KR20230065318A - 오염 리파제 활성의 검출 방법 - Google Patents

오염 리파제 활성의 검출 방법 Download PDF

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마티아스 요셉 네이프
멜라니 밀러
벤자민 조슈아 콜러
올리버 버커트
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베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하
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Abstract

본 발명은 발색단 4-메틸움벨리페릴 (4-MU)을 4-MU 에스테르 형태로 포함하는 기질의 가수분해를 측정하여 재조합 단백질의 샘플에서 오염 리파제 활성을 검출하는 방법에 관한 것이고, 여기서, 4-MU 에스테르는 포화 비분지형-쇄 지방산 (C6-C16) 4-MU 에스테르이다. 재조합 단백질의 샘플에서 오염 리파제 활성을 측정하기 위한 키트가 추가로 제공된다.

Description

오염 리파제 활성의 검출 방법
발명의 분야
본 발명은 재조합 단백질의 샘플에서 오염 리파제 활성을 검출하는 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 상기 방법은, 적어도 하나의 샘플 (예를 들면, IPC 샘플)을, (i) 약 pH 4 내지 약 pH 9의 pH를 갖는 완충액, (ii) 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 계면활성제, 여기서, 계면활성제는 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제임, (iii) 발색단 4-메틸움벨리페릴 (4-MU)을 4-MU 에스테르 형태로 포함하는 기질, 여기서, 4-MU 에스테르는 포화 비분지형-쇄 지방산 (C6-C16) 4-MU 에스테르임, 및 (iv) 임의로, 비-완충 염을 포함하는 반응 용액과 접촉시키는 단계; 및 4-MU 에스테르의 가수분해를 측정하여 오염 리파제 활성을 검출하고, 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 검출하는 단계를 포함한다. 다음을 포함하는 IPC 샘플과 같은 재조합 단백질을 포함하는 샘플에서 오염 리파제 활성을 측정하기 위한 키트를 추가로 제공한다: (i) 약 pH 4 내지 약 pH 9의 pH를 갖는 완충액, (ii) 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 계면활성제, 여기서, 계면활성제는 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제임, 및 (iii) 발색단 4-메틸움벨리페릴 (4-MU)을 4-MU 에스테르 형태로 포함하는 기질, 여기서, 기질은 포화 비분지형-쇄 지방산 (C6 내지 C16) 4-MU 에스테르임.
배경
치료제로서 단백질은 최근 십년간 점점 더 대중적으로 되었다. 치료학적 단백질, 예를 들면, 모노클로날 항체를 포함하는 제형은, 종종 100 mg/ml 이상의 높은 단백질 농도를 포함하고, 계면활성제의 존재를 종종 필요로 한다. 이들의 생체적합성 및 저 독성 때문에 생물약제 산업에서 가장 널리 사용되는 계면활성제는 폴리소르베이트 (PS), 예를 들면, 폴리소르베이트 20 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트, Tween 20®) 또는 폴리소르베이트 80 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트, Tween 80®)이다.
폴리소르베이트는 소르비톨 및 이의 무수물과, 지방산과 부분 에스테르화된 대략적으로 20개의 중합된 에틸렌 옥사이드 모이어티(moieties)를 함께 포함하는 이종 혼합물이다. 그러나, 폴리소르베이트는, 제품 품질에 유해하게 영향을 줄 수 있는 분해의 경향이 있다. 분해는, 단지 제형에서 수득된 감소된 폴리소르베이트 농도 뿐만 아니라, 또한 예를 들면, 지방산 및 폴리옥시에틸렌 측쇄와 같은 폴리소르베이트 분해제의 불용성 문제로부터의 가시적인 및 하위-가시적인 입자의 형성 때문에, 제품 품질에 영향을 줄 수 있다. 폴리소르베이트는 화학적으로 또는 효소적으로 분해될 수 있다. 화학적 폴리소르베이트 분해는 그 중에서도 알데히드, 케톤 및 지방산의 형성을 야기하는 산화 반응에 의해 주로 야기된다. 효소적 폴리소르베이트 분해는 폴리에톡실화된 소르비탄을 지방산과 연결하는 에스테르 결합의 가수분해를 특징으로 한다 (참조: Dwivedi et al., 2018, International Journal of Pharmaceutics 552:442-436). 폴리소르베이트의 산화적 분해가 장기간 동안 공지되었지만, 항체 제형에서 폴리소르베이트의 효소적 가수분해는 단지 최근에 주요 분해 경로 중 하나로서 고려되었다. 최근에, 폴리소르베이트 분해는 생물약제 커뮤니티에서 주요한 문제로서 발생하였다.
최종 약물 제품 (DP)에 포함된 리파제 또는 숙주 세포 단백질 (HCPs)의 다른 효소의 잔류 가수분해 활성이 폴리소르베이트 분해를 야기할 수 있다는 것을 보고하였다. 항체 제형 내에 폴리소르베이트의 분해에서 리파제의 역할은 추가로 치우(Chiu) 등의 문헌에서 강조되었고, 여기서, 지질단백질 리파제 (LPL) 녹아웃 CHO 세포로부터 수거된 세포 배양 유체 (HCCF)는 야생형과 비교하여 PS20 및 PS80 분해를 감소시켰다 (참조: Chui et al., 2017, Biotechnol. Bioeng. 114, 1006-1015). 치료학적 단백질 생산에서 업스트림 및 특히 다운스트림 생산 프로세스의 필수적인 변경 및 개조는, 폴리소르베이트 분해에 미치는 단일 정제 단계 및 조건의 영향력을 측정하는 것이 수주가 걸리기 때문에, 어렵다.
폴리소르베이트 함량 및 분해는 상이한 분석 기술을 사용하여 연구될 수 있다. 가장 통상 사용되는 폴리소르베이트의 정량화 방법은 역상 액체 크로마토그래피 (예를 들면, RP-HPLC)이고, 이는 추가로 증발 광산란 검출기 (ELSD) 및 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)에 결합될 수 있다. 폴리소르베이트 함량 결정을 가능하게 하는 다른 기술은 형광 미쉘 검정 (FMA) 또는 코발트 티오시아네이트 또는 제2철 티오시아네이트를 사용한 소르비탄 환의 화학적 복합화로 이루어진다. 그러나, 정제 프로세스의 변경이 폴리소르베이트 분해의 원인이 되는 가수분해 활성을 감소시키는 측면에서 성공적인지를 결정하기 위해, 관심 대상 샘플은 폴리소르베이트로 스파이크(spiked)될 필요가 있고, 이의 분해는 상기한 바와 같이 분석되는 것이 필요하다. 따라서, 폴리소르베이트 분해는 전형적으로, 폴리소르베이트 함량의 감소를 경시적으로 모니터링하여 평가된다. 그러나, 폴리소르베이트 분해는 수주 또는 수개월까지 걸릴 수 있는 느린 프로세스이다. 추가로, 분석은 복잡하고, 시간 소모적이다.
약물 제품에서 효소적 폴리소르베이트 분해를 최소화하는 정제 조건을 개발하기 위해, 상이한 샘플에 대해 용이하게 개조될 수 있고, 약물 제품 샘플의 약물 물질에서 폴리소르베이트 분해의 원인이 되는 가수분해 활성에 대한 예측되는 정보를 제공하는, 고 민감성을 갖는 신속한, 신뢰할 수 있는 자동화 고-처리량 검정이 필요하다. 이러한 검정은 표적 단백질로 공동-정제된 최소화된 폴리소르베이트 분해 활성 때문에 향상된 제품 품질을 갖는 약물 물질 생산을 위한 프로세스 개발을 안내하는 도구로서 유용하다.
형광 기질을 사용하는 시험관내 리파제의 가수분해 활성 검출은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 그러나 이들 선행 기술 검정은 재조합 단백질 (관심 대상 단백질)을 사용하여 진핵세포로부터 단지 공동-정제된 재조합 단백질 제조에서 오염 리파제 활성을 단시간 내에 신뢰할 수 있게 검출하기에는 충분히 민감하지 않다. 예를 들면, 쓰즈키(Tsuzuki) 등 (참조: Biosci. Biotechnol. Biochem, 2001, 65(9): 2078-2082)은 형광 기질을 사용하여 고 농도의 미생물로부터 수개의 리파제의 활성을 분석하고, DMSO가 특정 리파제를 위해 강한 소수성 기질의 가수분해를 증가시킴을 발견하였다. DMSO는 기질을 용해시키기 위해 정규적으로 사용된 유기 용매이고, 이는 미쉘을 형성하는 계면활성제가 아니다. 술시엔(Sulciene) 등(참조: Acta Paediatrica, supplement, 2018, 116:1049-1055)은 에폭시드화 오일을 생성하기 위해 효모로부터 고정된 지질분해성 효소의 사용을 개시하고, 정확한 조건이 개시되지 않는 형광 기질을 사용하는 이들 농축된 리파제-나노입자 접합체의 리파제 활성을 검출하는 것을 기술한다. 또한, 유(Yoo) 등 (참조: Cell Chemical Biology, 2020, 27: 143-157)은 리파제 활성을 검출하기 위한 형광발생 기질 검정을 개시하고, 반응 용액의 일부로서가 아니라 분석 전에 고 농축된 리파제 rPfMAGLLP를 용해시키기 위한 Triton X-100을 사용한다. WO 2010/024924는 형광발생 기질을 사용하는 이. 콜리(E.coli)에서 발현된 리파제를 스크리닝하기 위한 검정을 개시하고, 따라서, 다시 검정은 진핵세포로부터 정제된 재조합 단백질 샘플에서 오염 리파제 활성을 검출하기 위해 사용되지 않는다. 이들 선행 기술 검정 중 어느 것도 진핵세포에서 생산된 재조합 단백질 샘플에서 오염 리파제 활성을 측정하지 않는다.
2019년 문덴(Menden) 등(참조: Journal of Enzyme Inhibition of Medicinal Chemistry, 34(1): 1474-1480)은 칸디다 루고사 리파제 (CRL) 이소형의 제한된 효소 추출물의 리파제 활성을 검출하여 4-메틸움벨리페릴 부티레이트 (4-MUB) 및 팔미테이트 (4-MUP)를 기질로서 사용하여 억제제 트로폴론의 작용 방식을 입증하는 리파제 활성 검정을 보고한다. 검정에 대한 제한사항이 보고되어 있고, 여기에는 길이에 따른 소수성 지방산 테일의 용해성의 고유한 감소 및 염기성 pH 범위에서 기질의 자가촉매작용이 포함된다. 더욱이, 어떠한 계면활성제도 검정에서 사용되지 않았다. 보다 최근에, 2020년 존(Jahn) (참조: Pharm. Res. 37(118): 2-13)은 4-메틸움벨리페릴 올레에이트 (4-MuO)를 기질로서 사용하여 수거된 세포 배양 유체의 샘플에서 폴리소르베이트 분해를 측정할 때 사용하기 위한 발색단 기반 리파제 활성 검정을 보고한다. 그러나, 보통의 민감성은 여전히 24 시간 이상의 인큐베이션 시간이 요구된다.
따라서, 짧은 시간 내에 관련 샘플에서 리파제 활성을 결정할 수 있는 높은 민감성을 갖는 개선된 방법이 여전히 필요하다.
발명의 요지
본 발명은 하기를 포함하는 재조합 단백질을 포함하는 샘플에서 (오염) 리파제 활성을 검출하는 방법에 관한 것이다: (a) 진핵세포에서 생산된 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 제공하는 단계; (b) 적어도 하나의 샘플을 반응 용액과 접촉시켜 반응 혼합물을 형성하는 단계, 여기서, 반응 용액은 하기한 것을 포함하고: (i) 약 pH 4 내지 약 pH 9의 pH를 갖는 완충액, (ii) 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 계면활성제, 여기서, 계면활성제는 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제임, (iii) 발색단 4-메틸움벨리페릴 (4-MU)을 4-MU 에스테르 형태로 포함하는 기질, 여기서, 4-MU 에스테르는 포화 비분지형-쇄 지방산 (C6-C16) 4-MU 에스테르임, 및 (iv) 임의로, 비-완충 염; (c) 반응 혼합물 중 샘플 및 기질을 인큐베이팅하는 단계; 및 (d) 4-MU 에스테르의 가수분해를 측정하여 (오염) 리파제 활성을 검출하고, 방출된 발색단 4-MU (이는 4-MU 에스테르 가수분해 생성물)의 형광 강도를 검출하는 단계; 여기서, 임의로 가수분해는, 단계 (c)에 따라 상기 반응 혼합물 중 상기 샘플 및 상기 기질을 인큐베이팅하면서, 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 경시적으로 검출하여 측정된다. 상기 방법은 시험관내 방법을 언급한다는 것을 이해하여야 한다. 특정 실시형태에서, 반응 혼합물 중 샘플 및 기질을 2 분 내지 5 시간 미만, 3 시간 미만, 2 시간 미만, 또는 0.5 시간 미만의 임의의 기간 동안 인큐베이팅한다. 적어도 하나의 샘플은 수거된 세포 배양 유체 (HCCF), 공정-중 제어 (IPC) 샘플, 약물 물질 샘플 또는 약물 제품 샘플일 수 있다. 리파제 활성을 검출하기 위한 샘플에서 재조합 단백질은 바람직하게는 치료학적 단백질, 예를 들면, 항체, 항체 단편, 항체 유도된 분자 또는 융합 단백질 (예를 들면, Fc 융합 단백질)이다. 본 발명에 따라서, 리파제 활성을 검출하기 위한 샘플에서 재조합 단백질은 리파제가 아니고/아니거나, 리파제 활성을 포함하지 않는다. 따라서, 적어도 하나의 샘플에서 검출된 임의의 리파제 활성은 오염 리파제 활성이고/이거나, 리파제 활성을 갖는 적어도 하나의 오염 단백질, 예를 들면, 진핵세포로부터 유도된 숙주 세포 단백질 (HCPs)로부터 유도된 활성이다.
바람직한 실시형태에서, 기질은 4-메틸움벨리페릴 옥타노에이트, 4-메틸움벨리페릴 노나노에이트, 4-메틸움벨리페릴 데카노에이트 (4-MUD), 4-메틸움벨리페릴 운데카노에이트 및 4-메틸움벨리페릴 도데카노에이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 기질은 4-메틸움벨리페릴 옥타노에이트, 4-메틸움벨리페릴 데카노에이트 (4-MUD) 및 4-메틸움벨리페릴 도데카노에이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 따라서, 계면활성제는 반응 혼합물 중 이의 임계 미셀 농도 초과의 반응 혼합물 중 최종 농도를 갖는다. 비-변성 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제는 CHAPS, CHAPSO, 쯔비터젠트 (예를 들면, 쯔비터젠트 3-12) 또는 사포닌일 수 있다. 바람직하게는, 비-변성 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제는 CHAPS이다. CHAPS는 약 8 mM 내지 약 20 mM, 바람직하게는 약 8 mM 내지 약 15 mM, 보다 바람직하게는 약 10 mM의 반응 혼합물 중 최종 농도로 제공될 수 있다. 적합한 완충액은 포름산, 아세트산, 락트산, 시트르산, 말산, 말레산, 글리신, 글리실글리신, 석신산, TES (2-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}에탄설폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판설폰산), PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), MES (2-(N-모르폴리노)에탄설폰산), 트리스 염기, 비스-트리스, 비스-트리스-프로판, 비신 (N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신), HEPES (4-2-하이드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산), TAPS (3-([트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}프로판설폰산), 트리신 (N-트리스(하이드록시메틸)메틸글리신), Na2HPO4 및 NaH2PO4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 완충액 물질을 포함한다. 바람직하게는, 완충액은 약 5 내지 약 7.5의 pH를 갖고, 바람직하게는 완충액은 약 5.5 내지 약 7.5의 pH를 갖는다. 특정 실시형태에서, 완충액은 적어도 약 pH 5 내지 적어도 약 pH 7.5, 바람직하게는 적어도 약 pH 4 내지 적어도 약 pH 8의 완충 범위를 갖는 다-성분 완충액이다.
임의의 비-완충 염은, 예를 들면, NaCl, KCl 및 CaCl2일 수 있고, 바람직하게는 NaCl 또는 KCl이다. 이는 반응 혼합물 중 약 100 mM 내지 약 200 mM, 바람직하게는 약 130 mM 내지 약 170 mM, 보다 바람직하게는 약 140 mM 내지 약 150 mM의 농도로 제공될 수 있다. 반응 혼합물 중 비-완충 염의 이온성 강도는 반응 혼합물 중 바람직하게는 약 200 mM 이하, 보다 바람직하게는 약 170 mM 이하 및 보다 바람직하게는 약 150 mM 이하, 예를 들면, 약 100 mM 내지 약 200 mM, 바람직하게는 약 130 mM 내지 약 170 mM, 보다 바람직하게는 약 140 mM 내지 약 150 mM이다. 대안적으로 또는 추가로 반응 혼합물 중 완충액 및 비-완충 염의 누적 이온성 강도는 약 450, 바람직하게는 약 400 mM 이하, 보다 바람직하게는 약 350 mM 이하일 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 관심 대상 재조합 단백질을 제작하는 방법에 관한 것이고: (i) 세포 배양물 중 관심 대상 재조합 단백질을 발현하는 진핵세포를 배양하는 단계; (ii) 상기 재조합 단백질을 수거하는 단계; (iii) 상기 재조합 단백질을 정제하는 단계; 및 (iv) 임의로, 상기 재조합 단백질을 투여에 적합한 약제학적으로 허용되는 제형으로 제형화하는 단계; 및 (v) 단계 (ii), (iii) 및/또는 (iv)에서 상기 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 입수하는 단계; 여기서, 상기 방법은 추가로 하기를 포함하는 재조합 단백질을 포함하는 샘플에서 (오염) 리파제 활성을 검출함을 포함한다: (a) 단계 (v)의 진핵세포에서 생산된 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 제공하는 단계; (b) 적어도 하나의 샘플을 반응 용액과 접촉시켜 반응 혼합물을 형성하는 단계, 여기서, 반응 용액은 하기한 것을 포함하고: (i) 약 pH 4 내지 약 pH 9의 pH를 갖는 완충액, (ii) 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 계면활성제, 여기서, 계면활성제는 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제임, (iii) 발색단 4-메틸움벨리페릴 (4-MU)을 4-MU 에스테르 형태로 포함하는 기질, 여기서, 4-MU 에스테르는 포화 비분지형-쇄 지방산 (C6-C16) 4-MU 에스테르임, 및 (iv) 임의로, 비-완충 염; (c) 반응 혼합물 중 샘플 및 기질을 인큐베이팅하는 단계; (d) 4-MU 에스테르의 가수분해를 측정하여 (오염) 리파제 활성을 검출하고, 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 검출하는 단계; 임의로, 단계 (c)에 따라 상기 반응 혼합물 중 상기 샘플 및 상기 기질을 인큐베이팅하면서, 상기 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 경시적으로 검출하여 가수분해를 측정하는 단계. 특정 실시형태에서, 상기 방법은 하기 단계에서 상기 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 입수함을 포함하고: 단계 (ii)에서, 여기서, 샘플은 수거된 세포 배양 유체 (HCCF) 또는 세포 용해물임; 단계 (iii), 여기서, 샘플은 공정-중 제어 (IPC) 샘플임; 및/또는 단계 (iv), 여기서, 샘플은 약물 물질 샘플 또는 약물 제품 샘플임; 바람직하게는 단계 (iii)에서 상기 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 입수함을 포함하고, 친화성 크로마토그래피 전 및 후, 및/또는 산 처리 전 및 후, 산 처리에 이은 심층 여과 전 및 후, 및/또는 이온 교환 크로마토그래피, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피 전 및 후 적어도 하나의 샘플을 입수함을 포함한다.
또다른 측면에서 본 발명은 하기를 포함하는 IPC 샘플과 같은 재조합 단백질을 포함하는 샘플에서 오염 리파제 활성을 측정하기 위한 키트에 관한 것이다: (i) 약 pH 4 내지 약 pH 9의 pH를 갖는 완충액, (ii) 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 계면활성제, 여기서, 계면활성제는 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제임, (iii) 발색단 4-메틸움벨리페릴 (4-MU)을 4-MU 에스테르 형태로 포함하는 기질, 여기서, 기질은 포화 비분지형-쇄 지방산 (C6 내지 C16) 4-MU 에스테르임, 및 (iv) 임의로, 비-완충 염, 및/또는 (iiv) 임의로 희석용수. 특정 실시형태에서, 완충액, 계면활성제 및 임의의 비-완충 염은 검정 완충액으로서 사전혼합된다. 바람직하게는, 상기 검정 완충액은 최종 반응 혼합물에 비해 적어도 약 3-배 농축되거나 약 3-배 내지 약 5-배 농축된다. 대안적으로, 검정 완충액은 건조 혼합물로서 제공된다. 이러한 건조 혼합물은 물과 함께 재구성하여 최종 반응 혼합물에 비해 상기 적어도 약 3-배 농축된 또는 5-배 농축된 검정 완충액을 제공할 수 있다. 대안적으로 또는 완충액에 추가하여, 계면활성제, 기질 및 임의의 비-완충 염을 사전혼합하고, 마스터 믹스로서 샘플에 첨가하고, 여기서, 마스터 믹스는 반응 혼합물의 약 80% (v/v) 내지 약 70% (v/v), 바람직하게는 반응 믹스의 약 75%로 제공된다.
바람직한 실시형태에서, 기질은 4-메틸움벨리페릴 옥타노에이트, 4-메틸움벨리페릴 노나노에이트, 4-메틸움벨리페릴 데카노에이트 (4-MUD), 메틸움벨리페릴 운데카노에이트 및 메틸움벨리페릴 도데카노에이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 키트는 또한 기질을 용해시키기 위한 유기 용매, 또는 유기 용매 중 용해된 기질, 및/또는 96 웰 또는 다수의 96 웰을 갖는 하나 이상의 미세역가 플레이트를 추가로 포함할 수 있다. 비-변성 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제는 CHAPS, CHAPSO, 쯔비터젠트 (예를 들면, 쯔비터젠트 3-12) 및 사포닌일 수 있다. 바람직하게는, 비-변성 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제는 CHAPS이다. 특정 실시형태에서, 완충액은 포름산, 아세트산, 락트산, 시트르산, 말산, 말레산, 글리신, 글리실글리신, 석신산, TES (2-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}에탄설폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판설폰산), PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), MES (2-(N-모르폴리노)에탄설폰산), 트리스 염기, 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스-프로판, 비신 (N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신), HEPES (4-2-하이드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산), TAPS (3-([트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노-프로판설폰산), 트리신 (N-트리스(하이드록시메틸)메틸글리신), Na2HPO4 및 NaH2PO4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 완충액 물질을 포함한다. 바람직하게는 완충액은 약 5 내지 약 7.5의 pH를 갖고, 보다 바람직하게는 완충액은 약 5.5 내지 약 7.5의 pH를 갖는다. 특정 실시형태에서, 완충액은 적어도 약 pH 5 내지 적어도 약 pH 7.5, 바람직하게는 적어도 약 pH 4 내지 적어도 약 pH 8의 완충 범위를 갖는 다-성분 완충액이다. 임의의 비-완충 염은, 예를 들면, NaCl, KCl 및 CaCl2일 수 있고, 바람직하게는 NaCl 또는 KCl이다.
