TW202221008A - 製備蛋白質組成物之方法 - Google Patents

製備蛋白質組成物之方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202221008A
TW202221008A TW110129136A TW110129136A TW202221008A TW 202221008 A TW202221008 A TW 202221008A TW 110129136 A TW110129136 A TW 110129136A TW 110129136 A TW110129136 A TW 110129136A TW 202221008 A TW202221008 A TW 202221008A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
protein
hydrolase
solid support
composition
inhibitor
Prior art date
Application number
TW110129136A
Other languages
English (en)
Inventor
羅伯托 佛肯斯丹
法蘭克 威德開恩德
馬汀 藍普特
麥可 黎司
法蘭賽斯卡 艾德爾曼
托比爾斯 葛拉夫
Original Assignee
瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 filed Critical 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Publication of TW202221008A publication Critical patent/TW202221008A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本發明大致上涉及提供製備蛋白質組成物的工具和方法。本發明提供一種方法，其包含以下步驟 (i)        使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii)       將包含該蛋白質之組成物回收。 此外，本發明涉及一種製備蛋白質調配物之方法，該方法包含以下步驟 (i)        使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii)       將包含該蛋白質之組成物回收， 其中用於製備該蛋白質調配物之該方法進一步包含將界面活性劑、較佳的是脂肪酸酯加入包含該蛋白質之該組成物。 此外，本發明涉及藉由或可藉由本文所述之方法獲得的蛋白質組成物且/或涉及藉由或可藉由本文所述方法獲得的蛋白質調配物。

Description

製備蛋白質組成物之方法
本發明大致上涉及提供製備蛋白質組成物的工具和方法。本發明提供一種方法，其包含以下步驟 (i)  使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii) 將包含該蛋白質之組成物回收。
此外，本發明涉及一種製備蛋白質調配物之方法，該方法包含以下步驟 (i)  使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii) 將包含該蛋白質之組成物回收， 其中用於製備該蛋白質調配物之該方法進一步包含將界面活性劑、較佳的是脂肪酸酯加入包含該蛋白質之該組成物。
此外，本發明涉及藉由或可藉由本文所述之方法獲得的蛋白質組成物且/或涉及藉由或可藉由本文所述方法獲得的蛋白質調配物。
重組生物醫藥蛋白 (例如單株抗體 (mAb)、抗體片段 (Fab)、複合物、抗體衍生蛋白及融合蛋白) 通常在具有高表現率的中國倉鼠卵巢 (CHO) 宿主細胞株中表現 (Durocher (2009) Curr. Opin. Biotech. 20:700-707)。在此等蛋白質之純化過程中，需要消除或至少充分減少宿主細胞蛋白質 (HCP) 之量，以保證藥物之臨床或上市應用時對患者的安全性 (Vanderlaan (2018) Biotechnol Prog.34:828-837)。具有水解活性之 HCP 可導致界面活性劑降解 (Labrenz (2014) J. Pharm. Sci. 103:2268-2277)。已在生物醫藥行業內之多種生物醫藥調配物中觀測到酶來源之界面活性劑降解，且可能由於界面活性劑介導之蛋白質聚集預防的減弱及/或由於界面活性劑分解產物積累而導致可見粒子形成 (Labrenz (2014) J. Pharm. Sci. 103:2268-2277；Cao (2015) J. Pharm. Sci. 104:433–446；Larson (2020) J. Pharm. Sci. 109:633-639；Graf (2020) Eur. J. Pharm. Biopharm.152:318-326)。粒子及/或聚集體形成轉而導致儲存期限限制。
最近的研究揭示了若干水解酶，該等水解酶被認為導致生物醫藥調配物中升高的界面活性劑降解，包括脂蛋白脂酶 (LPL) (Chiu (2017) Biotechnol. Bioeng. 114:1006-1015)、溶體磷脂酶 A2 (LPLA2) (Hall ( 2016) J. Pharm. Sci. 105:1633-1642) 及推定類磷脂酶 B 2 (PLBL2) (Dixit (2016) J. Pharm. Sci. 105:1657-1666)。最值得注意的是，已反覆顯示此等酶在下遊加工中之持久性，突顯其難以移除及/或與 mAb 締合之特性 (Valente (2014) Biotechnol. Bioeng. 112:1232-1242；Levy (2014) Biotechnol. Bioeng. 111:904-912；Tran (2016) J. Chromatogr. A 1438:31-38)。
對個別 HCP，包括水解酶，諸如脂酶之選擇性移除知之甚少。據觀測，由聚山梨醇酯 20 或 80 等界面活性劑降解產生的大多數含有脂肪酸之聚集體/可見粒子在 (長期) 儲存期間增加 (Labrenz (2014) J. Pharm. Sci. 103: 2268-2277；Tomlinson (2015) Mol. Pharmaceutics 12: 3805-3815)。此引發了消除引發聚山梨醇酯降解之汙染之策略的發展。基於穩定性研究以及脂酶活性檢定，關於 HCP 移除對純化期間洗滌及/或培育步驟之效能進行評估，且發現在含有聚山梨醇酯之蛋白質調配物之 (長期) 儲存研究期間產生粒子的殘留風險仍然存在。例如，WO2016/057739 使用疏水交互作用介質來減少脂酶。然而，該方法之缺點在於疏水交互作用層析依賴於分子特徵 (疏水性) 的差異。此方法之適用性可能因蛋白質之特性而異。此外，取決於蛋白質之疏水性及應用之緩衝條件，蛋白質可能與 HIC 樹脂結合或導致產品之潛在產出損失。
因此，需要降低蛋白質組成物中之水解活性的手段及方法。
本發明之技術問題為提供用於製備具有增加/更高穩定性之蛋白質組成物及/或用於降低蛋白質組成物中之水解活性的手段及方法。藉由提供在申請專利範圍中表徵且如下文所提供之實施例，解決了技術問題且滿足了上述需求。
本發明係關於一種方法，其包含以下步驟 (i)  使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii) 將包含該蛋白質之組成物回收。
如所附實例中所說明，令人驚奇且出乎意料地發現水解酶抑制劑可固定於固體載體上而不失去功能性 (亦即經固定之抑制劑保持與水解酶之結合)。藉此可自蛋白質組成物中可靠地移除水解酶。
實例 1證明固定之水解酶抑制劑奧利司他 (orlistat) B 保留與溶體脂酶A2 (LPLA2) 相互作用的能力。向抗體溶液中摻加重組 LPLA2，且隨後與固定於磁珠上之奧利司他 B 一起培育。培育後，珠粒經 LC-MS/MS 分析，顯示 LPLA2 對珠粒之高親和力 ( 圖 2B)。此外，已顯示相比於與不含奧利司他 B 之對照珠粒一起培育之抗體溶液，與固定於珠粒上之奧利司他 B 一起培育之抗體溶液顯示水解活性顯著降低 ( 圖 2A)。此結果進一步證實在與固定之奧利司他 B 一起培育後自抗體溶液中移除 LPLA2。因此，不受科學理論束縛，設想盡管奧利司他 B 與珠粒共價結合，但其仍然能夠與 LPLA2 形成共價鍵。
實例 2針對更高濃度抗體溶液證實了此結果 ( 圖 3)。此顯示可在組成物中廣泛的蛋白質濃度範圍內達成水解酶移除及水解活性降低。
實例 3顯示，對於抗體組成物 (抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體 (格菲妥單抗 (glofitamab)，亦稱為 RG6026)) 之混合模式陰離子交換 (MMAEX) 負載溶液，確實存在殘餘水解酶活性。表明與起始蛋白質組成物相比，固定於固體載體上之奧利司他 B 能夠降低回收之蛋白質組成物中之水解酶活性 ( 圖 4)。與各別對照 (有連接子且無固定奧利司他 B 的珠粒/無連接子之珠粒) 相比，水解酶活性亦降低，表明水解酶抑制劑奧利司他 B 對水解酶活性之降低有特定作用。此外，實例 3 表明，當經由兩種不同的連接方法固定時，奧利司他 B 保持其與水解酶特異性結合的能力，該等連接方法亦即使用胺與 N-羥基琥珀醯亞胺 (NHS) 活化酯之間的反應的方法或使用鏈黴親和素及生物素之親和力的方法。因此，可獨立於特定固定方法及/或針對各種所關注蛋白質來達成水解活性降低。
實例 4進一步證實藉由在經曲妥珠單抗處理之蛋白質 A 洗提池中固定之奧利司他移除/降低殘留水解酶活性 ( 圖 5)。此外，實例 4 亦表明水解酶抑制劑奧利司他 A 可用於自抗體溶液中移除水解酶，亦即水解酶抑制劑本身可固定於各種固體載體上 (分別為NHS活化之瓊脂糖珠粒及鏈黴親和素瓊脂糖珠粒) 且保留其結合活性，此轉而可有利地用於降低水解活性。
實例 5用另一種水解酶抑制劑 (雙烯醇酯) 證實可達成固定至固體載體上，同時保持對水解酶之特異性結合活性 ( 圖 6)。實例 5 進一步證實水解酶確實與抑制劑特異性結合，且不與珠粒材料非特異性結合。
總之，本發明說明水解酶可自若干不同起始抗體組成物中移除，其中不同抑制劑固定於不同固體載體上。該等組成物亦具有各種抗體濃度。總而言之，此表明本發明可在多種條件下有利地實施。
已知水解酶降解其各別受質 (例如脂肪酸酯/脂質，諸如蛋白質調配物，如醫藥組成物中常規使用之界面活性劑)，且因此引起 (可見的) 粒子形成，其歸因於界面活性劑介導之蛋白質聚集預防的減少及/或歸因於積累的界面活性劑分解產物。因此，本文預期藉由本發明降低水解活性使得粒子 (形成) 減少及/或蛋白質調配物之穩定性/溶解性改良。
一種已知的分子，所謂的奧利司他，能夠抑制大多數與脂質水解相關之酶，且因此抑制具有相似化學特性之界面活性劑 (Jahn (2020), Pharm. Res. 37:118)。該分子能夠模擬脂酶之天然受質，且因此能夠經由在活性位點形成共價酯鍵來捕獲脂酶 (Fako (2014) ACS Catal.4: 3444 – 3453)。然而，不可能簡單地用奧利司他或其他抑制劑補充蛋白質組成物，因為大多數脂酶抑制劑為非極性化合物且必須添加於有機溶劑中。特別是奧利司他高度不溶於水。此外，此等化學物質可在患者施用藥物期間誘發不良事件，且可影響藥物品質。特別是奧利司他在靜脈內施用時可為有毒的，例如連同蛋白質組成物。此外，奧利司他與酶之間的酯鍵可在蛋白質組成物之儲存期間水解 (酸或鹼催化)，重新釋放活性酶。
在已添加水解酶抑制劑 (例如奧利司他) 之蛋白質組成物 (亦即其中抑制劑未固定於固體載體上) 的儲存期間，水解酶抑制劑 (例如奧利司他) 可由於蛋白質組成物中蛋白質之高濃度而與例如蛋白質 (例如抗體) 之絲胺酸殘基非特異性及共價反應。該非特異性反應可降低蛋白質 (例如抗體) 對靶標之結合親和力 (亦即降低產品功效) 及/或可導致 (增加) 蛋白質聚集 (亦即降低產品品質)。
相比之下，當蛋白質組成物僅與根據本發明之固定水解酶抑制劑短時間接觸時，該等非特異性反應不太可能。在罕見的情況下，固定水解酶抑制劑在步驟 (i) (「使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上」)期間與蛋白質組成物中之所關注蛋白質反應，所關注蛋白質亦將固定至固體載體且不會出現在回收之蛋白質組成物中。因此，藉由使用本文所述之本發明方法，可避免或最小化在將水解酶抑制劑 (例如奧利司他) 添加至蛋白質組成物時出現的上述缺點 (亦即存在 (一種或多種) 蛋白質 (例如一種或多種抗體)，其與靶標之結合親和力降低 (亦即產物功效降低) 及/或 (增加) (一種或多種) 蛋白質 (例如一種或多種抗體) 蛋白質之聚集 (亦即產物品質降低))。
作為本發明之另一優點，水解活性之降低可在蛋白質調配物中不存在水解酶抑制劑本身之情況下及/或不需要移除此類水解酶抑制劑之情況下 (亦即在將抑制劑添加至組成物中而不固定至固體載體之情況下) 達成。
水解酶抑制劑可共價結合水解酶。其上固定有水解酶抑制劑之固體載體可多次/重複用於實施本文所述之方法，特別是其步驟 (i)。此可為有用的，例如，若重複進行步驟 (i)，如下文進一步所述。因此，起始組成物可反覆/隨後經受相同的固體載體，例如直至達到水解酶之最大結合能力。然而，在一較佳態樣中，材料，亦即其上固定有水解酶抑制劑之固體載體為單次使用/利用的。該材料之單次使用/利用在例如 GMP (良好生產規範) 認證之純化製程/平臺及/或商業純化製程/平臺中可為較佳的。然而，對於基礎研究及/或學術研究，設想該材料可利用兩次或多次。如本文所用，兩次或多次利用該材料意謂步驟 (i) 使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上係用固定於固體載體上之相同水解酶抑制劑進行兩次或多次。技術人員非常清楚在何等情況下可利用具有固定水解酶抑制劑之固體載體兩次或多次，例如，當第一次利用 (亦即，使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上) 後，水解酶抑制劑分子未與水解酶定量反應時，亦即當固體載體上仍存在能夠在第二次或後續利用中與水解酶反應的水解酶抑制劑分子時。換言之，當在第一次利用 (亦即，使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上) 後，並非所有水解酶抑制劑分子均吸附 (結合) 水解酶時，材料，亦即具有固定水解酶抑制劑之固體載體可使用/利用兩次或多次。此意謂在第二次或後續利用中水解酶亦可吸附至水解酶抑制劑。換言之，仍有「遊離」 (未結合) 水解酶抑制劑分子可在第二次或後續利用中吸附水解酶分子。
如上所述，藉由疏水交互作用層析移除 HCP 可取決於蛋白質調配物中之蛋白質的特性。相反，水解酶抑制劑直接針對現有水解酶，且因此通常不受蛋白質調配物中之蛋白質影響。因此，本發明使用特定配位體自蛋白質調配物/組成物中移除特定雜質。
下文更詳細地描述本發明。
特定言之，本發明係關於以下各項： 1.        一種方法，其包含以下步驟： (i)  使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii) 將包含該蛋白質之組成物回收。 2.        如第 1 項之方法，其中該方法用於製備包含蛋白質之組成物。 3.        如第 1 或 2 項之方法，其中包含該蛋白質之該組成物相較於該起始組成物具有降低的水解活性和/或相較於該起始組成物具有減少的水解酶含量，其例如是藉由脂酶活性檢定 (針對聚山梨醇酯的脂酶酵素法 (LEAP) 檢定) 和/或脂肪酸質譜法 (FAMS) 檢定來判定。 4.        如第 1 至 3 項中任一項之方法，其中該方法用於降低起始組成物中之水解活性及/或降低起始組成物中水解酶之含量。 5.        如第 1 至 4 項中任一項之方法，其中起始組成物進一步包含 (一種或多種) 水解酶及/或具有水解活性。 6.        如第 1 至 5 項中任一項之方法，其中蛋白質組成物係藉由自起始組成物中移除水解酶及/或藉由降低起始組成物中水解酶之含量來製備。 7.        如第 1 至 6 項中任一項之方法，其中該步驟 (i) 進一步包含步 (a) 將水解酶吸附至水解酶抑制劑。 8.        如第 1 至 7 項中任一項之方法，其中包含蛋白質之組成物為包含蛋白質之溶液。 9.        如第 8 項之方法，其中該溶液為水溶液。 10.       如第 8 或 9 項之方法，其中該溶液為經緩衝之溶液。 11.       如第 1 至 10 項中任一項之方法，其中水解酶為 (一種或多種) 酯酶及/或 (一種或多種) 醯胺酶。 12.       如第 11 項之方法，其中該 (一種或多種) 酯酶為 (一種或多種) 羧酸酯水解酶及/或 (一種或多種) 硫酯酶。 13.       如第 12 項之方法，其中該 (一種或多種) 羧酸酯水解酶為 (一種或多種) 脂酶。 14.       如第 1 至 12 項中任一項之方法，其中該水解酶選自由以下所組成之群組：脂蛋白脂酶、軟脂醯基蛋白硫酯酶、酸性神經醯胺酶、脂肪酸合成酶的 C 端域、推定類磷脂酶 b 2、溶體酸性脂酶和溶體磷脂酶。 15.       如第 1 至 14 項中任一項之方法，其中經固定之抑制劑選自由奧利司他或雙烯醇酯組成之群組 。16.       如第 1 至 15 項中任一項之方法，其中固體載體選自由 Sepharose、聚苯乙烯及智慧聚合物組成之群組。 17.       如第 1 至 16 項中任一項之方法，其中抑制劑經由疊氮基及炔基之反應固定於固體載體上。 18.       如第 1 至 16 項中任一項之方法，其中抑制劑經由鏈黴親和素基團與生物素基團之結合固定於固體載體上。 19.       如第 1 至 16 項中任一項之方法，其中抑制劑經由胺基及 N-羥基琥珀醯亞胺基團之反應固定於固體載體上。 20.       如第 1 至 19 項中任一項之方法，其中抑制劑為可藉由使包含式(1)、(2)、(3) 或 (4)，較佳為式 (1)、(2) 或 (4) 或由其組成之化合物與疊氮化物反應獲得的基團。
Figure 02_image003
(1)
Figure 02_image005
(2)
Figure 02_image007
(3)
Figure 02_image009
(4) 21.       如第 1 至 20 項中任一項之方法，其中該等步驟按以下順序進行：步驟 (i) 繼之以步驟 (ii)。 22.       如第 1 至 21 項中任一項之方法，其進一步包含在步驟 (i) 之前及/或之後及/或在步驟 (ii) 之前及/或之後的蛋白質製備及/或純化步驟。 23.      如第 1 至 22 項中任一項之方法，其中步驟 (i) 係在親和層析之後進行，較佳在蛋白質 A 親和層析之後進行。 24.       如第 1 至 23 項中任一項之方法，其中該蛋白質為抗體。 25.       如第 24 項之方法，其中該抗體為單株抗體。 26.       如第 24 或 25 項之方法，其中該抗體是人抗體或人源化抗體。 27.       如第 1 至 26 項中任一項之方法，其中該蛋白質為抗 CD20 抗體、抗 CD40 抗體、抗 HER2 抗體、抗 IL6 抗體、抗 IgE 抗體、抗 IL13 抗體、抗 TIGIT 抗體、抗 PD-L1 抗體、抗 VEGF-A 抗體、抗 VEGF-A/ANG2 抗體、抗 CD79b 抗體、抗 ST2 抗體、抗 D 因子抗體、抗 IX 因子抗體、抗 X 因子抗體、抗 Aβ 抗體、抗 tau 抗體、抗 CEA 抗體，抗 CEA/CD3 抗體、抗 CD20/CD3 抗體、抗 FcRH5/CD3 抗體、抗 Her2/CD3 抗體、抗 FGFR1/KLB 抗體、FAP-4-1 BBL 融合蛋白、FAP-IL2v 融合蛋白、奧克利珠單抗 (ocrelizumab)、帕妥珠單抗 (pertuzumab)、曲妥珠單抗 (trastuzumab)、托珠單抗 (tocilizumab)、法利昔單抗 (faricimab)、帕羅托珠單抗 (polatuzumab)、甘特珠單抗 (gantenerumab)、賽必妥單抗 (cibisatamab)、克雷珠單抗 (crenezumab)、莫蘇妥珠單抗 (mosunetuzumab)、替瑞利尤單抗 (tiragolumab)、貝伐珠單抗 (bevacizumab)、利妥昔單抗 (rituximab)、阿托珠單抗 (atezolizumab)、奧比妥珠單抗 (obinutuzumab)、蘭帕麗珠單抗 (lampalizumab)、來瑞珠單抗 (lebrikizumab)、奧馬珠單抗 (omalizumab)、雷尼單抗 (ranibizumab)、艾美賽珠單抗 (emicizumab)、塞魯單抗 (selicrelumab)、普拉辛珠單抗 (prasinezumab)、格菲妥單抗 (glofitamab)、欣洛奇芙普 (simlukafusp alfa) 和 RG7827。 28.       一種製備蛋白質調配物之方法，該方法包含如第 1 至 27 項中任一項之方法的步驟，其中製備蛋白質調配物之方法進一步包含向組成物中添加界面活性劑，較佳為脂肪酸酯。 29.       一種製備蛋白質調配物之方法，其中該製備蛋白質調配物之方法進一步包含向藉由如第 1 至 27 項中任一項之方法獲得或可獲得之組成物中添加界面活性劑，較佳為脂肪酸酯。 30.       如第 28 或 29 項之方法，其中蛋白質調配物（基本上）不含可見和/或顯微鏡下可見 (subvisible) 的顆粒。 31. 如第 28 至 30 項中任一項之方法，其中蛋白質調配物在建議儲存條件下穩定至少 6 個月、至少 12 個月、至少 18 個月、至少 24 個月、至少 36 個月或至少 60 個月。 32.       如第 28 至 30 項中任一項之方法，其中脂肪酸酯是聚氧乙烯山梨醇酐或異山梨醇脂肪酸單酯、雙酯或三酯。 33.       如第 28 至 32 項中任一項之方法，其中脂肪酸酯是聚氧乙烯 (20) 山梨醇酐月桂酸酯。 34.       如第 28 至 32 項中任一項之方法，其中該脂肪酸酯選自由以下組成之群組：聚山梨醇酯 20、聚山梨醇酯 40、聚山梨醇酯 60、聚山梨醇酯 61、聚山梨醇酯 65、聚山梨醇酯 80、聚山梨醇酯 81、聚山梨醇酯 85 或聚山梨醇酯 120，或其組合。 35. 如第 28 至 32 項中任一項之方法，其中該脂肪酸酯為聚山梨醇酯 20 或聚山梨醇酯 80。 36.       如第 28 至 31 中任一項之方法，其中該界面活性劑為單或二醯基甘油、醣-脂肪酸酯或 α-生育酚聚乙二醇 (PEG) 琥珀酸酯。 37.       如第 28 至 36 項中任一項之方法，其中脂肪酸酯之降解為在 24 個月內小於 20%，較佳小於 10% 且更佳小於 5%。 38.       如第 26 至 37 項中任一項之方法，其中抗體濃度為至少1 mg/ml 且至多 250 mg/ml。 39.       如第 28 至 38 項中任一項之方法，其進一步包含將緩衝劑、賦形劑、稀釋劑、穩定劑及/或載劑添加至組成物中。 40.       如第 28 至 39 項中任一項之方法，其中蛋白質調配物為醫藥組成物。 41.       如第 1 至 40 項中任一項之方法，其中包含蛋白質之組成物及/或蛋白質調配物基本上不含水解酶抑制劑。 42.       一種藉由第 1 至 27 項中任一項之方法獲得或可獲得的蛋白質組成物。 43.       一種藉由第 28 至 41 項中任一項之方法獲得或可獲得的蛋白質調配物。 44.       如第 43 項之蛋白質調配物，其用作藥劑或用於藥物中。 45.       一種固定在固體載體上之水解酶抑制劑之用途，其用於製備蛋白質組成物和/或蛋白質調配物。 46.       一種固定在固體載體上之水解酶抑制劑之用途，其用於去除或減少蛋白質組成物和/或蛋白質調配物中的水解活性。 47.       一種固定在固體載體上之水解酶抑制劑之用途，其用於去除蛋白質組成物和/或蛋白質調配物中的雜質或減少其含量，該等雜質特定而言是宿主細胞蛋白質且較佳的是水解酶。 48.       一種固定在固體載體上之水解酶抑制劑之用途，其用於抑制或減少蛋白質組成物和/或蛋白質調配物中的可見和/或顯微鏡下可見之顆粒 (的形成) 和/或界面活性劑降解劑的出現/存在。
此外，本發明係關於以下態樣： 1.        一種方法，其包含以下步驟： (i) 使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii)        將包含該蛋白質之組成物回收。 2.        如第 1 項之方法，其中與起始組成物相比，包含蛋白質之組成物具有降低的水解活性。 3.        如第 1 或 2 項之方法，其中蛋白質組成物係藉由自起始組成物中移除 (一種或多種) 水解酶來製備。 4.        如第 3 項之方法，其中該 (一種或多種) 水解酶為 (一種或多種) 酯酶及/或 (一種或多種) 醯胺酶，較佳其中該 (一種或多種) 酯酶為 (一種或多種) 羧酸酯水解酶 及/或 (一種或多種) 硫酯酶。 5.        如第 4 項之方法，其中該 (一種或多種) 酯酶為 (一種或多種) 脂酶。 6.        如第 3 項之方法，其中水解酶選自由以下組成之群組：脂蛋白脂酶、軟脂醯基蛋白硫酯酶、酸性神經醯胺酶、脂肪酸合成酶、推定類磷脂酶 b 2、溶體酸性脂酶及溶體磷脂酶。 7.        如第 1 至 6 項中任一項之方法，其中經固定之抑制劑選自由奧利司他或雙烯醇酯組成之群組 。8.        如第 1 至 7 項中任一項之方法，其中抑制劑可藉由使包含式 (1)、(2)、(3) 或 (4)，較佳為式 (1)、(2) 或 (4)或由其組成的化合物與疊氮基反應而獲得：
Figure 02_image011
(1)
Figure 02_image013
(2)
Figure 02_image015
(3)
Figure 02_image017
(4) 9.        如第 1 至 8 項中任一項之方法，其在步驟 (i) 之前及/或之後進一步包含蛋白質製備及/或純化步驟。 10.       如第 1 至 9 項中任一項之方法，其中步驟 (i) 係在親和層析之後進行，較佳在蛋白質 A 親和層析之後進行。 11.       如第 1 至 10 項中任一項之方法，其中該蛋白質為抗體。 12.       一種製備蛋白質調配物之方法，該方法包含如第 1 至 11 項中任一項之方法的步驟，其中製備蛋白質調配物之方法進一步包含向組成物中添加界面活性劑，較佳為脂肪酸酯。 13.       如第 12 項之方法，其中蛋白質調配物 (基本上) 不含可見及/或顯微鏡下可見的粒子。 14.       如第 12 或 13 項之方法，其中該脂肪酸酯是聚氧乙烯山梨醇酐或異山梨醇脂肪酸單酯、雙酯或三酯。 15.       一種藉由第 1 至 11 項中任一項之方法獲得或可獲得的蛋白質組成物。
如上所述，本發明係關於一種包含以下步驟之方法 (i)  使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii) 將包含該蛋白質之組成物回收。
如本文所用，術語「包含蛋白質之起始組成物」通常係指包含「所關注蛋白質」之組成物。在此上下文中，術語「蛋白質」係指「所關注蛋白質」。「所關注蛋白質」通常為將自細胞培養物/培養細胞中獲得且將自細胞培養物/培養細胞中分離及/或純化的蛋白質，例如用於商業、醫藥、診斷及/或治療目的及/或科學研究。術語「所關注蛋白質」通常係指一種特定的所關注蛋白質，例如結合至抗原 A 之特異性抗體。然而，術語「所關注蛋白質」亦可指一種或多種不同的「所關注蛋白質」，例如兩種或更多種不同的所關注蛋白質 (例如結合至抗原 A 之一種抗體及結合至抗原 B 之第二抗體)。此外，如下文進一步解釋，除了「所關注蛋白質」之外，「起始組成物」可包含一種或多種宿主細胞蛋白質 (HCP)。
術語「蛋白質」之含義為此項技術中熟知的且相應地用於本發明之上下文中。特定而言，根據本發明，本文所用之術語「蛋白質」意謂蛋白質或多肽，其涵蓋給定長度之胺基酸鏈，其中胺基酸殘基藉由共價肽鍵連接。通常，「蛋白質」具有至少 20 個連續胺基酸且至多 3500 個連續胺基酸的長度。蛋白質可為單體。術語「蛋白質」內亦包括形成多聚體，諸如二聚體、三聚體、四聚體等的蛋白質，其中此類多聚體可為同多聚體或異多聚體。因此，本文所用之術語「蛋白質」可為由單體蛋白質組成之此類多聚體 (多聚蛋白質)。例示性蛋白質/所關注蛋白質在下文進一步描述。
如本文所用，術語「包含蛋白質之起始組成物」 (或類似地，「包含蛋白質之初始組成物」) 具體意指來自細胞培養物或培養細胞之提取物、產生蛋白質 (所關注蛋白質) 之該細胞培養物或該等培養細胞或用於產生蛋白質 (所關注蛋白質) 之該細胞培養物或該等培養細胞。提取物可為粗提取物或可為純化提取物 (純化提取物已經受一個或多個純化步驟)。「包含蛋白質之起始組成物」因此可能已經受一個或多個習知純化步驟，諸如離子交換層析 (例如陰離子交換層析或陽離子交換層析)、超濾/滲濾、病毒過濾、尺寸排阻層析、親和層析及疏水交互作用層析、混合模式層析/多模式層析 (例如混合模式離子交換層析) 及其任何組合。
雖然本文提供之方法實際上可用於任何「包含蛋白質之組成物」 (甚至不含或僅具有微量之任何雜質的高度純化組成物)，但應理解，如本文所用之「包含蛋白質之起始組成物」通常包含來自用於產生該蛋白質/所關注蛋白質之細胞培養物/培養細胞的至少一種雜質，亦即來自獲得/製備蛋白質/所關注蛋白質之細胞培養物/培養細胞的至少一種雜質。雜質可為一種或多種宿主細胞蛋白質，特別是 (一種或多種) 具有水解活性之蛋白質 (水解酶)。
