CN115989416A - 用于评估生物制药开发过程中聚山梨醇酯降解风险的高通量、基于荧光的酯酶活性测定法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于检测脂肪分解活性的组合物、方法和试剂盒。在一些实施例中，所述组合物包含水性测定样品和有机溶剂，其中所述有机溶剂包含辛酸4‑甲基伞形酮酯(MU‑C8)。本文还提供了用于确定蛋白质制剂的稳定性的方法。

Description

用于评估生物制药开发过程中聚山梨醇酯降解风险的高通量、基于荧光的酯酶活性测定法
背景技术
基于蛋白质的生物治疗药物在治疗严重疾病诸如多种形式的癌症和免疫介导的疾患方面取得了巨大的成功。但是，尽管过去几十年生物治疗药物制造技术取得了进步，但肠胃外蛋白质制剂仅限于少数常用的表面活性剂，每种表面活性剂都有其自身特有的缺点和挑战。聚山梨醇酯(PS)代表生物治疗药物制剂中最常见的一类表面活性剂，并且在蛋白质稳定性、生物相容性和安全性方面树立了标杆。最常用的聚山梨醇酯PS20和PS80由脱水山梨糖醇的核心组成，即经过聚乙氧基化和脂肪酸酯化(在PS20中主要为月桂酸，在PS80中主要为油酸)山梨聚糖与异山梨醇的混合物。聚山梨醇酯的降解可通过氧化或化学水解发生，导致游离脂肪酸(FFA)的积累。随时间推移(在药物产品的保质期内)的降解是一个问题，因为它可能导致：(i)由于聚山梨醇酯降解物的不溶性物质而产生可见颗粒物；(ii)对蛋白质质量的不利影响；(iii)表面活性剂浓度降低，导致蛋白质对界面应力的保护不足；(iv)药物产品安全性特征的潜在差异。
引起PS降解的一个主要因素是宿主细胞蛋白质(HCP)。基于蛋白质的治疗剂通常通过在哺乳动物或微生物细胞培养物中表达治疗性蛋白质来产生。通过从细胞培养上清液中分离表达的靶蛋白来制备蛋白质制剂。除表达治疗性蛋白质以外，这些细胞培养物还产生其自身的天然蛋白质(即HCP)，这些蛋白质可能污染蛋白质制剂并且使聚山梨醇酯水解。下游纯化工艺去除包含治疗性蛋白质的上清液中存在的大部分HCP；但是，通常残留痕量的HCP。有时在蛋白质制剂中鉴别出并且与水解降解相关联的HCP蛋白质的实例包括溶酶体磷脂酶A2(LPLA2),假定磷脂酶B样2(PLBL2)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、肝羧酸酯酶B-1样(CES-B1L)和肝羧酸酯酶1样(CES-1L)。由于典型药物产品(DP)中水解酶(HCP)的量极低，并且PS降解可能归因于一种或多种具有高催化活性的酶，因此难以测量给定蛋白质制剂中引起HCP降解的全部范围和种类。
已经开发出多种方法来检测聚山梨醇酯降解。高效液相色谱(HPLC)与蒸发光散射检测器(ELSD)联用，为测量和定量溶液中完整的聚山梨醇酯提供了有用的工具。配备ELSD的缓梯度反相色谱法可以对聚山梨醇酯和亚种进行分离和定性评估，但无法实现稳健的定量。最近报道了一种FFA测定法的开发和实施，该测定法可使用配备光电二极管阵列(PDA)检测器的反相超高效液相色谱(UHPLC)对聚山梨醇酯溶液中存在的脂肪酸进行定量。还已报道了其他质谱方法用于对聚山梨醇酯降解的产物进行定量。这些方法耗费时间，并且在发生足够程度的降解之前不具有检测聚山梨醇酯含量变化的灵敏度。
最近开发的用于检测酯酶活性的方法使用荧光或显色底物，这些底物已被修饰为含有脂肪酸侧链以模拟聚山梨醇酯酯键。伞形酮的酰氧基甲基醚和1-酰氧基-1-氰基-3-丙醚已被鉴别为用于酯酶和脂肪酶检测的稳定的荧光底物，因为它们与高碘酸盐和牛血清白蛋白发生二次反应。还已报道了使用4-甲基伞形酮(MU)的终点和动力学测定法。最后，还已报道可商购获得的试剂盒(如EnzChekTM)对LPL具有高敏感度，并且可作为监测脂肪酶活性的有用工具。
蛋白质治疗剂溶液中存在的痕量水解酶可能难以检测。因此，需要用于快速高通量检测这些酶的改进方法。
发明内容
在各种实施例中，本公开涉及一种用于确定样品中的宿主细胞蛋白质(HCP)的酶活性的测定法，其中HCP包含水解酶，该测定法包括以下步骤：在微孔板中获得反应混合物，其中反应混合物包含：样品、反应缓冲液和作为荧光底物的4-甲基伞形酮羧酸酯；获得阴性对照；将反应混合物和阴性对照暴露于荧光信号；监测由于暴露于荧光信号引起的反应混合物中的荧光底物从非荧光状态到荧光产物的转化，其中荧光产物为4-甲基伞形酮(MU)；以及基于荧光底物的转化来确定和定量HCP酶活性。
在各种实施例中，样品包含两种或更多种不同的HCP。在各种实施例中，HCP酶活性代表样品中的两种或更多种HCP的总体活性。在各种实施例中，反应混合物包含至少两种不同的荧光底物。在各种实施例中，HCP包括酯酶。在各种实施例中，HCP包括羧酸酯水解酶，并且其中HCP任选地包括脂肪酶和羧酸酯酶。在各种实施例中，荧光底物具有8、10、12、16和/或18的碳链长度。在各种实施例中，荧光底物为辛酸4-甲基伞形酮酯(MU-C8)。在各种实施例中，荧光底物为癸酸4-甲基伞形酮酯(MU-C10)。
在各种实施例中，样品包含来自原核或真核宿主的产物。在各种实施例中，样品包含由原核或真核宿主产生的重组蛋白。在各种实施例中，样品包含由细菌或哺乳动物宿主产生的重组蛋白。在各种实施例中，样品包含由原核或真核宿主产生的重组蛋白。在各种实施例中，样品包含基于IgG形式并且由细菌或哺乳动物宿主产生的重组蛋白。在各种实施例中，样品包含基于IgG形式并且由大肠杆菌或中国仓鼠卵巢(CHO)宿主产生的重组蛋白。
在各种实施例中，样品包含选自由以下项组成的组的重组蛋白：IgG1 mAb、IgG4mAb、双特异性抗体；由细菌宿主产生的mAb和由哺乳动物宿主产生的mAb。
在各种实施例中，阴性对照为酶空白。在各种实施例中，反应混合物中的荧光底物具有约0.1mM至5mM、约0.1mM至4mM、约0.1mM至3mM、约0.1mM至2mM或约0.5mM至1.0mM的浓度。在各种实施例中，样品为经过层析纯化的合并物样品。在各种实施例中，使用分别为300nm至400nm和400nm至500nm、任选地分别为约355nm和460nm的激发波长和发射波长，将样品暴露于增加的荧光信号下。在各种实施例中，孵育该样品任选地持续约1小时至5小时、约1小时至4小时、约1小时至3小时或约2小时。在各种实施例中，每5分钟至15分钟监测所述样品，或其中任选地每10分钟监测所述样品。在各种实施例中，反应混合物具有约4至9、约5至9、约6至9、约7至9或约8的pH。
在各种实施例中，酶活性用于评估样品中对聚山梨醇酯降解的水解活性水平。在各种实施例中，该测定法的输出用于比较和选择纯化工艺以改善水解HCP的去除。
在各种实施例中，本公开涉及一种用于确定样品中的宿主细胞蛋白质(HCP)的酶活性的测定法，其中HCP包含水解酶，并且该测定法包括以下步骤：(a)获得包含样品、反应缓冲液和荧光底物的反应混合物，其中荧光底物为4-甲基伞形酮羧酸酯，其中4-甲基伞形酮羧酸酯中的羧酸酯包含不超过十个碳；(b)在一个或多个时间点测量荧光信号；以及(c)基于测量的荧光确定和定量HCP酶活性。在各种实施例中，4-甲基伞形酮羧酸酯中的羧酸酯包含不超过8个碳。
在各种实施例中，4-甲基伞形酮羧酸酯为MU-C8。在各种实施例中，4-甲基伞形酮羧酸酯为MU-C10。在各种实施例中，在步骤c)中确定和定量的HCP酶活性代表样品中的两种或更多种HCP的总体活性。在各种实施例中，该测定法进一步包括：获得阴性对照，该阴性对照包含与反应混合物相同的反应缓冲液和荧光底物；在相同的一个或多个时间点测量阴性对照的荧光信号；以及通过从反应混合物中观察到的荧光信号的量中减去阴性对照中观察到的荧光信号的量来确定和定量HCP酶活性。在各种实施例中，反应混合物包含至少两种不同的荧光底物。在各种实施例中，HCP包括酯酶。在各种实施例中，HCP包括羧酸酯水解酶，任选地HCP包括脂肪酶和羧酸酯酶。
在各种实施例中，样品包含来自原核或真核宿主的产物。在各种实施例中，样品包含由原核或真核宿主产生的重组蛋白。在各种实施例中，样品包含由细菌或哺乳动物宿主产生的重组蛋白。在各种实施例中，样品包含基于IgG形式并且由细菌或哺乳动物宿主产生的重组蛋白。在各种实施例中，样品包含基于IgG形式并且由大肠杆菌或中国仓鼠卵巢(CHO)宿主产生的重组蛋白。在各种实施例中，样品包含选自由以下项组成的组的重组蛋白：IgG1 mAb、IgG4 mAb、双特异性抗体；由细菌宿主产生的mAb和由哺乳动物宿主产生的mAb。
在各种实施例中，阴性对照为酶空白。在各种实施例中，反应混合物中的荧光底物具有约0.1mM至5mM、约0.1mM至4mM、约0.1mM至3mM、约0.1mM至2mM或约0.5mM至1.0mM的浓度。在各种实施例中，样品为经过层析纯化的合并物样品。在各种实施例中，在步骤b)中，使用分别为300nm至400nm和400nm至500nm、任选地分别为约355nm和约460nm的激发波长和发射波长，将样品暴露于增加的荧光信号下。在各种实施例中，在步骤c)中，将样品任选地孵育约2小时、约1小时至5小时、约1小时至4小时或约1小时至3小时。在各种实施例中，在步骤c)中，每5分钟至15分钟监测所述样品，或其中任选地每10分钟监测所述样品。在各种实施例中，反应混合物具有约4至9、约5至9、约6至9、约7至9或约8的pH。在各种实施例中，酶活性用于评估样品中对聚山梨醇酯降解的水解活性水平。在各种实施例中，该测定法的输出用于比较和选择纯化工艺以改善水解HCP的去除。
在各种实施例中，本公开涉及一种组合物，该组合物包含：(a)水性测定样品，其包含蛋白质制剂；(b)有机溶剂，其包含反应缓冲液和至少一种4-甲基伞形酮羧酸酯；其中荧光底物为4-甲基伞形酮羧酸酯，并且其中4-甲基伞形酮羧酸酯中的羧酸酯包含不超过十个碳原子。
在各种实施例中，本公开涉及一种确定蛋白质制剂的稳定性的方法，其包括：(a)在微孔板中获得反应混合物，其中反应混合物包含：样品、反应缓冲液和作为荧光底物的4-甲基伞形酮羧酸酯；(b)获得阴性对照；(c)将反应混合物和阴性对照暴露于荧光信号；(d)监测由于暴露于荧光信号引起的反应混合物中的荧光底物从非荧光状态到荧光产物的转化，其中荧光产物为4-甲基伞形酮(MU)；以及(e)基于在步骤(d)中荧光底物的转化来确定和定量HCP酶活性。
在各种实施例中，本公开涉及一种优化或选择蛋白质纯化工艺以改善水解HCP的去除的方法，所述方法包括：(a)在微孔板中获得反应混合物，其中反应混合物包含：样品、反应缓冲液和作为荧光底物的4-甲基伞形酮羧酸酯；(b)获得阴性对照；(c)将反应混合物和阴性对照暴露于荧光信号；(d)监测由于暴露于荧光信号引起的反应混合物中的荧光底物从非荧光状态到荧光产物的转化，其中荧光产物为4-甲基伞形酮(MU)；以及(e)基于在步骤(d)中荧光底物的转化来确定和定量HCP酶活性。
附图说明
图1A至1E显示了在测定法开发中使用的底物的化学结构：a)辛酸4-甲基伞形酮酯(MU-C8)；b)癸酸4-甲基伞形酮酯(MU-C10)；c)4-甲基伞形酮基月桂酸酯(MU-C12)；d)4-甲基伞形酮基棕榈酸酯(MU-C16)；e)4-甲基伞形酮基油酸酯(MU-C18:1)。
图2显示了三种模型酶和三种纯化的蛋白质样品对具有不同碳链长度的4-甲基伞形酮底物的酯酶活性速率和底物特异性。测试了PCL(20ng/ml)、LPLA2(20ng/ml)、PLBL2(400μg/ml)和纯化的蛋白质样品(纯，mAb 1至mAb 3，150mg/ml至225mg/ml)。结果报告为来自单个板的重复样品的平均值；误差线代表距平均值±1SD。
图3A至3B显示了使用MU-C8作为荧光底物的酯酶活性测定的典型荧光时程曲线。图3A示出在存在和不存在纯化的mAb 2的情况下来自MU-C8孵育的荧光信号随时间的变化。在纯化的mAb 2存在下的荧光代表水解(酶促和非酶促两者)的总量，并且用于计算k原始；在不存在mAb 2的情况下(酶空白)的荧光代表非酶促水解(背景荧光)，并且用于计算k非酶促水解。图3B在不同MU浓度下MU荧光随孵育时间变化的标准曲线(右)。结果报告为来自单个板的重复样品的平均值；误差线代表距平均值±1SD。
图4显示了针对模型酶PCL和LPLA2(50ng/ml，在奥利司他孵育中)和纯化的mAb 1(25mg/ml，在奥利司他孵育中)使用MU-C8底物测量的奥利司他孵育和相应的酯酶活性速率。结果报告为来自单个板的重复样品或对照的平均值。误差条代表距平均值±1SD。
图5A至5C显示了pH对酯酶活性测定的影响。在不含底物的反应缓冲液中的MU荧光的pH依赖性(左上)：结果报告为三个独立板制剂的三次测量值的平均值。反应缓冲液中的MU-C8底物的非酶促水解的pH依赖性(右上)：结果报告为三个独立板制剂的五次测量值的平均值。模型酶PCL和纯化的mAb 2的酯酶活性速率的pH依赖性(底部)：PCL的结果报告为三个独立板制剂的三次测量值的平均值；mAb 2的结果报告为总共八个板上的重复测量值的平均值(在每个pH水平下测试一个板)。显示的pH值代表在完成实验后立即从MU、MU-C8或样品孔中获取的测量值。所有误差条均代表距平均值±1SD。
图6A至6B显示了在荧光底物(MU-C8)存在下不同样品基质得到的荧光(顶部)和非酶促水解(底部)的变化。变化相对于对照(水)进行计算。结果报告为重复孔测量的平均值；误差条代表距平均值±1SD。
图7A至7C显示了针对蛋白质和赋形剂对酯酶活性测定的影响的研究。在存在或不存在180mg/ml的mAb 4的情况下，在不同浓度的LPLA2下计算基于MU-C8水解的酯酶活性速率(左上)。在不同MU浓度(0μM、5μM和10μM)下，在存在(50mg/mL、100mg/mL和200mg/mL)或不存在mAb 1的情况下测量MU荧光(右上)。针对对照样品(无加标)或添加有0.1％PS20或0.1％PS80(底部)的样品测量模型酶PCL、纯化的mAb 1(纯)和纯化的mAb 3(纯)的酯酶活性速率。结果报告为重复孔测量的平均值；误差条代表距平均值±1SD。
图8A至8B显示了用于mAb 5的三种纯化工艺对酯酶活性速率和聚山梨醇酯降解的影响的比较。测试的样品采集自通过用于mAb 5的三种不同纯化方案(过程A、B和C)生成的UFDF合并物。将纯化的样品与荧光MU-C8底物一起孵育，以评估酯酶活性速率(左)：结果报告为重复孔的平均值；误差条代表距平均值±1SD。纯化的样品用PS20配制，并且在40℃孵育7天前后利用HPLC-ELSD方法测量每个样品的PS20含量：结果报告为由重复HPLC进样的平均值所测量的PS20含量下降百分比。
图9A至9B显示了mAb 2样品的PS80降解速率与酯酶活性之间的相关性。使用FFA测定法确定C18:1 FFA释放所引起的PS80的降解速率(左)。使用HPLC-ELSD方法确定PS80含量降低所引起的PS80的降解速率(右)。测量在25℃孵育42天前后采集的样品中的PS80降解。使用MU-C8底物测量相同样品(未孵育42天)的酯酶活性速率。测试的样品源自应用于CHO(中国仓鼠卵巢)细胞培养收获物的两种不同的纯化工艺方案；这些mAb 2样品涵盖纯化工艺(亲和色谱、离子交换色谱和UFDF)中的多个阶段。结果报告为重复孔的平均值；误差条代表距平均值±1SD。
具体实施方式
本公开涉及用于检测酶活性、用于检测聚山梨醇酯降解和用于确定蛋白质制剂的稳定性的组合物、方法和试剂盒。现已开发出一种快速、高通量、基于荧光的酯酶活性测定法，并且可用作生物工艺开发的定量和风险评估工具。本文进一步提供了组合物，这些组合物包含：水性测定样品，其包含蛋白质制剂；以及有机溶剂，其包含反应缓冲液和至少一种荧光底物，其中荧光底物为4-甲基伞形酮羧酸酯，并且其中4-甲基伞形酮羧酸酯中的羧酸酯包含不超过十个碳。本文提供的组合物和方法进一步用于确定蛋白质制剂的稳定性，和/或用于优化或选择蛋白质纯化工艺以改进水解HCP的去除。