도면의 설명
도 1: 기질 4-MUD에 대한 가수분해 반응을 도시한다.
도 2: 다양한 pH에서 상이한 벌크 약물 물질 (BDS)의 리파제 활성의 검출. 벌크 약물 물질 A-B 및 D-E (모노클로날 항체 및 항체-유사 포맷) 샘플의 가수분해 활성을 지시된 바와 같이 pH 4 내지 pH 8의 상이한 pH에서 측정하였다. 모든 측정을 흑색 96 웰 플레이트에서 마이크로플레이트 판독기 (λem = 450 nm, λex = 330 nm, 상부 판독 모드)를 사용하여 AMT 검정 완충액 (75 mM 아세테이트, 75 mM MES, 150 mM 트리스, 150 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 5.5) 중에서 30 μM 4-MUD를 사용하여 수행하였다.
도 3: 검정 완충액에서 4-MUD의 용해성. 0 내지 60 μM 4-MUD의 용해성을 흑색 96 웰 플레이트에서 마이크로플레이트 판독기 (λem = 450 nm, λex = 330 nm, 상부 판독 모드)를 사용하여 AMT 검정 완충액 (75 mM 아세테이트, 75 mM MES, 150 mM 트리스, 150 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 4-8) 중에서 광산란 실험으로 시험하였다.
도 4: 벌크 약물 물질 (BDS D)에서 가수분해 활성의 미카엘리스-멘텐 속도론. 검정을 흑색 96 웰 플레이트에서 마이크로플레이트 판독기 (λem = 450 nm, λex = 330 nm, 상부 판독 모드)를 사용하여 4-MUD (1.5625 μM - 150 μM)의 다양한 농도로 AMT 검정 완충액 (75 mM 아세테이트, 75 mM MES, 150 mM 트리스, 150 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 5.5) 중에서 수행하였다.
도 5: 4-MUD의 용해성을 1 cm 마이크로-큐벳에서 형광 분광계 (λem = 400 nm, λex = 400 nm)를 사용하여 AMT 검정 완충액 (75 mM 아세테이트, 75 mM MES, 150 mM 트리스, 150 mM NaCl, 20 mM CHAPS, pH 7) 중에서 광산란 실험으로 시험하였다.
도 6: 4-MUB 및 4-MUD의 자가가수분해. 형광성을 흑색 96 웰 플레이트에서 마이크로플레이트 판독기 (λem = 450 nm, λex = 330 nm, 상부 판독 모드)를 사용하여 AMT 검정 완충액 (75 mM 아세테이트, 75 mM MES, 150 mM 트리스, 150 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 5.5) 중에서 각각 30 μM의 4-MUB 또는 4-MUD를 사용하여 1800 초 동안 모니터링하였다.
도 7: 벌크 약물 물질 (BDS)에서 리파제 활성에 미치는 CHAPS의 영향. (A) BDS G 샘플 및 완충액 대조군의 가수분해 활성을 CHAPS의 첨가의 존재 또는 부재하에 측정하고, μM 단위로 방출된 4-MU를 경시적으로 제공한다. (B) BDS B, G & F (모노클로날 항체 및 항체-유사 포맷) 샘플의 가수분해 활성을 CHAPS의 첨가의 존재 또는 부재하에 측정하였다. 각각의 제품에 대한 CHAPS를 사용하여 가수분해 활성으로 정량화된 블랭크 공제된 데이터의 활성을 제공한다. 추가로, 한외여과/정용여과 후 대표적인 IPC 샘플 (제품 D의 UF/DF)을 도시한다. 모든 측정을 흑색 96 웰 플레이트에서 마이크로플레이트 판독기 (λem = 450 nm, λex = 330 nm, 기부 판독 모드)를 사용하여 10 mM CHAPS의 존재 또는 부재하에 AMT 검정 완충액 (75 mM 아세테이트, 75 mM MES, 150 mM 트리스, 150 mM NaCl, pH 5.5) 중에서 30 μM 4-MUD를 사용하여 수행하였다.
도 8: 이온성 강도에 대한 가수분해 활성의 의존성. 예시적인 약물 제품 (제품 E) 샘플의 가수분해 활성을 다양한 농도의 NaCl (7.8125 mM - 1000 mM)의 존재하에 측정하였다. 모든 측정을 흑색 96 웰 플레이트에서 마이크로플레이트 판독기 (λem = 450 nm, λex = 330 nm, 상부 판독 모드)를 사용하여 AMT 검정 완충액 (75 mM 아세테이트, 75 mM MES, 150 mM 트리스, 10 mM CHAPS, pH 5.5) 중에서 30 μM 4-MUD를 사용하여 수행하였다.
도 9: PS20에 의한 가수분해 활성의 경쟁적인 억제. 약물 제품 샘플의 가수분해 활성을 다양한 농도의 PS20 (0.0125 mg/mL - 3.2 mg/mL)의 존재하에 측정하였다. 모든 측정을 흑색 96 웰 플레이트에서 마이크로플레이트 판독기 (λem = 450 nm, λex = 330 nm, 상부 판독 모드)를 사용하여 AMT 검정 완충액 (50 mM 아세테이트, 50 mM MES, 100 mM 트리스, 150 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 5.5) 중에서 30 μM 4-MUD를 사용하여 수행하였다.
도 10: 검정 완충액에서 CHAPS, Triton X-100 또는 Triton X 100 및 검 아라비쿰을 사용한 가수분해 활성의 비교. 반응 혼합물 중 0.024 mg/ml PPL 또는 2.4 mg/ml BDS에서 PPL (A), 벌크 약물 물질 (BDS) B (B) 및 BDS E (C)의 가수분해 활성을 10 mM CHAPS (상부 흑색 선), 0.25% Triton X-100 (중간 밝은 회색 선) 또는 0.25% Triton X-100 및 0.125% 검 아라비쿰 (하부 짙은 회색 선)을 사용하여 표준 조건 (AMT 완충액, 5.5)에서 측정하였다.
도 11: 형광 분광계 (A) 뿐만 아니라 마이크로플레이트 판독기 (B)를 사용하여 측정된 하나의 제품 (모노클로날 항체)의 다양한 IPC 샘플에서 리파제 활성의 비교. 모든 측정을 3 μM 4-MUD를 포함하는 포스페이트 검정 완충액 (81 mM Na2HPO4, 19 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 7.4)을 사용하여 수행하였다. 형광 분광계에서 1 cm 마이크로-큐벳 및 마이크로플레이트 판독기에서 흑색 96 웰 플레이트 (상부 판독 모드)를 사용하고, 둘 다는 λem = 450 nm 및 λex = 340 nm이다. 다양한 IPC 샘플은 하기와 같이 지시된다: 단백질 A 용리 완충액 (Prot A 완충액) 및 제품 풀 (Prot A Prod P), 중화된 산 처리 제품 풀 (Neutral. AT Prod Pool), 심층 여과 제품 풀 (Depth. filtr. Prod. P), 양이온 교환 크로마토그래피 완충액 (CIEX 완충액) 및 제품 풀 (CIEX Prod P), 바이러스 여과 제품 풀 (Virus filtr. Prod P), 30 kD 한외여과/정용여과 완충액 (UF/DF 완충액) 및 제품 풀 (UF/DF Prod P), 제형 완충액, 약물 물질 (DS).
도 12: 오를리스타트에 의한 폴리소르베이트 분해의 억제. 0.2 mg/mL PS20를 사용한 약물 제품 샘플 (제품 D)을 56 일까지 수회 풀 포인트(pull point)로 실온에서 인큐베이팅하였다. 잔류 PS20 함량을 HPLC-CAD 방법을 사용하여 측정하였다. 1 μM 오를리스타트는 대조군 반응 (DMSO 단독)과 비교하여 PS20의 감소된 분해를 야기하였다.
도 13: 오를리스타트에 의한 가수분해 활성의 억제. 약물 제품 샘플 (제품 D)의 가수분해 활성을 다양한 농도의 오를리스타트 (7.3 nM - 20 μM)의 존재하에 측정하였다. 모든 측정을 흑색 96 웰 플레이트에서 마이크로플레이트 판독기 (λem = 450 nm, λex = 330 nm, 상부 판독 모드)를 사용하여 AMT 검정 완충액 (75 mM 아세테이트, 75 mM MES, 150 mM 트리스, 150 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 5.5) 중에서 30 μM 4-MUD를 사용하여 수행하였다. 결과는 오를리스타트가 폴리소르베이트 분해의 원인이 되는 가수분해 활성 뿐만 아니라 4-MUD 검정을 사용하여 모니터링된 가수분해 활성을 억제하고 있음을 제시한다.
도 14: PS-스파이크 IPC 샘플 (제품 B)에서 PS-분해의 비교 및 4-MUD 검정으로 측정된 가수분해 활성. PS 분해는 FMA 검정을 사용하여 결정하고; 가수분해 활성 (4-MUD 검정)을 1 cm 마이크로-큐벳에서 형광 분광계 (λem = 450 nm, λex = 340 nm)를 사용하여 3 μM 4-MUD를 포함하는 포스페이트 검정 완충액 (100 mM NaHPO4, 140 mM NaCl, 10mM CHAPS, pH 7.4)을 사용하여 수행하였다. 다양한 IPC 샘플은 하기와 같이 지시된다: 단백질 A 컬럼 (MabSelect) 심층 여과 제품 (Cuno), 양이온 교환 크로마토그래피 (Poros), 벌크 약물 물질 (BDS).
상세한 설명
일반적인 실시형태 "포함하는(comprising)" 또는 "포함된(comprised)"은 더 구체적인 실시형태 "로 이루어진(consisting of)"을 포함한다. 추가로, 단수 및 복수 형태는 제한적인 방식으로 사용되지 않는다. 본원에 사용된, 단수 형태 하나 ("a", "an") 및 상기 ("the")는, 단지 단수를 지정하는 것으로 명시적으로 나타내지 않는 한, 단수 및 복수 둘 다를 지정한다.
본원에 사용된 용어 "샘플"은 재조합 단백질을 포함하는 임의의 샘플을 언급하고, 여기서, 재조합 단백질은 세포 배양물 중 진핵세포에서 생산된다: 적어도 하나의 샘플은, 예를 들면, 수거된 세포 배양 유체 (HCCF) 또는 세포 용해물, 공정-중 제어 (IPC) 샘플, 재조합 단백질, 예를 들면, 항체, 항체 단편, 항체 유도된 분자 또는 융합 단백질 (예를 들면, Fc 융합 단백질)을 포함하는 약물 물질 (또한 본원에서 벌크 약물 물질로서 언급됨) 샘플 또는 약물 제품 샘플일 수 있다. 본원에 사용된, 샘플에 포함된 재조합 단백질은 리파제가 아니고/아니거나, 리파제 활성을 포함하지 않는다. 따라서, 샘플에서 검출된 임의의 리파제 활성은 오염 리파제 활성이고/이거나, 리파제 활성을 갖는 적어도 하나의 오염 단백질, 예를 들면, 진핵세포로부터 유도된 숙주 세포 단백질 (HCPs)로부터 유도된다.
본원에 사용된 용어 "오염(contaminating)" 또는 "오염(contamination)"은, 비-지질분해성 활성을 갖는 관심 대상 단백질 또는 의학적 치료를 위한 단백질, 예를 들면, 항체 또는 또는 항체-유사 화합물과 같은 다른 우세하게 생산된 물질과 비교하여, 미량 성분으로서만 간주될 수 있는, 목적하지 않는 및/또는 의도되지 않는 물질, 예를 들면, 지질분해성 활성을 동반하는 숙주 세포 단백질 및/또는 가수분해 활성, 예를 들면, 리파제 활성을 갖는 적어도 하나의 단백질 또는 물질의 존재를 언급한다. 본 발명의 문맥에서, 가수분해 및 특히 리파제 활성은, 재조합 단백질과 공동-정제될 수 있는 이의 폴리소르베이트 분해 가능성 때문에 바람직하지 않다. 이는 특히 유리하게는, 총 단백질 함량과 비교하여, 이러한 원치 않는 인자를 단지 1% (w/w) 미만, 바람직하게는 0.1% (w/w) 미만, 보다 바람직하게는 0.01% (w/w) 미만까지 포함하는 최종 제형화된 단백질 제제에 적용된다.
용어 "리파제 활성"은, 본원에 사용되는 경우, 지방산 에스테르와 같은 지질에서 에스테르 결합의 가수분해를 촉매화하는 물질, 전형적으로 단백질 (효소)의 활성을 언급한다. 리파제는 에스테르를 화학적 반응에서 물을 사용하여 산 및 알콜로 분해하는 하이드롤라제 효소이고, 또한 가수분해로서 언급된다. 리파제는, 예를 들면, 카복실산 에스테르 하이드롤라제 (EC 3.1.1), 예를 들면, 카복실에스테라제 (EC 3.1.1.1), 트리아실글리세롤 리파제 (EC 3.1.1.3), 포스포리파제 A2 (EC 3.1.1.4), 리소포스포리파제 (EC 3.1.1.5), (EC 3.1.1.23), 갈락토리파제 (EC 3.1.1.26), 포스포리파제 A1 (EC 3.1.1.32), 지질단백질 리파제 (EC 3.1.1.34) 또는 호르몬-민감성 리파제 (EC 3.1.1.79); 인산 디에스테르 하이드롤라제 (EC 3.1.4), 예를 들면, 포스포리파제 D (EC 3.1.4.4), 포스포이노시티드 포스포리파제 C (EC 3.1.4.11), 글리코실포스파티딜이노시톨 포스포리파제 D (EC 3.1.4.50) 또는 N-아세틸포스파티딜에탄올아민-가수분해되는 포스포리파제 D (EC 3.1.4.54); 또는 글리코스핑고리피드 데아실라제 (EC 3.5.1.69)일 수 있다.
용어 "단백질"은 "아미노산 서열" 또는 "폴리펩타이드"와 상호교환적으로 사용되고, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 언급한다. 이들 용어는 또한, 이에 제한되는 것은 아니지만, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화, 당화 또는 단백질 프로세싱을 포함하는 반응을 통해 번역-후 변형된 단백질을 포함한다. 변형 및 변화, 예를 들면, 다른 단백질로 융합, 아미노산 서열 치환, 결실 또는 삽입은, 폴리펩타이드의 구조 내에서 수행될 수 있고, 동시에 분자는 이의 생물학적 관능적 활성을 유지한다. 예를 들면, 특정 아미노산 서열 치환은 폴리펩타이드 또는 이의 기저 핵산 코딩 서열에서 수행될 수 있고, 단백질은 동일한 성질로 얻을 수 있다.
본원에 사용된 용어 "재조합 단백질"은 재조합 기술, 예를 들면, 분자 클로닝에 의해 생성된 단백질을 언급하고, 또한 관심 대상 재조합 단백질로서 언급될 수 있다. 본원에 사용된, 재조합 단백질은, 예를 들면, 샘플에서 정제되는 관심 대상 단백질이다. 이러한 방법은 다중 공급원으로부터 유전 물질에서 야기하거나, 천연으로 존재하지 않는 서열을 생성한다. 재조합 단백질은 전형적으로 CHO 세포 또는 HEK 293 세포와 같은 세포 배양물 중 단백질의 생산에서 사용되는 수령자 숙주 세포와 상이한 세포 또는 유기체 또는 상이한 종으로부터의 서열을 기초로 하거나, 인공 서열, 예를 들면, 융합 단백질을 기초로 한다. 본 발명의 문맥에서, 재조합 단백질은 관심 대상 단백질, 바람직하게는 치료학적 단백질, 예를 들면, 항체, 항체 단편, 항체 유도된 분자 (예를 들면, scFv, 이중- 또는 다중-특이적 항체) 또는 융합 단백질 (예를 들면, Fc 융합 단백질)이다. 따라서, 하나의 실시형태에서, 재조합 단백질은 항체, 항체 단편, 항체 유도된 분자 및 융합 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본원에 사용된 용어 "진핵세포"는 핵 외피 내에 핵를 갖고, 동물 세포, 사람 세포, 식물 세포 및 효모 세포를 포함하는 세포를 언급한다. 본 발명에서, "진핵세포"는 특히 포유동물 세포, 예를 들면, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 HEK293 세포 유래 세포, 및 효모 세포를 포함한다.
"약물 물질 (DS)" 또는 "벌크 약물 물질 (BDS)"은 본원에서 동의어로 사용되고, 부형제와 함께 제형화된 활성 약제학적 성분 (API)을 언급한다. API는, API의 전달을 돕는 부형제와는 대조적으로 체내에서 치료학적 효과를 갖는다. 생물학적 치료제의 경우, 부형제와 함께 제형화된 API는 전형적으로, 또한 약물 제품으로 언급되는, 최종 투여량(dosage) 형태로 사용되는 최종 제형 완충액에서 적어도 최대 농도의 농도의 API를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "약물 제품"은 DP로서 축약되고, 약물 물질의 최종 시판되는 투여량 형태, 예를 들면, 정제 또는 캡슐 또는 생물학적제제인 경우 전형적으로 적합한 용기, 예를 들면, 바이알 또는 주사기 내에 주사용 용액로 언급된다. 약물 제품은 또한 동결건조 형태로 존재할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리소르베이트 20"은 폴리에톡실화 소르비탄 및 라우르산 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트)로부터 유도된 비-이온성 폴리소르베이트-타입 계면활성제를 언급한다. 이는 또한 Tween 20로서 공지되어 있다. 이의 안정성 및 비교적 비-독성은 다수의 국내, 과학적 분석에서 이것이 계면활성제 및 유화제로서 사용되는 것을 허용한다. 폴리소르베이트 20은 면역검정, 웨스턴 블롯 및 ELISA에서 세척제로서 사용할 수 있다. 이는 추가로 약리학적 적용, 예를 들면, 약제학적 제형에서, 특히 생물학적제제, 예를 들면, 항체 및 Fc-융합 단백질을 위해 사용할 수 있다. 특히 이는 비-특이적 항체 결합을 예방하는 것을 돕는다.
본원에 사용된 용어 "폴리소르베이트 80"은 폴리에톡실화된 소르비탄 및 올레산 (폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올레에이트)으로부터 유도된 비-이온성 폴리소르베이트 타입 계면활성제를 언급한다. 이는 또한 Tween 80로서 공지되어 있고, 폴리소르베이트 20와 유사한 용도를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "치료학적 단백질"은 사람 및/또는 동물의 의학적 치료에 사용될 수 있는 단백질을 언급한다. 이들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 항체, 성장 인자, 혈액 응고 인자, 백신, 인터페론, 호르몬 및 융합 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "생산된(produced)"은 진핵세포, 바람직하게는 효모 세포 또는 포유동물 세포 중, 세포 배양물 중 재조합 단백질, 바람직하게는 치료학적 단백질의 생산에 관한 것이다. 당해 기술분야의 숙련가는 발효를 사용한 세포 중 재조합 단백질의 생산 방법을 알고 있다. 재조합 단백질의 생산은 세포 배양물 중 관심 대상 재조합 단백질을 발현하는 진핵세포를 배양함을 포함한다. 세포 배양물 중 재조합 단백질을 발현하는 진핵세포를 배양하는 것은 진핵세포를 적합한 배지에서 및 성장 및/또는 단백질 생산/발현을 가능하게 하는 조건하에 유지함을 포함한다. 재조합 단백질은 공급-배치(fed-batch) 또는 연속식 세포 배양으로 생산될 수 있다. 따라서, 진핵세포는 공급-배치 또는 연속식 세포 배양 또는 이의 조합으로, 바람직하게는 공급-배치 세포 배양에서 배양될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "재조합 단백질을 발현함"은, 세포 배양물 중 재조합 단백질의 생산을 야기하는, 번역-후 변형을 포함하는 단백질 서열 내로 전사 및 번역되는 재조합 단백질에 대한 DNA 서열 코딩을 포함하는 세포를 언급한다.
본원에 사용된 용어 "약"은 명시된 값의 10%의 변동을 언급하고, 예를 들면, 약 50%는 45 내지 55%의 변동을 포함한다.
리파제 활성을 검출하는 방법
본 발명은 하기 단계를 포함하는 재조합 단백질을 포함하는 샘플에서 (시험관내) 리파제 활성을 검출하는 방법에 관한 것이다: (a) 진핵세포에서 생산된 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 제공하는 단계; (b) 적어도 하나의 샘플을 반응 용액과 접촉시켜 반응 혼합물을 형성하는 단계, 여기서, 반응 용액은 하기한 것을 포함한다: (i) 약 pH 4 내지 약 pH 9의 pH를 갖는 완충액, (ii) 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 계면활성제, 여기서, 계면활성제는 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제임, (iii) 발색단 4-메틸움벨리페릴 (4-MU)을 4-MU 에스테르 형태로 포함하는 기질, 여기서, 4-MU 에스테르는 포화 비분지형-쇄 지방산 (C6-C16) 4-MU 에스테르임, 및 (iv) 임의로, 비-완충 염; (c) 반응 혼합물 중 샘플 및 기질을 인큐베이팅하는 단계; (d) 4-MU 에스테르 (기질)의 가수분해를 측정하여 리파제 활성을 검출하고, 방출된 발색단 4-MU (이는 4-MU 에스테르 가수분해 생성물임)의 형광 강도을 검출하는 단계; 임의로, 단계 (c)에 따라 상기 반응 혼합물 중 상기 샘플 및 상기 기질을 인큐베이팅하면서, 상기 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 경시적으로 검출하여 가수분해를 측정하는 단계. 상기 방법은 적어도 하나의 샘플에 대한 가수분해를 측정하여 입수된 데이터를 분석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용된 반응 용액은 수성 반응 용액이다. 당해 기술분야의 숙련가는 또한 적어도 하나의 샘플이 세포 배양물 중 진핵세포에서 생산된 재조합 단백질을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 추가로, 본 발명에 따른 방법은 오염 리파제 활성을 검출하기 위한 것이고, 단계 (d)에서 검출된 리파제 활성은 재조합 단백질, 보다 특히 관심 대상 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플에서 오염 리파제 활성이다.