例如，包含蛋白質之起始組成物可藉由在均質化溶液中均質化細胞來製備，該等細胞在細胞培養物中生長以產生該所關注蛋白質。當蛋白質在細胞培養期間直接分泌時，包含蛋白質之起始組成物亦可為細胞培養上清液。因此，包含蛋白質之起始組成物可為收獲細胞培養液 (HCCF)。HCCF 為 (如) (藉由過濾) 自細胞、細胞碎片及/或聚集體分離之組成物，例如在調節及/或過濾 (例如藉由過濾自細胞培養物或細胞培養物上清液製備的組成物) 後獲得 HCCF。本文中之起始組成物較佳為收獲細胞培養液 (HCCF)。過濾後變成 HCCF 之組成物可稱為收獲前細胞培養液 (PHCCF)。換言之，在調節及/或過濾之前的組成物 (例如由細胞培養物或細胞培養物上清液製備) 被稱為收獲前細胞培養液 (PHCCF)。
包含蛋白質之起始組成物可在均質化該等細胞後直接與水解酶抑制劑接觸，該等細胞在細胞培養物中生長以產生所關注蛋白質。然而，本文亦設想在包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸之前，使包含蛋白質之該組成物經受一個或多個純化步驟。此類純化步驟之非限制性實例在下文中描述。
根據本發明，使「包含蛋白質之起始組成物」經受 (進一步) 純化，包含使「包含蛋白質之起始組成物」與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上(方法之 (步驟 i))。
在該步驟之後，進行進一步的步驟 (方法之步驟 (ii))，亦即「回收包含蛋白質之組成物」，亦即回收「包含蛋白質之組成物」。更簡單地說，進一步的步驟為「回收蛋白質」。在此上下文中，術語「蛋白質」係指如上定義之「所關注蛋白質」。換言之，包含在起始組成物中之所關注蛋白質亦為回收組成物中之所關注蛋白質或為回收之所關注蛋白質。吾人在本文中亦將該組成物稱為「回收組成物」且將該蛋白質稱為「回收蛋白質」。
應理解，「包含蛋白質之起始組成物」與固定於固體載體上之水解酶抑制劑接觸。換言之，術語「使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定於固體載體上」意謂「使起始組成物與水解酶抑制劑接觸，該組成物包含蛋白質，其中該水解酶抑制劑固定於固體載體上」。
設想水解酶抑制劑可在接觸步驟之前，亦即在方法之步驟 (i) 之前固定於固體載體上。換言之，水解酶抑制劑可在與包含蛋白質之起始組成物接觸之前固定於固體載體上 (連接於固體載體上)。應理解，在本文中，水解酶抑制劑在接觸步驟之前固定於固體載體上。換言之，水解酶抑制劑在與包含蛋白質之起始組成物接觸之前固定於固體載體上 (連接於固體載體上)。
因此，本發明在一較佳態樣中係關於一種包含以下步驟之方法 (i)  使包含蛋白質之起始組成物與固定於固體載體上之水解酶抑制劑接觸； (ii) 將包含該蛋白質之組成物回收。
換言之，本發明在一較佳態樣中係關於一種包含以下步驟之方法 (i)  使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑為固定於固體載體上之水解酶抑制劑； (ii) 將包含該蛋白質之組成物回收。
應理解，藉由「使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸」，上述雜質，諸如一種或多種宿主細胞蛋白質，特別是 (一種或多種) 具有水解活性之蛋白質 (水解酶)，若存在於起始組成物中，則與「包含蛋白質之起始組成物」相比，在「回收組成物」中移除或至少減少其含量。本文中較佳的是 (一種或多種) 宿主細胞蛋白質，特別是 (一種或多種) 具有水解活性之蛋白質 (水解酶) 存在於起始組成物中。
如上所述，術語「回收包含蛋白質之組成物」可與「回收蛋白質」同義使用。因此，該方法旨在製備 (或同樣獲得) 包含蛋白質之組成物。在此上下文中，「包含蛋白質之組成物」通常為根據該方法之步驟 (ii) 回收組成物。
因此，本發明提供一種製備或獲得包含蛋白質之組成物的方法，其包含以下步驟： (i)  使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii) 將包含該蛋白質之組成物回收。
因此，若進行步驟 (i) 及 (ii) (以及視情況重複步驟 (i) 及 (ii)，如上所述)，則通常製備或獲得「包含蛋白質之組成物」。然而，該方法亦可在步驟 (i) 之前及/或在步驟 (ii) 之後及/或在步驟 (i) 與 (ii) 之間包含額外步驟 (諸如進一步的純化步驟 (例如習知純化) 以製備或獲得「包含蛋白質之組成物」。當重複步驟 (i) 及 (ii) 時，相同解釋及定義適用，如上所述。
亦如上文所述，本發明方法之目的為移除或降低起始組成物中之水解活性 (若存在) 及/或移除或降低起始組成物中之雜質 (若存在) 的含量，特別是宿主細胞蛋白質，且較佳 (一種或多種) 水解酶。因此，在一個態樣中，「包含蛋白質之組成物」相比於起始組成物具有降低的水解活性，及/或相比於起始組成物具有降低的雜質 (若存在) 含量，特別是宿主細胞蛋白質，且較佳 (一種或多種) 水解酶。相同解釋及定義適用於重複步驟 (i) 及 (ⅱ) 時，如本文所解釋。在本文中較佳的是，水解活性存在於起始組成物中及/或雜質存在於起始組成物中，特別是宿主細胞蛋白質，且較佳 (一種或多種) 水解酶存在於起始組成物中。
因此，在一個態樣中，本發明提供一種方法，其包含以下步驟 (i)  使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii) 將包含該蛋白質之組成物回收， 其中與起始組成物相比，包含蛋白質之組成物 (回收組成物) 具有降低的水解活性 及/或其中與起始組成物相比，包含蛋白質之組成物 (回收組成物)具有降低的雜質含量，特別是宿主細胞蛋白質，且較佳 (一種或多種)水解酶。
在此上下文中，應理解，起始組成物具有水解活性及/或起始組成物具有/包含雜質，特別是宿主細胞蛋白質，且較佳 (一種或多種) 水解酶。換言之，如上定義之水解活性及/或雜質較佳存在於起始組成物中。起始組成物中如上定義之水解活性及/或雜質的存在可藉由此項技術中已知及/或本文揭示及提供的分析來測定。量測、測定或定量水解活性之非限制性實例為偵測脂解活性的分析，或者換言之，脂酶活性檢定 (例如，如 Jahn 等人所述)，本文中稱為LEAP (針對聚山梨醇酯的脂酶酵素法) 分析 (Jahn (2020) Pharm. Res. 37: 118)，及/或脂肪酸質譜術 (FAMS) 分析 (Honemann (2019) J. Chromatogr. B 1116: 1-8；Cheng (2019) J. Pharm. Sci. 108: 2880-2886)。此類分析亦可用於測定水解活性的降低。
為測定蛋白質之存在或數量，本文可採用常規方法，諸如免疫凝集、免疫沉澱 (例如免疫擴散、免疫電泳、免疫固定)、西方墨點技術 (例如 (原位) 免疫組織化學、(原位) 免疫細胞化學、親和層析、酶免疫分析) 及類似方法。此等及其他適合之接觸蛋白質之方法為此項技術中熟知的，且例如亦描述於 Sambrook 及 Russell (2001.)Molecular cloning: a laboratory manual.第 2 卷，第 3 版.Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York中。可利用上述技術，特別是西方墨點技術進行定量。通常，技術人員知曉定量蛋白質之方法。溶液中純化蛋白質之量可藉由物理方法確定，例如測光術。定量混合物中之特定蛋白質的方法依賴於例如抗體之特異性結合。利用抗體特異性之特異性偵測及定量方法包含例如免疫組織化學 ( 原位)。西方墨點將藉由電泳分離蛋白質混合物及用抗體進行特異性偵測組合。電泳可為多維的，諸如 2D 電泳。通常，在 2D 電泳中，在一個維度中藉由多肽的表觀分子量並在另一個方向中藉由其等電點來分離多肽。
如下文進一步解釋，用於確定給定組成物，例如起始組成物具有水解活性及/或具有/包含如上定義之雜質的間接參數為可見及/或顯微鏡下可見的粒子 (例如由於界面活性劑降解劑之不溶性物質) 的出現/存在及/或界面活性劑降解劑的出現/存在。同樣，可見及/或顯微鏡下可見的粒子 (例如由於界面活性劑降解劑之不溶性物質) 的減少及/或界面活性劑降解劑本身的出現/存在為確定給定組成物 (較佳包含蛋白質之組成物 (回收組成物)) 與起始組成物相比具有降低之水解活性及/或具有降低之如本文所定義之雜質含量的間接參數。
(例如可見及/或顯微鏡下可見的粒子 (例如由於界面活性劑降解劑之不溶性物質) 的出現/存在及/或界面活性劑降解劑本身的出現/存在) 之確定可涉及儲存給定組成物 (例如起始組成物及/或包含蛋白質之組成物 (回收組成物))，例如在長期條件下儲存，如下文進一步解釋。例如，若給定組成物在開始時不顯示可見及/或顯微鏡下可見的粒子 (例如由於界面活性劑降解劑之不溶性物質) 的出現/存在及/或界面活性劑降解劑本身的出現/存在，但在儲存後確實顯示，則表明給定組成物在開始時具有水解活性及/或具有/包含如上定義之雜質。此可用於確定在本文用作參考點之「起始組成物」中水解活性及/或雜質的存在，例如，若該組成物不與抑制劑接觸。藉由將其相比於與抑制劑接觸之「起始組成物」 (亦即包含蛋白質之組成物 (回收組成物))，可評估接觸組成物 (亦即包含蛋白質之組成物 (回收組成物))與參考起始組成物 (且因此與「起始組成物」) 相比具有降低之水解活性及/或具有降低之如本文定義之雜質含量。
術語「水解活性」之含義為此項技術中熟知的，在本發明之上下文中相應地使用且在下文進一步詳細描述。
「水解酶抑制劑」在本文中以最廣義使用且可指抑制具有水解活性之另一分子的分子。水解活性及水解酶之定義在下文中提供。水解酶之非限制性實例亦在下文中提供。水解酶抑制劑可藉由與酶結合來抑制酶。水解酶抑制劑可結合酶之活性位點。水解酶抑制劑可與酶形成共價鍵。與對應酶形成共價鍵且在本發明之上下文中使用之水解酶抑制劑的非限制性實例為奧利司他及雙烯醇酯。
以下涉及根據本發明提供及使用之「水解酶抑制劑」。術語「水解酶抑制劑 (hydrolase inhibitor)」及「水解酶抑制劑 (inhibitor of hydrolase)」在本文中可互換使用。
術語「水解酶抑制劑」及「水解酶抑制劑」在本發明之上下文中尤其意謂能夠完全或部分阻止或降低水解酶生理活性的化合物。術語「拮抗劑」或「抑制劑」在本文中可互換使用。本文設想「水解酶抑制劑」為水解酶之選擇性抑制劑。
因此，在本發明之上下文中，該抑制劑可防止、降低、抑制或滅活水解酶之生理活性，例如在該化合物/物質 (亦即拮抗劑/抑制劑) 與該水解酶結合後。如本文所用，術語「拮抗劑」亦涵蓋競爭性拮抗劑、(可逆) 非競爭性拮抗劑或不可逆拮抗劑，尤其如 Mutschler，「Arzneimittelwirkungen」 (1986), Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, Germany 中所描述。此類抑制可藉由測定受質周轉來量測。
總之，本文所述之水解酶拮抗劑/抑制劑將因此導致水解酶活性的降低或降低。
本文設想且較佳的是水解酶之拮抗劑靶向水解酶，特別是靶向水解酶之活性位點 (例如催化三聯體)。術語「靶向」在本文中係指與水解酶 (且此處特別是水解酶之活性位點)的(特異性)結合及/或水解酶活性之抑制，特別是水解活性的抑制。
拮抗劑可為 (一種或多種) 小分子藥物，或 (一種或多種) 小結合分子。
本文使用之抑制劑可為 (一種或多種) 小分子藥物。術語「小分子藥物」及「小分子化合物」在本文中可互換使用。在本文中用作水解酶抑制劑之 (一種或多種) 小分子藥物可指 (有機)低分子量 (＜900道爾頓) 化合物。小分子可有助於調節生物過程，且通常大小約為 10 − 9m。本文使用之拮抗劑，如小分子 (藥物)，可例如藉由篩選化合物庫，例如Enamine、Chembridge 或 Prestwick化學庫來鑒定。
抑制劑較佳為水解酶之選擇性抑制劑。
選擇性表達了在給定化合物濃度下酶 (或蛋白質) 受到不同程度影響的生物學事實。在酶之情況下，選擇性抑制可定義為給定濃度之化合物的較佳抑制。或者換言之，一種酶 (或蛋白質) 相比於另一種酶 (或蛋白質) 經選擇性抑制係指當在一濃度下，會導致第一種酶 (或蛋白質) 經抑制，而第二種酶 (或蛋白質) 未經抑制，或未受到實質性影響。為了比較化合物對不同酶之影響，採用類似的分析形式至關重要，諸如螢光能量轉移 (FRET) 分析、Plus 分析、組蛋白甲基轉移酶 (HMT) 分析、熱位移分析、生物讀數 (報導蛋白/酶，諸如 Cxcl1/CXCL8)、酶聯免疫吸附分析 (ELISA) 或化學蛋白質體學。例如，可使用市售測試套組，如 ELISA 套組。
本文使用之抑制劑較佳對水解酶具有選擇性，亦即該化合物可選擇性抑制水解酶。換言之，水解酶抑制劑/拮抗劑較佳為選擇性水解酶抑制劑/拮抗劑。
如本文所用，術語「選擇性水解酶抑制劑」係指 (一種或多種) 本文定義之水解酶抑制劑 (特別是 (一種或多種) 小分子藥物，其抑制水解酶或顯示針對水解酶之拮抗作用，不顯示針對另一蛋白質或酶，特別是另一酶 (亦即特別是並非水解酶之另一蛋白質或酶) 之顯著抑制或拮抗作用。
因此，相對於另一蛋白質或酶 (亦即特別是並非水解酶之另一蛋白質或酶) 之抑制或拮抗作用，對水解酶具有選擇性之水解酶抑制劑表現出大於約 2 倍、3 倍、4 倍、5 倍、6 倍、7 倍、8 倍、9 倍、10 倍、20 倍、50 倍或大於約 100 倍的水解酶選擇性。相對於包含蛋白質之組成物中之所關注蛋白質，對水解酶具有選擇性之水解酶抑制劑可展現大於約 10,000 倍的水解酶選擇性。
例如，泛水解酶抑制劑 (亦即廣泛抑制基本上任何水解酶之化合物) (例如奧利司他) 可用於本發明之上下文中。泛水解酶抑制劑可為本文定義之選擇性水解酶抑制劑。例如，與其他蛋白質相比 (亦即特別是與非水解酶，特別是非脂酶相比)，奧利司他高度優先地結合至水解酶，特別是脂酶，但奧利司他可與不同脂酶反應/抑制不同脂酶。
術語「選擇性水解酶抑制劑」未必意味著該抑制劑具有高度特異性，因為其可與不同水解酶 (例如不同脂酶) 反應/抑制該等不同水解酶。高度特異性抑制劑將僅與單一酶 (單一水解酶) 反應，同時區分所有其他蛋白質。本文亦設想使用 (高度) 特異性水解酶抑制劑 (亦即僅與單一酶 (單一水解酶) 反應/抑制單一酶 (單一水解酶)，同時區分所有其他蛋白質的抑制劑)。本文設想本文定義之 (高度) 特異性水解酶抑制劑可為本文定義之選擇性水解酶抑制劑，且反之亦然。
此外，水解酶抑制劑/拮抗劑較佳為有效的水解酶抑制劑/拮抗劑。
「水解酶之效力」亦可藉由 IC50 值來確定或定義。例如，水解酶抑制劑相對於水解酶之 IC50 值較低，較佳低於 0.2 μM，更佳低於 0.15 μM、0.14 μM、0.13 μM、0.12 μM 或甚至更低。更佳地，IC50 值低於 0.1 µM、0.095 µM、0.090 µM、0.085 µM、0.080 µM、0.075 µM、0.070 µM、0.065 µM、0.060 µM、0.055 µM、0.050 µM、0.045 µM、0.040 µM 、0.035 µM、0.030 µM 或甚至低於 0.025 µM，其中較低值優於較高值。甚至更佳地，IC50 值低於 0.024 µM、0.023 µM、0.022 µM、0.021 µM、0.020 µM、0.019 µM、0.018 µM、0.017 µM、0.016 µM、0.015 µM、0.014 µM、0.013 µM、0.012 µM 或 0.011 µM。IC50 值甚至可能更低，例如低於 0.010 µM、0.009 µM、0.008 µM、0.007 µM、0.006 µM 或 0.005 µM。通常，較低值在本文中優於較高值。
根據本發明之有效水解酶抑制劑可替代地，或除了相對於水解酶之 IC50 值外，藉由相對於另一蛋白質或酶之 IC50 值來定義。
例如，有效水解酶抑制劑相對於另一蛋白質或酶之 IC50 值較高，較佳高於 0.001 µM、0.002 µM、0.003 µM、0.004 µM、0.005 µM、0.006 µM、0.007 µM、0.008 µM、0.009 µM 或 0.010 µM。更佳地，IC50 值高於 0.011 µM、0.012 µM、0.013 µM、0.014 µM、0.015 µM、0.016 µM、0.017 µM、0.018 µM、0.019 µM、0.020 µM、0.021 µM、0.022 µM、0.023 µM 或 0.024 µM。甚至更佳地，IC50 值高於 0.025 µM、0.030 µM、0.035 µM、0.040 µM、0.045 µM、0.050 µM、0.055 µM、0.060 µM、0.065 µM、0.070 µM、0.075 µM、0.080 µM、0.085 µM、0.090 µM、0.095 µM、0.1 µM 或甚至更高，其中較高值優於較低值。甚至更佳地，IC50 值高於0.12 μM、0.13 μM、0.14 μM、0.15 μM、0.2 μM 或甚至更高。
在本文中較佳的是，較佳根據相同分析測定的有效水解酶抑制劑針對水解酶之 IC50 值相對於另一蛋白質或酶針對水解酶之 IC50 值的比率為約 1:10 或更低。1:10 或更低的比率亦表明抑制劑對水解酶之效力。更佳為 1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或 1:100 或甚至更低的比率。
術語「水解酶」在本文中以最廣義使用且指具有水解活性之分子/化合物。通常，「水解酶」因此為水解化學鍵之酶。例如，「水解酶」為羧酸衍生之酯截切酶，其具有衍生之遊離酸作為最終產物。或者，水解酶為展現水解酶活性之酶，亦即藉由使用水分子破壞共價鍵。「水解酶」之非限制性實例為脂酶、酯酶、硫酯酶、磷脂酶或神經醯胺酶。
如此項技術中已知的，本文所用之「水解活性」係指水解化學鍵之能力。水解係指化學鍵之斷裂，其中水分子充當親核試劑。較佳地，具有水解活性之分子/化合物為具有水解活性之蛋白質或多肽。因此，具有水解活性之蛋白質或多肽為具有水解活性之酶。因此，水解酶較佳為具有水解活性之酶。水解酶可為酯酶或醯胺酶。
術語「酯酶」為此項技術中熟知的且在本發明之上下文中係指催化酯鍵水解以產生酸及醇的酶。換言之，酯酶可作用於 (一個) 酯鍵。酯酶為多種多樣的酶，包括乙醯酯酶、磷酸酶、核酸酶、硫酯酶及羧酸酯水解酶。較佳地，本發明之上下文中的水解酶為硫酯酶或羧酸酯水解酶。硫酯酶使用水分子將硫酯水解為硫醇及酸。羧酸酯水解酶使用水分子將羧酸酯水解為醇及羧酸鹽。最佳地，水解酶/酯酶 (諸如羧酸酯水解酶) 為脂酶。脂酶催化脂肪酸酯/脂質，包括三酸甘油酯、脂肪及油水解為脂肪酸及醇頭基。
術語「醯胺酶」為此項技術中熟知的且在本發明之上下文中係指催化醯胺鍵水解之酶。換言之，醯胺酶可作用於 (一個) 醯胺鍵。
較佳地，根據本發明之 (一種或多種) 水解酶為脂蛋白脂酶 (寄存編號：G3H6V7)、軟脂醯基蛋白硫酯酶 1 (寄存編號：G3HN89)、酸性神經醯胺酶 (寄存編號：G3GZB2)、脂肪酸合成酶之 C 端域 (寄存編號：G3GXD7)、推定類磷脂酶 b 2 (寄存編號：G3I6T1)、溶體酸性脂酶 (寄存編號：G3HQY6) 及/或溶體磷脂酶。更佳地，根據本發明之 (一種或多種) 水解酶為脂蛋白脂酶、推定類磷脂酶 b 2 及/或溶體磷脂酶。此係因為其對界面活性劑，諸如聚山梨醇酯之水解活性被證實，其歸因於組成物中之 (可見) 粒子的形成及/或組成物穩定性的降低。最佳地，根據本發明之水解酶為溶體磷脂酶，特別是溶體磷脂酶A2 (LPLA2) (寄存編號：G3HKV9)。
此意謂自包含蛋白質之起始組成物中移除 (或其含量減少) 之水解酶可選自由以下組成之群組：脂蛋白脂酶、軟脂醯基蛋白硫酯酶、酸性神經醯胺酶、脂肪酸合成酶 (特別是其 C 端域)、推定類磷脂酶 b 2、溶體酸性脂酶及溶體磷脂酶。因此，與水解酶抑制劑結合之水解酶可選自由以下組成之群組：脂蛋白脂酶、軟脂醯基蛋白硫酯酶、酸性神經醯胺酶、脂肪酸合成酶、推定類磷脂酶 b 2、溶體酸性脂酶及溶體磷脂酶。
術語「固定於固體載體上」意謂水解酶抑制劑連接於固體載體上 (術語「固體載體」及「固相」在本文中可互換使用)。換言之，水解酶抑制劑與固體載體結合。固體載體之非限制性實例在下文提供。水解酶抑制劑與固體載體之間的鍵可為共價鍵及/或非共價鍵。較佳地，該鍵為共價鍵。水解酶抑制劑可如何固定於固體載體上之非限制性實例在下文及隨附實例中描述。
「回收包含蛋白質之組成物」意謂在與水解酶抑制劑接觸後收集包含蛋白質之組成物。因此，「包含蛋白質之起始組成物」為在包含蛋白質之組成物與水解酶抑制劑接觸之前的該組成物。「包含蛋白質之組成物」為在包含蛋白質之組成物 (此處為「起始組成物」) 與水解酶抑制劑接觸之後的該組成物 (且「包含蛋白質之組成物」接著為回收的包含蛋白質之組成物)。
例如，步驟 (i) 及 (ii) 可如下進行：
該方法可包含第一步(步驟 (i))，其包含提供固體載體 (或固相)，該載劑包含固定於其上之水解酶抑制劑，且使起始組成物與水解酶抑制劑 (或與抑制劑所固定於的固體載體) 接觸。然後水解酶與水解酶抑制劑結合，而剩餘的蛋白質 (或至少其主要部分)，特別是所關注蛋白質，不與抑制劑結合且可經收集 (例如自流過物) (或結合至程度低於水解酶)。
該方法可進一步包含-為了回收包含蛋白質之組成物 ((步驟 (ii))-進行若干洗滌步驟，其中使用洗滌緩衝劑進行至少一個洗滌步驟，該洗滌緩衝劑能夠將至少一部分可能已與抑制劑及/或載劑結合之所關注蛋白質與固體載體及/或抑制劑分離，同時保留 (至少一部分) 與固體載體及/或抑制劑結合的雜質 (宿主細胞蛋白，例如水解酶)。視情況，該方法可包含假如蛋白質可能已與抑制劑/載體結合，使用能夠將 (至少一部分) 該蛋白質與固體載體及/或抑制劑分離的洗提緩衝劑獲得所關注蛋白質，同時保留 (至少一部分) 與固體載體及/或抑制劑結合的雜質 (宿主細胞蛋白質，諸如水解酶)。
如上所述，本文設想包含蛋白質之組成物與包含蛋白質之起始組成物相比具有降低的水解活性。
因此，在一個態樣中，本發明係關於一種方法，其包含以下步驟： (i)  使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii) 將包含該蛋白質之組成物回收， 其中與起始組成物相比，包含蛋白質之組成物具有降低的水解活性。
因此，本發明在一個態樣中提供一種製備或獲得包含蛋白質之組成物的方法，其包含以下步驟： (i)  使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii) 將包含該蛋白質之組成物回收， 其中與起始組成物相比，包含蛋白質之組成物具有降低的水解活性。
與包含蛋白質之起始組成物相比，包含蛋白質之組成物 (回收組成物) 可具有降低的水解活性，因為 (一種或多種) 水解酶已自包含蛋白質之起始組成物中移除及/或起始組成物中之 (一種或多種) 水解酶的含量已降低。
與包含蛋白質之起始組成物相比水解活性的降低當然意味著起始組成物具有水解活性。類似地，與包含蛋白質之起始組成物相比，(一種或多種) 水解酶之含量降低當然意味著起始組成物包含 (一種或多種) 水解酶。
因此，在本文所述之方法中，包含蛋白質之起始組成物可具有水解活性及/或包含一種或多種水解酶。
因此，本發明之方法可包含確定包含蛋白質之起始組成物的水解活性及/或確定包含蛋白質之組成物 (回收組成物) 之水解活性的步驟。當進行兩個步驟時 (亦即，當包含蛋白質之起始組成物及包含蛋白質之組成物 (回收組成物) 的水解活性經確定時，可容易地確定包含蛋白質之組成物 (回收組成物)是否具有與起始組成物相比降低的水解活性。
在一個態樣中，當 (僅) 進行確定包含蛋白質之起始組成物之水解活性的步驟時且當確定起始組成物不具有水解活性時，未進行技術方案之步驟 (i) (及步驟 (ii))。
在一個態樣中，當 (僅) 進行確定包含蛋白質之起始組成物之水解活性的步驟時且當確定起始組成物具有水解活性時，進行技術方案之步驟 (i) (及步驟 (ii))。
相同的解釋經必要修改後適用於包含蛋白質之起始組成物包含一種或多種水解酶的上述態樣。
水解酶存在之指示為 (增加的) 受質 (例如完整脂肪酸酯，例如聚山梨醇酯) 分解及/或蛋白質組成物/調配物中遊離脂肪酸含量的 (同時) 增加，特別是若與已確認不含水解酶之組成物/調配物相比。若確定了此類分解，則首先表明執行此方法之必要性。但是，該方法通常可用作難以移除之 HCP 的額外清除步驟。
技術人員非常清楚如何量測、測定或定量水解活性。
用於量測、測定或定量水解活性之非限制性實例為偵測脂解活性之分析，或者換言之，脂酶活性檢定 (例如，如 Jahn 等人所述)，本文亦稱為 LEAP (針對聚山梨醇酯的脂酶酵素法) 分析 (Jahn (2020) Pharm. Res. 37: 118)，及/或脂肪酸質譜術 (FAMS) 分析 (Honemann (2019) J. Chromatogr. B 1116: 1-8；Cheng (2019) J . Pharm. Sci. 108: 2880-2886)。
允許量測、確定或定量水解活性之分析的非限制性實例為量測 4-甲基傘形酮辛酸酯 (4-MUCA) 向 4-甲基傘形酮 (4-MU) 之轉化的脂酶活性檢定 (或者換言之，偵測脂解活性之分析)。可如下所述進行使用 4-MUCA 作為受質之分析。
可將 10 µL 包含待測定水解活性之蛋白質的組成物與 80 µL 反應緩衝劑 (150 mM Tris-HCl pH 8.0、0.25% (w/v) Triton X-100 及 0.125% (w /v) 阿拉伯膠) 及 10 µL 4-MUCA 受質 (1 mM 於 DMSO 中) 混合。反應可在 96 孔半面積聚苯乙烯盤 (黑色帶蓋及透明平底，Corning Incorporated)中進行，且可藉由將反應盤在 37℃ 下培育兩小時而每 10 分鐘監測螢光信號 (355 nm 激發，460 nm 發射) 之增加，例如在 Infinite 200Pro 盤讀取器 (Tecan Life Sciences) 中，以得出 4-MU 生產率。可將包含蛋白質之組成物的 4-MU 生產率與包含蛋白質之起始組成物進行比較。
以下段落描述用於執行 FAMS 分析之例示性樣品製備及分析程序。FAMS 分析藉由定量經由聚山梨醇酯 20 水解產生之遊離脂肪酸的積累來量測脂酶活性。
所有樣品 (抗體溶液及緩衝劑對照) 均可補充有 1% (w/v) 超精制聚山梨醇酯 20 (Croda Health Care) 及 0.25 M L-甲硫胺酸 (Sigma Aldrich，貨號 M5308) 之儲備溶液，以獲得 0.04% (w/v) 超精制聚山梨醇酯 20 及 0.01 M L-甲硫胺酸之每一樣品的最終濃度。對於各加標樣品，可將 190 µL 之等分試樣轉移至五個帶蓋的玻璃小瓶 (稱為 t0、t1、t2、t3、t4) 中，用於樣品培育。玻璃小瓶 t0 可在製備後立即在 -70℃ 下冷凍直至分析。玻璃小瓶 t1、t2、t3 及 t4 可在 25℃ 下直立培養且在培養箱中避光。在接下來的五天與14天之間的時段內，可一次停止一個玻璃小瓶的培育，隨後可將玻璃小瓶冷凍於-70℃直至分析。
為進行分析，冷凍樣品可置於室溫下 1 小時。穩定同位素標記之脂肪酸的儲備溶液可藉由將 50 mg 各別脂肪酸、月桂酸 2d 23(Sigma Aldrich，目錄號 451401) 及肉豆蔻酸 13C 14(Sigma Aldrich，目錄號 605689) 溶解於 50 mL 80% 丙酮/20% 甲醇中，以獲得最終濃度為 1 μg/mL 之各研究脂肪酸的沉澱試劑。將 50 μL 樣品溶液添加至反應管中之 200 μL 沉澱試劑中，渦旋混合，且室溫靜置 1 小時，以使蛋白質沉澱。可藉由在 20℃ 下以 15,000 xg 離心 15 分鐘來離心沉澱。可將 100 µL 上清液轉移至新反應管中，且與 100 µL 流動相 A (20 mM 乙酸銨) 混合。在 20℃ 下以 15,000×g 離心 15 分鐘後，可將 50 – 100 µL 溶液轉移至 LC-MS 小瓶(300 µl Fixed Insert Vial (透明，螺旋蓋)，Thermo Scientific，目錄號 03-FISV) 中。
藉由使用 Jupiter® C4 RP 管柱 (300 Å，2×50 mm，5 μm) (Phenomenex，目錄號 00B-4167-B0)，可在配備溫度可控自動進樣器及管柱隔室之 ACQUITY UPLC H-Class 系統 (Waters Corporation, Milford, MA, US) 上實現遊離脂肪酸 (FFA) 之分離。流動相 A 可為 20 mM 乙酸銨 (Sigma Aldrich，目錄號 73594)，且流動相 B 可為 100% 甲醇 (Merck，目錄號 1.06007.2500)，其可藉由應用以下梯度以 0.4 mL/min 之流動速率運行 4 分鐘：初始條件：70% 流動相 B，0.5 分鐘 – 3.4 分鐘：梯度可自 70% 至 85% 流動相 B 線性變化；3.5 – 4.0 分鐘：70% 流動相 B。自動進樣器可保持於 20℃，且管柱隔室可保持於 60℃。注射體積可設定為 8 μL。偵測可在配備有負離子模式外部前級泵之連接的 QDa Performance 質譜儀 (Waters) 上進行。MS 設定可為如下：錐孔電壓 15 V，源溫度 120℃，毛細管電壓 800 V，探針溫度 600℃，質量範圍 50–1000 m/z 及采樣頻率 2 Hz。所有樣品均可一式三份進行分析。
可使用作為 MassLynx 軟體版本 4.1 (SCN781) (Waters Corporation, Milford, MA, US) 之一部分的 TargetLynx 進行資料評估。月桂酸及肉豆蔻酸之含量可藉由使用下式將脂肪酸之峰面積與各別內部標記標準進行比較來確定：
Figure 02_image019
其中 ∑ FFA 峰面積 及 ∑ 內標峰面積分別係指單同位素峰及 +1/+2 或 -1/-2 處之同位素峰之和。
為了確定脂肪酸釋放速率，可相對於培育時間繪制各樣品之遊離脂肪酸濃度，且可自線性回歸之斜率提取降解速率。
與包含蛋白質之起始組成物相比，包含蛋白質之組成物的水解活性可降低至少 5%、至少 10%、至少 20%、至少 30%、至少 40%、至少 50% 、至少 60%、至少 70%、至少 80%、至少 90%、至少 95% 或至少 99%，例如 20% 至 80%，較佳 50% 至 80%。反之亦然，與包含蛋白質之起始組成物相比，包含蛋白質之組成物的水解活性可降低至多 5%、至多 10%、至多 20%、至多 30%、至多 40%、至多 50%、至多 60%、至多 70%、至多 80%、至多 90%、至多 95% 或至多 99%，較佳至多 20%，更佳至多 50%，甚至更佳至多 80%。若藉由本文提供之方法使組成物經受一或多次純化，如下文進一步解釋，本文定義之%減少較佳指作為參考點之 (初始、第一) 起始組成物，亦即未與本文所述之水解酶抑制劑接觸的起始組成物。
