％w/v、约0.08％w/v、约0.085％w/v、约0.09％w/v、约0.095％w/v、约0.1％w/v、约0.11％w/v、约0.115％w/v、约0.12％w/v、约0.125％w/v、约0.13％w/v、约0.135％w/v、约0.14％w/v、约0.145％w/v、约0.15％w/v、约0.155％w/v、约0.16％w/v、约0.165％w/v、约0.17％w/v、约0.175％w/v、约0.18％w/v、约0.185％w/v、约0.19％w/v、约0.195％w/v或约0.2％w/v。
在一些示例性实施例中，聚山梨醇酯可以被存在于组合物中的脂肪酶降解。这些脂肪酶可为工艺相关的杂质，所述杂质可以源自制造工艺并且可以包含三个主要类别：细胞底物源性、细胞培养物源性和下游源性。细胞底物源性杂质包含但不限于源自宿主生物体的蛋白质和核酸(宿主细胞基因组、载体或总DNA)。细胞培养物源性杂质包含但不限于诱导剂、抗生素、血清和其它介质组分。下游源性杂质包含但不限于酶、化学和生化加工试剂(例如，溴化氰、胍、氧化剂和还原剂)、无机盐(例如，重金属、砷、非金属离子)、溶剂、载体、配体(例如，单克隆抗体)和其它可浸出物。
一方面，脂肪酶可为丝氨酸水解酶。在一具体方面，脂肪酶可为羧酸酯酶B1样蛋白(A0A061I7X9)。在另一具体方面，脂肪酶可为肝羧酸酯酶1样蛋白(A0A061IFE2)。在又一具体方面，脂肪酶可为羧酸酯酶B1样蛋白和肝羧酸酯酶1样蛋白两者。
通过使用根据一些示例性实施例的检测方法来鉴定脂肪酶对聚山梨醇酯降解的影响。
已经鉴定出可以在某些蛋白质制剂中降解聚山梨醇酯的脂肪酶，具有用于特异性、灵敏和定量测定和/或耗竭此类脂肪酶水平的试剂、方法和试剂盒以及开发制备具有低水平脂肪酶的组合物的方法将是非常有利和可取的。
在一些示例性实施例中，本公开提供了包括小于约5ppm的羧酸酯酶B1样蛋白和/或肝羧酸酯酶1样蛋白的组合物。
在一些示例性实施例中，组合物中羧酸酯酶B1样蛋白和/或肝羧酸酯酶1样蛋白的残余量可以小于约5ppm。在一些具体的示例性实施例中，羧酸酯酶B1样蛋白和/或肝羧酸酯酶1样蛋白的残余量小于约0.01ppm、约0.02ppm、约0.03ppm、约0.04ppm、约0.05ppm、约0.06ppm，0.07ppm，0.08ppm，0.09ppm、约0.1ppm、约0.2ppm、约0.3ppm、约0.4ppm、约0.5ppm、约0.6ppm，0.7ppm，0.8ppm，0.9ppm、约1ppm、约2ppm、约3ppm、约4ppm或约5ppm。
在一些示例性实施例中，本公开提供了制备具有所关注的蛋白质的组合物的多种方法，所述所关注的蛋白质包括小于约5ppm的羧酸酯酶B1样蛋白和/或肝羧酸酯酶1样蛋白。
本公开还提供了一种制备具有小于约5ppm的羧酸酯酶B1样蛋白和/或肝羧酸酯酶1样蛋白的所关注的蛋白质的组合物的方法，所述方法包括用所关注的蛋白质和脂肪酶形成样品、使所述样品与探针接触，所述探针能够与脂肪酶结合以形成复合物并将所述复合物与所述样品分离。
在一些示例性实施例中，样品可以从生物过程的任何步骤获得，如培养细胞培养液(CCF)、收获的细胞培养液(HCCF)、过程性能鉴定(PPQ)、下游处理中的任何步骤、药物溶液(DS)或包括最终经调配产品的药物产品(DP)。在一些其它具体的示例性实施例中，样品可以选自澄清、色谱纯化、病毒灭活或过滤的下游过程的任何步骤。在一些具体的示例性实施例中，药物产品可以选自在临床、运输、储存或处理中制造的药物产品。在一些其它具体的示例性实施例中，药物产品可以包括聚山梨醇酯。
在一些示例性实施例中，制备具有含有小于约5ppm的羧酸酯酶B1样蛋白和/或肝羧酸酯酶1样蛋白的所关注的蛋白质的组合物的方法还可以包含另外的色谱步骤。
在一些示例性实施例中，制备具有含有小于约5ppm的羧酸酯酶B1样蛋白和/或肝羧酸酯酶1样蛋白的所关注的蛋白质的组合物的方法可以进一步包含过滤以下一项或全部：样品、来自一个或多个色谱步骤的洗脱液，和/或来自一个或多个色谱步骤的流出物。
如本文所使用的，“病毒过滤”可以包含使用合适的过滤器进行过滤，所述合适的过滤器包含但不限于Planova 20NTM、来自旭化成制药公司(Asahi Kasei Pharma)的50N或BioEx、来自EMD密理博公司(EMD Millipore)的ViresolveTM过滤器、来自Sartorius公司(Sartorius)的ViroSart CPV或来自颇尔公司(Pall Corporation)的Ultipor DV20 orDV50TM过滤器。对于本领域普通技术人员来说，选择合适的过滤器以获得所期望的过滤性能将是显而易见的。
在一些示例性实施例中，制备具有含有小于约5ppm的羧酸酯酶B1样蛋白和/或肝羧酸酯酶1样蛋白的所关注的蛋白质的组合物的方法可以进一步包含对以下一项或全部执行UF/DF：样品、来自一个或多个色谱步骤的洗脱液，和/或来自一个或多个色谱步骤的流出物。
如本文所使用的，术语“超滤”或“UF”可以包含类似于反渗透的膜过滤过程，使用静水压力迫使水通过半渗透膜。超滤详细描述于：LEOS J.ZEMAN和ANDREW L.ZYDNEY，《微滤和超滤：原理和应用(MICROFILTRATION AND ULTRAFILTRATION：PRINCIPLES AND APPLICATIONS)》(1996)。孔径小于0.1μm的过滤器可以用于超滤。通过采用具有如此小孔径的过滤器，样品的体积可以通过样品缓冲液通过过滤器的渗透而减少，而抗体被保留在过滤器后面。
如本文所使用的，“渗滤”或“DF”可以包含使用超滤器去除和交换盐、糖和非水溶剂、从结合的物种中分离游离物种、去除低分子量材料和/或引起离子和/或pH环境的快速变化的方法。通过以大约等于超滤速率的速率将溶剂添加到被超滤的溶液中，可以最有效地去除小分子溶质。这在恒定的体积下将小物种从溶液中洗去，从而有效地制造保留的抗体。在本发明的某些实施例中，可以采用渗滤步骤来交换与本发明有关的各种缓冲液，任选地在另外的色谱步骤或其它纯化步骤之前，以及从抗体制剂中去除杂质。
在一些示例性实施例中，探针能够连接在固体载体上。固体载体可为目前广泛使用或建议用于固定、分离等的任何众所周知的载体或基质。这些可以采取颗粒、片材、凝胶、过滤器、膜、纤维、毛细管或微量滴定条、管、板或孔等的形式。方便地，载体可以由玻璃、二氧化硅、乳胶或聚合物材料制成。由于其更大的结合能力，因此微粒材料，例如珠，特别是聚合物珠通常是优选的。根据本发明使用的微粒固体载体将包括球形珠。适用于本发明的方法的非磁性聚合物珠可从Dyno颗粒AS公司(DynoParticlesAS)(挪威利勒斯特罗姆(