검정 판독은 20분만큼 신속할 수 있거나 심지 더 빠를 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 반응 혼합물 중 샘플 및 기질을 5 시간 미만, 3 시간 미만, 2 시간 미만, 또는 0.5 시간 미만 동안 인큐베이팅한다. 충분한 데이터 포인트를 입수하기 위해, 반응 혼합물 중 샘플 및 기질을 적어도 1 분, 적어도 2 분 또는 적어도 5 분 동안 인큐베이팅하는 것이 권고된다. 따라서, 반응 혼합물 중 샘플 및 기질을 2 분 내지 5 시간 미만, 3 시간 미만, 2 시간 미만, 또는 0.5 시간 미만 동안 임의의 기간 동안 인큐베이팅할 수 있다. 적어도 하나의 샘플은 HCCF, 공정-중 제어 (IPC) 샘플, 약물 물질 또는 약물 제품일 수 있다. 본 발명에 따라서 샘플에서 재조합 단백질은 리파제가 아니고/아니거나, 리파제 활성을 포함하지 않는다. 더욱이, 본 발명의 방법에 따른 샘플에서 재조합 단백질은 에스테라제 또는 하이드롤라제가 아니고/아니거나, 에스테라제 또는 하이드롤라제 활성을 포함하지 않는다. 따라서, 적어도 하나의 샘플에서 검출된 임의의 리파제 활성은 오염 리파제 활성이고/이거나, 리파제 활성을 갖는 적어도 하나의 오염 단백질, 예를 들면, 진핵세포로부터 유도된 하나 이상의 숙주 세포 단백질 (HCPs)로부터 유도된다. 따라서, 진핵세포에서 생산된 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플은 리파제 활성을 갖는 적어도 하나의 오염 단백질을 잠재적으로 추가로 잠재적으로 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 상기 방법은 단계 (a)에서 세포 배양물 중 진핵세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서 생산된 재조합 단백질, 및 숙주 세포 단백질 (HCPs)을 을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 제공하고; 단계 (d)에서 4-MU 에스테르의 가수분해를 측정하여 상기 HCPs의 리파제 활성을 검출하고, 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 검출함을 포함한다.
기질은 포화 비분지형-쇄 지방산 (C6 내지 C16) 4-MU 에스테르 형태의 발색단 4-MU를 포함하고, 여기서, 포화 비분지형-쇄 지방산의 아실 쇄는 C6 내지 C16 탄소 원자를 갖는다. 이러한 기질은 폴리소르베이트의 임계 에스테르 결합, 즉, 지방산 에스테르 결합을 모사한다.
가수분해를 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도의 검출 전에 특정 시점에 정지할 수 있다. 대안적으로 및 바람직하게는, 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도는, 4-MU 에스테르의 가수분해를 중지시키지 않고 실-시간 검출될 수 있다. 특정 실시형태에서, 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도는, 4-MU 에스테르의 가수분해를 중지시키지 않고 검출된다. 특정 실시형태에서, 가수분해를, 단계 (c)에 따라 상기 반응 혼합물 중 상기 샘플 및 상기 기질을 인큐베이팅하면서, 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 경시적으로 검출하여 측정한다.
실-시간 검출은 가수분해를 경시적으로 측정하는 것을 가능하게 하고, 따라서, 특이적 반응 속도를 측정할 수 있다. 본 발명에 따른 방법에서 반응 혼합물 중 4-MU 에스테르의 가수분해는 전형적으로 유사-0차(pseudo-zero order) 반응 속도를 따른다. 따라서, 실-시간 형광 검출은 유사-0차 반응 속도로 시간-프레임 내에 측정을 가능하게 한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 경시적으로 검출하고, 유사-0차 반응 속도에 따른다. 임의로, 유사-0차 반응 속도의 요구조건을 충족하지 않는 반응 혼합물은 분석에서 제외된다. 유사-0차 반응 속도를 선형 회귀 분석으로 평가할 수 있다. 바람직하게는, 샘플은 적어도 삼중으로 수행하고, 개별적인 반응 혼합물은, 이들이 웰 내 기포 등 때문에 유사-0차 반응 속도를 충족하지 않는 경우, 분석에서 제외하여 이상치를 제거한다. 상기한 이상치를 제거하는 것은 검정의 민감성을 강력하게 증가시킨다. 정의된 농도의 4-MU를 사용한 교정 곡선을 사용하여 가수분해 속도 (예를 들면, nmol/s)를 계산할 수 있다. 공지된 4-MU 농도를 사용한 교정 곡선은 추가로 상이한 pH에서 값에서 반응 속도의 결정 및 비교를 가능하게 한다.
본원에 사용된 용어 "반응 속도"는 특이적 기간 내에 기질을 적어도 하나의 생성물로 전환시키는 효소의 속도를 언급한다. 일부 반응에서, 속도는 명백하게 반응물 농도에 독립적이다. 이는 방정식의 속도는 반응 속도 상수, k와 동일함을 의미하고, 0-차 반응을 언급한다. 0-차 속도론은 항상 반응이 수행되는 조건의 인공물(artefact)이다. 이러한 이유로, 0-차 속도론에 따르는 반응은 종종 종종 의사(pseudo)-0-차 반응으로 언급된다.
본 발명에 따른 방법은 추가로 상대 형광 단위 (RFU)로서 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 검출하고, 방출된 발색단 4-MU (mol/s)의 양을 측정하고 4-MU의 정의된 농도를 사용하여 생성된 교정 곡선과 이를 비교하여 가수분해 속도를 결정함을 포함할 수 있다. 전형적으로, 활성은 nmol/min 단위의 4-MU의 방출에 의해 측정된다. 대안적으로 또는 추가로 상대값은 내부 표준과 비교하여, 예를 들면, 또다른 샘플 또는 바람직하게는 시판되는 리파제, 예를 들면, 양성 대조군으로서 역할을 하는 돼지 췌장 리파제 (PPL)과 비교하여 계산할 수 있다.
반응 혼합물 중 샘플 및 기질의 인큐베이션은 리파제 활성을 갖는 잠재적으로 존재하는 적어도 하나의 오염 단백질을 4-MU 에스테르를 가수분해하게 한다. 인큐베이션은 전형적으로 수분 내지 수시간까지이다. 하나의 실시형태에서, 가수분해를 단계 (c)에 따라 상기 반응 혼합물 중 상기 샘플 및 상기 기질을 인큐베이팅하면서, 즉, 인큐베이션 동안 실-시간으로, 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 경시적으로 검출하여 측정한다. 검정의 민감성 때문에, 검출은 전형적으로 단계 (b) 후 즉시 시작된다. 인큐베이션 및 이에 따른 검출 시간은 샘플에 존재하는 리파제 활성에 좌우될 수 있고, 전형적으로 5 시간, 바람직하게는 3 시간을 넘치 않는다. 특정 실시형태에서, 반응 혼합물 중 샘플 및 기질을 5 시간 미만, 3 시간 미만, 2 시간 미만, 1 시간 미만, 또는 0.5 시간 미만 동안 인큐베이팅한다. 충분한 데이터 포인트를 입수하기 위해, 반응 혼합물 중 샘플 및 기질을 적어도 약 1 분, 적어도 약 2 분 또는 적어도 약 5 분 동안 인큐베이팅할 것이 권고된다. 따라서, 반응 혼합물 중 샘플 및 기질을 약 2 분 내지 5 시간 미만, 3 시간 미만, 2 시간 미만, 또는 0.5 시간 미만의 임의의 기간 동안 인큐베이팅할 수 있다. 바람직하게는, 반응 혼합물 중 샘플 및 기질을 20 분 내지 2 시간 동안 약 25℃의 온도에서 인큐베이팅한다. 반응 온도가 반응 시간에 영향을 줄 수 있기 때문에, 반응 온도는 예를 들면, 20 내지 37℃, 바람직하게는 22 내지 28℃, 보다 바람직하게는 24 내지 26℃의 일정한 온도로 측정 동안 일정하게 유지되어야 한다. 하나의 실시형태에서, 반응 혼합물 중 샘플 및 기질을 5 시간 미만, 3 시간 미만, 2 시간 미만 또는 1 시간 미만 동안 20 내지 37℃, 바람직하게는 22 내지 28℃, 보다 바람직하게는 24 내지 26℃의 일정한 온도에서 또는 약 2 분 내지 5 시간 미만, 3 시간 미만, 2 시간 미만 또는 1 시간 미만의 임의의 기간 동안 20 내지 37℃, 바람직하게는 22 내지 28℃, 보다 바람직하게는 24 내지 26℃의 일정한 온도에서 인큐베이팅한다.
발색단 4-MU를 포함하는 기질은 포화 비분지형-쇄 지방산 (C6 내지 C16) 4-MU 에스테르 형태이고, 여기서, 포화 비분지형-쇄 지방산의 아실 쇄는 C6 내지 C16 탄소 원자를 갖는다. 이러한 기질은 폴리소르베이트, 즉, 지방산 에스테르 결합 및 긴 아실 쇄의 주요한 특징을 모사한다. 폴리소르베이트 20은 지방산 라우르산의 에스테르, 포화 비분지형-쇄 지방산이다. 이와 비교하여 폴리소르베이트 80은 지방산 올레산의 에스테르, 불포화 지방산이다.
불포화 지방산은 이중 결합(들) 때문에 포화 지방산보다 더 크고(bulky), 추가 분지-쇄 지방산은 비분지형-쇄 지방산과 비교하여 더 크다. 재조합 단백질을 포함하는 샘플에서 리파제 활성은 하나 이상의 리파제 또는 다른 가수분해 효소에 의해 중재될 수 있고, 다양한 생성물, 예를 들면, 개별적인 항체 간에 상이하다 (도 2 참조). 따라서, 대부분의 경우, 리파제 활성을 갖는 오염 단백질(들)은 공지되어 있고, 하나 초과의 단백질의 혼합물일 수 있다. 다수의 리파제, 예를 들면, 트리아실글리세롤 리파제는, 개방 상태 또는 폐쇄 상태일 수 있고, 반면, 활성 부위는 폴리펩타이드 쇄, 덮개 또는 뚜껑의 부분에 의해 용매로부터 차폐된다. 따라서, 다수의 리파제의 활성 부위는, 아마도 기질 특이성을 결정하는 캐비티(cavity) 또는 배럴(barrel)의 내부와 유사하다. 배지 길이로 존재하는 포화 비분지형-쇄 지방산 (더 적은 크기 지방산)의 에스테르는, 따라서, 예를 들면, 본 발명의 방법에서 사용되는 더 긴 불포화 아실 쇄을 갖는 올레에이트와 비교하여 더 광범위한 효소 범위를 포획하는 경향이 있다. 바람직하게는 기질은 PS20 또는 PS80와 비교하여 동일하거나 더 광범위한 효소 범위를 포획한다.
추가로, 더 짧은 아실 쇄를 갖는 지방산 에스테르는 더 긴 쇄 길이 지방산 에스테르와 비교하여 수-계 반응 혼합물에서 더 우수한 용해성을 제공한다. 결과적으로, 더 큰 기질을 검정 믹스에서 사용될 수 있다. 보다 특히, 용해성은 C16 이상의 쇄 길이에서 더 강하게 제한되는 것으로 밝혀졌다.
추가로, 데카노에이트 에스테르 (4-MUD)가, 예를 들면, 부티레이트 에스테르 (4-MUB)와 비교하여, 자가-가수분해에 대해 더 우수한 저항성을 제공하는 것으로 밝혀졌다. C5 이하의 쇄 길이가 자가-가수분해를 강력하게 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 4-MUD에서 C10 지방산은 예로서 사용하기 위해 최적인 것으로 발견되지만, 약간 더 길거나 짧은 포화 비분지형 지방산 에스테르, 예를 들면, 포화 비분지형-쇄 지방산 (C6 내지 C16) 4-MU 에스테르 또는 보다 바람직하게는 포화 비분지형-쇄 지방산 (C8 내지 C12) 4-MU 에스테르는 본 발명에 따른 방법에서 유사하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 4-MU 에스테르는 C6 내지 C16 탄소 원자의 포화 비분지형-쇄 지방산의 아실 쇄를 갖는다. 보다 바람직하게는, 지방산은 배지-쇄 지방산이고, 4-MU 에스테르는 포화 비분지형-쇄 지방산 (C8 내지 C12) 4-MU 에스테르이다. 특정 실시형태에서, 기질은 4-메틸움벨리페릴 옥타노에이트, 4-메틸움벨리페릴 노나노에이트, 4-메틸움벨리페릴 데카노에이트 (4-MUD), 4-메틸움벨리페릴 운데카노에이트 및 4-메틸움벨리페릴 도데카노에이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 특정 실시형태에서, 기질은 4-메틸움벨리페릴 옥타노에이트, 4-메틸움벨리페릴 데카노에이트 (4-MUD) 및 4-메틸움벨리페릴 도데카노에이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 더 바람직한 실시형태에서, 기질은 4-MUD이다. 기질은 전형적으로 유기 용매, 예를 들면, 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 또는 디메틸 포름아미드 (DMF), 바람직하게는 DMSO 중 스톡 용액 (예를 들면, 반응 혼합물 중 농도에 비해 100x 스톡 용액)으로서 용해된다. 특정 실시형태에서, 기질은 DMSO 또는 DMF, 바람직하게는 DMF로부터 선택된 유기 용매 중 용해된 스톡 용액으로 제공된다.
본 발명에서 적합한 기질 농도는 약 1 μM 내지 약 1 mM일 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 기질은 약 1 μM 내지 약 1 mM, 바람직하게는 약 1 μM 내지 300 μM, 바람직하게는 1 μM 내지 30 μM, 보다 바람직하게는 약 3 μM 내지 30 μM의 반응 혼합물 중 최종 농도로 제공된다. 특정 실시형태에서, 기질은 유기 용매 중 스톡 용액으로서 제공되고, 여기서, 스톡 용액은 반응 믹스의 약 1% 내지 약 5%(v/v)로 첨가된다.
본 발명에 따른 방법은 적어도 하나의 샘플을 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 계면활성제을 포함하는 반응 용액과 접촉시킴을 포함하고, 여기서, 계면활성제는 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제이다 (또한 "에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제"로서 언급됨). 본원에 사용된 용어 "계면활성제"는 2개의 액체 간의, 기체 및 액체 간의 및 액체 및 고체 간의 표면 장력을 낮추는 미쉘을 형성할 수 있는 표면-활성 화합물을 언급한다. 계면활성제는 또한 본원에 계면활성제로서 언급될 수 있다. 계면활성제는 양친매성(amphiphilic)이고, 즉, 소수성 그룹 (테일) 및 친수성 그룹 (헤드) 둘 다를 포함한다. 계면활성제는 전형적으로 유기 화합물이다. 수성 상에서, 계면활성제는 응집물, 예를 들면, 미쉘을 형성하고, 여기서, 소수성 테일은 응집물의 코어를 형성하고, 친수성 헤드는 주위 수성 액체와 접촉하는 상태이다. 소수성 테일 (또한 소수성 탄화수소 모이어티)은 따라서 미쉘을 형성하는 특정 길이를 갖는다. 따라서, 본원에 사용된 계면활성제는 유기 용매, 예를 들면, 에탄올 또는 디메틸설폭시드 (DMSO)를 포함하지 않는다. 대부분 계면활성제의 테일은 전형적으로 분지형, 선형 또는 방향족일 수 있는 하나 이상의 탄화수소 쇄로 이루어진다. 계면활성제는 하나 이상의 소수성 테일을 포함할 수 있고, 바람직하게는 계면활성제는 하나의 소수성 쇄 (단일-테일드 계면활성제)를 포함한다. 계면활성제는 통상 친수성 헤드 그룹에 따라서 분류된다. 비-이온성 계면활성제는 이들의 헤드에서 어떠한 하전된 그룹도 갖지 않고, 이온성 계면활성제는 순 양성 (양이온성), 또는 음성 (음이온성) 전하를 갖고, 쯔비터이온성 계면활성제는 2개의 반대로 하전된 그룹을 포함한다. 따라서, 비-이온성 또는 쯔비터이온성 계면활성제는 친수성 헤드 그룹에서 순전하(net charge)를 갖기 않고, 따라서 천연에서 더 마일드(milder)하다. 더욱이, 다수의 계면활성제에서 소수성 테일은 PS20 또는 PS80에서와 같이 친수성 헤드에 에스테르 결합을 통해 링크된다. 더욱이, 비-이온성 또는 쯔비터이온성 계면활성제는 비-변성 계면활성제이다. 본원에 사용된 용어 "비-변성 계면활성제"는 단백질 구조에 대해 계면활성제의 효과를 언급한다. 비-변성 계면활성제는 단백질-단백질 상호작용을, 특히 수용성 단백질의 상호작용을 방해하지 않는다.
에스테르 결합을 포함하는 계면활성제는 리파제에 대한 잠재적 기질이고, 따라서 검정을 간섭할 수 있다. 더욱이, 리파제 활성을 갖는 단백질의 변성, 및 이에 따른, 샘플에서 리파제 활성에 따른 간섭은 예방되어야 한다. 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 계면활성제는 따라서 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 계면활성제이고, 여기서, 계면활성제는 비-이온성 또는 쯔비터 이온성 계면활성제이다. 적합한 비-변성 쯔비터-이온성 계면활성제의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트 (CHAPS), 3-([3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-2-하이드록시-1-프로판설포네이트 (CHAPSO), CHAPS 유사체 (예를 들면, Big CHAP N,N-비스-(3-D-글루콘아미도프로필)데옥시콜아미드), 쯔비터젠트 (상이한 길이, 예를 들면, n-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트 (쯔비터젠트 3-12)) 및 3-[N,N-디메틸(3-팔미토일아미노프로필)암모니오]-프로판설포네이트 또는 다른 아미도설포베타인 계면활성제이다. 적합한 비-변성, 비-이온성 계면활성제의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 피라노시드 계면활성제 (예를 들면, 옥틸 β-D-글루코피라노시드 (OGP), 노닐 β-D-글루코피라노시드, 도데실 β-D-말토피라노시드 (DDM) 또는 옥틸 β-D-티오글루코피라노시드), 폴리옥시에틸렌 (23) 라우릴 에테르 (Brij 35) 또는 다른 폴리옥시에틸렌 에테르; 사포닌 (예를 들면, Digitonin), 옥틸페녹시 폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-630), 폴록사머 188, 338, 407 또는 테르기톨이다. 특정 실시형태에서, 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 계면활성제 (비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제)는 에톡실레이트이고/이거나, 폴리에틸렌 글리콜 그룹을 포함하지 않고/않거나, 방향족 환을 포함하지 않는다. 특정 실시형태에서, 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제는 옥톡시놀-9가 아니고, 특히 폴리에틸렌 글리콜 3급-옥틸페닐 에테르 (Triton X-100, CAS No. 9002-93-1) 및/또는 폴리에틸렌 글리콜 노닐페닐 에테르 (NP-40, CAS No. 9016-45-9)가 아니다. 바람직한 실시형태에서, 계면활성제는 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 계면활성제이고, 여기서, 계면활성제는 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제이고, 보다 바람직하게는 계면활성제는 CHAPS (CAS No. 75621-03-3 또는 이의 수화물 CAS No. 331717-45-4), CHAPSO (CAS No. 82473-24-3), 쯔비터젠트 (예를 들면, 쯔비터젠트 3-12; CAS No. 14933-08-5) 및 사포닌 (CAS No. 8047-15-2), 바람직하게는 CHAPS로 이루어진 그룹으로부터 선택된 비-변성 계면활성제 (비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제)이다. 이들 예시적인 적합한 계면활성제 중 어느 것도 에스테르 결합 또는 아실 쇄를 나타내지 않고, 따라서 리파제를 위한 기질이 아니다. 이들 계면활성제는 기질과 경쟁하지 않고, 이에 따라, 검정의 민감성에 영향을 주지 않는다. 추가로, 계면활성제의 존재는 기질의 용해성을 물 중 사용되는 농도로 중재한다. 당해 기술분야의 숙련가는. 예를 들면, 실시예 7에서 PS20에 대해 나타낸 바와 같이, 검정 조건하에 4-MU 에스테르 가수분해에 미치는 이의 효과를 결정하여 에스테르-결합을 갖지 않는 추가로 적합한 비-변성 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제를 확인하는 방법을 알 수 있을 것이다.
계면활성제 (예를 들면, 10 mM CHAPS)의 존재는 리파제 활성을 증가시키고, 이에 따라 검정의 민감성을 향상시키는 것으로 나타났다. 이론에 결부시키지 않고, 계면활성제가, 활성 부위를 덮는 것으로 기술되는 뚜껑 또는 덮개의 재배열 및 오프닝을 가능하게 하여, 리파제 활성을 촉진하는 환경을 생성시킨다는 가설을 세운다 (참조: Grochulski P, Li Y, Schrag JD, et al. Protein Sci 1994; 3:82-91 and Grochulski P, Bouthillier F, Kazlauskas RJ, et al. Biochemistry 1994; 33:3494-500). 이러한 효과를 성취하기 위해, 계면활성제는 이의 임계 미셀 농도 (CMC) 초과이어야 한다.
따라서, 본 발명에 따라서 비-변성 계면활성제 (비-이온성 또는 쯔비터-이온성)는 반응 혼합물 중 이의 임계 미셀 농도 (CMC) 초과의 반응 혼합물 중 최종 농도를 갖다. CMC는 수성 용액 중 제공된 계면활성제의 중요한 물리화학적 특징을 나타낸다. 미쉘은 구형 응집물이고, 이의 탄화수소 그룹은 물과 거의 접촉하지 않는다. 본원에 사용된 용어 "임계 미쉘 농도" 또는 "CMC"는 그 위에 미쉘이 형성되는 계면활성제의 농도 (즉, 최대 단량체 농도)를 언급하고, 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 측정될 수 있다. 예를 들면, CMC를 측정하기 위한 적합한 방법은 형광 미쉘 검정 (FMA)이고, 이는 형광 소수성 염료 N-페닐-1-나프틸아민 (NPN)의 계면활성제 미쉘 내로 분할을 사용한다. NPN은, 더 큰 소수성 환경, 예를 들면, 미쉘의 코어에서 증가되는 수성 환경에서 저-형광 양자 수율을 나타낸다. 이러한 검정은 본래 CMC 측정을 위해 개발되었고, 또한 예시로서 생물약제에서 폴리소르베이트의 함량을 측정하기 위해 사용되었다. 미셀화시 1,6-디페닐-l,3,5-헥사트리엔 (DPH) 형광의 향상을 이용하는 대안적인 방법은 챠토파디아이(Chattopadhyay) 및 하리쿠마르(Harikumar) (참조: FEBS Letters 391 (1996) 199-202)에 의해 기술된다.
계면활성제에 대한 CMC는 문헌으로부터 추론할 수 있고, 예를 들면, CHAPS의 경우 약 6 mM, CHAPSO의 경우 약 8 mM, 쯔비터젠트 3-12의 경우 약 2-4 mM이다. 특정 실시형태에서, 비-변성 쯔비터-이온성 계면활성제는 CHAPS이고, 약 8 mM 내지 약 20 mM, 바람직하게는 약 8 mM 내지 약 15 mM, 보다 바람직하게는 약 10 mM의 반응 혼합물 중 최종 농도로 제공된다. 다른 실시형태에서, 비-변성 쯔비터-이온성 계면활성제는 CHAPSO이고, 약 10 mM 내지 약 20 mM, 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 15 mM의 반응 혼합물 중 최종 농도로 제공된다. 또한 또다른 실시형태에서, 비-변성 쯔비터-이온성 계면활성제는 쯔비터젠트 3-12이고, 약 4 mM 내지 약 10 mM, 바람직하게는 약 6 mM 내지 약 8 mM의 반응 혼합물 중 최종 농도로 제공된다. 또한 또다른 실시형태에서, 비-변성 비-이온성 계면활성제는 사포닌이고, 약 0.001% 내지 0.01% (w/v)의 반응 혼합물 중 최종 농도로 제공된다.