當然，亦設想將包含蛋白質之組成物中之水解活性降低至低於所用分析之偵測極限的水準 (在後一種情況下，認為水解活性及/或水解酶經「移除」，或更準確而言，自本文之起始組成物中「完全移除」)。
本發明亦關於一種製備或獲得包含蛋白質之組成物的方法，其中包含蛋白質之組成物與起始組成物相比具有降低的水解活性，其中水解活性可例如藉由本文所述之分析 (例如脂酶活性檢定 (例如，如 Jahn 等人所述)，本文稱為 LEAP (針對聚山梨醇酯的脂酶酵素法) 分析 (Jahn (2020) Pharm. Res. 37: 118)，及/或脂肪酸質譜術 ( FAMS) 分析) 之一來測定。
同樣，與起始組成物相比，該組成物可包含減少含量之宿主細胞蛋白質 (HCP)，諸如水解酶。例如，與起始組成物相比，HCP 含量可減少 5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95% 或 99%。例如，組成物包含較佳小於 100 ppm、更佳小於 10 ppm、更佳小於1 ppm、更佳小於 0.1 ppm、最佳小於 0.01 ppm 之 HCP。
應理解，當包含蛋白質之起始組成物在用於量測或定量水解活性之所採用分析中未展現可偵測水解活性時，亦可採用本文所述之方法。不必受科學理論束縛，設想在包含蛋白質之組成物中低於所採用分析之偵測極限的水解活性亦可能對包含蛋白質之組成物具有負面影響。該負面影響可能僅在包含蛋白質之組成物的長期儲存期間變得明顯。該負面影響可為界面活性劑，例如脂肪酸酯、酯或硫酯之降解且在本文中更詳細地描述。
本文亦設想包含蛋白質之產生/回收組成物基本上無水解活性。
因此，本發明係關於一種包含以下步驟之方法： (i)  使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii) 將包含該蛋白質之組成物回收， 其中包含蛋白質之組成物基本上無水解活性。
此外，本發明提供一種製備或獲得包含蛋白質之組成物的方法，其包含以下步驟： (i)  使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii) 將包含該蛋白質之組成物回收， 其中包含蛋白質之組成物基本上無水解活性。
如本文所用，「基本上無水解活性」可意謂包含蛋白質之組成物中之水解活性接近或低於用於量測或定量水解活性之分析的偵測極限。如本文所用，「基本上無水解活性」亦可意謂與包含蛋白質之起始組成物相比，包含蛋白質之組成物的水解活性降低 80%、90%、95% 或 99%。
如本文所用，「基本上無水解活性」亦可意謂當包含蛋白質之組成物例如在 4℃ 至 8℃ 下儲存 24 個月，例如至少 6 個月、至少 12 個月、至少 18 個月、至少 24 個月、至少 36 個月或至少 60 個月，且較佳在如本文所述之標準長期條件下儲存時，包含蛋白質之組成物中少於 10% 之 (一種或多種) 酯經降解。組成物可包含如本文所述之蛋白質濃度、如本文所述之緩衝系統、如本文所述之添加劑及如本文所述之界面活性劑 (例如聚山梨醇酯 20 或聚山梨醇酯 80)，範圍為 0.01% (w/v) 及 2% (w/v)。
可藉由結合 ELSD/CAD 偵測之混合模式 HPLC (Lippold (2017) J. Pharm. Biomed. Anal. 132:24-34) 或所謂的螢光膠束分析 (FMA) (Lippold (2017) J. Pharm. Biomed. Anal. 132:24-34) 測定剩餘的界面活性劑含量來監測降解。此外，FAMS 分析可用於直接監測主要降解產物 (例如，在PS20 之情況下的月桂酸及肉豆蔻酸、在PS80 之情況下的油酸) (Honemann (2019) J. Chromatogr. B 1116:1- 8；Cheng (2019) J. Pharm. Sci. 108:2880-2886)。
上述分析之使用及調整完全在相關技術人員之技能範圍內。
應理解，本文所述之方法可用於降低水解活性及/或用於降低包含蛋白質之起始組成物中水解酶之含量。
因此，本發明在一個態樣中亦關於一種包含以下步驟之方法： (i)  使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii) 將包含該蛋白質之組成物回收， 其中該方法用於降低起始組成物中之水解活性。
此外，本發明在一個態樣中提供一種製備或獲得包含蛋白質之組成物的方法，其包含以下步驟： (i)  使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii) 回收包含蛋白質之組成物 其中該方法用於降低起始組成物中之水解活性。
上文已詳細描述了水解活性及/或水解酶之含量可如何降低以及如何確定對應降低。
因此，本發明在一個態樣中亦提供自蛋白質組成物中移除水解酶及/或降低蛋白質組成物中水解酶之含量的方法。
通常，術語「蛋白質組成物」及「包含蛋白質之組成物」在本文中可互換使用。
換言之，本發明在一個態樣中係關於一種方法，其中藉由自包含蛋白質之起始組成物中移除水解酶及/或藉由降低起始組成物中水解酶之含量來製備包含蛋白質之組成物。因此，本發明在一個態樣中係關於一種方法，其中藉由自包含蛋白質之起始組成物中移除水解酶來製備包含蛋白質之組成物，該方法包含以下步驟： (i)  使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii) 將包含該蛋白質之組成物回收。
因此，在本文所述之方法中，包含蛋白質之起始組成物可包含一種或多種水解酶。
如本文所述之方法亦可包括將水解酶吸附至水解酶抑制劑之步驟。因此，本發明在一個態樣中係關於一種包含以下步驟之方法： (i)  使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii) 回收包含蛋白質之組成物； 其中該步驟 (i) 進一步包含步驟 (a) 將水解酶吸附至水解酶抑制劑。「吸附」在本文中以最廣泛的意義使用且意謂水解酶與水解酶抑制劑締合。換言之，水解酶與水解酶抑制劑結合。水解酶及水解酶抑制劑可經由非共價鍵或經由共價鍵締合。非共價鍵之實例為氫橋、離子交互作用及疏水交互作用。較佳地，水解酶及水解酶抑制劑經由共價鍵締合。共價鍵可為酯、硫酯或磷酸酯。
設想奧利司他之 β-內酯部分與水解酶之絲胺酸形成酯鍵。
進一步設想包含蛋白質之組成物 (回收組成物) 可為包含蛋白質之溶液。此外，包含蛋白質之起始組成物可為包含蛋白質之溶液。
該包含蛋白質之溶液可為水溶液。
該包含蛋白質之溶液可為經緩衝之溶液。因此，該包含蛋白質之水溶液亦可為經緩衝之溶液。
此項技術中熟知何等試劑可用作緩衝溶液之緩衝劑。術語「緩衝劑」在本文中如此項技術中已知地使用且係指穩定溶液之 pH 的試劑。緩衝劑通常包含弱酸及其共軛鹼，或弱鹼及其共軛酸。熟習此項技術者知曉可如何確定例如某一蛋白質之最佳 pH，及何種緩衝劑可用於穩定該最佳 pH。可用作緩衝劑之試劑的非限制性實例為 Tris、Hepes、Pipes、Mops、乙酸鹽及磷酸鹽。
如上所述，該方法可包含使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸。本文描述了水解酶抑制劑以及水解酶抑制劑之非限制性實例。此外，水解酶抑制劑可選自由以下組成之群組：奧利司他或雙烯醇酯、膦酸酯，例如 a-胺基烷基膦酸酯或對硝基苯基膦酸酯 (例如 4-硝基苯基十一-10-烯基膦酸甲酯) (Delorme (2014) Biochimie 107: 124-134)
如上所述，水解酶抑制劑可固定/連接於固體載體上。術語「固體載體」及「固相」在本文中可互換使用。
固體載體可為樹脂且呈管柱，例如市售樹脂/管柱形式。固相可例如為樹脂且通常呈管柱形式，其本身為市售的。在根據本發明之方法中使用管柱係較佳的，因為其易於放大。由於水解酶抑制劑與水解酶共價結合，此類管柱可一次性使用。因此，不需要再生管柱。設想包含固定至固體載體之水解酶抑制劑的此類管柱具有比例如用於類似方法步驟之疏水交互作用層析 (HIC) 之管柱更小的體積 (HIC 管柱之體積通常為約 20 L)。包含固定至固體載體之水解酶抑制劑之管柱的體積可在約 250 ml 與至多約 5 L 之間，例如可為約250 ml 至約 5 L、約 250 ml 至約 4 L、約 250 ml 至約 3 L、約 250 ml 至約 2 L、約 250 ml 至約 1.5 L、約 250 ml 至約 1 L 或可為約 500 ml 至約 5 L、約 500 ml 至約 4 L、約 500 ml 至約 3 L、約 500 ml 至約 2 L、約 500 ml 至約 1.5 L、約 500 ml 至約 1 L，例如可為約 500 ml、約 1 L、約 1.5 L、約 2 L、約 3 L、約 4 L 或約 5 L。較佳地，包含固定至固體載體之水解酶抑制劑之管柱的體積為約 500 ml 至約 1.5 L，更佳為約 500 ml 至約 1 L。最佳地，包含固定至固體載體之水解酶抑制劑之管柱的體積為約 500 ml、約 600 ml、約 700 ml、約 800 ml、約 900 ml、約 1 L、約 1.1 L、約 1.2 L、約 1.3 L、約 1.4 L 或約 1.5 L。特別較佳的是包含固定至固體載體之水解酶抑制劑之管柱的體積為約 500 ml 或約 1 L。
然而，固體載體亦可能呈珠粒之形式或呈膜之形式。例如，若固體載體呈包含該抑制劑之珠粒形式，則該方法可包含經由離心、傾析及溶解進行接觸及回收的步驟。亦可能在回收步驟 (其可包括洗滌步驟) 期間使用磁珠及磁性分離。熟習此項技術者熟悉用於親和純化之不同方法且可容易地將此等方法用於根據本發明之方法中。
固體載體可選自由以下組成之群組：瓊脂糖、聚苯乙烯、無機金屬及/或金屬-雜原子粒子 (例如 Fe 3O 4、SiO 2或 FeS 粒子)、金粒子、銀粒子及智慧聚合物。固體載體亦可能呈磁珠形式，且在進行該方法時可採用磁性分離。技術人員熟悉在親和純化之情形下通常使用的不同製程且可容易地調試此類製程以用於根據本發明之方法中。
盡管技術人員非常清楚水解酶抑制劑可如何固定於固體載體上，但以下提供了非限制性實例。通常，水解酶抑制劑可經由官能基連接及/或生物分子/配位體結合固定於固體載體上。
以下解釋以及上文關於水解酶抑制劑之解釋 經必要修改後亦適用於製備固定於固體載體上之水解酶抑制劑，例如製備包含固定於固體載體上之水解酶抑制劑之裝置 (諸如管柱) 的方法。用於製備固定於固體載體上之水解酶抑制劑 (或用於製備包含固定於固體載體上之水解酶抑制劑之裝置 (諸如管柱)) 的此類方法被明確視為本發明之一個態樣。固定於固體載體上之水解酶抑制劑及/或包含固定於固體載體上之水解酶抑制劑的裝置 (諸如管柱) 亦為本發明之一個態樣。 反之亦然，本文關於製備包含固定於固體載體上之水解酶抑制劑之裝置 (諸如管柱) 的解釋及定義 經必要修改後亦適用於固定於固體載體上之水解酶抑制劑及/或其製備方法。應理解，當根據本發明將水解酶抑制劑固定於固體載體上時，將使用如本文所解釋之水解酶抑制劑的衍生物。
水解酶抑制劑可經由疊氮基及炔基之反應固定於固體載體上。該反應可為疊氮基-炔基 Huisgen 環加成。炔基可連接至水解酶抑制劑，而疊氮基可連接至固體載體。然而，炔基可連接至固體載體而疊氮基可連接至水解酶抑制劑亦為可能的。
因此，水解酶抑制劑可固定至疊氮基修飾之磁性粒子 (聚苯乙烯基疊氮基珠粒；CLK-1036-1，Jena-Bioscience)。術語疊氮基及疊氮基在本文中可互換使用。
此外，水解酶抑制劑可經由鏈黴親和素基團與生物素基團之結合而固定於固體載體上。鏈黴親和素基團可連接至水解酶抑制劑，而生物素基團可連接至固體載體。較佳地，鏈黴親和素基團可連接至固體載體，而生物素基團連接至水解酶抑制劑。
此外，水解酶抑制劑可經由胺基及 N-羥基琥珀醯亞胺活化酯之反應固定於固體載體上。胺基可連接至水解酶抑制劑，而 N-羥基琥珀醯亞胺活化酯連接至固體載體。然而，亦有可能胺基連接至固體載體，而 N-羥基琥珀醯亞胺活化酯連接至水解酶抑制劑。盡管技術人員清楚，應注意水解酶抑制劑或固體載體可經由連接子與上述反應性基團分離。連接子在下文描述。
盡管技術人員清楚，應注意可組合如上所述的將水解酶抑制劑固定於固體載體上的手段及方法。例如，設想包含由連接子分隔開之疊氮基及生物素基團的試劑首先經由點擊化學偶聯至包含炔基的水解酶抑制劑。隨後，將與該試劑偶聯之水解酶抑制劑固定於包含鏈黴親和素基團之固體載體上。技術人員非常清楚何種連接子可為適合的。此類連接子可促進複合物形成及/或在水解酶抑制劑與固體載體之間建立限定距離。連接子原則上可為適合以所需距離共價連接固體載體上之水解酶抑制劑的任何化學鍵。技術人員可根據關於鍵對預期用途之環境及條件之耐受性的需要來選擇連接子。例如，連接子可包含 PEG 或生物聚合物，諸如 DNA/LNA、聚糖 (例如殼聚糖或衍生物)、順丁烯二醯亞胺烷烴連接子、化學可截切連接子 (例如肼/二硫化物連接子)或酶可截切連接子 (例如Val-Cit-PABC 連接子)。PEG 連接子可為 PEG3 或 PEG4。在一較佳實施例中，包含由 PEG 連接子間隔開的疊氮基及生物素基團的試劑/連接子為偶氮生物素-PEG3-疊氮化物 (Sigma-Aldrich；訂單號：900891；CAS 1339202-33-3) 在本文中亦稱為偶氮-生物素-疊氮化物，因為其以偶氮-生物素-疊氮化物的名稱分銷。在一較佳實施例中，與該試劑偶聯之水解酶抑制劑固定於 Streptavidin Mag Sepharose 珠粒 (GE Healthcare；訂單號：11791456)。在另一較佳實施例中，包含由PEG連接子間隔開的疊氮基及生物素基團之試劑為生物素-PEG4-疊氮化物 (BroadPharm；目錄號：BP-22119；CAS 1309649-57-7)。在一較佳實施例中，與該試劑偶聯之水解酶抑制劑固定於 Streptavidin Sepharose®高效能珠粒 (GE Healthcare；訂單號：17511301)。
此外，本文設想包含由連接子分隔開的疊氮基及胺基之試劑首先與包含 NHS 活化酯之固體載體偶聯。隨後，包含炔基之水解酶抑制劑與固定於固體載體上之該試劑偶聯。
上文描述了對連接子之描述。上文描述了對連接子之描述。在一較佳實施例中，包含由連接子間隔開的疊氮基及胺基之試劑為疊氮基-PEG4-胺 (Broadpharm，BP-21615；CAS 951671-92-4)。在一較佳實施例中，與該試劑偶聯之水解酶抑制劑固定於 NHS 活化 Sepharose® 4 Fast Flow 珠粒 (GE Healthcare；訂單號：17090601) 上。
以下係關於可根據本發明使用之抑制劑。
較佳地，水解酶抑制劑 (呈連接於固相上之前的形式) 選自化合物，該等化合物包含選自以下者或由其組成 (例如具有其結構)：
Figure 02_image021
(HI-1) 和
Figure 02_image023
(HI-2) 其中在 (HI-1) 中， R 1、R 2及 R 3各自獨立地選自可為直鏈或分支鏈之 C 2-24烷基，視情況其中 R 1、R 2或 R 3中之至少一個末端 –CH 2–CH 3基團經 -C≡CH 基團置換， 其中在 (HI-2) 中， R 11、R 12及 R 13各自獨立地選自可為直鏈或分支鏈之 C 2-24烷基，視情況且其中 R 11、R 12及 R 13中之至少一個末端 –CH 2–CH 3基團經 -C≡CH 基團置換。
存在於固體載體上之水解酶抑制劑較佳選自包含以下結構或由以下結構組成之化合物：
Figure 02_image025
(HIB-1) 和
Figure 02_image027
(HIB-2) 其中在 (HIB-1) 中， R 1、R 2及 R 3各自獨立地選自可為直鏈或分支鏈之 C 2-24烷基，其中 R 1、R 2或 R 3中 (較佳 R 2中) 之一個末端 –CH 3基團經 –CH 2–* 基團取代，其中 –* 指示水解酶抑制劑與固體載體連接的位置， 其中在 (HIB-2) 中， R 11、R 12及 R 13各自獨立地選自可為直鏈或分支鏈之 C 2-24烷基，且其中 R 11、R 12或 R 13中 (較佳 R 11中) 之一個末端 –CH 3基團經 –CH 2-* 基團取代，其中 -* 指示水解酶抑制劑與固體載體連接的位置。
R 1、R 2及 R 11中之碳原子數可獨立地選自 2 至 15，較佳 3 至 14，更佳 4 至 12，甚至更佳 5 至 11。
R 12及 R 13中之碳原子數可獨立地選自 5 至 24，較佳 8 至 18，更佳 10 至 16，甚至更佳 10 至 12。
R 3中之碳原子數可選自 2 至 10，較佳 2 至 8，更佳 3 至 6，甚至更佳 3 至 5。
R 1及 R 2之烷基較佳為直鏈。
R 11、R 12及 R 13之烷基較佳為直鏈。
R 3之烷基較佳為分支鏈。
較佳地，式 (HIB-1) 具有以下結構 (HIB-1a)：
Figure 02_image029
(HIB-1a) 其中 R 1、R 2及 R 3如上所定義。
在 (HI-1) 及 (HI-2) 之以上實例中，(呈連接至固相之前的抑制劑形式) 以及在其任何更特定實例中，可包括除 -C≡CH 基團之外的官能基，諸如羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、其他炔、疊氮化物或生物聚合物 (例如鏈黴親和素及/或生物素)。應理解，存在於固體載體上之水解酶抑制劑將經由由官能基產生之連接基團與固體載體結合，例如在抑制劑 (呈連接至固相之前的形式) 具有炔基且藉由與疊氮化物之反應 (直接或間接) 結合至固相的情況下，經由 1,2,3-三唑，連接基團在水解酶抑制劑與固相結合之前存在於固體載體及水解酶抑制劑上。
較佳地，水解酶抑制劑 (呈連接至固相之前的抑制劑形式) 含有炔基且選自具有選自以下之結構的化合物：
Figure 02_image031
Figure 02_image033
及
Figure 02_image035
。
應理解，本文提供之水解酶抑制劑通常涉及水解酶抑制劑本身，但對於固定化水解酶抑制劑需要進行修改/適應，例如因為抑制劑含有炔基。如此修飾/適應之水解酶抑制劑在本文中亦稱為「水解酶抑制劑衍生物」。
經修飾/適應之水解酶抑制劑 (水解酶抑制劑衍生物) (呈連接於固相之前的抑制劑形式) 較佳為含有炔基之水解酶抑制劑，且選自具有選自以下之結構的化合物：
Figure 02_image037
(HI-1) 和
Figure 02_image039
(HI-2) 其中在 (HI-1) 中， R 1、R 2和 R 3各獨立地選自 C 2-24-烷基，其可為直鏈或支鏈，其中，R 1、R 2或 R 3中的至少一個 –CH 2–CH 3端基由 –C≡CH 基團取代， 其中在 (HI-2) 中， R 11、R 12和 R 13各獨立地選自 C 2-24-烷基，其可為直鏈或支鏈，並且其中，R 11、R 12或 R 13中的至少一個 –CH 2–CH 3端基由 –C≡CH 基團取代。
此類修飾/適應之水解酶抑制劑 (水解酶抑制劑衍生物) 亦在下文中進一步解釋及定義。
以下提供了顯示可用於本發明上下文中之水解酶抑制劑的 Markush 結構。
Markush：奧利司他： 活性結構元件名稱：(乙基氧雜環丁-2-酮)：
Figure 02_image041
奧利司他作為市售物質：
Figure 02_image043
此在本文中亦稱為式 (4)。
R1=烷基- 炔； R2=烷基 (奧利司他衍生物 1；奧利司他 A))： R1=
Figure 02_image045
R2=
Figure 02_image047
R1=烷基；R2=烷基- 炔(奧利司他衍生物 2；奧利司他 B))： R1=
Figure 02_image049
R2=
Figure 02_image051
在一較佳實施例中，水解酶抑制劑為奧利司他。較佳地，奧利司他經由疊氮基及炔基之反應固定於固體載體上。應理解，當奧利司他應固定於固體載體上時，將使用奧利司他衍生物。較佳地，奧利司他衍生物包含炔基。奧利司他亦描述於 Yang 等人, (2010), J. Am. Chem. Soci 132, 656-666 中。較佳地，包含炔基之奧利司他衍生物選自由以下組成之群組：式(1)，其在本文中命名為奧利司他 A，及(2)，其在本文中命名為奧利司他 B。術語化合物 (A)、式 (1)、奧利司他 A 及奧利司他衍生物 1 在本文中可互換使用。術語化合物 (B)、式 (2)、奧利司他 B 及奧利司他衍生物 2 在本文中可互換使用。
Figure 02_image053
(1)
Figure 02_image055
(2)
在另一較佳實施例中，水解酶抑制劑為雙烯醇酯。雙烯醇酯為熟知的，且尤其描述於「Functionalized Bis-enol Acetates as Specific Molecular Probes for Esterases」 (Richter (2013) ChemBioChem 18:2435-2438) 中。
此結構元件 (雙烯醇酯) 源自具有以下結構之天然化合物
Figure 02_image057
(參見 https://roempp.thieme.de/lexicon/RD-03-00698 或 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Caulerpenyne)。此化合物稱為 Caulerpenyne，CAS 編號為 70000-22-5，且其 PubChem CID 為 5311436。
以下涉及雙烯醇酯。
Markush：雙烯醇酯：
Figure 02_image059
活性結構元件名稱：(1,3)-丁-1,3-二烯-1,4-二基二脂肪酸 R1=H 或偶聯基團 [CH 2-(CH 2) n-Alkin 或 DiG/ ＜Dig＞/生物素-鏈黴親和素、NHS、SH、LNA [n=1-10] R2= -(CH2)x-CH3 [x=1-20] R3= -(CH2)y-CH3 [y=1-20]
較佳地，雙烯醇酯經由連接子，諸如炔基固定於固體載體上，例如經由疊氮基與炔基之反應。應理解，當雙烯醇酯應固定於固體載體上時，將使用雙烯醇酯之衍生物。較佳地，雙烯醇酯衍生物包含炔基。較佳地，包含炔基之雙烯醇酯衍生物包含式 (3) 或由式 (3) 組成
Figure 02_image061
(3) 術語化合物 (C) 及式 (3) 在本文中可互換使用。
熟習此項技術者應理解，諸如「經固定之抑制劑選自由奧利司他或雙烯醇酯組成之群組」的表述表示奧利司他或雙烯醇酯經由適合之偶聯基團連接至固體載體。例如，奧利司他或雙烯醇酯可藉由使含有炔基之經修飾奧利司他或雙烯醇酯與具有一個或多個疊氮基之固體載體反應而固定。在此情況下，應理解，存在於固體載體上之奧利司他或雙烯醇酯在其烷基之一中具有修飾，奧利司他或雙烯醇酯藉由該修飾連接至固體載體。例如，若奧利司他之 CH2-CH3 基團已經修飾為 -C≡CH 基團以藉由與固體載體的疊氮基之「點擊」反應實現與固體載體的連接，則此部分奧利司他亦將以奧利司他與固體載體連接之形式修飾 (特別是代表 -C≡CH 基團之部分將變為藉由 -C≡CH 基團與疊氮基之反應形成之三唑的部分)。
如上所述，本發明在一個態樣中進一步關於製備或獲得固定於固體載體上之水解酶抑制劑及/或製備或獲得包含固定於固體載體上之水解酶抑制劑之裝置 (諸如管柱) 的方法。因此，此類方法包含將水解酶抑制劑固定於固體載體上之步驟。本發明在一個態樣中亦關於固定於固體載體上之水解酶抑制劑及/或包含固定於固體載體上之水解酶抑制劑之裝置 (諸如管柱)。該固定於固體載體上之水解酶抑制劑及/或該裝置可藉由該方法製備或獲得。此外，藉由本文揭示之方法製備、獲得或可獲得的經固定之抑制劑及/或藉由本文揭示之方法製備、獲得或可獲得的固定於固體載體上之水解酶抑制劑可根據本發明使用，例如在包含以下步驟之方法中： (i)  使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii) 將包含該蛋白質之組成物回收。
在一較佳態樣中，抑制劑為藉由使包含式 (1)、(2)、(3) 或 (4)，較佳為式 (1)、(2) 或 (4) 或由其組成之化合物與疊氮化物反應獲得或可獲得的基團。
換言之，本發明亦關於在以下第 1 至 42項中表述之方法及產品：
第 1 項.  一種將水解酶抑制劑固定在固體載體上之方法，其包含以下步驟： 提供固體載體， 提供水解酶抑制劑， 使該固體載體與含有該水解酶抑制劑的溶液接觸，以及 使該水解酶抑制劑固定在該固體載體上。
第 2 項.  如第 1 項之方法，其中固體載體選自聚(甲基)丙烯酸酯，如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)；聚苯乙烯；聚環氧乙烷；纖維素及纖維素衍生物，例如乙酸纖維素(CA)或再生纖維素；瓊脂糖，包括交聯瓊脂糖；聚碸 (PSU)；聚醚碸 (PES)；聚乙烯 (PE)；聚丙烯 (PP)；聚碳酸酯 (PC)；聚丙烯腈 (PAN)；聚醯胺 (PA)；聚四氟乙烯 (PTFE)；以及前述之摻合物或共聚物，或與親水聚合物，較佳與聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 或聚環氧乙烷 (PEO) 之摻合物或共聚物。
第 3 項.  如第 1 或 2 項之方法，其中提供固體載體之步驟包括處理固體載體以引入官能基之步驟，該等官能基較佳地選自羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、炔烴、疊氮化物及生物聚合物 (例如鏈黴親和素及/或生物素)。
第 4 項.  如第 3 項之方法，其中提供水解酶抑制劑之步驟包括處理水解酶抑制劑以引入官能基之步驟，該等官能基能夠與固體載體之官能基反應以較佳形成鏈黴親和素-生物素交互作用或形成選自酯類、醯胺類、亞胺類、胺甲酸乙酯類、脲、β-胺基醇及 1,2,3-三唑之一個或多個基團。
第 5 項.  如第 1 至 4 項中任一項之方法，其中提供水解酶抑制劑之步驟包括處理水解酶抑制劑以引入官能基之步驟，該等官能基較佳選自羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、炔烴、疊氮化物及生物聚合物 (例如鏈黴親和素及/或生物素)。
第 6 項.  如第 5 項之方法，其中提供固體載體之步驟包括處理固體載體以引入官能基之步驟，該等官能基能夠與水解酶抑制劑之官能基反應以較佳形成鏈黴親和素-生物素交互作用或形成選自酯類、醯胺類、亞胺類、胺甲酸乙酯類、脲、β-胺基醇及 1,2,3-三唑之一個或多個基團。
第 7 項.  如前述項中任一項之方法，其中該方法包含以下步驟： 提供固體載體， 使該固體載體與含有連接子的溶液接觸，以形成載體-連接子， 提供水解酶抑制劑， 使該載體-連接子與含有該水解酶抑制劑的溶液接觸，以及 使該水解酶抑制劑固定在該載體-連接子上。
第 8 項.  如第 7 項之方法，其中提供固體載體之步驟包括處理固體載體以引入官能基之步驟，該等官能基較佳選自羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、炔烴、疊氮化物及生物聚合物 (例如鏈黴親和素及/或生物素)。
第 9 項.  如第 7 或 8 項之方法，其中連接子包含官能基，該等官能基能夠與固體載體之官能基反應以較佳形成鏈黴親和素-生物素交互作用或形成選自酯類、醯胺類、亞胺類、胺甲酸乙酯類、脲、β-胺基醇及 1,2,3-三唑之一個或多個基團。
第 10 項.  如第 7 至 9 項中任一項之方法，其中提供水解酶抑制劑之步驟包括處理水解酶抑制劑以引入官能基之步驟，該等官能基較佳選自羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、炔烴、疊氮化物及生物聚合物 (例如鏈黴親和素及/或生物素)。
第 11 項.  如第 7 至 10 項中任一項之方法，其中連接子進一步包含官能基，該等官能基能夠與水解酶抑制劑之官能基反應以較佳形成鏈黴親和素-生物素交互作用或形成選自酯類、醯胺類、亞胺類、胺甲酸乙酯類、脲、β-胺基醇及 1,2,3-三唑之一個或多個基團。
第 12 項.  如前述項中任一項之方法，其中該方法包含以下步驟： 提供固體載體， 提供水解酶抑制劑， 使該水解酶抑制劑與連接子接觸，以形成水解酶抑制劑-連接子， 使該固體載體與含有該水解酶抑制劑-連接子的溶液接觸，以及 使該水解酶抑制劑-連接子固定在該固體載體上。
第 13 項.  如第 12 項之方法，其中提供固體載體之步驟包括處理固體載體以引入官能基之步驟，該等官能基較佳選自羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、炔烴、疊氮化物及生物聚合物 (例如鏈黴親和素及/或生物素)。
第 14 項.  如第 12 或 13 項之方法，其中連接子包含官能基，該等官能基能夠與固體載體之官能基反應以較佳形成鏈黴親和素-生物素交互作用或形成選自酯類、醯胺類、亞胺類、胺甲酸乙酯類、脲、β-胺基醇及 1,2,3-三唑之一個或多個基團。
第 15 項.  如第 12 至 14 項中任一項之方法，其中提供水解酶抑制劑之步驟包括處理水解酶抑制劑以引入官能基之步驟，該等官能基較佳選自羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、炔烴、疊氮化物及生物聚合物 (例如鏈黴親和素及/或生物素)。
第 16 項.  如第 12 至 15 項中任一項之方法，其中連接子進一步包含官能基，該等官能基能夠與水解酶抑制劑之官能基反應以較佳形成鏈黴親和素-生物素交互作用或形成選自酯類、醯胺類、亞胺類、胺甲酸乙酯類、脲、β-胺基醇及 1,2,3-三唑之一個或多個基團。
第 17 項.  如第 1 至 16 項中任一項之方法，其中固體載體上之官能基包含胺基，較佳一級胺基。
第 18 項.  如第 17 項之方法，其中固體載體上之胺基係藉由用反應式電漿處理引入，該電漿較佳為自包含氨之氣體混合物產生的電漿。