Figure BDA0003817365290000231
Norway))以及从凯杰公司(Qiagen)、法玛西亚公司(Pharmacia)和Serotec公司(Serotec)获得。
然而，为了协助操纵和分离，磁珠是优选的。如本文所使用的，术语“磁性”意指当放置在磁场中时载体能够具有赋予其的磁矩，并且因此在所述磁场的作用下可移位。换言之，包括磁性颗粒的载体可以通过磁性聚集容易地去除，这提供了在核酸结合步骤之后分离颗粒的快速、简单且有效的方法，并且是一种远不如传统技术(如产生可能会降解核酸的剪切力的离心)的严格方法。因此，使用本发明的方法，探针与脂肪酶之间形成的复合物可以通过施加磁场，例如使用永磁体来去除。通常在含有样品混合物的容器的侧面施加磁体以使颗粒聚集到容器的壁上并倒出剩余的样品就足够了。在一些具体方面，可以使用超顺磁颗粒，例如Sintef在EP-A-106873中描述的超顺磁颗粒，因为可以避免反应期间颗粒的磁性聚集和凝集，从而确保均匀和核酸提取。有Dynal AS公司(Dynal AS)(挪威奥斯陆(Oslo，Norway))作为DYNABEADS出售的众所周知的磁性颗粒特别适合用于本发明。进一步地，可以制备具有不同类型的功能化表面的珠或其它载体，例如带正电的或疏水性的。带弱正电荷和强正电荷的表面、带弱负电荷的中性表面和疏水性表面，例如，经聚氨酯涂覆的表面，已经被证明效果良好。
在一些示例性实施例中，探针能够使用配体连接在固体载体上。非限制性实例可以包含指示剂、生物素分子、经改性的生物素分子、经改性的生物素分子、经改性的生物素分子、细胞核、蛋白质序列、表位标签、缺电子分子或富电子分子。配体的具体实例可以包含但不限于生物素分子或经改性的如脱亚氨基生物素分子、脱硫生物素分子、邻二醇，如1，2-二羟基乙烷、1，2-二羟基环己烷等、地高辛、麦芽糖、寡聚组氨酸、谷胱甘肽、2，4-二硝基苯、苯砷酸盐、ssDNA、dsDNA、多肽的肽、金属螯合物、糖类、罗丹明或荧光素，或可产生抗体的任何半抗原。配体及其捕获试剂的实例包含但不限于：脱硫生物素或结构改性的基于生物素的试剂，包含脱亚氨基生物素分子，经改性的生物素分子，上述所述配体及其捕获试剂与亲和素/链霉亲和素家族的蛋白质结合，上述所述配体及其捕获试剂可以例如以链亲和素-琼脂糖、低聚物-亲和素-琼脂糖或单体-亲和素-琼脂糖的形式使用；任何1，2-二醇，如1，2-二羟基乙烷(HO-CH2-CH2-OH)，以及其它包含环状烷烃的1，2-二羟基烷烃，例如与烷基、或芳基硼酸或硼酸酯结合的1，2-二羟基环己烷，如苯基-B(OH)2或己基-B(O乙基)2，其可以通过烷基或芳基连接到固体载体材料，如琼脂糖上；与麦芽糖结合蛋白(以及任何其它糖/糖结合蛋白对或更一般地与具有上文所讨论的特性的任何配体/配体结合蛋白对)结合的麦芽糖；半抗原，如二硝基苯基，用于其中半抗原与识别半抗原的抗半抗原抗体结合的任何抗体，例如将与抗二硝基苯基-lgG结合的二硝基苯基；与过渡金属结合的配体，例如，将与Ni(II)结合的低聚物组氨酸，可以以树脂结合螯合的过渡金属形式使用过渡金属捕获试剂，如次氮基三乙酸螯合的Ni(II)或亚氨基二乙酸螯合的Ni(II)；与谷胱甘肽-S-转移酶结合的谷胱甘肽。
本公开还提供了一种通过使样品与丝氨酸水解酶探针接触来检测样品中的肝羧酸酯酶1样蛋白或肝羧酸酯酶B1样蛋白的方法。一方面，检测样品中的脂肪酶的方法可以包括使样品与丝氨酸水解酶探针接触并将样品与丝氨酸水解酶探针一起温育以形成脂肪酶和丝氨酸水解酶探针的复合物。在另外的方面，检测样品中的脂肪酶的方法可以包括过滤掉不形成脂肪酶和丝氨酸水解酶探针的复合物的丝氨酸水解酶探针。
在一些示例性实施例中，检测样品中的脂肪酶的方法可以进一步包括使样品与具有结合丝氨酸水解酶探针的能力的磁珠接触，使得磁珠与脂肪酶和丝氨酸水解酶探针的复合物结合。
在一些具体的示例性实施例中，与脂肪酶和丝氨酸水解酶探针的复合物结合的磁珠可以进一步从样品中去除并用缓冲液洗涤。
在一些示例性实施例中，检测样品中的脂肪酶的方法可以进一步包括去除磁珠，所述磁珠与脂肪酶和丝氨酸水解酶探针的复合物结合以形成富集脂肪酶的溶液。
在一些示例性实施例中，检测样品中的脂肪酶的方法可以进一步包括向溶液中添加水解剂以获得消化液。
如本文所使用的，术语“水解剂”是指可以进行蛋白质的消化的大量不同药剂中的任何一种或其组合。可以进行酶消化的水解剂的非限制性实例包含来自赛氏曲霉(Aspergillus Saitoi)的蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶XIII、胃蛋白酶、胰蛋白酶、Tryp-N、糜蛋白酶、曲霉胃蛋白酶I、LysN蛋白酶(Lys-N)、LysC蛋白内切酶(Lys-C)、蛋白内切酶Asp-N(Asp-N)、蛋白内切酶Arg-C(Arg-C)、蛋白内切酶Glu-C(Glu-C)或外膜蛋白T(OmpT)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的免疫球蛋白降解酶(IdeS)、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、V8蛋白酶或其生物激活片段或同源物或其组合。可以进行非酶消化的水解剂的非限制性实例包含使用高温、微波、超声、高压、红外、溶剂(非限制性实例是乙醇和乙腈)、固定化酶消化(IMER)、磁性颗粒固定化酶和芯片上固定化酶。对于讨论蛋白质消化的可用技术的最近综述，参见Switazar等人，“蛋白质消化：可用技术和最新开发的概述(Protein Digestion：An Overview of the Available Techniques andRecent Developments)”(Linda Switzar、Martin Giera和Wilfried M.A.Niessen，蛋白质消化：可用技术和最新开发的概述，12《蛋白质组学研究杂志(JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH)》1067-1077(2013))。水解剂中的一种或组合可以以序列特异的方式切割蛋白质或多肽中的肽键，从而产生可预测的较短肽的集合。