利用本文所公开的该测定法测量的酯酶活性速率已被证明与聚山梨醇酯降解速率相关。在各种实施例中，通过荧光底物中的羧酸酯键的水解测量的增加的酯酶活性对应于降低的PS20含量、降低的PS80含量和/或增加的FFA。本文所公开的方法提供了一种适用于以快速、高通量的方式评估生物工艺开发过程中聚山梨醇酯降解风险的测定法。已发现本文所公开的测定法灵敏、广泛适用并且与多种纯化的蛋白质和纯化过程中合并物样品类型和基质相容。
在各种实施例中，提供了一种测量蛋白质样品中的宿主细胞蛋白质的酶活性第方法。此类测定法可涉及获得包含蛋白质样品、反应缓冲液和荧光底物的反应混合物。下文详细提供了代表性蛋白质样品、反应缓冲液和荧光底物的非限制性实例。在各种实施例中，在一个或多个时间点测量由反应混合物发射的荧光信号随时间的变化。本文所公开的各种实施例的益处之一在于，该测定法提供了对酶活性的快速、高通量确定。在各种实施例中，在0小时、0.1小时、0.2小时、0.3小时、0.4小时、0.5小时、0.6小时、0.7小时、0.8小时、0.9小时、1小时、1.1小时、1.2小时、1.3小时、1.4小时、1.5小时、1.6小时、1.7小时、1.8小时、1.9小时、2小时、2.5小时和/或三小时时测量荧光。在各种实施例中，在30分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时或3小时的时间段内连续测量荧光。
在各种实施例中，由反应混合物发射的荧光的量代表反应混合物中存在的HCP酶活性的量。但是，在各种实施例中，荧光量也可以代表非酶促活性，并且可能需要阴性对照。在各种实施例中，针对每个反应混合物/蛋白质样品获得酶空白反应(即，阴性对照)，该酶空白反应具有与样品相同的缓冲液基质，但从溶液中省去了蛋白质。在各种实施例中，该空白反应测量底物的非酶促水解，并且从反应混合物/蛋白质样品中测量的总水解活性中减去，以得出样品的酶活性。酶空白反应速率代表特定样品基质中的底物的非酶促水解速率(k非酶促水解)。一些样品背景(例如乙酸盐、组氨酸、精氨酸和硫酸盐)改变MU反应产物的荧光信号或影响非酶促水解的速率。因此，在计算酯酶活性速率时，从总体荧光信号中减去背景荧光非常重要。通过提供短于3小时的总周转时间(其明显短于传统的表面活性剂加标和孵育方法以及迄今为止报道的其他活性测定法)，该测定法可支持在生物制药开发过程中更快速地评估聚山梨醇酯降解风险。
在一些实施例中，并行测量对照样品和水性测定样品中的脂肪分解活性。在一些实施例中，本公开提供一种检测水性测定样品中的酶活性的方法，该方法包括：(a)将包含蛋白质制剂的水性测定样品与包含4-甲基伞形酮基羧酸酯(4Mu)的有机溶剂合并以形成测定组合物；(b)将包含蛋白质制剂和脂肪酶抑制剂的对照样品与包含4-甲基伞形酮基羧酸酯(4Mu)的有机溶剂合并以形成对照组合物；以及(c)通过荧光测量测定组合物和对照组合物中羧酸酯和4-甲基伞形酮(4Mu)的形成。在一些实施例中，(a)的蛋白质制剂和(b)的蛋白质制剂由相同的蛋白质制剂提供。例如，获得来自细胞培养物的蛋白质制剂，可从其中取出两个等分试样。一个等分试样可为水性测定样品的蛋白质制剂，而另一等分试样可为对照样品的蛋白质制剂。在一些实施例中，(a)的蛋白质制剂和(b)的蛋白质制剂包含实质上相同的组分。在一些实施例中，预计(a)的蛋白质制剂与(b)的蛋白质制剂具有相同的酶活性水平。在一些实施例中，除对照样品中的脂肪酶抑制剂外，水性测定样品和对照样品具有实质上相同的组分。在一些实施例中，包含脂肪酶抑制剂的对照样品为阴性对照样品，即预计不会检测到荧光。在一些实施例中，该方法进一步利用阳性对照样品(即，预计其中产生荧光)。在一些实施例中，阳性对照样品包含已知量的4Mu。在一些实施例中，阳性对照样品包含已知量的4-甲基伞形酮基羧酸酯和已知量的活性酶。
如本文所讨论的，具有水解活性的酶可能干扰蛋白质制剂的组分。在一些实施例中，具有水解活性的酶使蛋白质制剂中存在的脂肪酸和/或酯水解。在一些实施例中，具有水解活性的酶使蛋白质制剂中存在的表面活性剂水解。在一些实施例中，表面活性剂的水解降低蛋白质制剂的稳定性。通过使用本文所提供的方法测量水解活性的量，然后可基于测量的水解活性的量确定蛋白质制剂中发生的水解水平，从而确定蛋白质制剂的稳定性。在一些实施例中，本公开提供一种确定蛋白质制剂的稳定性的方法，其包括：(a)将包含蛋白质制剂的水性测定样品与包含4-甲基伞形酮羧酸酯的有机溶剂合并；(b)通过荧光测量羧酸酯和4-甲基伞形酮(4Mu)的形成；以及(c)基于测量的荧光来确定蛋白质制剂的稳定性。例如，相对于对照所增加的荧光将指示存在酶活性，表明赋形剂(例如，表面活性剂诸如聚山梨醇酯)已被水解，从而形成非极性并因此不溶的长链脂肪酸，其可能使蛋白质制剂中的蛋白质不稳定。在一些实施例中，该方法用于确定用于药物制剂的蛋白质制剂的稳定性。
蛋白质制剂
在各种实施例中，本文所公开的本发明涉及检测经过纯化的蛋白质制剂中的宿主细胞蛋白质的酶活性或确定该蛋白质制剂的稳定性的方法。如本文在蛋白质制剂的上下文中所用，“纯化”是指一种过程，其中将一种或多种物质(例如，蛋白质)从复杂混合物(通常为细胞、组织或生物体)中分离出来。“纯化的”蛋白质样品或蛋白质制剂可以指以下样品，其中细胞、组织或生物体的一种或多种非水溶性组分(例如，细胞膜、脂质、聚集蛋白质或核酸以及其他疏水性物质)已被减少或去除并且仅留下可溶性组分(例如，可溶性蛋白质)。如本文所用，“可溶的”可以指物质溶解在某种溶剂(例如，细胞培养基、缓冲液、水或有机溶剂)中的能力。在蛋白质的上下文中，“可溶的”还可以指在某种溶剂(例如，细胞培养基、缓冲液、水或有机溶剂)中不沉淀和/或聚集的蛋白质。
示例性纯化工艺可包括：培养含有目标蛋白质(例如，治疗性蛋白质)的细胞培养物；从培养基中分离细胞；裂解细胞并且分离裂解的细胞以产生含有可溶性组分的细胞培养上清液和含有本文所述的不溶性组分的沉淀；以及使细胞培养上清液经受缓冲液交换、pH调节、离心、过滤(包括例如超滤和/或渗滤)、色谱法或它们的任意组合以产生纯化的蛋白质制剂。在一些实施例中，本公开的纯化的蛋白质制剂通过本文所述的工艺进行纯化。在一些实施例中，本公开的部分纯化的蛋白质制剂已经经受本文所述的纯化工艺的一部分。例如，部分纯化的蛋白质制剂可能尚未经受用于产生纯化的蛋白质制剂的所有缓冲液交换、pH调节、离心、过滤和/或色谱步骤。在一些实施例中，本文所述的细胞培养上清液包括本公开的治疗性蛋白质。在一些实施例中，本文所述的部分纯化的蛋白质制剂包括本公开的治疗性蛋白质。在一些实施例中，本文所述的纯化的蛋白质制剂包括本公开的治疗性蛋白质。
如本文所用，“水性”(例如，水性测定样品)是指其中水为溶剂的溶液或样品。因此，本公开的水性测定样品可包括细胞培养基、缓冲溶液、蛋白质样品等。在一些实施例中，本公开的水性测定样品包含蛋白质制剂。
在一些实施例中，蛋白质制剂为细胞培养上清液。细胞培养物上清液如本文所述，并且可例如从用于产生目标蛋白质的细胞培养物中获得。在一些实施例中，蛋白质为治疗性蛋白质。在一些实施例中，在裂解培养的细胞并且分离可溶性和不溶性组分(例如，通过离心)之后产生细胞培养上清液。本文提供适于培养和蛋白质生产的细胞和细胞系的实例。在一些实施例中，细胞培养上清液包含目标蛋白质(例如，治疗性蛋白质)以及另外的宿主细胞组分。在一些实施例中，该另外的宿主细胞组分包含另外的具有酶活性的宿主细胞蛋白质。在一些实施例中，该另外的宿主细胞蛋白质包含脂肪酶。在一些实施例中，该脂肪酶具有脂肪分解活性。
在一些实施例中，蛋白质制剂为部分纯化的蛋白质制剂。部分纯化的蛋白质制剂如本文所述，并且可例如在经历针对目标蛋白质的部分纯化程序(例如，本文所述的纯化工艺)之后从细胞培养物中获得。在一些实施例中，蛋白质为治疗性蛋白质。在一些实施例中，与细胞培养上清液相比，部分纯化的蛋白质制剂经历了另外的纯化步骤。在一些实施例中，部分纯化的蛋白质制剂包含治疗性蛋白质和宿主细胞的其他组分。在一些实施例中，宿主细胞组分包含宿主细胞蛋白质。在一些实施例中，宿主细胞蛋白质包含脂肪酶。在一些实施例中，该脂肪酶具有脂肪分解活性。在一些实施例中，治疗性蛋白质占部分纯化的蛋白质制剂中所有蛋白质的20％至95％(w/w)、30％至90％(w/w)或40％至80％(w/w)准备。
在一些实施例中，蛋白质制剂为纯化的蛋白质制剂。纯化的蛋白质制剂如本文所述，并且可例如在经历针对目标蛋白质的纯化程序(例如，本文所述的纯化工艺)之后从细胞培养物中获得。在一些实施例中，目标蛋白质为治疗性蛋白质。在一些实施例中，纯化的蛋白质制剂包含治疗性蛋白质和宿主细胞的其他组分。在一些实施例中，宿主细胞组分包含宿主细胞蛋白质。在一些实施例中，宿主细胞蛋白质包含脂肪酶。在一些实施例中，该脂肪酶具有脂肪分解活性。在一些实施例中，治疗性蛋白质占纯化的蛋白质制剂中所有蛋白质的大于70％(w/w)、大于80％(w/w)、大于85％(w/w)、大于90％(w/w)、大于95％(w/w)或大于99％(w/w)。
在一些实施例中，蛋白质制剂包含治疗性蛋白质。治疗性蛋白质的非限制性实例包括抗体(诸如单克隆抗体或多克隆抗体)和抗体片段；基于蛋白质的疫苗(例如，乙型肝炎表面抗原)；血液因子(例如，因子VIII和因子IX)；溶栓剂(例如，组织纤溶酶原激活物)；激素(例如，胰岛素、胰高血糖素、生长激素和促性腺激素)；造血生长因子(例如，促红细胞生成素和集落刺激因子)；干扰素(例如，干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ)；基于白介素的蛋白质(例如，白介素-12)；以及其他蛋白质，诸如肿瘤坏死因子和治疗酶。蛋白质治疗剂的进一步实例描述于例如以下文献中：Dimitrov,Methods Mol Biol 899:1-26(2012)；Lagasse等人,F1000Res 6:113(2017)；以及Protein Therapeutics,Vaughan等人编,2017:Wiley-VCH Verlag。治疗性蛋白质可包括重组蛋白、经修饰的蛋白质和融合蛋白，例如，抗体-药物缀合物、抗体-细胞因子融合物、Fc-融合物、双特异性抗体、多特异性抗体、亲和体融合物、糖基化蛋白和肽以及工程化受体拮抗剂。在一些实施例中，在药物制剂中使用包含治疗性蛋白质的蛋白质制剂。
在一些实施例中，蛋白质制剂包含商业上重要的蛋白质，例如工业酶。在商业上重要的蛋白质可用于多种行业诸如制药、化工生产、生物燃料、食品和饮料以及消费品中。例如，在一些实施例中，蛋白质制剂是在产生所需产物的工艺中使用的酶，或者可以是目标产物。在一些实施例中，在商业上重要的蛋白质用于食品、药物合成、生物燃料、化学或制造行业中。在一些实施例中，工业酶包括但不限于：Palatase Lipozyme、Lipopan、木糖异构酶、菠萝蛋白酶和Noopazyme(用于食品工业中)、纤维素酶和淀粉酶(用于生物染料工业中)、树脂酶(用于纸加工行业中)、酰胺酶(用于化学工业中)、Novozym-435(用于化妆品行业的肉豆蔻酸异丙酯生产中)或枯草杆菌蛋白酶(用于洗涤剂中)。
在一些实施例中，蛋白质制剂包含药物赋形剂。纳入药物赋形剂，例如，以帮助在生产之前、期间或之后加工药物递送系统；保护、支持或增强稳定性、生物利用度或患者可接受性；协助产品识别并且增强总体安全性；协助使用的药物的有效性和/或递送；和/或协助维持药物产品在储存期间的完整性。药物赋形剂的非限制性实例包括表面活性剂、填充剂、稀释剂、粘合剂、悬浮剂、粘度剂、包衣剂、调味剂、崩解剂、着色剂、润滑剂、助流剂、防腐剂、甜味剂等。在一些实施例中，将药物赋形剂加入蛋白质制剂中。在一些实施例中，在纯化之前、之后或期间将药物赋形剂加入蛋白质制剂中。
在一些实施例中，包含治疗性蛋白质的蛋白质制剂经过纯化，然后储存一段时间(例如，少于4小时、少于8小时、少于1天、约1天、约2天、约3天)天、约4天、约5天、约6天、约1周、大于1周、约2周、大于2周、约3周、大于3周、约1个月、大于1个月，约2个月、大于2个月、约3个月或大于3个月)。然后使蛋白质制剂经受本发明的方法以检测脂肪分解活性。
在一些实施例中，药物赋形剂为表面活性剂。如本文所用，“表面活性剂”是指降低两种液体之间的表面张力或界面张力的试剂。在一些实施例中，表面活性剂可通过最大限度减少组合物的一种或多种组分的聚集和/或沉淀和/或改善其溶解度(例如，通过降低表面张力和抑制蛋白质表面吸附；参见例如Agarkhed等人，AAPS PharmSciTech 14:1-9(2013))来稳定组合物(例如，本文所述的蛋白质制剂)。药物组合物中的表面活性剂还可调节活性药物成分(API)的生物利用度；协助API维持首选的多晶型形式；防止聚集或解离；和/或调节活性成分的免疫原性应答。表面活性剂可包括阳离子、阴离子、非离子、两性离子、兼性和/或两性表面活性剂。表面活性剂的非限制性实例包括：聚山梨醇酯(例如，
Figure BDA0004098114000000141
表面活性剂，诸如
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20和
Figure BDA0004098114000000143
80，它们也分别称为聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)，其衍生自用脂肪酸(例如，在聚山梨醇酯20中的月桂酸和在聚山梨醇酯80中的油酸)酯化的乙氧基化山梨聚糖；泰洛沙泊；泊洛沙姆(例如，
Figure BDA0004098114000000144
F68LF、
Figure BDA0004098114000000145
L-G2LF、
Figure BDA0004098114000000146
L62D、
Figure BDA0004098114000000147
F68和
Figure BDA0004098114000000148
P188)；聚氧乙烯蓖麻油(例如，
Figure BDA0004098114000000149
EL)及其衍生物；山梨聚糖酯，也称为司盘类聚氧乙烯硬脂酸酯；卵磷脂；磷脂；聚氧乙烯表面活性剂，例如
Figure BDA00040981140000001410
(例如，
Figure BDA00040981140000001411
X-100)和
Figure BDA00040981140000001412
(例如，
Figure BDA00040981140000001413
35)；以及聚乙氧基化脂肪酸，例如
Figure BDA00040981140000001414
S40、
Figure BDA00040981140000001415
S100和
Figure BDA00040981140000001416
52。
在一些实施例中，表面活性剂包含脂肪酸。在一些实施例中，表面活性剂包含酯。在一些实施例中，表面活性剂为聚山梨醇酯。聚山梨醇酯衍生自用脂肪酸酯化的乙氧基化山梨聚糖的一类化合物，并且包括例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯21、聚山梨醇酯61、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯81和聚山梨醇酯81。在一些实施例中，本文提供的蛋白质制剂博阿可聚山梨醇酯。在一些实施例中，蛋白质制剂中的聚山梨醇酯为聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或它们的组合。