第 19 項.  如第 7 至 18 項中任一項之方法，其中連接子為含有至少兩個選自以下之官能基的化合物：羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、炔烴、疊氮化物及生物聚合物 (例如鏈黴親和素及/或生物素)。
第 20 項.  如第 19 項之方法，其中連接子另外含有聚氧乙烯或聚氧丙烯部分，較佳含有 3 至 20 個 (更佳 3 至 10 個，甚至更佳 3 至 5 個) 與至少兩個官能基結合之氧乙烯或氧丙烯單元。
第 21 項.  如第 7 至 20 項中任一項之方法，其中連接子含有至少兩個選自以下之不同官能基：羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、炔烴、疊氮化物及生物聚合物 (例如鏈黴親和素及/或生物素)。
第 22 項.  如第 21 項之方法，其中連接子每分子含有選自以下之第一官能基：羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、炔烴、疊氮基、鏈黴親和素及生物素，以及此外的至少兩個第二官能基，該至少兩個第二官能基較佳為相同類型，選自羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、炔烴、疊氮化物及生物聚合物 (例如鏈黴親和素及/或生物素)，其不同於第一官能基。
第 23 項.  如第 1 至 22 項中任一項之方法，其中固體載體為交聯瓊脂糖，較佳 Sepharose，更佳 Mag-Sepharose-Streptavidin 或 Streptavidin Sepharose® 高效能珠粒。
第 24 項.  如第 1 至 23 項中任一項之方法，其中固體載體含有包括鏈黴親和素之官能基且連接子含有包括生物素之官能基。
第 25 項.  如第 24 项之方法，其中連接子另外含有疊氮基，且水解酶抑制劑含有炔基。
第 26 項.  如第 1 至 25 項中任一項之方法，其中固體載體含有包括羧酸酯之官能基，其視情況經 NHS 活化，且連接子含有包括胺之官能基。
第 27 項.  如第 26 项之方法，其中連接子另外含有疊氮基，且水解酶抑制劑含有炔基。
第 28 項.  如第 1 至 27 項中任一項之方法，其中連接子選自生物素-PEG3-疊氮化物 (CAS 875770-34-6)、生物素-PEG4-疊氮化物 (CAS 1309649-57-7)、偶氮-生物素-疊氮化物 (CAS 1339202-33-3) 及疊氮基-PEG4-胺 (CAS 951671-92-4)。
第 29 項.  如第 1 至 28 項任一項之方法，其中水解酶抑制劑含有炔基且選自具有選自以下之結構的化合物：
Figure 02_image063
(HI-1) 和
Figure 02_image065
(HI-2) 其中在 (HI-1) 中， R 1、R 2和 R 3各獨立地選自 C 2-24-烷基，其可為直鏈或支鏈，其中，R 1、R 2或 R 3中的至少一個 –CH 2–CH 3端基由 –C≡CH 基團取代， 其中在 (HI-2) 中， R 11、R 12和 R 13各獨立地選自 C 2-24-烷基，其可為直鏈或支鏈，並且其中，R 11、R 12或 R 13中的至少一個 –CH 2–CH 3端基由 –C≡CH 基團取代。
第 30 項.  如第 29 項之方法，其中 R 1、R 2及 R 11中之碳原子數獨立地選自 2 至 15，較佳 3 至 14，更佳 4 至 12，甚至更佳 5 至 11。
第 31 項.  如第 29 或 30 項之方法，其中 R 12及 R 13中之碳原子數獨立地選自 5 至 24，較佳 8 至 18，更佳 10 至 16，甚至更佳 10 至 12。
第 32 項.  如第 29 至 31 項中任一項之方法，其中 R 3中之碳原子數選自 2 至 10，較佳 2 至 8，更佳 3 至 6，甚至更佳 3 至 5。
第 33 項.  如第 29 至 32 項中任一項之方法，其中 R 1及 R 2之烷基為直鏈。
第 34 項.  如第 29 至 33 項中任一項之方法，其中 R 11、R 12及 R 13之烷基為直鏈。
第 35 項.  如第 29 至 34 項中任一項之方法，其中 R 3之烷基為分支鏈。
第 36 項.  如第 29 至 35 項中任一項之方法，其中式 (HI-1) 具有以下結構 (HI-1a)：
Figure 02_image067
(HI-1a) 其中 R 1、R 2及 R 3如前項中所定義。
第 37 項.  如第 1 至 36 項任一項之方法，其中水解酶抑制劑含有炔基且選自具有選自以下之結構的化合物：
Figure 02_image069
Figure 02_image071
及
Figure 02_image073
。
第 38 項.  一種固定於固體載體上之水解酶抑制劑，其可藉由如第 1 至 37 項中任一項之方法獲得。
第 39 項.  一種裝置，其包含如第 38 項之固定於固體載體上之水解酶抑制劑。
第 40 項.  如第 39 項之裝置，其中該裝置為具有至少兩個開口之管狀裝置。
第 41 項.  如第 39 或 40 項之裝置，其中該裝置包含容器，較佳由金屬、聚合物或玻璃制成，該容器形成空腔，其中含有固定於固體載體上之水解酶抑制劑。
第 42 項.  如第 39 至 41 項中任一項之裝置，其中該裝置為管柱，其至少部分填充有固定於固體載體上之水解酶抑制劑。
較佳在回收包含蛋白質之組成物之前，使包含蛋白質之起始組成物與固定於固體載體上之水解酶抑制劑接觸。換言之，在包含蛋白質之起始組成物與固定於固體載體上之水解酶抑制劑接觸後，回收包含蛋白質之組成物。因此，如本文所述之方法可按以下次序進行： 步驟 (i) 使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上； 接著為 步驟 (ii) 回收包含蛋白質之組成物。
本文所述方法之步驟 (i) 及 (ii) 通常以該次序進行，亦即步驟 (i) 繼之以步驟 (ii)。雖然在步驟 (i) 與步驟 (ii) 之間可能有進一步的步驟 (例如進一步的純化步驟)，但在此較佳步驟 (i) 之後緊接著為步驟 (ii)，亦即在步驟 (i) 與步驟 (ii) 之間無進一步的步驟步驟 (i) 及步驟 (ii)。
此外，本文中設想且較佳的是步驟 (i) 及 (ii) (較佳以 (i) 繼之以 (ii) 之次序) 可進行一次，例如包含蛋白質之起始組成物，如使粗提取物或已藉由習知方法 (例如蛋白質 A 親和層析) 純化之提取物經受該方法之步驟 (i)，接著回收包含根據步驟 (ii) 之蛋白質的組成物。換言之，本文中較佳的是在本文所述之方法中/在執行該方法時 (僅) 進行一次步驟 (i)。如本文所提及及描述，該方法可包含在步驟 (i) 之前及/或在步驟 (i) 與 (ii) 之間的額外純化及/或製備步驟，例如親和層析、離子層析及/或混合模式層析。
然而，亦設想步驟 (i) 及 (ii) (較佳以 (i) 繼之以 (ii) 之次序)可重複一次或多次，例如 2、3、4、5、6、7 、8、9 或 10 次。例如，可能需要 (進一步) 在第一次進行步驟 (i) 及 (ii) 之後降低包含蛋白質之回收組成物中之水解活性，例如達到水解活性之某一臨限值及/或為了 (進一步) 移除或減少雜質，諸如宿主細胞蛋白質，特別是水解酶。
在此上下文中，包含在方法之步驟 (ii) 中回收之蛋白質的組成物將與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上。
例如，該方法可接著相應地如下進行 (較佳以次序 (i) 繼之以 (ii)，繼之以 (iii)，繼之以 (iv) (短順序 (i) 至 (iv)：
一種方法，其包含以下步驟： (i)    使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii)   回收包含蛋白質之組成物； (iii)  使包含在 (先前) 步驟 (ii) 中回收之蛋白質的組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上； (iv)  將包含該蛋白質之組成物回收。
此接著可按需要重複，如上所述，例如如下：
一種方法，其包含以下步驟： (i)    使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii)   回收包含蛋白質之組成物； (iii)  使包含在 (先前) 步驟 (ii) 中回收之蛋白質的組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上； (iv)  回收包含蛋白質之組成物； (v)   使包含在 (先前) 步驟 (iv) 中回收之蛋白質的組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上； (vi)  回收包含蛋白質之組成物； 等。
為了進一步重複該等步驟，可在該方法中額外進行任何所需數目之以下步驟： (vii)      使包含在先前步驟中回收之蛋白質的組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上； (viii)     回收包含蛋白質之組成物； 等。
盡管技術人員清楚，但應指出本文所述之方法可與 (習知) 蛋白質製備及/或純化手段及方法組合。換言之，使包含蛋白質之起始組成物與固定水解酶抑制劑接觸之步驟及回收蛋白質組成物之步驟可與 (習知) 蛋白質製備及/或純化之額外步驟組合。
因此，在一較佳態樣中，該方法在步驟「(i) 使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上」之前可進一步包括一個或多個 (習知) 蛋白質製備及/或純化步驟。
該方法可在步驟        「(i)使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上」之後進一步包含一個或多個 (習知) 蛋白質製備及/或純化步驟。
該方法在步驟 (i) 使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上之前及之後可進一步包括一個或多個 (習知) 蛋白質製備及/或純化步驟。
(習知) 蛋白質製備及/或純化步驟之非限制性實例為離子交換層析 (諸如陰離子交換層析 (AEX) 及/或陽離子交換層析 (CEX)，較佳陽離子交換層析 (CEX))、親和層析、疏水交互作用層析 (HIC) 及 (超) 過濾，或其組合，諸如混合模式層析 (例如混合模式離子交換層析，較佳混合模式陰離子交換層析 (MMAEX))。親和層析較佳為蛋白質 A 親和層析。
此等術語之含義及蛋白質製備及/或純化步驟，包括親和層析、離子交換層析 (諸如陰離子交換層析 (AEX) 及/或陽離子交換層析 (CEX) 及/或疏水交互作用層析 (HIC) 層析，在此項技術中中為熟知的。
混合模式層析之優勢在於溶質藉由超過一種交互作用模式或機制與固定相交互作用，從而產生更高選擇性及分離能力 (Zhang 及 Liu (2016) J. Pharm. Biomed. Anal. 128:73-88)。混合模式層析 (或多模式層析) 可例如包含以下方法：
IEC/HIC
由於 IEC 及 HIC 條件最接近適合維持生物活性之生理條件，因此其組合被廣泛用於生物產品之分離。IEC/HIC MMC 提高了分離能力及選擇性，因為溶質經由靜電及疏水交互作用與固定相交互作用。
IEC/RPLC
IEC/RP MMC 結合了 RPLC 及 IEC 之優點。例如，與單一 WAX 或 RPLC- 相比，WAX/RP 具有提高的分離能力及調節分離選擇性之自由度
HILIC/RPLC
Liu等人合成了一種 HILIC/RP 固定相，其可藉由調節流動相中之有機相來顯示 RPLC 或 HILIC 保留 (Liu 及 Pohl (2008) J. Chrom.A 1191:83-89)。
HILIC/IEC
Mant等人報導，與 RPLC 相比，HILIC/CEX 為肽分離提供獨特選擇性、更強的分離能力及更廣泛的應用。(Mant 等人 (1998) J. Chrom.A. 816 (1):79-88)
SEC/IEC
蛋白質 SEC 中之疏水交互作用在低離子強度下相對較弱，靜電效應可顯著促進保留，且此允許吾人使用 SEC 管柱作為弱離子交換器。
較佳地，使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸係在包含蛋白質之起始組成物 (僅) 經受蛋白質 A 親和層析且視情況過濾之後進行。若進行過濾，則較佳次序為蛋白質 A 親和層析且隨後過濾 (亦即蛋白質 A 親和層析繼之以過濾)。「(僅) 經受」意謂起始組成物僅經受給定的 (習知) 蛋白質製備及/或純化步驟，諸如在此上下文中之蛋白質 A 親和層析及視情況選用之過濾，亦即該方法不包含除步驟 (i) 之前的給定方法之外的任何其他純化方法。
本文設想使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸係在包含蛋白質之起始組成物 (僅) 經受蛋白質 A 親和層析且視情況經受過濾之後，及/或在包含蛋白質之起始組成物經受離子交換層析或混合模式離子交換層析，較佳陽離子交換層析或混合模式陰離子交換層析之後進行。
因此，在一較佳態樣中，在步驟 (i) 使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上之前，該方法可進一步包含親和層析 (較佳蛋白質 A 親和層析) 及視情況選用之過濾。
如本文所用，蛋白質 A 親和層析較佳包括降低組成物之 pH 值及隨後增加 pH 值 (至初始 pH 值)。此用於滅活病毒 (若 (可能) 存在於組成物中)。經受此類蛋白質 A 親和層析之組成物在本文中亦稱為「經處理之蛋白質 A 溶液池」、「經處理之蛋白質 A 洗提池」、「經處理之蛋白質 A 洗提液」、蛋白質 A 洗提池或蛋白質 A 洗提液。
此外，如本文所用之過濾可包括使用深度過濾器。因此，深度過濾在本文中較佳。經受此類蛋白質 A 親和層析接著過濾之組成物在本文中亦稱為「混合模式陰離子交換負載溶液」 (其表明該溶液在進行步驟 (i) 之後經受混合模式離子交換層析，特別是混合模式陰離子交換層析。
如上所述，在步驟「(i) 使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上」之後，該方法可進一步包含一個或多個 (習知) 蛋白質製備及/或純化步驟。在一較佳態樣中，在步驟「(i) 使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上」之後 (且在回收組成物之前)，該方法可進一步包含 (至少) 一個離子交換層析及/或混合模式層析 (諸如混合模式離子交換層析)及/或疏水交互作用層析 (HIC)，較佳陽離子交換層析及/或混合模式層析 (諸如混合模式陰離子交換層析)及/或疏水交互作用層析 (HIC) 步驟。
混合模式離子交換層析在本文中較佳為混合模式陰離子交換層析 (MMAEX)。
在一些實施例中，如本文所揭示之用於自培養細胞產生、純化及/或分離目標蛋白質的步驟進一步包含選自由以下組成之群組的至少一個步驟：收集澄清過程 (或自細胞培養物中移除完整細胞及細胞碎片之類似過程)、超濾 (UF) 過程 (或濃縮產生之蛋白質之類似過程)、滲濾 (DF) 過程 (或改變或稀釋包含先前過程產生之蛋白質之緩衝劑的類似過程)、病毒滅活過程 (或滅活或移除病毒粒子之類似過程)、親和捕獲過程 (或任何一種捕獲產生之蛋白質且將其與其餘緩衝劑/溶液組分分離的層析方法)、調配過程及批量填充過程。在一態樣中，如本文所揭示，用於自培養細胞中產生、純化及/或分離蛋白質之步驟至少包含收集澄清過程 (或自細胞培養物中移除完整細胞及細胞碎片之類似過程)、收集後超濾 (UF) 過程 (或濃縮產生之蛋白質之類似過程)、收集後滲濾 (DF) 過程 (或改變或稀釋包含先前過程產生之蛋白質之緩衝劑的類似過程)、溶劑/洗滌劑病毒滅活過程 (或化學滅活病毒粒子之類似過程)、中間純化過程 (諸如疏水交互作用層析 (HIC) 或任何一種捕獲產生之蛋白質且將其與其餘的緩衝劑/溶液組分分離之層析方法)、HIC UF/DF 後過程 (或濃縮及/或緩衝劑交換產生之蛋白質的類似過程)、病毒減少過濾過程 (或進一步移除任何病毒粒子或其他雜質或汙染物之類似過程)；混合模式層析 (諸如 CAPTO® Adhere 瓊脂糖層析，或進一步純化及/或濃縮產生之蛋白質的類似過程)、調配過程及批量填充過程。在一態樣中，本文提供之方法之分離步驟進一步包含以下中之至少一者：收集澄清、超濾、滲濾、病毒滅活、親和捕獲、HIC 層析、混合模式層析及其組合。
在一些態樣中，如本文所揭示，用於自培養細胞純化蛋白質之步驟包含層析過程。在一個實施例中，層析過程為親和捕獲過程。層析過程可至少涉及疏水交互作用層析 (HIC)、蛋白質 A 層析 CAPTO® Adhere 混合模式層析。
如上文在一較佳態樣中所述，本文所述之方法可在步驟「(i) 使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上」之前及/或之後進一步包含一個或多個 (習知) 蛋白質製備及/或純化步驟。因此，本文所述之方法可為平臺過程 (亦即用於純化所關注蛋白質，諸如抗體之方法/過程)。
此類方法/過程可包含使用採用不同純化原理 (亦即不同蛋白質製備及/或純化步驟) 之若干管柱。
本文所述之典型過程或方法 (用於製備包含蛋白質之組成物) 包含所關注蛋白質之 (習知) 製備及/或純化的至少 4 個後續步驟，亦即自細胞培養物中製備蛋白質組成物，接著通常為 (至少) 3 個 (習知) 層析步驟，視情況 4 個 (習知) 層析步驟。
因此：在自細胞培養物或培養物上清液製備蛋白質組成物 ( 步驟 1) 之後，方法/過程通常包括 3 個後續 (習知) 層析步驟 (視情況 4 個後續步驟)，例如通常使用 3 個管柱 (視情況 4 個管柱)，各管柱採用不同純化原理 ( 步驟 2-4，或者若包括視情況選用之 步驟 5(管柱 4)，則為 步驟 2-5)。
較佳地，除了步驟「(i) 使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上」以外，本文所述之方法/過程 (用於製備包含蛋白質之組成物) 亦包括使用 (至少) 三個採用三種 (視情況 4 種) 不同純化原理之管柱 (視情況 4 個管柱)。
圖 7 示出用於製備所關注蛋白質之組成物/純化所關注蛋白質之習知示意性方法/過程。圖 7 亦說明可在本發明之方法中採用步驟「(i) 使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上」的情況。
首先，製備來自細胞培養物 (產生蛋白質/所關注蛋白質之細胞) 之組成物，例如藉由均質化細胞。該組成物亦可為細胞培養上清液。較佳地，隨後將上述組成物純化，例如該組成物接著為 (如) (例如藉由過濾) 與細胞、細胞碎片及/或聚集體分離的組成物。因此，(隨後純化之) 組成物為 (如) (藉由過濾) 與細胞、細胞碎片及/或聚集體分離之組成物，例如為 收集細胞培養液 (HCCF)。
其次，進一步純化上述組成物，例如藉由進一步的蛋白質製備及/或純化步驟 ( 步驟 2)。進一步的蛋白質製備及/或純化步驟較佳為親和層析 (較佳蛋白質 A 親和層析)。因此，親和層析 (較佳蛋白質 A 親和層析) 較佳為第一層析步驟。例如，使上述組成物 (例如收集細胞培養液 (HCCF)) 經受蛋白質 A 親和層析。換言之，該過程包括使用親和層析管柱 ( 蛋白質 A 親和層析管柱)。
第三，接著使溶離液經受第二管柱 ( 管柱 2 )/ 步驟 3)。
第四，接著使第二管柱之溶離液經受第三管柱 ( 管柱 3/ 步驟 4)。
第五，若在第四步驟之後 (亦即在三個管柱 (較佳各管柱採用不同純化原理) 之後) 未達成或欲進一步提高品質 (例如所關注蛋白質之純度)，則可視情況使用 第五步驟(例如使用第四純化原理之第四管柱) ( 管柱 4/ 步驟 5)。技術人員可根據具體情況決定第五步驟是否必要及/或有益，例如在平衡成本及/或增加之複雜性與提高之品質時。
因此， 步驟 3 至 5可為任何次序之離子交換層析 (例如陰離子交換層析 (AEX) 及/或陽離子交換層析 (CEX))、混合模式層析及疏水交互作用層析 (HIC)。換言之，管柱 2 至 4 可為任何次序之離子交換層析管柱 (例如陰離子交換層析 (AEX) 管柱或陽離子交換層析 (CEX) 管柱)、混合模式層析管柱及疏水交互作用層析 (HIC) 管柱，亦即，該過程包括以任何次序使用任何上述管柱。
在平臺過程/純化過程之開發中，技術人員可確定欲使用之步驟/管柱的次序。
第六，在管柱 3 或視情況選用之管柱 4 (步驟 4 及視情況選用之步驟 5) 之後，使溶離液經受病毒過濾，且接著為 第七，經受超濾/滲濾 (UFDF)。在第七步驟 (UFDF) 之後，可回收包含蛋白質之組成物。
在圖 7 之流程中，使收集細胞培養液 (HCCF) 經受蛋白質 A 親和層析。接著使溶離液經受第二管柱 (管柱 2)。接著使第二管柱之溶離液經受第三管柱 (管柱 3)。若在第三步驟之後 (亦即在使用三種不同純化原理之三個管柱之後) 未達成品質 (例如所關注蛋白質之純度)，則可使用第五步驟 (例如使用第四純化原理之第四管柱) (圖 7 中之管柱 4)，例如若確實有需要。否則，通常不會使用第五步驟/第四管柱，以避免成本、材料損失及複雜性增加。技術人員可根據具體情況決定第四步驟是否必要及/或有益。
對於圖 7 中示出之管柱 2、3 及 4，在開發過程中定義了一個序列。評估之純化原理描述於本文中且可為離子交換層析 (例如陰離子-陽離子交換層析)、混合模式層析或疏水交互作用層析。換言之，在平臺過程/純化過程的開發過程中，技術人員將確定所用管柱之次序。相對於彼此之不同純化原理 (蛋白質製備及/或純化步驟) 之次序的若干非限制性實例提供於上文中。
在管柱 3 或視情況選用之管柱 4 之後，使溶離液經受病毒過濾，且接著經受超濾/滲濾 (UFDF)。
此外，技術人員可確定何時進行步驟「(i) 使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上」 (在圖 7 中稱為使組成物與水解酶抑制劑接觸)。
本發明之方法/過程 (用於製備包含蛋白質之組成物) 包含步驟「(i) 使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑 (諸如奧利司他) 接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上」 (例如該步驟為水解酶抑制劑層析 (水解酶抑制劑層析步驟)。換言之，該方法/過程可包括使用水解酶抑制劑 (例如奧利司他) 管柱。
較佳地，水解酶抑制劑層析/層析步驟在親和層析 (較佳蛋白質 A 親和層析) 步驟/步驟 2 之後。換言之，該過程可包括在蛋白質 A 管柱之後 (直接) 使用水解酶抑制劑 (例如奧利司他) 管柱。因此，較佳地，步驟「(i) 使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上」 在親和層析 (較佳蛋白質 A 親和層析) 之後進行。此係為了確保以下純化步驟確保自蛋白質組成物中移除抑制劑 (諸如奧利司他)。例如，由於基質之潛在滲出 (亦即自抑制劑固定於其上之固體載體中滲出)，在進行該步驟 (i) 之後，抑制劑可能存在於組成物中。
然而，亦如本文他處所論述，步驟「(i) 使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上」可在管柱 2 或管柱 3 之後進行 (若第五步驟到位)。
因此，替代地，水解酶抑制劑層析/層析步驟可在步驟 3 至 5 中之任一者之後 (步驟 3 至 5 可為以任何次序之離子交換層析 (例如陰離子交換層析 (AEX) 及/或陽離子交換層析 (CEX))、混合模式層析及疏水交互作用層析 (HIC))。換言之，該過程包括在以任何次序使用離子交換層析管柱 (例如陰離子交換層析 (AEX) 管柱或陽離子交換層析 (CEX) 管柱)、混合模式層析管柱及疏水交互作用層析 (HIC) 管柱之後 (直接) 使用水解酶抑制劑 (例如奧利司他) 管柱。
在一態樣中，該方法/過程不包含混合模式層析。
水解酶抑制劑層析/層析步驟通常不 (直接) 在自細胞培養物製備蛋白質組成物之初始步驟之後 (例如不在 HCCF 之後)。換言之，水解酶抑制劑層析/層析步驟通常不在親和層析 (例如蛋白質 A 親和層析)/步驟 1 之前進行。此係因為此類初始蛋白質組成物 (例如來自細胞培養物/細胞培養物上清液，較佳 HCCF 之蛋白質組成物) 通常仍包含高度雜質，例如細胞、細胞碎片及/或聚集體。因此，該過程通常不包括在自細胞培養物製備蛋白質組成物之初始步驟之後 (直接) 使用水解酶抑制劑 (例如奧利司他) 管柱及/或通常不包括在使用親和層析管柱 (例如蛋白質 A 親和層析管柱) 之前使用水解酶抑制劑 (例如奧利司他) 管柱。
與本文所述之方法中使用之步驟次序無關，顯而易見的是純化之藥物物質(包含蛋白質之回收組成物) 不應含有抑制劑 (例如奧利司他) 或僅含有最少量 (較佳非可偵測量) 或不阻止向個體/患者投予組成物 (或本文所述之蛋白質調配物，例如包含組成物之調配物) 的量，例如以經諸如 FDA 或 EMA 等當局批准的調配物形式。換言之，該方法將以確保在回收之蛋白質組成物及/或本文所述之蛋白質調配物中不存在抑制劑 (或僅以如上所述之最小量存在) 的方式使用。
本文所述之方法 (用於製備包含蛋白質之組成物) 可包含以下次序之步驟 (1)自細胞培養物 (產生蛋白質/所關注蛋白質之細胞) 製備組成物或自細胞培養物中獲得細胞培養物上清液，較佳隨後純化所製備之組成物或上清液，例如自細胞、細胞碎片及/或聚集體中分離/移除 (例如藉由過濾) (較佳地，製備及/或純化之組成物為 收集細胞培養液 (HCCF))； (2) 親和層析 (較佳蛋白質 A 親和層析) (應用於藉由進行步驟 (1) 獲得之 (純化) 組成物)， 接著為「(i) 使包含蛋白質之起始組成物(例如此處為藉由進行親和層析獲得之 (純化) 組成物) 與水解酶抑制劑 (诸如奧利司他) 接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上」 (例如該步驟為水解酶抑制劑層析 (水解酶抑制劑層析步驟)； (3) 離子交換層析 (例如陰離子交換層析 (AEX) 及/或陽離子交換層析 (CEX)) (應用於藉由進行步驟 (2) 獲得之 (純化) 組成物； (4) 混合模式層析 (應用於藉由進行步驟 (3) 獲得之 (純化) 組成物)； 視情況，(5) 疏水交互作用層析 (HIC) (應用於藉由進行步驟 (4) 獲得之 (純化) 組成物； (6) 病毒過濾 (應用於藉由進行步驟 (4) (或 (5)，若適用)獲得之 (純化) 組成物； (7) 過濾 (例如 UFDF) (應用於藉由進行步驟 (6) 獲得之 (純化) 組成物；接著為 (ii) 回收包含蛋白質之組成物。
如所論述，離子交換層析 (例如陰離子交換層析 (AEX) 及/或陽離子交換層析 (CEX))、混合模式層析及疏水交互作用層析 (HIC) 可以任何次序使用。
因此，替代地，上述方法可例如包含以下次序之步驟： (3) 混合模式層析 (應用於藉由進行步驟 (2) 獲得之 (純化) 組成物)； (4) 離子交換層析 (例如陰離子交換層析 (AEX) 及/或陽離子交換層析 (CEX)) (應用於藉由進行步驟 (3) 獲得之 (純化) 組成物； 視情況，(5) 疏水交互作用層析 (HIC) (應用於藉由進行步驟 (4) 獲得之 (純化) 組成物。
在另一替代方案中，上述方法可例如包含以下次序之步驟： (3) 疏水交互作用層析 (HIC) (應用於藉由進行步驟 (2) 獲得之 (純化) 組成物； (4) 離子交換層析 (例如陰離子交換層析 (AEX) 及/或陽離子交換層析 (CEX)) (應用於藉由進行步驟 (3) 獲得之 (純化) 組成物； 視情況，(5) 混合模式層析 (應用於藉由進行步驟 (4) 獲得之 (純化) 組成物)。
在另一替代方案中，上述方法可例如包含以下次序之步驟： (3)       離子交換層析 (例如陰離子交換層析 (AEX) 及/或陽離子交換層析 (CEX)) (應用於藉由進行步驟 (2) 獲得之 (純化) 組成物； (4)       疏水交互作用層析 (HIC) (應用於藉由進行步驟 (3) 獲得之 (純化) 組成物； 視情況，(5) 混合模式層析 (應用於藉由進行步驟 (4) 獲得之 (純化) 組成物)。
如本文他處所論述，步驟「(i) 使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上」較佳在親和層析(參見以上步驟 (2)) 之後進行。
亦如上所述，步驟「(i) 使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上」可替代在親和層析 (參見以上步驟 (2)) 之後 (或甚至外加在親和層析之後)，在離子交換層析 (例如陰離子交換層析 (AEX) 及/或陽離子交換層析 (CEX)) 之後/之後進行，或進一步替代地，在混合模式層析之後/之後進行，或進一步替代地，在疏水交互作用層析 (HIC) 之後/之後進行，在本文所述之方法中，例如在以上步驟 (3)、(4) 及/或 (5) 中。
根據本文所使用及定義之術語「起始組成物」，將與水解酶抑制劑接觸之任何上述 (純化) 組成物，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上 (步驟 (i))，為或可為「起始組成物」。例如，藉由進行親和層析 (參見以上步驟 (2)) 獲得之 (純化) 組成物為「包含蛋白質之起始組成物」。
相同解釋經必要修改後一般適用於本文所述的與水解酶抑制劑接觸之 (純化) 組成物，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上 (步驟 (i))。例如，藉由進行離子交換層析 (例如陰離子交換層析 (AEX) 及/或陽離子交換層析 (CEX))、混合模式層析及/或疏水交互作用層析 (HIC) 獲得之 (純化) 組成物為「包含蛋白質之起始組成物」。