可以适当地选择水解剂与脂肪酶的比率和消化所需的时间，以获得脂肪酶的消化。当酶与底物的比率过高时，对应的高消化率将无法使肽有足够的时间通过质谱仪进行分析，并且序列覆盖率将受到影响。另一方面，低E/S比率需要较长消化时间，并且因此需要较长的数据采集时间。酶与底物的比率可以在约1∶0.5到约1∶200的范围内。如本文所使用的，术语“消化”是指蛋白质的一个或多个肽键的水解。存在若干种方法用于使用适当的水解剂进行样品中的蛋白质的消化，例如酶消化或非酶消化。
在一些示例性实施例中，检测样品中的脂肪酶的方法可以进一步包括向溶液中添加蛋白质变性剂。
如本文所使用的，“蛋白质变性”可以指分子的三维形状从其天然状态改变而不破坏肽键的过程。蛋白质变性可以使用蛋白质变性剂来进行。蛋白质变性剂的非限制性实例包含热、高或低pH，或暴露于离液剂。若干种离液剂可以用作蛋白质变性剂。离液溶质通过干扰由非共价力，如氢键、范德华力和疏水性作用介导的分子内相互作用来增加系统的熵。离液剂的非限制性实例包含丁醇、乙醇、氯化胍、高氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、苯酚、丙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲、N-月桂酰基肌氨酸、尿素和其盐。在一具体方面，所述蛋白质变性剂可为尿素。
在一些示例性实施例中，检测样品中的脂肪酶的方法可以进一步包括向溶液中添加蛋白质变性剂或蛋白质还原剂。
如本文所使用的，术语“蛋白质还原剂”是指用于还原蛋白质中的二硫键的药剂。用于还原蛋白质的蛋白质还原剂的非限制性实例是二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、埃尔曼试剂、盐酸羟胺、氰基硼氢化钠、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)或其组合。一方面，蛋白质还原剂可为DTT(二硫苏糖醇)。
在一些示例性实施例中，检测样品中的脂肪酶的方法可以进一步包括向溶液中添加蛋白质烷基化剂。
如本文所使用的，术语“蛋白质烷基化剂”是指用于烷基化蛋白质中的某些游离氨基酸残基的药剂。蛋白质烷基化剂的非限制性实例是碘乙酰胺(IOA)、氯乙酰胺(CAA)、丙烯酰胺(AA)、N-乙基马来酰亚胺(NEM)、甲烷硫代磺酸甲酯(MMTS)和4-乙烯基吡啶或其组合。
在一些示例性实施例中，检测样品中的脂肪酶的方法可以进一步包括分析消化液以检测脂肪酶。一方面，可以使用质谱仪分析所述消化液。在一具体方面，所述质谱仪可为串联质谱仪。在另一具体方面，所述质谱仪可以耦接到液相色谱系统。在又另一具体方面，所述质谱仪可以耦接到液相色谱-多反应监测系统。
如本文所使用的，术语“质谱仪”包含能够鉴定特定分子物种并且测量其准确质量的装置。所述术语意味着包含任何分子检测器，多肽或肽可以洗脱到所述分子检测器中以进行检测和/或表征。质谱仪可以包含三个主要部分：离子源、质量分析器和检测器。离子源的作用是产生气相离子。分析物原子、分子或簇可以被转移到气相中，并且同时(如以电喷雾电离的方式)或通过单独的过程被电离。离子源的选择在很大程度上取决于应用。
如本文所使用的，术语“串联质谱”包含通过使用多阶段的质量选择和质量分离来获得关于样品分子的结构信息的技术。先决条件是样品分子可以被转移到气相中并被完整地电离，并且所述样品分子可以在第一质量选择步骤之后以一些可预测和可控制的方式被诱导分裂。多级MS/MS或MSn可以通过首先选择并分离前体离子(MS2)、将其碎裂、分离初级碎片离子(MS3)、将其碎裂、分离次级碎片(MS4)等来进行，只要可以获得有意义的信息或碎片离子信号是可检测的。串联MS已通过各种分析器组合成功地执行。对于特定应用，组合哪种分析器可以由许多不同的因素确定，如灵敏度、选择性和速度，以及大小、成本和可用性。串联MS方法的两个主要类别是空间串联和时间串联，但也存在混合的情况，其中时间串联分析器在空间上耦接或与空间串联分析器耦接。空间串联质谱仪包括离子源、前体离子激活装置和至少两个非捕获质量分析器。可以设计特定的m/z分离函数，使得在仪器的一个区段中离子被选择、在中间区域中离解，并且然后将产物离子传输到另一个分析器进行m/z分离和数据采集。在时间串联中，离子源中产生的质谱仪离子可以在同一物理装置中被捕获、隔离、碎裂和m/z分离。
通过质谱仪鉴定的肽可以用作完整蛋白质及其翻译后改性的替代代表。所述肽可以通过关联实验和理论MS/MS数据而用于蛋白质表征，后者从蛋白质序列数据库中的可能的肽产生。所述表征包含但不限于对蛋白质片段的氨基酸进行测序、确定蛋白质测序、确定蛋白质从头测序、定位翻译后改性或鉴定翻译后改性或可比性分析或其组合。
如本文所使用的，术语“数据库”是指生物信息学工具，所述生物信息学工具提供了针对数据库中的所有可能序列搜索未解读的MS-MS光谱的可能性。此类工具的非限制性实例是Mascot(http://www.matrixscience.com)、Spectrum Mil1(http://www.chem.agilent.com)、PLGS(http://www.waters.com)、PEAKS(http://www.bioinformaticssolutions.com)、Proteinpilot(http://download.appliedbiosystems.com//proteinpilot)、Phenyx(http://www.phenyx-ms.com)、Sorcerer(http://www.sagenresearch.com)、OMSSA(http://www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/)、X！Tandem(http://www.thegpm.org/TANDEM/)、蛋白质探勘者(Protein Prospector)(http://www.http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm)、Byoni(https://www.proteinmetrics.com/products/byonic)或Sequest(http://fields.scripps.edu/sequest)。
在一些示例性实施例中，质谱仪可以与液相色谱系统耦接。