在一些实施例中，表面活性剂为水性测定样品的约0.001％w/v至约2％w/v。在一些实施例中，表面活性剂为水性测定样品的约0.005％w/v至约2％w/v。在一些实施例中，表面活性剂为水性测定样品的约0.01％w/v至约2％w/v。在一些实施例中，表面活性剂为水性测定样品的约0.02％至约1.5％w/v。在一些实施例中，表面活性剂为水性测定样品的约0.03％至约1.0％w/v。在一些实施例中，表面活性剂为水性测定样品的约0.04％至约0.8％w/v。在一些实施例中，表面活性剂为水性测定样品的约0.05％至约0.6％w/v。在一些实施例中，表面活性剂为水性测定样品的约0.06％至约0.4％w/v。在一些实施例中，表面活性剂为水性测定样品的约0.07％至约0.2％w/v。在一些实施例中，表面活性剂为水性测定样品的约0.08％至约0.15％w/v。在一些实施例中，表面活性剂为水性测定样品的约0.09％至约0.10％w/v。在一些实施例中，表面活性剂为水性测定样品的约0.01％至约0.04％w/v。在一些实施例中，表面活性剂为聚山梨醇酯。在一些实施例中，表面活性剂为聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或它们的组合。
宿主细胞蛋白质的酶活性
在一些实施例中，蛋白质制剂进一步包含一种或多另外的宿主细胞蛋白质。如本文所述，从细胞培养物(即，包含目标蛋白质(例如治疗性蛋白质)的宿主细胞)中制备蛋白质制剂。在一些实施例中，蛋白质制剂包括一种或多种另外的宿主细胞蛋白质。在一些实施例中，这些另外的宿主细胞蛋白质在与目标蛋白质(例如治疗性蛋白质)实质上相同的条件下是可溶的。在一些实施例中，这些另外的宿主细胞蛋白质不容易与目标蛋白质(例如治疗性蛋白质)分离。在一些实施例中，这些另外的宿主细胞蛋白质包含脂肪酶。在一些实施例中，这些另外的宿主细胞蛋白质中的一者或多者具有脂肪分解活性。
在一些实施例中，本公开涉及用于检测脂肪分解活性的组合物和方法。脂肪分解活性，即脂解，一般是指脂质的水解。脂解反应可由脂肪酶(酯酶的一个亚类)催化。因此，“脂肪酶”是指水解脂质(例如甘油三酯、磷脂、胆固醇酯等)的酯键的酶。脂肪酶包括例如甘油三酯脂肪酶、脂蛋白脂肪酶、胰脂肪酶、肝脂肪酶、胃脂肪酶、舌脂肪酶、内皮脂肪酶和磷脂酰丝氨酸磷脂酶。脂肪酶是天然产生的，例如由哺乳动物的胰腺、肝、舌腺、胃、甲状腺和/或粘膜产生，由某些细菌和真菌分泌，和/或存在于溶酶体中。在一些实施例中，脂肪酶对于蛋白质纯化中蛋白质所源自的细胞是内源性的。在一些实施例中，脂肪酶对于蛋白质制剂中的另一种生物组分(例如，包含添加至蛋白质制剂中的稳定蛋白质的生物组分)是内源性的。
如本文所指，“活性”脂肪酶是能够执行脂解(在本文中也称为具有“脂肪分解活性”)的脂肪酶。蛋白质制剂中存在的活性脂肪酶可能干扰涉及目标蛋白质(例如，治疗性蛋白质)的下游过程。在一些实施例中，包含目标蛋白质(例如，治疗性蛋白质)和脂肪酶的蛋白质制剂包括在药物制剂中。在一些实施例中，将赋形剂加入蛋白质制剂中。在一些实施例中，赋形剂例如通过最大程度减小界面应力、减少蛋白质聚集和/或改善蛋白质溶解度来稳定蛋白质制剂。在一些实施例中，赋形剂为表面活性剂。在一些实施例中，赋形剂包含脂肪酸、酯或两者。在一些实施例中，赋形剂易于被活性脂肪酶水解。在一些实施例中，在包含目标蛋白质和赋形剂的蛋白质制剂中存在活性脂肪酶，将降低制剂的稳定性。因此，可靠地检测蛋白质制剂中的脂肪分解活性是有利的，以便最大程度减小由赋形剂的脂肪酶水解引起的负面影响，诸如颗粒物增加、安全问题(由于例如注射部位反应增加)和质量下降。
在一些实施例中，脂肪酶由细胞培养物中的细胞产生。在一些实施例中，脂肪酶由用于生产目标蛋白质的细胞培养物中的细胞产生。适于生产目标蛋白质的细胞的非限制性实例包括细菌、昆虫、酵母、哺乳动物和/或转基因细胞。细胞系的非限制性实例包括CHO、HEK 293、HT-1080、PER.C6、CAP、VERO、BHK、HeLa、CV1、Cos、MDCK、3T3、NS0、NS1、PC12、W138、Sp2/0、HKB-11、TM4、MMT 060562、TR1、MRC5、FS4、骨髓瘤细胞系、杂交瘤细胞系和肝癌细胞系。在一些实施例中，用于产生目标蛋白质的细胞系为稳定细胞系，例如，其中目标蛋白质的基因稳定整合到细胞的基因组中。在一些实施例中，用于产生目标蛋白质的细胞系为瞬时细胞系，例如，其中细胞表达基因，但不将该基因整合到基因组中。
荧光底物
在各种实施例中，本发明涉及一种利用模型酯酶底物4-甲基伞形酮基羧酸酯的酶测定法，该模型酯酶底物由酯化到羧酸的荧光染料4-甲基伞形酮(MU)组成。荧光底物在完整时被淬灭，但当羧酸酯键被裂解以释放MU时，可检测到荧光。羧酸酯可具有任何碳长度。在优选实施例中，羧酸酯包含少于12、少于11、少于10、少于9、少于8、少于7、少于6、少于5、少于4、少于3、或少于2种酯。在各种实施例中，荧光底物为辛酸4-甲基伞形酮酯(MU-C8)，其由酯化到辛酸(一种八碳饱和脂肪酸)的荧光染料4-甲基伞形酮(MU)组成。在各种实施例中，荧光底物为MUC-C10。
在一些实施例中，4Mu的荧光用于检测水解酶对4-甲基伞形酮基羧酸酯的水解，并因此是水解活性的指标。本领域技术人员将理解，4-甲基伞形酮基羧酸酯的水解(如通过4Mu荧光所测量)将可能指示蛋白质制剂中已发生水解活性，即，表面活性剂可能已被水解，可能使蛋白质制剂不稳定。在一些实施例中，可以在约330nm的激发波长和约495nm的发射波长下测量4Mu的荧光。在一些实施例中，可以在约327nm的激发波长和约449nm的发射波长下测量4Mu的荧光。在一些实施例中，可在约300nm至约350nm的激发波长和约420nm至约500nm的发射波长下测量4Mu的荧光。在一些实施例中，当pH改变时，4Mu的荧光测量参数(例如，激发和发射波长)发生变化。在一些实施例中，当盐和/或缓冲液浓度改变时，4Mu的荧光测量参数(例如，激发和发射波长)发生变化。在一些实施例中，4-甲基伞形酮基羧酸酯为脂肪酶的底物。在一些实施例中，4-甲基伞形酮基羧酸酯被本文所述的蛋白质制剂中的脂肪酶水解。在一些实施例中，4Mu形成通过荧光来测量。在一些实施例中，包含本文所述的蛋白质制剂的测定样品的水解活性通过4Mu的荧光来测量。
缓冲液和反应条件
在一些实施例中，包含蛋白质制剂的水性测定样品进一步包含缓冲液、盐或两者。一般来说，本公开的盐是指阴离子并非OH-和O2-的离子化合物。在一些实施例中，盐减少和/或防止组合物中的一种或多种组分发生降解。可包括在水性测定样品中的合适的盐可由本领域普通技术人员来选择，包括例如钠盐、钾盐、钙盐、铵盐等。在一些实施例中，盐为氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、碳酸钠(Na2CO3)、硫酸钠(Na2SO4)、氯化钙(CaCl2)、氯化铵(NH4Cl)、乙酸铵(NH4CH3COO)、硫酸铵((NH4)2SO4)或它们的组合。在一些实施例中，盐为NaCl、CaCl2或它们的组合。在一些实施例中，盐为NaCl和CaCl2两者。
在一些实施例中，水性测定样品中的NaCl浓度有利于准确和/或高效地检测样品中的脂肪分解活性。在一些实施例中，水性测定样品中的NaCl为约10mM至约500mM。在一些实施例中，水性测定样品中的NaCl为约25mM至约400mM。在一些实施例中，水性测定样品中的NaCl为约50mM至约300mM。在一些实施例中，水性测定样品中的NaCl为约75mM至约250mM。在一些实施例中，水性测定样品中的NaCl为约100mM至约200mM。在一些实施例中，水性测定缓冲液中的NaCl为约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM。
在一些实施例中，最终组合物(水性测定样品和有机溶剂)中的NaCl为约10mM至约500mM。在一些实施例中，最终组合物中的NaCl为约25mM至约400mM。在一些实施例中，最终组合物中的NaCl为约50mM至约300mM。在一些实施例中，最终组合物中的NaCl为约75mM至约250mM。在一些实施例中，最终组合物中的NaCl为约100mM至约200mM。在一些实施例中，最终组合物中的NaCl为约100mM至约140mM，例如120mM。在一些实施例中，最终组合物中的NaCl为约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM、约110mM、约120mM、约130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM或200mM。
在一些实施例中，水性测定样品中的CaCl2浓度有利于准确和/或高效地检测样品中的脂肪分解活性。在一些实施例中，水性测定样品中的CaCl2为约0.1mM至约20mM。在一些实施例中，水性测定样品中的CaCl2为约0.2mM至约10mM。在一些实施例中，水性测定样品中的CaCl2为约0.5mM至约5.0mM。在一些实施例中，水性测定样品中的CaCl2为约0.7mM至约3.0mM。在一些实施例中，水性测定样品中的CaCl2为约1.0mM至约2.0mM。在一些实施例中，水性测定样品中的CaCl2为约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1.0mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.5mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM、约2.0mM、约2.5mM、约3.0mM、约3.5mM、约4.0mM、约4.5mM或约5.0mM。
在一些实施例中，最终组合物(水性测定样品和有机溶剂)中的CaCl2为约0.1mM至约20mM。在一些实施例中，最终组合物中的CaCl2为约0.2mM至约10mM。在一些实施例中，最终组合物中的CaCl2为约0.5mM至约5.0mM。在一些实施例中，最终组合物中的CaCl2为约0.7mM至约3.0mM。在一些实施例中，最终组合物中的CaCl2为约1.0mM至约2.0mM。在一些实施例中，最终组合物中的CaCl2为约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1.0mM、约1.1mM、约1.2mM、约1.3mM、约1.5mM、约1.5mM、约1.6mM、约1.7mM、约1.8mM、约1.9mM、约2.0mM、约2.5mM、约3.0mM、约3.5mM、约4.0mM、约4.5mM或约5.0mM。
在一些实施例中，NaCl和CaCl2减少和/或防止水性测定样品中的一种或多种组分发生降解。在一些实施例中，NaCl和CaCl2减少和/或防止蛋白质(例如，治疗性蛋白质)发生聚集和/或沉淀。在一些实施例中，NaCl和CaCl2减少和/或防止组合物中并非在水性测定样品中(例如，在有机溶剂中)中的一种或多种组分发生降解。在一些实施例中，NaCl和CaCl2减少和/或防止4-甲基伞形酮基羧酸酯自发水解。在一些实施例中，水性测定样品中的NaCl为约10mM至约500mM，并且CaCl2为约0.1mM至约20mM。在一些实施例中，水性测定样品中的NaCl为约25mM至约400mM，并且CaCl2为约0.2mM至约10mM。在一些实施例中，水性测定样品中的NaCl为约50mM至约300mM，并且CaCl2为约0.5mM至约5.0mM。在一些实施例中，水性测定样品中的NaCl为约75mM至约250mM，并且CaCl2为约0.7mM至约3.0mM。在一些实施例中，水性测定样品中的NaCl为约100mM至约200mM，并且CaCl2为约1.0mM至约2.0mM。在一些实施例中，水性测定样品中的NaCl为约150mM并且CaCl2为约0.3mM。
如本文所用，“缓冲液”是指溶液中用于维持溶液的pH的物质。缓冲液可将溶液维持在特定的pH范围内(即，在给定范围内的缓冲能力)，并且防止在向溶液中添加另外的组分时pH发生快速变化。一般来说，缓冲液可为弱酸或弱碱。在一些实施例中，缓冲液在约pH5.0、约pH 5.5、约pH 6.0、约pH 6.5或约pH 7.0下具有缓冲能力。具有约pH 5.0至约pH 7.0的缓冲能力的缓冲液包括例如柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、MES、Bis-Tris、ADA、ACES、PIPES、MOPSO、Bis-Tris丙烷、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、MOBS、TAPSO和Tris。缓冲液的缓冲能力可由本领域技术人员确定。在一些实施例中，水性测定样品中的缓冲液有利于准确和/或高效地检测样品中的脂肪分解活性。在一些实施例中，缓冲液减少和/或防止水性测定样品中的一种或多种组分发生降解。在一些实施例中，缓冲液减少和/或防止蛋白质(例如，治疗性蛋白质)发生聚集。在一些实施例中，缓冲液减少和/或防止组合物中并非在水性测定样品中(例如，在组合物的有机溶剂中)中的一种或多种组分发生降解。在一些实施例中，缓冲液减少和/或防止4-甲基伞形酮基羧酸酯自发水解。在一些实施例中，缓冲液作为水性缓冲溶液提供于水性测定样品中。
在一些实施例中，水性测定样品中的缓冲液为约5mM至约200mM。在一些实施例中，水性测定样品中的缓冲液为约10mM至约100mM。在一些实施例中，水性测定样品中的缓冲液为约20mM至约80mM。在一些实施例中，水性测定样品中的缓冲液为约30mM至约70mM。在一些实施例中，水性测定样品中的缓冲液为约40mM至约60mM。在一些实施例中，水性测定样品中的缓冲液为约10mM、约12mM、约15mM、约18mM、约20mM、约22mM、约25mM、约28mM、约30mM、约32mM、约35mM、约38mM、约40mM、约42mM、约45mM、约48mM、约50mM、约52mM、约55mM、约58mM、约60mM、约62mM、约65mM、约68mM、约70mM、约72mM、约75mM、约78mM、约80mM、约82mM、约85mM、约88mM、约90mM、约92mM、约95mM、约98mM或约100mM。在一些实施例中，缓冲液为Bis-Tris。在一些实施例中，缓冲液为Tris。
在一些实施例中，最终组合物(水性测定样品和有机溶剂)中的缓冲液为约5mM至约200mM。在一些实施例中，最终组合物(水性测定样品和有机溶剂)中的缓冲液为约10mM至约100mM。在一些实施例中，最终组合物中的缓冲液为约20mM至约80mM。在一些实施例中，最终组合物中的缓冲液为约30mM至约70mM。在一些实施例中，最终组合物中的缓冲液为约40mM至约60mM。在一些实施例中，最终组合物中的缓冲液为约10mM、约12mM、约15mM、约18mM、约20mM、约22mM、约25mM、约28mM、约30mM、约32mM、约35mM、约38mM、约40mM、约42mM、约45mM、约48mM、约50mM、约52mM、约55mM、约58mM、约60mM、约62mM、约65mM、约68mM、约70mM、约72mM、约75mM、约78mM、约80mM、约82mM、约85mM、约88mM、约90mM、约92mM、约95mM、约98mM或约100mM。