通常，應理解術語「使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸」意謂「包含蛋白質之起始組成物」，且此組成物將與水解酶抑制劑接觸 (其中水解酶抑制劑固定於固體載體上)。因此，起始組成物包含蛋白質且不包含水解酶抑制劑。
以下涉及可用於製備/生產所關注蛋白質之培養細胞/細胞培養物。編碼所關注蛋白質之核酸可作為較佳具有調節元件之外源基因引入此類宿主細胞，已作為活性內源基因存在於宿主細胞中或作為內源非活性基因被活化。
對應培養細胞可為宿主細胞或非人類宿主 (細胞)，其經載體或編碼所關注蛋白質之核酸分子轉化或包含該載體或核酸分子。應理解，根據本發明，術語「經本發明之載體轉形的宿主細胞或非人類宿主」通常涉及包含載體或編碼蛋白質之核酸分子的宿主細胞或非人類宿主。用於表現多肽之宿主細胞為此項技術中熟知的且包含原核細胞以及真核細胞。因此，宿主可選自由以下組成之群組：細菌、哺乳動物細胞、藻類細胞、纖毛蟲、酵母及植物細胞。典型的細菌包括埃希氏菌 (Escherichia)、棒狀杆菌 (麩胺酸)、假單胞菌 (螢光)、乳杆菌、鏈黴菌、沙門氏菌 (諸如巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium) 或枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis))或棒狀杆菌 (如麩胺酸棒狀杆菌 (Corynebacterium glutamicum))。本文中最佳的細菌宿主為大腸杆菌 (E. coli)。本文中使用之例示性纖毛蟲為四膜蟲，例如嗜熱四膜蟲 (Tetrahymena thermophila)。
典型的哺乳動物細胞包括 Hela、HEK293、HEK293T、H9、Per.C6 及 Jurkat 細胞、小鼠 NIH3T3、NS0 及 C127 細胞、COS 1、COS 7 及 CV1、鵪鶉 QC1-3 細胞、小鼠 L 細胞、小鼠肉瘤細胞、 Bowes 黑色素瘤細胞及中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞。根據本發明，最佳的哺乳動物宿主細胞為 CHO 細胞。此外，人類胚胎腎 (HEK) 細胞為較佳的。
其他適合之真核宿主細胞為例如酵母，諸如 畢赤酵母 (Pichia pastoris) 、乳酸克魯維酵母 (Kluyveromyces lactis) 、釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)及 粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)或雞細胞，諸如 DT40 細胞。適用於表現之昆蟲細胞為例如 果蠅 S2、 果蠅 Kc、 夜蛾 Sf9及 Sf21或 粉夜蛾 Hi5細胞。較佳的藻細胞為 萊茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)或 細長聚球藻 (Synechococcus elongatus)細胞及其類似細胞。例示性植物為蘚屬，例如 小立碗蘚 (Physcomitrella patens)。
初代哺乳動物細胞或細胞株亦在本發明之範疇內。初代細胞為直接獲自生物體之細胞。適合之初代細胞為例如小鼠胚胎纖維母細胞 (MEF)、小鼠初代肝細胞、心肌細胞及神經元細胞以及小鼠肌肉幹細胞 (衛星細胞)、人類真皮及肺纖維母細胞、人類上皮細胞 (鼻、氣管、腎、胎盤、腸、支氣管上皮細胞)、人類分泌細胞 (來自唾液腺、皮脂腺及汗腺)、人類內分泌細胞 (甲狀腺細胞)、人類脂肪細胞、人類平滑肌細胞、人類骨骼肌細胞、人類白細胞諸如 B 細胞、T 細胞、NK 細胞或樹突細胞及穩定的永生化細胞株 (例如 hTERT 或癌基因永生化細胞)。用於上述宿主細胞之適合培養基及條件為此項技術中已知的。
宿主細胞可例如用於產生大量所關注蛋白質，諸如結合分子。
在本發明之上下文中適用之例示性結合蛋白/結合分子包括但不限於抗體；抗體片段，諸如 Fab 片段、Fab' 片段、F(ab')2 片段、單鏈可變片段 (scFv)；(單) 域抗體，特別是衍生自駱駝科動物、美洲駝或鯊魚之抗體；分離之抗體可變區(VL 及/或 VH 區)，特別是來自人類或靈長類動物之彼等；CDR；免疫球蛋白域；CDR 衍生之肽模擬物；凝集素；纖連蛋白域；生腱蛋白域；蛋白質 A 域；SH3 域；錨蛋白重複域；及脂質運載蛋白或如上所述之各種類型的支架衍生之結合蛋白。
以下內容涉及宿主細胞蛋白質 (HCP)，其可存在於起始組成物中，且若存在，將自包含所關注蛋白質之組成物中移除 (或減少其含量)。
HCP 為由生產過程中使用之細胞或生物體產生或編碼的蛋白質，與預期產物無關。一些為生長、存活及正常細胞處理所必需的，而其他者則可能並非必需的。與預期產品一樣，HCP 亦可由宿主藉由許多轉譯後修飾進行修飾。不管效用如何，或缺乏效用，在最終藥物物質中通常不期望 HCP。盡管通常以少量存在 (百萬分率，表示為每毫克預期蛋白質之奈克數)，但工業界需要花費大量精力及成本來將其移除。在批准用於治療用途的生物產品之前，應定量量測產品中殘留 HCP 之水準。因此，通常必須消除或減少 HCP，且必須證明消除或減少。目前分析重組生物產品中是否存在汙染物 HCP 之分析方法包括 SDS-PAGE、免疫墨點技術及 ELISA。有許多關於移除 HCP 汙染及移除之出版物，例如使用例如疏水交互作用層析 (Shukla 等人，Biotechnol. Prog.2002, 18, 556-564)，蛋白質 A 層析 (Shukla 等人，Biotechnol. Prog.2008, 24, 11151121)，或耐鹽陰離子交換配位體 (Riordan 等人，Biotechnol. Prog.2009, 第 25 卷, 第 6 期)。
然而，如本文所示，藉由習知純化方法不能充分移除 HCP 含量。即使最少殘留量亦可導致長期儲存穩定性降低。設想由於界面活性劑降解劑之不溶性物質，組成物中 HCP 之存在可導致可見及/或顯微鏡下可見的粒子的出現。該等粒子可能違反非經腸調配物之要求 (EP 2.9.19、EP 2.9.20、USP ＜787＞、USP ＜788＞ 及 USP ＜789＞)。此外，此等粒子可包含不溶性蛋白質聚集體，其比可溶性蛋白質更具免疫原性。因此，本文提供之包含所關注蛋白質之組成物/調配物為包含低含量之 HCP 及/或較佳不顯示可見粒子形成之組成物/調配物，特別是在例如 2-8℃ 下儲存至少 6 個月、至少 12 個月、至少 18 個月、至少 24 個月、至少 36 個月或至少 60 個月期間。
可見粒子形成意謂熟習此項技術者可肉眼觀測到粒子，視情況使用放大裝置，諸如放大鏡。在監管領域中，可見微粒物質與不可見微粒物質之間存在區別。可見微粒被粗略地定義為可肉眼偵測到的任何微粒。通常，可見物體被定義為 0.05 mm 或更大的物體。本發明中使用之術語「可見粒子」意謂：0.05 mm 或更大，較佳 0.1 mm 或更大，更佳 0.2 mm 或更大，更佳 0.5 mm 或更大，最佳 1 mm 或更大的粒子。亦可使用設計用於偵測此類可見粒子之設備來偵測可見粒子形成。與根據本發明之組合物 (藉由一種方法獲得) 一樣，自動化澄清溶液中微粒偵測之最常用方法為攪拌溶液且隨時間對溶液成像。成像系統通常由機器視覺相機、照明 (在此情況下背光) 及視覺處理器以分析影像組成。一旦已獲取影像，接著對其按順序分析影像之間的差異。差異可解釋為在溶液內移動之物體，諸如氣泡及微粒。在較大、較致密微粒之情況下，偵測係藉由自分析濾出氣泡來實現，因為氣泡將上升，而微粒下沉。
若目標為找到直徑小於約 1 mm 之微粒，則必須使用更仔細的攪拌方法，以自視野中移除氣泡。此可藉由在仔細注意加速及減速率之情況下旋轉攪動溶液來實現。然而，出於本發明之目的，偵測方法對於定義「可見粒子」不重要，只要粒子具有如上定義之直徑。
根據本發明之方法較佳產生相對於所關注蛋白質含量包含小於 100 ppm、更佳小於 10 ppm、更佳小於 1 ppm、更佳小於 0.1 ppm、最佳小於 0.01 ppm HCP 之組成物/調配物。例如，組成物/調配物包含小於 100 ppm、更佳小於 50 ppm、更佳小於 20 ppm、更佳小於 10 ppm、更佳小於 5 ppm、更佳小於2 ppm、最佳小於1 ppm或更少的 (一種或多種) 宿主細胞蛋白質。
本文所述之方法不限於特定蛋白質/所關注蛋白質。起始組成物中之蛋白質/所關注蛋白質可為源自任何來源之任何蛋白質。
特定而言，涵蓋任何治療、診斷及/或醫藥蛋白質/所關注蛋白質以及科學研究中之任何所關注蛋白質。以下為所關注蛋白質之非限制性實例： 介白素受體拮抗劑、介白素 1 受體拮抗劑，如 EBI-005 或阿那白滯素、瘦素、乙醯膽鹼酯酶、活化蛋白 C (drotrecogin)、活化素受體 IIB 拮抗劑、腺苷脫胺酶、阿加糖酶 α、類鐸受體 5 促效劑如恩托莫德 (entolimod)、α-1 抗胰蛋白酶、α-1 蛋白酶抑制劑、α-半乳糖苷酶、α-人類心房利鈉肽、α-N-乙醯胺基葡萄糖苷酶、阿替普酶、阿米普酶、胰澱素、胰澱素類似物、ANF-Rho、血管收縮素 (1-7)、血管收縮素 II、血管收縮素轉換酶 2、抗上皮細胞黏附分子單鏈抗體片段、抗凝血酶 α、抗凝血酶 III、凋亡誘導酶 mi-APO，精胺酸脫亞胺酶、天冬醯胺酶如卡門冬酶 (calaspargase)、培門冬酶 (pegasaspargase)、克瑞他酶 (crisantaspase)、B域缺失因子 VIII 如 beroctocog alfa 或 octofactor、貝妥單抗 (bectumomab) (Lymphoscan)、膽鹽刺激之脂酶如布塞脂酶 α (Bucelipase alfa)、針對呼吸道融合病毒的結合蛋白如帕利珠單抗 (pavlizumab)、骨形態發生蛋白如 BMP-2 (dibotermin alfa) 或 BMP-6、三角梅核糖體失活蛋白 (bouganin)、牛碳氧血紅蛋白、牛生長激素、C1-酯酶抑制劑、C3 外酶蛋白、碳氧血紅蛋白、CD19 拮抗劑、CD20 拮抗劑如美羅華 (rituxan)、CD3 受體拮抗劑、CD40 拮抗劑, CD40L 拮抗劑如 達匹單抗 (dapirolizumab) 或 Antova、腦苷脂硫酸酯酶、賽生靈 (cethrin) 如 VGX-210、軟骨素截切酶, 凝血因子 IX 如 nonacog gamma、conacog beta、albutrepenonacog alfa、凝血因子 VIIa 如 eptacog alfa、alaceptogational、凝血因子 VIII 如susoctocog alfa、damoctocog alfa、turoctocog alfa、rurioctocog alfa、efmoroctocog alfa、efraloctocog alfa、simoctocog alfa、凝血因子 X、凝血因子 XIII 如catridecacog 拮抗劑、溶組織梭菌膠原酶、補體因子 C3 抑制劑、補體受體 5a 拮抗劑、促腎上腺皮質激素釋放因子、CSF1 受體拮抗劑如 FPA008、CSF1R 拮抗劑、CTLA-4 拮抗劑如伊匹單抗 (ipilimumab)、藍藻抗病毒蛋白-N (cyanovirin-N)、脫氧核糖核酸酶 I 樣阿法鏈道酶 (deoxyribonuclease I like dornase alfa)、EGFR 受體拮抗劑、彈性蛋白酶如人類 I 型胰彈性蛋白酶如伏帕尼酶 (vonapanitase)、內皮抑素、恩卡斯汀 (enkastim)、表皮生長因子、紅血球生成素 α、紅血球生成素 ζ、FcγIIB 受體拮抗劑、纖維蛋白原酶、纖溶酶如纖維蛋白酶、纖維母細胞生長因子 1 (人類酸性纖維母細胞生長因子)、纖維母細胞生長因子 18、纖維母細胞生長因子 2 (人類鹼性纖維母細胞生長因子)、纖維母細胞生長因子 21、纖維母細胞生長因子受體 2 拮抗劑如 FPA144、Fms 樣酪胺酸激酶 3 配位體、促卵泡激素如促卵泡素 α 或促卵泡素 β、人類殺菌/通透性增加蛋白 21 (奧培巴坎 (opebacan)/rBPI 21) 之片段、多花白樹毒蛋白 (gelonin)、升糖素受體促效劑、醣蛋白 IIb/IIIa 拮抗劑如阿昔單抗 (abciximab)、醣胺聚糖降解酶如安慰酶 (condoliase)、gp120/gp160、顆粒球集落刺激因子 (G-CSF)、顆粒球巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF)、來自與轉錄因子 E7 (verpasep caltespen) 融合之分枝杆菌 BCG 的熱休克蛋白 hsp 65、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體 (HGFR) 拮抗劑、鐵調素拮抗劑、Her2/neu 受體拮抗劑如赫賽汀 (herceptin)、異二聚體 15:IL-15Ra (hetIL-15)、水蛭素、hsp70 拮抗劑、人類酸性鞘磷脂酶、人類絨毛膜促性腺激素如絨毛膜促性腺激素 α、人類酶酸性 α-葡萄糖苷酶如 reveglucosidase alfa 或 alglucosidase alfa、人類生長激素、人類角質形成細胞生長因子 (KGF)、人類基質金屬蛋白酶鹼性蛋白片段、人類成骨蛋白 1、人類成骨蛋白-1、人類甲狀旁腺激素、人類血栓調節素 α、透明質酸酶如 rHuPH20、透明質酸酶如人類透明質酸酶 PH-20 (vorhyaluronidase alfa)、透明糖酶或牛透明質酸酶 (bovhyaluronidase)、水解溶體葡糖腦苷脂特異性酶如葡糖腦苷脂酶、維拉苷酶 α (velaglucerase alfa) 或塔利苷酶 α (taliglucerase alfa)、艾杜糖酸-2-硫酸酯酶、IgE拮抗劑如奧馬珠單抗、易洛魁同源盒蛋白 2 (IRX-2)、胰島素、胰島素類似物、整合素 α4β1 拮抗劑、干擾素-τ、干擾素-α、干擾素-α 拮抗劑，干擾素-α 超促效劑、干擾素-α-n3 (Alferon N 注射液)、干擾素-β、干擾素-γ、干擾素-λ、介白素 2 融合蛋白如 DAB(389)IL-2、介白素- 11 如奧普瑞介白素 (oprelevkin)、介白素-12、介白素-17 受體拮抗劑、介白素-18 結合蛋白、介白素-2、介白素-22、介白素-4 如匹曲白滯素 (pitrakinra)、介白素-4 突變蛋白、介白素-6 受體拮抗劑、介白素-7、介白素 -22 受體次單位 α (IL-22ra) 拮抗劑、鳶尾素、胰島新生相關蛋白、激肽原酶、乳鐵蛋白、乳鐵蛋白片段、拉諾普酶 (lanoteplase)、脂酶如布魯脂酶 (burlulipase)、根黴脂酶 (rizolipase)、依帕非酶 (epafipase) 或賽麗帕酶 α (sebelipase alfa)、促黃體激素、促黃體素 α、淋巴細胞擴增分子、溶葡萄球菌素、哺乳動物胃脂酶 (merispace)、甘露糖苷酶如維爾曼酶 α (velmanase alfa)、黑皮質素-4 受體促效劑、MEPE 衍生之 23個胺基酸之肽、甲硫胺醯人類幹細胞因子 (安塞司亭 (ancestim))、微纖溶酶、N-乙醯半乳糖胺-6-硫酸酯酶如 易樂蘇酶 α (elosulfase alfa)、N-乙醯胺基葡萄糖苷酶、那沙普酶 β、神經生長因子、神經調節蛋白-1、神經毒素 (例如梭菌神經毒素，如肉毒梭菌神經毒素 (諸如肉毒梭菌神經毒素血清型 A、B、C、D、E、F 或 G，特別是肉毒梭菌神經毒素血清型 A)、嗜中性球明膠酶相關脂質運載蛋白、奧裏帕明 (ocriplasmin)、非洲鈍緣蜱 (Ornithodoros moubata) 補體 (OmCI/Coversin)、骨保護素、P128 (StaphTAME)、帕米普酶 (pamiteplase)、甲狀旁腺素 (PTH)、PD-1 拮抗劑、PDGF 拮抗劑、正五聚蛋白-2 蛋白、噬菌體溶素如 HY133、苯丙胺酸氨截切酶如瓦利亞酶 (valiase)、磷酸酶如組織非特異性鹼性磷酸酶或 阿司福酶 α (asfotase alfa)、纖溶酶原、纖溶酶原變體如 V10153、血小板衍生生長因子-BB、豬生長激素、抑制素靶向肽 1、胰島素原、蛋白質 A、蛋白 C 如卓特考金 (drotrecognin)、蛋白結合纖維母細胞生長因子受體配位體如 FP-1039、重組組織因子途徑抑制劑 (替法考金 (tifacogin))、鬆弛素、鬆弛素類似物如舍拉辛 (serelaxin)、瑞特普酶 (reteplase)、rhPDGF-BB、核糖核酸酶如豹蛙酶 (onconase) 或豹蛙卵母細胞酶 (amphinase)、生瑞波酶 (senrebotase)、絲胺酸蛋白酶抑制劑如 康斯塔特 α (conestat alfa)、司非立酶 (sfericase)、唾液酸酶、可溶性補體受體 1 型、可溶性 DCC (在結直腸癌中缺失) 受體、可溶性 TACI 受體 (阿塞西普 (atacicept))、可溶性腫瘤壞死因子 I 受體 (sTNF-RI)、可溶性腫瘤壞死因子 II 受體 (sTNF-RII)、可溶性 VEGF 受體 Flt-1、可溶性人類 FcγIIB 受體、葡萄球菌激酶、鏈激酶、磺胺酶、T 細胞受體配位體、替奈普酶 (tenecteplase)、血小板生成刺激蛋白 (AMG-531)、血小板生成素、血小板反應蛋白-1、甲狀腺激素、促甲狀腺激素釋放激素 (TRH) 類似物如他替瑞林 (taltirelin)、組織纖溶酶原活化劑、組織型纖溶酶原活化劑如帕米普酶 (pamiteplase)、三肽基肽酶 I、腫瘤壞死因子 (TNFα)、腫瘤壞死因子 α 拮抗劑、尿酸酶如拉布立酶 (rasburicase) 或培阿曲酶 (pegadricase)、尿擴張素、尿促卵泡素、尿激酶、子宮珠蛋白 (uteroglobin)、VEGF 拮抗劑，如蘭比珠單抗 (ranbizumab) 或貝伐單抗 (bevacizumab)、VEGF/PDGF 拮抗劑、VEGF/PDGF 拮抗劑如多 VEGF/PDGF DARPin 或融合蛋白、槲寄生素 (viscumin)、馮威利布蘭因子 (von Willebrand factor)，如 vonicog alfa。介白素受體拮抗劑，尤其是介白素-1 受體拮抗劑，如 EBI-005 或阿那白滯素，及瘦素，尤其是人類瘦素，或突變人類瘦素 (huLeptin(W100Q)，一種在成熟多肽鏈中之 100 位處用色胺酸取代麩醯胺酸之人類瘦素突變體)，
較佳地，蛋白質/所關注蛋白質為抗體。因此，本發明在一個態樣中係關於一種包含以下步驟之方法： (i)  使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii) 將包含該蛋白質之組成物回收， 其中蛋白質為抗體。
術語「抗體」在本文中以最廣泛含義使用，涵蓋各種抗體結構且可為能夠特異性或選擇性結合目標蛋白之任何分子。抗體可包括或可為抗體或其域/片段，其中域/片段顯示與全長抗體基本相同的結合活性。非限制性實例為單株抗體、多株抗體或多特異性抗體 (例如較佳為雙特異性抗體)。較佳地，抗體為單株抗體或雙特異性抗體。本發明中之抗體亦可為嵌合抗體、重組抗體、人源化抗體或 (全) 人抗體。較佳地，抗體為人源化或人抗體。抗體片段之實例包括但不限於 Fv、Fab、Fab'、Fab' - SH、F(ab')2。
抗體亦可包括多價分子、多特異性分子 (例如雙抗體)、融合分子、適體、親合體或其他天然存在或重組產生的分子。適用於本發明之例示性抗體包括抗體樣分子。抗體樣分子為可藉由與目標分子結合而展現功能之分子 (參見例如 Gill (2006) Curr Opin Biotechnol 17:653-658；Nygren (1997) Curr Opin Struct Biol 7:463-469；Hosse (2006) Protein Sci 15:14-27)，且包括例如 DARPins (WO 2002/020565)、親和體 (WO 1995/001937)、親合體 (WO 2004/044011；WO 2005/040229)、阿德奈汀 (Adnectins) (WO 2002/032925) 及非諾莫 (fynomers) (WO 2013/135588)。
本發明中抗體之非限制性實例為抗 CD20 抗體、抗 CD40 抗體、抗 HER2 抗體、抗 IL6 抗體、抗 IgE 抗體、抗 IL13 抗體、抗 TIGIT 抗體、抗 PD-L1 抗體、抗 VEGF-A 抗體、抗 VEGF-A/ANG2 抗體、抗 CD79b 抗體、抗 ST2 抗體、抗 D 因子抗體、抗 IX 因子抗體、抗 X 因子抗體、抗 Aβ 抗體、抗 tau 抗體、抗 CEA 抗體，抗 CEA/CD3 抗體、抗 CD20/CD3 抗體、抗 FcRH5/CD3 抗體、抗 Her2/CD3 抗體、抗 FGFR1/KLB 抗體、FAP-4-1 BBL 融合蛋白、FAP-IL2v 融合蛋白、奧克利珠單抗 (ocrelizumab)、帕妥珠單抗 (pertuzumab)、曲妥珠單抗 (trastuzumab)、托珠單抗 (tocilizumab)、法利昔單抗 (faricimab)、帕羅托珠單抗 (polatuzumab)、甘特珠單抗 (gantenerumab)、賽必妥單抗 (cibisatamab)、克雷珠單抗 (crenezumab)、莫蘇妥珠單抗 (mosunetuzumab)、替瑞利尤單抗 (tiragolumab)、貝伐珠單抗 (bevacizumab)、利妥昔單抗 (rituximab)、阿托珠單抗 (atezolizumab)、奧比妥珠單抗 (obinutuzumab)、蘭帕麗珠單抗 (lampalizumab)、來瑞珠單抗 (lebrikizumab)、奧馬珠單抗 (omalizumab)、雷尼單抗 (ranibizumab)、艾美賽珠單抗 (emicizumab)、塞魯單抗 (selicrelumab)、普拉辛珠單抗 (prasinezumab)、格菲妥單抗 (glofitamab)、欣洛奇芙普 (simlukafusp alfa) 和 RG7827。
本文較佳的為抗 CD20/抗 CD3抗體 (特別是抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，尤其是格菲妥單抗)、抗 Her2 抗體 (特別是曲妥珠單抗)及/或抗 IL6 受體抗體 (特別是托珠單抗)。
當本文描述之本發明之方法用於純化曲妥珠單抗時，設想步驟「(i)使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上」在使曲妥珠單抗溶液經受蛋白質 A 層析之後進行。
格菲妥單抗為一種抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，且亦稱為 RG6026。格菲妥單抗之胺基酸序列揭示於 PCT/EP2015/067776 (WO/2016/020309) 中。當本文所述之本發明之方法用於純化格菲妥單抗時，設想步驟「(i) 使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上」在使格菲妥單抗溶液經受混合模式陰離子交換層析 (MMAEX)，亦即經處理之蛋白質 A 溶離液之前進行。在格菲妥單抗純化之上下文中，術語 MMAEX 負載溶液係指在經受 MMAEX 層析之前的抗體溶液。
在一較佳態樣中，所關注蛋白質為托珠單抗，抑制劑為奧利司他 B，包含由用於偶聯至固體載體之連接子間隔開的疊氮基及生物素基團之試劑 (連接子) 為偶氮生物素-疊氮，且固體載體為鏈黴親和素 Mag Sepharose (珠粒) (參見實例 1 及 2)。
在一較佳態樣中，所關注蛋白質為格洛替單抗，抑制劑為奧利司他 B，包含用於偶聯至固體載體之疊氮基及生物素基團的試劑 (連接子) 為生物素-PEG4-疊氮化物，且固體載體為鏈黴親和素 Sepharose ® 高效能珠粒 (參見實例 3)。
在一較佳態樣中，所關注蛋白質為格洛替單抗，抑制劑為奧利司他 B，包含用於偶聯至固體載體之疊氮基及胺基的試劑 (連接子) 為疊氮基-PEG4-胺，且固體載體為 NHS 活化 Sepharose® 4 Fast Flow 珠粒 (參見實例 3)。
在一較佳態樣中，所關注蛋白質為曲妥珠單抗，抑制劑為奧利司他 A 或奧利司他 B，包含用於偶聯至固體載體之疊氮基及生物素基團的試劑 (連接子) 為生物素-PEG4-疊氮化物，且固體載體為 Streptavidin Sepharose® 高效能珠粒 (參見實例 4)。
在一較佳態樣中，所關注蛋白質為曲妥珠單抗，抑制劑為奧利司他 A 或奧利司他 B，包含用於偶聯至固體載體之疊氮基及胺基的試劑 (連接子) 為疊氮基-PEG4-胺，且固體載體為 NHS 活化 Sepharose® 4 Fast Flow 珠粒 (參見實例 4)。
上述試劑/連接子稱為生物素-PEG4-疊氮化物 (CAS 1309649-57-7)、偶氮-生物素-疊氮化物 (CAS 1339202-33-3) (亦稱為偶氮-生物素-PEG3-疊氮化物) 及疊氮基-PEG4-胺 (CAS 951671-92-4)。
托珠單抗為一種抗 IL6 受體抗體。托珠單抗之 CAS 寄存編號為 375823-41-9。INN 托珠單抗揭示於 WHO Drug Information, 第 18 卷, 第 3 期, 2004 中。
如本文所用，術語「蛋白質」 (所關注蛋白質) 且特別是「抗體」包括及/或涉及其生物相似藥。因此，如本文所用，術語「蛋白質」 (所關注蛋白質) 且特別是「抗體」可理解為分別係指「蛋白質及/或其生物相似藥」 (或類似地「所關注蛋白質及/或其生物相似藥」)、「抗體及/或其生物相似藥」等等。
生物相似藥為與另一種已獲批准的生物藥物 (『對照藥品』) 高度相似的生物藥品 (亦稱為生物製品)。如本文所用，「對照藥品」亦指本文定義之「對照蛋白質/對照所關注蛋白質」，特別是若該「對照蛋白質/對照所關注蛋白質」獲批准 (由諸如 EMA、FDA 及類似當局批准)。
生物相似藥係根據適用於所有生物藥物之相同醫藥品質、安全性及有效性標準批准的。如本文所用，術語「生物相似藥」通常係指與本文定義之對照蛋白質/所關注蛋白質具有相同，亦即一致，(或基本上相同) 之胺基酸序列的蛋白質/所關注蛋白質。應理解，「生物相似藥」可具有與對照蛋白質/所關注蛋白質不同的醣基化或其他特徵。
例示性對照蛋白質/所關注蛋白質描述於本文中，例如奧雷利珠單抗、帕妥株單抗、曲妥珠單抗、托珠單抗、法利昔單抗、波妥珠單抗、甘特魯單抗、西比他單抗、克雷珠單抗、莫舒妥珠單抗、替拉戈單抗、貝伐單抗、利妥昔單抗、阿特珠單抗、奧比妥珠單抗、蘭帕珠單抗、來比珠單抗、奧馬珠單抗、雷尼珠單抗、伊美珠單抗、塞利路單抗、普拉西珠單抗、格菲妥單抗、simlukafusp alfa 及 RG7827。本文中較佳的為曲妥珠單抗、托珠單抗托珠單抗及格菲妥單抗。
經由 INN 及相關出版物可輕鬆鑒定對照蛋白質/所關注蛋白質之胺基酸序列。
根據上文，若本文提及特定對照蛋白質 (對照所關注蛋白質)，則特定對照蛋白質 (所關注對照蛋白質) 包括且涉及其生物相似藥 (較佳其中生物相似藥為與對照所關注蛋白質具有相同胺基酸序列的蛋白質)。
例如，術語「抗 CD20/抗 CD3 抗體」可指「抗 CD20/抗 CD3 抗體及/或其生物相似藥」 (較佳地，其中生物相似藥為抗 CD20/抗 CD3 抗體，其與對照抗 CD20/抗 CD3 抗體具有相同胺基酸序列)。
例如，術語「抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體」可指「抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體及/或其生物相似藥」 (較佳地，其中生物相似藥為抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體，其與對照抗 CD20/抗 CD3 雙特異性抗體具有相同胺基酸序列)。
例如，術語「格菲妥單抗」可指「格菲妥單抗及/或其生物相似藥」。(較佳地，其中生物相似藥為與對照抗體格菲妥單抗具有相同胺基酸序列的抗體)。
例如，術語「抗 Her2 抗體」可指「抗 Her2 抗體及/或其生物相似藥」 (較佳地，其中生物相似藥為與對照抗 Her2 抗體具有相同胺基酸序列的抗 Her2 抗體)。
例如，術語「曲妥珠單抗」可指「曲妥珠單抗及/或其生物相似藥」 (較佳地，其中生物相似藥為與對照抗體曲妥珠單抗具有相同胺基酸序列的抗體)。
例如，術語「抗 IL6 受體抗體」可指「抗 IL6 受體抗體及/或其生物相似藥」 (較佳地，其中生物相似藥為與對照抗 IL6 受體抗體具有相同胺基酸序列的抗 IL6 受體抗體)。
例如，術語「托珠單抗」可指「托珠單抗及/或其生物相似藥」 (較佳地，其中生物相似藥為與對照抗體托珠單抗具有相同胺基酸序列的抗體)。
以上解釋經必要修改後適用於本文揭示之所有蛋白質/所關注蛋白質，特別是抗體。
本發明進一步係關於一種製備蛋白質調配物之方法。該製備蛋白質調配物之方法可包含如上文所述之方法，且進一步向包含蛋白質之組成物中添加界面活性劑，較佳為脂肪酸酯。換言之，製備蛋白質調配物之方法可包含用界面活性劑，較佳為脂肪酸酯補充如藉由上文所述之方法製備的包含蛋白質之組成物。
如上文中所示，所提供之方法可用於製備具有降低之雜質 (諸如宿主細胞蛋白質，特別是水解酶) 含量及/或具有降低之水解活性的蛋白質組成物。因此，根據本發明製備之蛋白質組成物可有利地用於製備蛋白質調配物，後者顯示改良的 (物理) 穩定性，即使例如蛋白質調配物中存在此類宿主細胞蛋白質之受質，如界面活性劑亦如此。因此在長期儲存期間較佳減少粒子形成，較佳不形成可見粒子。
因此，本發明在一態樣中係關於一種製備蛋白質調配物之方法，其包含如上文所述之方法的步驟，其中製備蛋白質調配物之方法進一步包含將界面活性劑，較佳為脂肪酸酯添加至包含蛋白質之組成物中。
在一個實施例中，用於製備蛋白質調配物之方法可包含以下步驟： (i) 使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii)        將包含該蛋白質之組成物回收， 且進一步向包含蛋白質之組成物中添加界面活性劑，較佳為脂肪酸酯。