如本文所使用的，术语“色谱”是指其中由液体或气体携带的化学混合物可以由于化学实体在其固定液相或固相周围或在固定液相或固相上方流动时的差异分布而分离成组分的过程。色谱的非限制性实例包含传统反相(RP)、离子交换(IEX)和正相色谱(NP)。与疏水性相互作用、亲水性相互作用和离子相互作用分别是主要相互作用模式的RP、NP和IEX色谱不同，混合模式色谱可以采用这些相互作用模式中的两种或更多种相互作用模式的组合。若干类型的液相色谱可以与质谱仪一起使用，如快速分辨液相色谱(RRLC)、超高效液相色谱(UPLC)、超快速液相色谱(UFLC)和纳米液相色谱(nLC)。关于色谱方法和原理的进一步详细信息，参见Colin等人(COLIN F.POOLE等人，《液相色谱：基本原理和仪器(LIQUID CHROMATOGRAPHY FUNDAMENTALS AND INSTRUMENTATION)》(2017))。
在一些示例性实施例中，质谱仪可以耦接到纳米液相色谱。在一些示例性实施例中，用于洗脱液相色谱中的蛋白质的流动相可为可与质谱仪兼容的流动相。在一些具体的示例性实施例中，流动相可为乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵或其组合。
在一些示例性实施例中，质谱仪可以耦接到液相色谱-多反应监测系统。
如本文所使用的，“多反应监测”或“MRM”是指一种具有高灵敏度、特异性和宽动态范围的可以精确地定量复合物基质内的小分子、肽和蛋白质的基于质谱的技术，它，(PaolaPicotti和RuediAebersold，基于所选的反应监测的蛋白质组学：工作流程、潜力、误区和未来方向(Selected reaction monitoring-based proteomics：workflows，potential，pitfalls and future directions)，9《自然方法(NATURE METHODS)》555-566(2012))。MRM通常可以用三重四极杆质谱仪进行，其中在第一个四极杆中选择对应于所选小分子/肽的前体离子，并且在第三个四极杆中选择用于监测的前体离子的碎片离子(YongSeok Choi等人，用于验证多种阿尔茨海默氏病生物标志物候选物的靶向人脑脊液蛋白质组学(Targeted human cerebrospinal fluid proteomics for the validation ofmultiple Alzheimers disease biomarker candidates)，930《色谱杂志B(JOURNAL OFCHROMATOGRAPHY B)》129-135(2013))。
在一些示例性实施例中，质谱仪可以耦接到液相色谱-所选反应监测系统。
应当理解，本发明不限于上述中的任何一种：色谱树脂、赋形剂、过滤方法、水解剂、蛋白质变性剂、蛋白质烷基化剂、用于鉴定的仪器和任何色谱树脂、赋形剂、过滤方法、水解剂、蛋白质变性剂、蛋白质烷基化剂，可以通过任何合适的方式选择用于鉴定的仪器。
在整个说明书中引用了各种出版物，包含专利、专利申请、公开的专利申请、登录号、技术文章和学术文章。这些所引用的参考文献中的每个参考文献通过引用整体并且出于所有目的并入本文。
通过参考以下实例，将更充分地理解本发明。然而，以下实例不应被解释为限制本发明的范围。
实例
材料.
Dynabead MyOne-链霉亲和素T1购自赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific)(马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham，MA))的英杰公司(Invitrogen)。ActivX脱硫生物素-FP丝氨酸水解酶探针、甲酸、乙腈、二硫苏糖醇(DTT)和1步超TMD印迹溶液均购自赛默飞世尔科技公司(马萨诸塞州沃尔瑟姆)。乙酸、10X Tris缓冲盐水(TBS)、碘乙酰胺(IAM)、牛血清白蛋白(BSA)和尿素均购自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))。含EDTA和0.005％v/v表面活性剂P-20(HBS-EP)的HEPES缓冲盐水，购自通用电气公司(GE)(马萨诸塞州波士顿(Boston，MA))。单克隆抗体原料药由再生元制药公司(Regeneron Pharmaceutical Inc.)制造。聚山梨醇酯80购自禾大公司(Croda)(英国东约克郡(East Yorkshire，UK))。兔rLE购自西格玛奥德里奇公司(密苏里州圣路易斯)。人CES-1购自艾博抗公司(Abcam)(英国剑桥(ambridgeUK))。测序级改性胰蛋白酶购自普洛麦格公司(Promega)(威斯康星州麦迪逊(Madison，WI))。Oasis Max柱(2.1x20mm，30μm)和Acquity UPLC BEH C4柱(2.1x50mm，1.7μm)购自沃特世公司(Waters)(马萨诸塞州米尔福德市((Milford，MA))。Acclaim PepMap 100 C18分析柱(0.075x250mm，3μm)和AcclaimPepMap 100 C18捕获柱(0.075x20mm，3μm)购自赛默飞世尔科技公司(马萨诸塞州沃尔瑟姆)。DPBS(10x)购自Gibco公司(Gibco)(马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA))，并且吐温20购自J.T.贝克公司(J.T.Baker)(新泽西州菲利普斯堡(Phillipsburg，NJ))。具有电喷雾电离(ESI)源的Q-Exactive Plus购自赛默飞世尔科技公司(马萨诸塞州沃尔瑟姆)。
用于分析聚山梨醇酯降解的二维液相色谱-带电气溶胶检测(CAD)/质谱(MS)方法。
如Genentech先前所描述的，通过二维HPLC-CAD/MS方法分析了PS20和PS80在CHO无细胞培养基或调配的抗体中的降解(Yi Li等人，多维超高效液相色谱-带电气溶胶检测-质谱法对治疗性单克隆抗体调配物中聚山梨醇酯20的表征和稳定性研究(Characterization and Stability Study of Polysorbate 20 in TherapeuticMonoclonal Antibo dy Formulation by Multidimensional Ultrahigh-PerformanceLiquid Chromatography-Charged Aerosol Detection-Mass Spectrometry)，86《分析化学(ANALYTICAL CHEMISTRY)》5150-5157(2014))。首先使用Oasis MAX柱(2.1×20mm，30μm)，用99％溶剂A(含0.1％甲酸的水)和1％溶剂B(含0.1％甲酸的乙腈)预平衡，从调配的mAb中分离出聚山梨醇酯。样品注入后，将平衡梯度保持1分钟，然后在4分钟内将溶剂B线性增加到15％，以将聚山梨醇酯与mAb分离。然后使用开关阀将洗脱的聚山梨醇酯转移到AcquityBEH C4柱(2.1×50mm，1.7μm)以进行基于反相色谱的分离。在分离开始时，溶剂B在1.5分钟内迅速增加至20％，然后在45分钟内逐渐增加到99％并保持5分钟，随后进行1％B的平衡步骤，持续5分钟。将流速保持在0.1毫升/分钟并将柱温保持在40℃。