在一些实施例中，水性测定样品包含NaCl、CaCl2和缓冲液。在一些实施例中，水性测定样品中的NaCl为约10mM至约500mM，CaCl2为约0.1mM至约20mM，并且缓冲液为约5mM至约200mM。在一些实施例中，水性测定样品中的NaCl为约25mM至约400mM，CaCl2为约0.2mM至约10mM，并且缓冲液为约10mM至约100mM。在一些实施例中，水性测定样品中的NaCl为约50mM至约300mM，CaCl2为约0.5mM至约5.0mM，并且缓冲液为约20mM至约8mM。在一些实施例中，水性测定样品中的NaCl为约75mM至约250mM，CaCl2为约0.7至约3.0mM，并且缓冲液为约30mM至约70mM。在一些实施例中，水性测定样品中的NaCl为约100mM至约200mM，CaCl2为约1.0至约2.0mM，并且缓冲液为约40mM至约60mM。在一些实施例中，水性测定样品中的NaCl为约150mM，CaCl2为约0.3mM，并且缓冲液为约45mM至约55mM。在一些实施例中，缓冲液为Bis-Tris。在一些实施例中，缓冲液为Tris。本领域技术人员将认识到，盐和缓冲液常见于蛋白质制剂中，因此上述百分比仅作为示例提供。
在一些实施例中，调节水性测定样品的pH以使4Mu的荧光强度最大化。在一些实施例中，调节水性测定样品的pH以稳定水性测定样品和/或有机溶剂的一种或多种组分。在一些实施例中，微酸性至中性pH(例如，约5.0至约7.0)使水性测定样品中的组分的降解最小化。在一些实施例中，微酸性至中性pH(例如，约5.0至约7.0)使治疗性蛋白质的聚集最小化。在一些实施例中，微酸性至中性pH(例如，约5.0至约7.0)使4-甲基伞形酮基底物(4Mu)的自发水解最小化。
在一些实施例中，水性测定样品具有酸性pH。在一些实施例中，水性测定样品具有5.0至7.0的pH。在一些实施例中，水性测定样品具有约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9或约7.0的pH。
在一些实施例中，本公开的组合物包含：如本文所述的水性测定样品；以及有机溶剂。如本文所用，“有机溶剂”是指可用于溶解一种或多种溶质的碳基物质。有机溶剂的实例包括但不限于：烃，包括例如脂肪烃、环状烃、芳烃和卤代烃；酮类；胺类；酯类；醇类；醛类；醚类；腈类；亚砜等。在一些实施例中，有机溶剂能够稳定4-甲基伞形酮基底物(4Mu)。
在一些实施例中，有机溶剂包含醇、亚砜、腈或它们的组合。在一些实施例中，有机溶剂为二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施例中，有机溶剂包含乙腈(ACN)。在一些实施例中，有机溶剂包含醇。在一些实施例中，有机溶剂为C1-C6醇。在一些实施例中，C1-C6醇为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、叔丁醇、戊醇或己醇。在一些实施例中，有机溶剂甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、叔丁醇或它们的组合。在一些实施例中，有机溶剂包含乙腈与醇的混合物。在一些实施例中，有机溶剂包含乙腈与异丙醇的混合物。在一些实施例中，乙腈与异丙醇以约5:1、约4:1、约3:1、约2:1或约1:1的比率混合。
在本文所述的组合物和方法中可使用不同浓度的4Mu。一般而言，应最大程度减少4Mu的用量，以使自发水解的影响最小化。在一些实施例中，有机溶剂中的4Mu为约1μM至约1mM或约10μM至约500μM或约20μM至约200μM或约50μM至约150μM或约75μM至约125μM或约100μM。
在一些实施例中，组合物包含：水性测定样品，其包含如本文所述的蛋白质制剂；以及有机溶剂，其包含如本文所述的4-甲基伞形酮基羧酸酯。在一些实施例中，组合物不包含等体积的水性测定样品和有机溶剂。在一些实施例中，组合物中有机溶剂的量少于组合物中水性测定缓冲液的量，以便使有机溶剂对蛋白质制剂(特别是治疗性蛋白质)的潜在不利影响最小化。例如，如果有机溶剂的量过高，治疗性蛋白质可能发生聚集。在一些实施例中，水性测定样品按组合物的体积计为约70％至约99.9％，并且有机溶剂按组合物的体积计为约0.1％至约30％。在一些实施例中，水性测定样品按组合物的体积计为约70％至约99.5％，并且有机溶剂按组合物的体积计为约0.5％至约30％。在一些实施例中，水性测定样品按组合物的体积计为约70％至约99％，并且有机溶剂按组合物的体积计为约1％至约30％。在一些实施例中，水性测定样品按组合物的体积计为约75％至约99％，并且有机溶剂按组合物的体积计为约1％至约25％。在一些实施例中，水性测定样品按组合物的体积计为约80％至约98％，并且有机溶剂按组合物的体积计为约2％至约20％。在一些实施例中，水性测定样品按组合物的体积计为约90％至约98％，并且有机溶剂按组合物的体积计为约2％至约10％。在一些实施例中，水性测定样品按组合物的体积计为约95％至约98％，并且有机溶剂按组合物的体积计为约2％至约5％。
在一些实施例中，水性测定样品按组合物的体积计为约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.1％、约99.2％、约99.3％、约99.4％、约99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或约99.9％。在一些实施例中，蛋白质制剂按组合物的体积计为约70％至约85％、约75％至约85％或约80％至约85％，并且水性测定样品的非蛋白质制剂组分(例如，缓冲液和/或盐)按组合物的体积计为约15％至约30％、约15％至约25％、约15％至约20％。在一些实施例中，有机溶剂按组合物的体积计为约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％。本领域技术人员将认识到，盐和缓冲液常见于蛋白质制剂中，因此上述百分比仅作为示例使用。
在一些实施例中，组合物进一步包含脂肪酶抑制剂。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂通过使脂肪酶失活来降低或消除组合物中的脂肪分解活性。在一些实施例中，组合物中包括脂肪酶抑制剂以提供用于检测脂肪分解活性的阴性对照，即，预计包含脂肪酶抑制剂的组合物不具有脂肪分解活性。在一些实施例中，在检测脂肪分解活性(例如，通过测量4Mu的荧光)后，将脂肪酶抑制剂加入组合物中。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂在水性测定样品中。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂为水溶性的。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂在有机溶剂中。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂不溶于水。
在一些实施例中，脂肪酶抑制剂处于足以降低或消除组合物中的脂肪分解活性的浓度下。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂处于足以使组合物中的脂肪分解活性降低约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％或约100％的浓度下。在一些实施例中，组合物中的脂肪酶抑制剂为约1μM至约50μM。在一些实施例中，组合物中的脂肪酶抑制剂为约2μM至约40μM。在一些实施例中，组合物中的脂肪酶抑制剂为约3μM至约35μM。在一些实施例中，组合物中的脂肪酶抑制剂为约4μM至约30μM。在一些实施例中，组合物中的脂肪酶抑制剂为约5μM至约25μM。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂为约1μM、约2μM、约3μM、约4μM、约5μM、约6μM、约7μM、约8μM、约9μM、约10μM、约11μM、约12μM、约13μM、约14μM、约15μM、约16μM、约17μM、约17μM、约18μM、约19μM、约20μM、约21μM、约22μM、约23μM、约24μM、约25μM、约30μM、约35μM、约40μM、约45μM或约50μM。
在一些实施例中，脂肪酶抑制剂为(S)-2-甲酰氨基-4-甲基-戊酸(S)-1-[[(2S,3S)-3-己基-4-氧代-2-氧杂环丁烷基]甲基]-十二烷基酯(奥利司他(orlistat))。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂为生物碱，例如咖啡因、茶碱和可可碱。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂为类胡萝卜素，诸如岩藻黄质。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂为糖苷，例如，阿克替苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、芦丁、山柰酚、槲皮素和木犀草素。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂为多酚，例如，高良姜素、橙皮苷、甘草查尔酮A、CT-II、4-(3,5-二羟基苯氧基)-8-(2,4,6-三羟基苯氧基)二苯并对二噁英-1,3,6-三醇(4-(3,5-dihydroxyphenoxy)-8-(2,4,6-trihydroxyphenoxy)dibenzo-p-dioxin-1,3,6-triol；7-phloroeckol)和异甘草素。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂为皂苷，例如，Sessiloside和Chiianoside。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂为萜烯，例如番红花素和番红花酸。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂源自细菌，例如，利普司他汀(lipstatin)、伐利内酯(valilactone)、Percyquinnin、Panclicin、厄比内酯(ebelactone)、韧革菌素(vibralactone)和抑酯酶素(esterastin)。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂为合成脂肪酶抑制剂，例如，天然脂肪的合成类似物。脂肪酶抑制剂综述于Lunagariya等人,EXCLI J 13:897-921(2014)中。
在一些实施例中，本公开提供了一种组合物，该组合物包含：(a)约90％至约99.9％(vol/vol)的水性测定样品，其包含(i)纯化的蛋白质制剂，其包含蛋白质和脂质；(ii)缓冲液；(iii)约1.0mM至约2.0mM氯化钙；和(iv)约100mM至约200mM氯化钠；以及(b)约10％至约0.1％(vol/vol)的有机溶剂，该有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈或它们的组合，进一步包含4-甲基伞形酮基羧酸酯；其中水性测定样品具有5.0至7.0的pH。
在一些实施例中，本公开提供了一种组合物，该组合物包含：(a)约90％至约99.9％(vol/vol)的水性测定样品，其包含(i)纯化的蛋白质制剂，其包含蛋白质和聚山梨醇酯表面活性剂；(ii)缓冲液；(iii)约1.0mM至约2.0mM氯化钙；和(iv)约100mM至约200mM氯化钠；以及(b)约10％至约0.1％(vol/vol)的有机溶剂，该有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈或它们的组合，进一步包含4-甲基伞形酮基羧酸酯；其中水性测定样品具有5.0至7.0的pH。
在一些实施例中，本公开提供了一种组合物，该组合物包含：(a)约90％至约99.9％(vol/vol)的水性测定样品，其包含(i)部分纯化的蛋白质制剂，其包含蛋白质和脂质；(ii)缓冲液；(iii)约1.0mM至约2.0mM氯化钙；和(iv)约100mM至约200mM氯化钠；以及(b)约10％至约0.1％(vol/vol)的有机溶剂，该有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈或它们的组合，进一步包含4-甲基伞形酮基羧酸酯；其中水性测定样品具有5.0至7.0的pH。
在一些实施例中，本公开提供了一种组合物，该组合物包含：(a)约90％至约99.9％(vol/vol)的水性测定样品，其包含(i)细胞培养上清液，其包含蛋白质和脂质；(ii)缓冲液；(iii)约1.0mM至约2.0mM氯化钙；和(iv)约100mM至约200mM氯化钠；以及(b)约10％至约0.1％(vol/vol)的有机溶剂，该有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈或它们的组合，进一步包含4-甲基伞形酮基羧酸酯；其中水性测定样品具有5.0至7.0的pH。
在另外的实施例中，本文提供的组合物适合用于检测蛋白质制剂中的脂肪分解活性的方法中。在一些实施例中，本公开进一步提供了检测水性测定样品中的脂肪分解活性的方法。
在一些实施例中，本公开提供了一种检测水性测定样品中的脂肪分解活性的方法，该方法包括：(a)将包含蛋白质制剂的水性测定样品与包含4-甲基伞形酮基羧酸酯的有机溶剂合并；(b)通过荧光测量油酸酯和4-甲基伞形酮(4Mu)的形成。
在一些实施例中，水性测定样品为本文所述的水性测定样品。在一些实施例中，水性测定样品具有5.0至7.0的pH。
在一些实施例中，水性测定样品进一步包含缓冲液、盐或两者，如本文所述。本文还提供了适用于本发明的方法的缓冲液和盐及其浓度的实例。在一些实施例中，盐为氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2)或它们的组合。在一些实施例中，盐为氯化钠和氯化钙。在一些实施例中，水性测定样品中的氯化钠为约50mM至约400mM。在一些实施例中，水性测定样品中的氯化钠为约100mM至约200mM。在一些实施例中，水性测定样品中的氯化钙为约0.2mM至约10mM。在一些实施例中，水性测定样品中的氯化钙为约1.0mM至约2.0mM。
在一些实施例中，缓冲液在约pH 6.0下具有缓冲能力。在一些实施例中，缓冲液为Tris。在一些实施例中，缓冲液为Bis-Tris。在一些实施例中，水性测定样品中的缓冲液为约2mM至约200mM。在一些实施例中，水性测定样品中的缓冲液为约10mM至约100mM。在一些实施例中，水性测定样品中的缓冲液为约40mM至约60mM。在一些实施例中，水性测定样品中的缓冲液为约45mM至约55mM。
在一些实施例中，有机溶剂为本文所述的有机溶剂。在一些实施例中，有机溶剂为醇、亚砜、腈或它们的组合。在一些实施例中，有机溶剂为二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施例中，有机溶剂包含乙腈。在一些实施例中，有机溶剂包含醇。在一些实施例中，有机溶剂为C1-C6醇。在一些实施例中，有机溶剂甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、叔丁醇或它们的组合。在一些实施例中，有机溶剂包含乙腈与异丙醇的混合物。在一些实施例中，乙腈与异丙醇以约3:1的比率混合。
在一些实施例中，4-甲基伞形酮基羧酸酯的有机溶剂。本文提供了各种4-甲基伞形酮基羧酸酯的结构。在一些实施例中，4-甲基伞形酮基羧酸酯水解以形成羧酸酯和4-甲基伞形酮(4Mu)。本文提供了4Mu的结构。在一些实施例中，4Mu发荧光。在一些实施例中，4Mu荧光在约330nm激发波长和495mm发射波长下测量。