本發明在一態樣中進一步關於一種製備蛋白質調配物之方法，其中用於製備蛋白質調配物之方法進一步包含將界面活性劑 (較佳為脂肪酸酯) 添加至包含藉由上述方法獲得或可獲得之蛋白質的組合物中。
界面活性劑可用作助溶劑及穩定劑。其藉由與親水表面及親脂表面結合起作用，以維持成分 (如蛋白質) 之分散及結構穩定性。將界面活性劑添加至蛋白質調配物中主要是為了增強蛋白質對機械應力，例如空氣/液體界面及固體/液體界面剪切的穩定性。如本文所用，術語「界面活性劑」特別係指如本文所解釋及定義之「脂肪酸酯」。
當界面活性劑降解時，界面活性劑分解產物可能形成可見或顯微鏡下可見的粒子。亦設想隨著蛋白質調配物中界面活性劑濃度的降低，蛋白質在某些情況下可能在溶液中結構不穩定，且形成最終變為可見或顯微鏡下可見的粒子之多聚聚集體。
術語「脂肪酸酯」在本文中以最廣泛的含義使用，且係指含有經由酯鍵與頭基連接之脂肪酸鏈的任何有機化合物。當羥基 (例如醇或羧酸) 經烷氧基取代時，形成酯鍵。通常，酯衍生自羧酸及醇。醇基通常被稱為頭基。醇可為甘油、山梨糖醇、山梨醇酐、異山梨醇等。在聚山梨醇酯之情況下，酯化發生在羧酸與連接至例如山梨糖醇的聚氧乙烯重複單元之末端羥基之間。
術語「脂肪酸」或「脂肪酸鏈」意謂具有脂族尾之羧酸。脂族尾簡單地為包含碳及氫之烴鏈，且在一些情況下，包含氧、硫、氮及/或氯取代。
脂族尾可為飽和的 (如在飽和脂肪酸中)，此意謂所有碳-碳鍵均為單鍵 (亦即烷烴)。脂族尾可為不飽和的 (如在不飽和脂肪酸中)，其中一個或多個碳-碳鍵為雙鍵 (烯烴) 或三鍵 (炔烴)。
脂肪酸通常稱為短鏈脂肪酸，其脂族尾之碳少於六個；中鏈脂肪酸，其具有六至十二個碳；長鏈脂肪酸，其具有十三至二十一個碳；以及極長鏈脂肪酸，其具有二十二個碳及更長的脂族尾。如上所述，脂肪酸亦根據其飽和度進行分類，飽和度與剛性及熔點相關。常見的脂肪酸包括辛酸 (8 個碳原子: 0 個雙鍵；8:0)、癸酸 (10:0)、月桂酸 (12:0)、肉豆蔻酸 (14:0)、肉豆蔻油酸 (14:1)、棕櫚酸 (16:0)、棕櫚油酸 (16: 1)、鼠尾草酸 (16:1)、硬脂酸 (18:0)、油酸 (18:1)、反油酸 (18:1)、異油酸 (18:1)、亞油酸 (18:2)、亞反油酸 (18:2)、α-亞麻酸 (18:3)、花生酸 (20:0)、花生四烯酸 (20:4)、二十碳五烯酸 (20:5)、山萮酸 (22:0) 、芥酸 (22:1)、二十二碳六烯酸 (22:6)、木蠟酸 (24:0) 及蠟酸 (26:0)。
較佳地，脂肪酸酯為聚氧乙烯山梨醇酐或異山梨醇脂肪酸單酯、二酯或三酯。在一較佳實施例中，本發明中之脂肪酸酯為聚氧乙烯 (4) 山梨醇酐單酯、聚氧乙烯 (5) 山梨醇酐單酯或聚氧乙烯 (20) 山梨醇酐單酯。
聚氧乙烯 (4) 山梨醇酐、聚氧乙烯 (5) 山梨醇酐或聚氧乙烯 (20) 山梨醇酐之單酯較佳選自由以下組成之群組：聚山梨醇酯 20、聚山梨醇酯 40、聚山梨醇酯 60、聚山梨醇酯 61、聚山梨醇酯 80、聚山梨醇酯 81、聚山梨醇酯 120 及其組合。聚山梨醇酯 20 主要包含聚氧乙烯 (20) 山梨醇酐之單月桂酸酯。聚山梨醇酯 40 主要包含聚氧乙烯 (20) 山梨醇酐之單棕櫚酸酯。聚山梨醇酯 60 主要包含聚氧乙烯 (20) 山梨醇酐之單硬脂酸酯。聚山梨醇酯 61 主要包含聚氧乙烯 (4) 山梨醇酐之單硬脂酸酯。聚山梨醇酯 80 主要包含聚氧乙烯 (20) 山梨醇酐之單油酸酯。聚山梨醇酯 81 主要包含聚氧乙烯 (5) 山梨醇酐之單油酸酯。聚山梨醇酯 120 主要包含聚氧乙烯 (20) 山梨醇酐之單異硬脂酸酯。
在另一較佳實施例中，脂肪酸酯為聚氧乙烯 (20) 山梨醇酐單酯。較佳地，聚氧乙烯 (20) 山梨醇酐單酯選自由以下組成之群組：聚山梨醇酯 20、聚山梨醇酯 40、聚山梨醇酯 60、聚山梨醇酯 80、聚山梨醇酯 120 及其組合。更佳地，聚氧乙烯 (20) 山梨醇酐單酯選自由以下組成之群組：聚山梨醇酯 20、聚山梨醇酯 40、聚山梨醇酯 60、聚山梨醇酯 80 及其組合。最佳地，聚氧乙烯 (20) 山梨醇酐單酯選自由以下組成之群組：聚山梨醇酯 20、聚山梨醇酯 80 及其組合。
在另一較佳實施例中，本發明中之脂肪酸酯為聚氧乙烯 (20) 山梨醇酐三酯。較佳地，聚氧乙烯 (20) 山梨醇酐三酯選自由以下組成之群組：聚山梨醇酯 65、聚山梨醇酯 85 及其組合。聚山梨醇酯 65 主要包含聚氧乙烯 (20) 山梨醇酐之三硬脂酸酯。聚山梨醇酯 85 主要包含聚氧乙烯 (20) 山梨醇酐之三油酸酯。
在另一較佳實施例中，本發明中之脂肪酸酯為單或二醯基甘油、醣-脂肪酸酯或 α-生育酚 PEG 琥珀酸酯 (TPGS)。顯而易見的是本文提及之所有界面活性劑均可組合。
如上所述，界面活性劑之降解可為脂肪酸酯之水解。經由水解損失界面活性劑可導致蛋白質聚集，其可導致形成可見及/或顯微鏡下可見的粒子形成。界面活性劑本身之降解產物亦可導致形成可見及/或顯微鏡下可見的粒子。如本文所設想及上文所述，本發明之方法可降低包含蛋白質之組成物中的水解活性。因此，亦設想由該包含蛋白質之組成物製備之調配物可具有降低的水解活性或基本上無水解活性。技術人員將承認，製備之調配物中降低的水解活性或無水解活性將導致製備之調配物中可見及/或顯微鏡下可見的粒子的量減少。製備之調配物亦可能將不含或基本上不含可見及/或顯微鏡下可見的粒子。尤其重要的是，製備之調配物在儲存時不含或基本上不含可見及/或顯微鏡下可見的粒子。上文已提供了對應定義。此等定義及解釋經必要修改後在此處適用。
因此，本發明在一個態樣中係關於一種製備如本文所述之蛋白質調配物的方法，其中蛋白質調配物 (基本上) 不含可見及/或顯微鏡下可見的粒子，特別是在儲存時。
可見及顯微鏡下可見的粒子係藉由分析方法 (方法清單參見表 A) 進行表徵，且按照相應法規 (EP 2.9.19、EP 2.9.20、USP ＜787＞、USP ＜788＞ 及 USP ＜789＞) 中之要求分類。粒子之定量及化學鑒定用於為粒子風險評估提供資訊。藉由目視檢查之可見粒子偵測為概率性的，且取決於粒子大小、形態、顏色、密度、反射率、周圍調配物的特性、量測條件及人為表現。已公布之研究表明，150 μm 為球形聚苯乙烯粒子標準 (用於校準方法) 之尺寸，由人類檢查員以大於 70% 概率偵測到，如 USP ＜1790＞ (Melchore (2011) AAPS PharmSciTech.12: 215-221) 中所述。
顯微鏡下可見的粒子亦按照藥典以及 ≥10 μm 及≥25 μm 之粒子 (及 ≥ 50 μm 之眼用溶液) 的產品規格限制進行評估。通常亦監測 ≥ 2 μm 及 ≥ 5 μm 之粒子群體，尤其在產品開發過程中。基於當前可用技術 (例如，HIAC) 之顯微鏡下可見的粒子偵測上限為 100 μm。
與美國藥典 (USP) (USP ＜788＞) 一致，「可見灰色區域」係指可見檢查下限之尺寸範圍，其中藉由可見檢查偵測粒子之概率自 150 μm 處之 ＜70% 下降至 50 μm 附近之零，50 μm為顯微鏡下可見的粒子偵測能力之上限。
每10個容器之粒子的允許量可為少於 7 個、少於 6 個、少於 5 個、少於 4 個、少於 3 個、少於 2 個或少於 1 個粒子。
技術人員非常清楚如何接收關於粒子之額外資訊 (例如歐洲藥典 (EP) 2.9.19、EP 2.9.20、USP ＜787＞、USP ＜788＞、USP ＜789＞、 Mathonet (2016) PDA J Pharm Sci Technol. 70: 392-408、Rech (2020) J. Pharm. Sci. 109: 1725-1735)
Figure 02_image075
表 A ：偵測 / 表徵粒子之方法
如上所述，當局對醫藥調配物之可見及/或顯微鏡下可見的粒子的數目提供了限制。因此，由於可見及/或顯微鏡下可見的粒子形成，醫藥調配物在一定量的時間後不能再使用。
本文設想可見及/或顯微鏡下可見的粒子形成減少的蛋白質調配物具有增加之穩定性或穩定更長時間。換言之，可見及/或顯微鏡下可見的粒子形成減少的蛋白質調配物具有增加之儲存期限。
因此，具有降低之水解活性的蛋白質調配物可具有增加之穩定性、增加之儲存期限或穩定更長時間。
因此，本發明在一個態樣中係關於一種製備蛋白質調配物之方法，其包含本文所述之方法的步驟，其中製備蛋白質調配物之方法進一步包含將界面活性劑，較佳為脂肪酸酯添加至包含蛋白質之組成物中，其中蛋白質調配物具有增加之穩定性、增加之儲存期限及/或穩定 (更長時間)，特別是儲存穩定的。
必須生成藥品 (例如本文定義之蛋白質調配物) 之長期穩定性資料，以確認在整個儲存期限內之足夠穩定性。生物技術藥品通常考慮三個標準長期條件。長期條件亦稱為建議儲存條件。其表示建議的標簽儲存條件。
標準長期條件可包括 i) 在冷凍器 (-20℃) (根據 ICH Q1A) 中儲存至少 6 個月 (根據 ICH Q5C)， ii) 在冷藏機 (5℃ (根據 ICH Q1A)，亦即藥品之建議儲存條件) 中儲存至少 6 個月 (根據 ICH Q5C)， iii) 在室溫 (25℃) (根據 ICH Q1A) 下儲存至少 6 個月 (根據 ICH Q5C)。
標準長期條件 (亦稱為「標準長期儲存條件」或「建議儲存條件」) 可包括儲存至少 6 個月、至少 12 個月、至少 18 個月、至少 24 個月、至少 36 個月或至少 60 個月。
因此，可在此類「標準長期條件」下測試及/或確認藥品 (例如本文定義之蛋白質調配物) 的穩定性。
據了解，在實踐中，商業產品之批准需要至少 18 個月之儲存期限 (亦即穩定性)。因此，本文使用之標準長期條件 (亦稱為「標準長期儲存條件」或「建議的儲存條件」) 較佳包括儲存至少 18 個月。然而，出於實際目的，至少 6 個月之長期穩定性研究可為足夠的，因為資料可外推至更長儲存時間。
應理解，術語「至少 X 個月」可指特定時段，亦即「X 個月」。例如，術語「(儲存) 至少 6 個月」可指「(儲存) 6 個月」，等等。
應使用適當分析方法定期評估關鍵品質屬性。
如上文所述，設想本發明方法之步驟 (i) 降低包含蛋白質之組成物中的水解活性。
因此，本發明在一個態樣中係關於一種製備如本文所述之蛋白質調配物的方法，其中與未經受步驟 (i) 之方法的蛋白質調配物相比，該蛋白質調配物具有增加之穩定性、增加之儲存期限或穩定更長時間。
本發明進一步關於一種製備如本文所述之蛋白質調配物的方法，其中蛋白質調配物可在 4℃ 下儲存至多 18 個月、至多 24 個月、至多 36 個月或至多 60 個月，特別是其中調配物 (更) 穩定，特別是 (更) 儲存穩定。
例如，在穩定性測試期間，較佳在本文所述之標準長期條件下，例如在 2-8℃ 下，較佳在約 5℃ 下，調配物不顯示顯著可見粒子形成持續至少 2 個月，更佳至少 3 個月、至少 6 個月、至少 12 個月、至少 18 個月、至少 24 個月、至少 36 個月或至少 60 個月。
基本上無可見粒子形成係指在 1 mL 調配物中形成 ＜20 個可見粒子。較佳地，在指定用於調配物儲存之條件下的穩定性測試期間，每 1 mL調配物形成 15 個或更少粒子，更佳 10 個或更少，更佳 5 個或更少，最佳少於 1 個粒子。
如上所述，本文所用之術語「可見粒子」表示直徑為 50 μm 或更大，較佳 100 μm 或更大，更佳 500 μm 或更大，最佳 1 mm 或更大的粒子。粒子可藉由肉眼觀測，視情況使用放大裝置或藉由自動化過程，諸如膠片相機及適用於分析膠片材料之裝置，如前所述。
如上所述，設想製備之蛋白質調配物中的水解活性降低。因此，在製備之蛋白質調配物中，脂肪酸酯之降解亦可減少。
因此，本發明係關於一種製備如本文所述之蛋白質調配物的方法，其中脂肪酸酯之降解在較佳 24 個月內小於 20%、小於 15%、小於 10%、小於 9%、小於 8%、小於 7%、小於 6%、小於 5%、小於 4%、小於 3%、小於 2% 或小於 1%，例如與初始調配物 (儲存開始之前的調配物) 相比。此可在穩定性測試期間 (較佳在如本文所述之標準長期條件下) 確定。
較佳地，脂肪酸酯之降解在24個月內小於 10%，例如與初始調配物 (儲存開始之前的調配物) 相比。此可在穩定性測試期間 (較佳在如本文所述之標準長期條件下) 確定。
如上所述，包含蛋白質之組成物中的蛋白質較佳為抗體。因此，本文亦設想本發明之蛋白質調配物中的蛋白質為抗體。調配物中抗體之濃度可低於 1 mg/ml 或高於 250 mg/ml。通常，抗體之濃度將介於 1 mg/ml 與 250 mg/ml 之間。
因此，本發明係關於一種製備蛋白質調配物之方法，其中蛋白質為抗體，且其中抗體濃度為至少 1 mg/ml 且至多 250 mg/ml，較佳至少 5 mg/ml 且至多200 mg/ml。
例如，抗體濃度可為 5 mg/ml、10 mg/ml、20 mg/ml、30 mg/ml、40 mg/ml、50 mg/ml、60 mg/ml、70 mg/ml、80 mg/ml、90 mg/ml、100 mg/ml、110 mg/ml、120 mg/ml、130 mg/ml、140 mg/ml、150 mg/ml、160 mg/ml、170 mg/ml、180 mg/ml、190 mg/ml 或 200 mg/ml。
盡管技術人員清楚，但應注意，除了界面活性劑之外，亦可向包含蛋白質之組成物中添加額外物質。此類物質可為緩衝劑、賦形劑、稀釋劑、穩定劑、載劑及其組合。
因此，本發明係關於一種製備如本文所述之蛋白質調配物的方法，其進一步包含向包含蛋白質之組成物中添加緩衝劑、賦形劑、稀釋劑、穩定劑及/或載劑。
適合之緩衝劑、賦形劑、稀釋劑、穩定劑及載劑之實例為此項技術中熟知的。適合之緩衝劑、賦形劑、稀釋劑、穩定劑及載劑可包括任何材料，只要蛋白質調配物中之蛋白質在與該等緩衝劑、賦形劑、稀釋劑、穩定劑及載劑接觸時保持其生物活性即可。
緩衝劑之非限制性實例提供於上文中。其他物質之非限制性實例為海藻糖、蔗糖、山梨糖醇、氯化鈉、氯化鉀及氯化鈣、 對羥基苯甲酸甲酯、 對羥基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚、氯甲酚、人類血清白蛋白、卵磷脂、葡聚糖、環氧乙烷-環氧丙烷共聚物、羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚乙二醇、 N-乙醯半胱胺酸、 N-乙醯高半胱胺酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨糖醇、巰基乙酸及其鹽、硫代硫酸鈉、麩胱甘肽、異抗壞血酸、二丁基羥基甲苯、丁基羥基苯甲醚、生育酚、生育酚乙酸酯、L-抗壞血酸及其鹽、L-抗壞血酸棕櫚酸酯、L-抗壞血酸硬脂酸酯、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、沒食子酸三戊酯及沒食子酸丙酯、乙二胺四乙酸二鈉 (EDTA)、焦磷酸鈉及偏磷酸鈉。
顯而易見的是，製備之蛋白質調配物可為醫藥組成物 (或換言之，醫藥調配物)。
因此，本發明係關於一種製備如本文所述之蛋白質調配物的方法，其中蛋白質調配物為醫藥組成物。
如本文所述之醫藥組成物的投予可藉由不同方式實現，例如藉由非經腸、皮下、靜脈內、動脈內、腹膜內、局部、支氣管內、肺內及鼻內投予，以及若需要局部治療，病灶內投予。如本文所述之醫藥組成物亦可直接投予至目標位點，例如藉由基因槍遞送至外部或內部目標位點，如特定受影響器官。
本文亦設想蛋白質調配物可為診斷組成物，例如用於活體內或活體外/離體診斷方法。
本發明之一個優點為水解酶抑制劑固定於固體載體上且不會汙染包含蛋白質之組成物及由其衍生之蛋白質調配物。
因此，本發明係關於一種包含蛋白質之組成物及/或蛋白質調配物，其中包含蛋白質之組成物及/或蛋白質調配物基本上不含水解酶抑制劑 (例如在包含蛋白質之組成物及/或蛋白質調配物中不存在水解酶抑制劑 (或其存在不可偵測)，或水解酶抑制劑僅以微量存在)。
本發明進一步關於一種包含藉由本文所述之方法獲得或可獲得之蛋白質的組成物。
因此，本發明亦關於一種藉由如本文所述之製備蛋白質調配物之方法獲得或可獲得的蛋白質調配物。
本文中亦設想將本發明之蛋白質調配物用作藥劑。換言之，設想將本發明之蛋白質調配物用作藥劑或用於藥物中。
因此，本發明進一步關於一種藉由如本文所述之製備蛋白質調配物之方法獲得或可獲得的蛋白質調配物，其中該蛋白質調配物用作藥劑。因此，本發明進一步關於一種藉由如本文所述之製備蛋白質調配物的方法獲得或可獲得的蛋白質調配物，其中該蛋白質調配物用於藥物中。此外，本發明進一步關於一種藉由如本文所述之製備蛋白質調配物的方法獲得或可獲得的蛋白質調配物，其中該蛋白質調配物用於治療疾病。本發明亦關於一種藉由如本文所述之製備蛋白質調配物之方法獲得或可獲得的蛋白質調配物，其中該蛋白質調配物用於製備治療疾病之藥劑或用於製備診斷組成物。
此外，本發明係關於一種治療疾病之方法，其包含向有需要之個體投予藉由如本文所述之製備蛋白質調配物之方法獲得或可獲得的蛋白質調配物。
顯而易見的是，固定於固體載體上之水解酶抑制劑可用於製備包含蛋白質之組成物及/或蛋白質調配物。
因此，在一態樣中，本發明係關於固定於固體載體上之水解酶抑制劑用於製備包含蛋白質之組成物的用途。因此，在一態樣中，本發明亦關於固定於固體載體上之水解酶抑制劑用於製備蛋白質調配物的用途。在一態樣中，本發明亦關於固定於固體載體上之水解酶抑制劑用於製備蛋白質組成物及/或蛋白質調配物的用途。在一態樣中，本發明亦關於固定於固體載體上之水解酶抑制劑用於移除或降低蛋白質組成物及/或蛋白質調配物中之水解活性的用途。在一態樣中，本發明亦關於固定於固體載體上之水解酶抑制劑用於移除或降低蛋白質組成物及/或蛋白質調配物中之雜質，特別是宿主細胞蛋白質，且較佳 (一種或多種) 水解酶 (之含量) 的用途。在一態樣中，本發明亦關於固定於固體載體上之水解酶抑制劑用於抑制或減少蛋白質組成物及/或蛋白質調配物中可見及/或顯微鏡下可見的粒子 (之形成) 及/或界面活性劑降解劑之出現/存在的用途。
如本文所用，術語「包含」、「包括」、「具有」或其文法變體將被視為指定所述特徵、整數、步驟或組分，但不排除添加一個或多個額外特徵、整數、步驟、組分或其群組。術語「包含」/「包括」/「具有」涵蓋術語「由……組成」及「基本上由……組成」。因此，無論何時在本文中使用術語「包含」/「包括」/「具有」，其均可由「基本上由……組成」或較佳由「由……組成」替代。
術語「包含」/「包括」/「具有」意謂可存在任何其他組分 (或同樣地，特徵、整數、步驟及其類似者)。
術語「由……組成」意謂不可存在其他組分 (或同樣地，特徵、整數、步驟及其類似者)。
當在本文中使用時，術語「基本上由……組成」或其文法變體將被視為指定所述特徵、整數、步驟或組分，但不排除添加一個或多個額外特徵、整數、步驟、組分或其群組，但前提為額外特徵、整數、步驟、組分或其群組不會實質上改變所主張之產品、組成物、裝置或方法及其類似者的基本及新穎特徵。
因此，術語「基本上由……組成」意謂可存在特定的其他組分 (或類似地，特徵、整數、步驟及其類似者)，亦即不會實質上影響產品、組成物、裝置或方法之基本特性之彼等。換言之，術語「基本上由……組成」 (在本文中可與術語「基本上包含」互換使用)，允許在產品、組成物、裝置或方法中存在除強制性組分以外的其他組分 (或同樣地，特徵、整數、步驟及其類似者)，其前提為產品、組成物、裝置或方法之基本特徵不受其他組分之存在的實質性影響。
如本文所用，術語「約」係指 ± 10%。
如本文所用，「一 (a、an)」可意謂一或多。
本發明藉由所附非限制性圖式及實例進行說明。
實例說明本發明。
實例 1 ：使用固定於 Streptavidin Mag Sepharose 珠粒上之奧利司他 B 降低水解活性且自摻加 rec.LPLA2 之托珠單抗溶液 (5 mg/mL) 中移除 LPLA2
以下實驗證明使用固定於 Streptavidin Magnetic Sepharose 珠粒上之奧利司他 B (式 (2) 或化合物 (B)) (參見 圖 1B) 自托珠單抗溶液中移除重組溶體磷脂酶 A2 (LPLA2)。
藉由兩步程序製備官能化珠粒，該程序包含根據點擊化學將奧利司他 B (ASM Research Chemicals GmbH) 與偶氮生物素-疊氮基 (偶氮生物素-PEG3-疊氮化物) (Sigma-Aldrich；訂單號：900891；CAS 1339202-33-3) 結合，及後續偶聯步驟，其使用Streptavidin Mag Sepharose 珠粒 (GE Healthcare)，利用連接之生物素基團對鏈黴親和素之高親和力。
點擊反應 (樣品/對照) 係藉由根據 表 1中所示之次序在反應管中混合試劑來進行
試劑 體積 [µl] 組成物
1x PBS 410 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na 2HPO 4、1.8 mM KH 2PO 4，pH 7.4
奧利司他 B (樣品) 或 DMSO (對照) 100 含 2 mM 奧利司他 B 之 DMSO (樣品) 或 DMSO (對照)
偶氮生物素-疊氮化物 30 含 5 mM 偶氮生物素-疊氮化物之 DMSO (連接子)
TCEP 40 含 50 mM TCEP 之 PWA
TBTA 120 含 1.7 mM TBTA 之 4:1 三級丁醇/DMSO
CuSO 4 40 含 50 mM CuSO 4之 PWA
表 1：實例1之銅催化之點擊反應組成物。
兩種反應混合物 (包含奧利司他或僅包含 DMSO 之對照珠粒) 在室溫下在滾筒混合器上培育 2 小時，且使用真空離心機 (45℃，2 小時) 蒸發溶劑。將沉澱物溶解於 200 µL DMSO 中，且儲存於 4℃ 下直至進一步使用。
為了在 Streptavidin Mag Sepharose Beads 上結合，將 1 mL 10% 培養基漿液用 1 mL 1x PBS (137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na 2HPO 4、1.8 mM KH 2PO 4，pH 7.4) 洗滌 3 次。洗滌後，將 1 mL 10% 培養基漿液與 100 µL 如上所述之點擊反應產物 (樣品/對照，各一式兩份) 混合，且在滾筒混合器上培育 1 小時。用 1 mL 1x PBS 將結合珠粒洗滌五次，且儲存於 4℃ 下直至進一步使用。
向托珠單抗 摻加 rec.LPLA2 以獲得 5 mg/mL 之最終抗體濃度及 50 ppm (250 ng/mL) 之 LPLA2 濃度 ( 表 2)：
V ( 托珠單抗， c=180 mg/mL) [µl] V (rec.LPLA2, c=10 µg/mL) [µl] V (1 x PBS) [µl] 總體積 [µl]
138.9 125 4736.1 5000
表 2 ：將 50 ppm LPLA2 摻加於 5 mg/ml 托珠單抗溶液中。
根據釣魚反應，將 500 µL 摻加 LPLA2 之 托珠單抗 與 200 µL 結合珠粒 (樣品/對照) 在 37℃ 下在 Eppendorf ThermoMixer® 中以 900 rpm 培育 4 小時。培育後，藉由脂酶活性檢定 (參見以下「脂酶活性檢定」部分)評估上清液 (樣品/對照)，且處理結合珠粒 (樣品/對照) 以進行珠粒上消化及 LC-MS/MS 分析 (參見以下「珠粒上消化及 LC-MS/MS」部分)。
脂酶活性檢定
本段描述在實例 1、2、3 及 4 中進行之脂酶活性檢定。脂酶活性檢定藉由監測非螢光受質 (4-MUCA，Chem Impex Int'l Inc) 經由受質酯鍵截切轉化為螢光產物 (4-MU，Sigma-Aldrich) 來量測脂酶活性。分析反應混合物含有 80 µL 反應緩衝劑 (150 mM Tris-HCl pH 8.0、0.25% (w/v) Triton X-100 及 0.125% (w/v) 阿拉伯膠)、10 µL 4-MUCA 受質 (1 mM 於 DMSO 中)及 10 µL 蛋白質樣品。表 3 列出了對應實例中使用之樣品濃度及對應緩衝劑。
實例 待評估之蛋白質 評估之水解活性 緩衝劑 評估之樣品濃度 1 所報導活性 / 2 標準化為
1 LPLA2 摻加之脂酶 1xPBS，pH 7.4 50 ng/ml 5 ng/ml 1
2 LPLA2 摻加之脂酶 1xPBS，pH 7.4 50 ng/ml 5 ng/ml 1
3 格菲妥單抗    內源性 50 mM Tris 乙酸鹽，pH 7.0 6.2-7.4 mg/ml** 100 µg 2
4 曲妥珠單抗 內源性 150 mM Tris，pH 8.0* 20 g/l 100 µg 2
表 3：在脂酶活性檢定中使用之抗體溶液之樣品濃度及對應緩衝劑的概述。
*藉由使用 Amicon Ultra-0.5 ml 離心過濾裝置 (10,000 Da 截止值，Merck Millipore) 將經曲妥珠單抗處理之蛋白質 A 洗提池重新緩衝至 150 mM Tris-HCl pH 8.0。
**在將蛋白質溶液與珠粒一起培育後，再次量測各樣品之樣品濃度。此使用 Thermo Scientific™ NanoDrop™ One Microvolume UV-Vis 分光光度計一式兩份地進行。
各反應在 96 孔半面積聚苯乙烯盤 (黑色帶蓋及透明平底，Corning Incorporated) 中以技術一式三份建立，且藉由將反應盤在 Infinite 200Pro 盤讀取器 (Tecan Life Sciences) 中在 37℃ 下培育兩小時而每 10 分鐘監測螢光信號 (355 nm 激發，460 nm 發射) 的增加。MU 生產率由螢光時間過程 (0.5 小時 - 2 小時) 之斜率得出，且表示反應之原始速率(k 原始 [RFU/h])。
另外建立酶空白反應以量測由緩衝基質引起的受質之任何非酶截切。10 µL 蛋白質樣品由反應混合物中之 10 µL 樣品緩衝劑 ( 表 3) 替代。自截切速率 (k 自截切 [RFU/h]) 由螢光時間過程 (0.5 小時 - 2 小時) 之斜率得出。為了將螢光信號 (RFU) 轉換為 μM MU，向每個盤一式三份地添加標準 MU。10 µL MU (100 µM 於 DMSO 中) 補充有 10 µL 樣品緩衝劑 ( 表 3)及 80 µL 反應緩衝劑。藉由對螢光信號 (0.5 小時 - 2 小時) 取平均值且將其除以孔中存在之 MU 的最終濃度來計算轉換因子 a [RFU/µM]。
如下地確定以 [μM MU/h] 給出的樣品之脂酶活性：藉由自樣品之反應速率 (k 原始 [RFU/h]) 減去酶空白之反應速率 (k 自截切 [RFU/h])])，且藉由將該項除以轉換因子 a [RFU/µM] 將螢光信號轉換為 µM MU/h。活性係針對每孔應用之脂酶濃度報導 ( 表 3之第 1 及 2 列)，或標準化為 100 µg 抗體 ( 表 3之第 3 及 4 列) (另參見 圖 2A之說明)。
珠粒上消化及 LC-MS/MS
對於珠粒上消化，結合珠粒 (樣品，對照) 連續用 1 mL 1x PBS (137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na 2HPO 4、1.8 mM KH 2PO 4) 洗滌三次，用 1 mL 1% (w/v) SDS 洗滌三次，用 1 mL 變性緩衝劑 (400 mM Tris/HCl、8 M GdmCl，pH 8.5) 洗滌三次且用 1 mL 1x PBS (137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na 2HPO 4、1.8 mM KH 2PO 4) 洗滌五次。棄去上清液，且將珠粒在 50℃ 下 在以 900 rpm 之 Eppendorf ThermoMixer® 中在 300 µL 變性緩衝劑 (400 mM Tris/HCl，8 M GdmCl，pH 8.5) 及 10 µL DTT 溶液 (0.1 g DTT/mL 於 PWA 中) 中培育 60 分鐘。培育後，添加 10 µL 碘乙酸溶液 (0.33 g/mL 於 PWA 中) 且在室溫下在暗處培育 30 分鐘。用 1 mL 消化緩衝劑 (0.1 M Tris/HCl，pH 7.0) 洗滌珠粒且移除上清液。在添加 250 µL 消化緩衝劑 (0.1 M Tris/HCl，pH 7.0) 及 5 µL 0.25 mg/mL 胰蛋白酶溶液 (25 µg 凍乾胰蛋白酶於 100 µl 10 mM HCl 中) 之後，在 50℃ 下在以 900 rpm 之 Eppendorf ThermoMixer® 中進行珠粒上消化 18 小時。將上清液轉移至新反應管中，且藉由添加 25 µL 甲酸溶液 (10% 於 PWA 中) 滅活胰蛋白酶，且將樣品儲存於 4℃ 下直至分析。
使用 Thermo Fisher Scientific Vanquish-H UHPLC 系統，在 60℃ 下在 CSH130 C18 (1.7 μm，2.1 mm × 150 mm) 管柱 (Waters) 上分離肽。100 µL 樣品以 300 µL/min 之流動速率注入。流動相 A 由含 0.1% 甲酸之水組成，且流動相 B 由含 0.1% 甲酸之乙腈組成。65 分鐘梯度開始於 45 分鐘內 0% 至 40% B 之線性增加，接著在 95% B 下進行 5 分鐘管柱洗滌，且在 1% B 下進行 10 分鐘管柱再平衡。此外，在各樣品之前實施溶離液 A 運行 (65 分鐘梯度)且在各樣品之後實施用 10% 甲醇進行之 30 分鐘洗滌梯度，以防止遺留及結果失真。UHPLC 系統與配備 DuoSpray 離子源之 TripleTOF 6600 質譜儀 (Sciex) 聯用。使用具有以下設定之資料相關採集 (DDA) 進行串聯質譜分析：在 200-2000 m/ z之質量範圍內，自每次 MS 調查掃描 (250 ms) 中選擇前 20 個最豐富的離子。MS/MS 掃描 (69 ms) 係在 100–1600 m/ z(高靈敏度模式) 之質量範圍內採集的，包括 +2 至 +5 之電荷態。對於 MS/MS 選擇，動態排除設定為 6 秒時段，且前驅體離子臨限值設定為每秒 150 個計數。
使用 ProteinPilot 軟體 (Sciex，版本 5.0) 在定制的 CHO 資料庫中搜尋 MS/MS 資料，該資料庫具有 35,862 個蛋白質序列，含有來自 Uniprot.org 的所有 CHO 蛋白 (包括 Swiss-Prot 及 TrEMBL 注釋)、藥品序列及人類角蛋白雜質。將陽性蛋白質鑒定之接受準則設定為 ＜1% 的錯誤發現率，至少有兩個獨特肽，信賴區間為 95%。