2D-LC系统配备由Thermo UltiMate 3000并与Corona Ultra CAD检测器耦接，在75psi的氮气压力下操作以进行定量。Chromeleon7用于系统控制和数据分析。将具有ESI源的Q-Exactive Plus与2D-LC系统耦接以仅用于表征。仪器在阳性模式下操作，其中毛细管电压为3.8kV，毛细管温度为350℃，鞘流速为40，以及辅助流速为10。在150-2000的m/z范围内收集全扫描光谱。使用Thermo Xcalibur软件收集并分析MS数据。
从CAD色谱中获得每种酯的峰面积，并且相加以说明完整的PS80。降解之后的PS80的剩余百分比通过比较每个时间点25分钟与30分钟之间单酯洗脱的峰面积之和与时间零点的峰面积总和来计算。不同阶酯或总酯的相对百分比可以类似地计算。
用人CES-1、兔LES和调配的抗体进行PS80降解测定。
通过将2μL 0.1mg/mL人CES-1或0.02mg/mL兔LES与2μL 1％PS80在pH 6.0下的16μL 10mM组氨酸缓冲液中混合随后在4℃下分别温育1.5小时、8小时和18小时来检查人CES-1和兔LES对PS80的影响。在LC-CAD分析之前，通过添加pH 6.0的72μL 10mM组氨酸将每种溶液的一份等分试样(3μL)稀释25次。
通过将18μL 50mg/mL mAb(缓冲液交换到10mM组氨酸，pH 6.0)与2μL 1％PS80混合，然后在5℃下温育持续18小时、24小时和36小时来检查调配的mAb中PS80的水解。在LC-CAD分析之前将每种溶液的一份等分试样(3μL)用pH 6.0的10mM组氨酸稀释25次。
抑制来自源自CHO的抗体的脂肪酶。
将ActivX脱硫生物素-FP丝氨酸水解酶探针在DMSO中稀释到0.1mM作为储备溶液。将等分的1.25μL、5μL和20μL探针储备溶液分别在最终体积为1mL的1X PBS中与5mg mAb混合，随后在室温下缓慢旋转持续1小时。然后将每种混合物缓冲液更换为pH 6.0的10mM组氨酸以去除游离探针，并将mAb浓度调节到50mg/mL。将每种缓冲液更换的样品与0.1％PS80在5℃下温育，随后进行LC-CAD PS80降解测定。
从源自CHO的抗体耗竭脂肪酶。
通过使用固定化的ActivX脱硫生物素-FP丝氨酸水解酶探针进行脂肪酶耗竭实验。为了固定探针，首先通过在室温下缓慢旋转持续2小时，将35μL ActivX脱硫生物素-FP丝氨酸水解酶探针(在DMSO中的0.1mM储备溶液)与2mg链霉亲和素Dynabead在1X PBS中偶联，达到最终体积为1mL。通过将35μL DMSO与2mg链霉亲和素Dynabead在1X中混合达到最终体积为1mL，并在室温下缓慢旋转持续2小时来制备过程对照样品。将珠用1X PBS洗涤3次，并且然后重新悬浮到800μL 1 X PBS中。然后将5mg mAb样品添加到FP探针偶联的链霉亲和素Dynabead中，并在室温下缓慢旋转温育持续1小时。将上清液缓冲液更换为pH 6.0的10mM组氨酸，并将mAb浓度调节到50mg/mL。然后将缓冲液更换的上清液样品与0.1％PS80在5℃下孵育，随后进行LC-CAD PS80降解测定。
用ABPP检测源自CHO的抗体中的宿主细胞蛋白(HCP)。
将ActivX脱硫生物素-FP丝氨酸水解酶探针在DMSO中稀释到0.1mM作为储备溶液。首先将等分的20μL探针储备溶液在1 X PBS中与5mg mAb混合达到最终体积为1mL，随后在室温下缓慢旋转持续1小时。通过过滤去除游离探针，并通过PBS中的5M尿素回收蛋白质。向溶液中添加2mg链霉亲和素Dynabead，并在室温下缓慢旋转温育持续2小时。去除上清液后，通过磁体收集Dynabead，并通过PBS中的5M尿素洗涤，并且然后用5mM TCEP将其重新悬浮到5M尿素/50mM tris溶液中。将蛋白质在55℃下变性并还原持续30分钟，并且然后在黑暗中用10mM碘乙酰胺温育持续30分钟。将烷基化的蛋白质稀释5次，并在37℃下用1μg胰蛋白酶消化过夜。通过磁体去除Dynabead，并通过5μL的10％FA酸化含肽混合物的上清液，使用GL-TipTM SDB脱盐尖端(日本GL公司(GL science，Japan))脱盐，并重新悬浮到40μL 0.1％FA中。将15μL转移到Eppendorf管以进行纳米LC-MS/MS分析，并将其余储存在-80℃下。通过在80℃下加热mAb样品持续5分钟来首先变性所有蛋白质，以防止宿主细胞蛋白与ActivX脱硫生物素-FP丝氨酸水解酶探针结合来进行阴性对照。
LC-MS/MS分析。
将肽混合物溶解在40μL的0.1％甲酸(FA)中，并且首先将10μL负载到20cm x0.075mm Acclaim PepMap 100 C18捕获柱(赛默飞世尔科技公司)上进行脱盐，并且之后在UltiMate 3000 nanoLC(赛默飞世尔科技公司)中的250mm x 0.075mm Acclaim PepMap100 C18分析柱上进行分离。流动相A由含0.1％FA的超纯水制成，并且流动相B由含0.1％FA的80％ACN制成。用2％-32％的缓冲液B的150分钟线性梯度以300纳升/分钟的流速分离肽。将UltiMate 3000 nanoLC与Q-Exactive HFX质谱仪(赛默飞世尔科技公司)耦接。质谱仪在数据相关模式下操作，其中10个最强离子经受更高能量的碰撞解离(HCD)片段，其中归一化碰撞能量(NCE)为27％、AGC 3e6、每次全ms扫描的最大注入时间为60毫秒(来自分辨率为120,000的m/z 375-1500)和AGC 1e5，MS/MS事件的最大注入时间为60毫秒(来自分辨率为30,000的m/z 200-2000)。
mAb-1直接消化。
将100μg的mAb-1用高速真空干燥，然后用含有10mM DTT的20μL 8M尿素重建。将蛋白质在55℃下变性并还原持续30分钟，并且然后在黑暗中用6μL的50mg/mL碘乙酰胺温育持续30分钟。将烷基化的蛋白质在37℃下用100μL 0.1μg/tL胰蛋白酶消化过夜。用5μL 10％TFA酸化肽混合物。将样品稀释到0.4μg/μL，并将2μL注入柱上以进行LC-MS/MS分析。