在一些实施例中，该方法包括测量荧光长达24小时。在一些实施例中，测量荧光约24小时至约400小时。在一些实施例中，测量荧光长于约24小时。在一些实施例中，测量荧光长于约100小时。在一些实施例中，测量荧光长于约300小时。应当理解，荧光测量不一定是连续测量，可在预定时间点测量荧光。在一些实施例中，在约12小时至约400小时之间的选定时间点测量荧光。在一些实施例中，在约24小时、约48小时、约72小时、约96小时、约120小时、约144小时、约168小时、约192小时、约216小时、约240小时、约264小时、约288小时、约312小时、约336小时、约360小时、约384小时或约400小时的时间点测量荧光。可基于蛋白质制剂中的脂肪酶活性水平来选择测量荧光的时间段。例如，由于4-甲基伞形酮基羧酸酯的水解较慢，低水平的脂肪分解活性可能需要较长的检测时间段。
在一些实施例中，水性测定样品与有机溶剂以约70:30至约99:1的比率合并。在一些实施例中，水性测定样品与有机溶剂以约75:25至约99:1的比率合并。在一些实施例中，水性测定样品与有机溶剂以约80:20至约98:2的比率合并。在一些实施例中，水性测定样品与有机溶剂以约85:15至约98:2的比率合并。在一些实施例中，水性测定样品与有机溶剂以约90:10至约98:2的比率合并。在一些实施例中，水性测定样品与有机溶剂以约95:5至约98:2的比率合并。
在一些实施例中，在步骤(a)(即，将包含蛋白质制剂的水性测定样品与有机溶剂合并)之前，将水性测定样品与脂肪酶抑制剂一起孵育约10分钟至约1小时。在一些实施例中，在步骤(a)之前，将水性测定样品与脂肪酶抑制剂一起孵育约15分钟至约45分钟、约20分钟至约40分钟、或约30分钟。在一些实施例中，将水性测定样品与脂肪酶抑制剂一起孵育降低或消除脂肪分解活性。在一些实施例中，将水性测定样品与脂肪酶抑制剂一起孵育提供了用于检测脂肪分解活性的阴性对照。在其中在步骤(a)之前将水性测定样品与脂肪酶抑制剂一起孵育的实施例中，预计实测荧光是低的，即，表明脂肪分解活性低或缺乏脂肪分解活性。本文描述了脂肪酶抑制剂。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂为(S)-2-甲酰氨基-4-甲基-戊酸(S)-1-[[(2S,3S)-3-己基-4-氧代-2-氧杂环丁烷基]甲基]-十二烷基酯(奥利司他(orlistat))。在一些实施例中，组合物中的脂肪酶抑制剂为约1μM至约50μM。在一些实施例中，组合物中的脂肪酶抑制剂为约5μM至约25μM。
试剂盒
在一些实施例中，本公开提供了适于提供本发明的组合物的试剂盒。在一些实施例中，本公开提供了可用于完成本发明的方法的试剂盒。例如，在一些实施例中，本公开进一步提供了一种试剂盒，该试剂盒在两个或更多个容器中包含：(a)有机溶剂；(b)4-甲基伞形酮基羧酸酯；以及(c)脂肪酶抑制剂。
任何合适的容器均可用于本文所述的试剂盒中。在一些实施例中，容器为小瓶。在一些实施例中，容器为瓶。在一些实施例中，每个容器为多隔室容器的隔室。在一些实施例中，有机溶剂和4-甲基伞形酮基羧酸酯在第一容器中，并且脂肪酶抑制剂在第二容器中。在一些实施例中，有机溶剂和脂肪酶抑制剂在第一容器中，并且4-甲基伞形酮基羧酸酯在第二容器中。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂和4-甲基伞形酮基羧酸酯在第一容器中，并且有机溶剂在第二容器中。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂和有机溶剂在第一容器中，并且4-甲基伞形酮基羧酸酯和有机溶剂在第二容器中。在一些实施例中，4-甲基伞形酮基羧酸酯作为固体(例如，粉末)提供。在一些实施例中，4-甲基伞形酮基羧酸酯提供于溶液中(例如，在有机溶剂中)。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂作为固体(例如，粉末，诸如冻干粉末)提供。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂提供于溶液中(例如，在有机溶剂中)。在上述实施例中的任一项中，(a)有机溶剂；(b)4-甲基伞形酮基羧酸酯；和/或(c)脂肪酶抑制剂可包括在它们各自的容器中以接收预定的特定量的蛋白质制剂，其中每种组分的量足以实践本文所述的确定脂肪分解活性的方法。在一些实施例中，该试剂盒进一步包含如在本文所述的方法中利用该试剂盒来确定脂肪分解活性的说明书。
在一些实施例中，试剂盒进一步包含缓冲液、盐或两者。合适的缓冲液和盐如本文所述。在一些实施例中，试剂盒的使用者提供与该试剂盒一起使用的蛋白质制剂。在一些实施例中，使用者的蛋白质制剂在不适于与试剂盒一起使用的缓冲液(例如，促进4-甲基伞形酮基羧酸酯的自发水解和/或脂肪酶抑制剂的降解的缓冲液)中。在一些实施例中，该试剂盒提供了缓冲液交换柱。在一些实施例中，缓冲液交换柱将使用者的蛋白质制剂的缓冲液交换为适合与本文提供的试剂盒一起使用的缓冲液。缓冲液交换柱的实例包括但不限于：来自THERMO FISHER的
Figure BDA0004098114000000291
柱；来自GE HEALTHCARE的
Figure BDA0004098114000000292
和
Figure BDA0004098114000000293
柱；来自SARTORIUS的
Figure BDA0004098114000000294
和
Figure BDA0004098114000000295
浓缩器；来自BIO-RAD的
Figure BDA0004098114000000296
和
Figure BDA0004098114000000297
柱；以及来自G-BIOSCIENCES的
Figure BDA0004098114000000298
柱。
本文所述试剂盒的柱可用于交换缓冲体系。用于该目的的柱是本领域技术人员已知的。例如，该柱可用于将蛋白质制剂中的缓冲液交换为更适合实践如本文所述的确定脂肪分解活性的方法的缓冲液。
在一些实施例中，本公开提供了一种试剂盒，该试剂盒包含：(a)有机溶剂，其包含4-甲基伞形酮基底物(4Mu)；(b)适于交换蛋白质制剂的缓冲液的柱；以及(c)脂肪酶抑制剂。
用于本公开的试剂盒的合适的有机溶剂包括本文所述的有机溶剂。在一些实施例中，有机溶剂为醇、亚砜、腈或它们的组合。在一些实施例中，有机溶剂为二甲基亚砜(DMSO)。在一些实施例中，有机溶剂包含乙腈。在一些实施例中，有机溶剂包含醇。在一些实施例中，有机溶剂为C1-C6醇。在一些实施例中，有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇或它们的组合。在一些实施例中，有机溶剂包含乙腈与异丙醇的混合物。
用于本公开的试剂盒的合适的脂肪酶抑制剂包括本文所述的脂肪酶抑制剂。在一些实施例中，脂肪酶抑制剂为(S)-2-甲酰氨基-4-甲基-戊酸(S)-1-[[(2S,3S)-3-己基-4-氧代-2-氧杂环丁烷基]甲基]-十二烷基酯(奥利司他(orlistat))。在一些实施例中，当实践如本文所述的确定脂肪分解活性的方法时，脂肪酶抑制剂用作对照。
用于本公开的试剂盒的合适的盐包括本文所述的盐。在一些实施例中，盐为氯化钠、氯化钙或它们的组合。在一些实施例中，盐为氯化钠和氯化钙。
用于本公开的试剂盒的合适的缓冲液包括本文所述的缓冲液。在一些实施例中，缓冲液为Tris。在一些实施例中，缓冲液为Bis-Tris。
在一些实施例中，试剂盒进一步包含用于执行测定以确定脂肪分解活性的说明书。在一些实施例中，测定法包含本文所述的方法。
本文引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等，以及其中引用的参考文献，在它们尚未被引用的范围内，其全文通过引用并入本文。
定义
应当理解，本文的描述仅为示例性和解释性的，而不是对要求保护的本发明的限制。在本申请中，除非另外具体陈述，否则单数的使用包含复数。
此处使用的章节标题仅用于组织目的，不应被解释为限制所描述的主题。本申请中引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文，出于任何目的明确以全文引用的方式并入。如根据本公开所用，除非另外指明，否则以下术语应理解为具有以下含义：
如本文所用，“一(a)”或“一个(an)”可意指一个或多个。如本文所用，当与词语“包含”结合使用时，词语“一”或“一个”可表示一个或多于一个。如本文所用，“另一个”或“另外的”可以意指至少第二个或更多个。
在整个本申请中，术语“约”用于表示值包括用于确定该值的方法/装置的固有误差变化或者研究对象存在的变化。通常，术语“约”意在涵盖大约或小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％或更高的差异，视情况而定。在一些实施例中，本领域技术人员将由于术语“约”在本文中使用的上下文而理解该术语指示的差异水平。还应当理解，术语“约”的使用还包括具体引用的值。
尽管本公开内容支持仅是指可选项和“和/或”的定义，但权利要求书中使用的术语“或”用于意指“和/或”，除非明确指出仅是指可选项或可选项相互排斥。
如本文所用，术语“包含”(以及“包含”的任何变体或形式，诸如“包含多项”和“包含一项”)、“具有”(以及“具有”的任何变体或形式，诸如“具有多项”和“具有一项”)、“包括”(以及“包括”的任何变体或形式，诸如“包括多项”和“包括一项”)或“含有”(以及“含有”的任何变体或形式，诸如“含有多项”和“含有一项”)是非遍举的或开放式的，不排除额外的、未述及的要素或方法步骤。设想本说明书中讨论的任何实施例可相对于本公开的任何方法、组合物和/或试剂盒来实施。此外，本公开的组合物可用于实现本公开的方法和试剂盒。
使用的术语“例如”及其相应的缩写“e.g.”(无论是否为斜体)意指所引用的具体术语为本公开的代表性实例和实施例，除非另有明确说明，否则并非旨在限于所参考或引用的具体实例。
如本文所用，“在……之间”是包括范围末端的范围。例如，在x与y之间的数字明确地包括数字x和y以及落入x和y内的任何数字。
如本文所用，“蛋白质”、“肽”或“多肽”是指氨基酸的聚合形式，其可以具有任何长度。蛋白质可包括例如抗体、结构蛋白、酶、膜蛋白、膜结合蛋白和/或跨膜蛋白、转运体、受体、信号转导蛋白等。本公开的蛋白质和/或肽还涵盖经修饰的蛋白质，例如，缀合至一种或多种非肽物质诸如药物、靶向部分、标签(诸如可视化标签)等的蛋白质。本公开的蛋白质可为治疗性蛋白质，例如，用于疾病或疾患的诊断、治疗和/或预防中。在一些实施例中，本文所述的聚山梨醇酯可改善药物制剂中的蛋白质的稳定性。在一些实施例中，治疗性蛋白质为抗体。在一些实施例中，治疗性蛋白质为抗体药物缀合物。在一些实施例中，本文所述的蛋白质制剂包括蛋白质，例如治疗性蛋白质。
术语“分离的”是指(i)不含通常发现的至少一些其他蛋白质，(ii)基本上不含来自相同来源的其他蛋白质，例如来自相同物种，(iii)从至少约50％的多核苷酸、脂质、碳水化合物或在自然界中与其缔合的其他材料，(iv)与在自然界中不与其缔合的多肽可操作地缔合(通过共价或非共价相互作用)，或(v)在自然界中不存在。
多肽(例如，抗原结合分子)的“变体”包含氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸残基相对于另一多肽序列插入、缺失和/或取代至该氨基酸序列中。变体包括例如融合蛋白。
术语“衍生物”是指包括除氨基酸(或核酸)的插入、缺失或取代以外的化学修饰的分子。在某些实施例中，衍生物包含共价修饰，包括但不限于与聚合物、脂质或其他有机或无机部分的化学键合。在某些实施例中，经化学修饰的抗原结合分子可具有比未经化学修饰的抗原结合分子更长的循环半衰期。在一些实施例中，衍生抗原结合分子经共价修饰以包括一种或多种水溶性聚合物附接物，包括但不限于聚乙二醇、聚氧乙烯二醇或聚丙二醇。
可使用标准技术进行重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质体转染)。酶促反应和纯化技术可根据制造商的说明书或如本领域中通常完成的方式或如本文所述来执行。上述技术和程序通常可以根据本领域众所周知的常规方法以及如引用的各种一般和更具体的参考文献中所述和整个本说明书中所讨论的来执行。参见例如：Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))，其出于任何目的以引用方式并入本文。
如本文所用，术语“实质上”或“基本上”是指与参考数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相比高约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施例中，术语“基本上相同”或“实质上相同”是指与参考数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度大约相同的数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。
如本文所用，术语“实质上不含”和“基本上不含”可互换使用，并且当用于描述组合物诸如细胞群或培养基时，是指不含指定物质的组合物，诸如95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含指定物质，或通过常规方法测量不可检测到。在提及不存在组合物的特定物质或组分的情况下，类似的含义可应用于术语“不存在”。
如本文所用，术语“明显的”是指易于通过一种或多种标准方法检测到的数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围或事件。术语“不明显”和“不明显的”及其等同形式是指通过标准方法不易检测或检测不到的数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围或事件。在一个实施例中，如果事件发生的概率少于5％、4％、3％、2％、1％、0.1％、0.001％或更少，则该事件是不明显的。
在整个说明书中对“一个实施例”、“实施例”、“特定实施例”、“相关实施例”、“某个实施例”、“一些实施例”、“另外的实施例”或“进一步的实施例”的引用或它们的组合意指结合该实施例描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施例中。因此，贯穿本说明书各处出现的上述短语不一定全部指相同实施例。此外，具体特征、结构或特性可在一个或多个实施例中以任何合适的方式组合。
如本文所用，术语“水解酶”是指属于国际酶学委员会(EC)称为水解酶(EC 3)的主要酶类的宿主细胞蛋白质(HCP)。如本文所用，术语“酯酶”意指属于作用于酯键的水解酶的亚类的HCP。如本文所用，术语“羧酸酯水解酶”意指属于已知羧酸酯水解酶(诸如脂肪酶和羧酸酯酶)的水解酶亚类的HCP。如本文所用，术语“荧光底物”可任选地排除4-甲基伞形酮基油酸酯。如本文所用，术语“HCP酶活性”意指确定对水解荧光底物中的酯键的HCP酶活性速率。在实施例中，确定样品中的HCP酶活性意指确定样品中所有HCP的总活性。
实例
实施例1.改善的基于MU的酯底物和测定条件