본 발명에 따른 방법에 사용된 반응 용액은 추가로 약 pH 4 내지 약 pH 9의 pH를 갖는 완충액을 포함한다. 바람직하게는 상기 방법은 약 pH 4 내지 약 pH 8, 바람직하게는 약 pH 5 내지 약 pH 7.5, 보다 바람직하게는 약 pH 5.5 내지 약 pH 7.5의 pH를 갖는 완충액을 사용하여 수행한다. 당해 기술분야의 숙련가는 완충액의 pH가 본 발명의 방법에서 사용되는 이의 완충 범위 이내인 것을 이해할 것이다. 원칙적으로 당해 기술분야에 공지된 임의의 완충액을 사용할 수 있고, 단, 약 pH 4 내지 약 pH 9 이내의 완충 범위를 갖는다. 완충액은 단일 완충액 물질을 포함할 수 있거나, 다성분 완충액일 수 있다. 다성분 완충액은 전형적으로 더 광범위한 완충 범위를 갖는다. 예를 들면, 완충액은 포름산, 아세트산, 락트산, 시트르산, 말산, 말레산, 글리신, 글리실글리신, 석신산, TES (2-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}에탄설폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판설폰산), PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), MES (2-(N-모르폴리노)에탄설폰산), 트리스 염기, 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스-프로판, 비신 (N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신), HEPES (4-2-하이드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산), TAPS (3-([트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}프로판설폰산), 트리신 (N-트리스(하이드록시메틸)메틸글리신), Na2HPO4 및 NaH2PO4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 완충액 물질을 포함할 수 있다. 바람직하게는 완충액은 포스페이트 완충액 (Na2HPO4 및 NaH2PO4), 트리스 완충액 또는 HEPES 완충액이다. 특정 실시형태에서, 완충액은 약 50 내지 400 mM, 바람직하게는 약 50 내지 300 mM 보다 바람직하게는 약 50 내지 200 mM의 농도를 갖는다.
완충액은 추가로 더 광범위한 완충 범위를 갖기 위해 완충 범위가 중첩되는 하나 초과의 완충액 물질을 포함하는 다성분 완충액일 수 있다. 완충액은, 예를 들면, 2, 3, 4, 5개 이상의 완충 물질, 바람직하게는 2개의 완충 물질, 보다 바람직하게는 3개의 완충 물질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 다-성분 완충액은 2 내지 4개의 완충 물질, 3 내지 4개의 완충 물질, 보다 바람직하게는 3개의 완충 물질을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 다-성분 완충액은 완충 범위가 중첩되는 적어도 3개의 완충액 물질을 포함하고, 바람직하게는 트리스, MES 및/또는 아세트산 중 적어도 하나를 포함하고, 바람직하게는 아세트산, MES 및 트리스를 1:1:2의 비로 포함한다.
검정이 이온성 강도에 민감성인 것으로 판명되었기 때문에, 완충액 범위가 중복되는 완충액 물질을 포함하는 것 뿐만 아니라, 완충액이 상이한 pH에서 (pH 4-8 범위) 이온성 강도를 온건하게 (15% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만) 변화시키는 적합한 다-성분 완충액의 설계가 중요하다 (참조: Ellis KJ, Morrisson JF, 1982. Methods in Enzymology, 87: 405-426). 예를 들면, 아세트산, MES 및 트리스를 포함하는 AMT 완충액은 예를 들면, 가수분해 활성을 감소시키는 pH 조건을 포함하는 조건을 확인하기 위해 이온성 강도에 단지 온건하게 영향을 미치는, 상이한 pH에서 완충액의 사용을 가능하게 한다. 이러한 완충액은 추가로, 샘플에 존재하는 특정 조건에서 리파제 활성을 측정하기 위한 뿐만 아니라 정제 동안 상이한 상태에서 리파제 활성을 비교하기 위한 샘플의 pH에서 측정을 가능하게 한다. 검정은 추가로 최적 pH에서 샘플을 측정하여 민감성을 증가시킨다.
따라서, 본원에 개시된 다-성분 완충액은 적어도 약 pH 4 내지 적어도 약 pH 8 또는 적어도 약 pH 4 내지 적어도 약 pH 9의 다양한 pH에서 완충액의 사용을 가능하게 한다. 대안적으로 또는 추가로, 약 pH 4 내지 약 pH 9의 상이한 pH 값을 갖는 완충액의 사용은 15% 미만, 바람직하게는 10% 미만 또는 심지어 7.5% 미만 또는 5% 미만, 예를 들면, 0% 내지 15% 미만, 0% 내지 10% 미만, 0% 내지 7.5% 미만 또는 0% 내지 5% 미만, 또는 예를 들면, 2% 내지 15% 미만, 2% 내지 10% 미만, 2% 내지 7.5% 미만 또는 2% 내지 5% 미만까지 완충액의 이온성 강도에 영향을 줄 수 있다. 하나의 실시형태에서, 약 pH 4 내지 약 pH 8의 상이한 pH 값을 갖는 완충액의 사용은 15% 미만, 바람직하게는 10% 미만 또는 심지어 7.5% 미만 또는 5% 미만, 예를 들면, 0% 내지 15% 미만, 0% 내지 10% 미만, 0% 내지 7.5% 미만 또는 0% 내지 5% 미만, 또는 예를 들면, 2% 내지 15% 미만, 2% 내지 10% 미만, 2% 내지 7.5% 미만 또는 2% 내지 5% 미만까지 완충액의 이온성 강도에 영향을 미친다. 본원에 개시된 다-성분 완충액의 사용은 추가로 완충액의 pH를 샘플의 pH (완충액의 완충액 조성의 변경 없이)로 조정하는 것을 가능하게 한다. 본원에 개시된 다-성분 완충액의 사용은 추가로 완충액의 pH를 리파제 활성을 갖는 적어도 하나의 오염 단백질의 거의 최적 근처로 조정하고 (이에 의해 상기 방법의 민감성을 증가시킴) 및/또는 가수분해 활성을 감소시키는 조건을 비교하고 확인할 수 있게 한다.
반응 용액은 추가로 비-완충 염을 포함할 수 있다. 본 발명에서 물 중 분리되고 완충 효과가 없는 임의의 염이 반응 용액의 이온성 강도를 조정하기 위해 적합할 수 있다. 적합한 염의 예는 NaCl, KCl, 또는 CaCl2이다. 본 발명의 특정한 예에서, 비-완충 염은 NaCl, KCl 및 CaCl2로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 비-완충 염은 NaCl 또는 KCl이다.
비-완충 염의 최적 농도는 약 100 mM 내지 약 200 mM 범위 일 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 비-완충 염은 반응 혼합물 중 약 100 mM 내지 약 200 mM, 바람직하게는 약 130 mM 내지 약 170 mM, 보다 바람직하게는 약 140 mm 내지 약 150 mM의 농도를 갖는다. 그러나, 반응 믹스 중 이온성 강도는, 리파제 활성에 부정적인 영향을 미치기 때문에 특정 값을 초과하지 않아야 한다. 예를 들면, 임의의 비-완충 염의 이온성 강도는 바람직하게는 반응 혼합물 중 약 200 mM 이하, 약 190 mM 이하, 약 180 mM 이하, 약 170 mM 이하, 약 160 mM 이하, 또는 약 150 mM 이하, 예를 들면, 약 100 mM 내지 약 200 mM, 바람직하게는 반응 혼합물 중 약 130 mM 내지 약 170 mM, 보다 바람직하게는 약 140 mM 내지 약 150 mM이다. 특정 실시형태에서, 반응 혼합물 중 완충액 및 비-완충 염의 이온성 누적 이온성 강도는 약 450 mM을 초과하지 않는다. 따라서, 반응 혼합물 중 완충액 및 비-완충 염의 누적 이온성 강도는 약 450 mM 이하, 약 400 mM 이하, 약 380 mM 이하, 약 360 mM 이하 또는 약 350 mM 이하일 수 있다. 예를 들면, 반응 혼합물 중 완충액 및 비-완충 염의 누적 이온성 강도는 약 150 mM 내지 약 450 mM 이하, 약 150 mM 내지 약 400 mM 이하, 약 150 mM 내지 약 380 mM 이하, 약 150 mM 내지 약 360 mM 이하 또는 약 150 mM 내지 약 350 mM 이하일 수 있다
본 발명에 따른 방법은 형광 분광계 또는 마이크로플레이트 분광광도계에서 형광성을 검출하기 위해 적합하다 (바람직하게는 λex 330-340 nm, λem 450 nm에서). 따라서, 반응 혼합물을 큐벳 또는 미세역가 플레이트, 바람직하게는 적어도 96-웰 미세역가 플레이트 내에 측정을 위해 포함시킨다 (바람직하게는 혼합한다). 본 발명에 따른 방법은 따라서 샘플의 고 처리량 분석 및/또는 자동화 분석을 위해 특히 적합하다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법에서 적어도 2, 3, 4, 5, 10개 이상의 샘플을 동시에 분석한다. 추가로, 각각의 샘플을 바람직하게는 적어도 삼중으로 측정한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법은 따라서 96 웰 또는 다수의 96 웰을 갖는 미세역가 플레이트를 사용하여 수행된다. 미세역가 플레이트는 단지 단계 (d)에서 가수분해를 측정하기 위해 사용될 뿐만 아니라, 또한 단계 (d)에서 적어도 하나의 샘플을 반응 용액과 접촉시키고 단계 (c)에서 샘플을 기질과 반응 혼합물 중에서 인큐베이팅하기 위해 사용된다. 따라서, 특정 실시형태에서, 샘플은 96 웰 또는 다수의 96 웰을 갖는 미세역가 플레이트 포맷에서 접촉되고, 인큐베이팅되고, 측정된다.
특정 실시형태에서, 샘플은 반응 혼합물의 약 30% (v/v) 이하, 바람직하게는 약 25% (v/v) 이하로 제공된다. 따라서, 샘플은 반응 혼합물의 약 20% (v/v) 내지 약 30% (v/v), 바람직하게는 반응 혼합물의 약 20% (v/v) 내지 약 25% (v/v)로 제공될 수 있다. 임의로 샘플은 사전-희석될 수 있다. 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플은 수거된 세포 배양 유체 (HCCF) 또는 세포 용해물, 공정-중 제어 (IPC) 샘플, 약물 물질 샘플 또는 약물 제품 샘플, 바람직하게는 IPC 샘플, 약물 물질 샘플 또는 약물 제품 샘플일 수 있다. 바람직하게는, 적어도 하나의 샘플을 반응 용액과 접촉시켜 반응 혼합물을 형성하는 것은 적어도 하나의 샘플을 반응 용액과 혼합하여 균질한 반응 혼합물을 수득함을 포함한다. 이는 바람직하게는 더 적은 용적 (전형적으로 샘플)을 처음에 첨가하고, 더 큰 용적 (전형적으로 반응 용액)을 두번째로 첨가하여 수행된다. 바람직하게는, 반응 용액의 성분을 마스터 믹스로서 첨가하고, 여기서, 마스터 믹스를, 샘플에 첨가하기 전에 작동 농도로 희석되는 농축물로서 제조할 수 있다.
추가로, 완충액, 비-변성 계면활성제 (비-이온성 또는 쯔비터-이온성), 및 임의의 비-완충 염을 바람직하게는 반응 혼합물에 비해 적어도 약 3-배 또는 약 3-배 내지 약 5-배 농축된 검정 완충액으로 사전혼합한다. 검정 완충액은 사용 전에 저장될 수 있다. 대안적으로, 검정 완충액은 건조 혼합물로서 제공된다. 이러한 건조 혼합물은 물과 함께 재구성되어 최종 반응 혼합물에 비해 적어도 약 3-배 농축된 또는 약 3-배 내지 약 5-배 농축된 검정 완충액을 제공할 수 있다. 기질을 사용 전에 검정 완충액에 첨가하여 반응 용액을 제공하고; 바람직하게는, 기질을 사용 전에 즉시 검정 완충액에 첨가한다. 따라서, 완충액, 계면활성제, 기질 및 임의의 비-완충 염은 바람직하게는 마스터 믹스로서 사전혼합된다. 마스터 믹스의 성분은 반응 용액 중 성분과 동일하다. 마스터 믹스를, 샘플에 첨가하기 전에 작동 농도로 희석되는 농축물로서 제조할 수 있다.
특정 실시형태에서, 완충액, 비-변성 계면활성제 (비-이온성 또는 쯔비터-이온성), 기질 및 임의의 비-완충 염을 마스터 믹스로서 첨가하고, 여기서, 마스터 믹스는 약 70% (v/v) 이상, 약 75% (v/v) 이상으로 제공된다. 따라서, 마스터 믹스는 약 70% (v/v) 내지 약 80% (v/v), 바람직하게는 약 75% (v/v) 내지 약 80% (v/v)로 제공될 수 있다.
적어도 하나의 샘플은 수거된 세포 배양 유체 (HCCF) 또는 세포 용해물, 공정-중 제어 (IPC) 샘플, 약물 물질 샘플 또는 약물 제품 샘플일 수 있다. 샘플 중 리파제 활성을 검출하기 위한 재조합 단백질은 바람직하게는 치료학적 단백질, 예를 들면, 항체, 항체 단편, 항체 유도된 분자, 융합 단백질 (예를 들면, Fc 융합 단백질), 성장 인자, 사이토킨 또는 호르몬, 바람직하게는 항체, 항체 단편, 항체 유도된 분자 또는 Fc 융합 단백질이다. 따라서, 재조합 단백질은 바람직하게는 분비된 단백질이다. 본원에 사용된 용어 "수거된 세포 배양 유체" 또는 "HCCF"는 수거 후, 즉, 세포로부터 분리 후 세포 배양 상청액을 언급한다. 본 발명에 따라서 샘플에서 리파제 활성을 검출하기 위한 재조합 단백질은 리파제가 아니고/아니거나, 리파제 활성을 포함하지 않는다. 따라서, 적어도 하나의 샘플에서 검출된 임의의 리파제 활성은 오염 리파제 활성이고/이거나, 리파제 활성을 갖는 적어도 하나의 오염 단백질, 예를 들면, 진핵세포로부터 유도된 숙주 세포 단백질 (HCPs)로부터 유도된다. 더욱이, 본 발명의 방법에 따른 샘플에서 재조합 단백질은 에스테라제 또는 하이드롤라제가 아니고/아니거나, 에스테라제 또는 하이드롤라제 활성을 포함하지 않는다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 유리하게는 항체, 항체 단편, 항체 유도된 분자 또는 융합 단백질 (예를 들면, Fc 융합 단백질)을 포함하는 샘플에서 가수분해를 측정하여 리파제 활성을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 전형적으로, 항체는 일-특이적이지만, 항체는 또한 다중-특이적일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 일-특이적 항체, 다중-특이적 항체, 또는 이의 단편, 바람직하게는 항체 (일-특이적), 이특이적 항체, 삼특이적 항체 또는 이의 단편, 바람직하게는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 샘플에 대해 사용될 수 있다. 구체적으로 언급되지 않는 경우, 용어 "항체"는 일-특이적 항체를 언급한다. 본 발명의 범위 내의 예시적인 항체는, 이에 제한되는 것은 아니지만 항-CD2, 항-CD3, 항-CD20, 항-CD22, 항-CD30, 항-CD33, 항-CD37, 항-CD40, 항-CD44, 항-CD44v6, 항-CD49d, 항-CD52, 항-EGFR1 (HER1), 항-EGFR2 (HER2), 항-GD3, 항-IGF, 항-VEGF, 항-TNF알파, 항-IL2, 항-IL-5R, 항-IL-36R 또는 항-IgE 항체를 포함하고, 바람직하게는 항-CD20, 항-CD33, 항-CD37, 항-CD40, 항-CD44, 항-CD52, 항-HER2/neu (erbB2), 항-EGFR, 항-IGF, 항-VEGF, 항-TNF알파, 항-IL2, 항-IL-36R 및 항-IgE 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 실시형태에서, 항체는 항-IL-36R 항체, 특히 스페솔리맙이다. 또다른 실시형태에서, 항체는 항-IL-36R 항체가 아니고, 특히 스페솔리맙이 아니다.
본원에 사용된 용어 "항체", "항체들", 또는 "면역글로불린(들)"은 분화 B-림프구 (혈장 세포)로부터 외래 물질 (=항원)에 대한 숙주 유기체의 반응으로서 천연 형성된 글로불린 중에서 선택된 단백질을 언급한다. 면역글로불린의 다양한 부류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgY, IgW. 바람직하게는 항체는 IgG 항체, 보다 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 항체이다. 용어 면역글로불린 및 항체는 본원에서 상호교환하여 사용된다. 항체는 모노클로날, 일특이적 및 다중-특이적 (예를 들면, 이특이적 또는 삼특이적) 항체, 단일 쇄 항체, 항체의 항원-결합 단편 (예를 들면, Fab 또는 F(ab')2 단편), 디설파이드-링크된 Fv 등을 포함한다. 항체는 임의의 종의 항체일 수 있고, 키메라 및 사람화 항체를 포함한다. "키메라" 항체는 항체 도메인 및 영역이 상이한 종으로부터 유도된 분자이다. 예를 들면, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 래트 또는 마우스 항체로부터 및 사람 항체의 불변 영역으로부터 유도될 수 있다. "사람화" 항체에서 단지 최소 서열이 비-사람 종으로부터 유도된다. 종종 단지 사람 항체의 CDR 아미노산 잔기가 비-사람 종, 예를 들면, 마우스, 래트, 토끼 또는 라마의 CDR 아미노산 잔기로 대체된다. 때때로 항원 결합 특이성 및 친화성에 영향을 미치는 소수의 주요 프레임워크 아미노산 잔기는 또한 비-사람 아미노산 잔기로 대체된다. 항체는 화학적 합성을 통해, 재조합 또는 유전자이식 수단을 통해, 세포 (예를 들면, 하이브리도마) 배양, 또는 다른 수단으로 생산될 수 있다.
전형적으로 항체는 각각 중쇄 및 경쇄로 형성되는 2개의 쌍의 이종이량체로 구성된 4량체성 폴리펩타이드이다. 둘 다의 이종이량체 뿐만 아니라 4량체성 폴리펩타이드 구조의 안정화는 쇄간 디설파이드 브릿지를 통해 일어난다. 각각의 쇄는 "면역글로불린 도메인" 또는 "면역글로불린 영역"으로 칭명되는 구조적 도메인으로 구성되고, 이에 의해, 용어 "도메인" 또는 "영역"은 상호교환적으로 사용된다. 각각의 도메인은 약 70 - 110개의 아미노산을 포함하고, 압밀된 3-차원 구조를 형성한다. 둘 다의 중쇄 및 경쇄는 이들의 N-말단 종점에서 "가변 도메인" 또는 "가변 영역"을 항원 인지 및 결합을 담당하는 더 적은 보존 서열과 함께 포함한다. 경쇄의 가변 영역은 또한 "VL"로서 언급되고, 중쇄의 가변 영역은 "VH"로서 언급된다.
항원-결합 단편은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, "Fab 단편" (단편 항원-결합 = Fab)을 포함한다. Fab 단편은, 인접한 불변 영역에 의해 함께 유지되는, 둘 다의 쇄의 가변 영역으로 이루어진다. 이들은 프로테아제 소화에 의해, 예를 들면, 통상의 항체로부터의 파파인과 함께, 형성될 수 있지만, 유사하게는 Fab 단편은 또한 유전 조작에 의해 생산될 수 있다. 추가 항체 단편은, 펩신으로 단백질분해 절단하여 제조될 수 있는, F(ab')2 단편을 포함한다.
유전 조작 방법을 사용하여 단지 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역으로 이루어진 단축된 항체 단편을 생성하는 것이 가능하다. 이들은 Fv 단편 (가변 단편 = 가변 부분의 단편)으로 언급된다. 이들 Fv-단편은 불변 쇄의 시스테인에 의한 2개의 쇄의 공유 결합이 결핍되기 때문에, Fv 단편은 종종 안정화된다. 예를 들면, 10 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 15개의 아미노산의 짧은 펩타이드 단편에 의해 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 링크하는 것이 유리하다. 이러한 방식으로, 펩타이드 링커로 링크된 VH 및 VL로 이루어진 단일 펩타이드 가닥을 수득한다. 이러한 종류의 항체 단백질은 단일-쇄-Fv (scFv)로서 공지되어 있다. scFv-항체 단백질의 예는 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 따라서, 항체 단편 및 항원-결합 단편은 Fv-단편 및 특히 scFv를 추가로 포함한다.
최근에, 다량체성 유도체로서 scFv를 제조하는 다양한 전략이 개발되었다. 이는 특히, 개선된 약동학적 및 생물분포 성질 뿐만 아니라 증가된 결합 활성(avidity)을 갖는 재조합 항체를 생성하는 것을 의도한다. scFv의 다량체화를 성취하기 위해, scFv는 다량체화 도메인을 갖는 융합 단백질로저 제조되었다. 다량체화 도메인은, 예를 들면, IgG의 CH3 영역 또는 코일형 코일 구조 (나선 구조), 예를 들면, 루이신-지퍼 도메인일 수 있다. 그러나, 또한 scFv의 VH/VL 영역 간의 상호작용이 다량체화 (예를 들면, 디아-, 트리- 및 펜타바디)를 위해 사용되는 전략이 있다. 디아바디는 당해 기술분야의 숙련가에게 2가 동종이량체 scFv 유도체를 의미한다. scFv 분자에서 링커의 5 - 10개 아미노산으로 단축은 쇄간 VH/VL-중첩가 일어나는 동종이량체의 형성을 야기한다. 디아바디는 추가로 디설파이드 브릿지의 도입에 의해 안정화될 수 있다. 디아바디-항체 단백질의 예는 선행 기술에 공지되어 있다.
미니바디는 당해 기술분야의 숙련가에게 2가, 동종이량체 scFv 유도체를 의미한다. 이는 면역글로불린의 CH3 영역, 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 힌지 영역 (예를 들면, 또한 IgG1로부터) 및 링커 영역을 통해 scFv에 연결된 이량체화 영역으로서 IgG1을 포함하는 융합 단백질로 이루어진다. 미니바디-항체 단백질의 예는 선행 기술에 공지되어 있다.
트리바디는 당해 기술분야의 숙련가에게 3가 동종삼량체 scFv 유도체를 의미한다. VH-VL가 링커 서열 없이 직접적으로 융합된 ScFv 유도체는 삼량체의 형성을 야기한다.
당해 기술분야의 숙련가는 또한 2-, 3- 또는 4가 구조를 갖고 scFv로부터 유도되는 소위 미니항체에 익숙할 것이다. 다량체화는 2-, 3- 또는 4량체 코일형 코일 구조로 수행된다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 관심 대상 유전자는 상기한 이들 목적하는 폴리펩타이드 중 어느 것에 대해 바람직하게는 모노클로날 항체, 이의 유도체 또는 단편에 대해 암호된다.