mAb-1中的CES-B1L和CES-1L的PRM分析。
将样品(0.8μg)的直接消化负载到20cm x 0.075mm Acclaim PepMap 100 C18捕获柱(赛默飞世尔科技公司)上进行脱盐，并且之后在UltiMate 3000 nanoLC(赛默飞世尔科技公司)中的250mm x 0.075mm Acclaim PepMap 100 C18分析柱上进行分离。用98％流动相A(由含0.1％甲酸的水制成)和2％流动相B(由含0.1％甲酸的80％ACN制成)以300纳升/分钟的流速预平衡柱。样品注射后，在100分钟内施加2％到37％流动相B的线性梯度以分离肽。质谱数据是通过平行反应监测(PRM)获得的，所述平行反应监测靶向来自CES-1L的3种肽LNVQGDTK[m/z437.73512+]、AISESGVILVPGLFTK[m/z 815.97442+]和ENHAFVPTVLDGVLLPK[m/z 925.01452+]、来自CES-B1L的3种肽APEEILAEK[m/z 500.27152+]、DGASEEETNLSK[m/z 640.28612+]和IRDGVLDILGDLTFGIPSVIVSR[m/z 819.13553+]以及来自mAb-1的3种肽GPSVFPLAPCSR[644.32932+]、LLIYDASNRPTGIPAR[586.32833+]和STSESTAALGCLVK[712.35852+]。在所有实验中，相对于m/z 200(AGC靶1e6，60毫秒最长注入时间，m/z 350-2000)，在120,000分辨率下的全质谱之后进行了30,000分辨率的定时PRM扫描(AGC靶1e5，100毫秒最长注入时间)。较高能量的碰撞解离(HCD)使用27eV归一化碰撞能量和2m/z的隔离窗口进行MS/MS分析。
实例1.通过2D-LC-CAD/MS检测mAb调配物中的聚山梨醇酯
按照Yi Li等人，supra和Oleg V.Borisov等人，通过应用液相色谱-质谱和计算机辅助数据分析来理解聚山梨醇酯的分子异质性(Toward Understanding MolecularHeterogeneity of Polysorbates by Application of Liquid Chromatography-MassSpectrometry with Computer-Aided Data Analysis)，83《分析化学》3934-3942(2011)的略微修改的方法，通过2D-LC-CAD/MS分离、鉴定和定量调配的mAb中的聚山梨醇酯。设计的OasisMax柱的第一维LC用于去除mAb，并且基于其脂肪酸含量和类型实施第二维反相色谱以分离剩余的POE和POE酯。PS80物种按照POE、POE异山梨醇、POE山梨糖醇、单酯、二酯、三酯和四酯的顺序洗脱(图1，右图)。基于聚合物的化学式和源内片段产生的二氧戊酰离子，通过质谱阐明了每种酯的结构。图1右图A是PS80的代表性总离子电流(TIC)色谱，其中按照以下洗脱顺序标记了主峰：POE-POE异山梨醇-POE山梨糖醇、POE山梨糖醇单油酸酯、POE山梨糖醇单油酸酯、POE异山梨醇单油酸酯和POE单油酸酯、POE山梨糖醇亚油酸酯/油酸二酯、POE山梨糖醇二油酸酯、POE异山梨醇二油酸酯和POE二油酸酯，可能是POE异山梨醇/POE亚油酸酯/油酸二酯和POE山梨糖醇混合的三油酸酯和四油酸酯。应当注意，图1中的峰8被标记为可能的POE异山梨醇/POE亚油酸酯/油酸二酯混合器，因为质谱太复杂而无法解释。聚山梨醇酯的定量通过带电气溶胶检测(CAD)色谱分析确定(图1，右图B)。
实例2.mAb-1调配物中PS80的快速降解
在5℃下储存36小时期间，观察到mAb-1中的PS80的快速降解。在25分钟到30分钟之间洗脱的峰出现了显著下降，代表POE单酯，即POE山梨糖醇单油酸酯、POE山梨糖醇单油酸酯、POE异山梨醇单油酸酯和POE单油酸酯，而在10分钟到18分钟之间洗脱的POE示出了显著增加(图2)。在32-45分钟之间洗脱的POE二酯、三酯和四酯没有变化。这种独特的降解模式表明其更有可能是一个脂肪酶/酯酶家族负责PS80降解。此水解酶家族只能降解PS80的单酯部分，而不接触高阶酯。如果多于一种类型的水解酶参与降解，则降解模式将会更加复杂。
实例3.脱硫生物素-氟膦酸盐(FP)探针抑制脂肪酶导致PS80降解消失
因为据报道降解聚山梨醇酯的大多数脂肪酶属于丝氨酸水解酶家族，使用FP探针进行了抑制实验。此实验能够鉴定并区分酶活性水解与其它非活性水解的酶原形式或内源性抑制剂。此实验的基本原理是，如果存在任何活性丝氨酸水解酶，添加其抑制剂会阻止酶发挥作用，在案例中，降解PS80。脱硫生物素-FP探针是可商购获得的含有活性氟膦酸盐基团的丝氨酸水解酶探针之一，所述活性氟膦酸盐基团在丝氨酸型水解酶的催化中心与Ser形成共价键并阻断其酶活性。抑制实验清楚地表明，通过添加仅0.125μM的FP探针，酶活性完全停止(图3)。此实验还表明，由于脱硫生物素-FP探针对丝氨酸水解酶具有特异性，因此调配的药物中仅呈递丝氨酸类型的脂肪酶。
实例4.脱硫生物素-氟膦酸盐(FP)探针耗竭脂肪酶导致调配的mAb中的PS80降解减少
然后，使用固定的ActivX FP丝氨酸水解酶探针进行脂肪酶的耗竭。探针的生物素部分可以被捕获并固定在链霉亲和素表面上，从而允许富集和纯化所捕获的丝氨酸水解酶。耗竭实验的设计有两个目标：1)如果PS80降解是由属于丝氨酸水解酶家族的脂肪酶引起的，则耗竭将导致PS80降解减少；2)可以通过质谱分析进一步鉴定脱硫生物素-FP探针上所捕获的脂肪酶。
按照图4中所示出的mAb的耗竭方案，按照材料和方法一节所概述的进行耗竭实验。脱硫生物素-FP探针与链霉亲和素Dynabead偶联以耗竭脂肪酶。如在图5中所示出的，在脂肪酶耗竭之前，在5℃下温育18小时后，观察到mAb-1中大约44.7％的PS80单酯降解。另外18小时的温育导致PS80单酯完全丧失。脂肪酶耗竭后，在温育18小时或36小时后，观察到小于8％的PS80降解。耗竭结果表明，降解mAb-1中PS80的脂肪酶被脱硫生物素-FP探针去除。为了确保与脂肪酶相互作用的是探针而不是链霉亲和素磁珠，通过引入过程对照样品进行实验。通过仅将mAb-1与链霉亲和素磁珠混合而不添加脱硫生物素-FP探针来产生过程对照样品。在5℃下温育18小时和36小时后，分别观察到mAb1中大约29％和86％的PS80降解，从而表明脂肪酶与磁珠之间存在某些非特异性相互作用。与FP探针相比，通过非特异性相互作用去除的脂肪酶明显较少，因此，大部分脂肪酶通过固定化的FP探针与脂肪酶之间的特异性结合去除。