为改善本领域中的脂肪酶测定，考察了以下附加因素：(1)几种基于MU的酯底物，以鉴别最敏感的底物；(2)几种模型酶，以证明更广泛的相关性；(3)几种mAb涵盖不同形式和生产宿主，以确保对不同产品的适用性；(4)涵盖蛋白质制剂中的常用范围的多种缓冲液基质，以鉴别潜在的测定干扰；(5)不同的样品基质，包括纯化过程中合并物和不同制剂的纯化的材料，以评估对生物工艺和制剂样品的适用性；(6)表征特异性、精密度、检测限(LOD)和定量限(LOQ)的测定性能；(7)几种纯化方案，以区分其相应的聚山梨醇酯降解的风险；(8)FFA和聚山梨醇酯水平，以确定酯酶活性与聚山梨醇酯降解之间的相关性；以及(9)微孔板形式，以获得更高的通量和更快的测定周转时间。通过这些研究，我们开发出一种快速(总周转时间<3小时)、高通量、基于板的测定法，其可用于通过检测对辛酸4-甲基伞形酮酯(MU-C8)荧光底物酮的酯酶活性来评估聚山梨醇酯降解的风险。
1.材料和方法
1.1.材料
所用的试剂包括Tris碱和Tris氯化物(Sigma Aldrich)、Triton X-100(USBiological)、阿拉伯树胶(Acros Organics)、4-甲基伞形酮(MU)和伞形酮反应产物(SigmaAldrich，纯度>98％)、奥利司他(Sigma，纯度>98％)和二甲基亚砜(DMSO)。4-甲基伞形酮基羧酸酯底物为购买或定制合成的，并且在使用前溶解于DMSO中。使用辛酸4-甲基伞形酮酯(MU-C8，Research Organics，纯度99％)、4-甲基伞形酮基癸酸酯(MU-C10，Santa CruzBiotechnology，纯度98％)、4-甲基伞形酮基月桂酸酯(MU-C12，Hande Sciences，纯度>99％)、4-甲基伞形酮基棕榈酸酯(MU-C16，Biosynth，纯度>99％)和4-甲基伞形酮基油酸酯(MU-C18:1，Chemodex，纯度>95％)，并且化学结构见图1。所用的模型酶为洋葱假单胞菌脂肪酶(PCL,Sigma Aldrich,35U/mg)、溶酶体磷脂酶A2(LPLA2，内部生产)和磷脂酶B样2(PLBL2，内部生产)。所用的七种单克隆抗体(mAb 1至mAb 7)是在内部生产的。选择这些mAb以涵盖一系列产品，包括不同的分子形式和生产宿主：mAb 1和mAb 5至7为IgG1；mAb 2至4为IgG4，包括一种双特异性抗体；mAb 3由细菌宿主大肠杆菌(E.coli)产生，而其他mAb由CHO谱系的哺乳动物宿主产生。除非另有说明，否则所有测试的纯化的蛋白质(即mAb)样品均来自超滤渗滤(UFDF)合并物。为生成UFDF合并物，将CHO或E.coli收获物通过层析步骤到UFDF阶段进行纯化，使最终mAb浓度为57至225mg/ml。所有板(96孔，货号3882，Corning)均使用SpectraMax M2/M2e(Molecular Devices)或Synergy Neo2(Biotek)酶标仪进行读取。
1.2.酯酶活性测定
该酯酶活性测定法通过酯键的断裂来监测非荧光底物4-甲基伞形酮基脂肪酸酯向荧光产物MU的转化。反应混合物含有80μl反应缓冲液(150mM Tris氯化物pH 8.0、0.25％(w/v)Triton X-100和0.125％(w/v)阿拉伯树胶)、10μl最终浓度为1mM的底物以及10μl模型酶溶液或蛋白质样品。每种缓冲液组分的浓度基于内部测定开发研究来选择(数据未显示)。在脂肪酶和酯酶活性测定中，先前使用50mM Tris氯化物运行缓冲液(pH 8.0，含0.01％阿拉伯树胶)确定活性速率(Nalder TD等人,Biochimie.2016；128-129:127-132)。Triton X-100已被证明增强双(4-甲基伞形酮基)磷酸酯的水解(Jones CS等人,BiochimBiophys Acta.1982；71(3):261-268.)。
将模型酶用水稀释至所需浓度。蛋白质样品由纯化过程中合并物样品或来自UFDF合并物的纯化的蛋白质样品组成。对纯蛋白质样品进行测定以获得足够高的荧光信号，或在纯样品观察到的速率过高(>10μM MU/h)时稀释2至4倍。将该反应设置在96孔板中，并且通过在酶标仪中将反应板在37℃孵育两小时，每10分钟监测荧光信号的增加(分别使用355nm和460nm的激发和发射波长)。代表总水解活性(来自酶促水解和非酶促水解)的MU产生速率源自从30分钟至120分钟的荧光时程的斜率，并且由反应原始速率(k原始)表示。
每个样品都需要酶空白反应(即，阴性对照)，该酶空白反应具有与相同的缓冲液基质，但省去了酶(或蛋白质溶液中的蛋白质)。该空白反应测量底物的非酶促水解，将其从总水解活性中减去，以得出样品的酶活性。酶空白反应速率代表特定样品基质中的底物的非酶促水解速率(k非酶促水解)。
酶促水解速率在本文中称为酯酶活性速率。对于给定的样品，酯酶活性速率通过从反应原始速率中减去非酶促水解速率并且将荧光信号从每小时相对荧光单位(RFU/h)转换为每小时产生的μM的MU(μM MU/h)来确定。通过在同一板上运行游离MU产品的标准曲线来支持该转换。将重复样品的测定测量值取平均，并且误差条代表距平均值一倍标准偏差(±1SD)。酯酶活性速率的计算
如公式1所述：
Figure BDA0004098114000000361
其中k原始＝样品的反应原始速率，以RFU/h为单位，
k非酶促水解＝酶空白的原始速率，以RFU/h为单位，
α＝计算出的从荧光信号到MU的浓度的转换因子，以RFU/μM MU为单位。
1.3.底物特异性
图1提供了在底物特异性实验中使用的MU底物。将PCL、LPLA2、PLBL2、mAb 1、mAb 2和mAb 3用五种具有不同链长的4-甲基伞形酮基羧酸酯底物(MU-CX，其中X＝羧酸酯基团中的碳原子数)进行了测试。将底物溶于DMSO中，使最终底物浓度为0.5mM，这是对之前所述的测定设置所做的唯一修改。如之前所述计算所有样品的酯酶活性速率。
1.4.奥利司他抑制
针对每个抑制反应新鲜制备在DMSO中的奥利司他储备液。将纯化的mAb 1(225mg/ml纯，在孵育期间25mg/ml)、PCL(50ng/ml)和LPLA2(50ng/ml)与奥利司他(最终奥利司他孵育浓度为0、0.5、1和10μM)一起在室温孵育2至3小时，然后利用酯酶活性测定法进行测量。通过将mAb 1制剂缓冲液或水(用于模型酶稀释)与奥利司他一起孵育来制备酶空白(阴性对照)样品。MU标准曲线还包含与测试样品相同浓度的奥利司他和DMSO，以支持准确确定相应样品基质中的转换因子a。根据通过酶空白(阴性对照)孔测量的背景荧光来调整速率。如之前所述计算所有样品的酯酶活性速率，单位为μM MU/h。
为考察奥利司他对PS20降解的影响，将经过亲和层析纯化的mAb 2(28mg/mL)、mAb6(22mg/ml)和mAb 7(22mg/ml)样品在DMSO(10％v/v)的存在下与奥利司他(0.2μM和20μM)一起或不与奥利司他一起在室温孵育5小时。然后向样品中加标PS20(0.04％v/v)和甲硫氨酸(20mg/ml)并且在25℃孵育12天。孵育后，通过定量FFA降解物(月桂酸)来分析样品中的PS20水解降解，如先前所详述(Cheng Y等人,J Pharm Sci.2019；108(9):2880-2886)。
1.5.pH依赖性
使用MU-C8作为荧光底物来表征PCL和mAb 2在不同pH下的酯酶活性。将基于150mMTris氯化物的运行缓冲液调节为允许测试7至9的扩展pH范围。利用150mM乙酸钠缓冲液在pH 4至6下进行测定。在使用前测量每种缓冲液的pH，以验证将缓冲液制备成与目标pH相差0.1个单位以内。为确认测定过程中的pH漂移最小，在执行酯酶活性测定后，利用Apix-pH自动测量系统(AB Controls)立即测量每个样品孔和对照孔的pH。利用实测pH绘制pH依赖性曲线。
1.6.样品基质干扰
使用MU-C8作为荧光底物来评估样品基质(即，缓冲液组成)对MU的非酶促水解速率和荧光强度的影响。在样品基质研究中评估了乙酸钠pH 5.5(20mM和50mM)、Tris乙酸盐pH 5.5(20mM和500mM)、组氨酸氯化物pH 5.5(20mM和50mM)、Tris氯化物pH 8.0(20mM和200mM)、HEPES氯化物pH 8.0(20mM和200mM)、精氨酸氯化物(500mM和1000mM)、氯化钠(500mM和1000mm)和硫酸钠(500mM和600mM)。
1.7.蛋白质和赋形剂干扰
为确定对酯酶活性测定的潜在的蛋白质干扰，向0、20、50和100ng/ml(最终浓度)的模型酶LPLA2中加标或不加标180mg/ml mAb 4，充分混合并且立即测定。对于未加标LPLA2的样品，加入水以代替LPLA2。除该研究以外，还测量了与标准测定反应缓冲液(无底物)混合的0mg/ml至200mg/ml mAb 1的荧光信号，该缓冲液在每种蛋白质浓度水平下含有0μM、5μM或10μM MU。MU浓度通过调节用于加标到反应孔中的MU的储备液浓度并且保持添加体积恒定(10μL)来实现。在充分混合后，通过比较在包含蛋白质(测试)和不含蛋白质(空白)的孔中测量的荧光来评估蛋白质对荧光的干扰。最后，通过将0.1％PS20或0.1％PS80加标到PCL、纯化mAb 1或纯化mAb 3中来测试来自典型制剂赋形剂(PS20和PS80)的潜在测定干扰。通过加入等体积的水来代替加入PS20或PS80，生成对照样品(不加标)。在使用MU-C8作为荧光底物测定酯酶活性之前，将所有样品充分混合并且在室温下孵育30分钟。
1.8.测定性能表征
使用mAb纯化过程中合并物样品来确定酯酶活性测定的特异性、精密度(重复性和中间精密度)、LOD和LOQ。选择三种类型的mAb样品以涵盖不同水平的酯酶活性：(1)mAb 1(UFDF合并物样品，浓度为220mg/mL)，代表高酯酶活性；(2)mAb 6(UFDF合并物样品，浓度为57mg/ml)，代表中等酯酶活性；以及(3)mAb 2(亲和合并物样品，浓度为12mg/ml)，代表低酯酶活性。首先，在两次测定过程中使用六个板来评估测定特异性和精密度。使用每个板每个样品十个样品量(n)评估重复性方面的测定精密度。两名分析员使用由不同批次试剂制备的样品评估测定中间精密度，然后在使用不同批次的板的单独的测试过程中进行分析。通过根据公式2计算的在样品中测得的MU-C8水解速率与缓冲液空白(阴性对照)之间的最小差异来评估测定特异性：
水解速率的最小差异＝(平均值样品-SD样品)-(平均值缓冲液-SD缓冲液)
其中平均值样品＝样品中MU-C8水解速率的平均值，
SD样品＝样品中MU-C8水解速率的标准偏差，
平均值缓冲液＝缓冲液中MU-C8水解速率的平均值，
SD缓冲液＝缓冲液中MU-C8水解速率的标准偏差。
接下来，在三个板上评估以下三种缓冲体系下的LOD和LOQ(每个板n＝12)：(i)50mM Tris乙酸盐，pH为5.5；(ii)50mM组氨酸氯化物，pH为5.5；以及(iii)200mM精氨酸氯化物。基于样品基质干扰研究的结果来选择缓冲液。将测定LOD确定为酯酶活性速率的单侧95％置信区间(CI酯酶活性速率)的两倍。将测定LOQ确定为单侧95％CI酯酶活性速率的六倍。缓冲液空白的MU-C8水解速率的平均值不包括在酯酶活性测定法的LOD和LOQ的计算中，因为在计算酯酶活性速率时减去了在缓冲液空白中测得的非酶促水解结果(公式1)。使用公式3计算单侧95％CI酯酶活性速率：
Figure BDA0004098114000000381
1.9.游离脂肪酸(FFA)测定
通过在与PS80在25℃一起孵育42天之前和之后定量FFA来测量mAb 2纯化过程中和纯化的UFDF合并物样品中的PS80降解。这种方法是由Tomlinson等人(Mol Pharm.2015；12(11):3805-3815)先前开发和描述的。简而言之，使用Oasis HLB树脂从样品中提取FFA聚山梨醇酯降解物，用I-芘基重氮甲烷衍生过夜，并且使用配备Acquity PDA检测器和Acquity BEH-300C18反相柱的UHPLC进行色谱分析。
1.10.聚山梨醇酯含量测定
mAb 5纯化的UFDF合并物样品中的PS20降解通过利用Hewitt等人(2008；1215(1-2):156-160)先前详述的HPLC-ELSD方法定量分析PS20含量(在40℃孵育7天之前和之后)来确定。mAb 2纯化过程中和纯化的UFDF合并物样品中的PS80降解通过使用相同的HPLC-ELSD方法定量分析PS80含量(在25℃孵育42天之前和之后)来确定。简而言之，将用聚山梨醇酯配制的样品直接进样至在混合模式下操作的HPLC。疏水性聚山梨醇酯保留在Water OasisMAX小柱上，通过阶梯梯度洗脱，并且利用ELSD将其作为单峰进行定量。
2.结果
2.1.底物特异性
选择用于测试基于MU的荧光底物的三种模型酶属于羧酸酯水解酶亚类(EC3.1.1)，该亚类属于水解酶主类别(EC 3)中的酯酶亚类(EC 3.1)。选择PCL、LPLA2和PLBL2以涵盖可水解聚山梨醇酯中存在的羧酸酯键的一系列酶。选择纯化的mAb 1至mAb 3以包括不同的IgG亚类(IgG1和IgG4)和生产宿主(CHO和E.coli)。这些模型酶和mAb旨在用作酯酶活性测定的阳性对照，因为预计它们会降解聚山梨醇酯。对于这些实验，选择0.5mM的最终底物浓度是由于具有较长链长度的底物(诸如MU-C16)的溶解度限制。
底物特异性实验(图2)表明，模型酶对测试的两个或更多碳链长度的MU酯表现出活性(例如，所有三种酶均水解MU-C8和MU-C10)，但蛋白质样品对MU-C8底物表现出最高的灵敏度。为此，选择MU-C8作为酯酶活性测定的主要底物。因此，MU-C8是以下所有后续研究中使用的荧光底物。
2.2.酯酶活性测定
示出在酯酶活性测定(使用MU-C8底物)中的反应原始速率(k原始)和酶空白的反应速率(k非酶促水解)的典型荧光时程图见图3(左)。k原始在纯化的mAb 2的存在下产生，指示对MU-C8中羧酸酯键的水解裂解的总活性(酶促水解和非酶促水解)。k非酶促水解在不存在纯化的mAb(即，阴性对照)的情况下产生，并且指示来自MU-C8的非酶促水解的背景荧光。MU标准曲线(不含MU-C8底物)的时程荧光迹线显示了在30至120分钟的测定持续时间内每个MU浓度下水解反应产物(MU)的稳定信号(图3，右)。荧光的初始变化是由于测定板从室温平衡至37℃，并且在该初始时间段(0至30分钟)后荧光信号达到稳定。k原始、k非酶促水解和MU荧光特定于反应条件(例如，pH、样品和缓冲液基质)。因此，对于每种样品类型和测定条件，必须包括酶空白作为阴性对照；在计算酯酶活性速率时，酶空白用于说明背景荧光。
2.3.奥利司他抑制
奥利司他抑制PPL、微生物脂肪酶和哺乳动物羧酸酯酶，但效力有所不同。因此，本文包括奥利司他作为酯酶活性测定的阴性对照。为评估该测定法检测奥利司他抑制的能力，用mAb 1以及模型酶PCL和LPLA2加标，并且与奥利司他一起预孵育，然后测试酯酶活性。如图4所示，与DMSO对照(0μM奥利司他)相比，用奥利司他处理的mAb 1的酯酶活性速率呈剂量依赖性降低。此外，对于测试的奥利司他浓度，观察到PCL和LPLA2模型酶对酯酶活性的完全抑制。
为直接考察奥利司他对抑制mAb样品中聚山梨醇酯降解的影响，将经过亲和层析纯化的mAb2、mAb 6和mAb 7的CHO细胞培养物与奥利司他一起或不与奥利司他一起孵育。月桂酸是PS20水解的主要降解物，因此它是样品中存在的最丰富且定量最可靠的FFA物质。月桂酸释放速率将指示样品中水解PS20降解的速率。通过计算用奥利司他处理的mAb样品中的FFA释放速率相对于未经奥利司他处理的相同样品的百分比降低来评估奥利司他抑制PS20降解的功效(表1)。例如，奥利司他处理对水解PS20降解的完全抑制将导致FFA释放速率降低100％。与利用酯酶活性测定法评估的mAb 1的奥利司他孵育结果相似(图4)，对于mAb 2、6和7，观察到奥利司他抑制的剂量依赖性影响。与阴性对照(0μM奥利司他)相比，对于用奥利司他处理的样品，观察到PS20降解速率的下降(如FFA释放速率的下降所示)。