항체 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인로 구성된 면역글로불린 단편은 이들의 결정화 경향 (Fc = 결정화할 수 있는 단편) 때문에 "Fc 단편", "Fc 영역" 또는 "Fc"로 칭명된다. 이들은 예를 들면, 통상적인 항체로부터 파파인 또는 펩신과 함께 프로테아제 소화에 의해 형성될 수 있지만, 또한 유전적 조작에 의해 생산될 수 있다. Fc 단편의 N-말단 부분은 힌지 영역의 다수의 아미노산이 얼마나 여전히 존재하는지에 의존하여 변할 수 있다.
항원-결합 단편 및 Fc 영역을 포함하는 항체는 또한 전체-길이 항체로서 언급될 수 있다. 전체-길이 항체는 일-특이적 및 다중특이적 항체, 예를 들면, 이특이적 또는 삼특이적 항체일 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 치료학적 항체는 다중특이적 항체, 특히 이특이적 또는 삼특이적 항체이다. 이특이적 항체는 전형적으로 한 분자 내에서 표적 세포 (예를 들면, 악성 B 세포) 및 이펙터 세포 (예를 들면, T 세포, NK 세포 또는 마크로파지)에 대한 항원-결합 특이성을 조합한다. 예시적인 이특이적 항체는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 디아바디, BiTE (이-특이적 T-세포 인게이저(Engager)) 포맷 및 DART (이중-친화성 재-표적화) 포맷이다. 디아바디 포맷은 2개의 개별적인 폴리펩타이드 쇄 상에서 2개의 항원 결합 특이성의 중쇄 및 경쇄의 동계 가변 도메인을 분리하고, 2개의 폴리펩타이드 쇄는 비-공유결합으로 연관된다. DART 포맷은 디아바디 포맷을 기초로 하고, 그러나, C-말단 디설파이드 브릿지를 통해 추가적인 안정화를 제공한다. 삼특이적 항체는 3개의 항원-결합 특이성을 합한 모노클로날 항체이다. 이들을 2개의 상이한 항체의 항원-인지 도메인을 하나의 이특이적 분자로 변경하는 이특이적-항체 기술로 구축할 수 있다. 예를 들면, 삼특이적 항체를 암 세포에 대해 CD38 및 T 세포에 대해 CD3 및 CD28을 표적화하여 생성하였다. 다중특이적 항체는 특히 높은 품질의 생성물로 제조하기가 어렵다.
또다른 바람직한 치료학적 단백질은 융합 단백질, 예를 들면, Fc-융합 단백질이다. 따라서, 본 발명은 유리하게는 융합 단백질, 예를 들면, Fc-융합 단백질의 생산을 위해 사용될 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 단백질 생산을 증가시키는 방법은 유리하게는 융합 단백질, 예를 들면, Fc-융합 단백질의 생산을 위해 사용될 수 있다.
융합 단백질의 이펙터 부분은 천연 또는 변형된 이종 단백질의 완전한 서열 또는 서열의 임의의 부분일 수 있다. 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린 서브타입, 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2 서브타입 또는 IgA, IgE, IgD 또는 IgM와 같은 부류로부터 입수할 수 있다. 우선적으로 이들은 사람 면역글로불린으로부터 유도되고, 사람 IgG으로부터 유도되는 것이 보다 바람직하고, 사람 IgG1 및 IgG2으로부터 유도되는 것이 더욱 보다 바람직하다. Fc-융합 단백질의 비-제한적인 예는 MCP1-Fc, ICAM-Fc, EPO-Fc 및 scFv 단편 또는 N-링크된 글리코실화 부위를 포함하는 중쇄 면역글로불린 불변 영역의 CH2 도메인에 결합된 그 외에 유사한 것들이다. Fc-융합 단백질은 N-링크된 글리코실화 부위를 포함하는 중쇄 면역글로불린 불변 영역의 CH2 도메인을, 예를 들면, 다른 면역글로불린 도메인, 효소적 활성 단백질 부분, 또는 이펙터 도메인을 포함하는 또다른 발현 작제물에 도입하여 유전 공학 접근법에 의해 작제될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc-융합 단백질은 또한 예를 들면, N-링크된 글리코실화 부위를 포함하는 중쇄 면역글로불린 불변 영역의 CH2 도메인에 링크된 단일 쇄 Fv 단편를 포함한다.
본 발명의 재조합 단백질은 진핵세포에서 생산된다. 바람직하게는, 재조합 단백질을 제조하기 위해 사용되는 진핵세포는 효모 세포 (예를 들면, 사카로마이세스 클리베로마이세스) 또는 포유동물 세포 (예를 들면, 햄스터 또는 사람 세포)이다. 포유동물 세포는 바람직하게는 CHO 세포, HEK 293 세포 또는 이의 유도체이다. HEK293 세포는, 이에 제한되는 것은 아니지만, HEK293 세포, HEK293T 세포, HEK293F 세포, Expi293F 세포 또는 이의 유도체를 포함한다. 대규모 산업 생산에서 통상 사용되는 CHO 세포는 종종 조작되어 생산 프로세스에서 이들의 특징을 개선시키거나, 재조합 세포의 선택을 실행한다. 이러한 조작은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 아폽토시스 저항성 증가, 자가포식현상 감소, 세포 증식 증가, 세포-주기 조절 단백질의 변화된 발현, 샤페론 조작, 언폴드 단백질 반응 (UPR)의 조작, 분비 경로 조작 및 대사 조작을 포함한다.
바람직하게는, 유효한 세포주 개발 프로세스를 가능하게 하는 CHO 세포는 예를 들면, 글루타민 신테타제 (GS) 녹아웃 및/또는 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 녹아웃에 의해 대사적으로 조작되어 각각 메티오닌 설폭스이민 (MSX) 또는 메토트렉사이트를 사용한 선택을 실행되게 한다.
바람직하게는, 재조합 단백질을 제조하기 위해 사용되는 CHO 세포는 CHO-DG44 세포, CHO-K1 세포, CHO-DXB11 세포, CHO-S 세포, CHO 글루타민 신테타제 (GS)-결핍 세포 또는 이들 세포 중 어느 것의 유도체이다.
[표 2]
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세포는 무혈청 조건하에 및 임의로 동물 기원의 임의의 단백질/펩타이드가 없는 매질 내에서 확립되고, 적응되고, 완전히 배양되는 경우, 가장 바람직하다. 시판되는 배지, 예를 들면, 햄 F12 (Sigma, Deisenhofen, Germany), RPMI-1640 (Sigma), 둘베코 개질된 이글 배지 (DMEM; Sigma), 최소 필수 배지 (MEM; Sigma), 이스코브스 개질된 둘베코 배지 (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), 무-혈청 CHO 배지 (Sigma), 및 무-단백질 CHO 배지 (Sigma)가 예시적인 적합한 영양소 용액이다. 배지 중 어느 것을 필요한 경우 다양한 화합물로 보충하고, 이의 비-제한적인 예는 재조합 호르몬 및/또는 다른 재조합 성장 인자 (예를 들면, 인슐린, 트랜스페린, 상피 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자), 염 (예를 들면, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 포스페이트), 완충액 (예를 들면, HEPES), 뉴클레오사이드 (예를 들면, 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코스 또는 다른 등가의 에너지원, 항생물질 및 미량 원소이다. 임의의 다른 필수적인 보충물은 또한 당해 기술분야의 숙련가게 공지된 적합한 농도로 포함될 수 있다. 선택가능한 유전자를 발현하는 유전적으로 변형된 세포의 성장 및 선택을 위해, 적합한 선택 제제를 배양 배지에 첨가한다.
본 발명의 방법의 재조합 단백질은 세포 배양물 중 진핵세포에서 생산된다. 발현 후, 재조합 단백질은 수거되고, 추가로 정제된다. 재조합 단백질은 수거된 세포 배양 유체 (HCCF)에서 분비되고 당해 기술분야에 잘 공지된 기술을 사용하여 정제된 단백질로서 배양 배지로부터 또는 세포 용해물로부터 회수할 수 있다 (즉, 이에 제한되는 것은 아니지만, 세포막 및 임의로 세포벽의 효소적, 화학적, 삼투압, 기계적 및/또는 물리적 파괴를 포함하는 임의의 수단으로 용해된 세포의 함량을 포함하는 유체). 다양한 정제 단계에서 입수 및/또는 분석된 샘플은 또한 공정-중 제어 (IPC) 샘플 또는 프로세스 중간체로서 언급된다. 수거는 전형적으로, 예를 들면, 수거된 세포 배양 유체 또는 세포 용해물, 바람직하게는 수거된 세포 배양 유체를 생산하기 위해 원심분리 및/또는 여과를 포함한다. 따라서, 수거된 세포 배양 유체 또는 세포 용해물은 또한 정화된 수거된 세포 배양 유체 또는 정화된 세포 용해물로서 언급될 수 있다. 살아있는 세포를 포함하지 않고, 세포 데브리스 뿐만 아니라 대부분 세포 성분은 제거되었다. 정화는 전형적으로 원심분리 또는 여과, 바람직하게는 여과를 의미한다. 추가 프로세스 단계는 오염물로부터 생성물을 분리하기 위한 친화성 크로마토그래피, 특히 항체 또는 Fc-함유 단백질을 위한 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 추가 프로세스 단계는 바이러스를 불활성화하는 산 처리를 포함할 수 있고, 바람직하게는 산 처리 후 심층 여과에 의해 생성물 풀을 정화하여 세포 오염물, 예를 들면, HCPs 및 DNA을 제거한다. 추가 프로세스 단계는 이러한 순서로 또는 개별적인 경우 적합할 수 있는 임의의 다른 순서로 포함될 수 있다: 이온 교환 크로마토그래피, 특히 오염 세포 성분을 추가로 제거하기 위한 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 생성물 관련 오염물, 예를 들면, 응집물을 제거하기 위한 양이온 교환 크로마토그래피. 추가로, 바람직하게는 후속 프로세스 단계는 바이러스를 추가로 제거하기 위한 나노여과, 및 각각 재조합 단백질을 농축하고 완충액을 교환하기 위한 한외여과 및 정용여과를 포함할 수 있다.
리파제 활성이 숙주 세포 단백질 오염물과 연관될 수 있기 때문에, 본 발명에 따른 방법은 특히 프로세스 중간체에서 리파제 활성을 보다 효율적으로 제거하기 위한 관련 단계를 개조하기 위해 HCPs를 제거하는 정제 단계 후 (바람직하게는 전 및 후), 예를 들면, 친화성 크로마토그래피 전 및 후, 산 처리와 병행하여 심층 여과 전 및 후 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피 전 및 후 프로세스 중간체를 분석하기 위해 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 친화성 크로마토그래피 후, 및/또는 산 처리와 병행하여 심층 여과 후 (또는 산 처리 후 및/또는 심층 여과 후) 및/또는 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들면, 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 후 적어도 하나의 샘플을 입수함을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 적어도 하나의 샘플을 친화성 크로마토그래피 전 및 후 및/또는 산 처리와 병행하여 심층 여과 전 및 후 (또는 산 처리 전 및 후 및/또는 심층 여과 전 및 후) 및/또는 이온 교환 크로마토그래피, 예를 들면, 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 양이온 교환 크로마토그래피, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 전 및 후 입수함을 포함한다. 당해 기술분야의 숙련가는 특정한 방법 단계 후 입수된 샘플이 하기 방법 단계 전 입수된 샘플과 동일할 수 있고, 예를 들면, 친화성 크로마토그래피 (예를 들면, 단백질 A 크로마토그래피) 후 입수된 샘플은 산 처리 전 (또는 즉, 산 처리 후 병행하여 심층 여과 전) 샘플과 동일한 샘플일 수 있음을 알고 있다. 상기에 설명한 바와 같이, 완충액의 광범위한 완충 범위 때문에, 심지어 상이한 pH 값을 갖는 샘플 중 리파제 활성을 본 발명에 따른 방법을 사용하여 비교할 수 있다. 본 발명에 따른 방법을 사용하여 분석할 수 있는 다른 샘플은 약물 물질 또는 약물 제품 샘플이다. 약물 물질 또는 약물 제품 샘플은 제형 완충액을 포함하고, 따라서 종종 폴리소르베이트를 포함한다. 매우 높은 농도에서 폴리소르베이트는 기질과 경쟁하기 때문에 반응을 억제할 수 있다. 그러나, 검정의 민감성 때문에, 0.4 내지 0.8 mg/ml 폴리소르베이트의 전형적인 농도에서, 리파제 활성이 또한 약물 물질 또는 약물 제품 샘플 중에서 결정될 수 있다.
하나의 측면에서, 하기를 포함하는 재조합 단백질을 포함하는 샘플에서 리파제 활성을 검출하는 단계를 포함하는 관심 대상 재조합 단백질을 제작하는 방법이 제공된다: (a) 진핵세포에서 생산된 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 제공하는 단계; (b) 적어도 하나의 샘플을 반응 용액과 접촉시켜 반응 혼합물을 형성하는 단계, 여기서, 반응 용액은 하기한 것을 포함한다: (i) 약 pH 4 내지 약 pH 9의 pH를 갖는 완충액, (ii) 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 계면활성제, 여기서, 계면활성제는 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제임, (iii) 발색단 4-메틸움벨리페릴 (4-MU)을 4-MU 에스테르 형태로 포함하는 기질, 여기서, 4-MU 에스테르는 포화 비분지형-쇄 지방산 (C6-C16) 4-MU 에스테르임, 및 (iv) 임의로, 비-완충 염; (c) 반응 혼합물 중 샘플 및 기질을 인큐베이팅하는 단계; (d) 4-MU 에스테르의 가수분해를 측정하고 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 검출하여 리파제 활성을 검출하는 단계; 임의로, 단계 (c)에 따라 상기 반응 혼합물 중 상기 샘플 및 상기 기질을 인큐베이팅하면서, 상기 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 경시적으로 검출하여 가수분해를 측정하는 단계. 당해 기술분야의 숙련가는 상기 방법이 오염 리파제 활성을 검출하기 위한 것이고, 단계 (d)에서 검출된 리파제 활성이 재조합 단백질, 보다 특히 관심 대상 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플 중 오염 리파제 활성인 것을 이해할 것이다. 당해 기술분야의 숙련가는 상기 방법이 (i) 세포 배양물 중 관심 대상 재조합 단백질을 발현하는 진핵세포를 배양하는 단계; (ii) 상기 재조합 단백질을 수거하는 단계; (iii) 상기 재조합 단백질을 정제하는 단계; 및 (iv) 임의로, 재조합 단백질을 투여에 적합한 약제학적으로 허용되는 제형으로 제형화하는 단계를 추가로 포함한다. 따라서, 하기의 단계를 포함하는 관심 대상 재조합 단백질을 제작하는 방법이 제공된다: (i) 관심 대상 재조합 단백질을 발현하는 진핵세포를 배양하는 단계; (ii) 상기 재조합 단백질을 수거하는 단계; (iii) 상기 재조합 단백질을 정제하는 단계; 및 (iv) 임의로, 상기 재조합 단백질을 투여에 적합한 약제학적으로 허용되는 제형으로 제형화하는 단계; 및 (v) 단계 (ii), (iii) 및/또는 (iv)에서 상기 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 입수하는 단계; 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 재조합 단백질을 포함하는 샘플에서 (오염) 리파제 활성을 검출함을 추가로 포함한다: (a) 단계 (v)의 진핵세포에서 생산된 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 제공하는 단계; (b) 적어도 하나의 샘플을 반응 용액과 접촉시켜 반응 혼합물을 형성하는 단계, 여기서, 반응 용액은 하기한 것을 포함한다: (i) 약 pH 4 내지 약 pH 9의 pH를 갖는 완충액, (ii) 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 계면활성제, 여기서, 계면활성제는 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제임, (iii) 발색단 4-메틸움벨리페릴 (4-MU)을 4-MU 에스테르 형태로 포함하는 기질, 여기서, 4-MU 에스테르는 포화 비분지형-쇄 지방산 (C6-C16) 4-MU 에스테르임, 및 (iv) 임의로, 비-완충 염; (c) 반응 혼합물 중 샘플 및 기질을 인큐베이팅하는 단계; (d) 4-MU 에스테르의 가수분해를 측정하여 (오염) 리파제 활성을 검출하고, 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 검출하는 단계; 임의로, 단계 (c)에 따라 상기 반응 혼합물 중 상기 샘플 및 상기 기질을 인큐베이팅하면서, 상기 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 경시적으로 검출하여 가수분해를 측정하는 단계. 본 발명의 방법에서 사용된 반응 용액은 수성 반응 용액이다. 추가로 단계 (d)에서 검출된 리파제 활성은 재조합 단백질, 보다 특히 관심 대상 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플 중 오염 리파제 활성이다. 특정 실시형태에서, 관심 대상 재조합 단백질은 치료학적 단백질, 예를 들면, 항체, 항체 단편, 항체 유도된 분자 (예를 들면, scFv, 이- 또는 다중-특이적 항체) 또는 융합 단백질 (예를 들면, Fc 융합 단백질)이다. 하나의 실시형태에서, 항체는 항-IL-36R 항체, 특히 스페솔리맙이다. 또다른 실시형태에서, 항체는 항-IL-36R 항체가 아니고, 특히 스페솔리맙이 아니다.
특정 실시형태에서, 본 발명에 따라서 관심 대상 재조합 단백질을 제작하는 방법은 재조합 단백질을 수거하는 단계 (단계 (ii))에서 상기 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 입수함을 포함하고, 여기서, 샘플은 수거된 세포 배양 유체 (HCCF) 또는 세포 용해물이고; 재조합 단백질을 정제하는 단계 (단계 (iii))에서, 여기서, 샘플은 공정-중 제어 (IPC) 샘플이고; 및/또는 재조합 단백질을 투여에 적합한 약제학적으로 허용되는 제형으로 제형화하는 임의의 단계 (단계 (iv))에서, 여기서, 샘플은 약물 물질 샘플 또는 약물 제품 샘플이다. 바람직하게는, 본 발명에 따라서 관심 대상 재조합 단백질을 제작하는 방법은 단계 (iii)에서 상기 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 입수함을 포함하고, 여기서, 샘플은 친화성 크로마토그래피 후, 산 처리에 이은 심층 여과 후 (또는 산 처리 후 및/또는 산 처리 후), 및/또는 이온 교환 크로마토그래피, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피 후 예를 들면, 적어도 하나의 샘플을 입수함을 포함하는 공정-중 제어 (IPC) 샘플이다. 보다 바람직하게는 상기 방법은 친화성 크로마토그래피 전 및 후, 산 처리에 이은 심층 여과 전 및 후 (또는 산 처리 전 및 후 및/또는 산 처리 전 및 후), 및/또는 이온 교환 크로마토그래피, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피 전 및 후 적어도 하나의 샘플을 입수함을 포함한다. 재조합 단백질을 포함하는 샘플에서 리파제 활성을 검출하는 단계는 본원에 기재된 리파제 활성을 검출하기 위한 방법에 따라서 및 이에 명시된 바와 같이 수행된다.
샘플에서 가수분해를 측정하여 오염 리파제 활성을 측정하기 위한 키트
또한 다음을 포함하는 재조합 단백질을 포함하는 샘플에서 오염 리파제 활성을 측정하기 위한 키트가 제공된다: (i) 약 pH 4 내지 약 pH 9의 pH를 갖는 완충액, (ii) 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 계면활성제, 여기서, 계면활성제는 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제임, (iii) 발색단 4-메틸움벨리페릴 (4-MU)를 4-MU 에스테르 형태로 포함하는 기질, 여기서, 기질은 포화 비분지형-쇄 지방산 (C6 내지 C16) 4-MU 에스테르임, 및 (iv) 임의로, 비-완충 염, 및/또는 (iiv) 임의로 희석용수. 하나의 실시형태에서, 키트는 추가로 양성 대조군으로서 역할을 하는 내부 표준을 포함하고/하거나, 내부 표준, 예를 들면, 시판되는 리파제, 예를 들면, 돼지 췌장 리파제 (PPL)와 비교하여 상대값을 계산하도록 한다. 키트는 또한 96 웰 또는 다수의 96 웰을 갖는 하나 이상의 미세역가 플레이트를 포함할 수 있다. 키트 성분은 용액 및/또는 건조 성분으로서, 개별적으로 또는 사전-혼합된 형태로 제공될 수 있다. 완충액의 경우, 희석 또는 재구성시 약 pH 4 내지 약 pH 9의 pH를 갖는 완충액을 제공하는 건조 화합물로서 제공될 수 있다.
특정 실시형태에서, 완충액, 계면활성제 및 임의의 비-완충 염은 검정 완충액으로서 사전혼합된다. 바람직하게는, 상기 검정 완충액은 최종 반응 혼합물에 비해 적어도 약 3-배 농축되거나 약 3-배 내지 약 5-배 농축된다. 대안적으로, 검정 완충액은 건조 혼합물로서 제공된다. 이러한 건조 혼합물은 물로 재구성되어 최종 반응 혼합물에 비해 적어도 약 3-배 농축된 또는 5-배 농축된 검정 완충액을 제공할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 검정 완충액의 건조 혼합물은 동결건조된 검정 완충액이다. 기질은, 반응 용액을 제공하기 위해 사용하기 전에 검정 완충액에 첨가되도록 하도록 별도로 제공된다. 대안적으로 키트는 마스터 믹스로서 사전혼합된 완충액, 계면활성제, 기질 및 임의의 비-완충 염을 포함할 수 있다. 마스터 믹스는 반응 혼합물의 약 80% (v/v) 내지 약 70% (v/v), 바람직하게는 반응 믹스의 약 80% 내지 약 75%로 제공되도록 개조될 수 있다. 검정 완충액 및 반응 용액은 수성 용액이다.
반응 용액의 성분의 경우 동일한 것을 본 발명의 방법으로 상기 명시된 바와 같이 적용한다. 발색단 4-MU를 포함하는 기질은 포화 비분지형-쇄 지방산 (C6 내지 C16) 4-MU 에스테르의 형태로 존재하고, 여기서, 포화 비분지형-쇄 지방산의 지방족 쇄는 C6 내지 C16 탄소 원자 또는 바람직하게는 C8 내지 C12 탄소 원자를 갖는다. 따라서, 기질은 4-메틸움벨리페릴 옥타노에이트, 4-메틸움벨리페릴 노나노에이트, 4-메틸움벨리페릴 데카노에이트 (4-MUD), 메틸움벨리페릴 운데카노에이트 또는 메틸움벨리페릴 도데카노에이트일 수 있다. 특정 실시형태에서, 기질은 4-메틸움벨리페릴 옥타노에이트, 4-메틸움벨리페릴 데카노에이트 (4-MUD) 및 4-메틸움벨리페릴 도데카노에이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직한 실시형태에서, 기질은 4-MUD이다.