实例5.在来自mAb-1的FP探针富集级分中鉴定肝羧酸酯酶
如在材料和方法部分中所描述的，对脱硫生物素-FP探针所捕获的宿主细胞蛋白进行胰蛋白酶消化和质谱分析。在经鉴定的15种宿主细胞蛋白中(表1)，首次鉴定了CES-B1L和CES-1L。通过与变性的对照样品进行比较(表2)，得出结论，两种蛋白质均是通过与FP探针特异性结合捕获的。CES-1L仅以活性形式鉴定，而未以变性形式鉴定，从而表明其在mAb-1中具有生物活性。CES-B1L以活性形式鉴定为具有13种独特肽，而变性的形式中仅有2种独特肽，从而表明少量的CES-B1L蛋白能够与磁珠非特异性地结合，并且结果与耗竭实验中的过程对照结果一致(图5)。然而，在活性形式中鉴定出的独特肽的数量要高得多，从而表明CES-B1L也是PS80降解的原因。对于其它经鉴定的宿主细胞蛋白，大多数可以很容易地确定为非活性酶，因为发现其在两种条件下都具有相似数量的独特肽，例如cullin-9样蛋白和铜蓝蛋白。阴离子胰蛋白酶-2被鉴定为mAb-1的活性形式，因为其也是一种丝氨酸蛋白酶，但由于其充当与PS80降解无关的蛋白酶，因此可以被排除在外。另外两种共捕获的蛋白质，即肌动蛋白和膜联蛋白，由于缺乏酶功能，也可以被排除在降解PS80之外。
为了确定新鉴定的脂肪酶CES-B1L和CES-1L的丰度，进行了PRM分析。测定的CES-B1L和CES-1L的浓度分别为9.6ppm和9.0ppm。这两种脂肪酶的丰度相对较低，从而表明其降解PS80的酶活性很强。
表1.FP探针在天然mAb-1中鉴定的富集的宿主细胞蛋白
Figure BDA0003817365290000341
Figure BDA0003817365290000351
表2.FP探针在变性的mAb-1中鉴定的富集的宿主细胞蛋白
mAb-1中的蛋白质(变性的) 登录号 独特肽的数量
Cullin-9样蛋白 A0A061IMU7 7
转甲状腺素蛋白 G3I4M9 4
泛素-40S核糖体蛋白S27a样蛋白 A0A061IQ58 3
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 A0A061IDP2 3
过氧化物还原酶-1 Q9JKY1 3
维生素D-结合蛋白 G3IHJ6 3
铜蓝蛋白 A0A061INJ7 2
酪氨酸蛋白激酶受体 G3HG67 2
桥粒胶蛋白-2样蛋白 A0A061IEG0 2
肝羧酸酯酶B1样蛋白 A0A061I7X9 2
连接桥粒斑珠蛋白(Junction plakoglobin) G3HLU9 1
实例6.PS80与人肝羧酸酯酶1和兔肝酯酶的降解模式
HCP分析中一个常见且重要的实践是验证脂肪酶活性的功能。抑制和耗竭实验提供了CES-B1L和CES-1L很可能是负责PS80降解的脂肪酶的强有力的证据。然而，考虑到所使用的FP探针不是针对单个蛋白质而是针对蛋白质的家族，因此在药物产品中呈递的其它脂肪酶也可能在降解途径中发挥作用。掺入实验可以对可疑脂肪酶是否是PS80降解的根本原因提供基本验证。如果掺入的脂肪酶可以产生与内源性脂肪酶完全相同的降解模式，则可以确认经鉴定的脂肪酶是PS降解的关键元素。由于缺乏可用的活性脂肪酶，因此这一确认通常很困难。为了进一步确认这两种新鉴定的脂肪酶的作用，进行了BLAST搜索。搜索结果表明，可商购获得的兔肝酯酶和人肝羧酸酯酶1在功能上相似，其中分别与CES-B1L和CES-1L的第一片段具有56.0％和69.7％的序列同源性(图6D)。选择人肝羧酸酯酶1和兔肝酯酶两者来比较作为mAb-1的PS80降解模式。图6示出了人和兔肝酯酶两者均表现出与在mAb-1中所示出的降解模式相同的降解模式(图6，A-C)。在所有三个样品中，PS80的快速降解的组分为在25到30分钟之间洗脱的单酯，而32分钟后洗脱的二酯、三酯和四酯保持不变。已知脂肪酶的特征降解模式实验证实，CES-B1L和CES-1L负责mAb-1中的PS80降解。

Claims (55)

1.一种从样品中耗竭脂肪酶的方法，所述方法包括：
使包含脂肪酶的所述样品与探针接触，所述探针能够与所述脂肪酶结合以形成复合物；以及
从所述样品中分离所述复合物以由此从所述样品中耗竭所述脂肪酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包括所关注的蛋白质。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品包括聚山梨醇酯赋形剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述聚山梨醇酯赋形剂选自聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-80或其组合。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪酶是肝羧酸酯酶B1样蛋白。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪酶是肝羧酸酯酶1样蛋白。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述探针能够与固体载体连接。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述固体载体是琼脂糖珠。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述固体载体是磁珠。
10.根据权利要求1所述的方法，其中使用配体将所述探针与固体载体连接。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述配体可为指示剂、生物素分子、经修饰的生物素分子、细胞核、序列、表位标签、缺电子分子或富电子分子。
12.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括从所述复合物中回收所述脂肪酶。
13.一种纯化具有所关注的蛋白质和脂肪酶的样品的方法，所述方法包括：
使所述样品与探针接触，所述探针能够与所述脂肪酶结合以形成复合物；以及