表1.奥利司他孵育以及对蛋白质样品(mAb 2、mAb 6和mAb 7)的PS20降解的相应影响
Figure BDA0004098114000000411
*报告的结果相对于未经奥利司他处理的样品(阴性对照)计。基于月桂酸测量FFA释放速率并且指示PS20降解速率。
2.4.pH依赖性
接下来的研究考察了MU-C8的酶促水解和非酶促水解的pH依赖性。对于这些实验，将测定运行缓冲液调整为由150mM乙酸钠(pH 4至6)和150mM Tris氯化物(pH 7至9)组成。图5所示的迹线显示了反应完成后每个样品的实测pH值；观察到目标pH值(在实验开始前测得的每种缓冲液的值)和实验后立即测得的样品pH值之间的偏差很小。标称pH 4至9范围内底物的MU荧光和非酶促水解见图5(顶部，左侧和右侧)。在不存在酶但存在底物和反应缓冲液的情况下测得的非酶促水解速率随pH增加而提高，突出显示了MU-C8水解的pH依赖性(图5，右上)。
仔细监测样品(包含蛋白质)和阴性对照(不含蛋白质)孔中荧光信号的分离，以确保得到可靠的样品信号。PCL的pH依赖性曲线指示与使用mAb 2所观察到的趋势不同的依赖性(图5，底部)。PCL表现出较低的最佳pH，而纯化的mAb 2(UFDF合并物)样品表现出较高的最佳pH。由于酯酶活性测定的目的是检测由mAb 2样品代表的纯化过程中合并物和纯化的材料(例如，UFDF合并物、原料药或药物产品)中的水解酶活性，因此选择pH 8.0作为该测定的默认pH。
2.5.缓冲液基质干扰
为评估缓冲液基质对测定的影响，测试了八种常用的制剂缓冲液和盐。图6显示了与水(以黑色显示)相比，不同样品基质的平均MU荧光和底物非酶促水解。样品浓度的选择基于它们与纯化工艺和原料药或药物产品制剂的相关性。在两个浓度下评估每种缓冲液或盐。与水对照相比，高浓度(500mM)的Tris乙酸盐使MU荧光降低20％以上，而500mM和600mM硫酸钠使MU荧光提高10％至20％。此外，非酶促水解速率随高水平的Tris乙酸盐(500mM)而降低，而在测试的组氨酸氯化物(20mM至50mM)和精氨酸氯化物(500mM至1000mM)的水平下增加。所有其他条件均引起与水对照相比，MU荧光或非酶速率变化不超过10％。
2.6.蛋白质和赋形剂干扰
为考察蛋白质产物(例如，来自过程中纯化合并物或纯化的mAb)对测定的潜在影响，实施了三项蛋白质干扰实验。如图7中的平行线所示(左上角)，在高达100ng/ml的模型酶LPLA2中添加180mg/ml mAb 4不改变计算出的酯酶活性速率。图7(右上)还示出，将0、50、100和200mg/ml的mAb 1添加至0、5和10μM MU中后，蛋白质对荧光不产生干扰。这进一步证明，高浓度蛋白质的存在应不干扰酯酶活性速率计算或实测荧光。
为进一步考察在赋形剂的存在下蛋白质产物对测定的潜在影响，将模型酶PCL、纯化的mAb 1和纯化的mAb 3与水一起孵育(未加标)或加标赋形剂(PS20或PS80)。如图7(底部)所示，与加入水以代替聚山梨醇酯(未加标)的对照相比，添加PS20或PS80不改变所测试的蛋白质样品的酯酶活性速率。
2.7.测定性能表征
为表征酯酶活性测定的性能，评估了特异性、精密度(重复性和中间精密度)、LOD和LOQ。选择用于评估测定特异性和精密度的三种类型的mAb样品以涵盖一系列酯酶活性速率(表2)。在测定特异性方面，对于测试的所有三种mAb，mAb样品与缓冲液空白(阴性对照)之间的MU-C8水解速率的最小差异超过1μM MU/h。对于测试的所有三种样品类型，重复性和中间精密度的相对标准偏差(RSD)值均小于6％。
表2.使用三种类型的mAb样品评估测定特异性和精密度
Figure BDA0004098114000000431
*纯化过程中合并物样品类型。
**在两个测定过程中，六个板的平均酯酶活性速率，每个板包含10个重复样品。
***使用公式2计算的水解速率的最小差异。
****RSD(％)表示两名分析员在单独的测定过程中的中间精密度(每个板n＝10；每名分析员和分析过程使用3个板；每名分析员进行单独的试剂制备)。
为进一步表征不同样品基质对测定性能的影响，选择三种缓冲液以覆盖基质干扰的潜在范围：50mM Tris乙酸盐代表干扰最小的基质，而50mM组氨酸氯化物和200mM精氨酸氯化物代表具有可观察到的基质干扰的组氨酸和精氨酸缓冲液(图6)。使用这三种缓冲液来确定酯酶活性测定法的LOD和LOQ值(表3)。
表3.确定酯酶活性测定法的LOD和LOQ
Figure BDA0004098114000000432
*使用三个板和三种类型的缓冲液来评估测定LOD和LOQ(每个板n＝12)。
**使用单侧95％Cl酯酶活性速率的两倍来计算LOD(公式3)。
***使用单侧95％Cl酯酶活性速率的六倍来计算LOQ(公式3)。
2.8.纯化工艺中UFDF合并物样品的比较
为评估该测定法在生物工艺开发中的应用，对通过三种不同的纯化工艺纯化为UFDF合并物的mAb5样品的酯酶活性速率进行了比较：工艺A、工艺B和工艺C(图8)。这三个过程在色谱树脂、上样密度和合并标准方面有所不同。如实测酯酶活性速率所示，由于与工艺C相比，在工艺A和B中测得的酯酶活性速率较低，因此假设工艺C在去除酯酶方面的效率低于工艺A或B。对于这三个工艺中的每一者，利用HPLC-ELSD方法测得的40℃下的PS20含量变化进一步支持了这一假设。观察到与酯酶活性测量相同的趋势：工艺A和B的PS20降解最小，而工艺C表现出的PS20降解明显高于工艺A或B(图8，右)。此外，对于工艺A和工艺B，酯酶活性速率的相似性证实了它们在PS20含量损失方面的相似性。这些观察结果说明了该酯酶活性测定在评估纯化工艺中聚山梨醇酯降解风险方面的相关性：其提供了快速输出(总测定周转时间小于3小时)，以比较不同下游加工条件去除降解聚山梨醇酯的残留酯酶的有效性。
2.9.FFA和聚山梨醇酯降解相关性
为研究该测定法用于预测聚山梨醇酯降解风险的用途，对mAb 2的不同合并物样品中的PS80降解速率和酯酶活性进行了比较(图9)。测试的样品包括对于应用于mAb 2的两种不同纯化工艺的来自多个阶段(亲和色谱、离子交换色谱和UFDF)的纯化过程中合并物。为便于比较，将所有样品处理成相同的25mg/ml制剂。PS80降解通过主要降解产物(C18:1FFA)的增加和PS80含量的减少来衡量。观察到C18:1FFA释放率与酯酶活性之间(图9，左)以及PS80含量下降率与酯酶活性之间(图9，右)的正相关性。
3.讨论
本文所公开的结果证明了该酯酶活性测定法以快速、高通量的方式评估生物工艺开发过程中聚山梨醇酯降解风险的适用性。针对一系列纯化过程中合并物和纯化蛋白质(UFDF合并物)样品，对MU-C8底物进行了测试(图2至5，图7至9)。纯化的样品(mAb 1至mAb5)经历了色谱步骤以去除残留HCP，并且代表将被加工成原料药和药物产品的UFDF合并物。因此，预计本文测试的样品的HCP水平低于Jahn等人测试的加标样品。本文测试的样品还包括多种mAb产品(由CHO宿主产生的四种IgG1和两种IgG4，以及由E.coli宿主产生的一种IgG4)。在酯酶活性测定的早期开发过程中，优化了激发波长和测定运行缓冲液组分(Tris氯化物、Triton X-100和阿拉伯树胶)的浓度(数据未显示)。本文测试的测定条件代表优化的条件，并且与先前报道的条件不同。
基于使用酯酶活性测定法收集的数据，显然该测定法可以检测纯化过程中(图9和表2)和纯化蛋白质样品(图2至5，图7至9)中残留的酯酶活性。图3显示，UFDF合并物样品中存在可靠的可测量活性，可与背景荧光(归因于非酶促水解)区分开，表明存在一种或多种能够水解MU-C8中的羧酸酯键的酶。反应原始速率和非酶促水解的荧光迹线表现出高重现性(图3)，如代表重复样品之间的标准偏差的不重叠的小误差条所示。来自图5的额外的荧光轨迹进一步证明基于微孔板的酯酶活性测定法在板内和板间产生了可靠且可重现的数据。
为支持更快速的生物工艺开发和高效的研究，我们旨在缩短Jahn等人报道的用于脂肪酶测定(使用Eppendorf试管进行水解反应)的测定孵育时间(约24至300小时)。如图3所示，该酯酶活性测定法提供了更短的孵育时间(2小时)并且支持在当天读数。基于微孔板的形式能够对更多样品和测定条件进行高通量筛选(每个板30个样品，一式两份运行，由最多七种不同的缓冲液空白基质组成)。该微孔板形式还可以通过自动化来进一步提高效率。为选择适当的荧光MU酯底物，测试了五种MU酯：MU-C8、MU-C10、MU-C12、MU-C16和MU-C18:1。选择多种MU酯来评估空间位阻和碳链长度对酯酶活性的影响。但是，未选择具有较短链长的MU酯，因为MU-C4被证明是脂肪酶和磷脂酶的次优底物，并且具有C2和C4的显色底物先前被证明对测试的33种水解酶(主要是脂肪酶)的反应不佳。
图2所示的底物特异性实验表明，MU-C8是一种广泛且敏感的底物，可用于模型酶和纯化的蛋白质样品。发现MU-C16是溶解度最低的底物，在这些实验中将其浓度限制在0.5mM。包括MU-C18:1底物以揭示PS80中存在的油酸(C18:1)侧链的影响。与MU-C8不同，该MU-C18:1底物对测试的纯化蛋白质(mAb 1至3)样品中的每一者均未表现出活性。文献中报道的先前研究已经表明，与4-MU相比，伞形酮是一种更稳定的荧光团。但是，那些研究并未测试生物制药样品。相比之下，我们的研究测试了使用生物制药相关工艺产生的纯化mAb样品，并且结果表明MU-C8可用于酯酶活性测定，该测定在多种样品类型中具有高重现性(表2)。
除测试各种MU酯底物外，我们还测试了一系列模型酶和样品类型。选择三种模型酶作为阳性对照，因为它们与聚山梨醇酯降解有关：(1)PCL代表降解PS20和PS80的模型脂肪酶；(2)LPLA2降解PS20和PS80，并且存在于mAb制剂(9)中；(3)PLBL2被鉴别为与硫酸酯酶药物产品中PS20降解相关联的残留HCP。该测定检测模型酶(PCL、LPLA2和PLBL2)和纯化蛋白质(mAb 1至3)中的酯酶活性，如底物特异性(图2)和pH依赖性(图5)实验所示。此外，包括大肠杆菌源性纯化蛋白质样品(mAb 3)证明了该测定法检测细菌生产系统中的酶活性的能力(图2)。
在本研究中观察到的PLBL2有限的酯酶活性与最近的发现一致，表明PLBL2(也称为PLBD2)不太可能导致PS降解。如图2所示，与其他两种酶(PCL和LPLA2)相比，PLBL2对水解所测试的五种MU酯的活性显著降低：相对于PCL和LPLA2(测试的浓度均为20ng/ml)，需要提高20,000倍的PLBL2浓度(400μg/ml)来引发MU酯水解。
在脂肪酶抑制剂奥利司他的存在下，纯化的蛋白质样品和模型酶表现出对MU-C8水解的降低的酯酶活性(图4)。奥利司他被开发用于抑制胰脂肪酶，并且它对不同的酶表现出不同的效力。特别地，奥利司他显著抑制羧酸酯酶2，但不抑制羧酸酯酶1。值得注意的是，奥利司他对羧酸酯酶1(CES1)缺乏效力，因为CES1与最近被鉴别为mAb制剂中聚山梨醇酯降解的根本原因的两种CHO羧酸酯酶(CES-B1L和CES-1L)具有实质性序列同源性。
实施了一项单独的奥利司他孵育研究，通过测量月桂酸(PS20水解的主要FFA降解物)的释放来直接评估奥利司他对蛋白质样品(mAb 2、6和7)中PS20降解的影响。即使奥利司他浓度从0.2μM增加至20μM，奥利司他也不会完全抑制这些蛋白质样品中PS20的水解(表1)。类似地，即使奥利司他浓度从0.5μM增加至10μM，奥利司他也不会完全抑制mAb 1样品中MU-C8的水解(图4)。在使用各种纯化的mAb样品的其他奥利司他孵育研究中，我们还观察了奥利司他抑制功效的范围(数据未显示)。总之，这些结果表明，奥利司他孵育在不同的蛋白质样品中不同程度地减轻了PS20降解。我们假设(1)奥利司他不能完全有效地抑制一些降解聚山梨醇酯的CHO源性酶HCP；以及(2)对奥利司他抑制有抗性或不太敏感的残留水解HCP的种类和数量可能因纯化的蛋白质样品而异。因此，可以预见，奥利司他能够抑制mAb 1样品中存在的可水解MU-C8的一部分但非全部的残留HCP。同样，可以预见，奥利司他能够抑制mAb 2、mAb 6和mAb 7样品中存在的可水解PS20的一部分但非全部的残留HCP。
pH依赖性实验证明需要在最大荧光信号与可靠的速率测量之间进行折衷。图5所示的pH依赖性曲线表明，纯化的蛋白质样品(mAb 2)在pH 7.5和pH 8.5之间的活性速率急剧增加。在mAb样品中观察到的较高活性速率可能与在碱性pH范围内对MU-C8底物的较高的酶活性相关联。先前证明可降解CHO源性mAb样品(15,20)中的聚山梨醇酯的酶在碱性pH范围内可能更活跃：LPL在pH为8或更高时具有升高的活性(39)；羧酸酯酶在pH约6.5至8.0时具有最佳活性(14)。在增加的pH下观察到的更高的活性速率可归因于增加的碱介导的底物的非酶促水解。当在较高pH下操作时，观察到的非酶促水解速率的急剧增加可能降低测定灵敏度。但是，即使在pH 8.0时，我们的研究表明样品(测试)和酶空白(阴性对照)反应孔之间的荧光存在明显差异。因此，可通过确保从总荧光(测试样品)中始终减去背景荧光(即，来自阴性对照中的非酶促水解的信号)来计算给定样品的酯酶活性速率。为酯酶活性测定选择的pH 8.0在低活性样品的灵敏度和在高更碱性pH条件下增加的非酶促水解之间提供了最佳平衡。
在pH 8.0下，用于酯酶活性测定的pH高于药物产品中的典型pH。相比之下，检测FFA水平的测定被设置为测量制剂pH下的水解聚山梨醇酯降解；但是，降解率如此之低，以至于需要延长孵育时间(>1周)以产生足够高水平的FFA以支持可靠的定量。鉴于难以检测纯化的样品中的残留水解HCP的痕量水平，我们优先选择增强酯酶活性的测定pH，而不是使用具有代表性的制剂pH。尽管我们观察到在较高的测定pH 8下具有更高的酶活性，但是但理论上可能存在不同的趋势。对于给定的纯化蛋白质样品，预计酯酶活性的最佳pH取决于其酶特征。如果样品含有在较低pH下具有升高的酯酶活性的残留HCP，则预计该样品在酯酶活性测定中显示出相应较低的最佳pH。在此类情况下，可以降低用于酯酶活性测定的pH以提高测定灵敏度。但是，可能不需要对测定进行此类pH调整，因为该测定法主要用于支持生物工艺开发(例如，对聚山梨醇酯降解风险的纯化方案和条件进行排序)而不是制剂开发。如针对mAb 5的生物工艺开发实例所示(图8)，在去除水解HCP方面效率最低的纯化工艺(即，工艺C)产生了最高的酯酶活性速率(在pH 8.0下测试)和最高的聚山梨醇酯降解(在制剂pH<6.0下测试)。
图6显示的对缓冲液和盐种类的综合评估表明，大多数样品背景适用于酯酶活性测定。测试的样品基质对测得的荧光和非酶促水解速率无负面影响。生物加工中常用的高浓度乙酸盐和硫酸盐可能影响测得的荧光，并且可能导致测定灵敏度降低。高水平乙酸盐、低水平组氨酸和高水平精氨酸增加了底物的碱介导的非酶促水解。通过确保始终从用于计算酯酶活性速率的反应原始速率(k原始)中减去非酶促水解速率(k非酶促水解)来解决相关的背景荧光。但是，与表现出较低背景荧光的缓冲液的样品相比，较高的非酶促水解速率可能引起较低的测定灵敏度。在此类情况下，检查原始数据以验证k原始和k非酶促水解之间的明显差异将有助于确定是否需要额外的样品处理步骤。例如，如果未观察到k原始与k非酶促水解之间的明显分离，则可以实施样品调整措施(例如，缓冲液交换)。针对组氨酸测试的范围与药物产品制剂相关，并且在不采取样品调整措施的情况下可能影响测定这些样品的能力。对于此类制剂，如果需要提高测定灵敏度，则可以交换样品缓冲液以最大程度减小背景干扰。但是，我们的研究表明，大多数样品，即使是那些含有组氨酸或精氨酸的样品，也可以直接进行分析，而无需事先的样品调节步骤。