키트는 또한 기질을 용해시키기 위한 유기 용매를 추가로 포함할 수 있거나, 기질은 유기 용매에 용해된다. 기질은 건조 물질 및 임의로 추가 유기 용매로서 제공될 수 있거나, 스톡 용액 (예를 들면, 반응 혼합물에 비해 중 농도와 비교하여 100x 스톡 용액)으로서 유기 용매, 예를 들면, 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 또는 디메틸 포름아미드 (DMF), 바람직하게는 DMSO 중에서 용해될 수 있다. 따라서, 특정 실시형태에서, 기질은 약 100 μM 내지 약 100 mM, 바람직하게는 약 100 μM 내지 30 mM, 바람직하게는 100 μM 내지 3 mM, 보다 바람직하게는 약 300 μM 내지 3 μM의 스톡 용액으로서 제공된다. 특정 실시형태에서, 기질은 유기 용매 중 스톡 용액으로서 제공되고, 여기서, 스톡 용액은 반응 믹스의 약 1% 내지 약 5%(v/v)로 첨가된다.
에스테르 결합을 갖지 않는 적합한 비-변성 쯔비터-이온성 계날면활성제의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트 (CHAPS), 3-([3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-2-하이드록시-1-프로판설포네이트 (CHAPSO), CHAPS 유사체 (예를 들면, Big CHAP N,N-비스-(3-D-글루콘아미도프로필)데옥시콜아미드), 쯔비터젠트 (상이한 길이, 예를 들면, n-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판설포네이트 (쯔비터젠트 3-12)) 및 3-[N,N-디메틸(3-팔미토일아미노프로필)암모니오]-프로판설포네이트 또는 다른 아미도설포베타인 계면활성제이다. 적합한 비-변성 비-이온성 계면활성제의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 피라노시드 계면활성제 (예를 들면, 옥틸 β-D-글루코피라노시드 (OGP), 노닐 β-D-글루코피라노시드, 도데실 β-D-말토피라노시드 (DDM) 또는 옥틸 β-D-티오글루코피라노시드), 폴리옥시에틸렌 (23) 라우릴 에테르 (Brij 35) 또는 다른 폴리옥시에틸렌 에테르; 사포닌 (예를 들면, Digitonin), 옥틸페녹시 폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-630), 폴록사머 188, 338, 407 또는 테르기톨이다. 특정 실시형태에서, 계면활성제는 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제이고, 바람직하게는 계면활성제는 폴리에틸렌 글리콜 3급-옥틸페닐 에테르 (Triton X-100)가 아니고, 폴리에틸렌 글리콜 노닐페닐 에테르 (NP-40)가 아니다. 바람직한 실시형태에서, 계면활성제는 CHAPS, CHAPSO, 쯔비터젠트 (예를 들면, 쯔비터젠트 3-12) 및 사포닌, 바람직하게는 CHAPS로 이루어진 그룹으로부터 선택된 비-변성 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제이다.
특정 실시형태에서, 완충액은 포름산, 아세트산, 락트산, 시트르산, 말산, 말레산, 글리신, 글리실글리신, 석신산, TES (2-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}에탄설폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판설폰산), PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), MES (2-(N-모르폴리노)에탄설폰산), 트리스 염기, 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스-프로판, 비신 (N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신), HEPES (4-2-하이드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산), TAPS (3-([트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}프로판설폰산), 트리신 (N-트리스(하이드록시메틸)메틸글리신), Na2HPO4 및 NaH2PO4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 완충액 물질을 포함한다. 특정 실시형태에서, 완충액은 약 pH 4 내지 약 pH 8의 pH를 갖고, 바람직하게는 완충액은 약 pH 5 내지 약 pH 7.5의 pH를 갖고, 보다 바람직하게는 완충액은 약 pH 5.5 내지 약 pH 7.5의 pH를 갖는다.
완충액은 본 발명에 따른 방법에 대해 상기 명시된 바와 같이 단일 완충액 물질을 포함할 수 있거나, 다성분 완충액일 수 있다. 다-성분 완충액은 더 넓은 완충 범위를 갖기 위해 완충 범위가 중첩되는 하나 초과의 완충액 물질을 포함할 수 있다. 완충액은, 예를 들면, 2, 3, 4, 5개 이상의 완충 물질, 바람직하게는 2개 이상의 완충 물질, 보다 바람직하게는 3개 완충 물질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 다-성분 완충액은 2 내지 4개의 완충 물질, 3 내지 4개의 완충 물질, 보다 바람직하게는 3개의 완충 물질을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 다-성분 완충액은 완충 범위가 중첩되는 적어도 3개의 완충액 물질을 포함하고, 바람직하게는 트리스, MES 및/또는 아세트산 중 적어도 하나를 포함하고, 보다 바람직하게는 아세트산, MES 및 트리스를 1:1:2의 비로 포함한다. 특정 실시형태에서, 완충액은 적어도 약 pH 5 내지 적어도 약 pH 7.5, 바람직하게는 적어도 약 pH 4 내지 적어도 약 pH 8의 완충 범위를 갖는 다-성분 완충액이다. 하나의 실시형태에서, 약 pH 4 내지 약 pH 9의 상이한 pH 값 다-성분 완충액의 사용은 완충액의 이온성 강도를 15% 미만, 바람직하게는 10% 미만 또는 심지어 7.5% 미만 또는 5% 미만, 예를 들면, 0% 내지 15% 미만, 0% 내지 10% 미만, 0% 내지 7.5% 미만 또는 0% 내지 5% 미만, 또는 예를 들면, 2% 내지 15% 미만, 2% 내지 10% 미만, 2% 내지 7.5% 미만 또는 2% 내지 5% 미만으로 되게 한다. 임의의 비-완충 염은, 예를 들면, NaCl, KCl 및 CaCl2일 수 있고, 바람직하게는 NaCl 또는 KCl이다.
상기한 것을 고려하여, 본 발명이 또한 하기 항목을 포함하는 것을 이해할 수 있다:
항목 1은 하기 단계를 포함하는 재조합 단백질을 포함하는 샘플에서 리파제 활성을 검출하는 방법을 제공한다: (a) 진핵세포에서 생산된 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 제공하는 단계; (b) 적어도 하나의 샘플을 반응 용액과 접촉시켜 반응 혼합물을 형성하는 단계, 여기서, 반응 용액은 하기한 것을 포함한다: (i) 약 pH 4 내지 약 pH 9의 pH를 갖는 완충액, (ii) 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 계면활성제, 여기서, 계면활성제는 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제임, (iii) 발색단 4-메틸움벨리페릴 (4-MU)을 4-MU 에스테르 형태로 포함하는 기질, 여기서, 4-MU 에스테르는 포화 비분지형-쇄 지방산 (C6-C16) 4-MU 에스테르임, 및 (iv) 임의로, 비-완충 염; (c) 반응 혼합물 중 샘플 및 기질을 인큐베이팅하는 단계; 및 (d) 4-MU 에스테르의 가수분해를 측정하여 리파제 활성을 검출하고, 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 검출하는 단계; 임의로, 단계 (c)에 따라 상기 반응 혼합물 중 상기 샘플 및 상기 기질을 인큐베이팅하면서, 상기 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 경시적으로 검출하여 가수분해를 측정하는 단계.
항목 2는 항목 1 또는 2의 방법을 명시하고, 여기서, 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 4-MU 에스테르의 가수분해 중지시키지 않고 검출하고/하거나; 반응 혼합물 중 샘플 및 기질을 2 분 내지 5 시간 미만, 3 시간 미만, 2 시간 미만, 또는 0.5 시간 미만 동안 임의의 기간 동안 인큐베이팅한다.
항목 3은 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도는 경시적으로 검출되고, 유사-0차 반응 속도를 따르고, 임의로, 유사-0차 반응 속도의 요구조건을 충족하지 않는 반응 혼합물을 분석으로부터 제외한다.
항목 4는 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, (a) 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 상대 형광 단위 (RFU)로서 검출하여 가수분해 속도를 측정하고, 이를 4-MU의 정의된 농도를 사용하여 생성된 교정 곡선과 비교하여 방출된 발색단 4-MU (mol/s)의 양을 측정하는 단계, 및/또는 (b) 내부 표준과 비교하여 상대값을 계산하는 단계를 추가로 포함한다.
항목 5는 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 적어도 하나의 샘플에서 검출된 리파제 활성은 오염 리파제 활성이다.
항목 6은 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 기질은 4-메틸움벨리페릴 옥타노에이트, 4-메틸움벨리페릴 노나노에이트, 4-메틸움벨리페릴 데카노에이트 (4-MUD), 4-메틸움벨리페릴 운데카노에이트 및 4-메틸움벨리페릴 도데카노에이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
항목 7은 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 기질은 반응 혼합물 중 약 1 μM 내지 약 1 mM의 최종 농도로 제공된다.
항목 8은 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 기질은 유기 용매 중 스톡 용액으로서 제공되고, 스톡 용액은 반응 믹스의 약 1% 내지 약 5%(v/v)로 첨가하고/하거나, 유기 용매는 DMSO 또는 DMF이다.
항목 9는 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 계면활성제는 반응 혼합물 중 이의 임계 미셀 농도 초과의 반응 혼합물 중 최종 농도를 갖는다.
항목 10은 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 계면활성제는 CHAPS, CHAPSO 및 쯔비터젠트, 바람직하게는 CHAPS로 이루어진 그룹으로부터 선택되고/되거나, 폴리에틸렌 글리콜 3급-옥틸페닐 에테르 (Triton X-100)가 아니고, 폴리에틸렌 글리콜 노닐페닐 에테르 (NP-40)가 아니다.
항목 11은 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 계면활성제는 CHAPS이고, 약 8 mM 내지 약 20 mM, 바람직하게는 약 8 mM 내지 약 15 mM, 보다 바람직하게는 약 10 mM의 반응 혼합물 중 최종 농도로 제공된다.
항목 12는 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 완충액은 포름산, 아세트산, 락트산, 시트르산, 말산, 말레산, 글리신, 글리실글리신, 석신산, TES (2-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}에탄설폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판설폰산), PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), MES (2-(N-모르폴리노)에탄설폰산), 트리스 염기, 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스-프로판, 비신 (N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신), HEPES (4-2-하이드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산), TAPS (3-([트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}프로판설폰산), 트리신 (N-트리스(하이드록시메틸)메틸글리신), Na2HPO4 및 NaH2PO4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 완충액 물질을 포함하고.
항목 13은 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 완충액은 약 5 내지 약 7.5의 pH를 갖고, 바람직하게는 완충액은 약 5.5 내지 약 7.5의 pH를 갖는다.
항목 14는 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 완충액은 적어도 약 pH 5 내지 적어도 약 pH 7.5, 바람직하게는 적어도 약 pH 4 내지 적어도 약 pH 8의 완충 범위를 갖는 다-성분 완충액이다.
항목 15는 항목 14의 방법을 명시하고, 여기서, 다-성분 완충액은 완충 범위가 중첩되는 적어도 3개의 완충액 물질을 포함하고, 바람직하게는 트리스, MES 및/또는 아세트산 중 적어도 하나를 포함한다.
항목 16은 항목 14 또는 15의 방법을 명시하고, 여기서, 상기 방법은 (a) 적어도 약 pH 4 내지 적어도 약 pH 8의 다양한 pH를 갖는 완충액의 사용; (b) 약 pH 4 내지 약 pH 8의 상이한 pH 값을 갖는 완충액의 사용, 이에 의해, 이온성 강도를 15% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 바람직하게는 0% 내지 15% 미만, 0% 내지 10% 미만, 0% 내지 7.5% 미만 또는 0% 내지 5% 미만까지 야기함; (c) 완충액의 pH를 샘플의 pH로 조정함; (d) 완충액의 pH를 리파제 활성을 갖는 적어도 하나의 (오염) 단백질 최적 근처로 조정함; 또는 (e) 가수분해 활성을 감소시키는 조건을 비교하고 확인함을 포함한다.
항목 17은 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 적어도 2, 3, 4, 5, 10개 이상의 샘플은 동시에 분석한다.
항목 18은 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 샘플은 접촉하고, 인큐베이팅하고, 96 웰 또는 다수의 96 웰을 갖는 플레이트 포맷으로 측정한다.
항목 19는 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 샘플은 반응 혼합물의 약 20% 내지 약 30% (v/v), 바람직하게는 반응 혼합물의 약 25%로 제공되고, 임의로, 샘플을 사전-희석할 수 있다.
항목 20은 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 완충액, 계면활성제 및 임의의 비-완충 염은 반응 혼합물에 비해 약 3-배 내지 약 5-배 농축된 검정 완충액으로 사전혼합된다.
항목 21은 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 완충액, 계면활성제, 기질 및 임의의 비-완충 염을 마스터 믹스로서 샘플에 첨가하고, 마스터 믹스는 반응 혼합물의 약 80% (v/v) 내지 약 70% (v/v), 바람직하게는 반응 믹스의 약 75%로 제공된다.
항목 22는 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 비-완충 염은 NaCl, KCl 및 CaCl2로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 비-완충 염은 NaCl 또는 KCl이다.
항목 23은 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 비-완충 염은 반응 혼합물 중 약 100 mM 내지 약 200 mM, 바람직하게는 약 130 mM 내지 약 170 mM, 보다 바람직하게는 약 140 mM 내지 약 150 mM의 농도를 갖는다.
항목 24는 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 비-완충 염의 이온성 강도는 반응 혼합물 중 약 200 mM 이하이고, 바람직하게는 반응 혼합물 중 약 150 mM 이하, 바람직하게는 반응 혼합물 중 약 100 mM 내지 약 200 mM, 바람직하게는 약 130 mM 내지 약 170 mM, 보다 바람직하게는 약 140 mM 내지 약 150 mM이다.
항목 25는 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 반응 혼합물 중 완충액 및 비-완충 염의 누적 이온성 강도는 반응 혼합물 중 약 450 mM 이하, 바람직하게는 약 400 mM, 보다 바람직하게는 350 mM 이하이다.
항목 26은 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 형광성을 형광 분광계 또는 마이크로플레이트 분광광도계를 사용하여 검출한다.
항목 27은 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 적어도 하나의 샘플은 수거된 세포 배양 유체 (HCCF) 또는 세포 용해물, 공정-중 제어 (IPC) 샘플, 약물 물질 샘플 또는 약물 제품 샘플이다.
항목 28은 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, (a) 재조합 단백질은 리파제 및/또는 리파제 활성을 갖는 효소가 아니고; 및/또는 (b) 재조합 단백질은 항체, 항체 단편, 항체 유도된 분자 및 융합 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
항목 29는 선행하는 항목 중 어느 하나의 방법을 명시하고, 여기서, 재조합 단백질을 제조하기 위해 사용되는 진핵세포는 효모 세포 또는 포유동물 세포이고, 포유동물 세포는 바람직하게는 CHO 세포, HEK 293 세포 또는 이의 유도체이다.
항목 30은 다음을 포함하는 재조합 단백질을 포함하는 샘플에서 오염 리파제 활성을 측정하기 위한 키트를 제공한다: (i) 약 pH 4 내지 약 pH 9의 pH를 갖는 완충액; (ii) 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 계면활성제, 여기서, 계면활성제는 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제임; 및 (iii) 발색단 4-메틸움벨리페릴 (4-MU)을 4-MU 에스테르 형태로 포함하는 기질, 여기서, 기질은 포화 비분지형-쇄 지방산 (C6 내지 C16) 4-MU 에스테르임; 및 (iv) 임의로, 비-완충 염; 및/또는 (v) 임의로 희석용수.
항목 31은 항목 30의 키트를 명시하고, 여기서, 기질은 4-메틸움벨리페릴 옥타노에이트, 4-메틸움벨리페릴 노나노에이트, 4-메틸움벨리페릴 데카노에이트 (4-MUD), 4-메틸움벨리페릴 운데카노에이트 및 4-메틸움벨리페릴 도데카노에이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
항목 32는 항목 30 또는 31의 키트를 명시하고, 여기서, 키트는 기질을 용해시키기 위한 유기 용매를 추가로 포함하고, 바람직하게는 DMSO 또는 DMF이다.
항목 33은 항목 30 내지 32 중 어느 하나의 키트를 명시하고, 여기서, 계면활성제는 폴리에틸렌 글리콜 3급-옥틸페닐 에테르 (Triton X-100)가 아니고, 폴리에틸렌 글리콜 노닐페닐 에테르 (NP-40)가 아니거나, 계면활성제는 CHAPS, CHAPSO 및 쯔비터젠트, 바람직하게는 CHAPS로 이루어진 그룹으로부터 선택된 비-변성 쯔비터-이온성 계면활성제이다.
항목 34는 항목 30 내지 33 중 어느 하나의 키트를 명시하고, 여기서, 완충액은 포름산, 아세트산, 락트산, 시트르산, 말산, 말레산, 글리신, 글리실글리신, 석신산, TES (2-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}에탄설폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판설폰산), PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), MES (2-(N-모르폴리노)에탄설폰산), 트리스 염기, 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스-프로판, 비신 (N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신), HEPES (4-2-하이드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산), TAPS (3-([트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}프로판설폰산), 트리신 (N-트리스(하이드록시메틸)메틸글리신), Na2HPO4 및 NaH2PO4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 완충액 물질을 포함한다.
항목 35는 항목 30 내지 34 중 어느 하나의 키트를 명시하고, 여기서, 완충액은 약 5 내지 약 7.5의 pH를 갖고, 바람직하게는 완충액은 약 5.5 내지 약 7.5의 pH를 갖는다.
항목 36은 항목 30 내지 35 중 어느 하나의 키트를 명시하고, 여기서, 완충액은 적어도 약 pH 5 내지 적어도 약 pH 7.5, 바람직하게는 적어도 약 pH 4 내지 적어도 약 pH 8의 완충 범위를 갖는 다-성분 완충액이다.
항목 37은 항목 36의 키트를 명시하고, 여기서, 다-성분 완충액은 완충 범위가 중첩되는 적어도 3개의 완충액 물질을 포함하고, 바람직하게는 트리스, MES 및/또는 아세트산 중 적어도 하나를 포함한다.
항목 38은 항목 30 내지 37 중 어느 하나의 키트를 명시하고, 여기서, 키트는 96 웰 또는 다수의 96 웰을 갖는 하나 이상의 미세역가 플레이트를 추가로 포함한다.
항목 39는 항목 30 내지 38 중 어느 하나의 키트를 명시하고, 여기서, 완충액, 계면활성제 및 임의의 비-완충 염은 최종 반응 혼합물에 비해 적어도 약 3-배 또는 약 3-배 내지 약 5-배 농축된 검정 완충액으로 사전혼합되고/되거나, 건조 혼합물로서 제공된다.
항목 40은 항목 30 내지 39 중 어느 하나의 키트를 명시하고, 여기서, 비-완충 염은 NaCl, KCl 및 CaCl2로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 비-완충 염은 NaCl 또는 KCl이다.
항목 41은 하기의 단계를 포함하는 관심 대상 재조합 단백질을 제작하는 방법을 제공한다: (i) 세포 배양물 중 관심 대상 재조합 단백질을 발현하는 진핵세포를 배양하는 단계; (ii) 상기 재조합 단백질을 수거하는 단계; (iii) 상기 재조합 단백질을 정제하는 단계; 및 (iv) 임의로, 상기 재조합 단백질을 투여에 적합한 약제학적으로 허용되는 제형으로 제형화하는 단계; 및 (v) 단계 (ii), (iii) 및/또는 (iv)에서 상기 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 입수하는 단계; 여기서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 재조합 단백질을 포함하는 샘플에서 (오염) 리파제 활성을 검출함을 추가로 포함한다: (a) 단계 (v)의 진핵세포에서 생산된 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 제공하는 단계; (b) 적어도 하나의 샘플을 반응 용액과 접촉시켜 반응 혼합물을 형성하는 단계, 여기서, 반응 용액은 하기한 것을 포함한다: (i) 약 pH 4 내지 약 pH 9의 pH를 갖는 완충액, (ii) 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 계면활성제, 여기서, 계면활성제는 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제임, (iii) 발색단 4-메틸움벨리페릴 (4-MU)을 4-MU 에스테르 형태로 포함하는 기질, 여기서, 4-MU 에스테르는 포화 비분지형-쇄 지방산 (C6-C16) 4-MU 에스테르임, 및 (iv) 임의로, 비-완충 염; (c) 반응 혼합물 중 샘플 및 기질을 인큐베이팅하는 단계; (d) 4-MU 에스테르의 가수분해를 측정하여 오염 리파제 활성을 검출하고, 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 검출하는 단계; 임의로, 단계 (c)에 따라 상기 반응 혼합물 중 상기 샘플 및 상기 기질을 인큐베이팅하면서, 상기 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 경시적으로 검출하여 가수분해를 측정하는 단계. 바람직한 실시형태에서, 단계 (b) (ii)에서 계면활성제는 폴리에틸렌 글리콜 3급-옥틸페닐 에테르 (Triton X-100)가 아니고, 폴리에틸렌 글리콜 노닐페닐 에테르 (NP-40)가 아니다. 바람직하게는, 계면활성제는 예를 들면, CHAPS, CHAPSO 및 쯔비터젠트, 바람직하게는 CHAPS로 이루어진 그룹으로부터 선택된 비-변성 쯔비터-이온성 계면활성제이다.
항목 42는 항목 41에 따른 관심 대상 재조합 단백질을 제작하는 방법을 명시하고, 여기서, 상기 방법은 하기 단계에서 상기 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 입수함을 포함한다: 단계 (ii)에서, 여기서, 샘플은 수거된 세포 배양 유체 (HCCF) 또는 세포 용해물이고; 단계 (iii)에서, 여기서, 샘플은 공정-중 제어 (IPC) 샘플이고; 및/또는 단계 (iv)에서, 여기서, 샘플은 약물 물질 샘플 또는 약물 제품 샘플이다.
항목 43은 단계 (iii)에서, 상기 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 입수함을 포함하는 항목 41 또는 42에 따른 관심 대상 재조합 단백질을 제작하는 방법을 명시하고, 여기서, 샘플은 공정-중 제어 (IPC) 샘플이다.
항목 44는 항목 43에 따른 관심 대상 재조합 단백질을 제작하는 방법을 명시하고, 여기서, 상기 방법은 적어도 하나의 샘플을 친화성 크로마토그래피 후, 산 처리에 이은 심층 여과 (또는 산 처리 후 및/또는 심층 여과 후), 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피 후 입수하고, 바람직하게는 적어도 하나의 샘플을 친화성 크로마토그래피 전 및 후, 산 처리에 이은 심층 여과 전 및 후 (또는 산 처리 전 및 후 및/또는 심층 여과 전 및 후), 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피 전 및 후 입수함을 포함한다.
항목 45는 항목 1-29 중 어느 하나의 방법에 따른 재조합 단백질을 포함하는 샘플에서 리파제 활성을 검출함을 포함하는 항목 41 내지 44 중 어느 하나에 따라서 관심 대상 재조합 단백질을 제작하는 방법을 명시한다.
실시예
발색단으로서 4-MU의 선택
다수의 리파제는 4-메틸움벨리페론 (4-MU)의 지방산 에스테르를 가수분해할 수 있다. 가수분해시 지방산이 방출될 뿐만 아니라, 고도의 형광 4-MU이 방출된다 (도 1). 형광성의 증가는 가수분해 속도에 직접적으로 비례하고, 이에 따라 제공된 샘플에서 가수분해 활성 또는 리파제 활성을 측정하는데 사용할 수 있다.