結論
相比於不含奧利司他 B 之各別對照 (與 Streptavidin Mag Sepharose 珠粒結合之偶氮-生物素-疊氮化物)，將 5 g/l 摻加 50 ppm rec.LPLA2 之托珠單抗溶液與固定奧利司他 B 一起培育顯著降低上清液中之水解活性，如由脂酶活性檢定所示 ( 圖 2A)。與此等結果一致，rec.LPLA2 可藉由珠粒上消化及 LC-MS/MS 分析僅對奧利司他 B 官能化珠粒進行鑒定，但不可用於對照珠粒，表明奧利司他 B 在 LPLA2 上之共價結合，且因此將其自抗體溶液中移除 ( 圖 2B)。
實例 2 ：使用固定於 Streptavidin Mag Sepharose 珠粒上之奧利司他 B ( 式 (2) 或化合物 B)) 降低摻加 rec.LPLA2 之托珠單抗溶液 (100 mg/mL) 的水解活性
此實驗證明，實例 1 中所述之方法亦適用於含有高蛋白質濃度 (亦即 100 mg/mL 托珠單抗) 之抗體溶液，其摻加之 rec.LPLA2 的比率相同 (亦即 50 ppm，5 µg/mL)。
為此目的，如實例 1 中所述地製備官能化珠粒。
向托珠單抗 摻加 rec.LPLA2 以獲得 100 mg/mL 之最終抗體濃度及 50 ppm (5 µg/mL) 之 LPLA2 濃度 ( 表 4)。
V ( 托珠單抗， c=180 mg/mL) [µl] V (rec.LPLA2, c=100 µg/mL) [µl] V (1 x PBS) [µl] 總體積 [µl]
833 75 592 1500
表 4：摻加 50 ppm LPLA2 之100 mg/ml 托珠單抗溶液。
在 37℃ 下在 Eppendorf ThermoMixer® 中將 250 µL 摻加 LPLA2 之 托珠單抗 與 100 µL 結合珠粒 (樣品/對照) 一起以 900 rpm培育 4 小時。培育後，藉由脂酶活性檢定評估上清液 (樣品/對照) (參見實例 1)。
結論：
與實驗 1 之結果一致，相比於不含奧利司他 B 之各別對照 (與 Streptavidin Mag Sepharose 珠粒結合之偶氮-生物素-疊氮化物)，將 100 g/l 摻加 50 ppm rec.LPLA2 之托珠單抗溶液與固定奧利司他 B 一起培育顯著降低上清液中之水解活性，如由脂酶活性檢定所示 ( 圖 3A) 。此效應可歸因於奧利司他 B 之固定，因為對照樣品 (與 Streptavidin Mag Sepharose 珠粒偶聯之偶氮-生物素-疊氮化物) 顯示與摻加 rec.LPLA2 (不包含與 Streptavidin Mag Sepharose 珠粒之培育步驟) 之抗體溶液相當的水解活性。
實例 3 ：使用固定於Streptavidin Sepharose® 高效能珠粒 或 NHS 活化瓊脂糖珠粒上之奧利司他 B 降低格菲妥單抗加工池中之水解活性
此實驗表明，當與固定於 NHS 活化 Sepharose® 4 Fast Flow 珠粒(GE Healthcare) 或 Streptavidin Sepharose® 高效能珠粒 (GE Healthcare) 上之奧利司他 B (式 (2) 或化合物 B) 一起培育時，格菲妥單抗加工池 (亦即 MMAEX 負載溶液) 中之水解活性降低。
製備固定於 NHS 活化 Sepharose® 4 Fast Flow 珠粒上之奧利司他 B)
官能化 Sepharose® 4 Fast Flow 珠粒藉由兩步程序製備，該程序包含將連接子疊氮基-PEG4-胺 (BroadPharm，BP-21615；CAS 951671-92-4) 偶聯於胺反應性 NHS 活化珠粒上，且隨後，奧利司他 B 藉由根據點擊化學將其炔基與珠粒偶聯連接子之疊氮基結合來固定。
為了將連接子疊氮基-PEG4-胺偶聯於 NHS 活化珠粒上，進行以下步驟：將100 µL 疊氮基-PEG4-胺在 1900 µL 偶聯緩衝劑 (0.2 M NaHCO 3、0.5 M NaCl，pH 8.3) 中稀釋，以獲得 2000 µL 總體積。將 600 µL NHS 活化 Sepharose® 4 Fast Flow 珠粒裝入 Poly-Prep 層析管柱 (BioRad) 中，且在即將使用之前用 10 CV 冰冷的 1 mM HCl (於 PWA 中) 溶液洗滌。將 300 µL 製備之疊氮基-PEG4-胺溶液添加至經洗滌珠粒，且在室溫下在滾筒混合器上培育 4 小時。為了阻斷未反應之 NHS 酯及洗滌，將偶聯緩衝劑 (0.2 M NaHCO 3、0.5 M NaCl，pH 8.3)、洗滌緩衝劑 A (0.1 M 乙酸鈉、0.5 M NaCl，pH 4.0)、洗滌緩衝劑 B (0.1 M Tris-Cl，pH 8.0) 及 1x PBS (137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na 2HPO 4，1.8 mM KH 2PO 4，pH 7.4) 以指定次序及體積添加： a)          3x2CV 阻斷緩衝劑 b)          3x2CV 洗滌緩衝劑 A c)          3x2CV 阻斷緩衝劑 d)          在阻斷緩衝劑中靜置 30 分鐘 e)          3x2CV 洗滌緩衝劑 A f)           3x2CV 洗滌緩衝劑 B g)          3x2CV 洗滌緩衝劑 A h)          3x2CV 洗滌緩衝劑 B i)           3x2CV 洗滌緩衝劑 A j)           3x2CV 洗滌緩衝劑 B k)          5x2CV 1xPBS
為了根據點擊化學將奧利司他 B 結合於連接子之珠粒偶聯疊氮基上，進行以下步驟：
將500 µL 如上所述獲得之排空疊氮基官能化珠粒與 500 µL 1x PBS ((137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na 2HPO 4、1.8 mM KH 2PO 4，pH 7.4) 混合且均質化。將 400 µL 所得珠粒漿液填充至新的 Poly-Prep 層析管柱 (BioRad) 中。珠粒床沉降後，棄去上清液。為了結合奧利司他 B (稱為 NHS Sepharose 伴有奧利司他 B) 或生物素-PEG4-炔烴 (稱為 NHS Sepharose 無奧利司他 B) (Sigma-Aldrich)，將以下試劑以指定次序及體積添加至填充之 Poly-Prep 層析管柱 (表 5)：
試劑 體積 [µl] 組成物
1x PBS 150 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na 2HPO 4、1.8 mM KH 2PO 4，pH 7.4
奧利司他 B (樣品) 或生物素-PEG4-炔烴 (對照) 50 含 2 mM 奧利司他 B 之 DMSO (樣品) 或含 2 mM 生物素-PEG4-炔烴之 DMSO (對照)
TCEP 20 含 50 mM TCEP 之 PWA
TBTA 60 含 1.7 mM TBTA 之 4:1 三級丁醇/DMSO
CuSO 4 20 含 50 mM CuSO 4之 PWA
表 5:實例 3 中用於使疊氮基官能化珠粒官能化的銅催化點擊反應組成物
將兩種反應混合物 (樣品/對照) 在室溫下在滾筒混合器上培育 2 小時，且用 10 CV 1xPBS (137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na 2HPO 4、1.8 mM KH 2PO 4，pH 7.4) 洗滌。含有製備樹脂之管柱儲存於 4℃ 下直至進一步使用。
固定於 Streptavidin Sepharose® 高效能珠粒上之奧利司他 B
為了製備經奧利司他 B 官能化之 Streptavidin Sepharose® 高效能珠粒，奧利司他 B 與生物素-PEG4-疊氮化物 (BroadPharm；CAS 1309649-57-7) 之間的點擊反應係藉由根據指定次序及體積 (表 6) 在反應管中混合以下試劑來進行：
試劑 體積 [µl] 組成物
1x PBS 410 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na 2HPO 4、1.8 mM KH 2PO 4，pH 7.4
奧利司他 B (樣品) 或生物素-PEG4-炔烴 (對照) 100 含 2 mM 奧利司他 B 之 DMSO (樣品) 或含 2 mM 生物素-PEG4-炔烴之 DMSO (對照)
生物素-PEG4-疊氮化物 30 5 mM 生物素-PEG4-疊氮化物 (連接子)
TCEP 40 含 50 mM TCEP 之 PWA
TBTA 120 含 1.7 mM TBTA 之 4:1 三級丁醇/DMSO
CuSO 4 40 含 50 mM CuSO 4之 PWA
表 6實例 3 中用於 Streptavidin Sepharose ®高效能珠粒官能化的銅催化點擊反應組成物。
兩種反應混合物均在室溫下在滾筒混合器上培育 2 小時，且使用真空離心機 (45℃，2 小時) 蒸發揮發性溶劑，且儲存於 4℃ 下直至進一步使用。
為了在 Streptavidin Sepharose® 高效能珠粒上結合，將1 mL 培養基漿液用結合緩衝劑 (20 mM NaPO 4、0.15 M NaCl，pH 7.5) 洗滌十次，裝入 Poly-Prep 層析管柱 (BioRad) 且用 5 CV 結合緩衝劑 (20 mM NaPO 4、0.15 M NaCl，pH 7.5) 平衡。將 500 µL 結合緩衝劑 (20 mM NaPO 4，0.15 M NaCl，pH 7.5) 與 200 µL 結合之生物素-奧利司他 (稱為 Seph-SA 伴有奧利司他 B)/生物素-生物素 (稱為 Seph-SA 無奧利司他 B) 混合，且將全部混合物添加至平衡珠粒中。在室溫下在滾動混合器上培育 30 分鐘後，珠粒依次用 10 CV 結合緩衝劑 (20 mM NaPO 4、0.15 M NaCl，pH 7.5) 及 10 CV 1x PBS (137 mM NaCl、2.7 mM KCl、 10 mM Na 2HPO 4、1.8 mM KH 2PO 4，pH 7.4) 洗滌。將結合珠粒 (Seph-SA 伴有奧利司他 B 及 Seph-SA 無奧利司他 B)儲存於 4℃ 下直至進一步使用。
將結合珠粒與抗體格菲妥單抗之 MMAEX 負載溶液一起培育
100 µL 官能化珠粒漿液 (NHS Sepharose 伴有奧利司他 B、NHS Sepharose無奧利司他 B、Seph-SA 伴有奧利司他 B 及 Seph-SA 無奧利司他 B)以及普通珠粒漿液 (NHS 活化瓊脂糖珠粒及 Streptavidin Sepharose® 高效能) 轉移至反應管中，且棄去 50 µL 上清液。添加 450 µL 格菲妥單抗之 MMAEX 負載溶液 (c=7,3 mg/ml)，且將混合物在 25℃ 下在 Eppendorf Thermomixer 中以 850 rpm 培育。將樣品以 1000 rpm 離心 30 秒，且如實例 1 中所述地評估上清液之脂酶活性。
結論：
格菲妥單抗 (MMAEX 負載溶液) 與奧利司他 B 官能化珠粒一起培育使得水解活性顯著降低，如可藉由圖 4 中與各別對照珠粒 (亦即，無奧利司他 B 之結合珠粒及未結合珠粒)及起始蛋白質組成物相比，此等珠粒之平均轉化率降低看出。此等資料表明固定奧利司他 B 能夠自具有相當水準之水解活性之抗體溶液的加工池中移除水解活性酶。此外，固定奧利司他 B 之有益效果可在 NHS 活化 Sepharose® 4 Fast Flow 珠粒 (經由 NHS 及點擊化學偶聯，如上所述) 及 Streptavidin Sepharose® 高效能珠粒 (GE Healthcare) (經由點擊化學偶聯且利用生物素與鏈黴親和素之間的高親和力，如上所述) 中得到證實，因為與各別對照 (亦即，無奧利司他 B 之結合珠粒、未結合珠粒及起始蛋白質組成物) 相比，兩種方法均使得水解活性顯著降低，如由 圖 4中之平均轉換率所示。
實例 4 ：使用固定於Streptavidin Sepharose® 高效能珠粒 或 NHS 活化瓊脂糖珠粒上之奧利司他 A 或奧利司他 B 降低曲妥珠單抗加工池中之水解活性
此實驗表明，藉由使用固定於 NHS 活化 Sepharose® 4 Fast Flow 珠粒或 Streptavidin Sepharose® 高效能珠粒 (GE Healthcare) 珠粒上之奧利司他 A (式 (1) 或化合物 A)) 或奧利司他 B (式 (2) 或化合物 B)，Herceptin® (曲妥珠單抗) 加工池 (亦即蛋白質 A 洗提池) 中之水解活性降低。
如實例 3 中所述，為奧利司他 B 及奧利司他 A (藉由用奧利司他 A 取代奧利司他 B) 製備官能化珠粒 (NHS 活化 Sepharose® 4 Fast Flow 及 Streptavidin Sepharose® 高效能珠粒 (GE Healthcare))。
將 100 µL 奧利司他 A/B 官能化珠粒/相應的對照珠粒 (對於如上所述進行處理之 NHS 活化 Sepharose® 4 Fast Flow 珠粒以及 Streptavidin Sepharose® 高效能珠粒兩者) 轉移至反應管中，且棄去 50 µL 上清液。添加 450 µL Herceptin 蛋白質 A 洗提池 (7 g/l)，且將混合物在 25℃ 下在 Thermomixer 中以 850 rpm 培育。將樣品以 1000 rpm 離心 30 秒，且如實例 1 中所述地藉由脂酶活性檢定評估上清液以及起始蛋白質組成物。
結論：
相比於各別對照及起始蛋白質組成物 (不包含與官能化珠粒之培育步驟)，在與固定於 NHS 活化 Sepharose 4 Fast Flow 珠粒或 Streptavidin Sepharose 高效能珠粒上之奧利司他 A 及奧利司他 B 一起培育之後，Herceptin 之蛋白質 A 洗提池可實現水解活性顯著降低，如 圖 5中之平均轉化率所示，表明固定水解酶抑制劑 (亦即奧利司他 A 及 B) 自已純化之抗體溶液 (亦即曲妥珠單抗加工池) 中移除水解活性酶的能力。
實例 5 ：結合至固體載體之脂酶雙烯醇酯構築體的蛋白質體學評估
此實驗證明雙烯醇酯 (式 (3) 或化合物 C) 共價偶聯於疊氮化物改質磁性粒子上 (經由點擊反應化學)，以共價且選擇性地結合脂酶 (模型脂酶：CalB2) 且自抗體溶液中移除各別脂酶。將官能化珠粒結合脂酶之能力與作為對照之非官能化珠粒進行比較。
測試樣品：將作為基於 LC-MS 之蛋白質體學工作流程之對照蛋白質的 Herceptin (mAb；0.2 µg/µl 於磷酸鈉緩衝劑中) 與脂酶 CalB2 (CalB2；0.2 µg/µl 於磷酸鈉緩衝劑中) 以約1:1 (mol/mol) 比率) 混合作為靶標。上述樣品用共價偶聯至 60 µg 疊氮化物改質磁性粒子 (製備 60 µl 1 µg/µl 水溶液) (基於聚苯乙烯之疊氮基珠粒；CLK-1036-1，Jena-Bioscience) 之化合物 C (雙烯醇酯) 處理，化合物 C 藉由點擊反應及純化製備 (參見方案實驗實例 1 及針對 Jena-Bioscience 點擊方案描述之一般程序)。作為對照，非官能化疊氮化物改質珠粒 (基於聚苯乙烯之疊氮基珠粒；CLK-1036-1，Jena-Bioscience) 以與化合物 C 偶聯珠粒相同的方式處理，不同之處在於偶聯步驟僅用化合物 C 之溶劑進行。
CalB2 及 mAb 混合物之培育係藉由將 60 µg (60 µl 之 1 µg/µl 溶液) 各別官能化或非官能化珠粒與 50 µl CalB2 (0.2 µg/µl) 及 50 µl mAb (0.2 µg/µl) 混合來完成。樣品在 40℃ 下以 1000 rpm 渦旋隔夜。
培育後，官能化珠粒以及非官能化珠粒已根據以下方案使用磁性分離及低結合棄置品進行洗滌： 第 1 洗滌：60 µg 珠粒用 200 µl PBS 緩衝劑洗滌兩次，接著進行乾燥步驟 第 2 洗滌：用含有 Triton-X100 之 PBS 緩衝劑 (10 µl Triton-X100 與 9990 µl 稀釋 PBS) 將來自第 1 步之乾燥珠粒洗滌 3 次，接著在室溫下風乾 第 3 洗滌：將步驟二之珠粒用 200 µl 水洗滌兩次，接著在室溫下風乾 第 4 洗滌：步驟 3 之珠粒用 200 µl (70% 乙腈/30% 水及 0.1% 甲酸 (v/v/v) 洗滌 第 5 洗滌：步驟 4 之珠粒最終已用 200 µl 水洗滌 對於靶向 LC-MS 分析，洗滌之珠粒用 5 µl IAM 溶液 (55 mM：1 mg/ml 於 98.3 µl MilliQ-Water 中) 進行脲基甲基化且用 5 µl DTT (10 mM 於水中) 溶液還原 30 分鐘。
在上述步驟之後，藉由添加 50 µl 變性緩衝劑/消化緩衝劑 (胰蛋白酶稀釋液 (50 mM AcOH)、10 µl 冰 AcOH 與 3470 µL 稀釋 MilliQ-Water，4℃，接著將 20 µg 胰蛋白酶溶解於原始管中之 40 µl 胰蛋白酶稀釋溶液 (50 mM AcOH) 中) 使各別珠粒上之蛋白質變性。將 5 µl 胰蛋白酶溶液、1 µl Rapid PNGase F 及 1 µl (N / O -) 去醣基化 MIX II 添加至樣品混合物中，接著混合及培育：(在 37℃ 下在 1000 rpm、37℃ 之熱震盪器中 16-20 小時)。珠粒上清液分離係藉由短暫離心繼之以磁性分離來完成。
藉由將 2 µl FA-Solution 添加至樣品消化液中，接著進行培育步驟 (在 37℃ 下在 800 rpm 之熱震盪器中 1.5-2 小時 (用於水解 PPS)) 來停止消化。將消化樣品儲存於 -80℃ (原始樣品) 下直至分析。
使用水/乙腈梯度及作為緩衝劑之 TFA (0.05% v(v) 進行靶向 LC-MS 分析。分離管柱為 PepSwift Monolithic Capillary Column，200 μm × 5 cm，P/N：161409.使用 Thermo LTQ FT 系統作為質譜儀。定量分析之進一步實驗設計遵循一般實驗靶向 LC-MS 程序。藉由在分析管柱上注射 1 µl 消化樣品，將與珠粒結合之蛋白質施用於 LC-MS 系統。
以下肽及各別質量已用於評估由靶向質譜讀數 (標準化水準 ((NL) 之峰強度) 得出的絕對峰強度： 肽 CalB2 脂酶 1：LMAFAPDYK，電荷 z=2；質量/電荷：528.27Da 肽 CalB2 脂酶 2：PFAVGK，電荷 z=2；質量/電荷：309.68Da 肽 mAb：FNWYVDGVEVHNAK，電荷 z=3；質量/電荷：559.94Da mAb 肽及脂酶肽之各別靶向 LC-MS 信號與其各別信號強度一起使用以生成 圖 6。
質譜術結果之分析顯示，在消化後可在強信號計數下找到兩種針對脂酶 CalB2 之選擇性肽。
因此，該實驗清楚地表明，即使經受大量洗滌步驟，模型脂酶 CalB2 亦與經雙烯醇酯官能化之珠粒結合 ( 圖 6)。此交互作用顯然為特異性的，因為在非官能化對照珠粒上未偵測到脂酶。
mAb 極易沉澱且以非共價方式吸附至珠粒上。在官能化珠粒及對照珠粒上偵測到 mAb 肽，驗證了用於官能化珠粒及對照珠粒的基於官能性 LC-MS 之蛋白質體學工作流程。
本文引用之所有參考文獻均以全文引用的方式併入。現已充分描述了本發明，熟習此項技術者將理解，本發明可在條件、參數及其類似者之廣泛且等效的範圍內實施，而不影響本發明或其任何實施例之精神或範疇。
圖 1 ：用於固定之水解酶抑制劑的化學結構A) 如實例 4 中所用之炔取代之奧利司他變體 1 「奧利司他 A」 (式 (1) 或類似地，化合物 A) B) 如實例 1-4 中所用之炔取代之奧利司他變體 2「奧利司他 B」。(式 (2) 或類似地，化合物 B) C)如實例 5 中所用之「雙烯醇酯」試劑 (式 (3) 或類似地，化合物 C)。 圖 2 ：使用固定於 Streptavidin Mag Sepharose 珠粒上之奧利司他 B 自 托珠單抗溶液中移除重組 LPLA2 。奧利司他 B：Mag-Sepharose-Streptavidin + 偶氮-生物素-疊氮化物 (偶氮-生物素-PEG3-疊氮化物) + 炔烴-奧利司他 B； 珠粒對照：Mag-Sepharose-Streptavidin + 偶氮-生物素-疊氮化物； 在 5 mg/mL 托珠單抗 + 50 ppm rec.LPLA2 (= 250 ng/mL LPLA2) 中釣魚。 A) 摻加 LPLA2 之托珠單抗上清液在與結合珠粒培育之後的脂酶活性檢定。給出之活性等效於 5 ng/mL LPLA2。 B) 來自珠粒上消化樣品之 LPLA2 LC MS/MS 分析的光譜計數。 圖 3 ：在 100 mg/mL 托珠單抗 + 50 ppm rec.LPLA2 (=5 µg/mL LPLA2) 中用結合珠粒釣魚之後，托珠單抗溶液之脂酶活性檢定。給出之活性等效於 5 ng/mL LPLA2。 奧利司他 B：Mag-Sepharose-Streptavidin + 偶氮-生物素-疊氮化物 + 炔烴-奧利司他 B； 連接子對照：Mag-Sepharose-Streptavidin + 偶氮-生物素-疊氮化物； mAb + LPLA2：100 g/l 托珠單抗 + 50 ppm rec.LPLA2 (=5 µg/mL LPLA2)； mAb：100 g/L 托珠單抗。 圖 4 ：格菲妥單抗 MMAEX 負載溶液之脂酶活性檢定給定的活性標準化為 100 µg 蛋白質。各條柱代表一個技術釣魚複本。用於在格菲妥單抗 MMAEX 負載溶液中進行釣魚實驗之珠粒組成物如下： NHS 活化 Sepharose 「NHS 伴有奧利司他 B」：NHS 活化 Sepharose 珠粒 + 疊氮基-PEG4-胺 + 炔烴-奧利司他 B； 「NHS 無奧利司他 B」：NHS 活化 Sepharose 珠粒 + 疊氮基-PEG4-胺 + 生物素-PEG4-炔烴； 「NHS」：NHS 活化 Sepharose 珠粒 Steptavidin Sepharose 珠粒 「Seph-SA 伴有奧利司他 B」：Steptavidin Sepharose® 高效能微粒 + 生物素-PEG4-疊氮化物 + 炔烴-奧利司他 B； 「Seph-SA 無奧利司他 B」：Steptavidin Sepharose® 高效能珠粒 + 生物素-PEG4-疊氮化物 + 生物素-PEG4-炔烴； 「Seph-SA」：Steptavidin Sepharose® 高效能珠粒 「格菲妥單抗 ctrl.」係指起始蛋白質組成物的活性 可用的珠粒材料剛好足以對「NHS」、「SA 伴有奧利司他 B」及「SA」進行重複釣魚實驗，因此缺少三次重複量測。 圖 5 ：曲妥珠單抗經處理之蛋白質 A 洗提池樣品之脂酶活性檢定。僅負載，無任何珠粒。給定的活性標準化為 100 µg 蛋白質。用於在曲妥珠單抗經處理之蛋白質 A 洗提池中進行實驗之珠粒組成物如下： Seph-NHS 伴有奧利司他 A：NHS 活化 Sepharose 珠粒 + 疊氮基-PEG4-胺 + 炔烴-奧利司他 A； Seph-NHS 伴有奧利司他 B：NHS 活化 Sepharose 珠粒 + 疊氮基-PEG4-胺 + 炔烴-奧利司他 B； Seph-NHS 無奧利司他：NHS 活化 Sepharose 珠粒 + 疊氮基-PEG4-胺 + 生物素-PEG4-炔烴； Seph-SA 伴有奧利司他 A：Streptavidin Sepharose® 高效能珠粒 + 生物素-PEG4-疊氮化物 + 炔烴-奧利司他 A； Seph-SA 伴有奧利司他 B：Steptavidin Sepharose® 高效能微粒 + 生物素-PEG4-疊氮化物 + 炔烴-奧利司他 B； Seph-SA 無奧利司他：Steptavidin Sepharose® 高效能珠粒 + 生物素-PEG4-疊氮化物 + 生物素-PEG4-炔烴； 曲妥珠單抗 ctrl. 係指起始蛋白質組成物的活性。 圖 6 ： 結合於雙烯醇酯官能化珠粒上之脂酶 CalB2 的肽峰強度。給出了基於 LC-MS 之峰強度 (右側) 標準化水準讀數，其針對官能化珠粒上之共價結合脂酶 CalB2 (基於兩種肽 (肽 CalB2 脂酶 1：LMAFAPDYK 及 CalB2 脂酶 2：PFAVGK)，在由雙烯醇酯部分 (化合物 C (或同樣地，式 (3))，在與珠粒表面暴露之炔基進行點擊反應之後) 支持之洗滌步驟之後。非共價吸附之 mAb (肽 Mab：FNWYVDGVEVHNAK) 作為 mAb 吸附、消化及 LC-MS 實驗之對照肽 (右側及左側)。 圖 6 左側示出使用與圖 6 右側所示之官能化珠粒相同的樣品處理步驟之非官能化珠粒。非官能化珠粒缺少雙烯醇酯部分，且因此其表面上僅具有殘留的炔烴部分。非共價吸附之 mAb 肽在整個工作流程中提供信賴區間。脂酶肽缺失表明洗滌方案能夠移除非共價結合的脂酶。 圖 7 ：製備包含蛋白質之組成物的示意性過程。圖 7 示出用於製備包含根據本發明之蛋白質 (所關注蛋白質) 之組成物的例示性過程或方法。 典型過程或方法包含 (習知) 製備及/或純化所關注蛋白質之至少 4 個後續步驟，亦即自細胞培養物中製備蛋白質組成物，接著通常為 (至少) 3 個 ((習知) 層析步驟，視情況 4 個 (習知) 層析步驟。 因此：在自細胞培養物或培養物上清液製備蛋白質組成物 ( 步驟 1) 之後，過程通常包括 3 個後續 (習知) 層析步驟，例如通常使用 3 個管柱 (視情況 4 個管柱)，各管柱採用不同純化原理 ( 步驟 2-4，或者若包括視情況選用之 步驟 5(管柱 4)，則為 步驟 2-5)。 首先，製備來自細胞培養物 (產生蛋白質/所關注蛋白質之細胞) 之組成物，例如藉由均質化細胞。該組成物亦可為細胞培養上清液。較佳地，隨後將上述組成物純化，例如該組成物接著為 (如) (例如藉由過濾) 與細胞、細胞碎片及/或聚集體分離的組成物。因此，(隨後純化之) 組成物為 (如) (藉由過濾) 與細胞、細胞碎片及/或聚集體分離之組成物，例如為 收集細胞培養液 (HCCF)。 其次，進一步純化上述組成物，例如藉由進一步的蛋白質製備及/或純化步驟 ( 步驟 2)。進一步的蛋白質製備及/或純化步驟較佳為親和層析 (較佳蛋白質 A 親和層析)。因此，親和層析 (較佳蛋白質 A 親和層析) 較佳為第一層析步驟。例如，使上述組成物 (例如收集細胞培養液 (HCCF)) 經受蛋白質 A 親和層析。換言之，該過程包括使用親和層析管柱 ( 蛋白質 A 親和層析管柱)。 第三，接著使溶離液經受第二管柱 ( 管柱 2 )/ 步驟 3)。 第四，接著使第二管柱之溶離液經受第三管柱 ( 管柱 3/ 步驟 4)。 第五，若在第四步驟之後 (亦即在三個管柱 (較佳各管柱採用不同純化原理) 之後未達成或欲進一步提高品質 (例如所關注蛋白質之純度)，則可視情況使用 第五步驟(例如使用第四純化原理之第四管柱) ( 管柱 4/ 步驟 5)。技術人員可根據具體情況決定第五步驟是否必要及/或有益，例如在平衡成本及/或增加之複雜性與提高之品質時。 因此， 步驟 3 至 5可為任何次序之離子交換層析 (例如陰離子交換層析 (AEX) 或陽離子交換層析 (CEX))、混合模式層析及疏水交互作用層析 (HIC)。換言之，管柱 2 至 4 可為任何次序之離子交換層析管柱 (例如陰離子交換層析 (AEX) 管柱或陽離子交換層析 (CEX) 管柱)、混合模式層析管柱及疏水交互作用層析 (HIC) 管柱，亦即，該過程包括以任何次序使用任何上述管柱。 在純化過程之開發中，技術人員可確定欲使用之步驟/管柱的次序。 第六，在管柱 3 或視情況選用之管柱 4 (步驟 4 及視情況選用之步驟 5) 之後，使溶離液經受病毒過濾，且接著為 第七，經受超濾/滲濾 (UFDF)。 該過程包括步驟「(i) 使包含蛋白質之起始組成物與水解酶抑制劑 (諸如奧利司他) 接觸，其中水解酶抑制劑固定於固體載體上」 (例如該步驟為水解酶抑制劑層析 (水解酶抑制劑層析步驟)。換言之，該過程包括使用水解酶抑制劑 (例如奧利司他) 管柱。 較佳地，水解酶抑制劑層析/層析步驟在親和層析 (較佳蛋白質 A 親和層析) 步驟/步驟 2 之後。換言之，該過程包括在蛋白質 A 管柱之後 (直接) 使用水解酶抑制劑 (例如奧利司他) 管柱。 替代地，水解酶抑制劑層析/層析步驟在步驟 3 至 5 中之任一者之後 (步驟 3 至 5 可為以任何次序之離子交換層析 (例如陰離子交換層析 (AEX) 或陽離子交換層析 (CEX))、混合模式層析及疏水交互作用層析 (HIC))。換言之，該過程包括在以任何次序使用離子交換層析管柱 (例如陰離子交換層析 (AEX) 管柱或陽離子交換層析 (CEX) 管柱)、混合模式層析管柱及疏水交互作用層析 (HIC) 管柱之後 (直接) 使用水解酶抑制劑 (例如奧利司他) 管柱。 水解酶抑制劑層析/層析步驟通常不 (直接) 在自細胞培養物製備蛋白質組成物之初始步驟之後 (例如不在 HCCF 之後)。換言之，水解酶抑制劑層析/層析步驟通常不在親和層析 (例如蛋白質 A 親和層析)/步驟 2 之前進行。此係因為此類初始蛋白質組成物 (例如來自細胞培養物/細胞培養物上清液，較佳 HCCF 之蛋白質組成物) 通常仍包含高度雜質，例如細胞、細胞碎片及/或聚集體。因此，該過程通常不包括在自細胞培養物製備蛋白質組成物之初始步驟之後 (直接) 使用水解酶抑制劑 (例如奧利司他) 管柱及/或通常不包括在使用親和層析管柱 (例如蛋白質 A 親和層析管柱) 之前使用水解酶抑制劑 (例如奧利司他) 管柱。
Figure 110129136-A0101-11-0003-1

Claims (90)

  1. 一種方法，其包含以下步驟： (i)    使包含蛋白質的起始組成物與水解酶抑制劑接觸，其中該水解酶抑制劑固定在固體載體上； (ii)   將包含該蛋白質之組成物回收。
  2. 如請求項 1 之方法，其中該方法用於製備包含蛋白質之組成物。
  3. 如請求項 1 或 2 之方法，其中包含該蛋白質之該組成物相較於該起始組成物具有降低的水解活性和/或相較於該起始組成物具有減少的水解酶含量，其例如是藉由脂酶活性檢定 (針對聚山梨醇酯的脂酶酵素法 (LEAP) 檢定) 和/或脂肪酸質譜法 (FAMS) 檢定來判定。