从所述样品中分离所述复合物以由此纯化所述样品中的所述所关注的蛋白质。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述样品包括聚山梨醇酯赋形剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述聚山梨醇酯赋形剂选自聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-80或其组合。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述脂肪酶是肝羧酸酯酶B1样蛋白。
17.根据权利要求13所述的方法，其中所述脂肪酶是肝羧酸酯酶1样蛋白。
18.根据权利要求13所述的方法，其中所述探针能够与固体载体连接。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述固体载体是琼脂糖珠。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述固体载体是磁珠。
21.根据权利要求13所述的方法，其中使用配体将所述探针与固体载体连接。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述配体可为指示剂、生物素分子、经修饰的生物素分子、细胞核、序列、表位标签、缺电子分子或富电子分子。
23.根据权利要求13所述的方法，其进一步包括从所述复合物中回收所述脂肪酶。
24.一种减少样品中的聚山梨醇酯降解的方法，所述方法包括：
使包含脂肪酶和聚山梨醇酯的所述样品与探针接触，所述探针能够与所述脂肪酶结合以形成复合物；以及
从所述样品中分离所述复合物以由此减少所述样品中的聚山梨醇酯降解。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述样品进一步包括所关注的蛋白质。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述聚山梨醇酯选自聚山梨醇酯-20、聚山梨醇酯-60、聚山梨醇酯-80或其组合。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述脂肪酶是肝羧酸酯酶B1样蛋白。
28.根据权利要求24所述的方法，其中所述脂肪酶是肝羧酸酯酶1样蛋白。
29.根据权利要求24所述的方法，其中所述探针能够与固体载体连接。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述固体载体是琼脂糖珠。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述固体载体是磁珠。
32.根据权利要求24所述的方法，其中使用配体将所述探针与固体载体连接。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述配体可为指示剂、生物素分子、经修饰的生物素分子、细胞核、序列、表位标签、缺电子分子或富电子分子。
34.根据权利要求24所述的方法，其进一步包括从所述复合物中回收所述脂肪酶。
35.一种组合物，其具有从哺乳动物细胞中纯化的所关注的蛋白质、表面活性剂和残余量的肝羧酸酯酶B1样蛋白，其中所述残余量的肝羧酸酯酶B1样蛋白小于约5pprn。
36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯80。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述肝羧酸酯酶B1样蛋白使所述聚山梨醇酯80降解。
38.根据权利要求35所述的组合物，其中所述组合物是肠胃外调配物。
39.根据权利要求36所述的组合物，其中所述组合物中的所述聚山梨醇酯的浓度为约0.01％w/v到约0.2％w/v。
40.根据权利要求35所述的组合物，其中所述所关注的蛋白质选自由以下组成的组：单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、抗体片段和抗体-药物复合物。
41.根据权利要求35所述的组合物，其进一步包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。
42.根据权利要求35所述的组合物，其进一步包括缓冲液，所述缓冲液选自由以下组成的组：组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、藻酸盐缓冲液和精氨酸缓冲液。
43.根据权利要求35所述的组合物，其进一步包括张力改性剂。
44.根据权利要求35所述的组合物，其中所述所关注的蛋白质的浓度为约20mg/mL到约400mg/mL。
45.一种组合物，其具有从哺乳动物细胞中纯化的所关注的蛋白质、表面活性剂和残余量的肝羧酸酯酶1样蛋白，其中残余量的溶酶体酸性脂肪酶小于约5ppm。
46.根据权利要求45所述的组合物，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中所述表面活性剂是聚山梨醇酯80。
48.根据权利要求47所述的组合物，其中所述肝羧酸酯酶1样蛋白使所述聚山梨醇酯80降解。
49.根据权利要求46所述的组合物，其中所述组合物是肠胃外调配物。
50.根据权利要求46所述的组合物，其中所述组合物中的所述聚山梨醇酯的浓度为约0.01％w/v到约0.2％w/v。
51.根据权利要求45所述的组合物，其中所述所关注的蛋白质选自由以下组成的组：单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、抗体片段和抗体-药物复合物。
52.根据权利要求45所述的组合物，其进一步包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。
53.根据权利要求45所述的组合物，其进一步包括缓冲液，所述缓冲液选自由以下组成的组：组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、藻酸盐缓冲液和精氨酸缓冲液。
54.根据权利要求45所述的组合物，其进一步包括张力改性剂。
55.根据权利要求45所述的组合物，其中所述所关注的蛋白质的浓度为约20mg/mL到约400mg/mL。
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