4-메틸움벨리페릴은, 이의 스펙트럼 특징이 이온성 강도 및 pH (데이터를 나타내지 않음)를 변경에 대해 충분히 민감하지 않는 높은 양자 수율을 겸비하기 때문에 검출제로서 선택된다. 이들 특징은 강건한 검정 성능을 뒷받침한다. 추가로, 예를 들면, 광산란 (데이터를 나타내지 않음)에 의해 야기되는 교란에 충분히 민감하지 않은, 형광성을 기초로 한, 매우 민감성 검출 원리를 드러낸다.
리파제 검정
리파제 검정을 위해 2개의 상이한 완충액을 사용하였다. 포스페이트 검정 완충액 또는 다-성분 완충액, AMT 완충액. 포스페이트 완충액은 108 mM Na2HPO4, 25 mM NaH2PO4, 186.2 mM NaCl, 13.3 mM CHAPS를, pH 7.4에서 포함시켜 81 mM Na2HPO4, 19 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 7.4의 반응 혼합물 중 최종 농도를 초래한다. 4 - 8의 광범위한 완충 범위를 갖는 AMT 검정 완충액은 4x 스톡 용액으로서 제공되고, 0.3 M 아세트산, 0.3 M MES, 0.6 M 트리스, 0.6 M NaCl, 40 mM CHAPS를 포함하고, pH는 HCl 또는 NaOH를 사용하여 지시된 바와 같이 조정되어 (권장되는 pH 범위: 4 - 8), 75 mM 아세테이트, 75 mM MES, 150 mM 트리스, 150 mM NaCl, 및 10 mM CHAPS의 반응 혼합물 중 최종 농도를 야기한다.
기질을 DMSO 중 3 mM 4-메틸움벨리페릴 데카노에이트 (4-MUD; FM25973, Carbosynth)를 포함하는 농축된 스톡 용액에 저장하고, 사용 전에 DMSO 중에 1:10으로 희석하여 DMSO 중 0.3 mM을 포함하는 사용을 위한 100x 스톡 용액을 수득하였다.
측정치의 비교가능성을 보장하기 위해, 검정 완충액 및 기질을 사용하기 전에 혼합하였다. 마스터믹스를 사용하기 전에 즉시 제조하고, 제공된 샘플 (예를 들면, 약물 물질)을 기질 및 검정 완충액을 포함하는 마스터믹스 및 임의로 추가의 물과 혼합하여 반응을 시작하였다. 반응 용기에서 혼합 단계는, 대량 용적의 2개의 성분, 샘플 및 마스터믹스를 첨가하기 전에, 소량 용적을 반응 용기에 제공하여 수행하였다. 따라서, 전형적으로 샘플을 먼저 첨가하였다.
반응 혼합물을 다음과 같이 제조하였다. 포스페이트 완충액 (일정한 pH 7.4)을 기초로 하는 검정을 위해, A) 큐벳: 마스터믹스 (2250 μL 포스페이트 검정 완충액, 30 μL DMSO 중 0.3 mM 4-MUD)를 반응 용기 중에서 720 μL 샘플에 첨가하고, B) 웰당 96 웰 플레이트에서: 마스터믹스 (225 μL 포스페이트 검정 완충액, 3 μL DMSO 중 0.3 mM 4-MUD)를 반응 용기 중에서 72 μL 샘플을 첨가하였다. AMT 완충액 (또한 3-성분 완충액으로 언급됨 (다양한 pH)을 기초로 하는 검정을 위해, C) 큐벳: 마스터믹스 (750 μL 4x AMT 검정 완충액, 1500 μL H2O, 30 μL DMSO 중 0.3 mM 4-MUD)를 반응 용기 중에서 720 μL 샘플을 첨가하고, D) 96 웰 플레이트에서 웰당: 마스터믹스 (75 μL 4x AMT 검정 완충액, 150 μL H2O, 3 μL DMSO 중 0.3 mM 4-MUD)를 반응 용기 중에서 72 μL 샘플에 첨가하였다.
기질 4-MUD의 가수분해를 형광 강도에 의존하여 실-시간으로 수분 내지 5 시간 이하 동안 혼합 직후 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 검출하여 측정하였다. 4-MU 방출을 지시하는 형광성 (λem = 450 nm, λex= 330 또는 340 nm)은 형광 분광계를 사용하는 큐벳에서 또는 적합한 마이크로플레이트 판독기를 사용하는 96-웰 플레이트에서 25℃에서 모니터링되었다. 높은 상관관계를 형광 분광계 (Fluoromax4, Horiba Jobin Yvon) 및 플레이트 판독기 SpectraMax M3 (Molecular Devices)의 사용 사이에서 발견하였다 (도 9 참조). 샘플을 포함하지 않는 음성 대조군을 잠재적 자가-가수분해를 제외하기 위해 포함시켰다. 선형 피팅을 사용하여 기울기 (예를 들면, RFU/s)를 계산하였다. 실-시간 형광성 검출은 유사-0차 반응 속도를 갖는 시간-프레임에서 측정을 가능하게 한다. 샘플은 적어도 삼중으로 수행하고, 개별적인 반응 혼합물은, 이들이, 예를 들면, 벽내 거품 등으로 인해 유사-0차 반응 속도를 충족하지 않는 경우, 분석에서 제외되었다. 이러한 이상치를 제거하는 방식은 검정의 민감성을 강력하게 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 4-MU의 정의된 농도를 사용하는 교정 곡선을 사용하여 가수분해 속도 (예를 들면, nmol/s)를 계산할 수 있다. 공지된 4-MU 농도를 사용한 교정 곡선은 추가로 상이한 pH에서 값에서 반응 속도의 결정 및 비교를 가능하게 하였다.
AMT 완충액 개발
리파제 검정은 초기에 포스페이트 검정 완충액을 사용하여 설정하였다. 다양한 pH에서 상이한 제품 샘플에서 가수분해 활성의 속도론적 측정을 위해 3-성분 AMT 완충액을 개발하였다. 완충액 물질로서 아세트산, MES 및 트리스를 포함하는 AMT 완충액은, 더 넓은 pH 완충 범위를 가능하게 하고, 이에 따라, 더 큰 pH 범위 또는 또는 심지어 상이한 pH에서 측정을 가능하게 한다. 사용되는 완충액 물질은 비-형광성, 열악한 금속 킬레이터인 것으로 공지되어 있고, 효소적 활성을 간섭할 가능성이 없다. 포스페이트 검정 완충액에 필적하게, CHAPS를 CMC 초과로 첨가하고, 이온성 강도를 NaCl을 사용하여 조정하였다. 검정이 이온성 강도에 민감성인 것으로 판명되었기 때문에, 중복되는 완충액 범위를 갖는 완충액 물질을 포함하는 완충액 뿐만 아니라 상이한 pH에서 (범위 pH 4-8)에서 (15% 미만 바람직하게는 심지어 10% 미만) 이온성 강도를 단지 중간 정도로 변화하는 완충액을 생성하는 것이 중요하였다 (참조: Ellis KJ, Morrisson JF, 1982. Methods in Enzymology, 87: 405-426). AMT 완충액은, 예를 들면, 가수분해 활성을 감소시키는 pH 조건을 포함하는 조건을 확인할 수 있다. 이러한 완충액은 추가로 샘플의 pH를 측정하여 샘플이 존재하는 특정 조건에서 리파제 활성을 결정할 수 있게 하고, 뿐만 아니라 정제 동안 상이한 상태에서 리파제 활성을 비교할 수 있게 한다. 검정은 추가로 pH 최적에서 샘플을 측정하여 민감성을 증가시킬 수 있다.
HPLC-CAD 방법
HPLC-CAD를 사용하여 수성 용액 중 폴리소르베이트 함량을 정량화하였다. 이소프로판올 또는 등가물을 포함하는 수성 이동상을 사용하여, 온전한 폴리소르베이트가 역상 및 이온 교환 중합체의 혼합물을 기반으로 하는 혼합-방식 컬럼에 결합되었다. 이어서, 폴리소르베이트를 아세토니트릴 또는 등가물의 이동상을 사용하여 용리하였다. 보다 특히 HPLC 크로마토그래피를 10 mM 암모늄 포메이트, pH 4.5, 20% (v/v) 2-프로판올의 이동상 A (MPA) 및 50% (v/v) 아세토니트릴 및 50% 2-프로판올 (v/v)을 포함하는 이동상 B (MPB)을 사용하여 수행하였다. 단백질 및 매트릭스 성분 뿐만 아니라 폴리소르베이트 분해제의 분리는 혼합 방식 컬럼 (Oasis® Max Online 컬럼, 2.1 mm x 20 mm, 30 μm, 80 Å) 상에서 MPA에서 1.0 mL/min의 유동을 사용하여 성취하고, 온전한 폴리소르베이트 종을 MPB를 사용하는 단계-구배로 용리하였다. 피분석물을 하전된 에어로졸 검출기 (CAD)를 사용하여 검출하였다. CAD 검출은 피분석물을 분무하고, 이동상을 제거하고, 하전된 입자의 형성을 유도하는 불활성 가스 흐름 시스템을 이용한다. 유도된 현재 측정은 샘플에 포함된 폴리소르베이트의 양에 비례한다. 폴리소르베이트를 외부 교정 표준 연속을 사용하여 정량화하였다.
형광 미쉘 검정
형광 분자, 예를 들면, N-페닐-1-나프틸아민 (NPN)은 수성 용액에서 계면활성제의 존재하에 가용화될 수 있다. 계면활성제가 이의 임계 미셀 농도를 초과하는 경우, 형광 시약이 미쉘의 소수성 내부로 개재됨에 따라 형광 양자 수율의 대큐모 증가가 관찰된다. 가용화된 형광 시약의 양은 용액 중 미쉘의 농도에 직접적으로 비례한다. 보다 상세하게는, 샘플을 5x10-6 M NPN로 스파이크하고, 형광을 형광 검출기 (λem = 420 nm, λex= 350 nm)를 사용하여 검출하였다. 폴리소르베이트를 외부 교정 표준 연속을 사용하여 정량화하였다.
실시예 1: 리파제 검정은 상이한 약물 물질에서 활성을 측정하게 한다
리파제 검정을 정제 후 다양한 약물 물질에서 리파제 활성을 결정하기 위해 및 다운-스트림 프로세싱 동안 정제 단계를 개조하고 개선시키는 것을 도와서 최종 약물 제품에서 폴리소르베이트 분해를 야기하는 최종 약물 물질에서 리파제 활성을 제거하기 위해 개발하였다. 일부 약물 물질에 존재하는 숙주 세포 단백질로서 공동-정제된 오염 리파제 활성은 단백질 뿐만 아니라 정제 프로세스에 좌우되어 상이할 수 있다. 상이한 리파제는 특이적 pH 최적 값을 나타내고, 이는 보통 이들의 세포 국소화에 관련되고, 예를 들면, 리소좀 리파제는 전형적으로 산성 최적 pH를 갖는다.
따라서 리파제 검정을 다양한 pH의 상이한 벌크 약물 물질 (BDS)에서 가수분해 활성의 속도 측정을 위해 사용하였다. 이를 위해, AMT 완충액을 pH 범위 4-8 내에 pH 의존성을 결정하기 위해 확립하였다. BDS를 각각의 샘플에 대해 웰당 72 μL에서 희석된 형태로 사용하였다. 공지된 4-MU 농도를 사용한 교정 곡선은 각각의 pH에서 반응 속도를 nmol/min/mL 단위로 결정할 수 있게 하였다. 음성 대조군에서 블랭크 작동을 단지 비-효소적 가수분해를 모니터링하여 제형 완충액을 사용하여 수행하였다. 임의로 양성 대조군은 시판되는 리파제, 예를 들면, 돼지 췌장 리파제 (PPL)를 ≤ 0.24 mg/mL에서 사용하여 포함되었다. 약물 제품은, 제품 A, B, D 및 E (BDS A, B, D 및 E)의 BDS로 언급되고, 검출되는 가수분해 활성의 양 (도 2 참조) 뿐만 아니라 이들의 가수분해 활성 pH 프로파일에서 상이하였다. 예를 들면, BDS A는 알카리성 pH에서 분명한 최적 pH를 나타내지만, BDS D 및 BDS E는 오히려 산성 pH에서 최적 pH를 나타내었다 (도 2). pH ≥ 7.5에서 자가가수분해는 잔류 가수분해 활성을 설명할 수 있다 (BDS B 및 BDS E 참조). 이는 리파제 억제제, 예를 들면, 오를리스타트 (3.3 μM)의 존재하에 잔류 가수분해 활성을 검출하여 또는 동시에 리파제 활성 (샘플 완충액 또는 배지)를 포함하지 않는 블랭크 샘플을 작동하여 (데이터를 나타내지 않음) 입증할 수 있다. 이러한 실험은 또한, 예를 들면, BDS B에서 극도로 낮은 리파제 활성이, 최적 pH (pH 6)에서 여전히 검출가능하다는 것을 나타내었다.
전반적으로, pH 의존성이 시험된 다양한 약물 물질 샘플 간에 상이하다는 것을 발견하고, 이는 다양한 약물 물질이, 때때로 뚜렷한 최적 pH와 연관된 리파제 활성을 갖는 다양한 오염 단백질을 포함함을 나타낸다. 이는 검정이 시험 샘플에서 리파제 활성을 갖는 이러한 다른(divergent) 효소를 검출하기 위해 유용하다는 것을 나타낸다.
추가로 상이한 제형 완충액을 상이한 pH에서 시험에서 시험하고, 이는 상이한 제형 완충액이 약물 제품에서 리파제 활성을 지지하거나 억제할 수 있다는 것을 입증하였다 (데이터를 나타내지 않음).
실시예 2: 기질 농도의 영향
관찰된 반응의 충분히 높은 민감성을 성취하기 위해 용액 중 충분한 기질을 갖는 것이 중요하다. 이러한 필요성은 수-계 마스터- 및 반응-믹스 중 제한된 4-MUD 및 이의 유도체의 용해성과 경쟁한다. 물에 첨가하는 경우, 고 농도 4-MUD는 가시적 입자를 즉시 형성하였다. 계면활성제를 검정-믹스, 예를 들면, CHAPS로 첨가하여, 4-MUD의 용해성이 크게 증가되고, 이에 따라, 침전이 방지되었다.
결과적으로, 의도된 용도를 위한 이상적인 기질 농도는 광산란 및 활성 세트 실험을 수행하여 결정되었다. 4-MUD의 용해성을 1 cm 마이크로-큐벳에서 형광 분광계 (λem = 400 nm, λex = 400 nm)를 사용하여 AMT 검정 완충액 (75 mM 아세테이트, 75 mM MES, 150 mM 트리스, 150 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 7)에서 직각 광산란 (RALS) 실험을 사용하여 시험하였다. 10 mM CHAPS를 포함하는 ATM 완충액에서 최대 용해성은 약 ~40 μM의 4-MUD인 것이 발견되었다 (도 3).
벌크 약물 물질 (BDS D) 중 가수분해 활성의 미카엘리스-멘텐 속도론을 분석하였다 (72 μL/웰, 희석되지 않은 BDS D). 검정을 AMT 검정 완충액 (75 mM 아세테이트, 75 mM MES, 150 mM 트리스, 150 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 5.5) 중에서 다양한 농도의 4-MUD (1.5625 μM - 150 μM)를 사용하여 흑색 96 웰 플레이트에서 마이크로플레이트 판독기 (λem = 450 nm, λex = 330 nm, 상부 판독 모드)를 사용하여 수행하였다. pH를 벌크 약물 물질의 pH로 조정하였다. 도 4A에 나타낸 바와 같이 반응 속도는 신속한 판독을 뒷받침하기 위해 3 μM의 4-MUD 또는 심지어 그 이하에서 충분한 것으로 발견되었다. 전형적으로, 4-MU 방출을 혼합 직후 측정하고, 수분 내지 수시간 동안, 전형적으로 약 20 분 내지 약 2 시간 동안 검출한다.
결과적으로, 1 μM 내지 1000 μM의 농도가 사용될 수 있지만, 3 μM 내지 30 μM 4-MUD의 농도가 표준 농도로서 사용되는 것이 합리적인 타협인 것으로 입증되었다 (도 4).
특정한 단위 조작 및/또는 고장 탐구(troubleshooting) 활성의 경우, 예를 들면, 미카엘리스-멘텐 속도론를 결정하기 위해 더 높은 농도가 바람직할 수 있다 (도 4). 따라서, 어느 하나의 CHAPS 농도는 도 5에 나타낸 바와 같이 증가할 수 있거나, 다른 적합한 계면활성제가 사용될 수 있다 (예를 들면, 쯔비터젠트).
실시예 3: 지방산 쇄 길이의 영향
아실 에스테르 유도체 4-메틸움벨리페릴데카노에이트 (4-MUD)를 선택하고, 그 이유는, 예를 들면, 더 긴 불포화 아실 쇄를 포함하는 올레에이트를 사용하는 것과 비교하여, 데카노에이트 아실 에스테르가 더 광범위한 효소 스펙트럼를 포획하기 때문이다. 추가로, 더 짧은 쇄 길이의 데카노에이트는, 예를 들면, 올레에이트와 비교하여, 수계 반응 혼합물에서 더 양호한 용해성을 제공하였다. 결과적으로, 더 많은 기질이 검정 믹스에서 사용될 수 있다. 보다 특히, 용해성은 C16의 쇄 길이 또는 그 이상에서 강력하게 제한된다는 것을 발견하였다 (데이터를 나타내지 않음). 추가로, 데카노에이트가, 예를 들면, 부티레이트와 비교하여, 자가-가수분해에 대해 더 우수한 저항성을 제공한다는 것을 발견하였다 (도 6). 4-메틸움벨리페릴부티레이트 (4-MUB) 및 4-MUD의 자가-가수분해을 분석하였다. 형광을 1800 초 동안 30 μM의 4-MUB 및 4-MUD을 사용하여 모니터링하고, AMT 검정 완충액 (75 mM 아세테이트, 75 mM MES, 150 mM 트리스, 150 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 5.5) 중에서 흑색 96 웰 플레이트에서 마이크로플레이트 판독기 (λem = 450 nm, λex = 330 nm, 상부 판독 모드)를 사용하여 비교하였다. 본 발명자들은 추가로 C5 이하의 쇄 길이가 자가-가수분해를 강력하게 증가시킨다는 것을 측정하였다 (데이터를 나타내지 않음). 상이한 발색단을 더 많이 나타내지만, 여전히 허용가능한 자가-가수분해를 나타내는, C8 쇄를 갖는 기질을 사용한다 (데이터를 나타내지 않음). 종합하면, 사용되는 특이적 기질은 중요하고, 검정의 민감성을 강력하게 개선시키고 증가시킨다는 것을 입증하였다. 검정에 사용되는 4-MUD 중 C10 지방산은 최적의 선택인 것으로 발견되었다.
실시예 4: 반응 믹스 중 계면활성제의 영향
반응 조건은 관련 효소의 활성, 예를 들면, 리파제의 가수분해 활성을 유지하고 지원하도록 설계되어야 한다. 그중에서도, 이러한 요구조건을 검정의 반응 혼합물을 변형하여 성취하였다.
먼저, 계면활성제를 이의 CMC (임계 미쉘 농도) 위에서 시험하였다. 따라서 10 mM CHAPS를 검정에 첨가하였다. 특히, 검정을 30 μM 4-MUD를 사용하여 AMT 검정 완충액 (75 mM 아세테이트, 75 mM MES, 150 mM 트리스, 150 mM NaCl, pH 5.5)에서 10 mM CHAPS의 존재 또는 부재하에 흑색 96 웰 플레이트에서 마이크로플레이트 판독기 (λem = 450 nm, λex = 330 nm, 기부 판독 모드)를 사용하여 수행하였다. 시험된 샘플은 제품 G, 제품 B, 제품 F를 포함하는 약물 물질 샘플 및 제품 D의 한외여과/정용여과 후 샘플이고, 각각 웰당 72 μL로 첨가하였다. 결과는 도 7A 및 B에서 이의 CMC 위의 계면활성제, 예를 들면, CHAPS의 존재가 검정 민감성을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 이론에 결부시키지 않고, 계면활성제가, 활성 부위를 덮는 것으로 기재되어 있는 뚜껑 또는 덮개를 재배열 및 오픈하여 리파제 활성을 촉진하는 환경을 생성한다는 가설을 세웠다 (참조: Grochulski P, Li Y, Schrag JD, et al. Protein Sci 1994; 3:82-91 and Grochulski P, Bouthillier F, Kazlauskas RJ, et al. Biochemistry 1994; 33:3494-500). 따라서, 최종 반응-믹스 중 10 mM CHAPS의 농도를 선택하였다. 결과적으로, 리파제 가수분해 뿐만 아니라 검정의 민감성도 증가시켰다 (도 7).
계면활성제는 또다른 계면활성제일 수 있지만, 리파제 활성을 갖는 단백질의 본래 구조 및 활성을 유지하기 위해 마일드 및 특히 비-변성 계면활성제일 것이 요구된다. 추가로, 계면활성제가 리파제/가수분해와 경쟁하지 않거나 그렇지 않으면 억제하지 않는다는 것이 중요하다. CHAPS는 에스테르 결합 또는 아실 쇄를 나타내지 않고, 이에 따라 리파제를 위한 기질이 아니다. 따라서 이는 기질과 경쟁하지 않고, 이에 따라, 검정의 민감성에 영향을 주지 않는다. 추가로, CHAPS는 사용되는 농도에서 물 중 4-MUD의 용해성을 중재한다 (도 3).
실시예 5: 상이한 pH 값을 갖는 샘플 측정
효소의 활성은 종종 pH로 영향을 받는다. 공정-중 제어 (IPC) 샘플의 예측된 pH 범위가 3.5에서 7.5까지 도달함에 따른 (표 1), 오염 리파제의 관찰된 활성에 대한 영향을 예측하였다. 상이한 pH 값의 샘플 간의 비교가능성을 최대화하기 위해, 첫번째 완충액 성분을 반응 혼합물 중 7.4로 일정한 pH를 유지하기 위해 확인하였다. 표 1은 상이한 정제 단계로부터 비롯된 샘플의 pH를 나타내기 위해 하나의 다운스트림 프로세스로부터 상이한 IPC 샘플을 요약한다. 각각의 샘플의 pH 및 반응 혼합물의 상응하는 pH를 나타낸다. 유사한 pH 변동을 다운스트림 프로세싱 동안 상이한 항체 또는 Fc-융합 단백질에 대해 발견하였다. 실험을 유사한 결과를 제공하는 수개 제품으로 수행하였다.
Figure pct00002
IPC 샘플을 동일한 pH에서 분석하는 것은 일정한 반응 조건을 유지하고, 따라서, 수득한 데이터의 비교가능성을 증가시킨다. 그러나, 일부 경우, pH를 변경하여, 예를 들면, 가수분해 활성 (예를 들면, 도 2 참조)을 감소시키고 제형 개발을 뒷받침하는 조건을 발견하는 것이 유리하다. 따라서, 3-성분 AMT 완충액 시스템을 개발하였다.