  4. 如請求項 1 至 3 中任一項之方法，其中該方法用於降低該起始組成物中的水解活性和/或降低該起始組成物中的水解酶含量。
  5. 如請求項 1 至 4 中任一項之方法，其中該起始組成物進一步包含水解酶和/或具有水解活性。
  6. 如請求項 1 至 5 中任一項之方法，其中該蛋白質組成物是藉由自該起始組成物移除水解酶和/或藉由減少該起始組成物中的水解酶含量來製備。
  7. 如請求項 1 至 6 中任一項之方法，其中該步驟 (i) 進一步包含將該水解酶吸附至該水解酶抑制劑之步驟 (a)。
  8. 如請求項 1 至 7 中任一項之方法，其中包含蛋白質之該組成物是包含蛋白質之溶液。
  9. 如請求項 8 之方法，其中該溶液是水溶液。
  10. 如請求項 8 或 9 之方法，其中該溶液是經緩衝之溶液。
  11. 如請求項 1 至 10 中任一項之方法，其中該(等)水解酶是酯酶和/或醯胺酶。
  12. 如請求項 11 之方法，其中該(等)酯酶是羧酸酯水解酶和/或硫酯酶。
  13. 如請求項 12 之方法，其中該(等)羧酸酯水解酶是脂酶。
  14. 如請求項 1 至 12 中任一項之方法，其中該(等)水解酶選自由以下所組成之群組：脂蛋白脂酶、軟脂醯基蛋白硫酯酶、酸性神經醯胺酶、脂肪酸合成酶的 C 端域、推定類磷脂酶 b 2、溶體酸性脂酶和溶體磷脂酶。
  15. 如請求項 1 至 14 中任一項之方法，其中該經固定之抑制劑選自由奧利司他或雙烯醇酯所組成之群組。
  16. 如請求項 1 至 15 中任一項之方法，其中該固體載體選自由 sepharose、聚苯乙烯和智慧型聚合物所組成之群組。
  17. 如請求項 1 至 16 中任一項之方法，其中該抑制劑經由疊氮基和炔基的反應而固定在固體載體上。
  18. 如請求項 1 至 16 中任一項之方法，其中該抑制劑經由鏈黴親和素基團與生物素基團的結合而固定在固體載體上。
  19. 如請求項 1 至 16 中任一項之方法，其中該抑制劑經由胺基和 N-羥基琥珀醯亞胺基團的反應而固定在固體載體上。
  20. 如請求項 1 至 19 中任一項之方法，其中該抑制劑是可藉由使包含式 (1)、(2)、(3) 或 (4) 或由式 (1)、(2)、(3) 或 (4) 組成的化合物、較佳地使包含式 (1)、(2) 或 (4) 或由式 (1)、(2) 或 (4) 組成的化合物與疊氮化物反應而得到的基團
    Figure 03_image077
    (1)
    Figure 03_image079
    (2)
    Figure 03_image081
    (3)
    Figure 03_image083
    (4)。
  21. 如請求項 1 至 20 中任一項之方法，其中該等步驟是按以下順序進行：步驟 (i)，接以步驟 (ii)。
  22. 如請求項 1 至 21 中任一項之方法，其進一步包含在步驟 (i) 之前和/或之後和/或在步驟 (ii) 之前和/或之後的蛋白質製備和/或純化的步驟。
  23. 如請求項 1 至 22 中任一項之方法，其中步驟 (i) 在親和力層析之後、較佳地在蛋白質 A 親和力層析之後進行。
  24. 如請求項 1 至 23 中任一項之方法，其中該蛋白質為抗體。
  25. 如請求項 24 之方法，其中，該抗體是單株抗體。
  26. 如請求項 24 或 25 之方法，其中該抗體是人抗體或人源化抗體。
  27. 如請求項 1 至 26 中任一項之方法，其中該蛋白質為抗 CD20 抗體、抗 CD40 抗體、抗 HER2 抗體、抗 IL6 抗體、抗 IgE 抗體、抗 IL13 抗體、抗 TIGIT 抗體、抗 PD-L1 抗體、抗 VEGF-A 抗體、抗 VEGF-A/ANG2 抗體、抗 CD79b 抗體、抗 ST2 抗體、抗 D 因子抗體、抗 IX 因子抗體、抗 X 因子抗體、抗 Aβ 抗體、抗 tau 抗體、抗 CEA 抗體，抗 CEA/CD3 抗體、抗 CD20/CD3 抗體、抗 FcRH5/CD3 抗體、抗 Her2/CD3 抗體、抗 FGFR1/KLB 抗體、FAP-4-1 BBL 融合蛋白、FAP-IL2v 融合蛋白、奧克利珠單抗 (ocrelizumab)、帕妥珠單抗 (pertuzumab)、曲妥珠單抗 (trastuzumab)、托珠單抗 (tocilizumab)、法利昔單抗 (faricimab)、帕羅托珠單抗 (polatuzumab)、甘特珠單抗 (gantenerumab)、賽必妥單抗 (cibisatamab)、克雷珠單抗 (crenezumab)、莫蘇妥珠單抗 (mosunetuzumab)、替瑞利尤單抗 (tiragolumab)、貝伐珠單抗 (bevacizumab)、利妥昔單抗 (rituximab)、阿托珠單抗 (atezolizumab)、奧比妥珠單抗 (obinutuzumab)、蘭帕麗珠單抗 (lampalizumab)、來瑞珠單抗 (lebrikizumab)、奧馬珠單抗 (omalizumab)、雷尼單抗 (ranibizumab)、艾美賽珠單抗 (emicizumab)、塞魯單抗 (selicrelumab)、普拉辛珠單抗 (prasinezumab)、格菲妥單抗 (glofitamab)、欣洛奇芙普 (simlukafusp alfa) 和 RG7827。
  28. 一種製備蛋白質調配物之方法，該方法包含如請求項 1 至 27 中任一項之方法的步驟，其中該製備蛋白質調配物之方法進一步包含將界面活性劑、較佳的是脂肪酸酯加入該組成物。
  29. 一種製備蛋白質調配物之方法，其中該製備蛋白質調配物之方法進一步包含將界面活性劑、較佳的是脂肪酸酯加入藉由或可藉由如請求項 1 至 27 中任一項之方法獲得之組成物。
  30. 如請求項 28 或 29 之方法，其中該蛋白質調配物(基本上)不含可見和/或顯微鏡下可見 (subvisible) 的顆粒。
  31. 如請求項 28 至 30 中任一項之方法，其中該蛋白質調配物在建議儲存條件下可穩定至少 6 個月、至少 12 個月、至少 18 個月、至少 24 個月、至少 36 個月或至少 60 個月。
  32. 如請求項 28 至 30 中任一項之方法，其中該脂肪酸酯是聚氧乙烯山梨醇酐或異山梨醇脂肪酸單酯、雙酯或三酯。
  33. 如請求項 28 至 32 中任一項之方法，其中該脂肪酸酯是聚氧乙烯 (20) 山梨醇酐月桂酸酯。
  34. 如請求項 28 至 32 中任一項之方法，其中該脂肪酸酯選自由以下所組成之群組：聚山梨醇酯 20、聚山梨醇酯 40、聚山梨醇酯 60、聚山梨醇酯 61、聚山梨醇酯 65、聚山梨醇酯 80、聚山梨醇酯 81、聚山梨醇酯 85 或聚山梨醇酯 120 或其組合。
  35. 如請求項 28 至 32 中任一項之方法，其中該脂肪酸酯是聚山梨醇酯 20 或聚山梨醇酯 80。
  36. 如請求項 28 至 31 中任一項之方法，其中該界面活性劑是單醯基甘油或雙醯基甘油、醣-脂肪酸酯或α-生育酚聚乙二醇 (PEG) 琥珀酸酯。
  37. 如請求項 28 至 36 中任一項之方法，其中該脂肪酸酯的降解在 24 個月內低於 20%、較佳地低於 10% 且更佳地低於 5%。
  38. 如請求項 26 至 37 中任一項之方法，其中該抗體濃度為至少 1 mg/ml 且至多 250 mg/ml。
  39. 如請求項 28 至 38 中任一項之方法，其進一步包含將緩衝劑、賦形劑、稀釋劑、穩定劑和/或載劑加入該組成物。
  40. 如請求項 28 至 39 中任一項之方法，其中該蛋白質調配物是醫藥組成物。
  41. 如請求項 1 至 40 中任一項之方法，其中包含該蛋白質之該組成物和/或該蛋白質調配物基本上不含水解酶抑制劑。
  42. 一種蛋白質組成物，其藉由或可藉由如請求項 1 至 27 中任一項之方法獲得。
  43. 一種蛋白質調配物，其藉由或可藉由如請求項 28 至 41 中任一項之方法獲得。
  44. 如請求項 43 之蛋白質調配物，其用作藥物或用於藥品中。
  45. 一種固定在固體載體上之水解酶抑制劑之用途，其用於製備蛋白質組成物和/或蛋白質調配物。
  46. 一種固定在固體載體上之水解酶抑制劑之用途，其用於去除或減少蛋白質組成物和/或蛋白質調配物中的水解活性。
  47. 一種固定在固體載體上之水解酶抑制劑之用途，其用於去除或減少蛋白質組成物和/或蛋白質調配物中的雜質(的含量)，該等雜質特定而言是宿主細胞蛋白質且較佳的是水解酶。
  48. 一種固定在固體載體上之水解酶抑制劑之用途，其用於抑制或減少蛋白質組成物和/或蛋白質調配物中的可見和/或顯微鏡下可見之顆粒 (的形成) 和/或界面活性劑降解劑的出現/存在。
  49. 一種將水解酶抑制劑固定在固體載體上之方法，其包含以下步驟： 提供固體載體， 提供水解酶抑制劑， 使該固體載體與含有該水解酶抑制劑的溶液接觸，以及 使該水解酶抑制劑固定在該固體載體上。
  50. 如請求項 49 之方法，其中該固體載體選自聚(甲基)丙烯酸酯，如聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA)、聚苯乙烯、聚環氧乙烷、纖維素和纖維素衍生物，例如乙酸纖維素 (CA) 或再生纖維素、瓊脂糖，包括交聯瓊脂糖、聚碸 (PSU)、聚醚碸 (PES)、聚乙烯 (PE)、聚丙烯 (PP)、聚碳酸酯 (PC)，聚丙烯腈 (PAN)、聚醯胺 (PA)、聚四氟乙烯 (PTFE) 以及前述各項之摻合物或共聚物、或與親水聚合物、較佳地與聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 或聚環氧乙烷 (PEO) 的摻合物或共聚物。
  51. 如請求項 49 或 50 之方法，其中提供該固體載體的該步驟包括處理該固體載體以引入官能基之步驟，該等官能基較佳地選自羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、炔、疊氮化物及生物聚合物(例如鏈黴親和素和/或生物素)。
  52. 如請求項 51 之方法，其中提供該水解酶抑制劑的該步驟包括處理該水解酶抑制劑以引入官能基之步驟，該等官能基能夠與該固體載體之該等官能基反應，以較佳地形成鏈黴親和素-生物素交互作用或形成選自酯類、醯胺類、亞胺類、胺甲酸乙酯類、脲類、β-胺基醇類和 1,2,3-三唑類的一個或多個基團。
  53. 如請求項 49 至 52 中任一項之方法，其中提供該水解酶抑制劑的該步驟包括處理該水解酶抑制劑以引入官能基之步驟，該等官能基較佳地選自羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、炔、疊氮化物及生物聚合物(例如鏈黴親和素和/或生物素)。
  54. 如請求項 53 之方法，其中提供該固體載體的該步驟包括處理該固體載體以引入官能基之步驟，該等官能基能夠與該水解酶抑制劑之該等官能基反應，以較佳地形成鏈黴親和素-生物素交互作用或形成選自酯類、醯胺類、亞胺類、胺甲酸乙酯類、脲類、β-胺基醇類和 1,2,3-三唑類的一個或多個基團。
  55. 如請求項 49 至 53 中任一項之方法，其中該方法包含以下步驟： 提供固體載體， 使該固體載體與含有連接子的溶液接觸，以形成載體-連接子， 提供水解酶抑制劑， 使該載體-連接子與含有該水解酶抑制劑的溶液接觸，以及 使該水解酶抑制劑固定在該載體-連接子上。
  56. 如請求項 55 之方法，其中提供該固體載體的該步驟包括處理該固體載體以引入官能基之步驟，該等官能基較佳地選自羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、炔、疊氮化物及生物聚合物(例如鏈黴親和素和/或生物素)。
  57. 如請求項 55 或 56 之方法，其中該連接子包含官能基，該等官能基能夠與該固體載體之該等官能基反應，以較佳地形成鏈黴親和素-生物素交互作用或形成選自酯類、醯胺類、亞胺類、胺甲酸乙酯類、脲類、β-胺基醇類和 1,2,3-三唑類的一個或多個基團。
  58. 如請求項 55 至 57 中任一項之方法，其中提供該水解酶抑制劑的該步驟包括處理該水解酶抑制劑以引入官能基之步驟，該等官能基較佳地選自羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、炔、疊氮化物及生物聚合物(例如鏈黴親和素和/或生物素)。
  59. 如請求項 55 至 58 中任一項之方法，其中該連接子進一步包含能夠與該水解酶抑制劑之該等官能基反應以較佳地形成鏈黴親和素-生物素交互作用或形成選自酯類、醯胺類、亞胺類、胺甲酸乙酯類、脲類、β-胺基醇類和 1,2,3-三唑類的一個或多個基團之官能基。
  60. 如請求項 49 至 59 中任一項之方法，其中該方法包含以下步驟： 提供固體載體， 提供水解酶抑制劑， 使該水解酶抑制劑與連接子接觸，以形成水解酶抑制劑-連接子， 使該固體載體與含有該水解酶抑制劑-連接子的溶液接觸，以及 使該水解酶抑制劑-連接子固定在該固體載體上。
  61. 如請求項 60 之方法，其中提供該固體載體的該步驟包括處理該固體載體以引入官能基之步驟，該等官能基較佳地選自羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、炔、疊氮化物及生物聚合物(例如鏈黴親和素和/或生物素)。
  62. 如請求項 60 或 61 之方法，其中該連接子包含官能基，該等官能基能夠與該固體載體之該等官能基反應，以較佳地形成鏈黴親和素-生物素交互作用或形成選自酯類、醯胺類、亞胺類、胺甲酸乙酯類、脲類、β-胺基醇類和 1,2,3-三唑類的一個或多個基團。
  63. 如請求項 60 至 62 中任一項之方法，其中提供該水解酶抑制劑的該步驟包括處理該水解酶抑制劑以引入官能基之步驟，該等官能基較佳地選自羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、炔、疊氮化物及生物聚合物(例如鏈黴親和素和/或生物素)。
  64. 如請求項 60 至 63 中任一項之方法，其中該連接子進一步包含能夠與該水解酶抑制劑之該等官能基反應以較佳地形成鏈黴親和素-生物素交互作用或形成選自酯類、醯胺類、亞胺類、胺甲酸乙酯類、脲類、β-胺基醇類和 1,2,3-三唑類的一個或多個基團之官能基。
  65. 如請求項 49 至 64 中任一項之方法，其中該固體載體上的該等官能基包含胺基，較佳的是一級胺基。
  66. 如請求項 65 之方法，其中該固體載體上的該等胺基藉由以反應式電漿、較佳的是由包含氨的氣體混合物所產生的電漿來處理而被引入。
  67. 如請求項 55 至 66 中任一項之方法，其中該連接子為含有選自以下之至少兩種官能基的化合物：羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、炔、疊氮化物及生物聚合物(例如鏈黴親和素和/或生物素)。
  68. 如請求項 67 之方法，其中該連接子另外地包含聚氧乙烯或聚氧丙烯部分，其較佳地含有 3 至 20 個(更佳的是 3 至 10 個，再更佳的是 3 至 5 個)氧乙烯或氧丙烯單元，至少兩個官能基與該部分結合。
  69. 如請求項 55 至 68 中任一項之方法，其中該連接子含有選自以下之至少兩種不同的官能基：羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、炔、疊氮化物及生物聚合物(例如鏈黴親和素和/或生物素)。
  70. 如請求項 69 之方法，其中該連接子在每個分子中含有第一官能基，該第一官能基選自羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、炔、疊氮化物、鏈黴親和素和生物素，且另外地包含至少兩個第二官能基，該至少兩個第二官能基較佳的是相同類型、不同於該第一官能基、選自羥基、羧酸酯基團、酮、醛、異氰酸酯、環氧化物、羥基、羧酸酯基團、胺、炔、疊氮化物及生物聚合物(例如鏈黴親和素和/或生物素)。
  71. 如請求項 49 至 70 中任一項之方法，其中該固體載體是交聯瓊脂糖，較佳的是 sepharose，更佳的是 Mag-Sepharose-鏈黴親和素(珠)或鏈黴親和素 Sepharose® High Performance (珠)。
  72. 如請求項 49 至 71 中任一項之方法，其中該固體載體含有包括鏈黴親和素的官能基，且該連接子含有包括生物素的官能基。
  73. 如請求項 72 之方法，其中該連接子另外地含有疊氮基且該水解酶抑制劑含有炔基。
  74. 如請求項 49 至 73 中任一項之方法，其中該固體載體含有包括羧酸酯的官能基，該固體載體視情況為 NHS-活化型，且該連接子含有包括胺的官能基。
  75. 如請求項 74 之方法，其中該連接子另外地含有疊氮基且該水解酶抑制劑含有炔基。
  76. 如請求項 49 至 75 中任一項之方法，其中該連接子選自生物素-PEG3-疊氮化物 (CAS 875770-34-6)、生物素-PEG4-疊氮化物 (CAS 1309649-57-7)、偶氮基-生物素-疊氮化物 (CAS 1339202-33-3) 和疊氮基-PEG4-胺 (CAS 951671-92-4)。
  77. 如請求項 49 至 76 中任一項之方法，其中該水解酶抑制劑含有炔基且選自具有選自以下之結構的化合物：
    Figure 03_image085
    (HI-1) 和
    Figure 03_image087
    (HI-2) 其中在 (HI-1) 中， R 1、R 2和 R 3各獨立地選自 C 2-24烷基，其可為直鏈或支鏈，其中，R 1、R 2或 R 3中的至少一個 –CH 2–CH 3端基由 –C≡CH 基團取代， 其中在 (HI-2) 中， R 11、R 12和 R 13各獨立地選自 C 2-24烷基，其可為直鏈或支鏈，且其中，R 11、R 12或 R 13中的至少一個 –CH 2–CH 3端基由 –C≡CH 基團取代。
  78. 如請求項 77 之方法，其中 R 1、R 2和 R 11中的碳原子數目獨立地選自 2 至 15，較佳地選自 3 至 14，更佳地選自 4 至 12，再更佳地選自 5 至 11。
  79. 如請求項 77 或 78 之方法，其中 R 12和 R 13中的碳原子數目獨立地選自 5 至 24，較佳地選自 8 至 18，更佳地選自 10 至 16，再更佳地選自 10 至 12。
  80. 如請求項 77 至 79 中任一項之方法，其中 R 3中的碳原子數目選自 2 至 10，較佳地選自 2 至 8，更佳地選自 3 至 6，再更佳地選自 3 至 5。
  81. 如請求項 77 至 80 中任一項之方法，其中 R 1和 R 2的烷基是直鏈。
  82. 如請求項 77 至 81 中任一項之方法，其中 R 11、R 12和 R 13的烷基是直鏈。
  83. 如請求項 77 至 82 中任一項之方法，其中 R 3的烷基是支鏈。
  84. 如請求項 77 至 83 中任一項之方法，其中式 (HI-1) 具有以下結構 (HI-1a)：
    Figure 03_image089
    (HI-1a) 其中 R 1、R 2和 R 3如請求項 77、78、80、81 和 83 中任一項所定義。
  85. 如請求項 49 至 84 中任一項之方法，其中該水解酶抑制劑含有炔基，且選自具有選自以下之結構的化合物：
    Figure 03_image091
    Figure 03_image093
    及
    Figure 03_image095
    。
  86. 一種固定在固體載體上之水解酶抑制劑，其可藉由如請求項 49 至 85 中任一項之方法獲得。
  87. 一種裝置，其包含如請求項 86 之固定在固體載體上之水解酶抑制劑。
  88. 如請求項 87 之裝置，其中該裝置為具有至少兩個開口的管狀裝置。
  89. 如請求項 87 或 88 之裝置，其中該裝置包含容器，該容器較佳地由金屬、聚合物或玻璃製成，該容器形成空腔，該空腔中含有該固定在固體載體上之水解酶抑制劑。
  90. 如請求項 87 至 89 中任一項之裝置，其中該裝置是管柱，其至少部分地被該固定在固體載體上之水解酶抑制劑填充。
TW110129136A 2020-08-07 2021-08-06 製備蛋白質組成物之方法 TW202221008A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20190136 2020-08-07
EP20190136.0 2020-08-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202221008A true TW202221008A (zh) 2022-06-01

Family

ID=71995894

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW110129136A TW202221008A (zh) 2020-08-07 2021-08-06 製備蛋白質組成物之方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20240002430A1 (zh)
EP (1) EP4192842A1 (zh)
JP (1) JP2023536366A (zh)
CN (1) CN116033921A (zh)
AR (1) AR123165A1 (zh)
TW (1) TW202221008A (zh)
WO (1) WO2022029306A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2024517042A (ja) * 2022-04-13 2024-04-19 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３二重特異性抗体の薬学的組成物及び使用方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2707189B1 (fr) 1993-07-09 1995-10-13 Gradient Ass Procédé de traitement de résidus de combustion et installation de mise en Óoeuvre dudit procédé.
DE60140474D1 (de) 2000-09-08 2009-12-24 Univ Zuerich Sammlung von proteinen mit sich wiederholenden sequenzen (repeat proteins), die repetitive sequenzmodule enthalten
JP2004526419A (ja) 2000-10-16 2004-09-02 フィロス インク． 抗体模倣物および他の結合タンパク質のためのタンパク質骨格
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
US20050164301A1 (en) 2003-10-24 2005-07-28 Avidia Research Institute LDL receptor class A and EGF domain monomers and multimers
EP2825197B1 (en) 2012-03-16 2018-06-06 Covagen AG Novel binding molecules with antitumoral activity
FI3177643T5 (fi) 2014-08-04 2023-11-28 Hoffmann La Roche T-soluja aktivoivia bispesifisiä antigeeniä sitovia molekyylejä
AR102198A1 (es) 2014-10-09 2017-02-08 Regeneron Pharma Proceso para reducir partículas subvisibles en una formulación farmacéutica
KR20200054980A (ko) * 2017-09-19 2020-05-20 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 입자 형성을 감소시키는 방법 및 그것에 의해 형성된 조성물
EP3560945A1 (en) * 2018-04-27 2019-10-30 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for purification of polypeptides using polysorbates

Also Published As

Publication number Publication date
AR123165A1 (es) 2022-11-02
JP2023536366A (ja) 2023-08-24
CN116033921A (zh) 2023-04-28
WO2022029306A1 (en) 2022-02-10
US20240002430A1 (en) 2024-01-04
EP4192842A1 (en) 2023-06-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20050112743A1 (en) Method of analyzing enzyme compositions with lipolytic, proteolytic and amylolytic activity
Graf et al. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation
Graf et al. Controlled polysorbate 20 hydrolysis–a new approach to assess the impact of polysorbate 20 degradation on biopharmaceutical product quality in shortened time
Zhang et al. Degradation of polysorbate 20 by sialate O-acetylesterase in monoclonal antibody formulations
Zhang et al. Putative phospholipase B-like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products
US20210268073A1 (en) Methods of reducing polysorbate degradation in drug formulations
Corasolla Carregari et al. Biochemical, pharmacological, and structural characterization of new basic bbil-TX from bothriopsis bilineata snake venom
US20190083618A1 (en) Methods of reducing particle formation and compositions formed thereby
TW202221008A (zh) 製備蛋白質組成物之方法
US20210008199A1 (en) Methods and compositions comprising reduced level of host cell proteins
KR20230065318A (ko) 오염 리파제 활성의 검출 방법
US20210096130A1 (en) Compositions, methods, and kits for detection of lipolytic activity
CN115989416A (zh) 用于评估生物制药开发过程中聚山梨醇酯降解风险的高通量、基于荧光的酯酶活性测定法
Hu et al. Identification and quantification of a problematic host cell protein to support therapeutic protein development
EP3840726B1 (en) Lipase degradation resistant surfactants for use in large molecule therapeutic formulations
US20210371455A1 (en) Methods and compositions comprising reduced level of host cell proteins
Jung et al. Characterization of α-l-Iduronidase (Aldurazyme®) and its complexes
US20180066070A1 (en) Acetylated pcsk9
US20220018849A1 (en) Serine hydrolase profiling assay in biotherapeutics
JP2018538008A (ja) リソソーム酵素の取り込みを中和する抗体または他の因子の検出のための細胞ベースアッセイ
Yuan et al. Co-loss of profilin I, II and cofilin with actin from maturing phagosomes in Dictyostelium discoideum
CN116457470A (zh) 用于检测污染脂肪酶活性的方法
WO2024068753A1 (en) Glycan-mediated protein degradation
Carregari et al. Bothriopsis bilineata Snake Venom