在优化测定底物(图2)和条件(图5和6)后，进一步测试该测定法以验证不存在蛋白质或赋形剂干扰(图7)。高浓度mAb 4(180mg/ml)不干扰计算出的模型酶LPLA2的酯酶活性速率，如添加水的LPLA2与用mAb 4加标的LPLA2之间的平行的活性线所示(图7，左上)。这两条线之间的垂直差异归因于mAb 4本身的酯酶活性速率，其本身显示出可测量的活性速率。该垂直差异在测试的整个浓度范围内保持不变，因此它不影响模型酶LPLA2的活性速率计算。此外，在与生物制药制剂相关的范围内，荧光不受高浓度蛋白质的影响(图7，右)，并且酯酶活性速率不受赋形剂诸如蔗糖(数据未显示)、PS20和PS80(图7，底部)的影响。
进一步评估酯酶活性测定的特异性、精密度、LOD和LOQ(表2和3)。表征研究证明了测定特异性和精密度(<6％RSD)。正如预期的那样，对于与较高的基质干扰相关联的组氨酸和精氨酸缓冲液，LOD和LOQ值(图6)高于在Tris乙酸盐(50mM)中得到的结果。但是，在测试的所有三种缓冲液中，与典型的测试输出范围(>1μM MU/h；图2、图4至9)相比，酯酶活性测定法的LOD和LOQ值相对较低(<1μM MU/h；表3)。
最后，该测定法被证明适用于评估代表性生物工艺条件下聚山梨醇酯降解的风险。具体地，将该测定法与用于在生物工艺开发过程中定量分析聚山梨醇酯降解的两种常规(且更耗时)方法进行比较，其中一种方法测量聚山梨醇酯含量(6)并且另一种方法测量FFA聚山梨醇酯降解物(8)。酯酶活性测定在鉴别引起PS20降解的相对风险较低的生物工艺方面取得了成功(图8)。酯酶活性速率还与通过两种常规方法测得的PS80降解速率呈正相关(图9)。此外，我们发现对于其他mAb存在类似的正相关性，其中观察到聚山梨醇酯降解(数据未显示)。总之，这些研究表明，这种酯酶活性测定法可以在生物工艺开发和非常规调查(例如，技术转让期间的故障排除)期间提供对聚山梨醇酯降解风险的快速评估。尽管在酯酶活性与聚山梨醇酯降解速率之间观察到正相关性，但是该酯酶活性测定法存在理论上的局限性。该测定法的主要优势(使用荧光MU-C8底物提供更容易且更快速的测定读数)也代表其主要弱点。MU-C8不是PS20或PS80(通常用于药物产品中的表面活性剂)。残留HCP对MU-C8与PS20或PS80中的羧酸酯键的水解活性可能不同。同样，在该测定法中使用的pH 8.0可以增强纯化样品中酯酶活性的检测，但它并不代表肠胃外药物产品中所用的较低pH。
为弥补该酯酶活性测定法的理论局限性，可以在生物工艺开发过程中应用双阶段方法：(1)筛选纯化方案/条件，以鉴别最有希望使用该酯酶活性测定法的纯化工艺；(2)针对最优先的生物工艺选项直接评估纯化产品中聚山梨醇酯的降解情况，以使用基于FFA的测定来选择最终下游工艺。在第一阶段，通过测量降解MU-C8的HCP的残留水平，该酯酶活性测定法支持生物工艺开发的关键目标，即优化用于去除HCP的下游加工。该酯酶活性测定法可筛选大量样品以选择子集，通过基于FFA的测定进行后续测试(在以聚山梨醇酯作为底物的最终制剂条件下)。在第二阶段，通过直接测量聚山梨醇酯降解情况并且将其与在第一阶段期间获得的酯酶活性速率相关联，可确定酯酶活性测定用于评估聚山梨醇酯降解风险的相关性和关联(如图8和9中的实例所示)。通过这种方式，双阶段方法解决了用于评估聚山梨醇酯降解情况的每种工具的局限性，同时利用每种测定法的优势来指导生物工艺开发。
缩写
α：计算出的从荧光信号到MU的浓度的转换因子，以RFU/μM MU为单位
C18:1：油酸
CES1：羧酸酯酶1
CES-1L：羧酸酯酶1样
CES-B1L：羧酸酯酶B-1样
CHO：中国仓鼠卵巢
Cl酯酶活性速率：酯酶活性速率的置信区间
DMSO：二甲基亚砜
E.coli：大肠杆菌
ELSD：蒸发光散射检测器
FFA：游离脂肪酸
HCP：宿主细胞蛋白质
HPLC：高效液相色谱法
k非酶促水解：酶空白的反应速率，以RFU/h为单位
k原始：样品的反应原始速率，以RFU/h为单位
LOD：检测限
LOQ：定量限
LPL：脂蛋白脂肪酶
LPLA2：溶酶体磷脂酶A2
mAb：单克隆抗体
MU：4-甲基伞形酮
MU-C7：4-甲基伞形酮基庚酸酯MU-C8：4-甲基伞形酮基辛酸酯MU-
C10：4-甲基伞形酮基癸酸酯
MU-C12：4-甲基伞形酮基月桂酸酯
MU-C16：4-甲基伞形酮基棕榈酸酯
MU-C18:1：4-甲基伞形酮基油酸酯
n：样品量
PCL：洋葱假单胞菌脂肪酶
PDA：光电二极管阵列
PLBL2/PLDB2：磷脂酶B样2
PPL：猪胰脂肪酶
PS20：聚山梨醇酯20
PS80：聚山梨醇酯80
RFU：相对荧光单位
RSD：相对标准偏差
SD：标准偏差
UFDF：超滤渗滤
UHPLC：超高效液相色谱法

Claims (51)

1.一种用于确定样品中的宿主细胞蛋白质(HCP)的酶活性的测定法，其中所述HCP包含水解酶，所述测定法包括以下步骤：
a)在微孔板中获得反应混合物，其中所述反应混合物包含：所述样品、反应缓冲液和作为荧光底物的4-甲基伞形酮羧酸酯；
b)获得阴性对照；
c)将所述反应混合物和所述阴性对照暴露于荧光信号；
d)监测由于暴露于所述荧光信号引起的所述反应混合物中的所述荧光底物从非荧光状态到荧光产物的转化，其中所述荧光产物为4-甲基伞形酮(MU)；以及
e)基于在步骤d)中所述荧光底物的转化来确定和定量HCP酶活性。
2.根据权利要求1所述的测定法，其中所述样品包含两种或更多种不同的HCP。
3.根据权利要求1或2所述的测定法，其中在步骤e)中的所述HCP酶活性代表所述样品中的两种或更多种HCP的总体活性。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的测定法，其中所述反应混合物包含至少两种不同的荧光底物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的测定法，其中所述HCP包括酯酶。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的测定法，其中所述HCP包括羧酸酯水解酶，并且其中所述HCP任选地包括脂肪酶和羧酸酯酶。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的测定法，其中所述荧光底物具有8、10、12、16和/或18的碳链长度。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的测定法，其中所述荧光底物为辛酸4-甲基伞形酮酯(MU-C8)。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的测定法，其中所述荧光底物为癸酸4-甲基伞形酮酯(MU-C10)。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的测定法，其中所述样品包含来自原核或真核宿主的产物。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的测定法，其中所述样品包含由原核或真核宿主产生的重组蛋白。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的测定法，其中所述样品包含由细菌或哺乳动物宿主产生的重组蛋白。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的测定法，其中所述样品包含基于IgG形式并且由细菌或哺乳动物宿主产生的重组蛋白。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的测定法，其中所述样品包含基于IgG形式并且由大肠杆菌或中国仓鼠卵巢(CHO)宿主产生的重组蛋白。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的测定法，其中所述样品包含选自由以下项组成的组的重组蛋白：IgG1 mAb、IgG4 mAb、双特异性抗体；由细菌宿主产生的mAb和由哺乳动物宿主产生的mAb。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的测定法，其中所述阴性对照为酶空白。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的测定法，其中所述反应混合物中的所述荧光底物具有约0.1mM至5mM、约0.1mM至4mM、约0.1mM至3mM、约0.1mM至2mM或约0.5mM至1.0mM的浓度。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的测定法，其中所述样品为经过层析纯化的合并物样品。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的测定法，其中在步骤b)中，使用分别为300nm至400nm和400nm至500nm、任选地分别为约355nm和460nm的激发波长和发射波长，将所述样品暴露于增加的荧光信号下。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的测定法，其中在步骤c)中，孵育所述样品任选地持续约1小时至5小时、约1小时至4小时、约1小时至3小时或约2小时。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的测定法，其中在步骤c)中，每5分钟至15分钟监测所述样品，或其中任选地每10分钟监测所述样品。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的测定法，其中所述反应混合物具有约4至9、约5至9、约6至9、约7至9或约8的pH。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的测定法，其中所述酶活性用于评估所述样品中对聚山梨醇酯降解的水解活性水平。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的测定法，其中所述测定法的输出用于比较和选择纯化工艺以改善水解HCP的去除。
25.一种用于确定样品中的宿主细胞蛋白质(HCP)的酶活性的测定法，
其中所述HCP包含水解酶，并且所述测定法包括以下步骤：
a)获得包含所述样品、反应缓冲液和荧光底物的反应混合物，其中所述荧光底物为4-甲基伞形酮羧酸酯，其中所述4-甲基伞形酮羧酸酯中的羧酸酯包含不超过十个碳；
b)在一个或多个时间点测量所述荧光信号；以及
c)基于测量的荧光确定和定量HCP酶活性。
26.根据权利要求25所述的测定法，其中所述4-甲基伞形酮羧酸酯中的所述羧酸酯包含不超过8个碳。
27.根据权利要求25所述的测定法，其中所述4-甲基伞形酮羧酸酯为MU-C8。
28.根据权利要求25所述的测定法，其中所述4-甲基伞形酮羧酸酯为MU-C10。
29.根据权利要求25所述的测定法，其中在步骤c)中确定和定量的所述HCP酶活性代表所述样品中的两种或更多种HCP的总体活性。
30.根据权利要求25至29中任一项所述的测定法，其中所述测定法进一步包括
a.获得阴性对照，所述阴性对照包含与所述反应混合物相同的反应缓冲液和荧光底物；
b.在相同的一个或多个时间点测量所述阴性对照的荧光信号；以及
c.通过从所述反应混合物中观察到的荧光信号的量中减去所述阴性对照中观察到的荧光信号的量来确定和定量所述HCP酶活性。
31.根据权利要求25至30中任一项所述的测定法，其中所述反应混合物包含至少两种不同的荧光底物。
32.根据权利要求25至31中任一项所述的测定法，其中所述HCP包括酯酶。
33.根据权利要求25至32中任一项所述的测定法，其中所述HCP包括羧酸酯水解酶，任选地所述HCP包括脂肪酶和羧酸酯酶。
34.根据权利要求25至33中任一项所述的测定法，其中所述样品包含来自原核或真核宿主的产物。
35.根据权利要求25至34中任一项所述的测定法，其中所述样品包含由原核或真核宿主产生的重组蛋白。
36.根据权利要求25至35中任一项所述的测定法，其中所述样品包含由细菌或哺乳动物宿主产生的重组蛋白。
37.根据权利要求25至36中任一项所述的测定法，其中所述样品包含基于IgG形式并且由细菌或哺乳动物宿主产生的重组蛋白。
38.根据权利要求25至37中任一项所述的测定法，其中所述样品包含基于IgG形式并且由大肠杆菌或中国仓鼠卵巢(CHO)宿主产生的重组蛋白。
39.根据权利要求25至38中任一项所述的测定法，其中所述样品包含选自由以下项组成的组的重组蛋白：IgG1 mAb、IgG4 mAb、双特异性抗体；由细菌宿主产生的mAb和由哺乳动物宿主产生的mAb。
40.根据权利要求25至39中任一项所述的测定法，其中所述阴性对照为酶空白。
41.根据权利要求25至40中任一项所述的测定法，其中所述反应混合物中的所述荧光底物具有约0.1mM至5mM、约0.1mM至4mM、约0.1mM至3mM、约0.1mM至2mM或约0.5mM至1.0mM的浓度。
42.根据权利要求25至41中任一项所述的测定法，其中所述样品为经过层析纯化的合并物样品。
43.根据权利要求25至42中任一项所述的测定法，其中在步骤b)中，使用分别为300nm至400nm和400nm至500nm、任选地分别为约355nm和约460nm的激发波长和发射波长，将所述样品暴露于增加的荧光信号下。
44.根据权利要求25至43中任一项所述的测定法，其中在步骤c)中，孵育所述样品任选地持续约2小时、约1小时至5小时、约1小时至4小时或约1小时至3小时。
45.根据权利要求25至44中任一项所述的测定法，其中在步骤c)中，每5分钟至15分钟监测所述样品，或其中任选地每10分钟监测所述样品。
46.根据权利要求25至45中任一项所述的测定法，其中所述反应混合物具有约4至9、约5至9、约6至9、约7至9或约8的pH。
47.根据权利要求25至46中任一项所述的测定法，其中所述酶活性用于评估所述样品中对聚山梨醇酯降解的水解活性水平。
48.根据权利要求25至47中任一项所述的测定法，其中所述测定法的输出用于比较和选择纯化工艺以改善水解HCP的去除。
49.一种组合物，其包含
(a)水性测定样品，其包含蛋白质制剂，
(b)有机溶剂，其包含反应缓冲液和至少一种4-甲基伞形酮羧酸酯；
其中所述荧光底物为4-甲基伞形酮羧酸酯，并且其中所述4-甲基伞形酮羧酸酯中的羧酸酯包含不超过十个碳原子。
50.一种确定蛋白质制剂的稳定性的方法，其包括
a.在微孔板中获得反应混合物，其中所述反应混合物包含：所述样品、反应缓冲液和作为荧光底物的4-甲基伞形酮羧酸酯；
b.获得阴性对照；
c.将所述反应混合物和所述阴性对照暴露于荧光信号；
d.监测由于暴露于所述荧光信号引起的所述反应混合物中的所述荧光底物从非荧光状态到荧光产物的转化，其中所述荧光产物为4-甲基伞形酮(MU)；以及
e.基于在步骤d)中所述荧光底物的转化来确定和定量HCP酶活性。
51.一种优化或选择蛋白质纯化工艺以改善水解HCP的去除的方法，所述方法包括
a.在微孔板中获得反应混合物，其中所述反应混合物包含：所述样品、反应缓冲液和作为荧光底物的4-甲基伞形酮羧酸酯；
b.获得阴性对照；
c.将所述反应混合物和所述阴性对照暴露于荧光信号；
d.监测由于暴露于所述荧光信号引起的所述反应混合物中的所述荧光底物从非荧光状态到荧光产物的转化，其中所述荧光产物为4-甲基伞形酮(MU)；以及
e.基于在步骤d)中所述荧光底物的转化来确定和定量HCP酶活性。
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