실시예 6: 이온성 강도의 영향
샘플에서 단백질 응집을 방지하기 위해 및 단백질의 본래 구조를 유지하기 위해, 이온을 제공하는 것이 유리하다. 그러나, 이온성 강도는 또한 효소 활성에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 이온성 강도가 측정된 가수분해 활성에 미치는 영향을 시험하였다. 예시적인 약물 제품 샘플의 가수분해 활성을 다양한 농도의 NaCl (1000 mM - 7.8125 mM)의 존재하에 측정하였다. 모든 측정을 흑색 96 웰 플레이트에서 마이크로플레이트 판독기 (λem = 450 nm, λex = 340 nm, 25 ℃, 상부 판독 모드)를 사용하여 NaCl (75 mM 아세테이트, 75 mM MES, 150 mM 트리스, 10 mM CHAPS, pH 5.5)의 부재하에 AMT 검정 완충액 및 72 μL 샘플에서 30 μM 4-MUD를 사용하여 수행하였다. 이온성 강도에 대한 가수분해 활성의 의존성을 수개의 mAbs에 대해 조사하고, 도 8에서 제품 F에서 본보기로 나타낸다.
도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 리파제 활성은 250 mM 이상의 NaCl 농도에서 감소시켰다. AMT 완충액의 경우 150 mM의 NaCl 농도가 따라서 최적인 것으로 밝혀졌다.
실시예 7: 폴리소르베이트에 의한 리파제 검정의 억제
최종 약물 제품에서 폴리소르베이트는 추적할 수 있는 형광발생 기질 (4-MUD)에 대한 경쟁적인 기질로서 기능하는 경향이 있다. 약물 제품에서 폴리소르베이트 20 (PS20) 또는 폴리소르베이트 80 농도는 약 0.2 내지 1.0 g/L 범위일 수 있고, 전형적으로 PS20 또는 PS80 또는 이의 혼합물의 0.2 내지 0.4 g/L 범위 내이다. 따라서, 실험을 활성 약제학적 성분 (물 중 API, PS20 부재)으로서 항체의 한외여과-정용여과 물질을 사용하고 다양한 농도의 PS20 (0.0125 - 3.2 mg/mL)을 반응 혼합물에 첨가하여 설정하였다.
샘플에서 4-MUD 가수분해 활성을 0.0125 - 3.2 mg/mL PS20 (최종 반응 혼합물 농도)의 존재하에 측정하였다. 모든 측정을 흑색 96 웰 플레이트에서 마이크로플레이트 판독기 (λem = 450 nm, λex = 330 nm, 상부 판독 모드)를 사용하여 AMT 검정 완충액 (50 mM 아세테이트, 50 mM MES, 100 mM 트리스, 150 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 5.5) 중에서 30 μM 4-MUD를 사용하여 수행하였다. 이러한 초기 실험에서, AMT 완충액을 더 낮은 농도에서 사용하고, 이후에 pH 4 및 pH 8에서 완충하기 위해서는 너무 낮은 것으로 밝혀졌다. 따라서, 농도를 상기한 농도까지 증가시켰다.
결과는 PS20이 고 농도에서 4-MUD 가수분해에 경쟁적인 억제제임을 나타낸다. 어떠한 억제도 반응 혼합물 중 0.2 g/L PS20 (DP 중 ≥ 0.8 g/L) 까지 관찰되지 않았고, 농도-의존적 억제는 검정 샘플 중에서 0.4 g/L 이상의 농도에서 관찰되지만, 4-MUD 가수분해는 0.4 g/L PS20의 농도에서 분명히 아직 검출가능하였다 (도 9). 존 (Jahn) 등 (참조: Pharm. Res., 2020, 37:118, pages 1-13)과 대조적으로 샘플 중 0.02% PS20 (w/v) (0.2 g/L)에서 거의 완전한 억제를 이미 관찰하고, 이는 본 발명에 따른 리파제 검정의 더 높은 민감성을 나타낸다.
리파제 검정 억제는 이는 검정에서 검출된 4-MUD 가수분해 활성 및 폴리소르베이트 분해 사이의 상관관계를 나타내기 때문에 예측된다. 그러나, 또한 약물 제품 중에서 리파제 활성을 측정할 수 있기 위해, 항체 제형에 전형적으로 적용되는 농도, 예를 들면, 0.1 내지 0.4 g/L가 검정을 간섭하지 않거나 단지 약간 간섭하는 경우 유리하다.
전반적으로, 데이터는 제형화된 약물 물질에서 통상 사용되는 폴리소르베이트 농도를 포함하는 샘플을 분석하는 4-MUD 실험에서 활성에 어떠한 유의한 영향도 예상되지 않음을 나타낸다.
실시예 8: 리파제 활성에 미치는 다른 계면활성제의 효과
존(Jahn) 등 (참조: Pharm. Res., 2020, 37:118, pages 1-13)은 이들 중에서 Triton X-100의 계면활성제의 존재에 의해 야기되는 PPL 활성에 미치는 탈-활성화 효과를 보고하였다. 따라서, PPL (반응 혼합물 중 0.024 mg/ml)의 및 BDS B 및 BDS E (반응 혼합물 중 2.4 mg/ml) 중 가수분해 활성을 10 mM CHAPS, 0.25% Triton X-100 또는 0.25% Triton X-100 및 0.125% 검 아라비쿰을 사용하여 ATM 완충액, pH 5.5에서 측정하였다. 도 10A-C에서 나타낸 결과는 CHAPS가 Triton X-100 및 Triton X-100 및 검 아라비쿰을 능가함을 입증한다. 검 아라비쿰은 유화제이고, 활성에 미치는 검 아라비쿰의 효과는 실험 중 어느 것에서도 관찰되지 않았다.
실시예 9: IPC 샘플 분석을 위한 4-MUD 검정의 적합성
IPC 샘플 분석을 위한 4-MUD 검정의 적합성을 일부 예시적인 프로세스에서 시험하였다. 따라서, 상이한 다운스트림 프로세스 단계로부터 공정-중 제어 샘플을 용해성이 충분한지 여부에 대해 분석하고, pH는 예측되는 범위 내에 있고, 속도론 측정값은 요구조건 (유사-0차 반응 속도)을 충족한다.
표 2는 입자의 가능한 영향, 이온 강도, pH 및 수개의 다른 영향 인자에 대한 프로세스 샘플의 적용가능성을 나타낸다. 샘플을 삼중으로 분석하고, 유사-0차 반응 속도의 요구조건을 충족하지 않는 반응 혼합물을 분석으로부터 제외하였다.
Figure pct00003
검정의 적합성을 나타낼 수 있고, 결과적으로, 검정을 모든 한외-여과/정용여과 (UF/DF) 후 및 최종 제형화된 벌크 약물 물질 (BDS) 내를 포함하는 시험된 모든 프로세스 단계에서 적용할 수 있었다.
이는 추가로 분광계 (도 11A)에서 및 플레이트 판독기 (도 11B)에서 리파제 검정을 사용하여 특이적 항체에 대해 결정되었다.
4-MUD 플레이트 판독기 검정의 결과는 일반적으로 분광계의 결과와 잘 상호관련되었다. 둘 다의 판독은 용리 완충액 단독과 비교하여 샘플을 포함하는 제품에서 뿐만 아니라 제형 완충액 단독과 비교한 약물 물질에서 낮은 리파제 활성을 입증할 수 있다. 4-MUD 검정을 고-처리량 목적을 위해 미세역가 플레이트 포맷에서 수행할 수 있고, 따라서 자동화할 수 있다.
실시예 10: 리파제 억제제의 효과
에스테르 결합의 효소적 가수분해를 억제하기 위해 이용가능한 수개의 물질이 있다. 결과적으로, 약물 제품, 약물 물질 및 생물약제 개발의 다른 프로세스 단계에서 폴리소르베이트 분해를 감소할 수 있는 억제제는 또한 4-MUD 검정에 의해 모니터링된 가수분해 활성을 억제하여야 한다.
따라서, 샘플을 1 μM 오를리스타트 - 비가역적인 리파제 억제제 (Borgstrom 1988) -의 존재 또는 부재하에 인큐베이팅하고, 실온 (~22 ℃)에서 2 개월 동안 pH 5.5에서 안정성에 대해 시험하였다. 0.2 mg/mL PS20를 갖는 약물 제품 샘플 (제품 D)을 56 일까지 수회 풀 포인트(pull point)로 실온에서 인큐베이팅하였다. PS20 함량을 지시된 시점에서 HPLC-CAD 방법을 사용하여 측정하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 1 μM 오를리스타트는 대조군 반응 (DMSO 단독)과 비교하여 PS20의 감소된 분해를 야기하였다.
동일한 약물 제품 샘플 (제품 D)의 가수분해 활성을 오를리스타트의 다양한 농도 (7.3 nM - 20 μM)의 존재하에 리파제 검정을 사용하여 측정하였다. 모든 측정을 흑색 96 웰 플레이트에서 마이크로플레이트 판독기 (λem = 450 nm, λex = 330 nm, 상부 판독 모드)를 사용하여 AMT 검정 완충액 (75 mM 아세테이트, 75 mM MES, 150 mM 트리스, 150 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 5.5) 중에서 30 μM 4-MUD를 사용하여 수행하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 오를리스타트는 4-MUD 검정에 의해 결정되는 농도 의존적 방식으로 리파제 활성을 억제하였다. 결과는 오를리스타트가 폴리소르베이트 분해를 야기하는 가수분해 활성 (도 12) 뿐만 아니라 4-MUD 검정을 사용하는 모니터링된 가수분해 활성을 억제하고 있음을 제시한다 (도 13). 더욱이, 억제는 HPLC-CAD 방법 및 훨씬 더 낮은 억제제 농도를 사용하여 수일 보다는 수분 내에 검출가능하였다.
실시예 11: 4-MUD 활성과 비교한 스파이킹 실험에서 폴리소르베이트 분해
폴리소르베이트 스파이킹 실험을 폴리소르베이트 분해와 4-MUD 검정으로 측정하여 가수분해 활성 간의 상관관계를 시험하기 위해 수행하였다. 폴리소르베이트 분해 속도를 평가하기 위해, 관련 공정-중-단계 (IPC) 샘플을 폴리소르베이트로 스파이크되고, 결과적으로, 폴리소르베이트 함량을 형광 미쉘 검정 (FMA)으로 경시적으로 모니터링하였다. 시험된 IPC 샘플은 단백질 A 정제 (MabSelect) 후, 심층 여과 (Cuno), 이온 교환 크로마토그래피 (Poros) 후 샘플 및 벌크 약물 물질 (BDS)을 포함한다.
폴리소르베이트 분해를 FMA 검정을 사용하여 결정하고, 1 cm 마이크로-큐벳에서 형광 분광계 (λem = 450 nm, λex = 340 nm)를 사용하는 3 μM 4-MUD를 포함하는 포스페이트 검정 완충액 (81 mM Na2HPO4, 19 mM NaH2PO4, 140 mM NaCl, 10 mM CHAPS, pH 7.4)을 사용하여 리파제 검정으로 측정된 가수분해 활성을 비교하였다. 결과 (도 14)는 제품 B의 관련 IPC 단계에서 폴리소르베이트 분해와 리파제 검정으로 측정된 가수분해 활성의 상관관계를 제시한다.

Claims (16)

  1. 재조합 단백질을 포함하는 샘플에서 리파제 활성을 검출하는 방법으로서,
    (a) 진핵세포에서 생산된 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 제공하는 단계;
    (b) 상기 적어도 하나의 샘플을 반응 용액과 접촉시켜 반응 혼합물을 형성하는 단계로서, 여기서, 상기 반응 용액은:
    (i) 약 pH 4 내지 약 pH 9의 pH를 갖는 완충액,
    (ii) 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 계면활성제, 여기서, 상기 계면활성제는 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제임,
    (iii) 발색단 4-메틸움벨리페릴 (4-MU)을 4-MU 에스테르 형태로 포함하는 기질, 여기서, 상기 4-MU 에스테르는 포화 비분지형-쇄 지방산 (C6-C16) 4-MU 에스테르임, 및
    (iv) 임의로, 비-완충 염을 포함하는, 단계;
    (c) 상기 반응 혼합물 중 상기 샘플 및 상기 기질을 인큐베이팅하는 단계;
    (d) 상기 4-MU 에스테르의 가수분해를 측정하여 리파제 활성을 검출하고, 상기 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 검출하는 단계;
    임의로, 단계 (c)에 따라 상기 반응 혼합물 중 상기 샘플 및 상기 기질을 인큐베이팅하면서, 상기 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 경시적으로 검출하여 가수분해를 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 반응 혼합물 중 상기 샘플 및 상기 기질을 2 분 내지 5 시간 미만, 3 시간 미만, 2 시간 미만, 또는 0.5 시간 미만의 임의의 기간 동안 인큐베이팅하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 기질이 4-메틸움벨리페릴 옥타노에이트, 4-메틸움벨리페릴 노나노에이트, 4-메틸움벨리페릴 데카노에이트 (4-MUD), 4-메틸움벨리페릴 운데카노에이트 및 4-메틸움벨리페릴 도데카노에이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 계면활성제가, 상기 반응 혼합물 중 이의 임계 미셀 농도 초과의 상기 반응 혼합물 중 최종 농도를 갖고/갖거나;
    (b) 상기 계면활성제가,
    (i) CHAPS, CHAPSO 및 쯔비터젠트(zwittergent), 바람직하게는 CHAPS로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나;
    (ii) CHAPS이고, 상기 반응 혼합물 중 최종 농도 약 8 mM 내지 약 20 mM, 바람직하게는 약 8 mM 내지 약 15 mM, 보다 바람직하게는 약 10 mM로 제공되거나;
    (iii) 폴리에틸렌 글리콜 3급-옥틸페닐 에테르 (Triton X-100)가 아니고, 폴리에틸렌 글리콜 노닐페닐 에테르 (NP-40)가 아닌, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충액이 포름산, 아세트산, 락트산, 시트르산, 말산, 말레산, 글리신, 글리실글리신, 석신산, TES (2-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}에탄설폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판설폰산), PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), MES (2-(N-모르폴리노)에탄설폰산), 트리스 염기, 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스-프로판, 비신 (N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신), HEPES (4-2-하이드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산), TAPS (3-([트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}프로판설폰산), 트리신 (N-트리스(하이드록시메틸)메틸글리신), Na2HPO4 및 NaH2PO4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 완충액 물질을 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충액이,
    (a) 약 5 내지 약 7.5의 pH를 갖고, 바람직하게는 상기 완충액이 약 5.5 내지 약 7.5의 pH를 갖고/갖거나;
    (b) 적어도 약 pH 5 내지 적어도 약 pH 7.5, 바람직하게는 적어도 약 pH 4 내지 적어도 약 pH 8의 완충 범위를 갖는 다-성분 완충액인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 비-완충 염이 NaCl, KCl 및 CaCl2로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 비-완충 염이 NaCl 또는 KCl이고/이거나;
    (b) 상기 비-완충 염이 상기 반응 혼합물 중 약 100 mM 내지 약 200 mM, 바람직하게는 약 130 mM 내지 약 170 mM, 보다 바람직하게는 약 140 mM 내지 약 150 mM의 농도를 갖고/갖거나;
    (c) 상기 비-완충 염의 이온성 강도가 상기 반응 혼합물 중 약 200 mM 이하이고, 바람직하게는 상기 반응 혼합물 중 약 150 mM 이하이고/이거나;
    (d) 상기 반응 혼합물 중 상기 완충액 및 상기 비-완충 염의 누적 이온성 강도가 상기 반응 혼합물 중 약 450 mM 이하, 바람직하게는 약 400 mM 이하, 보다 바람직하게는 약 350 mM 이하인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 적어도 하나의 샘플이 수거된 세포 배양 유체 (HCCF), 공정-중 제어 (IPC) 샘플, 약물 물질 샘플 또는 약물 제품 샘플이고/이거나;
    (b) 상기 재조합 단백질이 리파제 및/또는 리파제 활성을 갖는 효소가 아니고/아니거나;
    (c) 상기 재조합 단백질이 항체, 항체 단편, 항체 유도된 분자 및 융합 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  9. 관심 대상 재조합 단백질을 제작하는 방법으로서,
    (i) 세포 배양물 중 관심 대상 재조합 단백질을 발현하는 진핵세포를 배양하는 단계;
    (ii) 상기 재조합 단백질을 수거하는 단계;
    (iii) 상기 재조합 단백질을 정제하는 단계; 및
    (iv) 임의로, 상기 재조합 단백질을 투여에 적합한 약제학적으로 허용되는 제형으로 제형화하는 단계; 및
    (v) 단계 (ii), (iii) 및/또는 (iv)에서 상기 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 입수하는 단계
    를 포함하고;
    여기서, 상기 방법은,
    (a) 단계 (v)의 진핵세포에서 생산된 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 제공하는 단계;
    (b) 상기 적어도 하나의 샘플을 반응 용액과 접촉시켜 반응 혼합물을 형성하는 단계로서, 여기서, 상기 반응 용액은:
    (i) 약 pH 4 내지 약 pH 9의 pH를 갖는 완충액,
    (ii) 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 계면활성제, 여기서, 상기 계면활성제는 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제이고, 바람직하게는 상기 계면활성제는 폴리에틸렌 글리콜 3급-옥틸페닐 에테르 (Triton X-100)가 아니고, 폴리에틸렌 글리콜 노닐페닐 에테르 (NP-40)가 아님,
    (iii) 발색단 4-메틸움벨리페릴 (4-MU)을 4-MU 에스테르 형태로 포함하는 기질, 여기서, 상기 4-MU 에스테르는 포화 비분지형-쇄 지방산 (C6-C16) 4-MU 에스테르임, 및
    (iv) 임의로, 비-완충 염을 포함하는, 단계;
    (c) 상기 반응 혼합물 중 상기 샘플 및 상기 기질을 인큐베이팅하는 단계; 및
    (d) 상기 4-MU 에스테르의 가수분해를 측정하여 리파제 활성을 검출하고, 상기 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 검출하는 단계;
    임의로, 단계 (c)에 따라 상기 반응 혼합물 중 상기 샘플 및 상기 기질을 인큐베이팅하면서, 상기 방출된 발색단 4-MU의 형광 강도를 경시적으로 검출하여 가수분해를 측정하는 단계
    를 포함하여 재조합 단백질을 포함하는 샘플 중에서 리파제 활성을 검출함을 추가로 포함하는, 방법.
  10. 제9항에 있어서, 하기 단계에서 상기 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 입수함을 포함하고:
    - 단계 (ii), 여기서, 상기 샘플은 수거된 세포 배양 유체 (HCCF) 또는 세포 용해물임;
    - 단계 (iii), 여기서, 상기 샘플은 공정-중 제어 (IPC) 샘플임; 및/또는
    - 단계 (iv), 여기서, 상기 샘플은 약물 물질 샘플 또는 약물 제품 샘플임;
    바람직하게는 단계 (iii)에서 상기 재조합 단백질을 포함하는 적어도 하나의 샘플을 입수함을 포함하고, 친화성 크로마토그래피 전 및 후, 산 처리 전 및 후, 심층 여과 전 및 후, 및/또는 이온 교환 크로마토그래피, 바람직하게는 음이온 교환 크로마토그래피 또는 양이온 교환 크로마토그래피 전 및 후 적어도 하나의 샘플을 입수함을 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 샘플에서 검출된 리파제 활성이 오염(contaminating) 리파제 활성인, 방법.
  12. (i) 약 pH 4 내지 약 pH 9의 pH를 갖는 완충액;
    (ii) 에스테르-결합을 갖지 않는 비-변성 계면활성제, 여기어, 상기 계면활성제는 비-이온성 또는 쯔비터-이온성 계면활성제임;
    (iii) 발색단 4-메틸움벨리페릴 (4-MU)을 4-MU 에스테르 형태로 포함하는 기질, 여기서, 상기 기질은 포화 비분지형-쇄 지방산 (C6 내지 C16) 4-MU 에스테르임; 및
    iv) 임의로, 비-완충 염; 및/또는
    (v) 임의로 희석용수
    를 포함하는 재조합 단백질을 포함하는 샘플에서 오염 리파제 활성을 측정하기 위한 키트.
  13. 제12항에 있어서,
    (a) 상기 기질이 4-메틸움벨리페릴 옥타노에이트, 4-메틸움벨리페릴 노나노에이트, 4-메틸움벨리페릴 데카노에이트 (4-MUD), 4-메틸움벨리페릴 운데카노에이트 및 4-메틸움벨리페릴 도데카노에이트로 이루어진 그룹으로부터 선택되고/되거나;
    (b) 상기 키트가 상기 기질을 용해시키기 위한 유기 용매를 추가로 포함하는, 키트.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    (a) 상기 계면활성제가 CHAPS, CHAPSO, 쯔비터젠트 및 사포닌, 바람직하게는 CHAPS로 이루어진 그룹으로부터 선택되고/되거나;
    (b) 상기 계면활성제가 폴리에틸렌 글리콜 3급-옥틸페닐 에테르 (Triton X-100)가 아니고, 폴리에틸렌 글리콜 노닐페닐 에테르 (NP-40)가 아니고;
    (c) 상기 완충액이 포름산, 아세트산, 락트산, 시트르산, 말산, 말레산, 글리신, 글리실글리신, 석신산, TES (2-{[트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}에탄설폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판설폰산), PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄설폰산)), MES (2-(N-모르폴리노)에탄설폰산), 트리스 염기, 트리스, 비스-트리스, 비스-트리스-프로판, 비신 (N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신), HEPES (4-2-하이드록시에틸-1-피페라진에탄설폰산), TAPS (3-([트리스(하이드록시메틸)메틸]아미노}프로판설폰산), 트리신 (N-트리스(하이드록시메틸)메틸글리신), Na2HPO4 및 NaH2PO4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 완충액 물질을 포함하는, 키트.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 완충액이 약 5 내지 약 7.5의 pH를 갖고, 바람직하게는 상기 완충액이 약 5.5 내지 약 7.5의 pH를 갖고/갖거나;
    (b) 상기 완충액이 적어도 약 pH 5 내지 적어도 약 pH 7.5, 바람직하게는 적어도 약 pH 4 내지 적어도 약 pH 8의 완충 범위를 갖는 다-성분 완충액이고/이거나;
    (c) 상기 비-완충 염이 NaCl, KCl 및 CaCl2로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 비-완충 염이 NaCl 또는 KCl인, 키트.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 키트가 96 웰 또는 다수의 96 웰을 갖는 하나 이상의 미세역가 플레이트를 추가로 포함하고/하거나; (b) 상기 완충액, 상기 계면활성제 및 상기 임의의 비-완충 염이 최종 반응 혼합물에 비해 약 3-배 내지 약 5-배 농축된 검정 완충액으로 사전혼합되고/되거나, 건조 혼합물로서 제공되는, 키트.
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